CN104208659A - 中风产生的血管发生增强剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及刺激或增强病人中血管发生的方法，包括将治疗有效量的endorepellin蛋白给药于所述病人，其中所述endorepellin蛋白具有基底膜蛋白聚糖的结构域V或其片段或衍生物，类似物的氨基酸序列；和刺激或增强血管的产生。本发明还涉及用于增强血管发生的组合物。
Description
本申请是发明人于2009年12月31日提交的题为“中风产生的血管发生增强剂及其用途”的中国专利申请200980157592.5的分案申请。
相关申请的交叉参考
本国际申请要求2008年12月31日提交的临时U.S.系列No.60/204,064的依据35U.S.C.§119(e)的优先权权益，该临时申请现已放弃，在此将其全部内容引入作为参考。
发明背景
发明领域
本发明总地涉及中风和血管发生的领域。更具体地，本发明涉及中风产生的血管发生增强剂及其用途。
相关领域的描述
中风的脑恢复是一个复杂的系统，涉及受损部位的血液供应(血管发生)和神经元(神经发生)的恢复。对于血管发生，可以早在12至24小时时发生内皮细胞增殖。这些新产生的细胞随后应答各种内皮细胞有丝分裂原(如血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血小板衍生的生长因子(PDGF))而移向缺血的脑区域，并在3-7天后在阻塞周围的皮层形成新的血管。然后血管发生持续至少21天。重要地，niaspan，一种提高啮齿动物中风后血管发生的药物，提高功能性中风恢复，这表明增强中风后大脑血管发生可以导致改善的中风结果。此外，由于脑脉管系统的独特特性，包括血脑屏障的形成、包埋在神经元-神经胶质环境中、不同的基质受体表达以及在发育后对血管发生的相关不应性，脑血管发生不同于非脑血管发生。
Ohab等(1)已经在啮齿动物中证明了中风后，迁移不成熟神经元(成神经细胞)与“神经血管小生境”中的重新塑造血管相关，该“神经血管小生境”与修复性血管发生和神经发生成因性相关。新产生的脉管系统通过产生各种生长因子促进神经发生，并且看来似乎用作新生神经元的支架，使神经元朝向阻塞组织迁移。除了使神经元和内皮细胞成熟，神经血管小生境含有血管发生过程中分泌并且活跃地重新塑造的胞外基质(ECM)，使细胞迁移和血管形态发生。一种这样的胞外基质成分，基底膜蛋白聚糖(perlecan)，是神经血管小生境必需的。小鼠中该物质的缺失，导致神经发生严重受损，这是由于提供支持神经发生的基底膜蛋白聚糖的神经元因子捕获的损失引起的。
中风过程中和中风后的基质重新塑造是脑受伤后修复的一个重要部分，并且修复进一步指向基底膜蛋白聚糖的重要性。在中风中，频死和浸润的炎症细胞释放基质金属蛋白酶(MMP)，其破坏血脑屏障，并且通过蛋白分解加工胞外基质。尽管胞外基质最初的加工和降解在很大程度上被认为是中风的负面结果，基质蛋白分解的一个结果是生物活性基质片段的产生。实际上，已知许多基质成分在其C-端区域带有生物活性基质片段，其可以抑制中枢神经系统外的血管发生(2-3)。基底膜蛋白聚糖具有中风后是最灵敏并且快速加工的基质成分的特点。在非人灵长类的脑中动脉阻塞2小时内产生基底膜蛋白聚糖蛋白分解，并且持续至少7天。
基底膜蛋白聚糖由五个结构域组成，各自具有与其他蛋白同源的序列。称为结构域V(DV或endorepellin)的基底膜蛋白聚糖的C-端片段由三个层粘连蛋白球状(LG)结构域组成，各自由两个表皮生长因子(EG)-样结构域隔开。结构域V及其LG3片段通常在人尿液、血液和脑脊髓液蛋白质组中找到。结构域V，通过结合α2β1整联蛋白的α2亚基，抑制非脑内皮细胞的几个血管发生功能，包括迁移和毛细管形态发生。结构域V与α2β1的相互作用似乎不同于导致相反结果的促血管发生(pro-angiogenic)胶原与α2β1的相互作用。在非脑来源的几种内皮细胞类型中，已经将结构域V表征为抗血管发生(4-5)。
尽管这样，现有技术缺乏血管发生增强剂。本发明满足了本领域中这种长期存在的需求。
发明概述
本发明显示结构域V增强了脑血管发生以及神经血管小生境中的内皮细胞和神经元之间的相互作用。结构域V与α5β1整联蛋白相互作用，影响α5β1整联蛋白的细胞分布并通过α5β1整联蛋白发挥其促血管发生作用。这些观察结果与缺乏结构域V抗血管发生α2β1整联蛋白的脑内皮细胞表达一致，并且与脑血管发生的调控不同于脑外的血管发生的概念一致。因此，本发明显示出中风后通过基底膜蛋白聚糖的提高和持续的蛋白分解产生的结构域V刺激中风后的血管发生，促进中风后神经发生和所控制的成神经细胞迁移需要的神经血管小生境的形成，并因此是脑自我修复基质的组成部分，可以在治疗上开发用于提高中风恢复。
在本发明的一个实施方案中，提供了刺激或增强病人中血管发生的方法，其包括将治疗有效量的endorepellin蛋白给药于所述病人，其中所述endorepellin蛋白具有基底膜蛋白聚糖的结构域V或其片段或衍生物、类似物的氨基酸序列；并且刺激或增强血管的产生。
在本发明的另一个相关实施方案中，提供了刺激或增强病人中血管发生的方法，包括将治疗有效量的内皮抑制素蛋白，或其片段或衍生物、类似物给药于所述病人；并且刺激或增强血管的产生。
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含基底膜蛋白聚糖的结构域V或其片段或衍生物、类似物，抑制素和可药用的载体或赋形剂的药物组合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含内皮抑制素或其片段或衍生物、类似物，抑制素和可药用的载体或赋形剂的药物组合物。
附图简述
在此已经包括附图，使得本发明的上述特征、优点和目的将变得清楚，并且可以详细了解。这些图形成说明书的一部分。然而，需要注意的是附图说明了本发明的优选实施方案，并且不应当认为限制本发明的范围。
图1A-1B显示出中风引起脑结构域V水平提高。使Harlan SpragueDawley大鼠接受内皮缩血管肽-1的立体定位注射，使大脑中动脉(MCAo)阻塞。用氯胺酮和甲苯噻嗪将大鼠麻醉，此后将头盖骨暴露，并且在左侧相对于前囟前面+0.9mm、侧面+3.4mm的立体定位坐标处钻小孔，并且离硬脑膜表面深度为8.5mm，注入3ml内皮缩血管肽-1(1mg/ml，American Peptide Company，CA)。图1A：中风后7天，来自相同单只大鼠的中风(2)和未中风(1)大脑半球的结构域V和GAPDH(负荷对照)的代表性Western印迹。中风的大脑半球比未中风的半球含有更多的(p<0.0001)结构域V(85kDa条带)及其LG3(26kDa条带)成分，如根据GAPDH进行标准化，并通过图1B中的光学密度测定来分析的(所示的DV)。
图2A-2B显示了结构域V增强了脑内皮细胞毛细管形成。图2A：将在细胞培养器(NuAire，Plymouth，MN)中在含有10％胎牛血清、10mg/ml肝素和50ng/ml酸性FGF的Dulbecco’s改性Eagle培养基(DMEM)中常规生长和传代的大鼠脑内皮细胞(8)加入Matrigel包被的孔中±用结构域V预孵育±功能阻断a5b1抗体(10mg/ml)预孵育30分钟。图2B：9小时后，结构域V处理的细胞比对照形成更多的(**p<0.0001)管，其反过来由抗a5b1抗体显著阻断(*p<0.001，与DV处理相比较)。误差棒＝s.d.，n＝3次实验，HPF＝高倍视野。
