ES2847798T3 - Uso de proteínas para controlar moluscos - Google Patents
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Abstract
Un método para controlar moluscos en una ubicación líquida, que comprende: administrar una cantidad eficaz de una composición que tiene una proteína que es 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, para controlar dichos moluscos en dicha ubicación líquida.
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de proteínas para controlar moluscos
Campo técnico de la invención
La presente divulgación se refiere, en general, al campo de las proteínas que tienen actividad molusquicida.
Antecedentes de latécnica
Sin limitar el alcance de la invención, se describen sus antecedentes en relación con las proteínas que tienen propiedades molusquicidas. La capacidad de los mejillones de colonizar rápidamente nuevas zonas, alcanzar rápidamente altas densidades y unirse a cualquier sustrato duro (p. ej., piedras, troncos, plantas acuáticas, conchas de mejillones nativos, exoesqueletos de langostas, plástico, hormigón, madera, fibra de vidrio, tuberías hechas de hierro y cloruro de polivinilo y superficies cubiertas con pinturas convencionales) hacen posible que causen consecuencias adversas graves. Estas consecuencias incluyen daños de infraestructura dependiente del agua, millones de dólares de incremento en el gasto operativo y daños significativos a sistemas ecológicos.
La gestión de mejillones es muy importante para proteger la infraestructura dependiente de agua y los sistemas ecológicos acuáticos. Existen diversos métodos proactivos y reactivos para controlar y reducir las poblaciones de mejillones. La eliminación reactiva incluye la eliminación mecánica, la eliminación por depredadores, y la eliminación química y bioquímica de mejillones adultos. Por ejemplo, pescados, aves, langostas, cangrejos, sanguijuelas y mamíferos depredan mejillones. Sin embargo, es poco probable que poblaciones invasivas de mejillones sean controladas por depredación natural, especialmente en estructuras hechas por el hombre, tales como tuberías o plantas de bombeo. Las medidas proactivas para controlar los mejillones incluyen cualquier medio mecánico, físico o químico en el que se evita que la etapa de vida del mejillón en fase planctónica (larva velígera) se asiente y crezca hasta llegar a la etapa de vida adulta o se colonice en sustratos duros. Evitar que los mejillones colonicen y crezcan hasta llegar a las etapas de vida adulta también se refiere como prevención de asentamiento. El documento US2013/196013 A1 divulga cepas de Pseudomonas, en particular ATCC 55799 (correspondiente a P. protegens CL145A) para el control de gasterópodos y moluscos. D. Molloy también enseña la cepa de P. protegens CL145A para controlar mejillones cebra y quagga (Journal of Invertebrate Pathology, 2013, vol. 113, páginas 104-114). I. T. Paulsen divulga el genoma de la cepa de P. fluorescens Pf-5, incluyendo una proteína con un 100 % de identidad con la presente proteína reivindicada (Nature Biotechnology, 2005, vol.23(7), 873-878 y Genbank CP000076.1). El documento WO2014/116378 A1 enseña que las proteínas de las cepas de Pseudomonas pueden ser molusquicidas.
Divulgación de la invención
La presente invención incluye un método para controlar moluscos en una ubicación líquida que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición que tiene una proteína que es un 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, para controlar dicho molusco en dicha ubicación líquida. La ubicación líquida puede ser una masa de agua, en una tubería o una pintura.
En otro aspecto, la presente divulgación denota la composición que puede comprender además gama-dodecalactona, delta-tridecalactona, piliferólido A, alfa-heptil-gamma-butirolactona o ácido 11-hidroxi-12-eno-octadecanoico.
Aún en otro aspecto, la dicha composición comprende además un material inerte.
Descripción de los dibujos
Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente invención, se hace referencia ahora a la Descripciónde la invención detallada junto con las figuras anexas y en las que:
La Figura 1 denota una gráfica de la mortalidad de los mejillones de los lisados celulares frente a los días del ensayo con mejillones.
La Figura 2 denota al menos tres proteínas de APM >260 kDa donde la expresión se correlaciona con la mortalidad de los mejillones en la Figura 1.
La Figura 3 es una gráfica de la actividad de fracción.
La Figura 4 es el SDS-PAGE de las fracciones.
Descripción de la invención
Para facilitar la comprensión de esta invención, a continuación, se definen varios términos. Los términos definidos en el presente documento tienen significados como los comúnmente entendidos por un experto habitual en la materia de las áreas relevantes para la presente invención. Los términos como "un", "una" y "el/la" no pretenden referirse únicamente a una entidad en singular, sino que incluyen la clase general de la que se puede usar un ejemplo específico como ilustración. La terminología del presente documento se usa para describir realizaciones específicas de la
invención, pero su uso no delimita la invención, excepto como se describe en las reivindicaciones.
Como se define en el presente documento, "cultivo de caldo entero" o "caldo de células enteras" se refiere a un cultivo líquido que contiene tanto células como medios. Si las bacterias son cultivadas en una placa, las células pueden ser cosechadas en agua u otro líquido, cultivo entero. Las expresiones "cultivo de caldo entero" y "caldo de células enteras" se usan indistintamente.
Como se define en el presente documento, "sobrenadante" se refiere al líquido que permanece cuando las células son cultivadas en caldo o cosechadas en otro líquido de una placa de agar y son eliminadas por centrifugación, filtración, sedimentación u otros medios bien conocidos en la materia.
