BRPI1007867B1 - anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição farmacêutica e kit compreendendo o referido anticorpo, métodos de detecção de antígeno de troponina i em uma amostra de teste e métodos in vitro de diagnóstico de síndrome coronariana aguda ou infarto do miocárdio em um paciente - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS PARA TROPONINA I E MÉTODO S DE USO PARA OS MESMOS. A presente invenção refere-se a anticorpos para troponina I, bem como métodos de uso dos mesmos. Em particular, esses anticorpos podem ser usados para detectar troponina I em um paciente e também ser usados no diagnóstico de, por exemplo, um infarto do miocárdio ou sindrome coronariana aguda.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[001]A presente invenção refere-se a anticorpos para troponina I, bem como métodos de uso.

Fundamentos da Invenção

[002]Troponina I é uma proteína muscular que pode ser utilizada na determinação do dano miocárdico subsequente ou durante, por exemplo, um infarto do mio- cárdio. Em particular, a troponina I é um dos três subunidades do complexo troponina, que está localizado no filamento fino do aparelho contrátil muscular. Este complexo tem um papel primordial no controle do processo de contração muscular.

[003]As outras duas subunidades (ou seja, T e C) também são imobilizadas n miofilamentos finos com troponina I tanto no tecido muscular cardíaco, como no es-quelético. Ensaios têm sido descritos que medem troponina I cardíaca no soro humano. Por exemplo, um radioensaio tem sido utilizado para esta finalidade (Cummins et al. Am Heart Journal 113:1333-1344 (1987). No entanto, o ensaio utilizou anticorpos policlonais tendo reatividade cruzada significativa com formas esqueléticas da tropo- nina I. Além disso, um ensaio de sanduíche tem sido utilizado, que utiliza dois anticorpos monoclonais (Bodar et al, Química Clínica 38:2203 - 2214 (1992); ver também Patente dos EUA n ° 7285418) Infelizmente, tais ensaios têm um grau muito alto de imprecisão, desta forma, a necessidade, certamente existe para imunoensaios que são altamente específicos e sensíveis para a troponina I. Estes imunoensaios também devem utilizar anticorpos que não possuem reatividade cruzada com troponina I encontrados no tecido ósseo. em particular, os tais imunoensaios são necessários para que a terapia apropriada possa ser utilizada pelo médico assistente, assim, dando ao paciente afetado o melhor prognóstico possível.

[004]Todas as patentes e publicações aqui referidos são incorporadas na sua totalidade por referência.

RESUMO DA INVENÇÃO

[005]A presente invenção se refere a proteínas de ligação, particularmente anticorpos, capazes de se ligar a troponina I. Em particular, estes anticorpos se ligam a um ou mais epitopos de troponina I. Além disso, a presente invenção também fornece métodos de produzir e usar essas proteínas de ligação ou partes dos mesmos, por exemplo, em ensaios de diagnóstico. Em particular, a presente invenção compreende uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO), conhecido como TnI 19C7 AMI HGL CHO 204, designado pelo American Type Culture Collection (ATCC) depósito número PTA-9816, bem como o anticorpo recombinante produzida por este linhagem celular.

[006]Além disso, a presente invenção inclui uma proteína isolada de ligação compreendendo um domínio de ligação de antígeno que se liga à troponina I, disse de ligação de antígenos de domínio, compreendendo pelo menos uma complementaridade determinar região (CDR) constituído por uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: GYTFTD YNLH (SEQ ID NO: 52), YIYPYNGITGYNQKFKS (SEQ ID NO: 53), DAYDYDLTD (SEQ ID NO: 54), RTSKNVGTN1H (SEQ ID NO:55), YASERLP (SEQ ID NO:56) e QQSNNWPYT (SEQ ID NO:57).

[007]A proteína de ligação da presente invenção podem incluir, por exemplo, pelo menos três desses CDRs. Além disso, esta proteína de ligação pode também incluir um ser humano aceitador quadro ou andaime. Esta proteína de ligação pode ser selecionado do grupo consistindo de, por exemplo, uma molécula de imunoglobu- lina, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo CDR- enxertadas, um anticorpo humanizado, a Fab, uma Fab ', um F (ab') 2, a Fv, um dis- sulfeto ligados Fv, um scFv , um anticorpo de domínio único, um diabody, um anticorpo multiespecíficas, um anticorpo específico dupla, um anticorpo anti-idiotípicos, um anticorpo biespecíficas, ou um fragmento funcionalmente epítopo de ligação ativa de qualquer uma dessas entidades.

[008]A presente invenção também engloba uma molécula de ácido nucléico isolado que codifica uma proteína de ligação, onde a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável da proteína de ligação tem identidade, pelo menos, 70% a SEQ ID NO: 25 (ver Figura 12). Esta molécula pode também compreende uma cadeia leve variável ter pelo menos 70% de identidade de SEQ ID NO: 28 (ver Figura 12). Além disso, a presente invenção inclui uma molécula de ácido nucléico isolado que codifica uma proteína de ligação, onde a sequência de aminoácidos da cadeia pesada da variável disse ligação às proteínas é SEQ ID NO: 25.

[009]Além disso, a presente invenção inclui uma molécula de ácido nucléico isolado que codifica uma proteína de ligação, onde a sequência de aminoácidos da cadeia leve da variável disse proteína de ligação é SEQ ID NO: 28. Esta molécula pode ainda compreende uma molécula de ácido nucléico isolado que codifica uma cadeia variável pesado, onde a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é SEQ ID NO: 25.

[0010]A presente invenção também inclui um vetor compreendendo uma ou mais das moléculas de ácido nucléico descrito acima, anexado a um elemento regulador (por exemplo, um promotor), bem como uma célula hospedeira que compõem este vetor.

[0011]Além disso, a presente invenção inclui um método de produzir qualquer uma das proteínas de ligação descritos acima, capazes de se ligar a troponina I, que método compreende cultivar a célula hospedeira, descrita acima, por um tempo e sob condições suficientes para produzir a proteína de ligação de interesse . A invenção também inclui a ligação às proteínas produzidas por este método.

[0012]Além disso, a presente invenção engloba uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais das proteínas de ligação descrito acima e um veículo farmaceuticamente aceitável. Além disso, a presente invenção inclui um método de detecção de antígeno de troponina I em uma amostra de teste. Este método com-preende as etapas de: contatar a amostra com um anticorpo que se liga à troponina I e dispõe de SEQ ID NO: 25 por um tempo e sob condições suficientes para a formação de anticorpos / antígenos complexos e detectar a presença dos complexos, presença dos complexos indicando presença de troponina I em antígeno disse amostra de teste. O anticorpo pode ainda compreender SEQ ID NO: 28. O anticorpo pode ser produzido por uma linhagem de células de Ovário de Hamster chinês ter a designação de depósito ATCC PTA-9816.

[0013]A presente invenção também inclui um método de detecção de antígeno de troponina I em uma amostra de teste compreendendo as etapas de: contatar a amostra com um primeiro anticorpo que se liga à troponina I e dispõe de SEQ ID NO: 25 por um tempo e sob condições suficientes para a formação de primeiro anticorpo / antígeno complexos; adição de um conjugado com o primeiro anticorpo / antígeno complexos, em que o dito conjugado compreende um segundo anticorpo ligado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável, por um tempo e sob condições suficientes para formar primeiro anticorpo / antígeno / complexos segundo anticorpo, e detectar a presença de um sinal de geração pela geração do sinal composto presença, da presença de sinal indicador de troponina I em antígeno disse amostra de teste.

[0014]O primeiro anticorpo pode ainda compreender SEQ ID NO: 28 e pode ser produzida por uma linhagem de células de Ovário de Hamster chinês ter a designação de depósito ATCC PTA-9816. Além disso, a presente invenção inclui um método de detecção de antígeno de troponina I em uma amostra de teste compreen-dendo as etapas de: contato com o antígeno troponina I com um anticorpo para tro- ponina I por um tempo e sob condições suficientes para formar troponina I complexos antígeno / anticorpo, em que a anticorpo compreende SEQ ID NO: 25 e é rotulado com um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável; adicionando a amostra de teste para troponina I disse complexos antígeno / anticorpo por um tempo e sob condições suficientes para formar troponina I antígeno / anticorpo / troponina I complexos teste do antígeno da amostra; e detectar a presença de um sinal de geração pela geração do sinal composto presença, da presença de sinal indicador de troponina I antígeno na amostra de teste. Mais uma vez, o anticorpo pode ainda compreender SEQ ID NO: 28 e pode ser produzida por uma linhagem de células de Ovário de Hamster chinês ter a designação de depósito ATCC PTA-9816

[0015]A presente invenção também abrange um outro método de detecção de antígeno de troponina I em uma amostra de teste. Este método compreende as etapas de: contatar a amostra com 1) um antígeno de referência troponina I, onde o antígeno é acoplado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável e 2) um anticorpo de troponina I em que o antígeno anticorpo compreende SEQ ID NO: 25, por um tempo e sob condições suficientes para formar troponina I de referência complexos antígeno / anticorpo, e detecção de um sinal gerado pelo sinal composto de geração, onde a quantidade de antígeno troponina I detectado na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de antígeno de referência troponina I ligada ao anticorpo. Mais uma vez, o anticorpo pode ainda compreender SEQ ID NO: 28 e pode ser produzida por uma linhagem de células de Ovário de Hamster chinês ter designação depósitos ATCC PTA-9816.

[0016]Além disso, a presente invenção inclui composição farmacêutica compreendendo uma ou mais das proteínas de ligação descrito acima e um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também abrange um método de diagnóstico de síndrome coronariana aguda ou infarto do miocárdio em um paciente com suspeita de uma dessas condições. Este método compreende as etapas de: isolar uma amostra biológica do paciente; entrar em contato com a amostra biológica com um anticorpo que se liga à troponina I e dispõe de SEQ ID NO: 25, por um tempo e sob condições suficientes para a formação da troponina I antígeno / anticorpo complexos; detectar presença da troponina I complexos antígeno / anticorpo; dissociar a troponina I antígeno presente nos complexos do anticorpo presente na referidos complexos, e medindo a quantidade de troponina I dissociada antígeno, onde uma quantidade de antígeno troponina I maior que cerca de 1-5 vezes o valor da troponina I do percentil 99 de uma população normal indica um diagnóstico de síndrome coronariana aguda ou infarto do miocárdio no paciente.

[0017]A presente invenção inclui um método adicional de diagnóstico de sín- drome coronariana aguda ou infarto do miocárdio em um paciente com suspeita de uma dessas condições.

[0018]Este método compreende as etapas de: isolar uma amostra biológica do paciente; entrar em contato com a amostra biológica com um anticorpo que se liga ao primeiro troponina I e dispõe de SEQ ID NO: 25, por um tempo e sob condições suficientes para a formação de troponina I antígeno / complexos de anticorpos; adição de um conjugado à troponina I, resultando complexos antígeno / anticorpo por um tempo e sob condições suficientes para permitir que o conjugado de se ligar à tropo- nina I antígeno ligado em que o conjugado compreende um segundo anticorpo ligado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável; detectar a presença de troponina I, que o antígeno pode estar presente na referida amostra biológica através da detecção de um sinal gerado pelo dito composto sinal geração; medir a quantidade de antígeno troponina I presente na amostra de teste através da medição da intensidade do sinal, um montante de troponina I antígeno maior que cerca de 1-5 vezes o valor do percentil 99 de uma população normal indica um diagnóstico de coronária aguda síndrome ou infarto do miocárdio no paciente.

[0019]A presente invenção também inclui um kit composto por um ou mais dos anticorpos monoclonais ou proteínas de ligação descrito acima e, se necessário, descrevendo as instruções da maneira em que para usar esse kit.

[0020]Além disso, a presente invenção inclui uma proteína isolada de ligação que compreende um domínio de ligação de antígenos, onde o domínio de ligação de antígenos compreende pelo menos um CDR compreendendo uma sequência de ami- noácidos selecionada do grupo que consiste em: CDR-VHl. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID NO:63), em que : X1 is G; X2 é Y; X3 é T ou S; X4 é F; X5 é T; X6 é D; X7 é Y; X8 é N; X9 é I ou L; e X10 é H. CDR- VH2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO:64), em que X1 é Y; X2 é I; X3 é Y; X4 é P; X5 é Y; X6 é N; X7 é G; X8 é I; X9 é T; X10 é G; X11 é Y; X12 é N; X13 é Q; X14 é K; X15 é F; X16 é K; e X17 é S. CDR-VH3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO:66), em que: X1 é D; X2 é A ou F; X3 é Y; X4 é D; X5 é Y ou S; X6 é D; X7 é W, Y ou A; X8 é L; X9 é A ou T; e X10 é Y ou D. CDR-VLl. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID NO:66), em que: X1 é R; X2 é A ou T; X3 é S; X4 é Q ou K; X5 é S ou N; X6 é I ou V; X7 é G; X8 é T; X9 é N; X10 é I; e X11 é Y ou H. CDR-VL2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID NO:67), em que: X1 é Y; X2 é A ou G; X3 é S ou T; X4 é E; X5 é S ou R; X6 é I, L ou V; e X7 é S, P ou F. e CDR-VL3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:68), em que : X1 é Q; X2 é Q; X3 é S; X4 é N; X5 é N; X6 é W; X7 é P; X8 é Y; e X9 é T.

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DAS FIGURAS

[0021]A Figura 1 é um fluxograma que mostra as etapas usadas para identificar e criar anticorpos que melhoraram afinidade para troponina I.

[0022]Figura 2 é a descrição de nucleotídeos (SEQ ID NO: 109 e SEQ ID NO: 110) do 19C7 TnI tipo primária fragmento variável de cadeia única ("scFv").

[0023]A Figura 3 mostra que a levedura expressar full-length TnI 19C7 único fragmento de cadeia variável bind (scFv) para uma única cadeia de troponina (28- 110aa)-ligante-troponina C conhecido como 2-scTnI-C (Diagnóstico Spectral, RP- 3700) . Mais especificamente, esta figura mostra que TnI 19C7 levedura scFv expressando foram incubadas com scTnI-C-2 ou anti-V5, seguido por um ou outro anti-tro- ponina e mAb anti cabra camundongo-ficoeritrina (GAM: PE) (Fig. 3B) ou GAM: PE, respectivamente (Fig. 3A). Os histogramas de citometria de fluxo ilustrar a expressão full-length de TnI 19C7 scFv como detectado pelo anti-V5 e da capacidade de TnI 19C7 scFv para ligar scTnI-C-2. PE-A unidades (abscissa): 102, 103,104 e 105. Contagem de unidades (ordenada): 102, 103,104 e 105.

[0024]A Figura 4 mostra a TnI 19C7 scFv medição de desconto na tarifa. Mais especificamente, o fermento expressar TnI 19C7 scFv foram incubados com uma con-centração de saturação de scTnI-C-2. Células foram lavadas duas vezes e em cada momento, as células foram transferidas para o gelo, lavadas e incubadas com anti- TnL mAb. Após 30 minutos, as células foram lavadas novamente e incubadas com ficoeritrina de cabra anti-rato. Novamente após 30 minutos, as células foram lavadas e analisadas no citômetro de fluxo. A equação de decaimento de primeira ordem foi usada para ajustar os pontos de tempo individuais onde ml foi o máximo teórico significa unidades de fluorescência ("MFU") no tempo 0 m2, foi o desconto na tarifa ("Kdef"), foi o m3 MFU de fundo devido à autdeluorescência e MO, que é o x tempo (x sendo o tempo que está sendo medido) era o x tempo que as medidas são tomadas.

[0025]A meia-vida (ti / 2) de TnI 19C7 scFv ligação a TnI-C-2 foi calculada usando: ti / 2 = In2/kdef. Cinco vezes a meia-vida foi o tempo utilizado para classificar os TnI 19C7 bibliotecas scFv CDR mutagênico.

[0026]A Figura 5 mostra a TnI 19C7 scFv equilíbrio de dissociação de medição (KD) constante. Mais especificamente, o fermento expressar TnI 19C7 scFv foram incubadas com concentrações variáveis de scTnI-C-2. Células foram lavadas duas vezes com PBS pH6.8 / 2% BSA/0.02% STANDAPOL ES-I e incubadas com anti-TnL mAb por 30min. Células foram lavadas novamente e incubadas com cabra anti-rato ficoeritrina por 30min. Finalmente, as células foram lavadas e analisadas no citômetro de fluxo.

[0027]A Figura 6 é uma representação esquemática que mostra como degenerada oligonucleotides foram projetados para que os primers são feitos de tal forma que para cada resíduo CDR nucleotídeo 70% permanece o resíduo do tipo primária e 30% uma mistura das outras três resíduos. Dois produtos de PCR são gerados para cada uma biblioteca spiked (sp) produto de PCR e uma não-cravado produto da PCR. Os produtos perfurantes e não spiked PCR são combinados para gerar uma intacta CDR mutagenizados biblioteca scFv.

[0028]Figura 7 é uma representação esquemática que mostra como a TnI 19C7 scFv biblioteca foi construída utilizando leveduras recombinação homóloga. Mais especificamente, o spiked CDR produto de PCR e mostrar o vetor de levedura excisadas foram transformados em S. cerevisiae cepa EBYlOO. Clones transformados foram selecionados em meio de glicose triptdeano deficiente.

[0029]Figura 8 é um resumo mostrando os primers PCR que foram usados para gerar a construção de scFv (tpVHfor através tpVLrev), as utilizadas para gerar as bibliotecas CDR spiked (19Hlspfor através pYD41rev2) e os utilizados para gerar a biblioteca de combinação (19FRH2for para 19FRL3) (ver SEQ ID n ° s: 22/01). As áreas em negrito e alargada dos primers representam as regiões em que a "70% do tipo primária, 30% mistura de outros nucleotídeos" foi incorporado, enquanto os primers foram sendo feitas. Como um primer "spiked" gerou a diversidade dentro da biblioteca.

