BRPI1016243B1 - Métodos para o controle de moluscos - Google Patents

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Asolkar Ratnakar
Rackl Sarahann
Huang Huazhang
Koivunen Marja
Marrone Pamela
Shu Stephanie
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Marrone Bio Innovations, Inc
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Description

(54) Título: MÉTODOS PARA O CONTROLE DE MOLUSCOS (51) lnt.CI.: A01N 63/02; A01N 43/08; A01N 43/72; A01N 35/06; A01P 9/00 (30) Prioridade Unionista: 10/12/2009 US 61/285,525, 20/04/2009 US 61/170,790, 20/04/2009 US 61/170,686 (73) Titular(es): MARRONE BIO INNOVATIONS, INC (72) Inventor(es): RATNAKAR ASOLKAR; SARAHANN RACKL; HUAZHANG HUANG; MARJA KOIVUNEN; PAMELA MARRONE; STEPHANIE SHU
1/51
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA O CONTROLE DE MOLUSCOS.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a composições e métodos para controlar moluscos, tal como mexilhões e/ou caracóis e/ou lesmas, que inclui, mas não se limita a, compostos contendo lactonas, lactamas, carbamatos, amidas e/ou ácido carboxílico como ingredientes ativos e/ou compostos derivados de um micróbio (por exemplo, Pseudomonas e/ou Erwinia). Também são fornecidos métodos e composições para aumentar a eficácia de produtos para controle químico e biológico para moluscos, tal como mexilhões e/ou caracóis e/ou lesmas em águas abertas, usinas elétricas e instalações de tratamento de água potável em condições de água fria ou de superfícies sólidas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O mexilhão Zebra Dreissena polymorpha era originalmente nativo do Mar Cáspio e do rio Ural na Ásia. No século dezenove, espalhou-se para o oeste e, agora, ocorre na maioria da Europa, na porção ocidental da Comunidade de Estados Independentes (formalmente a União Soviética) e Turquia. Mais de duas décadas atrás, os mexilhões, tal como o mexilhão zebra, Dreissena polymorpha e mexilhão quagga, Dreissena bugensis, foram introduzidos na América do Norte. Sua ampla disseminação através de águas internas levou à cobertura da maior parte do leste dos EUA [US Army Engineer Waterways Experiment Station. 1995. Zebra mussels: Biology, Ecology, and Recommended Control Strategies. Technical Note. ZMR-1-01.
Zebra Mussel Research Program, Vicksburg, MS]. Da mesma forma, o Mexilhão Dourado, Limnoperna fortune, afetou países asiáticos e sul-americanos (mexilhão dourado - Limnoperna fortuna). O molusco asiático Corbicula fluminea quase espalhou por todos os países da Ásia e os EUA [Non-indigenous species Information bulletin: Asian ciam, Corbicula fluminea (Muller,
1774) (Mollusca: Corbiculidae)]. E outros mexilhões como moluscos unionídeos existem nos EUA e outros países.
A capacidade dos mexilhões de rapidamente colonizar novas áPetição 870170052243, de 25/07/2017, pág. 9/21
2/51 reas, rapidamente alcançar altas densidades e fixar a qualquer substrato duro (por exemplo, rochas, troncos, plantas aquáticas, cascas de mexilhões nativos e exoesqueleto de crustáceos, plástico, concreto, madeira, fibra de vidro, tubos feitos de ferro e de polipolicloreto de vinila e superfícies cobertas com tintas convencionais) os tornam capazes de causar sérias consequências adversas. Estas consequências incluem danos em infraestrutura dependente de água, aumento de milhões de dólares na despesa operacional e danos significativos dos sistemas ecológicos [O'Neill, CR. , Jr. 1997, Economic impact of zebra mussels-results of the 1995 national zebra mussel Information clearing house study. Gt. Lakes Res.. Rev. 3, 35-44; Karatayev, A.Y., L.E. Burlakova, D.K., Padilla, 1997, the effects of Dreissena polymorpha (Palias) invasion on aquatic communalities in eastern Europe. Journal Shellfish Research, 16, 187-203; Maclsaac, HJ. , 1996. Potential abiotic and biotic impacts of zebra mussels on the inland waters of North America. American Zoology, 36, 289-299; D.P. Molloy, the potential for using biological control technologies in the management of Dreissena SPP, Journal of Shellfish Research, 1998 (17) 177-183] bem como redução de produtividade, que custa bilhões de dólares em receitas perdidas (Connelly, NA, CR O ' Neill, Jr, et al. (2007), Economic impacts of Zebra mussels on drinking water treatment and electric power generation facilities, Environmental Management 90:10. Economic impacts of zebra mussels on drinking water treatment and electric power generation facilities. Environmental Management 40: 105-112). Além disso, a invasão rápida de ecossistemas aquáticos por estes mexilhões invasivos causou declínio na riqueza e abundância de mexilhões unionídeos endêmicos, uma parte importante da biodiversidade (Ricciardi, A, Neves, RJ.
, Rasmussen, J.B. 1998. Impending extinctions of North American freshwater mussels (Unionidae) following the zebra mussel (Dreissena polymorpha) invasion. Journal of Animal Ecology 67; 613-619).
O manejo de mexilhões é muito importante para proteger a infraestrutura dependente de água e sistemas ecológicos de água. Há muitas maneiras de reduzir as populações de mexilhões. Estes métodos incluem métodos pró-ativos e reativos. A remoção reativa inclui remoção mecânica,
3/51 remoção de predador e remoção química e bioquímica. Por exemplo, peixes, aves, lagostas, caranguejos, sanguessugas e mamíferos têm demonstrado serem predadores de mexilhões. No entanto, é improvável que a população de mexilhõrd será controlada por predadores naturais, especialmente em estruturas feitas pelo homem, tal como tubulações ou estações de bombeamento.
A aplicação de moluscicidas é outra forma eficaz para reduzir a população de mexilhões. Por exemplo, hipoclorito de sódio é um agente de controle comumente usado na Europa, EUA e Canadá. No entanto, mexilhões podem resistir a este tratamento por vários dias, fechando suas conchas e o cloro pode apenas ser utilizado em tubulações ou dutos que contêm sensores de pressão ou outro equipamento, devido à toxicidade ambiental do cloro [U.S. Army Engineer Waterways Experiment Station. 1995. Zebra mussels: Biology, Ecology, and Recommended Control Strategies. Technical Note. ZMR-l-01. Zebra Mussel Research Program, Vicksburg, MS]. Além disso, há muitos outros moluscicidas comercializados, tal como sais de tensoativo de amônio, hidroxitolueno butilado (BHT) em tintas, N-trifenilmetilmorfolino e assim por diante. Estes produtos químicos possuem baixa seletividade e afetam os ecossistemas de água. Por exemplo, um 4-trifluretil-4nitrofenol comercializado como Bayluscide® (Bayer) é um possível candidato para controlar tais espécies exóticas invasivas. No entanto, o mecanismo tóxico de tal substância química é afetar a respiração celular do mexilhão, que na natureza limitará sua seletividade entre os mexilhões e outras espécies aquáticas, como peixes [Karen Perry JE John Lynn, Detecting physiological and pesticide-induced apoptosis in early developmental stages of invasive bivalves, Hydrobiologia (2009) 628:153-164; I Takougang, J Meli, F Angwafo, Field trials of low dose Bayluscide on snail hosts of schistosome and selected non-target organisms in sahelian Cameroon, Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2006, 101(4): 355-358],
É crucial para o manejo dos mexilhões invasivos uma forma segura, ecologicamente correta e econômica. A fim de encontrar métodos menos prejudiciais para o controle desses mexilhões invasivos, o laboratório de
4/51 pesquisa de campo do Museu do Estado de Nova Iorque (NYSM) analisou mais de 700 bactérias isoladas como potenciais agentes de controle biológico para serem usadas contra mexilhões zebra e quagga. Como resultado, eles descobriram uma cepa CL145A de Pseudomonas fluorescens isolada, como letal para estes mexilhões (vide Molloy, D.P. Patente US 6.194.194, expedida em 27 de fevereiro de 2001). Esta bactéria é de distribuição universal e está presente em todos os corpos de água da América do Norte. Na natureza, é uma espécie bacteriana inofensiva que se encontra protegendo as raízes de plantas do apodrecimento e mofo. É tão onipresente que é um organismo comum na deterioração de alimentos na geladeira habitual de casa [Daniel P. Molloy e Denise A. Mayer, OverView of a Novel Green Technology: Biological Control of Zebra and Quagga Mussels with Pseudomonas fluorescens, Version 6: Updated August 24, 2007],
LACTONAS, LACTAMAS, CARBAMATO E AMIDAS As lactonas são amplamente distribuídas em alimentos e bebidas, e também são metabólitos secundários de animais (por exemplo, esponjas) e micro-organismos (por exemplo, leveduras, fungos). Algumas lactonas têm um aroma especial (por exemplo, gama-decalactona), resultando em uma demanda crescente por produtos naturais na indústria de alimentos pelo uso de processos biotecnológicos para a produção destas lactonas [Mohamed Alchihab, Jacqueline Destain, Mario Aguedo, Lamia Majad, Hakim Ghalfi, Jean-Paul Wathelet, Philippe Thonart, Production of γDecalactone by a Psychophilic and a Mesophilic Strain of the Yeast Rhodotorula aurantiaca, Appl Biochem Biotechnol (2009) 158:41-50], Outras funções de lactonas diferentes estão associadas com atividade antibacteriana [Ikuko Shimizu, Yasunori Isshiki, Harue Nomura, Keisuke Sakuda, Katsuya Sakuma, Seiichi Kondo, The Antibacterial Activity of Fragrance Ingredients against Legionella pneumophila, Biol. Pharm. Bull. 2009, 32 (6) 1114-1117], atividade hepatoprotetora [Yumiko Itoh, Hiroshi Shimura, Mayumi Ito, Naoharu Watanabe, Michio Yamagishi, Masaharu Tamai and Kazunori Hanada, Novel hepatoprotective γ-lactone, MH-031 , I. Discovery isolation, physicochemical properties and structural elucidation, The Journal of Antibiotics 1991 , 8325/51
837], atividade contra a tuberculose [Ma, G.Y. et al. anti-tuberculosis constituents from the stem bark of micromelum hirsutum, Planta Med. 2005, 71, 261-267], atividade contra o HIV [Zhang et al., sesquiterpenes and butenolides, natural anti-HIV constituents from Litse verticillata, Planta Med, 2005, 71 , 452-457], feromônio sexual [J. H. Tumlinson, Identification of the Female Japanese Beetle Sex Pheromone Inhibition of Male Response by an Enantiomer, Science, 1977, 197, 789-792], atividade citotóxica [Fan, X.N. et al. Chemical Constituents of Heteroplexis micocephala, J. Nat. Prod. 2009, 72, 1184-1190], moléculas sinalizadoras [M.K. Vinson, et al. Multiple N-acyl-Lhomoserine lactone signal molecules regulate production of virulence determinante and secondary metabolites in Pseudomonas aeruginosa, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, 92, 9427-9431] e atividade inseticida [John A. Findlay, et al., Insect toxins from spruce endophytes, Can. J. Chem. 2003, 81 , 284292],
Embora as lactamas existam em algumas plantas e organismos marinhos, elas muitas vezes são metabólitos de fungos. Muitas atividades biológicas (por exemplo, a atividade citotóxica e antitumoral, inibição da angiogênese, atividade neuronal, atividade anti-infecciosa) foram revistas em uma publicação recente [Bastien Nay, Nassima Riache and Laurent Evanno, Chemistry and biology of non-tetramic γ-hydroxy-y-lactams and y-alkylideneγ-lactams from natural sources, Natural Product reports, 2009, 26, 10441062],
Carbamatos existem em plantas, micro-organismos e esponjas, mas menos atividades biológicas são relatadas para estes compostos em comparação com lactonas e amidas, pois muitos destes compostos não são estáveis em soluções aquosas. Há um exemplo de atividade fungicida dos carbamatos naturais [Richard J. Clark, et al., Antifungal Alkyl Amino Alcohols from the Tropical Marine Sponge Haliclona n. sp., J. Nat. Prod. 2001, 64, 1568-1571], ]. Amidas são amplamente distribuídas em plantas, microorganismos e esponjas. Por exemplo, Scalusamida A do fungo marinho derivado Penicillium citrinum exibiu atividade antibacteriana e antifúngica [Masashi Tsuda, et al., Scalusamides A-C, New Pyrrolidine Aikaloids from the Ma6/51 rine-Derived Fungus Penicillium citrinum, J. Nat. Prod. 2005, 68, 273-276].