Como se define en el presente documento, "filtrado" se refiere al líquido de un cultivo de caldo entero que ha pasado por una membrana.
Como se define en el presente documento, "extracto" se refiere a una sustancia líquida eliminada de las células por medio de un disolvente (agua, detergente, tampón, disolvente orgánico) y separada de las células por centrifugación, filtración u otro método.
Como se define en el presente documento, "metabolito" se refiere a un compuesto, sustancia o derivado de una fermentación de un microorganismo, o sobrenadante, filtrado, o extracto obtenido de un microorganismo que tiene actividad pesticida y, particularmente, molusquicida.
Como se define en el presente documento, "vehículo" es un material inerte, orgánico o inorgánico, con el que el principio activo se mezcla o fórmula para facilitar su aplicación a una planta u otro objeto para tratar, o su almacenamiento, transporte y/o manipulación.
Como se define en el presente documento, "controlar moluscos" se refiere a controlar los huevos, larvas, larvas velígeras, y postlarvas velígeras de los moluscos matándolos o inhabilitándolos de modo que no puedan colonizarse, crecer, establecerse, o reproducirse en una ubicación dada.
Como se define en el presente documento, "derivado de" y "que se puede obtener de" significa directamente aislado u obtenido de una fuente particular o alternativamente que tiene características de identificación de una sustancia u organismo aislado u obtenido de una fuente particular. Estos términos se usan indistintamente a lo largo de toda la memoria descriptiva.
Como se define en el presente documento, un "compuesto aislado" está esencialmente libre de otros compuestos o sustancias, p. ej., al menos aproximadamente un 20 % puro, preferentemente al menos aproximadamente un 40% puro, más preferentemente de manera aproximada un 60% puro, incluso más preferentemente de manera aproximada un 80 % puro, lo más preferentemente de manera aproximada un 90 % puro, e incluso lo más preferentemente de manera aproximada un 95 % puro, como se determina por métodos analíticos, incluyendo, pero sin limitación, métodos cromatográficos, métodos electroforéticos. El experto en la materia reconocerá que los porcentajes pueden ser de cualquier valor incremental entre 20-100 % y no es necesario enunciar específicamente a todos y cada uno de los valores abarcados en ese intervalo en el presente documento.
Como se define en el presente documento, una "molécula de ácido nucleico", pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero es, preferentemente, ADN bicatenario.
Como se define en el presente documento, un "vector", pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales al genoma vírico. Determinados vectores son aptos para la replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (p. ej., vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se refieren en el presente documento como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar indistintamente, dado que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. También se divulgan otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (p. ej., retrovirus defectuosos para la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.
Como se define en el presente documento, las expresiones "célula huésped recombinante" y "célula huésped transformada" se usan indistintamente y se refieren a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante y/o una molécula de ácido nucleico aislado. Debe entenderse que dichos términos pretenden referirse
no solo a la célula objeto particular sino a la progenie de tal célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones posteriores debido a una mutación o a influencias ambientales, dicha descendencia no puede, de hecho, ser idéntica a la célula precursora, pero aun así se incluyen dentro del alcance de la expresión "célula huésped", como se usa en el presente documento.
Los siguientes términos se usan para describir las relaciones secuenciales entre un polinucléotido/polipéptido de la presente invención con un polinucleótido/polipéptido de referencia: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de la secuencia", y (d) "porcentaje de identidad de secuencia".
Como se usa en el presente documento, "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como una base para comparación de secuencia con un polinucleótido/polipéptido de la presente invención. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, como un segmento de un ADNc o una secuencia génica de longitud completa, o el ADNc o la secuencia génica completa.
Como se usa en el presente documento, "ventana de comparación" incluye la referencia a un segmento contiguo y específico de una secuencia polinucleotídica/polipeptídica, en donde la secuencia polinucleotídica/polipeptídica puede compararse con una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia polinucleotídica/polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de al menos 20 nucleótidos/aminoácidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más. Los expertos en la materia entienden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia polinucleotídica/polipeptídica, se introduce normalmente una penalización por huecos y se resta del número de coincidencias.
Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Puede llevarse a cabo un alineamiento óptimo de secuencias para su comparación mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988); mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos, incluyendo, pero sin limitación: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Calif.; GAP, BEs Tf IT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., EE.UU; el programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins y Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 (1992), y Pearson et al., Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994).
La familia BLAST de programas que pueden usarse para búsquedas de similitud en bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a bases de datos de proteínas; BLASTP para secuencias de consulta de proteínas frente a bases de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos. See Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 19, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York (1995); Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); y, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).
El software para la realización de análisis BLAST se encuentra disponible al público, p. ej., A través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta valoración (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coincide o satisface algún valor umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina como el umbral del valor de palabra adyacente. Estos aciertos de palabra próxima iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra entonces se prolongan en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo el tiempo que pueda aumentarse el valor de alineamiento acumulativo. Los valores acumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (valor de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre >0) y N (valor de penalización para restos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de valores para calcular el valor acumulativo. La prolongación de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: el valor de alineación acumulativo queda fuera por una cantidad X de su valor conseguido máximo; el valor acumulativo llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con valor negativo; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un límite de 100, M=5, N =-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de valores BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico
de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que sucedería una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad.
