JP2013216686A - ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】天然物由来であって、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体リガンド活性の高いペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤および当該ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤を有効成分として含む組成物を提供することを目的とする。
【解決手段】ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤は、ロウロの抽出物、ビャクビの抽出物、エンフシの抽出物、ヤシツジュコンの抽出物のうち、少なくとも１種以上を含むことを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤および当該ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤を有効成分として含む組成物に関する。

ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（peroxisome proliferator-activated receptor；以下、「ＰＰＡＲ」ともいう。）は、脂質および糖代謝を維持する遺伝子群の発現制御を担う核内受容体ファミリーに属するリガンド依存性転写制御因子である。哺乳動物ではＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（ＰＰＡＲβ、ＮＵＣ−１、ＦＡＡＲ）、ＰＰＡＲγの３種のサブタイプの存在が知られており、ＰＰＡＲαは主に肝臓で発現し、ＰＰＡＲδは普遍的に発現している。

近年の研究において、２型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａ^yマウス）に対して、ＰＰＡＲαのアゴニストを投与すると、血中の脂肪量を減少させるだけでなく、体重増加を抑制し、アディポネクチン受容体の発現を増強させることが報告されている。また、ＰＰＡＲγのアゴニストを投与すると、血中のアディポネクチン濃度が上昇することが報告されている。これらの報告から、ＰＰＡＲの作用を増強することでメタボリックシンドロームなどの予防・改善作用が期待できる。

また、ＫＫ−Ａ^yマウスに対して、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγのアゴニストを同時に投与すると、白色脂肪組織におけるアディポネクチン受容体の発現増加およびアディポネクチン濃度の上昇により、アディポネクチンの作用が増強され、肥満によって引き起こされたインスリン抵抗性が改善されることも報告されている。この報告から、ＰＰＡＲαとＰＰＡＲγの作用が同時に発現すると、それぞれのアゴニストが単独で作用するよりも効果的にアディポネクチンが作用し、メタボリックシンドロームなどの予防・改善作用がより強く期待できる（非特許文献１参照）。

ＰＰＡＲの作用を増強するＰＰＡＲ活性剤としては、例えば、ベザフィブラートやクロフィブラートなどのフィブラート系抗高脂血症剤が知られている（非特許文献２参照）。また、例えば、ハーブの一種であるフェンネル抽出物を有効成分とするＰＰＡＲ活性剤や、ウコンなどの成分として知られているクルクミンまたはその誘導体からなるＰＰＡＲ活性剤などの天然物由来のＰＰＡＲ活性剤も知られている（特許文献１，２参照）。

国際公開第２００４／０４５６３２号パンフレット 特開２００３−１２８５３９号公報

"Diabetes"，２００５年，第５４巻，ｐ．３３５８〜３３７０ "Chemico-biologicalInteractions"，２００６年，第１６０巻，ｐ．２４１〜２５１

しかしながら、フィブラート系抗高脂血症剤は合成薬剤であるため、長期投与によって副作用のおそれがあるという問題を有する。一方、天然物由来のＰＰＡＲ活性剤は安全性に優れるが、従来のものは無添加群（対照群）と比較して１．８８〜４．４１倍程度の効果にとどまっているので、十分なＰＰＡＲリガンド活性が得られないという問題を有していた。

また、昨今のメタボリックシンドロームの増加や、これに伴う２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝などの罹患率の急増を鑑みると、これらを予防および／または改善する、安全かつＰＰＡＲリガンド活性の高いＰＰＡＲ活性剤の開発が望まれている。

そこで、本発明は、天然物由来であって、ＰＰＡＲリガンド活性の高いペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤および当該ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤を有効成分として含む組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、植物性の生薬１０００種の抽出物を、培養細胞を用いたレポーター遺伝子リガンド活性化試験に供試し、鋭意探索した結果、非常に高いＰＰＡＲリガンド活性作用を発揮する生薬を複数見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、前記した目的を達成するため、本発明のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤は、ロウロ、ビャクビ、エンフシ、ヤシツジュコンの各抽出物のうち、少なくとも１種以上を含むことを特徴とする。

このようなペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤は、ＰＰＡＲのリガンド結合領域に対して高い結合能力を有するので、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧などを予防および／または改善する作用を有する。

