BRPI0821301B1

BRPI0821301B1 - Composto de aspirinato de isossorbida, composição farmacêutica, e, seu uso

Info

Publication number: BRPI0821301B1
Application number: BRPI0821301-1A
Authority: BR
Inventors: John Francis Gilmer; Louise Clune-Moriarty; Maeve Lally
Original assignee: The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth, Near Dublin
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2019-05-21
Also published as: CA2709432A1; CA2709432C; EA201000918A1; JP2011517657A; IE20070934A1; EP2222681A1; EA022878B1; CN101925604B; AU2008339961A1; WO2009080795A1; BRPI0821301B8; BRPI0821301A2; ZA201004371B; EP2222681B1; US8486974B2; MX2010006878A; CN101925604A; NZ586304A; IL206424A; US20110046182A1

Abstract

composto de aspirinato de isossorbida, composição farmacêutica, e, seu uso a aspirina é uma das drogas mais amplamente usados no tratamento da inflamação, da dor e da febre. mais recentemente, ela tem encontrado aplicação na prevenção de ataques cardíacos e acidente vascular cerebral e está sendo estudada como um agente quimiopreventivo do câncer. apesar do seu valor, a aspirina continua a ser subutilizada por que esta causa hemorragia gástrica. a tecnologia sob desenvolvimento potencialmente remove este problema. esta é intencionada reduzir o contato entre a droga e o revestimento intestinal. um composto de aspirinato de isossorbida de pródroga é deste modo fornecido. o composto tem a estrutura geral como apresentado na fórmula geral (i) em que y é um éster de alquila cl - c8, um éster de alcóxi cl - c8, um éster de cicloalquila c3 - c10, um éster arílico, um éster de alquilarila cl - c8 ou um -c(o)oranel, em que ranel é um anel aromático de 5 membros ou não aromático de 5 membros tendo pelo menos um heteroátomo substituído por um carbono no sistema de anéis, que pode ser não substituído ou substituído com pelo menos um grupo de liberação de óxido nítrico.

Description

“COMPOSTO DE ASPIRINATO DE ISOSSORBIDA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, SEU USO”

Campo da Invenção

Esta invenção diz respeito às pró-drogas de aspirina potentes que são estáveis na umidade e em condições encontradas no lúmen do trato gastrointestinal, mas decompor-se-ão rapidamente durante e após a absorção para liberar aspirina e/ou óxido nítrico (NO).

Fundamento da Invenção

A aspirina é um das drogas mais amplamente usadas no mundo. O uso regular é associado com o risco reduzido da mortalidade em todos os grupos de risco cardiovascular. É um anti-inflamatório, analgésico e agente antipirético e é usado na luta contra a doença cardiovascular e é prognosticado ter um papel na prevenção de cânceres colorretais, esôfagos, gástrico e no pulmão (por exemplo, Chan 2005) bem como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer (Etminan et al., 2003) e outras formas de demência. Alguns modelos predizem que o consumo de aspirina diário pelas pessoas com mais de cinquenta anos dobrariam suas chances de viver até seus 90 anos (Morgan, 2003).

Os efeitos colaterais principais associados com o uso da aspirina são gastrointestinais. A aspirina causa dispepsia em quase a metade de todos os pacientes e triplica o risco de sangramento gastrointestinal. Os estudos controlados através de endoscopia demonstraram um risco aumentado de sangramento em todas as doses de aspirina mesmo em doses relativamente baixas usadas na prevenção do infarto do miocárdio (MI). Em um estudo, 10 % dos pacientes em baixas doses de aspirina (10 a 300 mg/dia) tiveram úlceras endoscópicas após 12 semanas, com um caso ocorrendo a 10 mg/dia (Cryer & Feldman, 1999, Cryer 2002). Vários estudos mostraram que o sangramento começa de 5 a 30 dias após o início da terapia que indica que a

Petição 870180140966, de 15/10/2018, pág. 18/21 adaptação não ocorre. Significantemente, o risco de efeitos colaterais gastrointestinais tem limitado o uso de aspirina aos grupos de pacientes com uma alta probabilidade de um evento trombótico: em uma população aleatória, o risco de um dano gastrointestinal sério é maior do que o risco da morte que pode ser prevenida pela aspirina. Até agora, não há dados relacionados com a dose confiáveis para o uso profilático de aspirina no câncer, contudo, esta parece ser provavelmente maior do que a dose ótima necessária para seu papel estabilizado na prevenção do ataque cardíaco e deste modo é provável ter um risco aumentado de maior toxicidade di gastrointestinal. Embora os riscos absolutos sejam baixos (1 a 2 %), seu consumo difundido e rapidamente crescente causa que a toxicidade gastrointestinal induzida por aspirina seja um assunto de saúde pública (Morgan, 2003; Laheij 2001; Newton et al., 2004).

Várias contribuições à toxicidade gastrointestinal da aspirina são reconhecidas. A parede do intestino é protegida dos conteúdos luminais irritantes por uma camada de proteção. Esta barreira é parcialmente mantida pela duas enzimas de ciclooxigenase (COX-1 & COX-2). Os efeitos de proteção cardiovasculares da aspirina originam-se da sua inibição da enzima da ciclooxigenase de plaqueta COX-1, enquanto seus efeitos citoprotetivos foram atribuídos a sua capacidade única de acetilar a enzima de cicloxigenase COX-2 que faz com que o ácido araquidônico seja conduzido para fora da PGE₂, um promotor do câncer, para HETE, um supressor do câncer. O COX2 também tem papel na cura de ferimentos no trato gastrointestinal.

A aspirina inibe estas enzimas ao passo que estas passam através do intestino durante a absorção e deste modo enfraquece seu papel de proteção. O aspecto bioquímico da toxicidade, portanto, resulta da inibição local de COX-1 e COX-2 através da aspirina que leva a supressão das prostaglandinas (PGE₂, PGI₂) que normalmente regulam a secreção ácido gástrica e fluxo sanguínea. Também há um aspecto químico claro para a toxicidade da aspirina. A aspirina é um ácido hidrofóbico (pKa de 3,5). Esta é solúvel em lipídeos em baixos valores de pH e é capaz de romper a camada hidrofóbica que cobre o epitélio permitindo acesso pelos conteúdos luminais, causando irritação, eventualmente levando à ulceração. Isto pode ser uma causa mais importante da toxicidade do que o componente bioquímico. Em um estudo recente, a administração da aspirina oral a ratos causou lesões gástricas considerando que não houve dano gástrico quando a droga foi fornecido subcutaneamente, com relação à evidência da inibição de COX de ambas as vias (Mahita, 2006). A toxicidade gastrointestinal induzida por drogas é muito complexa e o objeto de descobertas frequentemente conflitantes, mas seu estudo particular indica que a toxicidade química é significante.

O problema da toxicidade gastrointestinal foi o foco da atenção farmacêutica por muitos anos, mas estudos endoscópicos demonstram que as soluções convencionais tais como revestimentos ou tamponamentos entéricos são, na melhor das hipóteses, inadequadas (Kelly et al, 1996, Walker et al., 2007). Deste modo, estabelecer novas maneiras de liberar a aspirina ou lidar com seus efeitos de GI é um assunto de importância de saúde pública e uma oportunidade comercial importante.

Uma solução de valor potencial ao problema é o projeto de derivados de aspirina capazes de atrasar a liberação da aspirina de ocorrer no trato GI até após a absorção no plasma. Tal derivado deve ser apropriadamente chamado de uma pró-droga. As pró-drogas são agentes terapêuticos que são por si inativos, mas no metabolismo formam agentes ativos (Albert, 1958). As pró-drogas de aspirina foram investigadas por muitos anos como um meio de diminuir sua toxicidade gástrica (Jones, 1985).

A pró-droga de aspirina original exemplificado propôs que bloquear o ácido carboxílico da aspirina, por exemplo, com um éster, aboliría de maneira eficaz o aspecto químico da toxicidade gástrica que resulta do contato direto entre o ácido carboxílico da aspirina e a mucosa gástrica. Os ésteres de aspirina que são ativados durante a passagem através do epitélio gastrointestinal são esperados apresentar toxicidade gástrica muito reduzida se este modelo é correto, mesmo se a liberação da droga acontece dentro das células epiteliais.

Quando o componente bioquímico da toxicidade da aspirina se toma mais amplamente apreciado, a pró-droga exemplificado foi refinada. Ao contrário da aspirina, seus ésteres não têm a capacidade de inibir COX. Portanto, estes não interromperíam a síntese de prostaglandinas protetoras durante a passagem através das paredes do intestino. Em seguida, após a absorção, as esterases no sangue quebrariam o éster, liberando a aspirina. A droga alcançaria posteriormente o intestino através da circulação sistêmica, mas em uma concentração muito menor; a aspirina é rapidamente metabolizada no organismo e tem uma meia vida de somente 20 minutos. Suspeita-se que o bloqueio eficaz dos sistemas de defesa das mucosas dependentes de COX requer uma concentração mais alta de aspirina. Isto é porque a aspirina é um inibidor fraco de uma das enzimas COX (COX-1) e um inibidor muito fraco do outro (COX-2). Em outras palavras, a aspirina inibe tanto as enzimas protetoras durante a fase de absorção, mas é improvável de obter a concentração necessária para bloquear tanto as enzimas após a distribuição através do corpo após a absorção (um tipo similar de argumento farmacocinético explica a inibição seletiva da aspirina de tromboxano A₂ de plaquetas sobre a prostaciclina endotelial no coração (Pedersen A.K. & FitzGerald G.A. 1984)).

Os ésteres de pró-droga de aspirina são, portanto, esperados ter menor toxicidade no GI porque estes não causariam irritação tópica, a primeira passagem da aspirina através do GI em alta concentração seria evitada e a segunda distribuição é provável ser em uma concentração que deixaria as funções de proteção dependentes de COX-2 intactas. A idéia de tais pró-drogas de éster de aspirina é atrativa visto que as pró-drogas não são ácidas durante a passagem através da barreira de proteção e não a rompería. Estes também são esperados ter um impacto menor no mecanismo bioquímico que regula a barreira, se ativados no epitélio ou especialmente após a entrada na corrente sanguínea. Isto tem a vantagem de que os efeitos adversos ao GI associados à aspirina são evitados.

A droga é segura visto que este não é ativado até após ter passado através do trato GI (Figura 1).

Outro problema com a aspirina a partir de um ponto de vista clínico é que esta é instável na umidade e, portanto, não pode ser formulada em soluções. As soluções aquosas de aspirina seriam especialmente desejadas na medicina pediátrica e geriátrica. Um dos principais contribuidores para a instabilidade da aspirina é uma forma de autocatálise primeiramente descrita por Jencks and Pierre (1958). A aspirina tem um grupo de ácido carboxílico e um grupo de acetila. O grupo de ácido carboxílico tem a capacidade de ativar uma molécula próxima à água gerando hidróxido que ataca o grupo de acetila. Formando-se um éster de aspirina, o grupo de ácido carboxílico é mascarado e não pode se ocupar na autocatálise.

Os ésteres de aspirina são usualmente mais estáveis do que a aspirina e, portanto têm o potencial de ser formulados em uma variedade de maneiras úteis que não podem ser aplicadas à aspirina. Esta segunda vantagem para os ésteres de aspirina foi bem estabelecida de maneira experimental.

Por outro lado, a teoria hipotética da remoção da toxicidade da aspirina nunca foi testada porque nunca houve um candidato à pró-droga de éster de aspirina adequado. Isto é porque as pró-drogas de éster de aspirina são muito difíceis de projetar. Um éster de aspirina de paracetamol-benorilato esteve no mercado nos anos trinta até surgir que sua dose de administração aos seres humanos não resulta na liberação de aspirina (Williams et al., 1989).

O problema com os ésteres de aspirina e derivados relacionados é metabólico. Os ésteres de aspirina são convertidos no organismo para ácido salicílico ao invés de aspirina (Nielsen & Bundgaard, 1989). Os ésteres de aspirina são metabolizados no tecido humano e sangue por intermédio dos caminhos possíveis mostrados na Figura 2. Uma pró-droga de aspirina eficaz deveria ser clivada no grupo carreador que libera a aspirina após a absorção. A hidrólise rápida dos ésteres de aspirina acontece no sangue e plasma (t_1/2 < 1 min), mas não na ligação do éster de aspirina-carreador (posição B na Figura 2). Ao invés disso, o grupo de acetila é dividido (A na Figura 2) e o produto resultante é um éster de salicilato, e enfim, ácido salicílico. Este caminho bioquímico não pode produzir aspirina. A razão do salicilato para aspirina é usualmente maior do que 99:1, indiferente da identidade do grupo carreador (o componente de álcool da pró-droga usada para formar o éster com a droga de ácido carboxílico é conhecido como o carreador na terminologia de pró-drogas).

Se forma-se um éster a partir de uma droga ácida, a parte que está se ligando bloqueia a química ácida, mas também confere uma nova entidade de suas próprias características físico-químicas (cf. Figura 2). Este problema tem criado interesses tanto como um enigma farmacêutico e uma oportunidade comercial. Há um corpo substancial de literatura acadêmica e de patentes na área (Ver, Gilmer et al., 2002 e referências contidas). Embora a grande maioria dos compostos indicados como pró-drogas de aspirina na literatura não funcionem atualmente como pró-drogas de aspirina in vitro ou in vivo e estes liberam o éster de salicilato correspondente (Nielsen & Bundgaard, 1989).

De modo que um éster de aspirina funcione como uma hidrólise de pró-droga no sangue a clivagem tem que ocorrer na ligação de éster do carreador. O desafio do planejamento é que a esterificação da aspirina faz com que o grupo éster errado sofra a hidrólise na presença do plasma humano. O problema foi primeiramente explicado por Bungaard and Nielsen (1989). Quando a aspirina entra na corrente sanguínea, seu grupo de acetila é hidrolisado pela enzima esterase dominante na butirilcolinesterase do plasma humano (BuChE), resultando na formação de ácido salicílico. A aspirina é negativamente carregada no pH do sangue e a butirilcolinoestearase não é atualmente a mais eficiente quando processando negativamente os substratos carregados. Esterificando-se a aspirina, a carga negativa (que suprime o metabolismo) é removida e o grupo de acetila se toma um substrato muito melhor para a butirilcolinesterase. A introdução do novo grupo éster, portanto, acelera muito a taxa metabólica do éster acetílico existente. Por exemplo, a aspirina tem uma meia vida de cerca de um hora no plasma diluído, mas os ésteres de aspirina sofrem o mesmo processo de desacetilação com uma meia vida de menos do que um minuto: fenilacetatos neutros, tais como ésteres de aspirina estão entre os tipos de substrato de butirilcolinosterase mais eficazmente hidrolisados. Uma interpretação disto em termos de enzimologia básica é que o éster de aspirina se adéqua à enzima melhor do que a aspirina por si. A Bundgaard reconheceu que para que o metabolismo ocorra no ponto correto, o grupo carreador deve ter uma estrutura de complementaridade competitiva ao grupo de acetila isto é, deve ser pelo menos atrativo para um substrato para a enzima de BuChE como o grupo de acetila. Os grupos carreadores ainda melhores podem ser considerados os quais promovem sua própria hidrólise enquanto no mesmo tempo suprime a hidrólise do grupo de acetila adjacente. A enzima de butirilcolinoestearase leva seu nome pela eficiência nos ésteres de hidrólise de colino. Neilsen e Bungaard estudaram os ésteres de glicolamida da aspirina onde o grupo carreador foi indicado imitar colina de modo que sua separação pode competir com sucesso com a hidrólise do grupo de acetila. As glicolamidas tiveram apenas um sucesso parcial com o exemplo de maior sucesso sendo hidrolisado em tomo de 50 % em ambas as direções desejáveis e improdutivas (as vias A e B na Figura 2). Os trabalhos de Nielsen e Bundgaard estabeleceram o princípio importante de que uma pró-droga de aspirina bem sucedida requer um grupo carreador que se adapte às esterases plasmáticas humanas de uma maneira que supera sua preferência pelo grupo de acetila. Isto resulta ser uma exigência de alta demanda à qual sua resposta foi somente parcialmente adequada. Contudo, aparte da tecnologia aqui descrita, as glicolamidas são os únicos compostos conhecidos que podem ser ainda parcialmente descritos como pró-drogas de aspirina verdadeiras.

Outra estratégia que foi adotada de tempos em tempos é planejar ésteres onde a ligação aspirina-carreador é tão instável que quebra antes das esterases poderem atacar o grupo de acetila. O problema com este método é que a aspirina já é muito instável para a hidrólise por água e outros nucleófilos no seu grupo de acetila. Introduzir um segundo éster quimicamente ativo tem o efeito de fortificar a reatividade do grupo de acetila (bem como adicionar outro ponto de instabilidade). Os ésteres de aspirina deliberadamente intencionados a sofrer a divisão através de estímulos químicos tais como água, têm, portanto a falha óbvia de que são prováveis de encontrar tais estímulos durante o armazenamento e são, portanto suscetíveis à degradação na prateleira. Isto nega uma das vantagens das pró-drogas de éster de aspirina em primeiro lugar que estes são mais estáveis do que a aspirina na umidade. As pró-drogas indicados ser divididos em resposta ao estímulo químico genérico também tendem a quebrar sob condições encontradas na GIT, de que encontrariam antes da absorção.

O interesse na área das pró-drogas de aspirina tem se intensificado com a chegada das então chamadas aspirinas de óxido nítrico (NO), que são um tipo de éster de aspirina, mas com uma porção que libera NO ligada ao grupo carreador. A análise racional principal para o desenvolvimento de aspirinas de NO é que o NO promove a defesa das mucosas, compensando o dano causado pela aspirina (Fiorucci and Dei

Soldato, 2003). Este conceito é agora bem aceito na comunidade biomédica. O óxido nítrico e a aspirina também têm efeitos farmacológicos complementares e às vezes sinergísticos de modo que a combinação é esperada apresentar uma faixa maior de efeitos farmacológicos do que a aspirina sozinha. A liberação de NO protege o estômago da erosão gástrica induzida pela aspirina promovendo-se o fluxo sanguíneo e reduzindo a adesão do leucócito, às vezes suas propriedades anti-trombótica através do caminho de GMP potencializam os efeitos anti-plaqueta que surgem com a inibição de COX-1 pela aspirina. Deste modo, é considerado razoável ligá-los como um éster em uma tentativa de produzir uma pró-droga mútua de aspirina e óxido nítrico. NCX-4016 (NicOx SA, França) é um composto protótipo para as drogas de NO-aspirina (WO 95/030641, WO 97/16405, WO97/16405, W00044705.). Isto produz NO in vivo e tem efeitos anti-planqueta. A NCX4016 apresenta maior tolerância gástrica do que a aspirina em vários tipos de animais. NCX-4016 iniciou seu desenvolvimento pré-clínico em 1996 e desde 2002 foi avaliado no tratamento de distúrbios cardiovasculares (por exemplo, Peripheral Arterial Occlusive Desease (PAOD) (Fase II)), profilaxia do câncer do cólon (Fase I) e dor do câncer.

NCX-4016 foi um dos desenvolvimentos farmacêuticos mais amplamente perseguidos da década passada e foi considerado como um avanço biomédico signifícante (ver, por exemplo, Levin, 2004). Contudo, como uma pró-droga de NO -aspirina, NCX-4016 parece ter uma falha de planejamento signifícante. O teste chave para uma pró-droga de éster de aspirina é se este hidrolisa para aspirina ou seu éster de salicilato quando é incubado no plasma ou sangue humano. NCX-4016 é um éster de aspirina de um fenol substituído. Não são publicados dados no padrão de hidrólise de NCX-4016 no plasma humano mas existem dados para o éster de aspirina de paracetamol e ésteres similares (benorylate-Williams et al, 1989), o éster de aspirina de guicaol (Qu et al., 1990), e o éster de aspirina de fenol (Nielsen &

Bundgaard, 1989; também ver a Tabela 8). Nenhum destes compostos produziu mais do que 0,5 % de aspirina quando incubados em matrizes biológicas relevantes. Portanto, não há a evidência direta de que NCX4016 pode ou deve produzir aspirina. Os estudos metabólicos in vivo e in vivo no composto se referem somente aos metabólitos de salicilato (Carini et al., 2002). Além disso, a inibição de COX com NCX-4016 é menos extensiva do que com a aspirina. Isto é uma deficiência significante porque a inibição de plaquetas COX precisa ser quase completa para prevenir a agregação de plaquetas humanas. Outro estudo recente sugere que NCX-4016 pode agir diretamente no seu alvo sem a liberação da aspirina (Corazzi et al., 2005). Há várias tentativas recentes de planejar compostos capazes de liberar tanto a aspirina quanto o óxido nítrico no tecido humano. Os resultados foram desapontadores. Todos os compostos indicados sofrem hidrólise ao longo do caminho de salicilato típico e falham em liberar quantidades significantes de aspirina através das quais são potencialmente capazes de liberar o óxido nítrico (Gilmer et al., 2007; Valezquez et al., 2005; Cena et al., 2003).