Las búsquedas BLAST asumen que las proteínas pueden ser modeladas como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias que pueden ser tractos homopoliméricos, repeticiones de periodos cortos, o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Dichas regiones de baja complejidad pueden ser alineadas entre proteínas no relacionadas, aunque otras regiones de la proteína sean completamente desiguales. Un número de programas de filtro de baja complejidad puede emplearse para reducir dichos alineamientos de baja complejidad. Por ejemplo, Los filtros de baja complejidad SEG (Wooten y Federhen, Comput. Chem., 17:149-163 (1993)) y XNU (Clayerie y States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) pueden emplearse individualmente o en combinación.
A menos que se indique de otro modo, los valores de similitud/identidad de nucleótidos y proteínas proporcionados en el presente documentos se calculan usando GAP (GCP Versión 10) con valores predeterminados.
GAP (Global Alignment Program, programa de alineamiento global) también puede usarse para comparar un polinucleótido o polipéptido de la presente invención con una secuencia de referencia. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970) para hallar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. GAP toma en consideración todos los posibles alineamientos y crea el alineamiento con el mayor número de bases coincidentes y el menor número de huecos.
Permite la provisión de una penalización por creación de huecos y una penalización por extensión de huecos en unidades de bases emparejadas. GAP debe obtener un beneficio por la penalización por creación de huecos por el número de coincidencias para cada hueco que inserta. Si una penalización por extensión de huecos mayor a cero es seleccionada, GAP debe, además, obtener beneficios por cada hueco insertado de la longitud del hueco multiplicado por la penalización por extensión de huecos. Los valores para penalización por creación de huecos por defecto y los valores para penalización por extensión de huecos en la Versión 10 del paquete informático Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos, la penalización por creación de huecos por defecto es 50 mientras que la penalización por extensión de huecos por defecto es 3. Las penalizaciones por creación de huecos y por extensión de huecos pueden expresarse como un número entero seleccionado entre el grupo de números enteros que va de 0 a 100. Por tanto, por ejemplo, las penalizaciones por creación de huecos y por extensión de huecos pueden cada una ser independientemente: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 o superior.
GAP presenta un miembro de la familia de los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro tipos de mérito para alineamientos: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida por el número de bases en el segmento más corto. La Identidad porcentual es el porcentaje de los símbolos que coinciden realmente. La Similitud porcentual es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que están frente a los huecos son ignorados. Una similitud es puntuada cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es superior o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación usada en la Versión 10 del paquete informático Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
El alineamiento múltiple de las secuencias puede realizarse usando el método de alineamiento CLUSTAL (Higgins ay Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros por defecto (PENALIZACIÓN POR HUECOS = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECOS = 10). Los parámetros por defecto para alineamientos por parejas que usan el método CLUSTAL son KTUPLE 1, PENALIZACIÓN POR HUECOS = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES SALVADAS = 5.
Como se usa en el presente documento, "identidad de secuencia" o "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas normalmente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde se sustituyen los residuos de aminoácido por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (p. ej., carga o hidrofobia) y, por lo tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, puede ajustarse por exceso el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por dichas sustituciones conservativas tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la técnica.
Normalmente, esto implica puntuar una sustitución conservativa como un emparejamiento erróneo parcial en lugar de completo, aumentando de este modo el porcentaje de identidad de secuencia. Por tanto, por ejemplo, cuando se asigna a un aminoácido idéntico una puntuación de 1 y se asigna a una sustitución no conservativa una puntuación de cero, se asigna a una sustitución conservativa una puntuación entre cero y 1. Se calcula la puntuación de
sustituciones conservativas, p. ej., de acuerdo con el algoritmo de Meyers y Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17 (1988), p. ej., como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., EE. UU.).
Como se usa en el presente documento, el "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales se encuentra la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.
Una cantidad eficaz se define como la cantidad de proteínas, células de microorganismos, sobrenadante, caldo de cultivo de células enteras, filtrado, fracción o extracto de célula, metabolito y/o compuesto solo o en combinación con otra sustancia pesticida que es suficiente para controlar moluscos. La tasa eficaz puede verse afectada por la especie de la plaga presente, la etapa de crecimiento de la plaga, la densidad de población de la plaga y factores ambientales tales como temperatura, lluvia, hora del día y estacionalidad. La cantidad que estará dentro de un intervalo eficaz en un caso particular puede determinarse mediante pruebas de laboratorio o de campo.
En el presente documento se divulgan métodos para controlar moluscos usando una proteína que tiene un 100 % de homología o identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican dicha proteína SEQ ID NO: 1. Estas moléculas de ácido nucleico pueden ser ADN, ARN, ADNc, ARNc o secuencias análogas. Pueden obtenerse de una cepa de Pseudomonas o por síntesis química o por métodos recombinantes conocidos en la técnica. Se pueden construir, identificar selectivamente y amplificar bibliotecas de ácido nucleico específicamente. Por ejemplo, una biblioteca de ADNc o genómica puede identificarse selectivamente usando una sonda en función de la secuencia de un polinucleótido que se divulga en el presente documento. Las sondas pueden usar para hibridarse con secuencias de ADN o ADNc genómicas para aislar genes homólogos en la misma o en diferentes especies de planta. Los expertos en la materia apreciarán que diferentes grados de rigurosidad de hibridación pueden emplearse en el ensayo; y el medio de hibridación o lavado pueden ser rigurosos.