Outro exemplo de uma amida é um composto derivado de planta chamado sarmentina, que exibiu uma série de bioatividades. Conforme descrito no pedido número de série 61/227.412, 21 de julho de 2009 sarmentina foi isolada pela primeira vez a partir do fruto da Piper sarmentosum em 1987 [Likhitwitayawuid, K., Ruangrungsi, N, Lange, G and Decicco, C, Structural Elucidation and Synthesis of New Components isolated from Piper Samentosum, Tetrahedron 1987 (43) 3689-3694] e também de Piper nigrum, em 1988 [Kiuchi, F., Nakamura, N., Tsuda, Y., Kondo, K and Yoshimura, H. Studies on Crude Drugs Effective on Visceral Larva Migrans. IV. Isolation and Identification of Larvicidal Principies in Pepper Chemical and Pharmaceutical Bulletin 1988(36):2452], e sintetizada pela primeira vez em 1995 [Bernabeu, M., Chinchilla, R. and Najera, C, (2E,4E)-5-Tosyl-2,4-pentadienamides: New Dienic Sulfones for the Stereoselective Synthesis of (2E,4E)-Dienamides, Tetrahedron Letter, 1995 (36)3901-3904], Sarmentina age como um antioxidante in vivo da pele protegendo a pele fotoenvelhecida [Cornacchione, S.; Sadick, N. S.; Neveu, M.; Talbourdet, S.; Lazou, K.; Viron, C; Renimel, L; de Queral, D.; Kurfurst, R.; Schnebert, S.; Heusele, C; Andre, P.; Perrier E. In vivo skin antioxidant effect of a new combination based on a specific Vitis vinifera shoots extract and a biotechnological extract. J. Drugs in Dermatol. 2007, 6S, 8-13], mostrou atividade inibidora da agregação plaquetária [Li, C.Y.; Tsai, W.; Damu, A.G.; Lee, E. J.; Wu, T. S.; Dung. Ν. X.; Thang, T. D.; Thanh, L. Isolation and Identification of antiplatelet aggregatory principies from the leaves of Piper lolot, J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 9436-9442], atividade antiplasmodial e antimicobacteriana [Tuntiwachwuttikul, P.; Phansa, P.; Pootaeng-on, Y.; Taylor, W. C. Chemical constituents of the roots of Piper Sarmentosum, Chem. Pharm. Bull. 2006, 54, 149-151] e atividade contra tuberculose [Rukachaisirikul, T.; Siriwattanakit, P.; Sukcharoenphol, K.; Wongvein, C; Ruttanaweang, P.; Wongwattanavuch, P.; Suksamram, A. Chemical constituents and bioactivity of Piper sarmentosum, /. Ethnopharmacol., 2004, 93, 173-176], Sarmentina é usada como um solubilizante de compostos hidrofóbicos em cosméticos e produtos farmacêuticos (Stephen,
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T.; Andrew, Η. Compositions comprising macromolecular assembles of lipid surfactant, Publicação PCT N° WO/2008/065451). O pedido número de série 61/227.412, de 21 de julho de 2009 revela ainda que sarmentina e seus análogos podem ser usados para controlar pragas de plantas.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Esta invenção é dirigida a compostos, composições e métodos para controlar moluscos, especialmente os membros das classes Gastropoda e/ou Bivalvia e, mais particularmente, mexilhões, caracóis e lesmas. A invenção é dirigida a compostos isolados obtidos ou derivados de (a) microorganismos, em particular, espécies de Pseudomonas, mais particularmente, Pseudomonas fluorescens ou, alternativamente, um organismo com as características de identificação de Pseudomonas ATCC 55799, (b) é tóxica para um membro de uma classe de moluscos selecionada do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaría sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Cornu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marromamarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.) e (c) tem um peso molecular selecionado do grupo consistindo em: cerca de 540 a 550 e cerca de 1280 a 1335, conforme determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS). Estas composições podem ser formuladas em composições que podem ser utilizadas para controlar moluscos, especialmente os membros das classes Gastropoda e/ou Bivalvia e, mais particularmente, mexilhões, caracóis e lesmas. Em uma modalidade, o composto: (a) é obtido a partir de um micro-organismo, particularmente Pseudomonas sp;. (b) é tóxico para um membro de uma classe de moluscos selecionados do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biom8/51 phalaria sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Cornu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.) e (c) tem um peso molecular de cerca de 1280 a 1310 e, mais particularmente, 1295, conforme determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS), (d) tem valores 1H RMN de δ 9,25, 8,36, 8,06, 7,82, 7,71, 7,52, 7,45, 6,82, 6,36,
6,08, 5,42, 5,39, 5,30, 5,14, 4,68, 4,42, 4,31, 4,16, 4,11, 4,07, 3,95-3,86,
3,83, 3,72, 3,66, 3,53, 3,48, 3,37, 3,17, 3,06, 2,56, 2,53, 2,45, 2,32, 2,21,
2,02, 1,96, 1,84, 1,72, 1,65, 1,61, 1,51, 1,48-1,37, 1,32, 1,12, 0,94, 0,91,
0,68; (e) tem um tempo de retenção em Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de eerca de 50 a 55 minutos, mais especificamente cerca de 52 minutos e ainda mais especificamente cerca de 51,66 min em coluna HPLC C-18 de fase reversa (por exemplo, Thermo Scientific, Hydersil Gold, 100 x 10 mm) usando água:acetonitrila (CH3CN) com um sistema de solvente de gradiente (0 a 10 min.; 30 a 40% de CH3CN aquoso, 10 a 20 min.; 40 a 60% de CH3CN aquoso, 20 a 60 min.; 60 a 80% de CH3CN aquoso, 60 a 65 min.; 80 a 100% de CH3CN aquoso) em vazão de 2,5 mL/min e detecção UV de 210 nm.
Em outra modalidade, o composto tem as seguintes características: (a) é obtido a partir de um micro-organismo, particularmente de Pseudomonas sp.; (b) é tóxico para um membro de uma classe de moluscos selecionado do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaria sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Cornu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp), e a
9/51 lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.) e (c) tem um peso molecular de cerca de 1310 a 1335 e, mais particularmente, 1321, conforme determinado por LC/MS (d) tem um tempo de retenção em HPLC de cerca de 55 a 60 minutos, mais especificamente cerca de 60 minutos e ainda mais especificamente cerca de 59,61 min. em uma coluna HPLC C-18 de fase reversa (Thermo Scientific, Hydersil Gold, 100 x 10 mm) usando um gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) com um sistema de solvente de gradiente (0 a 10 min.; 30 a 40% de CH3CN aquoso, 10 a 20 min.; 40 a 60% de CH3CN aquoso, 20 a 60 min.; 60 a 80% de CH3CN aquoso, 60 a 65 min.; 80 a 100% de CH3CN aquoso) em vazão de 2,5 mL/min e detecção UV de 210 nm. Ainda em outra modalidade, a invenção é dirigida a um composto isolado possuindo as seguintes características (a) é obtido de um micro-organismo, em particular, Pseudomonas sp.; (b) é tóxico para um membro de uma classe de moluscos selecionados do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaria sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Cornu sp., Theba sp.), e/ou iesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.); (c) tem um peso molecular de cerca de 540 a 550 e, mais particularmente, 546, conforme determinado por LC/MS (d) tem um tempo de retenção em HPLC de cerca de 50 a 55 minutos, mais especificamente cerca de 52 minutos e ainda mais especificamente cerca de 51,54 min em uma coluna HPLC C-18 de fase reversa (Thermo Phenomenex, luna C 18(2) 10 p , 100 A Axia, A250 x 30 mm) usando um sistema de solvente de gradiente de água:acetonitrila (0 a 10 min.; 35 a 45% de CH3CN aquoso, 10 a 20 min.; 45 a 60% de CH3CN aquoso, 20 a 50 min.; 60 a 85% de CH3CN aquoso, 50 a 60 min. ; 85 a 100% de CH3CN aquoso, 60 a 70 min.; 100% CH3CN) em vazão de 10 mL/min e detecção UV de 210 nm.
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A invenção é ainda dirigida a um método para a obtenção do(s) composto(s) da presente invenção compreendendo (a) obtenção de uma suspensão de células derivadas de uma espécie Pseudomonas e, (b) isolamento do composto por métodos cromatográficos da dita suspensão.
A invenção é ainda dirigida a composições compreendendo os ditos compostos, bem como uma composição que compreende um sistema de solvente de água:acetonitrila (0 a 10 min.; 35 a 45% de CH3CN aquoso, 10 a 20 min.; 45 a 60% de CH3CN aquoso, 20 a 50 min.; 60 a 85% de CH3CN aquoso, 50 a 60 min.; 85 a 100% de CH3CN aquoso, 60 a 70 min.; 100% CH3CN) em vazão de 10 mL/min e detecção UV de 210 nm a partir de uma suspensão de células de uma espécie Pseudomonas por HPLC com um tempo de retenção de cerca de 45 a 50 min., a dita fração compreendendo pelo menos dois compostos que (a) são tóxicos para um membro de uma classe de moluscos selecionada do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.)Bivalvia e/ou Gastropoda, particularmente caracóis, que inclui, mas não são limitados a, caracóis aquáticos (por exemplo, espécies Biomphalaría) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Cornu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marromamarelada (por exemplo, Limacus sp), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.); (b) têm um peso molecular entre cerca de 630 a 660 e entre cerca de 970 a 1.000 conforme determinado por LC/MS.
A invenção refere-se a um método para controlar um ou mais moluscos em um local onde o controle é desejado compreendendo a introdução no dito local de pelo menos um de (a) uma suspensão ou extrato de célula derivado de células Erwinia sp.; (b) um ou mais compostos, em que os ditos compostos são compostos de lactona, lactama, carbamato, ácido carboxílico e/ou amida ou composições compreendendo os ditos compostos, com a ressalva de que os ditos compostos não são gama-octalactona, gama-nonalactona, gama-decanolactona, gama-undecalactona, N-ciclopentilci11/51 namamida, N-(trans-cinamoil)pirrolidina, N-(trans-cinamoil) piperidina e N(trans-cinamoil)hexametilenoimina, ácido 4-hidroxidodecanoico e ácido dodecanoico e com a ressalva de que a composição não é uma cultura, extrato ou suspensão de Pseudomonas; (c) um ou mais compostos obtidos ou derivados de (i) espécie Pseudomonas, (ii) é tóxico para um membro de uma classe de moluscos selecionada do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaria sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Comu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.) e (iii) tem um peso molecular selecionado do grupo consistindo em: cerca de 540 a 550 e cerca de 1280 a 1335, conforme determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (d) uma composição compreendendo um sistema de solvente água:acetonitrila (0 a 10 min.; 35 a 45% de CH3CN aquoso, 10 a 20 min.; 45 a 60% de CH3CN aquoso, 20 a 50 min.; 60 a 85% de CH3CN aquoso, 50 a 60 min.; 85 a 100% de CH3CN aquoso, 60 a 70 min.; 100% CH3CN) em vazão de 10 mL/min e detecção UV de 210 nm, fração obtida a partir de uma suspensão de células de uma espécie Pseudomonas por HPLC com um tempo de retenção de cerca de 45 a 50 min., a dita fração compreendendo peio menos dois compostos que (i) são tóxicos para um membro de uma classe de moluscos selecionada do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) Bivalviae/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, mas não se limita a, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaria sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exempio, Cantareus sp., Comu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma
12/51 marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.) (ii) têm um peso molecular entre cerca de 630 a 660 e entre cerca de 970 a 1000 conforme determinado por LC/MS, em quantidades eficazes para o controle dos ditos moluscos no dito local. Esse controle pode, em uma modalidade, ser alcançado através da indução de morte em um ou mais moluscos compreendendo o contato dos ditos moluscos com os compostos acima estabelecidos. Os moluscos podem ser contatados em um corpo de água ou superfície sólida. Da mesma forma, a invenção é dirigida para o uso dos compostos, suspensões e composições acima mencionados para a formulação de uma composição para uso no controle de moluscos, como Gastropoda e/ou Bivalvia em um local.