O Pedido Internacional N~ WO9403421 descreve os ésteres de salicilato do nitrato de isossorbida clinicamente usados, ISMN. O composto descrito é isossorbida-mono-nitrato aspirinato (ISMNA) e seu uso potencial em um caminho trasdérmico é divulgado.

O composto foi dito ser útil quanto suas propriedades antianginais e de lavagem de plaquetas. Os estudos de hidrólise químicos foram indicados mostrar degradação com a produção de mono-nitrato de isossorbida (ISMN), ácido salicílico e aspirina que expressaram atividades de lavagem e anti-angina. Contudo, não foi esperado que o ISMNA pudesse agir como uma pró-droga de aspirina viável porque nenhum outro éster de aspirina foi mostrado agir como uma pró-droga de aspirina, aparte das glicolamidas, e estas foram muito deliberadamente planejadas ser complementares ao BuChE no plasma. Contudo, ISMNA tomou-se um inibidor potente de agregação de plaquetas no tecido de coelhos in vitro e foi posteriormente mostrado que ISMNA é eficazmente convertido a aspirina pelas esterases do plasma dos coelhos. Este foi testado em um estudo oral em cães em que foi comparado com a aspirina em duas das indicações farmacológicas da aspirina: inibição da biossíntese de tromboxano (um bioquímico que estimula as plaquetas a agregar) e inibição funcional da agregação de plaquetas. ISMNA mostrou efeitos fracos em ambos marcadores indicando que liberou apenas pequenas quantidades de aspirina no cão. Incubando-se o ISMNA em um sangue canino e monitorando sua hidrólise fomos capazes de mostrar que este não é eficazmente convertido a aspirina pelas esterases caninas por causa das diferenças entra as esterases no sangue do coelho e do cão. Mais tarde emergiu que ISMNA também não é produtivamente hidrolisado no plasma humano. Em uma solução de plasma humano e no sangue humano in vitro, ISMNA produz >90 % de salicilato e <10 % de aspirina. ISMNA é correspondente muito menos potente do que a aspirina como um inibidor de agregação de plaquetas no sangue integral humano e plasma humano rico em plaquetas (seu IC50 é de 85 μΜ comparado com 5 μΜ para a aspirina na agregação de plaquetas humanas para ácido araquidônico no plasmático em plaquetas). Os resultados ensinaram que para um éster de aspirina, a capacidade de inibir a agregação de plaquetas ou síntese de tromboxano se relaciona com a capacidade de produzir aspirina: uma pró-droga ineficaz contribui para um inibidor ineficaz de agregação de plaquetas. O baixo nível de liberação de aspirina e a falta de potência impediram o aspirinato de mononitrato de isossorbida (ISMNA) de ser um candidato de droga viável para seres humanos.

O Pedido Internacional N6 WO9817673 divulga o diaspirinato de isossorbida e dois ésteres de monoaspirinato de isossorbida, a saber, isossorbida-2-aspirinato e isossorbida-5-aspirinato. Isossorbida-diaspirinato (ISDA), o assunto principal da WO9817673, não foi ostensivamente qualquer diferente de muitos outros candidatos de pró-droga de éster anteriores que foram testados.

Além disso, a pessoa habilitada na técnica não esperaria que o isossorbida-di-aspirinato (ISDA) funcionasse como uma pró-droga de aspirina e não tivesse nenhuma razão química ou bioquímica para acreditar que a hidrólise levaria a qualquer coisa que não a divisão do grupo de acetila e desde modo, enfim, ácido salicílico. Portanto, foi muito surpreendente que fomos capazes de mostrar em nosso próprio laboratório que o ISDA inibe a agregação de plaquetas no plasma de coelho rico em plaquetas. Este também teve um efeito inibidor na síntese de tromboxano depois da administração oral a um grupo de cães (Gilmer et al., 2003). As propriedades semelhantes à aspirina indicaram que a hidrólise de ISDA no plasma leva a alguma aspirina. O ISDA foi mostrado sofrer uma rápida hidrólise quando incubado em soluções de plasma humano tamponado com fosfato para produzir aproximadamente 60 % de aspirina (Gilmer et al., 2002). Os 40 % restante do composto foi hidrolisado junto com o caminho de salicilato não produtivo. O estudo indicou que uma enzima específica presente no plasma humano catalisa a liberação de aspirina do diaspirinato de isossorbida (ISDA). Foi confirmado que a butirilcolinoestearase foi a enzima plasmática humana envolvida. A butirilcolinoestearase plasmática de cavalo intimamente relacionada gerou 11 % de aspirina. A Gilmer et al (2001, 2002) também descreve as características de hidrólise e os efeitos biológicos do aspirinato de mono-nitrato de isossorbida (ISMNA) e isossorbida-di-aspirinato (ISDA).

O éster de diaspirinato ISDA e os ésteres de glicolamida de Nielsen e Bungaard são os únicos ésteres na literatura química que pode agir até certo grau significante como pró-drogas de aspirina no plasma humano. Os compostos que não produzem aspirina como um produto de hidrólise são mais bem classificados como pró-drogas de ácido salicílico. Por exemplo, no presente contexto, ISMNA é uma pró-droga de aspirina somente no tecido do coelho mas é uma pró-droga de ácido salicílico no sangue humano.

Há uma necessidade urgente para melhores compostos de pródrogas de aspirina devido ao seu potencial terapêutico intrínseco e devido à demanda por compostos capazes de liberar tanto a aspirina quanto o óxido nítrico. Um éster de aspirina que libera óxido nítrico deve ser, em primeiro lugar, um éster capaz de sofrer a conversão para aspirina no modelo chave de hidrólise plasmática. Em particular, é desejável fornecer compostos de pródroga de aspirina que resistem à hidrólise aquosa e α-quimotripsina, ainda sofrerá hidrólise rápida na presença de plasma humano para liberar a aspirina e potencialmente outras porções farmacologicamente ativas, em particular, óxido nítrico.

Sumário da Invenção

De acordo com a invenção, é fornecido um composto de aspirinato de isossorbida tendo a estrutura geral como mostrada na fórmula geral (I*)

em que Y é um éster alquílico Q - C₈, um éster de alcóxi Ci - C₈, um éster cicloalquílico C₃ - Cio, um éster arílico, um éster alquilicorila Q - C₈ ou 0(0)0^⁶^ em que R^mel é um anel aromático de 5 membros ou não aromático de 5 membros tendo pelo menos um heteroátomo substituído por um carbono no sistema de anéis, que pode ser não substituído ou substituído com pelo menos um grupo de liberação de óxido nítrico.

A presente invenção também diz respeito aos sais e/ou hidratos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui descritos.

Aqui usado, o termo “alquila” inclui qualquer uma de uma série de grupos univalentes da fórmula geral RC(O)R, ou mais especificamente -OC(O)C_nH_2n+i, que é um éster derivado de hidrocarbonetos alifáticos. As cadeias de alquila do éster de cadeias de alquila podem ser retas ou ramificadas em que o grupo metila (-CH₃) representa um grupo alquila C_betila (-C2H5) representa um grupo alquila C₂, propila (-C₃H₇) representa um grupo alquila C₃, butila (-C4H9) representa um grupo alquila C₄ e pentila (C5H7) representa um grupo alquila C5.

O termo “éster de alcóxi” inclui um grupo tendo a fórmula geral RC(O)OR, ou mais especificamente -OC(O)OC_nH_2n+i, em que C_nH_2n+i é uma cadeia alquila que pode ser retas ou ramificada em que o grupo metila (CH₃) representa um grupo alquila C_b etila (-C₂H₅) representa um grupo alquila C₂, propila (-C₃H₇) representa um grupo alquila C₃, butila (-C4H9) representa um grupo alquila C₄ e pentila (-C₅H₇) representa um grupo alquila c₅.

O termo “éster cicloalquílico” significa que o grupo C_nH₂n+l da fórmula acima é um grupo alquila cíclico tal como ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano etc.

O termo “éster arílico” é intencionado significar RC(O)Ar, em que Ar representa qualquer grupo funcional ou substituinte derivado de um anel aromático simples, por exemplo, um anel de benzeno, tolueno, xileno, ácido benzóico, benzoato, nicotinato, clorobenzeno ou outros grupos de halobenzeno.

O termo “ésteres de anéis heterocíclicos de 5 membros”, representa qualquer funcionalidade éster representada por -C(O)OR^anel em que, R^mel é um anel aromático de 5 membros ou não aromático de 5 membros tendo pelo menos um heteroátomo substituído por um carbono no sistema de anéis. Adequadamente, os grupos R³¹¹⁶¹ podem ser selecionados do grupo que consistem de: tiofenos, tiadiazolinas, pirróis, imidazóis, tiazóis, pirazóis, 4,5diidropirróis, imidazolidin-2-onas, pirazinas, 4,5-diidrotiofenos e imidazolidin-2-tionas. Os R^⁶¹³ preferidos são os anéis heterocíclicos

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\ / HN _Nn ^\hhN NHN^z S

Os grupos -C(O)OR^ane preferidos da invenção são isooxazoleoato, oxazoleoato ou tiadiazoleoato.

Adequadamente, todos estes compostos ativamente liberam aspirina no plasma humano até certo grau. Alguns dos compostos foram mostrados ter melhor atividade do que outros compostos considerando que alguns compostos têm uma menos atividade dependendo da natureza do substituinte escolhido como Y. Alguns dos compostos liberam NO além da aspirina.

Adequadamente, os compostos preferidos da invenção têm a atividade de mais do que ou igual a 15 % de aspirina liberados no plasma humano.

O grupo de liberação de óxido nítrico dos compostos da invenção pode compreender um éster de nitrato, um éster de nitrato de alquila de Ci a Cg, um éster de nitrato de cicloalquila de C3 - Ci₀ ou um éster de nitrato de alquila Ci - Cg.

Em uma forma de realização, o composto de aspirinato de isossorbida tem a estrutura geral como mostrada na fórmula geral (I)

em que Y é um éster alquílico Ci - Cg, um éster de alcóxi Ci - Cg, um éster cicloalquílico C3 - Ci₀, um éster de cicloalcóxi Ci - Cg, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um éster olico ou um éster alquil arílico Ci - Cg, que pode ser não substituído ou substituído com pelo menos um grupo de liberação de óxido nítrico.

Não obstante, são mais preferidos os compostos tendo ésteres que compreendem anéis heterocíclicos de 5 membros que podem ser selecionados do grupo que consiste de oxazoleoato, isoxazoleato e tiadiazoleoato.

Em uma forma de realização preferida, o composto de aspirinato de isossorbida tem a estrutura geral como mostrada na fórmula geral (I)

em que Y é um éster alquílico Cj - C₈ ou um éster de alcóxi Ci - C₈, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um éster cicloalquílico C₃ - Cio ou um éster de cicloalcóxi Q - C₈, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo de éster arílico, éster alquílico, benzoato, um nicotinato, oxazoleoato, isoxazoleato, tiadiazoleoato não substituído ou substituído, que pode ser substituído com pelo menos um do grupo que compreende hidróxido, -Cl, -Br, um alquila Ci - C₈, benzila, um alcóxi Q - C₈, benzilóxi, -NHC(O)R, -NH₂, -NO₂, -ONO₂, - (CH₂)_nONO₂, 0C(O)[(CH₂)_m]_cícii_C0ONO₂, -0COArONO_2i -OCOAr (CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila Cj - C₅, em que R é um alquila Ci - C₈ ou um grupo alcóxi Cj - C₈, n = 1 a 8, m = 3 a 10.

De acordo com a invenção é fornecido um composto de aspirinato de isossorbida tendo a estrutura geral como mostrada na fórmula geral (I*)

em que Y é

-C(O)OR^anel em que R³”⁶¹ é um anel aromático de 5 membros ou não aromático de 5 membros tendo pelo menos um heteroátomo substituído por um carbono no sistema de anéis, que pode ser não substituído ou substituído com pelo menos um grupo de liberação de óxido nítrico.

Em uma forma de realização preferida, o grupo de liberação de 5 óxido nítrico pode ser selecionado do grupo que consiste de: -NO₂, -ONO₂, (CH₂)_nONO₂, -OC(O)[(CH₂)_m]_cíclicoONO₂, -OCOArONO₂, -OCOAr (CH₂)_nONO₂.

Particularmente, os compostos preferidos incluem um composto de aspirinato de isossorbida tendo a estrutura geral como mostrado 10 na fórmula geral (I*)

em que X e Y são independentemente selecionados de O, S e

N.

Em outra forma de realização, é fornecido um composto que tem uma estrutura geral como mostrado na fórmula geral (I)

em que Y é um éster alquílico Ci - C₈ ou um éster de alcóxi Ci - C₈, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo do éster arílico, éster alquílico, benzoato, nicotinato, oxazoleoato, isoxazoleato, tiadiazoleoato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um do grupo que compreende hidróxido, -Cl, -Br, um alquila Q - C₈, benzila, um alcóxi Q - C₈, o-benzilóxi, NHC(O)R, -NH₂, -NO₂, -ONO₂, - (CH₂)_nONO₂, -OC(O)[(CH₂)_m]_cícIicoONO₂,OCOArONO₂ -OCOAr (CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila Ci - C₅, em que R é um alquila Ci - C₈ ou um grupo alcóxi C] - C₈, n = 1 a 8, m = 3 a 10.

Outros compostos preferidos são ilustrados pela estrutura geral como mostrado na fórmula geral (I)

em que Y é um éster alquílico Ci - C₈ ou um éster de alcóxi Q - C₈, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; um éster cicloalquílico C3 - Cjo ou um éster de ciclo alcóxi Q - C₈, que pode ser não substituído ou substituído por ONO₂; ou um grupo de éster arílico, éster alquil arílico, grupo benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um do grupo que compreende hidróxido, um alquila C] - C₈, benzila, um alcóxi Q - C₈, benzilóxi, -NHC(O)R, -NH₂, -NO₂, -ONO₂, -(CH₂)_nONO₂, -OC(0)[(CH₂)_m]cíclicoON0₂, -OCOArONO₂. -OCOAr(CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila Q - C₅, em que R é um alquila Cj - Cg ou um grupo alcóxi Q - Cg, n = 1 a 8, m = 3 a 10.

em que Y é um éster de alcóxi Ci - Cg, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um éster cicloalquílico C₃ - Cio ou um éster de cicloalcóxi Ci Cg, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído que pode ser substituído por pelo menos um do grupo que compreende hidróxido, um alquila Ci - Cg, benzila, um alcóxi Q - Cg, benzilóxi, -NHC(O)R, -NH₂, -NO₂, -ONO₂, -(CH₂)_nONO₂,

-OC(O)[(CH₂)_m]_cíclicoONO₂, -OCOArONCb -OCOAr (CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila C] - C5, em que R é um alquila Q - Cg ou um grupo alcóxi Cj - Cg, n = a 8, m = 3 a 10.

em que Y é um éster de alcóxi Q - Cg, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um do grupo que compreende hidróxido, -Cl, -Br, um alquila C] - C₈, benzila, um alcóxi Ci - Cg, o-benzilóxi, -NHC(O)R, -NH₂, NO₂, -ONO₂, -(CH₂)_nONO₂, -OC(O)[(CH₂)_m]_cíclicoONO₂, -OCOArONO₂ -OCOAr (CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila Ci - C₅,

8, m = 3 a 10.

Em uma forma de realização preferida, o composto de aspirinato de isossorbida pode ter a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (I)

^Y (I) em que Y é um éster alquílico Ci - Cg ou um éster de alcóxi Ci - Cg, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo de éster arílico, éster alquil arílico, benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um dos grupos que compreende hidróxido, -Cl, -Br, um alquila Ci C₈, benzila, um alcóxi Q - Cg, benzilóxi, -NHC(O)R, -NH₂, -NO₂, -ONO₂, (CH₂)_nONO₂, -OC(O)[(CH₂)_m]_cíclicoONO₂ -OCOAr- ONO_Z, OCOAr(CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila Ci - C₅, em que R é um grupo alquila Ci - C₈ ou um alcóxi Ci - Cg, n = 1 a 8, m = 3al0. Onde o substituinte benzilóxi é usado em um anel arila, é preferido que seja um substituinte de o-benzilóxi.

Em uma forma de realização particularmente preferida, o composto pode ter a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (I)

em que Y é um éster alquílico Ci - Cg, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um do grupo que compreende hidróxido, um alquila Ci - Cg, benzila, um alcóxi Cj - Cg, benzilóxi, -NHC(O)R, -NH₂, - NO₂, -ONO₂, -(CH₂)_nONO₂, -OC(O)[(CH₂)_mJ cíciicoON0₂, -OCOArONO₂, -OCOAr(CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila Cj - C₅, em que R é um alquila Ci - Cg ou um grupo alcóxi Ci - Cg, n = a 8, m = 3 a 10. Onde o substituinte benzilóxi é usado em um anel arila, é preferido que seja é um substituinte de o-benzilóxi.

Ainda em outra forma de realização, os compostos podem ter a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (I)

em que Y é um grupo benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um de hidróxido, um alquila Ci - C₈, alquilóxi Ci - C₈, benzilóxi, -(CH₂)_nONO₂ (η = 1 a 8), éster cicloalquílico ou éster de haloalquila C3 a Cio- Onde o substituinte benzilóxi é 5 encontrado no composto, é preferido ser o-benzilóxi.

Adequadamente, os compostos da invenção podem ter a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (I)

em que Y é um grupo benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um de hidróxido, alquila Q - C₈, alquióxi Q - C₈, o-benzilóxi, -(CH₂)_nONO₂ (η = 1 a 8), éster cicloalquílico ou éster de haloalquila C3 - CIO.

Onde um éster do grupo haloalquila é uma característica dos compostos, o substituinte halo pode ser Cl, Br ou F.

Em uma forma de realização onde o composto compreende um éster de haloalquila, o substituinte halo é adequadamente Cl, Br ou F. Cloro e bromo são os substituintes halo mais preferidos. Contudo, os ésteres de haloalquila tendo substituintes Br são particularmente preferidos.

Adequadamente, os compostos da invenção têm um alto grau de complementaridade para o lado ativo das carboxilesterases humanas e deste modo sugere a hidrólise ao longo do caminho ideal, liberando a aspirina.

Vantajosamente, os compostos podem ser especificamente ativados por mais do que uma enzima humana, visto que se um paciente tem a função enzimática anômala com relação a uma, é provável que outra compense e libere a aspirina.

Além disso, o composto de pró-drogas de aspirina são estáveis sob condições encontradas no lúmen do trato gastrointestinal mas quebra rapidamente após a absorção no fluxo sanguíneo à aspirina.

Outras vantagens surgem destes compostos visto que são estáveis com relação à umidade e deste modo, podem ser usados com sucesso nas formulações onde a umidade pode ser encontrada. Uma pró-droga de aspirina de umidade estável é vantajoso por muitas razões incluindo a possibilidade da formulação na solução e as formas transdérmicas. Um dos problemas com a liberação transdérmica da aspirina é que a umidade da pele causa a hidrólise da aspirina armazenada no caminho. Adequadamente, os compostos de umidade estável não precisam de acondicionamento farmacêutico de proteção à prova de umidade para o armazenamento.

Em uma forma de realização preferida, o grupo Y pode ser selecionado do grupo que consiste de:

O OH í J. ,L °

V·. '.,3'

F F

°....... ι Γϊ'ί i. r ι r o· y p o v P ο* V y o- v 'y C

O Mc / ''yk··· y z f f

Os compostos da invenção, quando Y na fórmula geral (I) é representado por qualquer uma das estruturas particulares, os compostos liberam aspirina no plasma humano e alguns graus variados e deste modo todos são ativos.

Contudo, os compostos tendo um substituinte Y selecionado do grupo que consiste de:

O

Jl.

⁰ ·„O

Π ,

II Ί r

JF

NO, t

Q Ç

O ‘C

Jl.

OKC. o t

c > o.....

,J—S }=N _f ^H=^c and são particularmente preferidos, visto que os compostos compreendem quaisquer um destes grupos mostram atividades de mais do que ou igual a 15 % de liberação de aspirina no plasma humano.