图3显示了结构域V刺激脑内皮细胞毛细管形成以及与神经元的相互作用。将大鼠脑内皮细胞(红色，用抗-von Willebrand因子抗体染色的，Dako)加入小脑微粒神经元(granule neurons)层(绿色，用抗TUJ1抗体染色的，Dako)，然后用结构域V(300nM)或载体对照处理。在对照中，内皮细胞与神经元分离形成不同的岛，而结构域V处理导致神经元周围的毛细管形成。
图4显示了结构域V引起α5β1整联蛋白重新分布。用结构域V(300nM)或载体对照将层粘连蛋白上的脑内皮细胞处理2小时。然后将细胞固定，并免疫染色α5β1整联蛋白(绿色)和DAPI核复染(蓝色)，并通过共焦显微镜观察。结构域V处理导致α5β1重新分布到血管发生内皮细胞中常见的细胞表面突起(projection)。
图5显示了结构域V支持脑内皮细胞粘附。将脑内皮细胞±用α5β1功能性阻断抗体预孵育加入用1％BSA或结构域V包被的孔中，接着固定，染色和OD560分光光度测定。与BSA相比，显著更多的(#，p<0.001)脑内皮细胞粘附于结构域V，其随后通过加入a5b1功能阻断性抗体显著地(*p<0.001)得到抑制。n＝3。误差棒＝s.d.。
图6A-6B显示了围产期动脉局部缺血性脑卒中(PAS)后的结构域V处理增加了脑表面和中风半影脉管系统。通过立体定位注射内皮缩血管肽-1诱导7天龄的大鼠中短暂的大脑中动脉阻塞。然后在中风后24和72小时，使动物接受0.5mg/kg腹膜内注射无菌过滤的结构域V或PBS载体对照。中风后5天后，取出动物脑，并将中风脑表面脉管系统成像，接着是冷冻组织切片的von-Willebrand免疫组织化学，以分析半影脉管系统。结构域V处理导致脑表面血管过度增加，并且中风半影脉管系统显著(p<0.001)增加。
图7通过免疫组织化学显示了给予的结构域V位于中风和梗塞周围的组织。通过免疫组织化学加工来自用结构域V或PBS载体对照处理的中风动物的冷冻组织切片，使用针对von Willebrand因子的抗体和针对HIS表位的抗体，以分别观察血管和给药的结构域V。在中风的组织和中风梗塞周围的脑组织中，存在大量的结构域V。在此，结构域V以在血管周围分布的方式沉积。相反，在相同的结构域V处理动物的相应未中风对侧脑组织中未检测到结构域V，表明结构域V特异性存在于中风和梗塞周围的脑组织中。
图8通过Western印迹显示了给予的结构域V位于中风脑组织中。通过Western印迹，使用结构域V的抗体(检测内源性和给予的DV)、HIS的抗体(只检测给予的结构域V)和GAPDH蛋白负荷对照，分析了来自PBS或结构域V处理动物的中风同侧(I)脑组织或相应对侧(C)未中风组织的溶解产物。对于抗-结构域V和抗-HIS，显示了85kDa条带。根据GAPDH负荷对照进行标准化时，在PBS(p<0.001)和结构域V(p<0.00001)处理的动物中，与对侧组织相比较，在中风组织中显著地检测到更多的结构域V，由于给予的结构域V，在结构域V处理的动物中更是如此。只在来自用结构域V处理的动物的中风皮层的溶解产物中检测到通过抗-HIS抗体检测到的给予的结构域V。
图9A-9B显示了结构域V处理提高了梗塞周围的脑组织中新生神经元的数量。图9A：将冷冻组织切片对新生神经元标记双皮层蛋白进行免疫染色，并用Adobe photoshop将梗塞周围的脑组织中每个高倍视野(HPF，每个动物20个图象)中双皮层蛋白阳性像素的平均百分比定量，该脑组织来自PBS和结构域V处理的动物。在用结构域V处理的动物中检测到显著更多的双皮层蛋白像素(*＝p<0.0001)。图9B：显示出几个不同双皮层蛋白(绿色)阳性神经元的结构域V处理的动物的免疫组织化学与梗塞周围的血管密切相关，梗塞周围的血管与给药的结构域V密切相关，如使用抗-HIS抗体检测的(红色)。用DAPI将细胞核复染(蓝色)。
图10显示了结构域V增强了皮层神经元迁移。将来自胚胎15天的C57B16小鼠+/-用100nM或200nM结构域V预孵育30分钟的皮层神经元加入改良的Boyden Chamber(3×103/孔)的上部孔中，并使其穿过用I型胶原包被的聚碳酸酯膜朝向不含任何物质(迁移对照)或含有神经生长因子(NGF，4nM/孔)的底部孔迁移8h(37℃)。对于每个条件，N＝3。结构域V预孵育显著地并且以剂量依赖性的方式增强了皮层神经元迁移，表明其对神经元具有直接的、潜在的治疗作用。*＝p<0.001，**＝p<0.0001。棒是标准误差。
图11显示了结构域V提高了内皮缩血管肽-1动物中风模型中的功能/运动结果。将中风的动物或假外科手术的对照置于20cm直径×35cm高的透明的圆柱体中3min，以测试四肢的优先选择及其在每个前肢上支持重量的能力(6)。因为动物站立以探索环境，计数两边的爪子定位、损伤同侧(右侧)爪子的定位和损伤对侧爪子的定位的数量。将爪子接触(contacts)录像，随后进行分析。使用等式同侧接触/(同侧+对侧接触)×100来计算同侧四肢使用的百分比。每个处理组N＝5，比较中风的结构域V处理的和中风的PBS处理的，*p<0.05，**p<0.001。从中风后3天向前，在假对照和结构域V处理的中风动物之间没有统计学差异。在中风后1、3、5、7天，用0.5mg/kg处理结构域V处理的动物。
图12A-12B显示了结构域V对BDNF的作用。图12A：在24小时的过程中，来自脑内皮细胞+/-结构域V+/-α5β1(针对α5配体结合结构域)抗体+/-SNAKA51(α5β1激活抗体)的条件培养基的BDNF ELISA。这证明了结构域V(**p＝0.0025)、α5β1抗体(*p＝0.0001)和SNAKA51(#p＝0.0007)都显著提高了BDNF水平。同时添加α5β1抗体和结构域V形成了基线BDNF释放水平，而SNAKA51和结构域V进一步提高了BDNF水平，但这种提高不是统计学显著的(p＝0.06)。图12B：在中风后3天和7天，来自用PBS载体对照或结构域V处理的动物中的同侧中风脑组织的代表性BDNF的Western印迹。图12C：BDNF的Western印迹的量化，证明了在中风后3天和7天，结构域V处理与相应天数的PBS处理的动物相比较，中风后BDNF水平显著提高(*p＝0.006，**p＝0.0001)，来自3个所示的分开的Western印迹的平均值+/-标准误差。
