BRPI0915173B1

BRPI0915173B1 - Compostos de nucleotídeos e nucleosídeos e método de sequenciamento de um ácido nucleico-alvo

Info

Publication number: BRPI0915173B1
Application number: BRPI0915173-7A
Authority: BR
Inventors: Vladislav A. Litosh; Megan N. Hersh; Brian P. Stupi; Weidong Wu; Michael L. Metzker
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2009-06-11
Publication date: 2021-05-04
Also published as: BRPI0915173A2; EA201100001A3; WO2009152353A2; NZ590265A; US20100041041A1; US20140051848A1; AU2009257369A1; US9200319B2; EP2307565A2; CA2727709A1; IL209917A; US20150140559A1; CN103588839A; CN103588839B; EA201100001A2; CA2979146C; MX2010013678A; US8877905B2; IL209917A0; HK1163184A1

Abstract

composto de nucleotídeos e nucleosídeos e método para uso dos mesmos em sequenciamento de dna. a presente invenção refere-se, de modo geral, a grupos terminais cliváveis rotulados e não rotulados e métodos para sequenciamento de dna e outros tipos de análise de dna. mais particularmente, a invenção refere-se, em parte, a nucleotídeos e nucleosídeos com grupos quimicamente cliváveis, fotocliváveis, enzimaticamente cliváveis ou não fotocliváveis e métodos para seu uso em sequenciamento de dna e sua aplicação em pesquisa biomédica.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade aos Pedidos Provisórios U.S. Nos. 61/060.795 e 61/184.779, depositado em 11 de Junho de 2008 e 5 de Junho de 2009, respectivamente, os conteúdos dos quais são, cada um, incorporados aqui por referência na íntegra.

I. Campo da Invenção

[002] A presente invenção refere-se, em geral, a composições e métodos para sequenciamento de DNA e outros tipos de análise de DNA. Mais particularmente, a invenção refere-se, em parte, a nucleotídeos e nucleosídeos com grupos quimicamente cliváveis, fotocliváveis, enzimaticamente cliváveis ou não fotocliváveis e métodos para seu uso em uma série de métodos de sequenciamento de DNA e suas aplicações em pesquisa biomédica.

II. Descrição da Técnica Relacionada

[003] Métodos para sequenciamento rápido de DNA têm se tornado necessários para análise de doenças e mutações na população e desenvolvimento de terapias. Formas comumente observadas de variação de sequência humana são polimorfismos de um único nucleotídeo (single nucleotide polymorphisms - SNPs), os quais ocorrem em aproximadamente 1 em 300 a 1 em 1000 pares de base da sequência genômica e variantes estruturais (structural variants - SVs), incluindo substituições em bloco, inserção/deleções, inversões, duplicações segmentais e variantes de número de cópia. Variantes estruturais respondem por 22% de todos os eventos variáveis e contribuem com mais bases variantes do que aquelas por SNPs (Levy et al., 2007, o qual é incorporado aqui por referência). Essa descoberta é consistente com aquela de Scherer, Hurles e colaboradores, que analisaram 170 indivíduos usando métodos baseados em microarranjo (Redon et al. 2006, o qual é incorporado aqui por referência). Baseado na sequência completa do genoma humano, esforços foram empreendidos para identificar o elo genético subjacente comum a doenças por meio de mapeamento de SNP ou associação direta. Desenvolvimentos tecnológicos focalizados sobre sequenciamento de DNA rápido, de alto rendimento e baixo custo facilitariam a compreensão e uso de informação genética, tal como SNPs, em medicina aplicada.

[004] Em geral, 10% a 15% dos SNPs afetarão a função da proteína alterando resíduos de aminoácido específicos, afetarão o processamento apropriado de genes mediante alteração de mecanismos de splicing ou afetarão o nível normal de expressão do gene ou proteína variando mecanismos regulatórios. SVs também podem exercer um papel importante em biologia e doenças humanas (Iafrate et al., 2004; Sebat et al., 2004; Tuzun et al., 2005; Stranger et al., 2007, os quais são incorporados aqui por referência). Considera-se que a identificação de SNPs e SVs informativos levará a diagnóstico mais preciso de doença hereditária, melhor prognóstico de suscetibilidades de risco ou identificar mutação esporádicas em tecidos. Uma aplicação de um perfil individual de SNP e SV seria retardar significativamente o início ou progressão de doença com terapias de fármaco profiláticos. Além disso, um perfil de SNP e SV de genes que metabolizam fármaco poderia ser usado para prescrever um regime de fármaco específico a fim de proporcionar resultados mais seguros e mais eficazes. Para atingir esses objetivos divergentes, o sequenciamento de genoma se focalizaria na fase de ressequenciamento com o potencial de sequenciamento parcial de uma grande maioria da população, o qual envolveria sequenciamento de regiões específicas em paralelo, as quais estão distribuídas por todo o genoma humano, a fim de obter o perfil de SNP e SV para uma determinada doença complexa.

[005] Variações de sequência que fundamentam as doenças mais comuns provavelmente envolvem múltiplos SNPs, SVs e uma série de combinações dos mesmos, as quais estão dispersas por todos os genes associados e existem em baixa frequência. Assim, é mais provável que tecnologias de sequenciamento de DNA que empregam estratégias para sequenciamento de novo detectem e/ou descubram essas variantes raras, amplamente dispersas do que tecnologias que objetivam apenas SNPs conhecidos.

[006] Tradicionalmente, sequenciamento de DNA tem sido obtido através do método de "Sanger" ou "dideóxi", o qual envolve o término de cadeia de síntese de DNA pela incorporação de 2’,3’- dideoxinucleotídeos (ddNTPs) usando DNA polimerase (Sanger et al., 1997, o qual é incorporado aqui por referência). A reação também inclui os 2’-deoxynucleotides (dNTPs) naturais, os quais estendem a cadeia de DNA por meio de síntese de DNA. Competição apropriadamente equilibrada entre extensão de cadeia e término de cadeia resulta na geração de um conjunto de fragmentos de DNA agrupados, os quais estão uniformemente distribuídos sobre milhares de bases e diferem quanto ao tamanho como incrementos de par de base. Eletroforese é usada para decompor os fragmentos de DNA agrupados por seu respectivo tamanho. A proporção de dNTP/ddNTP na reação de sequenciamento determina a frequência de término de cadeia e, consequentemente, a distribuição de comprimentos de cadeias terminadas. Os fragmentos são, então, detectados via a fixação prévia de quatro diferentes fluoróforos às quatro bases de DNA (isto é, A, C, G e T), os quais fluorescem suas respectivas cores quando irradiados com uma fonte de laser adequada. Atualmente, sequenciamento de Sanger tem sido o método mais amplamente usado para a descoberta de SNPs por meio de sequenciamento por PCR direto (Gibbs et al., 1989, o qual é incorporado aqui por referência) ou sequenciamento genômico (Hunkapiller et al., 1991; International Human Genome Sequencing Consortium., 2001, o qual é incorporado aqui por referência).

[007] Vantagens das tecnologias de sequenciamento da próxima geração (next-generation sequencing - NGS) incluem a capacidade de produzir um volume enorme de dados de modo econômico, em alguns casos, acima de cem milhões de leituras de sequências curtas por operação do instrumento. Muitas dessas abordagens são comumente referidas como sequencing-by-synthesis (SBS), a qual não esboça claramente a mecânica diferente de sequenciamento de DNA (Metzker, 2005, o qual é incorporado aqui por referência). Aqui, as estratégias DNA polimerase-dependentes são classificadas como término cíclico reversível (cyclic reversible termination - CRT), adição de um único nucleotídeo (single nucleotide addition - SNA, por exemplo, piro- sequenciamento) e sequenciamento em tempo real. Uma abordagem pela qual DNA polimerase é substituída por DNA ligase é referida como sequenciamento através de ligação (sequencing-by-ligation - SBL).

[008] Há uma grande necessidade pelo desenvolvimento de novas tecnologias de sequenciamento, com aplicações potenciais abrangendo diversos setores de pesquisa, incluindo genômica comparativa e evolução, ciência forense, epidemiologia e medicina aplicada para diagnóstico e produtos terapêuticos. Tecnologias atuais de sequenciamento são, frequentemente, muito onerosas, de trabalho intenso e consomem tempo para ampla aplicação em estudos de variação de sequência humana. O custo central do genoma é calculado com base em dólares por 1.000 bases Q20 e pode ser, em geral, dividido nas categorias de instrumentação, pessoal, reagentes e materiais e gastos superiores. Atualmente, estes centros são operados por pelo menos um dólar por 1.000 bases Q20 com pelo menos 50% do custo resultando apenas da instrumentação de sequenciamento de DNA. Desenvolvimentos em novos métodos de detecção, miniaturização na instrumentação, tecnologias de separação microfluídicas e um aumento no número de ensaios por operação terão, mais provavelmente, um grande impacto sobre a redução dos custos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Em alguns aspectos, a presente descrição proporciona novos compostos e composições que são úteis em sequenciamento eficiente de informação genômica em reações de sequenciamento de alto rendimento. Em outro aspecto, reagentes e combinações de reagentes que podem proporcionar informação genética eficaz e confiável são proporcionados. Em outros aspectos, a presente invenção proporciona bibliotecas e arranjos de reagentes para métodos diagnósticos e para o desenvolvimento de produtos terapêuticos objetivados a indivíduos.

[010] Em alguns aspectos, a presente descrição proporciona novos compostos que podem ser usados em sequenciamento de DNA. Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção proporciona compostos da fórmula

em que: Z é -O-, -S-, -NH-, -OC(O)O-, -NHC(O)O-, -OC(O)NH- ou -NHC(O)NH-;

[011] R1 é hidróxi, monofosfato, difosfato, trifosfato ou polifosfato;

[012] R2 é hidrogênio ou hidróxi;

[013] R3 e R4 são, cada um independentemente:

[014] hidrogênio, hidróxi, halo ou amino; ou

[015] alquila(c<i2), alquenila<o<i2), alquinila<o<i2), arila<o^i2), aralquila<o<i2), heteroarila<o<i2), heteroaralquila<o<i2), aicóxi<o<i2), ariióxi<o<12), araicóxi<o<12), heteroariióxi<o<12), heteroaraicóxi<o<12), aiquii- amino<o<i2), diaiquilamino<o<i2), arilamino<o<i2), aralquilamino<o<i2) ou uma versão substituída de quaiquer um desses grupos; ou

[016] R5, R6, R7, R8 e R9 são, cada um independentemente:

[017] hidrogênio, hidróxi, haio, amino, nitro, ciano ou mercapto;

[018] aiquila<o<i2), alquenila<o<i2), alquinila<o<i2), arila<o<i2), aralquila<o<i2), heteroarila<o<i2), heteroaralquila<o<i2), aciia<o<i2), iaicóxi<o<i2), aiqueniióxi<o<i2), aiquiniióxi<o<i2), ariióxi<o<i2), araicóxi<o<i2), heteroariióxi<o<i2), heteroaraicóxi <o<i2), aciióxi<o<i2), aiquilamino<o<i2), diaiquilamino<o<i2), aicoxiamino<o<i2), alquenilamino<o<i2), alquinilamino<o<i2), arilamino<o<i2), aralquilamino<o<i2), heteroarilamino<o<i2), heteroaralquilamino<o<i2), aiquiisuifoniimino<o<i2), amido <o<i2), aiquiitio<o<i2), aiqueniitio<o<i2), aiquiniitio<o<i2), ariitio<o<i2), araiquiitio <o<i2), heteroariitio<o<i2), heteroaraiquiitio<o<i2), aciitio<o<i2), tioaciia<o<i2), aiquiisuifoniia<o<i2), ariisuifoniia<o<i2), aiquilamônio<o<i2), aiquiisuifônio<o<i2), aiquiisiiiia<o<i2) ou uma versão substituída de quaiquer um desses grupos;

[019] um grupo de fórmuia:

em que: X é: -O-, -S- ou -NH-; ou Alcanodi-ila(c<i2), alcenodi-ila(C<12), alcinodi-ila(C<12), arenodi- ila (C<12), heteroarenodi-ila(c<i2) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos;

[020] Y é -O-, -NH-, alcanodi-ila(C<12) ou alcanodi-ila(C<12) substituída;

[021] n é um número inteiro de 0 a 12; e

[022] m é um número inteiro de 0 a 12; ou

[023] um -ligante-repórter;

[024] ou um sal, ésteres, hidratos, solvatos, tautômeros, profármacos ou isômeros ópticos dos mesmos.

[025] Em alguns aspectos, a invenção proporciona um compost de fórmula:

em que:

[026] Z é -O-, -S-, -NH-, -OC(O)O-, -NHC(O)O-, -OC(O)NH- ou

[027] -NHC(O)NH-;

[028] R1 é hidróxi, monofosfato, difosfato, trifosfato ou polifosfato;

[029] R2 é hidrogênio ou hidróxi;

[030] R3 e R4 são, cada um independentemente:

[031] hidrogênio, hidróxi, halo ou amino; ou

[032] aiquila<o<i2), alquenila<o<i2), alquinila<o<i2), arila<o^i2), aralquila<o<i2), heteroarila<o<i2), heteroaralquila<o<i2), aicóxi<o<i2), ariióxi<o<i2), araicóxi<o<i2), heteroariióxi<o<i2), heteroaraicóxi<o<i2), aiquii- amino<o<i2), diaiquilamino<o<i2), arilamino<o<i2), aralquilamino<o<i2) ou uma versão substituída de quaiquer um desses grupos;

[033] R5, R6, R7 e R8 são, cada um independentemente:

[034] hidrogênio, hidróxi, haio, amino, nitro, ciano ou mercapto; ou

[035] aiquila<o<i2), alquenila<o<i2), alquinila<o<i2), arila<o<i2), aralquila<o<i2), heteroarila<o<i2), heteroaralquila<o<i2), aciia<o<i2), aicóxi<o<i2), aiqueniióxi<o<i2), aiquiniióxi<o<i2), ariióxi<o<i2), araicóxi<o<i2), heteroariióxi<o<i2), heteroaraicóxi<o<i2), aciióxi<o<i2), aiquilamino<o<i2), diaiquilamino<o<i2), aicoxiamino<o<i2), alquenilamino<o<i2), alquinilamino<o<i2), arilamino<o<i2), aralquilamino<o<i2), heteroarilamino<o<i2), heteroaralquilamino<o<i2), aiquiisuifoniimino<o<i2), amido <o<i2), aiquiitio<o<i2), aiqueniitio<o<i2), aiquiniitio<o<i2), ariitio<o<i2), araiquiitio <o<i2), heteroariitio<o<i2), heteroaraiquiitio<o<i2), aciitio<o<i2), tioaciia<o<i2), aiquiisuifoniia<o<i2), ariisuifoniia<o<i2), aiquilamônio<o<i2), aiquiisuifônio<o<i2), aiquiisiiiia<o<i2) ou uma versão substituída de quaiquer um desses grupos; ou

[036] um grupo de fórmula:

em que: X é: -O-, -S- ou -NH-; ou

[037] alcanodi-ila(c<i2), alcenodi-ila(c<i2), alcinodi-ila(c<i2), arenodi- ila(c<i2), heteroarenodi-ila(c<i2) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos;

[038] Y é -O-, -NH-, alcanodi-ila(C<12) ou alcanodi-ila(C<12) substituída;

[039] n é um número inteiro de 0 a 12; e

[040] m é um número inteiro de 0 a 12; ou

[041] um -ligante-repórter; e

[042] R9 é alquila(C<12), arila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos;

[043] ou um sal, ésteres, hidratos, solvatos, tautômeros, profármacos ou isômeros ópticos dos mesmos.

[044] Em algumas modalidades, o composto é ainda definido como um composto de fórmula A. Em algumas modalidades, o composto é de fórmula B. Em algumas modalidades, o composto é ainda definido como um composto de fórmula C. Em algumas modalidades, o composto é de fórmula D. Em algumas modalidades Z é -O-. Em algumas modalidades R1 é hidróxi. Em algumas modalidades, R1 é um monofosfato. Em algumas modalidades R1 é um difosfato. Em algumas modalidades R1 é um trifosfato. Em algumas modalidades R1 é um polifosfato. Em algumas modalidades R2 é hidrogênio. Em algumas modalidades R2 é hidróxi. Em algumas modalidades R3 é hidrogênio. Em algumas modalidades R3 é alquila(C<12) ou uma versão substituída da mesma. Em algumas modalidades R3 é alquila(C<8). Em algumas modalidades R3 é alquila(C<6). Em algumas modalidades R3 é selecionado do grupo consistindo em metila, etila, n-propila, isopropila e terc-butila. Em algumas modalidades R3 é metila. Em algumas modalidades R3 é alquila(C2-6). Em algumas modalidades R3 é alquila(C3- 5). Em algumas modalidades R3 é isopropila. Em algumas modalidades R3 é terc-butila. Em algumas modalidades R4 é hidrogênio. Em algumas modalidades R4 é alquila(C<12) ou uma versão substituída da mesma. Em algumas modalidades R4 é alquila(c<8). Em algumas modalidades R4 é alquila(C<6). Em algumas modalidades R4 é selecionado do grupo consistindo em metila, etila, n-propila, isopropila e terc-butila. Em algumas modalidades R4 é metila. Em algumas modalidades R4 é alquila(C2-6). Em algumas modalidades R4 é alquila(C3-5). Em algumas modalidades R4 é isopropila. Em algumas modalidades R4 é terc-butila. Em algumas modalidades R5 é hidrogênio. Em algumas modalidades R5 é ciano. Em algumas modalidades R5 é alcóxi(C<12) ou uma versão substituída do mesmo. Em algumas modalidades R5 é alcóxi(C<8). Em algumas modalidades R5 é alcóxi(C<6). Em algumas modalidades R5 é alcóxi(C<3). Em algumas modalidades R5 é metóxi. Em algumas modalidades R5 é um grupo de fórmula:

[045] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi-ila(C<12), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; e n é um número inteiro de 0 a 12.

[046] Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C^C-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades R5 é um grupo de fórmula:

[047] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi- ila(C<12), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; Y é -O-, -NH-, alcanodi-ila(c<i2) ou alcanodi-ila(C<12) substituída; n é um número inteiro de 0 a 12; e m é um número inteiro de 0 a 12. Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C^C-. Em algumas modalidades Y é -CH2-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades m é zero. Em algumas modalidades R6 é um -ligante-repórter. Em algumas modalidades o ligante é:

[048] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi- ila(C<12), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; e n é um número inteiro de 0 a 12. Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C=C-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades o ligante é:

[049] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi- ila(C<12), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; Y é -O-, -NH-, alcanodi-ila(C<12) ou alcanodi-ila(C<12) substituída; n é um número inteiro de 0 a 12; e m é um número inteiro de 0 a 12. Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C^C-. Em algumas modalidades Y é -CH2-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades m é zero. Em algumas modalidades o ligante é:

[050] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi- ila(c<i2), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; Y é -O-, -NH-, alcanodi-ila(C<12) ou alcanodi-ila(C<12) substituída; n é um número inteiro de 0 a 12; e m é um número inteiro de 0 a 12. Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C^C-. Em algumas modalidades Y é -CH2-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades m é zero. Em algumas modalidades, o repórter é baseado em um corante, em que um corante é zanteno, fluoresceína, rodamina, BODIPY, cianina, cumarina, pireno, ftalocianina, ficobiliproteína, ALEXA FLUOR® 350, ALEXA FLUOR® 405, ALEXA FLUOR® 430, ALEXA FLUOR® 488, ALEXA FLUOR® 514, ALEXA FLUOR® 532, ALEXA FLUOR® 546, ALEXA FLUOR® 555, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 594, ALEXA FLUOR® 610, ALEXA FLUOR® 633, ALEXA FLUOR® 647, ALEXA FLUOR® 660, ALEXA FLUOR® 680, ALEXA FLUOR® 700, ALEXA FLUOR® 750 ou um corante de escaraína. Em algumas modalidades o repórter é:

[051] Em algumas modalidades R6 é modalidades R6 é alcóxi(c<i2) ou uma versão substituída do mesmo. Em algumas modalidades R6 é alcóxi(c<8). Em algumas modalidades R6 é alcóxi(C<6). Em algumas modalidades R6 é alcóxi(C<3). Em algumas modalidades R6 é metóxi. Em algumas modalidades R6 é um grupo de fórmula:

[052] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi- ila(C<12), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; e n é um número inteiro de 0 a 12. Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C=C-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades R6 é um grupo de fórmula:

[053] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi- ila(C<12), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; Y é -O-, -NH-, alcanodi-ila(c<i2) ou alcanodi-ila(C<12) substituída; n é um número inteiro de 0 a 12; e m é um número inteiro de 0 a 12. Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C^C-. Em algumas modalidades Y é -CH2-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades m é zero. Em algumas modalidades R6 é a -ligante-repórter. Em algumas modalidades o ligante é:

[054] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi- ila(C<12), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; e n é um número inteiro de 0 a 12. Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C=C-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades o ligante é:

[055] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi- ila(C<12), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; Y é -O-, -NH-, alcanodi-ila(C<12) ou alcanodi-ila(C<12) substituída; n é um número inteiro de 0 a 12; e m é um número inteiro de 0 a 12. Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C^C-. Em algumas modalidades Y é -CH2-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades m é zero. Em algumas modalidades o ligante é:

[056] em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodi-ila(C<12), alcenodi- ila(c<i2), alcinodi-ila(C<12), arenodi-ila(C<12), heteroarenodi-ila(C<12) ou uma versão substituída de qualquer um desses grupos; Y é -O-, -NH-, alcanodi-ila(C<12) ou alcanodi-ila(C<12) substituída; n é um número inteiro de 0 a 12; e m é um número inteiro de 0 a 12. Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C<12). Em algumas modalidades X é alcinodi-ila(C2-8). Em algumas modalidades X é -C^C-. Em algumas modalidades Y é -CH2-. Em algumas modalidades n é zero. Em algumas modalidades m é zero. Em algumas modalidades o repórter é baseado em um corante, em que um corante é zanteno, fluoresceína, rodamina, BODIPY, cianina, cumarina, pireno, ftalocianina, ficobiliproteína, ALEXA FLUOR® 350, ALEXA FLUOR® 405, ALEXA FLUOR® 430, ALEXA FLUOR® 488, ALEXA FLUOR® 514, ALEXA FLUOR® 532, ALEXA FLUOR® 546, ALEXA FLUOR® 555, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 594, ALEXA FLUOR® 610, ALEXA FLUOR® 633, ALEXA FLUOR® 647, ALEXA FLUOR® 660, ALEXA FLUOR® 680, ALEXA FLUOR® 700, ALEXA FLUOR® 750 ou um corante de escaraína. Em algumas modalidades o repórter é:

[057] Em algumas modalidades R7 é modalidades R8 é hidrogênio. Em algumas modalidades R8 é nitro. Em algumas modalidades R8 é alquila(c<i2) ou uma versão substituída da mesma. Em algumas modalidades R8 é alquila(c<8). Em algumas modalidades R8 é alquila(C<6). Em algumas modalidades R8 é alquila(C<3). Em algumas modalidades R8 é metila. Em algumas modalidades R9 é hidrogênio. Em algumas modalidades R9 é nitro. Em algumas modalidades R9 é alquila(C<12) ou uma versão substituída da mesma. Em algumas modalidades R9 é alquila(C<8). Em algumas modalidades R9 é alquila(C<6). Em algumas modalidades R9 é selecionado do grupo consistindo em metila, etila, n-propila, isopropila e terc-butila. Em algumas modalidades R9 é metila. Em algumas modalidades R9 é alquila(C2-6). Em algumas modalidades R9 é alquila(C3-5). Em algumas modalidades R9 é isopropila. Em algumas modalidades R9 é terc-butila. Em algumas modalidades R9 é arila(C<12) ou uma versão substituída da mesma. Em algumas modalidades R9 é arila(C<8). Em algumas modalidades R9 é fenila.

[058] Em algumas modalidades, a invenção provê um compost da fórmula:

[059] Em algumas modalidades, o composto é um sal da formula acima. Em algumas modalidades, o composto é uma mistura a 50:50 de R: S -α-carbono de diastereômeros de qualquer uma das fórmulas acima ou sais dos mesmos, que têm um estereocentro no α-carbono. Em algumas modalidades, o composto é predominantemente um diastereômero substancialmente isento de outros isômeros ópticos dos mesmos. Por exemplo, em algumas modalidades, a presente descrição proporciona qualquer um dos diastereômeros a seguir ou sais dos mesmos, substancialmente isento de outros isômeros ópticos dos mesmos:

[060] Em algumas modalidades, o sal de qualquer uma das fórmulas ou diastereômeros acima compreende um cátion monovalente. Em algumas modalidades, o cátion monovalente é lítio. Em algumas modalidades, o cátion monovalente é sódio. Em algumas modalidades, o cátion monovalente é potássio. Em algumas modalidades, o sal compreende um cátion divalente. Em algumas modalidades, o cátion divalente é cálcio, magnésio ou manganês(II). Em algumas modalidades, o sal compreende um cátion selecionado do grupo consistindo em amônio, tri-n-butil amônio e (HOCH2)3CNH3+.

[061] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de sequenciamento de um ácido nucleico-alvo compreendendo as etapas a seguir: (i) fixação da extremidade 5’ de um iniciador a uma superfície sólida; (ii) hibridização de um ácido nucleico-alvo ao iniciador preso à superfície sólida; (iii) adição de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 293, contando que onde mais de um tipo de base está presente, cada base é presa a um grupo repórter diferente; (iv) adição de uma enzima de replicação de ácido nucleico ao complexo de iniciador/alvo hibridizado para incorporar a composição da etapa (iii) na fita do iniciador em crescimento, em que a composição incorporada da etapa (iii) termina a reação de polimerase em uma eficiência de entre cerca de 70% a cerca de 100%; (v) lavagem da superfície sólida para remover os componentes não incorporados; (vi) detecção do grupo repórter incorporado para identificar a composição incorporada da etapa (iii); (vii) uma etapa de clivagem para remover a porção terminal, resultando em um iniciador estendido com bases que ocorrem naturalmente; (viii) lavagem da superfície sólida para remover o grupo terminal clivado; e (ix) repetição das etapas (iii) a (viii) uma ou mais vezes para identificar a pluralidade de bases no ácido nucleico-alvo.

[062] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de sequenciamento de um ácido nucleico-alvo compreendendo as seguintes etapas: (i) fixação da extremidade 5’ de um ácido nucleico-alvo a uma superfície sólida; (ii) hibridização de um iniciador ao ácido nucleico preso a uma superfície sólida; (iii) adição de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 293, contando que onde mais de um tipo de base está presente, cada base é presa a um grupo repórter diferente; (iv) adição de uma enzima de replicação de ácido nucleico ao complexo de iniciador/alvo hibridizado para incorporar a composição da etapa (iii) na fita do iniciador em crescimento, em que a composição incorporada da etapa (iii) termina a reação de polimerase em uma eficiência de entre cerca de 70% a cerca de 100%; (v) lavagem da superfície sólida para remover os componentes não incorporados; (vi) detecção do grupo repórter incorporado para identificar a composição incorporada da etapa (iii); (vii) opcionalmente, adição de um ou mais compostos químicos para revestir permanentemente iniciadores não estendidos; (viii) uma etapa de clivagem para remover a porção terminal, resultando em um iniciador estendido com bases que ocorrem naturalmente; (ix) lavagem da superfície sólida para remover o grupo terminal clivado; e (x) repetição das etapas (iii) a (ix) uma ou mais vezes para identificar a pluralidade de bases no ácido nucleico-alvo.

[063] Em algumas modalidades, o composto é incorporado por uma enzima de replicação de ácido nucleico que é uma DNA polimerase. Em algumas modalidades, a DNA polimerase é selecionada do grupo consistindo em Taq DNA polimerase, Klenow(exo-) DNA polimerase, Bst DNA polimerase, VENT® (exo-) DNA polimerase (DNA polimerase A clonada de Thermococcus litoralis e contendo as mutações D141A e E143A), Pfu(exo-) DNA polimerase e DEEPVENT® (exo-) DNA polimerase (DNA polimerase A, clonada da espécie Pirococcus GB-D e contendo as mutações D141A e E143A). Em algumas modalidades, a DNA polimerase é selecionada do grupo consistindo em AMPLITAQ® DNA polimerase, FS (Taq DNA polimerase que contém as mutações G46D e F667Y), THERMOSEQUENASE® DNA polimerase (Taq DNA polimerase que contém a mutação F667Y), THERMOSEQUENASE® II DNA polimerase (mistura de THERMOSEQUENASE® DNA polimerase e pirofosfatase de T. acidophilum), THERMINATOR® DNA polimerase (DNA polimerase A, clonada da espécie Thermococcus 9°N-7 e contendo as mutações D141A, E143A e A485L), THERMINATOR® II DNA polimerase (THERMINATOR® DNA polimerase que contém a mutação adicional Y409V) e VENT® (exo-) A488L DNA polimerase (VENT® (exo-) DNA polimerase que contém a mutação A488L). Em algumas modalidades, a clivagem da porção terminal é uma clivagem química, uma fotoclivagem, clivagem eletroquímica ou enzimática. Em algumas modalidades, a clivagem química é realizada usando um catalisador ou reagente estequiométrico. Em algumas modalidades, o catalisador é homogêneo ou heterogêneo. Em algumas modalidades, o catalisador heterogêneo compreende Paládio. Em algumas modalidades, o catalisador homogêneo compreende Paládio. Em algumas modalidades, 85% a 100% das porções terminais fotocliváveis são removidas por meio de foto-clivagem. Em algumas modalidades, a fotoclivagem é realizada usando um comprimento de onda de luz oscilando entre 300 nm a 400 nm. Em algumas modalidades, 85% a 100% das porções terminais fotocliváveis são removidas por meio de fotoclivagem. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de realização de sequenciamento de Sanger ou do tipo Sanger usando um composto descrito aqui. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de realização de piro-sequenciamento ou sequenciamento do tipo piro-sequenciamento usando um composto descrito aqui.

[064] Exemplos não limitativos de compostos fornecidos pela presente invenção incluem os compostos de acordo com as fórmulas mostradas abaixo. Em determinadas modalidades, esses compostos são substancialmente isentos de outros isômeros ópticos dos mesmos.

[065] Outros objetivos, características e vantagens da presente descrição se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Deverá ser entendido, contudo, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades específicas da invenção, são fornecidos à guisa de ilustração apenas, uma vez que diversas alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir dessa descrição detalhada. Nota-se que, simplesmente em virtude de ser atribuída a um composto em particular uma fórmula genérica em particular não significa que ele não pode também pertencer à outra fórmula genérica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[066] Os desenhos a seguir formam parte da presente especificação e são incluídos para demonstrar adicionalmente determinados aspectos da presente descrição. A invenção pode ser melhor entendida por meio de referência a um desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas aqui.

[067] FIGURA 1. Ensaio de incorporação: dCTP natural e um análogo de dCTP modificado foram ensaiados com relação à incorporação sobre um padrão com uma base "G" complementar.

[068] FIGURA 2. Dados de cristalografia por raios X de (1S)-canfanato de (S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-1-propila: C20H25NO6, M = 375,41, lâmina incolor, 0,26 x 0,24 x 0,10 mm3, ortorrômbico, grupo espacial P212121 (No. 19), a = 11,9268(15), b = 11,9812(14), c =13,5488(16) Â, V = 1936,1(4) A3, Z = 4, D c = 1,288 g/cm3, F000 = 800, detector de área MWPC, radiação CuKα, X = 1,54178 Â, T = 110(2)K, 26max = 120,0°, 22896 reflexões coletadas, 2665 únicas (Rin = 0,0462). GooF final = 1,009, R1 = 0,0219, wR2 = 0,0554, índices R baseados em 2629 reflexões com I >2sigma(I) (refino sobre F2), 245 parâmetros, 0 restrições. Lp e correções de absorção aplicadas, □ μ = 0,787 mm-1. Parâmetro de estrutura absoluta = 0,09(5).

[069] FIGURA 3. Dados de cristalografia por raios X para (1S)- canfanato de (R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propila: Dados de cristal para lg01a: C20H24INO6, M = 501,30, lâmina incolor, 0,30 x 0,20 x 0,20 mm3, monoclínica, grupo espacial P21 (No. 4), a = 7,5810(15), b = 12,446(3), c = 11,722(3) A, □ β = 107,613(10)°, V = 1054,2(4) A3, Z = 2, D c = 1,579 g/cm3, F000 = 504, detector de área CCD, radiação MoKa, □ X = 0,71073 A, T = 110(2)K, 2ómax = 50,0°, 24239 reflexões coletadas, 3558 únicas (Rint = 0,0302). GooF final = 1,010, R1 = 0,0123, wR2 = 0,0316, índices R baseados em 3520 reflexões com I >2sigma(I) (refino sobre F2), 253 parâmetros, 3 restrições. Lp e correções de absorção aplicadas, μ = 1,554 mm-1. Parâmetro de estrutura absoluta = 0,020(9).

[070] FIGURA 4. Traço, por HPLC, de hidrogenólise de 5-benzi- lóximetil-2’-deoxiuridina.

[071] FIGURA 5. Traço, por HPLC, de hidrogenólise de 5-(1-fenil- 2-metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS I. Definições

[072] Quando usado no contexto de um grupo químico, "hidrogênio" significa -H; "hidróxi" significa -OH; "oxo" significa =O; "halo" significa, independentemente, -F, -Cl, -Br ou -I; "amino" significa -NH2 (vide abaixo para definições de grupos contendo o termo amino, por exemplo, alquilamino); "hidroxiamino" significa -NHOH; "nitro" significa -NO2; imino significa =NH (vide abaixo para definições de grupos contendo o termo imino, por exemplo, alquilimino); "ciano" significa -CN; "azido" significa -N3; em um contexto monovalente, "fosfato" significa -OP(O)(OH)2 ou uma forma desprotonada do mesmo; em um contexto divalente, "fosfato" significa -OP(O)(OH)O- ou uma forma desprotonada do mesmo; "mercapto" significa -SH; "tio" significa =S; "tioéter" significa -S-; "sulfonamido" significa -NHS(O)2- (vide abaixo para definições de grupos contendo o termo sulfonamido, por exemplo, alquilsulfonamido); "sulfonila" significa -S(O)2- (vide abaixo para definições de grupos contendo o termo sulfonila, por exemplo, alquilsulfonila); "sulfinila" significa -S(O)- (vide abaixo para definições de grupos contendo o termo sulfinila, por exemplo, alquilsulfinila); e "silila" significa -SiH3 (vide abaixo para definições de grupos contendo o termo silila, por exemplo, alquilsilila).

[073] O símbolo "-" significa uma ligação simples, "=" significa uma ligação dupla e "=" significa uma ligação tripla. O símbolo "—" representa uma ligação simples ou uma ligação dupla. O símbolo "«MA ", quando desenhado perpendicularmente através de uma ligação, indica um ponto de fixação do grupo. Deve ser notado que o ponto de fixação é, tipicamente, identificado dessa maneira apenas para grupos maiores de forma a auxiliar o leitor em uma identificação rápida e inequívoca de um ponto de fixação. O símbolo "^" significa uma ligação simples onde o grupo preso à extremidade aderente da borda está "fora da página". O símbolo " significa uma ligação simplesonde o grupo preso à extremidade aderente da borda está "na página". O símbolo "^vx" significa uma ligação simples onde a conformação é desconhecida (por exemplo, R ou S), a geometria é desconhecida (por exemplo, E ou Z) ou o composto está presente como uma mistura de conformações ou geometrias (por exemplo, uma mistura a 50%/50%).

[074] Quando um grupo "R" é representado como um "grupo flutuante" sobre um sistema de anel, por exemplo, na fórmula:

[075] então, R pode substituir qualquer átomo de hidrogênio preso a qualquer um dos átomos no anel, incluindo um hidrogênio representado, implícito ou expressamente definido, na medida em que uma estrutura estável seja formada.

[076] Quando um grupo "R" é representado como um grupo "flutuante" sobre um sistema de anel fundido, como por exemplo na fórmula:

[077] então, R pode substituir qualquer hidrogênio preso a qualquer um dos átomos no anel de qualquer um dos anéis fundidos, a menos que de outro modo especificado. Hidrogênios passíveis de substituição incluem hidrogênios representados (por exemplo, o hidrogênio preso ao nitrogênio na fórmula acima), hidrogênios implicados (por exemplo, um hidrogênio da fórmula acima que não é mostrado, mas entendido como estando presente), hidrogênios expressamente definidos e hidrogênios opcionais cuja presença depende da identidade do átomo no anel (por exemplo, um hidrogênio preso a um grupo X, quando X é igual a -CH-), na medida em que uma estrutura estável seja formada. No exemplo representado, R pode estar sobre o anel de 5 elementos ou de 6 elementos do sistema de anel fundido. Na fórmula acima, a letra subscrita "y" imediatamente após o grupo "R" entre parênteses representa uma variável numérica. A menos que de outro modo especificado, essa variável pode ser 0, 1, 2 ou qualquer número inteiro maior do que 2, limitado apenas pelo número máximo de átomos de hidrogênio passíveis de substituição do sistema de anel ou anel.

[078] Quando y é 2 e "(R)y" é representado como um grupo flutuante sobre um sistema de anel tendo um ou mais átomos no anel tendo dois hidrogênios passíveis de substituição, por exemplo, um carbono saturado no anel, como por exemplo na fórmula:

[079] então, cada um dos grupos R pode residir sobre o mesmo ou um átomo diferente no anel. Por exemplo, quando R é metila e ambos os grupos R são presos ao mesmo átomo no anel, um grupo dimetila geminal resulta. Onde especificamente determinado, dois grupos R podem ser tomados juntos para formar um grupo divalente, tal como um dos grupos divalentes ainda definidos abaixo. Quando tal grupo divalente é preso ao mesmo átomo no anel, uma estrutura de anel espirocíclica resultará.

[080] Quando o ponto de fixação é representado como "flutuante", por exemplo, na fórmula:

[081] então, o ponto de fixação pode substituir qualquer átomo de hidrogênio passível de substituição sobre qualquer um dos átomos no anel de qualquer um dos anéis fundidos, a menos que de outro modo especificado.

[082] No caso de um grupo R duplamente ligado (por exemplo, oxo, imino, tio, alquilideno, etc.), qualquer par de átomos de hidrogênio implícito ou explicito preso a um átomo no anel pode ser substituído pelo grupo R. Esse conceito é exemplificado abaixo:

representa

[083] Para os grupos abaixo, os subscritos entre parênteses a seguir definem os grupos como segue: "(Cn)" define o número exato (n) de átomos de carbono no grupo. "(C<n)" define o número máximo (n) de átomos de carbono que pode haver no grupo, com o número mínimo de átomos de carbono em tais casos sendo de pelo menos um mas, de outro modo, tão pequeno quanto possível para o grupo em questão. Por exemplo, deve ser entendido que o número mínimo de átomos de carbono no grupo "alquenila(C<8)" é dois. Por exemplo, "alcóxi(C<10)" designa aqueles grupos alcóxi tendo de 1 a 10 átomos de carbono (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou qualquer faixa derivável na mesma (por exemplo, 3 a 10 átomos de carbono). (Cn-n‘) define os números mínimo (n) e máximo (n‘) de átomos de carbono no grupo. Similarmente, "alquila(C2-10)" designa aqueles grupos alquila tendo de 2 a 10 átomos de carbono (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou qualquer faixa derivável na mesma (por exemplo, 3 a 10 átomos de carbono)).

[084] O termo "alquila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo monovalente não aromático com um átomo de carbono saturado como o ponto de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, nenhuma ligação dupla ou tripla carbono-carbono e nenhum outro átomo que não carbono e hidrogênio. Os grupos -CH3 (Me), -CH2CH3 (Et), -CH2CH2CH3 (n-Pr), - CH(CH3)2 (iso-Pr), -CH(CH2)2 (ciclopropila), -CH2CH2CH2CH3 (n-Bu), - CH(CH3)CH2CH3 (sec-butila), -CH2CH(CH3)2 (iso-butila), -C(CH3)3 (terc- butila), -CH2C(CH3)3 (neo-pentila), ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila e ciclo-hexilmetila são exemplos não limitativos de grupos alquila. O termo "alquila substituída" refere-se a um grupo monovalente não aromático com um átomo de carbono saturado como o ponto de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, nenhuma ligação dupla ou tripla carbono-carbono e pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S. Os grupos a seguir são exemplos não limitativos de grupos alquila substituídos: -CH2OH, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2SH, -CF3, -CH2CN, -CH2C(O)H, -CH2C(O)OH, -CH2C(O)OCH3, -CH2C(O)NH2, - CH2C(O)NHCH3, -CH2C(O)CH3, -CH2OCH3, -CH2OCH2CF3, -CH2OC(O)CH3, -CH2NH2, -CH2NHCH3, -CH2N(CH3)2, -CH2CH2Cl, -CH2CH2OH, -CH2CF3, -CH2CH2OC(O)CH3, -CH2CH2NHCO2C(CH3)3 e -CH2Si(CH3)3.

[085] O termo "alcanodi-ila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo divalente não aromático, em que o grupo alcanodi-ila é preso com duas ^-ligações, com um ou dois átomos de carbono saturados como o ponto de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, nenhuma ligação dupla ou tripla carbono-carbono e nenhum outro átomo que não carbono e hidrogênio. Os grupos -CH2- (metileno), -CH2CH2-, -CH2C(CH3)2CH2-, -CH2CH2CH2- e

são exemplos não limitativos de grupos alcanodi-ila. O termo "alcanodi-ila substituída" refere-se a um grupo monovalente não aromático, em que o grupo alcinodi-ila é preso com duas ^-ligações, com um ou dois átomos de carbono saturados como o ponto de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, nenhuma ligação dupla ou tripla carbono-carbono e pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S. Os grupos a seguir são exemplos não limitativos de grupos alcanodi-ila substituídos: -CH(F)-, -CF2-, -CH(Cl)-, -CH(OH)-, - CH(OCH3)- e -CH2CH(Cl)-.

[086] O termo "alquenila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono não aromático como o ponto de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono não aromática, nenhuma ligação tripla carbono- carbono e nenhum outro átomo que não carbono e hidrogênio. Exemplos não limitativos de grupos alquenila incluem: -CH=CH2 (vinila), -CH=CHCH3, -CH=CHCH2CH3, -CH2CH=CH2 (alila), -CH2CH=CHCH3 e -CH=CH-C6H5. O termo "alquenila substituída" refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono não aromático como o ponto de fixação, pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono não aromática, nenhuma ligação tripla carbono-carbono, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica e pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S. Os grupos -CH=CHF, -CH=CHCl e -CH=CHBr são exemplos não limitativos de grupos alquenila substituídos.

[087] O termo "alcenodi-ila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo divalente não aromático, em que o grupo alcenodi-ila é preso com duas ^-ligações, com dois átomos de carbono como pontos de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, pelo menos uma ligação dupla carbono- carbono não aromática, nenhuma ligação tripla carbono-carbono e nenhum outro átomo que não carbono e hidrogênio. Os grupos - CH=CH-, -CH=C(CH3)CH2-, -CH=CHCH2- e

são exemplos no limitativos de grupos alcenodi-ila. O termo "alcenodi-ila substituída" refere-se a um grupo divalente não aromático, em que o grupo alcenodi- ila é preso com duas ^-ligações, com dois átomos de carbono como pontos de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono não aromática, nenhuma ligação tripla carbono-carbono e pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S. Os grupos a seguir são exemplos não limitativos de grupos alcenodi-ila substituídos: -CF=CH-, -C(OH)=CH- e - CH2CH=C(Cl)-.

