KR20040054738A - 시클로옥시게나제-2의 발현 및/또는 활성의 상승 억제를나타내는 쿠르쿠미노이드 조성물 - Google Patents

시클로옥시게나제-2의 발현 및/또는 활성의 상승 억제를나타내는 쿠르쿠미노이드 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물에서 염증성 반응을 억제하는 작용을 하는 신규 제제에 관한 것이다. 상기 제제는 제1 성분으로서 유효량의 쿠르쿠미노이드 종 및 제2 성분으로서 유효량의 알파 산 종 또는 베타 산 종 또는 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 포함한다. 상기 조성물은 생물학적 제제 또는 미지의 생태학에 기인하는 화학적 손상 또는 비정상적인 면역 자극에 반응하는 상승적인 항염증 효과를 제공한다.

Description

시클로옥시게나제-2의 발현 및/또는 활성의 상승 억제를 나타내는 쿠르쿠미노이드 조성물{CURCUMINOID COMPOSITIONS EXHIBITING SYNERGISTIC INHIBITION OF THE EXPRESSION AND/OR ACTIVITY OF CYCLOOXYGENASE-2}
오천만명 이상의 미국인들이 염증성 질환을 앓고 있다. 과거 10년 내지 15년 동안의 분자 및 세포 면역학적 기본 연구 결과, 이들 면역학적으로 기초한 질병들을 진단하고 치료하고 예방하는 방법은 급변하여 왔다. 이의 한 예는 시클로옥시게나제 효소 유도성 형태를 발견한 것이다. 1976년에 최초로 정제되고 1988년에 클로닝된 구성적 시클로옥시게나제(COX)는 아라키돈산(AA)으로부터 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 기능을 한다. 그의 정제후 3년이 경과하고, COX 활성을 갖는 유도성 효소가 동정되었고, COX-2라 명명한 반면, 구성적 COX는 COX-1이라 명명하였다.
COX-2 유전자 발현은 전염증성 시토킨 및 성장 인자의 조절 하에 있다. 따라서, COX-2는 염증 및 세포 성장의 조절 둘 다에 작용한다는 추론이 가능하다. COX-2는 많은 조직에서 유도성인 반면, 그는 구성적으로 뇌 및 척수 내에 존재하는데, 이 곳에서 그는 통증 및 열을 위한 신경 전달에 작용할 수 있다. COX의 2가지 동형태(isoform)는 구조적으로 거의 동일하나, 기질 및 억제 특이성과 그들의 세포내 위치에서 중요한 차이점이 존재한다. 위 내벽의 완전성을 보존하고 타협된 신장에서 정상적인 신장 기능을 유지하는 보호성 PGs는 COX-1에 의해 합성된다. 한편, 면역 세포에서 COX-2에 의해 합성되는 PGs는 염증 과정에 중요하다.
염증을 치료하기 위한 이상적인 제제는 COX-1의 활성에 영향을 미치지 않으면서 COX-2의 유도 및 활성을 억제하는 것이다. 그러나, 종래의 비스테로이드성 및 스테로이드성 항염증제는 COX-1에 영향을 미치지 않으면서 COX-2를 억제하는 특이성의 결여되어 있었으며, 장기간 사용시 위장관 시스템에 손상을 일으킬 수 있다는 위험도 있었다.
여러 연구를 통해 확인된 바에 따르면, 위장관(GI) 부작용의 상대적인 발병률은 상기 제제의 상대적인 COX-2 특이성과 관련되어 있다. COX-1에 비해 COX-2에 대한 특이성이 커지면 커질수록, GI 부조(不調; GI upset)의 발병률은 더 낮아진다. 따라서, COX-2 특이성이 단지 0.6인 아스피린은 보고된 COX-2 특이성의 거의 3.0인 쿠르쿠미노이드 보다 GI 장애의 발병률이 더 크다. 그러나, GI 부조의 가능성을 유의적으로 감소시키기 위해 필요한 일반적으로 허용되는 COX-2 특이성은 5.0 이다.
따라서, 유해 부작용이 없이 현저의 적은 용량 또는 현재의 임상적 용량으로 사용하여 COX-2 효소 활성의 발현을 특이적으로 억제 또는 예방하는 반면, COX-1 대사에 영향을 전혀 미치지 않거나 거의 미치지 않는 조성물을 동정하는 것이 유용하다.
일반적으로 의사들은 골관절염을 치료하기 위해 비스테로이드성 및 스테로이드성 항염증제를 이용한다. 그러나, 이들 약물은 장기간의 치료에 적합하지 않은데, 그 이유는 이들이 연골을 촉진 및 보호할 수 있는 능력이 결여되어 있고; 이들은 실질적으로 연골의 퇴행 또는 연골 합성의 감소를 유도할 수 있기 때문이다. 또한, 대부분의 비스테로이드성 항염증제는 장기간 사용시 위장관 시스템에 손상을 입힌다. 따라서, 관절염에 대한 새로운 치료법이 절실히 요구되고 있다.
글루코사민의 관절 보호 특성은 이를 골관절염의 치료에 사용할 수 있게 하는 중요한 장점임에도 불구하고, 글루코사민은 다음과 같은 두가지 단점을 갖고 있다: (1) 글로코사민 치료에 대한 반응 속도는 항염증제를 이용하는 치료의 반응 속도보다 더 느리며; (2) 글루코사민은 퇴행성 완화의 예상을 충족시키지 못한다. 글루코사민과 비스테로이드성 항 염증제의 비교 연구에서, 예를 들어 1500 mg의 글루코사민 설페이트/일과 1200 mg의 이부프로펜을 비교하는 이중 맹검 연구를 통해 입증된 바와 같이, 글루코사민으로 치료한 환자 보다 이부프로펜 환자에서 초기 2주 동안 통증 스코어가 더 신속하게 감소되었다. 그러나, 통증 스코어의 감소는 글루코사민으로 치료한 환자에서 시험 기간 전체를 통해 계속되었으며, 두 군 사이의 차이는 8주 후에는 클루코사민 쪽이 더 유리한 것으로 나타났다(Lopes Vaz, A.,Double-blind clinical evaluation ofthe relative effcacy of ibuprofen and glucosamine sulphate in the management of osteoarthritis of the knee in outpatients, 8 Curr. Med Res Opin. 145-149 (1982)). 따라서, 글루코사민은 관절염의 통증과 염증을 완화시킬 수 있으나, 사용가능한 항염증제 보다는 속도 면에서 더 느렸다.
또한, 현재 사용가능한 글루코사민 제제는 골관절염 및 류마티스양 관절염의 근본 원인을 최적으로 공격하여 완화시키도록 제형되지는 못했다. 또한, 현재 시판되고 있는 약초 보충물 및 식품 보충물의 경우에도, 가용한 제제는 사용 이력, 조절된 임상 테스트 결과 등을 보유하고 있지 못하여 안정하고 효율적으로 사용하는 것이 불가능하다.
연골 대사의 정상화 또는 골관절염의 치료를 위한 이상적인 제제는 강력한 염증 활성을 보유하면서도 적절한 연골보호 기능을 수행할 수 있어야 한다. 골관절염을 위한 최적의 식품 보충물은 글루코사민에 의해 제공되는 일반적인 관절 재구성 특성을 강화시켜야만 하며 임의의 유해한 부작용 없이 염증 반응을 감소시켜야만 한다. 또한, 염가로 제조할 수 있어야 하며, 모든 정부 규제에 부합되어야만 한다.
본 발명은 일반적으로 유도성 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현 및/또는 활성의 상승적인 억제를 나타내는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 구성적 시클로옥시게나제(COX-1)에 대한 유의적인 영향의 없거나 거의 없는 유도성 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 유도성 및/또는 활성을 상승적으로 억제하는 작용을 할 수 있다.
도 1[A] 내지 1[F]는 [A] 쿠르쿠미노이드 속 및 상기 속 내의 종으로서 각각 쿠르쿠민, 데메톡시쿠르쿠민, 비스데메톡시쿠르쿠민, 비스데메톡시쿠르쿠민, 쿠르쿠민의 시스-트랜스 기하 이성질체 및 시클로쿠르쿠민으로서 [B], [C], [D], [E] 및 [F]의 일반적인 화학식을 예시하는 도면이다.
도 2[A] 및 2[B]는 각각 알파 산 속 및 그 속내의 종으로서 후물론의 일반적인 화학식을 예시하는 도면이다.
도 3[A] 및 3[B]는 각각 상기 베타 산 속 및 루풀론의 일반적인 화학식을 예시하는 도면이다.
발명의 개요
따라서, COX-1에 영향을 전혀 미치지 않거나 거의 미치지 않으면서 COX-2에 의한 프로스타글란딘의 합성을 특이적으로 억제 또는 예방하는 화합물의 천연 제제를 동정하는 것이 바람직하다. 이러한 제제는 건강한 관절 조직의 보호, 관절염 또는 기타 염증 상태의치료에 유용한데, 이전에 보고된 적이 없는 것이다. 본원에 사용한 용어 "특이적인 또는 선택적인 COX-2 억제제"라는 용어는 COX-1 보다는 COX-2를 선택적으로 억제하는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 화합물은 COX-1의 억제에 대한 중간 유효 농도 보다 최소 5배 더 큰 COX-2 억제에 대한 중간 유효 농도를 보유한다. 예를 들어, 테스트 제제의 COX-2에 대한 중간 억제 농도가 0.2 ㎍/ml인 경우, 상기 제제는, COX-1에 대한 중간 억제 농고가 1 ㎍/ml 이상이 아닌 경우, COX-2 특이성인 것으로 간주되지 않는다.
바람직한 구체예는 제1 성분으로서 쿠르쿠미노이드 종 및 상기 쿠르쿠미노이드의 항염증 효과를 상승적으로 증강시킬 수 있는 제2 화합물을 포함한다. 상기 조성물은 쿠르쿠미노이드 종을 포함하는 제1 성분의 유효량과 알파 산, 베타 산, 및 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 포함하는 제2 성분의 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 알파 산은 후물론이다. 다른 구체예에서, 상기 베타 산은 루풀론이다. 다른 구체예에서, 상기 쿠르쿠미노이드는 쿠르쿠민이다.