Los ácidos nucleicos de interés también pueden amplificarse de muestras de ácido nucleico usando técnicas de amplificación. Por ejemplo, se puede usar la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de polinucleótidos descritas en el presente documento y genes relacionados directamente de bibliotecas de ADN genómico o ADNc. PCR y otros métodos de amplificación in vitro pueden también ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que se van a expresar, para hacer que los ácidos nucleicos sean usados como sondas para la detección de la presencia del ARNm deseado en muestras, para secuenciación de ácido nucleico, o para otros fines. La proteína 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim) puede usarse para mejorar el rendimiento de productos PCR largos.
Estas moléculas de ácido nucleico pueden insertarse en vectores. Los vectores pueden ser vectores de expresión. Se proporcionan por tanto vectores de expresión recombinante que contienen una secuencia que codifica estas moléculas de ácido nucleico. El vector de expresión puede contener una o más secuencias polinucleotídicas adicionales, tales como, pero sin limitación, secuencias reguladoras, un marcador de selección, un marcador de purificación o una señal de poliadenilación. Dichos elementos reguladores pueden incluir un promotor de la transcripción, potenciadores, sitios de unión ribosómica de ARNm o secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción.
Los vectores de expresión, especialmente vectores de expresión de mamíferos, pueden incluir uno o más elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y potenciador ligado al gen para expresar, otras secuencias no transcritas flanqueantes 5' o 3', secuencias no traducidas 5' o 3' (tales como sitios de unión a ribosomas necesarios), un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de corte y empalme, sitios de recombinación y secuencias terminadoras transcripcionales. También puede incorporarse un origen de replicación que confiere la capacidad de replicar en un huésped específico.
Los vectores pueden usarse para transformar cualquiera de una amplia gama de células huésped conocidas por los expertos en la materia. Los vectores incluyen, sin limitación, vectores plásmidos, fagémidos, cósmidos, bácmidos, cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC) y baculovirus, así como de otros vectores bacterianos, eucariotas, de levadura y víricos.
Las proteínas pueden obtenerse, o son obtenibles o derivadas de un organismo que tiene las características de identificación de una especie de Pseudomonas, más particularmente, de un organismo que tiene las características de identificación de una cepa de Pseudomonas fluorescens o alternativamente de un organismo con las características dentificatorias de un aislado de Pseudomonas fluorescens, ATCC 55799 de la manera expuesta en la patente de Estados Unidos n.° 6.194.194. Los métodos comprenden el cultivo de estos organismos y opcionalmente la obtención
de las proteínas al aislar estas proteínas de las células de estos organismos.
En particular, los organismos se cultivan en medios de nutrientes usando métodos conocidos en la técnica. Los organismos pueden cultivarse por medio del cultivo de matraz de agitación, fermentación a pequeña escala y a gran escala (incluyendo, pero sin limitación, fermentaciones continua, discontinua, discontinua alimentada o en estado sólido) en laboratorio o fermentadores industriales realizadas en medios adecuados y en condiciones que permitan el crecimiento celular. El cultivo puede tener lugar en medios de nutrientes adecuados que comprenden fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Pueden estar disponibles medios adecuados de fuentes comerciales o preparados de acuerdo con las composiciones publicadas.
Tras el cultivo, un cultivo sustancialmente puro o caldo de cultivo de células enteras que comprende dicha cepa, o fracción celular, sobrenadante, filtrado, compuesto (p. ej., metabolito) y/o extracto de o derivado de dicha Pseudomonas protegens pueden usarse en la formulación de una composición de la presente divulgación. Como alternativa, tras el cultivo, las proteínas y/o metabolitos pueden ser extraídos del caldo de cultivo. Como alternativa, tras el cultivo, las células en el cultivo puro o caldo de cultivo de células enteras puede lisarse. El cultivo lisado puede ser no purificado o purificado y usado en una fórmula para el control de moluscos en un líquido. La purificación puede variar en grado de la eliminación de desperdicio celular y/o ácidos nucleicos, con respecto al aislamiento de clases específicas de compuestos o compuestos individuales que se usan en una formulación para controlar moluscos en un líquido. En una realización, tras el cultivo, las proteínas y/o metabolitos se extraen del caldo de cultivo y se usan en una formulación para controlar moluscos. Como alternativa, tras el cultivo, una fracción de células sustancialmente pura, sobrenadante, filtrado y/o extracto de o derivado de dicha cepa puede usarse en la formulación de una composición para controlar moluscos en una ubicación líquida. Como alternativa, tras el cultivo, una o más proteínas y/o metabolitos pueden extraerse y usarse en la formulación de una composición para controlar moluscos en una ubicación líquida. El extracto puede fraccionarse mediante cromatografía. Las fracciones cromatográficas pueden analizarse para actividad tóxica contra, por ejemplo, moluscos. Este proceso puede repetirse una o más veces usando los mismos o diferentes métodos cromatográficos.
Las proteínas expuestas anteriormente pueden formularse de cualquier manera. Los ejemplos de formulación no limitantes incluyen, pero no se limitan a, concentrados emulsionables (CE), polvos humectables (PH), líquidos solubles (LS), aerosoles, soluciones de concentrado de volumen ultrabajo (VUB), polvos solubles (PS), microencapsulación, gránulos dispersados en agua, fluidos (FL), microemulsiones (ME), nanoemulsiones (NE), etc. En cualquier formulación descrita en el presente documento, el porcentaje del principio activo se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 0,01 % a 99,99 % incluyendo cada variación incremental en el intervalo, aunque no estén explicitamente enunciados.