图13A-13H显示了结构域V与α5β1整联蛋白相互作用，并通过α5β1整联蛋白发挥其促血管发生(pro-angiogenic)作用。图13A：固定化BSA(阴性对照)或结构域V+/-α5β1功能性阻断抗体(10mg/ml)的代表性脑内皮细胞粘附试验的量化证明了与BSA相比，结构域V显著支持更多的细胞粘附(**p＝0.00005)，这可被α5β1功能性阻断抗体显著地抑制(*p＝0.0007)。图13B：α5β1-DV ELISA证明了结构域V以剂量依赖性方式结合固定化的α5β1整联蛋白，具有大约30nM的Kd。还显示了吐温20阴性对照。图13C：朝向3％胎牛血清(对照)或DV+/-α5β1-GST或纤连蛋白-GST迁移的细胞的量化(根据阴性对照(无化学吸引剂(chemotractant))进行标准化)证明了结构域V是如同3％血清的强有力的化学吸引剂，其受到α5β1-GST(*p＝0.02)或纤连蛋白-GST(**p＝0.01)的显著抑制，误差棒是标准偏差。图13D：12小时后matrigel上，+/-结构域V+/-α5β1特异性结合肽CRRETAWAC(SEQ ID NO:3)的脑内皮细胞的代表性图象，证明了CRRETAWAC抑制了DV增强管样结构的形成。图13E：(图13D)中matrigel管实验的定量证明了CRRETAWAC显著抑制了(**p＝0.001)结构域V显著增强的(*p＝0.0003)管样结构的形成。图13F：8小时内+/-结构域V的血清饥饿的汇合脑内皮细胞的代表性a5b1和GAPDH负荷对照的Western印迹，证明了对照中完整细胞α5β1水平在8小时内降低，而结构域V维持了α5β1水平。图13G：脑内皮细胞的a5b1免疫细胞化学证明了结构域V暴露将α5β1定位从平均的细胞分布转移至表面/板状伪足。图13H：中风后3天来自PBS和结构域V处理的动物的脑组织的中风(I)和对侧(C)以及相应的GAPDH负荷对照的代表性Western印迹证明了用结构域V处理显著提高了总的中风脑α5β1的水平。
图14A-14B显示了α2β1对C57细胞中的DV细胞增殖活性的作用。图14A：与细胞培养基对照相比，DV提高了小鼠脑内皮细胞的增殖，其可以通过加入VEGF中和抗体或α5β1整联蛋白功能性阻断抗体来阻断。图14B：将α2β1整联蛋白加入细胞中抑制了而不是提高了细胞的生长。棒是平均值+/-标准偏差(图14B)。**p<0.01。##p<0.01。
图15A-15B显示了DV对Balb/c(图15A)和C57B16(图15B)株系的小鼠中血管间空间的作用。图15A：在BALB/c株系中，在DV缺失(0小时对照)和存在(8和24小时)下测量的[3H]甘露醇和[14C]蔗糖R组织值。允许区域中差异作用后，对于[3H]甘露醇和[14C]蔗糖的三个实验组之间的差异不高于偶然所预期的(*P>0.05；Two Way ANOVA)。每个组n＝4。平均值±SEM。图15B：在C57B16株系中，在DV缺失(0小时对照)和存在(2小时)下测量的[3H]甘露醇和[14C]蔗糖R组织值。对于[3H]甘露醇和[14C]蔗糖的实验组之间的差异不高于允许区域中差异作用后通过机会预期的(*P>0.05；Two Way ANOVA)。每个组n＝5。平均值±SEM。
发明详述
权利要求和/或说明书中，词语“一个(a)”和“一个(an)”结合术语“包含(comprising)”使用时，可以表示“一个(one)”，但也符合“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的意思。本发明的一些实施方案可以由一个或多个本发明的要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由一个或多个本发明的要素、方法步骤和/或方法组成。考虑了在此所述的任何方法或组合物可以关于在此所述的任何其他方法或组合物来进行。
权利要求中术语“或”的使用用来表示“和/或”，除非明确指出只表示替换方案或替换方案是互相排除的，尽管公开内容支持只表示替换方案和“和/或”的定义。
本发明提供了刺激或增强病人中血管发生的方法，包括将治疗有效量的endorepellin蛋白给药于所述病人，其中所述endorepellin蛋白具有基底膜蛋白聚糖的结构域V或其片段或衍生物、类似物的氨基酸序列；并且刺激或增强血管的产生。优选，基底膜蛋白聚糖的结构域V的片段具有与基底膜蛋白聚糖的结构域V至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。可以通过本领域技术人员容易确定的任何有用的方法来给药基底膜蛋白聚糖的结构域V或其片段或衍生物、类似物。此外，可以以约0.1mg/kg至约10mg/kg病人体重的含量来给药基底膜蛋白聚糖的结构域V或其片段或衍生物、类似物。通常，给药导致神经元内脑内皮细胞毛细管形成和/或脑内皮细胞中促血管发生α5β1整联蛋白提高的表达。
本发明还提供了刺激或增强病人中血管发生的方法，包括将治疗有效量的内皮抑制素蛋白，或其片段或衍生物、类似物给药于所述病人；和刺激或增强血管的生成。优选，内皮抑制素的片段具有与内皮抑制素至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。通常，本领域技术人员能够容易地衍生有用的片段或衍生物。可以通过本领域技术人员容易确定的任何有用的方法来给药内皮抑制素或其片段或衍生物、类似物。通常，可以以约0.1mg/kg至约10mg/kg病人体重的含量来给药内皮抑制素或其片段或衍生物、类似物。给药导致神经元内脑内皮细胞毛细管形成。
本发明还提供了药物组合物，其包含基底膜蛋白聚糖的结构域V或其片段或衍生物、类似物，抑制素化合物和可药用的载体或赋形剂。
本发明还提供了药物组合物，其包含内皮抑制素或其片段或衍生物、类似物，抑制素化合物和可药用的载体或赋形剂。
本发明还提供了药物组合物，其包含内皮抑制素或其片段或衍生物、类似物，抑制素和可药用的载体或赋形剂。
在此公开的组合物可以单独给药或结合另一种药物或化合物来给药。这样的药物或化合物可以与在此公开的组合物同时或依次给药。与组合物共同给药的作用是降低了已知的对抗待治疗疾病具有至少最小药物或治疗效果通常需要的药物或化合物的剂量。
在此公开的组合物和药物或化合物可以通过本领域已知的任何方法，例如，皮下、静脉内、非肠道、腹膜内、皮内、肌内、局部、肠、直肠、鼻、颊、阴道或通过吸入喷雾，通过药物泵或经皮贴或植入物内所含的，独立地全身或局部给药。在此所述的组合物的剂型可以包含适于给药方法的常规无毒的、生理上或可药用的载体或介质。
在此公开的组合物和药物或化合物可以一次或多次独立地给药，以实现、维持或提高治疗效果。确定剂量或组合物和药物或化合物中的一种或两种的合适剂量是否包括单次给药剂量或多次给药剂量在本领域技术人员的能力范围内。
如本领域公知的，对于任何特定病人产生的这些组合物的特定剂量水平取决于各种因素，包括所用的特定化合物的活性、年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合和进行治疗的特定疾病的严重程度。负责给药的人员将给个体患者确定合适的剂量。此外，对于人给药，制剂应当满足无菌、致热性和纯度标准，如FDA办公室的生物标准所要求的。
将本发明的组合物给药于病人或患者将遵循脑血管疾病或失调治疗中所施用疗法的一般方案，考虑组合物中和/或联合治疗实施方案中的成分的毒性(如果有的话)。预期按照需要可以重复治疗循环。还考虑了各种标准疗法，以及外科手术干预可以结合所述疗法来使用。
如本领域技术人员所知的，在此所述的组合物可以与任何已知的可药用的载体一起给药。此外，可以通过任何已知的给药途径，如皮下、鼻内或粘膜，来给药组合物。此外，可以通过进行本领域技术人员已知的实验来确定待给药的组合物的剂量。
给出以下的实施例，用于说明本发明的各种实施方案，并且不是表示以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到本发明非常适于进行目标并获得提及的终点和优点，以及在此固有的那些目的、终点和优点。本领域技术人员将清楚由权利要求范围所限定的本发明精神内包括的变化和其他用途。
实施例1
内皮细胞