특정 구체예에서, 상기 조성물은 글루코사민과 콘드로이친 설페이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 더 포함한다.
또한, 바람직한 구체예는 동물에서 염증 또는 염증-기초한 질병을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 쿠르쿠미노이드 종을 포함하는 제1 성분의 유효량 및 알파 산, 베타산 및 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 포함하는 제2 성분의 유효량을 포함하는 조성물을 염증의 징후가 있는 동물에게 제공하는 단계를 포함한다.
또한, 바람직한 구체예는 동물에서 골관절염의 징후를 감소시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 쿠르쿠미노이드 종을 포함하는 제1 성분의 유효량 및 알파 산, 베타산 및 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 포함하는 제2 성분의 유효량을 포함하는 조성물을 염증의 징후가 있는 동물에게 제공하는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
주목해야 할 것은 본원에 사용한 단수 명사는 문맥상 명백히 다르게 해석되는 경우를 제외하곤 관련 복수 명사를 포함하는 의미이다.
바람직한 구체예는 COX-2의 발현 및/또는 활성에 대한 상승적인 억제 효과를 보유하는 조성물을 제공한다. 더 구체적으로, 상기 조성물은 제1 성분으로서 쿠르쿠미노이드 및 제2 성분으로서 구체적으로 후술하는 바와 같이 알파 산, 베타 산 및 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 포함한다. 바람직한 구체예로서 제공되는 상기 조성물은 식품 보충물 또는 치료 조성물로 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 COX-1에 대한 유의적인 영향 없이 COX-2의 유도성 및/또는 활성을 상승적으로 억제하는 기능을 할 수 있다.
본원에 사용한 용어 "식품 보충물"은 생리학에서 구조적 변화 또는 기능적 변화에 영향을 미치기 위해 소비되는 조성물을 의미한다. 본원에 사용한 용어 "치료 조성물"은 질병을 치료하거나 예방하기 위해 투여되는 임의의 화합물을 의미한다.
본원에 사용한 바와 같은 용어 "쿠르쿠미노이드" 및 "활성 쿠르쿠미노이드"는 중증 염증 반응을 억제하거나 감소시킬 수 있거나, 또는 COX-1에 대해 영향을 전혀 미치지 않거나 거의 미치지 않으면서 COX-2의 유도성 및/또는 활성을 억제할 수 있는 쿠르쿠미노이드 속 내의 종을 의미하는 것이다. 상기 쿠르쿠미노이드는 천연 생성물로부터 추출하거나 화학적으로 합성할 수 있다.
쿠르쿠마 롱가(Curcuma longa)의 근경으로부터 분리된 황색으로 착색된 분획은 디신나모일 메탄기에 속하는 쿠르쿠미노이드를 함유한다. 쿠르쿠미노이드는 3 내지 5%의 양으로 존재한다. 이들은 가장 중요한 활성 성분으로 간주되며, 쿠르쿠마 롱가의 생물학적 활성을 담당하는 것으로 생각된다. 그들의 중요한 활성이 항염증성임에도 불구하고, 쿠르쿠미노이드는 산화방지 활성, 항알러지 활성, 상처 치유 활성, 진경 활성, 항균 활성, 항진균 활성 뿐만 아니라 항종양 활성도 보유하는 것으로 보고되어 왔다. 쿠르쿠민(도 1B)은 1815년에 분리되었으며, 1910년에 그 구조가 확인되었다. 쿠르쿠마 롱가로부터 분리된 다른 쿠르쿠미노이드로는 데메톡시쿠르쿠민(도 1C), 비스데메톡시쿠르쿠민(도 1D), 쿠르쿠민의 시스-트랜스 기하 이성질체(도 1E) 및 시클로쿠르쿠민(도 1F)을 들 수 있다. 쿠르쿠미노이드는 쿠르쿠마 롱가 이외에 쿠르쿠마 잔토리자(Curcuma xanthorrhiza) 및 쿠르쿠마 제도아리아(Curcuma zedoaria)와 같은 다른 식물에서도 발견할 수 있다.
쿠르쿠미노이드는 그들의 항염증 활성으로 잘 알려져있다. 투메릭(tumeric)은 아유르베다 의학에서 사용된 가장 오래된 항염증제중 하나이다. 쿠르쿠미노이드의 항염증 활성은 카라기난, 면 펠릿, 포름알데히드 및 육아종 파우치와 같은 화학적 또는 물리적 자극제와 같은 염증 반응 모델에서 평가되어 왔다. 인간을 대상으로 한 이중 맹검 임상 시험으로부터 입증된 바와 같이 5 내지 6주 동안 1200 mg의 쿠르쿠미노이드/일을 투여하면 류마티스양 관절염에 효과가 있었다. 그러나, 상기 용량은 위장관(GI) 장애 및 위 자극을 빈번하게 유발하는 것으로 보고되었다. 높은 용량의 쿠르쿠미노이드에 의해 유발된 GI 부조 및 위 자극은 쿠르쿠미노이드가 아스피린 및 아스피린-유사 항염증제의 방식과 유사한 방식으로 프로스타글란딘 생성에 작용한다는 사실에 기인하는 것일 수 있다.
바람직하게는, 도 1A에 나타내고 도 1B의 쿠르쿠민에 의해 특이적으로 예시된 바와 같은 쿠르쿠미노이드 속은 예를 들어 사빈사(121 Ethel Road West, Piscataway, NJ)로부터 시판되는 것과 같은 약학 등급의 식물 추출물이다. 사용할 수 있는 다른 쿠르쿠미노이드로는 데메톡시쿠르쿠민(도 1C), 비스데메톡시쿠르쿠민(도 1D), 시스-트랜스 쿠르쿠민(도 1E) 및 시클로쿠르쿠민(도 1F)을 들 수 있다. 사용된 쿠르쿠미노이드는 쿠르쿠마 롱가 엘.로부터 용이하게 얻을 수 있다. 약학 등급의 쿠르쿠미노이드 추출물은 표준화되어 약 70% 이상의 쿠르쿠미노이드 함량을 보유한다. 상기 약학 등급의 식물 추출물은 광범위한 안정성과 효능 절차를 거쳐야만 하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서 사용되는 바와 같이, 상기 추출물의 쿠르쿠미노이드 함량은 약 1 내지 99 중량%이다. 바람직하게는, 최소 쿠르쿠미노이드 함량은 약 70 중량%이다. 대안으로, 상기 쿠르쿠미노이드는 화학 합성 분야에 공지된 표준 기법을 이용하여 합성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "호프 추출물"은 (1) 호프 식물 생성물을 용매에 노출시키고, (2) 호프 식품 생성물로부터 용매를 분리하고, (3) 용매를 제거하는 과정을 통해 얻어진 고형 물질을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "용매"는 호프 식물 생성물로부터 고형 물질을 추출하기 위해 필요한 특성을 보유하는 수성 또는 유기 액체를 의미한다. 용매의 예로는 물, 스팀, 과열수, 메탄올, 에탄올, 헥산, 클로로포름, 액체 CO2, 액체 N2또는 이들 물질의 임의 배합물을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용한 용어 "CO2추출물"은 호프 식물 생성물을 액체 또는 초임계 CO2제제에 노출시킨 다음 CO2를 제거함으로써 얻어지는 고형 물질을 의미한다.
본원에 사용한 용어 "알파 산"은 호프 식물 생성물로부터 분리된 화합물을 의미하는데, 그 예로는 후물론, 코후물론, 이소후물론, 이소프리후물론, 훌루폰, 애드후물론, 잔토후몰 A 및 잔토후몰 B를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용한 용어 "베타 산"은 총괄하여 루풀론으로 알려진 화합물을 의미하는데, 그 예로는 루풀론, 코루풀론, 애드루풀론, 테트라히드로이소후물론 및 헥사히드로코루풀론을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용한 용어 "필수 오일 분획"은 미르센, 후물렌, 베타-카리오필린, 운데칸-2-온 및 2-메틸-부트-3-엔-올의 복합 혼합물을 의미한다.
본원에 사용한 용어 "지방"은 지방산의 트리아실글리세롤 에스테르를 의미한다.
본원에 사용한 용어 "왁스"는 매우 긴 사슬(>25 탄소) 지방 알콜 또는 지방산의 트리아실글리세롤 에테르 또는 에스테르를 의미한다.
한 형태 또는 다른 형태의 호프 추출은 150년 전의 19세기 초로 거슬러 올라가는데, 물 및 에탄올 내에서의 추출이 처음으로 시도되었다. 현재, 에탄올 추출은 유럽에서 이루어지고 있으나, 단연 주종의 추출물은 유기 용매 추출물(헥산) 및 CO2추출물(초임계 및 액체)이다. CO2(전형적으로 60 bar의 압력 및 5 내지 10℃의 온도)는 액체 상태로 존재하며, 상대적으로 중성의 비극성 용매이며 호프 연질 수지 및 오일에 매우 특이적이다. 임계점, 전형적으로 300 bar의 압력 및 60℃의 온도 이상에서는, CO2는 기체의 특성과 액체의 특성 둘 다를 보유하며, 훨씬 더 강한 용매이다. 여러가지 추출물의 대략의 성분은 하기 표 1에서 비교하였다.
호프 추출물(%W/W)
성분 호프 유기 용매 추출물 초임계 CO2 액체 CO2
전체 수지 12-20 15-60 75-90 70-95
알파 산 2-12 8-45 27-55 30-60
베타 산 2-10 8-20 23-33 15-45
필수 오일 0.5-1.5 0-5 1-5 2-10
경질 수지 2-4 2-10 5-11 없음
탄닌 4-10 0.5-5 0.1-5 없음
왁스 1-5 1-20 4-13 0-10
물 8-12 1-15 1-7 1-5
단순화하면, 호프 추출은 호프를 밀링, 펠렛팅 및 재밀링하여 루풀린을 살포하고, 충전 컬럼을 통해 용매를 통과시켜 수지 성분을 수집하고, 최종적으로 용매를 제거하여 전체 또는 "순수한" 수지 추출물을 얻는 과정을 포함한다.
주 유기 추출제는 강한 용매이며, 실질적으로 모든 루풀린 이외에 이들은 식물 색소, 큐티클 왁스, 물 및 수용성 물질을 추출한다.