Las composiciones pueden estar en forma de un líquido, gel o sólido. Una composición sólida puede prepararse suspendiendo un vehículo sólido en una solución de principio o principios activos y secando la suspensión en condiciones suaves, tales como evaporación a temperatura ambiente o evaporación al vacío a 65 °C o menos. Una composición puede comprender un principio o principios activos encapsulados en gel. Dichos materiales encapsulados en gel pueden prepararse mezclando un agente formador de gel (p. ej., gelatina, celulosa, o lignina) con un cultivo o suspensión de Pseudomonas protegens vivas o inactivadas, o un filtrado libre de células o fracción celular de un cultivo o suspensión de Pseudomonas protegens, o un cultivo, célula o fracción celular secado por pulverización o congelación, o en una solución de compuestos pesticidad que se usa en el método de la invención; e induciendo la formación de geles del agente.
La composición puede comprender adicionalmente un tensioactivo para usar para el fin de emulsión, dispersión, hidratación, propagación, integración, control de la disgregación, estabilización de principios activos y mejora de la fluidez o inhibición de roya. En una realización particular, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico no fitotóxico que pertenece preferentemente a la lista de EPA 4B. En otra realización particular, el tensioactivo no iónico es monolaurato de sorbitán de polioxietileno (20). La concentración de tensioactivos puede variar entre aproximadamente 0,1-35 % (incluyendo cada variación incremental en el intervalo, aunque no estén explícitamente enunciados) de la formulación total; un intervalo preferido es de aproximadamente 5-25 % (incluyendo cada variación incremental en el intervalo, aunque no estén explicitamente enunciados)). La elección de agentes de dispersión y emulsión, tales como agentes de dispersión y emulsificación no iónicos, aniónicos, anfotéricos y catiónicos, y la cantidad empleada se determina por la naturaleza de la composición y la capacidad del agente para facilitar la dispersión de las proteínas de la presente divulgación.
En otra realización, las proteínas expuestas en el presente documento pueden usarse en el control de moluscos, particularmente miembros de las clases de Gastropoda y/o Bivalvia y, más particularmente, mejillones, caracoles y babosas.
Métodos de uso. Las proteínas de la presente divulgación (SEQ ID No. 1) pueden usarse para controlar moluscos, particularmente, un miembro de la clase Gastropoda y/o Bivalvia, más particularmente mejillones (p. ej., especie Dreissana) y/o Gastropoda, particularmente, caracoles, que incluye, pero sin limitación, caracoles acuáticos (p. ej., especie Biomphalaria), y caracoles de jardín, incluyendo, pero sin limitación, caracoles de jardín marrones, caracoles de jardín blancos (p. ej., especie Cantareus, especie Cornu, especie Theba), y/o babosas, incluyendo, pero sin
limitación, babosa de jardín gris (p. Ej., Deroceras sp.), la babosa de banda o de tres bandas (p. ej., Lehmannia sp.), la babosa leonada (p. ej., Limacus sp.) y la babosa de invernadero (p. ej., Milax sp.) en una masa de agua o en las superficies donde los moluscos, tales como mejillones, caracoles y/o babosas se reúnen o alternativamente como un agente antiincrustante en una pintura. En caso de que se use como agente antiincrustante en una pintura, se presenta en una cantidad antivegetativa, biocidamente eficaz. Las superficies usadas por moluscos (tales como mejillones, caracoles y/o babosas) incluyen, pero sin limitación, plástico, hormigón, madera, fibra de vidrio, tuberías hechas de hierro y cloruro de polivinilo y superficies cubiertas con pinturas y/o recubrimientos. Los recubrimientos pueden ser formulados con pigmentos, aglutinantes, aditivos, y/o fluidos portadores y son preferentemente aplicados en una película fina para proporcionar protección o decoración a una superficie. El producto final (que contiene el compuesto activo) se usará a 10-200 mg/l, más específicamente a 25-100 mg/l (ppm) o 25-10000 mg/kg (incluyendo cada variación incremental en el intervalo, aunque no estén explicitamente enunciados)). Se aplicará como producto seco o suspendido en agua en tuberías, estructuras de presas, tanques de almacenamiento, y aguas abiertas tales como arroyos, lagos, canales de irrigación, estanques y lagos a través de bombas de aplicación y sistemas mezcladores específicos.
Sin embargo, en otra realización, la presente divulgación representa una composición que incluye metabolitos que tienen actividad molusquicida. Por ejemplo, lactonas y ácidos grasos se divulgan en la patente de Estados Unidos número 8.968.723.
La presente divulgación también está dirigida a un método que comprende una etapa de administración de una composición que tiene una proteína (p. ej., SEQ ID NO: 1) y en combinación con un material inerte, tal como arcilla para potenciar la absorción y, por ende, la mortalidad de los mejillones.