人脐静脉(HUVEC)和脑微血管内皮细胞各自购自Lonza(Basel，瑞士)和Cell Systems(Kirkland，WA)，并且按照供应商的说明传代。小鼠和大鼠脑微血管内皮细胞由Jane Welsh，Texas A&M大学提供，并且按照所述的(5)传代。
实施例2
结构域V和内皮抑制素
人内皮抑制素购自Cell Sciences，Inc.(Canton，MA)和SigmaChemical(St.Louis，MO)。将结构域V(DV)克隆至载体pSecTag2A(Invitrogen，Carlsbad，CA)中并通过C-端6XHis标签和Ni-ATA琼脂糖珠(Qiagen，Valencia，CA)柱色谱从转染的293FT(ATCC，Manassasa，VA)细胞纯化。通过SDS-PAGE和Western印迹，用抗-DV(R&D systems，Minneapolis，MN)和抗-his抗体(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)，证实了透析的DV(相对PBS)纯度。将之前证明的DV的抗-血管发生浓缩物(250nM)和内皮抑制素(600ng/ml)以及热灭活对照(100℃，30min)的三十分钟预处理用于所有实验。对于所述的实验，N＝15(5个分开的实验，每个条件重复进行三次)。对于所有实验，通过Student’s未配对t-检验，使用Sigmastat软件包，测定了统计学显著性(p<0.05)。
实施例3
体内中风模型中的内皮缩血管肽-1大脑中动脉
使Harlan Sprague Dawley大鼠(n＝10)接受大脑中动脉阻塞立体定位外科手术，使用内皮缩血管肽-1(Amercian Peptide Company，Sunnyvale，CA)或PBS注射。在外科手术后3或7天将大鼠处死，并且对大脑组织进行处理，用于结构域V和GAPDH的Western免疫印迹分析。
实施例4
体外血管发生试验
按照所述的(7)进行了Matrigel实验。在12-18hr后，将细胞成像，并使用Adobe Photoshop CS将管形成量化(管像素/高倍视野，每个条件10个区域)。按照制造商的说明，用改良的Boyden Chamber(NeuroProbe，Gaithersburg，MD)来确定细胞迁移。在6-8小时后，测定穿过I型胶原包被的聚碳酸酯膜朝向无血清培养基+/-3％胎牛血清的迁移。按照制造商的说明，48小时后，在使用MTS溶液(Promega，Madison，WI)的含有VEGF 20ng/ml的无血清培养基中测定增殖。
实施例5
神经元-脑内皮细胞共培养血管生成(tubulogenesis)试验
将从出生后8天的大鼠分离的小脑微粒神经元加入预先包被层粘连蛋白(Invitrogen)的腔室载波片中，并生长过夜。然后加入脑内皮细胞过夜，接着在无血清培养基中实验处理2-6小时。用抗-Von Willebrand因子(Dako，丹麦)或抗-TUJ1(Neuromics，Edina，MN)抗体和合适的flourochrome标记的二抗(Jackson ImmunoReasearch，West Grove，PA)，将固定的细胞免疫染色，用于共焦显微镜检查(Zeiss，纽约，NY)。
实施例6
结果
因为梗塞周围血管发生高峰在3-7天后开始，在中风后3天和7天后，通过Western免疫印迹检查来自相同动物的中风和未中风对照大脑半球的结构域V水平(每个时间点，n＝5)。中风诱发后三天，按照根据GAPDH负荷对照进行标准化，并通过光密度测定(ImageJ，NIH软件)定量，证明了中风大脑半球中结构域V的530％±20％(标准偏差)的提高(p<0.001，通过student’s未配对t-检验)(图1A-1B)。
使用体外毛细管试验，检查了DV影响脑血管发生的能力，和a5b1整联蛋白在过程中的牵连。将大鼠脑微血管内皮细胞(50,000细胞/孔，由Jane Welsh，Texas A&M提供)(8)加入24孔平板的Matrigel(刺激毛细管形成的血管基底膜样物质(9)，25ml/孔，BD Biosciences)包被的孔中±用DV(200nM)预孵育±功能阻断α5β1抗体(10mg/ml，图2A)。9h后，与未处理的对照相比，DV处理的脑内皮细胞形成显著更多的毛细管(p<0.0001)。该作用随后受到抗-a5b1抗体的显著阻断(p<0.001，与单独的DV处理相比较，图2B)。用单独的抗-α5β1阻断抗体的预处理没有显著影响管形成(p＝0.3)。
接着，为了测定DV是否影响脑内皮细胞和神经元之间的相互作用，即，神经血管小生境，开发了脑内皮细胞微粒神经元共培养试验，其中将脑内皮细胞加入获自出生后8天大鼠小脑的原代神经元层，其产生了>95％纯的新产生的微粒神经元培养物(10)。将神经元(5×104细胞/孔)加入预先包被层粘连蛋白的8室孔载波片中，并使其在37℃下生长过夜。第二天，加入脑内皮细胞(3×104细胞/孔)，并使其生长过夜，接着用DV在无血清培养基中处理6小时。在该试验中，脑内皮细胞快速(2-3h内)从神经元中分离出来形成不同内皮细胞岛。DV处理导致了神经元内显著的脑内皮细胞毛细管形成(图3)。
为了证明结构域V是否影响了脑内皮细胞中促血管发生α5β1整联蛋白的表达，通过免疫细胞化学和共焦显微镜检查分析了未处理的和结构域V暴露培养的大鼠脑内皮细胞中a5b1整联蛋白的亚细胞定位。图4显示了DV处理导致了α5β1整联蛋白从细胞质扩散地重新分布至通常在血管发生内皮细胞中可见的细胞表面突起中。
为了测定结构域V是否通过α5β1整联蛋白支持脑内皮细胞粘附，用包被1％BSA(粘附对照)或结构域V(40微克/ml)包被的孔和添加的细胞±α5β1功能阻断性抗体(10微克/ml)预孵育进行了细胞粘附试验。图5证明了结构域V显著比BSA支持更多脑内皮细胞粘附(p<0.001)和α5β1功能阻断抗体显著(p<0.001)抑制了脑内皮细胞与DV的粘附，表明DV可以支持α5β1整联蛋白介导的脑内皮细胞粘附的可能性。
这些结果证明了大脑结构域V在中风后增加，并且增强了神经元环境中的血管发生以及脑内皮细胞和神经元之间的相互作用。此外，这些作用需要与α5β1整联蛋白的相互作用。重要地，这些结果支持通过产生基底膜蛋白聚糖的生物活性片段(DV)自我修复中风后的大脑的看法，并且本领域技术人员可以在治疗上开发这种大脑修复机理。
实施例7
DV对脑血管发生和神经血管小生境形成的作用
为了证明结构域V在体外的脑血管发生中的作用，进行了血管发生试验，包括Matrigel毛细管试验、细胞迁移试验和细胞增殖试验，使用微血管脑内皮细胞和人重组结构域V。将神经元-脑内皮细胞共培养毛细管试验用于研究结构域V在更像脑的环境中对毛细管形成的作用，以及用于研究神经血管小生境的形成。在模拟局部缺血的体外剥夺氧和葡萄糖的环境(OGD)中进行了以上的研究。DV将显著地并且以剂量依赖性方式增强正常和OGD条件下的脑血管发生以及神经元和内皮细胞之间的相互作用。
实施例8
DV克隆和纯化
将结构域V克隆至pSecTag2A载体(Invitrogen)中，其将6XHis标签添加至DV的C-端。通过Lipofectamine(Invitrogen)将质粒转染至293FT(ATCC，Manassas，VA)细胞中。转染后，收集无血清条件培养基(含有细胞分泌的DV)并且通过Ni-ATA琼脂糖珠子柱色谱在4℃下纯化了DV。将洗脱的DV相对1×PBS进行透析，并通过用亮蓝G-colloidal(DVC)染色的SDS-PAGE以及通过用抗-DV抗体(显示)和抗-His抗体的Western印迹(DVWB)分析来测定纯度。用Quick StartBradford染色试剂来定量DV。