なお、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体はＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの少なくとも一方であること、すなわち、ＰＰＡＲ活性剤はＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの少なくとも一方に対するリガンド活性を有することが好ましい。また、抽出物は、エタノール抽出物またはメタノール抽出物が好ましい。

また、本発明は、前記ＰＰＡＲ活性剤を有効成分として含むメタボリックシンドロームを予防および／または改善する作用を有する組成物として利用することができる。また、本発明は、前記ＰＰＡＲ活性剤を有効成分として含む、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の症状を予防および／または改善する作用を有する組成物として利用することができる。

このような組成物は、ＰＰＡＲのリガンド結合領域に対して高い結合能力を有するＰＰＡＲ活性剤を有効成分として含んでいるので、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧などを予防および／または改善する作用を有する。

なお、本発明の組成物は飲食用とすることができ、ＰＰＡＲ活性剤の１日の摂取量が体重１ｋｇ当たり２０〜８０ｍｇとなることが好ましい。また、本発明の組成物は医薬用とすることができ、ＰＰＡＲ活性剤の１日の投与量が体重１ｋｇ当たり４０〜１６０ｍｇとなることが好ましい。

本発明によれば、天然物由来であって、ＰＰＡＲリガンド活性の高いＰＰＡＲ活性剤および当該ＰＰＡＲ活性剤を有効成分として含む組成物を提供することができる。本発明のＰＰＡＲ活性剤および組成物は、ＰＰＡＲのリガンド結合領域に対して高い結合能力を有するので、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧などを予防および／または改善することができる。

カロウニン抽出物の濃度別ＰＰＡＲγリガンド活性の測定結果を示すグラフである。 各群のマウスの体重変化を示すグラフである。 各群のマウス１匹当たりの１日の摂餌量を示すグラフである。

次に、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明のＰＰＡＲ活性剤は、ＰＰＡＲのリガンド結合領域に結合する能力、すなわち、ＰＰＡＲリガンド活性を有する物質である。このようなＰＰＡＲ活性剤（リガンド）は、アゴニストおよびアンタゴニストのうち、アゴニストであることが好ましい。

また、ＰＰＡＲ活性剤は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγのうち、少なくとも１種以上のＰＰＡＲに対し、リガンド活性を有していればよいが、特にＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの少なくとも一方に対するリガンド活性を有することが好ましい。すなわち、ＰＰＡＲ活性剤が結合するＰＰＡＲは、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの少なくとも一方であることが好ましい。

本発明のＰＰＡＲ活性剤は、具体的には、ロウロ、ビャクビ、エンフシ、ヤシツジュコンの各抽出物のうち、少なくとも１種以上を含んでいる。

カロウニンは、ウリ科カラスウリ属の植物である、トウカラスウリ（カロウ、学名；Trichosanthes kirilowii Maxim.）、モミジカラスウリ（ソウヘンカロウ、学名；Trichosanthes uniflora Hao）、ダイシカロウ（学名；Trichosanthes
truncate C. B. Clarke）、キカラスウリ（学名；Trichosanthes
kirilowii Maxim. var. japonica (Miq.) Kitam.）などの種子である。

ロウロは、キク科ヒゴダイ属の植物である、キシュウロウロ（学名；Rhaponticum uniflorum (L.) DC.）またはウシュウロウロ（学名；Echinops lafolius Tausch）の根である。
ケイシは、クスノキ科の植物であるケイ（ニッケイ、学名；Cinnamomum sieboldii）の若枝である。

カンモクツウは、ウマノスズクサ科の植物であるキダチウマノスズクサ（モクツウバトウレイ、学名；Aristolochia manshuriensis Kom.）の木質茎である。
ビャクビ（ハクビ）は、ガガイモ科の植物である、フナバラソウ（チョクリツハクビ、学名；Cynanchum atratum Bunge.）またはマンセイハクビ（学名；Cynanchum
versicolor Bunge）の根である。

コウボクは、モクレン科の植物である、コウボク（学名；Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）またはオウヨウコウボク（学名；Magnolia biloba (Rehd. et Wils.) Cheng）の樹皮または根皮である。
エンフシは、ウルシ科の植物であるヌルデ（エンフボク、学名；Rhus chinensis Mill.）の果実である。