[0030]A Figura 9 mostra o equilíbrio constante de dissociação (KD) medidas de selecionados TnI 19C7 scFv determinado como descrito acima na Figura 5.

[0031]A Figura 10 mostra os resultados de afinidade de anticorpos em relação medida como um antígeno% 50 (Ag50). Quatro clones 19C7 TnI foram convertidos em anticorpos de ratinho IgG2ak por clonagem dos domínios variáveis sobre os domínios de imunoglobulina constante. Os anticorpos foram expressos em um transiente sistema de célula HEK 294. O Ag50 é a concentração de scTnl-C em que é de 50% do sinal máximo e representa o ranking afinidade relativa do 19C7 selecionados TnI AM candidatos. TnI 19C7 AMI exemplifica a afinidade tightest relativa em comparação com o TnI 19C7 anticorpos do tipo primária.

[0032]A Figura 11 ilustra TnI 19C7 AMI 's capacidade de se ligar a scTnl-C em um formato de ensaio ARCHITECT ® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). TnI 19C7 foi marcado com acridinium e analisadas para a ligação com scTnl-C usando pérolas de anti-TnL captura. (X = sinal gerado com a concentração do calibrador determinado scTnl-C; X / A = relação de calibrador sinal X para calibrador Um sinal; RLU = unidade relativa de luz). TnI 19C7 AMI apresentaram melhor ligação com este formato de ensaio para a gama de calibradores em relação ao tipo primária anticorpo 19C7 TnI.

[0033]Figura 12 ilustra o nucleotídeo (NO ID SEQ: 23, SEQ ID NO: 24 (complemento), SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27 (complemento)) e sequências de amino- ácidos codificados do sequência pesada NO ID (SEQ: 25 ) e leve (SEQ ID nO: 28) cadeias de anticorpo monoclonal 19C7 TnI AMI e, em particular, da complementaridade determinar regiões (CDRs).

[0034]A Figura 13 ilustra as posições dentro das cadeias pesadas e leves do CDRs TnI 19C7 que pode ser substituído com aminoácidos diferentes daqueles mostrados na Figura 12 (n ° s SEQ ID: 29-49).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0035]Salvo estipulado em contrário, termos científicos e técnicos utilizados em conexão com a presente invenção terão os significados que são comumente en-tendidos por aqueles de habilidade comum na arte. O sentido eo alcance dos termos devem ser claros, no entanto, em caso de qualquer ambiguidade latente, as definições contidas neste documento prevalecem sobre qualquer dicionário ou definição extrínseca.

[0036]Além disso, exceto quando expressamente requerido pelo contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos devem incluir o plural singular. Nesta aplicação, o uso de "ou" meios "e / ou" salvo indicação em contrário. Além disso, o uso do termo "inclusive", bem como outras formas, como "inclui" e "incluídos", não é limitante. Além disso, termos como "elemento" ou "componente" abranger ambos os elementos e componentes, com uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais de uma subunidade, excepto quando indicado de outra forma.

[0037]Geralmente, nomenclaturas usadas em conexão com, e técnicas de célula, e cultura de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e de proteínas e ácidos nucleicos química e hibridização descritas neste documento são bem conhecidos e usados comumente na arte. Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais conhecidas na arte e, como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citados e discutidos ao longo do presente especificação salvo indicação em contrário.

[0038]Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizados de acordo com as especificações do fabricante, como é comumente feito na arte ou como aqui descritos. Nomenclaturas usadas em conexão com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de, química analítica, química orgânica sintética, e da química me-dicinal e farmacêutica aqui descritos são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados no art. Técnicas padrão são usados para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e entrega, e tratamento de pacientes. A fim de que a presente invenção pode ser mais facilmente compreendida, selecionar termos estão definidos abaixo. O termo "polipeptídeo" como aqui utilizado, refere-se a qualquer cadeia de polímeros de aminoácidos.

[0039]Os termos "peptídeo" e "proteínas" são utilizados alternadamente com o polipeptídeo prazo e também se referem a uma cadeia polimérica de aminoácidos. O termo "polipeptídeo" engloba proteínas nativas ou artificiais, fragmentos de proteínas e análogos de polipeptídeo de uma sequência de proteína. Um polipeptídeo pode ser monomérica ou polimérica. A "proteína isolada» ou «polipeptídeo isolado" é uma proteína ou polipeptídeo que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação não está associado com componentes naturalmente associados que a acompanham em seu estado nativo; é substancialmente livre de outras proteínas da mesmas espécies; é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou não ocorrem na natureza.

[0040]Assim, um polipeptídeo que é de síntese química ou sintetizada em um sistema celular diferente a partir da célula da qual se origina, naturalmente, será "iso-lado" de seus componentes naturalmente associado. A proteína também pode ser prestado substancialmente livre de componentes naturalmente associados pelo isolamento, usando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na arte.

[0041]O termo "recuperação", como utilizado aqui, refere-se ao processo de prestação de uma espécie química, como um polipeptídeo substancialmente livre de componentes naturalmente associados pelo isolamento, por exemplo, usando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na arte.

[0042]A presente invenção também inclui sequências de nucleotídeos isolados (ou fragmentos dos mesmos) que codifica a luz variável e cadeias pesadas dos anticorpos descritos neste documento, bem como as sequências de nucleotídeos (ou fragmentos dos mesmos) com sequências que compreende, correspondente a, idêntico, hibridizável, ou complementar, pelo menos, cerca de 70% (por exemplo, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% ou 79%), de preferência pelo menos cerca de 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% ou 89%), e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) identidade para essas sequências de codificação de nucleotídeos.

[0043]Todos os inteiros (e partes dele) entre e incluindo 70% e 100% são considerados dentro do escopo da presente invenção em relação à identidade por cento.) Tais sequências podem ser derivados a partir de qualquer fonte (por exemplo, isoladas a partir de uma fonte natural, produzido através de uma rota semi-sintético, ou sintetizados de novo). Em particular, essas sequências podem ser isoladas ou provenientes de outras fontes que não as descritas nos exemplos (por exemplo, bactérias, fungos, algas camundongo, ou humanos).

[0044]Além da sequência de nucleotídeos descrito acima, a presente invenção também inclui sequências de aminoácidos da luz variável e cadeias pesadas dos anticorpos descritos aqui (ou fragmentos destas sequências de aminoácidos). Além disso, a presente invenção também inclui sequências de aminoácidos (ou fragmentos dos mesmos) compreendendo, correspondente a, idêntico, ou complementar a pelo menos cerca de 70% (por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75 %, 76%, 77%, 78% ou 79%), de preferência pelo menos cerca de 80% (por exemplo, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% ou 89%), e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%), para as sequências de aminoácidos das proteínas da presente invenção. (Novamente, todos os números inteiros (e partes dele) entre e incluindo 70% e 100% (como recitado em conexão com as identidades sequência de nucleotí- deos mencionado acima) também são considerados dentro do escopo da presente invenção em relação à identidade por cento.)

[0045]Para fins da presente invenção, um "fragmento" de uma sequência de nucleotídeos é definida como uma sequência contígua de cerca de pelo menos 6, de preferência, pelo menos, cerca de 8, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 15 nucleotídeos correspondente a uma região da sequência especificada nucleotídeos.

[0046]O termo "identidade" se refere ao relacionamento de duas sequências em uma base de nucleotídeo por nucleotídeo através de uma janela de comparação em particular ou segmento. Assim, a identidade é definida como o grau de correspondência mesmice, ou de equivalência entre as vertentes mesma (ou sentido ou antisense) de dois segmentos de DNA (ou duas sequências de aminoácidos). "Percentual de identidade de sequência" é calculado comparando duas sequências perfeitamente alinhadas sobre uma região particular, determinar o número de posições em que a base de aminoácidos idênticos ou ocorre em ambas as sequências a fim de produzir o número de posições compensadas, dividindo o número de tais posições pelo número total de posições no segmento que estão sendo comparados e multiplicando o resultado por 100.

[0047]Alinhamento ideal de sequências podem ser realizadas pelo algoritmo de Smith & Waterman, Appl. Matemática. 2:482 (1981), pelo algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Moi. Biol. 48:443 (1970), pelo método de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (EUA) 85:2444 (1988) e por programas de computador que implementam os algoritmos relevantes (por exemplo, Clustal http://cmgm engavetamento Macaw stanford.edu/biochem218/11 Multiple.pdf;. Higgins et al, CABIOS 5L151-153. (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (Centro Nacional de Informação Biomédica;. Al- tschul et al, pesquisa dos ácidos nucleicos 25:3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI) ou GAP, BestFit, FASTA e TFASTA (Wisconsin Genetics Pacote de Sdetware Versão 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI). (Veja Patente dos EUA n ° 5912120.) Para fins da presente invenção, "complementaridade" é definida como o grau de parentesco entre dois segmentos de DNA. É determinada pela medição da capacidade da vertente sentido de um segmento de DNA de hibridizar com a fita anti-senso do segmento de DNA outro, em condições adequadas, para formar uma dupla hélice.

[0048]Um "complemento" é definido como uma sequência de pares para que uma determinada sequência baseada na base de emparelhamento canônica-regras. Por exemplo, uma sequência de AGT em uma fita de nucleotídeos é "complementar" ao TCA na outra vertente.

[0049]Na hélice dupla, adenina aparece em uma fita, timina aparece na outra vertente. Da mesma forma, onde quer guanina é encontrado em uma vertente, citosina é encontrado no outro. Quanto maior o parentesco entre as sequências de nucleotí- deos de dois segmentos de DNA, maior a capacidade de formar duplexes híbrido entre os fios dos dois segmentos de DNA.

[0050]Semelhança "entre duas sequências de aminoácidos é definida como a presença de uma série de idênticos, bem como resíduos de aminoácidos conservados em ambas as sequências. Quanto maior o grau de similaridade entre duas sequências de aminoácidos, maior a correspondência mesmice, ou equivalência dos duas se-quências. ("Identidade entre duas sequências de aminoácidos é definida como a presença de uma série de exatamente iguais ou invariante resíduos de aminoácidos em ambas as sequências.) as definições de" complementaridade "," identidade "e" semelhança "são bem conhecidos os de habilidade comum na arte.

[0051]"Codificado por" se refere a uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de polipeptídeo, no qual a sequência de polipeptídeo ou uma parte dele contém uma sequência de aminoácidos de pelo menos 3 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 8 aminoácidos, e ainda mais de preferência em pelo menos 15 aminoácidos de um polipeptídeo codificado pela sequência de ácidos nucléicos.

[0052]"A atividade biológica", como utilizado aqui, refere-se a todas as propriedades biológicas inerentes de um anticorpo contra a troponina I ou propriedades troponina I. incluem, por exemplo, a capacidade do anticorpo se ligar a troponina I e funcionalmente relacionados com anticorpos descritos neste documento.

[0053]Os termos "ligação específica" ou "especificamente vinculativo", como usado neste documento, em referência à interação de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo com uma espécie química em segundo lugar, significa que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo) sobre as espécies químicas, por exemplo, um anticorpo reconhece e liga-se a uma estrutura de proteína específica em vez de proteínas em geral. Se um anticorpo é específico para epítopo "A", a presença de uma molécula contendo epítopo A (ou livre, sem rótulo A), em uma reação contendo rotulados "A" e os anticorpos, irá reduzir a quantidade de rotulados A ligado ao anticorpo .

[0054]O termo "anticorpo" como usado neste documento, amplamente se refere a qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) composta por quatro cadeias polipep- tídicas, duas pesadas (H) e duas cadeias leves (L) correntes, ou de qualquer fragmento funcional, mutante, variante ou derivação °, que mantém as características essenciais epítopo de ligação de uma molécula de Ig. Mutante tal, variante, ou entidades de anticorpos derivados são conhecidos na arte, não limitando personificações dos quais são discutidos abaixo

[0055]Em um anticorpo de plena exensão, cada cadeia pesada é composta de uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviado como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é composta de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta de uma região variável da cadeia leve (aqui abreviado como LCVR ou VL) e uma região de cadeia leve constante.

[0056]A região constante de cadeia leve é composta de um domínio CL,. As regiões VH e VL pode ser subdividida em regiões de hipervariabilidade, regiões com-plementaridade denominado determinação (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, regiões framework denominado (FR). Cada VH e VL é composto de três CDRs e quatro FRs, organizadas a partir de amino-terminal de carboxi-termi- nal, na seguinte ordem: LRF, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0057]Moléculas de imunoglobulinas pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), (por exemplo, uma IgG, IgG2, IgG3, IgG4, Igal e IgA2) subclasse ou classe e pode ser de qualquer espécie (eg , camundongo, seres humanos, galinhagens, ratos, coelhos, ovelhas, tubarão, e camelídeos).

[0058]Os CDRs dos anticorpos da presente invenção são mostrados nas Tabelas 1 e 2 abaixo: TABELA 1: CDRs da cadeia pesada PARA Tn 19C7 AMI

TABELA 2: CDRs DE CADEIA DE LUZ PARA PARA TnI 19C7AMI

[0059]O termo "antígeno de ligação do mesmo" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpos"), como usado neste documento, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligam especificamente a um antígeno. Tem sido demonstrado que a função de ligação de antígenos de um anticorpo pode ser realizada por um ou mais fragmentos de um anticorpo pleno.

[0060]Incorporações de anticorpos também podem ser específicos, biespecí- ficas, duplo, ou multi-específicas, especialmente de ligação a dois ou mais antígenos diferentes. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidas pela expressão "de ligação de antígenos parte" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste na VL, VH, CL e CHL domínios; (ii) um F (ab ') 2 fragmento, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligadas por uma ponte dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd consiste na VH e domínios CHL, (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAB (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546, Winter et al, Intern. Appln. Pública. No. WO 90/05144 al aqui incorporados por referência), que compreende um único domínio variável e (vi) uma complementaridade isolado que determine região (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, são codificados por genes separados, eles podem ser unidas, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia de proteína único, no qual a VL e VH par regiões para formar moléculas monovalente (conhecida como única cadeia de Fv (scFv); ver, por exemplo, Bird et al (1988) Ciência 2A2-AYh-A2b \ e Huston et al (1988) Proc Natl Acad Sci 85:5879 5883 EUA). Tais anticorpos de cadeia única também são englobados aqui dentro do prazo "de ligação de antígenos parte" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, como diacorpos, também estão abrangidas. Diacorpos são bivalentes, anticorpos biespecífico em que domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia polipeptídica, mas usando um ligante que é muito curto para permitir o empa- relhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios para emparelhar com domínios complementares de outra cadeia da criação de dois locais de ligação do antígeno (ver, por exemplo, Holliger, P., et al (1993) Proc Natl Acad Sci EUA 90:6444-6448; Poljak, RJ, et al (1994) Estrutura 2:1121 - 1123). Porções de anticorpos tal vinculação são conhecidos na arte (Kontermann e Dubel eds., Anticorpos de Engenharia (2001) Springer-Verlag. New York. 790 p. (ISBN 3540-41354-5).

[0061]O termo "construto de anticorpos" como aqui utilizado refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma ou mais porções de ligação do antígeno da invenção ligada a um polipeptídeo ligante ou um domínio de imunoglobulina constante. Polipeptídeos Ligante compreendem dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas e são usados para ligar um ou mais porções de ligação do antígeno. Tais polipeptídeos ligante são bem conhecidas na arte (ver, por exemplo, Holliger, P., et al (1993) Proc Natl Acad Sci EUA 90:6444-6448; Poljak, RJ, et al (1994) Estrutura 2:1121-1123). Um domínio de imunoglobulina constante refere-se a um domínio da cadeia pesada ou leve constante.

[0062]Sequências de aminoácidos constantes de cadeia pesada e leve de IgG humana são conhecidas na técnica, e os exemplos estão apresentados na Tabela 3. TABELA 3: SEQUÊNCIA DE DOMINIO CONSTANTE DE CADEIA PESADA HUMANA IgG E DOMINIO CONSTANTE DE CADEIA LEVE.

[0063]Ainda mais, um anticorpo ou porção de ligação de antígenos do mesmo pode ser parte de uma molécula maior imunoadesão, formados por associação covalente ou não colvalente do anticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos. Exemplos de tais moléculas imunoadesão inclui o uso da região central estreptavidina para fazer uma molécula tetramérica scFv (Kipriyanov, SM, et al (1995) anticorpos humanos e Hibridomas 6:93 -. 101) e uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e uma tag polihistidina C-terminal para fazer moléculas bivalente e biotinilado scFv (Kipriyanov, SM, et al (1994) MoI Immunol 3J_: 1047-1058). Porções de anticorpos, como Fab e F (ab') 2 fragmentos, podem ser preparados a partir de anticorpos inteiro usando técnicas convencionais, como papaína ou digestão pela pepsina, respectivamente, de anticorpos todo. Além disso, os anticorpos, porções de anticorpos e moléculas imunoadesão podem ser obtidas através de técnicas de DNA recombinante, como aqui descrito. Um "anticorpo isolado", como usado neste documento, destina-se para se referir a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos com especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente isolado troponina I é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente antígenos que não troponina I). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a troponina I pode, no entanto, têm reatividade cruzada com outros antígenos, tais como moléculas de troponina I de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de material celular e / ou outros produtos químicos.

[0064]O "anticorpo humano", como utilizado aqui, tem como objetivo apresentar anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivados de sequências de imu- noglobulina humana germinativas. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina humana germinativas (por exemplo, as mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou site-specific in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, os CDRs e CDR3 particular. No entanto, o "anticorpo humano", como utilizado aqui, não se destina a incluir anticorpos no qual CDR sequências derivadas da linhagem germinativa de ou-tras espécies de mamíferos, como um camundongo, foram enxertados em sequências de quadro humano.