Em um aspecto relacionado, a invenção refere-se ainda a composições para controlar um ou mais dos moluscos, principalmente os mexilhões e/ou caracóis (por exemplo, caracóis de jardim brancos e/ou marrons, caracóis aquáticos) e/ou lesmas em um local onde o controle é desejado e/ou induzir a morte em um ou mais dos moluscos, principalmente os mexilhões e/ou caracóis (por exemplo, caracóis de jardim brancos e/ou marrons, caracóis aquáticos) e/ou lesmas no dito local que compreende uma ou mais lactonas, lactamas, carbamatos, ácidos carboxílicos e/ou amidas, novamente com a ressalva de que o dito composto não é gama-octalactona, gamanonalactona, gama-decanolactona, gama-undecalactona, N-ciclopentilcinamamida, N-(trans-cinamoil)pirrolidina, N-(trans-cinamoil)piperidina e N(trans-cinamoil)hexametilenoimina, ácido 4-hidroxidecanoico e ácido decanoico e com a ressalva de que a composição não é uma cultura, extrato ou suspensão de Pseudomonas.
Em uma modalidade particular, a invenção é dirigida a um método para controlar um ou mais moluscos, principalmente os mexilhões e/ou caracóis (por exemplo, caracóis de jardim brancos e/ou marrons, caracóis aquáticos) e/ou lesmas, o dito método compreendendo as etapas de: (a) preparar uma suspensão de células ou extrato derivado de células Erwinia sp., e (b) introduzir dita suspensão ou extrato em um local onde o controle é desejado em uma quantidade eficaz para o controle dos ditos moluscos.
13/51
Extratos de Erwínia podem conter ingredientes ativos estabelecidos acima, como lactonas e amidas. Da mesma forma, a suspensão ou extrato de células derivado de células Erwinia sp. pode ser formulado em composições para uso no controle de moluscos, particularmente uma classe de moluscos selecionada do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaria sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Comu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.).
A invenção é ainda dirigida a uma composição que compreende pelo menos uma ou mais substâncias eficazes para o controle de um ou mais moluscos, particularmente uma classe de moluscos selecionada do grupo que consiste em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaria sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Comu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.), e opcionalmente um material inerte de preferência para uso no controle de um ou mais moluscos. Além disso, a invenção é dirigida ao uso dessas substâncias e outros compostos e composições da presente invenção para uso na formulação de uma composição para o controle de um ou mais moluscos, particularmente uma classe de moluscos selecionada do grupo que consiste emm Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaria sp.) e caracóis de
14/51 jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Comu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.). A substância pode ser derivada de cloro ou de uma espécie Pseudomonas, mais particularmente, derivada de Pseudomonas fluorescens ou, alternativamente, um organismo (por exemplo, uma cepa Pseudomonas) com as características de identificação de Pseudomonas ATCC 55799. Em outra modalidade específica, a composição pode incluir uma substância que é uma suspensão de células derivada de uma espécie de Pseudomonas (por exemplo, P. fluorescens) e até mesmo em uma modalidade mais específica, a suspensão de células pode incluir células contendo características de produção de toxina de Pseudomonas ATCC 55799. Ainda em outra modalidade específica, as substâncias em dita composição podem ser uma ou mais toxinas derivadas de isolados de uma espécie de Pseudomonas ou, altemativamente, derivada de um organismo com as características de identificação de Pseudomonas ATCC 55799. A composição poderá, alternativamente, compreender os compostos utilizados no método da presente invenção estabelecidos acima, bem como os compostos da presente invenção estabelecidos acima e podem ser usados para o controle de um membro de uma classe Gastropoda e Bivalvia. O material inerte pode ser um mineral de argila (caulinita, esmectita, atapulgita). A invenção é ainda direcionada para um método para controlar um ou mais dos moluscos, principaimente, mexilhões e/ou caracóis (por exemplo, caracóis de jardim, aquáticos e/ou lesmas em um local onde o controle é desejado compreendendo a introdução no referido local de uma substância eficaz para o controle de ditos moluscos e, opcionalmente, um ou mais materiais inertes em quantidades eficazes para o controle dos ditos moluscos nos referidos locais contendo ditos moluscos. Em particular, a substância para o controle de ditos moluscos está presente em uma quantidade eficaz para resultar em pelo menos cerca de 20% da mortalidade em relação ao controle sem tratamento, ge15/51 ralmente cerca de 50 a 95% e o dito material inerte está presente em uma quantidade suficiente ou eficaz para aumentar a taxa de mortalidade de dita substância para o controle de ditos moluscos em pelo menos cerca de 20%, normalmente 25 a 40%. Em uma modalidade específica, o material inerte é introduzido no dito local antes da introdução da substância para o controle dos ditos moluscos; em uma modalidade mais específica, o material inerte é introduzido pelo menos cerca de uma hora antes da introdução da substância. Em outra modalidade específica, o material inerte é introduzido no local simultaneamente com a substância para controlar moluscos estabelecida acima, especialmente mexilhões, caracóis e/ou lesmas.
Em um aspecto relacionado, a invenção é dirigida ao uso de um material inerte para aumentar a eficácia de uma ou mais substâncias para o controle de um ou mais moluscos, particularmente uma classe de moluscos selecionada do grupo que consiste em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que incluem, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaría sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Cornu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.), em um local onde o controle é desejado. O local pode ser um líquido (por exemplo, um corpo de água ou tinta) ou uma superfície sólida, tal como plástico, concreto, madeira, fibra de vidro, tubos de ferro e poli policloreto de vinila, superfícies cobertas com materiais de revestimento e/ou tintas. Em particular, a invenção é dirigida ao método para aumentar a eficácia de uma ou mais substâncias para o controle de um ou mais dos ditos moluscos, particularmente uma classe de moluscos selecionada do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, Biomphalaría sp.) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim,
16/51 caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Cornu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.), compreendendo a introdução em um local onde o controle é desejado um ou mais materiais inertes em quantidades eficazes para aumentar a eficácia da dita substância quando introduzida no dito local. Em uma modalidade específica, esses materiais inertes aumentam a eficácia das ditas substâncias em pelo menos cerca de 20%.
Além disso, a invenção refere-se a uma tinta anti-incrustante compreendendo uma quantidade eficaz biocida antivegetativa das composições e compostos da presente invenção em um transportador de tinta. A invenção ainda diz respeito ao uso dos compostos e composições da presente invenção na formulação de tais tintas anti-incrustantes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
As figuras 1a e 1b mostram estruturas de produtos naturais usados no método da presente invenção.
A figura 2 mostra o esquema para isolar as frações ativas.
A figura 3 mostra uma representação esquemática do sistema de purificação para a obtenção dos compostos da presente invenção a partir de cultura de células de Pseudomonas.
A figura 4 mostra o desenvolvimento da mortalidade ao longo do tempo para os mexilhões tratados com argila e produto biopesticida de P. fluorescens em uma biocaixa.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Quando uma faixa de valores é fornecida, entende-se que cada valor interveniente, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto claramente dite de outra forma, entre o limite superior e inferior da faixa e qualquer outro valor declarado ou interveniente nessa faixa declarada é abrangido pela invenção. Os limites superiores e inferiores destas faixas menores que podem ser incluídos de forma independente nas faixas menores são também abrangidos pela invenção, sujeitos a qualquer limite especi17/51 ficamente excluído na faixa declarada. Quando a faixa determinada inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo cada um de ambos aqueles limites incluídos também estão incluídas na invenção.
A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que comumente compreendido por uma pessoa com versada na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos também possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.
Deve-se notar que como aqui usadas e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, e e o incluem referências plurais, a menos que o contexto claramente determine de outra maneira.
Como aqui definido, controle de mexilhões significa controlar os ovos, larvas, véliger e pós-veliger do mexilhão matando ou incapacitando os mesmos, de modo que eles não possam colonizar um determinado local.
Como aqui definido, derivado de significa diretamente isolado ou obtido a partir de uma fonte específica ou, alternativamente, tendo identificado características de uma substância ou organismo isolado ou obtido de uma fonte particular.
Como usado daqui por diante, o termo alquila refere-se a um radical de hidrocarboneto saturado que pode ser de cadeia linear ou de cadeia ramificada (por exemplo, etila, isopropila, t-amila ou 2,5-dimetil-hexila, etc.) Esta definição se aplica tanto quando o termo é usado sozinho quanto quando é usado como parte de um termo composto.
Os termos cicloalquila e cicloalquenila referem-se a um anel de hidrocarboneto saturado e inclui anéis bicíclicos e policíclicos. Da mesma forma, grupos cicloalquila e cicloalquenila tendo um heteroátomo (por exemplo, N, O, ou S) no lugar de um átomo de anel de carbono podem ser denominados como heterocicloalquila, heterociclila, e heterocicloalquileno, respectivamente.
O termo alquenila como aqui utilizado refere-se a um grupo alquila, como descrito acima, que contém um ou mais sítios de insaturação
18/51 que é uma ligação dupla. Da mesma forma, o termo alquinila como aqui utilizado refere-se a um grupo alquila, como descrito acima, que contém um ou mais sítios de insaturação que é uma ligação tripla.
O termo alcóxi refere-se a um radical alquila, como descrito acima, que também tem um substituinte do oxigênio que é capaz de se ligar de forma covalente a outro radical de hidrocarboneto (como, por exemplo, metóxi, etóxi, arilóxi, e t-butóxi).
O termo arila refere-se a um substituinte carbocíclico aromático que pode ser um único anel ou múltiplos anéis que são fundidos juntos, ligados covalentemente ou ligados a um grupo comum, como uma porção etileno ou grupo metileno. Da mesma forma, os grupos arila contendo um heteroátomo (por exemplo, N, O, ou S) no lugar de um átomo de anel de carbono são referidos como heteroarila.
Os termos arilalquila, arilalquenila e arilóxi alquila referemse a um radical arila ligado diretamente a um grupo alquila, um grupo alquenila, ou um átomo de oxigênio, que é anexado a um grupo alquila, respectivamente. Para resumir, arila como parte de um termo combinado como acima inclui heteroarila também.
O termo hetero, como usado em um grupo alquila contendo heteroátomo (isto é, um grupo heteroalquila) ou um grupo arila contendo heteroátomo (isto é, um grupo heteroarila) refere-se a uma molécula, ligação, ou substituinte em que um ou mais átomos de carbono são substituídos por um átomo diferente de carbono, por exemplo, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, ou silício.
Como aqui definido, derivado de e obtido de significa diretamente isolado ou obtido a partir de uma fonte específica ou, alternativamente, tendo identificado características de uma substância ou organismo isolado ou obtido de uma fonte particular. Esses termos são utilizados alternadamente em todo o relatório descritivo.
Como aqui definido, um composto isolado é essencialmente livre de outros compostos ou substâncias, por exemplo, pelo menos, cerca de
20% de pureza, de preferência pelo menos cerca de 40% de pureza, mais
19/51 preferencialmente 60% de pureza, ainda mais preferencialmente cerca de 80% de pureza, mais preferencialmente cerca de 90% de pureza, e ainda mais preferencialmente cerca de 95% de pureza, conforme determinado por métodos analíticos, incluindo, entre outros, métodos cromatográficos, métodos eletroforéticos.
Compostos
Os compostos usados nas composições e métodos da presente invenção podem ser membros das seguintes três famílias.
Compostos da família I
Em uma modalidade específica, a família I possui as seguintes estruturas químicas:
Figure BRPI1016243B1_D0001
onde X inclui, mas não se limita a, carbono, enxofre, fósforo; Y inclui, mas não se limita a, enxofre, oxigênio; A e M incluem, mas não se limitam a, carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre e n é 1 a 21, onde (R)z representa o número Z do número de substituintes no grupo R no anel. R e os substituintes em R podem ser um grupo hidrogênio, hidroxila, alquil hidroxila, aquenila hidroxila, alquinil hidroxila, alquilóxi, alqueniloxila, alquinilóxi, cicioalquila, cicloalquenila, alquila, alquenila, alquinila, heterociclila, heteroarila, aromático, grupo arila, grupo NH-substituído, ou Ν,Ν-substituído ou qualquer outro grupo substituído. O comprimento de uma das cadeias R substituídas pode ser de 1 a 25 átomos, o comprimento preferido será de 7 a 17 átomos; O número Z pode ser 0, 1,2, 3 até n+2, preferencialmente z=0, 1,2,3.