ヤシツジュコンは、ウルシ科の植物であるヤマハゼ（ヤシツジュ、学名；Rhus sylvestris Sieb. et Zucc.）の根である。
ヤシツジュヨウは、ウルシ科の植物であるヤマハゼ（ヤシツジュ、学名；Rhus sylvestris Sieb. et Zucc.）の葉である。

これらの植物は、古くから漢方薬や薬膳の材料として使用され、長い食経験を有しているため、これらの植物（天然物）由来のＰＰＡＲ活性剤は、合成薬剤（フィブラート系抗高脂血症剤など）と比較して、副作用のおそれがなく、安全性に優れている。

このような植物の抽出物を得る方法（抽出方法）は、ＰＰＡＲリガンド活性を有する抽出画分を得ることができる抽出方法であれば、特に限定されず、広く公知の抽出方法を採用することができる。例えば、植物に対して適量の有機溶媒を加え、２〜３時間撹拌することで植物エキス（ＰＰＡＲリガンド活性を有する成分）を抽出することができる。

このような抽出物は、植物を有機溶媒で抽出した粗抽出物であってもよいし、粗抽出物を常法により精製することで得られる抽出物画分であってもよい。
また、抽出に使用する有機溶媒としては、ＰＰＡＲ活性剤の用途に応じて、例えば、エタノール（濃度７０容積％以上）、メタノール（濃度７０容積％以上）、ヘキサン（濃度９０容積％以上）、クロロホルム（濃度９０容積％以上）などを挙げることができ、特にエタノールまたはメタノールであることが好ましい。

抽出物を製造するにあたり、植物は、生の状態であってもよいし、乾燥品や粗乾燥品であってもよいが、ＰＰＡＲリガンド活性を有する成分を効率的に抽出するという観点から、粉砕してから抽出することが好ましい。なお、乾燥品または粗乾燥品を使用する場合には、乾燥品または粗乾燥品を水に戻してから粉砕し、その後凍結乾燥して再度粉砕した素材を使用することが好ましい。

本発明のＰＰＡＲ活性剤は、ロウロ、ビャクビ、エンフシ、ヤシツジュコンの各抽出物のうち、１種のみ含むものであってもよいし、２種以上含むものであってもよい。また、ＰＰＡＲ活性剤には、ＰＰＡＲリガンド活性を有する他の材料（前記した植物以外の材料）を併せて含有させてもよい。

このようなＰＰＡＲ活性剤は、ＰＰＡＲのリガンド結合領域に結合することで、肝臓、骨格筋、脂肪組織などにおいて、脂肪酸代謝や脂肪細胞の分化誘導、糖代謝などを調節し、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧などの予防・改善作用を発揮する。

本発明は、ＰＰＡＲ活性剤を有効成分として含む組成物として利用することもできる。このとき、ＰＰＡＲ活性剤の含有量は、ＰＰＡＲリガンド活性を失わない範囲であればよく、具体的には１〜９９質量％であり、好ましくは５〜８０質量％、さらに好ましくは１０〜５０質量％である。

このようなＰＰＡＲ活性剤を有効成分として含む組成物は、目的に応じて様々な態様で使用することができる。例えば、飲食用、医薬用などとして安全かつ有効に使用することができる。

飲食用として使用する場合、各種食品（飲料を含む）に含ませることによって、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、機能性食品、栄養補助食品とすることができる。具体的には、例えば、澱粉質食品、練り製品、菓子類、冷菓類、飲料、調味料、サプリメント、その他の加工食品などに添加することができる。

組成物の添加量は０．１〜９９質量％の範囲内に設定することができるが、ＰＰＡＲ活性剤の１日の摂取量が体重１ｋｇ当たり５〜３２０ｍｇとなるように設定することが好ましく、１０〜１６０ｍｇとなるように設定することがより好ましく、２０〜８０ｍｇとなるように設定することがさらに好ましい。

医薬用として使用する場合、各種薬剤に含ませることができる。このとき、薬剤の形状（剤形）は、特に限定されず、その投与経路、例えば、経口投与、直腸投与、鼻内投与、頬側投与、舌下投与、膣内投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与などによって適宜選択することができる。具体的には、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、貼付剤などに添加することができる。組成物の添加量は０．０１〜１００質量％の範囲内に設定することができる。