[0065]O termo "anticorpo recombinante humana" como utilizado aqui, se destina a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressa, criados ou isoladas por meio recombinante, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectadas em uma célula hospedeira (descritas abaixo) , anticorpos recombinantes isoladas a partir de uma biblioteca de anticorpos, combinatorial humano (Hoogenboom HR, (1997) TIB Tecnologia 15:62-70;. Azzazy H., e Highsmith NÓS, (2002) Clin Biochem 35:425-445;.. Gavilondo JV e Larrick JW (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., e Chames p. (2000) Imunologia Hoje 21 :371-378), isolaram anticorpos de um animal (por exemplo, um rato) que é transgênico para humanos genes de imunoglobulina (ver, por exemplo, Taylor, LD, et al (1992) Nucl Res Ácidos 20:6287-6295;... Kellermann, SA e Green, LL (2002) Parecer atual em Biotecnologia 13:593-597.; Pouco M. et al (2000) Imunologia Hoje 21 :364-370) ou anticorpos preparados, expressa, criados ou isoladas por qualquer outro meio que envolve o entrelaçamento de sequências de genes humanos imunoglobulina para outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes humanos têm regiões variáveis e constantes derivados de sequências de imunoglobulina humana germinativas. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos recombinantes humanos são submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal para sequências transgênicas Ig humana é utilizada, in vivo somáticas mutagênese) e, assim, as sequências de ami- noácidos das regiões VH e VL do recombinante anticorpos são sequências que, embora derivado e relacionados com a linhagem germinativa humana VH e VL sequências, não pode, naturalmente, existem dentro do repertório de anticorpos humanos germinativas in vivo. O "anticorpo quimérico" termo refere-se a anticorpos que compõem cadeia pesada e cadeia leve sequências região variável de uma espécie e se-quências de região constante de outra espécie. A presente invenção inclui anticorpos quiméricos ter, por exemplo, murino regiões variáveis leve e pesada cadeia ligada ao ser humano regiões constante.

[0066]O termo "CDR-anticorpos enxertados" refere-se a anticorpos que compõem pesada e cadeia leve sequências variável região a partir de uma espécie, mas em que as sequências de uma ou mais das regiões CDR de VH e / ou VL são substituídas por sequências de CDR de outra espécie , tais como anticorpos tendo regiões murino cadeia pesada e leve variável no qual um ou mais dos CDRs murino (por exemplo, CDR3) foi substituído por sequências humana CDR.

[0067]O "anticorpo humanizado" termo refere-se a anticorpos que compõem pesada e cadeia leve sequências variável região a partir de uma espécie não-humana (por exemplo, um rato), mas em que pelo menos uma parte da VH e / ou sequência de VL foi alterada para ser mais "human-like", ou seja, mais similar ao humano germline sequências variável. Um tipo de anticorpo humanizado é um anticorpo CDR- enxertadas, no qual sequências humana CDR são introduzidos não-humanos VH e VL sequências para substituir o correspondente sequências não-humanos CDR. Os termos "Kabat numeração", "definições Kabat e" rotulagem Kabat "são usados indistintamente neste documento.

[0068]Estes termos, que são reconhecidos na arte, consulte um sistema de numeração resíduos de aminoácidos, que são mais variáveis (ie hipervariável) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões cadeia pesada e leve variável de um anticorpo, ou uma porção de ligação do antígeno do mesmo (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 e Kabat, eA, et al. (1991) sequências de Proteínas de Interesse imunológicos, Fifth Edition, EUA Departamento de Saúde e Serviços Humanos, N1H publicação n ° 91-3242). Para a região variável de cadeia pesada, os intervalos região hipervariável de posições de aminoácidos 31-35 para CDRl, posições de aminoácidos 50-65 para CDR2 e posições de aminoácidos 95-102 para a CDR3. Para a região variável de cadeia leve, os intervalos região hipervariável de posições de aminoácidos 24-34 para CDRl, posições de aminoácidos 50-56 para CDR2 e posições de aminoácidos 89-97 para CDR3. (Além disso, para fins da presente invenção, a definição AbM como definido por sdetware Oxford Molecular de modelagem de anticorpos ABM foi usado para definir a região CDR-Hl a partir de aminoácidos 26-35 para a cadeia pesada). Como usados aqui, os termos "receptor" e "anticorpos aceitador" referem-se ao anticorpo ou sequência de ácidos nucléicos fornecendo ou codificação de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos, 98% ou 100% das sequências de aminoácidos de uma ou mais das regiões quadro. Em algumas modalidades, o termo "receptor" se refere ao anticorpo amino ácido ou uma sequência de ácido nucléico fornecendo ou codificação de região constante (s).

[0069]Em ainda outra realização, o termo "receptor" se refere ao anticorpo amino ácido ou uma sequência de ácido nucléico fornecendo ou codificação de uma ou mais das regiões quadro da região constante (s). Em uma modalidade específica, o termo "receptor" se refere a um amino ácido anticorpo humano ou sequência de ácido nucléico que fornece ou codifica pelo menos 80%, de preferência, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98 %, ou 100% das sequências de aminoácidos de uma ou mais das regiões quadro. De acordo com esta incorporação, um receptor pode conter pelo menos um, pelo menos, 2, pelo menos, 3, pelo menos, 4, pelo menos 5, ou pelo menos 10 resíduos de aminoácidos que faz (fazer) não ocorrer em uma ou mais posições específicas de um anticorpo humano.

[0070]Uma região de estrutura receptora e / ou região receptora constante pode ser, por exemplo, derivados ou obtidos a partir de um gene de anticorpos germi- nativas, um gene de anticorpos maduros, um anticorpo funcionais (por exemplo, anticorpos conhecidos na arte, no desenvolvimento de anticorpos, ou anticorpos comer-cialmente disponíveis).

[0071]Como usados aqui, o termo "CDR" refere-se a determinar a complementaridade região dentro de sequências variáveis de anticorpos. Há três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e a cadeia leve, que são designados CDRl, CDR2 e CDR3, para cada uma das regiões variáveis. O termo "CDR set" como aqui utilizado refere-se a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma região única variável capaz de se ligar ao antígeno. Os limites exatos desses CDRs foram definidos de forma diferente de acordo com sistemas diferentes. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al. Sequências de proteínas de interesse imunológicos (National Institutes de Health, Bethesda, MD (1987) e (1991)) não só fornece um sistema de resíduos inequívoca numeração aplicável a qualquer região variável de um anticorpo , mas também fornece os limites de resíduos preciso definir as três CDRs.

[0072]Estes CDRs pode ser referido como CDRs Kabat. Chothia e colegas de trabalho (Chothia & Lesk, J. Moi. Biol. 196:901-917 (1987) e Chothia et al. Nature 342:877-883 (1989)) descobriram que certas sub-parcelas dentro de CDRs Kabat adotar quase idêntico peptídeo conformações backbone, apesar de ter grande diversidade ao nível da sequência de aminoácidos. Essas partes sub-foram designados como Ll, L2 e L3 ou Hl, H2 e H3, onde o "L" e "H" designa a cadeia leve e pesada das regiões correntes, respectivamente. Estas regiões podem ser referidos como CDRs Chothia, que têm fronteiras que se sobrepõem com CDRs Kabat.Outros limites que definem CDRs sobreposição com os CDRs Kabat foram descritos por Padlan (FASEB J. 9:133139 (1995)) e MacCallum (JMO / Biol 262 (5) :732-45 (1996)). Definições de fronteira ainda outras CDR pode não seguir rigorosamente um dos sistemas acima, tais como definições AbM, mas ainda assim sobrepor-se ao CDRs Kabat, embora possam ser reduzido ou aumentado em função dos resultados da previsão ou experimental que os resíduos ou grupos específicos de resíduos ou mesmo toda CDRs não significativamente ligação antígeno impacto. Os métodos utilizados neste documento podem utilizar CDRs definidos de acordo com qualquer um desses sistemas, embora moda-lidades preferidas uso Kabat, AbM ou Chothia CDRs definido.

[0073]Como usados aqui, o termo resíduo "canônico" refere-se a um resíduo em um CDR ou framework que define uma determinada estrutura canônica CDR, conforme definido pela Chothia et al. (J. Mol Biol. 196:901-907 (1987);.. Chothia et al, J. Mol Biol 227:799 (1992), ambos são aqui incorporadas por referência). De acordo com Chothia et al., Partes críticas do CDRs dos anticorpos muitas confirmações backbone quase idênticos apesar peptídeo grande diversidade ao nível da sequência de amino- ácidos. Cada estrutura canônica especifica basicamente um conjunto de ângulos backbone peptídeo torção para um segmento contíguo de resíduos de aminoácidos formando um laço.

[0074]Como usados aqui, os termos "doador" e "de anticorpos do doador" referem-se a um anticorpo fornecendo um ou mais CDRs. Em uma modalidade prefe-rida, o anticorpo doador é um anticorpo de uma espécie diferente da de anticorpos a partir do qual as regiões quadro são obtidos ou derivados. No contexto de um anticorpo humanizado, o "anticorpo doador" termo se refere a um anticorpo não-humano que forneçam um ou mais CDRs.

[0075]Como usados aqui, o termo "quadro" ou "sequência de quadro" refere- se às sequências restantes de uma região variável menos os CDRs. Porque a definição exata de uma sequência CDR pode ser determinada por diferentes sistemas, o significado de uma sequência de quadro está sujeita a interpretações diferentes cor-respondentemente. As seis CDRs (Ll-CDR, - L2, e L3-de cadeia de luz e CDR-Hl, H2- , e-H3 da cadeia pesada) também divide as regiões quadro da cadeia luz e da cadeia pesada em quatro sub-regiões (LRF, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, em que CDRl está posicionado entre LRF e FR2, CDR2 entre FR2 e FR3, e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar a determinadas sub-regiões como LRF, FR2, FR3 ou FR4, uma região quadro, tal como referido por outros, representa a FRs combinados dentro da região variável de uma única cadeia de imunoglobulina, que ocorrem naturalmente. Como usados aqui, um FR representa um dos quatro sub-regiões, e FRs representa duas ou mais das quatro sub-regiões que constituem uma região framework.

[0076]Em uma modalidade da invenção, a cadeia murino pesados e sequências de luzes doador cadeia são selecionados a partir das sequências descritas a seguir: TABELA 4: SEQUÊNCIAS DE DOADOR DA CADEIA PESADA PARA TnI 19C7 AMI

TABELA 5:SEQUÊNCIAS DE DOADOR DE CADEIA LEVE PARA TnI 19C7AMI

[0077]Como usados aqui, o termo "gene de anticorpos germinativas" ou "fragmento de gene" refere-se a uma sequência de imunoglobulina codificada pelo não- linfóides células que não sdereram o processo de maturação que leva ao rearranjo genético e mutação para a expressão de uma imunoglobulina específica. (. Ver, por exemplo, Shapiro et al, Rev. Crit Immunol 22 (3): 183-200 (2002); Marchalonis et al, Adv Exp Med Biol 484:.. 13-30 (2001).). Uma das vantagens proporcionadas pela encarnações diversas da presente invenção provém do reconhecimento de que genes de anticorpos germinativas são mais propensos do que os genes de anticorpos maduros para conservar as estruturas essenciais aminoácido sequência característica de indivíduos da espécie, portanto, menos probabilidade de ser reconhecido como de uma fonte estrangeira quando usado terapeuticamente em que as espécies.

[0078]Como usados aqui, o termo "chave" resíduos referem-se a determinados resíduos dentro da região variável que têm mais impacto sobre a especificidade de ligação e / ou afinidade de um anticorpo, em um determinado anticorpo humanizado. Um resíduo chave inclui, mas não limitado a, um ou mais dos seguintes: um resíduo que é adjacente a um CDR, um site glicosilação potencial (pode ser um site de N-ou O-glicosilação), um resíduo raro, um resíduo capaz de interagir com o antí- geno, um resíduo capaz de interagir com um CDR, um resíduo canônico, um resíduo de contato entre a região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve, um resíduo dentro da zona de Vernier, e um resíduo na região que se sobrepõe entre a definição de um Chothia CDRl cadeia variável pesados e a definição do quadro Ka- bat primeira cadeia pesada.

[0079]Como usados aqui, o "anticorpo humanizado" é um anticorpo ou uma variante, derivada, mesmo analógico ou fragmento que immuno especificamente liga a um antígeno de interesse e que compreende um quadro (FR), região que tenham substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e uma região complementar determinar (CDR), tendo substancialmente a sequência de aminoáci- dos de um anticorpo não-humanos. Como usados aqui, o termo "substancialmente" no contexto de um CDR se refere a um CDR ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais de preferência, pelo menos, 98% e mais de preferência pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de um não-humano de anticorpos CDR.

[0080]Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um e, normalmente, dois, domínios variáveis (Fab, Fab ', F (ab') 2, FABC, Fv), no qual todos ou quase todas as regiões CDR correspondem às de um não -imuno- globulina humana (ou seja, anticorpos doador) e todos ou quase todas as regiões quadro são as de uma sequência de imunoglobulina humana consenso. De preferência, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma parte de uma região de imunoglobulina constante (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém a cadeia de luz, bem como, pelo menos, de domínio da variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir a CH1, dobradiça, CH2, CH3, CH4 e regiões da cadeia pesada. Em outras modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizado. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia humanizado pesado. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio humanizado variável de uma cadeia leve e / ou ca-deia pesada humanizado. O anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo, sem limitação IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. O anticorpo humanizado pode incluir sequências de mais de uma classe ou isotipo, e em particular domínios constante pode ser selecionado para otimizar desejadas funções efetoras usando técnicas bem conhecidas na arte. As regiões quadro e CDR de um anticorpo humanizado não precisa corresponder exatamente às sequências dos pais, por exemplo, o doador de anticorpos CDR ou o quadro de consenso pode ser mutagenizados pela inserção de substituição, e / ou supressão de pelo menos um resíduo de aminoácido para que o CDR ou estrutura de resíduos naquele local não corresponde nem ao anticorpo doador ou o quadro de consenso. Em uma modalidade preferida, tais mutações, no entanto, não será extensiva.

[0081]Normalmente, pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivelmente pelo menos 95% dos resíduos anticorpo humanizado irá corresponder aos do FR parental e sequências de CDR. Como usados aqui, o "quadro de consenso" refere-se à região de quadro na sequência de imunoglobulina consenso. Como usados aqui, o termo "sequência de imunoglobulina consenso" refere-se à sequência constituída pelos ácidos que ocorrem mais frequentemente amino (ou nucleotídeos) em uma família de sequências relacionadas imunoglobulina (Veja Winnaker por exemplo, desde os genes até clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha , 1987). em uma família de imunoglobuli- nas, cada posição na sequência consenso é ocupada pelo aminoácido que ocorre mais frequentemente nessa posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem também com frequência, tanto pode ser incluído na sequência consenso.

[0082]Como usados aqui, "Vernier" zona refere-se a um subconjunto de resíduos de estrutura que pode ajustar CDR estrutura e afinar o ajuste ao antígeno, como descrito por Foote e Winter (1992, J. Moi. Biol. 224:487-499, que é aqui incorporada por referência). Resíduos Vernier zona de formar uma camada subjacente à CDRs e podem ter impacto sobre a estrutura dos CDRs e da afinidade do anticorpo.

[0083]O termo "atividade" inclui atividades como a especificidade de ligação / afinidade de um anticorpo de um antígeno, por exemplo, um anticorpo anti-troponina I, que se liga à troponina I. O termo "epítopo" inclui qualquer determinante polipeptídeo capaz de ligação específica para uma imunoglobulina ou de células T do receptor. Em certas modalidades, determinantes epítopo incluir agrupamentos superfície quimicamente ativa de moléculas como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforil, ou sulfonila e, em certas modalidades, podem ter específicas tridimensionais características estruturais e / ou características acusação específica.

[0084]Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligado a um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo é dito que se ligam especificamente um antí- geno quando se preferencialmente reconhece seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e / ou macromoléculas.

[0085]O termo "ressonância plasmon de superfície", como utilizado aqui, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise das interações em tempo real bioespecíficas pela detecção de alterações na concentração de proteínas dentro de uma matriz biosensor, por exemplo, usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB , Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). Para obter descrições mais pormenores, ver Jónsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 5J_ :19-26; Jónsson, U., et al. (1991) :620- 11 biotécnicas 627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Moi. Recognit. 8:125-131; e Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

[0086]O termo "Kon", como usado neste documento, pretende referir-se à taxa sobre constante de associação de um anticorpo para o antígeno para formar o complexo anticorpo / antígeno como é conhecido no art.

[0087]O termo "Koff", como usado neste documento, pretende referir-se à taxa def constante de dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo / antígeno como é conhecido no art. O termo "Kd" ou "KD", como usado neste documento, destina-se para se referir à constante de dissociação de uma interação antígeno-anticorpo particular como é conhecido no art. O termo "proteína de ligação rotulada" como usado neste documento, refere-se a uma proteína com uma etiqueta incorporada que prevê a identificação da proteína de ligação. Preferencialmente, o rótulo é um marcador de- tectável, eg, incorporação de um ácido radio marcado amino ou apego a um polipep- tídeo de metades biotinil que pode ser detectado por avidina marcados (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectado por óptico ou métodos colorimétricos).

[0088]Exemplos de etiquetas para polipeptídeos incluem, mas não estão limitados a, o seguinte: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 1251, 131I, 177Lu, 166Ho, ou 153Sm); etiquetas fluorescentes (por exemplo, , FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), etiquetas enzimática (por exemplo, peroxidase, fosfatase, luciferase alcalina); marcadores quimioluminescente; grupos biotinil; predeterminado epítopos polipeptídeo reconhecida por um repórter secundário (por exemplo, sequências de leucina par zíper, sítios de ligação para anticorpos secundários , metal domínios de ligação, tags epítopo); e agentes magnéticos, como quelatos de gadolíneo.

