BRPI0924061B1 - Composição farmacêutica compreendendo uma proteína endorepellin - Google Patents
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Abstract
INTENSIFICADORES DE ANGIOGENESE GERADA POR ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL E USOS DOS MESMOS. A presente invenpao refere-se a metodos de estimular ou intensificar angiogenese em um paciente compreendendo, administrar a referido paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma protefna endorepellin, em que referida protefna endorepellin tem uma sequencia de aminoacido de domfnio V de perlecan ou fragmentos ou derivados, analogos dos mesmos; e estimular ou intensificar geragao de vasos sanguineos. A presente invenção 6 direcionada a composigdes para intensificar angiogenese.
Description
[0001] Este pedido internacional reivindica o beneficio da prioridade sob 35 U.S.C. §119(e) do N° de Serie Provisorio dos Estados Unidos N°. 60/204.064, depositado em 31 de dezembro de 2008, agora abandonado, a totalidade do qual e, desse modo, incorpora por referenda.
[0002] A presente invenção refere-se geralmente ao campo de acidente vascular cerebral e angiogenese. Mais especificamente, a presente invenção se relaciona a intensificadores de angiogenese gerada por acidente vascular cerebral e usos dos mesmos.
[0003] A recuperaQao do cerebro de acidente vascular cerebral e um sistema complex© envolvendo a restauraQao de suprimento de sangue (angiogenese) e neurbnios (neurogenese) a area afetada. Para angiogenese, proliferaQao de celula endotelial pode ocorrer antes de 12 a 24 horas. Estas celulas recentemente geradas em seguida migram em direQao as regioes de cerebro isquemicas em resposta a um numero de mitogeneos de celula endotelial tais como fator de crescimento de celula endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) e formam novos vasos sanguineos em cortex de peri-infarto apos 3-7 dias. A angiogenese em seguida continua por pelo menos 21 dias. Importantemente, niaspan, um farmaco que aumenta angiogenese pos-acidente vascular cerebral em roedores, aperfeiQoa recuperaQao funcional do acidente vascular cerebral, sugerindo que a intensificaQao da angiogenese de cerebro pos-acidente vascular cerebral pode resultar em consequents aperfeipoadas de acidente vascular cerebral. Alem disso, a angiogenese do cerebro e diferente da angiogenese de nao cerebro devido as propriedades unicas da vasculatura do cerebro incluindo formapao da barreira hematoencefalica, embutimento em um meio neuronal-glial, expressao de receptor de matriz diferente, e refratariedade relativa a angiogenese apos desenvolvimento.
[0004] Ohab et al. (1) demonstraram em roedores que apos acidente vascular cerebral, neuronios imaturos de migrapao (neuroblastos) se associam com os vasos sanguineos de remodelagem em um "nicho neurovascular" que causalmente liga angiogenese reparativa e neurogenese. A vasculatura recentemente produzida promove neurogenese por produpao de varios fatores de crescimento e parece servir como um suporte para neuronios recentemente nascidos que permitem que eles migrem em direpao ao tecido infartado. Em adipao aos neuronios de maturapao e celulas endoteliais, o nicho neurovascular contem matriz extracelular (ECM) que e secretada e ativamente remodelada durante angiogenese para permitir migrapao celular e morfogenese de vaso sanguineo. Um tai componente de matriz extracelular, perlecan, e essencial ao nicho neurovascular. Sua ausencia em camundongos resulta na neurogenese severamente danificada devido a perda de captura de fator neurogenico que perlecan proporciona para suportar neurogenese.
[0005] A remodelagem da matriz durante e apos acidente vascular cerebral e uma parte importante de reparo do cerebro apos dano e reparo que adicionalmente aponta para a importancia de perlecan. No acidente vascular cerebral, tingimento e infiltrapao de celulas inflamatorias liberam matriz metaloproteinases (MMPs) que causam disturbio da barreira de sangue cerebro e processa proteoliticamente a matriz extracelular. Embora o processamento inicial e degradapao de matriz extracelular sejam grandemente atraves de uma consequencia negativa de acidente vascular cerebral, uma consequencia de proteolise da matriz e a geragao de fragmentos de matriz bioativa. De fato, muitos componentes de matriz sao conhecidos por abrigar fragmentos de matriz bioativa em suas reg ides C-terminais que podem inibir angiogenese fora do sistema nervoso central (2-3). Perlecan tem a distingao de ser o componente de matriz mais sensivel e rapidamente processado apos acidente vascular cerebral. A proteolise do perlecan ocorre dentro de 2 horas da oclusao da arteria cerebral media em primatas nao humanos, e persiste por pelo menos 7 dias.
[0006] Perlecan e composto de cinco dominios, cada um com homologia de sequencia a outras protefnas. O fragmento de perlecan C-terminal conhecido como dominio V (DV ou endorepellin) consiste em tres dominios de laminina globular (LG), cada um separado por dois dominios similares a fator de crescimento epidermal (EG). O dominio V e seu fragmento LG3 sao normalmente encontrados na urinaria humana, sangue e proteomas de fluido cerebro-espinhal. O dominio V, por ligagao a subunidade a2 do a201 integrina, inibe varias fungoes angiogenicas de celulas nao endoteliais do cerebro incluindo migragao e morfogenese capilar. A interagao do dominio V com a201 parece ser diferente daquele de colageno pro-angiogenico com a201 resultando em resultados opostos. O dominio V foi caracterizado como antiangiogenico em varios tipos de celula endotelial de origem de nao cerebro (4-5).
[0007] Apesar disto, a tecnica anterior e deficiente em intensificadores de angiogenese. A presente invenção preenche esta grande necessidade na tecnica.
[0008] A presente invenção mostra que o Dominio V intensifica a angiogenese do cerebro e a interagao entre celulas endoteliais e neuronios no nicho neurovascular. O Dominio V interage com, afeta a distribuiQao celular de, e exerce seu efeito pro-angiogenico via o a501 integrina. Estas observances sao consistentes com a falta de expressao de celula endotelial do cerebro do dominio V antiangiogenico a2p1 integrina, e com o conceito que a angiogenese do cerebro pode ser diferentemente regulada do que a angiogenese fora do cerebro. Portanto, a presente invenção mostra que o Dominio V, gerado apos acidente vascular cerebral por proteolise aumentada e sustentada de perlecan, estimula angiogenese de pos-acidente vascular cerebral, promove a formaQao do nicho neurovascular necessario para neurogenese de pos-acidente vascular cerebral e migraQao de neuroblasto direcionada, e, desse modo, e um componente do mecanismo de autorreparo do cerebro que pode ser terapeuticamente explorado para aperfeiQoar a recuperaQao do acidente vascular cerebral.
[0009] Em uma modalidade da presente invenção, e provido um metodo de estimular ou intensificar angiogenese em um paciente compreendendo administrar a referido paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteina endorepellin, no qual referida proteina endorepellin tem uma sequencia de aminoacido de dominio V de perlecan, ou fragmentos ou derivados, analogos destes; e estimular ou intensificar gerapao de vasos sanguineos.
[00010] Em outra modalidade relacionada da presente invenção, e provido um metodo de estimular ou intensificar angiogenese em um paciente compreendendo administrar a referido paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteina endostatina, ou fragmentos ou derivados, analogos desta; e estimular ou intensificar geraQao de vasos sanguineos.
[00011] Em outra modalidade da presente invenção, e provida uma Composicao farmaceutica compreendendo um dominio V de perlecan ou fragmentos ou derivados, analogos deste, uma estatina e um veiculo farmaceuticamente aceitavel ou excipiente.
[00012] Em outra modalidade da presente invenção, e provido um metodo de composigao farmaceutica, compreendendo endostatina ou fragmentos ou derivados, analogos desta, uma estatina e um veiculo farmaceuticamente aceitavel ou excipiente.
[00013] Os desenhos em anexo foram aqui incluidos de modo que as caracteristicas acima citadas, vantagens e objetos da invenção tornar-se-ao claras e possam ser compreendidas em detalhe. Estes desenhos formam uma parte do relatorio descritivo. E para ser notado, contudo, que os desenhos em anexo ilustram modalidades preferidas da invenção e nao devem ser considerados para limitar o escopo da invenção.
[00014] Figuras 1A-1B mostram que acidente vascular cerebral causa um aumento nos niveis de Dominio V do cerebro. Um rato Harlan Sprague Dawley foi submetido a injegao estereotaxica de endotelinaa-1 para ocluir a arteria cerebral media (MCAo). O rato foi anestesiado com cetamina e xilazina e, em seguida, o cranio foi exposto e um furo pequeno perfurado a esquerda nas coordenadas estereotaxicas +0,9 mm anterior, +3,4 mm lateral relative ao bregma e a uma profundidade de 8,5 mm a partir da superficie dural, 3 ml de endotelina-1 (1 mg/ml, American Peptide Company, CA) foi injetado. Figura 1A: Western blot representativa para Dominio V e GAPDH (controle de carregamento) a partir do hemisferio cerebral de acidente vascular cerebral (2) e sem acidente vascular cerebral (1) do mesmo rato unico, 7 dias apos acidente vascular cerebral. O hemisferio cerebral de acidente vascular cerebral continha mais (p<0,0001) Dominio V (faixa de 85 kDa) e seu componente LG3 (faixa de 26 kDa) (p<0,001) do que o hemisferio sem acidente vascular cerebral conforme normalizado para GAPDH e analisado via densitometria otica na Figura 1B (DV mostrado).
[00015] Figuras 2A-2B mostram que Dominio V intensifies formaQao de tubo capilar de celula endotelial do cerebro. Figura 2A: Celulas endoteliais do cerebro (8) do rato rotineiramente crescem e passam em uma incubadora de celula (NuAire, Plymouth, MN) em Meio Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal, heparina 10 mg/ml, e FGF acidico 50 ng/ml, foram adicionados a POQOS revestidos Matrigel ± pre-incubagao com Dominio V ± anticorpo de bloqueio de fungao a5b1 (10 mg/ml) por 30 minutos. Figura 2B: Apos 9 horas, celulas tratadas com Dominio V formaram mais (**p<0,0001) tubes do que os controles que foram, por sua vez, significantemente bloqueados por anticorpo anti-a5b1 (*p<0,001, comparado a tratamento com DV). Barras de erro=s.., experimentos n=3, HPF = campo de alta energia.