組成物に含まれるＰＰＡＲ活性剤の１日の投与量は、治療や予防の目的、患者の性別、体重、年齢、疾患の種類や程度、剤形、投与経路、投与回数などの種々の条件に応じて適宜設定することができる。例えば、ＰＰＡＲ活性剤の１日の投与量は、体重１ｋｇ当たり１０〜６４０ｍｇとなるように設定することが好ましく、２０〜３２０ｍｇとなるように設定することがより好ましく、４０〜１６０ｍｇとなるように設定することがさらに好ましい。なお、投与は１日数回に分けてすることができ、１回の投与で使用される薬剤中に含まれる組成物の含有量は、投与回数にあわせて適宜調整することができる。

また、組成物は飲食用、医薬用のほか、例えば、いわゆる医薬部外品としても使用することができる。具体的には、例えば、軟膏、リニメント剤、エアゾール剤、クリーム、石鹸、洗顔料、全身洗浄料、化粧水、ローション、入浴剤などに添加して、局所的に使用することができる。

なお、組成物には、必要に応じて、添加物を添加することができる。添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、結合剤、コーティング剤、着色剤、基剤、酸化防止剤、溶解剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、粘着剤などを挙げることができる。また、組成物には、有機物または無機物の担体を使用することができる。担体としては、例えば、乳糖、澱粉、油脂などを挙げることができる。

このような組成物は、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧などの予防・改善作用を発揮するＰＰＡＲ活性剤を有効成分として含んでいるので、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧などの予防・改善作用を有する。

ここで、本発明において、インスリン抵抗性とは、膵臓β細胞より分泌されたインスリンが、筋肉や脂肪組織で十分にその働きが行われず、糖の吸収促進作用が不十分な状態をいう。そして、インスリン抵抗性の予防とは、ＨＯＭＡ−Ｒ（the homeostasis model assessment of insulin resistance）などのインスリン抵抗性の指標となる値が、悪化するのを防ぐまたは遅らせることをいう。また、インスリン抵抗性の改善とは、インスリン抵抗性の指標となる値を改善することをいう。

本発明において、２型糖尿病とは、日本糖尿病学会が糖尿病治療ガイド２００６−２００７（２００６年２月発行）にて定義している糖尿病の状態をいう。そして、２型糖尿病の予防とは、前記した糖尿病の状態または境界域の状態になるのを防ぐまたは遅らせることをいう。また、２型糖尿病の改善とは、前記した糖尿病の状態または境界域の状態からガイドにて正常域と定義している状態に近づけることをいう。

本発明において、高脂血症とは、日本動脈硬化学会が動脈硬化性疾患診療ガイドライン２００２年版（２００２年９月発行）にて定義している、高コレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症、低ＨＤＬコレステロール血症および高トリグリセリド血症のうち、少なくとも１つ以上の状態をいう。そして、高脂血症の予防とは、前記した高脂血症の状態になるのを防ぐまたは遅らせることをいう。また、高脂血症の改善とは、前記した高脂血症の状態または境界域の状態からガイドラインにて正常域と定義している状態に近づけることをいう。

本発明において、内臓脂肪型肥満とは、日本肥満学会が肥満症治療ガイドライン２００６（２００６年４月発行）にて定義している、ＢＭＩ（Body Mass Index）が２５以上で、かつ、腹部ＣＴ検査での内臓脂肪面積が１００ｃｍ²以上である状態をいう。そして、内臓脂肪型肥満の予防とは、前記した内臓脂肪型肥満の状態になるのを防ぐまたは遅らせることをいう。また、内臓脂肪型肥満の改善とは、前記した内臓脂肪型肥満の状態から内臓脂肪面積を減少させることをいう。

本発明において、脂肪肝とは、肝臓内に脂質、主にトリグリセリドなどの中性脂肪が過剰に蓄積した状態、具体的には、肝細胞のほぼ半数以上に脂肪空胞が認められる状態をいう。そして、脂肪肝の予防とは、前記した脂肪肝の状態になるのを防ぐまたは遅らせることをいう。また、脂肪肝の改善とは、前記した脂肪肝の状態から正常な肝臓に近づけることをいう。