.ONO, t

N, que

Em outra forma de realização preferida, os compostos da invenção compreendem aqueles que têm atividades de liberação de aspirina maiores do que ou iguais a 15 %, com base na quantidade de aspirina como 10 uma porcentagem da concentração de éster inicial em moles medida por

HPCL no pico da produção de aspirina seguido pela adição de ésteres candidatos ao plasma humano tamponado a 37 °C no pH 7,4 (tampão de fosfato).

Nas formas de realização específicas, os compostos podem ter a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (I)

^Y (D em que Y é um grupo de benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído,que pode ser substituído por pelo menos um de hidróxido, metila, benzilóxi, metóxi, -NHC(O)CH₃, -OC(O)CH₂Br, -NO₂, OAc. -CH_zONO₂. Onde o substituinte benzilóxi é usado em um anel arila, é 5 preferido que seja um substituinte de o-benzilóxi.

Em uma forma de realização específica, os compostos podem ter a estrutura geral como mostrado na fórmula geral

em que Y é um grupo de benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um de hidróxido, -Cl, metila, benzilóxi, metóxi, -NHC(O)CH₃, -OC(O)CH₂Br, -NO₂,

-CH₂ONO₂. Onde o substituinte benzilóxi é usado em um anel arila, é preferido que seja substituinte de o-benzilóxi.

Os compostos de aspirinato de isossorbida mais preferidos têm uma das seguintes estruturas

ou

Altemativamente, o composto de aspirinato de isossorbida pode ter qualquer uma das estruturas selecionadas do grupo que consiste de:

(X) e

(XI).

Em outro aspecto da invenção, é fornecido um composto carreador para uma droga tendo a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (II) \ O

^γ (Π) em que Y é um éster alquílico Ci - C₈, um éster de alcóxi Q - C₈, um éster cicloalquílico C₃ - Cio, ^um éster arílico, um éster alquílico Cj - C₈ ou C(O)OR_anei em que R³¹¹⁶¹ é um anel aromático de 5 membros ou não aromático de 5 membros tendo pelo menos um heteroátomo substituído por um carbono no sistema de anéis, que pode ser não substituído ou substituído com pelo menos um grupo de liberação de óxido nítrico, e

X é a molécula da droga.

Neste aspecto, uma forma de realização preferida fornece um composto carreador para uma droga tendo a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (II)

^Y (II) em que Y é um éster alquílico Cj - C₈, um C₃ - Cio éster cicloalquílico, um éster arílico ou um éster alquil arílico Cj - C₈, que podem ser não substituídos ou substituídos com pelo menos um grupo de liberação de óxido nítrico, e

X é a molécula da droga.

Os carreadores preferidos da invenção podem ter a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (II) χ

Μ

em que Y é um éster alquílico Q - Cg, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um éster cicloalquílico C3 - Cio, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo do éster arílico, éster alquil arílico, benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um do grupo que compreende hidróxido, um alquila Ci - C₈, benzila, um alcóxi Cj - C₈, benzilóxi, -NHC(O)R, -NH₂, -NO₂, -ONO₂, -(CH₂)_nONO₂, -OC(O)[(CH₂)_m]_cícliC0ONO₂, -OCOArONO₂, -OCOAr (CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila Cj - C₅, em que R é um grupo alquila Q - C₈ ou alcóxi Ci - C₈, η = 1 a

8, m — 3 a 10.

Em outras formas de realização, o carreador da invenção pode ter a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (II) \ y

X-JL-o (Π) em que Y é um éster cicloalquílico C₃ - Cio, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo benzoato ou nicotinato não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um dos grupos que compreende hidróxido, um alquila Ci - C₈, benzila, um alcóxi Q - C₈, benzilóxi, -NHC(O)R, -NH₂, - NO₂, -ONO₂, -(CH₂)_nONO₂,

-OC(O)[(CH₂)_m]_cíclicoONO₂, -OCOArONO₂ -OCOAr (CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila Cj - C₅, em que R é um grupo alquila Q - C₈ ou alcóxi Q - C₈, η = 1 a 8, m = 3 a 10.

Nos compostos que compreendem um grupo funcional de éster haloalquílico, o substituinte halo pode ser Cl, Br ou F, contudo Br é mais particularmente preferido.

Vantajosamente, o composto de pró-drogas de aspirina da invenção resiste à hidrólise aquosa e α-quimotripsina, ainda sofrerá a hidrólise rápida na presença de plasma humano para liberar a aspirina e potencialmente outras porções farmacologicamente ativas. Os compostos preferidos da invenção liberam óxido nítrico além da aspirina.

Assim neste aspecto, os compostos da invenção são vantajosos visto que fornecem um melhor composto de pró-drogas de aspirina, em particular, um composto de pró-droga capaz de liberar tanto aspirina quanto óxido nítrico. Os dispositivos de pró-drogas capazes de liberar tanto a aspirina quanto óxido nitroso (NO) são particularmente vantajosos. Tais compostos são prováveis ser menos tóxicos mas tem um maior espectro de ações farmacológicas e eficácia do que seus componentes individualizados, porque a aspirina e óxido nítrico têm efeitos sinergísticos nas aplicações em doença cardiovascular e câncer.

Um éster de aspirina que libera óxido nítrico deve mo primeiro caso, ser um éster capaz de sofrer a conversão à aspirina no modelo chave de hidrólise plasmática ou modelo biologicamente relevante similar. O carreador da invenção pode ter um grupo de liberação de óxido nítrico que compreende um éster de nitrato, um éster de nitrato de alquila de Ci a C₈, um éster de nitrato de cicloaíquila C₃ - Cio ou um éster de nitrato de alquila Q - C₈.

Outras vantagens resultam do fato de que as pró-drogas da invenção são estáveis na presença de proteases digestivas típicas e para enzimas encontradas nas células CACO-2 das mucosas, mas podem ser hidrolisadas por aspirina através das esterases humanas, especialmente BuChE e CE-2. Neste aspecto, o carreador pode ter a estrutura geral como

em que Y é um éster alquílico C] - Cg, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um éster cicloalquílico C₃ - Cio, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo éster alquílico, benzoato, um nicotinato, oxazoleoato, isoxazoleato, tiadiazoleoato éster arílico não substituído ou substituído, que pode ser substituído por pelo menos um do grupo que compreende hidróxido, -Cl, -Br, um alquila Q - Cg, benzila, um alcóxi Ci - Cg, benzilóxi, -NHC(O)R, -NH₂, -NO₂, -ONO₂, -(CH₂)_nONO₂,

-OC(O)[(CH₂)_m]_cíciicoONO₂, -OCOArONCl· -OCOAr(CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila Q - C₅, em que R é um grupo alquila Cj - Cg ou alcóxi Cj - Cg, η = 1 a 8, m = 3 a 10 e X é a molécula da droga

Adequadamente, os carreadores da invenção sugerem a hidrólise até o ponto correto por causa de sua complementaridade com os locais ativos das esterases humanas.

Em uma forma de realização particularmente preferida, o carreador da invenção pode ter a estrutura geral como mostrado na fórmula geral (II)

em que Y é um éster cicloalquílico C₃ - Cio, que pode ser não substituído ou substituído com ONO₂; ou um grupo benzoato ou nicotinato não substituído ou 5 substituído, que pode ser substituído por pelo menos um do grupo que compreende hidróxido, -Cl, um alquila Cj - C₈, benzila, um alcóxi Q - Cg, benzilóxi, -NHC(O)R, - NH₂, -NO₂, -ONO₂, -(CH₂)_nONO₂, OC(O)[(CH₂)_m]_ciclic0ONO₂, -OCOArONO? -OCOAr(CH₂)_nONO₂ ou um éster de haloalquila C] - C₅, em que R é um alquila Q - Cg ou um grupo alcóxi Cj - C₈, n = a 8, m = 3 a 10.

Nos compostos preferidos que compreendam um éster de grupo de haloalquila funcional, o substituinte halo pode ser Cl, Br ou F, embora Br seja o substituinte mais particularmente preferido.

Em outra forma de realização favorável, o composto carreador pode ser selecionado do grupo que consiste de:

X. Η

em que X é a molécula da droga a ser carregada na forma de pró-droga.

Em outro aspecto da invenção, é fornecido um composto medicamentoso que compreende o composto carreador como aqui descrito.

Ainda em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um composto como definido acima e pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.

Em um aspecto particular, os compostos e/ou as composições da invenção podem ser usados in-vivo ou in-vitro para reduzir a expressão de 10 glico-proteína de plaqueta constitutiva em um nível onde a aspirina não tem efeito.

Os compostos e/ou as composições da invenção também podem ser usadas in-vivo ou in-vitro para induzir um efeito semelhante ao da aspirina. Um efeito semelhante ao da aspirina, por exemplo, é uma redução na 15 atividade anti-plaquetas ou a inibição de produtos de COX tais como tromboxano A2 ou malondialdeído. Vantajosamente, os compostos preferidos da invenção são mais potentes do que a aspirina por si e são melhores inibidores de agregação de plaquetas humanas e melhores inibidores dos produtos de COX a jusante (tais como tromboxano A₂ e malondialdeído) bem como a expressão da glico-proteína de plaqueta constitutiva.

Em outro aspecto, os compostos da invenção podem ser usados na fabricação de uma droga para o tratamento de doenças ou condições ou sintomas incluindo distúrbios cardiovasculares e cerebrovasculares, dor, pirético, inflamação, câncer, doença de Alzheimer ou demência.

A aspirina causa hemorragia gástrica irritando-se quimicamente as células da parede intestinal durante a absorção e interferindo-se com a secreção da sua barreira de proteção. A solução para este problema é para tomar a aspirina temporariamente inerte ligando-se quimicamente um grupo de mascaramento o qual é posteriormente removido no processo de absorção, fora da superfície vulnerável do trato GI. O desafia chave no desenvolvimento desta tecnologia foi descobrir um grupo de mascaramento que é removido do sangue de modo preciso e como já era esperado, um obstáculo que ninguém foi capaz de superar. Essencialmente, a invenção fornece uma forma inerte de aspirina que é ativada no corpo.

Em um refinamento adicional ao planejamento, um precursor de óxido nítrico foi incorporado no grupo carreador para fornecer outros compostos que podem liberar NO Junto com a aspirina. Tais pró-drogas duplas, então potencialmente interferem com os processos patológicos em dois níveis diferentes. O método de nitro-aspirina está se tomando amplamente aceito, mas a tecnologia aqui descrita é a única tecnologia que produz de maneira verificável tanto a aspirina quanto NO’ no tecido humano.

A hidrólise do isossorbida-di-aspirinato (ISDA, 16 na Tabela 2) no sangue humano foi investigada de modo a encontrar como esta produziu a aspirina.

Isossorbida-di-aspirinato (ISDA, 16) tem quatro grupos éster, um localizado em cada duas porções de aspirina, e um conectando cada uma destas porções ao núcleo de isossorbida. A interpretação correta dos dados da produção de aspirina foi aquela que dois ésteres de aspirinato nas posições 2 ou 5 são separados através das esterases diretamente da aspirina que libera ISDA. Isto é parcialmente verdade, mas o real mecanismo pareceu ser mais interessante e inesperado. Os quatro grupos éster em ISDA são suscetíveis à hidrólise através das esterases com uma ordem potencialmente complexa de metabólitos de éster. Basicamente, todos estes são hidrolisados para isossorbida e ácido salicílico. A cascara de hidrólise pode ser seguida por cromatografia, que permite a separação e medição de cada um dos metabólitos ao passo que estes desenvolvem e decompõe. Muitas experiências foram conduzidas, em que ISDA foi introduzido no meio biológico, a reação foi interrompida em pontos de tempo sucessivos e a mistura metabólica foi medida por HPLC. A plotagem destes dados sobre um curso de tempo é chamado de uma curva de progresso da hidrólise. As curvas de progresso para ISDA são apresentadas nas Figuras 3A e 3B. As curvas mostram o desaparecimento de ISDA e o aparecimento da aspirina com o tempo. Um exame cuidadoso destas curvas revela duas coisas: a concentração de aspirina continuou a crescer após o ISDA precursor ter desaparecido e em segundo lugar seu pico seguiu a elevação e o desaparecimento do outro metabólito. Isto foi uma descoberta surpreendente e altamente significante para indicar que a aspirina que aparece após o ISDA ser adicionada ao plasma humano pode não ser liberado do ISDA por si, mas sim de um metabólito de ISDA. Deste modo, todos os metabólitos potenciais de ISDA foram independentemente sintetizados e avaliados por HPLC como pró-drogas de aspirina incubando-os no plasma e seguindo sua hidrólise por HPLC. Um destes, o isossorbida-2-aspirinato-5-salicilato (ISAS, 2), revelou-se ser a pródroga mais eficaz conhecido até o momento no modelo chave de plasma humano (Figuras 4A e B). No plasma humano pé amplamente convertido à aspirina junto com o carreador de isossorbida-5-salicilato. Este é hidrolisado quase exclusivamente junto do seu caminho em uma solução de BuChE purificada (Figura 4B).

Os resultados gerais indicaram que o isossorbida-di-aspirinato (ISDA, 16) age como um precursor para uma pró-droga de aspirina verdadeira, seu isossorbida-2-aspirinato- 5-salicilato metabólito (ISAS, 2).

Foi descoberto que o plasma humano BuChE primeiro remove seletivamente o grupo de acetila do aspirinato de isossorbida-di-aspirinato (ISDA), que é ligado na posição 5, deste modo gerando isossorbida-2aspirinato-5-salicilato (ISAS). BuChE humano depois eficazmente separa a aspirina do isossorbida-2-aspirinato- 5-salicilato (ISAS). ISDA sofre hidrólise junto com outras vias paralelas (a Figura 5 é uma versão simplificada desta para esclarecimento) e não é tão eficazmente metabolizado à aspirina como o isossorbida-2-aspirinato- 5-salicilato (ISAS), nem foi descoberto ser tão potente nos ensaios biológicos. ISAS tem uma taxa de liberação de aspirina de 85 % no plasma (ti/₂ 2 min) considerando que ISDA é hidrolisado em tomo de 60 % junto com o caminho de aspirina com os 40 % restante procedendo ao longo de um caminho de salicilato improdutivo. De fato, devido o ISDA ter duas moléculas de aspirina ligadas, seu rendimento geral no sentido mais estrito é 30 %. Usando os inibidores de enzima específicos e as soluções enzimáticas purificadas, fomos capazes de estabelecer inequivocadamente a enzima no plasma humano responsável para a ativação exclusivamente exata de ISAS como butirilcolinoestearase (por exemplo, Figura 5).

Isossorbida-2-aspirinato-5-salicilato (ISAS) não é descrito no Pedido Internacional N² WO9817673. Embora seja um metabólito potencial ninguém pode ter antecipado que seria uma pró-droga. Outros metabólitos atuais ou potenciais de ISDA (por exemplo o 5-aspirinato, 2-aspirinato ou 2salicilato-5-aspirinato) foram cada um sintetizados e caracterizados. Nenhum destes agiram como pró-drogas de aspirina no plasma humano.

Vantajosamente, ISAS (2) é signifícantemente mais potente do que a aspirina como um inibidor da agregação de plaquetas humanas induzido por colágeno (Figura 6), ADP e ácido araquidônico e portanto, inibe os produtos de COX a jusante incluindo tromboxano A₂ e malondialdeído. Este também umidifica a expressão glicoprotéica de plaquetas constitutiva em concentrações em que a aspirina não tem efeito. A potência de isossorbida-2aspirinato-5-salicilato (ISAS) maior do que da aspirina, embora desejável de um ponto de vista do desenvolvimento de uma droga, é desconhecido e assunto de investigações em progresso. Também foi visto que o isossorbida-

2-aspirinato-5-salicilato (ISAS) precisa ser ativado pelas esterases para mostrar seus efeitos farmacológicos: este não tem atividade biológica intrínseca e portanto, é uma pró-droga. Enquanto ISAS sofre hidrólise no sangue humano com uma meia vida de < 2 minutos, este é estável na presença de proteases digestivas típicas e para as esterases encontradas nas células CACO-2. Este inibe a agregação de plaquetas para o ácido araquidônico no sangue humano integral (método de impedância) com um IC₅₀ de 17 μΜ. O IC50 da aspirina neste modelo é de 25 μΜ. ISAS também é eficaz na prevenção da síntese de TXA₂ in vivo (TXB₂/sangue integral) e síntese de MD A através de plaquetas lavadas.

Os estudos enzimáticos mostram que isossorbida-2- aspirinato5-salicilato (ISAS) é especificamente ativado por duas enzimas humanas: BuChE no plasma humano, e menos rapidamente, mas com a mesma razão do caminho A/B pela carboxilesterase-2 humana (CE-2) presente nos microssomos epiteliais do intestino. A observação de que duas enzimas podem liberar aspirina de isossorbida-2-aspirinato- 5-salicilato (ISAS) é clinicamente relevante e vantajoso: se um paciente tem a função enzimática anômala com relação a uma, a outra é provável compensar e liberar a aspirina. Outra vantagem do projeto é que o composto é estável sob condições encontradas no lúmen do trato gastrointestinal mas quebra rapidamente após a absorção aos metabólitos bem caracterizados: ácido salicílico, isossorbida, e naturalmente, aspirina. (A similaridade da preferência do substrato neste caso pelo CE-2 e BuChE é muito surpreendente). Outra vantagem do composto é que seu carreador é eventualmente metabolizado a ácido salicílico e isossorbida, compostos que são inócuos ou bem caracterizados do ponto de vista farmacêutico. Enquanto ISAS tem um mérito farmacêutico significante em si, sua descoberta aponta para algo mais geralmente valioso. A descoberta de ISAS e os modelos cinéticos para sua produção e a liberação de aspirina no plasma são descritos em nossos documentos recentes (Moriarty et al. 2008).

Isossorbida-2-aspirinato-5-salicilato (ISAS) age como uma pró-droga de aspirina porque a porção isossorbida-5-salicilato da molécula da pró-droga tem um alto grau de complementaridade ao sítio ativo das carboxilesterases humana. Isto é porque este sofre uma hidrólise muito rápida. A porção de isossorbida-5-salicilato ou grupo carreador de ISAS promove com sucesso sua própria separação da aspirina enquanto ao mesmo tempo impede a hidrólise do grupo acetila da aspirina. Isto introduz um novo tipo de carreador altamente eficaz para a aspirina e potencialmente para outras drogas de ácido carboxílico. Isto é uma importante compreensão para a invenção.

A questão surgiu como se fosse possível alterar a estrutura de isossorbida-5-salicilato para características farmacêuticas melhoradas, enquanto conservando sua complementaridade de estearase. Além, disso, foi evidenciado que o padrão de substituição na posição 5 é crítico para a liberação de aspirina porque ISMNA (em que o 5-salicilato é substituído com um nitrato) não é uma pró-droga de aspirina no plasma humano. A conclusão é que um 5-nitrato não é compatível com a ligação estearase produtiva humana. Aproximadamente 25 compostos foram preparados em que a posição 5 foi sistematicamente mudada de modo a testar a influência do grupo 5 nas características de liberação da aspirina do grupo carreador (Figura 7 e Tabela 2). Os novos ésteres de aspirina foram testados incubando-os na solução de plasma humano e medindo-se a quantidade de aspirina produzida com relação à quantidade molar do composto adicionado à solução plasmática. Os ésteres sofreram uma hidrólise caracteristicamente rápida em diferentes graus junto com as vias A e B algumas com taxas de liberação se aproximando da produtividade de ISAS (Tabela 2 e Figura 7).

As características de liberação de aspirina de uma faixa de 25 ésteres são mostradas na Tabela 2 junto com alguns exemplos selecionados como fórmulas estruturais com a porcentagem de liberação de aspirina na Figura 7. Foi mostrado que o grupo na posição 5 influencia de maneira notável a direção da hidrólise (Figura 8 e exemplos na Figura 9).

O composto não substituído (isossorbida-2-aspirinato, 17) não é uma pró-droga de aspirina, indicando que a substituição 5 é necessária para a liberação de aspirina. Em geral, foi descoberto que a liberação significante de aspirina ocorre com ésteres de 5-benzoato e nicotinato. O local de hidrólise dominante no caso dos compostos substituídos com ésteres alifáticos foi no éster acetílico habitual (çf Compostos 4,5, 23 na Tabela 2). Também foi descoberto que os ésteres arílicos em que o grupo fenila foi substituído nas posições 2- e 3- foram mais produtivos. Por exemplo, o composto 1 sofre hidrólise junto com o caminho de aspirina produtivo a cerca de 60 %.

O composto mais eficaz descoberto é ISAS que sofre quase a conversão completa a aspirina na presença de butirilcolinoestearase purificada em tomo de 80 % no sangue humano.