[00016] Figura 3 mostra que Dominio V estimula formagao capilar de celula endotelial do cerebro e interagao com neuronios. As celulas endoteliais do cerebro do rato (vermelhas, manchadas anticorpo de fator anti-von Willebrand, Dako) foram adicionadas a uma camada de neuronios de granule cerebelar (verde, manchada com um anticorpo anti-TUJ1, Dako) e, em seguida, tratadas com Dominio V (300nM) ou controle de veiculo. No controle, celulas endoteliais segregadas de neuronios formando ilhas distintas, enquanto tratamento com Dominio V resultou na formagao de tubo capilar ao redor dos neuronios.
[00017] Figura 4 mostra que o Dominio V causa redistribuigao de 0,501. As celulas endoteliais do cerebro em laminina foram tratadas com Dominio V (300nM) ou controle de veiculo por 2 horas. As celulas foram entao fixadas, e imunomanchadas por a501 integrina (verde), e contramancha de DAPI nuclear (azul) e visualizadas por microscopia confocal. O tratamento com Dominio V em redistribuigao de a501 para projegoes de superficie de celula comumente vista em celulas endoteliais angiogenicas.
[00018] Figura 5 mostra que o Dominio V suporta adesao de celula endotelial do cerebro. As celulas endoteliais do cerebro ± pre-incubaQao com anticorpo de bloqueio de funQao de a501 foram adicionadas aos POQOS revestidos com 1% de BSA ou Dominio V, seguido por fixaQao, manchamento e espectrofotometria de OD560. Significantemente mais (#, p<0,001) celulas endoteliais do cerebro aderidas ao Dominio V do que BSA que foi, por sua vez, significantemente (*, p<0,001) inibido pela adiQao de anticorpo de bloqueio de funQao 5b1. n=3. Barras de erro = s..
[00019] Figuras 6A-6B mostram que tratamento com Dominio V apos acidente vascular cerebral isquemico arterial perinatal (PAS) aumenta a superficie do cerebro e a vasculatura penumbral de acidente vascular cerebral. A oclusao de arteria cerebral media transiente em ratos de 7 dias de idade foi induzida via injegao estereotatica de endotelina-1. Os animais, em seguida, receberam 0,5 mg/kg de injegao intraperitoneal de Dominio V filtrado esteril ou controle de veiculo de PBS 24 e 72 horas apos acidente vascular cerebral. Apos 5 dias pbsacidente vascular cerebral, os cerebros dos animais foram removidos e vasculatura superficial de acidente vascular cerebral foi verificada por imagem, seguido por imuno-histoquimica de von-Willebrand de seQbes de tecido congeladas para analisar vasculatura penumbral. O tratamento com Dominio V resultou em hipervascularidade superficial do cerebro e um aumento significante (p<0,001) na vasculatura penumbral do acidente vascular cerebral.
[00020] Figura 7 mostra que o Dominio V administrado localiza para acidente vascular cerebral e tecido de peri-infarto por imunohistoquimica. SeQbes de tecido congeladas de animais tratados de acidente vascular cerebral com Dominio V ou controle de veiculo de foram processadas via imuno-histoquimica com anticorpos direcionados contra fator de Willebrand e o epitopo de HIS para visualizar vasos sangufneos e administrado Dominio V, respectivamente. Existe uma abundancia de Dominio V em tecido de acidente vascular cerebral e o tecido de cerebro de peri-infarto de acidente vascular cerebral. Aqui o Dominio V depositado em uma distribuigao perivascular. Em contrasts, no Dominio V foi detectado no tecido de cerebro contralateral sem acidente vascular cerebral correspondente do mesmo animal tratado com Dominio V sugerindo que o Dominio V especificamente reside no acidente vascular cerebral e no tecido de cerebro de peri-infarto.
[00021] Figura 8 mostra que o Dominio V administrado localiza tecido de cerebro de acidente vascular cerebral por western imunoblot. O lisato do acidente vascular cerebral de tecido de cerebro ipsilateral (I) ou tecido contralateral (C) correspondente sem acidente vascular cerebral de um animal tratado com PBS ou Dominio V foi analisado por western imunoblot com anticorpos para Dominio V (detecta ambos DV endogeno e administrado), HIS (detecta somente Dominio V administrado) e controle de carregamento de protefna de GAPDH. A faixa de 85 kDa e mostrada para antiDomfnio V e anti-HIS. Significantemente mais Dominio V foi detectado no tecido cerebral de acidente vascular cerebral conforme comparado ao tecido contralateral, quando normalizado para controle de carregamento de GAPDH, em ambos os animais tratados com PBS (p<0,001) e Dominio V (p<0,00001), o ultimo ainda mais devido ao extra administrado Dominio V. O Dominio V administrado conforme detectado por anticorpo anti-HIS pode somente ser detectado no lisato a partir do cortex de acidente vascular cerebral do animal tratado com Dominio V.
[00022] Figuras 9A-9B mostram que tratamento de Dominio V aumenta o numero de neurdnios recentemente nascidos em tecido de cerebro de peri-infarto. Figura 9A: SeQoes de tecido congeladas foram imunomanchadas para o marcador neuronal recem-nato cortin duplo e a percentagem media de pixels positives de cortin duplo por campo de energia alto (HPF, 20 imagens por animal) em tecido de cerebro de periinfarto de um animal tratado com PBS e Dominio V foi quantificada com Adobe photoshop. Significantemente mais pixels de cortin duplo foram detectados no animal tratado com Dominio V (*=p<0,0001). Figura 9B: Imuno-histoquimica do animal tratado com dominio V mostrando varios neuronios positives de cortin duplo (verde) diferentes proximamente associados com vasos sanguineos de peri-infarto administrados com Dominio V conforme detectado com anticorpo anti-HIS (vermelho). Nucleos de celula sao contramanchados com DAPI (azul).
[00023] Figura 10 mostra que Dominio V intensifica a migrapao de neuronio cortical. Neuronios corticais de camundongos embrionicos C57BI6 de 15 dias +/pre-incubapao por 30 minutos com 100nM ou 200 nM de Dominio V foram adicionados ao popo superior de uma camara Boyden modificada (3x103/popo) e permitidos migrarem por 8 h (a 37°C) atraves de uma membrana de policarbonato revestida com colageno tipo I em direpao a uma popo de fundo contendo nenhum (controle de migrapao) ou fator de crescimento de nervo (NGF, 4 nM por popo). N=3 para cada condipao. Pre-incubapao de Dominio V significantemente, e um modo dependente de dose, migrapao neuronal cortical intensificada sugerindo que ele pode ter efeitos terapeuticos potencialmente diretos nos neuronios. *=p<0,001, **=p<0,0001. As barras sao erro padrao.
[00024] Figura 11 mostra que o Dominio V aperfeipoa o resultado funcional/motor no modelo de acidente vascular cerebral de animal endotelina-1. Animais com acidente vascular cerebral ou controles de cirurgia de simulapao foram colocados em um cilindro de alta transparencia de 20 cm de diametro por 3 minutos para testar preferencia de membra e sua capacidade de suportar peso no membra anterior (6). Conforme o animal volta a explorar o ambiente, o numero de colocapdes de pata bilateral, colocapdes da pata ipsilateral a lesao (direita), e colocaqoes da pata contralateral a lesao (esquerda) sao contadas. Os contatos da pata foram gravados em videotape e analisados mais tarde. A percentagem de uso de membro ipsilateral foi calculada usando-se a equaqao contatos ipsilateral/ (contatos ipsilateral + contralateral) x 100. N=5 por grupo de tratamento, *p<0,05, **p<0,001 comparando Dominio V de acidente vascular cerebral tratado e PBD de acidente vascular cerebral tratado. De pos-acidente vascular cerebral de 3 dias em avan?o, nao existe diferen?a estatistica entre controles de simulapao e animais de Dominio V tratados de acidente vascular cerebral foram tratados com 0,5 mg/kg em pos-acidente vascular cerebral nos dias 1, 3, 5, 7.
[00025] Figuras 12A-12B mostram os efeitos de Dominio V em BDNF. Figura 12A: BDNF ELISA de meio condicionado de anticorpo de celulas endoteliais do cerebro +/Dominio V +/a501 (direcionado contra dominio de ligaQao de ligante a5) +/SNAKA51 (anticorpo de ativaQao de a5p1) sobre o curso de 24 horas. Isto demonstra que Dominio V (**p=0,0025), anticorpo a501 (*p=0,0001) e SNAKA51 (#p=0,0007) todos aumentam significantemente niveis de BDNF. A adiQao simultanea de anticorpo a501 e Dominio V resulta em niveis de liberaQao de BDNF de linha base, enquanto SNAKA51 e Dominio V adicionalmente aumentam niveis de BDNF, mas este aumento nao foi estatisticamente significante (p=0,06). Figura 12B: western blot de BDNF representativas de tecido de cerebro de acidente vascular cerebral ipsilateral em animais tratados com controle de veiculo PBS ou Dominio V em pos-acidente vascular cerebral nos dias 3 e 7. Figura 12C: QuantificaQao de western blot de BDNF demonstrando um aumento significante em niveis de BDNF em pos-acidente vascular cerebral no pos-acidente vascular cerebral nos dias 3 e 7 (*p=0,006, **p=0,0001) com tratamento com Dominio V conforme comparado ao dia correspondente em animais tratados com PBS, valores medios +/erro padrao de 3 de western blot separadas mostradas.