本発明において、高血圧とは、日本高血圧学会が高血圧治療ガイドライン２００４（２００４年１２月発行）にて、定義している高血圧の状態をいう。そして、高血圧の予防とは、前記した高血圧の状態になるのを防ぐまたは遅らせることをいう。また、高血圧の改善とは、前記した高血圧の状態からガイドラインにて正常域と定義している状態に近づけることをいう。

メタボリックシンドロームとは、内臓脂肪蓄積に加え、インスリン抵抗性を基盤とする２型糖尿病、高トリグリセリド血症および／または低ＨＤＬコレステロール血症、血圧高値、高血糖のうち２項目以上を満たす状態を表し、シンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群、内臓脂肪症候群、マルチプルリスクファクター症候群などの呼称で知られている。本発明において、メタボリックシンドロームの予防とは、前記した病態群より選ばれる少なくとも１つ以上の病態において、その症状になるのを防ぐまたは遅らせることをいう。また、メタボリックシンドロームの改善とは、前記した病態群より選ばれる少なくとも１つ以上の病態において、その症状を緩和または症状が治癒することをいう。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、以下に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順などは、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜変更することができる。すなわち、本発明は、以下に示す実施例に限定されるものではない。

＜植物抽出物の調整＞
本実施例においては、以下の植物（の部位）を使用した。
カロウニン ：トウカラスウリの種子 （製造元：栄進商事、品番：Ａ２３）
ロウロ ：キシュウロウロの根 （製造元：栄進商事、品番：Ａ４５）
ケイシ ：ニッケイの若枝・樹皮 （製造元：栄進商事、品番：Ａ４２）
カンモクツウ ：キダチウマノスズクサの木質茎（製造元：栄進商事、品番：Ａ８２）
ビャクビ ：フナバラソウの根 （製造元：栄進商事、品番：Ｂ３１）
コウボク ：コウボクの樹皮 （製造元：栄進商事、品番：Ｂ４０）
エンフシ ：ヌルデの果実 （製造元：栄進商事、品番：Ｊ４９）
ヤシツジュコン：ヤマハゼの根 （製造元：栄進商事、品番：Ｊ６１）
ヤシツジュヨウ：ヤマハゼの葉 （製造元：栄進商事、品番：Ｊ６２）

抽出は、以下の方法により、植物ごとに個別に行った。
植物は、生の状態のものは粉砕し、凍結乾燥して再度粉砕した。乾燥品は水に戻してから粉砕し、凍結乾燥して再度粉砕した。
得られた粉砕物１ｇに対し、１０〜１００ｍｌのエタノールを加えて２時間攪拌した後、ブフナー漏斗を使用して減圧ろ過し、ろ液を回収した。この操作は２回繰り返した。
得られたろ液をペースト状または乾固状になるまで減圧濃縮し、植物抽出物とした。

＜ＰＰＡＲαリガンド活性の測定＞
ＰＰＡＲαリガンド活性の測定は、レポーター遺伝子アッセイにより行った。詳細には、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター領域とＧａｌ４応答配列を４回組み込んだレポータープラスミド（ＵＡＳ×４−ＴＫ−ｌｕｃ）と、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合領域の後方にヒトＰＰＡＲαのリガンド結合領域を組み込んだ融合蛋白質発現プラスミド（Ｇａｌ４−ｈＰＰＡＲα）を細胞内に強制発現し、細胞溶解後のルシフェラーゼ活性を測定することによりそのリガンド活性を評価した。

具体的には、ＣＯＳ１細胞（ミドリザル腎臓由来の株化細胞）を、９６穴培養プレートに５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように植え込み、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。培地には、１０％ ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１０ｍｌ／Ｌ ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（それぞれ、５０００ＩＵ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ；Gibco社）、３７ｍｇ／Ｌ アスコルビン酸（和光純薬工業株式会社）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Gibco社）を使用した。

培養後の細胞をＣａ，Ｍｇ含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋）で洗浄した後、レポータープラスミド（ＵＡＳ×４−ＴＫ−ｌｕｃ）と融合蛋白質発現プラスミド（Ｇａｌ４−ｈＰＰＡＲα）を、リポフェクトアミン・プラス（Gibco社）を用いてトランスフェクションした。