[088] O termo "alquinila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono não aromático como o ponto de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e nenhum outro átomo que não carbono e hidrogênio. Os grupos -C^CH, -C=CCH 3, -C=CC6H5 e -CH2CHCCH3 são exemplos não limitativos de grupos alquinila. O termo "alquinila substituída" refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono não aromático como o ponto de fixação e pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica e pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S. O grupo -C=CSi(CH3)3 é um exemplo não limitativo de um grupo alquinila substituído.

[089] O termo "alcinodi-ila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo divalente não aromático, em que o grupo alcinodi-ila é preso com duas G-ligações, com dois átomos de carbono como pontos de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e nenhum outro átomo que não carbono e hidrogênio. Os grupos -C^C- , -C=CCH2- e -C=CCH(CH3)- são exemplos não limitativos de grupos alcinodi-ila. O termo "alcinodi-ila substituída" refere-se a um grupo divalente não aromático, em que o grupo alcinodi-ila é preso com duas G-ligações, com dois átomos de carbono como pontos de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S. Os grupos -C^CCFH- e -CnCHCH(Cl)- são exemplos não limitativos de grupos alcinodi-ila substituídos.

[090] O termo "arila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono aromático como o ponto de fixação, o referido átomo de carbono formando parte de uma ou mais estruturas de anel aromático com seis elementos, em que os átomos no anel são todos carbono e em que um grupo monovalente não consiste em nenhum outro átomo que não carbono e hidrogênio. Exemplos não limitativos de grupos arila incluem fenila (Ph), metilfenila, (dimetil)fenila, -C6H4CH2CH3 (etilfenila), -C6H4CH2CH2CH3 (propilfenila), -C6H4CH(CH3)2, -C6H4CH(CH2)2, -C6H3(CH3)CH2CH3 (metiletilfenila), -C6H4CH=CH2 (vinilfenila), - C6H4CH=CHCH3, -C6H4CHCH, -C6H4CHCCH3, naftila e um grupo monovalente derivado de bifenila. O termo "arila substituída" refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono aromático como o ponto de fixação, o referido átomo de carbono formando parte de uma ou mais estruturas de anel aromático com seis elementos, em que os átomos no anel são todos carbono e em que um grupo monovalente tem ainda pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S. Exemplos não limitativos de grupos arila substituídos incluem os grupos: -C6H4F, -C6H4Cl, -C6H4Br, - C6H4I, -C6H4OH, -C6H4OCH3, -C6H4OCH2CH3, -C6H4OC(O)CH3, - C6H4NH2, -C6H4NHCH3, -C6H4N(CH3)2, -C6H4CH2OH, - C6H4CH2OC(O)CH3, -C6H4CH2NH2, -C6H4CF3, -C6H4CN, -C6H4CHO, - C6H4CHO, -C6H4C(O)CH3, -C6H4C(O)C6H5, -C6H4CO2H, -C6H4CO2CH3, -C6H4CONH2, -C6H4CONHCH3 e -C6H4CON(CH3)2.

[091] O termo "arenodi-ila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo divalente, em que o grupo arenodi- ila é preso com duas ^-ligações, com dois átomos de carbono aromáticos como pontos de fixação, os referidos átomos de carbono formando parte de uma ou mais estruturas de anel aromático com seis elementos, em que os átomos no anel são todos carbono e em que um grupo monovalente não consiste em nenhum outro átomo que não carbono e hidrogênio. Exemplos não limitativos de grupos arenodi-ila incluem:

[092] O termo "arenodi-ila substituída" refere-se a um grupo divalente, em que o grupo arenodi-ila é preso com duas ^-ligações, com dois átomos de carbono aromáticos como pontos de fixação, os referidos átomos de carbono formando parte de uma ou mais estruturas de anel aromático com seis elementos, em que os átomos no anel são carbono e em que o grupo divalente tem ainda pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S.

[093] O termo "aralquila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo monovalente -alcanodi-il-arila, no qual os termos alcanodi-ila e arila são, cada um, usados de uma maneira consistente com as definições fornecidas acima. Exemplos não limitativos de aralquilas são: fenilmetila (benzila, Bn), 1-fenil-etila, 2- fenil-etila, indenila e 2,3-di-hidro-indenila, contanto que indenila e 2,3-di- hidro-indenila são exemplos de aralquila apenas na medida em que o ponto de fixação, em cada caso, seja um dos átomos de carbono saturados. Quando o termo "aralquila" é usado com o modificador "substituído", uma ou ambas da alcanodi-ila e da arila é substituída. Exemplos não limitativos de aralquilas substituídas são: (3-clorofenil)- metila, 2-oxo-2-fenil-etila (fenilcarbonilmetila), 2-cloro-2-fenil-etila, cromanila onde o ponto de fixação é um dos átomos de carbono saturados e tetra-hidroquinolinila, onde o ponto de fixação é um dos átomos saturados.

[094] O termo "heteroarila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono ou átomo de nitrogênio aromático como o ponto de fixação, o referido átomo de carbono ou átomo de nitrogênio formando parte de uma estrutura de anel aromático em que pelo menos um dos átomos no anel é nitrogênio, oxigênio ou enxofre e em que um grupo monovalente não consiste em nenhum outro átomo que não carbono, hidrogênio, nitrogênio aromático, oxigênio aromático e enxofre aromático. Exemplos não limitativos de grupos arila incluem acridinila, furanila, imidazoimidazolila, imidazopirazolila, imidazopiridinila, imidazopirimidinila, indolila, indazolinila, metilpiridila, oxazolila, fenilimidazolila, piridila, pirrolila, pirimidila, pirazinila, quinolila, quinazolila, quinoxalinila, tetra-hidroquinolinila, tienila, triazinila, pirrolopiridinila, pirrolopirimidinila, pirrolopirazinila, pirrolotriazinila, pirroloimidazolila, cromenila (onde o ponto de fixação é um dos átomos aromáticos) e cromanila (onde o ponto de fixação é um dos átomos aromáticos). O termo "heteroarila substituída" refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono ou átomo de nitrogênio aromático como o ponto de fixação, o referido átomo de carbono ou átomo de nitrogênio formando parte de uma estrutura de anel aromático em que pelo menos um dos átomos no anel é nitrogênio, oxigênio ou enxofre e em que um grupo monovalente tem ainda pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em nitrogênio não aromático, oxigênio não aromático, enxofre não aromático, F, Cl, Br, I, Si e P.

[095] O termo "heteroarenodi-ila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo divalente, em que o grupo heteroarenodi-ila é preso com duas G-ligações, com um átomo de carbono ou átomo de nitrogênio aromático como o ponto de fixação, o referido átomo de carbono ou átomo de nitrogênio formando parte de uma ou mais estruturas de anel aromático em que pelo menos um dos átomos no anel é nitrogênio, oxigênio ou enxofre e em que o grupo divalente não consiste em nenhum outro átomo que não carbono, hidrogênio, nitrogênio aromático, oxigênio aromático e enxofre não aromático. Exemplos não limitativos de grupos heteroarenodi-ila incluem:

[096] O termo "heteroarenodi-ila substituída" refere-se a um grupo divalente, em que o grupo heteroarenodi-ila é preso com duas G- ligações, com um átomo de carbono aromático ou átomo de nitrogênio como o ponto de fixação, o referido átomo de carbono ou átomo de nitrogênio formando parte de uma ou mais estruturas com anel aromático de seis elementos, em que pelo menos um dos átomos no anel é nitrogênio, oxigênio ou enxofre e em que o grupo divalente tem ainda pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em nitrogênio não aromático, oxigênio não aromático, enxofre não aromático F, Cl, Br, I, Si e P.

[097] O termo "heteroaralquila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo monovalente -alcanodi-il-heteroarila, no qual os termos alcanodi-ila e heteroarila são, cada um, usados de uma maneira consistente com as definições fornecidas acima. Exemplos não limitativos de aralquilas são: piridilmetila e tienilmetila. Quando o termo "heteroaralquila" é usado com o modificador "substituído", qualquer uma ou ambas a alcanodi-ila e a heteroarila são substituídas.

[098] O termo "acila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono de um grupo carbonila como o ponto de fixação, tendo ainda uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, não tendo outros átomos adicionais que não são carbono ou hidrogênio, além do átomo de oxigênio do grupo carbonila. Os grupos -CHO, -C(O)CH3 (acetila, Ac), -C(O)CH2CH3, -C(O)CH2CH2CH3, -C(O)CH(CH3)2, - C(O)CH(CH2)2, -C(O)C6H5, -C(O)C6H4CH3, -C(O)C6H4CH2CH3, - COC6H3(CH3)2 e -C(O)CH2C6H5 são exemplos não limitativos de grupos acila. O termo "acila", portanto, abrange, mas não está limitado a grupos algumas vezes referidos como grupos "alquil carbonila" e "aril carbonila". O termo "acila substituída" refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono de um grupo carbonila como o ponto de fixação, tendo ainda uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, tendo ainda pelo menos um átomo, além do oxigênio do grupo carbonila, independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S. Os grupos -C(O)CH2CF3, - CO2H (carboxila), -CO2CH3 (metilcarboxila), -CO2CH2CH3, - CO2CH2CH2CH3, -CO2C6H5, -CO2CH(CH3)2, -CO2CH(CH2)2, -C(O)NH2 (carbamoíla), -C(O)NHCH3, -C(O)NHCH2CH3, -CONHCH(CH3)2, - CONHCH(CH2)2, -CON(CH3)2, -CONHCH2CF3, -CO-piridila, -CO-imidazoíla e -C(O)N3 são exemplos não limitativos de grupos acila substituídos. O termo "acila" abrange, mas não está limitado a grupos "heteroaril carbonila".

[099] O termo "alquilideno", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo divalente =CRR‘, em que o grupo alquilideno é preso com uma ^-ligação e uma K-ligação, no qual R e R‘ são independentemente hidrogênio, alquila ou R e R‘ são tomados juntos para representar alcanodi-ila. Exemplos não limitativos de grupos alquilideno incluem: =CH2, =CH(CH2CH3) e =C(CH3)2. O termo "alquilideno substituído" refere-se ao grupo =CRR\ em que o grupo alquilideno é preso com uma ^-ligação e uma K-ligação, no qual R e R‘ são independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituída ou R e R‘ são tomados juntos para representar a alcanodi-ila substituída, contanto que um de R e R‘ seja uma alquila substituída ou R e R‘ sejam tomados juntos para representar uma alcanodi-ila substituída.

[0100] O termo "alcóxi", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -OR, no qual R é uma alquila, conforme esse termo é definido acima. Exemplos não limitativos de grupos alcóxi incluem: -OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -OCH(CH3)2, -OCH(CH2)2, -O-ciclopentila e -O-ciclo-hexila. O termo "alcóxi substituído" refere-se ao grupo -OR, no qual R é uma alquila substituída, conforme esse termo é definido acima. Por exemplo, -OCH2CF3 é um grupo alcóxi substituído.

[0101] Similarmente, os termos "alquenilóxi", "alquinilóxi", "arilóxi", "aralcóxi", "heteroarilóxi", "heteroaralcóxi" e "acilóxi", quando usados sem o modificador "substituído", referem-se a grupos definidos como - OR, no qual R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila, heteroaralquila e acila, respectivamente, conforme esses termos são definidos. Quando qualquer um dos termos alquenilóxi, alquinilóxi, arilóxi, aralquilóxi e acilóxi é modificado por "substituído," ele refere-se ao grupo -OR, no qual R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila, heteroaralquila e acila substituída, respectivamente.

[0102] O termo "alquilamino", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -NHR, no qual R é uma alquila, conforme esse termo é definido acima. Exemplos não limitativos de grupos alquilamino incluem: -NHCH3, -NHCH2CH3, -NHCH2CH2CH3, - NHCH(CH3)2, -NHCH(CH2)2, -NHCH2CH2CH2CH3, -NHCH(CH3)CH2CH3, -NHCH2CH(CH3)2, -NHC(CH3)3, -NH-ciclopentila e -NH-ciclo-hexila. O termo "alquilamino substituído" refere-se ao grupo - NHR, no qual R é uma alquila substituída, conforme esse termo é definido acima. Por exemplo, -NHCH2CF3 é um grupo alquilamino substituído.

[0103] O termo "dialquilamino", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -NRR’, no qual R e R‘ podem ser os mesmos ou diferentes grupos alquila ou R e R‘ podem ser tomados juntos para representar uma alcanodi-ila tendo dois ou mais átomos de carbono saturados, pelo menos dois dos quais são presos ao átomo de nitrogênio. Exemplos não limitativos de grupos dialquilamino incluem: - NHC(CH3)3, -N(CH3)CH2CH3, -N(CH2CH3)2, N-pirrolidinila e N- piperidinila. O termo "dialquilamino substituído" refere-se ao grupo - NRR’, no qual R e R‘ podem ser os mesmos ou diferentes grupos alquila substituídos, um de R ou R‘ é uma alquila e o outro é uma alquila substituída ou R e R‘ podem ser tomados juntos para representar a alcanodi-ila substituída com dois ou mais átomos de carbono saturados, pelo menos dois dos quais são presos ao átomo de nitrogênio.

[0104] Os termos "alcoxiamino", "alquenilamino", "alquinilamino", "arilamino", "aralquilamino", "heteroarilamino", "heteroaralquilamino" e "alquilsulfonilmino", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a grupos definidos como -NHR, no qual R é alcóxi, alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila, heteroaralquila e alquilsulfonila, respectivamente, conforme esses termos são definidos. Um exemplo não limitativo de um grupo arilamino é -NHC6H5. Quando qualquer um dos termos alcoxiamino, alquenilamino, alquinilamino, arilamino, aralquilamino, heteroarilamino, heteroaralquilamino e alquilsulfonilmino é modificado por "substituído," ele refere-se ao grupo -NHR, no qual R é alcóxi, alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila, heteroaralquila e alquilsulfonila substituída, respectivamente.

[0105] O termo "amido" (acilamino), quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -NHR, no qual R é acila, conforme esse termo é definido acima. Um exemplo não limitativo de um grupo acilamino é -NHC(O)CH3. Quando o termo amido é usado com o modificador "substituído", ele refere-se a grupos definidos como - NHR, no qual R é acila substituída, conforme esse termo é definido acima. Os grupos -NHC(O)OCH3 e -NHC(O)NHCH3 são exemplos não limitativos de grupos amido substituídos.

[0106] O termo "alquilimino", quando usado sem o modificador"substituído", refere-se ao grupo =NR, em que o grupo alquilimino é preso com uma a-ligação e uma K-ligação, no qual R é uma alquila, conforme esse termo é definido acima. Exemplos não limitativos de grupos alquilimino incluem: =NCH3, =NCH2CH3 e =N-ciclo-hexila. O termo "alquilimino substituído" refere-se ao grupo =NR, em que o grupo alquilimino é preso com uma a-ligação e uma K-ligação, no qual R é uma alquila substituída, conforme esse termo é definido acima. Por exemplo, =NCH2CF3 é um grupo alquilimino substituído.

[0107] Similarmente, os termos "alquenilimino", "alquinilimino", "arilimino", "aralquilimino", "heteroarilimino", "heteroaralquilimino" e "acilimino", quando usados sem o modificador "substituído", referem-se a grupos definidos como =NR, em que o grupo alquilimino é preso com uma G-ligação e uma K-ligação, no qual R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila, heteroaralquila e acila, respectivamente, conforme esses termos são definidos. Quando qualquer um dos termos alquenilimino, alquinilimino, arilimino, aralquilimino e acilimino é modificado por "substituído," ele refere-se ao grupo =NR, em que o grupo alquilimino é preso com uma G-ligação e uma K-ligação, no qual R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila, heteroaralquila e acila substituída, respectivamente.

[0108] O termo "fluoroalquila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a uma alquila, conforme esse termo é definido acima, na qual um ou mais átomos de flúor foram substituídos por hidrogênios. Os grupos -CH2F, -CF2H, -CF3 e -CH2CF3 são exemplos não limitativos de grupos fluoroalquila. O termo "fluoroalquila substituída" refere-se a um grupo monovalente não aromático com um átomo de carbono saturado como o ponto de fixação, uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, pelo menos um átomo de flúor, sem ligações duplas ou triplas carbono-carbono e pelo menos um átomo independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, Cl, Br, I, Si, P e S. O grupo a seguir é um exemplo não limitativo de um grupo fluoroalquila substituído: -CFHOH.

[0109] O termo "alquilfosfato", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -OP(O)(OH)(OR), no qual R é uma alquila, conforme esse termo é definido acima. Exemplos não limitativos de grupos alquilfosfato incluem: -OP(O)(OH)(OMe) e -OP(O)(OH)(OEt). O termo "alquilfosfato substituído" refere-se ao grupo -OP(O)(OH)(OR), no qual R é uma alquila substituída, conforme esse termo é definido acima.

[0110] O termo "dialquilfosfato", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -OP(O)(OR)(OR‘), no qual R e R‘ podem ser os mesmos ou diferentes grupos alquila ou R e R‘ podem ser tomados juntos para representar uma alcanodi-ila tendo dois ou mais átomos de carbono saturados, pelo menos dois dos quais são presos via os átomos de oxigênio ao átomo de fósforo. Exemplos não limitativos de grupos dialquilfosfato incluem: -OP(O)(OMe)2, -OP(O)(OEt)(OMe) e -OP(O)(OEt)2. O termo "dialquilfosfato substituído" refere-se ao grupo - OP(O)(OR)(OR‘), no qual R e R‘ podem ser os mesmos ou diferentes grupos alquila substituídos, um de R ou R‘ é uma alquila e o outro é uma alquila substituída ou R e R‘ podem ser tomados juntos para representar uma alcanodi-ila substituída com dois ou mais átomos de carbono saturados, pelo menos dois dos quais são presos via os átomos de oxigênio ao fósforo.

[0111] O termo "alquiltio", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -SR, no qual R é uma alquila, conforme esse termo é definido acima. Exemplos não limitativos de grupos alquiltio incluem: -SCH3, -SCH2CH3, -SCH2CH2CH3, -SCH(CH3)2, -SCH(CH2)2, -S-ciclopentila e -S-ciclo-hexila. O termo "alquiltio substituído" refere-se ao grupo -SR, no qual R é uma alquila substituída, conforme esse termo é definido acima. Por exemplo, -SCH2CF3 é um grupo alquiltio substituído.

[0112] Similarmente, os termos "alqueniltio", "alquiniltio", "ariltio", "aralquiltio", "heteroariltio", "heteroaralquiltio" e "aciltio", quando usados sem o modificador "substituído", referem-se a grupos definidos como - SR, nos quais R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila, heteroaralquila e acila, respectivamente, conforme esses termos são definidos. Quando qualquer um dos termos alqueniltio, alquiniltio, ariltio, aralquiltio, heteroariltio, heteroaralquiltio e aciltio é modificado por "substituído," ele refere-se ao grupo -SR, no qual R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila, heteroaralquila e acila substituída, respectivamente.

[0113] O termo "tioacila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo monovalente com um átomo de carbono de um grupo tiocarbonila como o ponto de fixação, tendo ainda uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, não tendo ainda átomos adicionais que não são carbono ou hidrogênio, além do átomo de enxofre do grupo carbonila. Os grupos, -CHS, -C(S)CH3, - C(S)CH2CH3, -C(S)CH2CH2CH3, -C(S)CH(CH3)2, -C(S)CH(CH2)2, - C(S)C6H5, -C(S)C6H4CH3, -C(S)C6H4CH2CH3, -C(S)C6H3(CH3)2 e - C(S)CH2C6H5, são exemplos não limitativos de grupos tioacila. O termo "tioacila", portanto, abrange, mas não está limitado a, grupos algumas vezes referidos como grupos "alquila tiocarbonila" e "arila tiocarbonila". O termo "tioacila substituída" refere-se a um radical com um átomo de carbono como o ponto de fixação, o átomo de carbono sendo parte de um grupo tiocarbonila, tendo ainda uma estrutura linear ou ramificada, ciclo, cíclica ou acíclica, tendo ainda pelo menos um átomo, além do átomo de enxofre do grupo carbonila, independentemente selecionado do grupo consistindo em N, O, F, Cl, Br, I, Si, P e S. Os grupos - C(S)CH2CF3, -C(S)O2H, -C(S)OCH3, -C(S)OCH2CH3, - C(S)OCH2CH2CH3, -C(S)OC6H5, -C(S)OCH(CH3)2, -C(S)OCH(CH2)2, - C(S)NH2 e -C(S)NHCH3 são exemplos não limitativos de grupos tioacila substituídos. O termo "tioacila substituído" abrange, mas não está limitado a grupos "heteroarila tiocarbonila".

[0114] O termo "alquilsulfonila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -S(O)2R, no qual R é uma alquila, conforme esse termo é definido acima. Exemplos não limitativos de grupos de alquilsulfonila incluem: -S(O)2CH3, -S(O)2CH2CH3, -S(O)2CH2CH2CH3, -S(O)2CH(CH3)2, -S(O)2CH(CH2)2, -S(O)2-ciclopentila e -S(O)2-ciclo-hexila. O termo "alquilsulfonila substituída" refere-se ao grupo -S(O)2R, no qual R é uma alquila substituída, conforme esse termo é definido acima. Por exemplo, -S(O)2CH2CF3 é um grupo alquilsulfonila substituído.

[0115] Similarmente, os termos "alquenilsulfonila", "alquinilsulfonila", "arilsulfonila", "aralquilsulfonila", "heteroarilsulfonila" e "heteroaralquilsulfonila", quando usados sem o modificador "substituído", refere-se a grupos definidos como -S(O)2R, no qual R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila e heteroaralquila, respectivamente, conforme esses termos são definidos. Quando qualquer um dos termos alquenilsulfonila, alquinilsulfonila, arilsulfonila, aralquilsulfonila, heteroarilsulfonila e heteroaralquilsulfonila é modificado por "substituído," ele refere-se ao grupo -S(O)2R, no qual R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila e heteroaralquila substituída, respectivamente.

[0116] O termo "alquilsulfinila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -S(O)R, no qual R é uma alquila, conforme esse termo é definido acima. Exemplos não limitativos de grupos alquilsulfinila incluem: -S(O)CH3, -S(O)CH2CH3, -S(O)CH2CH2CH3, -S(O)CH(CH3)2, -S(O)CH(CH2)2, -S(O)-ciclopentila e -S(O)-ciclo-hexila. O termo "alquilsulfinila substituída" refere-se ao grupo -S(O)R, no qual R é uma alquila substituída, conforme esse termo é definido acima. Por exemplo, -S(O)CH2CF3 é um grupo alquilsulfinila substituído.

[0117] Similarmente, os termos "alquenilsulfinila", "alquinilsulfinila", "arilsulfinila", "aralquilsulfinila", "heteroarilsulfinila" e "heteroaralquilsulfinila", quando usados sem o modificador "substituído", refere-se a grupos definidos como -S(O)R, nos quais R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila e heteroaralquila, respectivamente, conforme esses termos são definidos. Quando qualquer um dos termos alquenilsulfinila, alquinilsulfinila, arilsulfinila, aralquilsulfinila, heteroarilsulfinila e heteroaralquilsulfinila é modificado por "substituído," ele refere-se ao grupo -S(O)R, no qual R é alquenila, alquinila, arila, aralquila, heteroarila e heteroaralquila substituída, respectivamente.

[0118] O termo "alquilamônio", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo, definido como -NH2R+, -NHRR‘+ ou -NRR‘R‘‘+, no qual R, R‘ e R" são os mesmos ou diferentes grupos alquila ou qualquer combinação de dois de R, R‘ e R’’ podem ser tomados juntos para representar uma alcanodi-ila. Exemplos não limitativos de grupos catiônicos alquilamônio incluem: -NH2(CH3)+, -NH2(CH2CH3)+, - NH2(CH2CH2CH3)+, -NH(CH3)2+, -NH(CH2CH3)2+, -NH(CH2CH2CH3)2+, - N(CH3)3+, -N(CH3)(CH2CH3)2+, -N(CH3)2(CH2CH3)+, -NH2C(CH3)3+, -NH(ciclopentila)2+ e -NH2(ciclo-hexila)+. O termo "alquilamônio substituído" refere-se a -NH2R+, -NHRR’+ ou -NRR’R’’+, no qual pelo menos um de R, R’ e R’’ é uma alquila substituída ou dois de R, R’ e R’’ podem ser tomados juntos para representar uma alcanodi-ila substituída. Quando mais de um de R, R’ e R’’ é uma alquila substituída, eles podem ser os mesmos ou diferentes. Qualquer um de R, R’ e R’’ que não são alquila substituída ou alcanodi-ila substituída, pode ser alquila, as mesmas ou diferentes ou podem ser tomados juntos para representar a alcanodi-ila com dois ou mais átomos de carbono, pelo menos dois dos quais são presos ao átomo de nitrogênio mostrado na fórmula.

[0119] O termo "alquilsulfônio", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se ao grupo -SRR’+, no qual R e R’ podem ser os mesmos ou diferentes grupos alquila ou R e R’ podem ser tomados juntos para representar uma alcanodi-ila. Exemplos não limitativos de grupos alquilsulfônio incluem: -SH(CH3)+, -SH(CH2CH3)+, -SH(CH2CH2CH3)+, -S(CH3)2+, -S(CH2CH3)2+, -S(CH2CH2CH3)2+, - SH(ciclopentila)+ e -SH(ciclo-hexila)+. O termo "alquilsulfônio substituído" refere-se ao grupo -SRR’+, no qual R e R’ podem ser os mesmos ou diferentes grupos alquila substituídos, um de R ou R’ é uma alquila e o outro é uma alquila substituída ou R e R‘ podem ser tomados juntos para representar uma alcanodi-ila substituída. Por exemplo, - SH(CH2CF3)+ é um grupo alquilsulfônio substituído.

[0120] O termo "alquilsilila", quando usado sem o modificador "substituído", refere-se a um grupo monovalente, definido como -SiH2R, -SiHRR’ ou -SiRR’R’’, no qual R, R‘ e R’’ podem ser os mesmos ou diferentes grupos alquila ou qualquer combinação de dois de R, R’ e R’’ podem ser tomados juntos para representar uma alcanodi-ila. Os grupos -SiH2CH3, -SiH(CH3)2, -Si(CH3)3 e -Si(CH3)2C(CH3)3 são exemplos não limitativos de grupos alquilsilila não substituídos. O termo "alquilsilila substituída" refere-se a -SiH2R, -SiHRR’ ou -SiRR’R’’, nos quais pelo menos um de R, R’ e R’’ é uma alquila substituída ou dois de R, R’ e R’’ podem ser tomados juntos para representar uma alcanodi-ila substituída. Quando mais de um de R, R’ e R’’ é uma alquila substituída, eles podem ser os mesmos ou diferentes. Qualquer um de R, R’ e R’’ que não são alquila substituída ou alcanodi-ila substituída, pode ser alquila, as mesmas ou diferentes ou podem ser tomados juntos para representar a alcanodi-ila com dois ou mais átomos de carbono saturados, pelo menos dois dos quais são presos ao átomo de silício.

[0121] Além disso, átomos que compõem os compostos da presente invenção se destinam a incluir todas as formas isotópicas de tais formas. Isótopos, conforme usado aqui, inclui aqueles átomos tendo o mesmo número atômico, mas diferentes números de massa. À guisa de exemplo geral e, sem limitação, isótopos de hidrogênio incluem trítio e deutério e isótopos de carbono incluem 13C e 14C. Similarmente, considera-se que um ou mais átomos de carbono de um composto da presente invenção pode ser substituído por (um) átomo(s) de silício. Além disso, considera-se que um ou mais átomos de oxigênio de um composto da presente invenção podem ser substituídos por (um) átomo de enxofre ou selênio.

[0122] Um composto tendo uma fórmula que é representada por uma linha tracejada se destina a incluir as fórmulas tendo opcionalmente zero, uma ou mais ligações duplas. Assim, por exemplo, a estrutura

inclui as estruturas

. Conforme sera entendido por aqueles versados na técnica, nenhum de tais átomos no anel forma parte de mais de uma ligação dupla.

[0123] Qualquer valência indefinida sobre um átomo de uma estrutura mostrada no presente pedido representa, implicitamente, um átomo de hidrogênio ligado ao átomo.

[0124] Conforme usado aqui, um "auxiliar quiral" refere-se a um grupo quiral removível que é capaz de influenciar a estereosseletividade de uma reação. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com tais compostos e muitos estão comercialmente disponíveis.

[0125] Os termos "base de nucleotídeo", "nucleobase" ou simplesmente "base", conforme usado aqui, refere-se a um anel heteroaromático parental contendo nitrogênio substituído ou não substituído de um tipo que é comumente encontrado em ácidos nucleicos, bem como variantes naturais, substituídas, modificadas ou manipuladas ou análogos das mesmas. Em uma modalidade típica, a nucleobase é capaz de formação de ligações de hidrogênio de Watson- Crick e/ou Hoogsteen com uma nucleobase apropriadamente complementar. Nucleobases exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a:

[0126] purinas, tais como 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, adenina (A), etenoadenina, N-Δ2-isopenteniladenina (6iA), N6-Δ2- isopentenil-2-metiltioadenina (2ms6iA), N6-metiladenina, guanina (G), isoguanina, N2-dimetilguanina (dmG), 7-metilguanina (7mG), 2- tiopirimidina, 6-tioguanina (6sG), hipoxantina e O6-metilguanina;

[0127] 7-deaza-purinas, tais como 7-deaza-adenina (7-deaza-A), 7- deazaguanina (7-deaza-G), 7-deaza-7-hidroximetil adenina, 7-deaza-7- aminometil adenina e 7-deaza-7-hidroximetilguanina;

[0128] pirimidinas, tais como citosina (C), 5-propinilcitosina, isocitosina, 5-hidroxilmetilcitosina (HOMeC), 5-aminometil-citosina, timina (T), 4-tiotimina (4sT), 5,6-di-hidrotimina, O4-metiltimina, uracila (U), 4-tiouracila (4sU), 5-hidroxilmetiluracila (HOMeU), 5-aminometil- uracila e 5,6-di-hidrouracila (di-hidrouracila; D);

[0129] indolas, tais como nitroindola e 4-metilindola; pirrolas, tais como nitropirrola; nebularina; base (Y); etc.

[0130] Nucleobases exemplificativas adicionais podem ser encontradas em Lehninger, 2005, o qual é incorporado aqui por referência e as referências citadas no mesmo.

[0131] O termo "nucleosídeo", conforme usado aqui, refere-se a uma glicosilamina consistindo em uma nucleobase ligada a um açúcar com cinco carbonos, tipicamente uma ribose ou uma deoxiribose. Exemplos desses incluem, mas não estão limitados a, citidina, 2'- deoxicitidina, 5-hidroxilmetilo citidina, 2'-deoxi-5-hidroxilmetil citidina, 5- aminometilcitidina, 2'-deóxi-5-aminometilcitidina, uridina, 2'-deoxiuridina, 5-hidroxilmetiluridina, 2'-deóxi-5-hidroxilmetiluridina, 5- aminometiluridina, 2'-deóxi-5-aminometiluridina, adenosina, 2'-deóxiadenosina, 7-deaza-7-hidroximetiladenosina, 2'-deóxi-7-deaza-7- hidroximetiladenosina, 7-deaza-7-aminometiladenosina, 2'-deóxi-7- deaza-7-aminometiladenosina, guanosina, 2'-deoxiguanosina, 7-deaza- 7-hidroximetil guanosina, 2'-deóxi-7-deaza-7-hidroximetila, 7-deaza-7- aminometil guanosina, 2'-deoxi-7-deaza-7-aminometil guanosina, timidina e 2'-deoxitimidina.

[0132] Um "nucleotídeo" é composto de um nucleosídeo com um,dois, três ou mais grupos fosfato presos em uma cadeia ao açúcar do α-carbono do nucleosídeo.

[0133] A menos que de outro modo especificado, um "ligante" refere-se a um ou mais grupos divalentes (elementos de ligação) que funcionam como uma ponte molecular covalentemente ligada entre dois outros grupos. Um ligante pode conter um ou mais elementos de ligação e um ou mais tipos de elementos de ligação. Elementos de ligação exemplificativos incluem: -C(O)NH-, -C(O)O-, -NH-, -S-, -S(O)n- onde n é 0, 1 ou 2, -O-, -OP(O)(OH)O-, -OP(O)(O-)O-, alcanodi-ila, alcenodi-ila, alcinodi-ila, arenodi-ila, heteroarenodi-ila ou combinações dos mesmos. Alguns ligantes têm cadeias laterais pendentes ou grupos funcionais pendentes (ou ambos). Exemplos de tais porções pendentes são modificadores de hidrofilicidade, por exemplo, grupos de solubilização tais como, por exemplo, -SO3H ou -SO3-. Em algumas modalidades, um ligante pode conectar um repórter à outra porção, tal como um grupo químico, fotoquímico ou enzimaticamente reativo (por exemplo, uma porção terminal clivável ou não clivável). Em outras modalidades, um ligante conecta um repórter a um componente biológico e não biológico, por exemplo, uma nucleobase, um nucleosídeo ou um nucleotídeo. A porção formada por um ligante ligado a um repórter pode ser designada -L-Repórter. Dependendo de fatores tais como as moléculas a serem ligadas e as condições nas quais o método de síntese de fita é realizado, o ligante pode variar quanto ao comprimento e composição para otimização de propriedades tais como estabilidade, comprimento, eficiência em FRET, resistência a determinados produtos químicos e/ou parâmetros de temperatura e ser de estereosseletividade ou tamanho suficiente para ligar operavelmente um rótulo a um nucleotídeo, de modo que o conjugado resultante seja útil em otimização de uma reação de polimerização. Ligantes podem ser empregados usando técnicas químicas padrões e incluem, mas não estão limitados a, ligantes de amina para fixação de rótulos a nucleotídeos (vide, por exemplo, Hobbs e Trainor, Patente U.S. No. 5.151.507, a qual é incorporada aqui por referência); um ligante contém, tipicamente, uma amina primária ou secundária ligando operavelmente um rótulo a um nucleotídeo; e um braço de hidrocarboneto rígido adicionado a uma base de nucleotídeo (vide, por exemplo, Service, 1998, o qual é incorporado aqui por referência). Algumas metodologias de ligação exemplificativas para fixação de repórteres a moléculas de base são fornecidas nas Patentes U.S. 4.439.356 e 5.188.934; Pedido de Patente Europeia 87310256.0; Pedido International PCT/US90/05565 e Barone et al., 2001, cada um dos quais é incorporado aqui por referência.

[0134] Um "ligante clivável" é um ligante que tem um ou mais grupos cliváveis que podem ser decomposto como um resultado de reação ou condição. O termo "grupo clivável" refere-se a uma porção, por exemplo, uma porção fluorogênica ou fluorescente. Tal clivagem é, tipicamente, mediada química, fotoquímica ou enzimaticamente. Grupos enzimaticamente cliváveis exemplificativos incluem fosfatos ou sequências peptídicas.

[0135] O uso da palavra "um" ou "uma", quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou no relatório descritivo, pode significar "um(a)", mas é também consistente com o significado de "um(a) ou mais", "pelo menos um(a)" e "um(a) ou mais de um(a)".

[0136] Por todo o presente pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método que está sendo empregado para determinar o valor ou a variação que existe entre os indivíduos de estudo.

[0137] Os termos "compreender", "ter" e "incluir" são verbos de ligação de sentido amplo. Quaisquer formas ou sentenças de um ou mais desses verbos, tais como "compreende", "compreendendo", "tem", "tendo", "inclui" e "incluindo" também são de sentido amplo. Por exemplo, qualquer método que "compreende", "tem" ou "inclui" uma ou mais etapas não está limitado a possuindo apenas uma ou mais etapas e também abrange outras etapas não listadas.

[0138] O termo "eficaz", conforme esse termo é usado no relatório descritivo e/ou reivindicações, significa adequado para obter um resultado desejado, esperado ou pretendido.

[0139] O termo "hidrato", quando usado como um modificador de um composto, significa que o composto tem menos de uma (por exemplo, hemi-hidrato), uma (por exemplo, mono-hidrato) ou mais de uma (por exemplo, di-hidrato) moléculas de água associadas a cada molécula de composto, tal como em formas sólidas do composto.

[0140] Conforme usado aqui, o termo "IC50" refere-se, mas não está limitado a concentração de um análogo de nucleotídeo na qual sua incorporação sobre um complexo de iniciador-padrão proporciona números iguais de moles de substrato e produto e/ou poderia ser definido, mas não limitado a, eficiência de incorporação medida determinando-se a concentração na qual o composto incorpora metade dos complexos de iniciador-padrão.

[0141] Conforme usado aqui, o termo "oligonucleotídeo" refere-se a fragmentos de DNA de 2 a 200 nucleotídeos covalentemente ligados.

[0142] Conforme usado aqui, o termo "padrão" refere-se a um oligonucleotídeo que serve como a fita complementar para a síntese de DNA (incorporação).

[0143] Conforme usado aqui, o termo "iniciador" refere-se a um oligonucleotídeo que é hibridizado a uma sequência complementar sobre a fita-padrão usada para iniciar a síntese de DNA (incorporação).

[0144] Quando usado aqui no sentido científico ou técnico, o termo"incorporação" refere-se a um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo que forma um par de base complementar com a fita-padrão e uma ligação covalente a uma fita de iniciador através de uma polimerase. O complexo de iniciador-padrão é estendido uma ou mais bases a partir da fita de iniciador inicial.

[0145] Conforme usado aqui, o termo "clivagem" refere-se à remoção do grupo terminal através de fotoclivagem, clivagem química, clivagem enzimática ou similar.

[0146] Conforme usado aqui, o termo "ciclo de incorporação" refere-se à incorporação de um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo por uma polimerase, à detecção e identificação do referido nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo e, se um análogo de nucleotídeo, clivagem do grupo terminal do referido análogo.

[0147] Conforme usado aqui, o termo "incorporação errônea" refere-se a um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo que forma um par de base não complementar com a fita-padrão e uma ligação covalente a um iniciador através de uma polimerase.

[0148] Conforme usado aqui, o termo "discriminação" refere-se às diferenças de concentração IC50 para incorporação errônea versus incorporação de nucleotídeo ou análogos de nucleotídeo por uma polimerase.

[0149] Conforme usado aqui, o termo "término" refere-se à incorporação de um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo que forma um par de base complementar ou não complementar com a fita-padrão e uma ligação covalente a um iniciador por uma polimerase. O complexo de iniciador-padrão é estendido apenas uma base a partir da fita de iniciador inicial para qualquer dado ciclo de incorporação.

[0150] Conforme usado aqui, o termo "DT50" refere-se à quantidade de tempo requerida para clivar 50% do análogo de base incorporado no complexo de iniciador-padrão.

[0151] O termo "análogo", conforme usado aqui, deve ser entendido como sendo uma substância a qual não compreende o mesmo esqueleto de carbono básico e funcionalidade carbono em sua estrutura que um "determinado composto", mas o qual pode imitar o determinado composto mediante incorporação de uma ou mais substituições tal como, por exemplo, substituição de carbono por heteroátomos.

[0152] Um "isômero" de um primeiro composto é um compost distinto no qual cada molécula contém os mesmos átomos constituintes que o primeiro composto, mas onde a configuração desses átomos em três dimensões difere.

[0153] Conforme usado aqui, o termo "paciente" ou "indivíduo" refere-se a um organismo mamífero vivo, tal como um ser humano, macaco, vaca, ovelha, cabra, cão, gato, camundongo, rato, porquinho- da-índia ou espécies transgênicas dos mesmos. Em determinadas modalidades, o paciente ou indivíduo é um primata. Exemplos não limitativos de seres humanos são adultos, jovens, bebês e fetos.

[0154] Quando usado em referência a um composto, composição, método ou dispositivo, "farmaceuticamente aceitável" significa geralmente seguro, não tóxico e nem biológica ou de outro modo indesejável e inclui aquilo que é aceitável para uso veterinário, bem como uso farmacêutico com seres humanos.

[0155] Conforme usado aqui, "predominantemente um enantiômero" significa que um composto contém pelo menos cerca de 85% de um enantiômero ou, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de um enantiômero ou, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% de um enantiômero ou, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 99% de um enantiômero. Similarmente, a frase "substancialmente isento de outros isômeros ópticos" significa que a composição contém pelo no máximo cerca de 15% de outro enantiômero ou diastereômero, mais preferivelmente no máximo cerca de 10% de outro enantiômero ou diastereômero, ainda mais preferivelmente no máximo cerca de 5% de outro enantiômero ou diastereômero e, ainda mais preferivelmente, cerca de 1% de outro enantiômero ou diastereômero.

[0156] "Prevenção" ou "prevenir" inclui: (1) inibição do início de uma doença em um indivíduo ou paciente o qual pode estar em risco e/ou predisposto à doença, mas ainda não experimenta ou mostra qualquer ou toda a patologia ou sintomatologia da doença e/ou (2) diminuição do início da patologia ou sintomatologia de uma doença em um indivíduo ou paciente o qual pode estar em risco e/ou predisposto à doença, mas ainda não experimenta ou mostra qualquer ou toda a patologia ou sintomatologia da doença.

[0157] O termo "saturado", quando de referência a um átomo, significa que o átomo é conectado a outros átomos apenas por meio de ligações simples.

[0158] Um "estereoisômero" ou "isômero óptico" é um isômero de um determinado composto no qual os mesmos átomos são ligados aos mesmos outros átomos, mas onde a configuração desses átomos em três dimensões difere. "Enantiômeros" são estereoisômeros de um determinado composto que são imagens de espelho uns dos outros, tais como as mãos direita e esquerda. "Diastereômeros" são estereoisômeros de um determinado composto que não são enantiômeros.

[0159] A invenção considera que, para qualquer estereocentro ou eixo de quiralidade para o qual a estereoquímica não tenha sido definida, o estereocentro ou eixo de quiralidade pode estar presente em sua forma R, forma S ou como uma mistura das formas R e S, incluindo misturas racêmicas e não racêmicas.

[0160] "Quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade farmaceuticamente eficaz" significa aquela quantidade a qual, quando administrada a um indivíduo ou paciente para tratamento de uma doença, é eficaz para tal tratamento da doença.

[0161] "Tratamento" ou "tratar" inclui (1) inibição de uma doença em um indivíduo ou paciente que está experimentando ou mostrando a patologia ou sintomatologia da doença (por exemplo, interrupção do desenvolvimento da patologia e/ou sintomatologia), (2) alívio de uma doença em um indivíduo ou paciente que está experimentando ou mostrando a patologia ou sintomatologia da doença (por exemplo, reversão da patologia e/ou sintomatologia) e/ou (3) afetar qualquer diminuição mensurável em uma doença em um indivíduo ou paciente que está experimentando ou mostrando a patologia ou sintomatologia da doença.

[0162] Conforme usado aqui, o termo "solúvel em água" significa que o composto dissolve em água pelo menos até o ponto de 0,010 mole/litro ou é classificado como solúvel de acordo com a precedência da literatura.