Los ejemplos de material inerte que pueden usarse en las composiciones de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, minerales inorgánicos tales como caolín, mica, yeso, filosilicatos, carbonatos, sulfatos o fosfatos; o materiales botánicos, tales como productos de madera, corcho, mazorcas de maíz en polvo, cáscaras de grano de arroz, cáscaras del grano de arroz y cáscaras de nueces. En una realización particular, el material inerte puede obtenerse o derivarse de un mineral arcilloso (caolinita, esmectita, atapulgita) suspendido en agua a una tasa de aproximadamente 1 a 20 mg/litro correspondiente a aproximadamente 1 a 20 UTN (unidades de turbidez normalizadas). Los materiales inertes usados para potenciar la extracción de mejillones pueden aplicarse en forma sólida o como una suspensión en solución acuosa, preferentemente, agua, directamente al agua o la ubicación (p. ej., superficie sólida) donde los mejillones son tratados. En una realización particular, para mejorar la eficacia del producto, un material inorgánico, tal como arcilla, cieno, sedimento o cualquier otro material sin valor nutricional y con un tamaño de partícula lo suficientemente pequeño puede suspenderse en agua antes del tratamiento con un producto químico o biopesticida.
Sustituciones conservativas y fragmentos funcionales. Al comparar secuencias de aminoácidos, las posiciones de los residuos que no son idénticas pueden diferir en sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia, una secuencia polipeptídica de prueba que difiere solo en sustituciones conservativas se indica como "variante sustituida de manera conservativa" de la secuencia de referencia.
Un "fragmento funcional" de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la de la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, aunque todavía mantiene la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos, o el mismo número de residuos que la molécula nativa correspondiente, y/o puede mantener uno o más aminoácidos o sustituciones de nucleótidos. Los métodos para determinar la función de un ácido nucleico (p. ej., función de la codificación, capacidad para hibridarse con otro ácido nucleico) son bien conocidos en la técnica. De forma similar, se conocen métodos para determinar la función proteica. Por ejemplo, la función de unión al ADN de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, por unión al filtro, cambio de movilidad electroforética o ensayos de inmunoprecipitación. Véase Ausubel etal., mencionado anteriormente. La capacidad de una proteína para interactuar con otra proteína puede determinarse, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación conjunta, ensayos de dos híbridos o complementación, bien genética o bien bioquímica. Véase, por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340:245246; patente de los Estados Unidos n.° 5.585.245 y documento PCT WO 98/44350.
Normalmente, un fragmento funcional conserva al menos 50 % de la actividad o función del polipéptido. Un fragmento funcional conserva al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o 100 % (incluyendo cada variación incremental en el intervalo, aunque no estén explícitamente enunciados) de la actividad o función del polipéptido.
Un fragmento funcional de un polipéptido puede incluir sustituciones de aminoácidos conservativas (con respecto a la secuencia polipeptídica nativa) que no alteran sustancialmente la actividad o función del polipéptido. La expresión "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere al agolpamiento de aminoácidos basándose en determinadas estructuras y/o propiedades comunes. Con respecto a estructuras comunes, los aminoácidos pueden agruparse en los que tienen cadenas laterales no polares (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina y triptófano), los que tienen cadenas laterales polares sin carga (serina, treonina, asparagina, glutamina, tirosina y cisteína) y los que tienen cadenas laterales polares con carga (lisina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico e histidina). Un grupo de aminoácidos que contienen cadenas laterales aromáticas incluye fenilalanina, triptófano y tirosina. Están presentes cadenas laterales heterocíclicas en prolina, triptófano e histidina. En el grupo de aminoácidos que contiene cadenas laterales no polares, las que tienen cadenas laterales de hidratos de carbono cortas (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina) pueden distinguirse de las que tienen cadenas laterales distintas de hidratos de carbono, más largas (metionina, prolina, fenilalanina, triptófano). En el grupo de aminoácidos con cadenas laterales polares con carga, los aminoácidos ácidos (ácido aspártico, ácido glutámico) pueden distinguirse de los que tienen cadenas laterales básicas (lisina, arginina e histidina).
Un método funcional para definir propiedades comunes de aminoácidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de los cambios de aminoácidos entre proteínas correspondientes de organismos homólogos (Schulz, G. E. y R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1979). De acuerdo con dichos análisis, pueden definirse grupos de aminoácidos en los que los aminoácidos en un grupo se sustituyen preferentemente entre sí en proteínas homólogas y, por lo tanto, tienen influencia similar en la estructura proteica general (Schulz, G. E. y R. H. Schirmer, citado anteriormente). De acuerdo con este tipo de análisis, la "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a una sustitución de un residuo de aminoácido por otro que comparte propiedades químicas y físicas de la cadena lateral del aminoácido (p. ej., carga, tamaño, hidrofobicidad/hidrofilia). Los siguientes son ejemplos de residuos de aminoácidos que comparten determinadas propiedades químicas y/o físicas:
(i) aminoácidos que contienen un grupo con carga, que consisten en Glu, Asp, Lys, Arg e His, (ii) aminoácidos que contienen un grupo con carga positiva, que consisten en Lys, Arg e His, (iii) aminoácidos que contienen un grupo con carga negativa, que consisten en Glu y Asp, (iv) aminoácidos que contienen un grupo aromático, que consisten en Phe, Tyr y Trp, (v) aminoácidos que contienen un grupo de anillo de nitrógeno, que consisten en His y Trp, (vi) aminoácidos que contienen un grupo no polar alifático grande, que consisten en Val, Leu e Ile, (vii) aminoácidos que contienen un grupo ligeramente polar, que consisten en Met y Cys, (viii) aminoácidos que contienen un grupo de residuos pequeños, que consisten en Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln y Pro, (ix) aminoácidos que contienen un grupo alifático que consisten en Val, Leu, Ile, Met y Cys, y (x) aminoácidos que contienen un grupo hidroxilo que consisten en Ser y Thr.