トランスフェクションの約２４時間後、植物抽出物（１種ずつ）を含む培地に交換し（ｎ＝３）、２４時間培養した。植物抽出物は、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという。）に溶解し、最終濃度が３０μｇ／ｍｌとなるよう培地に添加した。なお、対照群にはＤＭＳＯを使用し、培地に１／１０００量（０．１％（ｖ／ｖ））添加した。

培養後の細胞をＰＢＳ＋で洗浄した後、ルックライト（Packard社）を添加し、トップカウント・マイクロプレートシンチレーション／ルミネッセンスカウンター（Packard社）にてルシフェラーゼの発光強度を測定した。各測定群の発光強度の平均値（ｎ＝３）を算出し、対照群に対する比活性を各植物抽出物のＰＰＡＲαリガンド活性とした。その結果を表１に示す。

表１に示すように、本実施例で使用される植物の抽出物は、対照群と比較して６０倍以上ものきわめて高いＰＰＡＲαリガンド活性を有することが確認された。これは、前記した従来の天然物由来のＰＰＡＲ活性剤が対照群と比較して多くても４．４倍程度のリガンド活性であったことを考慮するときわめて高い活性である。

以上より、本実施例のＰＰＡＲ活性剤は、高いＰＰＡＲαリガンド活性を有するので、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧などを効果的に予防および／または改善する作用を期待することができる。

＜ＰＰＡＲγリガンド活性の測定＞
ＰＰＡＲγリガンド活性の測定は、前記したＰＰＡＲαリガンド活性の測定と同様に、レポーター遺伝子アッセイにより行った。詳細には、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター領域とＧａｌ４応答配列を４回組み込んだレポータープラスミド（ＵＡＳ×４−ＴＫ−ｌｕｃ）と、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合領域の後方にヒトＰＰＡＲγのリガンド結合領域を組み込んだ融合蛋白質発現プラスミド（Ｇａｌ４−ｈＰＰＡＲγ）を細胞内に強制発現し、細胞溶解後のルシフェラーゼ活性を測定することによりそのリガンド活性を評価した。

具体的には、ＣＯＳ１細胞を、９６穴培養プレートに５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように植え込み、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。培地には、ＰＰＡＲαリガンド活性の測定時と同様に、１０％ ＦＢＳ、１０ｍｌ／Ｌ ペニシリン・ストレプトマイシン溶液、３７ｍｇ／Ｌ アスコルビン酸を含むＤＭＥＭを使用した。

培養後の細胞をＰＢＳ＋で洗浄した後、ＵＡＳ×４−ＴＫ−ｌｕｃとＧａｌ４−ｈＰＰＡＲγを、リポフェクトアミン・プラス（Gibco社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの約２４時間後、植物抽出物（１種ずつ）を含む培地に交換し（ｎ＝３）、２４時間培養した。植物抽出物は、ＤＭＳＯに溶解し、最終濃度が３０μｇ／ｍｌとなるよう培地に添加した。また、カロウニン抽出物については、ＤＭＳＯに溶解し、最終濃度が５、１０、３０、５０μｇ／ｍｌとなるよう培地に添加した。なお、対照群にはＤＭＳＯを使用し、培地に０．１％（ｖ／ｖ）添加した。

培養後の細胞をＰＢＳ＋で洗浄した後、ＰＰＡＲαリガンド活性の測定時と同様の方法でルシフェラーゼの発光強度を測定した。各測定群の発光強度の平均値（ｎ＝３）を算出し、対照群に対する比活性を各植物抽出物のＰＰＡＲγリガンド活性とした。その結果を表２および図１に示す。図１はカロウニン抽出物の濃度別ＰＰＡＲγリガンド活性の測定結果を示すグラフである。

表２に示すように、本実施例で使用される植物の抽出物は、対照群と比較して約５倍以上のＰＰＡＲγリガンド活性を有することが確認された。これは、前記したＰＰＡＲαリガンド活性に加えて、ＰＰＡＲγリガンド活性も有するという点で特筆すべき特徴である。

また、図１に示すように、本実施例で使用される植物の１種であるカロウニン抽出物は、濃度に依存してＰＰＡＲγリガンド活性を増強させ、５０μｇ／ｍｌ添加群では対照群と比較して１４倍程度の高いＰＰＡＲγリガンド活性を有することが確認された。