[0163] As definições acima superam qualquer definição conflitante em qualquer uma das referências que é incorporada por referência aqui. O fato de que determinados termos são definidos, contudo, não devem ser considerados como indicativos de que qualquer termo que não tenha definição seja indefinido. Antes, acredita-se que todos os termos usados descrevem a invenção de modo que aqueles versados na técnica possam apreciar o escopo e prática da presente invenção. II. Métodos Sintéticos Compostos da presente descrição podem ser feitos usando os métodos esboçados na seção Exemplos. Esses métodos podem ainda ser modificados e otimizados usando os princípios e técnicas de química orgânica, conforme aplicado por aqueles versados na técnica. Tais princípios e técnicas são ensinados, por exemplo, em March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure (2007), o qual é incorporado aqui por referência.

III. Função Biológica e Taxas de Clivagem

[0164] Conforme mostrado em alguns aspectos da presente descrição, substituição e sua estereoquímica do α-carbono do grupo 2- nitrobenzila afeta a função biológica e taxas de clivagem de reação de dNTPs base-modificados 3’-não bloqueados.

[0165] Em uma modalidade, componentes de amostra permitem a determinação de SNPs. O método pode ser para a identificação em alto rendimento de SNPs informativos. Os SNPs podem ser obtidos diretamente a partir de material de DNA genômico, de material amplificado por PCR ou de material de DNA clonado e podem ser ensaiados usando um método de extensão de iniciador de um único nucleotídeo. O método de extensão de iniciador de um único nucleotídeo pode compreender uso de dNTPs únicos não rotulados, dNTPs únicos rotulados, dNTPs únicos 3’-modificados, 3’-dNTPs únicos base-modificados, alfa-tio-dNTPs únicos ou 2’,3’-dideoxinucleotídeos únicos rotulados. O método de minissequenciamento pode compreender uso de dNTPs únicos não rotulados, dNTPs únicos rotulados, dNTPs únicos 3’-modificados, 2’-dNTPs únicos base- modificados, alfa-tio-dNTPs únicos ou 2’,3’-dideoxinucleotídeos únicos rotulados. Os SNPs podem ser obtidos diretamente a partir de material de DNA genômico, de material amplificado por PCR ou de material de DNA clonado.

[0166] A presente descrição ainda proporciona compostos de nucleotídeo e nucleosídeo, bem como sais, ésteres e fosfatos dos mesmos, que podem ser usados na tecnologia de sequenciamento rápido de DNA. Os compostos estão, opcionalmente, na forma de trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) e trifosfatos de deoxiribonucleotídeo (dNTP). Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo, em alguns casos, incluem um grupo fotoclivável rotulado com um grupo repórter, tal como um corante fluorescente. Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo incluem grupos de proteção fotorremovíveis que são criados para terminar a síntese de DNA, bem como clivar rapidamente, de modo que esses monômeros podem ser usados para sequenciamento rápido em um formato paralelo. A presença de tais grupos de clivagem rápida rotulados com corantes fluorescentes sobre os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo pode intensificar a velocidade e precisão de sequenciamento de grandes oligômeros de DNA em paralelo para permitir, por exemplo, sequenciamento rápido de todo o genoma e a identificação de polimorfismos e outra informação genética valiosa.

[0167] Em determinados aspectos, a presente descrição refere-se a compostos em que a base do nucleosídeo é covalentemente presa a um grupo 2-nitrobenzila e a posição alfa carbono do grupo 2-nitrobenzila é opcionalmente substituída por um grupo alquila ou arila, conforme descrito aqui. Em determinados exemplos, a base do nucleosídeo é covalentemente presa com um grupo 2-nitrobenzila e o grupo 2- nitrobenzila é opcionalmente substituído por um ou mais de um grupo de doação de elétrons e um de extração de elétrons, conforme descrito aqui. O grupo 2-nitrobenzila pode ser funcionalizado para intensificar as propriedades de término, bem como a taxa de desproteção catalisada pela luz. As propriedades de terminação do grupo 2-nitrobenzila alfa carbono substituído e 2-nitrobenzila preso a uma nucleobase ocorrem mesmo quando o grupo 3’-OH sobre o açúcar ribose é desbloqueado. Esses terminadores 3’-OH desbloqueados são bem tolerados por uma série de DNA polimerases comercialmente disponíveis, representando uma vantagem chave com relação a terminadores 3’-O-bloqueados. O grupo 2-nitrobenzila alfa carbono substituído também pode ser derivatizado para incluir um corante fluorescente selecionado ou outro grupo repórter.

A. Compostos de Nucleotídeo e Nucleosídeo e Seu Uso em Sequenciamento de DNA

[0168] Compostos de nucleotídeo e nucleosídeo são proporcionados, os quais são úteis na tecnologia de sequenciamento de DNA. Um aspecto da presente invenção é dirigido ao uso da abordagem de sequenciamento promissora, término reversível cíclico (CRT). CRT é um método cíclico de detecção de adições sincronizadas de uma única base de múltiplos padrões. Essa abordagem se diferencia do método de Sanger (Metzker, 2005, o qual é incorporado aqui por referência) pelo fato de que ela pode ser realizada sem a necessidade de eletroforese em gel, um grande obstáculo no avanço nesse campo. Tal como sequenciamento de Sanger, contudo, extensões de leitura longas se traduzem em menos ensaios de sequenciamento necessários para cobrir todo o genoma. O ciclo de CRT compreende, tipicamente, três etapas, incorporação, formação de imagem e desproteção. Para esse procedimento, a eficiência de ciclo, tempo de ciclo e sensibilidade são fatores importantes. A eficiência de ciclo é o produto das eficiências de desproteção e incorporação e determina a extensão de leitura de CRT. O tempo de ciclo de CRT é a soma dos tempos de incorporação, formação de imagem e desproteção. Para CRT rápido para sequenciamento de todo o genoma, os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo conforme descrito aqui podem ser usados, os quais podem exibir propriedades de desproteção rápidas e eficientes. Esses compostos podem ser rotulados com grupos repórteres, tais como corantes fluorescentes, presos diretamente ao grupo 2-nitrobenzila proporcionando, por exemplo, terminadores fluorescentes reversíveis, com propriedades de desproteção similares. Tem sido difícil obter o objetivo de longas leituras de CRT porque terminadores reversíveis atuam, tipicamente, como pobres substratos com DNA polimerases comercialmente disponíveis. Análogos de nucleotídeo modificados da presente invenção podem ser usados para aprimorar essa tecnologia fornecendo substratos que incorporam tão bem ou melhor do que um nucleotídeo natural com DNA polimerases comercialmente disponíveis.

[0169] Quando aplicados ao DNA genômico, os compostos podem ser usados em CRT para leitura diretamente a partir do DNA genômico. DNA genômico fragmentado pode ser hibridizado a um chip de oligonucleotídeo de alta densidade contendo sítios de "priming" que abrangem cromossomos selecionados. Cada sequência de priming é separada pela extensão de leitura estimada do método CRT. Entre adições de base, um aparelho de formação de imagem fluorescente pode, simultaneamente, formar a imagem de todo o chip de alta densidade, fazendo aprimoramentos significativos na velocidade e sensibilidade. Em modalidades específicas, um fluoróforo, o qual é preso ao grupo 2-nitrobenzila ou seus derivados descritos aqui, é removido através de irradiação UV, liberando o grupo 2-nitrobenzila para o próximo ciclo de adição de base. Após aproximadamente 500 ciclos de CRT, a informação da sequência genômica completa e contígua pode, então, ser comparada com o genoma humano de referência para determinar a extensão e tipo de variação de sequência em uma amostra individual. Terminadores reversíveis que exibem maiores eficiências de incorporação e desproteção obterão, tipicamente, maiores eficiências de ciclo e, assim, extensões de leitura mais longas.

[0170] A eficiência de CRT é definida pela fórmula: (RL)Ceff = 0,5, onde RL é a extensão de leitura em bases e Ceff é a eficiência global de ciclo. Em outras palavras, uma extensão de leitura de 7 bases poderia ser obtida com uma eficiência global de ciclo de 90%, 70 bases poderia ser obtida com uma eficiência de ciclo de 99% e 700 bases com uma eficiência de ciclo de 99,9%. A eficiência de incorporação de compostos de acordo com a invenção pode oscilar de cerca de 70% a cerca de 100% da incorporação do nucleosídeo nativo análogo. De preferência, a eficiência de incorporação oscilará de cerca de 85% a cerca de 100%. As eficiências de fotoclivagem oscilarão, de preferência, de cerca de 85% a cerca de 100%. Ainda, término da extensão de ácido nucleico oscilará de cerca de 90% a cerca de 100% quando de incorporação de compostos de acordo com a invenção. Compostos de nucleosídeo e nucleotídeo têm, em uma modalidade, uma eficiência de ciclo de pelo menos 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9%.

[0171] Outro aspecto da presente invenção é dirigido ao uso de piro-sequenciamento, o qual é um método de bioluminescência não eletroforético que mede a liberação de pirofosfato inorgânico (PPi) convertendo proporcionalmente o mesmo em luz visível através de uma série de reações enzimáticas (Ronaghi et al., 1998, o qual é incorporado aqui por referência). Diferente de outras abordagens de sequenciamento que usam nucleotídeos modificados para terminar a síntese de DNA, o ensaio de pirossequenciamento manipula a DNA polimerase através da adição simples de um dNTP em quantidades limitadas. A DNA polimerase, então, estende o iniciador quando de incorporação do dNTP complementar e para. A síntese de DNA é reiniciada após a adição do próximo dNTP complementar no ciclo de distribuição. A ordem e intensidade dos picos de luz são registrados como fluxogramas, revelando a sequência de DNA subjacente. Para repetições homopoliméricas de até seis nucleotídeos, o número de dNTPs adicionado é diretamente proporcional ao sinal luminoso. Repetições homopoliméricas maiores do que seis nucleotídeos podem resultar em erros de inserção, os quais são o tipo de erro mais comum para piro-sequenciamento. Os análogos de nucleotídeo modificados da presente invenção podem aprimorar essa tecnologia mediante sequenciamento preciso através de repetições homopoliméricas, particularmente aqueles maiores do que seis nucleotídeos de comprimento.

[0172] Outro aspecto da presente invenção é dirigido ao uso de sequenciamento de Sanger, particularmente em detecção heterozigótica. A despeito do avanço, aprimoramentos na química de sequenciamento com terminador dideóxi-BigDye para detecção precisa de heterozigotos são necessários. Em geral, acredita-se que uma distribuição de altura de pico uniforme nos dados primários torna a atribuição de base e detecção de heterozigotos mais confiável e precisa. O padrão de término em sequenciamento de Sanger é primariamente em virtude da incorporação de tendência sequência-dependente pela DNA polimerase, a qual pode incorporar seletivamente nucleotídeos naturais com relação a nucleotídeos modificados (Metzker et al., 1998, o qual é incorporado aqui por referência). Esses efeitos de incorporação de tendência são mais pronunciados com uma química de corante- terminador do que com uma química de corante-iniciador. Isso pode ser atribuído aos efeitos das grandes estruturas de corantes fluorescentes presos ao nucleotídeo de término, diminuindo a atividade enzimática em pelo menos 10 vezes àquela do substrato natural. Assim, a redução nos efeitos de incorporação de tendência pela DNA polimerase com relação a terminadores rotulados com corante poderia levar a uma detecção de heterozigoto aprimorada. Análogos de nucleotídeo modificados da presente invenção podem aprimorar essa tecnologia mediante incorporação também ou melhor do que um nucleotídeo natural, assim, eliminando a incorporação de tendências em sequenciamento de Sanger.

[0173] Outro aspecto da presente invenção é direcionada ao uso de padrões amplificados por clonagem e padrões de uma única molécula de DNA. A tecnologia de ponta NGS pode ser dividida em dois campos: padrões amplificados por clonagem a partir de uma única molécula de DNA e padrões de uma única molécula de DNA. É bem-reconhecido na técnica que o DNA pode ser imobilizado sobre uma superfície sólida através de fixação de um iniciador à referida superfície e hibridização de um ácido nucleico-alvo ao referido iniciador (Southern e Cummins, 1998, Patente US No. 5.770.367; Harris et al., 2008, os quais são incorporados aqui por referência) ou mediante fixação de um ácido nucleico-alvo à referida superfície por meio de amplificação por clonagem e hibridização de um iniciador ao referido ácido nucleico-alvo (Dressman et al., 2003; Margulies et al., 2005, os quais são incorporados aqui por referência). Qualquer configuração de imobilização pode ser usada na presente invenção para, então, ligação de uma DNA polimerase a fim de iniciar o método CRT ou o método de piro-sequenciamento.

[0174] Para que terminadores CRT funcionem apropriadamente, o grupo de proteção deve ser eficientemente clivado sob condições brandas. A remoção de um grupo de proteção geralmente envolve tratamento com ácido forte ou base, redução catalítica ou química ou uma combinação desses métodos. Essas condições podem ser reativas à DNA polimerase, nucleotídeos, padrão oligonucleotídeo-produzido ou ao suporte sólido, criando resultados indesejáveis. O uso de grupos de proteção fotoquímicos é uma alternativa atraente ao tratamento químico rigoroso e pode ser empregado de uma maneira não invasiva. Uma série de grupos de proteção fotorremovíveis incluindo, mas não limitado a, 2-nitrobenzila, benziloxicarbonila, 3-nitrofenila, fenacila, 3,5- dimetoxibenzoinila, 2,4-dinitrobenzenossulfenila e seus respectivos derivados, têm sido usados para a síntese de peptídeos, polissacarídeos e nucleotídeos (Pillai, 1980, o qual é incorporado aqui por referência). Desses, o grupo de proteção 2-nitrobenzila sensível à luz tem sido aplicado com sucesso ao grupo 2’-OH de ribonucleosídeos para a síntese de dirribonucleosídeo (Ohtsuka et al., 1974, o qual é incorporado aqui por referência), ao grupo 2’-OH de ribofosforamiditas em síntese automática de ribozima (Chaulk e MacMillan, 1998, o qual é incorporado aqui por referência), ao grupo 3-OH de fosforamiditas para a síntese de oligonucleotídeo na química Affymetrix (Pease et al., 1994, o qual é incorporado aqui por referência) e ao grupo 3’-OH para aplicações de sequenciamento de DNA (Metzker et al., 1994, o qual é incorporado aqui por referência). Sob condições de desproteção (luz ultravioleta >300 nm), o grupo 2-nitrobenzila pode ser eficientemente clivado sem afetar as bases pirimidina ou purina (Pease et al., 1994 e Bartholomew e Broom, 1975, os quais são incorporados por referência).

[0175] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada ao uso de terminadores reversíveis quimicamente cliváveis. Por exemplo, o grupo de proteção benzila tem sido amplamente usado em síntese orgânica como um resultado de sua estabilidade e facilidade de desproteção branda e seletiva por meio de hidrogenólise catalítica (Green e Wuts, 1999, o qual é incorporado aqui por referência). Hidrogenólise, a qual pode ser conduzida sob condições neutras, é vantajosa quando trabalhando com nucleosídeos contendo ligações de fosfoanidrido, uma vez que difosfatos de nucleosídeo e, especialmente, trifosfatos de nucleosídeo degradam sob condições ácidas (Wu et al., 2004; Johnson et al., 2004, os quais são incorporados aqui por referência). Remoção de um grupo de proteção benzila de compostos suportados em sólido por meio de hidrogenólise usando nanopartículas de Paládio (Kanie et al., 2000, o qual é incorporado aqui por referência) e hidrogenação conduzida sobre um dispositivo microfluídico com catalisador de Paládio imobilizado (Kobayashi et al. 2004, o qual é incorporado aqui por referência) também foram reportadas, além de hidrogenólise usando catalisador de Paládio convencional.

B. Ensaios de Polimerase

[0176] Nucleotídeos naturais e modificados foram testados comrelação à eficiência de incorporação usando o "ensaio de endpoint de polimerase" (Wu et al., 2007, o qual é incorporado aqui por referência). Esse ensaio examina a eficiência de incorporação sobre bases-padrão erroneamente combinadas e combinadas. A eficiência de incorporação é medida determinando-se a concentração na qual o composto incorpora metade dos complexos de iniciador-padrão (IC50). Titulações de concentração crescente de composto foram realizadas para gerar curvas a partir das quais a IC50 pode ser determinada.

[0177] A sequência do DNA-padrão é selecionada dependendo de qual composto será testado. Por exemplo, a primeira base de interrogação após o iniciador na sequência-padrão é a base complementar do composto quando de medição da eficiência de incorporação e uma das três bases de combinação errônea quando de medição das propriedades de discriminação.

[0178] À reação anelada, uma DNA polimerase (por exemplo, THERMINATOR® DNA polimerase, 0,25 unidade por reação, New England Biolabs), 1x Tampão Thermopol e uma concentração conhecida de nucleotídeo natural ou modificado são adicionados a cada 10 μL de reação e incubados a 75°C durante 10 minutos, esfriados sobre gelo e dissipados com 10 μL de solução de término (formamida a 98%: Na2EDTA a 10 mM, pH = 8,0, 25 mg/ml de Blue Dextran). As reações terminadas são aquecidas para 75°C durante 30 segundos para desnaturar o DNA e, então, colocadas sobre gelo. Os produtos da extensão são analisados sobre um gel de poliacrilamida Long Ranger (Lonza) a 10% usando um sequenciador de DNA ABI modelo 377. Detalhes adicionais são fornecidos no Exemplo 1, abaixo.

[0179] A figura 1 compara a incorporação com DNA polymerase THERMINATOR®™ de nucleotídeos descritos aqui com nucleotídeos naturais. Por exemplo, o composto 3p065 (5-(a-isopropil-2- nitrobenziloximetil-2’-dCTP) atinge incorporação de 50% em uma concentração menor do que seu análogo natural (IC50 = 1,1 ± 0,1 nM versus 3,0 ± 0,6 nM). Compostos rotulados com corante também aumentam a eficiência com DNA polimerase THERMINATOR®, por exemplo, o composto 6p038/6p017 5-(a-isopropil-2-nitrobenzilóxi) metil- 2’-dCTP-Cy5 tem uma IC50 = 5,1 ± 1,4 nM. A Tabela A mostra as concentrações IC50 para muitos dos análogos de nucleotídeo modificados descritos aqui.

C. Discriminação Errônea

[0180] Foi reportado que substituição no α-carbono do grupo 2- nitrobenzila pode aumentar a taxa da reação de clivagem (Reichmanis et al., 1985; Cameron e Frechet, 1991; Hasan et al., 1997, os quais são incorporados aqui por referência). Sem estar preso pela teoria, os resultados apresentados aqui sugerem que substituição no α-carbono do grupo 2-nitrobenzila também pode afetar o término da síntese de DNA para trifosfatos de nucleotídeo 3’-não bloqueados e aprimorar a discriminação contra incorporação errônea. Além disso e baseado nos resultados discutidos em maiores detalhes abaixo, descobriu-se que a estereoquímica da substituição do α-carbono no grupo 2-nitrobenzila pode ter um impacto significativo sobre a extensão de discriminação errônea e a taxa da reação de clivagem.

[0181] A Tabela 1 mostra uma comparação entre os dois diastereômeros "ds1" e "ds2" do carbono α-substituido e seus precursores. As proporções de combinação errônea/combinação representam a capacidade da polimerase de distinguir entre incorporação corretamente contra uma base-padrão combinada e aquela erroneamente combinada. Discriminação é considerada suficiente quando a proporção de combinação errônea/combinação é maior do que ou igual a 100 (duas ordens de magnitude). A Tabela 1 mostra a discriminação de dGTP natural e análogos de C7-hidroximetil- dGTP, 5p107, 5p143-ds1 e 5p143-ds2. dGTP natural e C7-(2- nitrobenzilóxi)metil-2’-dGTP (5p107) mostram proporções de combinação errônea/combinação oscilando de 10 a 360 e 10 a 250, respectivamente, dois dos quais estão abaixo do limiar de 100 vezes. Substituição do carbono α-metileno com um grupo isopropila, contudo, resulta em uma proporção de discriminação significativamente maior para todas as bases-padrão erroneamente combinadas. 5p143-ds1 exibe uma alta proporção de discriminação errônea comparado com 5p143-ds2. Esses dados fornecem evidência de que a estereoquímica do grupo α-isopropila pode afetar o grau de discriminação contra incorporação errônea. Uma tendência similar é observada para os análogos de C7-hidróximetil-dATP. Para os compostos mostrados na Tabela 1, substituição no α-carbono do grupo 2-nitrobenzila aumenta a discriminação de combinação errônea de uma maneira estéreo- específica.

dGTP = dGTP natural 5p107 = C7-(2-nitrobenzilóxi)metil-2’-dGTP 5p143 = C7-(a-isopropil-2-nitrobenzilóxi)metil-2’-dGTP

D. Término

[0182] Sem estar preso pela teoria, acredita-se que pelo menos dois fatores influenciam o término de síntese de DNA após uma única incorporação: a) substituição, no α-carbono, do grupo 2-nitrobenzila e b) substituição na posição 2 do anel de benzila. A Tabela 2 mostra a influência de várias substituições usando uma análise de "soma ponderada", a qual é determinada mediante quantificação de produtos de extensão de iniciador usando eletroforese em gel automática. Uma soma ponderada de 1,0 representa término completo após uma única incorporação, enquanto que um valor maior do que 1,0 indica incorporação além da posição +1 (por exemplo, uma leitura de nucleotídeo). Para padronizar o ensaio de término, uma concentração de 25x do valor de IC50 de um determinado composto é usada. O ensaio é realizado conforme descrito acima para o ensaio de endpoint de polimerase, exceto que o padrão usado é uma repetição homopolimérica, desse modo, permitindo múltiplas incorporações de um determinado composto nucleotídico. Nesse exemplo, análogos de dUTP modificados são comparados com dTTP natural o qual, a 25x, seu valor de IC50 estende todo o comprimento-padrão da repetição homopolimérica e incorpora erroneamente a 11a base (soma ponderada = 11). Composto 3p085 (2-nitrobenziloximetil-2’-dUTP) mostra um grau de término com uma soma ponderada de 3,7 ± 0,1. Substituição do α- carbono com um grupo metila (2p043) aprimora adicionalmente o término, reduzindo o valor de soma ponderada para 1,7 ± 0,1. Término completo é obtido com uma substituição de α-isopropila (2p148), mostrando um valor de soma ponderada de 1,0. O valor de IC50 para a base complementar, contudo, não aumenta, indicando que uma maior substituição de isopropila tem um efeito benéfico sobre o término, mas não compromete a eficiência de incorporação.

[0183] A substituição da posição 2 sobre o anel de benzila pode também influenciar as propriedades de término desses nucleotídeos modificados. Por exemplo, remoção do grupo nitro dessa posição (composto 5p111) aumenta o valor somado ponderado para 1,1 para um análogo com substituição em α-isopropila. Uma série de análogos de dUTP foram sintetizados com diversos substituintes sobre a posição 2 e caracterizados com relação ao término na ausência do grupo isopropila no α-carbono. A Tabela 2 mostra uma tendência geral de aumento do tamanho e formato do substituinte e propriedades de término aprimoradas; comparar 5p145 (WS = 2,9) e 6p010 (WS = 1,7) a 25x concentrações IC50.

E. Taxas de UV-Clivagem

[0184] Clivagem do grupo 2-nitrobenzila substituído terminal quando análogos são incorporados na fita de iniciador com luz a 365 nm permite que o próximo ciclo de incorporação de inicie. Sem estar preso pela teoria, descobriu-se que, tipicamente, pelo menos dois fatores influenciam as taxas de UV-clivagem dos análogos de nucleotídeo incorporados: a) estereoquímica da substituição α-carbono do grupo 2- nitrobenzila e b) substituição sobre o anel de benzila. Incorporação sobre um padrão combinado é realizada conforme descrito acima usando uma concentração de 1 μM para estender a fita de iniciador. Dez tubos idênticos são usados para cada experimento de incorporação, após o que NaN3 é adicionado até uma concentração final de 50 mM. Reações com iniciador estendido são expostas à luz a 365 nm durante vários pontos de tempo usando o dispositivo desprotetor de UV descrito por Wu et al. (2007, o qual é incorporado aqui por referência) e analisado usando o sequenciador de DNA AB modelo 377. Os dados quantitativos são plotados linearmente como formação de produto versus tempo de exposição e o ponto de tempo no qual metade do análogo de nucleotídeo é clivado é calculado como um valor DT50. Conforme mostrado na Tabela 3, a estereoquímica afeta a taxa de UV-clivagem para análogos de C7-hidroximetil-dATP 5p098-ds1 e -ds2, 6p057-ds1 e -ds2 e 6p087-ds1 e -ds2. Por exemplo, baseado nesses exemplos, os análogos ds2 mostram taxas de clivagem mais rápida (por exemplo, menores valores DT50) comparado com análogos ds1. Além disso, substituição de um grupo metóxi na posição 4 sobre o anel de benzila aumenta adicionalmente a taxa de UV-clivagem, embora para análogos ds2 apenas (por exemplo, o valor DT50 para 5p098-ds2 é 3,3 seg versus aquele de 1,9 seg para 6p087-ds2). Baseado nos exemplos resumidos na Tabela 3, substituição no α-carbono do anel de 2-nitrobenzila aumenta a UV-clivagem de uma maneira estéreo-específica.

F. Clivagem Química

[0185] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada ao uso de terminadores quimicamente cliváveis. Por exemplo, o grupo de proteção benzila tem sido amplamente usado em síntese orgânica como um resultado de sua estabilidade e facilidade de desproteção branda e seletiva por meio de hidrogenólise catalítica (Green e Wuts, 1999, o qual é incorporado aqui por referência). Hidrogenólise, a qual pode ser conduzida sob condições neutras, é vantajosa quando de trabalho com nucleosideos contendo ligações de fosfoanidrido, uma vez que difosfatos de nucleosídeo e, especialmente, trifosfatos de nucleosídeo, degradam sob condições ácidas (Wu et al., 2004; Johnson et al., 2004, os quais são incorporados aqui por referência). Remoção de um grupo de proteção benzila de compostos suportados em sólido por meio de hidrogenólise usando nanopartículas de paládio (Kanie et al., 2000, o qual é incorporado aqui por referência) e hidrogenação conduzida sobre um dispositivo microfluídico com catalisador de paládio imobilizado (Kobayashi et al. 2004, o qual é incorporado aqui por referência) também foram reportados, além de hidrogenólise usando catalisador de paládio convencional. Exemplos de resultados de clivagem quimicamente reversível, incluindo clivagem de análogos de 5- benziloximetil-dU usando hidrogenólise catalítica, são fornecidos no Exemplo 10 abaixo.

I. Exemplos

[0186] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Será apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelo inventor como funcionando bem na prática da invenção e, assim, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. Contudo, aqueles versados na técnica apreciarão, à luz da presente descrição, que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas as quais são descritas e ainda obter um resultado semelhante ou similar sem se desviar do espírito e escopo da invenção.

Exemplo 1 - Métodos e Materiais

[0187] Ensaios de Polimerase. Nucleotídeos naturais e modificados foram testados com relação à eficiência de incorporação usando o "Ensaio de Endpoint de Polimerase" (Wu et al., 2007, o qual é incorporado aqui por referência). Esse ensaio examina a eficiência de incorporação sobre bases-padrão combinadas e erroneamente combinadas. A eficiência de incorporação é medida determinando-se a concentração na qual o composto incorpora sobre metade dos complexos de iniciador-padrão (IC50). Titulações de concentração crescente de composto foram realizadas para gerar curvas a partir das quais a IC50 pode ser determinada.

[0188] O ensaio é realizado primeiro anelando 5 nM de iniciador rotulado com BODIPY-FL DNA-padrão a 40 nM em 1x Tampão Thermopol (Tris-HCl a 20 mM, pH de 8,8; (NH4)2SO4 a 10 mM; KCl a 10 mM; MgSO4 a 2 mM; Triton X-100 a 0,1%, New England BioLabs). O ciclo de temperatura para completar anelamento de iniciador é 80°C durante 30 segundos, 57°C durante 30 segundos, então, resfriamento para 4°C. A sequência do DNA-padrão é selecionada dependendo de qual composto será testado. Por exemplo, a primeira base de interrogação após o iniciador na sequência-padrão é a base complementar do composto quando de medição da eficiência de incorporação e uma de três bases erroneamente combinadas quando de medição de propriedades de discriminação de combinação errônea.

[0189] À reação anelada, DNA polimerase (por exemplo, THERMINATOR® DNA polimerase, 0,25 unidade por reação, New England Biolabs), 1x Thermopol Buffer e uma concentração conhecida de nucleotídeo natural ou modificado nucleotídeo são adicionados a cada 10 μL de reação e incubados a 75°C durante 10 minutos, esfriados sobre gelo e dissipados com 10 μL de solução de término (formamida a 98%: Na2EDTA a 10 mM, pH = 8,0, 25 mg/ml de Blue Dextran). As reações interrompidas são aquecidas para 75°C durante 30 segundos para desnaturar o DNA e então, colocadas sobre gelo. Os produtos da extensão são analisados sobre um gel de poliacrilamida Long Ranger (Lonza) a 10% usando um sequenciador de DNA ABI modelo 377. Os dados quantitativos são visualizados como uma plotagem linear-log de formação de produto versus concentração de composto e a IC50 é calculada usando o software KaleidaGraph (Synergy Software). Exemplo 2 - Síntese de alcoóis 2-Nitrobenzílicos a-substituídos Síntese de (RS)-1-(2-nitrofenil)etanol

1. (i) NaBH4, MeOH, 1,4-dioxano, temperatura ambiente,

[0190] (RS)-1-(2-Nitrofenil)etanol: Boridreto de sódio (0,69 g, 18,16 mmol) foi adicionado a uma solução de uma 2-nitroacetofenona (1,0 g, 6,06 mmol) em metanol (9 mL) e 1,4-dioxano (6 mL) em pequenas porções (Dong et al., 2005, o qual é incorporado aqui por referência). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi diluído com acetato de etila (50 mL), lavado com água (10 mL) e salmoura (10 mL). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada in vacuo para proporcionar (RS)-1-(2- nitrofenil)etanol racêmico (1,02 g, 100%). 1H RMN (400 MHz, CDCh): δ 7,90 (m, 1 H, Ph-H), 7,84 (m, 1 H, Ph-H), 7,66 (m, 1 H, Ph-H), 7,44 (m, 1 H, Ph-H), 5,42 (m, 1 H, Ph-CH), 2,33 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, OH) 1,58 (d, 3 H, J = 5,1 Hz, CH3). Síntese de (RS)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)etanol

Esquema 2. Síntese de (RS)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)etanol: (i) NaNO2, H2SO4, menos 2oC; então, NaI, 100oC, 82%; (ii) NBS, peróxido de benzoíla, CCl4, refluxo, 45%; (iii) DMSO, NaHCO3, 86oC, 61%; (iv) Me2Zn, Ti(Oi-Pr)4, CH2Cl2, tolueno, 0oC, 48%.

[0191] 4-Iodo-2-nitrotolueno: A uma suspensão de 4-metil-3- nitroanilina (4,30 g, 28,26 mmol) em água (40 mL) gelada em um banho de água gelada, ácido enxofreico a 98% (1,89 mL) foi adicionado cuidadosamente (Herm et al., 2002, o qual é incorporado aqui por referência). Cloreto de sódio foi adicionado ao banho de água gelada para diminuir a temperatura para menos 2oC e uma solução de NaNO2 (2,15 g, 31,10 mmols) em água (10 mL) foi adicionada em uma taxa tal que a temperatura de reação não excedia 0oC. Quando de término da adição, a mistura foi agitada a menos 2oC durante 45 minutos. Essa solução do composto diazo foi, então, cuidadosamente adicionada (em pequenas porções) a uma solução em ebulição de NaI (12,89 g, 86 mmols) (CUIDADO: evolução vigorosa de gás). Quando de término da adição, a mistura de reação foi esfriada para a temperatura ambiente e extraída com cloreto de metileno (50 mL) quatro vezes. A fase orgânica combinada foi lavada com NaHCO3 saturado (40 mL) e água (40 mL), seca sobre Na2SO4, concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 4-iodo-2- nitrotolueno (6,07 g, 82%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,28 (d, 1 H, J = 1,8 Hz, Ph-H), 7,81 (dd, 1 H, J = 2,2 e 8,1 Hz, Ph-H), 7,09 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 2,55 (s, 3 H, CH3).

[0192] 1-Bromometil-4-iodo-2-nitrobenzeno: NBS (5,45 g, 30,62 mmol) e peróxido de benzoíla (75% aq, 200 mg, 0,85 mmol) foram adicionados a uma solução de 4-iodo-2-nitrotolueno (4,63 g, 17,60 mmol) em CCl4 (60 mL). A mistura foi aquecida para refluxo durante a noite, então, esfriada para a temperatura ambiente, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna para proporcionar 1-bromometil-4-iodo-2-nitrobenzeno (2,71 g, 45%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,35 (d, 1 H, J = 1,8 Hz, Ph-H), 7,93 (dd, 1 H, J = 1,8 e 8,1 Hz, Ph-H), 7,30 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 4,76 (s, 2 H, PhCH2).

[0193] 4-Iodo-2-nitrobenzaldeído: NaHCO3 (3,32 g, 39,48 mmol) foi adicionado a uma solução de 1-bromometil-4-iodo-2-nitrobenzeno (2,25 g, 6,58 mmol) em DMSO anidro (150 mL). A mistura foi agitada a 86oC durante 19 horas sob uma atmosfera de nitrogênio, então, esfriada para a temperatura ambiente, diluída com água (300 mL) e extraída com cloreto de metileno quatro vezes (250 mL). A fase orgânica combinada foi seca sobre Na2SO4, concentrada in vacuo e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 4-iodo-2-nitrobenzaldeído (1,11 g, 61%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 10,38 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, CHO), 8,45 (d, 1 H, J = 1,5 Hz, Ph-H), 8,15 (dd, 1 H, J = 1,5 e 8,0 Hz, Ph-H), 7,67 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 187,28 (CH), 143,18 (CH), 133,29 (CH), 130,67 (CH), 130,28 (C), 109,60 (C), 99,78 (C).

[0194] (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)etanol: Isopropóxido de titânio(IV) (1,2 mL, 4,04 mmols) foi dissolvido em diclorometano anidro (8 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio. A solução foi esfriada para 0oC e dimetilzinco (2 M em tolueno, 8,67 mL, 17,34 mmols) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada a 0oC durante 45 minutos, seguido pela adição de 4-iodo-2-nitrobenzaldeído (800 mg, 2,89 mmols). A mistura foi agitada a 0oC durante 36 horas, então, dissipada através de HCl a 1 M (CUIDADO: evolução vigorosa de gás!) e extraída com etil éter (50 mL) três vezes. A fase orgânica combinada foi lavada com água (50 mL), solução saturada de NaHCO3 (50 mL) e salmoura (50 mL), seca sobre Na2SO4, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna para proporcionar (RS)-1-(4-Iodo-2- nitrofenil)etanol racêmico (408 mg, 48%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,21 (dd, 1 H, J = 1,8 e 5,3 Hz, Ph-H), 7,96 (m, 1 H, Ph-H), 7,58 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 5,38 (q, 1 H, J = 6,1 Hz, Ph-CH), 2,34 (br s, 1 H, OH), 1,54 (d, 3 H, J = 6,1 Hz, CH3); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 147,98 (C), 142,49 (CH), 140,68 (C), 132,77 (CH), 131,31 (CH), 91,60 (C), 65,40 (CH), 24,28 (CH3). Síntese de (RS)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol e (S)-1-(2- nitrofenil)-2-metil-1-propanol

Esquema 3. Síntese de (RS)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol e (S)-1- (2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol. (i) PhMgCl, i-PrCHO, THF (anidro), menos 40oC à temperatura ambiente, 99%; (ii) cloreto de ácido (1S)canfânico, piridina (anidra), temperatura ambiente; (iii) recristalização a partir de metanol; (iv) K2CO3/MeOH, refluxo, 97%.

[0195] (RS)-1-(2Nitrofenil)-2-metil-propanol: A uma solução de 1- iodo-2-nitrobenzeno (1,12 g, 4,5 mmol) em THF anidro (15 mL) esfriada para menos 40oC sob uma atmosfera de nitrogênio, uma solução de cloreto de fenilmagnésio (2 M em THF, 2,4 mL, 4,8 mmol) foi adicionada gota a gota em uma taxa tal que a temperatura não excedesse menos 35oC. Quando de término da adição, a mistura foi agitada durante cinco minutos a menos 40oC, seguido pela adição de isobutiraldeído (0,545 mL, 6,0 mmol). A mistura foi gradualmente aquecida para a temperatura ambiente, dissipada com cloreto de amônio saturado (6 mL), entornada em água (80 mL) e extraída com acetato de etila três vezes (100 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (80 mL), seca sobre Na2SO4 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (RS)-1-(2- nitrofenil)-2-metil-propanol racêmico (0,876 g, 99%) como um óleo amarelo-claro. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,84 (dd, 1 H, J = 1,2 e 8,2 Hz, Ph-H), 7,73 (dd, 1 H, J = 1,4 e 7,9 Hz, Ph-H), 7,61 (m, 1 H, Ph-H), 7,39 (m, 1 H, Ph-H), 5,03 (dd, 1 H, J = 4,5 e 5,8 Hz, Ph-CH), 2,42 (d, 1 H, J = 4,5 Hz, OH), 2,02 (m, 1 H, CH), 0,95 (d, 3 H, J = 6,7 Hz, CH3), 0,89 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 148,48 (C), 138,91 (C), 132,95 (CH), 128,85 (CH), 127,95 (CH), 124,21 (CH), 73,79 (CH), 34,30 (CH), 19,66 (CH3), 17,01 (CH3).

[0196] (1S)-canfanato de (S)-1-(2-Nitrofenil)-2-metil-propila: A uma solução de (RS)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propanol (2,18 g, 11,2 mmol) em piridina anidra (10 mL) cloreto de ácido (1S)canfânico (2,63 g, 12,2 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada durante 18 horas em temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio, então, concentrada in vacuo a fim de proporcionar (1S)-canfanato de (RS)-1- (2-nitrofenil)-2-metil-propila bruto (mistura a 1:1 de diastereômeros). O canfanato foi dissolvido em metanol em ebulição (100 mL) e a solução foi deixada esfriar para a temperatura ambiente e descansar durante a noite. Os cristais formados foram coletados por meio de filtração e foram redissolvidos em metanol em ebulição (80 mL) e a solução foi deixada esfriar para a temperatura ambiente e descansar durante a noite. Os cristais formados foram coletados por meio de filtração a fim de proporcionar (1S)-canfanato de (S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propila puro (0,76 g, 36%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,99 (dd, 1 H, J = 1,8 e 7,8 Hz, Ph-H), 7,63 (m, 2 H, Ph-H), 7,45 (m, 1 H, Ph-H), 6,33 (d, 1 H, J = 6,0 Hz, Ph-CH), 2,32 (m, 2 H), 1,91 (m, 2 H), 1,67 (m, 1 H), 1,12 (s, 3 H, CH3), 1,05 (s, 3 H, CH3), 1,03 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3), 1,00 (s, 3 H, CH3), 0,99 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3).

[0197] Dados de cristalografia por raios X de (1S)-canfanato de (S)- 1-(2-nitrofenil)-2-metil-propila: C20H25NO6, M = 375,41, lâmina incolor, 0,26 x 0,24 x 0,10 mm3, ortorrômbico, grupo espacial P2i2i2i (No. 19), a = 11,9268(15), b = 11,9812(14), c = 13,5488(16) A, V = 1936,1(4) A3, Z = 4, Dc = 1,288 g/cm3, F000 = 800, detector de área MWPC, radiação CuKα, X = 1,54178 A, T = 110(2)K, 26max = 120,0°, 22896 reflexões coletadas, 2665 únicas (Rint = 0,0462). GooF final = 1,009, R1 = 0,0219, wR2 = 0,0554, índices R baseados em 2629 reflexões com I >2sigma(I) (refino sobre F2), 245 parâmetros, 0 restrições. Lp e correções de absorção aplicadas μ = 0,787 mm-1, Parâmetro de estrutura absoluta = 0,09(5) (Flack, 1983, o qual é incorporado aqui por referência). Vide figura 2.

[0198] (S)-1-(2-Nitrofenil)-2-metil-propanol: (1S)-canfanato de (S)- 1-(2-Nitrofenil)-2-metil-propila (0,717 g, 1,90 mmol) foi dissolvido em metanol quente (40 mL) e K2CO3 (0,380 g, 2,74 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida para refluxo durante uma hora, então, esfriada, concentrada in vacuo e diluída com dietil éter (100 mL). A fase orgânica foi lavada com água (20 mL), seca sobre Na2SO4 anidro e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (S)-1- (2-nitrofenil)-2-metil-propanol (0,360 g, 97%) como um óleo amarelo claro. 1H RMN era idêntico àquele do álcool racêmico. Síntese de (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol, (R)-1-(4- Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol e (S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2- metil-1-propanol

Esquema 4. Síntese de (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol, (R)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol e (S)-1-(4-Iodo-2- nitrofenil)-2-metil-1-propanol. (i) NaNO2, AcOH, H2SO4, menos 5-0oC; NaI, 100oC, 99%; (ii) PhMgCl, i-PrCHO, THF (anidro), menos 40oC à temperatura ambiente, 80%; (iii) cloreto de ácido (1S)canfânico, DMAP, CH2Cl2 (anidro), temperatura ambiente, 84%; (iv) recristalização a partir de metanol ou isopropanol; (v) K2CO3, MeOH, refluxo, 100%. 1,4-Di-iodo-2-nitrobenzeno: 4-Iodo-2-nitroanilina (6,60 g, 0,025 mol) foi suspensa em água (19 mL) e ácido acético glacial (17,5 mL) (Sapountzis et al., 2005, o qual é incorporado aqui por referência). A mistura foi esfriada para 0oC. Ácido enxofreico (17,5 mL, 0,328 mol) foi adicionado cuidadosamente. A mistura foi esfriada para menos 5oC e uma solução de NaNO2 (1,90 g, 0,028 mol) em água (7,5 mL) foi adicionada gota a gota em uma taxa tal que a temperatura não excedesse 0oC. Quando de término da adição, a mistura foi agitada durante 30 minutos e foi adicionada, em pequenas porções, a uma solução em ebulição de iodeto de sódio (22,33 g, 0,149 mol) em água (7,5 mL) (CUIDADO: evolução vigorosa de nitrogênio!). A mistura resultante foi mantida a 60oC durante uma hora, então, esfriada para a temperatura ambiente, seguido pela adição de dietil éter (500 mL). A solução de éter foi separada, lavada duas vezes com água (150 mL) e uma vez NaHCO3 saturado (150 mL). A solução foi seca sobre Na2SO4 e concentrada in vacuo até um sólido, o qual foi recristalizado a partir de etanol para proporcionar 1,4-di-iodo-2-nitrobenzeno (9,30 g, 99%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,15 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,75 (d, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,56 (dd, 1 H, J = 8,3 e 2,0 Hz).