ISDA pertence a uma nova família de compostos de éster substituído 5aromáticos que agem como pró-drogas de aspirina na presença de esterases humanas. Não é conhecido por que os compostos de benzoato também substituídos na posição orto ou meta são tão bem sucedidos, mas é provável 10 que seja devido a um arranjo favorável no local ativo da enzima. Este tipo de controle remoto da posição do ataque enzimático não é habitual.

^z Ó OH

Deste modo, foi descoberto que certos grupos carreadores com base em isossorbida promovem a hidrólise no ponto correto, levando à liberação de aspirina no sangue humano (b acima). Certos compostos de 15 isossorbida substituídos liberam aspirina em quantidades significantes quando incubados no sangue humano. A hidrólise seletiva é causada por uma interação altamente específica entre o grupo carreador e butirilcolinoestearase humana presente no plasma e com CE-2 no epitélio intestinal.

O reconhecimento de que os ésteres de isossorbida de aspirina podem agir como pró-drogas de aspirina contanto que a posição 5 seja apropriadamente substituída é crucial para a invenção. Os substituintes mais eficazes são ésteres 5-arílicos que também são substituídos na posição -2 ou 3 do anel de benzeno. Tais grupos promovem a liberação de aspirina na isossorbida na posição 2 remota ao invés da hidrólise do grupo de acetila. O composto 2 é o mais eficaz e o mais estudado das pró-drogas e isto leva à identificação de uma nova classe de carreadores eficazes para as pró-drogas de aspirina. Contudo, a invenção inclui e antecipa outros compostos diferentemente substituídos na posição 5 mas de maneira igualmente eficaz converteu a aspirina na presença de enzimas plasmáticas do sangue. Em particular, há um forte interesse comercial e acadêmico em um dispositivo de pró-droga capaz de liberar tanto aspirina quanto óxido nítrico, NO'.

Visto que os requerimentos estruturais para a hidrólise produtiva (ou direção dentro do local da estearase) foram identificados, o desafio de projetar uma pró-droga tanto de aspirina quanto de óxido nítrico continuou. O SAR sugeriu que um carreador do grupo de isossorbida-5benzoato pode tolerar outra substituição com um nitrato no anel de benzeno sem afetar sua características de direcionamento de hidrólise. Infelizmente, os nitratos aromáticos são ésteres de nitrato instáveis de fenol prontamente desproporcionados com relação ao orto-nitro fenol. Por sua vez, vários derivados de isossorbida- 2-aspirinato-5-benzoato de nitroximetila foram feitos os quais se adequam ao padrão abaixo: Estes incluem os compostos de 20 a 23 na Tabela 2.

plasmática humana para a capacidade de produzir aspirina no plasma humano. Consistente com o padrão anterior, foi descoberto que o composto de nitroximetila orto- e meta- substituído liberou a aspirina no plasma humano. Não houve liberação de aspirina à partir do composto para-substituído. Os compostos bem sucedidos também liberam quantidades signifícantes de aspirina na presença de microssomos do intestino humano, aparentemente mediados pela enzima CE-2, e seguindo o mesmo padrão como a orientação de IS AS (Figura 9). Uma vantagem é que onde um paciente tem baixa atividade de BuChE, o CE-2 pode liberar aspirina junto com a porção doadora de óxido nítrico. O composto 20 foi testado na agregação de plaquetas induzida por colágeno in vitro e descobriu ser mais potente do que a aspirina na inibição da agregação. Este também é um inibidor mais potente da agregação de plaquetas induzida por ADP em PRP. Não obstante, devido a este também liberar NO' é esperado inibir a agregação ao estí8mulo patológico que a aspirina não tem efeito. A aspirina inibe somente a agregação dependente de tromboxano, isto é, a agregação de plaquetas para somente um estímulo. Isto tem pouco efeito na agregação de alta dose de colágeno ou na agregação ao ADP. O óxido nítrico foi mostrado atenuar a toxicidade gástrica da aspirina e promover a cura de úlceras. Os compostos capazes de liberar tanto a aspirina quanto o óxido nítrico têm um potencial signifícante na prevenção do câncer, terapia e no tratamento de doenças cardiovasculares. A ativação do receptor de glicoproteína integrina GPIIb/IIIa é crucial para que a agregação de plaquetas ocorra. Além dos deslocamentos da selectina P dos α-grânulos para a membrana de superfície de plaqueta estar por baixo da adesão de plaquetas, respectivamente. Medimos estes receptores na agregação com diferentes concentrações dos compostos. As Figuras de 32 a 36 mostram que pro-asa e nitro-asa signifícantemente diminuíram a ativação de GPIIb/IIIa e o deslocamento da selectina P. A ativação de GPIIb/IIIa é a interação dinâmica controlada do caminho que estimula ou inibe a agregação. O óxido nítrico media o caminho inibidor principal e regulam a função de GPIIb/IIIa. A aspirina falhou em inibir a ativação das plaquetas na mesma concentração como ISAS (2) ou e compostos de nitrato 31a 32.

A invenção também considera as composições farmacêuticas que compreendem um composto da invenção que podem ser adaptados para a administração oral como uma cápsula ou tablete ou para a administração percutânea, por exemplo, na forma de um caminho transdérmico. A composição também pode estar na forma de um supositório ou uma formulação com base aquosa.

A invenção também fornece o uso do composto para obter a atividade anti-plaquetas e/ou outro tipo de atividades do tipo tal como atividade anti-pirética e/ou anti-inflamatória.

Em uma forma de realização particularmente preferida da invenção, a composição inclui outra entidade farmacêutica, especialmente um óleo terapêutico, tipicamente um óleo de peixe tal como óleo de fígado de bacalhau, ou um óleo vegetal tal como óleo de onagrácea. Nesta caso, a composição pode estar na forma de uma cápsula tendo uma casca de retenção contendo um enchimento incluindo os ingredientes ativos. O enchimento pode incluir um agente de suspensão tal como aquele selecionado de um ou mais de dióxido de sílica coloidal, óleos vegetais hidrogenados (opcionalmente em combinação com cera de abelhas), glicerídeos de alto ponto de fusão, e/ou lecitinas. O enchimento também pode incluir um antioxidante tal como aquele selecionado de um ou mais de D-alfa tocoferol, acetato de D-alfa tocoferol, tocoferóis misturados e ácido ascórbico. A cápsula pode ser uma cápsula de gelatina.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: Teoria da Remoção da Toxicidade da Aspirina

Figura 2: Uma pró-droga de aspirina bem sucedida deve sofrer a hidrólise no éster B em uma taxa maior do que o grupo de O-acetila A.

Figura 3A e 3B: Curva de progresso para a hidrólise de ISDA em plasma humano a 10 % (pH 7,4, 37° C): mostrando a concentração do precursor e alguns dos seus metabólitos como medido por HPLC em pontos de tempo sucessivos: ISDA (·), aspirina ( ), ácido salicílico (o), isossorbida2/5-aspirinato-2/5-salicilato (□), di-salicilato de isossorbida (0) e isossorbida5-salicilato (Δ). A aspirina máxima é atrasada com relação ao desaparecimento do ISDA precursor indicando que um metabólito é responsável por sua produção. O gráfico é redesenhado com a curva de ISDA omitida.

Figura 4A: Curva de progresso para a hidrólise de isossorbida2-aspirinato-5-salicilato ISAS (2) em 50 % de plasma humano (pH 7,4) a 37° C: ISAS (□), di-salicilato de isossorbida (0), isossorbida-5-salicilato (Δ), aspirina ( ) e ácido salicílico (o).

Figura 4B: Curva de progressão para a hidrólise de isossorbida-2-aspirinato-5-salicilato ISAS com BuChE de soro humano purificado no pH 7,4 e 37° C: Isossorbida-2-aspirinato-5-salicilato (□), isossorbida-5-salicilato (Δ), aspirina ( ), ácido salicílico (o) e di-salicilato (0).

Figura 5: ISDA primeiro sofre a hidrólise no grupo de acetila do 5-aspirinato (70 %) liberando ISAS (2) que sofre hidrólise predominantemente à aspirina e isossorbida-5-salicilato. Os pontos principais da intervenção produtiva pela colinoestearase plasmática (BuChE) são indicados em vermelho. Note que isto é relativamente estável para as esterases. A hidrólise de ISDA também procede (30 %) junto com um caminho paralelo não produtivo que não libera a aspirina mas ao invés disso, isossorbida e ácido salicílico.

Figura 6: Curvas de resposta de concentração mostrando a inibição da agregação de plaquetas humanas induzida por colágeno in vitro por ISAS (2) e aspirina (ASA). As concentrações de drogas que inibem a agregação em 50 % (IC₅₀,) também são mostradas. ISAS é signifícantemente mais potente do que ASA na agregação (os dados são média ± SD p < 0,01, n = 4). 6B mostra as curvas de inibição relativa para ISAS (2), óxido nítrico que libera pró-drogas 31, 32, 33 e aspirina. 6 mostra a agregação em % do PRP após a incubação com ISAS, compostos 31 a 33 ou aspirina. Esta figura mostra a agregação em porcento para colágeno ao invés da inibição em porcento da agregação para o colágeno em três concentrações diferentes para cinco compostos, aspirina, ISAS e os três nitratos isoméricos, 31, 32, 33. (***P<0,05)

Figura 7: Exemplos de 5-ésteres altenativos incubados na solução plasmática humana da Tabela 2. Os valores em % representam a quantidade de hidrólise que ocorre nos locais A, liberando éster de salicilato, e o local B liberando a aspirina. Esta figura ilustra a dependência da liberação de aspirina na posição 2 na estrutura do éster na posição 5 remota.

Figura 8: O 5-substituinte ‘R’ influencia de maneira decisiva o caminho da hidrólise.

Figura 9: Mostrando o desaparecimento do isossorbida-2aspirinato-5-(3-nitroximeil)-benzoato após a incubação na presença de microssomos do epitélio intestinal humano e a liberação de aspirina, ácido salicílico e o carreador de isossorbida substituído por nitrato.

Figura 10: Síntese de ISAS 2 de ISMN ligando ao ácido salicílico protegido seguido pela desbenzilação.

Figura 11: Via sintética para a preparação de Is-2-aspirinato-547 (3-nitróxi-metil)benzoato 21

Figura 12: Via sintética para a preparação de cloreto de 2clorometilbenzoíla.

Figura 13: Síntese direta de 5-ésteres substituídos por nitrato.

Figura 14: Síntese de éster de 3-nitroxibenzoato de isossorbida-2-aspirinato através da esterificação com um benzoato de clorometila e troca de haleto com nitrato de prata.

Figura 15: Is-2-aspirinato-5-salicilato (ISAS, 2) em HLM. 9,4 μΜ de aspirina produzida.

Figura 16: Is-2-aspirinato-5-salicilato (ISAS, 2) (1,04 x IO'⁴M) em HIM. 27 μΜ de aspirina produzida.

Figura 17: HLM incubado por cinco minutos com um inibidor de BChE potente antes de adicionar Is-2-aspirinato-5-salicilato (ISAS, 2). 16 μΜ de aspirina produzida.

Figura 18: Is-2-aspirinato-5-salicilato (ISAS, 2) (1,1 x 10'⁴M) em HLM com iso-OMPA (10 μΜ). 8,5 μΜ de aspirina produzida.

Figura 19: Is-2-aspirinato-5-salicilato (ISAS, 2) (1,04 x IO’⁴M) em HIM com BNPP (14 μΜ).

Figura 20: Is-2-aspirinato-5-(3-nitróxi-metil)benzoato (21) (2,5 x 10’⁴M) em 50 % de plasma humano. 26 μΜ de aspirina produzida.

Figura 21: Is-2-aspirinato-5-(3-nitróxi-metil)benzoato (21) (1 x 10’⁴M) em 80 % de plasma humano. 21 μΜ de aspirina produzida.

Figura 22: Is-2-aspirinato-5-(3-nitróxi-metil)benzoato (21) (1 x 10’⁴M) em HLM com iso-OMPA (14,4 μΜ). 1,4 μΜ de aspirina produzida.

Figura 23: Is-2-aspirinato-5-(3-nitróxi-metil)benzoato (21) (1,05 x 10’⁴M) em HIM. 20 μΜ de aspirina produzida.

Figura 24: Is-2-aspirinato-5-(3-nitróxi-metil)benzoato (21) (1,1 x 10’⁴M) em HIM com iso-OMPA (14 μΜ). 12,7 μΜ de aspirina produzida.

Figura 25: Is-2-aspirinato-5-(2-nitróxi-metil)benzoato (20) (1 x

IO’⁴M) em 50 % de plasma humano. 10,3 μΜ de aspirina produzida.

Figura 26: Is-2-aspirinato-5-(2-nitróxi-metil)benzoato (20) (1 x 10'⁴M) em HIM. 21,7 μΜ de aspirina produzida.

Figura 27: Is-2-aspirinato-5-(4-nitróxi-metil)benzoato (22) (1 x 10'⁴M) em 50 % de plasma humano. 2 μΜ de aspirina produzida.

Figura 28: Is-2-aspirinato-5-(4-nitróxi-metil)benzoato (22) (1 x 10’⁴ M) em HIM. 9,97 μΜ de aspirina produzida.

Figura 29: Éster fenílico do ácido 2-acetoxibenzóico (éster fenólico de aspirina) (1,09 x 10’⁴M) em HIM (40 pg/ml). 7,7 μΜ de aspirina produzida.

Figura 30: Éster fenílico do ácido 2-acetoxibenzóico (1,09 x 10'⁴M) em HIM (20 pg/ml). 5,3 μΜ de aspirina produzida.

Figura 31: Inibição da agregação de plaquetas em resposta ao ADP in vitro pelos cinco compostos de teste em três concentrações diferentes. A concentração zero é a inibição pelo veículo, DMSO.

Figura 32: Expressão PAC-1 em resposta ao colágeno na plaqueta lavada tratada com compostos de teste 2, 31 a 33, aspirina. Esta figura mostra a expressão em porcento da glicoproteína PAC-1 em plaquetas lavadas. Há pouca estearase na preparação de modo que os dados ilustram que a ativação da estearase das pró-drogas da invenção é necessária antes da inibição da função de plaquetas in vitro.

Figura 33: Expressão de PAC-1 em resposta ao colágeno no plasma rico em plaquetas com os compostos de teste 2, 31 a 33, aspirina. Esta figura mostra o grau da expressão de glicoproteína no plasma rico em plaquetas. A expressão da glicoproteína é necessária para a reticulação das plaquetas na agregação completa e os dados mostram que os compostos da invenção são mais potentes do que a aspirina na supressão desta expressão na preparação do plasma.

Figura 34: Expressão de selectina P para colágeno no plasma rico em plaquetas com os compostos de teste 2, 31 a 33, aspirina. A selectina P é outra glicoproteína cuja expressão se relaciona com a ativação de plaquetas. Os compostos da invenção são muito mais potentes do que a aspirina na ativação da inibição de plaquetas nas preparações plasmáticas.

Figura 35: A expressão da selectina P para colágeno em plaquetas lavadas com os compostos de teste 2, 31 a 33, aspirina. Neste ponto, novamente em plaquetas lavadas existe algum amortecimento da expressão de glicoproteína (diferença significante com colágeno (***p < 0,001). Contudo, nas suspensões de plaquetas lavadas que carecem de esterases, os compostos não são tão eficazes quanto a aspirina.

Descrição Detalhada da Invenção

Métodos experimentais gerais: Materiais

5-ISMN foi obtido da Sifa Ltd. butirilcolinoestearase de soro humano purificado (EC 3.1.1.8), carboxilestearase de fígado de coelho (EC 3.1.1.1), BNPP (bis-4-nitrofenilfosfato), iso-OMPA (tetraisopropilpirofosforamida), microssomos de fígado humano reunidos, cloreto de 3clorometilbenzoíla, cloreto de 4-clorometilbenzoíla, nitrato de prata, ftaleto, diclorotrifenilfosforano e solventes de grau de HPLC foram obtidos da Sigma-Aldrich. Colágeno e ADP foram obtidos da Chronolog (Havertown, PA, E.U.A.). Aloficocianina anticorpo monoclonal conjugado a (APC) contra GPIIb/IIIa de alta afinidade (PAC-l-APC) e anticorpo monoclonal conjugado a APC contra a selectina P de plaqueta humana (CD62P) foram adquiridos da BD Biosciences (Oxford, RU).

Todos outros solventes e reagentes eram de grau analítico. Os microssomos reunidos do intestino humano foram obtidos da BD Gentest no Reino Unido.

Os compostos da invenção são facilmente preparados à partir de aspirinato de mono-nitrato de isossorbida (ISMNA), por si preparado através da esterificação de mono-nitrato de isossorbida (ISMN) com cloreto de acetil salicoíla de acordo com a Gilmer et al 2001. O nitrato é seletivamente removido através do tratamento com paládio no carbono sob uma atmosfera de hidrogênio gerando o isossorbida-2-aspirinato intermediário chave. Os compostos também podem ser obtidos através da 5esterificação seletiva de isossorbida seguido pela ligação do grupo aspirinato na posição 2 (a posição 5 com relação ao isossorbida sendo endo é mais reativa para a acilação do que a posição 2-exo porque o 5-OH é ativado por uma ligação de H intramolecular)

No caso do isossorbida-2-aspirinato-5-salicilato (ISAS), a acilação direta com ácido salicílico seria complicada através da competição entre o salicilato-OH e o isossorbida-OH. Consequentemente um ácido salicílico protegido por éter benzílico é introduzido primeiramente usando o procedimento de ligação de DCC padrão e a proteção benzila é removida sob condições redutivas (Figura 10).

Outros compostos de éster da invenção podem ser preparados através da acilação direta usando a ligação DCC ou através do tratamento com o cloreto ácido apropriado na presença de uma base temária tal como trietilamina. Os ésteres substituídos por nitróxi podem ser preparados ligandose diretamente aos ácidos apropriadamente substituídos. Altemativamente, os compostos substituídos por nitróxi podem ser obtidos primeiramente esterificando-os com um ácido que carrega um cloreto ou brometo que podem ser subsequentemente deslocados por nitrato através do tratamento com AgNO₃ em acetonitrila.

Exemplos experimentais: síntese de isossorbida-2-aspirinato5-ésteres: As fórmulas moleculares aparecem na Figura 2.

