PT1446136E - Composições curcuminóides exibindo inibição sinérgica da expressão e/ou actividade de ciclooxigenase-2 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES CURCUMINÓIDES EXIBINDO INIBIÇÃO SINÉRGICA DA EXPRESSÃO E/OU ACTIVIDADE DE CICLOOXIGENASE-2"

Antecedentes da invenção

Campo da Invenção A presente invenção refere-se, em geral, a uma composição exibindo inibição sinérgica da expressão e/ou actividade de ciclooxigenase-2 (COX-2) indutivel. A composição pode funcionar sinergicamente para inibir a inducibilidade e/ou actividade de ciclooxigenase (COX-2) indutivel, com pouco ou sem efeito significativo sobre a ciclooxigenase constitutiva (COX-1).

Descrição da Técnica Relacionada

As doenças inflamatórias afectam mais de cinquenta milhões de Americanos. Como resultado de investigação básica em imunologia molecular e celular ao longo dos últimos dez a quinze anos, as abordagens ao diagnóstico, tratamento e prevenção destas doenças de base imunológica foram dramaticamente alteradas. Um exemplo disto mesmo é a descoberta de uma forma indutivel da enzima ciclooxigenase. A ciclooxigenase constitutiva (COX), primeiro purificada em 1976 e clonada em 1988, funciona na síntese de prostaglandinas (PG) a partir de ácido araquidónico (AA) . Três anos após a sua purificação, foi identificada uma enzima indutivel com actividade de COX e 1 atribuído o nome COX-2, enquanto a COX constitutiva foi designada COX-1. A expressão génica de COX-2 está sob o controlo de citocinas pró-inflamatórias e factores de crescimento. Deste modo, a inferência é que COX-2 funciona na inflamação e controlo do crescimento celular. Embora COX-2 seja indutível em muitos tecidos, está presente, de modo constitutivo, no cérebro e medula espinal, onde pode funcionar na transmissão nervosa para dor e febre. As duas isoformas de COX são quase idênticas em estrutura mas têm diferenças importantes em substrato e selectividade de inibidor e nas suas localizações intracelulares. PG protectoras, que preservam a integridade do revestimento do estômago e mantêm a função renal normal num rim comprometido, são sintetizadas por COX-1. Por outro lado, PG sintetizadas por COX-2 em células imunitárias são centrais para o processo inflamatório.

Uma formulação ideal para o tratamento da inflamação inibiria a indução e actividade de COX-2, sem afectar a actividade de COX-1. Contudo, os fármacos anti-inflamatórios não esteróides e esteróides convencionais não têm a especificidade de inibição da COX-2 sem afectar a COX-1 e correm o risco de causar lesões no sistema gastrointestinal, quando utilizados durante períodos prolongados.

Numerosos estudos mostraram que a incidência relativa de efeitos secundários gastrointestinais (GI) pode ser correlacionada com a especificidade relativa de COX-2 dos agentes. Quanto maior a especificidade para COX-2 em relação a COX-1, menor a incidência de desarranjo GI. Deste modo, aspirina, com uma especificidade de COX-2 de apenas 0,6, produz 2 uma maior incidência de perturbação GI do que curcuminóides, com uma especificidade de COX-2 referida de quase 3,0. Contudo, a especificidade de COX-2 geralmente aceite como necessária para reduzir significativamente a probabilidade de desarranjo GI é 5,0.

Por conseguinte, seria útil identificar uma composição que inibisse ou prevenisse especificamente a expressão de actividade enzimática de COX-2 tendo, simultaneamente, pouco ou nenhum efeito sobre o metabolismo de COX-1, de modo que estas pudessem ser utilizadas a doses suficientemente baixas ou a doses clinicas actuais, sem efeitos secundários adversos.

Os médicos utilizam, em geral, fármacos anti-inflamatórios não esteróides e esteróides para o tratamento da osteoartrite. Estes fármacos não são, contudo, bem adaptados para terapia de longo prazo, em virtude de não terem apenas a capacidade de promover e proteger a cartilagem; estes podem, na realidade, conduzir à degenerescência da cartilagem ou redução da sua síntese. Além do mais, a maioria dos fármacos anti-inflamatórios não esteróides lesiona o sistema gastrointestinal, quando utilizados durante períodos prolongados. Deste modo, são urgentemente necessários novos tratamentos para a artrite.

As propriedades protectoras das articulações da glucosamina fariam dela um agente terapêutico atractivo para a osteoartrite, à excepção de dois inconvenientes: (i) a velocidade de resposta ao tratamento com glucosamina é mais lenta do que para o tratamento com fármacos anti-inflamatórios e (ii) a glucosamina pode não cumprir a expectativa de remissão degenerativa. Em estudos comparando glucosamina com agentes anti-inflamatórios não esteróides, por exemplo, um estudo com dupla ocultação, 3 comparando 1500 mg de sulfato de glucosamina, por dia, com 1200 mg de ibuprofeno, demonstrou que as pontuações de dor diminuíram mais rapidamente durante as primeiras duas semanas nos doentes com ibuprofeno do que nos doentes tratados com glucosamina. Contudo, a redução em pontuações de dor continuou por todo o período de ensaio em doentes recebendo glucosamina e a diferença entre os dois grupos mudou significativamente a favor de glucosamina na semana oito. Lopes Vaz, A., Double-blind clinicai evaluation of the relative efficacy of ibuprofen and glucosamine sulphate in the management of osteoarthritis of the knee in outpatients, 8 Curr. Med Res Opin. 145-149 (1982) . Deste modo, a glucosamina pode aliviar a dor e inflamação da artrite, mas a uma velocidade mais baixa do que os fármacos anti-inflamatórios disponíveis.

Além disso, as formulações de glucosamina actualmente disponíveis não foram formuladas para atacarem e mitigarem, de um modo óptimo, as causas subjacentes de osteoartrite e artrite reumatóide. Igualmente, como com muitos suplementos herbários e dietéticos comercialmente disponíveis, as formulações disponíveis não têm uma história de utilização, nem testes clínicos controlados, que possam garantir a sua segurança e eficácia.

Uma formulação ideal para a normalização do metabolismo de cartilagem ou tratamento da osteoartrite proporcionaria condroprotecção adequada, com potente actividade anti-inflamatória. O suplemento dietético óptimo para osteoartrite deverá melhorar as qualidades gerais de reconstrução de articulação oferecidas pela glucosamina e atenuar a resposta inflamatória, sem introduzir quaisquer efeitos secundários nocivos. Deverá ser produzido de modo pouco 4 dispendioso e cumprir com todas as regulamentações governamentais.

Sumário da Invenção

Deste modo, seria útil identificar uma formulação natural de compostos que inibisse ou prevenisse especificamente a síntese de prostaglandinas por COX-2, com pouco ou nenhum efeito sobre COX-1. Uma tal formulação, que seria útil para preservar a saúde dos tecidos das articulações, para tratamento de artrite ou outros estados inflamatórios, não foi anteriormente descoberta. 0 termo "inibidor específico ou selectivo de COX-2" abarca compostos ou misturas de compostos que selectivamente inibem COX-2 em relação a COX-1. De um modo preferido, os compostos têm uma concentração eficaz mediana para inibição de COX-2 que é, no mínimo cinco vezes superior à concentração eficaz mediana para a inibição de COX-1. Por exemplo, se a concentração inibitória mediana para COX-2 de uma formulação de teste fosse 0,2 pg/mL, a formulação não seria considerada específica de COX-2, a menos que a concentração inibitória mediana para COX-1 fosse igual ou superior a 1 pg/mL. A invenção proporciona uma composição compreendendo, como um primeiro componente, uma espécie curcuminóide e um segundo composto que pode melhorar sinergicamente o efeito anti-inflamatório do curcuminóide. Mais especificamente, a composição compreende uma quantidade eficaz de um primeiro componente, compreendendo uma espécie curcuminóide e um segundo componente, compreendendo um membro seleccionado do grupo consistindo em tetra-hidroiso-humulona e di-hidroiso-humulona. Numa forma de realização, o curcuminóide é a curcumina. 5

Numa determinada forma de realização, a composição compreende, adicionalmente, um membro seleccionado do grupo consistindo em glucosamina e sulfato de condroitina. A invenção também se refere a um método de tratamento de inflamação ou doenças baseadas em inflamação num animal utilizando a composição da invenção. A invenção também se refere a um método de redução dos sintomas de osteoartrite num animal utilizando a composição da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1[A]—[F] ilustram a estrutura química geral de [A] género curcuminóide e [B], [C], [D], [E] e [F], respectivamente, como curcumina, desmetoxicurcumina, bis(desmetoxi)-curcumina, o isómero geométrico cis-trans de curcumina e ciclocurcumina como espécies dentro desse género.

As Figuras 2 [A] e [B], respectivamente, ilustram as estruturas químicas gerais do género ácido alfa e humulona como uma espécie dentro desse género.

As Figuras 3 [A] e [B], respectivamente, ilustram as estruturas químicas gerais do género ácido beta e lupulona. 6

Descrição Detalhada da Forma Da Realização Preferida

Deve ser notado que, como utilizado nesta memória descritiva e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", e "o" incluem referentes plurais, excepto quando o contexto claramente dita o contrário.