[0089]O "conjugado anticorpo" se refere a uma proteína de ligação, tal como um anticorpo, ligado quimicamente a uma molécula química segundo, como um agente terapêutico ou citotóxicas. O termo "agente" é usado aqui para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extrato feito a partir de materiais biológicos. De preferência a agentes terapêuticos ou citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, a toxina pertussis, ta- xol, citocalasina B, gramicidin D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vimblastina, vincristina, colchicin, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi anthracin dione, mitoxantrona, mithramycin, actinomicina D, 1 dehydrotestosterone, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos da mesma. Os termos "cristal" e "cristalizado", como usado neste documento, referem-se a um anticorpo, ou parte de ligação de antígeno dos mesmos, que existe na forma de um cristal. Cristais são uma forma de estado sólido da matéria, que é distinto de outras formas, como o estado amorfo sólido ou no estado líquido cristalino. Cristais são compostos de regular, repetindo, matrizes tridimensionais de átomos, íons, moléculas (por exemplo, proteínas, como anticorpos), ou conjuntos molecular (por exemplo, complexos antígeno / anticorpo). Essas matrizes tridimensionais são organizadas de acordo com específicas relações matemáticas que são bem compreendidos no campo.

[0090]A unidade fundamental, ou bloco de construção, que se repete em um cristal é chamado de unidade assimétrica. Repetição da unidade assimétrica em um arranjo que está em conformidade com uma determinada simetria cristalográfica, bem definidos fornece a "célula unitária" do cristal. Repetição da célula unitária por traduções regulares em todas as três dimensões fornece o cristal. Ver Giege, R. e Ducruix, A. Barrett, Cristalização de ácidos nucléicos e proteínas, uma Abordagem Prática, 2 a ed., Pp 20 16/01, Oxford University Press, New York, New York, (1999). "

[0091]O "polinucleotídeo" termo que se refere o presente documento significa uma forma polimérica de dois ou mais nucleotídeos, ambos os ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeos. O termo inclui formas simples e dupla fita de DNA, mas de preferência é DNA de dupla fita.

[0092]O termo "polinucleotídeo isolado" como aqui utilizado, um polinucleotídeo (por exemplo, de origem genômico, cDNA, ou sintético, ou alguma combinação deles) que, em virtude de sua origem, não está associada com a totalidade ou uma parte de um polinucleotídeo com que o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza; é operavelmente ligados a um polinucleotídeo que não está ligada à natureza, ou não ocorrem na natureza como parte de uma sequência maior.

[0093]O termo "vector" como usado neste documento, pretende referir-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico para o qual foi ligado. Um tipo de vector é um "plasmídeo", que se refere a um circuito circular de DNA dupla fita em que segmentos de DNA adicional pode ser ligada. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicional pode ser ligada no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores de bactérias têm uma origem bacteri- ana da replicação e epissomal vetores de mamíferos).

[0094]Outros vetores (por exemplo, não epissomal vetores de mamíferos) pode ser integrado no genoma da célula hospedeira, após a introdução na célula hospedeira e, portanto, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes ao qual estão ligados operacionalmente.

[0095]Vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vectores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante são muitas vezes na forma de plasmí- deos. Na especificação do presente ", plasmídeo" e "vector" podem ser usados de forma intercambiável como o plasmídeo é a forma mais comumente utilizada de vetor. No entanto, a invenção destina-se a incluir esses outros tipos de vetores de expres-são, tais como vetores virais (por exemplo, a replicação do retrovírus defeituoso, ade- novírus e vírus adeno-associado), que desempenham funções equivalentes.

[0096]O termo "operavelmente ligados" se refere a uma justaposição em que os componentes descritos estão em um relacionamento que lhes permitam funcionar na sua forma pretendida. A sequência de controle "operavelmente ligado" a uma sequência de codificação é ligada de tal forma que a expressão da sequência de codificação é alcançada em condições compatíveis com as sequências de controle.

[0097]"Operavelmente ligados" sequências incluem ambas as sequências expressão de controle que são contíguos com o gene de interesse e sequências de controle que atuam na expressão trans ou à distância para controlar o gene de interesse. O termo "sequência de controle de expressão", como utilizado neste documento refere-se a sequências de polinucleotídeos que são necessárias para efetuar a expressão e transformação de sequências de codificação ao qual estão ligados. Sequências de controle incluem a expressão adequada a transcrição de iniciação, rescisão, promotor de sequências; eficiente processamento de sinais, tais como RNA junção e po- liadenilação sinais; sequências que estabilizam mRNA citoplasmático; sequências que aumentam a eficiência de tradução (ou seja, Kozak sequência consenso); sequências que melhoram a estabilidade da proteína e, quando desejado, sequências que aumentam a secreção de proteínas. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro, em procariontes, como sequências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossomal, e sequência de terminação da transcrição; em eucariotos, geralmente, tais sequências de controle incluem promotores e sequência de terminação de transcrição. O termo "sequências de controle" se destina a incluir componentes cuja presença é essencial para a expressão e transformação, e também podem incluir componentes adicionais, cuja presença é vantajoso, por exemplo, sequências de líder e parceiro de sequências de fusão. "Transformação", conforme definido neste documento, refere-se a qualquer processo pelo qual o DNA exógeno entra em uma célula hospedeira. Transformação pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais, utilizando vários métodos conhecidos na arte. Transformação pode confiar em qualquer método conhecido para a inserção de estrangeiros sequências de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira procarióticas ou eucarióticas. O método é selecionado com base na célula hospedeira sendo trans-formada e pode incluir, mas não limitado a, infecção viral bombardeio eletroporação, lipdeílico, e partículas,

[0098]Tal "transformadas" células incluem as células estavelmente transformadas em que o DNA inserido é capaz de replicação autônoma ou como um plasmí- deo replicar ou como parte do cromossomo hospedeiro. Eles também incluem células que transitoriamente expressar o DNA ou RNA inserido por períodos limitados de tempo.

[0099]O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "celular do hospedeiro"), como usado neste documento, destina-se para se referir a uma célula em que o DNA exógeno foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos são projetadas para se referir não apenas para a célula de assunto particular, mas também para os descendentes dessa célula. Porque algumas modificações podem ocorrer em sucessivas gerações, quer devido a mutação ou influências ambientais, tais descendentes não podem, de fato, ser idêntico ao da célula-mãe, mas ainda estão incluídos no âmbito da "célula hospedeira", tal como utilizado neste documento.

[00100]O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "celular do hospedeiro"), como usado neste documento, destina-se para se referir a uma célula em que o DNA exógeno foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos são projetadas para se referir não apenas para a célula de assunto particular, mas também para os descendentes dessa célula. Porque algumas modificações podem ocorrer em sucessivas gerações, quer devido a mutação ou influências ambientais, tais descendentes não podem, de fato, ser idêntico ao da célula-mãe, mas ainda estão incluídos no âmbito da "célula hospedeira", tal como utilizado neste documento.Preferivelmente células hospedeiras incluem células procarióticas e eucarióticas selecionadas de qualquer dos disponíveis no reino. Células eucarióticas preferidas incluem, protistas, fungais, e plantas e células de animais. Mais preferivelmente células hospedeiras incluem, porém não se limitam a, linhagens de células procarióticas E.coli; linhagens de células mamárias CHO, HEK 293 e COS; a linha de célula de inseto Sf9; e a célula fungal Saccharomyes cerevisaie ou Picchia Pastoris.

[00101]Técnicas padrão podem ser utilizadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura de tecidos e transformação (por exemplo, eletro- poração, lipdeílico). Reações enzimáticas e técnicas de purificação pode ser feita de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente realizado na arte ou como aqui descritos. As técnicas e procedimentos acima podem ser geralmente executadas de acordo com os métodos convencionais conhecidas na arte e, como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citados e discutidos ao longo do presente especificação. Veja por exemplo, Sambrook et al. Clonagem Molecular: Um Manual de Laboratório (2d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).), Que é aqui incorporadas por referência para qualquer finalidade.

[00102]"Organismo transgênico", como são conhecidas na arte e, como usado neste documento, refere-se a um organismo com células que contêm um transgene, onde o transgene introduzido no organismo (ou um ancestral do organismo) não expressa um polipeptídeo naturalmente expressa no organismo .

[00103]A "transgene" é uma construção de DNA, que é estável e operavel- mente integrado no genoma de uma célula a partir da qual um organismo transgênico desenvolve, direcionando a expressão de um produto gene codificado em um ou mais tipos de células ou tecidos do organismo transgênico.

[00104]O termo "regular" e "modular" são usados alternadamente, e, como usado neste documento, refere-se a uma mudança ou uma alteração na atividade de uma molécula de interesse (por exemplo, a atividade biológica de troponina I). Modulação pode ser um aumento ou uma diminuição na magnitude de uma determinada atividade ou função da molécula de interesse. Atividades e funções exemplar de uma molécula incluem, mas não estão limitados a características de ligação, a atividade enzimática, ativação do receptor de células, e transdução de sinal.

[00105]Correspondentemente, o termo "modulador", como utilizado aqui, é um composto capaz de mudar ou alterar uma atividade ou função de uma molécula de interesse (por exemplo, a atividade biológica de troponina I). Por exemplo, um mo- dulador pode causar um aumento ou diminuição da magnitude de uma determinada atividade ou função de uma molécula em comparação com a magnitude da atividade ou função observadas na ausência do modulador. Em certas modalidades, um modu- lador é um inibidor, que diminui a magnitude de pelo menos uma atividade ou função de uma molécula. Inibidores exemplares incluem, mas não estão limitados a proteínas, peptídeos, anticorpos, pepticorpos, hidratos de carbono ou pequenas moléculas orgânicas. Pepticorpos são descritas, por exemplo, no pedido internacional Publicação n ° WO 01/83525. O "agonista" termo, como usado neste documento, refere-se a um modulador que, quando contactado com uma molécula de interesse, provoca um aumento na magnitude de uma determinada atividade ou função da molécula em relação à magnitude da atividade ou função observada em a ausência do agonista. . Agonistas de interesse particular podem incluir, mas não estão limitados a polipeptí- deos troponina I, ácidos nucléicos, hidratos de carbono, ou qualquer outras moléculas que se ligam à troponina I. O "antagonista" termo ou "inibidor", como usado neste documento, referem-se a um modulador que, quando contactado com uma molécula de interesse provoca uma diminuição na magnitude de uma determinada atividade ou função da molécula em relação à magnitude da atividade ou função de observados na ausência do antagonista.

[00106]Como usados aqui, "o montante efetivo" refere-se a quantidade de uma terapia que é suficiente para reduzir ou amenizar a gravidade e / ou duração de uma desordem ou um ou mais sintomas da mesma, impedir o avanço de uma doença, causam regressão dá uma doença, prevenir a recorrência, o desenvolvimento de início, ou progressão de um ou mais sintomas associados com uma doença, detectar uma doença, ou aumentar ou melhorar o efeito profilático ou terapêutico (s) de outra terapia (agente, por exemplo, profilático ou terapêutico). A "amostra" termo, como usado neste documento, é usada em seu sentido mais amplo.

[00107]A "amostra biológica", como usado neste documento, inclui, mas não limitado a qualquer quantidade de uma substância de um ser vivo ou coisa antiga vida. Seres vivos incluem, mas não estão limitados a os seres humanos, camundongos, ratos, macacos, cães, coelhos e outros animais mamíferos ou não-mamíferos. Tais substâncias incluem, mas não estão limitados a o sangue, soro, urina, líquido sinovial, células, órgãos, tecidos (por exemplo, cérebro), medula óssea, gânglios linfáticos, lí-quido cefalorraquidiano, e baço.

PROCESSOS DE FABRICAÇÃO DE ANTICORPOS

[00108]Anticorpos da presente invenção pode ser feita por qualquer um de uma série de técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, os anticorpos podem ser preparados com uma grande variedade de técnicas, incluindo o uso de tecnologias de visualização ou fago recombinante, ou uma combinação destes. O "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucarióticos, procarióticos, ou fago, e não o método pelo qual ele é produzido.

[00109]Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de gerar anticorpos recombinantes (assim como os anticorpos produzidos pelo método) compreendendo uma cultura de Ovário de Hamster Chinês linhagem de células secretoras de um anticorpo da invenção. Além disso, fragmentos de anticorpos da presente invenção, que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por meio de técnicas conhecidas. Por exemplo, Fab e F (ab') 2 fragmentos da invenção podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulinas, utilizando enzimas como a papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir F (ab') 2 fragmentos). F (ab') 2 fragmentos contém a região variável, a região da cadeia de luz constante e o domínio CHI da cadeia pesada. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TROPONINA I USANDO BIBLIOTECAS ANTICORPO RECOMBINANTE

[00110]Métodos in vitro também pode ser usado para fazer os anticorpos da invenção, em que uma biblioteca de anticorpos é analisada para identificar um anticorpo com a especificidade desejada ligação. Métodos para a triagem de bibliotecas tais anticorpos recombinantes são bem conhecidas na arte e incluem métodos descritos, por exemplo, Ladner et al, Patente dos EUA n ° 5223409; Kang et al, International Appln. Publicação n ° WO 92/18619; Dower et al, International Appln. Publicação n ° WO 91/17271; Winter et al, International Appln. Publicação n ° WO 2 / 20791; Markland et al, Appln internacionais. Publicação n ° WO 92/15679; Breitling et al, International Appln. Publicação n ° WO 93/01288; McCafferty et al, PCT Publicação n ° WO 92/01047; Garrard et al, International Appln. Publicação n ° WO 92/09690; Fuchs et al (1991), Bio / Technology 9:1370-1372; Hay et al, (1992) Hum anticorpos Hibridomas 3:81-85; Huse et al (1989), Ciência 246: 1275-1281; McCafferty et al, Nature (1990) 48:552-554; Griffiths et al (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al, (1992) J Biol MoI 226:889-896; Clackson et al, (1991) Nature 352:624-628; Gram et al, (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al (1991) Bio / Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al (1991), Nuc ácido Res 19:4133-4137 e Barbas et al (1991), PNAS 88 :7978-7982, EUA pedido de patente n ° 20030186374 de publicação, e pedido internacional publicação n ° WO 97/29131, o conteúdo de cada um dos quais são incorporadas aqui por referência.

[00111]A biblioteca de anticorpos recombinantes pode ser de um assunto imunizados com troponina I, ou uma parte dele. Alternativamente, a biblioteca de anticor-pos recombinantes pode ser de um assunto naive, ou seja, alguém que não tenha sido imunizado com troponina I, tais como uma biblioteca de anticorpos humanos a partir de um sujeito humano que não tenha sido imunizado com troponina I. Os anticorpos humanos da invenção são selecionados por triagem de anticorpos recombinantes a biblioteca com o peptídeo compreendendo troponina I humano para, assim, selecionar aqueles anticorpos que reconhecem troponina I. Métodos para realizar a triagem e seleção, tais são bem conhecidas na arte, tal como descrito nas referências no parágrafo anterior. Para selecionar anticorpos da invenção tendo especial afinidade de ligação para a troponina I, tais como aqueles que se dissociam da troponina I humano com uma taxa de Kdef especial constante, o método da técnica conhecido de ressonância de plasma de superfície pode ser usado para selecionar anticorpos tendo a taxa Kdef desejado constante. Em um aspecto, a invenção pertence a um anticorpo isolado, ou mesmo uma porção de ligação ao antígeno, que se liga humana troponina I. Em modalidades diversas, o anticorpo é um anticorpo recombinante. Em outra abordagem os anticorpos da presente invenção também pode ser gerado através de métodos de levedura mostrar conhecido no art. Em métodos de exibição de levedura, métodos genéticos são usados para amarrar domínios de anticorpos para a parede celular de levedura e exibi-las na superfície da levedura. Em particular, tal levedura pode ser utilizada para mostrar antígeno domínios de ligação expressa a partir de um repertório ou a biblioteca de anticorpos combinatorial (por exemplo, humano ou mu- rino). Exemplos de métodos de levedura de exibição que pode ser usado para fazer os anticorpos da presente invenção incluem aqueles Wittrup divulgados et al., EUA Patent No. 6.699.658 aqui incorporados por referência. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS RECOMBINANTES

[00112]Como observado acima, os anticorpos da presente invenção pode ser produzido por qualquer número de técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, a expressão de células do hospedeiro, onde vetor de expressão (s) de codificação de cadeias pesadas e leves é (são) transfectadas em uma célula hospedeira através de técnicas padrão é o método preferido de produzir os anticorpos da presente invenção. (As várias formas do "transfecção" termo se destinam a abranger uma grande variedade de técnicas comumente utilizadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procarióticas ou eucarióticas, por exemplo, eletroporação, fosfato de cálcio-precipitação, DEAE-dextran transfecção e os gosto.)

[00113]Embora seja possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras ou procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas é preferível, e mais preferencialmente em células hospedeiras de mamíferos, porque tais células eucarióticas (e em particular as células de mamíferos) são mais prováveis do que as células procariotas de montar e secretam um anticorpo adequadamente dobradas e imunologicamente ativas.

[00114]Preferidos células hospedeiras de mamíferos para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo DHFR-CHO células, descrito no Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. LSg EUA 77:4216-4220, utilizado com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, conforme descrito no RJ Kaufman e Sharp PA (1982) Moi. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Quando vetores de expressão recom- binantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos pelo cultivo as células do hospedeiro por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secreção do anticorpo em o meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos de purificação de proteína padrão.