Em uma modalidade específica, o composto pode ser derivado de Pseudomonas fluorescens e tem uma estrutura de lactona de ácido graxo insaturado hidroxilado compreendendo pelo menos um grupo lactona, que é uma γ-lactona de 5 membros, pelo menos um grupo insaturado e pelo menos um grupo álcool, um peso molecular de 285 a cerca de 310 na estrutura do núcleo, pelo menos 15 átomos de carbono e pelo menos 3 oxigênios. Em
20/51 uma modalidade mais específica, o composto pode ter a estrutura
Figure BRPI1016243B1_D0002
n R2 m r3 em que: X é, cada um, independentemente -O, -NRi, ou - -S, onde Ri é --H ou CrCg alquila; n = 0a15, R2aR4 são, cada um, independentemente -H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterociclo, heterociclo substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila,-C (O) H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurilasulfurila; m = ligação dupla ou ligação tripla. Ainda em outra modalidade específica, Y e M são oxigênio, A e X são carbono e n é 2 ou 3, R é uma alquila C7 ou C8 e z é 0, em que quando n é 2 e R é uma alquila C7, R é ligado a A.
Ainda em outra modalidade específica, compostos da Família I podem ser os compostos previstos em 1 a 28 (figuras 1a e 1b). Estes são tanto de material natural ou compostos obtidos de fontes comerciais ou por síntese química. Fontes naturais de compostos da família I incluem, entre outros, plantas, corais, micro-organismos, esponjas e animais. Em uma modalidade mais específica, as plantas que incluem os compostos da Família I incluem, mas não se limitam a, ou, altemativamente, os compostos da Família I podem ser derivados de espécies tais como Myoporum bontioides (composto 14) [Moe Kanemoto, et al., Chlorine-containing iridoid and iridoid glucoside, and other glucosides from leaves of Myoporum bontioides, Phytochemistry 69 (2008) 2517-2522], Micromelum hirsutum (composto 18) [Ma, G.Y. et al. anti-tuberculosis constituents from the stem bark of Micromelum hirsutum, Planta Med. 2005, 71, 261-267], compostos da Família I também podem ser derivados de micro-organismos, incluindo, entre outros, Antrodia camphorate (compostos 4, 5) [Shao, Y.Y. et al., Chemical constituents of Antrodia camphorata submerged whole broth, Natural Product Research, 2008, 22 (13) 1151-1157], Saccharomyces cerevisiae (composto 2) [Gocho,
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S. ef al. Biotransformation of oleic acid to optically active y-dodecalactone , Biosci. Biotech. Biochem. 1995, 59 (8) 1571-1572], Mesorhizobium sp. (Compostos 2, 17) [Wei, G.H. et al., Rhizobialide: A New Stearolactone Produced by Mesorhizobium sp. CCNWGX022, a Rhizobial Endophyte from Glycyrrhiza uralensis, Chemistry and Biodiversity, 2007, 4, 893-898], Ophiostoma piliferum (Composto 16) [Wei, G.H. et al., Rhizobialide: A New Stearolactone Produced by Mesorhizobium sp. CCNWGX022, a Rhizobial Endophyte from Glycyrrhiza uralensis, Chemistry and Biodiversity, 2007, 4, 893898], Streptomyces sp. (Composto 8) [Khaled A. Shaaban, Mohamed Shaaban, Petrea Facey, Serge Fotso, Holm Frauendorf, Elisabeth Helmke, Armin Maier, Heinz H. Fiebig, Hartmut Laatsch, Electrospray lonization Mass Spectra of Piperazimycins A and B and γ-Butyrolactones from a Marine-derived Streptomyces sp. J. Antibiot. 61(12): 736-746, 2008], Macrophomina phaseolzna (compostos 9, 10 & 15) [Shashib, Mahat et al., structure and stereochemistry of phaseolinic acid: a new acid from Macrophomina phaseolzna, Journal of Natural products, 1987, 50 (2) 245-247], Sporidiobolus salmonicolor (compostos 1, 3) [Laurent Dufosse, et al., Chirality of the γ-Lactones Produced by Sporidiobolus salmonicolor Grown in Two Difterent Media, Chirality, 1997, 667-671] e Streptomyces (composto 7) [Shohei Sakuda, et al., Biosynthetic Studies on Virginiae Butanolide A, a Butyrolactone Autoregulator from Streptomyces. Part 2, Preparation of Possible Biosynthetic Intermediates and Conversion Experiments in a Cell-free System. J. Chem. Soc. Perkin Trans. Eu 1993, 2309-2315].
Em uma modalidade adicional específica, compostos da Família I podem ser derivados de esponjas, como Haliclona n. sp (compostos 26, 27 & 28) [Richard J. Clark, Mary J. Garson, e John N.A. Hooper, Antifungal Alkyl Amino Alcohols from the Tropical Marine Sponge Haliclona n. sp. J. Nat. Prod. 2001 , 64, 1568-1571], Axinellas sp (composto 25) [Miller, W. F. Tinto, J.-P. Yang, S. McLean and W. F. Reynolds, Axinellamide, a new alkaloid from the marine sponge Axinellas sp. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 5851] , Plakortis nigra (compostos 19 a 20) [Joel S. Sandler, et al., Cytotoxic βCarbolines and Cyclic Peroxides from the Palauan Sponge Plakortis nigra, J.
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Nat Prod. 2002, 65, 1258-1261] e Ircinia formosana (compostos 21 a 24) [Shen, Y. C. et al., Novel linear C22-sesterterpenoids from sponge Ircinia formosana, Tetrahedron Letters 47 (2006) 4007-4010], Compostos 26 a 28 são exemplos de carbamatos.
Em outra modalidade específica, compostos da Família I podem ser derivados de corais, incluindo, mas não se limitando a, Sarcophyton trocheliophorum e arboretum Lithophyton (compostos 11 & 13) [Tomas Rezanka, et al., γ-lactones from the soft corais Sarcophyton trocheliophorum and Lithophyton arboretum, Tetrahedron, 2001, 57, 8743-8749].
Ainda em outra modalidade específica, insetos que incluem os compostos da família I podem ser derivados de insetos, incluindo, mas não se limitando a, Feromônio Sexual da Fêmea de Besouro Japonês (composto 12) [J. H. Tumlinson, Identification of the Female Japanese Beetle Sex Pheromone Inhibition of Male Response by an Enantiomer, Science, 1977, 197,
789-792] e toxinas de inseto (composto 6) [John A. Findlay, et al., Insect toxins from spruce endophytes, Can. J. Chem. 2003, 81, 284-292].
Compostos da Família I também podem incluir, mas não se limitando a, gama-dodecalactona, delta-tridecalactona, piliferolida A e alfaheptil-gama-butirolactona estabelecidos nos exemplos. Estes podem ser ob20 tidos por métodos sintéticos usando procedimentos conhecidos na técnica ou de fontes comerciais.
Compostos da Família II
Em uma modalidade específica, a família II possui as seguintes estruturas químicas:
Figure BRPI1016243B1_D0003
onde X é carbono; Y é oxigênio; A, B e M são carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre ou outros átomos, e n é de 1 a 21;
23/51 onde (R)z representa o número Z do número de substituintes no grupo R do anel. R e os substituintes em R podem ser um grupo hidrogênio, hidroxila, alquil hidroxila, aquenil hidroxila, alquinil hidroxila, alquilóxi, alqueniloxila, alquinilóxi, cicloalquila, cicloalquenila, alquila, alquenila, alquinila, heterociclila, heteroarila, aromático, arila, grupo NH-substituído, ou Ν, Nsubstituído ou qualquer outro grupo substituído. O comprimento de uma das cadeias R substituídas pode ser de 1 a 25 átomos, com o comprimento preferido de 7 a 17 átomos. O número Z pode ser 0, 1, 2, 3 até n+2, preferencialmente z=0, 1, 2, 3.
Em uma modalidade específica, os compostos da Família II, como os compostos 29 a 36 e 44 (vide figuras 1a e 1b) podem ser derivados de fontes naturais, síntese química ou fontes comerciais. Fontes naturais de compostos da Família II incluem, entre outros, plantas, corais, microorganismos, esponjas e animais. Em uma modalidade específica, exemplos de plantas incluem as seguintes espécies, entre outras, Heteroplexis micocephala (compostos 30, 31, 32 & 33) [Fan, X.N., et al., J. Nat. Prod. 2009, 72, 1184-1190] e espécies de Iryanthera (composto 34) [Vieira, P.C., et al., γ-Lactones from Iryanthera species, Phytochemistry, 1983, 22 (3) 711-713] e Litse verticillata (composto 44) [Zhang, H. J. et al., sesquiterpenes and butenolides , natural anti-HIV constituents from Litse verticillata, Planta Med, 2005, 71 , 452-457]. Em uma modalidade mais específica, fontes de microorganismos que incluem os compostos da Família II incluem as seguintes espécies, entre outras, como a Streptomyces rishiriensis A-5969 (composto 29) [[Yumiko Itoh, Hiroshi Shimura, Mayumito, NaoHaru Watanabe, Michio Yamagishi, Masaharu Tamai and Kazunori Hanada, novel hepatoprotective 7-lactone, MH-031 , Discovery, Isolation, Physical-Chemical properties and structural eiucidation, The Journal of antibiotics, 1991 , 44 (8) 832-837]. Em uma modalidade mais específica, os corais, que incluem os compostos da Família II incluem as seguintes espécies, entre outras, como Pterogorgia anceps (composto 35) [Guo, Y. W. et al., Thee New Butenolide Lipids from the Caribbean Gorgonian Pterogorgia anceps, J. Nat. Prod. 1999, 62, 11941196; Manuel Lorenzo et al., 13C RMN-Based Empirical Rules to Determine
24/51 the Configuration of Fatty Acid Butanolides. Novel γ-Dilactones from Pterogorgia spp, Organic Letters, 8 (22) 5001-5004] e Pterogorgia citrino (composto 36) [Abimael D. Rodriguez et al., further butenolides from the Caribbean octocoral Pterogorgia citrine, Journal of Natural Products, 1994, 57(3) 3395 347].
Compostos da Família III
Em uma modalidade específica, os compostos da família III possuem as seguintes estruturas químicas:
Figure BRPI1016243B1_D0004
em que X é carbono, Y é oxigênio; Z é grupo hidrogênio, hidroxi10 la, alquenil hidroxila, alquinil hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, heterociclila, aromático, arila, grupo NH-substituído, ou N, N-substituído ou qualquer outro grupo substituído.
em que R é alquenil hidroxila, alquinil hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, heterociclila, aromático, grupo arila, grupo NH-substituído, ou N, N15 substituído ou qualquer outro grupo substituído. O comprimento da cadeia R pode ser 1 a 50, preferencialmente 7 a 17.
Em uma modalidade específica, os compostos da Família III como os compostos 37 a 43 (figuras 1a e 1b) podem ser derivados de fontes naturais, fontes comerciais ou síntese química. Fontes naturais de compos20 tos da Família III incluem, entre outros, plantas, corais, micro-organismos, esponjas e animais. Em uma modalidade mais específica, fontes vegetais incluem, mas sem se limitar a, Piperspp (composto 43) [Likhitwitayawuid, K., Ruangrungsi, N, Lange, G and Decicco, C, Structural Elucidation and Synthesis of New Components isolated from Piper Samentosum, Tetrahedron
1987 (43) 3689-3694; Kiuchi, F., Nakamura, N., Tsuda, Y., Kondo, K and
Yoshimura, H. Studies on Crude Drugs Effective on Visceral Larva Migrans.
IV. Isolation and Identification of Larvicidal Principies in Pepper Chemical and
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Pharmaceutical Bulletin 1988(36):2452]. Em uma modalidade mais específica, corais incluem, mas sem se limitar a, Plexaura fiava (composto 42) [Β. N. Ravi, et al., Lipid and Terpenoid Metabolites of the Gorgonian Plexaura fiava, Aust. J. Chem., 1982, 35, 105-12] e em uma modalidade mais específica, os micro-organismos que incluem os compostos da Família III incluem as seguintes espécies ,entre outras, como Lyngbya majuscula e Schizothix calcícola (compostos 39, 40) [George G. Harrigan, et al., Tumonoic Acids, Novel Metabolites from a Cyanobacterial Assemblage of Lyngbya majuscula and Schizothix calcicola, J. Nat. Prod. 1999, 62, 464-467], Pseudomonas aeruginosa (composto 41) [Michael, K. Winson., etal. Multiple N-acyl-L-homoserine lactone signal molecules regulate production of virulence determinants and secondary metabolites in Pseudomonas aeruginosa, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 1995, 92, 9427-9431], Erwinia carotovora (composto 37) [Gunter Brader, Solveig Sjõblom, Heidi Hyytiãinen, Karen Sims-Huopaniemi, and E. Tapio Paiva, Altering Substrate Chain Length Specificity of an Acylhomoserine Lactone Synthase in Bacterial Communication, The Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(11) 10403-10409] e Photobacterium phosphoreum (composto 38) [L. R. Flodgaard, P. Dalgaard, J. B. Andersen, K. F. Nielsen, M. Givskov, and L. Gram, Nonbioluminescent Strains of Photobacterium phosphoreum produce the Cell-to-Cell Communication Signal N-(3Hydroxyoctanoyl)homoserine Lactone, Applied and Environmental Microbiology , 2005, 71(4), 2113-2120],
Ainda em outra modalidade específica, os compostos da família III podem ser análogos da sarmentina possuindo a seguinte estrutura:
Figure BRPI1016243B1_D0005
Ha em que R1 é um grupo alquila, alquenila, alquinila, heterociclila, aromático, arila, grupo NH-substituído, ou N, N-substituído e o comprimento da cadeia R1 é 4 a 20 átomos, e de preferencialmente 6 a 12 átomos.