实施例9
DV对内皮细胞增殖的作用
内皮细胞增殖是血管发生中的重要启动步骤。为了测定结构域V对内皮细胞的增殖作用，将来自小鼠和大鼠的微血管脑内皮细胞用于排出物种特异性差异并且与体内中风模型中使用大鼠相一致。将人脐静脉内皮细胞(HUVEC，Lonza，Basel，瑞士)用作对照，并且将人脑微血管内皮细胞(Cell Systems，Kirkland，WA)用于确定结构域V的作用是否也适用于人。对于增殖试验，用0.25％的胰蛋白酶(Invitrogen)收集细胞，用悬浮液中的载体对照或不同浓度的DV(对于所有体外血管发生实验，使用1-450nM浓度)在含20ng/ml VEGF的无血清培养基中预处理30分钟，然后以5×103细胞/孔的密度加入96孔平板中。然后在正常的培养条件下孵育细胞48小时。之后加入MTS溶液(20ml/孔)1小时，然后使用平板读数器在490nm下读取吸光度。
实施例10
测定DV对内皮细胞迁移的作用
随着血管发生内皮细胞增殖，它们响应由需要血管的组织释放的化学吸引剂而开始朝向需要新血液供应的组织区域迁移。为了确定DV是否可以影响内皮细胞迁移，收集细胞并装载于改良的Boyden Chamber(NeuroProbe，Gaithersburg，MD)的上部室中±在悬浮液中含有不同浓度DV的合适无血清培养基中在37℃下预孵育30分钟，并使其在37℃下穿过包被I型胶原、层粘连蛋白或纤连蛋白的聚碳酸酯膜朝向含有无血清培养基+/-3％FBS的下部室中迁移6-8h。重要地，这些胞外基质各自表示脑内皮细胞中性、抗血管发生和促血管发生物质(11)，并且它们的使用应当使得本领域技术人员可以确定DV作用是否是ECM特异性的。然后用丙酮固定膜(含有迁移细胞)，并用结晶紫(Sigma)将细胞染色，并在显微镜下计数。此外，测定了DV是否不同地影响朝向不同化学吸引剂的迁移，这些化学吸引剂包括VEGF、脑源性的神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)和碱性FGF(bFGF)。
实施例11
测定DV对内皮细胞Matrigel诱导的管形成的作用
一旦内皮细胞到达预定的需要新血液供应的组织目标，细胞经历毛细管形态发生，以形成新的血管。Matrigel血管发生试验是公认的用于研究体外内皮细胞毛细管形态发生的技术(12)。为此，按照以上所述的进行了这些试验±用不同浓度的DV预孵育内皮细胞。在不同的时间点观察细胞，然后在12-18h后固定于4％多聚甲醛中。使用标准图象获取软件，使用连接倒置显微镜的CCD相机，获取了图象。用AdobePhotoshop CS将管形成定量(管像素/显微视野，每个条件10个视野)。
实施例12
测定DV对共培养物中的内皮细胞管形成和神经元相互作用的影响
为了研究结构域V在比Matrigel更像脑的环境中对调节脑内皮细胞毛细管形成的能力，研发了由小脑颗粒神经元和脑内皮细胞组成的共培养实验系统。选择出生后8天的大鼠小脑作为神经元来源，因为其容易获得并且是新生神经元的丰富来源(13)，其与脑内皮细胞相互作用。除了层粘连蛋白，将神经元加入用胶原I或纤连蛋白预先包被的孔中，以测定每种基础物质对内皮细胞管形成的相对重要性。对于不同的培养时间段(1、3、6、9小时)，测定了不同浓度的结构域V对内皮细胞管形成程度的作用。证明了结构域V具有剂量依赖性地增强管形成的作用。
在此的数据表明了在结构域V缺失时，脑内皮细胞与神经元分离，而结构域V促进了神经元中的毛细管形成。因此，除了研究毛细管形成以外，这种共培养系统使得本领域技术人员可以检查DV对内皮细胞、神经元和ECM之间的动态相互作用的影响。首先，通过收集固定细胞的Z-堆栈图象，使用共焦显微镜来检查结构域V在不同的时间点对脑内皮细胞、神经元和周围的ECM之间的3维相互作用的影响，这些固定细胞相对抗-Von Willebrand因子、抗-TUJ1、抗-α5β1、紧密连接蛋白claudin-5和抗-ECM成分(包括纤连蛋白、层粘连蛋白和IV型胶原)进行免疫染色。在这些研究中，显示了DV是否影响a5b1整联蛋白相对周围ECM的内皮细胞分布以及确定同型的内皮细胞相互作用的变化，如通过claudin-5表达和细胞分布的变化所测量的，以及异型的神经元相互作用的变化，如通过内皮细胞-神经元接近中的变化所测量的。
将活细胞显微镜检查(Nikon显微镜，具有连接CCD相机和PC的机械化平台和加热的、CO2平台，使用Metamorph成像软件)用于使diI和diO荧光标记的神经元和内皮细胞的相互作用成像(14)，各自±在延长时间段内的DV疗法。结构域V处理提高了脑内皮细胞和神经元之间的可见物理接触，由此促进和增强了中风恢复过程中的神经血管小生境形成。以每个显微镜视野/每个小时的可见内皮细胞-神经元接触的数量来定量内皮细胞-神经元接触。还定量了每个小时单独的内皮细胞接触神经元的程度。
最后，为了测定存在的神经元或其分泌的ECM/生长因子对于DV的毛细管促进作用是否是必需的，在一些实验中，在加入脑内皮细胞±DV处理之前，用Cellstripper除去了神经元，Cellstripper是一种非酶分解溶液，其将神经元分泌的基质留在孔底部，如通过ECM抗体所证实的。在其他实验中，将神经元条件培养基加入在层粘连蛋白上培养的内皮细胞中。数据表明神经元内皮细胞相互作用对于内皮细胞管形成是必需的。
实施例13
DV体外试验中氧-葡萄糖剥夺(OGD)的影响
在缺氧室中在葡萄糖(1g/L)减少的培养基中，使用上述的血管发生试验，显示了结构域V在缺血的体外模型中的作用(15)。对于每次试验，将葡萄糖减少的培养基±DV中的培养物置于缺氧室中，所述缺氧室用95％N2/5％CO2充满1h，接着将室密封，在上述每个血管发生试验所述的实验持续时间期间持续。单独的OGD提高了脑内皮细胞血管发生，并且这得到DV的进一步增强。
实施例14
a5b1整联蛋白和DV在脑内皮细胞中的促血管发生作用
DV促血管发生作用对α5β1的需求意味着α5β1阻断和/或α5β1减少降低或抑制了结构域V促血管发生作用。因此，显示了迁移、增殖和管形成试验中，用功能性阻断抗体和IgG对照(Millipore，10-20mg/ml，与细胞预孵育)功能性地抑制a5b1整联蛋白和用siRNA(Accell预先设计的siRNA，Dharmacon，Chicago，IL)降低α5β1水平各自对DV和未处理的脑内皮细胞的作用。通过Western印迹证实了a5b1的降低(knockdown)。
实施例15
测定DV对内皮细胞a5b1表面定位的作用
为了直接测量应答DV暴露的脑内皮细胞a5b1整联蛋白表面定位，将Milner等的方法(15)用于制备在塑料或各种底物(层粘连蛋白，胶原，纤连蛋白或固定化DV，以40mg/ml加入孔中，在4℃下过夜)上±DV暴露下生长的细胞，用于流式细胞计数，使用Becton-DickinsonFACSCalibur仪器，使用CellQuest(Becton-Dickinson)ModFit LT(Verity)软件。
实施例16
测定DV与a5b1整联蛋白的相互作用和激活该蛋白