As formas de realização preferidas proporcionam composições tendo um efeito inibitório sinérgico sobre a expressão e/ou actividade de COX-2. De um modo mais particular, a composição compreende, como um primeiro componente, um curcuminóide e, como um segundo componente, um membro seleccionado do grupo consistindo em tetra-hidroiso-humulona e di-hidroiso-humulona, como mais especificamente descritos abaixo. A composição proporcionada pelas formas de realização preferidas pode ser formulada como um suplemento dietético ou composição terapêutica. A composição pode funcionar sinergicamente, para inibir a inducibilidade e/ou actividade de COX-2, sem efeito significativo sobre COX-1.

Como aqui utilizado, o termo "suplemento dietético" refere-se a composições consumidas para afectar alterações estruturais ou funcionais em fisiologia. 0 termo "composição terapêutica" refere-se a quaisquer compostos administrados para tratar ou prevenir uma doença.

Como aqui utilizados, os termos "curcuminóide" e "curcuminóide activo" referem-se a espécies dentro dos géneros curcuminóides que são capazes de inibir a inducibilidade e/ou actividade de COX-2 tendo, simultaneamente, pouco ou nenhum efeito sobre COX-1 ou são capazes de inibir ou reduzir a 7 gravidade de uma resposta inflamatória. 0 curcuminóide pode ser extraido de produtos naturais ou quimicamente sintetizados.

Uma fracção pigmentada amarela isolada dos rizomas de Curcuma longa contém curcuminóides pertencendo ao grupo metano de dicinamoílo. Os curcuminóides estão presentes na extensão de 3 a 5 por cento. São considerados os ingredientes activos mais importantes e acredita-se que sejam responsáveis pela actividade biológica de Curcuma longa. Embora a sua actividade principal seja anti-inflamatória, foi referido que os curcuminóides possuem actividade antioxidante, antialérgica, de cicatrização, antiespasmódica, antibacteriana, antifúngica e igualmente antitumoral. A curcumina (Fig. 1B) foi isolada em 1815 e estruturalmente definida em 1910. Outro curcuminóides isolados de Curcuma longa incluem desmetoxicurcumina (Fig. 1C), bis(desmetoxi)-curcumina (Fig. 1D), um isómero geométrico cis-trans de curcumina (Fig. 1E) e ciclocurcumina (Fig 1F). Os curcuminóides podem encontrar-se em outras espécies botânicas além de Curcuma longa, tais como Curcuma xanthorrhiza e Curcuma zedoaria.

Os curcuminóides são bem conhecidos pela sua actividade anti-inflamatória. O turmérico é um dos fármacos anti-inflamatórios mais antigos utilizados em medicina Ayurvédica. A actividade anti-inflamatória dos curcuminóides foi avaliada em modelos de reacção inflamatória, tais como irritantes químicos ou físicos como carragenina, peletes de algodão, formaldeído e a bolsa de granuloma. Ensaios clínicos humanos, com dupla ocultação, demonstraram eficácia em artrite reumatóide, a uma dose de 1200 mg de curcuminóides/dia, durante cinco a seis semanas. A estas doses, contudo, são frequentemente referidos sinais de desconforto gastrointestinal (GI) e 8 irritação do estômago. 0 desarranjo GI e irritação do estômago, causados por doses elevadas de curcuminóide, podem dever-se ao facto de que os curcuminóides actuam sobre a produção de prostaglandina num modo semelhante àquele da aspirina e agentes anti-inflamatórios semelhantes a aspirina.

De um modo preferido, o género curcuminóide, como representado pela FIG.1[A] e especificamente exemplificado por curcumina na FIG.1[B] é um extracto botânico de grau farmacêutico, tal como pode ser comercialmente obtido, por exemplo, de Sabinsa (121 Ethel Road West, Piscataway, NJ). Outros curcuminóides que podem ser empregues incluem desmetoxicurcumina (FIG 1 [C]), bis(desmetoxi)-curcumina (FIG. 1[D]), uma curcumina cis-trans (Fig 1E) e ciclocurcumina (FIG 1F) . 0 curcuminóide utilizado pode ser facilmente obtido de Curcuma longa L. 0 extracto curcuminóide de grau farmacêutico está padronizado para ter um teor de curcuminóide superior a cerca de 70 por cento. De um modo preferido, o extracto farmacêutico de grau botânico deverá ter passado processos extensos de segurança e eficácia. Como empregue nas formas de realização preferidas, o extracto tem um teor de curcuminóide de cerca de 1 a 99 por cento em peso. De um modo preferido, o teor mínimo de curcuminóide é cerca de 70 por cento em peso. Alternativamente, o curcuminóide pode ser sintetizado utilizando técnicas padrão conhecidas em síntese química.

Como aqui utilizado, o termo "extracto de lúpulo" refere-se ao material sólido resultando da (1) exposição de um produto de planta de lúpulo a um solvente, (2) separação do solvente do produto de planta de lúpulo e (3) eliminação do solvente. 9

Como aqui utilizado, o termo "solvente" refere-se a um liquido de natureza aquosa ou orgânica possuindo as necessárias caracteristicas para extrair material sólido do produto de planta de lúpulo. Exemplos de solventes incluiriam, mas não estão limitados a água, vapor, água superaquecida, metanol, etanol, hexano, clorofórmio, CO2 liquido, N2 liquido ou quaisquer combinações destes materiais.

Como aqui utilizado, o termo "extracto de C02" refere-se ao material sólido resultando de exposição de um produto de planta de lúpulo a uma preparação de C02 líquida ou supercrítica, seguida da remoção do C02.

Como aqui utilizado, o termo "ácidos alfa" refere-se a compostos isolados de produtos de planta de lúpulo incluindo, mas não limitados a humulona, co-humulona, iso-humulona, isopre-humulona, hulupona, ad-humulona, xanto-humol A e xanto-humol B.

Como aqui utilizado, o termo "ácidos beta" refere-se a compostos colectivamente conhecidos como lupulonas incluindo, mas não limitados a lupulona, colupulona, adlupulona, tetra-hidroiso-humulona e hexa-hidrocolupulona.

Como aqui utilizado, o termo "fracção de óleo essencial" refere-se a uma mistura complexa de componentes compreendendo mirceno, humuleno, beta-cariofileno, undecan-2-ona e 2-metil-but-3-en-ol.

Como aqui utilizado, o termo "gorduras" refere-se a ésteres de triacilglicerol de ácidos gordos. 10

Como aqui utilizado, o termo "ceras" refere-se a éteres ou ésteres de triacilglicerol de álcoois ou ácidos gordos de cadeia extremamente longa (>25 carbonos). A extracção de lúpulo, numa forma ou outra, remonta há mais de 150 anos, ao inicio do século dezanove, quando a extracção em água e etanol foi primeiro tentada. Ainda hoje, está disponível na Europa um extracto de etanol mas, de longe, os extractos predominantes são extractos de solvente orgânico (hexano) e extractos de CO2 (supercrítico e líquido). O C02 (tipicamente, a pressão de 60 bar e 5 a 10 °C) está num estado líquido e é um solvente relativamente brando, não polar, altamente específico para resinas moles e óleos de lúpulo. Para lá do ponto crítico, tipicamente à pressão de 300 bar e 60 °C, o C02 tem as propriedades de um gás e de um líquido e é um solvente muito mais forte. Os componentes aproximados dos diversos extractos são comparados na Tabela 1. TABELA 1. Extractos de Lúpulo (percentagem P/P)

Componente Lúpulo Extracto de Solvente Orgânico co2 Supercrítico co2 Líquido Resinas totais 12-20 15-60 75-90 70-95 Ácidos alfa 2-12 8-45 27-55 30-60 Ácidos beta 2-10 8-20 23-33 15-45 Óleos essenciais 0,5-1,5 0-5 1-5 2-10 Resinas duras 2-4 2-10 5-11 Nenhum Taninos 4-10 0,5-5 0,1-5 Nenhum Ceras 1-5 1-20 4-13 0-10 Água 8-12 1-15 1-7 1-5 11

De uma forma simplista, a extracção de lúpulo envolve trituração, formação de pelete e re-trituração do lúpulo de modo a disseminar a lupulina, passagem de um solvente através de uma coluna compactada para recolher os componentes de resina e, finalmente, remoção do solvente de modo a produzir um extracto de resina completo ou "puro".

Os principais extractantes orgânicos são solventes fortes e, além disso a virtualmente todos os componentes de lupulina, estes extraem pigmentos vegetais, ceras cuticulares, água e materiais hidrossolúveis. 0 C02 supercritico é mais selectivo do que os solventes orgânicos e extrai menos dos taninos e ceras e menos água e, por este motivo, componentes hidrossolúveis. Este extrai alguns dos pigmentos vegetais, como clorofila, mas menos do que o fazem os solventes orgânicos. 0 C02 liquido é o solvente mais selectivo comercialmente utilizado para lúpulo e, por este motivo, produz o extracto de resina completa e óleo mais puros. Este não extrai nenhuma das resinas duras ou taninos, niveis muito inferiores de ceras vegetais, nenhuns pigmentos vegetais e menos água e materiais hidrossolúveis.

Como uma consequência desta selectividade e das propriedades de solvente mais brandas, o rendimento absoluto de extracto de C02 liquido por peso de unidade de lúpulo é inferior a quando se utilizam os outros solventes mencionados. Adicionalmente, o rendimento de ácidos alfa com C02 liquido (cerca de 89-93%) é inferior àquele de C02 supercritico (cerca de 91-94%) ou dos solventes orgânicos (cerca de 93-96%) . Após extracção, há o processo de remoção de solvente que, para solventes orgânicos, envolve aquecimento de modo a causar 12 volatilização. Não obstante isto, quantidades vestigiais de solvente permanecem no extracto. A remoção de CO2, contudo, simplesmente envolve uma libertação de pressão, para volatilizar o C02.