[00115]Células do hospedeiro também pode ser usado para produzir fragmentos de anticorpos funcionais, tais como fragmentos Fab ou moléculas scFv. Será entendido que variações sobre o procedimento acima estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável para transfecção de uma célula hospedeira com o DNA de codificação de fragmentos funcionais de uma das cadeias a luz e / ou a cadeia pesada de um anticorpo desta invenção. Tecnologia de DNA re- combinante pode também ser usado para remover alguns, ou todos, a codificação de DNA ou em ambas as cadeias leves e pesados que não é necessário para a ligação com os antígenos de interesse.

[00116]As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA também são truncados abrangeu pelos anticorpos da invenção. Além disso, os anticorpos bi- funcional pode ser produzida em que uma cadeia pesada e uma luz é um anticorpo da invenção e da cadeia de outras pesadas e leves são específicos para um antígeno que não os antígenos de interesse por reticulação de um anticorpo da invenção de um segundo anticorpos por métodos padrão de reticulação química.

[00117]Em um sistema preferido para a expressão recombinante de um anticorpo ou antígeno de ligação do mesmo, da invenção, uma codificação de vetor re- combinante de expressão tanto a cadeia de anticorpos pesada e cadeia leve do anticorpo é introduzido em células CHO-DHFR por transfecção de fosfato de cálcio mediada . Dentro do vetor de expressão recombinante, o anticorpo pesados e genes de cadeia leve são cada operatório ligados a elementos CMV melhorador / AdMLP promotor regulamentar destinado a promover altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando a seleção meto- trexato / amplificação

[00118]As células hospedeiras transformantes selecionados são cultivados para permitir a expressão do anticorpo cadeias leves e pesadas e de anticorpos intactos é recuperado a partir do meio de cultura. Padrão de técnicas de biologia molecular são utilizados para preparar o vetor de expressão recombinante, transfecção as células hospedeiras, selecione para transformantes cultura, as células hospedeiras e recuperar os anticorpos a partir do meio de cultura. Ainda mais a invenção fornece um método de sintetizar um anticorpo recombinante da invenção através da cultura de uma célula hospedeira da invenção em um meio de cultura adequado, até que um anticorpo recombinante da invenção é sintetizada. O método pode ainda compreender isolar o anticorpo recombinante a partir do meio de cultura. ANTICORPOS ANTI-TROPONINA

[00119]O isolado anti-troponina I sequências de anticorpos CDR aqui descrito (ver Tabelas 1 e 2) estabelecer uma nova família de proteínas de ligação a troponina I, isolado, de acordo com esta invenção, e polipeptídeos compreendendo que incluem as sequências CDR listados nas Tabelas 1 e 2 acima. Para gerar e selecionar CDRs da invenção ter preferido troponina I atividade de ligação, os métodos padrão conhecido na arte para a geração de proteínas de ligação da presente invenção e avaliar as características de ligação dos mesmos poderão ser usados, incluindo, mas não limitado às empresas especificamente aqui descritos. ANTICORPOS ANTI-TROPONINA I QUIMERICO

[00120]Um anticorpo quimérico é uma molécula em que diferentes partes do anticorpo são derivados de diferentes espécies animais, tais como anticorpos tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região de imunoglobulina humana constante. Métodos para a produção de anticorpos quiméricos, como os da presente invenção, são bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Morrison, Ciência 229:1202 (1985); Oi et al, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al, (1989) Métodos J. Immunol 125:191-202; EUA Pat. N ° s 5807715; 4816567 e 4816397, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades. Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al, 1984, Proc Natl Acad Sci 81 :851-855;.. Neuberger et al, 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al, 1985, 314:452-454 Natureza que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades) por junção genes de uma molécula de anticorpo do rato de especificidade do antígeno apropriado em conjunto com genes de uma molécula de anticorpo humano da atividade biológica apropriada pode ser usado.

[00121]Em uma modalidade, os anticorpos quiméricos da invenção são produzidos pela substituição da região constante da cadeia pesada dos anticorpos descritos acima com uma região IgGl humana constante. Em uma modalidade específica, o anticorpo quimérico da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. ANTICORPOS ENXERTADOS ANTI-TROPONIN I CDR

[00122]Os anticorpos-CDR enxertados de acordo com presente invenção compreendem pesada e cadeia leve sequências região variável de um anticorpo humano no qual uma ou mais das regiões CDR de VH e / ou VL são substituídas por sequências de CDR dos anticorpos murinos da invenção. A sequência de quadro a partir de qualquer anticorpo humano pode servir como modelo para CDR enxertia. No entanto, a substituição da cadeia direto para um quadro deste tipo muitas vezes leva a alguma perda de afinidade de ligação ao antígeno.

[00123]Quanto mais homólogas um anticorpo humano é o anticorpo murino originais, a menos provável a possibilidade de que a combinação dos CDRs murino com o quadro humano irá introduzir distorções na CDRs que poderiam reduzir a afinidade.

[00124]Portanto, é preferível que o quadro humano variável que é escolhido para substituir o quadro murino variável além da CDRs ter pelo menos uma identidade de sequência com 65% do quadro região de anticorpos murinos variável. É preferível que as regiões humanos e murinos variável além da sequência de CDRs ter pelo me-nos 70% identificar. É ainda mais preferível que as regiões humanos e murinos variável além da CDRs ter identidade sequência pelo menos 75%.

[00125]É preferível que as regiões humanos e murinos variável além da CDRs ter pelo menos 80% identidade de sequência. Métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na arte e discutido em detalhes no Exemplo 2.2. {Veja também EP 239400; Intern. Appln. Publicação n ° WO 91/09967; U. S. Pat. N ° s 5225539; 5530101 e 5585089), folheados ou resurfacing (EP 592106; EP 519596; Padlan, MolecularImmunology 28 (4 / 5) :489-498 (1991); Studnicka et al, Proteína Engenharia 7 (6): 805 -814 (1994); Roguska et al, PNAS 91 :969-973 (1994)), e da cadeia de baralhar (EUA Pat No.5, 565352).. ANTICORPOS HUMANIZADOS

[00126]Anticorpos são moléculas de anticorpo humanizado de não-humano de anticorpos que se ligam espécies o antígeno desejado ter uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de espécies não-humanas e regiões estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana. Conhecido sequências humana Ig são divulgadas, por exemplo:www.ncbi.nlm.nih.gov / entrez / query.fcgi; www.atcc.org / fago / hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www. . antibo-dyresource .com / html onlinecomp; www.public.iastate.edu / .about.pedro / rese- arch_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de / SD / TI / IT.html; www.whfreeman.com / imunologia / CH-05/kuby05.htm; www. . thinkquest.org biblioteca / 12429/Immune / Antibody html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrcy/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com /; path- box.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl. edu / .about.hcl /; www.pe- bio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about . Yasuhito / Elisa.html; www.biodesign.com / table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl. edu / .about.fccl / proto- col.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- start.html; baserv.uci.kun. nl / .about.jraats / linksl.html; www.recab.uni- hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- Blic / intro.html; www.ibt.unam.mx / virN_mice.html; imgt.cnusc.fr: 8104 /; www.biochem.ucl. ac.uk / .about.martin / abs / index.html; antibody.bath.ac.uk /; abgen.cvm.tamu.edu / lab / wwwabgen.html; www.unizh.ch / .about.honegger / AHOsem . - INAR / SlideOl html; www.cryst.bbk.ac .uk/.about.ubcg07s /; www.nimr.mrc.ac.uk / CC / ccaewg / cca- ewg.htm; www.path.cam.ac uk. /. . about.mrc7/h- umanisation / T AHHP html; www.ibt.unam.mx / vir / estrutura / stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu / smithgp / index.html; www.cryst.bioc. cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina / Web-páginas / Pept / spot- tech.html; www.jerini.de / fr roducts.htm; www.patents.ibm.com / ibm.html.Kabat et al.,

[00127]Sequências de proteínas de interesse imunológicos, são aqui apresentadas de acordo com o Departamento de Saúde dos Estados Unidos (1983), cada um inteiramente aqui incorporados por referência. Tais sequências importado pode ser usado para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, aumentar ou modificar afinidade, vinculativo, sobre a taxa, da taxa a avidez, especificidade, meia-vida, ou qualquer outra característica adequada, tal como é conhecida na arte.

[00128]Resíduos de quadro nas regiões de estrutura humana pode ser substituído com o resíduo correspondente do anticorpo doador CDR para alterar, de preferência melhorar, ligação de antígeno. Estas substituições quadro são identificados pelos métodos conhecidos na arte, por exemplo, pela modelagem das interações do CDR e resíduos quadro para identificar resíduos quadro importante para ligação do antígeno e comparação de sequência para identificar resíduos quadro incomum em posições específicas. (Ver, por exemplo, a rainha et al, EUA No. 5.585.089 Pat;.. Riechmann et al, Nature 332:323 (1988),que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.) Modelos tridimensionais imunoglobulina são comumente disponíveis e são familiares para os qualificados no art. Programas de computador estão disponíveis, que ilustram e exibir prováveis estruturas tridimensionais conformacionais de sequências de imunoglobulina selecionados candidato. Inspeção destas apresentações permite a análise da possível papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidato, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade do candidato de imunoglobulina para vincular seu antígeno. Desta forma, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados do consenso e as sequências de importação de modo que a característica do anticorpo desejado, tais como aumento da afinidade para o antígeno-alvo (s), seja alcançado.

[00129]Em geral, os resíduos são diretamente CDR e mais substancialmente envolvidos na influência de ligação de antígeno. Os anticorpos podem ser humanizado, usando uma variedade de técnicas conhecidas na arte, tais como, mas não limitados aos descritos em Jones et al, Nature 321:.. 522 (1986); Verhoeyen et al, Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Moi. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al, J. Immunol.. 151:. 2623 (1993), Padlan, Imunologia Molecular 28 (4 / 5) :489-498 (1991); Studnicka et al, Proteína Engenharia 7 (6) :805-814 (1994); Roguska et al, PNAS. 91 :969-973 (1994); Internacional Appln. Publicação n ° WO 91/09967, PCT /: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424 , WO90/14430, EP 229246, EP 592106; EP 519596, EP 239400, EUA Pat. N ° s 5565332, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, cada um inteiramente aqui incorporados por referência, incluídas as referências citadas nele. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS E LINHAGENS DE CÉLULA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[00130]Como observado acima, de preferência, anticorpos da presente invenção exibem uma alta capacidade de se ligam especificamente a troponina I, por exemplo, como avaliado por qualquer um dos vários in vitro e em ensaios in vivo conhecido na arte (por exemplo, ver exemplos abaixo). Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada, como um IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD região constante. De preferência, a região constante da cadeia pesada é uma região da cadeia pesada IgGl constante ou uma IgG4 região constante da cadeia pesada. Além disso, o anticorpo pode incluir uma região constante de cadeia leve, kappa ou uma região constante de cadeia leve lambda ou uma região cadeia de luz constante. De preferência, o anticorpo compreende uma região kappa cadeia de luz constante. Alternativamente, a parcela de anticorpos podem ser, por exemplo, um fragmento Fab ou um único fragmento Fv de cadeia.

[00131]Substituições de resíduos de aminoácidos na porção Fc para alterar a função efetora de anticorpos são conhecidos na arte (Winter et al, Patente dos EUA N ° s 5648260 e 5624821). A porção Fc de um anticorpo medeia várias importantes funções efetoras, por exemplo, a indução de citocinas, ADCC, fagocitose, citotoxici- dade dependente do complemento (CDC) ea meia-vida / clearance taxa de complexos anticorpo e antígeno-anticorpo. Em alguns casos, essas funções efetoras são desejáveis para anticorpo terapêutico, mas em outros casos podem ser desnecessários ou mesmo prejudiciais, dependendo dos objetivos terapêuticos.

[00132]Determinados isotipos IgG humana, particularmente IgGl e IgG3, mediar ADCC e CDC via ligação a FCYRS CIQ e complementar, respectivamente. Receptores Fc neonatal (FcRn) são os componentes críticos determinar a circulação de meia-vida de anticorpos. Em ainda outra encarnação, pelo menos um resíduo de ami- noácido é substituído na região constante do anticorpo, por exemplo, a região Fc do anticorpo, de modo que funções efetoras dos anticorpos são alterados.

[00133]Uma modalidade fornece uma proteína de ligação rotulada onde uma porção de anticorpo ou anticorpos da invenção é derivatizado ou ligada a outra molécula funcional (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Por exemplo, uma proteína de ligação rotulada da invenção podem ser obtidas por funcionalmente ligar um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção (por produto químico de acoplamento, a fusão genética, associação não covalentes ou não) a uma ou mais outras entidades moleculares, como o outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo ou um diacorpo bis especifico), um agente detectáveis, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e / ou uma proteína ou peptídeo que pode mediar associado do anticorpo ou porção de anticorpos com uma outra molécula (como uma região de núcleo estreptavidina ou um tag polyhistidine).

[00134]Útil agentes detectável com a qual um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser derivatizado incluem compostos fluorescentes. Exemplar agentes de avivamento fluorescentes detectáveis incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, 5-dimetilamina-1-napthalenesulfonyl cloreto, ficoeritrina e outros. Um anticorpo também pode ser derivatizado com enzimas detectáveis, tais como fosfatase alcalina, peroxidase, glicose oxidase e similares.

[00135]Quando um anticorpo é derivatizado com uma enzima detectável, é detectado pela adição de reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação detectável. Por exemplo, quando o agente detectável peroxidase está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina leva a um produto de reação de cor, que é detectável. Um anticorpo também pode ser derivatizado com biotina, e detectados através da medição indireta de avidina ou estreptavidina vinculativo. Uma outra modalidade da invenção fornece uma proteína cristalizada vinculativo. De preferência, a invenção refere-se cristais de todo anticorpos anti-troponina I e fragmentos dos mesmos conforme divulgado aqui, e formulações e composições compreendendo tais cristais. Em uma modalidade a proteína cristaliza vinculativo tem maior meia-vida in vivo do que a contraparte solúvel da proteína de ligação. Em outra modalidade, a proteína de ligação mantém atividade biológica após a cristalização.

[00136]Cristalizado proteína de ligação da invenção podem ser produzidos de acordo com métodos conhecidos na arte e conforme divulgado na Appln Internacional. Publicação n ° WO 02/072636, aqui incorporados por referência. Uma outra modalidade da invenção fornece uma proteína glicosilada de ligação em que o anticorpo ou antígeno de ligação do mesmo é composto por um ou mais resíduos de carboidratos. Nascente na produção de proteínas in vivo podem sderer processamento adicional, conhecido como post-translational modificação. Em particular, o açúcar (glicosil) resíduos podem ser adicionadas enzimaticamente, um processo conhecido como glicosi- lação. As proteínas resultantes tendo covalentemente ligadas cadeias laterais de oli- gossacarídeos são conhecidas como proteínas ou glicoproteínas glicosiladas. Os anticorpos são glicoproteínas com um ou mais resíduos de carboidratos no domínio Fc, bem como o domínio da variável. Resíduos de carboidratos no domínio Fc têm efeito importante sobre a função efetora do domínio Fc, com efeito mínimo sobre a ligação do antígeno ou meia-vida do anticorpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp 1116 ). Em contraste, a glicosilação do domínio variável pode ter um efeito sobre a atividade de ligação do antígeno do anticorpo. Glicosilação no domínio variável pode ter um efeito negativo sobre a afinidade de ligação do anticorpo, provavelmente devido ao impedimento estérico (Co, MS, et al. Moi. Immunol. (1993) 30:1361-1367), ou resultar em aumento da afinidade para o (Exp Wallick, S. C, et al, Med (1988) 168:10991109 ; Wright, A., et al, EMBO J. (1991) 10:2717 2723) antígeno.

[00137]Um aspecto da presente invenção é direcionada para a geração de mutantes glicosilação site no qual o O-ou N-linked local de glicosilação da proteína de ligação tem sido mutado. Um técnico no assunto pode gerar mutantes tais usando o padrão bem conhecido tecnologias. A criação de mutantes glicosilação site que manter a atividade biológica, mas tem aumentado ou diminuído a atividade de ligação são outro objeto da presente invenção.