[00026] Figuras 13A-13H mostram que o Dominio V interage com e exercem seus efeitos pro-angiogenicos via a a501 integrina. Figura 13A: QuantificaQao de ensaio de adesao representative de celula endotelial do cerebro para BSA imobilizado (controle negative) ou Dominio V +/anticorpo de bloqueio de funQao a5p1 (10 mg/ml) demonstrando que Dominio V suporta significantemente mais adesao de celula conforme comparado a BSA (** p=0,00005) que pode ser significantemente inibido por anticorpo de bloqueio de funQao de a5pi (* p=0,0007). Figura 13B: a5pi-DV ELISA demonstra que Dominio V se liga a a5pi integrina imobilizado em uma dose dependente com um Kd de aproximadamente 30 nM. Controle negative de Tween 20 tambem e mostrado. Figura 13C: QuantificaQao de celulas que migram para 3% de soro bovino fetal (controle) ou DV +/a5pi1-GST ou fibronectinaGST (conforme normalizado para controle negative (nenhum quimioatraente) demonstrando que Dominio V foi como quimioatraente mais poderoso do que 3% de soro que pode ser significantemente inibido por a5pi-GST (* p=0,02) ou fibronectina-GST (** p=0,01), barras de erro sao desvio padrao. Figura 13D: Imagens representativas de celulas endoteliais do cerebro em matrigel apos 12 horas, +/Dominio V +/o peptideo de ligaQao especifico de a5p1 CRRETAWAC (SEQ ID N°: 3) demonstrando que CRRETAWAC inibe intensificaQao de DV’s de formaQao de estrutura similar a tubo. Figura 13E: QuantificaQao de experimentos de tubo de matrigel na (Figura 13D) demonstrando que Dominio V intensifica significantemente formaQao de estrutura similar a tubo (* p=0,0003) foi significantemente inibida (** p=0,001) por CRRETAWAC. Figura 13F: western blot a5b1 representativa de celulas endoteliais do cerebro confluentes famintas por soro com controle de carregamento de GAPDH por 8 horas +/Dominio V demonstrando que niveis de a5pi de celula total diminuem por 8 horas em controles, enquanto o Dominio V mantem niveis de a5pi. Figura 13G: Imunocitoquimica de a5b1 de celulas endoteliais do cerebro demonstrando que exposiQao do Dominio V altera a localizagao de a5pi de distribuiQao mesmo celular para superficie/lamellipodia. Figura 13H: western blot representativa de acidente vascular cerebral (I) e (C) posacidente vascular cerebral contralateral no dia 3 em tecido de cerebro de PBS e animais tratados com Dominio V com controle de carregamento de GAPDH correspondente demonstrando um aumento significante no acidente vascular cerebral total em niveis de cerebro a5pi com tratamento com Dominio V.
[00027] Figuras 14A-14B mostram os efeitos de a2p1 na atividade proliferativa de celula DV em celulas C57. Figura 14A: DV aumenta a proliferaqac de celulas endoteliais do cerebro de camundongo, conforme comparado a controle medio de celula, que pode ser bloqueado pela adiQao de anticorpo de neutralizaQao de VEGF ou anticorpo de bloqueio de fungao de a5pi integrina. Figura 14B: AdiQao de a2pi integrina as celulas suprime preferivelmente do que aumenta o crescimento das celulas. As barras sao valores +/desvio padrao (Fig. 14B). **p<0,01.##p<0,01.
[00028] Figuras 15A-15B mostram como os efeitos de DV no espapo intervascular em cepas de camundongos Balb/c (Figura 15A) e C57BI6 (Figura 15B). Figura 15A: Em cepa BALB/c [3H]manitol e [14C]sacarose, valores Riecido medidos na ausencia (controle 0 hora) e presenQa de DV (8 e 24 horas). A diferenQa entre os tres grupos experimentais para ambos [3H]manitol e [14C]sacarose nao e maior do que seria esperado pela mudanga apos permitir os efeitos de diferenQas na regiao (*P>0.05; Dois Way ANOVA). Cada grupo n=4. Valores mediostSEM. Figura 15B: Cepa C57BI6 [3H]manitol e [14C]sacarose valores Riecido medidos na ausencia (controle 0 hora) e presenQa de DV (2 horas). A diferenQa entre o grupo experimental para ambos [3H]manitol e [14C]sacarose nao e maior do que seria esperado por mudanpa apos permitir os efeitos de diferenpas na regiao (*P>0,05; Dois Way ANOVA). Cada grupo n=5. Valores mediostSEM.
[00029] O uso da palavra "um" ou "uma" quando usada em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicaçoes e/ou no relatorio descritivo pode significar "um", mas ele e tambem consistente com o significado "um ou mais", "pelo menos um", e "um ou mais do que um". Algumas modalidades da invenpao podem consistir em ou consistir essencialmente em um ou mais elementos, etapas de metodo, e/ou metodos da invenpao. E contemplado que qualquer metodo ou composipao aqui descritos podem ser implementados com relapao a qualquer outro metodo ou composipao aqui descritos.
[00030] O uso do termo "ou" nas reivindicaçoes e usado para significar "e/ou", a menos que explicitamente indicado para se referir a alternativas somente, ou as alternativas sao mutuamente exclusivas, embora descripao suporte uma definipao que se refere a somente alternativas e "e/ou".
[00031] A presente invenpao proporciona um metodo de estimular ou intensificar angiogenese em um paciente compreendendo administrar a referido paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma protefna endorepellin, no qual a referida protefna endorepellin tem uma sequencia de aminoacido de dominio V de perlecan ou fragmentos ou derivados, analogos do mesmo; e estimular ou intensificar gerapao de vasos sangufneos. Preferivelmente, fragmentos do dominio V de perlecan tem uma sequencia de aminoacido que e pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% identica ao dominio V de perlecan. O dominio V de perlecan ou fragmentos ou derivados, analogos do mesmo pode ser administrado por qualquer metodo util que pode ser prontamente determinado por um versado na tecnica. Alem disso, o dominio V de perlecan ou fragmentos ou derivados, analogos deste pode ser administrado em uma quantidade de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporeo do paciente. Tipicamente, a administraQao resulta em formaQao de tubo capilar endotelial no cerebro dentro dos neurdnios e/ou expressao aumentada do pro-angiogenico a5pi integrina em celulas endoteliais do cerebro.
[00032] A presente invenção tambem proporciona um metodo de estimular ou intensificar angiogenese em um paciente compreendendo administrar ao referido paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma protefna endostatina, ou fragmentos ou derivados, analogos da mesma; e estimular ou intensificar geraQao de vasos sangufneos. Preferivelmente, os fragmentos de endostatina tem uma sequencia de aminoacido que e pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% identica a endostatina. Geralmente, um versado na tecnica seria capaz de prontamente derivar fragmentos ou derivados uteis. A endostatina ou fragmentos ou derivados, analogos do mesmo, pode ser administrada por qualquer metodo util que pode ser prontamente determinado por um versado na tecnica. Geralmente, a endostatina ou fragmentos ou derivados, analogos da mesma, pode ser administrada em uma quantidade de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporeo do paciente. A administraQao resulta na formaQao de tubo capilar de celula endotelial no cerebro dentro dos neurdnios.
[00033] A presente invenção tambem proporciona uma Composicao farmaceutica compreendendo um dominio V de perlecana, ou fragmentos ou derivados, analogos do mesmo, um composto de estatina e um veiculo farmaceuticamente aceitavel ou excipiente.
[00034] A presente invenção tambem proporciona uma Composicao farmaceutica, compreendendo endostatina ou fragmentos ou derivados, analogos da mesma, um composto de estatina, e um veiculo farmaceuticamente aceitavel ou excipiente.
[00035] A presente invenção tambem proporciona uma Composicao farmaceutica compreendendo endostatina ou fragmentos ou derivados, analogos da mesma, uma estatina e um veiculo farmaceuticamente aceitavel ou excipiente.
[00036] A composigao aqui descrita pode ser administrada ou sozinha, ou em combinagao com outro farmaco ou um composto. Tai farmaco ou composto pode ser administrado concorrentemente ou sequencialmente com a Composicao aqui descrita. O efeito de coadministraQao com a Composicao e abaixar a dosagem do farmaco ou o composto normalmente requerido que e conhecido ter pelo menos um efeito farmacologico ou terapeutico minimo contra a doenQa que esta sendo tratada.
[00037] A composigao aqui descrita e o farmaco ou o composto podem ser administrados independentemente, ou sistemicamente ou localmente, por qualquer metodo conhecido na tecnica, por exemplo, subcutaneamente, intravenosamente, parenteralmente, intraperitonealmente, intradermalmente, intramuscularmente, topicamente, enteralmente, retalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente ou por pulverizaQao por inalaQao, por bomba de farmaco ou contidos dentro de emplastro transdermal ou um implante. As formulaQoes de dosagem da Composicao aqui descrita podem compreender veiculos fisiologicamente ou farmaceuticamente aceitaveis convencionais, nao toxicos ou veiculos adequados para o metodo de administraQao.
[00038] A composigao aqui descrita e o farmaco ou o composto podem ser administrados independentemente uma ou mais vezes para alcanQar, manter ou aperfeigoar um efeito terapeutico. Esta bem dentro dos conhecimentos de um versado na tecnica determinar a dosagem ou se uma dosagem adequada de qualquer ou ambas da Composicao e do farmaco ou do composto compreendem uma dose administrada unica ou doses administradas multiplas.
[00039] Conforme e bem-conhecido na tecnica, um nivel de dose especifico de tai Composicao gerada deste para qualquer paciente particular depende de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto especifico empregado, idade, peso corporeo, saude geral, sexo, dieta, tempo de administraQao, rota de administraQao, taxa de excregao, combinagao de farmaco, e a severidade da doenQa particular suportando terapia. A pessoa responsavel pela administraQao determinara a dose apropriada ao paciente individual. Alem disso, para administraQao humana, as preparagoes devem encontrar esterilidade, pirogenicidade, seguranga geral e padroes de pureza conforme requeridos pelo Escritorio da FDA de Padroes Biologicos.
[00040] A administraQao da Composicao da presente invenção a um paciente ou indivfduo seguira os protocolos gerais para a administraQao de terapias usadas no tratamento de doenga ou disturbios vasculares cerebrals levando-se em conta a toxicidade, se houver, dos componentes na Composicao e/ou, em modalidades de terapia de combinagao. E esperado que os ciclos de tratamento seriam repetidos conforme necessario. E tambem contemplado que varias terapias padroes, bem como intervengao cirurgica, podem ser aplicadas em combinagao com a terapia descrita.
[00041] Conforme e conhecido a um versado na tecnica, a composigao aqui descrita pode ser administrada junto com qualquer dos veiculos farmacologicamente aceitaveis conhecidos. Adicionalmente, a composigao pode ser administrada via qualquer das rotas conhecidas de administragao, tais como subcutanea, intranasal ou mucosal. Alem disso, a dosagem da composigao a ser administrada pode ser determinada por realizagao de experimentos conforme e conhecido a um versado na tecnica.
[00042] Os seguintes exemplos sao dados para a proposta de ilustraQao de varias modalidades da invencao, e nao sao significativos para limitar a presente invenção de qualquer modo. Um versado na tecnica apreciara prontamente que a presente invenção e bemadaptada para efetuar os objetivos e obter as finalidades e vantagens mencionadas, bem como aqueles objetivos, finalidades e vantagens aqui inerentes. MudanQas destes e outros usos que sao envolvidos dentro do espirito da invenção como definida pelo escopo das reivindicaçoes ocorrerao aqueles versados na tecnica.