Nas formas de realização preferidas, 0 ácido alfa, ácido beta ou seus derivados, pode ser extraído de lúpulo ou quimicamente sintetizado. De um modo preferido, o ácido alfa, ácido beta ou seus derivados, é extraído de lúpulo, de um modo mais preferido, extraído por C02 supercrítico.

De um modo preferido, o género do ácido alfa, como representado por FIG. 2 [A] e especificamente exemplificado por humulona na FIG. 2 [B] e o género do ácido beta, como representado por FIG. 3 [A] e especificamente exemplificado por lupulona (FIG. 3 [B]) é uma preparação de grau farmacêutico, tal como pode ser obtida comercialmente, por exemplo, de Hopunion. (Yakima, WA). A identificação de humulona a partir de extracto de lúpulo como um inibidor de reabsorção óssea é referida em Tobe, H. Et al. 1997. [Bone resorption inhibitors from hop extract. Biosci. Biotech. Biochem 61(1)158-159]. Estudos posteriores pelo mesmo grupo caracterizaram o mecanismo de acção de humulona como inibição de transcrição do gene de COX-2 após estimulação de TNF alfa de células MC3T3 -EI (Yamamoto, K. 2000. Suppression of cyclooxygenase-2 gene transcription by humulon of bee hop extract studied with reference to glucocorticoid. FEBS Letters 465:103-106]. Contudo, estas referências divulgam a utilização de humulona isoladamente para as aplicações de osteoporose e transcrição do gene COX-2. 13

As formas de realização preferidas proporcionam para modificação da molécula curcuminóidepara se alcançar maior eficácia e menor toxicidade e adição de um segundo componente que actua num modo sinérgico. Por conseguinte, formas de realização preferidas relacionam-se com uma descoberta de que, quando se combina um curcuminóide com uma segunda molécula seleccionada do grupo consistindo em um ácido alfa, um ácido beta e seus derivados, a combinação produz um efeito sinérgico numa célula alvo. Uma tal resposta sinérgica seria a inibição especifica de COX-2 indutível.

Espécies representativas dentro de cada género são listadas na Tabela 2. Das espécies listadas em cada género na Tabela 2, aquelas contendo, pelo menos, um asterisco (*) são preferidas e aquelas contendo dois asteriscos (**) são particularmente preferidas . TABELA 2. Componentes de Composição CURCUMINÓIDES ÁCIDOS ALFA ÁCIDOS BETA Curcumina** Humulona** Lupulona** Desmetoxicurcumina** Co-humulona* Colupulona** Bis(desmetoxi)-curcumina** Iso-humulona* Adlupulona* Curcumina cis-trans* Isopre-humulona* Tetra-hidroiso- humulona* Ciclocurcumina* Hulupona* Hexa-hidrocolupulona* Ad-humulona* Di-hidroiso-humulona* Xanto-humulona A* Xanto-humulona B* 14

De um modo preferido, as formas de realização preferidas utilizam curcuminóide activo e ingredientes activos de extracto de lúpulo ou seus derivados. Como aqui utilizados, os termos "curcuminóide activo", "ingrediente activo de extracto de lúpulo' ou seus derivados, referem-se a derivados, de ocorrência natural ou sintéticos, de espécies dentro do âmbito dos respectivos géneros que são capazes de inibirem a inducibilidade e/ou actividade de COX-2 tendo, simultaneamente, pouco ou nenhum efeito sobre COX-1 ou são capazes de inibirem ou reduzirem a gravidade de uma resposta inflamatória. "Conjugados" de curcuminóides, ácidos alfa e beta ou seus derivados, significa curcuminóides, ácidos alfa e ácidos beta covalentemente ligados ou conjugados a um membro seleccionado do grupo consistindo em monossacáridos ou dissacáridos, aminoácidos, sulfatos, succinato, acetato e glutationo. De um modo preferido, o monossacárido ou dissacárido é um membro seleccionado do grupo consistindo em glucose, manose, ribose, galactose, ramnose, arabinose, maltose e frutose. A inibição da actividade da enzima COX-2 por ácidos alfa ou ácidos beta pode proporcionar um duplo efeito sinérgico com curcuminóides. Deste modo, o segundo composto da composição da invenção pode aumentar a actividade anti-inflamatória dos curcuminóides. 0 resultado das composições da invenção é um efeito mais selectivo sobre a actividade de COX-2, a doses inferiores de curcuminóides, do que seria normalmente requerido. Através da diminuição da dose de curcuminóides, para se alcançar a desejada inibição de COX-2, a probabilidade de efeitos secundários deste composto diminui quase exponencialmente. 0 segundo composto da composição pode proporcionar benefícios, 15 tais como, mas não limitados a hepatoprotecção, promoção antitumoral, anti-hiperlipidemia, anti-hiperglicemia e protecção contra formação de úlcera a partir de inibição de COX-1 pelos curcuminóides.

De um modo preferido, uma dose diária (mg/kg-dia) do suplemento dietético preferido seria formulada para distribuir, por kg de peso corporal do animal, cerca de 0,001 a cerca de 30,0 mg de curcuminóides e cerca de 0,5 a cerca de 20,0 mg de ácidos alfa ou ácidos beta. A composição das formas de realização preferidas para aplicação tópica conteria um dos seguintes: cerca de 0,001 a cerca de 1% em peso, de um modo preferido, cerca de 0,01 a cerca de 1% em peso, de curcuminóides e cerca de 0,025 a cerca de 1% em peso, de um modo preferido, cerca de 0,05 a cerca de 1% em peso, de ácidos alfa ou ácidos beta. A composição das formas de realização preferidas produziria concentrações séricas na seguinte gama: cerca de 0,0001 a cerca de 10 μΜ de curcuminóides e cerca de 0,001 a cerca de 10 μΜ de ácidos alfa ou ácidos beta.

Nas formas de realização preferidas, a composição pode adicionalmente compreender glucosamina ou sulfato de condroitina. A glucosamina é, em geral, aceite como sendo eficaz e segura para tratamento de osteoartrite. Por conseguinte, as composições que compreendem, adicionalmente, glucosamina ou sulfato de condroitina podem auxiliar na formalização da função de articulação ou redução dos sintomas de osteoartrite. 16

Além da combinação de curcuminóides e ácidos alfa, tetra-hidroiso-humulona e derivados de di-hidroiso-humulona, a presente composição pode incluir, para aplicação dietética, diversos aditivos, tais como, mas não limitados a outros componentes naturais de metabolismo intermediário, antioxidantes, vitaminas, minerais, proteínas, gorduras, hidratos de carbono e aminoaçúcares, assim como ingredientes inertes, tais como, mas não limitados a talco e estearato de magnésio, que são excipientes padrão na preparação de comprimidos e cápsulas. A composição da invenção pode compreender, adicionalmente, um veiculo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes isotónicos e de retardamento de absorção, adoçantes e semelhantes. Estes veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados a partir de uma ampla gama de materiais incluindo, mas não limitados a diluentes, aglutinantes e adesivos, lubrificantes, desintegrantes, agentes corantes, agentes espessantes, agentes aromatizantes, agentes adoçantes e materiais diversos, tais como tampões e absorventes que podem ser necessários com o fim de preparar uma particular composição terapêutica. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na técnica. Excepto na medida em que quaisquer meios ou agentes convencionais sejam incompatíveis com os ingredientes activos, é contemplada a sua utilização nas formas de realização preferidas. Numa forma de realização, talco e estearato de magnésio são incluídos na formulação. São componentes preferidos pó de talco Astac Brand 400 USP e o grau verdadeiro de estearato de magnésio. Outros ingredientes conhecidos por afectarem a preparação desta composição como uma 17 barra dietética ou alimento funcional podem incluir aromatizantes, açúcares, aminoaçúcares, proteínas e/ou amidos modificados, assim como gorduras e óleos.

Os suplementos dietéticos, loções ou composições terapêuticas das formas de realização preferidas podem ser formulados de qualquer modo conhecido por um especialista na técnica. Numa forma de realização, a composição é formulada numa cápsula ou comprimido utilizando técnicas disponíveis para alguém especialista na técnica. Na forma de cápsula ou comprimido, a dose diária recomendada para um humano ou animal adulto estaria, de um modo preferido, contida em uma a seis cápsulas ou comprimidos. Contudo, as presentes composições também podem ser formuladas em outras formas convenientes, tais como uma solução ou suspensão injectável, uma solução ou suspensão de pulverização, uma loção, goma, pastilha, alimento ou lanche. Itens de alimento, lanche, goma ou pastilha podem incluir quaisquer ingredientes ingeríveis, incluindo adoçantes, aromatizantes, óleos, amidos, proteínas, frutas ou extractos de frutas, vegetais ou extractos de vegetais, cereais, gorduras ou proteínas animais. Deste modo, as presentes composições podem ser formuladas em cereais, itens de alimento, tais como batatas fritas, tabletes, gomas, bombons mastigáveis ou pastilhas de dissolução lenta. A invenção contempla o tratamento de todos os tipos de doenças baseadas em inflamação, tanto agudas como crónicas. A presente formulação reduz a resposta inflamatória e, desse modo, promove a cura ou previne lesão adicional ao tecido afectado. Um veículo farmaceuticamente aceitável também pode ser utilizado nas presentes composições e formulações.