DV应当结合并激活a5b1整联蛋白，通过RGD纤连蛋白/α5β1结合基序导致提高的脑内皮细胞对纤连蛋白的亲和性。显示了相对于对照肽SDGRG(SEQ ID NO:2)，DV提高脑内皮细胞粘附于固定的纤连蛋白以及RGD序列GRGDS(SEQ ID NO:1)的作用。
如上所述，在包被DV(40微克/ml)、纤连蛋白(10微克/ml)、GRDGS或SDGRG肽(0.1微克/ml)或1％BSA的孔中，进行了细胞粘附试验。为了显示细胞粘附于DV是α5β1依赖性的，进行了其中抑制了α5β1的功能或表达的粘附试验。按照制造商的说明，用a5b1siRNA处理细胞，并且通过Western免疫印迹证实了α5β1的降低效率。或者，在粘附试验之前，用抗-α5β1阻断抗体预孵育细胞。显示了α5β1的功能或表达的抑制降低或抑制了脑内皮细胞粘附于DV。显示了DV增强脑内皮细胞粘附于纤连蛋白和GRGDS肽，α5β1siRNA处理抑制了脑内皮细胞粘附于固定化的结构域V，并且添加的DV增强了脑内皮细胞粘附于纤连蛋白和GRGDS。
实施例17
中风-产生的DV
中风后给予DV，并且显示了其对中风病理和功能恢复的作用。因为神经血管小生境形成，体内中风给予DV后，提高了中风后的血管发生，并且大鼠中的病理性和功能性的中风结果得到了提高。DV疗法在动物中是非常耐受的。
实施例18
内皮缩血管肽-1体内中风模型和DV治疗
如上所述，将Harlan Sprague Dawley大鼠接受内皮缩血管肽-1(或PBS假对照)诱导的大脑中动脉阻塞(MCAo)。使用激光Doppler流量计(型号BPM2，Vasamedics Inc，St.Paul.MN)证实了血流中断(16)(49)。MCAo后24h，将动物随机分成两组，1组通过腹膜内(I.P.)注射接受2-6mg/kg过滤过的DV(含量足以抑制肿瘤血管发生，如(7)公开的)(处理组)，1组接受载体对照，每2天一次持续2周。还从MCAo后24h开始，大鼠每日接受(持续14天)I.P.注射的溴脱氧尿苷(BrdU；100mg/kg；Sigma)来标记新合成的DNA，以鉴定出恢复的大鼠脑中的新生神经元。
实施例19
中风组织免疫组织化学和Western免疫印迹
为了测定大鼠中中风后的血管发生和神经血管小生境形成±DV治疗，将来自中风和假中风动物的新鲜脑组织在液氮中冷冻。对于血管发生免疫组织化学，用直接抗血管抗原(即，CD31和von Willebrand因子(Dako))的抗体对使用Microm HM 550低温箱(Walldorf，德国)获得的中风大脑半球的冷冻切片进行探测。测定了与BrdU+神经元相互作用的血管的程度，并用Adobe Photoshop CS来定量。此外，使用针对DV的6×HIS标签(EMD)的抗体显示了注射的DV的中风组织吸收和分布。与未处理的中风动物相比，DV治疗将导致中风脑组织周围的血管的增加，即CD31和/或von Willebrand阳性细胞的增加，中风脑组织周围还具有提高的α5β1整联蛋白表达以及这些血管和BrdU+神经元之间提高的相互作用。给予的DV将定位于中风部位，并且导致降低的梗塞大小。
实施例20
对于中风诱发的脑性瘫痪的基底膜蛋白聚糖结构域V治疗
围产期动脉局部缺血性脑卒中(PAS)，是在胎儿或新生儿生命过程中发生的脑血管事件，是婴儿脑性瘫痪的主要诱因。不幸地，通常滞后地诊断出PAS，即，在已经发生了损伤后，并且对于传统的中风疗法(如，组织纤维蛋白溶酶原激活剂)而言太迟了。因此，成功的脑性瘫痪疗法应当开发大脑自我修复机制。不幸地，对大脑自我修复了解的很少，但似乎发生在血管再生成(血管发生)和神经元再生(神经发生)的神经血管小生境中。这两个过程都涉及蛋白酶驱动的胞外基质(ECM)重塑，具有未知的结果。通过产生ECM(基底膜蛋白聚糖)的生物活性片段部分地刺激了中风后脑血管发生和神经血管小生境形成，并且开发这种自我修复机制，用于PAS-诱发的脑性瘫痪的治疗。中风快速产生了基底膜蛋白聚糖的生物活性片段，其是所研究的蛋白酶最灵敏的ECM成分，并且基底膜蛋白聚糖对于血管发生和神经发生都是必需的。此外，基底膜蛋白聚糖片段，结构域V(DV，也称为endorepellin)，可以通过α2β1整联蛋白抑制非脑系统中的血管发生。
本发明显示了中风后的大脑中，DV得到上调，并且出人意料地在中风后在体外和体内增强了脑血管发生，这可能是由于脑内皮细胞中α2β1整联蛋白的缺失引起的。DV通过促血管发生α5β1整联蛋白在脑内皮细胞中发挥其作用，并且增强了神经元和内皮细胞之间的相互作用。共同地，这些结果表明大脑能够通过DV产生进行自我修复，并且可以在治疗上对此进行开发。
为了证明DV疗法对PAS的效用，使用内皮缩血管肽-1在7天龄的大鼠中诱导暂时的大脑中动脉阻塞(MCAo)中风。然后在中风后24和72小时，动物接受了0.5mg/kg腹膜内注射无菌DV或PBS载体对照。因为峰半影(直接围绕在中风组织周围的区域)血管发生在3-7天后开始，在中风后5天检查了中风大脑的脉管系统。在DV处理动物的中风皮层表面上存在血管过度增生，这在对侧皮层或PBS处理的中风动物中不明显(图6A-6B)。此外，用血管标记物von-Willebrand因子对这些脑的冷冻组织切片的免疫染色揭示了与PBS处理对照相比，DV处理动物中显著增加的中风半影脉管系统(图6A-6B)。总之，这些结果表明DV可以增加PAS后的血管发生。
实施例21
给予的DV定位于中风和梗塞周围组织
通过免疫组织化学分析大脑组织，以检测给予的DV(重组DV的c-端上的HIS表位标签)以及血管(von Willebrand因子)，以确定在中风的脑组织中是否检测到给予的DV以及它可能在哪定位。图7证明了在中风的脑组织中找到了大量给予的DV，在梗塞周围皮层中发现了较低程度的，但在相同动物的对侧未中风皮层中未发现。此外，实际上所有给予的DV以较低程度沉积在梗塞周围皮层和中风组织中分布的血管周围，这与其在体内的脑血管促进作用及其靶向激活的实体肿瘤血管周围的能力相一致。重要地，这表明了DV通过至今未知的机制能够穿过血脑屏障，至少远至离腔的血管周围区域，其可以暴露于其他细胞类型(如，星形细胞和神经元)并对所述细胞发挥作用。图8证明了各自获自PBS和DV处理的中风动物的中风和对侧皮层的裂解物的Western印迹分析的相似结果。
实施例22
给予的DV定位于中风和梗塞周围组织
为了确定DV疗法是否影响梗塞周围脑组织(如紧邻梗塞脑组织的脑区域所限定的)中成神经细胞迁移的程度，并且由此影响新神经元在中风脑组织中的再生，使用了来自PBS和DV处理的中风动物的脑切片的双皮层蛋白免疫组织化学(图9A)，并定量了各自中风梗塞周围组织中每个高倍视野(HPF，n＝20/动物)的双皮层蛋白像素的平均数。注意到DV处理的动物中双皮层蛋白阳性像素显著增加。此外，看起来与DV促进神经血管小生境形成的假设相一致，就在血管附近注意到显著(p<0.001)更高百分比的鉴定的双皮层蛋白阳性细胞，如通过在梗塞周围脑组织中与PBS处理的对照(60％+/-3％)相比较，DV处理的动物中(90％+/-5％，n＝20个图象/动物)针对von Willebrand的抗体或HIS抗体所鉴定的(图9B)。
实施例23
DV增强体外皮层神经元迁移
如以上结果所示的，通过对脑内皮细胞的作用来促进神经血管小生境的形成，DV可以是神经元保护性的(neuroprotective)，增强了神经发生和神经元迁移。此外，如果DV穿过血脑屏障，对神经元也有直接作用。还测定了DV是否具有与其对中风的治疗效能一致的直接神经元作用。为此，使用用于特别关注除去脑膜的原代细胞分离的常规无菌分离技术从15天的胚胎C57B16小鼠分离了小鼠原代皮层神经元，并用这些细胞进行了体外迁移试验。