Em que R2 e R3 são grupo alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, aromático, arilalquila, heterociclila ou heteroarila; ou,
26/51 alternativamente, R2 +R3+ N pode ser uma porção heterocíclica contendo N,
Em que, quando R2+R3+N é uma porção heterocíclica contendo N, R1 é um grupo alquila, alquenila, alquinila, heterociclila, NH-substituído, ou N,N-substituído.
Em uma modalidade mais específica, o analógo de sarmentina é N-ciclopentildecanamida, N-(decanoil)pirrolidina, N-(decanoil)piperidina, N(decanoil)hexametilenoimina, N-ciclopentildecenamida, (N-(decenoil) pirrolidina, N-(decenoil)piperidina, N-(decenoil) hexametilenoimina e N(decenoil)piperidina.
Os análogos de sarmentina podem ser obtidos através dos métodos conhecidos na técnica que podem incluir, mas não se limitam aos, estabelecidos no pedido N° de série 61/227.412, depositado em 21 de julho de 2009.
Em uma modalidade específica, o composto pode ser derivado de Pseudomonas fluorescens e caracterizado como contendo uma estrutura de ácido graxo insaturado hidroxilado compreendendo pelo menos uma porção ácido carboxílico, pelo menos uma porção insaturada e pelo menos um grupo álcool; um peso molecular de 285 a cerca de 310 na estrutura do núcleo, pelo menos 15 átomos de carbono e pelo menos 3 oxigênios. Em uma modalidade mais específica da invenção, são fornecidos compostos contendo a estrutura
Figure BRPI1016243B1_D0006
em que: X é, cada um independemtemente, -OH-, -NRt ou -S, em que Ri é -H ou alquila; n = 0a15, R2aR4 são, cada um independentemente, -H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterociclo, heterociclo substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidroxi, halogênio, amino, amido, carboxila, —C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila;. m = ligação dupla ou ligação tripla.
Em uma modalidade mais específica, o composto tem a estrutura
27/51
Ο ΟΗ
Métodos de Produção
Como observado acima, os compostos e composições da presente invenção podem ser obtidos, são obtidos ou derivados de um organismo com as características de identificação de uma espécie de Pseudomonas, mais particularmente, de um organismo com as características de identificação de uma cepa de Pseudomonas fluorescens ou, alternativamente, de um organismo com as características de identificação de Pseudomonas fluorescens isolada, ATCC 55799, conforme estabelecido na Patente US N° 6.194.194. Os métodos compreendem o cultivo destes organismos e obtenção dos compostos e/ou composições da presente invenção, isolando estes compostos a partir das células destes organismos.
Em particular, os organismos são cultivados em um meio nutriente usando métodos conhecidos na técnica. Os organismos podem ser cultivados peio cultivo com agitação do frasco, fermentação em pequena escala ou larga escala (incluindo, entre outros, fermentação contínua, em batelada, em batelada alimentada, ou em estado sólido), em fermentadores laboratoriais ou industriais realizada em meio adequado e em condições que permitam o crescimento celular. O cultivo pode ocorrer em meio adequado de nutrientes compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, utilizando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis ou podem estar disponíveis a partir de fontes comerciais ou preparados de acordo com composições publicadas. Uma modalidade específica é descrita nos exemplos abaixo e na Patente US N° 6.194.194.
Após o cultivo, as células podem ser concentradas e posteriormente suspensas em um tampão para obter uma suspensão celular. Os compostos e/ou composições da presente invenção podem ser extraídos da suspensão. O extrato pode ser fracionado por cromatografia. O ensaio de cromatografia pode ser usado para a atividade tóxica contra os moluscos, como mexilhões, caracóis (por exemplo, aquático e/ou caracóis de jardim) e/ou lesmas, usando métodos conhecidos na técnica; uma modalidade em particular é descrita nos exemplos, abaixo. Este processo pode ser repetido
28/51 uma ou mais vezes usando os mesmos ou diferentes métodos cromatográficos.
Os compostos da presente invenção também podem ser obtidos por métodos sintéticos. Altemativamente, para os compostos de peptídeo, os compostos podem ser obtidos expressando sequências de ácidos nucleicos que codificam esses compostos em um hospedeiro de DNA recombinante usando métodos conhecidos na técnica.
Formulações
A composição da presente invenção pode incluir um produto químico ou biopesticida que é útil no controle de moluscos, especialmente os membros das classes Gastropoda e/ou Bivalvia e mais particularmente, mexilhões, caracóis e lesmas. A invenção é dirigida a compostos isolados obtidos ou derivados de (a) micro-organismos, em particular, espécies de Pseudomonas, mais particularmente, Pseudomonas fluorescens ou, alternativamente, um organismo com as características de identificação de Pseudomonas ATCC 55799, (b) é tóxico para um membro de uma classe de moluscos selecionadas do grupo consistindo em Bivalvia, particularmente, mexilhões (por exemplo, Dreissana sp.) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, caracóis aquáticos (por exemplo, espécies de Biomphalaría) e caracóis de jardim, incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, Cantareus sp., Comu sp., Theba sp.), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.) e (c) tem um peso molecular selecionado do grupo consistindo em: cerca de 540 a 550 e cerca de 1280 a 1335, conforme determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS). Estas composições podem ser formuladas em composições que podem ser utilizadas para controlar moluscos, especialmente os membros das classes Gastropoda e/ou Bivalvia e, mais especificamente, mexilhões, caracóis e lesmas.
29/51
Exemplos incluem, entre outros, cloro e substâncias derivadas de uma espécie de Pseudomonas, conforme descrito no exemplo da Patente US 6.194.194. Além disso, os compostos acima descritos e utilizados na invenção podem ser preparados em composições (também referidas alternativamente como formulações) e podem ser formulados em qualquer forma. Exemplos não limitantes de formulações incluem concentrados emulsionáveis (EC), pós umectáveis (WP), líquidos solúveis (SL), aerossóis, soluções concentradas em volume ultrabaixo (ULV), pós solúveis (SP), microencapsulação, grânulos dispersíveis em água, suspensão concentrada (FL), microemulsões (ME), nanoemulsões (NE), etc. Em qualquer formulação aqui descrita, o percentual de ingrediente ativo está dentro de uma faixa de 0,01% a 99,99%. Em uma modalidade específica, as formulações podem ser isentas de tensoativos.
Exemplos de materiais inertes que podem ser usados nas composições da presente invenção incluem, sem limitação, minerais inorgânicos como caulim, mica, gesso, filossilicatos, carbonatos, sulfatos, ou fosfatos; ou materiais botânicos, como produtos de madeira, cortiça, espigas de milho em pó, casca de arroz, casca de amendoim e cascas de nozes. Em uma modalidade específica, o material inerte pode ser obtido ou derivado de um mineral de argila (caulinita, esmectita, atapulgita) em suspensão na água a uma taxa de cerca de 1 a 20 mg/litro que corresponde a aproximadamente 1 a 20 NTU (unidades de turbidez normalizada). Os materiais inertes utilizados para melhorar a sifonagem do mexilhão podem ser aplicados na forma sólida como uma suspensão em solução aquosa, de preferência água, diretamente para a água ou o local (por exemplo, superfície sólida), em que os mexilhões são tratados. Em uma modalidade específica, para melhorar a eficácia do produto, um material inerte, como argila, silte, sedimento ou qualquer outro material sem valor nutritivo e com um tamanho de partícula suficientemente pequeno pode ser suspenso em água antes do tratamento com um produto químico ou um biopesticida.
Métodos de Uso
Os compostos e composições da presente invenção podem ser
30/51 usados para controlar moluscos, em particular, membros das classes Gastropoda e/ou Bivalvia, mais particularmente, mexilhões (por exemplo, espécies de Dreissana) e/ou Gastropoda, particularmente, caracóis, que inclui, entre outros, os caracóis aquáticos (por exemplo, espécies de Biomphalaria) e caracóis de jardim incluindo, entre outros, caracóis marrons de jardim, caracóis brancos de jardim (por exemplo, espécies de Cantareus, espécies de Cornu, espécies de Theba), e/ou lesmas, incluindo, entre outras, lesma cinza de jardim (por exemplo, Deroceras sp.), a lesma em faixas ou de três bandas (por exemplo, Lehmannia sp.), a lesma marrom-amarelada (por exemplo, Limacus sp.), e a lesma de estufa (por exemplo, Milax sp.) em um corpo de água ou em superfícies em que os moluscos como mexilhões, caracóis e/ou lesmas se reúnem ou, alternativamente, como um agente anti-incrustantes em tintas. No caso em que eles são usados como um agente anti-incrustante em tintas, eles estão presentes em uma quantidade antivegetativa, biocida eficaz. Superfícies em que os moluscos como mexilhões, caracóis e/ou lesmas incluem, entre outras, plástico, concreto, madeira, fibra de vidro, tubos de ferro e policloreto de vinila e superfícies cobertas com tintas e/ou revestimentos. Revestimentos podem ser formulados a partir de pigmentos, aglutinantes, aditivos e/ou fluidos transportadores e de preferência aplicados em uma fina película para fornecer proteção ou decoração a uma superfície. O produto final (que contém o composto ativo) será usado em 10 a 200 mg/L, mais especificamente a 25 a 100 mg/L (ppm) ou 25 a 10000 mg/kg. Ele será aplicado tanto como um produto seco ou suspenso na água em canos, estruturas de barragens, tanques de retenção, e águas abertas, tal como córregos, rios, lagos, canais de irrigação, lagoas e lagos através de bombas de aplicação específicas e sistemas de mistura.
Em uma modalidade específica, a presente invenção é dirigida a um método para melhorar a atividade biopesticida e pesticida de materiais utilizados para controlar moluscos invasivos, particularmente mexilhões, compreendendo as etapas de:
1. suspensão do material inerte, tal como argila na água para desencadear a atividade de sifonagem por cerca de 1 a 24 horas antes do
31/51 tratamento químico ou biopesticida;
2. adição de uma substância química ou um biopesticida na água a um nível desejado.
A invenção é também dirigida a um método compreendendo uma etapa de administrar um biopesticida microbiano em combinação com um material inerte como argila para melhorar a absorção e, consequentemente, a mortalidade de mexilhões.
Para ativar a sifonagem do mexilhão, esse tratamento com a argila (turbidez) deve ser realizado por cerca de 1 a 6 horas, geralmente cerca de 3 a 4 horas, e durante cerca de 1 a 24 horas, normalmente cerca de 14 a 18 horas antes do tratamento com um produto químico/pesticida. Alternativamente, o tratamento de turbidez pode ser aplicado simultaneamente com o tratamento químico ou biopesticida.
De acordo com uma modalidade desta invenção, o tratamento de moluscos, como mexilhões, caracóis e lesmas pode ser realizado em frascos de vidro de 500 mL ou em uma biocaixa construída com placas de acrílico. Nos frascos de vidro, a aeração durante o tratamento é fornecida pelo fluxo de ar através das pedras de ar do aquário ligadas a tubulação de náilon. Na biocaixa, a água flui constantemente a uma taxa de 3785,41 cm3 (1 galão) por minuto.
Os materiais para o tratamento de turbidez, bem como para o produto químico/biopesticida podem ser misturados na água por pipetagem ou através de uma bomba peristáltica. Em biocaixas, uma mistura mais uniforme é alcançada através de um misturador de pá no ponto de injeção. As composições da presente invenção podem ser de forma adequada para aplicação direta ou como um concentrado ou composição primária, que requer diluição com uma quantidade adequada de água ou outro solvente antes da aplicação.
A quantidade eficaz dos materiais de turbidez dependerá da aplicação, temperatura da água, se aplicado à água, e a duração do tratamento. Em geral, a composição pode ser aplicada a uma taxa de cerca de 1 a cerca de 20 mg por litro, de preferência a uma taxa de cerca de 5 a cerca de
32/51 mg por litro de modo que a turbidez medida não fique acima de 20 NTU.