Isossorbida-2-aspirinato-5-[2-metilbenzoato] 1

A uma solução de isossorbida-2-aspirinato 17 (0,2 g, 0,65 mmol) em diclorometano (15 ml) foi adicionado trietilamina (0,11 ml, 0,98 mmol) e cloreto de 2-toluoíla (0,09 ml, 0,72 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 24 horas e depois foi lavada com água (2 x 25 ml), HCI (1 m, 25 ml) e NaHCO₃ aquoso saturado antes de secar em MgSO₄ anidro. O solvente foi removido no vácuo para fornecer 0,41 g de produto bruto como óleo marrom. Purificação por cromatografia de coluna usando hexano e acetato de etila (2:1) como eluentes forneceu o produto como um óleo amarelo. Este foi recristalizado em etanol para produzir o composto 1 como um sólido branco (0,11 g, 39,6 %) ponto de fusão 104 a 106 °C. IR_vmax (KBr): 2987,1 e 2922,8 (alongamento de C-H), 1762,0 e 1718,1 (C=O), 1259,5 e 1199,8 (C(O)OR aromático), 1072,4 (C-O-C) cm’¹. HRMS: Requer: 449,1212 (M⁺+23), Encontrado: 449,1238 (ΝΓ+23), *H RMN δ (CDC1₃): 2,38 (3H, s, OCOCH₃), 2,65 (3H, s, ArCH₃), 4,01 (1H, dd, J 5,52 e

5,52 Hz, IS6-H [a]), 4,12 (3H, m, IS1H [αβ] e IS6H [β]), 4,66 (1H, d, J 4,52 Hz, ISH-3), 5,04 (1H, t, J 5,04 e 5,0 Hz, ISH-4), 5,41 (1H, q, J 5,52, 5,52 e

5,52 Hz, ISH-5), 5,47 (1H, d, J 2,0 Hz, ISH-2), 7,13 (1H, dd, J 1,0 e 1,0 Hz, ArH-4), 7,33 (1H, t, J 7,0 e 6,52 Hz, ArH-2), 7,59 (1H, t, J 6,52 e 6,52 Hz, ArH-3), 8,02 (1H, dd, J 1,52 e 2,0 Hz, ArH-1). ¹³CRMN ppm (CDC1₃): 20,43 (Ar-CH₃), 21,12 (OCOCH₃), 70,29 (ISC-1), 72,72 (ISC-6), 73,81 (OC(O)Ar), 78,22 (ISC-4), 80,52 (ISC-2), 85,63 (ISC-3), 122,32 (ArjC-1), 123,38 (ArjC-

4), 125,58 (AtíC-2 e Ar₂C-4), 128,46 (Ar₂C-2 e Ar₂C-5), 130,19 (Ar₂C-3), 133,78 (AtíC-3), 140,08 (Ar₂C-l), 150 26 (ArjC-5), 163,12 (ArOCOMe), 169,15 (ArCOOR)

Isossorbida-2-aspirinato-5-salicilato, ISAS, 2

O ácido 2-benziloxibenzóico (364,8 mg = 1,6 mmol) foi dissolvido em DCM seco (20 ml) e agitado. IS-2-asp-5-OH (500 mg =1,6 mmol) e 10 % de DMAP foram adicionados. O frasco foi resfriado a 0 °C e DCC (340 mg, l,6mmol) foi adicionado. A agitação foi continuada por cinco minutos e a temperatura foi deixada chegar até a temperatura ambiente onde foi agitada durante a noite. A reação foi filtrada e o filtrado foi lavado com 0,lM HCI, 5 % NaHCO₃ e água. Secado em sulfato de sódio e evaporado até um óleo. Este foi purificado por cromatografia de coluna de hexano/acetato de etila (2:1) para fornecer um produto branco (Rf = 0,4, 228 mg). Este foi dissolvido em metanol/acetato de etila (1:1). O Pd/C foi adicionado e a reação foi agitada sob hidrogênio durante a noite. A reação foi filtrada e concentrada. O óleo foi purificado por cromatografia de coluna usando hexano/acetato de etila (1:1) para produzir um sólido branco (107 mg Rf = 0,67). ). ’ΗΚΜΝ δ (CDCh) 400MHz: 2,38 (3H, s, OCOCH₃), 4,02 (4H, m, ISH-1, ISH-1’, ISH-6 e ISH-6’), 4,63 (1H, d, ISH-3), 5,03 (1H, t, ISH-4), 5,43 (2H, dd, ISH-2, ISH-

5), 6,91 (1H, t, Ar-H), 7,01 (1H, d, Ar-H), 7,1 (1H, d, Ar-H), 7,28 (1H, t, ArH), 7,48 (1H, t, Ar-H), 7,53 (1H, t, Ar-H), 7,89 (1H, d, ArH), 8,00 (1H, d, ArH), 10,61 (1H, s, OH). ¹³CRMN ppm (CDCfi) 400MHz: 20,51 (OCOCH₃), 70,46 (ISC-1), 72,78 (ISC-6), 74,31 (ISC-5), 77,91 (ISC-2), 80,69 (ISC-4), 85,70 (ISC-3), 117,30 (Ar₂ C-l), 118,90, 123,41, 125,65, 129,47, 131,42, 133,94, 135,65, 150,24 (AriC-2), 163,12 (ArOCOCH₃), 168,87 (ArÇ(O)OR).

Isossorbida-2-aspirinato-5- [3 -metilbenzoato] 3

Isossorbida-2-aspirinato 17 (0,2 g, 0,65 mmol) foi dissolvido em tolueno (15 ml) a 0 °C, ao qual foi adicionado DCC (0,13 g, 0,65 mmol) e DMAP (0,08 g, 0,07 mmol). Após 10 minutos o frasco de reação foi retomado à temperatura ambiente e ácido 3-toluico (0,09g) foi adicionado e deixando agitar por 24 horas. Após lavagem com HCl (30 ml, 1M), NaHCO3 aquoso saturado (30 ml), solução de salmoura saturada (30 ml) e água (3 x 30 ml) a mistura de reação foi secada em Na₂SO₄ anidro e o solvente removido no vácuo para produzir um produto bruto como um óleo transparente. Purificação por cromatografia de coluna usando hexano e acetato de etila (3:2) como eluentes produziu o composto 3 como cristais brancos (0,12 g, 43,2 %): ponto de fusão 96 a 98 °C. IR_vmax (KBr): 2987,1 e 2922,8 (C-H alongamento), 1762,0 e 1718,1 (C=O), 1259,5 e 1199,8 (C(O)OR, aromático), 1072,4 (CO-C) cm¹. HRMS: Requer: 449,1212 (M⁺+23), Encontrado: 449,1234 (M⁺+23), Ή RMN δ (CDC1₃): 2,36 (3H, s, OCOCH₃), 2,43 3H, s,

ArCH₃), 4,09 (4H, m, ISl-H₂[a + β] e IS6-H₂[a + β]), 4,65 (1H, d, J 5,0 Hz, ISH-3), 5,04 (1H, t, J 5,04 e 5,0 Hz, ISH-4), 5,43 (2H, m, ISH-5 e ISH-2), 7,12 (1H, d, J 8,0 Hz, ArH-4), 7,35 (3H, m, ArH-2), 7,58 (1H, q, J 1,0, 6,56 e 1,48 Hz, ArH-3), 8,01 (1H, dd, J 1,0 e 1,52 Hz, ArH-1). ¹³CRMN ppm (CDC1₃): 20,42 (ArCH₃), 20,79 (OCOÇH₃), 70,39 (ISC-1), 72,77 (ISC-6), 73,92 (ISC-5), 78,19 (ISC-3), 80,66 (ISC-2), 85,66 (ISC-3), 122,35 (Ar^-1), 123,39 (ArjC-4), 125,57 (ArjC-6), 126,45 (ArjC-2), 12,89 (Ar₂C-4), 129,80 (Ar₂C-5), 131,37 (Ar₂C-3), 133,77 (Ar₂C-l), 150,25 (ArjC-5), 163,15 (ArOÇOCH₃), 165,58 (ISOÇOAr), 169,12 (ArOÇO).

Isossorbida-2-aspirinato-5-acetato 4

A uma solução de isossorbida-2-aspirinato 17 (0,2 g, 0,65 mmol) em diclorometano (20 ml) foi adicionado trietilamina (0,09 ml, 0,65 mmol) e anidrido acético (0,06 ml, 0,65 mmol). O frasco de reação foi agitado na temperatura ambiente por 24 horas antes de lavar com água (2 x 20 ml), HCl (1M, 30 ml), NaHCO3 aquoso saturado (30 ml) e secado em MgSCh. O solvente foi removido por evaporação rotativa para produzir 0,52 g de produto bruto. Purificação por cromatografia de coluna usando hexano e acetato de etila (3:2) como eluentes forneceu o composto 4 como material branco cristalino (0,1 g, 43,8 %). ponto de fusão 96 a 98 °C. IR_vmax(KBr): 2966,9 e

2928,6 (C-H alongamento), 1751,6 e 1734,0 (C=O), 1607,8 (C=C alongamento), 1262,0 e 1193,9 (C(O)OR aromático), 1082,5 (C-O-C) cm'¹. HRMS: Requer: 373,0899 (M⁺+23), Encontrado: 373,0877 (MG23), 'Η RMN δ (CDC1₃): 2,13 (3H, s, IS-OCOCH₃), 2,37 (3H, s, Ar-OCOCH₃), 3,85 (1H, q, J 5,52, 4,52 e 4,96 Hz, IS6a-H), 3,99 (1H, q, J 6,0, 3,52 e 6,04 Hz, Ι861β-Η), 4,10 (2H, t, J 3,52 e 2,0 Hz, ISlH₂[a + β]), 4,59 (1H, d, J 4,52 Hz, ISH-3), 4,90 (1H, t, J 5,0 e 5,04 Hz, ISH-4), 5,19 (1H, d, J 5,52 Hz, ISH-5), 5,44 (1H, d, J 5,52 Hz, ISH-2), 7,12 (1H, d, J 8,04 Hz, ArH-4), 7,33 (1H, t, J

7,52 e 7,56 Hz, ArH-2), 7,59 (1H, m, ArH-3), 8,01 (1H, dd, J 6,04 Hz, ArH1). ¹³C RMN ppm (CDC1₃): 20,43 (ArOCOCH₃), 20,18 (IS-OCOCH₃), 69,91 (ISC-2), 72,78 (ISC-6), 73,52 (ISC-5), 78345 (ISC-3), 80,32 (ISC-1), 122,29 (ArC-5), 123,39 (ArC-1), 125,58 (ArC-3), 131,36 (ArC-2), 133,81 (ArC-4), 154,32 (ArC-6), 167,15 (OÇOAr), 168,48 (ArOÇOCH₃), 171,27 (OÇOCH₃).

Isossorbida-2-aspirinato-5-proprionato 5

Isossorbida-2-aspirinato 17 (0,3 g, 0,98 mmol) foi dissolvido em diclorometano (20 ml) ao qual foi adicionado anidrido propriônico (0,14 ml, 1,07 mmol) e trietilamina (0,09 ml, 1,07 mmol). Este foi deixado agitar na temperatura ambiente por 24 horas antes de lavar com HCI (30 ml, 1M), NaHCO₃ aquoso saturado (30 ml) e água (2 x 30 ml). A reação foi secada em Na₂SO₄ anidro e o solvente foi removido no vácuo para produzir um produto bruto como um óleo amarelo (0,19 g). Purificação por cromatografia de coluna usando hexano e acetato de etila (5:2) como eluentes produziu um produto como cristais brancos (0,3 g, 84,3 %): ponto de fusão 54 a 56 °C. IR_vmax (KBr): 2989,0 e 2933,0 (C-H alongamento), 1764,0 e 1734,5 (C=O), 1606,3 (C=C alongamento), 1254,3 e 1193,6 (C(O)OR, aromático), 1080,6 (C-O-C) cm’¹. HRMS: Requer: 387,1056 (M⁺+23), Encontrado: 387,1069 (ΜΓ+23). ^!H RMN δ (CDC1₃): 1,19 (3H, t, J 8,04 e 7,52 Hz, CH₃), 2,37 (3H, s, OCOCH₃), 2,44 (2H, q, J 7,52, 8,04 e 7,52 Hz, OCH₂), 3,86 (1H, q, J 5,52,

4,52 e 5,04 Hz, IS6a-H), 3,98 (1H, q, J 5,52, 4,04 e 6,0 Hz, Κόβ-Η), 4,08 (2H, m, ISlH₂[a + β]), 4,59 (1H, d, J 4,52 Hz, ISH-3), 4,91 (1H, t, J 5,0 e 5,04, ISH-4), 5,20 (1H, q, J 5,04, 6,0 e 5,52 Hz, ISH-5), 5,43 (1H, d, J 3,0 Hz, ISH-2), 7,12 (1H, dd, J 1,0 e 1,0 Hz, ArH-4), 7,33 (1H, t, J 1,0, 6,56 e 8,0 Hz, ArH-2), 7,59 (1H, t, J 6,0 e 6,52 Hz, ArH-3), 8,01 (1H, dd, J 1,48 e 2,0 Hz, ArH-1). ¹³C RMN ppm (CDC1₃): 8,62 (CH₂ÇH₃), 20,49 (COCH₃), 26,84 (OCOCH₂), 70,08 (ISC-2) 72,72 (ISC-6), 73,32 (ISC-5), 78,12 (ISC-3), 80,37 (ISC-1), 85,45 (ISC-4), 122,22 (ArC-5), 123,41 (ArC-1), 125,64 (ArC-3), 131,41 (ArC-2), 133,89 (ArC-4), 150,24 (ArC-6), 163,09 (OÇOAr), 169,28 (OÇOCH₃), 173,40 (OÇOCH₂).

Isossorbida-2-aspirinato-5-benzoato 6

A uma solução de isossorbida-2-aspirinato 17 (1,0 g, 3,25 mmol) em diclorometano (20 ml) foi adicionado ácido benzóico (0,59 g, 4,88 mmol), DCC (l,34g, 6,49 mmol) e DMAP (0,38 g, 3,11 mmol). A mistura de reação foi deixada agitar na temperatura ambiente por três horas antes de filtrar o precipitado e lavar o filtrado com HCl (30 ml, 1M), Na₂HCO3 aquoso saturado (30 ml) e água (3 x 30 ml). Foi secado em Na₂SO₄ anidro e o solvente foi removido no vácuo para fornecer óleo incolor, que foi recristalizado em etanol até produzir um produto como cristais brancos (1,13 g, 84,3 %): ponto de fusão 80 a 82 °C. IR_vmax(KBr): 2991,1 e 2932,9 (C-H, alongamento), 1762,9 e 1720,6 (C=O), 1275,5 e 1199,1 (C(O)OR aromático), 1078,4 (C-O-C) cm’¹. HRMS: Requer: 435,1056 (M⁺+23), Encontrado: 435,1043 (M⁺+23). ’H RMN δ (CDC13): 2,37 (3H, s, OCOCH3), 4,07 (1H, m, ISla-H), 4,11 (3H, m, IS6H[a + ] e ISlp-H), 4,65 (1H, d, J 5,0 Hz, ISH-5), 5,05 (1H, t, J 5,5 e 5,0 Hz, ISH-3), 5,56 (1H, m, ISH-4), 7,13 (1H, d, J 8,04 Hz, ArjH-5 e A^H-3), 7,27 (1H, t, J 8,04 e 6,52 Hz, Ar2H- e Ar2H-5), 7,33 (1H, d, J 7,56 Hz, ArjH-4), 7,49 (2H, t, J 7,52 e 7,56 Hz, Ar2H-5), 8,01 (1H, d, J 7,56 Hz, ArjH-2), 8,12 (2H, d, J 7,52 Hz, Ar2H-2 e Ar2H-6). ¹³C RMN ppm (CDC13): 20,44 (OÇOCH₃), 70,42 (ISC-1), 72,79 (ISC-6), 73,97 (ISC-5) 78,16 ISC-2), 80,67 (ISC-4), 85,67 (ISC-3), 123,39 (ArjC-5), 125,58 (ARjC1), 128,00 (ArjC-3), 129,31 (Ar₂C-3 e Ar₂C-5), 131,39 (ArjC-2 e Ar₂C-6), 132,82 (Ar₂C-2 e Ar₂C-l), 133,79 (Ar₂C-4), 134,81 (AnC-4), 154,32 (ArjC-

6), 167,10 (OCOCH3), 168,2 (OÇOArj e OÇOAr₂).

Isossorbida-2-aspirinato-5-nicotinato 7

Isossorbida-2-aspirinato 17 (0,3 g, 0,98 mmol), em diclorometano (20 ml) a 0 °C foi agitado por 10 minutos na presença de DCC (0,2 g, 0,98 mmol) e DMAP (0,12 g, 0,98 mmol). O frasco de reação foi retomado até a temperatura ambiente, ácido nicotínico (0,12 g, 0,98 mmol) foi adicionado e deixado agitar por 24 horas. A mistura de reação foi lavada com HCl (20 ml, 1M), NaHCO3 aquoso saturado (20 ml), água (3 x 20 ml), secada em Na₂SO4 anidro e o solvente removido no vácuo para fornecer produto como um óleo bruto (0,95 g). Purificação por cromatografia de coluna em gel de sílica usando diclorometano e acetato de etila (95:5) como eluentes produziu o composto 7 como cristais brancos (0,12g, 29,7 %): ponto 5 de fusão 94 a 96 °C. IR_vmax (KBr): 3327,6 (N=C), 2929,6 (C-H alongamento),

1731.7 e 1718,7 (OO), 1654,4 (C=C alongamento), 180,7 e 1195,9 (C(O)OR aromático), 1090,4 (C-O-C) cm'¹. HRMS: Requer: 436,1008 (M⁺+23),

Encontrado: 436,1011 (M^+23). Ή RMN δ (CDC1₃): 2,36 (3H, s, OCOCH₃),

4,11 (9H, m, ISl-H₂[a + β] e IS6-H2[a + β]), 6,64 (1H, d, J 4,52 Hz, ISH-3), 10 5,05 (1H, t, J 5,04 e 5,52 Hz, ISH-4), 5,46 (2H, dd, J 2,0 e 2,52 Hz, ISH-5 e

ISH-2), 7,11 (1H, d, J 8,52 Hz, AriH-2), 7,32 (1H, q, J 6,52, 8,04 e 8,52 Hz, AnH-3), 7,43 (1H, q, J 6,53, 8,04 e 8,52 Hz, ΑηΗ-5), 7,59 (1H, t, J 6,04 e

6,52 Hz, AriH-4), 8,00 (1H, dd, J 1,52 e 2,0 Hz, Ar₂H-5), 8,34 (1H, m, Ar₂H-

6), 8,82 (1H, dd, J 2,0 e 1,48 Hz, Ar₂H-4), 9,28 (1H, d, J 2,0 Hz, Ar₂H-2). ¹³C

RMN ppm (CDC1₃): 20,52 (OCOÇH₃), 79,32 (ISC-1), 72,75 (ISC-6), 74,38 (ISOC(O)Ar), 74,43 (ISC-5), 78,27 (ISC-4), 80,60 (ISC-2), 85,60 (ISC-3),

122,26 (ArjC-1), 122,88 (ArjC-4), 123,38 (Ar₂C-4), 125,57 (ArjC-6), 131,35 (Ar₂C-6), 133,83 (ArjC-2), 136,68 (ArjC-3), 150,55 (Ar₂C-5), 153,30 (Ar₂C1), 164,13 (AriC-5), 164,13 (Ar₂C-3), 170,59 (ArÇOOR).

Isossorbida-2-aspirinato-5-[iso-nicotinato] 8

Isossorbida-2-aspirinato 17 (0,2 g, 0,65 mmol) foi dissolvido em diclorometano (20 ml) a 0 °C ao qual foi adicionado DCC (0,13 g, 0,65 mmol) e DMAP (0,08 g, 0,65 mmol). Após 10 minutos o frasco de reação foi retomado à temperatura ambiente e ácido iso-nicotiníco (0,08 g, 0,65 mmol) 25 foi adicionado e agitado por 24 horas. A reação foi lavada com HCI (20 ml,

1M), NaHCO3 aquoso saturado (20 ml), água (3 x 20 ml), secado em anidro MgSO₄ e o solvente removido no vácuo para produzir um composto 8 como um pó branco (0,17 g, 63,1 %): ponto de fusão 86 a 88 °C. IR_vmax (KBr):

3327.8 (N=C), 2929,3 (C-H alongamento), 1751,8 e 1710,7 (C=O), 1628,0 (C=C alongamento), 1249,0 e 1194,1 (C(O)OR aromático), 1082,8 (C-O-C) cm'¹. HRMS: Requer: 436,1008 (M>23), Encontrado: 436,1004 (M⁺+23). Ή RMN δ (CDC1₃): 2,37 (3H, s, OCOCH₃), 4,09 (5H, m, ISl-H₂[a + β] e IS6Η₂[α + β]), 4,65 (1H, d, J 4,52 Hz, ISH-3), 5,05 (1H, t, J 5,52 e 5,04 Hz, ISH4), 5,46 (2H, dd, J 5,52 e 5,04 Hz, ISH-5 e ISH-2), 7,12 (1H, d, J 7,04 Hz, AriH-2), 7,33 (1H, m, AriH-3), 7,59 (2H, t, J 6,04 e 6,04 Hz, AriH-5 e ArjH4), 7,90 (1H, d, J 5,04 Hz, Ar₂H-6), 8,01 (H, dd, J 2,0 e 1,52 Hz, Ar₂H-2), 8,84 (1H, s, Ar₂H-5), 8,98 (1H, s, Ar₂H-3).