以上より、本実施例のＰＰＡＲ活性剤は、高いＰＰＡＲγリガンド活性を有するので、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧などを効果的に予防および／または改善する作用を期待することができる。

＜カロウニン抽出物の２型糖尿病モデルマウスに対する効果＞
カロウニン抽出物の２型糖尿病モデルマウスに対する効果は、２型糖尿病モデルマウスであるＫＫ−Ａ^yマウス（雌、４週齢）に対してカロウニン抽出物を投与し、体重変化および摂餌量、並びに、血清中のグルコース濃度、トリグリセリド（ＴＧ）濃度および総コレステロール濃度を測定することによって評価した。

まず、ＫＫ−Ａ^yマウスに対して、通常食（ＣＥ−２；日本クレア株式会社）を１週間自由摂取にて与えた後、平均体重および体重のばらつきが同等になるように、正常個体を、実施例１、実施例２、比較例１（対照群）および比較例２（ポジティブコントロール群）の４群（各７匹）に分けた。

その後、各群に高脂肪食（ＱｕｉｃｋＦａｔ；日本クレア株式会社）を、水とともに自由摂取にて与えるとともに、１日１回、マウス用胃ゾンデを用いて、以下に示す投与液を４週間経口投与した。なお、照明時間は点灯７〜１９時、消灯１９〜７時とし、室温は２２℃とした。

実施例１には、カロウニン抽出物を２．５％（ｗ／ｖ）となるように、０．５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ８０を添加した０．５％（ｗ／ｖ） ＣＭＣ−Ｎａ（Carboxymethyl Cellulose Sodium Salt）水溶液に加え、これをボルテックスミキサー（Scientific Industries社）で懸濁したものを投与液とし、１匹当たり５ｍｌ／ｋｇの割合（カロウニン抽出物１２５ｍｇ／ｋｇ）で経口投与した。

実施例２には、カロウニン抽出物を１０％（ｗ／ｖ）となるように、０．５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ８０を添加した０．５％（ｗ／ｖ） ＣＭＣ−Ｎａ水溶液に加え、これをボルテックスミキサー（Scientific Industries社）で懸濁したものを投与液とし、１匹当たり５ｍｌ／ｋｇの割合（カロウニン抽出物５００ｍｇ／ｋｇ）で経口投与した。

比較例１には、０．５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ８０を添加した０．５％（ｗ／ｖ） ＣＭＣ−Ｎａ水溶液を投与液とし、１匹当たり５ｍｌ／ｋｇの割合で経口投与した。

比較例２には、Ｗｙ−１４６４３（Sigma社）を０．６％（ｗ／ｖ）となるように、０．５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ８０を添加した０．５％（ｗ／ｖ） ＣＭＣ−Ｎａ水溶液に懸濁したものを投与液とし、１匹当たり５ｍｌ／ｋｇの割合（Ｗｙ−１４６４３・３０ｍｇ／ｋｇ）で経口投与した。なお、Ｗｙ−１４６４３は、ピリニクス酸（Pirinixic acid）とも称され、脂質低下薬として使用されるフィブラート系物質の一種である。

［体重変化、摂餌量の測定］
マウスの体重は、１日１回、投与液を経口投与する前に動物用天秤（新光電子株式会社）を使用して測定した。
摂餌量は、ケージ単位（各群ごと）に毎日測定し、マウス数（７匹）で除した値をマウス１匹当たりの１日の摂餌量とした。

［グルコース濃度、ＴＧ濃度、総コレステロール濃度の測定］
経口投与最終日に一晩絶食し、翌日に採血を行って血清を得た。具体的には、マウスにエーテル麻酔をした後、頚部静脈より１．５ｍｌ、エッペンチューブに採血した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）を行って血清を分離し、測定を行うまで−８０℃で保存した。

血清中のグルコース濃度、ＴＧ濃度および総コレステロール濃度は、それぞれ、グルコースＣII−テストワコー（和光純薬工業株式会社）、トリグリセリドＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）およびコレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて常法により測定した。そして、比較例１（対照群）との差をDunnettの多重比較解析法により、有意水準５％で解析した。