EXEMPLOS
O exemplo a seguir é apresentado para descrever modalidades preferidas e utilidades da invenção e não se destina a limitar a invenção a menos que de outra forma declarado nas reivindicações anexas.
EXEMPLO 1: ESTUDOS DE MOLUSCICIDAS
Materiais e Métodos
1. Permite-se que mexilhões quagga se aclimatem nas pequenas placas Petri por 24 horas.
• Despejam-se os mexilhões em uma placa Petri para determinar se os mexilhões estão vivos ou não. Jogam-se fora os mexilhões mortos e vazios.
• Contam-se 10 mexilhões vivos/saudáveis.
• Colocam-se 10 mexilhões vivos/saudáveis em cada placa Petri pequena com água dura.
• Mantém-seum prato separado de mexilhões. Estes são os mexilhões extras que serão usados para substituir os mexilhões mortos ou vazios após 24 horas nas placas de outros experimentos.
•Aeração não é necessária devido ao baixo volume de água (DO é alta).
2. Dia de tratamento do mexilhão:
•Verificam-se os mexilhões (Usam-se os bastões de vidro com ponteira de borracha em todos os momentos ao verificar os mexilhões. Só usa-se a pinça para retirar os mexilhões mortos).
• Conta-se para certificar-se que há 10 mexilhões vivos/saudáveis por placa de Petri pequena.
• Obtém-se(têm-se) a(s) amostra(s) pronta(s).
• Dilui-se adequadamente com água dura em um tubo falcon de 50ml para cada amostra. Submete-se a vórtice para misturar antes da dosagem.
• EX: 70 ppm, 2 repetições por amostra. Adicionam-se 34ml de água dura dentro do tubo falcon. Adicionam-se 51 ul da amostra dentro do
33/51 mesmo tubo falcon com água dura. Submete-se a vórtice para misturar antes da dosagem.
3. Dosagem:
• Submete-se a vórtice a amostra antes da dosagem.
• Usando uma pipeta sorológica de 25ml, pipeta-se para cima e para baixo para misturar. Pipetam-se 15ml da mistura em cada placa Petri pequena. Deixa-se que os mexilhões se acomodem em repouso por 24 horas. Observam-se a data e hora.
4. 24 horas após o tratamento:
•Após 24 horas depois da dosagem, retira-se a água tratada e verifica-se a mortalidade de mexilhões.
• Despeja-se a água tratada. Enxagua-se com água dura limpa 3 vezes antes de acrescentar água para cada placa Petri pequena.
• Repete-se esse processo para todas as placas Petri.
•Todas as placas Petri devem ser autoclavadas após o teste.
Após serem autoclavados, os frascos serão lavados com água.
5. Calcula-se a mortalidade • Mortalidade (%) = 100 * (Total de mexilhões mortos no tratamento-total de mexilhões mortos no controle)/ Total de mexilhões no tratamento.
Estudos com Compostos Comerciais
Compostos comerciais obtidos da Sigma-Aldrich foram examinados em uma concentração final de 11,1 pg/ml. Os resultados são apresentados na tabela 1.
34/51
Tabela 1. Efeito Moluscicida de Compostos Comerciais
96 h o o o o o o 96,7±5,8
72 h o o o o o o 96,7±5,8
48 h o o o o o o 96,7±5,8
24 h o o o o o o 86,7±5,8
Cone [pg/ml] T“ 11,1 V“ 11,1 V* V” T“ [‘ΙΛ V“ T“
Estrutura Oh Y-Fenil-y-butirolactona γ-heptalactona γ-octalactona γ-nonalactona γ-decanolactona γ-undecalactona o
O SAR-013 SAR-011 SAR-010 SAR-008 SAR-014 SAR-009 SAR-001
35/51
96 h o o o +1 o o 76,7 ±15,3
72 h o o 10± 10 o 73,3± 11,5
48 h o o o -H O o 66,7±15,3
24 h o o 3,3±5,7 o o -H O CO
Cone [pg/ml] 11,1 T- 11,1 -
Estrutura γ-dodecalactona Ácido-4- hidroxidodecanóico Ácido dodecanóico o \/° « \ ° / ü / co \ ro > o / ° \ 5 \ t-* / 1 / VO δ-miristolactona a-heptil- γ-butirolactona
O H SAR-006 SAR-005 SAR-003 SAR-004 SAR-002
36/51
Compostos sintéticos
Compostos sintetizados são avaliados contra o mexilhão quagga na concentração final de 11,1 pg/ml. O procedimento a seguir é usado para obter os compostos.
Síntese de amidas: À solução de ácido carboxílico resfriado com gelo (3 mmols) em diclorometano (20 ml) é adicionada sequencialmente 1etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodi-imida (3,3 mmols) e 4dimetilaminopiridina (3 mmols). Após 5 min, amina (3,3 mmols) é adicionada na solução de reação. A reação é lentamente aquecida à temperatura ambiente e permanece durante a noite. A reação é extraída com acetato de etila (200 mL). A fase orgânica é seca com sulfato de sódio anidro. Após a evaporação a vácuo, o resíduo passa através de uma coluna de sílica-gel com uma relação adequada de acetato de etila em hexano. O rendimento dos produtos finais varia entre 85% a 90%. Os produtos finais são caracterizados com RMN de prótons.
N-ciclopentilcinamamida (SAR-023): IH RMN (CDC13): δ (ppm)
7.62 (d, J=15,6 Hz, IH), 7,50 (d, J=7,0 Hz, 2H), 7,35 (m, 3H), 6,37 (d, J=15,6, IH), 5,61 (d, J= 5,0, Hz, IH, NH), 4,35 (sexteto, J=7,0, IH), 2,06 (m, 2H), 1,71 (m, 2H) , 1,64 (m, 2H), 1,46 (m, 2H).
N-(trans-cinamoil)pirrolidina (SAR-024): IH RMN (CDC13): δ (ppm) 7,70 (d, J=15,5 Hz, IH), 7,53 (d, J=7,0 Hz, 2H), 7,36 ( m, 3H), 6,74 (d, J=15,5, IH), 3,63 (t, J=7,0, 2H), 3,60 (t, J=7,0, 2H), 2,01 (quinteto, J=7,0, 2H), 1,91 (quinteto, J=7,0, 2H).
N-(trans-cinamoil)piperidina (SAR-025): IH RMN (CDC13): δ (ppm) 7,64 (d, J=15,5 Hz, IH), 7,52 (d, J=7,2 Hz, 2H), 7,36 (m, 3H), 6,90 (d, J=15,5, IH), 3,67 (s, 2H), 3,59 (s, 2H), 1,68 (m, 2H), 1,62 (m, 4H), N-(transcinamoil) hexametilenoimina (SAR-026): IH RMN (CDC13): δ (ppm) 7,70 (d,J=15,4 Hz, IH), 7,52 (d, J=7,6 Hz, 2H), 7,36 (m, 3H), 6,88 (d, J=15,4, IH),
3.63 (t, J=6,0, 2H), 3,61 (t, J=6,0, 2H), 1,76 (m, 4H), 1,59 (m, 4H).
N-ciclopentildecanamida (SAR-020): IH RMN (CDC13): δ (ppm)
5,35 (br, IH), 4.22 (sexteto, J=7,00, IH), 2,12 (t, J=7,20, 2H), 1,98 ( m, 2H),
1,59-1,67 (m, 6H), 1,26-1,36 (m, 14H), 0,88 (t, J=7,00, 3H).
37/51
N-(decanoil) pirrolidina (SAR-007): IH RMN (CDC13): δ (ppm) 3,45 (t, J=6,80, 2H), 3,40 (t, J=6,80, 2H), 2,24 (t, J=7,20, 2H), 1,94 (quinteto, J=6,80, 2H), 1,84 (quinteto, J=6,80, 2H), 1,62 (quinteto, J=7,20, 2H), 1,251,30 (m, 12H), 0,87 (t, J=7,20, 3H).
N-(decanoil) piperidina (SAR-021): IH RMN (CDC13): δ (ppm) 3,55 (t, J=5,20, 2H), 3,39 (t, J=5.20, 2H), 2,31 (t, J=7,60, 2H), 1,58-1,65 (m, 4H), 1,52-1,57 (m, 4H), 1,20-1,30 (m, 12H), 0,87 (t, J=7,20, 3H).
N-(decanoil)hexametilenoimina (SAR-022): IH RMN (CDC13): δ (ppm) 3,52(t, J=6,00, 2H), 3,42 (t, J=6,00, 2H), 2,30(t, J=7,80, 2H), 1,66-1,74 (m, 4H), 1,60-1,66 (m, 2H), 1,50-1,6,0 (m, 4H), 1,20-1,30 (m, 12H), 0,87 (t, J=7,20, 3H).
N-ciclopentildecenamida (SAR-027): IH RMN (CDC13): δ (ppm)
6,82 (dt, JI=15,20,J2=7,20, IH), 5,71 (d, J=15,20, IH), 5,33 (br, IH), 4.27 (sexteto, J=7,00, IH), 2,15 (m, 2H), 2,10 (m, 2H), 1,67 (m, 2H), 1,60 (m, 2H), 1,40 (m, 4H), 1,28 (m, 8h), 0,88 (t, J=7,00, 3H).
N-(decenoil)pirrolidina (SAR-030): IH RMN (CDC13): δ (ppm) 6,90 (dt, JI=15,20, J2=7,00, IH), 6,07 (d, J=15,20, IH), 3,52 (t, J=6,30, 2H), 3,50 (t, J=6,30, 2H), 2,19 (m, 2H), 1,96 (quinteto, J=7,00, 2H), 1,85 (quinteto, J=7,00, 2H), 1,44 (m, 2H), 1,28 (m, 8H), 0,88 (t, J=7,00, 3H).
N-(decenoil)piperidina (SAR-031): IH RMN (CDC13): δ (ppm)
6,82 (dt, JI=15,20, J2=7,00, IH), 6,23(d, J=15,20, IH), 3,59 (t, J=6,30, 2H), 3,47(t, J=6,30, 2H), 2,17 (m, 2H), 1,64 (quinteto, J=5,60, 2H), 1,56 (quinteto, J=5,60, 4H), 1,44 (quinteto, J=7,00, 2H), 1,28 (m, 8H), 0,88 (t, J=7,00, 3H).
N-(decenoil)hexametilenoimina (SAR-032): IH RMN (CDC13): δ (ppm) 6,91 (dt, JI=15,20, J2=7,00, IH), 6,21 (d, J=15,20, IH), 3,57 (t, J=6,00, 2H), 3,49(t, J=6,00, 2H), 2,17 (m, 2H), 1,73 (m, 4H), 1,56 (m, 4H), 1,45 (m, 2H), 1,28 (m, 8H), 0,88 (t, J=7,00, 3H).
N-(decenoil)piperidina (SAR-033): IH RMN (CDC13): δ (ppm)
6,82 (dt, JI=15,20, J2=7,00, IH), 6,23(d, J=15,20, IH), 3,59 (t, J=6,30, 2H), 3,47(t, J=6,30, 2H), 2,17 (m, 2H), 1,64 (quinteto, J=5,60, 2H), 1,56 (quinteto, J=5,60, 4H), 1,44 (quinteto, J=7,00, 2H), 1,28 (m, 8H), 0,88 (t, J=7,00, 3H).
Os resultados são apresentados na tabela 2.