[00138]Em ainda outra modalidade, a glicosilação do anticorpo ou antígeno de ligação do mesmo da invenção é modificado. Por exemplo, um anticorpo aglycos- lated podem ser feitas (ou seja, o anticorpo não tem glicosilação). Glicosilação pode ser alterado, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Modificações de carboidratos como pode ser feito, por exemplo, alterando um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência de anticorpos. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas que resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação variável região para, assim, eliminar a glicosilação naquele site. Aglycosylation como podem aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhes no Internacional Appln. Publicação n ° WO 03/016466A2 e U. S. Pat. N ° s 5714350 e 6350861, sendo cada uma delas aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[00139]Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo modificado da invenção pode ser feito que tem um tipo alterado de glicosilação, como um anticorpo hipdeucosolado ter quantidades reduzidas de resíduos fucosyl ou um anticorpo tendo aumentado bisecting estruturas GIcNAc. Tais padrões de glicosilação alterados têm sido demonstrados para aumentar a capacidade ADCC de anticorpos. Modificações de carboidratos como pode ser feito, por exemplo, expressar o anticorpo em uma célula hospedeira com máquinas glicosilação alterada. Células com máquinas glicosila- ção alterados têm sido descritos na arte e pode ser usado como células hospedeiras para expressar anticorpos recombinantes da invenção para, assim, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Veja, por exemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, bem como, No Europeu de Patentes: EP 1176195; Internacional Appln. Publicação n ° s WO 03/035835 e 99/5434280 WO, sendo cada uma delas aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[00140]Glicosilação da proteína depende da sequência de aminoácidos da proteína de interesse, bem como a célula hospedeira em que a proteína é expressa. Diferentes organismos podem produzir enzimas de glicosilação diferentes (por exemplo, glicosiltransferases e glicosidases), e têm diferentes substratos (açúcares nucle- otídeos) disponíveis. Devido a esses fatores, padrão de proteínas glicosilação e composição dos resíduos glicosil, podem ser diferentes dependendo do sistema de aco-lhimento em que uma proteína particular é expressa. Ele é conhecido por aqueles especializados na arte que as diferentes glicosilação de proteínas pode resultar em diferentes características da proteína. Por exemplo, a eficácia de uma proteína tera-pêutica produzido em uma série de micro-organismos, como fungos e glicosilada, utilizando a via de endógena de leveduras pode ser reduzida comparada com a da mesma proteína expressa em uma célula de mamíferos, como uma linhagem de células CHO. Glicoproteínas também podem ser imunogênica em seres humanos e apresentam reduzida meia-vida in vivo após a administração. Receptores específicos em humanos e outros animais podem reconhecer resíduos glicosil específicos e promover a remoção rápida da proteína da corrente sanguínea. Outros efeitos adversos podem incluir mudanças no enovelamento de proteínas, a solubilidade, a susceptibilidade a proteases, tráfico, transporte, compartimentalização, secreção, o reconhecimento por outras proteínas ou fatores, antigenicidade ou alergenicidade. Assim, um médico pode preferir uma proteína terapêutica com uma composição específica e padrão de glicosilação, por exemplo, glicosilação e composição padrão idêntico, ou pelo menos semelhante, ao que é produzido em células humanas ou em células específicas da espécie do animal tema pretendido. Expressando as proteínas glicosiladas diferente da de uma célula hospedeira pode ser obtida por modificação genética da célula hospedeira para expressar as enzimas de glicosilação heteróloga. Usando técnicas conhecidas na arte um praticante pode gerar anticorpos ou de ligação de antí- genos partes dele exibindo glicosilação de proteínas humanas. Por exemplo, cepas de leveduras foram geneticamente modificados para expressar não-enzimas naturais glicosilação de tal forma que as proteínas glicosilada (glicoproteínas) produzidos nessas cepas de leveduras exibem glicosilação da proteína idêntica à de células animais, especialmente células humanas (U. S posições Patente de publicação de aplicativos . 20040018590 e 20020137134 e Internacional Appln. publicação n ° WO 05/100584 A2).

[00141] O termo "proteína de ligação multivalentes" é usado nesta especificação para denotar uma proteína de ligação que compreende dois ou mais sítios de ligação antigênica. A proteína de ligação multivalentes é preferencialmente projetado para ter três ou mais sítios de ligação antigênica, e geralmente não é um anticorpo que ocorrem naturalmente. O termo "proteína multiespecífico vinculativo" refere-se a uma proteína de ligação capaz de ligar duas ou mais metas relacionadas ou não relacionadas. Dupla variável de domínio (DVD) proteínas de ligação como aqui utilizadas, são proteínas de ligação que compreende dois ou mais sítios de ligação antigênica e são tetravalente ou proteínas de ligação multivalentes.

[00142]DVDs poderá ser monoespecífico, ou seja, capaz de antígeno uma ligação ou multiespecífico, ou seja, capazes de se ligar dois ou mais antígenos. Proteínas de ligação DVD composto por dois polipeptídeos da cadeia pesada DVD e dois DVD polipeptídeos de cadeia leve é encaminhado a um Ig DVD. Cada metade de um Ig DVD inclui um DVD cadeia pesada polipeptídeo, e um DVD polipeptídeo de cadeia leve, e dois sítios de ligação antigênica. Cada sítio de ligação compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, com um total de 6 CDRs envolvidos na ligação do antígeno por local de ligação do antígeno. DVD proteínas de ligação e os métodos de produção de proteínas de ligação DVD são divulgados nos EUA pedido de patente n ° 11/507, 050 e aqui incorporadas por referência.

[00143]Um aspecto da invenção pertence a uma proteína de ligação DVD compreendendo proteínas de ligação capaz de ligar a troponina I. De preferência, a proteína de ligação DVD é capaz de troponina I e vinculativo um segundo alvo. A presente invenção também engloba triple-variável de domínio (TVD) proteínas de li-gação em que o anticorpo é capaz de troponina I de ligação, bem como dois alvos adicionais (ie, um alvo segundo e terceiro).

[00144]Além da proteínas de ligação, a presente invenção é também dirigida a um anti-idiotípicos (anti-Id) de anticorpos específicos para tais proteínas de ligação da invenção. Um anticorpo anti-Id é um anticorpo que reconhece determinantes únicos geralmente associado com a região de ligação de antígenos de outro anticorpo. O anti-Id pode ser preparado por imunizar um animal com a ligação às proteínas (por exemplo, anticorpos de interesse) ou um CDR contendo sua região. O animal imunizado irá reconhecer e responder aos determinantes idiotípicos do anticorpo imunizar e produzir um anticorpo anti-Id. O anticorpo anti-Id também pode ser usado como um "imunógeno" para induzir uma resposta imune em ainda um outro animal, produzindo o chamado anticorpo anti-anti-Id.

[00145]Além disso, será apreciado por um técnico no assunto que uma proteína de interesse pode ser expressa usando uma biblioteca de células hospedeiras geneticamente modificados para expressar as enzimas de glicosilação diversos, tais que as células-Membro de acolhimento da biblioteca produzir a proteína de interesse com glicosilação variante padrões. Um médico pode, então, selecionar e isolar a proteína de interesse com padrões de glicosilação especial romance. De preferência, a proteína tendo um padrão de glicosilação especialmente selecionados romance exibe melhorada ou alterada propriedades biológicas. USO DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS ANTI-TROPONIN I

[00146]Dada a sua capacidade de se ligar a troponina I, o anti-troponina I anticorpos, ou partes deles, da invenção pode ser usada para detectar troponina I (por exemplo, em uma amostra biológica, tais como sangue, soro total, CSF, o tecido cerebral ou plasma ), usando um ensaio convencional imunoensaio competitivo ou não competitivo, como, por exemplo, um ensaio imunoenzimático (ELISA), um radioimu- noensaio (RIA), um ensaio imunométrico ou imuno-histoquímica dos tecidos. A invenção portanto fornece um método para a detecção de troponina I em uma amostra biológica compreendendo contatar uma amostra biológica com um anticorpo, ou parte de anticorpos, da invenção e detectando-se anticorpos (ou a porção de anticorpos) ligado à troponina I ou anticorpo não ligado (ou anticorpos parte), para, assim, detectar a troponina I na amostra biológica. O anticorpo é direta ou indiretamente rotulados com uma substância detectáveis para facilitar a detecção do anticorpo acoplado ou não acoplado. Substâncias adequadas etectáveis incluem várias enzimas, grupos pro- téticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem horseradish peroxidase, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos grupo adequado prótese incluem estreptavidina / biotina e avidina / biotina; exemplos de materiais adequados fluorescentes incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresce- ína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamine , cloreto de dansil ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol, e os exemplos de material radioativo adequado incluir 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 1251, 1311, 177Lu, 166Ho, ou 153Sm.

[00147]Como uma alternativa à rotulagem do anticorpo, troponina I podem ser analisadas em fluidos biológicos por um imunoensaio de competição utilizando padrões recombinante troponina I rotulados com uma substância detectável e um sem rótulo anti-anticorpo troponina I. Neste ensaio, a amostra biológica, a rotulados padrões recombinante troponina I e a troponina anticorpo anti-I são combinados, e da quantidade de rotulados troponina I recombinante padrão ligado ao anticorpo é determinada sem rótulo. A quantidade de troponina I na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão rotulados recombinante troponina I vinculado ao anticorpo anti-troponina I.

[00148]Em particular, em uma modalidade da presente invenção, um ou mais dos anticorpos da presente invenção são revestidos em uma fase sólida (ou estão em uma fase líquida). O teste ou biológicas amostra (por exemplo, soro, plasma, urina, etc) é, então, contatado com a fase sólida. Se antígenos troponina I estão presentes na amostra, tais antígenos se ligam aos anticorpos na fase sólida e são, então, detectada por um método de direta ou indireta. O método direto compreende simplesmente detectar a presença do próprio complexo e, portanto, a presença dos antígenos. Note- se que se pode usar o anticorpo inteiro ou um fragmento do mesmo em conexão com os anticorpos revestido na fase sólida. (Para fins da presente invenção, um "fragmento" ou "porção" de um anticorpo é definida como uma subunidade do anticorpo que reage da mesma maneira, funcionalmente, como o anticorpo total em relação a propriedades de ligação.) Como mencionado acima , no método indireto, um conjugado é adicionado o antígeno ligado. O conjugado compreende um segundo anticorpo que se liga ao antígeno ligado, conectado a um composto de geração de sinal ou o rótulo. Caso o segundo anticorpo para o antígeno ligado, o composto de geração de sinal gera um sinal mensurável. Este sinal, em seguida, indica a presença do antígeno (ie, troponina I) na amostra de teste. Exemplos de fases sólido utilizado em imunoen- saios de diagnóstico são materiais porosos e não-porosas, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas (ver Patente dos EUA n ° 5705330), contas, membranas, microtitulação poços e tubos de plástico. A escolha do material em fase sólida e método de rotulagem o antígeno ou anticorpo presente no conjugado, se desejar, são determinados com base em características de desempenho desejado ensaio formato. Como observado acima, o conjugado (ou reagente indicador) será composta por um anticorpo (ou talvez de anticorpos anti-, dependendo do ensaio), anexado a um composto de geração de sinal ou o rótulo. Este composto de geração de sinal ou "label" é por si só detectáveis ou pode ser reagido com um ou mais compostos adicionais para gerar um produto detectável. Exemplos de composto de geração de sinals incluem cromógenos, radioisótopos (eg, 1251, 1311, 32P, 3H, 14C e 35S), compostos de quimioluminescência (por exemplo, acridinium), partículas (visível ou fluorescente), ácidos nucléicos, agentes complexantes, ou catalisadores, tais como enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, peroxidase, beta-galactosidase e ribonuclease). No caso de utilização de enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase), além de uma geração cromo, fluro, ou resultados Lumo-gênica em substrato de um sinal detectável. Outros sistemas de detecção como o tempo-resolved fluorescence, interna-reflexão espectroscopia de fluorescência, a amplificação (por exemplo, a reação em cadeia da polimerase) e Raman também são úteis.

[00149]Como observado acima, exemplos de fluidos biológicos que possam ser testados pelo imunoensaios acima incluem urina plasma, sangue total, sangue total seco, soro, líquido cefalorraquidiano, saliva, lágrimas, lavagens nasais ou extracto aquoso de tecidos e células.

[00150]Além disso, também deve ser notado que o anticorpo de captura inicial (para detecção de antígenos troponina I) utilizados no imunoensaio pode ser covalen- temente ou não-covalente (por exemplo, hidrdeóbicas, iônicas, etc) ligado à fase sólida. Agentes de ligação para a ligação covalente são conhecidos na arte e pode ser parte da fase sólida ou derivatizados a ele antes do revestimento. Além disso, os ensaios e kits da presente invenção, opcionalmente, pode ser adaptado ou otimizados para sistemas de ponto de atendimento do ensaio, incluindo Abbott Ponto de Atendimento (i-STAT ™) sistema de imunoensaio eletroquímica. Imunosensores e métodos de fabricação e operá-los em dispositivos de uso único teste são descritas, por exemplo nos EUA Patent No. 5063081 e publicado Patente dos EUA N ° s Aplicação 20030170881, 20040018577, 20050054078, 20060160164 e (incorporado por referência neste documento para os seus ensinamentos em relação à mesma ). Claro, qualquer um dos formatos exemplar aqui e qualquer ensaio ou kit de acordo com a invenção pode ser adaptado ou optimizados para utilização em sistemas automatizados e semi-automático (incluindo aqueles em que há uma fase sólida compreendendo um micropartículas), conforme descrito, por exemplo, nos EUA Patentes N ° s 5089424 e 5006309, e como, por exemplo, comercialmente comercializado pela Abbott Laboratories (Abbott Park, IL), incluindo mas não limitado a ARCHITECT Abbott ®, AxSYM, IMX, PRISM, e plataformas Quantum II, bem como outras plataformas

[00151]Outros formatos de ensaio que podem ser utilizados para fins da presente invenção incluem, por exemplo, um teste rápido, um Western blot, bem como o uso de partículas paramagnéticas, por exemplo, um arquiteto ® ensaio (ver Frank Quinn, O Imunoensaio Handbook, Segunda edição, editado por David Wild, páginas 363-367, de 2001, aqui incorporado em sua totalidade por referência). Esses formatos são conhecidos como os de habilidade comum na arte.

[00152]É também de salientar que os elementos dos ensaios descritos acima são particularmente adequados para uso na forma de um kit. O kit também pode incluir um recipiente tal como um frasco, garrafa ou tiras. Esses kits também podem conter frascos ou recipientes de outros reagentes necessários para a realização do ensaio, como o processamento de lavar, e reagentes indicador. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00153]A invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo ou antígeno de ligação ao mesmo, da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos da invenção são para uso, mas não limitado a o diagnóstico, detecção, monitoramento ou uma doença, na prevenção, tratamento, gestão, ou melhorar de uma doença ou um ou mais sintomas da mesma, e / ou em pesquisa. Em uma modalidade específica, a composição compreende um ou mais anticorpos da invenção. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um ou mais anticorpos da invenção e um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos que não sejam anticorpos da invenção para tratar um distúrbio no qual a atividade troponina I é prejudicial. De preferência, os agentes profiláticos ou terapêuticos conhecidos por serem útil para ou que tenha sido ou sendo usados na prevenção, tratamento, gestão, ou melhoria de um distúrbio ou um ou mais sintomas destes. De acordo com estas incorporações, a composição pode ainda compreender de uma transportadora diluente ou excipiente.

[00154]Os anticorpos e porções de anticorpos da invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para a administração a um sujeito. Normalmente, a composição farmacêutica compreende uma porção de anticorpo ou anticorpos da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todas e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de absorção de adiar, e similares que são fisiologicamente compatíveis.

[00155]Exemplos de portadores farmaceuticamente aceitável incluir um ou mais de água, solução salina, tampão fosfato salino, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônica, por exemplo, açúcares, poliálcoois como o cloreto de manitol, sorbitol, ou de sódio na composição. Portadores farmaceuticamente aceitável pode ainda compreender pequenas quantidades de substâncias auxiliares, tais como molhar ou agentes emulsificantes, conservantes ou buffers, que melhoram a vida de prateleira ou a eficácia do anticorpo ou porção de anticorpos.

[00156]Vários sistemas de análise são conhecidos e podem ser usadas para administrar um ou mais anticorpos da invenção ou a combinação de um ou mais anticorpos da invenção e um agente profilático ou agente terapêutico útil para prevenir, gerir, tratar ou amenizar uma doença ou um ou mais sintomas da mesma, por exemplo, o encapsulamento em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recom- binantes capazes de expressar o anticorpo ou fragmento de anticorpo, endocitose mediada pelo receptor (ver, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), a construção de um ácido nucléico, como parte de um vetor retroviral ou outros, etc. Métodos de administração de um agente profilático ou terapêutico da invenção incluem, mas não estão limitados a administração parenteral (por exemplo, intra- dérmica, intramuscular, intraperitoneal, endovenosa e subcutânea), peridural, administração intratumoral e administração das mucosas (por exemplo, intranasal e oral rotas). Além disso, a administração pulmonar pode ser empregado, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulização, e formulação com um agente aerosolizantes. Ver, por exemplo, U. S. Pat. N ° s 6019968, 5985320, 5985309, 5934, 272, 5874064, 5855913, 5290540, 4880078 e; e Internacional Appln. Publicação n ° s WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 e WO 99/66903, cada um dos quais é aqui incorporadas por referência suas totalidades. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção, a terapia de combinação, ou uma composição da invenção é adminis-trado usando Alkermes AIR ® tecnologia de entrega de medicamentos pulmonares (Alkermes, Inc., Cambridge, MA). Em uma modalidade específica, agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção são administrados por via intramuscular, por via intravenosa, intratumoralmente, por via oral, intranasal, pulmonar ou subcutânea. Os agentes profilácticos ou terapêuticos podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, infusão ou injeção em bolus, por absorção através de forros epiteliais ou mucocutânea (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc) e pode ser administrado juntamente com outros biologicamente agentes ativos. Administração pode ser sistêmica ou local.

[00157]Em uma modalidade específica, pode ser desejável para administrar os agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção localmente para a área que precisa de tratamento, o que pode ser alcançado, por exemplo, e não por meio de infusão de limitação, local, por injeção, ou por meio de um implante, disse implante sendo de um material poroso ou não poroso, incluindo membranas e matrizes, tais como membranas sialásticas, polímeros, matrizes fibroso (por exemplo, um tecido ®), ou matrizes de colágeno.