[0199] (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol: A uma solução de 1,4-di-iodo-2-nitrobenzeno (2,24 g, 6,0 mmol) em THF anidro (20 mL) a menos 40oC sob uma atmosfera de nitrogênio, brometo de fenilmagnésio (2 M em THF, 3,2 mL, 6,4 mmol) foi adicionado gota a gota em uma taxa tal que a temperatura não excedesse menos 35oC. Quando de término da adição, a mistura foi agitada durante 5 minutos, seguido pela adição de isobutiraldeído (0,726 mL, 8,0 mmol). A mistura foi gradualmente aquecida para a temperatura ambiente, dissipada com NH4Cl saturado (8 mL), então, entornada em água (100 mL). A mistura foi extraída três vezes com acetato de etila (150 mL) e a fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (100 mL), seca sobre Na2SO4, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1- propanol racêmico (1,54 g, 80%) como um óleo amarelo-claro. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,18 (d, 1 H, J = 1,7 Hz, Ph-H), 7,93 (dd, 1 H, J = 1,7 e 8,3 Hz, Ph-H), 7,50 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 5,04 (m, 1 H, Ph- CH), 2,17 (d, 1 H, J = 4,4 Hz, OH), 1,98 (m, 1 H, CH), 0,93 (d, 3 H, J = 4,4 Hz, CH3), 0,92 (d, 3 H, J = 4,4 Hz, CH3); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 148,62 (C), 141,81 (CH), 138,57 (C), 132,72 (CH), 130,49 (CH), 91,51 (C), 73,48 (CH), 34,22 (CH), 19,62 (CH3), 16,71 (CH3).

[0200] (1S)-canfanato de (R)- e (S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil- propila: Sob uma atmosfera de nitrogênio, cloreto de ácido (1S)canfânico (0,89 g, 4,09 mmol) foi adicionado a uma solução de (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol (1,10 g, 3,41 mmol) e DMAP (0,50 g, 4,09 mmol) em diclorometano anidro (30 mL). A mistura foi agitada durante 1,5 hora em temperatura ambiente e então, concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para (1S)-canfanato de (RS)-1-(4- Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propila (1,44 g, 84%, mistura a 1:1 de diastereômeros) como um sólido, o qual foi dissolvido em metanol em ebulição (70 mL) e deixado descansar em temperatura ambiente durante a noite. Os cristais formados foram filtrados para proporcionar (1S)-canfanato de (R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propila puro (0,465 g, 65%). O líquido de origem foi evaporado e o resíduo foi dissolvido em isopropanol em ebulição (40 mL) e deixado descansar em temperatura ambiente durante a noite. Os cristais formados foram filtrados e recristalizados a partir de isopropanol em ebulição (20 mL) para proporcionar (1S)-canfanato de (S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil- 1-propila puro (0,288 g, 40%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) para (R, S)- canfanato: δ 8,30 (d, 1 H, J = 1,8 Hz, Ph-H), 7,92 (dd, 1 H, J = 1,8 e 8,3 Hz, Ph-H), 7,56 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 6,27 (d, 1 H, J = 6,8 Hz, Ph- CH), 2,40 (m, 1 H), 2,23 (m, 1 H), 2,06 (m, 1 H), 1,92 (m, 1 H), 1,72 (m, 1 H), 1,11 (s, 3 H, CH3), 1,03 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 1,02 (s, 1 H, CH3), 0,98 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,82 (s, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CDCI3) para (R, S)-canfanato: δ 178,21 (C), 166,92 (C), 148,67 (C), 142,07 (CH), 134,80 (C), 133,34 (CH), 129,73 (CH), 92,59 (C), 90,75 (C), 76,07 (CH), 54,79 (C), 54,34 (C), 33,27 (CH), 31,03 (CH2), 28,88 (CH2), 19,07 (CH3), 17,40 (CH3), 16,70 (CH3), 16,66 (CH3), 9,61 (CH3).

[0201] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) ) para (S, S)-canfanato: δ 8,30 (d, 1 H, J = 1,8 Hz, Ph-H), 7,94 (dd, 1 H, J = 1,8 e 8,3 Hz, Ph-H), 7,35 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 6,23 (d, 1 H, J = 6,1 Hz, Ph-CH), 2,34 (m, 1 H), 2,24 (m, 1 H), 1,91 (m, 2 H), 1,67 (m, 1 H), 1,13 (s, 3 H, CH3), 1,04 (s, 3 H, CH3), 1,02 (d, 3 H, J = 5,2 Hz, CH3), 1,00 (s, 3 H, CH3), 0,98 (d, 3 H, J = 5,6 Hz, CH3); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) (S, S)-canfanato: δ 178,28 (C), 167,03 (C), 148,67 (C), 142,27 (CH), 134,90 (C), 133,28 (CH), 129,59 (CH), 91,60 (C), 91,06 (C), 76,21 (CH), 54,91 (C), 54,40 (C), 33,16 (CH), 30,75 (CH2), 28,83 (CH2), 19,14 (CH3), 17,41 (CH3), 16,97 (CH3), 16,65 (CH3),9,70 (CH3).

[0202] Dados de cristalografia por raios X para (1S)-canfanato de (R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propila: Dados de cristal para lg01a: C20H24INO6, M = 501,30, lâmina incolor, 0,30 x 0,20 x 0,20 mm3, monoclínica, grupo espacial P21 (No. 4), a = 7,5810(15), b = 12,446(3), c = 11,722(3) Â, β = 107,613(10)°, V = 1054,2(4) Â3, Z = 2, Dc = 1,579 g/cm3, F000 = 504, detector de área CCD, radiação MoKα, À = 0,71073 Â, T = 110(2)K, 26max = 50,0°, 24239 reflexões coletadas, 3558 únicas (Rint = 0,0302). Final GooF = 1,010, R1 = 0,0123, wR2 = 0,0316, índices R baseados em 3520 reflexões com I >2sigma(I) (refino sobre F2), 253 parâmetros, 3 restrições. Lp e correções de absorção aplicadas, μ = 1,554 mm-1. Parâmetro de estrutura absoluta = 0,020(9) (Flack, 1983, o qual é incorporado aqui por referência). Vide figura 3.

[0203] (R)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol: (1S)-canfanato de (R)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propila (0,41 g, 0,82 mmol) foi dissolvido em metanol quente (60 mL) e K2CO3 (0,22 g, 1,58 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida para refluxo durante uma hora, esfriada para a temperatura ambiente e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (R)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol (0,262 g, 100%) como um óleo amarelo-claro. 1H RMN era idêntico àquele do álcool racêmico.

[0204] (S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol: (1S)-canfanato de (S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propila (0,288 g, 0,57 mmol) foi dissolvido em metanol quente (40 mL) e K2CO3 (0,15 g, 1,1 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida para refluxo durante uma hora, esfriada para a temperatura ambiente e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol (0,184 g, 100%) como um óleo amarelo-claro. 1H RMN era idêntico àquele do álcool racêmico. Síntese de (RS)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol e (R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol

Esquema 5. Síntese de (RS)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol e (R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol. (i) PhMgCl, t-BuCHO, THF (anidro), menos 40oC à temperatura ambiente, 72%; (ii) cloreto de ácido (1S) canfânico, piridina (an.), temperatura ambiente, 81%; (iii) recristalização a partir de metanol; (iv) K2CO3, MeOH, refluxo, 92%.

[0205] (RS)-1-(2-Nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol: Sob uma atmosfera de nitrogênio, uma solução de 1-iodo-2-nitrobenzeno (3,0 g, 12 mmol) em THF anidro (30 mL) foi esfriada para menos 40oC e então, cloreto de fenilmagnésio (2 M em THF, 7,2 mL, 14,5 mmol) foi adicionado gota a gota em uma taxa tal que a temperatura não excedesse menos 35oC. Após a mistura ser agitada durante 20 minutos a menos 40oC, trimetilacetaldeído (1,85 mL, 16,8 mmol) foi adicionado gota a gota e a mistura foi agitada durante mais 30 minutos a menos 40oC. A mistura foi gradualmente aquecida para a temperatura ambiente, dissipada com cloreto de amônio saturado (60 mL), entornada em água (60 mL) e extraída com acetato de etila três vezes (60 mL cada). A fase orgânica combinada foi seca sobre Na2SO4 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (RS)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1- propanol (1,82 g, 72%) como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,82 (d, 1 H, J = 6,4 Hz, Ph-H), 7,76 (d, 1 H, J = 6,4 Hz, Ph- H), 7,61 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, Ph-H), 7,39 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, Ph-H), 5,39 (d, 1 H, J = 2,8 Hz, Ph-CH), 2,14 (d, 1 H, J = 3,2 Hz, OH), 0,89 (s, 9 H, C(CH3)3).

[0206] (1S)-canfanato de (RS)-1-(2-Nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propila: Sob uma atmosfera de nitrogênio, cloreto de ácido (1S)canfânico (3,37 g, 15,6 mmol) foi adicionado a uma solução de (RS)-1-(2-nitrofenil)-2,2- dimetil-1-propanol (2,71 g, 13 mmol) e DMAP (80 mg, 0,65 mmol) em piridina anidra (50 mL). A mistura foi agitada durante 24 horas em temperatura ambiente. O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (50 mL), lavado com 0,5 M HCl (20 mL) duas vezes, seguido por solução saturada de NaHCO3 (20 mL). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (1S)- canfanato de (RS)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propila (4,11 g, 81%, mistura a 1:1 de diastereômeros) como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 7,91 (m, 1 H, Ph-H), 7,62 (m, 2 H, Ph-H), 7,46 (m, 1 H, Ph-H), 6,66 e 6,62 (2 s, 1 H, Ph-CH), 2,38 (m, 1 H), 2,10 - 1,9 (m, 2 H), 1,71 (m, 1 H), 1,13, 1,11, 1,08, 1,04, 1,03, 0,87 (6 s, 9 H, CH3 X 3), 0,97 (s, 9 H, (CHβ^C).

[0207] (1S)-canfanato de (R ou S)-1-(2-Nitrofenil)-2,2-dimetil-1- propila: Diastereômero único puro (1S)-canfanato de (R ou S)-1-(2- nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propila (0,79 g, 35%) foi obtido após cristalização repetida de (1S)-canfanato de (RS)-1-(2-Nitrofenil)-2,2- dimetil-1-propila (4,57 g) a partir de metanol. A configuração absoluta do diastereômero único canfanato não é determinada. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,91 (dd, 1 H, J = 0,8 e 8,0 Hz, Ph-H), 7,61 (m, 2 H, Ph- H), 7,46 (m, 1 H, Ph-H), 6,62 (s, 1 H, Ph-CH), 2,35 (m, 1 H), 1,93 (m, 2 H), 1,69 (m, 1 H), 1,13, 1,08 e 1,02 (3 s, 9 H, CH3 x 3), 0,96 (s, 9 H, (CH3)3C).

[0208] (R ou S)-1-(2-Nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol: Uma mistura de único diastereômero (1S)-canfanato de (R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2- dimetil-1-propila (658 mg, 1,68 mmol) e K2CO3 (241 mg, 1,74 mmol) em metanol (23 mL) foi aquecida para refluxo durante 30 minutos. Água (5 mL) foi adicionada e a solução foi neutralizada para um pH de 7 com HCl a 1 M. O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi captado em uma mistura de acetato de etila (20 mL) e água (10 mL). A fase orgânica foi separada, seca sobre anidro Na2SO4, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar o enantiômero único (R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1- propanol (325 mg, 92%) como um óleo amarelo-claro. 1H RMN era idêntico àquele do álcool racêmico. A configuração absoluta do álcool de enantiômero único não é determinada. Síntese de (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol e (R ou S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol

Esquema 6. Síntese de (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1- propanol e (R ou S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol. (i) PhMgCl, t-BuCHO, THF (anidro), menos 40oC à temperatura ambiente, 81%; (ii) cloreto de ácido (1S)canfânico, DMAP, CH2Cl2 (anidro), temperatura ambiente, 88%; (iii) recristalização a partir de metanol; (iv) K2CO3, MeOH, refluxo, 98%.

[0209] (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol: Sob uma atmosfera de nitrogênio uma solução de 1,4-di-iodo-2-nitrobenzeno (3,0 g, 8,0 mmol) em THF anidro (20 mL) foi esfriada para menos 40oC e então, uma solução de cloreto de fenilmagnésio (2 M em THF, 4,8 mL, 9,6 mmol) foi adicionada gota a gota em uma taxa tal que a temperatura não excedesse menos 35oC. Quando de término da adição, a mistura foi agitada durante dez minutos, seguido pela adição de trimetilacetaldeído (1,2 mL, 11,2 mmol) e a mistura foi agitada durante 30 minutos a menos 40oC. A mistura foi gradualmente aquecida para a temperatura ambiente, dissipada com cloreto de amônio saturado (60 mL), entornada em água (120 mL) e extraída com acetato de etila duas vezes (60 mL cada). A fase orgânica combinada foi lavada com água (60 mL), seca sobre Na2SO4 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (RS)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol racêmico (2,17 g, 81%) como um óleo marrom. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,04 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, Ph-H), 7,88 (dd, 1 H, J = 1,6 e 8,4 Hz, Ph-H), 7,51 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ph-H), 5,28 (d, 1 H, J = 3,6 Hz, Ph-CH), 2,29 (d, 1 H, J = 3,6 Hz, OH), 0,85 (s, 9 H, C(CH3)3). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 149,87 (C), 141,0 (CH), 136,2 (C), 132,3 (CH), 131,63 (CH), 91,85 (C), 74,33 (CH), 36,81 (C), 25,6 (CH3).

[0210] (1S)-canfanato de (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1- propila: Sob uma atmosfera de nitrogênio, cloreto de ácido (1S)canfânico (1,68 g, 7,77 mmol) foi adicionado a uma solução de (RS)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol (2,17 g, 6,47 mmol) e DMAP (1,18 g, 9,7 mmol) em diclorometano anidro (50 mL). A mistura foi agitada durante a noite em temperatura ambiente e então, lavada com solução saturada de NaHCO3 (60 mL) e água (60 mL). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (1S)- canfanato de (RS)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propila (2,94 g, 88%, mistura a 1:1 de diastereômeros) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 8,23 (m, 1 H, Ph-H), 7,90 (m, 1 H, Ph-H), 7,31 (m, 1 H, Ph-H), 6,56 e 6,51 (2 s, 1 H, Ph-CH), 2,38 (m, 1 H), 2,07 - 1,9 (m, 2 H), 1,69 (m, 1 H), 1,13, 1,11, 1,07, 1,04, 1,02, 0,87 (6 s, 9 H, CH3 X 3), 0,96 (s, 9 H, (CHβ^C).

[0211] (1S)-canfanato de (R ou S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2- dimetil-1-propila: (1S)-canfanato de (RS)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2- dimetil-1-propila (2,07 g) foi dissolvido em metanol em ebulição (100 mL) e deixado descansar em temperatura ambiente durante dois dias. Os cristais formados foram filtrados para proporcionar diastereômero único puro (1S)-canfanato de (R ou S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propila (0,409 g, 39%). A configuração absoluta do diastereômero único canfanato não é determinada. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,23 (d, 1 H, J = 2,0 Hz, Ph-H), 7,89 (dd, 2 H, J = 2,0 e 8,4 Hz, Ph-H), 7,30 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ph-H), 6,56 (s, 1 H, Ph-CH), 2,42 (m, 1 H), 2,07 (m, 1 H), 1,94 (m, 1 H), 1,73 (m, 1 H), 1,11, 1,04 e 0,87 (3 s, 9 H, CH3 3), 0,95 (s, 9 H, (CH3)3C).

[0212] (R ou S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol: Uma mistura de único diastereômero (R ou S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2- dimetil-1-propila (1S)-canfanato (409 mg, 0,79 mmol) e K2CO3 (110 mg, 0,8 mmol) em metanol (15 mL) foi aquecida para refluxo durante 30 minutos. Água (5 mL) foi adicionada e a solução foi neutralizada para um pH de 7 com HCl a 1 M. O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi captado em uma mistura de acetato de etila (30 mL) e água (10 mL). A fase orgânica foi separada, seca sobre anidro Na2SO4, concentrada in vacuo e purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar o enantiômero único (R ou S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)- 2,2-dimetil-1-propanol (260 mg, 98%) como um óleo amarelo claro. 1H RMN era idêntico àquele do álcool racêmico. A configuração absoluta do álcool de enantiômero único não é determinada. Síntese de (±)-1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil-1-propanol

Esquema 7. Síntese de 1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil-1-propanol racêmico. (i) Nitrito de isoamila, di-iodometano, 105oC, 52%; (ii) PhMgBr, THF anidro, menos 45oC; então, i-PrCHO, processamento, 30%.

[0213] 1-Iodo-2,2-dinitrobenzeno: A uma dispersão de 2,6- dinitroanilina (4,00 g, 0,021 mol) em di-iodometano (24 mL, 0,297 mol) nitrito de isoamila (15 mL, 0,112 mol) foi adicionado (Smith et al., 1990, o qual é incorporado aqui por referência). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e então, aquecida a 105oC durante oito horas. O excesso de di-iodometano foi removido em alto vácuo. O resíduo foi diluído com acetato de etila (10 mL). Sílica (aproximadamente 30 mL, mesh 230-400 Â) foi adicionada; a mistura foi concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna para proporcionar 1-iodo-2,6-dinitrobenzeno (3,21 g, 52%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,84 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,67 (t, 1 H, J = 8,0 Hz).

[0214] (±)-1-(2,2-dinitrofenil)-2-metil-1-propanol: A uma solução de 1-iodo-2,6-dinitrobenzeno (1,55 g, 5,27 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (18 mL) esfriada para menos 53oC (banho de isopropanol-gelo seco) sob uma atmosfera de nitrogênio, brometo de fenilmagnésio (2 M em THF, 3,16 mL, 6,32 mmol) foi adicionado em uma taxa para manter a temperatura em ou abaixo de menos 45oC. Quando de término da adição, a mistura foi agitada durante cinco minutos, então, isobutiraldeído (0,957 mL, 10,54 mmol) foi adicionado. A mistura foi deixada aquecer gradualmente para a temperatura ambiente, então, dissipada com NH4Cl saturado (5 mL) e entornada em água (50 mL)/diclorometano (100 mL). A camada orgânica foi separada; a camada aquosa foi extraída três vezes com diclorometano (50 mL cada). O extrato orgânico combinado foi lavado com água (20 mL), seco sobre anidro Na2SO4, concentrado sob pressão reduzida e purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (RS)-1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil-1-propanol racêmico (0,375 g, 30%) como um óleo amarelo-claro. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,82 (d, 2 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,59 (t, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 4,84 (dd, 1 H, J = 7,6 e 9,2 Hz, Ph-CH), 2,87 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, OH), 2,18 (m, 1 H, CHCH(CH3)2), 1,12 (d, 3 H, J = 6,4 Hz, CH3), 0,77 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3); 13C RMN (100 MHz, CDCI3): δ 150,82 (C), 130,62 (C), 129,31 (CH), 127,30 (CH), 74,52 (CH), 34,19 (CH), 19,84 (CH3), 19,14 (CH3). Síntese de (±)-1-(4-metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol

Esquema 8. Síntese de 1-(4-metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol. (i) PhMgCl, THF anidro, menos 40oC; então, i-PrCHO, processamento, 67%.

[0215] (±)-1-(4-Metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol: A uma solução de 4-iodo-2-nitroanisola (2,79 g, 10,00 mmol) em tetra- hidrofurano anidro (20 mL) esfriada para menos 45oC (banho de isopropanol-gelo seco) sob uma atmosfera de nitrogênio, cloreto de fenilmagnésio (2 M em THF, 6 mL, 6,32 mmol) foi adicionado em uma taxa para manter a temperatura em ou abaixo de menos 40oC. Quando de término da adição, a mistura foi agitada durante cinco minutos, então, isobutiraldeído (1,816 mL, 20,00 mmols) foi adicionado. A mistura foi deixada aquecer gradualmente para a temperatura ambiente, então, dissipada com NH4Cl saturado (5 mL) e entornada em água (30 mL)/diclorometano (100 mL). A camada orgânica foi separada; a camada aquosa foi extraída três vezes com diclorometano (50 mL cada). O extrato orgânico combinado foi seco sobre anidro Na2SO4, concentrado sob pressão reduzida e purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (RS)-1-(4- metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol racêmico (1,502 g, 30%) como um óleo amarelo. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,62 (AB d, 1 H, J = 8,8 Hz, Ph-H), 7,34 (d, 1 H, J = 2,6 Hz, Ph-H), 7,15 (dd, 1 H, J = 2,6 e 8,8 Hz, Ph-H), 4,91 (m, 1 H, Ph-CH), 3,86 (s, 3 H, MeO), 2,45 (br s, 1 H, OH), 2,00 (m, 1 H, CHCH(CH)2), 0,97 (d, 3 H, J = 6,7 Hz, CH), 0,86 (d, 3 H, J = 6,9 Hz, CH3); 13C RMN (100 MHz, CDCI3): δ 158,76 (C), 149,07 (C), 130,79 (C), 129,88 (CH), 119,62 (CH), 108,66 (CH), 73,75 (CH), 55,81 (CH3), 34,27 (CH), 19,59 (CH3), 17,36 (CH3). Síntese (±)-1-(5-ciano-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol

Esquema 9. Síntese de 1-(5-ciano-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol racêmico. (i) NaNO2/H2SO4, 0oC, 1 hora, então, NaNO2/CuSO4, 100oC, 35%; (ii) PhMgCl, THF anidro, menos 40oC; então, i-PrCHO, processamento, 30%.

[0216] 3-iodo-4-nitrobenzonitrilo: A uma suspensão de 4-amino-3- iodobenzeno (2,44 g, 10,00 mmol) em ácido enxofreico aquoso (2 M, 50 mL) resfriado para 0oC (banho de água gelada-NaCl) uma solução de nitrito de sódio (1,656 g, 24,00 mol) em água (6 mL) foi adicionada em uma taxa tal que a temperatura da mistura de reação não excedia 0oC. Quando de término da adição, a mistura foi agitada durante uma hora (ou até clarificada), então, foi transferida, aos poucos, para uma solução quente de nitrito de sódio (13,8 g, 200 mmol) e CuSO4,5H2O (0,12 g, 0,05 mmol). (CUIDADO: evolução vigorosa de gás!) Quando de término da transferência, a mistura foi agitada em refluxo durante 30 minutos, então, esfriada para a temperatura ambiente e extraída três vezes com diclorometano (100 mL cada). Os extratos combinados foram secos sobre Na2SO4, concentrados sob pressão reduzida, misturados com sílica (aproximadamente 30 mL, mesh 230-400 Â) e purificados por meio de cromatografia em coluna para proporcionar 3-iodo-4-nitrobenzonitrilo (0,95 g, 35%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,10 (d, 1 H, J = 1,9 Hz), 7,99 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,29 (dd, 1 H, 8,2 e 1,9 Hz, 1 H); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 141,76 (CH), 139,93 (CH), 131,66 (CH), 116,65 (C), 114,78 (CN), 113,15 (C), 108,62 (C).

[0217] (±)-1-(5-ciano-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol: A uma solução de 3-iodo-4-nitrobenzonitrilo (314 mg, 1,14 mmol) em tetra- hidrofurano anidro (5,5 mL) esfriada para menos 45oC (banho de isopropanol-gelo seco) sob uma atmosfera de nitrogênio, brometo de fenilmagnésio (2 M em THF, 3,16 mL, 6,32 mmol) foi adicionado em uma taxa para manter a temperatura em ou abaixo de menos 40oC. Quando de término da adição, a mistura foi agitada durante cinco minutos, então, isobutiraldeído (0,957 mL, 10,54 mmol) foi adicionado. A mistura foi deixada aquecer gradualmente para a temperatura ambiente, então, dissipada com NH4Cl saturado (2 mL) e entornada em água (50 mL)/diclorometano (50 mL). A camada orgânica foi separada; a camada aquosa foi extraída três vezes com diclorometano (25 mL cada). O extrato orgânico combinado foi seco sobre anidro Na2SO4, concentrado sob pressão reduzida e purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar (RS)-1-(5-ciano-2-nitrofenil)-2-metil-1- propanol racêmico (57 mg, 23%) como um óleo amarelo-claro. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,93 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 7,74 (s, 1 H, Ph-H), 7,21 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 4,72 (d, 1 H, J = 3,6 Hz, Ph-CH), 2,33 (br. s, 1 H, OH), 2,03 (m, 1 H, CHCH(CHβ)2), 1,04 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,89 (d, 3 H, J = 6,6 Hz, CH3); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 147,78 (C), 140,25 (CH), 131,40 (CH), 131,24 (CH), 118,36 (C), 112,27 (CN), 103,82 (C), 80,80 (CH), 33,56 (CH), 19,70 (CH3), 15,62 (CH3). Exemplo 3 - Síntese de Análogos de Deoxiuridina e Deoxicitidina com Grupos α-Isopropila Síntese 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deóxiuridina-5’-trifosfato

Esquema 10. Síntese de 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’- deoxiuridina-5’-trifosfato. (i) (S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propanol, puro, 108 a 112oC, 4%; (ii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HCO3.

[0218] 5-[(S)-1-(2-Nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (dU.x1): Composto dU.x0 (250 mg, 0,385 mmol) e (S)-1-(2-nitrofenil)-2- metil-propanol (300 mg, 1,54 mmol) foram aquecidos puros a 105 a 110oC durante 30 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil- 2’-deoxiuridina dU.x1 (6 mg, 4%). (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimetil-silil)-5- [(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (39 mg, 18%) e 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetil-silil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (36 mg, 14%) foram também obtidas a partir da reação. 1H RMN (100 MHz, CD3OD) para dU.xl: δ 7,96 (s, 1 H, H-6), 7,88 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 7,74 (dd, 1 H, J = 1,5 e 7,6Hz, Ph- H), 7,68 (m, 1 H, Ph-H), 7,49 (m, 1 H, Ph-H), 6,25 (dd, 1 H, J = 6,4 e 7,8 Hz, H-1’), 4,77 (d, 1 H, J = 6,0 Hz, Ph-CH), 4,39 (m, 1 H, H-3’), 4,17 (AB d, 1 H, J = 12,3 Hz, 5-CH2a), 4,07 (AB d, 1 H, J = 12,3 Hz, 5-CH2b), 3,92 (m, 1 H, H-4’), 3,77 (AB dd, 1 H, J = 3,4 e 12,1 Hz, H-5’a), 3,71 (AB dd, 1 H, J = 3,8 e 12,1 Hz, H-5’b), 2,24 (m, 2 H, H-2’), 1,95 (m, 1 H, CH), 0,94 (d, 3 H, J = 6,7 Hz, CH3), 0,85 (d, 3 H, J = 6,9 Hz, CH3).

[0219] 5-[(S)-1-(2-Nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina- 5’-trifosfato (WW3p063): POCl3 (4 μL, 0,045 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.x1 (14 mg, 0,03 mmol) e esponja de prótons (13 mg, 0,06 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) a 0oC e agitados durante uma hora. Mais POCl3 (4 μL, 0,045 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada durante mais três horas. Uma solução de pirofosfato de tri-n- butilamônio (72 mg, 0,15 mmol) e tri-n-butilamina (30 μL) em DMF anidra (0,3 mL) foi adicionada. Após cinco minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e então, liofilizada até secagem. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions sobre uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 240 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas a fim de proporcionar 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propi- lóxi]metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato WW3p063 (10 mg, 46%) como um sólido fofo branco. 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 7,88 (dd, 1 H, J = 1,2 e 6,4 Hz, Ph-H), 7,66 (m, 1 H, Ph-H), 7,58 (dd, 1 H, J = 1,2 e 6,4 Hz, Ph- H), 7,56 (s, 1 H, H-6), 7,46 (dt, 1 H, J = 1,2 e 6,4 Hz, Ph-H), 6,09 (t, 1 H, J = 5,6 Hz, H-1’), 4,46 (m, 1 H, H-3’), 4,39 (AB d, 1 H, J = 10 Hz, 5- CH2a), 4,23 (AB d, 1 H, J = 10 Hz, 5-CH2b), 4,20 - 4,12 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 2,29 (m, 1 H, H-2’a), 2,2 (m, 1 H, H-2’b), 1,94 (m, 1 H, CH), 0,97 (d, 3 H, J = 5,6 Hz, CH3), 0,74 (d, 3 H, J = 5,6 Hz, CH3). 31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,06 (d, J = 16,2 Hz), -10,55 (d, J = 16,2 Hz), -20,9 (t, J = 16,2 Hz). Síntese 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato

Esquema 11. Síntese de 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’- deoxicitidina-5’-trifosfato. (i) (S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propanol, puro, 108 a 112oC, 14%; (ii) cloreto de 2,4,6-tri-isopropilbenzeno-sulfonila, DAMP, Et3N, CH2Cl2 (anidro), temperatura ambiente, 42%; (iii) NH3 (0,5 M em 1,4-dioxano), 85 a 90oC, 61%; (iv) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 96%; (v) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HCO3

[0220] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetil-silil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2- metil-propilóxi]metil-2’-deóxiuridina (dU.x2): Composto dU.x0 (250 mg, 0,385 mmol) e (S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propanol (300 mg, 1,54 mmol) foram aquecidos puros a 105 a 110oC durante 30 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetil-silil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-2’-deoxiuridina dU.x2 (36 mg, 14%). (3’ ou 5’)-O-(terc- butildimetil-silil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi] metil-2’- deóxiuridina (39 mg, 18%) e 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil- 2’-deóxiuridina (6 mg, 4%) foram também obtidas a partir da reação. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) para dU.x2: δ 8,76 (s, 1 H, NH), 7,84 (dd, 1 H, J = 1,1 e 8,1 Hz, Ph-H), 7,73 (dd, 1 H, J = 1,3 e 7,9 Hz, Ph-H), 7,66 (m, 1 H, Ph-H), 7,59 (s, 1 H, H-6), 7,42 (m, 1 H, Ph-H), 6,29 (dd, 1 H, J = 5,9 e 7,8 Hz, H-1’), 4,78 (d, 1 H, J = 6,2 Hz, Ph-CH), 4,42 (m, 1 H, H-3’), 4,18 (AB d, 1 H, J = 12,0 Hz, 5-CH2a), 4,04 (AB d, 1 H, J = 12,0 Hz, 5- CH2b), 3,94 (m, 1 H, H-4’), 3,77 (m, 2 H, H-5’), 2,30 (m, 1 H, H-2’a), 2,05 (m, 1 H, H-2’b), 1,96 (m, 1 H, CH), 0,92 (d, 3 H, J = 6,7 Hz, CH3), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,84 (d, 3 H, J = 6,9 Hz, CH3), 0,10 (s, 3 H, CH3Si), 0,09 (s, 3 H, CH3Si), 0,08 (s, 3 H, CH3Si), 0,07 (s, 3 H, CH3Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) para dU.x2: δ 162,39 (C), 150,01 (C), 149,47 (C), 138,33 (CH), 136,78 (C), 132,88 (CH), 129,24 (CH), 124,08 (CH), 111,48 (C), 87,84 (CH), 85,16 (CH), 81,33 (CH), 72,35 (CH), 64,50 (CH2), 63,09 (CH2), 40,95 (CH2), 34,91 (CH), 25,94 (C(CH3)3), 25,76 (C(CH3)3), 19,28 (CH3), 18,41 (C), 18,02 (C), 17,90 (CH3), -4,66 (CH3), -4,82 (CH3), -5,32 (CH3), -5,41 (CH3).

[0221] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetil-silil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2- metil-propilóxi]metil-O4-(2,4,6-tri-isopropilbenzeno-sulfonil)-2’- deóxiuridina (dU.x3): A uma solução de composto dU.x2 (90 mg, 0,136 mmol), DMAP (17 mg, 0,140 mmol) e trietilamina (0,172 mL, 1,224 mmol) em diclorometano anidro (6 mL) cloreto de 2,4,6-tri- isopropilbenzeno-sulfonila (1,57 g, 5,19 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 17 horas sob uma atmosfera de nitrogênio, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna a fim de proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc- butildimetil-silil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-4-O-(2,4,6- tri-isopropilbenzeno-sulfonil)-2’-deoxiuridina dU.x3 (54 mg, 42%). 1H RMN (400 MHz, CDCh): δ 8,07 (s, 1 H, H-6), 7,86 (m, 1 H, Ph-H), 7,71 (m, 1 H, Ph-H), 7,46 (m, 1 H, Ph-H), 7,16 (s, 2 H, Ph-H), 6,09 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1’), 4,79 (d, 1 H, J = 6,2 Hz, Ph-CH), 4,34 (m, 1 H, H-3’), 4,12 (m, 4 H), 3,97 (m, 1 H, H-4’), 3,80 (AB dd, 1 H, J = 3,4 e 11,2 Hz, H-5’a), 3,80 (AB dd, 1 H, J = 3,6 e 11,2 Hz, H-5’b), 2,89 (m, 1 H, CH), 2,51 (m, 1 H, H-2’a), 1,96 (m, 2 H), 1,29 e 1,21 (d, 12 H, J = 6,7 Hz, CH3 x 4), 1,25 (d, 6 H, J = 7,0 Hz, CH3 x 2), 0,99 (d, 3 H, J = 6,7 Hz, CH3), 0,87 (2 s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,84 (d, 3 H, J = 6,9 Hz, CH3), 0,07 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,06 (s, 6 H, (CH3)2Si).

[0222] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetil-silil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2- metil-propóxi]metil-2’-deoxcitidina (dC.x4): A uma solução de composto dU.x3 (47 mg, 0,051 mmol) em 1,4-dioxano anidro (3 mL) uma solução de amônia (3 mL, 0,5 M em dioxano, 1,50 mmol) foi adicionada. A mistura foi transferida para um tubo vedado e aquecida a 85 a 90oC durante 1,5 hora. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetil-silil)-5-[(S)-1- (2-nitrofenil)-2-metil-propóxi]metil-2’-deoxcitidina dC.x4 (20 mg, 61%) como um sólido graxo. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,81 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 7,66 (m, 2 H, Ph-H), 7,51 (s, 1 H, H-6), 7,45 (m, 1 H, Ph-H) , 6,64 e 5,81 (2 br. s, 2 H, NH2), 6,28 (t, 1 H, J = 6,5 Hz, H-1’), 4,70 (d, 1 H, J = 6,8 Hz, Ph-CH), 4,32 (m, 1 H, H-3’), 4,20 (AB d, 1 H, J = 12,6 Hz, 5-CH2a), 4,07 (AB d, 1 H, J = 12,6 Hz, 5-CH2b), 3,89 (m, 1 H, H-4’), 3,77 (AB dd, 1 H, J = 3,5 e 11,2Hz, H-5’a), 3,69 (AB dd, 1 H, J = 3,4 e 11,2 Hz, H-5’b), 2,42 (m, 1 H, H-2’a), 1,99 (m, 2 H, H-2’b e CH), 0,98 (d, 3 H, J = 6,6 Hz, CH3), 0,88 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,80 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,78 (d, 3 H, J = 7,0 Hz, CH3), 0,07 (s, 3 H, CH3Si), 0,06 (s, 3 H, CH3Si), -0,01 (s, 3 H, CH3Si), - 0,04 (s, 3 H, CH3Si).

[0223] 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina (dC.x5): A uma solução de composto dC.x4 (16 mg, 0,024 mmol) em THF (1 mL) uma solução de tri-hidrato de fluoreto de tetra-n-butilamônio (31 mg, 0,096 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel a fim de proporcionar 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxicitidina dC.x5 (10 mg, 96%) como um sólido graxo. 1H RMN (400 MHz, DMSO- d6) δ 7,95 (m, 1 H, Ph-H), 7,76 (m, 1 H, Ph-H), 7,64 (m, 1 H, Ph-H), 7,63 (s, 1 H, H-6), 7,56 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 7,39 e 6,66 (2 br. s, 2 H, D2O permutável, NH2), 6,13 (m, 1 H, H-1’), 5,20 (d, 1 H, J = 4,1 Hz, D2O permutável, 3’-OH), 4,85 (t, 1 H, J = 5,4 Hz, D2O permutável, 5’-OH), 4,67 (d, 1 H, J = 6,0 Hz, Ph-CH), 4,17 (m, 1 H, H-3’), 4,10 (AB d, 1 H, J = 12,2 Hz, 5-CH2a), 3,99 (AB d, 1 H, J = 12,2 Hz, 5-CH2b), 3,74 (m, 1 H, H-4’), 3,49 (m, 2 H, H-5’), 2,08 (m, 1 H, H-2’a), 1,91 (m, 2 H, H-2’b e CH), 0,88 (d, 3 H, J = 6,7 Hz, CH3), 0,77 (d, 3 H, J = 6,9 Hz, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 166,57 (C), 158,14 (C), 151,46 (C), 142,74 (CH), 137,30 (C), 134,29 (CH), 130,28 (CH), 129,91 (CH), 125,32 (CH), 104,64 (C), 89,00 (CH), 87,57 (CH), 81,04 (CH), 72,13 (CH), 66,42 (CH2), 62,87 (CH2), 42,22 (CH2), 36,30 (CH), 19,64 (CH3), 18,56 (CH3).

[0224] 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina- 5’-fosfato (WW3p065): POCl3 (3 μL, 0,034 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.x5 (10 mg, 0,023 mmol) e esponja de prótons (10 mg, 0,046 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) a 0oC e agitados durante duas horas. Mais POCl3 (3 μL, 0,034 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada durante mais uma hora. Uma solução de pirofosfato de tri-n- butilamônio (55 mg, 0,115 mmol) e tri-n-butilamina (30 μL) em DMF anidra (0,25 mL) foi adicionada. Após cinco minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e então, liofilizada até secagem. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions sobre uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 240 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas a fim de proporcionar 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato WW3p065 (16 mg, 96%) como um sólido fofo branco. 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 7,85 (dd, 1 H, J = 1,2 e 8,4 Hz, Ph-H), 7,65 (m, 3 H, Ph-H e H6), 7,49 (dt, 1 H, J = 1,6 e 8,4 Hz, Ph-H), 6,05 (t, J = 6,4 Hz, 1 H, H-1’), 4,54 (AB d, 1 H, J = 13,6 Hz, 5-CH2a), 4,46 (m, 1 H, H-3’), 4,44 (AB d, 1 H, J = 13,6 Hz, 5-CH2b), 4,18 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 2,39 (m, 1 H, H-2’a), 2,2 (m, 1 H, H-2’b), 2,01 (m, 1 H, CH), 1,06 (d, 3 H, J = 6,4 Hz, CH3), 0,73 (d, 3 H, J = 7,2 Hz, CH3); 31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -5,25 (d, J = 21,0 Hz), -10,79 (d, J = 19,44 Hz), -21,14 (t, J = 21,0 Hz). Exemplo 4 - Síntese de Análogos de Deoxiuridina e Deoxicitidina com Grupos α-terc-Butila Síntese 5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’- deoxiuridina-5’-trifosfato

Esquema 12. Síntese de 5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1- propilóxi] metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato. (i) (R ou S)-1-(2-nitrofenil)- 2,2-dimetil-1-propanol, puro, 108 a 115oC, 4%; (ii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HCO3.

[0225] 5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’- deoxiuridina (dU.x4): Composto dU.x0 (520 mg, 0,802 mmol) e (R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol enântio-puro (580 mg, 2,77 mmol) foram aquecidos puros a 108 a 115oC durante uma hora sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 5- [(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (dU.x4) (16 mg, 4%). (3’ ou 5’)-O-(terc-butil-dimetil-silil)-5-[(R ou S)-1- (2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (78 mg, 17%) e 3’,5’-O-bis-(terc-butil-dimetil-silil)-5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil- 1-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (115 mg, 21%) foram também obtidas a partir da reação. 1H RMN (100 MHz, CD3OD) para dU.x4: δ 7,84 (s, 1 H, H-6), 7,68 (dd, 1 H, J = 1,2 e 8,1 Hz, Ph-H), 7,64 (dd, 1 H, J = 1,4 e 7,9 Hz, Ph-H), 7,53 (m, 1 H, Ph-H), 7,36 (m, 1 H, Ph-H), 6,13 (t, 1 H, J = 7,2 Hz, H-1’), 4,84 (s, 1 H, Ph-CH), 4,26 (m, 1 H, H-3’), 4,13 (AB d, 1 H, J = 12,4 Hz, 5-CH2a), 3,96 (AB d, 1 H, J = 12,4 Hz, 5-CH2b), 3,78 (m, 1 H, H-4’), 3,60 (m, 2 H, H-5’), 2,12 (m, 2 H, H-2’), 0,69 (s, 9 H, (CH3)3C).

[0226] 5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’- deoxiuridina-5’-trifosfato (WW3p075): POCl3 (5 μL, 0,053 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.x4 (16 mg, 0,035 mmol) e esponja de prótons (15 mg, 0,07 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) a 0oC e agitados durante duas horas. Mais POCl3 (3 μL, 0,032 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada durante mais uma hora. Uma solução de pirofosfato de tri-n-butilamônio (83 mg, 0,175 mmol) e tri-n-butilamina (35 μL) em DMF anidra (0,35 mL) foi adicionada. Após cinco minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e então, liofilizada até secagem. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions sobre uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 240 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas a fim de proporcionar 5-[(R ou S)-1-(2- nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato WW3p075 (14 mg, 53%) como um sólido fofo branco. 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 7,83 (d, 1 H, J = 8,8 Hz, Ph-H), 7,63 (m, 3 H, Ph-H e H-6), 7,47 (m, 1 H, Ph-H), 6,08 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 4,46 (m, 1 H, H-3’), 4,41 (AB d, 1 H, J = 8,4 Hz, 5-CH2a), 4,32 (AB d, 1 H, J = 8,8 Hz, 5- CH2b), 4,20 - 4,11 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 2,24 (m, 2 H, H-2’), 0,79 (s, 9 H, (CH3)3C); 31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,11(d, J = 19,4 Hz), -10,55 (d, J = 19,4 Hz), -20,9 (t, J = 19,4 Hz). Síntese 5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’- deoxicitidina-5’-trifosfato

Esquema 13. Síntese de 5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil- propilóxi] metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato. (i) (S)-1-(2-nitrofenil)-2,2- dimetil-1-propanol, puro, 108 a 115oC, 21%; (ii) cloreto de 2,4,6-tri- isopropilbenzenossulfonila (TPSCl), DMAP, Et3N, CH2Cl2 (anidro), temperatura ambiente, 31%; (iii) NH3 (0,5 M em 1,4-dioxano), 85 a 90oC, 61%; (iv) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 96%; (v) PoCl3, esponja de prótons, (Meo)3Po, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2o7, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HCo3.

[0227] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)- 2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (dU.x5): Composto dU.x0 (520 mg, 0,802 mmol) e (R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol enântio-puro (580 mg, 2,77 mmol) foram aquecidos puros a 108 a 115oC durante uma hora sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)- 1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi] metil-2’-deoxiuridina dU.x5 (115 mg, 21%). (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimeti-silil)-5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)- 2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (78 mg, 17%) e 5-[(R ou S)- 1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (16 mg, 4%) foi também obtido a partir da reação. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) para dU.x5: δ 8,97 (s, 1 H, NH), 7,76 (d, 2 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,60 (m, 2 H, Ph-H e H-6), 7,41 (s, 1 H, Ph-H), 6,29 (dd, 1 H, J = 6,0 e 7,6 Hz, H-1’), 4,97 (s 1 H, Ph-CH), 4,42 (m, 1 H, H-3’), 4,28 (AB d, 1 H, J = 12,0 Hz, 5-CH2a), 4,06 (AB d, 1 H, J = 12,0 Hz, 5-CH2b), 3,92 (m, 1 H, H-4’), 3,76 (m, 2 H, H-5’), 2,30 (m, 1 H, H-2’a), 2,05 (m, 1 H, H-2’b), 0,95 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,83 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,12 (s, 3 H, CH3Si), 0,09 (s, 3 H, CH3Si), 0,07 (s, 3 H, CH3Si), 0,06 (s, 3 H, CH3Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) para dU.x5: δ 162,52 (C), 150,82 (C), 150,15 (C), 138,50 (CH), 134,19 (C), 132,01 (CH), 130,11 (CH), 128,14 (CH), 123,81 (CH), 111,45 (C), 87,70 (CH), 84,98 (CH), 81,44 (CH), 72,19 (CH), 64,60 (CH2), 62,95 (CH2), 40,85 (CH2), 36,51 (C), 25,94 ( (CH3)3C), 25,91 ( (CH3)3C), 25,78 (C(CH3)3), 18,39 (C), 18,00 (C), -4,66 (CH3), -4,84 (CH3), -5,35 (CH3), -5,42 (CH3).