초임계 CO2는 유기 용매 보다 더 선택적이며, 더 적은 탄닌과 왁스 및 더 적은 물과 수용성 성분을 추출한다. 이는 클로로필과 같은 식물 색소의 일부를 추출하지만, 유기 용매 보다는 덜 추출한다. 액체 CO2는 호프를 위해 상업적으로 사용되는 가장 선택적인 용매이며, 따라서 가장 순수한 전체 수지 및 오일 추출물을 생성한다. 이는 경질 수지 또는 탄닌을 전혀 추출하지 않으며, 훨씬 적은 양의 식물 왁스를 추출하며, 식물 색소를 전혀 추출하지 않으며, 적은 양의 물 및 수용성 물질을 추출한다.
이러한 선택성 및 더 온화한 용매 특성으로 인해, 호프의 단위 중량당 액체 CO2추출물의 절대 수율은 언급한 다른 용매를 사용하는 경우 보다 덜하다. 또한, 액체 CO2(약 89-93%)를 이용하는 알파 산의 수율은 초임계 CO2를 이용하는 경우의 수율(약 91-94%) 또는 유기 용매를 이용하는 경우의 수율(약 93-96%)보다 낮다. 추출후, 용매 제거 과정을 수행하는데, 유기 용매는 가열하여 휘발시킨다. 이와 같은 차이에도 불구하고, 미량의 용매가 추출물 내에 잔존하게 된다. 그러나, CO2의 제거는 압력을 감소시켜 CO2를 휘발시키는 간단한 방법으로 수행할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 알파 산, 베타 산 또는 이의 유도체는 호프로부터 추출하거나 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 바람직하게는, 알파 산, 베타 산 또는 이의 유도체는 호프로부터 더 바람직하게는 초임계 CO2에 의해 추출한다.
바람직하게는, 도 2A에 나타내고 도 2B의 후물론에 의해 구체적으로 예시한 바와 같은 알파 산 속 및 도 3A에 나타내고 도 3B의 루풀론에 의해 구체적으로 예시한 바와 같은 베산 산 속은 예를 들어 호푸니온(Yakima, WA)으로부터 시판되는 것과 같은 약학 등급 제제이다.
뼈 재흡수의 억제제로서 호프 추출물로부터 후물론의 동정은 문헌(Tobe, H. 등 1997. Bone resorption Inhibitors from hop extract. Biosci. Biotech. Biochem 61 (1) 158-159.)에 보고되어 있다. 동일 집단에 의해 이루어진 후기 연구는 MC3T3-E1 세포의 TNF-알파 자극후 COX-2 유전자 전사의 억제로서 후물론의 작용 메카니즘의 특성을 규명하였다(Yamamoto, K. 2000. Suppression of COX-2 gene transcription by humulon of bee hop extract studied with reference to glucocorticoid. FEBS Letters 465: 103-106). 그러나, 이들 참고 문헌은 골다공증 및 COX-2 유전자 전사의 적용을 위해 후물론만을 사용하는 것을 개시한 것이다.
바람직한 구체예는 쿠르쿠미노이드 분자를 변형시켜 더 큰 효능과 더 낮은 독성을 얻고, 상승적인 방식으로 작용하는 제2 성분을 첨가하는 것을 포함한다. 따라서, 바람직한 구체예는 쿠르쿠미노이드와 알파 산, 베타 산 및 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 제2 분자를 배합하는 경우, 상기 배합은 표적 세포에서 상승 효과를 생성한다는 발견에 기초한 것이다. 이러한 상승적인 반응은 유도성COX-2의 특이적인 억제이다.
각각의 속내 대표적인 종은 하기 표 2에 요약하였다. 하기 표 2에서 각각의 속 하에 목록화한 종들 중에서, 하나 이상의 별표(*)를 표시한 것이 바람직하며, 두개 이상의 별표(**)를 표시한 것이 특히 바람직하다.
조성물의 성분
쿠르쿠미노이드 알파 산 베타 산
쿠르쿠민** 후물론** 루풀론**
데메톡시쿠르쿠민** 코후물론* 코루풀론*
비스데메톡시쿠르쿠민** 이소후물론* 아드루풀론*
시스-트랜스 쿠르쿠민* 이소프레후물론* 테트라히드로이소후물론*
시클로쿠르쿠민* 후루폰* 헥사히드로코루풀론*
아드후물론* 디히드로-이소후물론*
잔토후물론 A*
잔토후물론 B*
바람직하게는, 바람직한 구체예는 활성 쿠르쿠미노이드 및 호프 추출물의 활성 성분 또는 이의 유도체를 이용한다. 본원에 사용한 용어 "활성 쿠르쿠미노이드", "호프 추출물의 활성 성분" 또는 이의 유도체는 COX-1에 대해 영향을 전혀 미치지 않거나 거의 미치지 않거나 중증 염증 반응을 억제하거나 감소시킬 수 있으면서, COX-2의 유도성 및/또는 활성을 억제할 수 있는 각각의 속의 범위내에서 자연발생하는 종 또는 상기 종의 합성 유도체를 의미한다.
또한, 바람직한 구체예는 쿠르쿠미노이드, 알파 산 및 베타 산 또는 이의 유도체의 컨쥬게이트를 이용할 수도 있다. 쿠르쿠미노이드, 알파 산 및 베타 산 또는 이의 유도체의 "컨쥬게이트"는 모노-사카라이드, 디-사카라이드, 아미노산, 설페이트, 숙시네이트, 아세테이트 및 글루타치온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원에 공유 결합되거나 컨쥬게이트된 쿠르쿠미노이드, 알파 산 및 베타 산을 의미한다. 바람직하게는, 상기 모노-사카라이드 또는 디-사카라이드는 글루코즈, 만노즈, 리보즈, 갈락토즈, 람노즈, 아라비노즈, 말토즈 및 프럭토즈로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원이다.
특정 구체예는 쿠르쿠민 및 후물론과 루풀론으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량을 포함하는 조성물이다.
알파 산 또는 베타 산에 의한 COX-2 효소 활성의 억제는 쿠르쿠미노이드와 이중의 상승 효과를 제공할 수 있다. 따라서, 알파 산 및 베타 산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제2 화합물은 쿠르쿠미노이드의 항염증 활성을 증가시킬 수 있다. 바람직한 구체예의 조성물의 결과는 보통 필요한 쿠르쿠미노이드의 양 보다 더 적은 용량으로 COX-2의 활성에 대한 더 선택적인 효과를 제공한다는 것이다. 소정의 COX-2 억제를 달성하기 위해 쿠르쿠미노이드의 양을 감소시킴으로써, 상기 화합물로부터 유발되는 부작용의 가능성은 거의 지수적으로 감소된다. 알파 산 및 베타 산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제2 화합물은 간보호, 항종양 촉진, 항고지혈, 항고혈당 및 쿠르쿠미노이드에 의한 COX-1 억제에 기인하여 형성된 궤양에 대한 보호와 같은 장점을 제공하는데, 이로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 바람직한 식품 보충물의 일일 용량(mg/kg-일)은 동물 체중 1 kg 당 약 0.001 내지 약 30.0 mg 쿠르쿠미노이드 및 약 0.5 내지 약 20.0 mg 알파 산 또는 베타 산이다.
국소 적용을 위한 바람직한 구체예의 조성물은 하기 성분중 하나를 함유한다: 약 0.001 내지 약 1 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 1 중량%의 쿠르쿠미노이드 및 약 0.025 내지 약 1 중량%, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 1 중량%의 알파 산 또는 베타 산.
바람직한 구체예의 조성물은 다음과 같은 범위의 혈청 농도를 생성한다: 약 0.0001 내지 약 10 μM의 쿠르쿠미노이드 및 약 0.001 내지 약 10 μM 알파 산 또는 베타 산.
바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 글루코사민 또는 콘드로이친 설페이트를 더 포함할 수 있다. 글루코사민은 일반적으로 골관절염 치료를 위한 안정성과 효능을 보유하고 있는 것으로 간주된다. 따라서, 글루코사민 또는 콘드로이친 설페이트를 더 포함하는 조성물은 관절 기능을 정상화시키거나 골관절염의 징후를 감소시키는 데 도움이 될 수 있다.
쿠르쿠미노이드 및 알파 산, 베타 산 또는 이의 유도체의 배합 이외에, 식품에 적용하기 위한 본 발명의 조성물은 다른 천연 중간 대사 성분, 산화방지제, 비타민, 미네랄, 단백질, 지방, 탄수화물 및 아미노슈가(이로 제한되는 것은 아님)와 같은 여러가지 첨가제 뿐만 아니라 정제 및 캡슐의 제조에서 표준 부형제인 탈크 및 마그네슘 스테아레이트(이로 제한되는 것은 아님)와 같은 불활성 성분을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 본원에 사용한 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 등장제 및 흡수 지연제, 감미제 등을 포함한다. 이들 약학적으로 허용가능한 담체는 넓은 범위의 물질로부터 제조될 수 있는데, 그 예로는 희석제, 결합제 및 접착제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 벌크제, 향미제, 감미제 및 기타 물질, 예를 들어 특정 치료 조성물을 제조하기 위해 필요한 버퍼 및 흡수제를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 약학적 활성 물질을 위해 이러한 매질 및 제제의 이용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고, 바람직한 구체예에서 이들의 사용이 고려된다. 한 구체예에서, 탈크 및 마그네슘 스테아레이트가 제제 중에 포함된다. 바람직한 성분은 아스탁 브랜드 400 USP 탈크 분말 및 진정 등급의 마그네슘 스테아레이트이다. 식품 바 또는 기능성 식품으로서 상기 조성물의 제조에 영향을 미치는 것으로 공지된 다른성분으로는 향미제, 슈가, 아미노슈가, 단배질 및/또는 개질된 전분 뿐만 아니라 지방 및 오일을 들 수 있다.