Determinadas "sustituciones de aminoácidos conservativas" pueden incluir una sustitución en los siguientes grupos de residuos de aminoácidos: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr.
Por tanto, como se ha ilustrado anteriormente, los expertos en la materia conocen sustituciones de aminoácidos conservadoras y estas pueden realizarse en general sin alterar la actividad o función biológica de la molécula resultante. Los expertos en esta técnica también reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica. Véase, p. ej., Watson, et al., "Molecular Biology of the Gene", 4a edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Menlo Park, CA, pág. 224.
Los polipéptidos de la presente divulgación abarcan los que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más sustituciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, p. ej., sustituciones de aminoácidos conservativas. Los residuos de aminoácidos que pueden sustituirse pueden ubicarse en posiciones de residuos que no están muy conservadas. Los expertos habituales en la materia apreciarán que, en función de la ubicación de los sitios activos y/o de la homología con proteínas relacionadas, una proteína tolerará sustituciones, eliminaciones y/o inserciones en algunos de sus residuos de aminoácidos, sin cambios significativos en sus propiedades físicas y químicas.
Los polipéptidos de la presente divulgación abarcan los que tienen una secuencia de nucleótidos que es al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,8 % o al menos 100 % idéntica a cualquiera de los polipéptidos mostrados en SEQ ID NO: 1. Sin embargo, la presente invención se limita a métodos para controlar moluscos en un espacio líquido que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición que tiene una proteína que es un 100 % idéntica a SEQ ID NO. 1 para controlar dichos moluscos en dicho espacio líquido.
Ejemplos. Las alícuotas de muestra de cultivo de medio de células enteras se eliminaron de una fermentación con 100 l de Pseudomonas protegens CL145A a las 8, 16, 24,5 y 33 horas (FDF, fin de la fermentación). La pasta de células enteras libre de sobrenadante se lisó por sonicación, y los lisados fueron examinados para actividad por bioensayo de mejillón vivo y analizados por SDS-PAGE. La Figura 1 es una gráfica de la mortalidad de los mejillones de los lisados celulares frente a los días del ensayo con mejillones.
La actividad de mejillones de los lisados celulares es muy baja durante las primeras 16 horas de la fermentación y alcanza el nivel más alto al final de la fermentación. SDS-PAGE (Figura 2) revela claramente al menos tres proteínas de APM >260 kDa donde la expresión se correlaciona con la mortalidad de los mejillones en la Figura 1.
El sobrenadante (SN) del lisado celular al FDF de P. protegens fue fraccionado a través de cromatografía de intercambio aniónico Q-sefarosa y las fracciones fueron bioanalizadas para actividad de mortalidad de mejillones. La Figura 3 es una gráfica de la actividad de fracción y la Figura 4 es el SDS-PAGE de las fracciones.
La banda de APM se eliminó del gel SDS-PAGE y se sometió a los proteómicos UC Davis para una identificación de proteínas a través de la coincidencia de péptidos. La proteína resultante presenta la siguiente secuencia:
MAFMSKDFTRLLNTLIDQQIKTAGRQTEWFNMSADERAAYIGQVGERLLEMQQSTLSV
L AAQHY QMQDNP V S VGDQLQ VLQQRRKEMK AIADTP ATI AYKQQLDRDILLY SRQDT
AISHYD STWNK ALRLLSPGGAKAE VLQ AD AP AKQKELKGRINRLEKHL SLQ V AD STF S
QTYVTLFSELQAYKEVSTRYNAWLKAAPQQQAASLDALAKPPRASDELPVNLSLLMM
EERPGYIRMNYALVNASTDGRFKDFYLEHGRLYVPTDGVLNFSFGTAARSLAWQQQYR
LKSEPPSMRSPTYAPIRSVLVKTGFVEQYFANHLVSESSLREGFKAQVLSNGRKLLLTGV