在使用前，用TUJ-I免疫细胞化学证实了神经元的同一性。改进的Boyden Chamber(NeuroProbe，Gaithersburg，MD)，其中神经元(3×103/孔)装载于上部室±在合适的含有100nM或200nM DV悬浮液的无血清培养基中在37℃下预孵育30分钟，然后使其穿过用I型胶原包被的聚碳酸酯膜朝向化学吸引剂神经生长因子(NGF，4nM/下部孔)迁移，在37℃下持续8h。然后用丙酮将膜(含有迁移中的细胞)固定，然后用结晶紫(Sigma)将细胞染色，并在显微镜下计数。图10显示了DV增强了皮层神经元迁移，通过证明DV处理显著地并且以剂量依赖性方式增强了皮层神经元朝向NGF迁移(对于两个DV浓度，p<0.0001)，表明DV对神经元具有直接的治疗效果。
DV治疗提高了功能性中风成果
图11显示了从中风后3天向前，假对照和结构域V处理的中风动物之间不存在统计学差异。在中风后1，3，5，7天，用0.5mg/kg结构域V处理动物。
实施例24
结构域V诱导BDNF释放
在此的体内结果表明DV处理促进了神经血管脑修复，这可能部分是由于DV诱导的神经血管促进因子(如，脑源性神经营养因子(BDNF))的释放。图12A证明了24小时后，DV显著(**p＝0.0025)增强了脑微血管内皮细胞BDNF释放。相似地，中风后DV处理导致了与PBS处理的对照相比，在中风后3和7天，中风脑BDNF水平的显著提高(图12B-12C)。此外，将DV加入原代分离的大鼠星形细胞或皮层神经元中，没有看到对BDNF水平的作用，表明DV对体内脑BDNF水平的作用主要是脑内皮细胞介导的。
实施例25
结构域V与α5β1整联蛋白相互作用并且通过α5β1整联蛋白发挥其
促血管发生作用
因为大脑微血管内皮细胞没有表达之前鉴定的DV受体α2β1整联蛋白，DV对脑内皮细胞的促血管发生作用可能是由于α2β1的缺失和不同的促血管发生DV受体的存在而引起的。α5β1对于血管发育是关键的，并且促进中风后的脑血管发生，但在成熟脑中却得到下调，直至缺氧后在脑内皮细胞中重新表达。血管发生促进生长因子angiopoetin 1的单体变体结合α5β1整联蛋白，并通过α5β1整联蛋白促进血管稳定，进一步确认了该受体在血管发生和血管重塑中的重要性。
首先测定了α5β1整联蛋白的特异性激活是否影响BDNF水平。图12A证明了用特异性识别a5配体结合结构域的a5b1抗体的细胞处理自身能够提高BDNF释放。此外，SNAKA51(通过结合配体结合结构域外的区域激活α5β1整联蛋白并由此引发α5β1结合配体的抗体)显著提高了BDNF水平(p＝0.0007)。令人感兴趣地，α5β1抗体和DV的同时加入抑制了BDNF释放，而同时添加DV和SNAKA51进一步提高了BDNF水平(p＝0.06)。这与DV通过结合α5配体结合结构域而提高BDNF释放的假设相一致。
通过证明针对α5配体结合结构域的α5β1抗体可以防止其粘附于固定化的DV来检查了大脑微血管内皮细胞粘附DV是否依赖于α5β1(图12A)。通过使用重组a5b1整联蛋白的ELISA，证明了DV以剂量依赖性的方式结合α5β1，具有大约30nM的Kd(图13B)。为了进一步将DV的促血管发生作用与α5β1相关联，证明了脑内皮细胞朝向DV的迁移受到纤连蛋白-GST和可溶性α5β1-GST的抑制(图13C)。此外，α5β1特异性结合肽CRRETAWAC(SEQ ID NO:3)在体外显著(p＝0.001)抑制了DV对脑内皮细胞管形成的作用(图13D-13E)。
为了测定DV提高大脑血管发生是否一部分通过提高α5β1的脑内皮细胞表达，8小时内汇合脑内皮细胞单层的DV处理维持了总的α5β1蛋白水平，这在无血清对照条件下显著降低(图13F)。此外，生长于塑料上的脑内皮细胞的DV处理将α5β1整联蛋白显著重新分布于表面/板状伪足(图13G)，但对星形细胞或原代皮层神经元中的α5β1表面表达没有作用。最后，为了测定DV在体内是否还影响α5β1整联蛋白水平，进行了中风后3天动物+/-DV处理的中风和对侧半球的脑裂解物的Western印迹分析(图13H)，并观察到DV处理动物的中风脑组织处理中显著更多的α5β1整联蛋白(p＝0.00004，定量未显示)。总之，这些结果表明DV结合α5β1整联蛋白，影响α5β1整联蛋白的表达并通过α5β1整联蛋白发挥其促血管发生作用。
α2β1整联蛋白逆转DV细胞增殖活性
将α2β1整联蛋白加入C57小鼠脑内皮细胞逆转了结构域V细胞增殖活性。因为DV在同时表达α2β1整联蛋白(抗血管发生受体)和α5β1整联蛋白(促血管发生因子)的大部分内皮细胞中是抗血管发生的，考虑了由于其对α2β1整联蛋白(大约30nM的Kd)超过α5β1整联蛋白(160nM的Kd)提高的亲和性，DV在这些细胞中是抗血管发生的。将α2β1整联蛋白转染至通常不表达该受体的小鼠脑微血管内皮细胞中。这通过用含有编码α2-亚基整联蛋白和C-端RFP融合蛋白(Texas A&MUniversity Biomedical Engieering)的序列的质粒载体(pEGFP-N2，Clontech)转染来完成，将空载体用作对照。使细胞在不含抗生素的培养基中恢复24h。使用倒置荧光显微镜在24h后测定转染效率。按照制造商的说明，在含有MTS溶液(Promega，Madison，WI)的无血清培养基中48小时后，测定细胞增殖。与细胞培养基对照相比，DV提高了小鼠脑内皮细胞的增殖，这可以通过加入VEGF中和抗体或α5β1整联蛋白功能阻断抗体来阻断(图14A)。将α2β1整联蛋白加入细胞中抑制而不是提高了细胞的生长，这证明了将α2β1整联蛋白加入小鼠脑内皮细胞中，将DV从增殖转变成抗增殖的。棒是平均值+/-标准偏差(图14B)。**p<0.01，##p<0.01。
DV与A5结合的动力学
按照所述的(17)，使用光学生物传感器(IAsys；Affinity Sensors，UK)，进行了结合试验。简而言之，为了将称为受体的A5结构域结合至传感器表面上，通过注入0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.4M N-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(Pierce)的1:1混合物，将表面上存在的碳酸酯基团激活。然后使溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的受体结合激活的表面，直至达到应答平台。通过注入100μL的1M Tris-HCl(pH8.5)来阻断残余的活性基团。
用结合缓冲液(150mM NaCl，25mM Tris-HCl，pH7.4和1mM MnCl2)在25℃下将含有固定化A5的比色皿预处理10min。将100μL含有溶解于结合缓冲液中的游离DV反应物的样品加入比色皿中，然后记录结合相。随后，除去样品，将无分析物缓冲液加入比色皿中，然后记录解离相。每次试验后，通过用pH＝4的100mM甘氨酸简短洗涤，接着用结合缓冲液平衡，使比色皿的表面再生。在再生循环过程中，注意表面结合的分析物的完全去除，并且持续洗涤，直至达到应答等于基线值。