바람직한 구체예의 식품 보충물, 로션 또는 치료 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 방식으로 제형화될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 당업자가 이용할 수 있는 기법에 의해 캡슐 또는 정제로 제형화된다. 캡슐 또는 정제 형태에서, 성장한 인간 또는 동물을 위한 추천 일일 용량은 1개 내지 6개의 캡슐 또는 정제 내에 함유되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 조성물은 다른 유용한 형태, 예를 들어 주사 용액 또는 현탁액, 분무 용액 또는 현탁액, 로션, 검, 로젠지, 식품 또는 스낵을 제형화할 수도 있다. 식품, 스낵, 검 또는 로젠지는 임의의 소화가능한 성분, 예를 들어 감미제, 향미제, 오일, 전분, 단백질, 과일 또는 과일 추출물, 채소 또는 채소 추출물, 그레인, 동물 지방 또는 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 시리얼, 스낵, 예를 들어 칩, 바, 검드로프스, 츄잉 캔디 또는 천천히 용해되는 로젠지로 제형화될 수 있다. 바람직한 구체예는 모든 유형의 염증-기초한 질병의 치료를 고려하는데, 이러한 질병에는 만성 질병 및 급성 질병 모두가 포함된다. 본 발명의 제제는 염증 반응을 감소시킴으로써 환부 조직의 치유를 촉진하며 추가 손상을 예방한다. 또한, 약학적으로 허용가능한 담체는 본 발명의 조성물 및 제제에 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에 따라, 동물은 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 조류, 말, 반추동물 또는 기타 온혈 동물로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원일 수 있다. 바람직한 구체예는 주로 인간의 치료에 관한 것이다. 투여는 당업자가 사용할 수 있는 임의의 방법, 예를 들어 경구 투여, 국소 투여, 경피 투여, 경점막 투여 또는 비경구 투여에 의해 이루어질 수 있다.
하기 표 3은 COX-2 효소 발현 및 활성이 중요한 역할을 수행하여 바람직한 구체예의 조성물에 의한 정상화 또는 치료를 위한 적합한 표적인 질병 목록을 제공한다.
COX-2 관련 질병
질병 조직
애디슨병 부신
앨러지 염증 세포
알츠하이머병 신경 세포
관절염 염증 세포
아테롬성 동맥경화증 혈관 벽
결장암 장
크론병 장
I형/II형 당뇨병 췌장
습진 피부/염증 세포
그레이브스병 갑상선
귈라인-바르 증후군 신경 세포
염증성 장 질환 장
백혈병 면역 세포
림프종 면역 세포
다발성 경화증 신경 세포
중증 근무력증 신경 근 결합 조직
골관절염 관절 내벽
건선 피부
원발성 담즙성 간경변 긴
류마티스양 관절염 관철 내벽
고형 종양 여러가지 조직
전신성 홍반성 루프스 다중 조직
포도막염 눈
COX-2의 발견은 COX-1에 의해 제조된 위 및 신장 내의 보호성 PGs를 제거하지 않고 염증을 감소시키는 약물의 설계를 가능하게 한다. 바람직한 구체예의 조성물은 개체내 염증의 치료 및 염증-관련된 질환, 예를 들어 통증 및 두통 치료에서의 진통, 열병 치료를 위한 해열(이로 제한되는 것은 아님)을 위해 유용하다. 바람직한 구체예의 조성물은 혈관 질병, 편두통, 결절성 동맥주위염, 갑상선염, 재생불량성 빈혈, 호지킨병, 공피증, 류마티스열, I형 당뇨병, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 유육종증, 신증후군, 버켓 증후군, 다발성근염, 치은염, 과민, 손상후 발생하는 종창, 심혈관 빈혈 등과 같은 질병에서 염증을 치료하는 데 유용하다. 바람직한 구체예의 조성물은 항염증제로서 유용하며, 유해한 부작용이 현저하게 적다는 추가적인 잇점을 갖는다.
또한, 바람직한 구체예는 글루코사민 또는 콘드로이친 설페이트가 관절 운동을 정상화시키거나 골관절염의 징후를 감소시키기 위해 작용하는 속도를 증가시키는 물질로 이루어진 조성물을 제공한다. 예를 들어, 바람직한 구체예의 조성물은 관절염, 예를 들어 류마티스양 관절염, 척추관절증, 통풍성 관절염, 골관절염, 전신성 홍반성 루프스 및 소아 관절염(이로 제한되는 것은 아님)을 치료하는 데 유용하다.
또한, 바람직한 구체예의 상기한 바와 같은 조성물은 천식, 기관지염, 월경 곤란증, 건염, 활액낭염 및 피부 관련 질환, 예를 들어 건선, 습진, 화상 및 피부염의 치료에 유용하다. 또한, 바람직한 구체예의 조성물은 위장관 질환, 예를 들어 염증성 장 질환, 크론병, 위염, 염증성 장 증후군 및 궤양성 결장염의 치료에 유용하며, 결장직장암과 같은 암의 예방 또는 치료에 유용하다.
또한, 바람직한 구체예의 조성물은 안질환, 예를 들어 망막증, 결막염, 포도막염, 광선공포증 및 눈 조직의 급성 손상의 치료에 유용하다. 또한, 상기 화합물은 폐 염증, 예를 들어 바이러스 감염 및 낭포성 섬유증과 관련된 염증의 치료에 유용하다. 또한, 상기 화합물은 알츠하이머병을 포함하는 대뇌피질성 치매와 같은 특정 중추신경계 장애의 치료에 유용하다. PGE2의 COX-2 매개된 생합성의 억제제로서, 이들 조성물은 알러지성 비염, 호흡 장애 증후군, 내독소 쇼크 증후군, 아테롬성 경화증 및 발작, 빈형 및 외상에 기인한 중추신경계 손상의 치료에 유용하다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 바람직한 구체예를 제시할 목적으로 기술하는 것이며, 어떤 형태로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
실시예 1
쿠르쿠미노이드와 호프 추출물에 의한 쥐과동물 B 세포에서 프로스타글란딘 E2 생성의 상승 억제
본 실시예는 쿠르쿠미노이드 단독 사용과 비교하여 바람직한 구체예의 쿠르쿠미노이드와 호프 추출물의 배합물의 뛰어난 COX-2 억제 효능 및 선택성을 예시한다.
RAW 264.7 세포에서 PGE2의 COX-2 매개된 생성의 억제
장비- 평형기, 분석용 오하우스 익스플로러(Ohaus Model #EO1140,Switzerland), 생안정성 캐비넷(Forma Model #F1214, Marietta, Ohio), 피펫터, 100 내지 1000 ㎕(VWR Catalog #4000-208, Rochester, NY), 세포 핸드 톨리 계수기(VWR Catalog #23609-102, Rochester, NY), C02항온처리기(Forma Model #F3210, Marietta, Ohio), 헤마사이토미터(Hausser Model #1492, Horsham, PA), 역상 현미경(Leica Model #DM IL, Wetzlar, Germany), 다중 채널 피펫터, 12-채널 (VWR Catalog #53501-662, Rochester, NY), 피펫 에이드(VWR Catalog #53498-103, Rochester, NY), 피펫턴, 0.5 내지 10 ㎕(VWR Catalog #4000-200, Rochester, NY), 피펫터, 100 내지 1000 ㎕(VWR Catalog #4000-208, Rochester, NY), 피펫터, 2 내지 20 ㎕(VWR Catalog #4000-202, Rochester, NY), 피펫터, 100 내지 1000 ㎕(VWR Catalog #4000-208, Rochester, NY), 피펫터, 2 내지 20 ㎕(VWR Catalog #4000-202, Rochester, NY), 피펫터, 20 내지 200 ㎕(VWR Catalog #4000-204, Rochester, NY) PURELAB 플러스 워터 폴리싱 시스템(U.S. Filter, Lowell, MA), 냉장고,4℃ (Forma Model #F3775, Marietta, Ohio), 볼텍스 믹서(VWR Catalog #33994-306, Rochester, NY), 수조(Shel Lab Model #1203, Cornelius, OR).
세포, 화학물질, 시약 및 버퍼- 세포 스크레이퍼(Corning Catalog #3008, Corning, NY), 디메틸설폭사이드(DMSO)(VWR Catalog #5507, Rochester, NY), 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)(Mediatech Catalog #10-013-CV, Herndon, VA), 태아 소 혈청-열 불활성화됨(FBS-HI)(Mediatech Catalog #35-011-CV, Herndon, VA), 리포폴리사카라이드(LPS)(Sigma Catalog #L-2654, St. Louis, MO), 미세원심분리 튜브, 1.7 ml(VWR Catalog #20172-698, Rochester, NY), 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech Catalog #30-001-CI, Hemdon, VA), 0.5 내지 10 ㎕ 피펫터를 위한 피펫 팁(VWR Catolog #53509-138, Rochester, NY), 100 내지 1000 ㎕ 피펫터를 위한 피펫 팁(VWR Catolog #53512-294, Rochester, NY), 2 내지 20 ㎕ 및 20 내지 200 ㎕ 피펫터를 위한 피펫 팁(VWR Catolog #53512-260, Rochester, NY), 피펫, 10 ml(Becton Dickinson Catalog #7551, Marietta, OH), 피펫 2 ml(Becton Dickinson Catalog #7507, Marietta, OH), 피펫 5 ml(Becton Dickinson Catalog #7543, Marietta, OH), RAW 264.7 세포(American Type Culture Collection Catalog #TIB-71, Manassas, VA), 테스트 화합물(액체 C02호프 추출물; Hopunion, Yakima, WA), (쿠르쿠민; Sigma St. Louis, MO)(Product C 1386), 65-70% 쿠르쿠마 롱가 분말), 조직 배양 플레이트, 96-웰(Becton Dickinson Catalog #3075, Franklin Lanes, NJ), 초고순도수(저항 = 18 megaOhm-cm 탈이온수).
일반 절차- ATCC에서 얻은 RAW 264.7 세포는 DMEM 배지 내에서 성장시키고 로그 증식기 성장 상태에서 유지하였다. 상기 DMEM 성장 배지는 다음과 같이 제조하였다: 열불활성화된 FBS 50 ml 및 페니실린/스트렙토마이신 5 ml를 DMEM 500 ml 병에 첨가하고 4℃에서 저장하였다. 이는 수조 내에서 37℃로 가온한 다음 사용하였으며, 최상의 결과를 얻기 위해서는 3개월 내에 사용하여야 한다.