De acordo com as formas de realização preferidas, o animal pode ser um membro seleccionado do grupo consistindo em humanos, 18 primatas não humanos, cães, gatos, aves, cavalos, ruminantes ou outros animais de sangue quente. As formas de realização preferidas são principalmente dirigidas ao tratamento de seres humanos. A administração pode ser por qualquer método disponível para o especialista na técnica, por exemplo, por via oral, tópica, transdérmica, transmucosal ou parentérica. A TABELA 3 abaixo proporciona uma lista de doenças, nas quais a expressão e actividade da enzima COX-2 podem desempenhar um papel e, por conseguinte, são alvos apropriados para normalização ou tratamento pelas composições das formas de realização preferidas. TABELA 3. Doenças Associadas a COX-2 DOENÇA TECIDO Doença de Addison Supra-renal Alergias Células inflamatórias Doença de Alzheimer Células nervosas Artrite Células inflamatórias Aterosclerose Parede de vaso Cancro do cólon Intestino Doença de Crohn Intestino Diabetes (tipo i)/tipo li Pâncreas Eczema Pele/Células inflamatórias Doença de Grave Tiróide Síndrome de Guillain-Barre Células nervosas Doença Inflamatória Intestinal Intestino Leucemia Células imunitárias 19 (continuação) DOENÇA TECIDO Linfornas Células imunitárias Esclerose Múltipla Células nervosas Miastenia Grave Junção neuromuscular Osteoartrite Revestimento de articulação Psoríase Pele Cirrose Biliar Primária Fígado Artrite Reumatóide Revestimento de articulação Tumores Sólidos Diversos Lúpus Eritematoso Sistémico Múltiplos tecidos Uveíte Olho A descoberta de COX-2 tornou possível a concepção de fármacos que reduzem a inflamação, sem remoção das PG protectoras no estômago e rim realizadas por COX-1. As composições da invenção seriam úteis mas não limitadas para o tratamento de inflamação num indivíduo e para tratamento de outros distúrbios associados a inflamação, tais como, como um analgésico no tratamento de dor e dores de cabeça ou como um antipirético para o tratamento de febre. As composições da invenção seriam úteis no tratamento de inflamação em doenças, tais como doenças vasculares, dores de cabeça de enxaqueca, periarterite nodosa, tiroidite, anemia aplástica, doença de Hodgkin, escleroma, febre reumática, diabetes tipo I, miastenia grave, esclerose múltipla, sarcoidose, síndrome nefrótica, síndrome de Behchet, polimiosite, gengivite, hipersensibilidade, inchaço ocorrendo após lesão, isquemia do miocárdio e semelhantes. As composições da invenção são úteis como agentes 20 anti-inflamatórios, com o benefício adicional de terem efeitos secundários significativamente menos nocivos. A composição da invenção também aumenta a velocidade a que glucosamina ou sulfato de condroitina funcionam, de modo a normalizar o movimento de articulação ou reduzir os sintomas de osteoartrite. Por exemplo, pretende-se que as composições da invenção tratem a artrite, incluindo mas não limitada a artrite reumatóide, espondiloartropatias, artrite gotosa, osteoartrite, lúpus eritematoso sistémico e artrite juvenil.

Tais composições da invenção também seriam úteis no tratamento de asma, bronquite, dores menstruais, tendinite, bursite e estados relacionados com a pele, tais como psoríase, eczema, queimaduras e dermatite. As composições da invenção também seriam úteis para tratar estados gastrointestinais, tais como doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, gastrite, síndrome do intestino irritável e colite ulcerativa e para a prevenção ou tratamento de cancro, tal como cancro colorrectal.

As composições da invenção também seriam úteis no tratamento de doenças oftálmicas, tais como retinopatias, conjuntivite, uveite, fotofobia ocular e de lesão aguda do tecido ocular. As composições também seriam úteis no tratamento de inflamação pulmonar, tais como aquelas associadas a infecção virai e fibrose quistica. As composições também seriam úteis para o tratamento de determinados distúrbios do sistema nervoso, tais como demências corticais incluindo doença de Alzheimer. Como inibidores da biossíntese mediada por COX-2 de PGE2, estas composições também seriam úteis no tratamento de rinite alérgica, síndrome de insuficiência respiratória, síndrome de choque de endotoxina, aterosclerose e lesão do sistema nervoso 21 central resultando de acidente vascular cerebral, isquemia e trauma.

Pretende-se que os exemplos sequintes ilustrem a invenção: EXEMPLO 1 (comparativo)

Inibição Sinérglca de Produção de Prostaqlandina E2 em Células B Murinas por Curcuminóide e um Extracto de Lúpulo

Este exemplo ilustra a superior potência inibitória e selectividade de COX-2 da combinação de curcuminóides e extracto de lúpulo das formas de realização preferidas, em comparação com curcuminóides isoladamente.

Inibição de Produção Mediada por Cox-2 de Pge2 em Células RAW 264.7

Equipamento - balança, analítica, Ohaus Explorer (Modelo Ohaus N° EO1140, Suíça), câmara de biossegurança (Modelo Forma N° F1214, Marietta, Ohio), pipetador, 100 a 1000 pL (Catálogo VWR N° 4000-208, Rochester, NI), contador-registrador celular manual (Catálogo VWR N° 23609-102, Rochester, NI), incubadora de CO2 (Modelo Forma N° F3210, Marietta, Ohio), hemacitómetro (Modelo Hausser N° 1492, Horsham, PA), microscópio, invertido (Modelo Leica N° DM IL, Wetzlar, Alemanha), pipetador multicanal, 12 Canais (Catálogo VWR N° 53501-662, Rochester, NI), Auxiliar de Pipeta (Catálogo VWR N° 53498-103, Rochester, NI), Pipetador, 0,5 a 10 pL (Catálogo VWR N° 4000-200,

Rochester, NI), pipetador, 100 a 1000 pL (Catálogo VWR 22 Ν° 4000-208, Rochester, NI), pipetador, 2 a 20 pL (Catálogo VWR N° 4000-202, Rochester, NI), pipetador, 20 a 200 pL (Catálogo VWR N° 4000-204, Rochester, NI), PURELAB Plus Water Polishing System (U.S. Filter, Lowell, MA), frigorífico, 4 °C (Modelo Forma N° F3775, Marietta, Ohio), agitador em vórtice (Catálogo VWR N° 33994-306, Rochester, Ni), banho-maria (Modelo Shel Lab N° 1203, Cornelius, OR). Células, Substâncias Químicas, Reagentes e Tampões

Raspadores de células (Catálogo Corning N° 3008, Corning, NI), dimetilsulfóxido (DMSO) (Catálogo VWR N° 5507, Rochester, NI), Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Catálogo Mediatech N° 10-013-CV, Hemdon, VA), soro bovino fetal, inactivado por

calor (FBS-HI) (Catálogo Mediatech N° 35-011-CV, Hemdon, VA), lipopolissacárido (LPS) (Catálogo Sigma N° L-2654, St. Louis, MO), tubos de microcentrífuga, 1,7 mL (Catálogo VWR

N° 20172-698, Rochester, NI), penicilina/estreptomicina (Catálogo Mediatech N° 30-001-C1, Hemdon, VA), pontas de pipeta para pipetador de 0,5 a 10 pL (Catálogo VWR N° 53509-138, Rochester, NI), pontas de pipeta para pipetador de 100-1000 pL (Catálogo VWR N° 53512-294, Rochester, NI), pontas de pipeta para pipetadores de 2-20 pL e 20-200 pL (Catálogo VWR N° 53512-260, Rochester, NI), pipetas, 10 mL (Catálogo Becton Dickinson N° 7551, Marietta, OH), pipetas, 2 mL (Catálogo Becton

Dickinson N° 7507, Marietta, OH, pipetas, 5 mL (Catálogo Becton

Dickinson N° 7543, Marietta, OH), Células RAW 264.7 (Catálogo American Type Culture Collection N° TIB- -71, Manassas, VA), compostos de teste (extracto de lúpulo de C02 líquido da

Hopunion, Yakima, WA), (curcumina da Sigma (St. Louis, MO) (Produto C 1386), pó de Curcuma longa a 65-70%), placas de cultura de tecidos, 96 poços (Catálogo Becton Dickinson N° 3075, 23

Franklin Lanes, NJ), Água ultrapura (Água desionizada de resistência =18 megaOhm-cm).

Processo Geral - Células RAW 264.7, obtidas de ATCC, foram cultivadas em meio DMEM e mantidas em crescimento de fase log. 0 meio de crescimento dmem foi preparado como se segue: 50 mL de FBS inactivado por calor e 5 mL de penicilina/estreptomicina foram adicionados a uma garrafa de 500 mL de DMEM e armazenado a 4 °C. Este foi aquecido para 37 °C, num banho-maria, antes de utilização e, para melhores resultados, deve ser utilizado no espaço de três meses.

No dia um da experiência, as células 264.7 de fase log foram plaqueadas, a 8 x 104 células por poço, em 0,2 mL de meio de crescimento por poço, numa placa de cultura de tecidos de 96 poços. Depois de 6 a 8 horas após plaqueamento, foram removidos 100 pL de meio de crescimento de cada poço e substituídos com 100 pL de novo meio. Uma solução a 1,0 mg/mL de LPS, que foi utilizada para induzir a expressão de COX-2 nas células RAW 264.7, foi preparada através da dissolução de 1,0 mg de LPS em 1 mL de DMSO. Esta foi misturada até estar dissolvida e armazenada a 4 °C. Imediatamente antes da utilização, esta foi descongelada, à temperatura ambiente, ou num banho-maria a 37 °C.