[00043] Veia umbilical humana (HUVEC) e celulas endoteliais microvasculares do cerebro foram compradas de Lonza (Basel, SuiQa) e Sistemas de Celula (Kirkland, WA), respectivamente, e manuseadas de acordo com as instrugoes do fabricante. As celulas endoteliais microvasculares do cerebro do rato ou camundongos foram providas por Jane Welsh, Texas A&M University, e manuseadas conforme descrito (5).
[00044] Endostatin humana foi adquirida por Cell Sciences, Inc. (Canton, MA) e Sigma Chemical (St. Louis, MO). Dominio V (DV) foi clonado no vetor pSecTag2A (Invitrogen, Carlsbad, CA) e purificado de celulas 293FT (ATCC, Manassas, VA) transfectadas via sua etiqueta Cterminal 6XHis e coluna de cromatografia de gotas de agarose Ni-ATA (Qiagen, Valencia, CA). Pureza de DV dialisado (contra PBS) foi confirmada via SDS-PAGE e western blot com anti-DV (R&D systems, Minneapolis, MN) e anticorpos anti-his (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ). Pre-tratamentos de trinta minutos demonstraram anteriormente concentraQoes antiangiogenicas de DV (250 nM) e endostatina (600 ng/ml) e controles ativados por calor (100° C por 30 min) foram usados para todos os experimentos. Para todos os experimentos descritos, N=15 (5 experimentos separados, cada condipao realizada em triplicata). Significancia estatistica (p<0,05) foi determinada para todos os experimentos por teste-t nao emparelhado Student’s com o pacote de software Sigmastat.
[00045] Ratos Harlan Sprague Dawley (n=10) foram submetidos a cirurgia estereotaxica de oclusao de arteria cerebral media com endotelin-1 (American Peptide Company, Sunnyvale, CA) ou injepao de PBS. Os ratos foram terminados 3 ou 7 dias pos cirurgia e tecido de cerebro foi processado para Dominio V e analise de western imunoblot de GAPDH.
[00046] Experimentos de matrigel foram realizados conforme descrito (7). Apos 12-18 horas, foram feitas imagens das celulas e formapao de tubo foi quantificada (pixels de tubo/campo de alta energia, 10 areas por condipao) com Adobe Photoshop CS. A migrapao de celula foi avaliada com uma Camara modificada Boyden (NeuroProbe, Gaithersburg, MD) seguindo as instrupoes do fabricante. A migrapao atraves de uma membrana de policarbonato revestida com colageno tipo I para meio livre de soro +/3% de soro bovino fetal foi avaliada apos 6-8 horas. A proliferapao foi avaliada apos 48 horas em meio livre de soro contendo VEGF 20ng/ml com solupao de MTS (Promega, Madison, Wl), seguindo as instrupoes do fabricante.
[00047] Neurdnios de granule cerebelar, isolados de rates pbs-natal de 8 dias foram adicionados a uma lamina de camara pre-revestida com laminina (Invitrogen) e crescidos durante a noite. Celulas endoteliais do cerebro foram entao adicionadas durante a noite, seguido por tratamentos experimentais por 2-6 horas em meio livre de soro. Celulas fixadas foram imunomanchadas com fator anti-Von Willebrand, (Dako, Dinamarca) ou anticorpos anti-TUJ1 (Neuromics, Edina, MN) e anticorpos secundarios etiquetados com fluorocromo apropriados (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) para microscopia confocal (Zeiss, New York, NY).
[00048] Conforme angiogenese de peri-infarto de pico se inicia apos 3-7 dias, o controle do acidente vascular cerebral e nao acidente vascular cerebral dos hemisferios cerebrals, do mesmo animal, foi examinado para niveis de Dominio V por western imunoblot apos 3 e 7 dias apos acidente vascular cerebral (n=5 para cada ponto de tempo). Tres dias apos induQao de acidente vascular cerebral, um aumento de 530% ± 20% (desvio padrao) no Dominio V no hemisferio do acidente vascular cerebral foi demonstrado conforme normalizado para controle de carregamento de GAPDH e quantificado por densitometria otica (software ImageJ, NIH) (p<0,001 por teste-t nao emparelhado Student) (figura 1A-1B).
[00049] A capacidade de DV afetar angiogenese do cerebro, e o envolvimento de neste processo foi examinado usando-se um ensaio de tubo capilar in vitro. As celulas endoteliais microvasculares de cerebro (50.000 celulas/poqo, proporcionadas por Jane Welsh, Texas A&M) (8) foram adicionadas a POQOS revestidos de Matrigel (uma substancia similar a membrana base que estimula tubulogenese capilar (9), 25 ml/poQO, BD Biosciences) de 24 placas de po?o ± uma pre-incubapao com DV (200 nM) ± anticorpo a5p1 de bloqueio de fungao (10 mg/ml, figura 2A). Apos 9 horas, celulas endoteliais do cerebro tratadas com DV formam significantemente mais tubos capilares conforme comparado a controles nao tratados (p<0,0001). Este efeito foi, por sua vez, significantemente bloqueado por anticorpo anti-a5b1 (p<0,001, conforme comparado a tratamento com DV apenas, figura 2B). Pretratamento com anticorpo de bloqueio anti-a5pi sozinho nao afetou significantemente formagao de tubo (p=0,3).
[00050] Em seguida, para determinar se DV pode afetar a interagao entre celulas endoteliais do cerebro e neuronios, isto e, o nicho neurovascular, um ensaio de cocultura de neuronio de granule de celula endotelial de cerebro foi desenvolvido em que celulas endoteliais do cerebro sao adicionadas a uma camada de neuronios primaries obtidos de um cerebelo de rato de 8 dias pos-natal que produziu >95% de cultura de neuronio de granulo gerado recentemente puro (10). Os neuronios (5x104 celulas/pogo) foram adicionados a uma lamina de pogo de camara pre-revestida com laminina e permitida crescer durante a noite a 37°C. No dia seguinte, as celulas endoteliais do cerebro foram adicionadas (3x104 celulas/pogo) e permitidas crescer durante a noite, seguido por tratamento com DV por 6 horas em meio livre de soro. Neste ensaio, as celulas endoteliais do cerebro rapidamente (dentro de 2-3 horas) se segregaram dos neuronios formando ilhas de celula endotelial distinta. O tratamento com DV resultou na formagao dramatica de tubo capilar de celula endotelial no cerebro dentro dos neuronios (figura 3).
[00051] Para demonstrar se o Dominio V afeta a expressao do proangiogenico a5p1 integrina em celulas endoteliais do cerebro, a localizagao subcelular de a5b1 integrina em Dominio V nao tratado e celulas endoteliais do cerebro cultivadas expostas de rato foram analisadas via imunocitoquimica e microscopia confocal. A figura 4 mostra que tratamento com DV resultou em uma redistribuigao de a5pi integrina de citoplasmico difusamente para projeQdes de superficie de celula comumente vistas em celulas endoteliais angiogenicas.
[00052] Para determinar se Dominio V pode suportar adesao de celula endotelial do cerebro via a501 integrina, um ensaio de adesao de celula foi realizado com POQOS revestidos com 1% de BSA (controle de adesao) ou Dominio V (40 microgramas g/ml) e celulas adicionadas ± 0,501 anticorpo de bloqueio de fungao (10 microgramas mg/ml) de preincubaQao. A figura 5 demonstra que Dominio V suporta significantemente mais adesao de celula endotelial do cerebro do que BSA (p<0,001), e que anticorpo de bloqueio de fungao de a501 significantemente (p<0,001) inibiu adesao de celula endotelial do cerebro a DV, sugerindo a possibilidade que DV pode suportar adesao de celula endotelial do cerebro de a501 integrina.
[00053] Estes resultados demonstram que Dominio V do cerebro e aumentado pos-acidente vascular cerebral e intensifica ambos angiogenese em um meio neuronal e a interagao entre celulas endoteliais do cerebro e neuronios. Alem disso, estes efeitos requerem interaQoes com a a501 integrina. Importantemente, estes resultados suportam a posigao que o pos-acidente vascular cerebral cerebro se autorrepara por geraQao de um fragmento bioativo (DV) de perlecan, e pode explorar terapeuticamente este mecanismo de reparo do cerebro. EXEMPLO 7 Efeitos de DV na angiogenese do cerebro e formacao do nicho neurovascular
[00054] Para demonstrar o papel de Dominio V na angiogenese do cerebro in vitro, ensaios de angiogenese sao realizados incluindo ensaios de tubo capilar de Matrigel, ensaios de migraQao de celula, e ensaios de proliferaQao de celula com celulas endoteliais do cerebro microvasculares e Dominio V recombinante humano. Um ensaio de tubo capilar de cocultura de celula endotelial de neuronio-cerebro e usado para estudar os efeitos de Dominio V na formaQao de tubo capilar em um ambiente similar ao cerebro, bem como para estudar a formaQao do nicho neurovascular. Os estudos acima sao realizados em ambiente desprovido de glicose (OGD) para isquemia focal modelo in vitro. DV intensificara significantemente, e em um modo dependente da dose, a angiogenese do cerebro, bem como a interaQao entre neurdnios e celulas endoteliais em ambas as condiQoes normals e de OGD.
[00055] Dominio V foi clonado no vetor pSecTag2A (Invitrogen) que adicionou uma etiqueta 6XHis ao C-terminal de DV. Plasmideos foram transfectados em celulas 293FT (ATCC, Manassas, VA) via Lipofectamina (Invitrogen). Apos transfecQao, meio condicionado livre de soro (contendo DV secretado por celula) foi coletado e DV foi purificado via coluna de cromatografia de gota de agarose nNi-ATA a 4°C. O DV eluido foi dialisado contra 1X PBS e avaliado para pureza via SDS-PAGE manchado com Brilliant Blue G-coloidal (DVc) e por analise de western blot (DVWB) com anticorpo anti-DV (mostrado), e anticorpo anti-His. O DV foi quantificado com Reagente Quick Start Bradford Dye. EXEMPLO 9
[00056] A proliferaQao de celula endotelial e uma etapa inicial importante em angiogenese. Para avaliar os efeitos proliferativos de Dominio V em celulas endoteliais, celulas endoteliais microvasculares do cerebro de ambos camundongos e ratos sao usadas para ambas regra de diferenQas especificas de especie e correspondem ao uso de ratos em modelo de acidente vascular cerebral in vivo. Celulas endoteliais de veia umbilical (HUVEC, Lonza, Basel, SuiQa) sao usadas como um controle, e celulas endoteliais microvasculares de cerebro humano (Cell Systems, Kirkland, WA) sao usadas para determinar se os efeitos de Dominio V podem tambem ser aplicaveis a humanos. Para ensaios de proliferapao, as celulas sao coletadas com tripsina 0,25% (Invitrogen), pre-tratadas com controle de veiculo, ou concentrapoes diferentes de DV (1-450 nM de concentrapoes usadas para todos os experimentos de angiogenese in vitro) em suspensao por 30 minutos em meio livre de soro contendo 20 ng/ml de VEGF, e, em seguida, sao adicionados a 96 placas de popo a uma densidade de 5x103 celulas/popo. As celulas sao, em seguida, incubadas por 48 horas sob condipoes de crescimento normals. A solupao de MTS e, em seguida, adicionada (20 ml/popo) por 1 hora, seguido por uma leitura de absorvencia a 490 nm com a leitora de placa.