[0228] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)- 2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-O4-(2,4,6-tri-isopropilbenzenossulfonil)-2’- deoxiuridina (dU.x6): A uma solução de dU.x5 (110 mg, 0,16 mmol), DMAP (20 mg, 0,17 mmol) e trietilamina (63 μL, 0,45 mmol) em diclorometano anidro (3 mL) cloreto de 2,4,6-tri-isopropil benzenossulfonila (61 mg, 0,20 mmol) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 36 horas sob uma atmosfera de nitrogênio, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel a fim de proporcionar 3’,5’-O-bis- (terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]

[0229] metil-O4-(2,4,6-tri-isopropilbenzenossulfonil)-2’-deoxiuridina dU.x6 (47 mg, 31%). 1H RMN (500 MHz, CDCh): δ 8,08 (s, 1 H, H-6), 7,80 (dd, 1 H, J = 1,2 e 8,0 Hz, Ph-H), 7,78 (dd, 1 H, J = 1,6 e 8,0 Hz, Ph-H), 7,67 (m, 1 H, Ph-H), 7,46 (m, 1 H, Ph-H), 7,20 (s, 2 H, Ph-H), 6,09 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1’), 4,98 (s, 1 H, Ph-CH), 4,35 (m, 1 H, H-3’), 4,25 (AB d, 1 H, J = 11,6 Hz, 5-CH2a), 4,11 (AB d, 1 H, J = 11,6 Hz, 5- CH2b), 3,97 (m, 1 H, H-4’), 3,79 (dd, 1 H, J = 3,6 e 11,6 Hz, H-5’a), 3,74 (dd, 1 H, J = 11,6 e 3,6 Hz, H-5’b), 2,90 (m, 1 H, CH), 2,50 (m, 2 H, H- 2’), 1,98 (m, 2 H, CH), 1,31 - 1,22 (m, 18 H, (CH3)2CH x 3), 0,88 (2 s, 18 H, (CH3)3CSi x 2), 0,87 (s, 9 H, (CH^C), 0,07 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,06 (s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 166,03 (C), 154,39 (C), 153,52 (C), 151,09 (C), 150,94 (C), 144,77 (CH), 133,60 (C), 132,43 (CH), 131,07 (C), 130,12 (CH), 128,24 (CH), 123,05 (CH), 123,81 (CH), 104,64 (C), 88,39 (CH), 87,42 (CH), 82,45 (CH), 71,93 (CH), 64,41 (CH2), 62,78 (CH2), 42,09 (CH2), 36,54 (C), 34,26 (CH), 29,60 (CH), 25,92 ( (CH3)3C), 25,82 ( (CH3)3C), 25,74 ( (CH3)3C), 24,62 (CH3), 24,34 (CH3), 23,48 (CH3), 18,40 (C), 17,99 (C), -4,62 (CH3), -4,92 (CH3), -5,37 (CH3), -5,34 (CH3).

[0230] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)- 2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina (dC.x6): A uma solução de composto dU.x6 (47 mg, 0,050 mmol) em 1,4-dioxano anidro (2 mL) uma solução de amônia (2 mL, 0,5 M em dioxano) foi adicionada. A mistura foi transferida para um tubo vedável e foi aquecida a 92oC durante 10 horas. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina dC.x6 (31 mg, 91%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ 7,67 (m, 3 H, Ph-H), 7,53 (s, 1 H, H-6), 7,45 (m, 1 H, Ph-H), 6,30 (t, 1 H, J = 6,6 Hz, H-1’), 5,72 (br s, 2 H, NH2), 4,88 (s, 1 H, Ph-CH), 4,32 (m, 1 H, H-3’), 4,28 (AB d, 1 H, J = 12,8 Hz, 5-CH2a), 4,08 (AB d, 1 H, J = 12,8 Hz, 5-CH2b), 3,87 (m, 1 H, H-4’), 3,74 (dd, 1 H, J = 3,6 e 14,8 Hz, H-5’a), 3,66 (dd, 1 H, J = 3,6 e 11,3 Hz, H-5’b), 2,41 (m, 1 H, H-2’a), 2,03 (m, 1 H, H-2’b), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,87 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,83 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,09 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,06 (2 s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 165,16 (C), 155,52 (C), 151,31 (C), 140,63 (CH), 133,31 (C), 132,04 (CH), 129,53 (CH), 128,56 (CH), 123,76 (CH), 101,89 (C), 87,39 (CH), 85,72 (CH), 81,24 (CH), 71,59 (CH), 66,55 (CH2), 62,68 (CH2), 41,65 (CH2), 36,20 (C), 25,92 ((CH3)3C), 25,82 ( (CH3)3C), 25,75 ( (CH3)3C), 18,23 (C), 17,97 (C), -4,64 (CH3), -4,94 (CH3), -5,47 (CH3) , -5,53 (CH3).

[0231] 5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’- deoxcitidina (dC.x7): Uma solução de tri-hidrato de fluoreto de tetra-n- butilamônio (28 mg, 0,09 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada a uma solução de composto dC.x6 (20 mg, 0,03 mmol) em THF (2 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1- propilóxi]metil-2’-deoxcitidina dC.x7 (11 mg, 82%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,87 (s, 1 H, H-6), 7,82 (dd, 1 H, J = 1,2 e 8,4 Hz, Ph-H), 7,76 (dd, 1 H, J = 1,6 e 8,0 Hz, Ph-H), 7,68 (m, 1 H, Ph-H), 7,51 (m, 1 H, Ph- H), 6,23 (t, 1 H, J = 6,6 Hz, H-1’), 4,94 (s, 1 H, Ph-CH), 4,44 (AB d, 1 H, J = 13,2 Hz, 5-CH2a), 4,34 (m, 1 H, H-3’), 4,11 (AB d, 1 H, J = 13,2 Hz, 5-CH2b), 3,88 (m, 1 H, H-4’), 3,71 (dd, 1 H, J = 3,2 e 12,0 Hz, H-5’a), 3,63 (dd, 1 H, J = 4,0 e 12,0 Hz, H-5’b), 2,35 (m, 1 H, H-2’a), 2,14 (m, 1 H, H-2’b), 0,80 (s, 9 H, (CH3) 3C); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 166,65 (C), 158,22 (C), 152,66 (C), 143,25 (CH), 134,69 (C), 133,42 (CH), 131,19 (CH), 129,96 (CH), 125,30 (CH), 104,49 (C), 88,94 (CH), 87,46 (CH), 81,44 (CH), 72,20 (CH), 66,33 (CH2), 62,88 (CH2), 42,11 (CH2), 37,34 (C), 26,44 ((CH3) 3C).

[0232] 5-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’- deoxcitidina-5’trifosfato (WW3p085): POCl3 (3,5 μL, 0,038 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.x7 (11 mg, 0,025 mmol) e esponja de prótons (10,5 mg, 0,049 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) a 0oC e agitados durante duas horas. Mais POCl3 (3,5 μL, 0,038 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada durante mais uma hora. Uma solução de pirofosfato de tri-n-butilamônio (59 mg, 0,125 mmol) e tri-n-butilamina (30 μL) em DMF anidra (0,25 mL) foi adicionada. Após cinco minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e então, liofilizada até secagem. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions sobre uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 240 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas a fim de proporcionar 5-[(R ou S)-1-(2- nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilóxi]metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato WW3p085 (12 mg, 65%) como um sólido fofo branco. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,81 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,65 (m, 3 H, Ph-H e H- 6), 7,45 (t, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 6,03 (t, 1 H, J = 6,4Hz, H-1’), 4,52 (AB d, 1 H, J = 13,6 Hz, 5-CH2a), 4,46 (d, 1 H, J = 13,6 Hz, 5-CH2b), 4,41 (m, 1 H, H-3’), 4,12 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 2,35 (m, 1 H, H-2’a), 2,17 (m, 1 H, H-2’b), 0,82 (s, 9 H, (CH3) 3C); 31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -5,15 (d, J = 21,0 Hz), -10,64 (d, J = 19,44 Hz), -21,0 (t, J = 21,0 Hz). Exemplo 5 - Síntese de Análogos de Deoxiuridina e Deoxicitidina Presos a Corante com Grupos α-Isopropila Síntese de 5-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil-propilóxi} metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato 6-JOE rotulado

Esquema 14. Síntese de 5-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato 6-JOE rotulado. (i) (R)- 1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol, puro, 108 a 112oC, 9%; (ii) N- propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4 (0), CuI, Et3N, DMF (an.), 86%; (iii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n- Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1M; NH4OH; (iv) 6-JOE-SE, tampão de Na2CO3 a 0,1 M/NaHCO3 (pH de 9,2).

[0233] 5-[(R)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetilpropilóxi]metil-2’- deoxiuridina (dU.y1): Composto dU.x0 (775 mg, 1,19 mmol) e (R)-1-(4- iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol enântio-puro (1,22 g, 3,80 mmols) foram aquecidos puros a 108 a 112oC durante 45 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 5- [(R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (dU.y1) (60 mg, 9%). (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (90 mg, 11%) e 3’,5’-O- bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (194 mg, 21%) foram também obtidas a partir da reação. 1H RMN (400 MHz, CD3CD) para dU.yl: δ 8,23 (d, 1 H, J = 1,7 Hz, Ph-H), 8,03 (dd, J = 8,4 e 1,7 Hz, 1 H, Ph-H), 8,00 (s, 1 H, H-6), 7,50 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ph-H) , 6,26 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 4,69 (d, 1 H, J = 5,8 Hz, PhCH), 4,40 (m, 1 H, H-3’), 4,13 (AB d, J = 11,8 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,08 (AB d, J = 11,8 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,93 (m, 1 H, H-4’), 3,79 (dd, J = 12,0 e 3,3 Hz, 1 H, H-5’a), 3,73 (dd, J = 12,0 e 3,6 Hz, 1 H, H-5’b), 2,26 (m, 1 H, H-2’a), 2,19 (m, 1 H, H-2’b), 1,93 (m, 1 H, CH(CH3)3), 0,93 (d, J = 6,4 Hz, 3 H, CH3), 0,87 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3).

[0234] 5-{(R)-1-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-2’-deoxiuridina (dU.y2): Uma solução de composto dU.y1 (60 mg, 0,11 mmol), N-propargiltrifluoroacetilamida (48 mg, 0,32 mmol), tetracis(trifenilfosfina)-paládio(0) (12 mg, 0,01 mmol), CuI (4 mg, 0,02 mmol) e Et3N (30 μL, 0,21 mmol) em DMF anidra (5 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 4,5 horas. Metanol (4 mL) e cloreto de metileno (4 mL) foram adicionados, seguido por bicarbonato de sódio (49 mg, 0,58 mmol). A mistura foi agitada durante mais uma hora, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 5-{(R)-1-[4-(3-trifluoroacetamido-1- propinil)-2-nitrofenil]-2-metil-propilóxi} metil-2’-deoxiuridina dU.y2 (54 mg, 86%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 11,33 (s, 1 H, D2O permutável, 3-NH), 10,12 (br t, J = 4,8 Hz, 1 H, D2O permutável, CH2NHTFA), 7,98 (d, 1 H, J = 1,5 Hz, Ph-H), 7,85 (s, 1 H, H-6), 7,74 (dd, J = 8,2 e 1,5 Hz, 1 H, Ph-H), 7,64 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 6,13 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 5,24 (d, J = 4,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 4,96 (t, J = 5,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,61 (d, 1 H, J = 5,5 Hz, PhCH), 4,30 (d, 2 H, J = 4,8 Hz, CH2NHTFA), 4,22 (m, 1 H, H-3’), 3,97 (s, 2 H, 5-CH2a e 5-CH2b), 3,76 (m, 1 H, H-4’), 3,56 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,06 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 1,88 (m, 1 H, CH(CHβ)3), 0,83 (d, J = 6,7 Hz, 3 H, CH3), 0,80 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 163, 59 (C), 157,22 (C), 150,67 (C), 149,23 (C), 139,78 (CH), 137,05 (C), 135,21 (CH), 129,48 (CH), 126,63 (CH), 122,76 (C), 110,89 (C), 87,60 (CH), 85,70 (C), 85,14 (CH), 87,96 (CH), 80,27 (C), 70,86 (CH), 64,34 (CH2), 61,44 (CH2), 39,96 (CH2), 34,62 (CH), 29,07 (CH2), 18,30 (CH3), 16,44 (CH3).

[0235] 5-{(R)-1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil- propilóxi} metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato (dU.y3): POCl3 (6 μL, 0,06 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.y2 (18 mg, 0,03 mmol) e esponja de prótons (13 mg, 0,06 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) a 0oC e agitados durante duas horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (73 mg, 0,15 mmol) e tri-n-butilamina (30 μL) em DMF anidra (0,3 mL) foi adicionada. Após cinco minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e então, liofilizada até secagem. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e parte da solução foi purificada com HPLC de fase invertida usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para proporcionar 5-{(R)-1-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2- nitrofenil]-2-metil-propilóxi}metil-2’-deoxi-uridina-5’-trifosfato. Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água (pH de 7,0); B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). O trifosfato purificado foi, então, tratado com hidróxido de amônio concentrado (27%) em temperatura ambiente durante duas horas para proporcionar 5-{(R)-1- [4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil-propilóxi} metil-2’- deoxiuridina-5’-trifosfato dU.y3. 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,01 (s, 1 H, Ph-H), 7,76 (d, 1 H, J = 6,9 Hz, Ph-H), 7,62 (m, 2 H, H-6 e Ph-H), 6,17 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1’), 4,55 (m, 1 H, H-3’), 4, 39 e 4,29 (2 d, 2 H, J = 6,4 Hz, CH2), 4,17 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 3,74 (s, 2 H, CH2), 2,28 (m, 2 H, H-2’), 2,00 (m, 1 H, CH), 0,79 (m, 3 H, CH3); 31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,40 (d, J = 19,4 Hz), -10,75 (d, J = 19,4 Hz), -21,23 (t, J = 19,4 Hz).

[0236] 5-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil- propilóxi} metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato 6-JOE rotulado (WW3p024): Uma solução de 6-JOE-SE (0,625 mg, 1 μmol) em DMSO anidro (25 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dU.y3 (0,31 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH de 9,2; 180 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificado por meio de HPLC de fase invertida usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para proporcionar o trifosfato 6-JOE rotulado WW3p024. Fase móvel: A, TEAA a 100 mM em água (pH de 7,0); B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). WW3p024 foi caracterizado por sua incorporação pela DNA polimerase e fotodesproteção. Síntese de 5-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil- propilóxi} metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato Cy5 rotulado

Esquema 15. Síntese de 5-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato Cy5 rotulado (i) (R)-1- (4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol, puro, 108 a 112oC, 21%; (ii) TPSCl, DMAP, Et3N, CH2Cl2 (anidro), temperatura ambiente; (iii) NH3, 1,4-dioxano, 92 a 94oC, 76% para duas etapas; (iv) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 80%; (v) N-propargiltrifluoroacetamida,Pd(PPh3)4 (0), CuI, Et3N, DMF (anidro), 99%; (vi) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M; NH4OH;

Esquema 16. (vii) Cy5 mono NHS, tampão de Na2CO3 a 0,1 M/NaHCO3, pH de 9,2.

[0237] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)- 2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (dU.y4): Composto dU.x0 (775 mg, 1,19 mmol) e (R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-1-propanol enântio- puro (1,22 g, 3,80 mmol) foram aquecidos puros a 108 a 112oC durante 45 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetil-silil)-5-[(R)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina dU.y4 (194 mg, 21%). (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimetil-silil)-5-[(R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (90 mg, 11%) e 5-[(R)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (60 mg, 9%) foram também obtidas a partir da reação. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) para dU.y4: δ 8,43 (s, 1 H, 3-NH), 8,18 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, Ph-H), 7,96 (dd, J = 8,3 e 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,65 (s, 1 H, H-6), 7,47 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H) , 6,29 (dd, 1 H, J = 7,8 e 5,8 Hz, H-1’), 4,74 (d, 1 H, J = 5,8 Hz, PhCH), 4,39 (m, 1 H, H-3’), 4,14 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2a), 3,98 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,97 (m, 1 H, H-4’), 3,78 (m, 2 H, H- 5’a e H-5’b), 2,31 (m, 1 H, H-2’a), 1,99 (m, 1 H, H-2’b), 1,91 (m, 1 H, CH(CH3)3), 0,92 (d, J = 6,7 Hz, 3 H, CH3), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,98 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,86 (d, J = 6,9 Hz, 3 H, CH3), 0,09 (s, 3 H, CH3Si), 0,08 (s, 3 H, CH3Si), 0,07 (s, 3 H, CH3Si), 0,04 (s, 3 H, CH3Si); 13C RMN (100 MHz, CDCI3) para dU.y4: δ 162,20 (C), 149,83 (C), 149,69 (C), 141,89 (CH), 138,68 (CH), 136,56 (C), 132,63 (CH), 130,94 (CH), 111,19 (C), 91,84 (C), 88,00 (CH), 85,41 (CH), 80,99 (CH), 72,40 (CH), 64,46 (CH2), 63,18 (CH2), 41,22 (CH2), 34,74 (CH), 25,93 (C(CH3)3), 25,75 (C(CH3)3), 19,29 (CH3), 18,40 (C), 18,00 (C), 17,49 (CH3), -4,64 (CH3), -4,81 (CH3), -5,37 (2 CH3).

[0238] 3’,5-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)- 2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina (dC.y5): A uma solução de composto dU.y4 (0,256 g, 0,32 mmol), DMAP (23 mg, 0,21 mmol) e trietilamina (1,138 mL, 8,10 mmol) em diclorometano anidro (14 mL), cloreto de 2,4,6-tri-isopropil benzenossulfonila (1,57 g, 5,19 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas sob uma atmosfera de nitrogênio e, então, concentrada in vacuo. Amônia (0,5 M em dioxano, 24 mL, 12,0 mmol) foi adicionada e a mistura foi transferida para um tubo vedado e aquecida a 92 a 94oC durante quatro horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 3’,5-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina dC.y5 (192 mg, 76%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,13 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, Ph-H), 7,95 (dd, J = 8,3 e 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,59 (s, 1 H, H-6), 7,38 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H) , 6,28 (t, 1 H, J = 6,5 Hz, H-1’), 6,02 (br, 2 H, 4-NH2), 4,63 (d, 1 H, J = 6,6 Hz, PhCH), 4,32 (m, 1 H, H-3’), 4,19 (AB d, J = 12,5 Hz, 1 H, 5- CH2a), 4,04 (AB d, J = 12,5 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,93 (m, 1 H, H-4’), 3,81 (AB dd, J = 11,3 e 3,0 Hz, 1 H, H-5’a), 3,72 (AB dd, J = 11,3 e 2,8 Hz, 1 H, H-5’b), 2,43 (m, 1 H, H-2’a), 1,92 (m, 2 H, H-2’b e CH(CH3)3), 0,96 (d, J = 6,6 Hz, 3 H, CH3), 0,82 (d, J = 6,9 Hz, 3 H, CH3), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,80 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,06 (s, 3 H, CH3Si), 0,05 (s, 3 H, CH3Si), -0,02 (s, 3 H, CH3Si), - 0,04 (s, 3 H, CH3Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 165,02 (C), 152,93 (C), 150,09 (C), 141,92 (CH), 140,37 (CH), 135,53 (C), 132,55 (CH), 130,35 (CH), 101,50 (C), 92,35 (C), 87,76 (CH), 86,26 (CH), 80,33 (CH), 71,98 (CH), 66,92 (CH2), 62,84 (CH2), 42,14 (CH2), 34,75 (CH), 25,89 (C(CH3)3), 25,77 (C(CH3)3), 19,01 (CH3), 18,30 (C), 18,15 (CH3), 18,00 (C), -4,57 (CH3), -4,87 (CH3), -5,43 (CH3) , -5,49 (CH3).

[0239] 5-[(R)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-2’- deoxcitidina dC.y6: Uma solução de tri-hidrato de fluoreto de tetra-n- butilamônio (112 mg, 0,36 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de composto dC.y5 (192 mg, 0,24 mmol) em THF (8 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 45 minutos, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 5-[(R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-2’-deoxcitidina dC.y6 (110 mg, 80%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,26 (d, 1 H, J = 1,7 Hz, Ph-H), 8,07 (dd, J = 8,3 e 1,7 Hz, 1 H, Ph-H), 7,70 (s, 1 H, H-6), 7,38 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 7,32 e 6,59 (2 br. s, 2 H, D2O permutável, 4-NH2), 6,11 (dd, 1 H, J = 7,2 e 6,1 Hz, H-1’), 5,19 (d, J = 4,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 4,88 (t, J = 5,4 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,58 (d, 1 H, J = 6,0 Hz, PhCH), 4,19 (m, 1 H, H-3’), 4,07 (AB d, J = 12,2 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,02 (AB d, J = 12,2 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,75 (m, 1 H, H-4’), 3,51 (m, 2 H, H-5’a e H- 5’b), 2,09 (m, 1 H, H-2’a), 1,90 (m, 2 H, H-2’b e CH(CHβ)3), 0,87 (d, J = 6,7 Hz, 3 H, CH3), 0,78 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 166,48 (C), 158,09 (C), 151,27 (C), 143,22 (CH), 142,77 (CH), 137,32 (C), 133,80 (CH), 132,20 (CH), 104,72 (C), 93,10 (C), 89,08 (CH), 87,73 (CH), 81,82 (CH), 72,05 (CH), 67,22 (CH2), 62,82 (CH2), 42,21 (CH2), 36,20 (CH), 19,62 (CH3), 18,41 (CH3).

[0240] 5-{(R)-1-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-2’-deoxcitidina (dC.y7): Uma solução de composto dC.y6 (110 mg, 0,20 mmol), N-propargiltrifluoroacetilamida (88 mg, 0,59 mmol), tetracis(trifenilfosfina)-paládio(0) (23 mg, 0,02 mmol), CuI (7 mg, 0,04 mmol) e Et3N (0,11 mL, 0,78 mmol) em DMF anidra (4 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 4,5 horas. Metanol (4 mL) e cloreto de metileno (4 mL) foram adicionados, seguido por bicarbonato de sódio (90 mg, 1,07 mmol). A mistura foi agitada durante mais uma hora, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 5-{(R)-1-[4-(3- trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil-propilóxi} metil-2’- deoxcitidina dC.y7 (112 mg, 99%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,12 (br t, 1 H, D2O permutável, CH2NHTFA), 7,98 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, Ph-H), 7,76 (dd, J = 8,2 e 1,7 Hz, 1 H, Ph-H), 7,73 (s, 1 H, H-6), 7,62 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,33 e 6,60 (2 br. s, 2 H, D2O permutável, 4-NH2), 6,11 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 5,19 (d, J = 4,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 4,89 (t, J = 5,4 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,64 (d, 1 H, J = 5,9 Hz, PhCH), 4,31 (d, 2 H, J = 5,2 Hz, CH2NHTFA), 4,19 (m, 1 H, H- 3’), 4,09 (AB d, J = 12,1 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,03 (AB d, J = 12,1 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,75 (m, 1 H, H-4’), 3,52 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,08 (m, 1 H, H-2’a), 1,91 (m, 2 H, H-2’b e CH(CHβ)3), 0,87 (d, J = 6,7 Hz, 3 H, CH3), 0,79 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3): 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 164, 83 (C), 157,51 (C), 157,14 (C), 156,45 (C), 149,25 (C), 141,23 (CH), 136,46 (C), 135,39 (CH), 129,39 (C), 126,64 (CH), 122,98 (C), 117,43 (C), 114,58 (C), 87,54 (CH), 86,22 (CH), 86,02 (C), 80,34 (C), 80,27 (CH), 70,53 (CH), 65,75 (CH2), 61,28 (CH2), 40,60 (CH2), 34,73 (CH), 29,16 (CH2), 18,15 (CH3), 16,96 (CH3). HRMS: for C25H29F3N5O8 [MH+]: calculado 584,1968 encontrado 584,1926

[0241] 5-{(R)-1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil- propilóxi} metil-2’-deoxcitidina-5’-trifosfato (dC.y8): POCl3 (6 μL, 0,06 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dC.y7 (19 mg, 0,03 mmol) e esponja de prótons (14 mg, 0,06 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) a 0oC e agitados durante duas horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (76 mg, 0,16 mmol) e tri-n-butilamina (32 μL) em DMF anidra (0,32 mL) foi adicionada. Após cinco minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo a 25oC. O resíduo foi dissolvido em água (2 mL), filtrado e purificado com HPLC de fase invertida usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para proporcionar 5-{(R)-1-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil- propilóxi}metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato. Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água (pH de 7,0); B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). O trifosfato purificado foi, então, tratado com hidróxido de amônio concentrado (27%) em temperatura ambiente durante duas horas para proporcionar 5-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)- 2-nitrofenil]-2-metil-propilóxi} metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato dC.y8,

[0242] Cy5 rotulado 5-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato (WW3p117): Uma solução de Cy5 mono NHS (1 mg, 1,26 μmol) em DMSO anidro (40 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dC.y8 (0,31 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH de 9,2; 100 μL) e deixada descansar em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por meio de HPLC de fase invertida usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para proporcionar o trifosfato Cy5 rotulado WW3p117, Fase móvel: A, TEAA a 100 mM em água (pH de 7,0); B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Exemplo 6 - Síntese de Análogos de Deoxiuridina e Deoxicitidina Presos a Corante com Grupos a-terc-Butila Síntese de 5-{(R ou S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2,2- dimetil-propóxi}metil-2‘-deoxicitidina-5‘-trifosfato 6-TAMRA rotulado

Esquema 17. Síntese de 5-{(R ou S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2- nitrofenil]-2,2-dimetil-propóxi}metil-2‘-deoxicitidina-5‘-trifosfato 6- TAMRA rotulado. (i) Enântio-puro (R ou S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2- dimetil-1-propanol, puro, 108-115oC, 28%; (ii) TPSCl, DMAP, CH2Cl2 (anidro), temperatura ambiente, 54%; (iii) NH3, 1,4-dioxano, 96oC, 65%; (iv) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 73%; (v) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4 (0), CuI, Et3N, DMF (anidro), 85%;

Esquema 18. (vi) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M; NH4OH; (vii) 6- TAMRA-SE, tampão de Na2CO3 a 0,1 M/NaHCO3, pH de 9,2.

[0243] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetil-silil)-5-[(R ou S)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2,2-dimetil-propilóxi]metil-2’-deoxiuridina (dU.z1): Composto dU.x0 (688 mg, 1,06 mmol) e (R ou S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil- 1-propanol enântio-puro (889 mg, 2,65 mmol) foram aquecidos puros a 108-115oC durante uma hora sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc- butildimetil-silil)-5-[(R ou S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propilóxi]- metil-2’-deoxiuridina dU.z1 (236 mg, 28%). (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimetil- silil)-5-[(R ou S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propilóxi]metil-2’- deoxiuridina (20 mg, 3%) e 5-[(R ou S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil- propilóxi] metil-2’-deoxiuridina (49 mg, 8%) foram também obtidas a partir da reação. 1H RMN (400 MHz, CDCh) para dU.zl: δ 8,86 (s, 1 H, 3-NH), 8,08 (d, 1 H, J = 1,8 Hz, Ph-H), 7,94 (dd, J = 8,4 e 1,7 Hz, 1 H, Ph-H), 7,68 (s, 1 H, H-6), 7,47 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ph-H) , 6,29 (dd, 1 H, J = 7,8 e 5,8 Hz, H-1’), 4,91 (s, 1 H, PhCH), 4,39 (m, 1 H, H-3’), 4,23 (AB d, J = 11,8 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,01 (AB d, J = 11,8 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,98 (m, 1 H, H-4’), 3,78 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,31 (m, 1 H, H-2’a), 1,99 (m, 1 H, H-2’b), 1,91 (m, 1 H, CH(CH3)3), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,82 (s, 9 H, (CH3)3CC), 0,09 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,08 (s, 3 H, CH3Si), 0,06 (s, 3 H, CH3Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) para dU.zl: δ 162,41 (C), 150,98 (C), 150,00 (C), 141,60 (CH), 138,58 (CH), 133,83 (C), 132,26 (CH), 131,89 (CH), 111,16 (C), 92,05 (C), 88,03 (CH), 85,49 (CH), 81,62 (CH), 72,46 (CH), 64,64 (CH2), 63,22 (CH2), 41,22 (CH2), 36,55 (C), 25,92 (C(CH3)3), 25,75 (C(CH3)3), 25,70 (C(CH3)3), 18,38 (C), 18,00 (C), -4,64 (CH3Si), -4,81 (CH3Si), -5,39 (2 (CH3)2Si).

[0244] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2,2-dimetil-propilóxi]metil-O4-(2,4,6- triisopropilbenzenossulfonil)-2’-deoxiuridina (dU.z2): cloreto de 2,4,6- triisopropil benzenossulfonila (1,57 g, 5,19 mmols) foi adicionado a uma solução de composto dU.z1 (0,236 g, 0,29 mmol), DMAP (38 mg, 0,32 mmol) e trietilamina (0,465 mL, 3,31 mmol) em diclorometano anidro (10 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas sob uma atmosfera de nitrogênio, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel a fim de proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2,2-dimetil-propilóxi]metil-O4-(2,4,6- triisopropilbenzenossulfonil)-2’-deoxiuridina dU.z2 (169 mg, 54%). 1H RMN (500 MHz, CDCl3): δ 8,18 (s, 1 H, H-6), 8,10 (d, J = 1,8 Hz, 1 H, Ph-H), 7,98 (dd, J = 8,3 e 1,8 Hz, 1 H, Ph-H), 7,63 (d, J = 8,3 Hz, 1 H, Ph-H), 7,20 (s, 2 H, OSO2Ph-H), 6,10 (t, J = 6,3 Hz, 1 H, H-1’), 4,91 (s, 1 H, PhCH(t-Bu)O), 4,30 (m, 1 H, H-3’), 4,23 (m 3 H, 5-CH2a e OSO2Ph(o-CH(CH3)2)2), 4,01 (m, 2 H, H-4’ e 5-CH2b), 3,85 (AB dd, J = 11,4 e 3,3 Hz, 1 H, H-5’a), 3,74 (AB dd, J = 11,4 e 2,8 Hz, 1 H, H-5’b), 2,90 (sep, J = 6,9 Hz, 1 H, OSO2Ph(p-CH(CH3)2)), 2,53 (m, 1 H, H-2’a), 1,94 (m, 1 H, H-2’b), 1,29 (d, J = 6,9 Hz, 6 H, OSO2Ph(p-CH(CH3)2)), 1,26 (d, J = 7,2 Hz, 12 H, OSO2Ph(o-CH(CH3)2)2), 0,87 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,85 (s, 9 H, (CH3)3CC), 0,06 e 0,05 (2 s, 12 H, 2 (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCh): δ 166,01 (C), 154,43 (C), 153,54 (C), 151,21 (C), 151,08 (C), 145,07 (CH), 141,49 (CH), 133,16 (C), 132,32 (CH), 131,76 (CH), 131,15 (C), 124,08 (CH), 104,64 (C), 92,25 (C), 88,60 (CH), 87,83 (CH), 82,48 (CH), 71,83 (CH), 64,33 (CH2), 62,75 (CH2), 42,31 (CH2), 36,51 (C), 34,26 (CH), 29,68 (CH), 25,91 (C(CH3)3), 25,73 (C(CH3)3), 24,51 (C(CH3)3), 23,52 (CH3), 23,45 (CH3), 18,37 (C), 17,98 (C), -4,57 (CH3), -4,91 (CH3), -5,34 (CH3), -5,39 (CH3).

[0245] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)-1-(4-iodo-2-nitro- fenil)-2,2-dimetil-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina (dC.z3): Amônia (0,5 M em dioxano, 4 mL, 2,0 mmol) foi adicionada ao composto dU.z2 (169 mg, 0,158 mmol) e a mistura foi transferida para um tubo vedado e aquecida a 96oC durante 16 horas. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel a fim de proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-[(R ou S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2- dimetil-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina dC.z3 (83 mg, 65%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,04 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, Ph-H), 7,92 (dd, J = 8,3 e 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,66 (s, 1 H, H-6), 7,42 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H) , 6,29 (t, 1 H, J = 6,7 Hz, H-1’), 4,81 (s, 1 H, PhCH), 4,32 (m, 1 H, H-3’), 4,28 (AB d, J = 12,9 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,04 (AB d, J = 12,9 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,96 (m, 1 H, H-4’), 3,79 (AB dd, J = 11,2 e 3,2 Hz, 1 H, H-5’a), 3,72 (AB dd, J = 11,2 e 2,8 Hz, 1 H, H-5’b), 2,42 (m, 1 H, H-2’a), 1,90 (m, 1 H, H- 2’b), 0,88 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,81 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,80 (s, 9 H, (CH3)3CC), 0,07 (s, 3 H, CH3Si), 0,06 (s, 3 H, CH3Si), -0,05 (s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 165,23 (C), 155,63 (C), 151,24 (C), 141,01 (CH), 140,65 (CH), 133,29 (C), 132,26 (CH), 131,35 (CH), 101,59 (C), 92,38 (C), 87,80 (CH), 86,29 (CH), 81,00 (CH), 72,17 (CH), 66,80 (CH2), 62,92 (CH2), 42,10 (CH2), 36,27 (C), 25,82 (C(CH3)3), 25,80 (C(CH3)3), 25,77 (C(CH3)3), 18,27 (C), 17,99 (C), -4,58 (CH3), -4,85 (CH3), -5,47 (CH3) , -5,53 (CH3).

[0246] 5-[(R ou S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propilóxi]metil- 2’-deoxicitidina (dC.z4): Uma solução de tri-hidrato de fluoreto de tetra- n-butilamônio (81 mg, 0,26 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de composto dC.z3 (82 mg, 0,10 mmol) em THF (3 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel a fim de proporcionar 5-[(R ou S)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2,2- dimetil-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina dC.z4 (43 mg, 73%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,23 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, Ph-H), 8,06 (dd, J = 8,4 e 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,73 (s, 1 H, H-6), 7,38 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ph-H), 7,37 e 6,64 (2 br. s, 2 H, D2O permutável, 4-NH2), 6,10 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H- 1’), 5,20 (d, J = 4,0 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 4,88 (t, J = 5,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,76 (s, 1 H, PhCH), 4,19 (m, 1 H, H-3’), 4,10 (s, 1 H, 5-CH2a e 5-CH2b), 3,75 (m, 1 H, H-4’), 3,51 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,08 (m, 1 H, H-2’a), 1,93 (m, 1 H, H-2’b), 0,76 (s, 9 H, (CH3)3C).

[0247] 5-[(R ou S)-1-(4-{3-Trifluoroacetamido-1-propinil}-2- nitrofenil)-2,2-dimetil-propilóxi]metil-2’-deoxcitidina (dC.z5): Uma mistura de composto dC.z4 (40 mg, 0,069 mmol), N- propargiltrifluoroacetilamida (32 mg, 0,208 mmol), CuI (3 mg, 0,014 mmol), Et3N (0,01 mL, 0,138 mmol) e tetracis (trifenilfosfina)paládio(0) (8 mg, 0,007 mmol) em DMF anidra (3 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 4,5 horas. Metanol (3 mL) e cloreto de metileno (3 mL) foram adicionados, seguido por bicarbonato de sódio (32 mg, 0,380 mmol). A mistura foi agitada durante 15 minutos, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 5-[(R ou S)-1-(4-{3-trifluoroacetamido-1-propinil}-2- nitrofenil)-2,2-dimetil-propilóxi]metil-2’-deoxicitidina dC.z5 (35 mg, 85%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,13 (br t, 1 H, D2O permutável, NHTFA), 7,94 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, Ph-H), 7,75 (m, 2 H, Ph-H e H-6), 7,63 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,34 e 6,66 (2 br. s, 2 H, D2O permutável, 4- NH2), 6,10 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 5,20 (d, J = 4,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 4,89 (t, J = 5,4 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,82 (s, 1 H, PhCH), 4,31 (d, 2 H, J = 5,4 Hz, CH2NHTFA), 4,19 (m, 1 H, H-3’), 4,14 (AB d, J = 12,5 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,10 (AB d, J = 12,5 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,75 (m, 1 H, H-4’), 3,51 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,08 (m, 1 H, H-2’a), 1,93 (m, 1 H, H-2’b), 0,76 (s, 9 H, (CH3)3C); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 164, 83 (C), 157,51 (C), 157,14 (C), 156,45 (C), 150,34 (C), 141,65 (CH), 134,48 (CH), 133,91 (C), 130,26 (CH), 126,50 (CH), 123,01 (C), 87,55 (CH), 86,28 (CH), 86,08 (C), 80,77 (CH), 80,17 (C), 70,623 (CH), 65,74 (CH2), 61,33 (CH2), 40,51 (CH2), 36,19 (C), 29,09 (CH2), 24,83 (CH3) 3C).

[0248] 5-[(R ou S)-1-(4-{3-Amino-1-propinil}-2-nitrofenil)-2,2-dimetil- propilóxi]metil-2’-deoxcitidina-5’-trifosfato (dC.z6): POCl3 (2,5 μL, 0,027 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dC.z5 (11 mg, 0,018 mmol) e esponja de prótons (8 mg, 0,036 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) a 0oC e agitados durante duas horas. Mais POCl3 (2,5 μL, 0,027 mmol) foi adicionado duas vezes em intervalos de uma hora. Uma solução de bis-pirofosfato de tri-n-butilamônio (43 mg, 0,09 mmol) e tri- n-butilamina (20 μL) em DMF anidra (0,2 mL) foi adicionada. Após cinco minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo a 25oC. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e parte da mistura foi purificada com HPLC de fase invertida usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para proporcionar 5-{(R ou S)-1-[4-(3- trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propilóxi}metil-2’- deóxi-citidina-5’-trifosfato. Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água (pH de 7,0); B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). O trifosfato purificado foi, então, tratado com hidróxido de amônio concentrado (27%) em temperatura ambiente durante duas horas para proporcionar 5-{(R ou S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2- nitrofenil]-2,2-dimetil-propilóxi}metil-2’-deoxicitidina-5’-trifosfato dC.z6, 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 8,01(s, 1 H, H-6), 7,84 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,67 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,51 (m, 1 H, Ph-H), 6,11 (t, 1 H, J = 6,4Hz, H-1’), 4,54 (AB d, 1 H, J = 13,6 Hz, 5-CH2a), 4,49 (m, 1 H, H- 3’), 4,35 (d, 1 H, J = 13,6 Hz, 5-CH2b), 4,15 - 3,81 (m, 4 H, H-4’, H-5’ e CH2), 2,31 (m, 1 H, H-2’a), 2,12 (m, 1 H, H-2’b), 0,81 (s, 9 H, (CH3) 3C); 31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -5,20 (d, J = 19,4 Hz), -10,77 (d, J = 19,4 Hz), -20,96 (t, J = 19,4 Hz).

[0249] 5-[(R ou S)-1-(4-{3-amino-1-propinil}-2-nitrofenil)-2,2-dimetil- propilóxi]metil-2’-deoxcitidina-5’-trifosfato 6-TAMRA rotulado (WW3p091): Uma solução de Cy5 mono NHS (0,65 mg, 1,23 μmol) em DMSO anidro (26 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dC.z6 (0,386 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH de 9,2; 200 μL) e deixada descansar em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por meio de HPLC de fase invertida usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para proporcionar o trifosfato 6-TAMRA rotulado WW3p091. Fase móvel: A, TEAA a 100 mM em água (pH de 7,0); B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Exemplo 7 - Síntese de Análogos de 7-Deazaguanosina Síntese de 7-(2-nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’-deoxiguanosina-5’- trifosfato

Esquema 19. Síntese de 7-(2-nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’-deoxigua- nosina-5’-trifosfato. (i) TFAA, piridina (an.), temperatura ambiente, 91% (ii) NIS, CH2Cl2 (an.), temperatura ambiente; (iii) NH3, MeOH, temperatura ambiente, 59%; (iv) cloreto de 2-deóxi-3,5-O-di-(p-toluoil)- α-D-ribofuranosila, TDA-1, KOH, MeCN (anidro), temperatura ambiente, 80%; (v) NH3, MeOH, temperatura ambiente, 80%; (vi) TBSCl, imidazol, DMF (anidro), temperatura ambiente, 56%; (vii) CO, PdCl2[PhCN]2, MeOH/1,4-dioxano, 50oC, 90%; (viii) LiBH4, MeOH, THF, refluxo, 68%; (ix) brometo de 2-nitrobenzila, n-Bu4NBr, CH2Cl2/aq. NaOH, temperatura ambiente, 48%; (x) n-Bu4NF, THF, 95%;

Esquema 20. (xi) DABCO, H3O, refluxo, 30%; (xii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0250] 6-Cloro-2-(trifluoroacetil)amino-7-deazapurina (dG.22): Composto dG.22 foi sintetizado de acordo com o procedimento descrito por Seela e Peng (2006, o qual é incorporado aqui por referência). A uma solução de 2-amino-6-cloro-7-deazapurina (2,00 g, 11,86 mmol) em piridina anidra (15 mL) foi adicionado anidrido trifluoroacético (2,18 mL, 15,54 mmol) durante quinze minutos. A solução foi agitada em temperatura ambiente durante três horas e concentrada in vacuo e co- evaporada com água (2 mL) duas vezes. O material foi, então, filtrado, lavado com água gelada e seco sobre KOH sob vácuo para proporcionar 6-cloro-2-(trifluoroacetil)amino-7-deazapurina dG.22 (2,86 g, 91%) como um sólido âmbar.

[0251] 2-Amino-6-cloro-7-iodo-7-deazapurina (dG.23): Composto dG.23 foi sintetizado de acordo com o procedimento descrito por Seela e Peng (2006, o qual é incorporado aqui por referência). A uma suspensão de composto dG.22 (2,86 g, 10,81 mmol) em CH2Cl2 anidro (51 mL) foi adicionada N-iodossuccinimida (2,68 g, 11,89 mmol). A mistura foi protegida da luz enquanto se agitava em temperatura ambiente durante duas horas. A reação foi, então, diluída com 322 mL de CH2Cl2 e filtrados; o precipitado foi, então, dissolvido em NH3 a 7N em solução de metanol (41 mL) e agitado em temperatura ambiente durante três horas. O sólido resultante foi filtrado e seco in vacuo para proporcionar 2-amino-6-cloro-7-iodo-7-deazapurina dG.23 (1,86g, 59%) como um sólido âmbar.