No dia dois da experiência, os materiais de teste foram preparados como stock a 1000X em DMSO. Por exemplo, se a concentração final do material de teste tivesse que ser 10 pg/mL, era preparado um stock, a 10 mg/mL, através da dissolução de 10 mg do material de teste em 1 mL de DMSO. Foram preparados novos materiais de teste no dia 2 da experiência. Em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL, foi adicionado 1 mL de DMEM 24 sem FBS, de modo a obter-se concentrações de teste de 0,05, 0,10, 0,5 e 1,0 pg/mL. 2 pL do stock de DMSO, a lOOOx, do material de teste foram adicionados ao 1 mL de meio sem FBS. O tubo que continha a concentração final do material de teste foi concentrado 2 vezes. O tubo foi colocado na incubadora, durante 10 minutos, a equilibrar.

Foram removidos cem mL de meio de cada poço das placas celulares preparadas no dia um. Foram adicionados cem mL de concentração final 2x equilibrada dos compostos de teste a células e incubados durante 90 minutos. Foi preparado LPS em DMEM sem FBS, através da adição de 44 pL do stock de DMSO, a 1 mg/mL, a 10 mL de meio. Para cada poço de células a serem estimuladas, foram adicionados 20 pL de LPS (concentração final de LPS é 0,4 pg/mL de LPS). A estimulação de LPS continuou, durante 24 horas, após o que o meio de sobrenadante de cada poço foi transferido para um novo tubo de microcentrifuga, para determinação do teor de PGE2 no meio.

Determinação da Inibição da Enzima Cox-1 por Curcuminóides e Extracto de Lúpulo A capacidade de um material de teste inibir a síntese de COX-1 de PGE2 foi determinada essencialmente como descrito por Noreen, Y., et al. (J. Nat. Prod. 61, 2-7,1998).

Equipamento - balança (2400 g, Acculab VI-2400, Catálogo VWR N° 11237-300, Rochester, Ni), balança, analítica, Ohaus Explorer (Modelo Ohaus N° EO1140, Suíça), câmara de biossegurança (Modelo Forma N° F1214, Marietta, Ohio), Arca congeladora, -30 °C (Modelo Forma N° F3797), Arca congeladora, 25 -80 °C Ultralow (Modelo Forma N° F8516, Marietta, OH), placa de agitação aquecida (Catálogo VWR N° 33918-262, Rochester, NI), gerador de gelo (Modelo Scotsman N° AFE400A-1A, Fairfax, SC), pipetador multicanal, 12 Canais (Catálogo VWR N° 53501-662, Rochester, NI), Pipetador multicanal, 8 Canais (Catálogo VWR N° 53501-660, Rochester, NI), plataforma agitadora orbital (Scienceware N° F37041-0000, Pequannock, NJ), medidor de pH (Catálogo VWR N° 33221-010, Rochester, NI), auxiliar de pipeta (Catálogo VWR N° 53498-103, Rochester, NI), pipetador, 0,5 a 10 pL (Catálogo VWR n° 4000-200, Rochester, Ni), pipetador, 100 a 1000 pL (Catálogo VWR N° 4000-208, Rochester, NI), pipetador, 2 a 20 pL (Catálogo VWR N° 4000-202, Rochester, NI), pipetador, 20 a 200 pL (Catálogo VWR N° 4000-204, Rochester, NI), PURELAB Plus Water Polishing System {U.S. Filter, Lowell, MA), frigorifico, 4 °C (Modelo Forma N° F3775, Marietta, Ohio), câmara de vácuo (Catálogo Sigma N° Z35, 407-4, St. Louis, MO), agitador em vórtice (Catálogo VWR N° 33994-306, Rochester, NI).

Acessórios e Reagentes - placa de fundo redondo de 96 poços (Nalge Nunc N° 267245, Rochester, NI), ácido araquidónico (Catálogo Sigma N° A-3925, St. Louis, MO), tubos de centrífuga, 15 mL, cónicos, estéreis (Catálogo VWR N° 20171-008, Rochester, NI), enzima COX-1 (ovina) 40000 unidades/mg (Catálogo Cayman Chemical N° 60100, Ann Arbor, MI), dimetilsulfóxido (DMSO) (Catálogo VWR N° 5507, Rochester, NI), etanol a 100% (Catálogo VWR N° MK701908, Rochester, NI), epinefrina (Catálogo Sigma N° E-4250, St. Louis, MO), glutationo (reduzido) (Catálogo Sigma N° G-6529, St. Louis, MO), cilindro graduado, 1000 mL (Catálogo VWR N° 24711-364, Rochester, NI), hematina (porcina) (Catálogo Sigma N° H-3281, St. Louis, MO), ácido cloridrico (HC1) (Catálogo VWR N° VW3110-3, Rochester, NI), Papel de Laboratório (Catálogo Kimberly Clark N° 34256, Roswell, GA), tubos de 26 microcentrifuga, 1,7 mL (Catálogo VWR N° 20172-698, Rochester, NI), NaOH (Catálogo Sigma N° S-5881, St. Louis, MO), pontas de pipeta para pipetador de 0,5 a 10 pL (Catálogo VWR N° 53509-138, Rochester, NI), pontas de pipeta para pipetador de 100-1000 pL (Catálogo VWR N° 53512-294, Rochester, NI), pontas de pipeta para pipetadores de 2-20 pL e 20-200 pL (Catálogo VWR N° 53512-260, Rochester, NI), prostaglandina E2 (Catálogo Sigma N° P-5640, St. Louis, MO), prostaglandina F2 alfa (Catálogo Sigma N° P-0424, St. Louis, MO), barra de agitação, magnética (Catálogo VWR N° 58948-193, Rochester, Ni), garrafa de armazenamento, 1000 mL (Catálogo Corning N° 1395-1 L, Corning, NI), garrafa de armazenamento, 100 mL (Catálogo Corning N° 1395-100, Corning, NI), extracto de C02 de lúpulo (Hopunion, Yakima, WA), curcumina (Sigma, St. Louis, MO, (Produto C 1386), pó de Curcuma longa a 65-70%), Tris-HCl (Catálogo Sigma N° T-5941, St. Louis, MO), água ultrapura (Água desionizada de resistência =18 megaOhm-cm).

Processo Geral - Tampão Tris-HCl isento de oxigénio, a 1,0 M (pH 8,0), foi preparado como se segue. Num copo de 1000 mL, 12,11 g de HC1 Trizma foram dissolvidos em 900 mL de água ultrapura. O copo foi colocado numa placa de agitação com uma barra de agitação. Foi adicionado NaOH até o pH atingir 8,0. O volume foi ajustado para um volume final de 1000 mL e armazenado numa garrafa de armazenamento de 1000 mL. O tampão Tris-HCl foi colocado dentro de uma câmara de vácuo com o topo solto e a bomba de ar foi ligada até o tampão parar de borbulhar. A câmara de vácuo foi, depois, desligada e a garrafa de armazenamento bem tapada. Esta etapa foi repetida sempre que foi utilizado o tampão Tris-HCl isento de oxigénio. 27

Um mL de solução de cofactor foi preparada através da adição de 1,3 mg (-) de epinefrina, 0,3 mg de glutationo reduzido e 1,3 mg de hematina a 1 mL de tampão Tris-HCl isento de oxigénio. As soluções do material de teste foram preparadas conforme necessário, i. e., 10 mg de aspirina foram pesados e dissolvidos em 1 mL de DMSO.

As enzimas, i. e., prostaglandina E2 ou prostaglandina F2 alfa, foram dissolvidas em tampão Tris-HCl isento de oxigénio como se segue, i. e., sobre gelo, 6,5 pL de enzima a 40000 unidades/mL foram retirados e adicionados a 643,5 pL de tampão Tris-HCl isento de oxigénio. Esta solução enzimática é suficiente para 60 reacções. A solução enzimática de COX-1 foi preparada como se segue: Num tubo de centrífuga de 15 mL, 10 pL de enzima COX-1, a 40000 unidades/mL, foram adicionados a Tris-HCl isento de oxigénio, com 50 pL da solução de cofactor por reacção. A mistura foi incubada sobre gelo durante 5 minutos. Para 60 reacções, 650 pL de enzima foram adicionados em tampão Tris-HCl isento de oxigénio com 3,25 mL de solução de cofactor.

Sessenta microlitros da solução enzimática foram combinados com 20 pL da solução de teste em cada poço de uma placa de 96 poços. As concentrações finais das soluções de teste eram 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 3,12 pg/mL. As placas foram pré-incubadas sobre gelo, durante 10 minutos. Vinte pL de ácido araquidónico (30 pM) foram adicionados e incubados, durante 15 minutos, a 37 °C.

Foi preparado HC1, a dois M, através da diluição de HC1 a 12,1 N numa garrafa de armazenamento de 100 mL. Foram adicionados 83,5 mL de água ultrapura e, depois, forram 28 adicionados 16,5 mL de HC1 a 12,1 N. Este foi armazenado numa garrafa de armazenamento de 100 mL na câmara de Biossegurança. A reacção foi terminada através da adição de 10 pL de HC1 a 2 Μ. A solução final foi utilizada como o sobrenadante para o ensaio de PGE2.

Determinação de Concentração de PGE2 em Meio O processo seguido foi aquele essencialmente descrito por Hamberg, M. e Samuelsson, B. {J. Biol. Chem. 1971. 246, 6713-6721); contudo, foi empregue um processo comercial, não radioactivo.