실험 제1 일에, 로그 증식기의 264.7 세포를 96웰 조직 배양 플레이트 내에 웰당 0.2 ml 성장 배지내에 웰당 8 x 104세포로 플레이팅하였다. 플레이팅한 다음 6 내지 8 시간후, 각각의 웰로부터 성장 배지 100 ㎕를 제거하고 새로운 배지 100㎕로 대체하였다. RAW 264.7 세포중에서 COX-2의 발현을 유도하기 위해 사용된 LPS의 1.0 mg/ml 용액을 DMSO 1 ml중의 LPS 1.0 mg을 용해시켜 제조하였다. 이는 용해될 때까지 혼합하고, 4℃에서 저장하였다. 사용직전에, 이를 실온에서 해동하거나 37℃ 수조에서 해동하였다.
실험 제2 일에, 테스트 물질은 DMSO 중에서 1000X 스톡으로서 제조하였다. 예를 들어, 테스트 물질의 최종 농도가 10 ㎍/ml인 경우, 10 mg/ml 스톡은 DMSO 1ml 중에 테스트 물질 10 mg을 용해시켜 제조하였다. 새로운 테스트 물질은 실험 제2 일에 제조하였다. 1.7 ml 들이 미세원심분리 튜브에, FBS를 함유하지 않는 DMEM 1 ml를 첨가하여 테스트 농도 0.05, 0.10, 0.5 및 1.0 ㎍/ml를 얻었다. 테스트 물질의 1000X DMSO 스톡 2 ㎕를 FBS를 함유하지 않는 배지 1 ml에 첨가하였다. 최종 농드의 테스트 물질을 함유하는 튜브는 2배로 농축하였다. 상기 튜브는 10분 동안 항온처리기 내에 위치시켜 평형처리하였다.
제1 일에 세포 플레이트의 각각의 웰로부터 배지 100 ml를 제거하였다. 평형처리된 2X 최종 농도 테스트 화합물 100 ml를 세포에 첨가하고 90분 동안 항온처리하였다. FBS를 함유하지 않는 DMEM 중의 LPS는 배지 10 ml에 1 mg/ml DMSO 스톡 44 ㎕를 첨가함으로써 제조하였다. 자극하려는 세포가 있는 각각의 웰에 LPS(LPS의 최종 농도 0.4 ㎍/ml LPS) 20 ㎕를 첨가하였다. 배지 내에서 PGE2 함량을 결정하기 위해 각각의 웰로부터 상청액 배지를 깨끗한 미세원심분리 튜브에 이전한 후에 LPS 자극은 24 시간 동안 계속하였다.
쿠르쿠미노이드와 호프 추출물에 의한 COX-1 효소 억제의 측정
PGE2의 COX-1 합성을 억제할 수 있는 테스트 물질의 능력은 문헌(Noreen, Y. 등, J. Nat. Prod. 61, 2-7, 1998)에 기술된 바와 같이 측정하였다.
장비- 평형기(2400 g, Acculab VI-2400, VWR Catalog #11237-300, Rochester, NY), 평형기, 분석용 오하우스 익스플로러(Ohaus Model #EO1140, Switzerland), 생안정성 캐비넷(Forma Model #F1214, Marietta, Ohio), 동결기, -30℃(Forma Model #F3797), 동결기, -80℃ 초저(Forma Model #F8516, Marietta, OH), 가열된 교반 플레이트(VWR Catalog #33918-262, Rochester, NY), 얼음 제조기(Scotsman Model #AFE400A-1A, Fairfax, SC), 다중 채널 피펫터, 12-채널(VWR Catalog #53501-662, Rochester, NY), 다중채널 피펫터, 8-채널(VWR Catalog #53501-660, Rochester, NY), 궤도 진탕기 플랫폼(Scienceware #F37041-0000, Pequannock, NJ), pH 측정기(VWR Catalog #33221-010, Rochester, NY), 피펫 에이드(VWR Catalog #53498-103, Rochester, NY), 피펫터, 0.5 내지 10 ㎕(VWR Catalog #4000-200, Rochester, NY), 피펫터, 100 내지 1000 ㎕(VWR Catalog #4000-208, Rochester, NY), 피펫터, 2 내지 20 ㎕(VWR Catalog #4000-202, Rochester, NY), 피펫터, 20 내지 200 ㎕(VWR Catalog #4000-204, Rochester, NY), PURELAB 플러스 워터 폴리싱 시스템(U.S. Filter, Lowell, MA), 냉장고, 4℃ (FormaModel #F3775, Marietta, Ohio), 진공 챔버(Sigma Catalog #Z35, 407-4, St. Louis, MO), 볼텍스 혼합기(VWR Catalog #33994-306, Rochester, NY).
시약 및 용품- 96-웰 둥근 바닥 플레이트(Nalge Nunc #267245, Rochester, NY), 아라키돈산(Sigma Catalog #A-3925, St. Louis, MO), 원추형의 멸균 원심분리 튜브, 15 ml(VWR Catalog #20171-008, Rochester, NY), COX-1 효소(양) 40,000 유닛/mg(Cayman Chemical Catalog #60100, Ann Arbor,MI), 디메틸설폭사이드(DMSO) (VWR Catalog #5507, Rochester, NY), 에탄올 100%(VWR Catalog #MK701908, Rochester, NY), 에피네프린(Sigma Catalog #E-4250, St. Louis, MO), 글루타치온(환원형)(Sigma Catalog # G-6529, St. Louis, MO), 눈금 실린더, 1000 ml(VWR Catalog #24711-364, Rochester, NY), 헤마틴(돼지)(Sigma Catalog # H-3281, St. Louis, MO), 염산(HCl)(VWR Catalog #VW3110-3, Rochester, NY), 킴와이프스(Kimberly Clark Catalog #34256, Roswell, GA), 미세원심분리 튜브, 1.7 ml(VWR Catalog #20172-698, Rochester, NY), NaOH(Sigma Catalog #S-5881, St. Louis, MO), 0.5 내지 10 ㎕ 피펫터용 피펫 팁(VWR Catolog #53509-138, Rochester, NY), 100 내지 1000 ㎕ 피펫터용 피펫 팁(VWR Catolog #53512-294, Rochester, NY), 2 내지 20 ㎕ 및 20 내지 200 ㎕ 피펫터용 피펫 팁(VWR Catolog #53512-260, Rochester, NY), 프로스타글란딘 E2(Sigma Catalog #P-5640, St. Louis, MO), 프로스타글란딘 F2 알파(Sigma Catalog # P-0424, St. Louis, MO), 자기 교반 막대(VWR Catalog #58948- 193, Rochester, NY), 저장 병, 1000 ml (Corning Catalog #1395-1L, Coming, NY), 저장 병, 100 ml(Corning Catalog #1395-100, Coming, NY), 호프의 C02추출물(Hopunion, Yakima, WA), 쿠르쿠민(Sigma, St. Louis, MO, (Product C 1386), 65-70% 쿠르쿠마 롱가 분말), Tris-HCl(Sigma Catalog #T-5941, St. Louis, MO), 초고순도수(저항 = 18 megaOhm-cm 탈이온수).
일반 절차- 무산소 1.0 M 트리스-HCl 버퍼(pH 8.0)는 다음과 같이 제조하였다. 1000 ml 비이커 내에서, 초고순도수 900 ml 중에 12.11g의 트리즈마 HCl을 용해시켰다. 상기 비이커는 교반 막대가 구비된 교반 플레이트 상에 위치시켰다. pH가 8.0이 될 때까지 NaOH를 첨가하였다. 부피를 조정하여 최종 부피를 1000 ml로 하고, 1000 ml 저장 병에 저장하였다.
트리스-HCl 버퍼는 마개를 느슨하게 한 진공 챔버내에 위치시켰으며, 공기 펌프를 버퍼의 버블링이 정지할 때까지 작동시켰다. 이어서, 진공 펌프를 정지시키고, 저장 병을 완전히 밀봉하였다. 이 단계는 무산소 트리스-HCl 버퍼를 사용하는 경우 마다 반복하였다.
1 ml의 보조 인자 용액은 1 ml의 무산소 트리스-HCl 버퍼에 1.3 mg의 (-) 에피네프린, 0.3 mg의 환원형 글루타치온 및 1.3 mg의 헤마틴을 첨가하여 제조하였다. 테스트 물질의 용액은 필요에 따라 제조하였는데, 즉 10 mg의 아스피린을 평량하고 1 ml의 DMSO에 용해시켰다.
효소, 즉 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 F2 알파는 다음과 같이 무산소 트리스-HCl 버퍼에 용해시켰는데, 즉 얼음상에서, 6.5 ㎕의 효소(40,000 유닛/ml)를 취하고, 643.5 ㎕의 무산소 트리스-HCl 버퍼에 첨가하였다. 상기 효소 용액은 60회의 반응을 위해 충분하였다. COX-1 효소 용액은 다음과 같이 제조하였다: 15 ml의 원심분리 튜브 내에, 10 ㎕의 COX-1 효소(40,000 유닛/ml)를 취하고, 무산소 트리스-HCl 버퍼에 반응당 보조인자 용액 50 ㎕와 함께 첨가하였다. 상기 혼합물은 얼음 상에서 5분 동안 항온처리하였다. 60회 반응을 위해, 650 ㎕의 효과는 3.25 ml의 보조인자 용액과 함께 무산소 트리스-HCl에 첨가하였다.
96 웰 플레이트의 각각의 웰 내에서 상기 효소 용액 60 ㎕와 테스트 용액 20 ㎕를 배합하였다. 테스트 용액의 최종 농도는 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.12 ㎍/ml 였다. 상기 플레이트는 얼음 상에서 10분 동안 미리항온처리하였다. 아라키돈산(30 μM) 20 ㎕를 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 항온처리하였다.
2 M HCl은 100 ml 들이 저장 병 내에서 12.1 N HCl을 희석하여 제조하였다. 초고순도수 83.5 ml를 첨가하고, 이어서 12.1 N HCl 16.5 ml를 첨가하였다. 이는 100 ml 들이 저장병에 저장하고, 생안전 캐비넷 내에 위치시켰다. 반응은 10 ㎕의 2 M HCl을 첨가함으로써 종결시켰다. 최종 용액은 PGE2분석을 위한 상청액으로서 사용하였다.