[0252] 2-Amino-6-doro-9-[/]-D-3:,5:-O-di-(p-toluoil)-2:- deoxirribofuranosil]-7-iodo-7-deazapurina (dG.24): A uma suspensão de KOH (1,38 g, 22,16 mmol) e tris(3,6-dioxa-heptil)amina (0,26 mL, 0,80 mmol) em anidro acetonitrila (76 mL) foi adicionado composto dG.23 (1,86 g, 6,33 mmol). Após agitação a mistura durante cinco minutos, cloreto de 2-deóxi-3,5-di-O -(p -toluoil)-α-D-ribofuranosila (3,20 g, 8,23 mmol) foi adicionado durante 15 minutos. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos, então, filtrada e o precipitado foi lavado com acetonitrila (75 mL). O filtrado combinado foi concentrado in vacuo e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 2-amino-6-cloro-9-[β-D-3’,5’-O-di-( p -toluoil)-2‘- deoxirribofuranosil]-7-iodo-7-deazapurina dG.24 (3,29 g, 80%) como uma espuma branca. 1H RMN (400 MHz, CDCh): δ 8,05 (m, 4 H, Ph-H), 7,39 (s, 1 H, H-8), 7,37 (m, 4 H, Ph-H), 6,66 (dd, 1 H, J = 8,0 e 6,0 Hz, H-1’), 5,83 (m, 1 H, H-3’), 5,24 (bs, 2 H, 2-NH2), 4,85 (dd, 1 H, H-5’a), 4,74 (dd, 1 H, H-5’b), 4,68 (m, 1 H, H-4’), 2,88 (m, 1 H, H-2’a), 2,76 (m, 1 H, H-2’b), 2,54 (s, 3 H, Ph-CH3), 2,53 (s, 3 H, Ph-CH3).

[0253] 2-Amino-6-cloro-9-(β-D-2’-deoxirribofuranosil)-7-iodo- 7- deazapurina (dG.25): Composto dG.24 (3,29 g, 5,09 mmol) foi dissolvido em NH3 a 7N em solução de metanol (153 mL) e agitado em temperatura ambiente durante 32 horas. A mistura foi concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 2-amino-6-cloro-9-(β-D-2’-deoxirribofuranosil)-7-iodo-7- deazapurina dG.25 (1,66 g, rendimento de 80%) como uma espuma branca. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,60 (s, 1 H, H-8), 6,87 (bs, 2 H, 2-NH2), 6,40 (dd, 1 H, J = 8,0 e 6,0 Hz, H-1’), 5,25 (d, 1 H, 3’-OH), 4,93 (t, 1 H, 5’-OH), 4,30 (m, 1 H, H-3’), 3,78 (m, 1 H, H-4’), 3,51 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,40 (m, 1 H, H-2’a), 2,13 (m, 1 H, H-2’b).

[0254] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-2-(terc-butildimetilsilil)amino-6-cloro-7-iodo-7- deazapurina (dG.26): Composto dG.25 (0,29 g, 0,70 mmol) foi evaporado a partir de piridina anidra três vezes (3 mL cada) e, então, dissolvido em DMF anidra (5 mL). Cloreto de terc-Butildimetilsilila (1,27 g, 8,43 mmol) e imidazola (1,15 g, 16,86 mmol) foram adicionados e a mistura foi agitada a 40°C durante 42 horas (mais cloreto de terc- butildimetilsilila (0,64 g, 4,22 mmol) e imidazol (0,57 g, 8,43 mmol foram adicionados a cada seis horas). A reação foi concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9- [β-D-3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-2-(terc- butildimetilsilil) amino-6-cloro-7-iodo-7-deazapurina dG.26 (0,30 g, rendimento de 56%) como uma espuma branca. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,35 (s, 1 H, H-8), 6,53 (t, 1 H, J = 6,0 Hz, H-1’), 4,70 (s, 1 H, 2-NH), 4,47 (m, 1 H, H-3’), 3,97 (m, 1 H, H-4’), 3,78 (m, 2 H, H-5’a e H- 5’b), 2,23 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 0,98 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,95 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,29 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,13 (2 s, 6 H, CH3)2Si), 0,09 (s, 6 H, CH3)2Si).

[0255] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-2-(terc-butil-dimetil-silil)amino-6-cloro-7- metoxicarbonil-7-deazapurina (dG.27): Uma solução de dG.26 (105 mg, 0,139 mmol) foi dissolvida em 1,4-dioxano anidro (6 mL). Metanol anidro (6 mL) e trietilamina (0,04 mL) foram adicionados e a mistura foi agitada durante dez minutos sob uma atmosfera de monóxido de carbono, seguido pela adição de bis(benzonitrila)dicloropaládio(II). A reação foi agitada a 50oC durante 48 horas sob uma atmosfera de CO e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O -bis-( terc- butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-2-(terc-butildimetilsilil)amino-6- cloro-7-metoxicarbonil-7-deazapurina dG.27 (112 mg, 90%) como um óleo viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,92 (s, 1 H, H-8), 6,57 (dd, 1 H, J = 8,0 e 6,0 Hz, H-1’), 4,78 (s, 1 H, 2-NH), 4,49 (m, 1 H, H-3’), 4,02 (m, 1 H, H-4’), 3,85 (s, 3 H, CH3), 3,81 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,25 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 0,98 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,93 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,92 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,31 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,13 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si);

[0256] 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 163,04 (C), 160,06 (C), 154,46 (C), 153,04 (C), 129,81 (CH), 107,79 (C), 107,51 (C), 87,86 (CH), 84,05 (CH), 72,73 (CH), 63,21 (CH2), 51,26 (CH3), 42,21 (CH2), 26,48 (CH3), 25,96 (CH3), 25,72 (CH3), 18,42 (C), 18,03 (C), 17,59 (C), -4,73 (CH3), - 4,80 (CH3), -5,49 (CH3), -5,57 (CH3).

[0257] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-2-(terc-butildimetilsilil)amino-6-cloro-7-hidroxmetil- 7-deazapurina (dG.28): A uma solução de dG.27 (52 mg, 0,076 mmol) em THF anidro (3 mL) boro-hidreto de lítio (0,007 g, 0,305 mmol) foi adicionado, seguido por metanol (0,05 mL). A mistura de reação foi aquecida em refluxo durante uma hora. Quando de resfriamento, a mistura de reação foi diluída com diclorometano (100 mL), dissipada com água (10 mL); a camada orgânica foi separada, lavada duas vezes com salmoura (10 mL cada), seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O-bis-(terc- butildimetilsilil)-2’-deoxirribo-furanosil]-2-(terc-butildimetilsilil)amino-6- cloro-7-hidroximetil-7-deazapurina dG.28 (0,12 g, 45%) como um óleo viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,16 (s, 1 H, H-8), 6,56 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1’), 4,79 (AB d, J = 13,6 Hz, 7-CH2a), 4,75 (AB d, J = 13,6 Hz, 7-CH2b), 4,70 (s, 1 H, 2-NH), 4,50 (m, 1 H, H-3’), 3,96 (m, 1 H, H- 4’), 3,76 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,23 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 0,98 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,94 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,92 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,30 (s, 3 H, (CH3)2Si), 0,29 (s, 3 H, (CH3)2Si), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si) , 0,10 (s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 160,07 (C), 154,29 (C), 151,23 (C), 120,92 (CH), 115,65 (C), 108,44 (C), 87,26 (CH), 83,21 (CH), 72,50 (CH), 63,28 (CH2), 57,15 (CH2), 42,33 (CH2), 26,55 (CH3), 25,97 (CH3), 25,73 (CH3), 18,42 (C), 17,93 (C), 17,61 (C), -4,71 (CH3), - 4,75 (CH3), -5,34 (CH3), -5,47 (CH3).

[0258] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-2-(terc-butildimetilsilil)amino-6-cloro-7-(2- nitrobenzilóxi)metil-7-deazapurina (dG.29): A uma solução de composto dG.28 (150 mg, 0,23 mmol) em CH2Cl2 (3 mL) foram adicionados n- Bu4NBr (37 mg, 0,12 mmol), brometo de 2-nitrobenzila (148 mg, 0,68 mmol) e solução de NaOH a 1 M (3 mL). A mistura de reação foi agitada vigorosamente em temperatura ambiente durante dois dias no escuro. A camada orgânica foi separada, seca sobre Na2SO4, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O -bis-( terc-butildimetilsilil)-2’-deoxirribofurano- sil]-2-(terc-butildimetilsilil)amino-6-cloro-7-(2-nitrobenzilóxi)metil-7- deazapurina dG.29 (87 mg, 48%) como um óleo viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,06 (dd, 1H, J = 8,0 e 1,2 Hz, Ph-H), 7,87 (d, 1 H, J = 7,2 Hz, Ph-H), 7,61 (dt, 1 H, J = 7,6 e 1,2 Hz, Ph-H), 7,43 (m, 1 H, Ph- H), 7,20 (s, 1 H, H-8), 6,56 (dd, 1 H, J = 7,6 e 6,0 Hz, H-1’), 4,99 (s, 2 H, PhCH2), 4,83 (AB d, 1 H, J = 11,4 Hz, 7-CH2a), 4,75 (AB d, 1 H, J = 11,4 Hz, 7-CH2b), 4,67 (s, 1 H, 2-NH), 4,50 (m, 1 H, H-3’), 3,96 (m, 1 H, H- 4’), 3,77 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,25 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 0,98 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,92 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,30 (s, 3 H, (CH3)2Si), 0,29 (s, 3 H, (CH3)2Si), 0,09 (m, 12 H, (CHa^Si); 13C RMN (100 MHz, CDCI3): δ 159,94 (C), 154,18 (C), 151,78 (C), 147,16 (C), 135,23 (C), 133,6 (CH), 129,0 (CH), 127,75 (CH), 124,49 (CH), 121,85 (CH), 112,17 (C), 108,74 (C), 87,24 (CH), 83,22 (CH), 72,50 (CH), 68,48 (CH2), 65,04 (CH2), 63,27 (CH2), 41,31 (CH2), 26,52 (CH3), 25,93 (CH3), 25,7 (CH3), 18,36 (C), 17,89 (C), 17,56 (C), -4,75 (CH3), -4,81 (CH3), -5,39 (CH3), -5,52 (CH3).

[0259] 2-Amino-6-cloro-9-[β-D-2:-deoximbofuranosil]- 7-(2- nitrobenzilóxi) metil-7-deazapurina (dG.30): Uma solução de n-Bu4NF (123 mg, 0,39 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de composto dG.29 (105 mg, 0,13 mmol) em THF (3 mL) a 0°C. A mistura de reação foi agitada a 0°C durante uma hora e, então, em temperatura ambiente durante duas horas. A reação foi concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 2-amino-6-cloro-9-[β-D-2’-deoxirribofuranosil]-7-(2- nitrobenzilóxi)metil-7-deazapurina dG.30 (57 mg, 95%) como uma espuma amarela. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ, 8,02 (m, 1 H, Ph- H), 7,74 (m, 2 H, Ph-H), 7,55 (m, 1 H, Ph-H), 7,41 (s, 1 H, H-8), 6,73 (s, 2 H, D2O permutável, NH2), 6,41 (dd, 1 H, J = 8,4 e 6,0 Hz, H-1’), 5,26 (d, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 4,91 (t, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,88 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,66 (dd, 2 H, J = 11,6 Hz, 7-CH2), 4,31 (m, 1 H, H-3’), 3,78 (m, 1 H, H-4’), 3,50 (m, 2 H, H-5’), 2,38 (m, 1 H, H-2’a), 2,15 (m, 1 H, H-2’b).

[0260] 7-(2-Nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’-deoxiguanosina (dG.31): Uma mistura de dG.29 (38 mg, 0,084 mmol) e 1,4- diazabiciclo[2,2,2]octano (11 mg, 0,1 mmol) em água (4 mL) foi aquecida para refluxo sob uma atmosfera de nitrogênio durante 4 horas. Água foi removida in vacuo e o resíduo foi evaporado a partir de metanol três vezes (3 mL cada) e purificado por meio de cromatografia em sílica- gel para proporcionar 7-(2-nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’- deoxiguanosina dG.31 (11 mg, 30%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,4 (s, 1 H, D2O permutável, N-H), 8,03 (dd, 1 H, J = 8,4 e 0,8 Hz, Ph- H), 7,83 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,73 (m, 1 H, Ph-H), 7,55 (m, 1 H, Ph-H), 6,92 (s, 1 H, H-8), 6,28 (m, 1 H, H-1’), 6,26 (bs, 2 H, D2O permutável, NH2), 5,21 (d, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 4,89 (t, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,88 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,60 (dd, 2 H, 7-CH2), 4,28 (m, 1 H, H-3’), 3,74 (m, 1 H, H-4’), 3,48 (m, 2 H, H-5’), 2,32 (m, 1 H, H-2’a), 2,08 (m, 1 H, H-2’b).

[0261] 7-(2-Nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’-deoxiguanosina-5’- trifosfato (WW5p107): POCI3 (5 μL, 0,05 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dG.31 (11 mg, 0,025 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Uma solução de bis-pirofosfato de tri-n-butilamônio (118 mg, 0,25 mmol) e tri-n-butilamina (50 μL) em DMF anidra (0,5 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna de troca de ânions Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% de bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas a fim de proporcionar 7-(2-nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’- deoxiguanosina-5’-trifosfato WW5p107 o qual foi ainda purificado por meio de HPLC de fase invertida sobre uma coluna Perkin Elmer Aquapore OD-300 (7 μm, 250 x 4,6 mm). Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água; B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Síntese de 7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiguanosina-5’-trifosfato

Esquema 21. Síntese de 7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7- deaza-2’-deoxiguanosina-5’-trifosfato. (i) PPh3/CH2Cl2 (anidro), K2CO3, refluxo, 46%; (ii) 1-(2-nitrofenil)-2-metil-propanol (racêmico), puro, vácuo, 124oC; (iii) n-Bu4NF, THF, 7% para duas etapas; (iv) DABCO, H2O, refluxo, 29%; (v) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0262] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-2-(terc-butildimetilsilil)amino-6-cloro-7-clorometil-7- deazapurina (dG.32): A uma solução de dG.27 (1,22 g, 1,84 mmol) em tetracloreto de carbono (24 mL, recentemente destilado a partir de CaH2) foram adicionados carbonato de potássio (1,00 g, 7,36 mmol) e trifenil fosfina (1,20 g, 4,60 mmol). A reação foi agitada em refluxo durante 24 horas. A mistura foi concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O- bis-(terc-butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-2-(terc-butildimetilsilil) amino-6-cloro-7-clorometil-7-deazapurina dG.32 (0,54 g, 43%) como uma espuma. 1H RMN (400 MHz, CDCh): δ 7,16 (s, 1 H, H-8), 6,54 (dd, 1 H, J = 8,0 e 6,0 Hz, H-1’), 4,78 (AB d, J = 11,4 Hz, 7-CH2a), 4,68 (AB d, J = 11,4 Hz, 7-CH2b), 4,64 (s, 1 H, 2-NH), 4,47 (m, 1 H, H-3’), 3,94 (m, 1 H, H-4’), 3,73 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,20 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 0,98 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,28 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,09 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,07 (2 s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 159,85 (C), 154,16 (C), 151,82 (C), 121,86 (CH), 112,80 (C), 108,94 (C), 87,23 (CH), 83,17 (CH), 72,58 (CH), 63,35 (CH2), 41,24 (CH2), 29,72 (CH2), 26,57 (CH3), 25,97 (CH3), 25,74 (CH3), 18,38 (C), 17,93 (C), 17,62 (C), -4,71 (CH3), - 4,74 (CH3), -4,76 (CH3), -5,37 (CH3), -5,49 (CH3).

[0263] 2-Amino-6-doro-9-[/]-D-2:-deoximbofuranosil]-7-[1-(2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metila -7-deazapurina (dG.33): Composto dG.32 (0,82 g, 1,21 mmol) e 1-(2-nitrofenil)-2-metil-propanol (2,36 g, 12,10 mmol) foram dissolvidos em diclorometano anidro (10 mL). O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi aquecido in vacuo a 124oC durante 22 horas, então, dissolvido em acetato de etila e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O- bis-(terc-butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-2-amino-6-cloro-7-[1-(2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deazapurina bruta. Esse intermediário foi, então, dissolvido em tetra-hidrofurano (14 mL) e tratado com tri-hidrato de fluoreto de tetra-n-butilamônio (0,954 g, 3,03 mmol). Após 30 minutos, a mistura foi evaporada e purificada por meio de cromatografia em coluna para proporcionar 9-[β-D-2’- deoxirribofuranosil]-2-amino-6-cloro-7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-7-deazapurina dG.33 (41 mg, 7%, mistura a 1:1 de diastereômeros). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) para diastereômeros: δ 7,82 e 7,79 (2 dd, J = 8,0 e 1,2 Hz, 1 H, Ph-H), 7,72 (dt, J = 8,0 e 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,60 (m, 1 H, Ph-H), 7,41 (m, 1 H, Ph-H), 7,17 e 7,14 (2 s, 1 H, H-8), 6,41 (m, 1 H, H-1’), 4,71 (t, 1 H, J = 6,8 Hz Ph-CH), 4,48 (m, 2 H, 7-CH2 e H-3’), 3,94 (m, 1 H, H-4’), 3,71 (m, 2 H, H-5’), 2,53 (m, 1 H, H-2’a), 2,27 (m, 1 H, H-2’b), 1,92 (oct, J = 6,8 Hz, 1 H, CHCH(CH3)2), 0,96 e 0,94 (2 d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,80 e 0,76 (2 d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) para diastereômeros: δ 160,65 (C), 155,83 e 155,78 (C), 153,54 e 153,45 (C), 151,39 e 151,12 (C), 138,42 e 138,27 (C), 133,89 e 133,77 (CH), 130,66 e 130,56 (CH), 129,44 e 129,36 (CH), 125,66 e 125,29 (CH), 124,97 e 124,88 (CH), 113,67 e 113,39 (C), 110,08 (C), 88,81 e 88,78 (CH), 85,52 e 85,27 (CH), 81,60 e 81,87 (CH), 73,08 (CH), 64,71 e 64,18 (CH2), 63,84 e 63,78 (CH2), 41,00 e 40,86 (CH2), 36,31 e 36,28 (CH), 19,77 e 19,73 (CH3), 18,58 e 18,52 (CH3).

[0264] 7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiguanosina (dG.34): Uma mistura de dG.33 (54 mg, 0,11 mmol) e 1,4-diazabiciclo [2,2,2]octano (25 mg, 0,22 mmol) em água (5 mL) foi aquecida para refluxo sob uma atmosfera de nitrogênio durante três horas. A água foi removida in vacuo e o resíduo foi evaporado a partir de metanol três vezes (5 mL cada) e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-7-deaza-2’-deoxiguanosina dG.34 (15 mg, 29%, mistura a 1:1 de diastereômeros). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) para diastereômeros: δ 7,82 (m, 1 H, Ph-H), 7,76 (m, 1 H, Ph-H), 7,60 (m, 1 H, Ph-H), 7,42 (m, 1 H, Ph-H), 6,81 e 6,78 (2 s, 1 H, H-8), 6,28 (m, 1 H, H-1’), 4,79 (m, 1 H, Ph-CH), 4,50 (m, 3 H, 7-CH2 e H-3’), 3,92 (m, 1 H, H-4’), 3,71 (m, 2 H, H-5’), 2,48 (m, 1 H, H-2’a), 2,22 (m, 1 H, H-2’b), 1,92 (m, 1 H, CH), 0,93 (m, 3 H, CH3), 0,83 (m, 3 H, CH3).

[0265] 7-[1-(2-Nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiguanosina-5-trifosfato (WW5p143 ds1 & ds2): POCI3 (6 μL, 0,064 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dG.34 (15 mg, 0,032 mmol) em trimetilfosfato (0,4 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante cinco horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (285 mg, 0,6 mmol) e tri-n-butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas a fim de proporcionar 7-[1-(2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’-deoxiguanosina-5’-trifosfato WW5p143 as mistura de dois diastereômeros, os quais foram separados por meio de HPLC de fase invertida sobre uma coluna Perkin Elmer Aquapore OD-300 (7 μm, 250 x 4,6 mm) para proporcionar o diastereômero único WW5p143_ds1 (eluição rápida) e WW5p143_ds2 (eluição lenta). Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água; B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Síntese de 7-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil- propilóxi} metil-7-deaza-2’-deoxiguanosina-5’-trifosfato 6-ROX rotulado

Esquema 22. Síntese de 7-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-7-deaza-2’-deoxiguanosina-5’-trifosfato 6-ROX rotulado (i) (R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propanol, puro, vácuo, 124oC; (ii) n-Bu4NF, THF, 13% para duas etapas; (iii) DABCO, H2O, refluxo, quatro horas, 23%; (iv) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4 (0), CuI, Et3N, DMF anidra (anidro), quatro horas, 50%;

Esquema 23. (v) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M; (vi) 6-ROX-SE, tampão de Na2CO3 a 0,1 M/NaHCO3 (pH de 9,2), uma hora.

[0266] 2-Amino-6-cloro-9-[/kD-2’-deoxirribofuranosil]-- 7-[(R)-1-(4- iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deazapurina (dG.35): Composto dG.32 (0,62 g, 0,914 mmol) e (R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2- metil-propanol (3,52 g, 10,97 mmol) foram dissolvidos em diclorometano anidro (10 mL). O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi aquecido in vacuo a 122oC durante 16 horas, então, dissolvido em acetato de etila e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 2-amino-6-cloro-9-[β-D-3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-7-[(R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil- 7-deazapurina bruta, que foi dissolvida em tetra-hidrofurano (15 mL). O intermediário foi tratado com tri-hidrato de fluoreto de tetra-n- butilamônio (0,72 g, 2,28 mmol). Após 30 minutos, a mistura foi evaporada e purificada por meio de cromatografia em coluna para proporcionar 2-amino-6-cloro-9-[β-D-2’-deoxirribofuranosil]--7-[(R)-1-(4- iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deazapurina dG.35 (74 mg, 13%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ 8,09 (d, J = 1,2 Hz, 1 H, Ph-H), 7,86 (dd, J = 8,0 e 1,2 Hz, 1 H, Ph-H), 7,43 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, Ph-H), 7,14 (s, 1 H, H-8), 6,38 (dd, J = 8,0 e 6,0 Hz, 1 H, H-1’), 4,65 (d, J = 6,4 Hz, 1 H, Ph-CH), 4,57 (AB d, J = 12,4, 1H, 7-CH2a), 4,48 (m, 1 H, H-3’), 4,47 (AB d, J = 12,4, 1H, 7-CH2b), 3,95 (m, 1 H, H-4’), 3,76 (AB dd, J = 12,0 e 3,6 Hz, 1 H, H-5’a), 3,70 (AB dd, J = 12,0 e 3,6 Hz, 1 H, H-5’b), 2,52 (m, 1 H, H-2’a), 2,26 (m, 1 H, H-2’b), 1,89 (oct, J = 6,8 Hz, 1 H, CHCH(CH3)2), 0,94 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,79 (2 d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 159,09 (C), 151,52 (C), 151,95 (C), 149,53 (C), 141,20 (CH), 136,91 (C), 131,91 (CH), 130,96 (CH), 124,03 (CH), 111,96 (C), 108,59 (C), 90,84 (C), 87,29 (CH), 83,97 (CH), 79,92 (CH), 71,62 (CH), 63,44 (CH2), 62,36 (CH2), 39,31 (CH2), 34,63 (CH), 18,22 (CH3), 16,95 (CH3).

[0267] 7-[(R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza- 2’-deoxiguanosina (dG.36): Composto dG.35 (72 mg, 0,12 mmol) e 1,4- diazabiciclo[2,2,2]octano (52 mg, 0,46 mmol) em água (5 mL) foram aquecidos para refluxo sob uma atmosfera de nitrogênio durante quatro horas. A água foi removida in vacuo e o resíduo foi evaporado a partir de metanol três vezes (5 mL cada) e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 7-[(R)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’-deoxiguanosina dG.36 (16 mg, 23%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ 8,12 (d, J = 1,6 Hz, 1 H, Ph- H), 7,86 (dd, J = 8,4 e 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,50 (d, J = 8,4 Hz, 1 H, Ph- H), 6,80 (s, 1 H, H-8), 6,28 (dd, J = 8,0 e 6,0 Hz, 1 H, H-1’), 4,74 (d, J = 5,6 Hz, 1 H, Ph-CH), 4,55 (AB d, J = 12,0, 1H, 7-CH2a), 4,48 (AB d, J = 12,0, 1H, 7-CH2b), 4,44 (m, 1 H, H-3’), 3,92 (m, 1 H, H-4’), 3,75 (AB dd, J = 12,0 e 4,0 Hz, 1 H, H-5’a), 3,69 (AB dd, J = 12,0 e 4,0 Hz, 1 H, H- 5’b), 2,46 (m, 1 H, H-2’a), 2,23 (m, 1 H, H-2’b), 1,91 (m, 1 H, CH), 0,93 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,86 (2 d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3).

[0268] 7-{(R)-1-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-7-deaza-2’- deoxiguanosina (dG.37): Uma solução de composto dG.36 (15 mg, 0,025 mmol), N- propargiltrifluoroacetilamida (11 mg, 0,075 mmol), tetracis(trifenilfosfina)-paládio(0) (3 mg, 0,0025 mmol), CuI (1 mg, 0,005 mmol) e Et3N (7 μL, 0,050 mmol) em DMF anidra (1,5 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas. A mistura foi concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 7-{(R)-1-[4-(3-trifluoroacetamido-1- propinil)-2-nitrofenil]-2-metil-propilóxi}metil-7-deaza-2’- deoxiguanosina dG.37 (15 mg, 99%) como um sólido graxo. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ 7,88 (d, J = 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,75 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, Ph-H), 7,45 (dd, J = 8,0 e 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 6,83 (s, 1 H, H-8), 6,30 (dd, J = 8,4 e 6,4 Hz, 1 H, H-1’), 4,80 (d, J = 6,4 Hz, 1 H, Ph-CH), 4,56 (AB d, J = 12,0, 1H, 7-CH2a), 4,50 (AB d, J = 12,0, 1H, 7-CH2b), 4,47 (m, 1 H, H-3’), 4,35 (s, 1 H, CH2N), 3,94 (m, 1 H, H-4’), 3,77 (AB dd, J = 12,0 e 4,0 Hz, 1 H, H-5’a), 3,71 (AB dd, J = 12,0 e 4,0 Hz, 1 H, H-5’b), 2,49 (m, 1 H, H-2’a), 2,23 (m, 1 H, H-2’b), 1,93 (m, 1 H, CH), 0,95 (d, J = 6,4 Hz, 3 H, CH3), 0,87 (d, J = 6,4 Hz, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 161,61 (C), 154,02 (C), 152,67 (C), 150,49 (C), 142,69 (C), 139,77 (C), 136,37 (CH), 131,37 (CH), 127,90 (CH), 123,71 (C), 119,34 (CH), 117,19 (C), 116,42 (C), 88,69 (CH), 86,89 (C), 85,58 (CH), 81,93 (C), 81,42 (CH), 71,19 (CH), 65,42 (CH2), 63,97 (CH2), 41,12 (CH2), 36,16 (CH), 30,63 (CH2), 19,93 (CH3), 18,00 (CH3).

[0269] 7-{(R)-1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil- propilóxi} metil-7-deaza-2’- deoxiguanosina-5’-trifosfato (dG.38): POCl3 (7 μL, 0,076 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dG.37(12 mg, 0,019 mmol) e esponja de prótons (8 mg, 0,038 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante quatro horas. Uma solução de bis-pirofosfato de tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (100 μL) em DMF anidra (1 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas até secagem. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL) e tratado com hidróxido de amônio concentrado (2 mL, 27%) em temperatura ambiente durante uma hora a fim de proporcionar 7-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)- 2-nitrofenil]-2-metil-propilóxi} metil-7-deaza-2’- deoxiguanosina-5’- trifosfato dG.38, o qual foi purificado por meio de HPLC de fase invertida sobre uma coluna Perkin Elmer Aquapore OD-300 (7 μm, 250 x 4,6 mm). Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água; B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70).

[0270] 6-ROX rotulado 7-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]- 2-metil-propilóxi}metil-7-deaza-2’-deoxiguanosina-5’-trifosfato (WW6p034): Uma solução de 6-ROX-SE (3,5 mg, 5,54 μmol) em DMSO anidro (280 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dG.38 (0,85 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH de 9,2, 800 μL). A mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente durante uma hora. Um trifosfato rotulado com corante foi primeiro purificado por meio de HPLC de troca de ânions usando uma coluna Perkin Elmer AX-300 (7 μm, 250 x 4,6 mm). Fase móvel: A, 25% de CH3CN /75% de TEAB a 0,1 M; B, 25% de CH3CN/75% de TEAB a 1,5 M. O produto foi ainda purificado por meio de HPLC de fase invertida usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 (7 μm, 4,6 x 250 mm) para proporcionar trifosfato 6-ROX rotulado WW6p034. Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água (pH de 7,0); B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Exemplo 8 - Síntese de Análogos de 7-Deazaadenosina Síntese de 7-(2-nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina-5’- trifosfato

Esquema 24. Síntese de 7-(2-nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’-deoxia- denosina-5’-trifosfato. (i) NIS, CH2Cl2 (anidro), temperatura ambiente, 52%; (ii) cloreto de 2-deóxi-3,5-di-O -(p -toluoil)-α-D-ribofuranosila, TDA- 1, KOH, MeCN (anidro), temperatura ambiente; (iii) NH3, MeOH, temperatura ambiente, 47%; (iv) TBSCl, zolimidazol, DMF (anidro), temperatura ambiente, 51%; (v) CO, PdCl2[PhCN]2, MeOH/1,4-dioxano, 50oC, 99%; (vi) LiBH4, MeOH, THF, 45%; (vii) brometo de 2-nitrobenzila, n-Bu4NBr, CH2Cl2/aq. NaOH, , temperatura ambiente, 50%; (viii) n- Bu4NF, THF; NH3, 1,4-dioxano/MeOH, 90-100oC, 91%; (ix) POCl3, (MeO)3PO, menos 40oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0271] 6-Cloro-7-iodo-7-deazapurina (dA.23): Composto dA.23 foi sintetizado de acordo com o procedimento descrito por Ju et al. (2006, o qual é incorporado aqui por referência). A uma suspensão de 6-cloro- 7-deazapurina (1,00 g, 6,51 mmol) em CH2Cl2 anidro (55 mL) foi adicionada N-iodossuccinimida (1,70 g, 7,56 mmol). A reação foi protegida da luz enquanto se agitava em temperatura ambiente durante duas horas. A reação foi, então, concentrada in vacuo. O material foi re- cristalizado a partir de metanol quente para proporcionar 6-cloro-7-iodo- 7-deazapurina dA.23 (0,94 g, 52%).

[0272] 9-(β-D-2:-Deoximbofuranosil)-6-doro- 7-iodo- 7-deazapurina (dA.24): Composto dA.24 foi sintetizado de acordo com o procedimento descrito por Ju et al. (2006, o qual é incorporado aqui por referência). A uma suspensão de KOH (0,52 g, 8,29 mmol) e tris(3,6-dioxa- heptil)amina (0,07 mL, 0,22 mmol) em 56 mL anidro acetonitrila foi adicionado composto dA.23 (0,93 g, 3,32 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante cinco minutos e, então, cloreto de 2- deóxi-3,5-di-O-(p-toluoil)-α-D-ribofuranosila (1,38 g, 3,55 mmol) foi adicionado durante 15 minutos. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, então, foi filtrada e lavada com acetona quente (50 mL). O filtrado foi concentrado in vacuo e metade do material foi dissolvido em NH3 a 7N em solução de metanol (40 mL) e agitado em temperatura ambiente durante 16 horas. A reação foi, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em sílica- gel para proporcionar 9-(β-D-2’-deoxirribofuranosil)-6-cloro-7-iodo-7- deazapurina dA.24 (0,31 g, 47%) como uma espuma branca.

[0273] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-iodo-7-deazapurina (dA.25): Composto dA.24 (0,30 g, 0,76 mmol) foi evaporada a partir de piridina anidra (2 mL) três vezes e dissolvida em DMF anidra (5 mL). Cloreto de terc- Butildimetilsilila (0,34 g, 2,28 mmol) e imidazol (0,31 g, 4,55 mmol) foram adicionados e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas. A reação foi concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O-bis-(terc- butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-iodo-7-deazapurina dA.25 (0,24 g, 51%) como uma espuma branca. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,61 (s, 1 H, H-2), 7,81 (s, 1 H, H-8), 6,74 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1’), 4,56 (m, 1 H, H-4’), 4,01 (m, 1 H, H-3’), 3,87 (dd, 1 H, H-5’a), 3,79 (dd, 1 H, H-5’b), 2,39 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 0,96 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,18 (2s, 6 H, (CH3)2Si), 0,15 (s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 152,50 (C), 150,80 (CH), 150,48 (C), 131,94 (CH), 117,33 (C), 87,92 (CH), 84,16 (CH), 72,20 (CH), 63,01 (CH2), 51,98 (C), 42,08 (CH2), 26,07 (CH3), 25,77 (CH3), 18,51 (C), 18,05 (C), -4,63 (CH3), -4,78 (CH3), -5,25 (CH3), -5,39 (CH3).

[0274] 9-[β-D-3’,5’-O- Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-metoxicarbonil-7-deazapurina (dA.26): A uma solução de dA.25 (1,3 g, 2,1 mmol) em 1,4-dioxano anidro (30 mL) e metanol anidro (25 mL) foi adicionada trietilamina (0,58 mL). Após agitação durante dez minutos sob atmosfera de CO, bis(benzonitrila)dicloropaládio(II) foi adicionado. A reação foi agitada a 50oC durante 48 horas sob uma atmosfera de CO e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica- gel a fim de proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-metoxicarbonil-7-deazapurina dA.26 (1,15 g, 99%) como um óleo viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,69 (s, 1 H, H-2), 8,31 (s, 1 H, H-8), 6,77 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 4,58 (m, 1 H, H-4’), 4,06 (m, 1 H, H-3’), 3,90 (s, 3 H, CH3O), 3,87 (dd, 1 H, H-5’a), 3,81 (dd, 1 H, H-5’b), 2,42 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 0,93 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,13 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,12 (s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 162,46 (C), 153,12 (C), 152,07 (C), 151,35 (CH), 133,27 (CH), 115,27 (C), 107,65 (C), 88,23 (CH), 84,52 (CH), 72,46 (CH), 63,06 (CH2), 51,55 (CH3), 42,15 (CH2), 25,99 (CH3), 25,77 (CH3), 18,45 (C), 18,03 (C), -4,64 (CH3), -4,78 (CH3), -5,49 (CH3), -5,55 (CH3).

[0275] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7- hidroxmetil-7-deazapurina (dA.27): A uma solução de dA.26 (0,28 g, 0,50 mmol) em THF anidro (4 mL) boro- hidreto de lítio (0,044 g, 2,01 mmol) foi adicionado, seguido por metanol (0,1 mL). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante dez minutos e, então, aquecida em refluxo durante 45 minutos. Quando de resfriamento, a mistura de reação foi diluída com diclorometano (20 ml) e dissipada com água (2 mL). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura duas vezes (5 mL cada), seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’- O-bis-(terc-butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-hidroxmetil- 7-deazapurina dA.27 (0,12 g, 45%) como uma espuma branca. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,62 (s, 1 H, H-8), 7,61 (s, 1 H, H-2), 6,75 (dd, 1 H, J = 6,0 e 7,2 Hz, H-1’), 4,96 (AB d, 1 H, J = 11,6 Hz, 7-CH2a), 4,91 (AB d, 1 H, J = 11,6 Hz, 7-CH2b), 4,57 (m, 1 H, H-4’), 4,00 (m, 1 H, H-3’), 3,80 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,44 (m, 1 H, H-2’a), 2,04 (m, 1 H, H-2’b), 0,91 (2 s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,11 (2 s, 12 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 151,84 (C), 151,37 (C), 150,98 (CH), 125,33 (CH), 115,97 (C), 115,48 (C), 87,67 (CH), 83,73 (CH), 72,28 (CH), 63,07 (CH2), 56,89 (CH2), 41,42 (CH2), 25,98 (CH3), 25,79 (CH3), 18,45 (C), 18,03 (C), -4,64 (CH3), -4,76 (CH3), -5,35 (CH3), -5,47 (CH3).

[0276] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-(2-nitrobenzilóxi)metil-7-deazapurina (dA.28): A uma solução de dA.27 (30 mg, 0,057 mmol) em CH2Cl2 (2 mL) foram adicionados n-Bu4NBr (9 mg, 0,029 mmol), brometo de 2- nitrobenzila (37 mg, 0,17 mmol) e solução de NaOH a 1 M (2 mL). A mistura de reação foi agitada vigorosamente em temperatura ambiente durante 48 horas no escuro. A camada orgânica foi separada, seca sobre Na2SO4, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O-bis-(terc- butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-(2-nitrobenzilóxi)metil- 7-deazapurina dA.28 (19 mg, 50%) como um óleo viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,63 (s, 1 H, H-2), 8,06 (dd, 1 H, J = 8,4 e 1,2 Hz, Ph-H), 7,84 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,64 (s, 1 H, H-8), 7,62 (m, 1 H, Ph-H), 7,43 (t, 1 H, Ph-H), 6,75 (dd, 1 H, J = 7,2 e 6,0 Hz, H-1’), 5,03 (s, 2 H, PhCH2), 4,95 (AB d, 1 H, J = 12,0 Hz, 7-CH2a), 4,88 (AB d, 1 H, J = 12,0 Hz, 7-CH2b), 4,59 (m, 1 H, H-4’), 4,00 (m, 1 H, H-3’), 3,80 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,48 (m, 1 H, H-2’a), 2,37 (m, 1 H, H-2’b), 0,92 (2 s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,10 (s, 6 H, (CH3)2Si).

[0277] 7-(2-Nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina (dA.29): Uma solução de n-Bu4NF (17 mg, 0,054 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada a uma solução de dA.28 (18 mg, 0,027 mmol) em THF (1 mL) a 0oC. A mistura de reação foi gradualmente aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante duas horas. A mistura foi concentrada in vacuo e, então, o resíduo foi dissolvido em 1,4-dioxano (2 mL), seguido pela adição de NH3 a 7N em metanol (4 mL). A mistura foi transferida para um tubo vedado e agitada a 90-100 oC durante 16 horas, então, esfriada, concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 7-(2- nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina dA.29 (10 mg, 91%) como uma espuma branca. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,08 (s, 1 H, H-2), 8,06 (m, 1 H, Ph-H), 7,75 (m, 2 H, Ph-H), 7,58 (m, 1 H, Ph-H), 7,42 (s, 1 H, H-8), 6,64 (bs, 2 H, D2O permutável, 6-NH2), 6,48 (dd, 1 H, J = 2,0 e 6,0 Hz, H-1’), 5,25 (d, 1 H, J = 4,0 Hz, D2O permutável, 3’-OH), 5,08 (t, 1 H, J = 5,6 Hz, D2O permutável, 5’-OH), 4,90 (s, 2 H, PhCH2), 4,75 (AB dd, 2 H, 7-CH2), 4,33 (m, 1 H, H-3’), 3,81 (m, 1 H, H-4’), 3,54 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,47 (m, 1 H, H-2’a), 2,15 (m, 1 H, H-2’b).

[0278] 7-(2-Nitrobenzilóxi)metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina-5’- trifosfato (WW5p085): POCl3 (2,6 μL, 0,028 mmol) foi adicionado a uma solução de dA.29 (6 mg, 0,014 mmol) e esponja de prótons (6 mg, 0,028 mmol) em trimetilfosfato (0,25 mL) a menos 40oC e agitados durante quatro horas. Uma solução de bis-pirofosfato de tri-n-butilamônio (66 mg, 0,14 mmol) e tri-n-butilamina (28 μL) em DMF anidra (0,28 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 1 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (2 mL), filtrado e purificado com HPLC de fase invertida usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (7 μm, 4,6 x 250 mm) para proporcionar 7-(2-nitrobenzilóxi)metil-7-deaza- 2’-deoxiadenosina-5’-trifosfato WW5p085. Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água (pH de 7,0); B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Síntese de 7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiadenosina-5’-trifosfato

Esquema 25. Síntese de 7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7- deaza-2’-deoxiadenosina-5’-trifosfato. (i) TsCl, DMAP, CH2Cl2 (anidro), temperatura ambiente, 39%; (ii) 1-(2-nitrofenil)-2-metil-propanol (racêmico), puro, vácuo, 105oC, 54%; (iii) n-Bu4NF, THF; NH3, 1,4- dioxano/MeOH, 90-100oC, 76%; (iv) POCl3, (MeO)3PO, menos 40oC a 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0279] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-clorometil-7-deazapurina (dA.30): A uma solução de dA.27 (0,257 g, 0,485 mmol) em diclorometano (12 mL, recentemente destilado a partir de CaH2) foram adicionados 4-N,N- dimetilaminopiridina (0,148 g, 1,213 mmol) e cloreto de tosila (0,111 g, 0,583 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 18 horas e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9- [β-D - 3’,5‘-O -bis-( terc-butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7- clorometil-7-deazapurina dA.30 (0,103 g, 26%) como um óleo viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,64 (s, 1 H, H-2), 7,72 (s, 1 H, H-8), 6,73 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 4,95 (AB d, J = 12,4 Hz, 7-CH2a), 4,91 (AB d, J = 12,0 Hz, 7-CH2b), 4,58 (m, 1 H, H-3’), 4,00 (m, 1 H, H-4’), 3,82 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,41 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 0,95 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,93 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,12 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 151,78 (C), 151,56 (C), 151,26 (CH), 126,68 (CH), 112,15 (C), 115,54 (C), 87,78 (CH), 83,97 (CH), 72,17 (CH), 62,98 (CH2), 41,72 (CH2), 37,56 (CH2), 25,99 (CH3), 25,78 (CH3), 18,45 (C), 18,03 (C), -4,63 (CH3), -4,78 (CH3), -5,35 (CH3), -5,45 (CH3).

[0280] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7- deazapurina (dA.31): Composto dA.30 (54 mg, 0,1 mmol) e 1-(2- nitrofenil)-2-metil-propanol (191 mg, 0,978 mmol) foram dissolvidos em diclorometano anidro (10 mL). O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi aquecido in vacuo durante uma hora, então, dissolvido em acetato de etila e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O -bis-( terc-butildimetilsilil)-2‘- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7- deazapurina dA.31 (38 mg, 54%, mistura a 1:1 de diastereômeros). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) para diastereômeros: δ 8,60 e 8,59 (2 s, 1 H, H- 2), 7,83 (m, 1 H, Ph-H), 7,79 (m, 1 H, Ph-H), 7,56 (m, 1 H, Ph-H), 7,48 e 7,47 (2 s, 1 H, H-8), 7,38 (m, 1 H, Ph-H), 6,70 (m, 1 H, H-1’), 4,81 (m, 1 H, Ph-CH), 4,70 (m, 1H, 7-CH2a), 4,58 (m, 2 H, 7-CH2b e H-3’), 3,99 (m, 1 H, H-4’), 3,78 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,48 (m, 1 H, H-2’a), 2,35 (m, 1 H, H-2’b), 1,96 (m, 1 H, CH), 0,98 e 0,96 (2 d, 3 H, CH3), 0,93 (2 s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,89 (2 s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,82 e 0,78 (2 d, 3 H, CH3), 0,12 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,08 e 0,07 (2 s, 3 H, (CH3)2Si), 0,06 e 0,05 (2 s, 3 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 152,60 e 152,47 (C), 150,84 (CH), 150,28 e 150,21 (C), 149,56 e 149,47 (C), 148,01 (C), 137,22 e 137,08 (C), 132,70 e 132,68 (CH), 129,15 e 129,13 (CH), 127,97 (CH), 126,65 e 126,29 (CH), 123,85 e 123,79 (CH), 112,36 e 112,07 (C), 87,63 e 87,59 (CH), 83,71 e 83,68 (CH), 81,92 e 81,08 (CH), 72,40 e 72,28 (CH), 63,50 (CH2), 63,15 e 63,03 (CH2), 41,07 e 41,00 (CH2), 35,08 e 35,05 (CH), 19,20 e 19,11 (CH3), 18,42 e 18,40 (C), 18,18 e 18,05 (CH3), -4,67 e -4,76 (CH3Si), -4,78 (CH3Si), -5,35 (CH3Si), -5,47 e -5,51 (CH3Si).