Equipamento - arca congeladora, -30 °C (Modelo Forma N° F3797), placa de agitação aquecida (Catálogo VWR N° 33918-262, Rochester, NI), pipetador multicanal, 12 Canais (Catálogo VWR N° 53501-662, Rochester, NI), plataforma agitadora orbital (Scienceware N° F37041-0000, Pequannock, NJ), Auxiliar de Pipeta (Catálogo VWR N° 53498-103, Rochester, NI), pipetador, 0,5 a 10 pL (Catálogo VWR N° 4000-200, Rochester, NI), pipetador. 100 a 1000 pL (Catálogo vwr N° 4000-208, Rochester, NI), pipetador, 2 a 20 pL (Catálogo VWR N° 4000-202, Rochester, NI) , pipetador, 20 a 200 pL (Catálogo VWR N 0 4000-204 , Rochester, NI) , leitor de placas (Modelo Bio-tek Instruments N° Elx800, Winooski, VT), PURELAB Plus Water Polishing System (U.S. Filter, Lowell, MA), frigorifico, 4 °C (Modelo Forma N° F3775, Marietta, Ohio).

Substâncias Químicas, Reagentes e Tampões - Kit de Prostaglandina E2 EIA Monoclonal 480 poços (Catálogo Cayman Chemical N° 514010, Ann Arbor, MI), tubo de centrífuga, 50 mL, cónico, estéril (Catálogo VWR N° 20171-178, Rochester, NI), Meio 29 de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Catálogo Mediatech N° 10-013-CV, Hemdon, VA), cilindro graduado, 100 mL (Catálogo VWR N° 24711-310, Rochester, NI), Papel de Laboratório (Catálogo Kimberly Clark N° 34256, Roswell, GA), tubos de microcentrifuga, 1,7 mL (Catálogo VWR N° 20172-698, Rochester, NI), penicilina/estreptomicina (Catálogo Mediatech N° 30-001-C1, Hemdon, VA), pontas de pipeta para pipetador de 0,5 a 10 pL (Catálogo VWR N° 53509-138, Rochester, NI), pontas de pipeta para pipetador de 100-1000 pL (Catálogo VWR N° 53512-294, Rochester, Ni), pontas de pipeta para pipetadores de 2-20 pL e 20-200 pL (Catálogo VWR N° 53512-260, Rochester, NI), pipetas, 25 mL (Catálogo Becton Dickinson N° 7551, Marietta, OH), garrafa de armazenamento, 100 mL (Catálogo Corning N° 1395-100, Corning, NI), garrafa de armazenamento, 1000 mL (Catálogo Corning N° 1395-1L, Corning, NI), água ultrapura (Água desionizada de resistência =18 megaOhm-cm).

Processo Geral - Foi preparado tampão EIA através da diluição do conteúdo do Concentrado de Tampão EIA (frasquinho N° 4) com 90 mL de Água ultrapura. O frasquinho N° 4 foi enxaguado várias vezes, de modo a garantir que todos os cristais tinham sido removidos e foi, depois, colocado dentro de uma garrafa de armazenamento de 100 mL e armazenado a 4 °C. O Tampão de Lavagem foi preparado através da diluição de Concentrado de Tampão de Lavagem (frasquinho N° 5) 1:400 com Água ultrapura. 0,5 mL/litro de Tween 20 (frasquinho N° 5a) foi, depois, adicionado (utilizando uma seringa para medição precisa). De modo a preparar um litro de Tampão de Lavagem, adicionar 2,5 mL de Concentrado de Tampão de Lavagem, 0,5 mL de Tween-20 e 997 mL de Água ultrapura. A solução foi armazenada numa garrafa de armazenamento de 1 litro, a 4 °C. 30 0 padrão Prostaglandina E2 foi reconstituído como se segue. Uma ponta de pipeta de 200 pL foi equilibrada através do enchimento e expulsão repetidos da ponta várias vezes em etanol. A ponta foi utilizada para transferir 100 pL do Padrão PGE2 (frasquinho N° 3) para dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. 900 pL de água Ultra-pure foram adicionados ao tubo e armazenado a 4 °C, que era estável durante ~6 semanas. O marcador acetilcolinesterase de prostaglandina E2 foi reconstituído como se segue. 100 pL de marcador de PGE2 (frasquinho N° 2) foram misturados com 30 mL do Tampão EIA num tubo de centrífuga de 50 mL e armazenado a 4 °C. O anticorpo monoclonal de Prostaglandina E2 foi reconstituído como se segue. 100 pL de Anticorpo de PGE2 (frasquinho N0 1) foram misturados com 30 mL do tampão EIA num tubo de centrífuga de 50 mL e armazenado a 4 °C. DMEM com penicilina/estreptomicina foi preparado através da adição de 5 mL de penicilina/estreptomicina a 500 mL de DMEM e armazenado a 4 °C.

As placas foram estabelecidas como se segue: Cada placa continha um mínimo de dois brancos (B), dois poços de ligação não específica (NSB), dois poços de ligação máxima (B0) e uma curva-padrão de oito pontos corrida em duplicado (S1-S8). Cada amostra foi ensaiada um mínimo de duas diluições e cada diluição foi corrida em duplicado. O padrão foi preparado como se segue: Oito tubos de microcentrífuga de 1,7 mL foram rotulados como tubos 1-8. 900 pL de DMEM foram adicionados ao tubo 1 e 500 pL de DMEM aos tubos 31 2-8. 100 pL do padrão PGE2 foram adicionados ao tubo 1 e misturados. Quinhentos mL de solução foram retirados do tubo 1 e colocados dentro do tubo 2 e este processo foi repetido até ao tubo 8.

Cinquenta mL de Tampão EIA e 50 pL de DMEM foram adicionados aos poços NSB. Cinquenta pL de DMEM foram adicionados aos poços B0. Foram retirados cinquenta mL de solução do tubo N° 8 e adicionados a ambos os poços de padrão mais baixo (S8) . Foram retirados cinquenta mL do tubo N° 7 e adicionados a cada um dos dois poços seguintes. Isto continuou até ao tubo N° 1. (Foi utilizada a mesma ponta de pipeta para todos os 8 padrões, assegurando o equilíbrio da ponta em cada novo padrão, através da pipetagem para cima e baixo nesse padrão). Utilizando um P200, foram adicionados 50 pL de cada amostra a cada diluição aos poços das amostras.

Utilizando um pipetador de 12 canais, foram adicionados 50 pL do marcador acetilcolinesterase de Prostaglandina E2 a cada poço, excepto os poços de Actividade Total (TA) e o Branco (B) . Utilizando um pipetador de 12 canais, foram adicionados 50 pL do anticorpo monoclonal de Prostaglandina E2 a cada poço, excepto os poços de Actividade Total (TA), o (NSB) e o Branco (B) . A placa foi tapada com filme plástico (item N° 7) e incubada, durante 18 horas, a 4 °C.

As placas foram desenvolvidas como se segue: um frasquinho de 100 pL de Reagente de Ellman (frasquinho N° 8) foi reconstituído com 50 mL de Água ultrapura num tubo de centrífuga de 50 mL. Este foi protegido da luz e utilizado no mesmo dia. Os poços foram lavados e enxaguados cinco vezes com Tampão de Lavagem utilizando um pipetador de 12 canais. Duzentos mL de 32

Reagente de Ellman foram adicionados a cada poço utilizando um pipetador de 12 canais e 5 pL de Marcador para os poços de actividade total (TA) foram, depois, adicionados a cada poço utilizando uma pipeta PIO. A placa foi tapada com um filme plástico e colocada num agitador orbital, no escuro, durante 60-90 minutos. A placa foi lida no leitor de placas Bio-tek a um único comprimento de onda entre 405 e 420 nm. Antes da leitura de cada placa, o fundo foi limpo com um papel de laboratório. A placa deve ser lida quando a absorvência dos poços for na gama de 0,3-0,8 A.U. Se a absorvência dos poços exceder 1,5, estes foram lavados e foi adicionado novo Reagente de Ellman e, depois, re-revelados. Cálculo de sinergia e índice de combinação A sinergia entre os curcuminóides e andrografolida foi avaliada utilizando CalcuSyn (BIOSOFT, biosoft.com). Este pacote estatístico realiza múltiplos cálculos de dose-efeito de fármaco, utilizando os métodos Median Effect descritos por T-C Chou e P. Talaly (Trends Pharmacol. Sei. 4:450-454), aqui incorporado por referência.