배지내 PGE2 농도의 측정
하기 절차는 본질적으로 문헌(Hamberg, M. 및 Samuelsson, B., J. Biol. Chem. 1971.246, 6713-6721)에 기술된 절차와 동일하다. 그러나, 상업적으로 이용할 수 있는 비방사성 절차를 사용하였다.
장비- 동결기, -30℃(Forma Model #F3797), 가열된 교반 플레이트(VWR Catalog #33918-262, Rochester, NY), 다중채널 피펫터, 12-채널(VWR Catalog #53501-662, Rochester, NY), 궤도 진탕기 플랫폼(Scienceware #F37041-0000, Pequannock, NJ), 피펫 에이드(VWR Catalog #53498-103, Rochester, NY), 피펫터, 0.5 내지 10 ㎕(VWR Catalog #4000-200, Rochester, NY), 피펫터, 100 내지 1000 ㎕(VWR Catalog #4000-208, Rochester, NY), 피펫터, 2 내지 20 ㎕(VWR Catalog#4000-202, Rochester, NY), 피펫터, 20 내지 200 ㎕(VWR Catalog #4000-204, Rochester, NY), 플레이트 판독기(Bio-tek Instruments Model #ex800, Winooski, VT), PURELAB 플러스 워터 폴리싱 시스템(U.S. Filter,Lowell, MA), 냉장고, 4℃ (Forma Model #F3775, Marietta, Ohio).
화학물질, 시약 및 버퍼- 프로스타글란딘 E2 EIA 키트-모노클로날 480-웰 (Cayman Chemical Catalog # 514010, Ann Arbor,MI), 원추형 멸균 원심분리 튜브, 50 ml(VWR Catalog #20171- 178, Rochester, NY), 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)(Mediatech Catalog #10-013-CV, Herndon, VA), 눈금 실린더, 100 ml (VWR Catalog #24711-310, Rochester, NY), 킴와이프스(Kimberly Clark Catalog #34256, Roswell, GA), 미세원심분리 튜브, 1.7 ml(VWR Catalog #20172-698, Rochester, NY), 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech Catalog #30-001-CI, Herndon, VA), 0.5 내지 10 ㎕ 피펫터용 피펫 팁(VWRCatolog #53509-138, Rochester, NY), pipet tips for 100-1000pL 피펫터 (VWRCatolog #53512-294, Rochester, NY), 2 내지 20 ㎕ 및 20 내지 200 ㎕ 피펫터용 피펫 팁 (VWR Catolog #53512-260, Rochester, NY), 피펫, 25 ml(Becton Dickinson Catalog #7551, Marietta, OH), 저장병, 100 ml(Coming Catalog #1395-100, Corning, NY), 저장 병, 1000 ml(Corning Catalog #1395-1 L, Corning, NY), 초구순도수(저항 = 18 megaOhm-cm 탈이온수).
일반 절차- EIA 버퍼는 EIA 버퍼 농축물의 내용물(바이랄 #4)을 90 ml의 고고순도수로 희석하여 제조하였다. 바이랄 #4는 수회 세정하여 모든 결정이 제거되도록 하였으며, 이어서 100 ml 들이 저장병에 위치시키고 4℃에서 저장하였다.
세척 버퍼는 세척 버퍼 농축액(바이알 #5)을 초고순도수로 1:400 희석함으로써 제조하였다. 이어서, 트윈 20(바이알 #5a) 0.5 ml/l를 첨가하였다(정확한 측정을 위해 주사기를 이용하였음). 세척 버퍼 1 l에 2.5 ml의 세척 버퍼 농축액, 0.5 ml의 트윈 20 및 997 ml의 초고순도수를 첨가하였다. 상기 용액은 1 리터 들이 저장 병 내에서 4℃에서 저장하였다.
프로스타글란딘 E2표준물은 다음과 같이 재구성하였다. 200 ㎕ 피펫 팁은 에탄올 내에서 주입과 배출을 수회 반복하여 평형처리하였다. 상기 팁을 이용하여 PGE2표준물(바이알 #3) 100 ㎕fmf 1.7 ml 들이 미세원심분리 튜브 내에 이전하였다. 900 ㎕의 초고순도수를 상기 튜브에 첨가하고, 4℃에서 저장하였는데, 이는 ∼6주간 안정하였다. 프로스타글란딘 E2아세틸콜린에스테라제 트레이서는 다음과 같이 재구성하였다. 100 ㎕의 PGE2트레이서(바이알 #2)는 50 ml 들이 원심분리 튜브 내에서 EIA 버퍼 30 ml와 혼합하고 4℃에서 저장하였다.
프로스타글란딘 E2모노클로날 항체는 다음과 같이 재구성하였다: 100 ㎕의 PGE2항체(바이알 #1)은 50 ml 들이 원심분리 튜브 내에서 EIA 버퍼 30 ml와 혼합하고, 4℃에서 저장하였다.
페니실린/스트렙토마이신을 보유하는 DMEM은 500 ml의 DMEM내 5 ml의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 제조하고, 4℃에서 저장하였다.
상기 플레이트는 다음과 같이 셋업하였다: 각각의 플레이트는 최소 2개의 블랭크(B), 2개의 비특이성 결합 웰(NSB), 2개의 최대 결합 웰(B0) 및 2회 실시한 8개의 포인트 표준 곡선(S1-S8)을 함유하였다. 각각의 샘플은 최소 2개의 희석물에서 분석하였으며, 각각의 희석은 2회 수행하였다.
표준물은 다음과 같이 제조하였다: 8개의 1.7 ml 들이 미세원심분리 튜브는 튜브 1 내지 8로 표지하였다. 900 ㎕의 DMEM을 튜브 1에 첨가하고, 500 ㎕의 DMEM을 튜브 2 내지 8에 첨가하였다. PGE2표준물 100 ㎕를 튜브 1에 첨가하고 혼합하였다. 500 ml의 용액을 튜브 1로부터 취하고, 튜브 2에 투입하고, 이 과정을 튜브 8까지 반복 수행하였다.
50 ml의 EIA 버퍼 및 50 ㎕의 DMEM은 NSB 웰에 첨가하였다. 50 ㎕의 DMEM은 B0웰에 첨가하였다. 50 ml의 용액을 튜브 8로부터 취하고 가장 낮은 표준물 웰(S8)에 첨가하였다. 이러한 과정은 튜브 1까지 반복하였다. (모두 8개의 표준물에 대해 동일한 피펫 팁을 사용하였는데 상기 표준물 내에서 피펫을 상하로 이동시켜 각각의 새로운 표준물 내에서 피펫 팀을 평형처리하였다)
12 채널 피펫터를 이용하여, 50 ㎕의 프로스타글란딘 E2아세틸콜린에스테라제 트레이서를 각각의 웰에 첨가하였는데, 전체 활성(TA) 웰 및 블랭크(B) 웰에는 첨가하지 않았다. 12 채널 피펫터를 이용하여, 50 ㎕의 프로스타글란딘 E2모노클로날 항체를 각각의 웰에 첨가하였는데, 전체 활성(TA) 웰, (NSB) 웰 및 블랭크(B) 웰에는 첨가하지 않았다. 상기 플레이트는 플라스틱 필름(아이템 #7)로 덮고, 4℃에서 18 시간 동안 항온처리하였다.
상기 플레이트는 다음과 같이 현상하였다: 100 ㎕ 들이 엘만 시약 바이알 한개(바이알 #8)은 50 ml 들이 원심분리 튜브 내의 50 ml의 초고순도수로 재구성하였다. 이는 빛으로부터 보호하였으며 재구성한 날에 사용하였다. 상기 웰은 12 채널 피펫터를 이용하여 세척 버퍼로 5회 세척 및 세정하였다. 200 ml의 엘만 시약을 각각의 웰에 12 채널 피펫터를 이용하여 첨가하고, 5 ㎕의 트레이서를 전체 할성(TA) 웰에 첨가한 후, 각각의 웰에 P10 피펫을 이용하여 첨가하였다. 상기 플레이트는 플라스틱 필름으로 덮고, 암실내의 궤도 진탕기 상에 60-90 분동안 위치시켰다.
상기 플레이트는 405 내지 420 nm 사이의 단일 파장에서 바이오텍 플레이트 판독기에서 판독하였다. 각각의 플레이트를 판독하기 이전에, 바닥은 킴스와이프스로 닦아냈다. 상기 플레이트는 웰의 흡광도가 0.3 내지 0.8 A.U. 범위내에 존재하는 경우에 판독하여야만 한다. 웰의 흡광도가 1.5를 초과하는 경우, 이들은 세척하고, 새로운 엘만 시약을 첨가한 후에 재현상하였다.
상승작용 및 배합 지수의 계산
쿠르쿠미노이드와 안드로그라폴라이드의 상승작용은 CalcuSyn(BIOSOFT, biosoft.com)을 이용하여 평가하였다. 이 통계학적 패키지는 다중 약물 용량-효과 계산을 수행하는데 본원에 참고 인용한 문헌(T-C Chou 및 P.Talaly, Trends Pharmacol. Sci. 4: 450-454)에 기술된 중간 효과 방법을 이용하였다.
개략적으로 설명하면, "용량"과 "효과" 사이에는 가장 단순한 형태의 상관관계가 성립한다: fa/fu = (C/Cm)m(식중, C는 화합물의 농도 또는 용량이고, Cm은 농도를 의미하는 중간 유효 용량이다. Cm은 중간-효과 플롯의 x 절편으로부터 결정하였다. 테스트 물질의 농도에 영향을 받는 분율은 fa이며, 상기 농도에 영향을 받지 않는 분율은 fu이다. 즉, fu = 1 - fa의 관계식이 성립한다. 지수 m은 sigmoidicity 또는 용량-효과 곡선의 형태를 의미하는 매개변수이다. 이는 중간-효과 플롯의 기울기로 추정한다.
중간-효과 플롯은 x=log(C) 대 y=log(fa/fu)의 플롯이며, Chou의 중간-효과 방정식의 로그 형태에 기초한다. 중간-효과 방정식에 대한 데이타를 위한 적합도는 중간-효과 플롯의 선형 상관관계 계수에 의해 나타낸다. 일반적으로, 효소 또는 수용체 시스템으로부터 유래하는 실험 데이타는 r>0.96, 조직으로부터 유래하는 실험 데이타는 r>0.90 및 동물 시스템으로부터 유래하는 실험데이타는 r>0.85를 갖는다.