38/51
Tabela 2. Potência de amidas sintetizadas em direção aos mexilhões quagga
96 h 75 ±7 65 ±21 . 65 ±7 45 ±21 O o o
X““ M
b- CM V“ x—
-H +1 -H +1
CM lo LO O o
b- b- LO CO Xt O o o
M
x~ CM s-
x; ’ή Ή +4 Ή
co LO O LO O
b- LO LO O o o
b- b- CM b-
XZ Ή +1 +1 +1
'St m LO LO LO
CM b- CO LO CO o o o
F
CD
ZL
o c X— X“~ X— X- X“
o v— V” T*~ x— X- x~ X—
o *“ X“ X X“
P 0 0 0
rz
v=° >=o o=/ Q o
/ > / A 2X o
/ \ / z—7
\ \ \ / °\ o=/
05 / / / \ >/ \ \
u. y \ \ ) //
Z3 \ \ \ / <z (
M—» / / / \ \_, \ \
23 L— » \ ξ ) ΛΛ ΛΛ
ω ) / y \ / \ / \ /
LU / x \=7 \=J \=/
o b- CM co IO
CM o CM CM CM CM CM
O o O O O O O
£ ά ά ύ {£ ύ ά
O < < < < < < <
Ü) w CO w V) CO cn
39/51
XZ ±7 ±28 Mt Ή ±21
96 o 95 40 O 00 75
xz ±7 ±35 Ν’ Ή x— CN Ή
72 o 95 35 Ο 00 75
xz ±7 ±35 ±14 τ— CN -H
48 o 95 35 50 75
xz ±7 ± 14 l ±21 ±14
24 o 85 20 45 70
,E
d> zx
o cz o O 'l T“ 111 V“*
Q zx O O o
o 0=7 / o=7 / o= // 0=1 z—y //
C0 u_ ZJ o= $ $
Z3 ·♦-» ω LU o < <
026 027 031 -032 -033
O 2 SAR- SAR- SAR- SAR- SAR-
40/51
EXEMPLO 2. EXTRATOS DE ERWINIA
Erwinia carotovora é cultivada em caldo LB (por litro: 10 g triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCI, pH=7,5). O inóculo é cultivado por estrias em uma placa TSA (ágar de soja tríptica) de um estoque de glicerol. A pureza da cultura é confirmada através de inspeção visual da morfologia das colônias. Usando uma alça estéril de 10 pL, colônias são coletadas da superfície do ágar e ressuspensas em 50 ml de caldo LB em Erlenmeyer sem chicanas de 250 mL com tampa de rosca. A cultura líquida é incubada por 48 a 72 horas a 200 rpm e 25°C.
Após 72 h, todo o caldo é extraído com acetato de etila. A fase orgânica é seca a vácuo. O extrato seco é feito uma solução de 5,0 mg/mL em sulfóxido de dimetila (DMSO). Então, essa solução (100 pL) é adicionada em 45 mL de água dura. A concentração final dos extratos de acetato de etila é de 11,1 ppm.
Os dados apresentados na tabela 3 indicam que os compostos bioativos contra o mexilhão quagga são produzidos em Erwinia carotovora quando cultivada nos meios LB. O composto 37 (figura 1b) descrito acima é uma das lactonas produzidas por E. carotovora cultivada em meio LB [Gunter Brader, Solveig Sjoblom, Heidi Hyytiainen, Karen Sims-Huopaniemi, and E. Tapio Paiva, Altering Substrate Chain Length Specificity of an Acylhomo serine Lactone. Synthase in Bacterial Communication, The Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(11) 10403-10409],
Tabela 3: Eficácia de extratos de acetato de etila de Erwinia carotovora cultivados em caldo LB
Tratamento % mortalidade (24 h) % mortalidade (48 h) % mortalidade (72 h) % mortalidade (96h) % mortalidade (120 h) % mortalidade (144 h)
Erwinia carotovora 30 ±0 75 + 7 80 ±0 80 ±0 80 ±0 90 ± 14
Branco 0 0 0 0 0 0
Exemplo 3: ISOLAMENTO DE COMPOSTOS MOLUSCICIDAS
DE PSEUDOMONAS
Estudo A
41/51
Fracionamento de Compostos
O procedimento a seguir é utilizado para o fracionamento dos compostos extraídos de células lavadas de Pseudomonas fluorescens CL145A:
O pélete celular derivado da fermentação de 10-L de P. fluorescens CL 145 A (ATCC 55799) no meio de crescimento FM2 é suspenso em tampão de diluição e extraído com resina Amberlite XAD-7 (Asolkar, R. N., Jensen, P. R., Kauffman, C. A., Fenical, W. 2006. Daryamides A-C, Weakly Cytotoxic Polyketides from a Marine-Derived Actinomycete of the Genus Streptomyces strain CNQ-085 / Nat. Prod. 69:1756-1759; Williams, P. G., Miller, E. D., Asolkar, R. N., Jensen, P. R., Fenical, W. 2007. Arenicolides AC, 26- Membered Ring Macrolides from the Marine Actinomycete Salinispora arenicola. J. Org. Chem. 72:5025-5034) por agitação da suspensão de células com resina a 225 rpm por duas horas à temperatura ambiente. A resina e a massa de células são coletadas por filtração através de gaze e lavadas com água Dl para remover os sais. A resina, a massa de células, e a gaze são então, embebidas por 2 h em acetona, depois a acetona é filtrada e seca a vácuo utilizando evaporador rotativo gerando o extrato bruto. O extrato bruto é então fracionado usando cromatografia líquida de fase reversa a vácuo C18 (H2O/CH3OH; gradiente 90:20 de 0:100%) para gerar 7 porções. Estas porções são então concentradas até secura utilizando evaporador rotativo e os resíduos resultantes secos são analisados para atividade biológica utilizando tanto um bioensaio com frascos de teste com mexilhões quagga vivos quanto um ensaio baseado em célula com uma linha de células embrionárias de caracol de água doce (Biomphalaria glabrata). Os bioensaios são descritos mais detalhadamente nos exemplos #2 e #3. As porções ativas são então submetidas a HPLC de fase normal/reversa (Spectra System P4000 (Thermo Scientific) para gerar compostos puros, que são então analisados em bioensaios acima mencionados para localizar/identificar os compostos ativos. Para confirmar a identidade do composto, dados espectroscópicos adicionais, como LC/MS e RMN são gravados.
Um diagrama do método utilizado é mostrado na figura 3. Base42/51 ado em ambos os mexilhões vivos e no teste celular de caracol, as porções #4 e #5 contêm compostos ativos. De todos os compostos separados por HPLC (coluna C-18 , sistema de solvente de gradiente de água:acetonitrila (0 a 10 min.; 30 a 40% de CH3CN aquoso, 10 a 20 min.; 40 a 60% de CH3CN aquoso, 20 a 60 min.; 60 a 80% de CH3CN aquoso, 60 a 65 min., 80 a 100% de CH3CN aquoso) em vazão de 2,5 mL/min e detecção UV de 210 nm, número de picos 20, tempo de retenção 51,66 min, 21, tempo de retenção 52,56 min e 22A tempo de retenção 59,61 min inibem o crescimento (por exemplo, valor de OD600 baixo) de células de caracol no bioensaio.
A análise de espectroscopia de massa de picos ativos é executada em um instrumento de eletropulverização Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus eletropulverização (ESI) utilizando ambos os modos de ionização positivo e negativo no modo de varredura completa (m/z 100 a 1500 Da) em um Espectrômetro de Massa DECA LCQ XPplus (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA). Instrumento térmico de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) equipado com detector Finnigan PDA Surveyor plus, amostrador automático plus, bomba de MS e uma coluna Luna C 18 M 5 4,6 mm x 100 mm (Phenomenex). O sistema de solventes é constituído de água (solvente A) e acetonitrila (solvente Β). A fase móvel começa com 10% do solvente B e é linearmente aumentada para 100% de solvente B após 20 min e depois mantido por 4 min e, finalmente, retorna a 10% solvente B após 3 min e mantido por 3 min. A vazão é de 0,5 mL/min. O volume de injeção foi de 10 PL e as amostras são mantidas à temperatura ambiente em um amostrador automático. Os compostos são analisados por LC-MS utilizando o LC e cromatografia de fase reversa. A análise de espectroscopia de massa dos compostos presentes é realizada sob as seguintes condições: A taxa de fluxo do gás nitrogênio foi fixada em 30 e 15 arb para o revestimento e aux/taxa de fluxo de gás de varredura, respectivamente. Ionização por eletropulverização foi realizada com uma tensão de pulverização fixada em 5000 V e uma tensão capilar em 35,0 V. A temperatura capilar foi de 400°C. Os dados foram analisados no software Xcalibur. O composto ativo no pico #20 tem uma massa molecular de 1294,75 no modo de ionização positiva. O cromatogra43/51 ma LC-MS para outro composto ativo (pico #22A) sugere uma massa molecular de 1320,83 no modo de ionização positiva.
Para elucidação da estrutura, o composto parcialmente purificado do pico ativo #20 será novamente analisado usando um instrumento de RMN 600 MHz, e tem valores δ em δ9,25, 8,36, 8,06, 7,82, 7,71, 7,52, 7,45, 6,82, 6,36, 6,08, 5,42 , 5,39, 5,30, 5,14, 4,68, 4,42, 4,31, 4,16, 4,11, 4,07, 3,95-3,86, 3,83, 3,72, 3,66, 3,53, 3,48, 3,37, 3,17, 3,06, 2,56, 2,53, 2,45, 2,32, 2,21, 2,02 , 1,96, 1,84, 1,72, 1,65, 1,61, 1,51, 1,48-1,37, 1,32, 1,12,
0,94, 0,91, 0,68 no CDCI3. Os dados de RMN indicam que o composto contém grupos amino, éster, ácido carboxílico, fenila, indol, metila alifática, etila, metileno, oximetileno, metino, o-metila, oximetino e enxofre.
Da mesma forma, a análise HPLC em uma coluna C-18 e sistema de solvente de acetonitrila/água (0 a 10 min.; 35 a 45% de CH3CN aquoso, 10 a 20 min.; 45 a 60% de CH3CN aquoso, 20 a 50 min.; 60 a 85% de CH3CN aquoso, 50 a 60 min.; 85 a 100% de CH3CN aquoso, 60 a 70 min., 100% CH3CN) em vazão de 10 mL/min e detecção UV de 210 nm da porção ativa #4 utilizando bioensaio de fracionamento guiado gerou picos múltiplos com atividade contra ambos os mexilhões vivos e as células de embrião de caracol. A maior parte da atividade está concentrada nos picos #27 com tempo de retenção de 47,73 min e #30 com tempo de retenção de 51,52 min.
Os picos #27 e #30 são ainda analisados por LC/MS. Com base nos resultados, o pico #27 contém vários compostos com os dois principais componentes possuindo uma massa de grosseiramente 643 e 984. O pico #30 contém menos compostos, e a análise de massa sugere uma massa molecular em torno de 546 para o principal componente do pico.
Teste de Bioensaio de mexilhão
Este teste de bioensaio com mexilhão vivo é usado para guiar a identificação de compostos ativos por meio de fracionamento da amostra usando HPLC e LC-MS como ferramentas analíticas.
Vinte mexilhões quagga recém-coletados são colocados num frasco contendo 250 mL de água sem cloro da torneira em temperatura am44/51 biente. Os frascos são mantidos à temperatura ambiente e conectados em um tubo de distribuição fornecendo suprimento de ar constante através de borbulhamento. Cada amostra de teste (porção de HPLC ou pico) dissolvida em DMSO é pipetada em frascos separadamente em uma concentração de 1 a 5 mg, e os mexilhões são incubadas com a amostra de teste por 24 horas. Após o período de incubação, a água em cada frasco é descartada, e os mexilhões são lavados com água fresca e transferidos para placas Petri abertas por um período de observação de 10 dias. Mexilhões são verificados diariamente para a mortalidade e os mexilhões mortos são retirados e descartados. Cada tratamento é realizado em três repetições, e no final do período de incubação de 10 dias, a% de mortalidade é calculada para cada tratamento.
Ensaio Baseado em Células
Como um método alternativo, este ensaio baseado em células é utilizado como uma ferramenta para facilitar o isolamento e identificação de compostos ativos nas células P. fluorescens após a fermentação. Células embrionárias de um caramujo de água doce (Biomphalaría glabrata, ATCC CRL-1494) são utilizadas como um sistema modelo para as células epiteliais da glândula digestiva do mexilhão conhecidas por serem suscetíveis às biotoxinas de P. fluorescens. Para o ensaio, 200 uL de células que crescem ativamente em um meio de crescimento completo contendo meio de Drosophila, soro fetal bovino, d-galactose, e lactoalbumina são adicionados em cada poço de uma placa estéril de 96 poços. O composto de teste (porção de HPLC ou pico em 20 mg/mL) dissolvido em DMSO é adicionado em cada poço, e a placa é coberta e incubada em ambiente controlado a 23°C e 5% de CO2. A atividade (inibição do crescimento = baixa turbidez) é medida a 600 nm usando um leitor de placas SpectraMax com o software Pro SoftMax, e comparado ao controle negativo com DMSO puro como um composto de teste. Cada tratamento é executado em quatro repetições, e um tratamento com controle positivo replicado é incluído em cada prato.