Resumidamente, este correlaciona a "Dose" e o "Efeito" na forma mais simples possível: fa/fu = (C/Cm)m, onde C é a concentração ou dose do composto e Cm é a dose mediana eficaz, significando a potência. Cm é determinado a partir da intercepção x do gráfico de efeito mediano. A fraeção afectada pela concentração do material de teste é fa e a fraeção não afectada pela concentração é fu (fu = 1 - fa) . 0 exponente m é 33 o parâmetro significando a sigmoidicidade ou forma da curva dose-efeito. Este é estimado pelo declive do gráfico mediana-efeito. 0 gráfico mediana-efeito é uma representação gráfica de x= log(C) vs y = log(fa/fu) e é baseado na forma logarítmica da equação mediana-efeito de Chou. A adequação do ajuste para os dados para a equação mediana-efeito é representada pelo coeficiente de correlação linear, r, da representação gráfica mediana-efeito. Habitualmente, os dados experimentais dos sistemas de enzima ou receptor têm um r > 0,96, de cultura de tecidos um r > 0,90 e de sistemas animais um r > 0,85. A sinergia dos componentes de teste é quantificada utilizando o parâmetro índice de combinação (Cl) O Cl de Chou-Talaly é baseado no efeito de múltiplos fármacos e é derivado de modelos cinéticos enzimáticos (Chou, T.-C. e

Talalay, P. (1977) A simple generalized equation for the analysis of multiple ínhíbítíons of Michaelis-Menten kinetic Systems. J. Bíol. Chem. 252:6438-6442). A equação determina apenas o efeito aditivo, em vez de sinergismo ou antagonismo. Contudo, o sinergismo é definido como um efeito aditivo mais do que esperado e antagonismo como um efeito aditivo menos do que esperado, como proposto por Cho e Talalay em 1983 (Trends

Pharmacol. Sei. (1983) 4:450-454). Utilizando a designação de

Cl = 1 como o efeito aditivo, obtém-se para compostos mutuamente exclusivos que têm o mesmo modo de acção ou para fármacos não mutuamente exclusivos que têm modos de acção totalmente independentes das seguintes relações: Cl < 1, = 1, e > 1 indicando sinergismo, aditividade e antagonismo, respectivamente. 34 inibitórias medianas

Concentrações combinações de dois componentes relação: esperadas das foram estimadas utilizando a [I/IC50 Esperado] = [A/IC50 de A] + [B/IC50 de B] onde A = fracção molar de componente A na combinação e B = a fracção molar de componente B na combinação. A TABELA 4 ilustra as concentrações inibitórias medianas observadas e esperadas para curcumina e extracto de lúpulo, para produção de PGE2 por COX-2 no ensaio de células RAW 264.7. Embora o IC50 esperado para a combinação 10:1 de curcumina e extracto de lúpulo fosse 1,6 pg/mL, o valor observado foi 0,77 pg/mL ou 2 vezes maior. Este nivel de diferença foi inesperado e constitui uma nova verificação para a actividade inibitória combinada de COX-2 da combinação 1:10 de curcumina e extracto de lúpulo. TABELA 4. Concentrações Inibitórias Medianas Observadas e Esperadas para uma Formulação (10:1) de Curcumina e Extracto de Lúpulo

Composição Razão IC50 (pg/mL) Extracto de Lúpulo 0, 216 Curcumina 4,5 Combinada Contribuição de Extracto de Lúpulo 1 0, 071 Contribuição de Curcumina 10 0, 715 Observada 0, 786 Calculada 1, 605 35 A análise estatística da inibição da produção de COX-2 de PGE2 no modelo de células RAW 264.7 para a combinação 1:10 de curcumina e extracto de lúpulo é apresentada na TABELA 5. O Cl para esta combinação foi 0,490, 0,472 e 0,454, respectivamente, para o lC5o, IC75 e lCg0. Estes valores de Cl indicam forte sinergia entre curcumina e extracto de lúpulo ao longo da curva de dose-resposta completa. TABELA 5. índice de Combinação para uma Formulação 1:10 de Curcumina e Extracto de Lúpulo índice de Combinação Cl Médio IC50 IC75 IC90 0,490 0,472 0,454 0,472 A concentração inibitória média de COX-2 por curcumina isoladamente no modelo de células RAW 264.7 foi 4,01 yg/mL (TABELA 6) . A inibição da actividade enzimática de COX-1 por curcumina foi um tanto superior, com um IC50 de 10,0 yg/mL. O extracto de lúpulo exibiu um IC50 de inibição de PGE2 por COX-2 de 0,21 yg/mL e um IC50 para inibição da enzima COX-1 estimada a 6,25 yg/mL; a especificidade de COX-2 de curcumina isoladamente foi 2,5 e, para extracto de lúpulo, foi 29,5. Onze formulações de curcumina e extracto de lúpulo exibiram especificidade de COX-2 variando de 48,6 a 11,2, com uma especificidade mediana de COX-2 de 17,4. A totalidade das combinações de curcumina e extracto de lúpulo demonstrou, inesperadamente, especificidade de COX-2 superior ao nominal 5,0, sugerido como o mínimo para produtos farmacêuticos concebidos para limitarem a produção de PGE2 especificamente através de inibição de COX-2. Esta 36 verificação indica que as combinações de curcumina e um extracto de lúpulo poderiam funcionar como potentes formulações anti-inflamatórias, sem os efeitos secundários de Gl verificados com inibição de COX-1. TABELA 6. Especificidade de Cox-2 para Curcumina, Extracto de Lúpulo e onze Formulações de Curcumina e Extracto de Lúpulo

Extracto de Lúpulo Curcumina [x:y] Extracto de Lúpulo [%] Curcumina [%] IC50 de COX-1 [pg/mL] IC50 de COX-2 [pg/mL] COX-1 COX-2 100 0 6,25 0,212 29,5 [10:1] 91 9 6,471 0,186 34,8 [8:1] 89 11 6,522 0,426 15,3 [6:1] 86 14 6,604 0,590 11,2 [4:1] 80 20 6,757 0,389 17,4 [2:1] 67 33 7,143 0,147 48,6 [1:1] 50 50 7,692 0,452 17,0 [1:2] 33 67 8,333 0,332 25,1 [1:4] 20 80 8,929 0,377 23, 7 [1:6] 14 86 9,211 0,449 20, 5 [1:8] 11 89 9,375 0,563 16,7 [1:10] 9 91 9,483 0, 786 12,1 0 100 10, 0 4,01 2, 5 37 EXEMPLO 2

Normalização de Funcionamento de Articulação Após Trauma

Uma composição representativa da presente invenção como um suplemento dietético seria numa formulação oral, í. e., comprimidos, que proporcionaria uma das seguintes combinações: (a) 15 mg de curcuminóide/kg por dia e 6,0 mg de humulona/kg por dia; (b) 15 mg de curcuminóide/kg por dia e 6,0 mg de lupulonas/kg por dia; (c) 15 mg de curcuminóide/kg por dia e 6,0 mg de di -hidroiso-humulonas/kg por dia. A normalização do movimento de articulação após trauma físico, em virtude de exercício ou stress de movimento repetitivo, seria esperado que ocorresse após duas a dez doses. Este resultado seria esperado em todos os animais. EXEMPLO 3 (comparativo)

Eficácia Clínica de Formulações de Loção no Tratamento de Acne Rosácea

Uma loção concebida para conter um dos seguintes: (a) curcuminóides a 0,1% em peso e humulona a 0,5%; ou (b) curcuminóides a 0,1% em peso e lumulona a 0,5% é aplicado em áreas afectadas de doentes que tenham exibido acne rosácea, como diagnosticada pelos seus profissionais de saúde e confirmada por um dermatologista independente certificado pela administração. Testes de auto-avaliação são administrados uma semana antes do estudo, para quantificar a área de superfície afectada e vermelhidão. Adicionalmente, variáveis semelhantes são pontuadas pelo pessoal clínico profissional não consciente do estado de 38 tratamento dos doentes. Estas avaliações são repetidas nos Dias 0, 7, 14 e 21.

Os doentes são aleatoriamente atribuídos à formulação de teste ou placebo no início do estudo. A formulação de teste e o placebo são aplicados à área afectada, uma ou duas vezes por dia. Durante o estudo, é permitido o tratamento para estados de saúde, tais como diabetes, hipertensão, etc. As pontuações são estatisticamente comparadas entre a formulação de teste e o placebo para cada um dos quatro períodos observacionais. Os doentes tratados com a composição da presente invenção numa formulação de loção são considerados melhorados se as pontuações dos doentes melhoram em mais de 20%, a partir das pontuações do pré-teste dentro de cada categoria avaliada. A percentagem de pessoas exibindo melhoramento é comparada entre as formulações de combinação e o controlo de placebo. A diferença entre os dois grupos é considerada estatisticamente significativa se a probabilidade de rejeição da hipótese nula quando verdadeira for inferior a cinco por cento. EXEMPLO 4 (comparativo)

Eficácia Clínica de Formulação de Loção no Tratamento de Psoríase

Este exemplo é realizado do mesmo modo como descrito no Exemplo 3, com a excepção de que a composição é aplicada a áreas afectadas de doentes que tenham exibido psoríase, como diagnosticada pelo seu próprio médico e confirmada por um dermatologista independente certificado pela administração. Testes de auto-avaliação são administrados uma semana antes do 39 estudo, para quantificar a área de superfície afectada e estado da pele. Adicionalmente, variáveis semelhantes são pontuadas pelo pessoal clínico profissional não consciente do estado de tratamento dos doentes. Estas avaliações são repetidas nos Dias 0, 7, 30 e 60.