Isossorbida-2-aspirinato-5-benzilóxi benzoato 9

A uma solução de isossorbida-2-aspirinato 17 (0,27 g, 0,87 mmol) em diclorometano (20 ml) foi adicionado ácido benzilóxi benzóico (0,20 g, 0,87 mmol), DCC (0,18 g, 0,87 mmol) e DMAP (0,01 g, 0,09 mmol). O frasco de reação foi agitado na temperatura ambiente por 24 horas antes de filtrar e lavar o filtrado com HCl (30 ml, 0,1 M), NaHCOs aquoso saturado (30 ml) e água (2 x 30 ml). Após secar em Na₂SÜ4 anidro, o diclorometano foi removido no vácuo para fornecer 0,7 g de produto bruto como óleo incolor. Purificação por cromatografia de coluna em gel de sílica usando hexano e acetato de etila (3:1) como eluentes produziu 0,19 g de composto 9 como cristais brancos (41,5 %): ponto de fusão 76 a 78 °C. IR_vmax (KBr): 1772,7 e 1726,2 (C=O), 1276,6 (C(O)OR aromático), 1078,1 (C-O-C) cm’¹. HRMS: Requer: 541,1475 (M⁺+23), Encontrado: 541,1460 (M⁺+23). ^!H RMN δ (CDCIs): 2,05 (2H, s, ArOCH2Ar), 2,36 (3H, s, OCOCH3), 3,92 (1H, q, J 5,0, 5,04 e 5,0 Hz, IS6a-H), 4,02 (3H, m, ISlHfa + β]), 4,13 (1H, q, J 7,04, 7,0 e 7,56 Hz, ISóH-β), 4,62 (1H, d, J 5,0 Hz, ISH-3), 5,02 (1H, t, J 5,04 e 5,0 Hz, ISH-4), 5,19 (2H, s, ISH-5), 5,39 (2H, m, ISH-5), 7,03 (2H, m, 2 x Ar-H) 7,11 (1H, d, J 7,56 Hz, Ar-H) 7,33 (2H, m, Ar-H), 7,41 (2H, t, J 6,04 e 7,04 Hz, Ar-H), 7,48 (3H, m, Ar-H) 7,58 (1H, m, Ar-H), 7,92 (1H, dd, J 1,52 e 2,0 Hz, Ar-H) 8,01 (1H, dd, J 1,48 e 2,0 Hz, Ar-H). ^I3CRMN ppm (CDC13): 20,49 (OCOCH₃), 70,12 (ISC-6), 70,19 (ISC-2), 72,59 (ISC-5), 73,84 (ISC58

3),78,28 (ArOÇH₂), 80,48 (ISC-1), 85,59 (ISCA), 113,18 (Ar₂C-5), 119,29 (Ar₂C-l). 120,10 (Ar₂C-3), 122,30 (AijC-5), 123,41 (ArjC-1), 125,64 (AnC3), 126,78 (Ar₃C-2 e Ar₃C-6), 127,51 (Ar₃C-4), 128,08 (Ar₃C-3 e Ar₃C-6),

128.13 (AriC-2), 131,44 (Ar₂C-2), 131,81 (ArjC-4) 133,44 (Ar₂C-4), 136,09 (Ar₃C-l), 150,21 (ArjC-6), 157,95 (Ar₂C-6), 163,16 (ArOÇ(O)Me), 165,20 (Ai€(O)OR), 169,28 (ArÇ(O)OR).

Isossorbida-2-aspirinato-5-(2-aminobenzoato) 10

Isossorbida-2-aspirinato 17 (0,69g, 2,2 mmol) foi dissolvido em DCM (20 ml) ao qual foi adicionado DCC (0,44g, 2,2 mmol) e DMAP (0,05 g, 0,22 mmol) e o frasco de reação foi agitado a 0 °C por 10 minutos. Depois de retomado à temperatura ambiente, ácido antranílico (0,29g, 2,2 mmol) foi adicionado deixando agitar por 3 horas. A mistura de reação foi lavada com HCl (20 ml, 1M), NaHCO₃ aquoso saturado (20 ml), solução de salmoura saturada (20 ml) e água (2 x 20 ml), secado em Na₂SO₄ anidro e solvente removido no vácuo para produzir produto como óleo bruto amarelo. Purificação por cromatografia de coluna em gel de sílica usando hexano e acetato de etila (4:1) como eluentes produziu composto 10 como um sólido amarelo (0,39g, 41,5 %). O produto foi armazenado a 0 a 4 °C até necessário para testar. Ponto de fusão 150 a 152 °C. IR_Vmax (KBr): 3443,4 (N-H alongamento), 2920,5 (C-H alongamento), 1742,7 (C=O), 1548,0 (curva de N-H), 1220,9 e 1158,6 (C(O)OR, aromático), 1047,4 (C-O-C) cm'¹. Ή RMN δ (CDC1₃): 2,07 (3H, s, OCOCH₃), 4,04 (2H, m, NH₂), 3,88 (1H, q, J 5,52,

4,52 e 5,0 Hz, ISH-1), 4,16 (2H, m, ISH-2 e ISH-5), 4,69 (2H, dd, J 4,52 e 4,52, ISH-1 e ISH-3), 4,95 (1H, t, J 5,04 e 5,0 Hz, ISH-4), 6,69 (1H, t, J 57,52 e 7,52 Hz, Ar₂H-5), 6,91 (1H, t, J 8,0 e 7,04, Ar₂H-3), 7,01 (2H, d, J 8,52, AnH-3 e ArjH-5), 7,31 (1H, m, Ar₂H-4), 7,51 (1H, m, ArjH-4), 7,82 (1H, dd, J 2,0 e 2,0 Hz, Ar₂H-2), 7,92 (1H, d, J 7,04, ArjH-2). ¹³C RMN ppm (CDC1₃):

20.13 (ArOCOCH₃), 69,82 (ISC-1), 70,02 (ISC-5), 75,01 (ISC-2), 75,03 (ISC-6), 79,29 (ISCA), 81,86 (ISCA), 115,02 (Ar₂C-5), 117,49 (Ar₂C-l),

119,32 (Ar₂C-3), 121,63 (ArjC-5), 123,59 (ArjC-l), 125,42 (ArjC-3), 130,23 (ArjC-2), 130,59 (Ar₂C-1),133,27 (AriC-4), 133,36 (Ar₂C-4), 147,99 (Ar₂C6), 154,32 (AnC-6), 167,02 (OÇOAr), 167,06 (OÇOAr), 168,92 (OÇOCH₃).

Isossorbida-2-aspirinato-5-[2’-metóxi]-benzoato 11

Isossorbida-2-aspirinato 17 (0,2 g, 0,65 mmol) foi dissolvido em tolueno (15 ml) a 0 °C ao qual foi adicionado DMAP (0,08 g, 0,65 mmol) e DCC (0,13 g, 0,65 mmol). Após 10 minutos o frasco de reação foi retomado à temperatura ambiente, ácido 2-anísico (ácido 2-metóxi benzóico, 0,10 g, 0,65 mmol) foi adicionado e deixado agitar por 12 horas. A mistura de reação foi lavada com HC1 (20 ml, 1M), NaHCO₃ aquoso saturado (20 ml), solução de salmoura saturada (20 ml) e água (3 x 20 ml), secado em Na₂SC>4 anidro e o solvente removido no vácuo para produzir produto como um óleo bruto. Purificação por cromatografia de coluna em gel de sílica usando hexano e acetato de etila (3:1) como eluentes produziu composto 11 como cristais brancos (0,23 g, 79,8 %): ponto de fusão 132 a 134 °C. IR_vmax(KBr): 2920,5 (C-H alongamento), 1764,9 e 1720,4 (C=O), 1253,2 (C(O)OR, aromático), 1075,2 (C-O-C) cm'¹. HRMS: Requer: 465,1162 (M⁺+23), Encontrado: 465,1131 (M⁺+23), ^]H RMN δ (CDC1₃): 2,89 (3H, s, OCOCH₃) 3,95 (3H, m, ArOCH₃, 4,06 (1H, m, IS6-Ha), 4,14 (3H, m, ISl-H₂[a + β] e ISó-Ηβ), 4,64 (1H, d, J 5,0 Hz, ISH-3), 5,03 (1H, t, J 5,04 e 5,52 Hz, ISH-4), 5,40 (1H, t, J 5,0 e 5,52 Hz, ISH-5), 5,45 (1H, d, J 2,0 Hz, ISH-2), 7,01 (2H, q, J 4,52, 2,52 e 6,0 Hz, Ar₂H-3 e Ar₂H-5), 7,11 (1H, d, J 8,04 Hz, ArjH-2), 7,31 (1H, m, ArjH-3), 7,50 (1H, m, ArjH-4), 7,58 (1H, m, AriH-5), 7,88 (1H, dd, J 2,04 e

1,52 Hz, Ar₂H-4), 8,01 (1H, dd, J 1,52 e 1,48 Hz, Ar₂H-6). ¹³C RMN ppm (CDC1₃): 20,42 (ArOCOCH₃), 55,52 (ArOCH₃), 70,41 (ISC-1), 72,66 (ISC6), 73,69 (ISOCOAr), 76,58 (ISC-5). 78,25 (ISC-4), 80,56 (ISC-2), 85,64 (ISC-3), 111,74 (Ar₂C-3) 118,83 (Ar₂C-l), 122,39 (Ar₂C-5), 122,91 (AriC-5), 123,38 (AriC-1), 125,42 (ArjC-3), 125,56 (ArjC-2), 131,38 (Ar₂C-6), 133,45 (AriC-4), 133,75 (Ar₂C-4), 150,24 (ArjC-6), 159,09 (Ar₂C-6), 164,79 (ArCOOR), 169,13 (ArOC(O)CH₃).

Isossorbida-2-aspirinato-5-[3 ’-metóxi]-benzoato 12

Isossorbida-2-aspirinato 17 (0,2 g, 0,65 mmol) foi dissolvido em tolueno (15 ml) a 0 °C ao qual foi adicionado DMAP (0,08 g, 0,65 mmol) e DCC (0,13 g, 0,65 mmol). Após 10 minutos o frasco de reação foi retomado à temperatura ambiente, ácido 3-anísico (ácido 3-metóxi benzóico) (0,10 g, 0,65 mmol foi adicionado e deixado agitar por 12 horas. A mistura de reação foi lavada com HCl (20 ml, 1M), NaHCO₃ aquoso saturado (20 ml), solução de salmoura saturada (20 ml) e água (3 x 20 ml), secado em Na₂SO4 anidro e o solvente removido no vácuo para produzir produto como um óleo bruto. Purificação por cromatografia de coluna em gel de sílica usando hexano e acetato de etila (3:1) como eluentes produziu composto 12 como cristais brancos (0,23 g, 79,8 %): ponto de fusão 125 a 128 °C. IR_vmax(KBr): 2980,9 (C-H alongamento), 1768,3 e 1723,8 (C=O), 1298,5 e 1253,5 (C(O)OR, aromático), 1075,9 (C-O-C) cm'¹. HRMS: Requer: 465,1162 (M^+23), Encontrado: 465,1168 (M⁺+23),¹H RMN δ (CDC13): 2,36 (3H, s, OCOCH3) 3,87 (3H, s, ArOCH3), 4,05 (1H, d, J 5,0 Hz, IS6-Ha), 4,09 (2H, t, J 3,0 e 2,52 Hz, ISl-H2[a + β]), 4,14 (2H, d, J 7,52 Hz, ISó-Ηβ), 4,64 (1H, d, J 5,04 Hz, ISH-3), 5,03 (1H, t, J 5,04 e 5,52 Hz, ISH-4), 5,43 (1H, q, J 5,0, 5,52 e 5,52 Hz, ISH-5), 5,47 (1H, s, ISH-2), 7,13 (2H, q, J 4,52, 2,52 e 6,0 Hz, Ar2H-3 e Ar2H-5), 7,33 (2H, m, Ar^-2 e Ar3H-3), 7,58 (2H, m, Ar3H-4 e AnH-5), 7,69 (1H, d, J 7,52 Hz, Ar2H-4), 8,01 (1H, dd, J 1,52 e 1,52 Hz, Ar2H-6). ¹³C RMN ppm (CDC13): 20,41 (ArOCOCH₃), 54,99 (ArOCH₃), 70,43 (ISC-1), 72,74 (ISC-6), 74,05 (ISOCOAr), 76,58 (ISC-5), 78,17 (ISC-4), 80,49 (ISC2), 85,67 (ISC-3), 113,96 (Ar₂C-2), 119,21 (Ar₂C-4), 121,67 (ArjC-5), 122,34 (Ar₂C-6), 123,38 (AjjC-1), 125,56 (Ar₃C-3), 129,03 (Ar₂C-5), 130,39 (Ar₃C2), 131,36 (Ar₂C-l), 133,77 (AriC-4), 150,24 (ArjC-5) 159,20 (Ar₂C-3), 163,14 (ArCOOR), 169,11 (ArOCOCH₃).

Isossorbida-2-aspirinato-5-[4-metóxi]-benzoato 13

Isossorbida-2-aspirinato 17 (0,2 g, 0,65 mmol) foi dissolvido em tolueno (15 ml) a 0 °C ao qual foi adicionado DMAP (0,08 g, 0,65 mmol) e DCC (0,13 g, 0,65 mmol). Após 10 minutos o frasco de reação foi retomado à temperatura ambiente, ácido 4-anísico (ácido 4-metóxi benzóico) (0,10 g, 0,65 mmol foi adicionado e deixado agitar por 12 horas. A mistura de reação foi lavada com HC1 (20 ml, 1M), NaHCO₃ aquoso saturado (20 ml), solução de salmoura saturada (20 ml) e água (3 x 20 ml), secado em Na₂SO₄ anidro e o solvente removido no vácuo para produzir produto como um óleo bmto. Purificação por cromatografia de coluna em gel de sílica usando hexano e acetato de etila (2:1) como eluentes produziu produto como cristais brancos (0,17 g, 58,9 %): ponto de fusão 141 a 144 °C. IR_vmax(KBr): 2994,1 e 2936,7 (C-H alongamento), 1764. e 724,9 (C=)), 1605,8 (C=C alongamento), 1260,5 (C(O)OR, aromático), 1078,6 (C-O-C) cm'¹. HRMS: Requer: 465,1162 (M⁺+23), Encontrado: 465,1157 (M⁺+23),1H RMN δ (CDC13): 2,32 (3H, s, OCOCH3), 3,84 (3H, s, ArOCH3, 3,99 (1H, m, IS6-Ha), 4,07 (6H, m, IS1Η2[α + β] e ISó-Ηβ), 4,59 (1H, d, J 4,52 Hz, ISH-3), 4,98 (1H, t, J 5,52 e 5,0 Hz, ISH-4), 5,38 (1H, t, J 5,0 e 5,52 Hz, ISH-5), 5,43 (1H, d, J 2,0 Hz, ISH2), 6,91 (2H, d, J 8,52 Hz, Ar2H-3 e Ar2H-5), 7,08 (1H, d, J 8,0 Hz, AriH-4), 7,28 (1H, t, J 7,56 e 9,52 Hz, ArjH-2), 7,54 (1H, t, J 8,0 e 7,52 Hz, AnH-3), 7,99 (3H, q, J 9,0, 7,04 e 8,04 Hz, ArjH-1, Ar2H-2 e Ar2H-6). ¹³C RMN ppm (CDC13): 20,48 (ArOCOCH3), 59,83 (ArOCH₃), 70,41 (ISC-1), 72,82 (ISC6), 73,58 (ISOCOAr), 76,58 (ISC-5). 78,26 (ISC-4), 80,47 (ISC-2), 85,46 (ISC-3), 113,33 (Ar₂C-3 e Ar₂C-5), 121,46 (AriC-5), 122,35 (Ar₂C-l), 123,36 (AriC-1), 125,54 (AriC-3), 131,35 (AriC-2), 133,73 (Ar₂C-2 e Ar₂C-6), 133,76 (ArjC-4), 150,23 (ArjC-6), 163,12 (ArOCH₃ e Ar₂C-4), 165,09 (ArCOOR), 169,08 (ArCOOR), 170,52 (ArOCOCH₃).

Isossorbida-2-aspirinato-5-[4-metila benzoato] 14

Uma solução de isossorbida-2-aspirinato 17 (0,2 g, 0,65 mmol) foi dissolvida em tolueno a 0 °C a qual foi adicionado trietilamina (0,13 ml,

0,98 mmol) e cloreto de 4-toluíla (0,93 ml, 0,78 mmol). O frasco de reação foi retomado à temperatura ambiente e deixado agitar por 10 horas, depois lavado com HCI (30 ml, 1M), NaHCO₃ aquoso saturado (30 ml), água (3x30 ml) e solução de NaCl saturado (30 ml). A reação foi secada com Na₂SO₄ anidro e o solvente foi removido no vácuo usando acetato de etila como co-solvente para fornecer produto bruto. Purificação por cromatografia de coluna usando hexano e acetato de etila (9:1) como eluentes forneceu composto 14 como cristais brancos (0,1 g, 35,99 %): ponto de fusão 102 a 104 °C. IR_vmax(KBr): 2982,7 e 2923,6. (C-H alongamento), 1763,9 e 1717,8 (C=O), 1608,5 (C=C), 1275,4 e 1202,0 (C(O)OR), 1100,3 (CO-C)) cm'¹. HRMS: Requer: 449,1212 (ΜΓ+23), Encontrado: 449,1229 (M^+23), *H RMN δ (CDC13): 2,19 (3H, s, OCOCH3), 2,43 (3H, s, Ar-CH3), 4,05 (2H, d, J 5,0 Hz, ISlH2[a+ ] e IS6H2[a+ ]), 4,09 (2H, t, J 4,04 e 3,52 Hz, ISH-6), 4,14 (1H, t, J 7,04 e 7,52 Hz, ISH-5), 4,63 (1H, d, J 5,0 Hz, ISH-3), 5,03 (1H, t, J 4,8 e 5,0, ISH-4), 5,44 (2H, m, ISH-2), 7,11 (1H, d, J 8,04 Hz, Ar-H), 7,27 (2H, d, J 8,56 Hz, Ar-H), 7,33 (1H, t, J 7,52 e 7,52 Hz, Ar-H), 7,55 (1H, t, J 1,52 e 6,04 Hz, ArH), 8,00 (3H, m, Ar-H). ¹³C RMN ppm (CDC13): 13,71 (ArCH₃), 20,54 (OCOCH₃), 70,49 (ISC-1), 72,75 (ISC-6), 73,78 (ISC-5), 78,13 (ISC-4), 80,72 (ISC-2), 85,62 (ISC-3), 122,25 (ArjC-1), 123,38 (ArjC-4), 125,64 (AriC-6), 126,26 (ArjC-2 e Ar₂C-4), 128,74 (Ar₂C-2 e Ar₂C-5), 129,36 (Ar₂C-6), 131,42 (Ar₂C-3), 133,87 (Ar^-3), 143,62 (Ar₂C-l), 150 22 (A^C5), 163,15 (ArOCOCH₃), 165,48 (IS-OCOAr), 169,27 (ArCOO).

Isossorbida-2-aspirinato-5-(4-nitrobenzoato) 15 (Note que um composto 16 não é incluído neste relatório descritivo)

Isossorbida-2-aspirinato 17 (0,2g, 0,65 mmol) foi dissolvido em DCM (10 ml) na temperatura ambiente. Ao frasco de reação foi adicionado cloreto de 4-nitrobenzoíla (0,15g, 0,78 mmol) e trietilamina (1,12 ml, 0,78 mmol). A reação foi deixada agitar na temperatura ambiente por 48 horas antes de lavar com HCl (20 ml, 1M), NaHCO₃ aquoso saturado (25 ml), solução de salmoura saturada (20 ml) e água (2 x 20 ml), secada em Na₂SO₄anidro e o solvente removido no vácuo para produzir produto como um óleo bruto amarelo. Purificação por cromatografia de coluna em gel de sílica usando hexano e acetato de etila (3:2) como eluentes produziu composto 15 como um óleo incolor que quando recristalizado em etanol fornece um produto como cristais brancos (0,15g, 50,5 %). ponto de fusão 66 a 68 °C. IR_vmax (KBr): 1772,7 e 1726,2 (C=O), 1276,6 (C(O)OR, aromático), 1078,1 (C-O-C) cm’¹. HRMS: Requer: 480,0907 (M⁺+23), Encontrado: 480,0922 (M⁺+23), ^JH RMN δ (CDC13): 2,34 (3H, s, OCOCH3), 4,07 (4H, m, ISH-3), 4,64 (1H, d, J 4,52 Hz, ISH-1 e ISH-4), 5,04 (1H, t, J 5,04 e 5,0 Hz, ISH-5), 5,45 (2H, m, ISH-2 e ISH-6), 7,10 (1H, dd, J 1,0 e 1,0 Hz, ArjH-2), 7,31 (1H, m, AriH-3), 7,53 (1H, m, ArjH-4), 7,99 (1H, dd, J 2,04 e 1,52 Hz, AriH-5), 8,25 (4H, dd, J 2,0 e 2,04 Hz, Ar2H-2 e Ar2H-6), 8,31 (2H, dd, J 2,0 e 2,04 Hz, Ar2H-3 e Ar2H-5). ¹³C RMN ppm (CDC13): 20,41 (ArOCOCH₃), 70,26 (ISC-1), 72,76 (ISC-5), 74,88 (ISC-2 e ISC-6), 80,52 (ISC-4), 85,68 (ISC-3), 123,16 (ArjC-5), 123,36 (ArjC-1), 125,58 (Ar₂C-3 e Ar₂C-5), 130,39 (ArjC2), 131,32 (Ar₂C-2 e Ar₂C-6), 133,87 (ArjC-4), 150,32 (Ar₂C-4), 163,07 (OCOAr), 163,53 (OCOAr), 169,09 (OCOCH₃).

Isossorbida-2-aspirinato-5-OH 17

Uma solução agitada de cloreto de acetilsaliciloíla (m.w.