[0281] 7-[1-(2-Nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiadenosina (dA.32): Uma solução de n-Bu4NF(44 mg, 0,140 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de dA.31 (38 mg, 0,053 mmol) em THF (2 mL) a 0oC. A reação foi gradualmente aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante duas horas. A mistura foi concentrada in vacuo, dissolvida em 1,4-dioxano (4 mL), seguido pela adição de NH3 a 7N em solução de metanol (8 mL). A mistura foi transferida para um tubo vedado e agitada a 90-100oC durante 24 horas, então, esfriada, concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 7-[1-(2-nitrofenil)-2- metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina dA.32 (19 mg, 76%, mistura a 1:1 de diastereômeros) como um óleo viscoso. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 8,06 e 8,04 (2 s, 1 H, H-2), 7,90 (m, 1 H, Ph-H), 7,67 (m, 2 H, Ph-H), 7,56 (m, 2 H, Ph-H), 7,19 e 7,16 (2 s, 1 H, H-8), 6,63 (bs, 2 H, D2O permutável, 6-NH2), 6,39 (m, 1 H, H-1’), 5,23 (m, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 5,00 (m, 1 H, D2O permutável, 5’- OH), 4,72 (2 d, 1 H, Ph-CH), 4,45 (s, 2 H, 7-CH2), 4,30 (m, 1 H, H-3’), 3,77 (m, 1 H, H-4’), 3,49 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,40 (m, 1 H, H-2’a), 2,12 (m, 1 H, H-2’b), 1,94 (m, 1 H, CH), 0,87 (m, 3 H, CH3), 0,74 (m, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) para diastereômeros: δ 157,76 (C), 151,08 (CH), 149,92 e 149,57 (C), 148,01 (C), 135,99 e 135,92 (C), 132,51 e 132,41 (CH), 128,89 (CH), 128,20 e 128,15 (CH), 123,49 e 123,43 (CH), 122,32 e 121,97 (CH), 111,86 (C), 103,02 (C), 87,65 e 87,59 (CH), 85,25 e 85,00 (CH), 80,29 e 79,60 (CH), 71,73 (CH), 63,97 e 69,92 (CH2), 63,49 e 62,41 (CH2), 39,95 e 39,77 (CH2), 34,55 e 34,51 (CH), 18,09 (CH3), 17,16 (CH3). 7-[1-(2-Nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiαdenosinα-5’-trifosfαto (WW5p098 ds1 & ds2): POCh (8 μL, 0,083 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dA.32 (19 mg, 0,041 mmol) em trimetilfosfato (0,4 mL) e a reação foi agitada a menos 40 oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Mais POCl3 (8 μL, 0,083 mmol) foi adicionado e a reação foi agitada a 0oC durante mais três horas. Uma solução de bis-pirofosfato de tri-n-butilamônio (97 mg, 0,2 mmol) e tri-n-butilamina (40 μL) em DMF anidro (0,4 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% de bicarbonato de trietilamônio a 0,1M(TEAB) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB a 1,5 M durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 7-[1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiadenosina-5’-trifosfato WW5p098 as mistura de dois diastereômeros, os quais foram separados por meio de HPLC de fase invertida sobre uma coluna Perkin Elmer Aquapore OD-300 (7 μm, 250 x 4,6 mm) para proporcionar o diastereômero único WW5p098 ds1 (eluição rápida) e WW5p098 ds2 (eluição lenta). Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água; B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Síntese de 7-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina-5’-trifosfato 6-FAM rotulado

Esquema 26. Síntese de 7-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina-5’-trifosfato 6-FAM rotulado (i) (R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propanol, puro, vácuo, 108oC, 47%; (ii) n-Bu4NF, THF; NH3, 1,4-dioxano/MeOH, 90-100oC, 82%; (iii) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4 (0), CuI, Et3N, DMF anidra, 99%; (iv) POCl3, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

Esquema 27. (v) 6-FAM-SE, tampão de Na2CO3 a 0,1 M/NaHCO3 (pH de 9,2).

[0282] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[(R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-7-deazapurina (dA.33). Composto dA.30 (80 mg, 0,147 mmol) e (R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propanol enântio-puro (518 mg, 1,163 mmol) foram dissolvidos em diclorometano anidro (10 mL). O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi aquecido in vacuo durante uma hora, então, dissolvido em acetato de etila e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’,5’-O -bis-( terc- butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[(R)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deazapurina dA.33 (57 mg, 47%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,60 (s, 1 H, H-2), 8,12 (d, J = 2,0 Hz, 1 H, Ph-H), 7,87 (dd, J = 8,4 e 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,47 (d, J = 8,0 Hz,1 H, Ph-H), 7,47 (s, 1 H, H-8), 6,71 (dd, J = 7,6 e 6,0 Hz, 1 H, H-1’), 4,76 (d, J = 6,4 Hz, 1 H, Ph-CH), 4,70 (AD d, J = 11,6 Hz, 1H, 7-CH2a), 4,58 (m, 2 H, 7-CH2b e H-3’), 4,00 (m, 1 H, H-4’), 3,79 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,45 (m, 1 H, H-2’a), 2,36 (m, 1 H, H-2’b), 1,93 (sep, J = 6,8 Hz, 1 H, CHCH(CH3)2), 0,98 (d, J = 6,4 Hz, 3 H, CH3), 0,93 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,82 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,126 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,123 (s, 3 H, (CH3)2Si), 0,09 (s, 3 H, (CH3)2Si), 0,06 (s, 3 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCI3): δ 151,81 (C), 151,76 (C), 150,93 (CH), 149,79 (C), 141,63 (CH), 137,04 (C), 132,34 (CH), 130,85 (CH), 126,41 (CH), 116,17 (C), 112,06 (C), 91,57 (C), 87,65 (CH), 83,77 (CH), 80,68 (CH), 72,41 (CH), 63,58 (CH2), 63,15 (CH2), 41,07 (CH2), 34,95 (CH), 25,96 (C(CH3)3), 25,80 (C(CH3)3), 19,13 (CH3), 18,42 (C), 18,05 (CH3), -4,63 (CH3), -4,78 (CH3), -5,35 (CH3), -5,45 (CH3).

[0283] 7-[(R)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza- 2’-deoxiadenosina (dA.34): Uma solução de n-Bu4NF (58 mg, 0,182 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de dA.33 (57 mg, 0,069 mmol) em THF (2 mL) a 0oC. A reação foi gradualmente aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante duas horas. A mistura foi concentrada in vacuo, dissolvida em 1,4-dioxano (5 mL), seguido pela adição de NH3 a 7N em solução de metanol (16 mL). A mistura foi transferida para um tubo vedado e agitada a 90-100oC durante 24 horas, então, esfriada, concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 7-[(R)-1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina dA.34 (33 mg, 82%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,22 (d, J = 1,6 Hz, 1 H, Ph- H), 8,04 (s, 1 H, H-2), 8,00 (dd, J = 8,4 e 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,39 (d, J = 8,4 Hz, 2 H, Ph-H), 7,19 (s, 1 H, H-8), 6,60 (bs, 2 H, D2O permutável, 6-NH2), 6,40 (dd, J = 8,4 e 6,0 Hz, 1 H, H-1’), 5,24 (d, J = 4,0 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 5,00 (d, J = 5,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’- OH), 4,64 (d, J = 6,0 Hz, 1 H, Ph-CH), 4,45 (AB dd, 2 H, 7-CH2), 4,29 (m, 1 H, H-3’), 3,78 (m, 1 H, H-4’), 3,47 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,40 (m, 1 H, H-2’a), 2,11 (m, 1 H, H-2’b), 1,92 (m, 1 H, CH), 0,87 (d, J = 6,4 Hz, 3 H, CH3), 0,76 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 164,68 (C), 151,12 (CH), 150,12 (C), 149,84 (C), 141,38 (CH), 136,09 (C), 131,94 (CH), 130,66 (CH), 122,15 (CH), 111,79 (C), 103,09 (C), 91,16 (C), 87,63 (CH), 85,12 (CH), 80,31 (CH), 71,80 (CH), 63,36 (CH2), 62,53 (CH2), 39,76 (CH2), 34,41 (CH), 18,00 (CH3), 17,20 (CH3).

[0284] 7-{(R)-1-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- metil-propilóxi}metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina (dA.35): Uma solução de composto dA.34 (33 mg, 0,056 mmol), N- propargiltrifluoroacetilamida (25 mg, 0,168 mmol), tetracis(trifenilfosfina)-paládio(0) (7 mg, 0,0065 mmol), CuI (2 mg, 0,0112 mmol) e Et3N (16 μL, 0,050 mmol) em DMF anidra (3 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas. A mistura foi concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 7-{(R)-1-[4-(3-trifluoroacetamido-1- propinil)-2-nitrofenil]-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina dA.35 (34 mg, 99%) como um sólido graxo. 1H RMN (400 MHz, DMSO- d6): δ 10,11 (br t, 1 H, D2O permutável, NHTFA), 8,12 (br s, 1 H, H-2), 7,94 (d, J = 1,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,71 (AB dd, J = 8,0 e 1,6 Hz, 1 H, Ph- H), 7,62 (AB d, J = 8,4 Hz, 2 H, Ph-H), 7,28 (s, 1 H, H-8), 6,95 (bs, 2 H, D2O permutável, 6-NH2), 6,42 (dd, J = 8,0 e 6,0 Hz, 1 H, H-1’), 5,25 (br s, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 4,98 (br s, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,60 (d, J = 6,0 Hz, 1 H, Ph-CH), 4,51 (AB dd, J = 12,8 Hz, 1 H, 7-CH2a), 4,45 (AB dd, J = 12,4 Hz, 1 H, 7-CH2b), 4,30 (m, 3 H, CH2NH e H-3’), 3,78 (m, 1 H, H-4’), 3,47 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,39 (m, 1 H, H-2’a), 2,14 (m, 1 H, H-2’b), 1,95 (m, 1 H, CH), 0,88 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,76 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 157,62 (C), 151,15 (CH), 150,05 (C), 149,47 (C), 136,64 (C), 135,03 (CH), 129,34 (CH), 126,31 (CH), 122,68 (C), 122,14 (CH), 115,02 (C), 111,84 (C), 87,59 (CH), 85,83 (C), 85,01 (CH), 80,28 (CH), 80,13 (C), 81,42 (CH), 71,74 (CH), 64,28 (CH2), 62,49 (CH2), 39,73 (CH2), 34,50 (CH), 29,07 (CH2), 18,03 (CH3), 17,18 (CH3).

[0285] 7-{(R)-1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil- propilóxi} metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina-5’-trifosfato (dA.36): POCl3 (8 μL, 0,089 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dA.35 (27 mg, 0,045 mmol) e esponja de prótons (19 mg, 0,089 mmol) em trimetilfosfato (0,4 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Uma solução de bis-pirofosfato de tri- n-butilamônio (285 mg, 0,6 mmol) e tri-n-butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% de bicarbonato de trietilamônio a 0,1 M (TEAB) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB a 1,5 M durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas até secagem. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL) e tratado com hidróxido de amônio concentrado (2 mL, 27%) em temperatura ambiente durante uma hora para proporcionar 7-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2- nitrofenil]-2-metil-propilóxi} metil-7-deaza-2’- deoxiadenosina-5’- trifosfato dA.36, o qual foi purificado por meio de HPLC de fase invertida sobre uma coluna Perkin Elmer Aquapore OD-300 (7 μm, 250 x 4,6 mm). Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água; B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70).

[0286] 7-{(R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-metil- propilóxi} metil-7-deaza-2’- deoxiadenosina-5’-trifosfato 6-FAM rotulado (WW6p028): Uma solução de 6-FAM-SE (4 mg, 8,4 μmol) em DMSO anidro (80 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dA.36 (2,6 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH de 9,2, 1,6 mL). A mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente durante uma hora. Um trifosfato rotulado com corante foi primeiro purificado por meio de HPLC de troca de ânions usando uma coluna PerkinElmer AX-300 (7 μm, 250 x 4,6 mm). Fase móvel: A, 25% de CH3CN /75% de TEAB a 0,1 M; B, 25% de CH3CN/75% de TEAB a 1,5 M. O produto foi ainda purificado por meio de HPLC de fase invertida usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 (7 μm, 4,6 x 250 mm) para proporcionar 6-FAM rotulado trifosfato WW6p028. Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água (pH de 7,0); B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Síntese de 7-[1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiadenosina-5’-trifosfato

Esquema 28. Síntese de 7-[1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7- deaza-2’-deoxiadenosina-5’-trifosfato. (i) 1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil- propanol (racêmico), puro, vácuo, 108oC, 33% (dA.37a) e 11% (da.37b); (ii) n-Bu4NF, THF; NH3, 1,4-dioxano/MeOH, 90-100oC, 86%; (iv) POCl3, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3a 1 M.

[0287] 9-[β-D-3:-O-(terc-Butildimetilsilil)-2:-deoximbofuranosil]-6- cloro-7-[1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deazapurina (dA.37a) e 9-[/3-D-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(2,6-dinitrofenil)-2- metil-propilóxi]metil-7-deazapurina (dA.37b): Composto dA.30 (109 mg, 0,201 mmol) e 1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil-propanol (448 mg, 1,863 mmol) foram dissolvidos em diclorometano anidro (10 mL). O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi aquecido a 108oC in vacuo durante 30 minutos, então, dissolvido em acetato de etila e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 9-[β-D-3’-O-(terc- butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(2,6-dinitrofenil)-2- metil-propilóxi]metil-7-deazapurina dA.37a (42 mg, 33%, mistura a 1:1 de diastereômeros) e 9-[β-D-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(2,6- dinitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deazapurina dA.37b (13 mg, 11%, mistura a 1:1 de diastereômeros). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) para dA.37a (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 8,59 (s, 1 H, H-2), 7,78 (m, 2 H, Ph-H), 7,63 (m, 1 H, Ph-H), 7,38 (s, 1 H, H-8), 6,39 (m, 1 H, H-1’), 5,01 (2 br s, 1 H, 5’-OH), 4,72 (m, 4 H, Ph-CH, 7-CH2 e H-3’), 4,11 (m, 1 H, H-4’), 3,91 (AB d, 1 H, H-5’a), 3,85 (m, 1 H, H-5’b), 2,96 (m, 1 H, CH(CH3)2), 2,40 (m, 2 H, H-2’), 1,08 (m, 3 H, CH3), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,78 (2 d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,13 (s, 6 H, (CH3)2Si);

[0288] 13C RMN (100 MHz, CDCl3) para dA.37a (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 152,60 e 152,47 (C), 150,92 e 150,66 (C), 150,47 e 150,28 (C), 151,84 (CH), 150,28 e 150,21 (C), 129,72 e 129,69 (CH), 129,18 (CH), 128,77 (C), 128,63 e 128,54 (CH), 126,69 (CH), 117,57 e 117,29 (C), 110,84 e 110,59 (C), 89,39 e 89,18 (CH), 88,70 e 88,80 (CH), 82,00 e 81,84 (CH), 73,47 e 73,35 (CH), 64,56 e 64,34 (CH2), 63,10 e 63,05 (CH2), 41,12 (CH2), 34,86 (CH), 25,81 ((CH3)3Si), 19,13 (CH3), 18,36 (CH3), 18,08 (C), -4,67 (CH3Si), -4,76 (CH3Si).

[0289] 1H RMN (400 MHz, CD3OD) para dA.37b (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 8,57 e 8,56 (2 s, 1 H, H-2), 7,96 (m, 2 H, Ph-H), 7,45 (m, 2 H, Ph-H e H-8), 6,39 (m, 1 H, H-1’), 4,78 (m, 2 H, Ph-CH, 7-CH2a), 4,56 (m, 2 H, 7-CH2b e H-3’), 4,02 (m, 1 H, H-4’), 3,78 (m, 2 H, H-5’), 2,62 (m, 1 H, CH(CH3)2), 2,44 (m, 1 H, H-2’a), 2,30 (m, 1 H, H-2’b), 1,02 e 0,95 (2 d, J = 6,4 Hz, 3 H, CH3), 0,71 e 0,69 (2 d, J = 7,2 Hz, 3 H, CH3).

[0290] 7-[1-(2,6-Dinitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiadenosina (dA.38): Uma solução de n-Bu4NF(44 mg, 0,140 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de dA.37a (42 mg, 0,066 mmol) em THF (5 mL) a 0oC. A reação foi gradualmente aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante duas horas. A mistura foi concentrada in vacuo e uma solução de dA.37b (12 mg, 0,022 mmol) em 1,4-dioxano (4 mL) foi adicionado, seguido por NH3 a 7N em solução de metanol (18 mL). A mistura foi transferida para um tubo vedado e agitada a 90-100oC durante 36 horas, então, esfriada, concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 7-[1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza- 2’-deoxiadenosina dA.38 (38 mg, 86%, mistura a 1:1 de diastereômeros) como um óleo viscoso. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 8,17 (m, 1 H, Ph-H), 8,07 e 8,06 (2 s, 1 H, H-2), 7,85 (m, 1 H, Ph-H), 7,69 (m, 1 H, Ph-H), 7,20 e 7,18 (2 s, 1 H, H-8), 6,57 (bs, 2 H, D2O permutável, 6-NH2), 6,46 (m, 1 H, H-1’), 5,26 (d, J = 3,6 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 5,01 (m, 1 H, D2O permutável, 5’- OH), 4,60 (m, 2 H, Ph-CH e 7-CH2a), 4,29 (m, 1 H, 7-CH2b), 4,13 (m, 1 H, H-3’), 3,80 (m, 1 H, H-4’), 3,51 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,49 (m, 1 H, CH(CH3)3), 2,16 (m, 1 H, H-2’a e H-2’b), 0,91 (m, 3 H, CH3), 0,65 (m, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) para diastereômeros: δ 157,73 (C), 151,33 e 151,18 (CH), 150,39 (C), 150,22 (C), 130,45 e 130,49 (CH), 127,25 e 127,13 (C), 126,90 (CH), 128,20 e 128,15 (CH), 123,45 e 123,32 (CH), 110,32 e 110,23 (CH), 103,03 e 102,75 (C), 87,74 e 87,58 (CH), 85,43 e 84,73 (CH), 79,94 e 79,37 (CH), 71,88 e 71,64 (CH), 64,08 e 63,71 (CH2), 62,67 e 62,32 (CH2), 40,95 e 39,82 (CH2), 34,24 e 34,16 (CH), 19,63 (CH3), 17,49 (CH3). ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C22H27N6O8 [M+H]+, a massa calculada foi 503,1890 e a massa observada foi 503,2029.

[0291] 7-[1-(2,6-Dinitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’- deoxiadenosina-5-trifosfato (WW6p057ds1 & ds2): POCI3 (11 μL, 0,12 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dA.38 (30 mg, 0,06 mmol) em trimetilfosfato (0,4 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante quatro horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (285 mg, 0,6 mmol) e tri-n-butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% de bicarbonato de trietilamônio a 0,1 M (TEAB) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB a 1,5 M durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 7-[1-(2,6- dinitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina-5’- trifosfato WW6p057 como mistura de dois diastereômeros, os quais foram separados por meio de HPLC de fase invertida sobre uma coluna Perkin Elmer Aquapore OD-300 (7 μm, 250 x 4,6 mm) para proporcionar o diastereômero único WW6p057 ds1 (eluição rápida) e WW6p057 ds2 (eluição lenta). Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água; B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Síntese de 7-[1-(4-metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7- deaza-2’-deoxiadenosina-5’-trifosfato

Esquema 29. Síntese de 7-[1-(4-metóxi-2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina-5’-trifosfato. (i) 1-(4-metóxi- 2-nitrofenil)-2-metil-propanol (racêmico), puro, vácuo, 108oC, 33% (dA.39a) e 21% (da.39b); (ii) n-Bu4NF, THF; NH3, 1,4-dioxano/MeOH, 90-100oC, 61%; (iv) POCl3, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3a 1 M.

[0292] 9-[β-D-3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(4-metóxi-2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-7-deazapurina (dA.39a) e 9-[β-D-3:-O-(terc- butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(4-metóxi-2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deazapurina (dA.39b): Composto dA.30 (103 mg, 0,19 mmol) e 1-(4-metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-propanol (428 mg, 1,90 mmol) foram dissolvidos em diclorometano anidro (3 mL). O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi aquecido a 108oC in vacuo durante 30 minutos, então, dissolvido em acetato de etila e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel em 9-[β-D-3’,5’-O-bis- (terc-butildimetilsilil)-2’-deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(4-metóxi-2- nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deazapurina dA.39a (46 mg, 33%, mistura a 1:1 de diastereômeros) e 9-[β-D-3’-O-(terc-butildimetilsilil)-2’- deoxirribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(4-metóxi-2-nitrofenil)-2-metil- propilóxi]metil-7-deazapurina dA.39b (25 mg, 21%, mistura a 1:1 de diastereômeros). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) para dA.39a (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 8,60 e 8,59 (2 s, 1 H, H-2), 7,64 e 7,62 (2 d, J = 6,4 Hz, 1 H, Ph-H), 7,47 e 7,45 (2 s, 1 H, H-8), 7,32 (m, 1 H, Ph-H), 7,12 (m, 1 H, Ph-H), 6,71 (m, 1 H, H-1’), 4,62 (m, 4 H, Ph-CH, 7-CH2 e H-3’), 3,99 (m, 1 H, H-4’), 3,87 e 3,86 (2 s, 3 H, MeO), 3,70 (AB d, 1 H, H-5’a e H-5’b), 2,50 (m, 1 H, H-2’a), 2,35 (m, 1 H, H-2’a), 1,93 (m, 1 H, CH(CH3)2), 1,00 e 0,97 (2 d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,93 e 0,92 (2 s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,91 e 0,89 (2 s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,80 e 0,76 (2 d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,12 e 0,10 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,08, 0,07, 0,06 e 0,05 (4 s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) para dA.39a (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 158,82 (C), 151,82 e 151,46 (C), 151,32 e 151,16 (C), 150,85 (CH), 150,27 e 150,08 (C), 130,16 (CH), 128,95 e 129,80 (C), 126,56 e 126,22 (CH), 119,60 (CH), 112,49 e 122,22 (C), 108,21 e 108,14 (CH), 87,64 e 87,58 (CH), 83,69 (CH), 80,68 e 79,98 (CH), 72,42 e 72,27 (CH), 63,26 e 63,17 (CH2), 63,03 e 62,80 (CH2), 55,80 (CH3), 41,04 (CH2), 35,08 (CH), 25,95 ((CH3)3Si), 25,80 ((CH3)3Si), 25,66 ((CH3)3Si), 19,12 e 19,05 (CH3), 18,42 (CH3), 18,05 (C), -3,75 (CH3Si), -4,66 e -4,76 (CH3Si), -5,36 (CH3Si), -5,46 e -5,50 (CH3Si).

[0293] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) para dA.39b (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 8,59 e 8,57 (2 s, 1 H, H-2), 7,62 e 7,60 (2 d, J = 6,4 Hz, 1 H, Ph-H), 7,33 e 7,32 (2 d, J = 2,4 Hz, 1 H, Ph-H), 7,30 e 7,29 (2 s, 1 H, H-8), 7,14 e 7,10 (2 dd, J = 8,8, 2,4 Hz, 1 H, Ph-H), 6,28 (m, 1 H, H-1’), 5,06 (br t, 1 H, 5’-OH), 4,64 (m, 4 H, Ph-CH, 7-CH2 e H-3’), 4,11 (m, 1 H, H-4’), 3,94 (AB d, J = 10,8 Hz, 1 H, H-5’a), 3,87 e 3,85 (2 s, 3 H, MeO), 3,76 (m, 1 H, H-5’b), 2,93 (m, 1 H, H-2’a), 2,25 (m, 1 H, H-2’b), 1,96 (set, J = 6,4 Hz, 1 H, CH(CH3)2), 0,95 (m, 3 H, CH3), 0,94 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,80 (m, 3 H, CH3), 0,13 (s, 6 H, (CH3)2Si).

[0294] 7-[1-(4-metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza- 2’-deoxiadenosina (dA.40): Uma solução de n-Bu4NF (68 mg, 0,217 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de dA.39a (46 mg, 0,063 mmol) e dA.39b (25 mg, 0,040 mmol) em THF (8 mL) a 0oC. A reação foi gradualmente aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante 30 minutos. A mistura foi concentrada in vacuo, dissolvida em 1,4-dioxano (8 mL), seguido pela adição de NH3 a 7N em metanol (24 mL). A mistura foi transferida para um tubo vedado e agitada a 90-100oC durante 16 horas, então, esfriada, concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 7-[1-(4-metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7- deaza-2’-deoxiadenosina dA.40 (38 mg, 61%, mistura a 1:1 de diastereômeros) como um óleo viscoso. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 8,06 e 8,05 (2 s, 1 H, H-2), 7,57 e 7,54 (2 d, J = 8,8 Hz, 1 H, Ph-H), 7,47 e 7,44 (2 d, J = 2,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,33 e 7,27 (2 dd, J = 8,8, 2,6 Hz, 1 H, Ph-H), 7,18 e 7,15 (2 s, 1 H, H-8), 6,63 (bs, 2 H, D2O permutável, 6-NH2), 6,43 (m, 1 H, H-1’), 5,24 (m, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 5,03 (m, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,55 (m, 2 H, Ph-CH, 7-CH2a), 4,30 (m, 2 H, 7-CH2b e H-3’), 3,86 e 3,84 (2 s, 3 H, MeO), 3,78 (m, 1 H, H-4’), 3,48 (m, 2 H, H-5’), 2,45 (m, 1 H, H-2’a), 2,12 (m, 1 H, H-2’b), 1,93 (m, 1 H, CH(CH3)2), 0,88 (m, 3 H, CH3), 0,74 e 0,71 (2 d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) para diastereômeros: δ 158,46 e 158,40 (C), 158,40 (C), 150,28 e 150,25 (CH), 149,97 e 149,78 (C), 149,28 (C), 129,19 e 129,16 (CH), 126,69 e 126,56 (C), 121,36 e 121,02 (CH), 118,11 e 117,99 (CH), 111,20 e 110,95 (C), 107,27 e 107,20 (CH), 102,40 e 102,36 (C), 86,87 e 86,83 (CH), 84,42 e 84,25 (CH), 79,47 e 78,73 (CH), 70,97 (CH), 63,00 e 62,46 (CH2), 61,73 e 61,64 (CH2), 54,30 (CH3), 39,16 e 38,99 (CH2), 33,71 e 33,68 (CH), 17,29 (CH3), 16,71 e 16,66 (CH3). ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C23H30N5O7 [M+H]+, a massa calculada foi 488,2145 e a massa observada foi 488,2466,

[0295] 7-[1-(4-Metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza- 2-deoxiadenosina-5’-trifosfato (WW6p087 ds1 & ds2): POCI3 (11 μL, 0,12 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dA.40 (28 mg, 0,06 mmol) em trimetilfosfato (0,35 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (100 μL) em DMF anidra (1,0 mL) foi adicionada. Após 10 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% de bicarbonato de trietilamônio a 0,1 M (TEAB) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB a 1,5 M durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 7-[1-(4- metóxi-2-nitrofenil)-2-metil-propilóxi]metil-7-deaza-2’-deoxiadenosina- 5’-trifosfato WW6p087 como uma mistura de dois diastereômeros, os quais foram separados por meio de HPLC de fase invertida sobre uma coluna Perkin Elmer Aquapore OD-300 (7 μm, 250 x 4,6 mm) para proporcionar o diastereômero único WW6p087 ds1 (eluição rápida) e WW6p087 ds2 (eluição lenta). Fase móvel: A, acetato de trietilamônio a 100 mM (TEAA) em água; B, TEAA a 100 mM em água/CH3CN (30:70). Exemplo 9 - Síntese de Análogos Quimicamente Cliváveis Síntese de 5-(benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato

Esquema 30. Síntese de 5-(benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato. (i) álcool benzílico, puro, 112oC, 44%; (ii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0296] 5-(Benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n1): Composto dU.x0 (381 mg, 0,586 mmol) e álcool benzílico (634 mg, 5,864 mmol) foram aquecidos puros a 112oC durante 30 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de diclorometano e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 5- (benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n1 (89 mg, 44%). Deve ser notado que dU.n1 é conhecido (por exemplo, veja Mel’nik et al., 1991, o qual é incorporado aqui por referência), mas foi obtido de uma forma diferente daquela reportada no mesmo). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 11,40 (s, 1 H, D2O permutável, 3-NH), 7,94 (s, 1 H, H-6), 7,30 (m, 5 H, Ph-H), 6,17 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 5,26 (d, J = 4,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 5,04 (t, J = 5,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,49 (s, 2 H, PhCH2), 4,24 (m, 1 H, H-3’), 4,17 (m, 2 H, 5-CH2a e 5-CH2b), 3,79 (m, 1 H, H-4’), 3,57 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,10 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 165,29 (C), 152,24 (C), 141,23 (CH), 139,62 (C), 129,52 (CH), 129,05 (CH), 128,84 (CH), 112,44 (C), 89,04 (CH), 86,73 (CH), 73,69 (CH2), 72,27 (CH), 65,95 (CH2), 62,92 (CH2), 41,50 (CH2).

[0297] 5-(Benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato (WW5p145): POCl3 (8 μL, 0,086 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.n1 (15 mg, 0,043 mmol) e esponja de prótons (18 mg, 0,086 mmol) em trimetilfosfato (0,35 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (100 μL) em DMF anidra (1 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 5- (benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato WW5p145. 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 7,82 (s, 1 H, H-6), 7,26 (m, 5 H, Ph-H), 6,14 (t, J = 6,8 Hz, 1 H, H-1’), 4,51 (m, 1 H, H-3’), 4,5 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,31 (2 d, 2 H, 5- CH2), 4,08 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 2,21 (m, 2 H, H-2’); 31P RMN (162 Hz, D2O): δ -9,79 (d, J = 19,4 Hz), -11,67 (d, J = 21,0 Hz), -23,13 (t, J = 21,0 Hz). Síntese de 5-(1-fenil-2-metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato

Esquema 31. Síntese de 5-(1-fenil-2-metil-propóxi)metil-2’- deoxiuridina-5’-trifosfato. (i) 2-metil-1-fenil-1-propanol, puro, 108-114oC, 12%; (ii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0298] 5-(1-Fenil-2-metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n2): Composto dU.x0 (0,331 g, 0,51 mmol) e 2-metil-1-fenil-1-propanol (1,238 g, 8,24 mmol) foram aquecidos puros a 108-114oC durante uma hora sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 5-(1-fenil-2-metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n2 (26 mg, 12%, mistura a 1:1 de diastereômeros). 3’,5’-O-Bis-(terc- butildimetilsilil)-5-(1-fenil-2-metil-propilóxi)metil-2’-deóxi-uridina (77 mg, 24%, mistura a 1:1 de diastereômeros) e (3’ ou 5’)-O-(terc- butildimetilsilil)-5-(1-fenil-2-metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina (46 mg, 18%, mistura a 1:1 de diastereômeros) foram também obtidas a partir da reação. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para dU.n2 (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 11,31 (br s, 1 H, D2O permutável, 3-NH), 7,77 (2 s, 1 H, H-6), 7,29 (m, 5 H, Ph-H), 6,14 (m, 1 H, H-1’), 5,25 (d, J = 4,4 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 4,98 (m, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,22 (m, 1 H, H-3’), 4,00 (m, 1 H, PhCH), 3,91 (m, 2 H, 5-CH2a e 5-CH2b), 3,77 (m, 1 H, H-4’), 3,54 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,06 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 1,83 (m, 2 H, CH(CHβ)2), 0,88 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,66 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3).

[0299] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) durante 3’,5’-O-bis-(terc- butildimetilsilil)-5-(1-fenil-2-metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 9,07 e 9,06 (2 s, 1 H, 3-NH), 7,95 e 7,53 (2 s, 1 H, H-6), 7,29 (m, 5 H, Ph-H), 6,29 (m, 1 H, H-1’), 4,24 (m, 1 H, H- 3’), 4,03 (m, 4 H, 5-CH2a, 5-CH2b, PhCH e H-4’), 3,77 (AB dd, J = 11,2 e 3,4 Hz, 1 H, H-5’a), 3,75 (AB dd, J = 11,2 e 4,4 Hz, 1 H, H-5’b), 2,29 (m, 1 H, H-2’a), 1,98 (m, 1 H, H-2’b), 1,04 e 1,01 (2 d, J = 6,4 e 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,89 e 0,88 (2 s, 9 H, (CH3)3C), 0,74 e 0,73 (2 d, J = 6,8 e 6,4 Hz, 3 H, CH3) 0,10 e 0,09 (2 s, 6 H, CH3Si), 0,08 e 0,07 (2 s, 3 H, CH3Si), 0,06 e 0,05 (2 s, 3 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) durante 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(1-fenil-2-metil- propilóxi)metil-2’-deoxiuridina (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 162,51 (C), 150,20 e 150,15 (C), 140,83 e 140,79 (C), 137,28 e 137,19 (CH), 128,15 e 128,11 (CH), 127,54 (CH), 127,45 (CH), 112,41 (C), 88,40 e 88,31 (CH), 87,83 e 87,78 (CH), 85,38 e 85,30 (CH), 72,49 e 72,41 (CH), 63,64 e 63,57 (CH2), 63,22 (CH2), 40,79 (CH2), 34,82 e 34,79 (CH), 25,93 e 25,92 (C(CH3)3), 25,76 e 25,72 (C(CH3)3), 19,20 e 19,17 (CH3), 19,00 (CH3), 18,38 (C), 18,00 (C), -4,65 (CH3), -4,80 (CH3), -5,35 e -5,38 (CH3) , -5,40 e -5,44 (CH3).

[0300] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) for (3’ ou 5’)-O-(terc- butildimetilsilil)-5-(1-fenil-2-metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina (mistura a 1:1 de diastereômeros): δ 9,09 (s, 1 H, 3-NH), 7,61 (s, 1 H, H-6), 7,28 (m, 5 H, Ph-H), 6,18 (m, 1 H, H-1’), 4,51 (m, 1 H, H-3’), 4,09 (s, 2 H, 5- CH2a, 5-CH2b), 3,98 (d, J = 7,2 Hz, 1 H, PhCH), 3,93 (m, 1 H, H-4’), 3,90 (m, 1 H, H-5’a), 3,73 (m, 1 H, H-5’b), 2,50 (br, 1 H, 3’- ou 5’-OH), 2,30 (m, 1 H, H-2’a), 1,98 (m, 2 H, H-2’b e CH(CH3)2), 1,01 (d, J = 6,4 Hz, 3 H, CH3), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,74 (d, J = 6,8 Hz, 3 H, CH3), 0,10 (s, 3 H, CH3Si), 0,07 e 0,06 (2 s, 3 H, CH3Si).

[0301] 5-(1-Fenil-2-metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato (WW5p143): POCI3 (6 μL, 0,063 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.n2 (15 mg, 0,032 mmol) e esponja de prótons (14 mg, 0,063 mmol) em trimetilfosfato (0,4 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Mais POCl3 (6 μL, 0,063 mmol) foi adicionado duas vezes em intervalos de uma horas. Uma solução de bis-pirofosfato de tri-n-butilamônio (285 mg, 0,6 mmol) e tri-n-butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 5-(1-fenil-2- metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5-’trifosfato WW5p143 (mistura a 1:1 de diastereômeros); 31P RMN (162 Hz, D2O): δ -10,88 (m), -11,33 (m), -23,08 (m). Síntese de 5-(2-metilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato

Esquema 32. Síntese de 5-(2-metilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’- trifosfato. (i) álcool 2-metil benzílico, puro, 110oC; (ii) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 38%; (iii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0302] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(2-metilbenzilóxi)metil-2’- deoxiuridina (dU.n3) e (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimetilsilil)-5-(2- metilbenzilóxi) metil-2’-deoxiuridina (dU.n4): Composto dU.x0 (0,438 g, 0,67 mmol) e álcool 2-metil benzílico (0,823 g, 6,74 mmol) foram aquecidos puros a 110oC durante 45 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(2-metilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n3 (20 mg, 5%) e (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimetilsilil)-5-(2- metilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n4 (43 mg, 14%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) for dU.n3: δ 8,42 (s, 1 H, NH), 7,66 (s, 1 H, H-6), 7,30 (m, 1 H, Ph-H), 7,18 (m, 3 H, Ph-H), 6,28 (t, 1 H, H-1’), 4,59 (2 d, 2 H, Ph- CH2), 4,38 (m, 1 H, H-3’), 4,27 (2 d, 2 H, 5-CH2), 3,94 (m, 1 H, H-4’), 3,75 (m, 2 H, H-5’), 2,34 (s, 3 H, CH3), 2,26 (m, 1 H, H-2’a), 2,0 (m, 1 H, H-2’b), 0,89 e 0,90 (2 s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,09 e 0,08 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,07 e 0,06 (2 s, 6 H, (CH3)2Si); 1H RMN (400 MHz, CDCl3) for dU.n4: δ 8,67 (s, 1 H, NH), 7,73(s, 1 H, H-6), 7,33 (m, 1 H, Ph-H), 7,22 (m, 3 H, Ph-H), 6,16 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1’), 4,6 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,46 (m, 1 H, H-3’), 4,34 (2 d, 2 H, 5-CH2), 3,92 (m, 1 H, H-4’), 3,81 (m, 1 H, H-5’a), 3,67 (m, 1 H, H-5’b), 2,35 (s, 3 H, CH3), 2,30 (m, 1 H, H-2’a), 2,24 (m, 1 H, H-2’b), 0,89 (1 s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,07 (2 s, 6 H, (CH3)2Si).

[0303] 5-(2-Metilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n5): Uma solução de composto dU.n3 (20 mg, 0,034 mmol) em THF (2 mL) foi tratada com n-Bu4NF (32 mg, 0,1 mmol) em temperatura ambiente durante três horas. Separadamente, uma solução de composto dU.n4 (43 mg, 0,09 mmol) em THF (4 mL) foi também tratada com n-Bu4NF (64 mg, 0,2 mmol) em temperatura ambiente durante três horas. As duas misturas de reação foram combinadas, concentradas in vacuo e purificadas por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel para proporcionar 5-(2-metilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n5 (17 mg, 38%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 11,38 (s, 1 H, D2O permutável, NH), 7,93 (s, 1 H, H-6), 7,29 (m, 1 H, Ph-H), 7,15 (m, 3 H, Ph-H), 6,15 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 5,24 (d, J = 4,4 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’- OH), 5,02 (t, 1 H, J = 5,2 Hz, D2O permutável, 5’-OH), 4,46 (s, 2 H, Ph- CH2), 4,22 (m, 1 H, H-3’), 4,16 (2 d, 2 H, 5-CH2), 3,77 (m, 1 H, H-4’), 3,55 (m, 2 H, H-5’), 2,24 (s, 1 H, CH3), 2,08 (m, 2 H, H-2’).

[0304] 5-(2-Metilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato (WW147): POCI3 (8 μL, 0,083 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.n5 (15 mg, 0,041 mmol) e esponja de prótons (18 mg, 0,083 mmol) em trimetilfosfato (0,35 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Mais POCl3 (4 μL, 0,041 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada durante mais duas horas a 0oC. Uma solução de bis-pirofosfato de tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (100 μL) em DMF anidra (1 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 5-(2-metilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato WW5p147, 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 7,96 (s, 1 H, H-6), 7,32 (m, 1 H, Ph-H), 7,24 (m, 3 H, Ph-H), 6,28 (t, J = 6,8 Hz, 1 H, H-1’), 4,63 (m, 3 H, Ph-CH2 e H-3’), 4,43 (2 d, 2 H, 5-CH2), 4,20 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 2,36 (m, 2 H, H-2’), 2,31 (s, 3 H, CH3); 31P RMN (162 Hz, D2O): δ -7,29 (m), - 10,66 (d, J = 17,8 Hz), -21,4 (m). Síntese de 5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato

Esquema 33. Síntese de 5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina- 5’-trifosfato (i) n-BuLi, formaldeído a menos 78oC, 59%; (ii) álcool 2- isopropil benzílico, puro, 110-112oC, 12%; (iii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0305] Álcool 2-isopropil benzílico: A uma solução de 1-bromo-2- isopropilbenzeno (2,50 g, 12,56 mmol) em THF anidro (40 mL), 2,2’- dipiridila (aproximadamente 2 mg) foi adicionada sob uma atmosfera de nitrogênio (Zhi et al., 2003, o qual é incorporado aqui por referência). A mistura foi esfriada para menos 78oC e uma solução de n-butillítio (5,52 mL, 2,5 M em hexanos, 13,82 mmol) foi adicionada gota a gota via uma seringa dentro do período de dez minutos. Quando de adição, a mistura foi agitada durante 30 minutos, então, aquecida para menos 30oC e um fluxo de formaldeído (gerado a partir de 1,77 g de paraformaldeído mediante aquecimento a 160oC) foi passado através da solução até que a cor vermelho profundo desaparecesse completamente. A mistura foi dissipada com cloreto de amônio saturado (5 mL), então, entornada em salmoura (15 mL). A camada orgânica foi separada; a camada aquosa foi extraída duas vezes com diclorometano (20 mL cada); os extratos combinados foram secos sobre Na2SO4 anidro, evaporados e purificados por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar álcool 2-isopropil benzílico (1,11 g, 59%) como um óleo. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,30 (m, 3 H, Ph-H), 7,18 (m, 3 H, Ph-H), 4,75 (s, 2 H, CH2OH), 3,27 (set, J = 6,6 Hz, 1 H, CH(CHβ) 2), 1,53 (s, 1 H, CH2OH), 1,26 (d, J = 6,6 Hz, 1 H, CH(CH3) 2).

[0306] 5-(2-Isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n6): Composto dU.x0 (0,331 g, 0,51 mmol) e álcool 2-isopropil benzílico (1,238 g, 8,24 mmol) foram aquecidos puros a 110-112oC durante 1,5 horas sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 5-(2- isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n6 (33 mg, 12%). 3’,5’-O-bis- (terc-butildimetilsilil)-5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (134 mg, 29%) e (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimetilsilil)-5-(2-isopropil- benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (98 mg, 26%) foram também obtidas a partir da reação. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para dU.n6: δ 11,41 (s, 1 H, D2O permutável, NH), 7,94 (s, 1 H, H-6), 7,29 (m, 3 H, Ph-H), 7,14 (m, 1 H, Ph-H), 6,16 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 5,26 (t, J = 4,4 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 5,03 (t, J = 5,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’- OH), 4,51 (s, 2 H, CH2O), 4,24 (m, 1 H, H-3’), 4,18 (AB d, J = 12,7 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,15 (AB d, J = 12,7 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,78 (m, 1 H, H-4’), 3,56 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 3,15 (sep, J = 6,8 Hz, 1 H, CH(CH3)2), 2,09 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 1,15 (d, J = 6,8 Hz, 6 H, CH(CH3)2); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) para dU.n6: δ 163,77 (C), 150,77 (C), 147,85 (C), 139,85 (CH), 134,29 (C), 129,41 (CH), 128,19 (CH), 125,19 (CH), 125,03 (CH), 110,97 (C), 87,56 (CH), 85,22 (CH), 70,85 (CH), 70,35 (CH2), 64,29 (CH2), 61,47 (CH2), 40,01 (CH2), 28,39 (CH), 23,09 (CH3).