DRKVPNQVGIQVSGQSPGTSVTREVPLAGALSELINQNADITSFQTLGVEDYRQNSYHP
DRDGLFVNIHELERSVGFAEHQYLLEMPQGDAYRSATPFAVMTVEGDKVSSSHLSKAQ
TETLYQYNAAFFERLEQLRGEGFKASRLFAGSSERATFVQQLTRLLERNHITPAGVLLA
QHSRPSLRDIKGNNLNKVLWEQAFAASVWQSHDNDELLFGLGQNLVKNQALSKVLQG
GYLQSDIAQAKLLLAPLYEQWRAQAIEMETQRVASANAGQHPGNPKVHVFDQVAVER
GLDSKLLNLLLSGPQGLAPADVALRPTVEALLSGDQGRSLRKQALFHALRPVADSFSKA
AVPVNAHAALTPKTGADKVMINNRLNQPDPYLILNTHPEQARTDAALLIQDDKYRSYS
QFRPDPNNEATRYMSDLDTPFVGGISGTTQTVSNALPELFGSAPSIKQYWQFQMANAAF
MIRNGYHSFFETFYVAARYEPQGPDSIGKDFFQTFDRYRAQGRREAFHGEFYDAVMAR
VLPIVNQGLAPSEEFHPPRFTDLGPLPALLGQAAKDLQLKTGLASLGAGFEPRQGSADIH
QFAADPVQFAQTHTLSAEALVKAGRLPAQGNVQLVEVAPRLYELEYTEHSANSVSGSP DSVPAYFLGYNGPNQANAAPAYVDIPKQARPGSFLFTGTLSGCSLVVTSLDATTYRVYH DGRVN S SLLYDNVVMAVD YKD Y Q VAGT AEGLAAA YMQ VVDGQWQL VF QRQEY QRE GQMVW PKLREGAEPLAIQTADSQVQERNRTQFAEYREQVHQNLKKVATQFGYSTEGV ADGVYSGGDFSPEHPAIAAW NRLRDAVQAKVSADIEQLGNQRYQLQEQRRGASDKRLI DQQIKQLNLTQDFYRAQYEPVLREAASVEKTWLW QQIQAKQGSAAVVRTDDTAIQGG GDERSTSVGERYAIAEAYQRGARGTAFSDGVRDFREIKIPGLDDKKSALEMKRLFLDGQ LTPGQRGALSARISETSQAEYIDKVLRQTATLSEDFRGAGSVFGQLAPQDFYLSLVGDRS GGRCYPLVRAM AVALARGGEAGVNSLVQKLFLASADPQAGSSTLLKNSLIRLHSNYDA V Q ASK ALGQF QL SD Y V ARL ANGS SD SMF ALNT QNH SMM V GS TQGPEGRRY YF YDPNV GIF AFD S SKGLAK AMEQHL VRRKLAAHY GSF GSQ SQP AFNL VEIDTHKMAE VP V GSGL NVADLSRPEELAGVIGQRRQVEQAVGAQQRVSQDLRLGAALTTFDAEQWGARFDAAS TRLAREHQLSSQWIPIIANTEPQPEGGYRVQFINRDQPDQTRWLSTDDGTFVEFRRFVDE HM SVLNEHFTLEHGQIRPRGGVGEVAHVDGLNAGFAVQTLIQW FADKNRKDAAQGVV SPDL AT ALKIHS YLGL AQIGHGT V QD V AK VTEL VQT ALRGEAL A AE S SLKDF AS TLGHT VNEGAGVLF GGAMVGLDAYELAHAEND VQKAVF GTQLAFDS ASF VSGAAGIGAGLIG ASTTAAVLGGAGVILGGLAVGFTALAQAFGAVAEDAKAVGRYFDTLDKAYQGNGYR YDEKQQ VL VPL AGA VVKRLDLRSNE V GFD S Q YIYRTHHGS T GS GAINYFF W V GDFPRM IHDRAQAIEVRSGIGHGAKPPRLDHGDSRTVILPGTPKSYISYEYMILPGATTRHDTGFDV IRKLEQDRRFD YDF YIFP SEETIRRIHQEYVETP VEVLLDGHNRQL V VPQLPKELY GYLR YDIQGAGGEYLIGLNEGTEVRL SNE AGRQP SRWIID S S QLE SD SIT V AKDHLL V GGVKVR LDP AQ S GQ VLL VN AKGEVRAADF AGQTT YVVKED AS Q W Q VS GQRIEQHLKEL AQ AHQ LHGQ YVV VENYKHGERNV GRA YYE V AKDRMLFTDTD V Q Q ARN AQLGA VIGEH A YF V DAENAAAW RVDIASGKVDAQFAPAFNQSAGQISRFWQEGDAVYLARRYQLKEREAEL SFRILGDRMELVGVVGDESLLQLSASNSQHGKDAKTLLNTLLKGYETQATQRDTPVYS LGAPVLEPTAAELITVFGLDNAKVAHRYWVRSSDGIVIKPNLAPPAGQAPRADAPGQAQ SAW QIPADLVLAGSQAQPGGQEVFYFYSKAQQVLFRQEGPGQKVLDAGQPSALRLSTP PLANVLNLNGHLLAVTNDGRMARIEATGRLSYEAVNEHWLKAHSNWWKNLAEVAGS NATLAVFGVKAADGKSALPVWYHNGQVVVASSALQGKPLQFLGFDSASASARLFEPES GKLYLQPPLT AQALATAF GKDEVLEAS AQLPAAIDWMPKQPLRS AVQVDAGLRLTTVQ GEVLLRSNNGDVQLVAVDKGWQQAHLGNLPQALATVAGQWGAKGVLSLQDGDTRG WFDIASGQMF ASNGIPGGSDLRFIGVAAGTPNS AYVY SPTAQ ALY QVKDGKALQLGHY ANVERIGSSLLLQGASGNAPQDDLAPPLIAGVDSVVLHGGAGDDTYRFSPAMW AHYRS
Claims (4)
1. Un método para controlar moluscos en una ubicación líquida, que comprende:
administrar una cantidad eficaz de una composición que tiene una proteína que es 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, para controlar dichos moluscos en dicha ubicación líquida.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha ubicación líquida es una masa de agua, en una tubería, o una pintura.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende además gammadodecalactona, delta-tridecalactona, piliferólido A, alfa-heptil-gamma-butirolactona o ácido 11-hidroxi-12-enooctadecanoico.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende además un material inerte que comprende caolín, mica, yeso, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, productos de madera, corcho, mazorcas de maíz en polvo, cáscaras de grano de arroz, cáscaras de cacahuetes, cáscaras de nuez, arcilla, cieno o sedimento.
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