[00057] A medida que as celulas endoteliais angiogenicas estao proliferando, elas comepam a migrar para uma regiao de tecido que requer um novo suprimento de sangue em resposta a um quimioatraente liberado pelo tecido que demanda de vaso sanguineo. Para avaliar se o controle de DV afeta a migrapao de celula endotelial, as celulas sao coletadas e carregadas na camara superior de uma Camara de Boyden modificada (NeuroProbe, Gaithersburg, MD) ± preincubapao por 30 minutos no meio livre de soro apropriado com concentrapoes diferentes de DV em suspensao a 37°C, e permitidas migrarem atraves de uma membrana de policarbonato revestida com colageno tipo I, laminina ou fibronectina para o meio livre de soro +/3% de FBS na camara inferior por 6-8 horas a 37°C. Importantemente, estas matrizes extracelulares representam um substrato antiangiogenico e pro-angiogenico de celula endotelial de cerebro neutra (11), respectivamente, e seu uso deve permitir determinar se os efeitos de DV sao ECM especificos. As membranas (contendo celulas de migrapao) sao, em seguida, fixadas com acetona, e as celulas manchadas com cristal violeta (Sigma) e contadas sob o microscopio. Adicionalmente, se DV afeta diferencialmente a migragao para quimioatraentes para quimioatraentes diferentes incluindo VEGF, fator neurotrofico derivado do cerebro (BDNF), fator de crescimento de nervo (NGF) e FGF basico (bFGF) e determinado.
[00058] Uma vez que as celulas endoteliais chegam ao tecido-alvo pretendido requisitando um novo suprimento de sangue, as celulas suportam morfogenese capilar para produzir o novo caso sanguineo. Os ensaios de tubulogenese de Matrigel sao uma tecnica bem-estabelecida para estudar morfogenese capilar de celula endotelial in vitro (12). Para esta finalidade, estes ensaios sao realizados conforme descrito acima ± pre-incubagao de celula endotelial com concentragoes diferentes de DV. As celulas sao observadas em varios pontos de tempo e, em seguida, fixadas em 4% de paraformaldeido apos 12-18 horas. As imagens sao adquiridas com uma camera CCD fixada a um microscopio invertido usando-se softaware de captura de imagem padrao. A formagao de tubo e quantificada (pixels de tubo/campo microscopico, 10 campos por condigao) com Adobe Photoshop CS.
[00059] Para investigar a capacidade do Dominio V modular a formagao de tubo capilar de celula endotelial no cerebro em um ambiente mais similar a cerebro do que Matrigel, um sistema de ensaio de cocultura composto de neurdnios de granule cerebelar e celulas endoteliais do cerebro foi desenvolvido. O cerebelo de rato de 8 dias pos-natal foi selecionado como a fonte neuronal visto que e facilmente acessivel e uma fonte abundante de neuronios recentemente natos (13), cuja interapao com celulas endoteliais do cerebro. Em adipao a laminina, os neuronios sao adicionados a popos pre-revestidos com colageno I ou fibronectina para determinar a importancia relativa de cada substrato subjacente a formapao de tubo de celula endotelial. Os efeitos de concentrapoes diferentes de Dominio V na extensao de formapao de celula endotelial sao determinados para periodos diferentes de incubapao (1,3, 6, 9 horas). Os efeitos na intensificapao dependente de dose de Dominio V na formapao de tubo sao demonstrados.
[00060] Os dados aqui sugerem que na ausencia de Dominio V, celulas endoteliais do cerebro segregam dos neuronios enquanto o Dominio V promove formapao de tubo capilar contra os neuronios. Portanto, em adipao ao estudo de formapao capilar, este sistema de cocultura permite examinar os efeitos do DV nas interapoes dinamicas entre celulas endoteliais, neuronios e o ECM. Primeiro, o microscopic confocal e usado para examinar os efeitos do Dominio V em pontos de tempo diferentes na interapao tridimensional entre as celulas endoteliais do cerebro, neuronios e ECM circundante por coleta de imagens de pilha Z de celulas fixadas imunomanchadas para Fator de anti-Von Willebrand, anti-TUJ1, anti-a5p1, a protefna de junpao hermetica claudin-5 e componentes anti-ECM incluindo fibronectina, laminina e colageno tipo IV. Nestes estudos, se os efeitos de DV na distribuipao de celula endotelial de a5b1 integrina em relapao ao ECM circundante, bem como determinapao de mudanpas nas interapoes homotfpicas de celula endotelial, conforme medida pelas mudanpas em expressao de claudin5 e distribuipao celular, e interapoes neuronais heterotipicas, conforme medidas por mudanpas na proximidade de celula endotelial-neuronio, sao mostradas.
[00061] A microscopia de celula viva (microscopic Nikon com estagio motorizado e aquecido, estagio de CO2 conectado a uma camera CCD e PC com software de imagem Metamorph) sao usados para imagem da interaQao de neuronios etiquetados fluorescentemente dil e diO e celulas endoteliais (14), respectivamente ± terapia de DV por um penodo prolongado. O tratamento com Dominio V aumenta os contatos fisicos visiveis entre as celulas endoteliais do cerebro e neuronios, promovendo, desse modo, e intensificando a formaQao de nicho neurovascular durante recuperaQao de acidente vascular cerebral. Os contatos de celula endotelial-neuronio sao quantificados como o numero de contatos de celula endotelial-neuronio visiveis por campo microscopico/por hora. A extensao que as celulas endoteliais individuais contatam os neuronios por hora e tambem quantificada.
[00062] Finalmente, para determinar se a presenQa de neuronios ou seus ECM/fatores de crescimento secretados e necessaria para os efeitos de promoQao de tubo capilar de DV, em alguns experimentos os neuronios sao removidos com Cellstripper, uma soluQao de dissociaQao nao enzimatica que deixara a matriz secretada de neuronio no fundo do POQO conforme verificado por anticorpos de ECM, antes da adiQao das celulas endoteliais do cerebro ± tratamento com DV. Em outros experimentos, meio condicionado neuronal e adicionado as celulas endoteliais cultivadas em laminina. Os dados mostram a necessidade das interaQdes neurbnio-celula endotelial para formaQao de tubo de celula endotelial.
[00063] Os efeitos de Dominio V em um modelo in vitro de isquemia (15) sao mostrados usando-se os ensaios angiogenicos acima descritos em meio de glicose reduzido (1 g/L) em uma camara de hipoxia. Para cada ensaio, as culturas, em meio de glicose reduzido ± DV, sao colocadas nas camaras de hipoxia que sao inundadas com 95% de N2/5% de CO2 por 1 hora, seguido por vedaQao da camara pela duraQao do experimento conforme descrito acima para cada ensaio de angiogenese. A OGD sozinha aumenta a angiogenese de celula endotelial do cerebro e que esta e adicionalmente aumentada por DV. EXEMPLO 14 a5b1 integrina e efeitos pro-angiogenicos de DV em celulas endoteliais do cerebro
[00064] Requerimento de a5pi para efeitos pro-angiogenicos de DV significa que bloqueio de a5p1 e/ou reduQao de a5p1 evita ou inibe efeitos pro-angiogenicos de Dominio V. Portanto, os efeitos de inibiqao funcional de a5b1 integrina com um anticorpo de bloqueio de funQao e controle de IgG (Millipore, 10-20 mg/ml pre-incubados com celulas) e reduQao de niveis de a5pi com siRNA (Accell pre-designado siRNA, Dharmacon, Chicago, IL), respectivamente, em DV e celulas endoteliais do cerebro nao tratadas em ensaios de migraQao, proliferaQao e tubulogenese sao mostrados. a5b1 knockdown e confirmado via western blot.
[00065] Para medir diretamente a localizaQao superficial de a5b1 integrina de celula endotelial de cerebro em resposta a exposiQao de DV, os metodos de Milner et al. (15) sao usados para preparar celulas crescidas no plastico ou varios substrates (laminina, colageno, fibronectina ou DV imobilizado, a 40 mg/ml adicionados aos POQOS durante a noite a 4° C) ± exposiQao de DV para citometria de fluxo usando-se a maquina Becton-Dickinson FACSCalibur com software CellQuest (Becton-Dickinson) Mod Fit LT (Verity).
[00066] DV deve se ligar a e ativar a a5b1 integrina resultante em afinidade de celula endotelial de cerebro aumentada para fibronectina, via o motivo de ligapao de RGD fibronectina/a5pi. Os efeitos de DV para aumentar adesao de celula endotelial do cerebro a fibronectina imobilizada e a sequencia de RGD GRGDS (SEQ ID N°: 1) versus um peptideo de controle SDGRG (SEQ ID N°: 2) sao mostrados.
[00067] Ensaios de adesao de celula foram efetuados conforme descrito acima em POQOS revestidos com DV (40 microgramas/ml), fibronectina (10 microgramas/ml), GRGDS ou peptfdeos de SDGRG (0,1 micrograma/ml), ou 1 % de BSA. Para mostrar que adesao de celula a DV e dependente de a501, estudos de adesao sao conduzidos onde fungao ou expressao de a5pi e inibida. As celulas sao tratadas com a5b1 siRNA, seguindo as instruQdes do fabricante e eficiencia de a5pi knockdown e confirmada via western imunoblot. Alternativamente, as celulas sao pre-incubadas com o anticorpo de bloqueio anti-a5pi antes do ensaio de adesao. Esta inibiQao de fungao ou expressao de a5pi que diminui ou inibe a adesao de celula endotelial de cerebro a DV e mostrada. Este DV aumenta a adesao de celula endotelial de cerebro a fibronectina e peptideo de GRGDS e tratamento com a5pi siRNA inibe a adesao de celula endotelial do cerebro a Dominio V imobilizado e que adicionados a DV intensifica a adesao de celula endotelial do cerebro a fibronectina e GRGDS e mostrada.