198,60 g/mol, 10,9g - 54,9mmol) em diclorometano (160 ml) foi tratada com trietilamina (m.w. 101,19 g/mol, d=0,726 g/ml, 9,1 ml = 65,4 mmol). A mistura foi resfriada a 0 °C e 5-ISMN (m.w. 191,12 g/mol, 10 g = 52,3 mmol) foi adicionado. O frasco foi agitado na temperatura ambiente durante a noite e protegido da luz. A mistura foi lavada com HCl (2M), NaHCO₃ 5 % e água, secada em sulfato de sódio e concentrada até um óleo. Esta foi recristalizada usando etanol quente (cristalização pode ser muito lenta) para fornecer 10 g de cristais amarelos. Esta foi dissolvida em metanol/acetato de etila (1:1),

Pd/C foi adicionado e um balão de hidrogênio foi ligado. Agitada durante a noite e monitorada por TLC (hexano/acetato de etila 2:1) até estabelecer uma reação completa. A mistura foi filtrada e o solvente removido. Pouco de diclorometano adicionado e concentrado, éter dietila adicionado, deixado repousar por 10-15 minutos e concentrado aos cristais brancos (7,4 g). ^]H RMN δ (CDC13) 400MHz: 2,37 (3H, s, OCOCH3), 3,6 (1H, m, ISH-6) 3,9 (1H, m ISH-6’), 4,07 (2H, 2xdd, ISH-l/H-1’), 4,3 (1H, q, ISH-3), 4,58 (1H, d, ISH-4), 4,69 (1H, m, ISH-2), 5,45 (1H, d, ISH-5), 7,11 (1H, d, Ar-H), 7,28 (1H, t, Ar-H), 7,57 (1H, t, Ar-H), 8,00 (1H, dd, Ar-H). ¹³C RMN ppm (CDC13) 400MHz: 20,48 (OCOCH₃), 71,56 (ISC-1), 72,91 (ISC-6), 73,11 (ISC-5), 78,44 (ISC-2), 81,56 (ISC-4), 85,09 (ISC-3), 122,18 (Ar₂ C-2/C-6), 123,42, 125,66 (Ar₂ C-4),131,37 (An C-4), 133,95, 150,23 (Ar₂OCO), 163,03 (OCOArCH₂ONO₂), 169,27 (ArC(O)OR).

Isossorbida-2-aspirinato-5-(3-(2-bromo-acetóxi))-benzoato 18

A uma solução de isossorbida-2-aspirinato-5-salicilato (0,15 g, 0,35 mmol) e DBU (0,052 ml, 0,35 mmol) em diclorometano (5 ml) foi adicionado cloreto de bromoacetila (0,03 ml, 0,35 mmol) e a mistura de reação foi deixada agitar durante a noite. A reação foi lavada com água (2x5 ml) e os solventes removidos no vácuo para produzir composto 18 como um óleo incolor (0,13 g). IR_vmax (película) cm'¹: 1765,6 e 1724,3 (OO), 1608,1 (OO), 1288,4 e 1251,4 (C(O)OR), 1196,9 e 1135,6 (C-O-C), 732,6 (C-Br). HRMS: Requer: 531,1013 (M⁺); Encontrado: 570,4453 (M⁺+23). δ H (400MHz; CDC13): 2,37 (3H, s, OCOCH3), 4,07 (4H, m, IS 1, 6-H), 4,48 (2H, s, CH2), -4,63 (1H, m, IS4-H), 4,98 (1H, m, IS3-H), 5,40 (2H, m, IS2, 5-H), 7,11 (1H, d, J8,0 e 7,5 Hz, Ar-H), 7,60 (2H, m, 2 x ArH), 8,11 (1H, d, Jl,5Hz, Ar-H), 8,12 (1H, d, J 1,5Hz, Ar-H); δ¹³Ο (100MHz; CDC13): 20,86 (OCOCH₃), 40,99 (CH2), 70,47 (IS-C), 73,24 (IS6-C), 74,69 (IS4-C), 78,40 (IS3-C), 81,09 (IS5-C), 86,07 (IS2-C), 123,61, 123,83, 126,01, 126,65 e 131,78, 132,21, 134,26, 134,42, 150,23, 150,69, 163,5, 166,11, 169,55.

Isossorbida-2-aspirinato-5-ciclopropanoato 19

Cloreto de ciclopropano carbonila (m.w. 104,54 g/mol, d=l, 152 g/ml, 250 μΐ = 2 mmol) foi dissolvido em DCM (10 ml). Trietilamina (500 μΐ = 6 mmol) foi adicionado e a mistura foi resfriada a 0 °C. Isossorbida2-aspirinato, 17 foi adicionado (506,2mg=l,6mmol) e a reação foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. Lavada com 2M HCl (10 ml), NaHCO₃ a 5 % (10 ml) e água (10 ml). Secada em sulfato de sódio e concentrada. Purificada por cromatografia de coluna (hexano/acetato de etila 2:1) Rf= 0,3 para fornecer 396 mg de um óleo. 'HRMN δ (CDC1₃) 400MHz: 0,9-1,18 (2xdd e t, 4H, 2xCH₂), 2,32 (3H, s, OCOCH₃), 3,78 (m, 1H, IsH-1), 3,9 (m, 1H, IsH-6), 4,06 (2H, d, ISH-l’e ISH-6’), 4,5 (1H, d, ISH-3), 4,83 (1H, t, ISH-4), 5,12 (1H, q, IsH-2), 5,38 (1H, s,H-5), 7,06 (1H, d, Ar-H), 7,26 (1H, t, Ar-H), 7,52 (1H, t, Ar-H), 7,95 (1H, d, Ar-H). ¹³CRMN ppm (CDC1₃) 400MHz: 9 e 10 (2xCH₂), 12,15 (CH), 20,43 (OCOCH₃), 69,96 (ISC-1), 72,71 (ISC-6), 73,40 (ISC-5), 78,14 (ISC-2), 80,39 (ISC-4), 85,35 (ISC-3), 122,20 (ArC-6), 123,37 (ArC-2), 125,59 (ArC-4), 131,36 (ArC-3), 133,86 (ArC-5), 150,19 (ArC-1), 163,05 (Ar₂OCO), 169,18 (CH₃OCOAr), 173,78 (OCOciclopropano).

Isossorbida-2-aspirinato-5-(p-cianobenzoato) 20

Isossorbida-2-aspirinato 17 (200 mg, 0,6mmol) e cloreto de 4cianobenzoíla (120 mg, 0,72 mmol) foram reagidos juntos de acordo com GP2 para fornecer 213 mg (81 %) de um óleo amarelo após cromatografia cintilante com EtOac : Hex 1:4. Ή RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 8,2 (2H, d, J =

8,5 Hz), 8,0 (1H, dd, J = 8 Hz, 1,5 Hz), 7,8 (2H, d, J = 10 Hz), 7,6 (1H, dt, J = 8 Hz, 1,5 Hz), 7,35 (1H, dt, J = 6,5 Hz, 1 Hz), 7,1 (1H, d, J = 8,5 Hz), 5,45 (2H, m), 5,05 (1H, t, J = 5 Hz), 4,65 (1H, d, J = 5 Hz), 4,1 (4H, m), 2,4 (3H, s). ¹³CRMN (CDC1₃ 400 MHz) δ 169,3, 163,8, 163,1, 150,3, 133,9, 132,8, 131,9, 131,4, 129,8, 125,7, 123,4, 122,1, 117,4, 116,3, 85,7, 80,7, 80,5, 77,9, 76,8 74,8, 72,7, 70,3, 20,5. HRMS (EI) C₂₃H₁₉O₈N, [M+H]⁺ requer 438,4068, encontrado 438,4183. Anal. C23H19O8N requer C: 63,16, H: 4,38, N: 3,20, encontrado C: 63,46, H: 4,51, N: 2,97.

Isossorbida-2-aspirinato-5-(p-fenilbenzoato) 21

Isossorbida-2-aspirinato 17 (200 mg, 0,6 mmol) e cloreto de 4fenilbenzoíla (156 mg, 0,72 mmol) foram reagidos juntos para fornecer 185 mg (65 %) de um óleo incolor após cromatografia cintilante com EtOac : Hex 1:4. ’H RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 8,2 (2H, d, J = 8,5 Hz), 8,0 (1H, dd, J = 8 Hz, 1,5 Hz), 7,7 (2H, d, J - 8,5 Hz), 7,65 (2H, d, J = 7Hz), 7,6 (1H, dt, J = 8 Hz, 1,5 Hz), 7,5 (2H, t, J = 7,5 Hz), 7,45 (1H, t, J = 8 Hz), 7,35 (1H, dt, J = 6,5Hz, 1 Hz), 7,1 (1H, d, J = 8,5 Hz), 5,45 (2H, m), 5,05 (1H, t, J - 5 Hz), 4,65 (1H, d, J = 5 Hz), 4,1 (4H, m), 2,4 (3H, s). ¹³CRMN (CDC1₃ 400 MHz) δ

169,3, 165,3, 163,1, 150,3, 145,6, 139,5, 133,9, 131,4, 129,8, 128,5, 127,8,

127.7, 126,8, 126,7 125,7, 123,4, 122,1, 85,7, 80,7, 78,12, 77,2, 76,8 73,9,

72.7, 70,5, 20,5. HRMS (EI) C₂₈H₂₄O₈₎ [M+H]⁺ requer 489,4933, encontrado 489,5021. Anal. C₂₈H₂₄O₈ requer C: 68,85, H: 4,95, encontrado C: 68,88, H: 5,08.

Isossorbida-2-aspirinato-5-(6-cloronicotinato) 22

Isossorbida-2-aspirinato 17 (250 mg, 0,8 mmol) e cloreto de 6cloronicotinoíla (230 mg, 0,9 mmol) foram reagidos juntos de acordo com GP2 para fornecer 256 mg (70 %) de um sólido branco após cromatografia cintilante com EtOac : Hex 3:7. ’H RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 9,3 (1H s) 8,9 (1H, s), 8,3 (2H, d, J = 8,5 Hz), 8,0 (1H, dd, J = 8 Hz, 1,5 Hz), 7,6 (1H, dt, J = 8 Hz, 1,5 Hz), 7,45 (1H, t, J = 1Hz) 7,35 (1H, dt, J - 6,5 Hz, 1 Hz), 7,1 (1H, d, J = 8,5 Hz), 5,45 (2H, m), 5,05 (1H, t, J = 5 Hz), 4,65 (1H, d, J = 5 Hz), 4,1 (4H, m), 2,4 (3H, s). ¹³CRMN (CDC1₃ 400 MHz) δ 169,3, 164,2, 163,1, 153,3,

150,5, 150,2, 136,8, 133,9, 131,4, 125,7, 123,4, 123,0, 122,2, 85,7, 80,6, 77,9,

76.8, 74,4, 72,8, 70,4, 20,5. HRMS (EI) C₂₁Hi₈CINO₈, [M+H]⁺ requer 448,8304, encontrado 448,8295. Anal. C₂iHi₈CINO₈ requer C: 56,32, H: 4,05, N: 3,13 encontrado C: 56,20, H: 4,21, N: 3,02.

Isossorbida-2-aspirinato-5-(-2-cloro-6-metil-piridino-4-oato)

Isossorbida-2-aspirinato 17 (250 mg, 0,8 mmol) e cloreto de 2cloro-6-metilpiridino-4-carbamoíla (247 mg, 0,9 mmol) foram reagidos juntos de acordo com GP2 para fornecer 196 mg (53 %) de uma espuma branca após cromatografia cintilante com EtOac : Hex 2:6. Ή RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 8,0 (1H, dd, J = 8 Hz, 1,5 Hz), 7,74 (1H, s), 7,68 (1H, s) 7,6 (1H, dt, J = 8 Hz,

1.5 Hz), 7,45 (1H, t, J = 1Hz) 7,35 (1H, dt, J = 6,5 Hz, 1 Hz), 7,1 (1H, d, J =

8.5 Hz), 5,45 (2H, m), 5,05 (1H, t, J = 5 Hz), 4,65 (1H, d, J - 5 Hz), 4,1 (4H, m), 2,65 (3H, s), 2,4 (3H, s). ¹³C RMN (CDC1₃ 400 MHz) δ 169,3, 163,1, 151,1, 150,2, 139,3, 134,0, 131,4, 125,7, 123,4, 122,1, 120,8, 120,4, 85,7,

80.4, 77,8, 77,6, 75,1, 72,8, 70,2, 23,8, 20,5. HRMS (EI) C₂₂H_2OCINO₈, [M+H]⁺ requer 462,8570, encontrado 462,8601. Anal. C₂₂H₂₀CINO₈ requer C: 57,21, H: 4,36, N: 3,03 encontrado C: 56,91, H : 4,38, N : 2,94.

Isossorbida-2-aspirinato-5-(-3, 5-etoxibenzoato) 24

Isossorbida-2-aspirinato 17 (200 mg, 0,65 mmol) e cloreto de 3,5-etoxibenzoíla (157 mg, 0,72 mmol) foram reagidos juntos de acordo com GP2 para fornecer 296 mg (74 %) de um óleo amarelo viscoso após cromatografia cintilante com EtOac : Hex 1:4. ³H RMN (CDC13, 400 MHz) δ 8,1 (1H, d, J = 8Hz, Asp H5), 7,6 (1H, dt, J = 8Hz, 1,5Hz, Asp H4), 7,35 (1H, t, J = 1Hz, Asp H3), 7,2(2H, d, 1Hz, Benz H2+6), 7,1 (1H, d, 8,5 Hz, Asp H2), 6,7 (1H, t, J - 2,25 Hz, Benz H4), 5,45 (2H, m, IS H5 + H2), 5,05 (1H, t, J - 5 Hz, IS H4), 4,65 (1H, d, J = 5,5 Hz, IS H3), 4,05 (8H, m, IS1-H2 [α + β], IS6-H2 [a + β], etóxi-CH2), 2,4 (3H, s, Acet-CH3), 1,45 (6H, t, J = 3,5 Hz, Eto-CH3). ¹³CRMN (CDC13 400 MHz) δ 169,8, 165,8, 163,6, 160,0, 150,7,

134,3, 131,9, 131,1, 126,1, 123,8, 122,7, 107,9, 106,6, 86,1, 81,1, 78,6, 76,7,

74.5, 73,2, 71,0, 63,8, 61,2, 20,9, 14,8. HRMS (EI) C₂₆H₂₈Oi₀, [M+H]⁺ requer 500,4945, encontrado 500,4932. Anal. C₂ôH₂₈Oio requer C: 62,39, H: 5,64, encontrado C: 62,45, H : 5,79

Isossorbida-2-aspirinato-5-(-3-metil-isoxazol-4-oato) 25

Isossorbida-2-aspirinato 17 (200 mg, 0,65 mmol) e ácido 3metil-isoxazol-4-carboxílico (127 mg, 0,72 mmol) foram reagidos juntos de acordo com GP1 para fornecer 228 mg (83 %) de uma espuma branca após cromatografia cintilante com EtOac : Hex 1:3. *H RMN (CDC1₃, 400 ΜΗζ) δ 8,55 (1H, s, isox), 8,0 (1H, d, J = 8Hz, Asp H5), 7,65 (1H, dt, J = 8Hz, 1,5Hz, Asp H4), 7,3 (1H, t, J = 1Hz, Asp H3), 7,1 (1H, d, 8,5 Hz, Asp H2), 5,4 (2H, m, IS H5 + H2), 5,0 (1H, t, J = 5 Hz, IS H4), 4,6 (1H, d, J = 5,5 Hz, IS H3), 4,1 (4H, m, IS1-H₂ [α+b], IS6-H₂ [a + β]), 3,8 (3H, s, isox-CH₃), 2,35 (3H, s, Asp-acet-CH3). ¹³C RMN (CDC1₃ 400 ΜΗζ) δ 169,2, 163,0, 160,4, 150,2, 149,6, 133,9, 131,4, 125,6, 123,4, 122,1, 85,6, 80,5, 73,9, 72,7, 70,2, 33,5,

24,5, 20,5, 12,3.

Isossorbida-2-aspirinato-5-(-4-metil-l, 2, 3-tiadiazol-5-oato) 26

Isossorbida-2-aspirinato 17 (200 mg, 0,65 mmol) e ácido 4metil-l,2,3-tiadiazol-5-carboxílico foram reagidos juntos para fornecer 228 mg (83 %) de uma espuma rosa claro após cromatografia cintilante com EtOac : Hex 1:3. ^JH RMN (CDC13, 400 MHz) 6 8,1 (1H, d, J = 8Hz, Asp H5), 7,7 (1H, dt, J - 8Hz, 1,5Hz, Asp H4), 7,35 (1H, t, J = 1Hz, Asp H3), 7,15 (1H, d, 8,5 Hz, Asp H2), 5,5 (2H, m, IS H5 + H2), 5,05 (1H, t, J = 5 Hz, IS H4), 4,65 (1H, d, J = 5,5 Hz, IS H3), 4,1 (4H, m, IS1-H2 [α + β], IS6-H2 [a + β]), 3,05(3H, s, tiad-CH3), 2,4 (3H, s, Aspacet-CH3). ¹³C RMN (CDC13 400 ΜΗζ) δ 169,7, 163,5, 162,9, 159,1, 150,7, 134,4, 131,8, 126,1, 123,8, 122,5, 86,2, 80,9, 78,2, 75,9, 73,2, 70,8, 21,0, 14,1.

Isossorbida-2-aspirinato-5-(N-Boc-isonipecotato) 27

Isossorbida-2-aspirinato 17 (200 mg, 0,65 mmol) e ácido 4Nboc-isonipecótico (162 mg, 0,72 mmol) foram reagidos juntos para fornecer 166 mg (49 %) de um óleo branco-sujo após cromatografia cintilante com MeOH : DCM 3:97. Ή RMN (CDC1₃, 400 ΜΗζ) δ 8,1 (1H, d, J = 8Hz, Asp

Η5), 7,7 (1Η, dt, J = 8Hz, 1,5Hz, Asp H4), 7,35 (1H, t, J = 1Hz, Asp H3), 7,15 (1H, d, 8,5 Hz, Asp H2), 5,5 (1H, d, J = 1,5 Hz IS H2), 5,5, (1H, dd, J = 5 Hz, 1Hz) 4,95 (1H, t, J = 5 Hz, IS H4), 4,65 (1H, d, J = 5,5 Hz, IS H3), 4,1 (8H, m, IS1-H₂ [α + β], IS6-H₂ [a + β], 4 nip H), 2,6 (1H, m, nip-metino-H),

2.4 (3H, s, Asp-Acet-CH₃), 1,7 (4H, m, 4 nip H), 1,5, (9H, s, t-Bu). ^,3CRMN (CDC1₃ 400 MHz) δ 173,9, 169,8, 163,5, 154,7, 150,7, 134,4, 131,9, 126,1, 123,9, 122,6, 85,9, 80,7, 79,6, 78,5, 77,2, 76,5, 73,9, 73,0, 70,7, 42,9, 40,9,

28.4, 28,1, 27,9, 20,9. HRMS (EI) C₂₆H₃₃Oi₀N, [M+H]⁺ requer 520,4616, encontrado 520,4631. Anal. C₂₆H₃₃Oi₀N requer C: 60,11, H: 6,40, N: 2,69 encontrado C: 60,15, H: 6,79, N: 2,76

Isossorbida-2-aspirinato-5-(m-acetamidobenzoato) 28

Isossorbida-2-aspirinato 17 (200 mg, 0,65 mmol) e ácido macetamidobenzóico (128 mg, 0,72 mmol) foram reagidos juntos para fornecer 202 mg (66 %) de um sólido branco após cromatografia cintilante com MeOH : DCM 3:97. *H RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ8,0 (3H, m, Asp H5, Ar H2+4),

7,85 (1H, d, J = 8 Hz, Ar H6), 7,6 (1H, dt, J = 8Hz, 1,5Hz, Asp H4), 7,45 (1H, t, J = 7,5 Hz, Ar H5), 7,35 (1H, t, J = 1Hz, Asp H3), 7,15 (1H, d, 8,5 Hz, Asp H2), 5,5 (2H, m, IS H5 + H2), 5,05 (1H, t, J - 5 Hz, IS H4), 4,65 (1H, d, J =

5.5 Hz, IS H3), 4,1 (4H, m, IS1-H₂ [α + β], IS6-H₂ [a + β]), 2,4 (3H, s, AspAcet-CH₃), 2,2 (3H, Ar-acet-CH₃). ¹³C RMN (CDC1₃ 400 MHz) δ 169,3, 168,0, 165,0, 163,1, 150,2, 137,7, 133,9, 131,4, 129,7, 128,9, 125,6, 125,0,

124.4, 123,4, 122,2, 120,2, 85,7, m80,7, 78,1, 74,12, 72,8, 70,4, 60,0, 24,2,

20,5, 13,8. HRMS (EI) C₂₄H₂₃O₉N [M+H]⁺ requer 470,4392, encontrado 470,4403. Anal. C₂₄H₂₃O₉N requer C: 61,41, H: 4,93, N: 2,98 encontrado C: 61,52, H: 5,09, N: 2,86.