[00158]Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos antagonistas da invenção é administrado localmente para a área afetada para um as-sunto para prevenir, tratar, gerir e / ou amenizar uma doença ou um sintoma do mesmo. Em outra modalidade, uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos da invenção é administrado localmente para a área afetada em combinação com uma quantidade eficaz de um ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos) que não seja um anticorpo do invenção de um assunto para prevenir, tratar, gerir e / ou amenizar uma doença ou um ou mais sintomas destes. Em outra modalidade, o agente profilático ou terapêutico pode ser entregue em uma libe-ração controlada ou sistema de liberação sustentada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser utilizado para conseguir liberação controlada ou sustentada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:20; Buchwald et al, 1980, Cirurgia 88:507; Saudek et al, 1989, N. Engl Med J. 321:.. 574). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser utilizados para alcançar liberação controlada ou sus-tentada das terapias da invenção (ver, por exemplo, aplicações médicas de liberação controlada, Langer e Wise (eds.), Pres CRC., Boca Raton, FL (1974) ; de drogas con-troladas biodisponibilidade, Design de Produto de Drogas e Desempenho, Smolen e Ball (eds.), Wiley, New York (1984);... ranger e Peppas, 1983, J. Macromol LSg Rev. Macromol Chem 23:61, ver também Levy et al, 1985, Ciência 228:190; Durante et al, 1989, Ann Neurol 25:351; Howard et al, 1989, J. Neurosurg 7 1:.. 105); U. S. Pat. N ° 5679377; U. S. Pat. N ° 5916597;

[00159]EUA Pat. N ° 5912015; U. S. Pat. N ° 5989463; U. S. Pat. N ° 5128326; Internacional Appln. Publicação n ° WO 99/15154 e Internacional Appln. Publicação n ° WO 99/20253. Exemplos de polímeros usados em formulações de liberação sustentada incluem, mas não estão limitados a, poli (2-hidroxi etil metacrilato), poli (metacri- lato de metila), poli (ácido acrílico), poli (etileno-co-acetato de vinila), poli (metacrílico ácido), poliglicolídeos (PLG), Polianidridos, poli (N-vinil pirrolidona), poli (álcool viní- lico), de poliacrilamida, poli (etileno glicol), polylactides (PLA), poli (ácido lático-co- glicolídeos) (PLGA), e poliortoesteres. Em uma modalidade preferida, o polímero usado em uma formulação de liberação sustentada é inerte, livre de impurezas lixivi- ável, estável em armazenamento, estéril e biodegradáveis. Em ainda outra encarnação, um sistema de liberação controlada ou sustentada pode ser colocado na proximidade do alvo profilático ou terapêutico, exigindo apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, em aplicações médicas de liberação controlada, supra, vol. 2, pp 115-138 (1984)).

[00160]Sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (1990, Science 249:1527-1533). Qualquer técnica conhecida a um dos habilidade na arte pode ser usada para produzir formulações de liberação sustentada compreendendo um ou mais agentes terapêuticos da invenção. Ver, por exemplo, U. S. Pat. N ° 4526938, International Appln. Publicação n ° WO 91/05548, International Appln. Publicação n ° WO 96/20698, Ning et al. 1996, "Radio imunoterapia intratumoral de um Xenoenxerto Humanos Colon Cancer Usando um Gel de Libertação Prolongada", Radioterapia e Oncologia 39:179-189, Song et al., 1995, "Pulmão mediada por anticorpos Segmentação de longa circulação Emulsões," Journal de Pharmaceutical PDA Ciência e Tecnologia 50:372-397, Cleek et al. 1997, "biodegradável Portadores poliméricos para um anticorpo bFGF para Aplicação Cardiovascular," Pro. Int'l. Sintomas. Controle. REI. Bioact. Mater. 24:853-854, e Lam et al., 1997, "Microencapsulação de anticorpo monoclonal humanizado recombinante para entrega local", Proc. Int'l. Sintomas. Controle de REI. Bioact. Mater. 24:759 - 760, cada um dos quais é aqui incorporadas por referência em suas totalidades. Deve ser entendido que os anticorpos da porção invenção ou de ligação do antígeno do mesmo pode ser usado sozinho ou em combinação com um ou mais agentes adicionais, por exemplo, um agente terapêutico (por exemplo, uma molécula pequena ou biológica), disse que agente adicional sendo selecionado pelo artesão hábil para os fins pretendidos. O agente adicional também pode ser um agente que transmite um atributo benéfico para a composição terapêutica por exemplo, um agente que afeta a viscosidade da composição. Além disso, deve ser entendido que as combinações que devem ser incluídos dentro desta invenção são as combinações úteis para o fim previsto

[00161]Os agentes estabelecidos abaixo são ilustrativos para fins e não pretende ser um fator limitante. As combinações, que fazem parte desta invenção, pode ser os anticorpos da presente invenção e pelo menos um agente adicional selecionado da lista abaixo. A combinação também pode incluir mais de um agente adicional, por exemplo, dois ou três agentes adicionais se a combinação é tal que a composição formada pode realizar sua função pretendida.

[00162]As composições farmacêuticas da invenção pode incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade prdeilaticamente eficaz" de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção. A "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessário, para alcançar o resultado terapêutico desejado. A quantidade terapeuticamente eficaz de a parte anticorpo ou anticorpos pode ser determinada por um perito na arte e podem variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, bem como a capacidade do anticorpo ou anticorpos parte para obter uma resposta desejada no indivíduo. A quantidade terapeuticamente eficaz é também aquele em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo, ou parte de anticorpos, são superados pelos efeitos terapêuticos benéficos. Uma "quantidade profilatica- mente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessário, para atingir o resultado desejado profilático. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou numa fase mais precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será inferior ao montante terapeuticamente eficazes.

[00163]Tendo agora descrito a presente invenção em detalhe, o mesmo será mais claramente entendido por referência os seguintes exemplos, que são incluídos para fins de ilustração somente e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção. EXEMPLOS EXEMPLO I GERAÇÃO E ISOLAMENTO DE 19C7 Identificação de genes de imunoglobulina

[00164]O RNA foi isolado de subclonado anti-TnL células 19C7-144 hibridoma. (Célula Hibridoma linha TnI 19C7 é descrita nos EUA Publicação pedido de patente n ° US2006/0018897.) TnI mRNA 19C7 foi utilizada em uma reação em cadeia da polimerase da transcriptase reversa, utilizando um camundongo Ig kit conjunto de primers comprado de Novagen (Novagen (que é um Afiliado da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), Cat n ° 69.831-3) com primers gene de imunoglobulina específicas contidas no kit. Os produtos resultantes da PCR foram sequênciados e, assim, a imunoglobulina variável genes de cadeia pesada e variável de luz foram identificados (ver Figura 2). Clonagem TnI 19C7 variável genes região em pYD41 vector

[00165]Um sistema de exibição de levedura foi usada para expressar não mutante ou tipo primária anti-TnL proteínas (aqui descritos infra) e uma biblioteca de anti- TnL proteínas na superfície de levedura como uma fusão para o AGA2 proteína de levedura. Um vetor mostrar fungo chamado PYD (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) foi usado, pois permite a clonagem do gene anti-TnL no C-terminal do gene AGA2, um fator de acasalamento levedura (Veja, Boder e Wittrup Nature Biotechnology, 15:553 - 557 (Junho de 1997)). Outras características importantes do vetor PYD incluir um promotor induzível galactose e uma tag epítopo, V5, no C-terminal da inseridos anti- TnL gene (ver Figura 12).

[00166]A plataforma de exibição levedura utiliza um formato de anticorpo conhecido como o único fragmento de cadeia variável. No formato de scFv, o domínio variável pesado é conectado ao domínio de luz variável através de um ligante flexível (domínio pesado variável - GPAKELTPLKEAKVS Ligante (SEQ ID NO: 58) - domínio de luz variável).

[00167]PCR extensão sobreposição única (SOE) foi usado para combinar a pesada variável (VH) e os genes de luz variável (VL) para a construção de 19C7 TnI scFv (Figura 2 e SEQ ID NOs: 54 e 55). A TnI 19C7 scFv DNA foi clonado na levedura mostrar vector pYD41 usando vetor restrição locais Sβl e Xhol. O pYD41-TnI 19C7scFv vector foi transformado em E. coli DH5α. DNA plasmidial foi então isolado da E. coli ea TnI 19C7 scFv inserir foi sequênciado para garantir a scFv foi clonado no quadro com a proteína AGA2.

[00168]O site da clonagem para a scFv na levedura mostrar vector pYD41 está em uma ORF que inclui os genes seguinte: AGA2 teter-ligante 41-X-prima epí- topo tag TnL 19C7 variável de cadeia pesada Ligante-40-19C7 TnI variável de cadeia leve-V5 epítopo tag - (SEQ ID NO: 29) tag. Além disso, a levedura é uma estirpe EBYlOO auxotroph triptdeano e o vetor pYD41 codifica triptdeano como marcador se- lecionável do sistema. Transformação em cepa saccharomyces cerevisiae EBYlOO

[00169]Mostrar levedura plasmídeo, pYD41 TnI-19C7 scFv, foi transformado em S. cerevisiae EBYlOO usando o Gietz e Schiestl Método (Veja Schiestl e Gietz, Genética atual, 16 (5-6) :339-46 (dezembro 1989)). Diluições da reação de transformação foram semeados em placas de glicose seletiva (2% de glicose (0,67% base nitrogenada de levedura, 0,105% HSM-trp-ura, 1,8% agar bacteriana, 18,2% sorbitol, 0,86% NaH2PO4 H2O, 1,02% Na2HPO4 7H2O)) e incubadas a 3O ° C durante 48-72 horas. Media glucose seletiva foi inoculado com colônias individuais e cresceu agitando a 3O ° C durante 16-20 horas. Expressão da proteína foi induzida em colônias, transferindo 0,5 OD600 de células / ml (le7cells/0.5OD/ml) para a mídia galactose seletivo. Colônias foram abalados em 2O ° C durante 16-24 horas e, em seguida, analisados pelo citômetro de fluxo FACS Aria para a ligação com scTnI-C-2 e anti-V5. (Note-se que scTnI-C-2 é um ligado, single-cahin TnI (28-110aa)-ligante-TnC (l- 160aa) de Diagnóstico Spectral, Toronto, Canadá. ScTnI-C-2 é abreviado como "scTnl-C "para fins da presente discussão.) Para ensaios de citometria de fluxo, as células de levedura expressar TnI 19C7 scFv incubadas com scTnI-C-2 ou anti-V5 seguido por um ou outro anti-mAb troponina e cabra anti-rato ficoeritrina (GAM: PE) (Figura 3B) ou GAM: PE, respectivamente (Figura 3A). Os histogramas de citometria de fluxo ilustrar a expressão full-length de TnI 19C7 scFv como detectado pelo anti- V5 e da capacidade de TnI 19C7 scFv para ligar scTnI-C-2. Desconto na tarifa de Análise de TnI 19C7 scFv e variantes TnI 19C7 em levedura

[00170]Desconto na tarifa de medições de TnI 19C7 e 19C7 scFv TnI variantes em leveduras foram medidos pela incubação de 0,05 levedura OD (1x106 células) com 50 nM scTnI-C-2 por 30-60 minutos em temperatura ambiente. As células foram então lavadas duas vezes com bloqueio tampão fosfato contendo salina tamponada pH 6.8 com 2% albumina sérica bovina e 0,2% STANDAPOL ES-I (PBS / BSA / STANDAPOL) e incubadas em temperatura ambiente por diferentes quantidades de tempo (0, 0,25 h, 0,5 hr, 1 hr, 2 hr, hr 4,25, 25,5 hr, 50 hr 75 hr e 144 h (ver Figura 4). Em cada momento indivíduo, células de levedura foram transferidos para o gelo para interromper a reação. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de bloqueio e suspenso no reagente coloração próxima, especificamente, anti-TnL mAb 8E10 a 100 nM. Células foram incubadas em gelo por 30 minutos, lavados duas vezes e, em seguida, incubadas com cabra anti-rato ficoeritrina (GAM: PE). Finalmente, as células foram lavadas e analisadas no citômetro de fluxo FACS Aria. A Figura 4 mostra os dados def-taxa plotados como média de unidades de fluorescência ("MFU") versus tempo (em segundos). A equação de decaimento de primeira ordem foi usado para ajustar os dados. A taxa de def-m2, na equação mostrada na Figura 4, foi montado para 0,007 sec-1. A TnI 19C7 scFv meia-vida (t /) foi de aproximadamente 8.5min (t/= In2/kdef).

[00171]Uma estratégia de triagem def-taxa foi utilizada para identificar def- rate melhorou TnI 19C7 variantes de bibliotecas mutagênico. Portanto, a TnI 19C7 scFv, não mutante ou tipo primária ("wt"), meia-vida foi utilizado para determinar o momento apropriado para classificar as bibliotecas mutagênico. Bibliotecas TnI 19C7 mutagênico foram classificados cerca de 9 min após a lavagem células livres de scTnI- C-2 com as condições do ensaio mesmo descrito para wt TnI 19C7 scFv. Análise de Dissociação de Equilíbrio para TnI 19C7 scFv e TnI

[00172]KD medições de TnI 19C7 scFv e variantes TnI 19C7 em leveduras foram medidos por 0,05 incubando levedura OD (1x106 células) com diferentes concentrações de scTnI-C-2 para 45-60 minutos em temperatura ambiente. Tampão de bloqueio contendo tampão fosfato pH 6.8 com solução salina a 2% albumina sérica bovina e 0,2% STANDAPOL ES-I (PBS / BSA / STANDAPOL) foi utilizada para lavagens e as diluições dos reagentes. As células foram então lavadas duas vezes e incubadas por 30 min com mAb anti-TnL, 8E10. Células foram lavadas novamente e incubadas com cabra anti-rato ficoeritrina por 30min. Finalmente, as células foram lavadas e analisadas no citômetro de fluxo FACS Aria (ver Figura 5). A Figura 5 mostra os dados plotados como KD normalizado significa unidades de fluorescência ("MFU") versus concentração SCTN-IC-2 (em molaridade). O anticorpo-normalizada, de ligação de antígenos intensidade média de fluorescência foi plotada contra a concentração de antígeno e uma mínimos quadrados não-linear se encaixam (y = ml + m2 * m0 / (m3 + mθ)) foi usado para se determinar o KD. Geração de Bibliotecas de Ponta TnI 19C7 CDR

[00173]Mutagênese foi direcionado para os três pesados e três de cadeia leve regiões complementares determinantes (CDR) de anticorpos TnI 19C7 uma vez que estes loops são os locais de contato importante antígeno. CDR laço comprimentos e numeração foram definidos usando Kabat e Molecular de Oxford AbM nomenclatura de modelagem. Bibliotecas individuais eram compostas de tal forma que as mutações aleatórias são incorporados em cada posição de aminoácidos do CDR de uma única biblioteca. Um total de seis bibliotecas foram gerados correspondem a uma biblioteca para cada CDR. Bibliotecas foram geradas através da combinação Sfil / Xhol digerida pYD41 vector e produtos de PCR com fermento EBYlOO quimicamente competentes (ver Figura 7). Dois produtos de PCR foram gerados para cada biblioteca CDR para permitir PCR classificação e recombinação homóloga em levedura. Um produto de PCR utilizado uma cartilha que foi projetado, tal que para todo o comprimento do CDR, um tipo primária de 70% para 30% taxa de nucleotídeos outro foi usado na síntese primer. Este produto foi chamado de spiked produto (sp) (ver Figura 7). O produto da PCR segundo foi projetado para incluir o resto do gene scFv. Os dois produtos de PCR foram combinadas e usadas para gerar um único fragmento de cadeia variável ou um produto scFv. Vector digerido (1 ug) e os produtos scFv PCR (5 ug) foram combinados com EBYlOO levedura (5.2e8-6.4e8 células) e transformados utilizando eletroporação. O scFv produto da PCR eo vector pYD41 digerida ciclizam durante a transformação devido à recombinação homóloga facilitada pela sobreposição de nu- cleotídeos e do mecanismo de levedura reparação gap endógena. Bibliotecas foram cultivadas a 30 ° C durante 48-72 horas em meios de glicose seletiva e passou novamente em meio de glucose seletiva antes da indução da expressão da proteína para a organização da biblioteca. Bibliotecas CDRTnl 19C7 Mutagênico

[00174]Bibliotecas TnI 19C7 foram classificadas com base em uma estratégia de triagem def-rate. Bibliotecas TnI 19C7 CDR mutagênico foram induzidas em media expressão galactose em 2O ° C por 18-24 horas. TnI scFv 19C7 e 19C7 TnI bibliotecas em leveduras foram incubadas com 25-50 nM scTnI-C-2 para 10-15 minutos em tem-peratura ambiente.

[00175]As células foram então lavadas duas vezes com bloqueio tampão fosfato contendo salina tamponada pH 6.8 com 2% albumina sérica bovina e 0,2% STANDAPOL ES-I (PBS / BSA / STANDAPOL) e incubadas em temperatura ambiente por 8 min. Células de levedura foram transferidos para o gelo para interromper a reação. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de bloqueio e suspenso no reagente coloração próxima, especificamente, anti-TnL mAb 8E10 a 100 nM e anti- V5 em 1,5-2 ug / ml. Células foram incubadas em gelo por 30 minutos, lavados duas vezes e depois incubadas com 1: 200 de cabra anti-camundongo IgG2a ficoeritrina (GAMIgG2a: PE) e com 1: 200 de diluição de cabra anti-camundongo lgGl Alexa Fluor488 (GAMIgGl: 488). Finalmente, as células foram lavadas, analisados e classificados no citômetro de fluxo FACS Aria.

[00176]Ordenar portões foram definidas com base em não mutada TnI 19C7 vinculativa a 8-9min com um portão set para classificar clones full-length TnI vinculativo. Cada espécie coletou os 0,1-0,5% mais ricos da população TnI vinculativo. Ordenado células foram cultivadas em meios de glicose seletiva e cresceu 18-24 horas a 30 ° C. Ordenar uma células foram induzidas e classificação foi repetido por duas ou três rodadas adicionais.