[00068] DV e administrado pos-acidente vascular cerebral e seus efeitos na patologia do acidente vascular cerebral e recupera^ao funcional sao mostrados. Angiogenese de pos-acidente vascular cerebral e aumentada apos administrapao de DV em um acidente vascular cerebral in vivo conforme e a formaQao de nicho neurovascular, e os resultados de acidente vascular cerebral patologico e funcional em ratos sao aperfeipoados. A terapia de DV e bem-tolerada em animais.
[00069] Ratos Harlan Sprague Dawley sao submetidos a endotelin-1 (ou controle de simulagao de PBS) oclusao de arteria cerebral media induzida (MCAo) conforme descrito acima. A interrupgao do fluxo de sangue e confirmada usando-se um fluxometro a laser Doppler (modelo BPM2, Vasamedics Inc, St. Paul, MN) (16) (49). 24 horas apos MCAo, os animais sao randomizados em dois grupos, 1 recebendo 2-6 mg/kg de DV filtrado (uma quantidade suficiente para inibir angiogenese de tumor conforme publicado (7)) por injegao intraperitoneal (I.P.) (grupo tratado) e 1 recebendo controle de veiculo todo 2 dias por 2 semanas. Tambem comegando a 24 horas pos-MCAo, os ratos recebem diariamente (por 14 dias) injegoes I.P. de bromodeoxiuridina (Brdll; 100 mg/kg; Sigma) para etiquetar DNA recentemente sintetizado para identificar neuronios recem-natos na recuperagao de cerebros de rato. EXEMPLO 19 Imuno-histoquimica de tecido de acidente vascular cerebral e western imunoblot
[00070] Para avaliar angiogenese de pos-acidente vascular cerebral e formagao de nicho neurovascular ± terapia de DV nos ratos, tecido fresco de cerebro de acidente vascular cerebral e animais de simulagao de acidente vascular cerebral sao congelados em nitrogenio liquido. Para imuno-histoquimica de angiogenese, criossegdes dos hemisferios cerebrals do acidente vascular cerebral, obtidas com um criostato Microm HM 550 (Walldorf, Germany) sao sondados com anticorpos direcionados contra antigenos de vaso de sangue, isto e, CD31 e fator de von Willebrand (Dako). A extensao de interagoes de vaso de sangue com BrdU+ neuronios sao avaliadas e quantificadas com Adobe Photoshop CS. Alem disso, percepgao de tecido de acidente vascular cerebral e distribuiQao de DV injetado e mostrada com anticorpo direcionado a etiqueta DV’s 6xHIS (EMD). Conforme comparado a animais nao tratados de acidente vascular cerebral, a terapia de DV resultara em um aumento no vaso sanguineo, isto e, um aumento em celulas positivas de CD31 e/ou von Willebrand, ao redor do tecido de cerebro de acidente vascular cerebral que pode tambem ter expressao aumentada de a501 integrina e interaQao aumentada entre estes vasos sangumeos e BrdU+ neurdnios. O DV administrado localizara o local do acidente vascular cerebral e resulta em tamanho de infarto reduzido.
[00071] Acidente vascular cerebral isquemico arterial perinatal (PAS), um event© cerebrovascular que ocorre durante vida fetal ou neonatal, e uma causa maior de paralisia cerebral infantil. Infelizmente, PAS e tipicamente diagnosticado retrospectivamente, isto e, apos o dano ter sido feito e muito tarde para terapias de acidente vascular cerebral tradicionais tais como ativador de plasminogen de tecido. Portanto, terapias de paralisia cerebral bem-sucedidas devem explorar mecanismos de autorreparo do cerebro. Infelizmente, autorreparo do cerebro e pobremente compreendido, mas parece ocorrer em um nicho neurovascular de revascularizaQao (angiogenese) e repopulaQao neuronal (neurogenese). Ambos destes processos envolvem remodelagem de matriz extracelular acionada por protease (ECM) com consequencias desconhecidas. Angiogenese de cerebro de posacidente vascular cerebral e formaQao de nicho neurovascular e estimulada em parte pela geraQao de um fragmento bioativo do ECM, perlecan, e que este mecanismo de autorreparo e explorado para terapia de paralisia cerebral induzida por PAS. O acidente vascular cerebral gera rapidamente fragmentos bioativos de perlecan, que e o componente de ECM sensivel a protease mais estudado, e perlecan e requerido para ambos angiogenese e neurogenese. Alem disso, um fragmento de perlecan, dominio V (DV, tambem conhecido como endorepellin), pode inibir angiogenese em sistemas de nao cerebro atraves da a2pi integrina.
[00072] A presente invenpao mostra que DV e regulado para cima no cerebro apos acidente vascular cerebral e inesperadamente intensifica angiogenese do cerebro in vitro e in vivo apos acidente vascular cerebral, possivelmente devido a ausencia da a2pi integrina em celulas endoteliais do cerebro. DV exerce seus efeitos em celulas endoteliais do cerebro atraves da pro-angiogenica a5pi integrina, e intensifica a interapao entre neuronios e celulas endoteliais. Coletivamente, estes resultados sugerem que o cerebro pode se autorreparar atraves da produpao de DV e que isto pode ser explorado terapeuticamente.
[00073] Para demonstrar a utilidade de terapia de DV para PAS, endotelina-1 foi usada para induzir oclusao de arteria cerebral media (MCAo) de acidente vascular cerebral em ratos de 7 dias de idade. Os animais entao recebem 0,5 mg/kg de injepao intraperitoneal de DV esteril ou controle de veiculo de PBS 24 e 72 horas apos acidente vascular cerebral. Conforme a angiogenese penumbral de pico (a area que circunda imediatamente o tecido de acidente vascular cerebral) inicia apos 3-7 dias, a vasculatura dos cerebros de acidente vascular cerebral foi examinada 5 dias apos acidente vascular cerebral. Existe hipervascularidade na superficie do cortex do acidente vascular cerebral em animais tratados com DV que nao foi evidente no cortex contralateral ou em animais tratados com PBS de acidente vascular cerebral (figuras 6A-6B). Alem disso, imunomanchamento de sepbes de tecido congeladas destes cerebros com o marcador de vaso de sangue de fator de von-Willebrand revelou vasculatura penumbral de acidente vascular cerebral significantemente aumentada em animais tratados com DV conforme comparado a controle tratado com PBS (figuras BABB). Coletivamente, estes resultados sugerem que DV pode aumentar pos-PAS angiogenese.
[00074] Tecido de cerebro foi analisado por imuno-histoquimica para detectar DV administrado (etiqueta de epitope de HIS no c-terminal de DV recombinante), bem como vasos sanguineos (fator de von Willebrand) para determinar se DV administrado pode ser detectado em tecido de cerebro de acidente vascular cerebral e onde ele pode se localizar. A Figura 7 demonstra que DV administrado pode ser encontrado em abundancia em tecido de cerebro de acidente vascular cerebral e a uma menor extensao no cortex de peri-infarto, mas nao no cortex de nao acidente vascular cerebral contralateral do mesmo animal. Alem disso, virtualmente todo DV administrado depositado em uma distribuigao perivascular no cortex de peri-infarto e o tecido de acidente vascular cerebral a uma menor extensao, consistente com seus efeitos de promopao de vaso sanguineo do cerebro e sua capacidade para perivasculatura de tumor solido alvo ativado in vivo. Importantemente, isto sugere que DV e capaz de cruzar a barreira de sangue cerebro, pelo menos regioes albuminais perivasculares distantes, via um mecanismo ainda desconhecido, onde pode ser exposto a e exercer efeitos em outros tipos de celula tais como astrocitos e neuronios. A figura 8 demonstra um resultado similar por analise de western blot de lisatos obtidos a partir do acidente vascular cerebral e cortex contralateral de um PBS e DV tratado de animal com acidente vascular cerebral, respectivamente.
[00075] Para determinar se terapia de DV pode afetar a extensao de neuroblastos que migram no tecido de cerebro de peri-infarto, conforme definido como uma area do cerebro imediatamente adjacente a tecido de cerebro infartado, e influencia, desse modo, a repopulaqao de tecido de cerebro de acidente vascular cerebral com novos neurdnios, imunohistoquimica de dupla cortin foi usada (figura 9A) de seqoes de cerebro de um PBS e DV tratado de animal com acidente vascular cerebral e quantificado o numero medio de pixels de dupla cortin per campo de alta energia (HPF, n=20 imagens per animal) no respective tecido de periinfarto de acidente vascular cerebral. Um aumento significante em pixels positives de dupla cortin no animal tratado com DV foi notado. Alem disso, parece acordado com a hipotese que a formaQao adota DV do nicho neurovascular, uma percentagem significantemente (p<0,001) maior de celulas positivas de dupla cortin identificadas foi notada na proximidade imediata para vasos sanguineos, conforme identificado por anticorpos direcionados para anticorpo de von Willebrand ou anticorpo de HIS (figura 9B) no animal tratado com DV (90% +/5%, n=20 imagens por animal) conforme comparado ao controle tratado com PBS (60% +/3%) no tecido de cerebro de peri-infarto.
[00076] Pela adoqao de formaQao do nicho neurovascular atraves dos efeitos em celulas endoteliais do cerebro, conforme sugerido pelos resultados acima, DV pode ser neuroprotetor, intensifica neurogenese e migraQao neuronal. Alem disso, se DV cruza a barreira sangue cerebro, ele pode tambem ter efeitos diretos nos neuronics. Se DV pode ter efeitos neuronals diretos que podem ser consistentes com seu potencial terapeutico para acidente vascular cerebral foi determinado. Para esta finalidade, neurdnios corticais primaries de camundongo de camundongos C57BI6 de 15 dias foram isolados usando-se tecnica de dissecapao esteril de rotina para isolamento primario prestando atenpao particular para remover meninges e um ensaio de migrapao in vitro foi realizada com estas celulas.