테스트 화합물의 상승 작용은 배합 지수(CI) 매개변수를 이용하여 정량화된다. Chou-Talaly의 CI는 다중 약물-효과에 기초하며, 효소 반응속도 모델로부터 유도된다(Chou, T. -C. 및 Talalay, P. (1977) A simple generalized equation for the analysis of multiple inhibitions of Michaelis-Menten kinetic systems. J.Biol. Chem. 252: 6438-6442). 상기 방정식은 단지 상승작용이나 길항작용 보다는 추가 효과만을 측정한다. 그러나, 본 발명자들은 문헌(Chou 및 Talalay in 1983, Trends Pharmacol. Sci. (1983) 4: 450-454)에서 제안된 바와 같이 예상된 추가 효과 이상으로서 상승작용을 정의하였으며, 예상된 추가 효과 이하로서 길항작용을 정의하였다. 추가 효과로서 CI=1이라는 정의를 사용함으로써, 본 발명자들은 적으로 독립적인 작용 모드를 보유하는 상호 비배타적인 약물 또는 동일한 작용모드를 보유하는 상호 배타적인 화합물에 대해 하기 관계식을 얻었다: CI < 1, = 1, 및 > 1은 각각 상승작용, 추가작용 및 길항작용을 의미한다.
2-성분 배합물의 예상된 중간 억제 농도는 다음과 같은 관계식으로부터 추정하였다:
[1/예상 IC50] = [A/IC50A] + [B/IC50B]
상기 식 중, A는 배합물내 성분 A의 몰 분율이며, B는 배합물내 성분 B의 몰 분율이다.
하기 표 4는 RAW 264.7 세포 분석에서 COX-2에 의한 PGE2 생성에 대한 쿠르쿠민과 호프 추출물에 대한 관찰 및 추정 중간 억제 농도를 예시한다. 쿠르쿠민관 호프 추출물의 10:1 배합물에 대한 추정 IC50은 1.6 ㎍/ml인 반면, 관찰된 값은 0.77 ㎍/ml 또는 2배 이상 더 컸다. 이러한 레벨의 차이는 예상치못한 것이었으며, 쿠르쿠민과 호프 추출물의 1:10 배합물의 연합 COX-2 억제 활성에 대한 신규한 발견을 구성한다.
쿠르쿠민과 호프 추출물의 (10:1) 제제에 대한 관찰 및 추정 중간 억제 농도
조성물 비 IC50(㎍/ml)
호프 추출물 0.216
쿠르쿠민 4.5
배합
호프 추출물 기여 1 0.071
쿠르쿠민 기여 10 0.715
관찰값 0.786
계산값 1.605
쿠르쿠민과 호프 추출물의 1:10 배합물에 대한 RAW 264.7 세포 모델에서 PGE2의 COX-2 생성 억제의 통계학적 분석은 하기 표 5에 나타냈다. 이러한 배합에 대한 CI는 각각 IC50, IC75및 IC90에 대해 0.490, 0.472 및 0.454였다. 이들 CI 값은 완전 용량 응답 곡선에 걸쳐서 쿠르쿠민과 호프 추출물 사이에 강한 상승 작용을 나타냈다.
쿠르쿠민과 호프 추출물의 1:10 제제에 대한 배합 지수
배합 지수 중간 CI
IC50 IC75 IC90
0.490 0.472 0.454 0.472
RAW 264.7 세포 모델에서 쿠르쿠민 단독에 의한 COX-2의 중간 억제 농도는 4.01 ㎍/ml였다(표 6). 쿠르쿠민에 의한 COX-1 효소 활성의 억제는 IC5010.0 ㎍/ml 보다 다소 높았다. 호프 추출물은 COX-2에 의한 PGE2 억제의 IC50은 0.21 ㎍/ml이며, COX-1 효소 억제에 대한 IC50은 6.25 ㎍/ml로 추정되었으며; 쿠르쿠민 단독의 COX-2 특이성은 2.5 였으며, 호프 추출물의 COX-2 특이성은 29.5 였다. 쿠르쿠민과 호프 추출물로 이루어진 11개의 제제는 48.6 내지 11.2 범위의 COX-2 특이성을 나타냈으며, 중간 COX-2 특이성은 17.4 였다. 쿠르쿠민과 호프 추출물의 모든 배합물은 COX-2의 억제를 통해 PGE2 생성을 특이적으로 제한하기 위해 설계된 약품에 대한 최소값으로서 제안된 공칭 5.0 보다 더 큰 COX-2 특이성을 나타냈으며, 이는 예상치 못한 것이었다. 이러한 발견으로부터 확인할 수 있는 것은 쿠르쿠민과 호프 추출물의 배합물이 COX-1 억제에서 확인되는 GI 부작용 없이 강력한 항염증 제제로서 작용할 수 있다는 것이다.
쿠르쿠민, 호프 추출물 및 쿠르쿠민과 호프 추출물의 11개의 배합물의 COX-2 특이성
호프 추출물:쿠르쿠민[x:y] 호프 추출물[%] 쿠르쿠민[%] COX-1 IC50[㎍/ml] COX-2 IC50[㎍/ml] COX-1/COX-2
100 0 6.25 0.212 29.5
[10:1] 91 9 6.471 0.186 34.8
[8:1] 89 11 6.522 0.426 15.3
[6:1] 86 14 6.604 0.590 11.2
[4:1] 80 20 6.757 0.389 17.4
[2:1] 67 33 7.143 0.147 48.6
[1:1] 50 50 7.692 0.452 17.0
[1:2] 33 67 8.333 0.332 25.1
[1:4] 20 80 8.929 0.377 23.7
[1:6] 14 86 9.211 0.449 20.5
[1:8] 11 89 9.375 0.563 16.7
[1:10] 9 91 9.483 0.789 12.1
0 100 10.0 4.01 2.5
실시예 2
외상후 관절 작용의 정상화
식품 보충물로서 본 발명의 대표적인 조성물은 다음과 같은 배합물중 하나를 공급하는 경구용 제제, 즉 정제일 수 있다: (a) 15 mg 쿠르쿠미노이드/kg/일 및 6.0 mg 후물론/kg/일; (b) 15 mg 쿠르쿠미노이드/kg/일 및 6.0 mg 우풀론/kg/일; (c) 15 mg 쿠르쿠미노이드/kg/일 및 6.0 mg 디히드로이소후물론/kg/일. 운동 또는 반복적인 운동 스트레스에 기인한 물리적인 외상후 관절 운동의 정상화는 2 내지10 용량후에 발생하는 것을 추정되었다. 이러한 결과는 모든 동물에서 예상되었다.
실시예 3
주사비(酒鼻; Acne Rosacea)의 치료에서 로션 제제의 임상적 유효성
로션은 하기 성분중 하나를 함유하도록 설계하였다: (a) 0.1 중량%의 쿠르쿠미노이드 및 0.5% 후물론; 또는 (b) 0.1 중량%의 쿠르쿠미노이드 및 0.5% 루물론. 제조된 로션은 주치의가 진단하고 독립 위원회가 공인한 피부학자에 의해 확인된 주사 환자의 환부에 도포하였다. 환부 표면 및 발적을 정량화하기 위한 연구를 수행하기 일주일 전에 자가 평가 테스트를 수행하고 투여하였다. 또한, 환자의 치료 상태에서 인식하지 못한 전문 임상 스탭에 의해 유사한 변수들을 평가하였다. 이들 평가는 0일, 7일, 14일 및 21일에 반복하여 수행하였다.
환자는 연구 개시일에 테스트 제제군 및 위약 대조군에 무작위로 할당하였다. 테스트 제제 및 위약은 일일 1회 또는 2회 환부에 도포하였다. 당뇨병, 고혈압 등과 같은 건강상의 질환 치료는 상기 연구 중에 허용된다. 스코어는 4회의 관찰 기간 각각에 대해 테스트 제제군과 위약 대조군 사이에서 통계학적으로 비교하였다. 로션 제제로서 본 발명의 조성물로 치료된 환자는, 환자의 스코어가 평가된 각각의 카테고리로부터 테스트전 스코어로부터 20% 이상 증가되는 경우, 개선된 것으로 간주하였다. 개선을 나타내는 환자의 백분율은 배합 제제군과 위약 대조군간에 비교하였다. 상기 두 군의 차이에서 귀무가설을 배척할 가능성이 실제 5% 미만인 경우 통계학적으로 유의적인 것으로 간주하였다.
실시예 4
건선의 치료에서 로션 제제의 임상적 유효성
본 실시예는 실시예 3에 기술된 것과 동일한 방식으로 수행하였으나, 상기 조성물은 주치의에 의해 진단되고 독립 위원회 공인된 피부학자에 의해 확인된 바와 같이 건선을 나타내는 환자의 환부에 도포하였다. 환부 표면과 피부 상태를 정량화하기 위한 연구 일주일 이전에 자가 평가 테스트를 수행하고 투여하였다. 또한, 환자의 치료 상태에서 인식하지 못한 전문 임상 스탭에 의해 유사한 변수들을 평가하였다. 이들 평가는 0일, 7일, 14일 및 21일에 반복하여 수행하였다.
환자는 연구 개시일에 테스트 제제군 및 위약 대조군에 무작위로 할당하였다. 테스트 제제 및 위약은 일일 1회 또는 2회 환부에 도포하였다. 당뇨병, 고혈압 등과 같은 건강상의 질환 치료는 상기 연구 중에 허용된다. 스코어는 4회의 관찰 기간 각각에 대해 테스트 제제군과 위약 대조군 사이에서 통계학적으로 비교하였다. 로션 제제로서 본 발명의 조성물로 치료된 환자는, 환자의 스코어가 평가된 각각의 카테고리로부터 테스트전 스코어로부터 20% 이상 증가되는 경우, 개선된 것으로 간주하였다. 개선을 나타내는 환자의 백분율은 배합 제제군과 위약 대조군간에 비교하였다. 상기 두 군의 차이에서 귀무가설을 배척할 가능성이 실제 5% 미만인 경우 통계학적으로 유의적인 것으로 간주하였다.