[00177]Após o último tipo, as células classificadas foram semeadas em placas de glicose seletiva e posicionado a 30 ° C por 72 horas. Colônias de leveduras individuais dessas bibliotecas foram inoculadas em meios de glicose seletiva, criopreser- vados e induzida em media galactose seletivo. Colônias individuais foram caracteriza-dos e classificados em um ensaio def-rate. TnI 19C7 AM4 foi isolado e identificado a partir desta saída de classificação. Geração e Analise de Clones Mutantes Combinanatório TnI 19C7

[00178]Clones que foram caracterizados por desconto na tarifa a partir de cada CDR mestre biblioteca ou o total mestre CDR saída da biblioteca foram utilizados para construir genes scFv contendo pares diferentes das mutações individuais. Esta abordagem permitiu determinar se as propriedades de ligação foram reforçadas em cima combinando mutações individuais. Clones combinatórios clones contendo várias mutações em cada região CDR foram construídas por PCR e combinado com técnicas de rotina conhecida por aqueles hábeis na arte. Bibliotecas combinatórias mutante foram transformados em levedura, como descrito acima e classificados duas vezes usando def-taxa e pressões de seleção KD. Para a seleção KD, 100 pM (round 1) e 5OpM (round 2) scTnl-C foram usados no experimento KD como descrito acima (Figura 5). Para fora da taxa de classificação, a triagem foi realizada como descrito acima, com tempos de incubação após purificação de antígenos de 3 hr 40 min (round 1) e 4 h 25 min (round 2). Ordenar portões foram definidas com base em não mutada TnI 19C7 vinculativo para cada condição, com um portão set para classificar clones full-length TnI vinculativo. Cada espécie coletada a 0,1% mais ricos da população TnI vinculativo. Ordenado células foram cultivadas em meios de glicose seletiva por 1824 horas a 30 ° C. Ordenar uma células foram induzidas e classificação foi repetido para uma rodada adicional.

[00179]Após o último tipo, as células classificadas foram semeadas em placas de glicose seletiva e posicionado at30 ° C por 72 horas. Colônias de leveduras individuais dessas bibliotecas foram inoculadas em meios de glicose seletiva, criopreser- vados e induzida em meio de galactose seletivo. Colônias individuais foram caracteri-zados e classificados em um ensaio def-rate. TnI 19C7 AMI, AM2, AM3 e foram isolados e identificados a partir desta biblioteca combinatória. Análise de TnI 19C7 Variantes

[00180]Selecionada de clones variantes foram inicialmente caracterizados por melhorias no KD como descrito acima para tipo primária TnI 19C7 scFv. A Figura 9 mostra os valores scFv KD determinada por quatro clones selecionados. A TnI 19C7 AMI clone exibiu a ligação que mais cresceu em 0,36 nM em comparação com o anticorpo. Selecionados TnI variantes 19C7 scFv foram sequênciados para determinar as mutações de aminoácidos sendo expresso. Inicialmente, o DNA do plasmídeo foi isolado de culturas de leveduras suspensão utilizando uma levedura mini-prep kit (Cat. D2001, Zymo Research Orange, CA). A fim de obter o sequênciamento de DNA plas- mídeo grau, plasmídeo da levedura kit mini-prep foi transformado em DH5α E.coli, e em seguida purificada de cultura de E. coli usando mini-prep kits (Qiagen). DNA plas- mídeo puro foi então sequênciado utilizando os primers pYD41 vetor específico (pYD41 for-TAGCATGACTGGTGGACAGC (SEQ ID NO: 59) e pYD41rev- CGTAGAATCGAGACCGAG (SEQ ID NO: 60)). Dados sequências de aminoácidos para as variantes TnI 19C7 scFv é mostrado na Figura 13. Números de posição se refere à posição de aminoácidos no CDR respectivas (como numeradas usando o método Kabat).

[00181]Globalmente, a fonte de diversidade de sequência do clone do tipo primária foi encontrado na L2 CDR CDR e Hl, enquanto CDR Ll e H3 dobrado em um motivo de consenso. A L3 CDR e CDR H2 permaneceu não mutada. Os dados de sequência para CDR Hl indicaram uma preferência por uma mudança conservadora na posição 34 da isoleucina a leucina como identificado na 3 clones isolados da biblioteca combinatória. A sequência consenso para CDR H3 indicaram uma forte preferência em posição para 100 em vez de triptdeano tirosina, na posição 101 para treo- nina, em vez de alanina, e na posição 102 para aspartato, em vez de tirosina como identificado na 3 clones isolados da biblioteca combinatória. Desde a triagem CDR mestre em que clone 19C7 AM4 foi identificado, o H3 CDR foi o CDR somente com mutações que eram diferentes do que o consenso combinatorial conjunto de sequências. Especificamente as mutações foram Ala96Phe, Tyr99Ser, TrplOOaAla e TyrlO2Asp. Os dados consenso sequência para CDR Ll indicaram uma preferência por treonina na posição 25, lisina na posição 27, asparagina na posição 28, valina na posição 29, e histidina na posição 34. Para a L2 CDR, cada clone tem mutações únicas ou não com apenas TnI 19C7 AMI e AM2 compartilhando apenas a mutação Ser54Arg. Clonagem e Expressão Solúvel de TnI 19C7 Anticorpos Quiméricos em um Sistema de Expressão Estável Transiente

[00182]Selecionados TnI 19C7 variantes foram convertidos para quimérico do camundongo camundongo IgG2a/camundongo kappa e / ou camundongo-anticorpos humanos IGGI / kappa humana através da clonagem do 19C7 TnI domínios variáveis no sistema de expressão transiente vetor chamado pBOS (Abbott Centro Bioresearch, Worcester, MA ). Mais especificamente, a PCR foi usado para amplificar a variável de genes de cadeia pesada e variável de luz com sítios de restrição para clonagem em vetores separados pBOS (Mizushima e Nagata, pesquisa dos ácidos nucleicos, 18:5322 (1990)). A variável de genes luz pesados e variável foram ligados no vetor digerido e desfosforilada e transformado em Escherichia DH5α E.. DNA plasmidial foi purificado de E. coli e em células transfectadas 293H usando PEI (lmg / ml). Anticorpo transitória foi expressa para os seguintes variantes TnI 19C7: TnI 19C7 wt, AMI, AM2, AM3 e AM4. Por exemplo, usando o pBOS-TnL vetores 19C7 AMI pesados e leves, uma linhagem de células CHO plasmídeo estável foi criada em um procedimento de clonagem em duas etapas. Em primeiro lugar, a cadeia variável pesados e genes de luz variável foram ligados na moldura para os genes humanos constante PBV e plas- mídeos PJV (Abbott Centro Bioresearch, Worcester, MA), respectivamente, utilizando as enzimas de restrição SRFL / NOTL. Reações ligadura foram Transformados los E. coli e DNA plasmidial DH5α FOI posteriormente isolado de colônias pessoas físicas. O V-pB TnI rato 19C7 Variável heavy-Humana e IgGl p JV-TnI rato 19C7 Variável de luz Humana kappa foram sequênciados em locais de clonagem.

[00183]A segunda etapa de clonagem envolveu a combinação dos genes de cadeia pesada IGGI e os genes de cadeia leve kappa em um vetor linha estável única célula. O V-pB TnI 19C7 AMI humana e IgGl p JV-19C7 TnI AMI vetores humana kappa foram digeridos com Ascl / Pacl. O VL-humana kappa constante eo VH-humana IgGl fragmentos de DNA foram constantes gel purificado e ligado para produzir o vetor linha estável de células chamado de J-pB TnI 19C7 AMI. O J-pB TnI 19C7 AMI humana pesado / leve quimérico plasmídeo foi transformado em células CHO usando um lipdeectamine (Invitrogen) protocolo. Linhagens celulares estáveis foram subclo- nado da transformação inicial. A linhagem de células CHO estável foi desenvolvido para a AMI clone (também referida como "TnI 19C7AM1 hGlkCHO204") e foi depositado na American Type Culture Collection, 10.801 University Boulevard Manassas, Virgínia 20110-2209 em 11 de fevereiro de 2009 e recebidas designação de depósito PTA-9816. EXEMPLO II AFINIDADE RELATIVA DO CLONE TROPONINA I 19C7 TIPO PRIMARIO E AFINIDADE ANTICORPOS MATURADOS

[00184]Clone de Troponina I 19C7 tipo primária (camundongo plena construção) e afinidade amadureceu (região constante humano) foram avaliados para anticorpos de afinidade relativa em um ensaio imunoenzimático de microtitulação. Placas de 96 poços ensaio (NUNC Corporation, Rochester, NY) foram revestidas por adição de 100 uL / poço de uma solução de 2 ug / ml de uma ovelha anti-camundongo IgG FcY anticorpo específico (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) ou de burro anti -IgG humana FCY fragmento de anticorpo específico (ImmunoResearch Jackson). Ambos os anticorpos foram diluídos em tampão fosfato (PBS, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). As placas foram incubadas durante a noite de ensaio a 15-30 ° C. No dia seguinte, o reagente de revestimento foi removido e 200 uL / poço de solução de BSA (albumina sérica bovina [Abbott Laboratories] diluído em PBS) foi adicionado. A solução BSA foi incubado nos poços de ensaio durante 30 minutos a 15-30 ° C, retirados e lavados os poços de ensaio, adicionando 300 uL / poço de água destilada (dH2O, Abbott Laboratories) e aspirando por três ciclos de lavagem. Em seguida, 100 amostras uL / poço foram adicionados. As amostras de teste foram preparadas através da criação de uma solução inicial de 2 ug / mL (em solução BSA) de cada anticorpo, seguido de log 3 diluições, em solução BSA. As amostras de teste foram incubadas por 2-3 horas a 15-30 ° C, após o que foram aspirados de distância e os poços lavados com dH2O como descrito acima. Em seguida, 100 ul / poço de soluções de antígeno foram adicionados em cada ensaio bem. As soluções de teste do antígeno foram criados pela primeira preparação de uma solução de 1,000 ng / mL de scTnI-C- 2 (aa 28-100 de troponina I cardíaca ligada a todo o comprimento troponina C, Spectral Diagnostics) em solução de BSA, seguido por log 2 diluições. As soluções de an- tígeno foram incubadas nos poços de ensaio por 10 minutos a 15-30 ° C e depois removidas por esbdeetear as soluções. As placas do ensaio foram então lavados com dH2O conforme descrito anteriormente. Em seguida, 100 ul / poço de biotina cabra marcado anti-anticorpo troponina I (HyTest, diluído para 500 ng / mL em solução BSA) foi adicionado a cada ensaio de poço e incubados durante 30 minutos a 15-30 ° C. O anticorpo foi então aspirado de distância e os poços lavados com dH2O como descrito. Em seguida, 100 ul / poço de uma solução de 200 ng / mL (em solução BSA) da peroxidase de rábano rotulados estreptavidina (SA-HRPO, ImmunoResearch Jackson) foi adicionado e incubado por 30 minutos a 15-30 ° C. O SA-HRPO reagente foi então aspirado de distância e as placas lavadas como descrito. Solução de substrato Em seguida, foi preparada dissolvendo 1 comprimido OPD por 10 mL de diluente OPD (o-fenilenodiamina, tanto Laboratórios Abbott). 100 uL / poço da solução de substrato preparado foi adicionado às placas de ensaio, incubados por cerca de 4-5 minutos e depois apaga a reação adicionando 100 uL / poço em ácido sulfúrico (Abbott Laboratories). O sinal resultante foi lida a 492 nm usando um fluorímetro óptica. Os resultados do experimento foram plotados usando sdetware kaleidagraph. O valor Agso (a concentração de antígeno a 50% da ligação máxima) foi determinada e usada para comparar os anticorpos para a afinidade em relação ao antígeno testado. EXEMPLO III USO DE ANTICORPO MONOCLONAL 19C7 EM UM IMUNOENSAIO

[00185]Troponina I clone 19C7 tipo primária (camundongo plena construção) e afinidade amadureceu (região constante humano) foram avaliados para anticorpos afinidade relativa no analisador de imunoensaio ARCHITECT ® (Abbott Laboratories). O ensaio foi totalmente automatizados, e o analisador executa todos os passos. Mi- cropartículas revestidas de um rato de anticorpos anti-troponina I (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) foram misturados com diferentes níveis de scTnl-C-2 (aa 28-100 de troponina I cardíaca ligada a todo o comprimento troponina C (Diagnóstico Spectral) e incubados por 18 minutos a 15-30 ° C.

[00186]Durante este tempo, o anticorpo de micropartículas revestidas obrigado a scTnI-C-2. As micropartículas foram, então, atraído por um imã, a solução remanescente foi aspirada ensaio, e as partículas lavadas com diluente (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Em seguida, o tipo primária ou afinidade amadureceu 19C7 anticorpos, os quais foram marcados com acridinium (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) foram adicionados ao micropartículas e incubado por 4 minutos a 15-30 ° C. Em seguida, o micropartículas foram atraídos por um imã, a solução remanescente foi aspirada ensaio, e as partículas foram lavadas com diluente de ensaio. Sinal (unidade relativa de luz) foi gerado pela adição de soluções pré-gatilho e disparar (ambos Abbott Laboratories). Relações sinal foram calculados e utilizados para comparar an-ticorpos. Como pode ser estabelecida com base nos resultados mostrados na Figura 11, AMI anticorpos deu um sinal melhor do que do tipo primária de anticorpos.

Claims (10)

1. Anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à Troponina I e compreende uma região VH e uma região VL, em que a região VH compreende: a) uma CDR H1 possuindo uma sequência de aminoácidos GYTFTDYNLH (SEQ ID NO: 52); b) uma CDR H2 possuindo uma sequência de aminoácidos YIYPYNGITGYNQKFKS (SEQ ID NO: 53); e c) uma CDR H3 possuindo uma sequência de aminoácidos DAYDYDYLTD (SEQ ID NO: 54); e em que a região VL compreende: d) uma CRD L1 possuindo uma sequência de aminoácidos RTSKNVGTNIH (SEQ ID NO: 55); e) uma CDR L2 possuindo uma sequência de aminoácidos YASERLP (SEQ ID NO: 56); e f) uma CDR L3 possuindo uma sequência de aminoácidos QQSNNWPYT (SEQ ID NO: 57).

2. Anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a região VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e a região VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28.

3. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

4. Método de detecção de antígeno de Troponina I em uma amostra de teste, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a) contatar a referida amostra de teste com um anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, por um tempo e sob condições suficientes para a formação de complexos anti- corpo/antígeno; e b) detectar a presença dos referidos complexos, que indica a presença de antígeno de Troponina I na referida amostra de teste.

5. Método de detecção de antígeno de Troponina I em uma amostra de teste, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a) contatar a referida amostra de teste com um primeiro anticorpo recombi- nante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, por um tempo e sob condições suficientes para a formação dos complexos primeiro anticorpo/antígeno; b) adicionar um conjugado aos referidos complexos primeiro anticorpo/antí- geno, em que o referido conjugado compreende um segundo anticorpo ligado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável, por um tempo e sob condições suficientes para formar complexos primeiro anticorpo/antígeno/se- gundo anticorpo; e c) detectar a presença de uma geração de sinal pelo referido composto de geração de sinal, em que a presença do referido sinal indica a presença de antígeno de Troponina I na referida amostra de teste.

6. Método de detecção de antígeno de Troponina I em uma amostra de teste, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a) contatar o antígeno de Troponina I com o anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, por um tempo e sob condições suficientes para formar complexos antígeno de Tropo- nina I/anticorpo, em que o referido é marcado com um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável; b) adicionar a referida amostra de teste aos referidos complexos antígeno de Troponina I/anticorpo por um tempo e sob condições suficientes para formar complexos antígeno de Troponina I/anticorpo/amostras de teste de antígeno de Troponina I; e c) detectar a presença de um sinal gerado pelo referido composto de geração de sinal, em que a presença do referido sinal indica a presença de antígeno de Tro- ponina I na referida amostra de teste.

7. Método de detecção de antígeno de Troponina I em uma amostra de teste, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a) contatar a referida amostra de teste com 1) um antígeno de Troponina I de referência, em que o referido antígeno está ligado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável e 2) o anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, por um tempo e sob condições suficientes para formar complexos de antígeno de Troponina I de referência/anticorpo; e b) detectar um sinal gerado pelo referido composto de geração de sinal, em que a quantidade de antígeno de Troponina I detectada na referida amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de antígeno de Troponina I de referência ligada ao referido anticorpo.

8. Método in vitro de diagnóstico de síndrome coronariana aguda ou infarto do miocárdio em um paciente com suspeita de ter uma dessas condições, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a) isolar uma amostra biológica do referido paciente; b) contatar a referida amostra biológica com o anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, por um tempo e sob condições suficientes para a formação de complexos antígeno de Troponina I/ anticorpo; e c) detectar a presença dos referidos complexos antígeno de Troponina I/ anticorpo; d) dissociar o referido antígeno de Troponina I presente nos referidos complexos dos referidos anticorpos presentes nos referidos complexos; e e) mensurar a quantidade de antígeno de Troponina I dissociado, em que uma quantidade de antígeno de Troponina I maior que aproximadamente 1 a 5 vezes o valor de Troponina I do 99° percentil de uma população normal indica um diagnóstico de síndrome coronariana aguda ou infarto do miocárdio no referido paciente.

9. Método in vitro de diagnóstico de síndrome coronariana aguda ou infarto do miocárdio em um paciente com suspeita de ter uma destas condições, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a) isolar uma amostra biológica do referido paciente; b) contatar a referida amostra biológica com um primeiro anticorpo recombi- nante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, por um tempo e sob condições suficientes para a formação dos complexos antígenos de Troponina I/ anticorpos; c) adicionar um conjugado aos complexos antígeno de Troponina I/ anticorpo resultantes por um tempo e sob condições suficientes para permitir que o referido conjugado se ligue ao antígeno de Troponina I ligado, em que o referido conjugado compreende um segundo anticorpo ligado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável; d) detectar a presença de antígeno de Troponina I que pode estar presente na referida amostra biológica pela detecção de um sinal gerado pelo referido composto de geração de sinal; e e) mensurar a quantidade de antígeno de Troponina I presente na referida amostra de teste pela mensuração da intensidade do referido sinal, em que uma quantidade do antígeno de Troponina I maior que aproximadamente 1 a 5 vezes o valor do 99° percentil de uma população normal indica um diagnóstico de síndrome coronariana aguda ou infarto do miocárdio no referido paciente.

10. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um recipiente compreendendo o anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, e instruções de uso do mesmo.

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