[0307] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) durante 3’,5’-O-bis-(terc-butildi- metilsilil)-5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina: δ 9,60 (s, 1 H, 3- NH), 7,64 (s, 1 H, H-6), 7,28 (m, 3 H, Ph-H), 7,28 (dt, J = 7,1 e 1,8 Hz, 1 H, Ph-H), 6,29 (dd, J = 7,7 e 5,9 Hz, 1 H, H-1’), 4,64 (s, 2 H, CH2O), 4,38 (m, 1 H, H-3’), 4,31 (AB d, J = 12,7 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,27 (AB d, J = 12,7 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,93 (m, 1 H, H-4’), 3,74 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 3,24 (set, J = 6,8 Hz, 1 H, CH(CH3)2), 2,28 (m, 1 H, H-2’a), 2,00 (m, 1 H, H-2’b), 1,23 (d, J = 6,8 Hz, 6 H, CH(CH3)2), 0,89 (s, 9 H, (CHβ^C), 0,88 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,09 (s, 3 H, CH3Si), 0,07 (s, 3 H, CH3Si), 0,06 (s, 3 H, CH3Si), 0,05 (s, 3 H, CH3Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) durante 3’,5’- O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina: δ 162,94 (C), 150,29 (C), 147,74 (C), 138,11 (CH), 134,27 (C), 129,41 (CH), 128,40 (CH), 125,54 (CH), 125,38 (CH), 111,90 (C), 87,81 (CH), 85,28 (CH), 72,24 (CH), 71,08 (CH2), 64,44 (CH2), 62,99 (CH2), 41,08 (CH2), 28,63 (CH), 25,92 (C(CH3)3), 25,74 (C(CH3)3), 23,99 (CH3), 18,36 (C), 17,98 (C), -4,67 (CH3), -4,84 (CH3), -5,44 (CH3) , -5,52 (CH3).

[0308] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para (3’ ou 5’)-O-(terc-butildi- metilsilil)-5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina: δ 11,42 (s, 1 H, D2O permutável, NH), 7,89 (s, 1 H, H-6), 7,28 (m, 3 H, Ph-H), 7,12 (m, 1 H, Ph-H), 6,14 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 5,07 (t, J = 5,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,51 (s, 2 H, CH2O), 4,41 (m, 1 H, H-3’), 4,31 (AB d, J = 12,7 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,15 (AB d, J = 12,7 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,76 (m, 1 H, H-4’), 3,56 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 3,14 (set, J = 6,8 Hz, 1 H, CH(CH3)2), 2,16 (m, 1 H, H-2’a), 2,09 (m, 1 H, H-2’b), 1,14 (d, J = 6,8 Hz, 6 H, CH(CH3)2), 0,86 (s, 9 H, (CH3W 0,06 (s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) para (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimetilsilil)-5-(2- isopropilbenzilóxi)metil-2’-deóxi-uridina: δ 162,77 (C), 150,30 (C), 147,76 (C), 138,79 (CH), 134,26 (C), 129,32 (CH), 128,54 (CH), 125,60 (CH), 125,48 (CH), 111,92 (C), 87,77 (CH), 87,14 (CH), 71,72 (CH), 71,03 (CH2), 64,40 (CH2), 61,98 (CH2), 40,68 (CH2), 28,68 (CH), 25,71 (C(CH3)3), 23,99 (CH3), 17,93 (C), -4,73 (CH3), -4,88 (CH3).

[0309] Compostos 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(2- isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (134 mg, 0,22 mmol) e (3’ ou 5’)- O-(terc-butildimetilsilil)-5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (98 mg, 0,19 mmol) foram dissolvidos em THF (5 mL) e uma solução de tri- hidrato de fluoreto de tetra-n-butilamônio (323 mg, 1,05 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel a fim de proporcionar 5-(2- isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n6 (108 mg, 67%).

[0310] 5-(2-Isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’trifosfato (WW5p149): POCI3 (15 μL, 0,164 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.n6 (32 mg, 0,082 mmol) e esponja de prótons (35 mg, 0,164 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante 2 horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (356 mg, 0,75 mmol) e tri-n-butilamina (150 μL) em DMF anidra (1,5 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em uma mistura de água (5 mL) e acetonitrila (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato WW5p149. 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 7,98 (s, 1 H, H-6), 7,36 (m, 3 H, Ph-H), 7,21 (m, 1 H, Ph-H), 6,27 (t, J = 6,8 Hz, 1 H, H-1’), 4,64 (m, 3 H, Ph-CH2 eH-3’), 4,43 (AB d, 1 H, J = 12 Hz, 5-CH2a), 4,39 (AB d, 1 H, J = 12 Hz, 5-CH2b), 4,25 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 2,34 (m, 2 H, H-2’), 1,15 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3); 31P RMN (162 Hz, D2O): δ -5,11 (d, J = 21,0 Hz), -10,5 (d, J = 19,4 Hz), -20,94 (t, J = 21,0 Hz). Síntese de 5-(2-terc-butilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’- trifosfato

Esquema 34. Síntese de 5-(2-terc-butilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina- 5’-trifosfato. (i) NaNO2, HBr, 5 -10°C, então, Cu(0), 50°C, 27%; (ii) n- BuLi, formaldeído, menos 78oC, 75%; (iii) álcool 2-terc-butil benzílico, puro, 115-118oC; (iv) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 70%; (v) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3a 1 M.

[0311] 1-Bromo-2-terc-butilbenzeno: A uma solução de 2-terc- butilanilina (7,46 g, 50 mmol 15,6 mL) em ácido hidrobrômico (40% peso/peso, 15 mL) esfriada para <5°C (banho de gelo/sal), uma solução de 7,55 g (0,11 mol) de nitrito de sódio em 10 mL de água foi adicionada em uma taxa tal que a temperatura não excedia 10oC (tempo de adição de aproximadamente duas horas). Quando a diazotização estava completa, 0,20 g de pó de cobre foram adicionados. (CUIDADO: a solução foi submetida a refluxo cuidadosamente em virtude da evolução vigorosa de gás!). Quando a evolução vigorosa de nitrogênio terminou, o sistema foi mantido a 50°C durante 30 minutos e foi, então, diluído com 80 mL de água e extraído três vezes com dietil éter (100 mL cada). A camada orgânica foi lavada com solução de KOH a 10%; seca sobre Na2SO4, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia sobre sílica-gel. O produto obtido foi ainda destilado a 85°C (3 mm Hg) para proporcionar 1-bromo-2-terc-butilbenzeno (2,88 g, 27%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,58 (m, 1 H, Ph-H), 7,45 (m, 1 H, Ph-H), 7,24 (m, 1 H, Ph-H), 7,02 (m, 1 H, Ph-H), 1,51 (s, 9 H, C(CH3)3).

[0312] Álcool 2-terc-butil benzílico: A uma solução de 1-bromo-2- terc-butilbenzeno (2,88 g, 13,51 mmol) em THF anidro (45 mL) 2,2’- dipiridila (aproximadamente 10 mg) foi adicionada sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para menos 78oC e uma solução de n-butillítio (2,5 M em hexanos, 5,94 mL, 14,86 mmol) foi adicionada gota a gota via uma seringa dentro do período de dez minutos. Quando de adição, a mistura foi agitada durante 30 minutos, então, aquecida para menos 30oC e um fluxo de formaldeído (gerado a partir de 1,91 g de paraformaldeído mediante aquecimento durante 160oC) foi passado através da solução até que a cor vermelho profundo desaparecesse completamente. A mistura foi dissipada com solução saturada de cloreto de amônio (5 mL), então, entornada em uma mistura de diclorometano (100 mL) e água (50 mL). A fase orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída com diclorometano (20 mL) duas vezes. A fase orgânica combinada foi seca sobre Na2SO4 anidro, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar álcool 2-terc-butil benzílico (1,67 g, 75%) como um óleo. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,50 (m, 1 H, Ph-H), 7,41 (m, 1 H, Ph-H), 7,24 (m, 2 H, Ph-H), 4,93 (d, J = 4,8 Hz, 2 H, CH2OH), 1,54 (br, 1 H, CH2OH), 1,43 (s, 1 H, C(CH3) 3).

[0313] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(2-terc- butilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n7) e (3’ ou 5’)-O-(terc- butildimetilsilil)-5-(2-terc-butilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n8): Composto dU.x0 (230 mg, 0,36 mmol) e álcool 2-terc-butil benzílico (0,49 g, 3,60 mmol) foram aquecidos puros a 118-122oC durante uma hora sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(2-terc-butilbenzilóxi) metil-2’-deoxiuridina dU.n7 (32 mg, 17%) e (3’ ou 5’)-O-(terc- butildimetilsilil)-5-(2-terc-butilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n8 (28 mg, 19%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) for dU.n7: δ 9,28 (s, 1 H, 3-NH), 7,77 (s, 1 H, H-6), 7,43 (m, 2 H, Ph-H), 7,25 (m, 2 H, Ph-H), 6,16 (t, J = 6,6 Hz, 1 H, H-1’), 4,84 (AB d, J = 11,2 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,81 (AB d, J = 11,2 Hz, 1 H, 5-CH2b), 4,40 (m, 1 H, H-3’), 4,36 (s, 2 H, CH2O), 3,91 (m, 1 H, H-4’), 3,76 (AB d, J = 12,0 Hz, 1 H, H-5’a), 3,64 (AB d, J = 12,0 Hz, 1 H, H-5’b), 2,27 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 1,40 (s, 9 H, C(CH3)3), 0,89 (s, 9 H, SiC(CH3)3), 0,88 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,09 (s, 3 H, CH3Si), 0,07 (s, 3 H, CH3Si), 0,06 (s, 3 H, CH3Si), 0,05 (s, 3 H, CH3Si); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para dU.n8: δ 11,42 (s, 1 H, D2O permutável, NH), 7,93 (s, 1 H, H-6), 7,42 (m, 1 H, Ph-H), 7,35 (m, 1 H, Ph-H), 7,18 (m, 2 H, Ph- H), 6,15 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 5,08 (t, J = 5,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,66 (s, 2 H, CH2O), 4,41 (m, 1 H, H-3’), 4,26 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,21 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,78 (m, 1 H, H-4’), 3,56 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,18 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 1,34 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,85 (s, 9 H, (CH^CSi), 0,07 (s, 6 H, (CHsJzSi).

[0314] 5-(2-terc-butilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n9): Compostos dU.n7 (32 mg, 0,050 mmol) e dU.n8 (27 mg, 0,052 mmol) foram dissolvidos em THF (4 mL) e uma solução de tri-hidrato de fluoreto de tetra-n-butilamônio (65 mg, 0,204 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, então, concentrada in vacuo e purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel a fim de proporcionar 5-(2-terc- butilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n9 (108 mg, 67%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ 8,10 (s, 1 H, H-6), 7,46 (m, 1 H, Ph-H), 7,39 (m, 1 H, Ph-H), 7,20 (m, 1 H, Ph-H), 6,28 (t, 1 H, J = 6,6 Hz, H-1’), 4,79 (s, 2 H, CH2O), 4,37 (m, 3 H, 5-CH2a, 5-CH2b e H-3’), 3,92 (m, 1 H, H-4’), 3,76 (AB dd, J = 12,4 e 3,2 Hz, 1 H, H-5’a), 3,70 (AB dd, J = 12,4 e 3,6 Hz, 1 H, H-5’a, H-5’b), 2,22 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 1,39 (s, 9 H, C(CH3)3).

[0315] 5-(2-terc-butilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato (WW6p024): POCI3 (10 μL, 0,11 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.n9 (30 mg, 0,074 mmol) e esponja de prótons (32 mg, 0,15 mmol) em trimetilfosfato (0,4 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (285 mg, 0,6 mmol) e tri-n-butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em uma mistura de água (5 mL) e acetonitrila (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 5-(2-terc-butilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato WW6p024, 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 7,89 (s, 1 H, H-6), 7,34 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, Ph-H), 7,32 (d, 1 H, J = 2,0 Hz, Ph-H), 7,15 (m, 2 H, Ph-H), 6,17 (t, J = 6,8 Hz, 1 H, H-1’), 4,64 (2 d, 2 H, Ph-CH2), 4,48 (m, 1 H, H- 3’), 4,32 (2 d, 2 H, 5-CH2), 4,04 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 2,23 (m, 2 H, H- 2’), 1,20 (s, 9 H, C(CH3)3); 31P RMN (162 Hz, D2O): δ -11,76 (m), -12,41 (d, J = 19,4 Hz), -24,0 (t, J = 19,4 Hz). Síntese de 5-(2-fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato

Esquema 35. Síntese de 5-(2-fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’- trifosfato (i) 2-bifenilmetanol, puro, 118-122oC, 15%; (ii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3a 1 M.

[0316] 5-(2-Fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n10): Composto dU.x0 (0,916 g, 1,41 mmol) e 2-bifenilmetanol (2,596 g, 14,10 mmol) foram aquecidos puros a 118 -122oC durante 1,5 horas sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 5-(2-fenilbenzilóxi)metil- 2’-deoxiuridina dU.n10 (87 mg, 15%). 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)- 5-(2-fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (134 mg, 19%) e (3’ ou 5’)-O- (terc-butildimetilsilil)-5-(2-fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (263 mg, 36%) foram também obtidas a partir da reação. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para dU.n10: δ 11,40 (s, 1 H, D2O permutável, NH), 7,91 (s, 1 H, H-6), 7,39 (m, 9 H, Ph-H), 6,14 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 5,25 (t, J = 4,4 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 5,02 (t, J = 5,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,33 (s, 2 H, CH2O), 4,21 (m, 1 H, H-3’), 4,15 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,08 (AB d, J = 12,7 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,78 (m, 1 H, H-4’), 3,55 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,05 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b); 1H RMN (400 MHz, CDCl3) durante 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(2- fenilbenzilóxi) metil-2’-deoxiuridina: δ 8,75 (s, 1 H, 3-NH), 7,63 (s, 1 H, H-6), 7,37 (m, 9 H, Ph-H), 6,29 (dd, J = 7,6 e 6,0 Hz, 1 H, H-1’), 4,49 (s, 2 H, CH2O), 4,39 (m, 1 H, H-3’), 4,24 (AB d, J = 12,7 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,19 (AB d, J = 12,7 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,96 (m, 1 H, H-4’), 3,76 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,28 (m, 1 H, H-2’a), 2,03 (m, 1 H, H-2’b), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,09 (s, 3 H, CH3Si), 0,06 (s, 3 H, CH3Si), 0,05 (s, 3 H, CH3Si), 0,02 (s, 3 H, CH3Si): 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para (3’ ou 5’)-O-(terc-butildimetilsilil)-5-(2- fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina: δ 11,42 (s, 1 H, D2O permutável, NH), 7,86 (s, 1 H, H-6), 7,39 (m, 9 H, Ph-H), 6,13 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H- 1’), 5,08 (t, J = 5,2 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,39 (m, 1 H, H-3’), 4,33 (s, 2 H, CH2O), 4,15 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,09 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,77 (m, 1 H, H-4’), 3,54 (m, 2 H, H-5’a e H- 5’b), 2,08 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b), 0,87 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,07 (2 s, 6 H, (CH3)2Si).

[0317] 5-(2-Fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato (WW6p010): POCI3 (9 μL, 0,1 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.n10 (28 mg, 0,066 mmol) e esponja de prótons (28 mg, 0,13 mmol) em trimetilfosfato (0,4 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (285 mg, 0,6 mmol) e tri-n-butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em uma mistura de água (6 mL) e acetonitrila (4 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 5-(2-fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato WW6p010, 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 7,77 (s, 1 H, H-6), 7,56 (m, 1 H, Ph-H), 7,44 (m, 2 H, Ph-H), 7,39 (m, 3 H, Ph-H), 7,27 (m, 3 H, Ph-H), 6,25 (t, J = 6,8 Hz, 1 H, H-1’), 4,62 (m, 1 H, H-3’), 4,41 (AB d, 1 H, J = 11,2 Hz, 5-CH2a), 4,36 (AB d, 1 H, J = 12 Hz, 5-CH2b), 4,24 (m, 1 H, H- 4’), 4,17 (m, 2 H, H-5’), 2,30 (m, 2 H, H-2’); 31P RMN (162 Hz, D2O): δ - 5,59 (d, J = 19,4 Hz), -10,6 (d, J = 19,4 Hz), -21,04 (t, J = 19,4 Hz). Síntese de 5-(2,6-dimetilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato

Esquema 36. Síntese de 5-(2,6-dimetilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina- 5’-trifosfato: (i) BH3(SMe2), THF, refluxo, 51%; (ii) álcool 2,6-dimetil benzílico, puro, 118-120oC, 80%; (iii) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 67%; (iv) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0318] álcool 2,6-dimetil benzílico: álcool 2,6-dimetil benzílico foi preparado de acordo com Beaulieu et al. (2000, o qual é incorporado aqui por referência), mas não obteve sucesso, de modo que um agente de redução diferente foi usado. A uma suspensão de ácido 2,6- dimetilbenzoico (1,00 g, 6,65 mmol) em THF anidro (10 mL) uma solução de BH3(SMe2) em THF foi cuidadosamente adicionada sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi aquecida em refluxo durante 16 horas, então, dissipada com cloreto de amônio saturado (5 mL) e HCl a 2 M (10 mL). (CUIDADO: evolução vigorosa de gás!). A camada orgânica foi separada; a camada aquosa foi extraída três vezes com acetato de etila (45 mL cada); os extratos combinados foram lavados duas vezes com bicarbonato de sódio saturado (20 mL cada), secos sobre Na2SO4 anidro, evaporados e purificados por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar álcool 2,6-dimetil benzílico (0,50 g, 51%) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,08 (m, 3 H, Ph-H), 4,70 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,05 (br s, 1 H, OH), 2,40 (s, 6 H, CH3).

[0319] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(2,6-dimetilbenzilóxi)metil- 2’-deoxiuridina (dU.n11): Composto dU.x0 (230 mg, 0,36 mmol) e álcool 2,6-dimetil benzílico (0,49 g, 3,60 mmol) foram aquecidos puros a 118- 122oC durante uma hora sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(2,6- dimetilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n11 (170 mg, 80%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,94 (s, 1 H, 3-NH), 7,63 (s, 1 H, H-6), 7,07 (m, 3 H, Ph-H), 6,28 (dd, J = 7,6 e 5,6 Hz, 1 H, H-1’), 4,63 (s, 2 H, CH2O), 4,38 (m, 1 H, H-3’), 4,32 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,27 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,92 (m, 1 H, H-4’), 3,74 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,39 (s, 6 H, 2 CH3), 2,24 (m, 1 H, H-2’a), 2,00 (m, 1 H, H-2’b), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,11 (s, 3 H, CH3Si), 0,09 (s, 3 H, CH3Si), 0,08 (s, 3 H, CH3Si), 0,06 (s, 3 H, CH3Si).

[0320] 5-(2,6-Dimetilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n12): A uma solução de composto dU.n11 (131 mg, 0,22 mmol) em THF (4 mL), uma solução de tri-hidrato de fluoreto de tetra-n-butilamônio (171 mg, 0,54 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel a fim de proporcionar 5-(2,6-dimetilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n12 (108 mg, 67%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ 8,08 (s, 1 H, H-6), 7,02 (m, 3 H, Ph-H), 6,26 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1’), 4,61 (s, 2 H, CH2O), 4,38 (m, 1 H, H-3’), 4,33 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2a), 4,15 (AB d, J = 11,6 Hz, 1 H, 5-CH2b), 3,91 (m, 1 H, H-4’), 3,77 (AB dd, J = 12,0 e 3,2 Hz, 1 H, H-5’a), 3,70 (AB dd, J = 12,0 e 3,6 Hz, 1 H, H-5’a, H-5’b), 2,36 (s, 6 H, CH), 2,24 (m, 2 H, H-2’a e H-2’b); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 163,80 (C), 150,76 (C), 140,85 (CH), 137,81 (C), 133,73 (C), 127,81 (CH), 127,72 (CH), 110,82 (C), 87,56 (CH), 85,22 (CH), 70,74 (CH), 66,33 (CH2), 64,47 (CH2), 61,38 (CH2), 40,02 (CH2), 18,36 (CH3).

[0321] 5-(2,6-Dimetilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato (WW6p015): POCI3 (11 μL, 0,12 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dU.n12 (30 mg, 0,08 mmol) e esponja de prótons (34 mg, 0,16 mmol) em trimetilfosfato (0,4 mL) e a reação foi agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (285 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) foi adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em uma mistura de água (5 mL) e acetonitrila (5 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para proporcionar 5-(2,6-dimetilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato WW6p015, 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,0 (s, 1 H, H-6), 7,16 (m, 1 H, Ph-H), 7,07 (m, 3 H, Ph-H), 6,30 (t, 1 H, J = 7,2 Hz, H-1’), 4,64 (m, 3 H, Ph-CH2 e H-3’), 4,47 (AB d, 1 H, J = 7,2 Hz, 5-CH2a), 4,40 (AB d, 1 H, J = 7,2 Hz, 5-CH2b), 4,20 (m, 3 H, H-4’ e H-5’), 2,38 (m, 2 H, H-2’), 2,33 (s, 6 H, CH3); 31P RMN (162 Hz, D2O): δ -8,94 (d, J = 19,4 Hz), -10,78 (d, J = 19,4 Hz), -22,08 (d, J = 19,4 Hz). Síntese de 5-(3-fenil-2-propenilóxi)metil-2’-deoxiuridina e reação a seu 5’-trifosfato

Esquema 37. Síntese de 5-(3-fenil-2-propenilóxi)metil-2’-deoxiuridina- 5’-trifosfato. (i) álcool cinamílico, puro, 104oC, 36%; (ii) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 76%; (iii) POCl3, esponja de prótons, (MeO)3PO, 0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; HNEt3HCO3 a 1 M.

[0322] 3’,5’-O-Bis-(terc-butildimetilsilil)-5-(3-fenil-2- propenilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n13): Composto dU.x0 (500 mg, 0,77 mmol) e álcool cinamílico (331 mg, 2,17 mmol) foram aquecidos puros a 104oC durante uma hora sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente, dissolvida em uma quantidade mínima de acetato de etila e purificada por meio de cromatografia em sílica-gel para proporcionar 3’,5’-O-bis-(terc- butildimetilsilil)-5-(3-fenil-2-propenilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n13 (169 mg, 36%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,32 (s, 3-NH), 7,68 (s, 1 H, H-6), 7,31 (m, 5 H, Ph-H), 6,64 (d, J = 16,0 Hz, 1 H, = CH), 6,28 (m, 2 H, H-1’ e = CH), 4,40 (m, 1 H, H-3’), 4,28 (m, 2 H, 5-CH2a e 5-CH2b), 4,23 (m, 2 H, CH2O), 3,94 (m, 1 H, H-4’), 3,80 (AB dd, J = 11,2 e 3,2 Hz, 1 H, H-5’a), 3,75 (AB dd, J = 11,2 e 3,2 Hz, 1 H, H-5’b), 2,27 (m, 1 H, H- 2’a), 2,01 (m, 1 H, H-2’b), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,88 (s, 9 H, (CH3)3C), 0,08 (s, 3 H, CH3Si), 0,07 (s, 3 H, CH3Si), 0,05 (2 s, 6 H, (CH3)2Si); 13C RMN (100 MHz, CDCI3): δ 162,56 (C), 150,04 (C), 138,34 (CH), 136,58 (C), 133,06 (CH), 128,54 (CH), 127,76 (CH), 126,55 (CH), 125,60 (CH), 111,80 (C), 87,92 (CH), 85,28 (CH), 72,27 (CH), 71,67 (CH2), 64,40 (CH2), 62,99 (CH2), 41,24 (CH2), 25,96 (C(CH3)3), 25,76 (C(CH3)3), 18,42 (C), 18,01 (C), -4,65 (CH3), -4,82 (CH3), -5,40 (CH3) , -5,50 (CH3).

[0323] 5-(3-Fenil-2-propenilóxi)metil-2’-deoxiuridina (dU.n14): A uma solução de composto dU.n13 (138 mg, 0,23 mmol) em THF (2 mL) uma solução de tri-hidrato de fluoreto de tetra-n-butilamônio (321 mg, 0,73 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, então, concentrada in vacuo e purificada por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel a fim de proporcionar 5-(3-fenil-2-propenilóxi)metil-2’-deoxiuridina dU.n14 (65 mg, 76%) como um sólido graxo. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 11,39 (br s, 1 H, D2O permutável, NH), 7,93 (s, 1 H, H-6), 7,44 (m, 2 H, Ph-H), 7,32 (m, 2 H, Ph-H), 7,23 (m, 1 H, Ph-H), 6,64 (d, J = 16,0 Hz, 1 H, = CH), 6,34 (dt, J = 16,0 e 5,7 Hz, 1 H, = CH), 6,16 (t, 1 H, J = 6,7 Hz, H- 1’), 5,24 (d, J = 3,9 Hz, 1 H, D2O permutável, 3’-OH), 5,04 (t, J = 4,9 Hz, 1 H, D2O permutável, 5’-OH), 4,22 (m, 1 H, H-3’), 4,18 (s, 2 H, 5-CH2a e 5-CH2b), 4,11 (d, J = 5,7 Hz, 2 H, CH2), 3,77 (m, 1 H, H-4’), 3,57 (m, 2 H, H-5’a e H-5’b), 2,09 (dd, J = 6,5 e 4,9 Hz, 2 H, H-2’a e H-2’b).

[0324] 5-(3-Fenil-2-propenilóxi)metil-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato: Essa composto não foi feito, mas pode ser sintetizado de acordo com o método a seguir ou uma versão modificada do mesmo: POCI3 (9 μL, 0,1 mmol) poderia ser adicionado a uma solução de composto dU.n14 (28 mg, 0,066 mmol) e esponja de prótons (28 mg, 0,13 mmol) em trimetilfosfato (0,4 mL) e a reação poderia, então, ser agitada a 0oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante duas horas. Uma solução de bis- pirofosfato de tri-n-butilamônio (285 mg, 0,6 mmol) e tri-n-butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) poderia, então, ser adicionada. Após 30 minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH de 7,5; 10 mL) poderia ser adicionado. A reação poderia, então, ser agitada durante uma hora em temperatura ambiente e, então, concentrada in vacuo. O resíduo poderia, então, ser dissolvido em uma mistura de água (6 mL) e acetonitrila (4 mL), filtrado e purificado por meio de cromatografia de troca de ânions usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 10 cm) com um gradiente linear de 25% de acetonitrila/75% bicarbonato de trietilamônio (TEAB, 0,1M) a 25% de acetonitrila/75% de TEAB (1,5 M) durante 240 min a 4,5 ml/min. As frações contendo trifosfato poderiam, então, ser combinadas e liofilizadas para proporcionar 5-(3-fenil-2-propenilóxi)metil-2’- deoxiuridina-5’-trifosfato WW6p014. Exemplo 10 - Resultados de Clivagem Química de Análogos de dU Clivagem química de 5-(benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina

Esquema 38. Clivagem química de 5-(benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina. (i) H2, Pd/C, etanol, 30 minutos, 88%; (ii) H2, Na2PdCl4, anidro etanol, 20 minutos.

[0325] Clivagem química usando catalisador de paládio heterogêneo: A uma solução de 5-(benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (29 mg, 0,082 mmol) em etanol absoluto (2 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio foram adicionados 10 mg de paládio sobre carvão ativado (10 % em peso, 10 mg) (CUIDADO: sólido inflamável! Assegurar manipulação em atmosfera sem oxigênio). A mistura foi submetida a fluxo de gás hidrogênio e agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos enquanto era monitorada por meio de TLC a cada cinco minutos. A mistura foi filtrada, concentrada sob pressão reduzida e seca sob vácuo para proporcionar timidina (18 mg, 88%) que foi identificada através de comparação com a amostra autêntica (TLC e 1H RMN).

[0326] Clivagem química usando catalisador de paládio homogêneo: A uma solução de 5-(benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina (3,48 mg, 0,01 mmol) em etanol absoluto (0,1 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio uma solução de tetracloropaladato de sódio (II) (0,6 mg, 0,002 mmol) em etanol absoluto (0,9 mL) foi adicionada. A mistura foi submetida a fluxo de gás hidrogênio e agitada em temperatura ambiente enquanto era monitorada por meio de TLC a cada cinco minutos. Após 20 minutos, TLC indicou desaparecimento completo de material de iniciação. O único produto da clivagem foi identificado como sendo timidina por meio de comparação com a amostra autêntica quando de TLC. Clivagem química de 5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina

Esquema 39.Clivagem química de 5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’- deoxiuridina (i) H2, Pd/C, etanol, 5 minutos.

[0327] Clivagem química usando catalisador de paládio heterogêneo: A uma solução de 5-(2-isopropilbenzilóxi)metil-2’- deoxiuridina em etanol absoluto (10 mM, 1 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio foi adicionado paládio sobre carvão ativado (10 % em peso, 2 mg) (CUIDADO: sólido inflamável! Assegurar manipulação em atmosfera sem oxigênio). A mistura foi submetida a fluxo de gás hidrogênio e agitada em temperatura ambiente durante cinco minutos enquanto era monitorada por meio de TLC a cada um minuto. Após cinco minutos, TLC indicou desaparecimento completo de material de iniciação. O único produto da clivagem foi identificado como sendo timidina por meio de comparação com a amostra autêntica quando de TLC. Clivagem química de 5-(2-fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina

Esquema 40. Clivagem química de 5-(2-fenilbenzilóxi)metil-2’- deoxiuridina (i) H2, Pd/C, etanol, 5 minutos.

[0328] Clivagem química usando catalisador de paládio heterogêneo: A uma solução de 5-(2-fenilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina em etanol absoluto (10 mM, 1 mL ) sob uma atmosfera de nitrogênio foi adicionado paládio sobre carvão ativado (10 % em peso, 2 mg) (CUIDADO: sólido inflamável! Assegurar manipulação em atmosfera sem oxigênio). A mistura foi submetida a fluxo de gás hidrogênio e agitada em temperatura ambiente durante cinco minutos enquanto era monitorada por meio de TLC a cada 1 minuto. Após cinco minutos, TLC indicou desaparecimento completo de material de iniciação. O único produto da clivagem foi identificado como sendo timidina por meio de comparação com a amostra autêntica quando de TLC. Clivagem química de 5-(2,6-dimetilbenzilóxi)metil-2’-deoxiuridina

Esquema 41. Clivagem química de 5-(2,6-dimetilbenzilóxi)metil-2’- deoxiuridina (i) H2, Pd/C, etanol, 5 minutos.

[0329] Clivagem química usando catalisador de paládio heterogêneo: A uma solução de 5-(2,6-dimetilbenzilóxi)metil-2’- deoxiuridina em etanol absoluto (10 mM, 1 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio foi adicionado paládio sobre carvão ativado (10 % em peso, 2 mg) (CUIDADO: sólido inflamável! Assegurar manipulação em atmosfera sem oxigênio). A mistura foi submetida a fluxo de gás hidrogênio e agitada em temperatura ambiente durante cinco minutos enquanto era monitorada por meio de TLC a cada 1 minuto. Após cinco minutos, TLC indicou desaparecimento completo de material de iniciação. O único produto da clivagem foi identificado como sendo timidina por meio de comparação com a amostra autêntica quando de TLC. Clivagem química de 5-(benzilóxi)metil-2’-deoxiuridina

Esquema 42. Hidrogenólise catalítica de 5-benziloximetil-2’-deoxiuridina

[0330] A uma solução de 5-benzilóxi-2’-deoxiuridina (10 mg) em etanol (1 mL) foi adicionado Pd/C (10%, 10 mg) e a mistura foi agitada durante cinco minutos. Hidrogênio foi introduzido ao sistema via um balão e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente. Alíquotas (5 μL) foram tomadas da mistura de reação em vários intervalos de ponto de tempo e foram analisadas por meio de cromatografia em camada fina e HPLC. Clivagem completa à timidina foi observada após dez minutos em temperatura ambiente (Esquema 42 e FIG. 4). O intermediário da clivagem foi identificado como sendo 5- oximethidroxmetil-dU gerado a partir da remoção inicial do grupo benzila e HOMedU foi ainda reduzido à timidina.

[0331] Clivagem de 5-(1-fenil-2-metil-propilóxi)metil-2’-deoxiuridina usando hidrogenólise catalítica: A uma solução de 5-(1-fenil-2-metil- propilóxi)metil-2’-deoxiuridina (13 mg) em etanol (3 mL) foi adicionado Pd/C (10%, 15 mg) e a mistura foi agitada durante cinco minutos. Hidrogênio foi introduzido no sistema via um balão e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente. Alíquotas (5 μL) foram tomadas da mistura de reação em vários intervalos de ponto de tempo e foram analisadas através de cromatografia em camada fina e HPLC. Clivagem completa à timidina foi observada após 240 minutos em temperatura ambiente (Esquema 43 e FIG. 5). A clivagem lenta do 5-benziloximetil- dU α-isopropila substituído pode ser causada pelo estéreo-impedimento apresentado pela substituição quando o composto se liga à superfície do catalisador. Assim, a taxa de clivagem química é substancialmente reduzida para análogos de 5-benziloximetiluridina quando substituídos no α-carbono o qual, de outro modo, é importante para as propriedades de término e discriminação desses compostos. Sem desejar estar preso pela teoria, substituição da posição 2 do anel de benzila, mas não da posição do α-carbono, pode também afetar as propriedades de término (veja Tabela 2), a qual proporciona nucleotídeos de clivagem mais rápida.

Esquema 43. Hidrogenólise catalítica de 5-(1-fenil-2-metil- propilóxi)metil-2’-deoxiuridina

[0332] Todos os métodos divulgados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente divulgação. Embora as composições e métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será evidente para aqueles versados no campo que variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem se desviar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que determinados agentes os quais são química e fisiologicamente relacionados, podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, ao mesmo tempo em que resultados similares ou semelhantes ainda são obtidos. Todos de tais substitutos e modificações similares evidentes para aqueles versados no campo são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definido pelas reivindicações em anexo.

LISTAGEM DE REFERÊNCIAS

[0333] As referências a seguir e aquelas listadas no Apêndice, até o ponto em que elas proporcionam procedimentos exemplificativos ou outros detalhes suplementares àqueles apresentados aqui, são especificamente incorporadas aqui por referência, Patente U.S. 4.439.356 Patente U.S. 5.151.507 Patente U.S. 5.188.934 Patente U.S. 5.770.367 Barone et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 20: 1141-1145, 2001. Bartholomew e Broom, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 38, 1975. Beaulieu et al., J. Med. Chem., 43: 1094-1108, 2000. Cameron e Frechet, J. Am. Chem. Soc., 113: 4303-4313, 1991. Chaulk e MacMillan, Nucleic Acids Res., 26: 3173-3178, 1998. Dong et al., Org. Lett., 7: 1043-1045, 2005. Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 8817-8822, 2003. Pedido de Patente Européia 87310256.0 Flack, Acta Cryst., A39: 876-881, 1983. Green e Wuts, Protective Groups in organic Synthesis, 3a Ed. Wiley, NY, 1999. Harris et al., Science, 320: 106-109, 2008. Hasan et al., Tetrahedron, 53: 4247-4264, 1997. Herm et al., Chem. Eur. J., 8: 1485-1499, 2002. Hunkapiller et al., Science, 254: 59-67, 1991. Iafrate et al., Nature Genet., 36: 949-951, 2004. International Human Genome Sequencing Consortium., Nature, 409: 860-921, 2001. Johnson et al., Org. Lett., 6: 4643-46, 2004. Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 19635-40, 2006. Kanie et al., Angew. Chem. Int. Ed., 39: 4545-4547, 2000. Kobayashi et al., Science, 304: 1305-1308, 2004. Lehninger, Em: Principles of Biochemistry, 273-305, W.H. Feeman and Co., NY, 2005. Levy et al., PLoS Biol., 5: 254, 2007. March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 2007. Margulies et al, Nature, 437: 376-380, 2005. Mel’nik et al., Bioorganicheskaya Khimiya, 17: 1101-1110, 1991. Metzker et al., Biotechniques, 25: 446-462, 1998. Metzker et al., Nucleic Acids Res., 22: 4259-4267, 1994. Metzker, Genome Res., 15: 1767-1776, 2005. Ohtsuka et al., Nucleic Acids Res., 1: 1351-1357, 1974. Pedido PCT PCT/US90/05565 Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5022-5026, 1994. Pillai, Synthesis, 1-26, 1980. Redon et al., Nature, 444: 444-454, 2006. Reichmanis et al., J. Polymer Sci., 23: 1-8, 1985. Ronaghi et al., Science, 281: 363-365, 1998. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1997. Sapountzis et al., J. Org. Chem., 70: 2445-2454, 2005. Sebat et al., Science, 305: 525-528, 2004. Seela e Peng, J. Org. Chem., 71: 81-90, 2006. Service, Science, 282: 1020-1021, 1998. Smith et al., J. Org. Chem., 55: 2543-2545, 1990. Stranger et al., Science, 315: 848-853, 2007. Tuzun et al., Nature Genet., 37: 727-732, 2005. Wu et al., Nucleic Acids Res., 35: 6339-6349, 2007. Wu et al., Org. Lett., 6: 2257-2260, 2004. Zhi et al., J. Med. Chem., 46: 4104-4112, 2003.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula:

em que: Z é -O-, -S-, -NH-, -OC(O)O-, -NHC(O)O-, -OC(O)NH- ou -NHC(O)NH-; R1 é hidróxi, monofosfato, difosfato, trifosfato ou polifosfato; R2 é hidrogênio ou hidróxi; R3 e R4 são, cada um, independentemente: hidrogênio, hidróxi, halo ou amino; ou alquila(c<i2), alquenila<o<i2), alquinila<o<i2), arila<o^i2), aralquila<o<i2), heteroarila<o<i2), heteroaralquila<o<i2), aicóxi<o<i2), ariióxi<o<i2), araicóxi<o<i2), heteroariióxi<o<i2), heteroaraicóxi<o<i2), aiquilamino<o<i2), diaiquilamino<o<i2), arilamino<o<i2), ou aralquilamino<o<i2); e R5, R6, R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente: hidrogênio, hidróxi, haio, amino, nitro, ciano ou mercapto; aiquila<o<i2), alquenila<o<i2), alquinila<o<i2), arila<o<i2), aralquila<o<i2), heteroarila<o<i2), heteroaralquila<o<i2), aciia<o<i2), aicóxi<o<i2), aiqueniióxi<o<i2), aiquiniióxi<o<i2), ariióxi<o<i2), araicóxi<o<i2), heteroariióxi<o<i2), heteroaraicóxi<o<i2), aciióxi<o<i2), aiquilamino<o<i2), diaiquilamino<o<i2), aicoxiamino<o<i2), alquenilamino<o<i2), alquinilaminθ(c<i2), arilaminθ(c<i2), aralquilaminθ(c<i2), heteroarilaminθ(c<i2), heteroaralquilaminθ(c<i2), alquilsulfonilaminθ(c<i2), amido(C<12), alquiltio(C<12), alqueniltio(C<12), alquiniltio(C<12), ariltio(C<12), aralquiltio(C<12), heteroariltio(C<12), heteroaralquiltio(C<12), aciltio(C<12), tioacila(C<12), alquilsulfonila(C<12), aril-sulfonila(C<12), alquilamônio(C<12), alquilsulfônio(C<12) ou alquil-silila(C<12); ou um grupo de fórmula: em que:

em que X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodiila(C<12), alcenodiila(C<12), alcinodiila(C<12), arenodiila(C<12) ou heteroarenodiila(C<12); Y é -O-, -NH- ou alcanodiila(C<12); n é um número inteiro de 0-12; e m é um número inteiro de 0-12; ou um -ligante-repórter; ou um sal do mesmo.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Z é -O-.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que R1 é hidróxi.

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que R1 é um trifosfato.

5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que R2 é hidrogênio.

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que R3 é alquila(C<12), em particular alquila^), alquila^), alquila(C2-6), alquila(C3-5), metila, etila, n- propila, isopropila e terc-butila.

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que R4 é hidrogênio.

8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que R5 é hidrogênio, ciano ou alcóxi(C<6).

9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que R6 é um -ligante- repórter, em que o ligante é:

em que: X é -O-, -S- ou -NH-; ou alcanodiila(C<12), alcenodiila(C<12), alcinodiila(C<12), arenodiila(C<12) ou heteroarenodiila(C<12); e n é 0.

10. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que X é -C^C-.

11. Composto de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o repórter é baseado em um corante, em que o corante é zanteno, fluoresceína, rodamina, BODIPY, cianina, cumarina, pireno, ftalocianina, ficobiliproteína, ALEXA FLUOR® 350, ALEXA FLUOR® 405, ALEXA FLUOR® 430, ALEXA FLUOR® 488, ALEXA FLUOR® 514, ALEXA FLUOR® 532, ALEXA FLUOR® 546, ALEXA FLUOR® 555, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 594, ALEXA FLUOR® 610, ALEXA FLUOR® 633, ALEXA FLUOR® 647, ALEXA FLUOR® 660, ALEXA FLUOR® 680, ALEXA FLUOR® 700, ALEXA FLUOR® 750 ou um corante de esquarina, ou em que o repórter é:

12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que R6 é hidrogênio, alcóxi(c<i2) ou um grupo da fómula:

em que X é -C=C- e n é zero.

13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que R7 é hidrogênio.

14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que R8 é hidrogênio ou nitro.

15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que R9 é hidrogênio.

16. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que R9 é nitro.

17. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda é definido como:

ou um sal de qualquer uma das fórmulas acima.

18. Método de sequenciamento de um ácido nucleico-alvo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir: (i) fixação da extremidade 5' de um iniciador a uma superfície sólida; (ii) hibridização de um ácido nucleico-alvo ao iniciador preso à superfície sólida ou hibridização de um iniciador a um ácido nucleico- alvo preso à superfície sólida, dependendo de qual de ambos se prendeu à superfície sólida; (iii) adição de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4 a 10 e 13 a 16, em que R1 é trifosfato e R6 é um -ligante-repórter, contanto que onde mais de um tipo de base esteja presente, cada base é presa a um grupo repórter diferente; (iv) adição de uma enzima de replicação de ácido nucleico ao complexo de ácido nucleico-alvo/iniciador hibridizado para incorporar a composição da etapa (iii) na fita do iniciador em crescimento, em que a composição incorporada da etapa (iii) termina a reação em cadeia de polimerase em uma eficiência de entre cerca de 70% a cerca de 100%; (v) lavagem da superfície sólida para remover os componentes não incorporados; (vi) detecção do grupo repórter incorporado para identificar a composição incorporada na etapa (iii); (vii) realizar uma etapa de clivagem para remover a porção terminal, resultando em um iniciador estendido com bases que ocorrem naturalmente; (viii) lavagem da superfície sólida para remover o grupo terminal clivado; e (ix) repetição das etapas (iii) a (viii) uma ou mais vezes para identificar a pluralidade de bases no ácido nucleico-alvo.