[00077] Antes do uso, a identidade neuronal foi confirmada com imunocitoquimica de TUJ-1. Uma camara modificada de Boyden (NeuroProbe, Gaithersburg, MD) em que os neuronios (3x103/popo) foram carregados na camara superior ± pre-incubapao por 30 minutos no meio livre de soro apropriado com 100 nM ou 200 nM de DV em suspensao a 37° C, e, em seguida, permitido migrar atraves de uma membrana de policarbonato revestida com colageno tipo I em direpao ao fator de crescimento de nervo de quimioatraente (NGF, 4 nM por popo inferior) por 8 horas a 37°C. A membrana (contendo celulas de migrapao) foi, entao, fixada com acetona, e as celulas manchadas com cristal de violeta (Sigma) e contadas sob o microscopic. A figura 10 mostra que DV intensifica migrapao de neuronio cortical por demonstrapao que tratamento com DV significantemente, e em um modo dependente da dose, migrapao neuronal cortical intensificada para NGF (p<0,0001 para ambas concentrapoes de DV), sugerindo que DV pode ter efeitos terapeuticos diretos nos neuronios. Terapia de DV aperfeicoa resultados funcionais de acidente vascular cerebral
[00078] A figura 11 mostra que de pos-acidente vascular cerebral de 3 dias em avanpo, nao existe diferenpa estatistica entre controles de simulapao e animais tratados de Dominio V de acidente vascular cerebral. Os animais tratados com Dominio V foram tratados com 0,5 mg/kg no pos-acidente vascular cerebral nos dias 1, 3, 5, 7.
[00079] Os resultados aqui in vivo sugerem que tratamento com DV favorece reparo de cerebro neurovascular que pode ser devido, em parte, a liberaQao induzida por DV de fatores de promopao neurovascular tais como fator neurotrofico derivado do cerebro (BDNF). A figura 12A demonstra que apos 24 horas, DV intensifica significantemente (** p = 0,0025) liberaQao de BDNF de celula endotelial microvascular do cerebro. Similarmente, o tratamento com DV de posacidente vascular cerebral resultou em um aumento significante em niveis de BDNF de cerebro de acidente vascular cerebral (figuras 12B12C) em pos-acidente vascular cerebral de 3 e 7 dias, conforme comparado a controles tratados com PBS. Alem disso, nenhum efeito nos niveis de BDNF foi visto com adiQao de DV a astrocitos ou neuronios corticais de rato isolado primario sugerindo que efeitos de DV em niveis de BDNF de cerebro in vivo podem ser principalmente celula endotelial de cerebro mediada.
[00080] A medida que as celulas endoteliais microvasculares do cerebro nao expressam o receptor de DV a2pi integrina anteriormente identificado, o efeito pro-angiogenico de DV nas celulas endoteliais do cerebro podem ser devido a ambos a ausencia de a2pi e a presenQa de um receptor de DV pro-angiogenico distinto. a5pi e critica para desenvolvimento vascular e promove angiogenese de cerebro de posacidente vascular cerebral, mas e, de outro modo, regulada abaixo no cerebro mature ate reexpressa em celulas endoteliais do cerebro apos hipoxia. Uma variante monomerica da angiogenese que promove fator de crescimento angiopoetin 1 se liga a e promove estabilizaQao vascular, via a a5p1 integrina, enfatizando adicionalmente esta importancia do receptor em angiogenese e remodelagem vascular.
[00081] Foi primeiro determinado se ativagao especifica da a5pi integrina pode afetar niveis de BDNF. A figura 12A demonstra que o tratamento de celula com um anticorpo a5b1 que reconhece especificamente o dominio de ligaQao de ligante a5, foi, por si, capaz de aumentar liberaQao de BDNF. Alem disso, SNAKA51, um anticorpo que ativa a a5pi integrina por ligagao a uma regiao fora do dominio de ligaQao de ligante e, desse modo, originando a5pi que se liga a ligante, aumentam significantemente os niveis de BDNF (p = 0,0007). Interessantemente, a adiQao simultanea de anticorpo a5pi e liberaQao de BDNF inibida por DV, enquanto adiQao simultanea de DV e SNAKA51 aumentam adicionalmente os niveis de BDNF (p = 0,06). Isto e consistente com a hipotese que a liberaQao de BDNF aumenta o DV por ligaQao ao dominio de ligaQao de ligante de a5.
[00082] Se adesao de celula endotelial microvascular de cerebro a DV pode depender de a5pi foi examinada por demonstraQao que anticorpo de a5pi direcionado contra o dominio de ligaQao de ligante de a5 pode prevenir sua adesao a DV imobilizado (figura 12A). Por ELISA com a5b1 integrina recombinante, foi demonstrado que DV se liga a a5pi em um modo dependente da dose com uma Kd de aproximadamente 30 nM (figura 13B). Para adicionalmente ligar efeitos pro-angiogenicos de DV com a5p1, foi demonstrado que migraQao de celula endotelial de cerebro em direQao ao DV pode ser inibida por ambos fibronectina-GST e a5pi-GST soluvel (figura 13C). Alem disso, o peptideo de ligaQao de a5pi CRRETAWAC (SEQ ID N°: 3) pode inibir significantemente (p = 0,001) efeitos de DV na formaQao de tubo de celula endotelial in vitro (figuras 13D-13E).
[00083] Para determinar se DV aumenta a angiogenese do cerebro em parte pelo aumento de expressao de celula endotelial de cerebro de a5p1, tratamento com DV de monocamadas de celula endotelial de cerebro confluentes por 8 horas mantem niveis de proteina total de a5pi que, de outro modo, diminui significantemente nas condiQoes de controle livre de soro (figura 13F). Alem disso, o tratamento com DV de celulas endoteliais do cerebro crescidas em plastico redistribui significantemente a5pi integrina a superficial lamellipodia (figura 13G), mas nao tinha efeito na expressao de superficie de a501 em astrocitos ou neuronios corticais primarios. Por ultimo, para determinar se DV pode tambem afetar os niveis de a5p1 integrina in vivo, analise de western blot de lisato de cerebro a partir do acidente vascular cerebral e hemisferios contralaterais de animais com pos-acidente vascular cerebral de 3 dias +/tratamento com DV foram realizados (figura 13H) e observados significantemente mais a501 integrina em tecido de cerebro de acidente vascular cerebral tratados de animais tratados com DV (p = 0,00004, quantificagao nao mostrada). Coletivamente, estes resultados sugeriram que DV se liga a, afeta a expressao de, e exerce seu efeito pro-angiogenico, via a a501 integrina. a2B1 integrina reverte atividade de proliferacao de celula de DV
[00084] A adigao de a201 integrina a celulas endoteliais do cerebro de camundongo C57 reverte a atividade proliferativa da celula de Dominio V. A medida que DV e antiangiogenico em muitas celulas endoteliais que expressam ambas a2pi integrina (receptor antiangiogenico) e a5pi integrina (receptor pro-angiogenico), foi contemplado que DV e antiangiogenico nestas celulas devido a sua afinidade aumentada para a2pi integrina (Kd ao redor de 30 nM) sobre a5pi integrina (Kd 160 nM). a2p1 integrina foi transfectado em celulas endoteliais microvasculares de cerebro de camundongo que nao expressam normalmente este receptor. Isto foi efetuado por transfecgao com um vetor de plasmideo (pEGFP-N2, Clontech) contendo uma sequencia que codifica a a2-subunidade integrina com uma proteina de fusao de RFP C-terminal (Texas A&M University Biomedical Engineering), vetor vazio foi usado como um controle. As celulas foram permitidas se recuperarem durante 24 horas em meio nao contendo antibidticos. A eficiencia de transfecpao foi apreciada apos 24 horas usando-se um microscopic fluorescente invertido. A proliferapao da celula foi avaliada apos 48 horas em meio livre de soro com solupao de MTS (Promega, Madison, Wl) seguindo as instrupoes do fabricante. DV aumenta a proliferapao de celulas endoteliais do cerebro de camundongo, conforme comparado ao controle de meio de celula, que pode ser bloqueada pela adipao de anticorpo de neutralizapao de VEGF ou anticorpo de bloqueio de funpao de a501 integrina (figura 14A). A adipao de a201 integrina as celulas suprime preferivelmente do que aumenta o crescimento das celulas demonstrando que a adipao de a2pi integrina as celulas endoteliais do cerebro de camundongo converte DV de ser proliferative a antiproliferative. As barras sao valores medios +/desvio padrao (figura 14B). **p<0,01. ##p<0,01.
[00085] Ensaios de ligapao foram efetuados usando-se um biossensor otico (lAsys; Affinity Sensors, UK) conforme descrito (17). Em breve, para ligar covalentemente o dominio A5, designado como um aceitador, nas superficies de um sensor, os grupos carboxilato presentes na superficie foram ativados por injepao de uma mistura 1:1 de 0,1 M de N-hidroxisuccinimida e 0,4 M de A/-Etil-3-(3dimetilaminopropil) carbodi-imida (Pierce). O aceitador dissolvido em salina tamponada por fosfato (PBS) foi entao permitido se ligar a superficie ativada ate que uma placa de resposta foi alcanpada. Os grupos ativos residuals foram bloqueados por uma injepao de 100 pL de Tris-HCI 1 M (pH 8,5).
[00086] Um tubo com A5 imobilizado foi originado com o tampao de ligapao (150 mM de NaCI, 25 mM de Tris-HCI, pH=7,4, e 1 mM de MnCh) a 25°C por 10 minutos. Uma amostra de 100 pL contendo interagente livre de DV dissolvido no tampao de ligapao foi adicionado ao tubo, e entao a fase de associapao foi registrada. Subsequentemente, a amostra foi removida, tampao livre de analito foi adicionado ao tubo, e a fase de dissociapao foi registrada. Apos cada ensaio, a superficie do tubo foi regenerado por uma breve lavagem com 100 mM de glicina, pH = 4, seguido por equilibrio com o tampao de ligaQao. Durante ciclos de regerapao atenpao foi prestada para completar a remopao do analito ligado a superficie, e a lavagem continuada ate de uma resposta igual a um valor de linha base foi alcanpado.
[00087] Para ensaios de ligaQao, DV livre foi adicionado a concentrapoes variando de 8,0 x 10'8 M a 4,0 x 10'7 M. Os dados do biossensor foram analisados pelo metodo de ajuste total, conforme descrito (18). Para cada ensaio, as constantes de taxa de associapao (kOn) e as constantes de taxa de dissociapao (k0/r) foram obtidas, e os valores das constantes de dissociapao de equilibrio (K<y) foram calculados de uma proporpao de k0^k0/1. Em adipao, o controle de ligapao de albumina de soro bovino (BSA) na concentrapao molar de 8,0 x 10-7 (dupla da concentrapao mais alta para DV foi tambem realizada). Conforme mostrado na Tabela 1, DV se liga a a501 integrina.