図２に体重変化の結果を、図３に摂餌量の結果を、表３にグルコース濃度、ＴＧ濃度および総コレステロール濃度の測定結果を示す。図２は各群のマウスの体重変化を示すグラフであり、図３は各群のマウス１匹当たりの１日の摂餌量を示すグラフである。

図２に示すように、実施例１（□）、実施例２（△）および比較例２（×）は、比較例１（○）と比較して、軽度ではあるが体重の増加抑制傾向が認められた。これは、図３に示すように、摂餌量について各群間で大きな差がなかったことを考慮すると、カロウニン抽出物を投与することで、体重の増加が抑制されることが確認されたといえる。

表３に示すように、グルコース濃度については、比較例２が比較例１と比べて高い傾向を示した。一方、実施例１，２では、用量依存性は認められなかったものの、比較例１に比べて低い値を示す傾向にあった。すなわち、カロウニン抽出物を投与することで、グルコース濃度（血糖値）が低下することが確認された。

ＴＧ濃度については、比較例１が３００ｍｇ／ｄｌを超えているのに対し、比較例２が２２７ｍｇ／ｄｌ、実施例１が１７８ｍｇ／ｄｌと低い値を示す傾向が見られ、さらに、実施例２では１５０ｍｇ／ｄｌとなり、比較例１と比べて有意に低い値（半分以下の値）を示した。すなわち、カロウニン抽出物を投与することで、ＴＧ濃度（血中の中性脂肪）が低下することが確認された。なお、実施例１，２による用量依存的なＴＧ濃度の低下は、ＰＰＡＲαアゴニストとしての作用を介して発現したと考えられる。

総コレステロール濃度については、比較例２が比較例１と比べて有意に高い値を示した。一方、実施例１，２では、用量依存性は認められなかったものの、比較例１に比べて低い値を示す傾向にあった。すなわち、カロウニン抽出物を投与することで、総コレステロール濃度が低下することが確認された。

以上より、本実施例のＰＰＡＲ活性剤（カロウニン抽出物）によれば、体重の増加を抑制することができるとともに、グルコース濃度、ＴＧ濃度および総コレステロール濃度を低下させることができる。これにより、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、メタボリックシンドロームなどを効果的に予防および／または改善する作用を期待することができる。

なお、マウスの１日当たりの経口投与量（摂取量）１２５〜５００ｍｇ／ｋｇを、ヒトの１日当たりの摂取量に換算すると約２０〜８０ｍｇ／ｋｇとなる。これは、ほ乳類を体重で比較すると、時間が体重の１／４乗に比例する（本川達雄著、「ゾウの時間ネズミの時間：サイズの生物学」、中央公論社、１９９２年８月）という関係から求められる。例えば、マウスの体重を０．０３ｋｇ、ヒトの体重を５０ｋｇとすると、ヒトの時間はマウスの時間より約６．４倍長いので、ヒトの摂取量はマウスの１／６．４ですむという計算になる。また、ＰＰＡＲ活性剤の効果を確実に得るため、投与量は摂取量の２倍量（４０〜１６０ｍｇ／ｋｇ）とした。

Claims (12)

1. ロウロの抽出物を含むことを特徴とするペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤。
2. ビャクビの抽出物を含むことを特徴とするペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤。
3. エンフシの抽出物を含むことを特徴とするペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤。
4. ヤシツジュコンの抽出物を含むことを特徴とするペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤。
5. ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体が、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体αおよびペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γの少なくとも一方である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤。
6. 前記抽出物が、エタノール抽出物またはメタノール抽出物である請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤。
7. 請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤を有効成分として含むメタボリックシンドロームを予防および／または改善する作用を有する組成物。
8. 請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤を有効成分として含む、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、脂肪肝、高血圧からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の症状を予防および／または改善する作用を有する組成物。
9. 飲食用である請求項７または請求項８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 前記ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤の１日の摂取量が体重１ｋｇ当たり２０〜８０ｍｇとなる請求項９に記載の組成物。
11. 医薬用である請求項７または請求項８のいずれか１項に記載の組成物。
12. 前記ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性剤の１日の投与量が体重１ｋｇ当たり４０〜１６０ｍｇとなる請求項１１に記載の組成物。

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