45/51
Estudo Β
Materiais e Métodos
O procedimento a seguir é usado para a purificação de compostos extraídos da cultura de células de Pseudomona fluorescens e é resumido na figura. 3. Especificamente, o pélete celular derivado da fermentação 10-L. de P. fluorescens CL 145 A (ATCC 55799) no meio de crescimento FM2 é suspenso em tampão de diluição e extraído com resina Amberlite XAD-7 (Asolkar, R. N., Jensen, P. R., Kauffman, C. A., Fenical, W. 2006. Dary amides A-C, Weakly Cytotoxic Polyketides from a Marine-Derived Actinomycete of the Genus Streptomyces strain CNQ-085 / Nat Prod. 69:1756-1759; e Williams, P. G., Miller, E. D., Asolkar, R. N., Jensen, P. R., Fenical, W. 2007. Arenicolides A-C, 26- Membered Ring Macrolides from the Marine Actinomycete Salinispora arenicola. J. Org. Chem. 72:5025-5034) por agitação da suspensão de células com resina a 225 rpm por duas horas à temperatura ambiente. A resina e massa de células são coletadas por filtração através de gaze e lavadas com água Dl para remover os sais. A resina, massa de células, e a gaze são então, embebidas por 2 h em acetona depois a acetona é filtrada e seca a vácuo utilizando evaporador rotativo gerando o extrato bruto. O extrato bruto é então fracionado usando cromatografia líquida de fase reversa a vácuo C18 (H2O/CH3OH; gradiente 90:20 de 0:100%) para dar 7 frações. Estas frações são então concentradas à secura utilizando evaporador rotativo e os resíduos resultantes secos são analisados para atividade biológica utilizando tanto um bioensaio com frascos-teste com mexilhões quagga vivos quanto um ensaio baseado em célula com uma linha de células embrionárias de caracol de água doce (Biomphalaria glabrata). As frações ativas são então submetidas à HPLC de fase reversa (Spectra System P4000 (Thermo Scientific) gerando compostos puros, que são então analisados em bioensaios acima mencionados para localizar/identificar os compostos ativos. Para confirmar a identidade do composto, dados espectroscópicos adicionais, como LC/MS e RMN são gravados.
A porção ativa 4 é ainda subfracionada usando cromatografia por exclusão de tamanho Sephadex LH 20 gerando 7 subtrações. A purifica46/51 ção do Pilferolide A e do ácido 11-hidróxi-12-eno-octadecanoico é realizada por HPLC usando coluna C-18 (Phenomenex, Luna 10u C18 (2) 100 A, 250 x 30), sistema de solvente de gradiente de água:acetonitrila (0 a 10 min.; 50 a 60% de CH3CN aquoso, 10 a 20 min.; 60 a 75% de CH3CN aquoso, 20 a 45 min; 75 a 100% de CH3CN aquoso, 45 a 55 min; 100% de CH3CN, 55 a 70 min; 100 a 50% de CH3CN aquoso) em vazão de 8 mL/min e detecção UV de 210 nm, os picos ativos número 21, tempo de retenção 45,59 min, e 23, tempo de retenção 48,53 min.
A análise de espectroscopia de massa de picos ativos é executada em um instrumento de eletropulverização Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus (ESI) utilizando ambos os modos de ionização positivo e negativo no modo de varredura completa (m/z 100-1500 Da) em um Espectrômetro de Massa DECA LCQ XPplus (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA). Instrumento térmico de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) equipado com detector Finnigan PDA Surveyor plus, amostrador automático plus, bomba de MS e uma coluna Luna C 18 M 5 4,6 mm x 100 mm (Phenomenex). O sistema de solventes é constituído de água (solvente A) e acetonitrila (solvente Β). A fase móvel começa com 10% do solvente B e é linearmente aumentada para 100% de solvente B após 20 min e depois mantida por 4 min e, finalmente, retorna a 10% solvente B após 3 min e mantida por 3 min. A vazão é de 0,5 mL/min. O volume de injeção foi de 10 pL e as amostras são mantidas à temperatura ambiente em um amostrador automático. Os compostos são analisados por LC-MS utilizando o LC e cromatografia de fase reversa. A análise de espectroscopia de massa dos compostos presentes é realizada sob as seguintes condições: A taxa de fluxo do gás nitrogênio foi fixada em 30 e 15 arb para o revestimento e taxa de fluxo de gás aux/varredura, respectivamente, ionização por eletropulverização foi realizada com uma tensão de pulverização fixada em 5000 V e uma tensão capilar em 35,0 V. A temperatura capilar foi de 400°C. Os dados foram analisados no software Xcalibur. O composto ativo Piliferolide A tem uma massa molecular de 295,65 no modo de ionização negativa. O cromatograma LCMS para outro composto ativo sugere uma massa molecular de 297,74 no
47/51 modo de ionização negativa.
Para elucidação da estrutura, o composto purificado Piliferolide A com um peso molecular de 296 será novamente analisado usando um instrumento de RMN 500 MHz, a referência é definida com padrão interno tetrametilsilano (TMS, 0,00 ppm). O composto tem valores 1H RMN de δ 5,62,
5,42, 4,55, 3,97, 2,58, 2,35, 2,04, 1,88, 1,73, 1,64, 1,54, 1,39, 0,92 e tem valores de RMN 13C de 179,1, 133,3, 131,3, 81,9, 72,6, 37,3, 35,4, 32,1, 31,3, 29,5, 29,4, 29,0, 28,6, 27,8, 25,4, 25,3, 22,5, 13,3. A ID detalhada e análise de RMN 2D confirmam a estrutura do composto como Piliferolide A como o composto conhecido.
O segundo composto purificado com um peso molecular 298 será novamente analisado usando um instrumento de RMN 500 MHz, e tem valores 1H RMN de δ 5,61, 5,41, 3,96, 2,27, 2,04, 1,69, 1,51, 1,42, 1,32, 0,92 e valores 13C RMN de δ 176,6, 133,2, 132,6, 73,5, 37,5, 33,9, 32,4, 31,6, 29,8, 29,7, 29,6, 29,4, 29,3, 29,1, 25,7, 24,9, 22,8, 14,3. A ID detalhada e análise de RMN 2D confirmam a estrutura do composto que não é relatado para a fonte microbiana; de fórmula molecular Ci8H34O3. A estrutura do composto ácido 11-hidróxi-12-eno-octadecanoico é mostrada abaixo;
Figure BRPI1016243B1_D0007
A potência dos compostos isolados de cultura celular de Pseudomonas é testada utilizando procedimentos descritos acima. Os resultados são apresentados abaixo na tabela 4.
48/51
Tabela 4. Efeitos moluscicidas de Piliferolide A e ácido 11-hÍdróxi-12-eno-octadecanoico
Figure BRPI1016243B1_D0008
49/51
EXEMPLO 5: EFEITOS DO CAULIM
O efeito da argila de caulim sobre a eficácia de um biopesticida microbiano baseado em bactérias P. fluorescens é testado em um estudo realizado em biocaixa a 11,8°C. No primeiro dia do experimento, argila de caulim é aplicada à biocaixa de uma solução estoque concentrada através de uma bomba peristáltica de modo que a turbidez final na biocaixa seja de aproximadamente 20 NTU (unidades de turbidez normalizada). Cinquenta mexilhões quagga são colocados em tubos de acrílico medindo 1 pé fechado com uma malha de nylon em ambas as extremidades, e os tubos são colocados no fundo da biocaixa para o tratamento. A duração da aplicação de argila é de 6 horas, e depois os mexilhões nos tubos de acrílico foram expostos à água corrente fresca na biocaixa por 18 horas. No dia seguinte, a argila extra é removida do fundo da biocaixa, e o biopesticida em suspensão aquosa foi aplicado através de uma bomba peristáltica para uma concentração final de 200 ppm. Após o tratamento de 6 horas com o biopesticida, os mexilhões nos tubos são incubados na biocaixa com água corrente fresca a uma taxa de 1 galão por minuto. Mexilhões são observados e contados semanalmente por 5 semanas para a determinação da% de mortalidade. Os tratamentos de controle incluem um controle sem tratamento, um tratamento somente com argila de caulim (sem biopesticida) e um tratamento somente com biopesticida (sem pré-tratamento com argila). Todos os tratamentos são executados em três repetições.
Os resultados apresentados na tabela 5 e figura 4 mostram um aumento significativo na mortalidade de mexilhões expostos à argila de caulim 18 horas antes do tratamento biopesticida comparado com mexilhões com pré-tratamento sem argila. Este fenômeno pode ser explicado pelo aumento da atividade de sifonagem de mexilhões coletados e tratados em água fria (11,8°C) durante o período de baixa atividade biológica. Este aumento na atividade de sifonagem resulta em maior absorção do produto pesticida, o que resulta em aumentada mortalidade do mexilhão.
Tabela 5. Eficácia do biopesticida expressa como% de mortalidade medida em cada ponto do tempo (dias)
50/51 % mortalidade
1 9 16 21 27 34
Controle não tratado 0 0 0 0 0 0
Caol1n2ONTU 0 0 0 0 0 1
Caolin2QNTU + 200ppm 0 35 64 n 77 83
200 ppm 0 22 46 55 58 63
Exemplo 6: Efeitos da Gama-Dodecalactona e N-decenoil)
pirrolidina em caracóis
Experimentos com Caracol: Primeiramente uma quantidade
apropriada de um composto de teste é dissolvida em acetona (2 mL). A so5 lução foi adicionada em 2,5 gramas de amido de milho e bem misturada. A mistura resultante é transferida para uma placa de Petri (Φ 25 mm). A placa de Petri é então colocada na capa para secagem natural. Após a secagem, água (2 mL) é adicionada na placa de Petri para formar uma pasta.
Caracóis marrons de jardim (Cantareus aspersus) são coletados a partir de um jardim de uma casa e crescidos por pelo menos um dia no laboratório com couve ou cenoura vermelha. Cinco indivíduos com um tamanho semelhante são escolhidos para cada tratamento e transferidos para uma proveta de 1L. Para tornar o caracol ativo, um pouco de água é pulverizada sobre eles e na proveta usando um pulverizador de mão. Após a pulve15 rização de água, a placa de Petri com produtos químicos que contêm amido de milho é colocada na proveta, a proveta é coberta no topo com papel alumínio. O comportamento alimentar, a quantidade consumida de amido de milho e a mortalidade em 24 horas são anotados.
Os dados indicam (estabelecidos na tabela 6) que gama20 dodecalactona (SAR-014) a 100 mg/grama de amido de milho repele fortemente os caracóis marrons de jardim. No entanto, N-(decenoil)pirrolidina (SAR-030) em 100 mg/grama de amido de milho mata todos os caracóis marrons de jardim depois que eles comem.
51/51
Tabela 6. Efeitos químicos no caracol marrom de jardim
Contro- le 0 Todos os indivíduos comeram amido de milho Terminaram com todo o 0%
amido milho e de τη 2h
1 SAR-014 100 Todos os indivíduos fugiram rapidamente do amido 0% 24h após 0%
2 SAR-030 100 Quatro indivíduos em cada cinco comeram um pouco do amido e afastaram-se Menos de 5% do amido de milho foram consumidos após 24h Todos os indivíduos que comeram 0 amido de milho morreram
Embora esta invenção tenha sido descrita com referência às modalidades específicas, os detalhes da mesma não devem ser interpreta5 dos como uma limitação, sendo óbvio que se pode usar vários equivalentes, alterações e modificações e ainda se manter dentro do escopo da presente invenção.
Várias referências são citadas ao longo deste relatório, cada uma das quais é aqui incorporada para referência em sua totalidade.
1/1

Claims (2)

REIVINDICAÇÕES
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1. Método para controlar um ou mais moluscos em um local onde o controle é desejado, caracterizado pelo fato de compreender a introdução no dito local pelo menos um de um ou mais compostos, em que os
5 ditos compostos são compostos selecionados de (a) gama-dodecalactona, delta-tridecalactona e alfa-heptil-gamabutirolactona;
(b) uma amida selecionada de /V-ciclopentildecanamida e Nciclopentildecenamida;
10 (c) piliferolida A;
(d) ácido 11-hidróxi-12-eno-octadecanoico; e (e) /V-(decenoil) pirrolidina e controlar dito um ou mais moluscos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 15 fato de os ditos moluscos serem controlados por indução de morte nos ditos moluscos.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e
2, caracterizado pelo fato de que o molusco é um membro de uma classe Gastropoda ou Bivalvia.
20 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
3, caracterizado pelo fato de que o molusco é um Dreissana sp.
Petição 870170052243, de 25/07/2017, pág. 10/21
2/5
BRPI1016243-7A 2009-04-20 2010-04-20 Métodos para o controle de moluscos BRPI1016243B1 (pt)

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