[00088] Estes estudos demonstram que o inibidor derivado de matriz extracelular de angiogenese, perlecan DV, e estavelmente e cronicamente gerado no cerebro danificado de acidente vascular cerebral. Muito inesperadamente, o DV administrado intensifica prefer!velmente do que inibe angiogenese do cerebro in vitro e in vivo. O DV para acidente vascular cerebral e tecido de cerebro de peri-infarto intensifica a formapao de nicho neurovascular, devido a pelo menos em parte a liberapao intensificada de BDNF, e por ultimo aperfeipoa o resultado motor funcional a niveis de pre-acidente vascular cerebral de linha base em endotelin-1 e modelos de acidente vascular cerebral de tandem ipsilateral CCA & MCA em rates e camundongos, respectivamente. Finalmente, DV intensifica angiogenese de celula endotelial do cerebro, na ausencia da a201 integrina, via a a5p1 integrina.
[00089] Perlecan, sintetizado e secretado pelos neuronios, astrocitos, e celulas endoteliais, induzidos nas ultimas por VEGF165, tem a distinpao de ser o mais sensivel e rapidamente processado componente de matriz apos acidente vascular cerebral. A proteolise de perlecan por catepsin L ocorre dentro de 2 horas da oclusao da arteria cerebral media em primatas nao humanos e persiste por varios dias. O processamento sustentado de perlecan por dias apos acidente vascular cerebral e consistente com estudos demonstrando um aumento na produpao de perlecan em neuronios e astrocitos apos dano do cerebro. No presente estudo, existe um rapido aumento em niveis de perlecan DV que aumenta gradualmente a um nivel elevado sobre o curso de sete dias, um modelo temporal que se correlaciona bem com 0 perfil de proteolise de perlecan de pos-acidente vascular cerebral de primata nao humano.
[00090] A capacidade de um fragmento de matriz extracelular antiangiogenica promover angiogenese do cerebro pode ser devido ao conceito de heterogeneidade endotelial, pelo que celulas endoteliais em leitos vasculares diferentes, neste caso cerebro versus nao cerebro, respondem diferentemente a fatores angiomodulatorios. Esta resposta diferencial pode ser devido a diferenpas nos respectivos microambientes, diferenpas em receptores expresses, tai como a presenpa ou ausencia de a201 integrina, ou diferenpas em componentes de transdupao de sinal. Adicionalmente, o inibidor derivado de colageno tipo XVIII de angiogenese, Endostatin, promove angiogenese em celulas endoteliais imaturas derivadas de celulastronco embridnicas diferenciadas que dao a possibilidade que funQao endotelia de cerebro angiogenica ou torna-se similar a endotelia imatura. De fato, endotelia de cerebro angiogenica recente suporta uma comutaQao de receptor integrina apos hipoxia do cerebro de receptores integrina maturos de volta para desenvolvimento de expressao de integrina, particularmente, a a5pi integrina.
[00091] A expressao intensificada de pos-acidente vascular cereb ral de a5pi integrina pode tambem explanar capacidade de DV em abrigar o acidente vascular cerebral e vasculatura de cortex de peri-infarto apenas como vasculatura de tumor que expressa a2p1 suportada por DV-alvo in vivo. Adicionalmente, a proteolise quase imediata de posacidente vascular cerebral de perlecan e geraQao de DV pode servir como parte do disparador do comutador de receptor de integrina. Este e suportado pela observaQao que DV aumenta expressao total de a5pi integrina em celulas endoteliais do cerebro in vitro e niveis de a5b1 integrina em tecido de cerebro de pos-acidente vascular cerebral.
[00092] A presente invenção tambem mostra que DV estimula liberaQao de BDNF. BDNF e ambos pro-angiogenico, neuroprotetor, e estimula migraQao neuronal e renovapao de celula-tronco neural. BDNF e cntico para recuperaQao induzida por reabilitaQao apos acidente vascular cerebral em ratos.
[00093] A isquemia cerebral focal causa o rompimento da barreira sangue-cerebro que e manifestada como uma perda na integridade microvascular e vazamento de constituintes de plasma no espaQO extravascular. Alem disso, a prevenQao de aumentos precoces na permeabilidade pode ser benefica para resultado de dano. nDV pode realizar esta funQao e talvez ainda aperfeiQoar a funQao de barreira dentro desta estrutura de tempo reduzindo, desse modo, o grau de dano. Intrigantemente, o mesmo processo proteolitico que quebra a matriz extracelular vascular e contribui diretamente para vazamento vascular de acidente vascular cerebral agudo tambem gera DV, sugerindo que acidente vascular cerebral-proteolise de matriz vascular induzida nao e completamente nocivo. Permeabilidade subsequente induzida por DV apos 8 horas pode indicar um papel na remodelagem vascular precoce que contribui para um rapido reestabelecimento de um estado constants para distribuigao de oxigenio. Notavelmente, o aumento induzido por DV na permeabilidade microvascular precede a segunda fase de 24-48 horas de vazamento de barreira vista em modelos de acidente vascular cerebral emprestando peso a esta possibilidade.
[00094] Devido a ser demonstrado que DV pode diminuir TEER em celulas endoteliais do cerebro in vitro, um efeito de potencialmente afligir o efeito de pos-acidente vascular cerebral onde a permeabilidade da barreira sangue cerebro ja e negativamente impactada, foi determinado se DV tinha qualquer efeito na permeabilidade da barreira sangue cerebro in vivo.
[00095] [3H]manitol (14.2Ci/mmol) e [14C]sacarose (412mCi/mmol) foram comprados de Moravek Biochemicals (USA). Os quimicos remanescentes foram comprados de Sigma Chemical Company (UK). Os camundongos foram adquiridos por Harlan, UK.
[00096] Todos os experimentos foram realizados dentro das linhas guia dos Animals Scientific Procedures Act (1986, UK). Camundongos adultos machos BALB/c (27,3±0,3g) e C57BI6 (27,9±0,6g) foram anestesiados (i.p. cloridrato de medetomidina (2 mg/kg) e cetamina (150 mg/kg)) e heparinisados (100 U, i.p.) e a tecnica de perfusao de cerebro in situ realizada por canulapao do ventriculo esquerdo do coraQao e seccionamento do atrio direito conforme descrito por Sanderson et al., 2007. O plasma artificial contem [3H]manitol (35,2nM; 182Da; raio=3,6A) e [14C]sacarose (1,1 mM; 342Da; raio 4.6A) e perfusao foi por 10 minutos. Apos o qual o animal foi decapitado e regioes do cerebro (cortex frontal, cortex ocipital, nucleo caudato, hipocampo, hipotalamo, talamo, cerebelo, ponte) tomadas para contagem de cintilagao liquida. A quantidade de radioatividade do tecido foi expressa como uma percentagem daquela no plasma artificial plasma e denominado RTecido% (ml. 100g-1). Aos grupos separados de camundongos foram dados DV (1 mg/kg) dissolvido no veiculo de PBS e o procedimento de perfusao de cerebro in situ realizado a 2,8 e 24 horas pos-injegao. Estes grupos experimentais foram comparados a animais que tinham recebido veiculo somente. O efeito de DV no teor de agua no cerebro (giro central anterior) foi tambem examinado nos pontos de tempo estudados. Dois Way ANOVA ou Um Way ANOVA foi aplicado aos dados usando-se pacote de software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc.).
[00097] Na cepa BALB/c, o espago vascular em todas as regioes do cerebro conforme medido por [14C]sacarose e [3H]manitol nao foi significantemente afetado 8 ou 24 horas apos uma injegao intraperitoneal de DV (1 mg/kg, figura 15A). Alem disso, o teor de agua no cerebro foi 73,3±1,3% a 0 hora e nao foi significantemente afetado (64,6±3,4%) 8 ou 24 (72,8±2,9%) horas pela injegao intraperitoneal de DV (1 mg/kg) (Um Way ANOVA). Na cepa C57BI6, o espago vascular nas regioes de cerebro, conforme medido as por [14C]sacarose e [3H]manitol, nao foi significantemente afetado 2 horas apos uma injegao intraperitoneal de DV (1 mg/kg, figura 15B).
[00098] As seguintes referencias sao citadas aqui. 1. Ohab et al. J Neurosci, 26:13007-16 (Dec 13, 2006). 2. Mundel etal. Microvascular Research, 74:85-9 (2007). 3. Bix et a/.,Trends Cell Biol, 15:52-60 (2005). 4. Bix et al. J Natl Cancer Inst, 98:1634-46 (2006). 5. Bix etal. J Cell Biol, 166:97-109 (2004). 6. Schallert etal. Adv. Neurol. 73:229-238 (1997). 7. O'Reilly etal., Cell, 88:277 (1997). 8. Sapatino etal. In Vitro Cell Dev Biol, 29A:923-8 (1993). 9. Bix etal. Blood, 109:3745-8 (2007). 10. Asou etal. Neuroscience Letters, 144:221-4 (1992). 11. Fukuda etal. Stroke, 35:1364-70 (Apr. 1, 2004). 12. Auerbach etal. Clin Chem, 49:32-40 (Jan 1, 2003). 13. Bix etal. J Neurosci, 18:307-18 (Jan 1,1998). 14. Hirotsune etal. Nature Genetics, 19:333 (Aug 1998). 15. Milner etal. Stroke , 39:191-7 (Jan 1,2008). 16. Aronowski et al. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 19:652-60 (June 19, 1999). 17. Brittinlewsk, etal. J Biol Chem 280:191-198 (2005). 18. Myszka e Morton. Trends Biochem Sci, 22:149-150 (1998).
Claims (7)
1. Composiçao farmaceutica, caracterizada pelo fato de que compreende um dominio V de perlecan ou o fragmento LG3 do dominio V de perlecan, um composto de estatina selecionado de atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina e sinvastatina, e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitavel.
2. Composiçao farmaceutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que e para uso no estimulo ou no melhoramento da angiogenese cerebral, em que a referida composiçao farmaceutica e para ser administrada de forma oral, subcutanea, intravenosa ou intraperitoneal.
3. Composiçao farmaceutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que e para ser administrada em uma quantidade de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg do peso corporal do paciente.
4. Composiçao farmaceutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que e para uso no melhoramento da recuperaQao do AVC.
5. Composiçao farmaceutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que e para uso no estimulo da angiogenese pos-AVC e promoQao da formaQao do nicho neurovascular necessario para neurogenese pos-AVC e migraQao dirigida de neuroblastos.
6. Composiçao farmaceutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende o dominio V de perlecan.
7. Composiçao farmaceutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende o fragmento LG3 do dominio V de perlecan.
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