실시예 5
알츠하이머병의 치료에서 제제의 임상적 유효성
실시예 2에 기술된 바와 같은 경구 제제는 주치의에 의해 진단되고 독립 위원회 공인된 신경학자에 의해 확인된 바와 같이 초기 단계의 알츠하이머(AD)로 판명된 환자에게 투여하였다. 임상 시험 2주일 전에, 환자에게 미니 멘탈 스테이터스 이그잼(MMSE), 알츠하이머병 분석 스케일(ADAS), 보스톤 네이밍 테스트(BNT) 및 토큰 테스트(TT)와 같은 신경정신과 테스트를 수행하였다. 신경정신과 테스트는 임상 시험 0일, 6일 및 3개월에 반복하였다. 상기 테스트들은 환자의 치료 방법을 인지하지 못하는 신경정신학자에 의해 수행되었다.
환자는 연구 개시일에 테스트 제제군 및 위약 대조군에 무작위로 할당하였다. 테스트 제제 및 위약은 일일 1회 또는 2회 환부에 도포하였다. 당뇨병, 고혈압 등과 같은 건강상의 질환 치료는 상기 연구 중에 허용된다. 스코어는 3회의 관찰 기관 각각에 대해 테스트 제제군과 위약 대조군 사이에서 통계학적으로 비교하였다. 치료하지 않으면, AD의 자연적인 경과는 임상 시험 과정에서 테스트 스코어에 유의적인 열화를 초래했다. 테스트 제제로서 본 발명의 조성물로 치료한 환자는 환자의 스코어가 임상 시험 과정 중에 동일하거나 향상되는 경우 개선된 것으로 간주하였다.
실시예 6
결장암의 치료 및 예방에서의 경구 제제
실시예 2에 기술된 바와 같은 경구 제제는 주치의에 의해 진단되고 독립 위원회 공인된 결장학자에 의해 확인된 바와 같이 초기 단계의 결장암으로 판명된 환자에게 투여하였다.
환자는 연구 개시일에 테스트 제제군 및 위약 대조군에 무작위로 할당하였다. 테스트 제제 및 위약은 일일 1회 또는 2회 환부에 도포하였다. 당뇨병, 고혈압등과 같은 건강상의 질환 치료는 상기 연구 중에 허용된다. 내시경 평가는 1개월, 2개월, 6개월 및 12개월에 수행하였다. 추가 4회의 임상적 진단 중 임의의 한 진단중에 종양이 재발되었음이 확인되는 치료는 실패한 것으로 간주하였다. 치료 실패의 백분율은 테스트 제제군과 위약 대조군 사이에서 비교하였다. 기술한 실험 조건 하에서, 테스트 물질은 대조군에 비해 종양 발생을 감소시키는 것으로 예상되었다. 상기 두 군의 차이에서 귀무가설을 배척할 가능성이 실제 5% 미만인 경우 통계학적으로 유의적인 것으로 간주하였다.
실시예 7
염증성 장 질환 치료용 경구 제제
실시예 2에 기술된 바와 같은 경구 제제를 주치의로부터 염증성 장 질환이라고 진단된 환자에게 투여하였다. 24 시간내에 정상적인 장 작용이 회복되었다.
실시예 8
골관절염에서 관절 작용의 정상화
실시예 2에 기술된 조성물을 이용하여 글루코사민 또는 콘드로이친 설페이트의 존재 또는 부재 하에서 5 내지 20의 용량을 투여한 후 골관절염에 기인한 연골 강직이 정상화되었다. 또한, 상기 조성물은 전통적인 비스테로이드성 항염증제와는 달리 이들 2개의 프로테오글리간 구성물의 정상 관절 재구축 효과를 방해하지 않았다.
요약하면, 특정 구체예는 유도성 COX-2 활성의 억제하기 위한 조성물인데, 상기 조성물은 COX-1 활성에 대한 영향은 최소이며, 제1 성분으로서 유효량의 쿠르쿠미노이드 종 및 유효량의 제2 성분으로서 알파 산 종 및 베타 산 종 또는 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 포함한다. 상기 쿠르쿠미노이드 종은 쿠르쿠민, 데메톡시쿠르쿠민 또는 비스데메톡시쿠르쿠민이 바람직하다. 상기 알파 산 종은 후물론, 코후물론, 이소후물론, 이소프리후물론, 훌루폰, 애드후물론, 잔토후몰 A 또는 잔토후몰 B가 바람직하다. 상기 베타 산 종은 루풀론, 코루풀론, 애드루풀론, 테트라히드로이소후물론, 헥사히드로코루풀론 또는 디히드로이소후물론이 바람직하다. 본 발명의 조성물의 제1 성분 및 제2 성분은 약학 등급일 수 있거나 식물(들) 또는 식물 추출물(들)로부터 유도될 수 있다. 또한, 상기 제1 성분 및 제2 성분은 모노-사카라이드 또는 디-사카라이드, 아미노산, 설페이트, 석시네이트, 아세테이트 또는 글루타치온과 같은 화합물과 컨쥬게이트될 수 있다. 바람직한 구체예의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체내에서 제형화될 수 있고 첨가제, 예를 들어 산화방지제, 비타민, 미네랄, 단백질, 지방, 탄수화물, 글루코사민, 콘드로이친 설페이트 또는 아미노슈가를 함유할 수 있다.
다른 구체예는 염증의 징후가 있는 동물에서 염증 징후를 감소시키기 위해 바람직한 구체예의 조성물의 식품 보충 방법을 포함한다. 상기 조성물은 투여를 통해 각각의 쿠르쿠미노이드 종을 약 0.001 내지 약 30.0 mg/kg 체중/일, 알파산 종 또는 베타 산 종 약 0.5 내지 약 20.0 mg/kg 체중/일을 제공하도록 임의 제형으로 제형화할 수 있다. 상기 조성물은 각각의 쿠르쿠미노이드 종의 혈청 농도를 약 0.1 내지 약 50 μM로 유지하고, 각각의 알파 산 종 또는 베타 산 종의 혈청 농도를 약 0.001 내지 약 50 μM로 유지하기에 충분한 양으로 투여된다. 상기 동물은 인간,비인간 영장류, 개, 고양이, 조류, 파충류, 양서류, 말 또는 반추동물일 수 있다. 상기 투여는 경구 투여, 비경구 투여, 국소 투여, 경피 투여 또는 경점막 투여 시스템을 이용하여 수행할 수 있다.
따라서, 교시된 여러가지 제제 중에서, 제1 성분으로서 쿠르쿠미노이드 및 알파 산과 베타 산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제2 화합물을 포함하는 제제가 개시된다. 이들 배합물은 생물학적 제제 또는 미지의 생태학에 기인한 비정상적인 면역 자극 또는 물리적이거나 화학적 손상에 대한 반응에서 상승적인 항염증 효과를 제공할 수 있다.
이상과 같이 본원을 기술하였으나, 당업자라면 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 본원에 기술한 구체예를 변형하여 실시할 수 있을 것이며, 이러한 모든 변경 및 변형 실시는 첨부한 특허청구의 범위에 의해 정해지는 발명의 범위내에 포함되는 것임을 밝혀둔다.

Claims (25)

  1. 쿠르쿠미노이드 종을 포함하는 제1 성분의 유효량 및 알파 산, 베타 산 및 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 포함하는 제2 성분의 유효량을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알파 산은 후물론, 코후물론, 이소후물론, 이소프리후물론, 훌루폰, 애드후물론, 잔토후물론 A 및 잔토후물론 B로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 알파 산이 후물론인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 베타 산은 루풀론, 코루풀론, 애드루풀론, 테트라히드로이소후물론, 헥사히드로코루풀론 및 디히드로이소후물론으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 베타 산은 루풀론인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 알파 산 또는 베타 산은 모노-사카라이드 또는 디-사카라이드, 아미노산, 지방산, 설페이트, 석시네이트, 아세테이트 및 글루타치온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물에 컨쥬게이트된 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제2 성분은 호프로부터 추출된 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 추출은 초임계 CO2에 의해 수행되는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 쿠르쿠미노이드는 쿠르쿠민, 데메톡시쿠르쿠민, 비스데메톡시쿠르쿠민, 시스-트랜스-쿠르쿠민 및 시클로쿠르쿠민으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 쿠르쿠미노이드는 쿠르쿠민인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 쿠르쿠노이드는 모노-사카라이드 또는 디-사카라이드, 아미노산, 지방산, 설페이트, 석시네이트, 아세테이트 및 글루타치온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물에 컨쥬게이트된 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 제1 성분은 합성 화합물인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제2 성분은 합성 화합물인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화되는 것인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 글루코사민 및 콘드로이친 설페이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 더 포함하는 것인 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 산화방지제, 비타민, 미네랄, 단백질, 지방, 탄수화물 및 아미노슈가로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 더 포함하는 것인 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 동물에서 염증 또는 염증-기초한 질병의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 동물에서 골관절염의 징후를 감소시키는데 사용하기 위한 조성물.
  19. 동물에서 염증 또는 염증-기초한 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하는 제1항의 조성물의 용도.
  20. 제19항에 있어서, 상기 조성물은 투여가 제1 성분 약 0.001 내지 약 30 mg/kg 동물 체중/일 및 제2 성분 약 0.5 내지 약 20 mg/kg 동물 체중/일을 제공하도록 제형으로 제형화되는 것인 용도.
  21. 제19항에 있어서, 투여는 경구 전달, 비경구 전달, 국소 전달, 경피 전달 및 경점막 전달로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  22. 제21항에 있어서, 국소 적용 제제는 제1 성분 약 0.001 내지 약 1 중량% 및 제2 성분 약 0.025 내지 약 1 중량%를 제공하는 것인 용도.
  23. 제22항에 있어서, 국소 적용 제제는 제1 성분 약 0.01 내지 약 1 중량% 및 제2 성분 약 0.05 내지 약 1 중량%를 제공하는 것인 용도.
  24. 동물에서 골관절염의 징후를 감소시키기 위한 약제의 제조에 사용하는 제1항의 조성물의 용도.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조성물은 글루코사민 및 콘드로이친 설페이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원을 더 포함하는 것인 용도.
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