对于结合试验，加入浓度范围为8.0×10-8M至4.0×10-7M的游离DV。按照(18)所述的，通过通用拟合方法分析来自生物传感器的数据。对于每次试验，获得了结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)，并且从koff/kon的比例计算平衡解离常数(Kd)。此外，还在8.0×10-7(DV最高浓度的两倍)的摩尔浓度下，进行了牛血清白蛋白(BSA)的对照结合。如表1中所示，DV结合α5β1整联蛋白。
| kon[M-1s-1] | koff[s-1] | Kd(Kd＝koff/kon)[M] |
| 3.8x 106±2.7x 105 | 7.2x 10-1±1.1x 10-1 | 1.6x 10-7±7.2x 10-8 |
这些研究证明胞外基质-衍生的血管发生的抑制剂，基底膜蛋白聚糖DV，在中风受伤的脑中稳定且长期地产生。非常出人意料地，给予DV在体内和体外增强而不是抑制脑的血管发生。DV存在于中风和梗塞周围的脑组织中，增强了神经血管小生境形成，至少部分是由于增强的BDNF释放引起的，并且最终在大鼠和小鼠各自的内皮缩血管肽-1和串联同侧CCA&MCA中风模型中，将运动神经功能性结果提高至中风前的基线水平。最后，在α2β1整联蛋白缺失下，通过α5β1整联蛋白，DV增强了脑内皮细胞血管发生。
基底膜蛋白聚糖，通过神经元、星形细胞和内皮细胞合成和分泌，其在后者中通过VEGF165诱导，在中风后具有是最灵敏和快速得到加工的基质成分的特征。非人灵长类动物中通过组织蛋白酶L的基底膜蛋白聚糖蛋白水解在大脑中动脉阻塞的2h内发生，并持续几天。中风后基底膜蛋白聚糖持续加工几天与证明大脑损伤后神经元和星形细胞中基底膜蛋白聚糖产生增加的研究相一致。在目前的研究中，基底膜蛋白聚糖DV水平存在快速增加，在几天的过程中逐渐达到升高水平的稳定状态，这是与非人灵长类动物中风后基底膜蛋白聚糖蛋白水解特征充分关联的短暂模式。
抗血管发生胞外基质片段促进脑血管发生的能力可能是由于内皮异质性的概念引起的，其中不同血管床中的内皮细胞，在这此的情况是大脑vs.非大脑，不同地应答血管调节因子。这种不同的应答可能是由于各自微环境的差异、表达受体的差异，如α2β1整联蛋白的存在或缺失，或信号传导成分的差异引起的。此外，XVIII型胶原衍生的血管发生抑制剂，内皮抑制素，促进了源自分化的胚胎干细胞的不成熟内皮细胞中的血管发生，产生了类似不成熟内皮的血管发生大脑内皮功能或行为的可能性。实际上，新血管发生的脑内皮在脑缺氧后经历了整联蛋白受体转换，从成熟整联蛋白受体转换回发育整联蛋白表达，特别是α5β1整联蛋白。
增强的α5β1整联蛋白的中风后表达也解释了DV存在于中风和梗塞周围皮层脉管系统的能力，正如表达α2β1的肿瘤脉管系统支持体内DV靶向。此外，就在中风后的基底膜蛋白聚糖的蛋白水解和DV的产生可以作为整联蛋白受体转换引发剂的一部分。这通过DV提高了体外脑内皮细胞上α5β1整联蛋白的总表达和中风后大脑组织中a5b1整联蛋白水平的观察结果得到支持。
本发明还显示了DV刺激了BDNF释放。BDNF是促血管发生的、神经保护性的，并且刺激神经元迁移和神经干细胞恢复。BDNF对于大鼠中风后的复原诱导的恢复是关键的。
局灶性脑缺血引起血脑屏障的破坏，其表现为微血管完整性的丢失和血浆成分渗漏至血管外空间中。此外，防止渗透性早期提高对于损伤结果是有益的。nDV可以执行这种功能，并且甚至可能提高该时间框内的屏障功能，因此降低损伤程度。令人感兴趣地，分解血管胞外基质和直接引起急性中风脉管泄漏的相同蛋白水解过程也产生了DV，表明中风诱导的血管基质蛋白水解不完全是有害的。8h后，随后的DV诱导的渗透性可以表明在早期血管重塑中的作用，引起用于氧传送的稳定状态的快速重建。特别地，DV诱导的微血管渗透性的提高先于中风模型中看到的第二期屏障泄漏24-48h，进一步加重了这种可能性。
实施例26
DV在体内没有显著影响血脑屏障渗透性
因为证明了DV可以在体外降低脑内皮细胞中的TEER，这是潜在担忧的中风后影响，其中血脑屏障渗透性已经得到了负面影响，确定DV在体内是否对血脑屏障渗透性具有任何影响。
材料和方法
[3H]甘露醇(14.2Ci/mmol)和[14C]蔗糖(412mCi/mmol)购自MoravekBiochemicals(USA)。剩余的化学品购自Sigma Chemical Company(UK)。小鼠购自Harlan，UK。
所有实验在动物科学程序法令(1986，UK)的指导内进行。将成年雄性BALB/c(27.3±0.3g)和C57Bl6(27.9±0.6g)小鼠麻醉(i.p.美托咪定盐酸(2mg/kg)和氯胺酮(150mg/kg))，并肝素化(100U，i.p.)，并按照Sanderson等，2007中所述的，通过心脏左心室的插管和右心房的分段进行了原位大脑灌注技术。人造血浆含有[3H]甘露醇(35.2nM；182Da；)和[14C]蔗糖(1.1mM；342Da；)，灌注持续了10分钟。此后，将动物斩首，并且取出脑部分(额叶皮层、枕叶皮质、尾状核、海马、下丘脑、丘脑、小脑、脑桥)，用于液体闪烁计数。将组织放射性的含量表示为人造血浆中的百分比并称为R组织％(ml.100g-1)。分开组的小鼠给予了溶解于PBS载体中的DV(1mg/kg)，并且在注射后2、8和24小时进行了原位脑灌注程序。将这些实验组与只接受了载体的动物相比较。在研究的时间点，还检测了DV对脑(中央前回)含水量的影响。将Two Way ANOVA或One Way ANOVA用于数据分析，使用GraphPad Prism 5.0软件包(GraphPad Software Inc.)。
DV对小鼠中血管空间的作用
在BALB/c株系中，在腹膜内注射DV(1mg/kg，图15A)后8或24小时，通过[14C]蔗糖和[3H]甘露醇测量的所有脑部分中的血管空间没有受到显著影响。此外，在0小时时，脑含水量为73.3±1.3％，并且腹膜内注射DV(1mg/kg)8小时(64.6±3.4％)或24小时(72.8±2.9％)时没有受到显著影响(One Way ANOVA)。在C57Bl6株系中，腹膜内注射DV(1mg/kg，图15B)后2小时，如通过[14C]蔗糖和[3H]甘露醇测量的所有大脑部分中的血管空间没有受到显著影响。
在此引用了以下参考文献
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Claims (8)
1.endorepellin蛋白在制备用于刺激或增强中风病人脑中血管生成的药物中的用途，其中所述endorepellin蛋白由基底膜蛋白聚糖的结构域V的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的用途，其中所述药物适合口服给药。
3.权利要求1的用途，其中以约0.1mg/kg至约10mg/kg病人体重的含量来给药所述endorepellin蛋白。
4.权利要求1的用途，其中以0.1mg/kg至10mg/kg病人体重的含量来给药所述endorepellin蛋白。
5.权利要求1、3或4的用途，其中所述药物适合皮下、静脉内或腹膜内给药。
6.权利要求5的用途，其中所述药物适合腹膜内给药。
7.权利要求5的用途，其中所述药物适合静脉内给药。
8.权利要求5的用途，其中所述药物适合皮下给药。
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