Os doentes são aleatoriamente atribuídos à formulação de teste ou placebo no início do estudo. A formulação de teste e o placebo são aplicados à área afectada, uma ou duas vezes por dia. Durante o estudo, é permitido o tratamento para estados de saúde, tais como diabetes, hipertensão, etc. As pontuações são estatisticamente comparadas entre a formulação de teste e o placebo para cada um dos quatro períodos observacionais. Os doentes tratados com a composição da presente invenção como a formulação de loção de teste são considerados melhorados se as pontuações dos doentes melhoram em mais de 20%, a partir das pontuações do pré-teste dentro de cada cateqoria avaliada. A percentagem de pessoas exibindo melhoramento é comparada entre a formulação de teste e o controlo de placebo. A diferença entre os dois grupos é considerada estatisticamente significativa se a probabilidade de rejeição da hipótese nula quando verdadeira for inferior a cinco por cento. EXEMPLO 5

Eficácia Clínica de uma Formulação no Tratamento da Doença de Alzheimer

Uma formulação oral, como descrita no Exemplo 2, é administrada a doentes que tenham manifestado uma fase inicial da doença de Alzheimer (AD), como diagnosticada pelo seu médico 40 e confirmada por um neurologista independente certificado pela administração. Duas semanas antes do ensaio clinico, os doentes são submetidos a testes psiconeurológicos apropriados, tais como o Mini-Exame do Estado Mental (MMSE), a Escala de Avaliação da Doença de Alzheimer (ADAS), o Teste de Nomeação de Boston (BNT) e o Teste Simbólico (TT). Testes neuropsicológicos são repetidos no Dia 0, 6 semanas e 3 meses do ensaio clinico. Os testes são realizados por neuropsicólogos que não estão conscientes do regime de tratamento do doente.

Os doentes são aleatoriamente atribuídos à formulação de teste ou placebo no início do estudo. A formulação de teste e placebo são tomados oralmente, uma ou duas vezes por dia. Durante o estudo, é permitido o tratamento para estados, tais como diabetes, hipertensão, etc. As pontuações são estatisticamente comparadas entre a formulação de teste e o placebo para cada um dos três períodos observacionais. Sem tratamento, o curso natural da AD é a deterioração significativa nas pontuações de teste durante o decurso do ensaio clínico. Os doentes tratados com a composição da presente invenção, como com a formulação de teste, são considerados melhorados se as pontuações dos doentes permanecerem as mesmas ou melhorarem durante o decurso do ensaio clínico. EXEMPLO 6

Formulação Oral no Tratamento e Prevenção do Cancro do Cólon

Uma formulação oral, como descrita no Exemplo 2, é administrada a doentes que tenham manifestado uma fase inicial 41 do cancro do cólon, como diagnosticado pelos seus próprios médicos e confirmado por um oncologista independente certificado pela administração.

Os doentes são aleatoriamente atribuídos à formulação de teste ou um placebo no início do estudo. A formulação de teste e placebo são tomados oralmente, uma ou duas vezes por dia. Durante o estudo, é permitido o tratamento para estados, tais como diabetes, hipertensão, etc. As avaliações endoscópicas são realizadas a um, dois, seis e doze meses. A evidência de reaparecimento do tumor durante qualquer uma das quatro visitas clínicas de seguimento é considerada uma falha de tratamento. A percentagem de falhas de tratamento é comparada entre a formulação de teste e o controlo de placebo. Sob as condições experimentais descritas, é esperado que o material de teste diminua a incidência de tumor, em relação ao grupo de controlo. A diferença entre os dois grupos é considerada estatisticamente significativa se a probabilidade de rejeição da hipótese nula quando verdadeira for inferior a cinco por cento. EXEMPLO 7

Formulação Oral para o Tratamento da Síndrome de Intestino Irritável

Uma formulação oral, como descrita no Exemplo 2, é administrada a doentes que tenham manifestado síndrome de intestino irritável, como diagnosticada pelos seus médicos. 0 funcionamento normal do intestino é restaurado no espaço de 24 horas. 42 EXEMPLO 8

Normalização do Funcionamento de Articulação em Osteoartrite

Utilizando composições descritas no Exemplo 2, a normalização da ancilose da articulação, em virtude de osteoartrite, ocorre após cinco a vinte doses, na presença ou ausência de glucosamina ou sulfato de condroitina. Adicionalmente, a composição não interfere com os efeitos normais de reconstrução da articulação destes dois proteoglicanos constituintes, ao contrário de agentes anti-inflamatórios não esteróides tradicionais.

Resumindo, a invenção refere-se a uma composição para inibição de actividade de COX-2 indutivel e tendo efeito mínimo sobre a actividade de COX-1, a referida composição compreendendo, como um primeiro componente, uma quantidade eficaz de uma espécie curcuminóide e uma quantidade eficaz de um segundo componente, seleccionado do grupo consistindo em tetra-hidroiso-humulona e di-hidroiso-humulona. A espécie curcuminóide é, de um modo preferido, curcumina, desmetoxicurcumina ou bis(desmetoxi)-curcumina. Espécies de ácidos alfa incluem humulona, co-humulona, iso-humulona, isopre-humulona, hulupona, ad-humulona, xanto-humol A ou xanto-humol B. Espécies de ácidos beta incluem lupulona, colupulona, adlupulona, tetra-hidroiso-humulona, hexa-hidrocolupulona ou di-hidroiso-humulona. 0 primeiro ou o segundo componente da presente composição pode ser de grau farmacêutico ou derivado de planta(s) ou extracto(s) de plantas. 0 primeiro ou segundo componente também pode ser conjugado com um composto, tais como monossacáridos ou dissacáridos, 43 aminoácidos, sulfatos, succinatos, acetatos ou glutationo. As composições da invenção podem ser formuladas num veiculo farmaceuticamente aceitável e contêm aditivos, tais como antioxidantes, vitaminas, minerais, proteínas, gorduras, hidratos de carbono, glucosamina, sulfato de condroitina ou aminoaçúcares. A invenção refere-se, ainda, à utilização da composição, de modo a reduzir os sintomas em animais sofrendo de sintomas de inflamação. A composição é formulada numa forma de dosagem, para que a referida administração proporcione de cerca de 0,001 a cerca de 30,0 mg de peso corporal, por dia, de cada espécie curcuminóide e desde cerca de 0,5 a cerca de 20,0 mg/kg de peso corporal por dia, de espécies de ácidos alfa ou espécies de ácidos beta. A composição é administrada numa quantidade suficiente para manter uma concentração sérica de cerca de 0,1 a cerca de 50 μΜ de cada espécie curcuminóide e de cerca de 0,001 a cerca de 50 μΜ de cada espécie de ácido alfa ou espécie de ácido beta. O animal pode ser humano, primatas não humanos, cães, gatos, aves, répteis, anfíbios, cavalos ou ruminantes. A administração pode ser um sistema de distribuição oral, parentérico, tópico, transdérmico ou transmucosal.

As combinações dos componentes da composição podem proporcionar para um efeito anti-inflamatório sinérgico, em resposta a lesão física ou química ou estimulação imunitária anormal, em virtude de um agente biológico ou etiologia desconhecida.

Lisboa, 22 de Dezembro de 2010 44

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo uma quantidade eficaz de um primeiro componente compreendendo uma espécie curcuminóide e um segundo componente compreendendo um membro seleccionado do grupo consistindo em tetra-hidroiso-humulona e di-hidroiso-humulona.
2. 2. Composição da Reivindicação 1, em que o segundo componente é extraído de lúpulo.
3. 3. Composição da Reivindicação 2, em que a extracção é realizada por C02 supercrítico.
4. 4. Composição da Reivindicação 1, em que o curcuminóide é seleccionado do grupo consistindo em curcumina, desmetoxicurcumina, bis(desmetoxi)-curcumina, cis-trans-curcumina e ciclocurcumina.
5. 5. Composição da Reivindicação 4, em que o curcuminóide é curcumina.
6. 6. Composição da Reivindicação 1, em que o primeiro componente é um composto sintético.
7. 7. Composição da Reivindicação 1, em que o segundo componente é um composto sintético.
8. 8. Composição da Reivindicação 1, em que a composição é formulada com um veiculo farmaceuticamente aceitável. 1
9. 9. Composição da Reivindicação 1 compreendendo, ainda, um membro seleccionado do grupo consistindo em glucosamina e sulfato de condroitina.
10. 10. Composição da Reivindicação 1 compreendendo, ainda, um membro seleccionado do grupo consistindo em antioxidantes, vitaminas, minerais, proteinas, gorduras, hidratos de carbono e aminoaçúcares.
11. 11. Composição da Reivindicação 1 para utilização no tratamento de inflamação ou doenças baseadas em inflamação, num animal.
12. 12. Composição da Reivindicação 1 para utilização na redução dos sintomas de osteoartrite num animal.
13. 13. Utilização da composição da Reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para tratamento de inflamação, ou doenças baseadas em inflamação, num animal.
14. 14. Utilização da Reivindicação 13, em que a composição é formulada numa forma de dosagem, de modo a que a administração da referida forma de dosagem proporcione cerca de 0,001 a cerca de 30 mg por kg de peso corporal do animal, por dia, do primeiro componente e cerca de 0,5 a cerca de 20 mg por kg de peso corporal do animal por dia, do segundo componente.
15. 15. Utilização da Reivindicação 13, em que o referido medicamento é para administração por um meio seleccionado do grupo consistindo em distribuição oral, parentérica, tópica, transdérmica e transmucosal. 2
16. 16. Utilização da Reivindicação 15, em que a fórmula de aplicação tópica proporciona cerca de 0,001% a cerca de 1% em peso do primeiro componente e cerca de 0,025% a cerca de 1% em peso, do segundo componente.
17. 17. Utilização da Reivindicação 16, em que a fórmula de aplicação tópica proporciona cerca de 0,01% a cerca de 1% em peso do primeiro componente e cerca de 0,05% a cerca de 1% em peso, do segundo componente.
18. 18. Utilização da composição da Reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para redução dos sintomas de osteoartrite num animal.
19. 19. Utilização da Reivindicação 18, em que a composição compreende, ainda, um membro seleccionado do grupo consistindo em glucosamina e sulfato de condroitina. Lisboa, 22 de Dezembro de 2010 3