Isossorbida-2-aspirinato-5-(m-benzilóxibenzoato) 29

Isossorbida-2-aspirinato 17 (250 mg, 0,8 mmol) e ácido mbenzilóxibenzóico (182 mg, 0,88 mmol) foram reagidos juntos de acordo com GP1 para fornecer 346 mg (85 %) de um sólido branco após cromatografia cintilante com EtOac:Hex 1:2. 'Η RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 8,0 (1H, d, J = 8Hz, Asp H5), 7,7 (3H, m, Asp H4, Ar2H), 7,35 (2H, m, Asp H3, ArH), 7,1 (2H, m, Asp H2, ArH), 7,25 (5H, m, BnH), 5,5 (3H, m, IS H2, Bn-CH₂), 5,05 (1H, t, J = 5 Hz, IS H4), 4,65 (1H, d, J = 5,5 Hz, IS H3), 4,1 (4H, m, IS1-H₂[α+b.], IS6-H₂ [a + β]), 2,4 (3H, s, Asp-Acet-CH₃). ¹³C RMN (CDC1₃ 400 MHz) δ 169,76, 165,2, 163,6, 150,7, 135,8, 134,4, 133,7, 132,9, 131,9, 130,8, 130,3, 130,2, 129,2, 126,1, 123,9, 122,7, 97,7, 86,1, 81,1, 78,5, 74,7, 73,2,

70,8, 43,9, 20,9. HRMS (EI) C₂₉H₂₆O₉, [M+H]⁺ requer 518,4344, encontrado 518,4357. Anal. C₂₉H₂₆O₉ requer C: 67,19, H: 5,05 encontrado C: 67,28, H: 5,09.

Isossorbida-2-aspirinato-5-(p-benziloxibenzoato) 30

Isossorbida-2-aspirinato (250 mg, 0,8 mmol) e ácido mbenzilóxibenzóico (182 mg, 0,88 mmol) foram reagidos juntos de acordo com GP1 para fornecer 346 mg (85 %) de um sólido branco após cromatografia cintilante com EtOac:Hex 1:2. Ή RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 8,0 (1H, d, J = 8Hz, Asp H5), 7,7 (1H, dt, J = 8Hz, 1,5Hz, Asp H4),7,45 (m, 4H, ArH), 7,35 (1H, t, J = 1Hz, Asp H3), 7,25 (5H, m, BnH) 7,1 (1H, d, 8,5 Hz, Asp H2), ,

5,5 (3H, m, IS H2, Bn-CH₂), 5,05 (1H, t, J = 5 Hz, IS H4), 4,65 (1H, d, J =

5,5 Hz, IS H3), 4,1 (4H, m, IS1-H₂ [α + β], IS6-H₂ [a + β]), 2,4 (3H, s, AspAcet-CH₃). ¹³CRMN(CDC13 400 MHz) δ 169,76, 165,2, 163,6, 150,7, 136,9, 135,2, 133,0, 132,2, 131,9, 130,8, 130,3, 130,2, 129,2, 126,1, 123,9, 122,7, 97,7, 86,1, 81,1, 78,5, 74,7, 73,2, 70,8, 43,9, 20,9. HRMS (EI) C29H26O9, [M+H]⁺ requer 518,4344, encontrado 518,4338. Anal. C29H₂₆O₉ requer C: 67,19, H: 5,05 encontrado C: 67,35, H: 5,18.

Isossorbida-2-aspirinato-5-(2-nitróxi-metil) benzoato 31

Fitaleto (m.w. 134,13g/mol, 5,03g = 37 mmol) e diclorotrifenilfosforano (m.w. 333,19 g/mol, 12,3g = 38 mmol) foram aquecidos até 180 °C por 4 horas com agitação^[3]. A mudança de cor de verde para marrom foi observado no decurso de 4 horas. TLC (hexano/acetato de etila 2:1) mostrou 3 marcas e RMN determinou que a marca de topo (Rf 0,77) foi aquela do cloreto de 2-clorometilbenzoíla, a segunda marca (Rf 0,57) foi Fitaleto o ponto do fundo (Rf 0,14) foi trifenilfosforoso. Uma grande quantidade do fitaleto foi reagida, cloreto de 2-clorometilbenzoíla (Figura 12) (m.w. 189,04 g/mol, 600pl) foi dissolvido em diclorometano (10 ml). Trietilamina (m.w. 101,19 g/mol, d=0,726 g/ml, 600pl = 4,3 mmol) foi adicionado e a mistura foi resfriada a 0 °C. O composto 17 (m.w. 308,14 g/mol, 0,5298g = 1,7 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante a noite enquanto protegido da luz. A mistura (cor verde) foi lavada com HC1 (2M, 10 ml), NaHCO₃ a 5 % (10 ml) e água destilada (10 ml) e secada em sulfato de sódio. A mistura foi concentrada produzindo 769,5 mg de um óleo marrom/verde. Esta foi submetida à cromatografia usando hexano/acetato de etila (2:1) resultando em 419,4 mg de um sólido marrom (Rf 0,38). Ή RMN δ (CPC1₃) 400MHz: 2,38 (3H, s, OCOCH₃), 4,03 (4H, m, ISH-1, ISH-1’, ISH-6 e ISH-6’), 4,66 (1H, d, ISH-3), 5,04 (2H, m, CH₂CI), 5,10 (1H, ss, ISH-4), 5,42 (2H, m, ISH-2/H-5), 7,12 (1H, d, Ar-H), 7,28 (1H, m, Ar-H), 7,42 (1H, m, Ar-H), 7,6 (3H, m, Ar-H), 8,01 (2H, dd, Ar-H). ¹³C RMN ppm (CPC1₃) 400MHz: 20,51 (OCOCH₃), 43,95 (CH₂CI), 70,15 (ISC-1), 72,78 (ISC-6), 74,33 (ISC-5), 78,11 (ISC-2), 80,52 (ISC-4), 85,58 (ISC-3), 122,21 (Ar₂ C-2/C-6), 123,42, 125,65 (Ar₂ C4), 128,03 (ArjC-6), 128,07 (ArjC-2), 130,60 (AtjC-5), 130,73 (ArlC-1), 131,43 (An C-4), 133,45 (Ar₂C-5), 133,92, 138,54, 150,25 (Ar₂O0O), 163,12 (OCOArCH₂ONO₂), 165,47 (ArOCOCH₃), 169,29 (ArC(O)OR). 400 mg foram dissolvidos em CH₃CN/THF (6 ml, 4/2 v/v) e tratados com AgNO₃(m.w. 169,87 g/mol, 0,30 g = 1,7 mmol) e submetidos ao refluxo por 4 horas antes de agitar durante a noite na temperatura ambiente enquanto protegido da luz. A mistura foi filtrada e concentrada. Esta foi reconstituída em acetato de etila (10 ml) e água (2 ml). A fase orgânica foi lavada com água (3x2 ml), salmoura (2 ml) e secada em sulfato de sódio. Concentrada, produzindo um óleo que submetido a cromatografia usando hexano/acetato de etila (2:1) resultando em 95 mg de material amarelo semelhante à cera, *H RMN δ (CDCfi) 400MHz: 2,38 (3H, s, OCOCH₃), 4,01 (4H, m, ISH-1, ISH-1’, ISH-6 e ISH-6’), 4,65 (1H, d, ISH-3), 5,02 (1H, t, ISH-4), 5,41 (2H, m, C I₂), 5,86 (2H, ss, ISH-2/H-5), 7,11 (1H, d, Ar-H), 7,28 (1H, t, Ar-H), 7,49 (2H, q, ArH), 7,61 (2H, q, Ar-H), 8,01 (1H, d, Ar-H), 8,10 (1H, d, Ar-H). ¹³CRMNppm (CPC1₃) 400MHz: 20,51 (OCOCH₃), 70,37 (CH₂ONO₂), 72,78 (ISC-1), 73,46 (ISC-6), 74,30 (ISC-5), 78,01 (ISC-2), 80,61 (ISC-4), 85,64 (ISC-3), 122,19 (Ar₂ C-2/C-6), 123,40, 125,66 (Ar₂ C-4), 128,76 (ArjC-6), 129,77 (ArjC-2),

129,85 (AnC-5), 130,30 (ArlC-1), 131,41 (An C-4), 132,44 (Ar₂ C-5), 133,25, 133,93, 150,23 (Ar₂OCO), 163,12 (OCOArCH₂ONO₂), 164,71 (ArOCOCH₃), 169,28 (ArC(O)OR).

Isossorbida-2-aspirinato-5-(3-nitróxi-metil) benzoato 32

Cloreto de 3-clorometilbenzoíla (m.w. 189,04 g/mol, d=l,33 g/ml, 500pl = 3,5 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10 ml). Trietilamina (m.w. 101,19 g/mol, d=0,726 g/ml, 600pl = 4,3 mmol) foi adicionado e a mistura foi resfriada a 0 °C. O composto 17 (m.w. 308,14 g/mol, 0,51 lg = 1,6 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante a noite enquanto protegida da luz. A mistura foi lavada com HC1 (2M, 10 ml), NaHCO3 5 % (10 ml) e água destilada (10 ml) e secada em sulfato de sódio. A mistura foi concentrada produzindo 1,18 g de um óleo. Este foi submetido à cromatografia usando hexano/acetato de etila (3:1) resultando em 903,4 mg de um óleo (Rf 0,2). ’H RMN δ (CPC1₃) 400MHz: 2,37 (3H, s, OCOCH₃), 4,06 (4H, m, ISH-1, ISH-1’, ISH-6 e ISH6’), 4,65 (3H, ds, ISH-3 e CH₂CI), 5,03 (1H, t, ISH-4), 5,43 (2H, dd, ISH-2, ISH-5), 7,10 (1H, d, Ar-H), 7,32 (1H, t, Ar-H), 7,47 (1H, t, Ar-H), 7,57 (2H, m, Ar-H), 8,00 (2H, m, Ar-H), 8,10 (1H, s, Ar-H). ¹³C RMN ppm (CPC1₃) 400MHz: 20,49 (OCOCH₃), 45,01 (CH₂CI), 70,41 (ISC-1), 72,76 (ISC-6), 74,20 (ISC-5), 78,04 (ISC-2), 80,64 (ISC-4), 85,63 (ISC-3), 122,18 (Ar₂ C73

2/C-6), 123,39, 125,67 (Ar₂ C-4), 128,61 (ArjC-6), 129,28 (AnC-2), 129,36 (ArjC-5), 129,52 (ArlC-1), 131,41 (An C-4), 133,02 (Ar₂ C-5), 133,93, 137,57, 150,20 (Ar₂OCO), 163,16 (OCOArCH₂ONO₂), 164,94 (ArOCOCH₃), 169,37 (ArC(O)OR). Este foi dissolvido em CH₃CN/THF (6 ml, 4/2 v/v) e tratado com AgNO₃ (m.w. 169,87 g/mol, 0,67 g = 3,9 mmol) e submetido ao refluxo por 4 horas antes de agitar durante a noite na temperatura ambiente enquanto protegido da luz. A mistura foi filtrada e concentrada. Esta foi reconstituída em acetato de etila (10 ml) e água (2 ml). A fase orgânica foi lavada com água (3x2 ml), salmoura (2 ml) e secada em sulfato de sódio. Concentrada, produzindo um óleo que submetido a cromatografia usando hexano/acetato de etila (1:1) resultou em 184,3 mg de material amarelo semelhante à cera. ^]HRMN δ (CPC13) 400MHz: 2,38 (3H, s, OCOCH3), 4,09 (4H, m, ISH-1, IsH-1’, IsH-6 e ISH-6’), 4,65 (1H, d, ISH-3), 5,05 (1H, t, ISH4), 5,5 (4H, dd, ISH-2, ISH-5 e CH2),7,12 (1H, d, Ar-H), 7,29 (1H, t, Ar-H), 7,50 (3H, m, Ar-H), 7,65 (1H, d, Ar-H), 8,01 (2H, amplo s, Ar-H). ¹³CRMN ppm (CPC13) 400MHz: 20,51 (OCOCH₃), 70,37 (CH₂ONO₂), 72,78 (ISC-1), 73,46 (ISC-6), 74,30 (ISC-5), 78,01 (ISC-2), 80,61 (ISC-4), 85,64 (ISC-3), 122,19 (Ar₂ C-2/C-6), 123,40, 125,66 (Ar₂ C-4), 128,76 (ArjC-6), 129,77 (ArjC-2), 129,85 (AnC-5), 130,30 (ArlC-1), 131,41 (Αη C-4), 132,44 (Ar₂C-5), 133,25, 133,93, 150,23 (Ar₂O0O), 163,12 (OCOArCH₂ONO₂), 164,71 (ArOCOCH₃), 169,28 (ArC(O)OR).

Isossorbida-2-aspirinato-5-(4-nitróxi-metil) benzoato 33

Cloreto de 4-clorometilbenzoíla (m.w. 189,04 g/mol, 650pl) foi dissolvido em diclorometano (10 ml). Trietilamina (m.w. 101,19 g/mol, d=0,726 g/ml, 600pl = 4,3 mmol) foi adicionado e a mistura foi resfriada a 0 °C. O composto 17 (m.w. 308,14 g/mol, 0,5320g =1,7 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante a noite enquanto protegida da luz. A mistura foi lavada com HCI (2M, 10 ml), NaHCO₃ a 5 % (10 ml) e água destilada (10 ml) e secada em sulfato de sódio. A mistura foi concentrada e submetida à cromatografia usando hexano/acetato de etila (2:1) resultando em 100 mg de material branco sólido. ^ΤΗ RMN δ (CPC13) 400MHz: 2,35 (3H, s, OCOCH3), 4,04 (4H, m, ISH-1, IsH-1’, IsH-6 e ISH6’), 4,6 (4H, m, ISH-3 e CH2CI, imp), 5,04 (1H, d, ISH-4), 5,42 (2H, t, ISH-2, ISH-5), 7,09 (1H, d, Ar-H), 7,26 (1H, t, Ar-H), 7,47 (2H, m, Ar-H), 7,51 (1H, q, Ar-H), 8,00 (1H, d, Ar-H), 8,06 (2H, m, Ar-H). ¹³C RMN ppm (CPC13) 400MHz: 20,51 (OCOCH₃), 44,87 (CH₂CI), 70,47 (ISC-1), 72,76 (ISC-6), 74,11 (ISC-5), 78,05 (ISC-2), 80,67 (ISC-4), 85,64 (ISC-3), 122,22 (Ar₂ C2/C-6), 123,40, 125,65 (Ar₂ C-4), 128,53 (ArjC-6), 128,96 (ArjC-2), 129,77 (ArjC-5), 130,16 (ArlC-1), 130,56 (Αη C-4), 131,43 (Ar₂ C-5), 139,91, 142,23, 150,23 (Ar₂OCO), 163,14 (OCOArCH₂ONO₂), 164,91 (ArOCOCH₃), 169,31 (ArC(O)OR). Esta foi dissolvida em CH₃CN/THF (6 ml, 4/2 v/v) e tratada com AgNO₃ (m.w. 169,87 g/mol, 75 mg = 0,4 mmol) e submetida ao refluxo por 4 horas antes de agitar durante a noite na temperatura ambiente enquanto protegida da luz. A mistura foi filtrada e concentrada. Esta foi reconstituída em acetato de etila (10 ml) e água (2 ml). A fase orgânica foi lavada com água (3x2 ml), salmoura (2 ml) e secada em sulfato de sódio. Concentrada, produzindo um óleo que submetido a cromatografia usando hexano/acetato de etila (2:1) resultou em 28,3 mg de sólido branco-sujo. ^H RMN δ (CPC1₃) 400MHz: 2,35 (3H, s, OCOCH₃), 4,04 (4H, m, ISH-1, ISH1’, ISH-6 e ISH-6’), 4,62 (1H, d, ISH-3), 5,01 (1H, t, ISH-4), 5,41 (2H, m, CH₂), 5,48 (2H, s, ISH-2/H-5), 7,09 (1H, d, Ar-H), 7,31 (1H, t, Ar-H), 7,48 (2H, d, Ar-H), 7,55 (1H, t, Ar-H), 8,00 (1H, d, Ar-H), 8,10 (2H, d, Ar-H). ¹³C RMN ppm (CPC1₃) 400MHz: 20,51 (OCOCH₃), 70,44 (CH₂ONO₂), 72,76 (ISC-1), 73,18 (ISC-6), 74,23 (ISC-5), 78,02 (ISC-2), 80,65 (ISC-4), 85,65 (ISC-3), 122,19 (Ar₂ C-2/C-5), 123,41, 125,66 (Ar₂ C-4), 128,17 (ArjC-6),

129,85 (ArjC-2), 129,92 (AriC-5), 131,41 (ArjC-1), 133,93 (Αη C-4), 137,19 (Ar₂ C-5), 150,24 (Ár₂OCO), 163,14 (OCOArCH₂ONO₂), 164,75 (ArOCOCH₃), 169,29 (ArC(O)OR).

Isossorbida-2-aspirinato-5-(nitróxi)-acetato 34

A uma solução de isossorbida-2-aspirinato 17 (0,49 g, 1,6 mmol) em diclorometano (10 ml) foi adicionado DCC (0,33 g, 1,6 mmol), DMAP (0,02 g, 0,16 mmol) e ácido nitróxi acético (0,19 g, 1,6 mmol). A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante a noite antes de filtrar e lavar o filtrado com HCI (2 x 10 ml, 0,1 M), NaHCO₃ aquoso saturado (2x10 ml) e água (2x10 ml). Após secar em Na₂SO₄ anidro, o diclorometano foi removido no vácuo para produzir um produto como um óleo bruto. A purificação por cromatografia de coluna em gel de sílica usando hexano e acetato de etila (5:2) como eluentes produziu o composto 23 (0,38 g) como um óleo incolor. IRvmax (película) cm’¹: 1759,0 e 1727,5 (C=O), 1643,6 (NO2), 1287,7 (NO2), 1256,3 (C(O)OR, aromático), 1193,5 (C-O-C). HRMS: Requer 411,0802 (M⁺), Encontrado: (M⁺). δ H (400MHz; CDCL3): 2,36 (3H, s, OCOCH₃), 2,68 (1H, d, J 7,52Hz, IS-H), 3,61 (1H, q, J 6,04, 3,52 e 6Hz, ISH), 3,92 (1H, q, J 6,04, 3,52 e 6Hz, IS-H), 4,12 (2H, m, IS-H₂), 4,33 (1H, M, IS-H₂). 4,58 (1H, d, J 4Hz, IS-H), 4,67 (1H, t, J 5 e 5,04Hz, IS-H), 5,44 (2H, s, OCH_ZO), 7,11 (1H, d, J 8,04Hz, Ar-H), 7,33 (1H, t, J 8 e 7,52Hz, Ar-H), 7,59 (1H, t, 7,06 e 8,26Hz, Ar-H), 8,01 (1H, d, J 6,52Hz, Ar-H). Ô¹³C (100MHz; CDCL₃): 20,91 (OCOCH₃), (CH₂), 72,36 (IS-C), 73,41 (IS-C), 73,69 (IS-C), 78,96 (IS-C), 82,04 (IS-C), 85,64 (IS-C), 122,77 (ArC-1), 123,89, 126,07, 131,81 e 134,31 (metina aromática), 150,74 (CO), 163,51 (ArOC(O)Me), 169,59 (ArC(O)OR).

Isossorbida-2-aspirinato-5-mononitrato ISMNA

A uma solução de IS-5-MN (5 g, 26,65 mmol) em tolueno (100 ml) a 0 °C foi adicionado trietilamina (5,52 ml, 3,96 mmol) e cloreto de acetilsaliciloíla (6,31 g, 31,74 mmol). A reação foi retomada à temperatura ambiente e deixada agitar por 6 horas antes de lavar com água (2 x 50 ml), HCI (1 M, 2 x 50 ml), NaHCO₃ aquoso saturado (2 x 50 ml) e salmoura (100 ml). A fase orgânica foi secada com Na₂SO₄ e o solvente removido no vácuo para produzir o produto como um óleo. Este foi cristalizado por etanol para produzir 5,42 g do produto como cristais brancos. (58,05 %): ponto de fusão 82 a 84 °C. IR_vmax (KBr): 1757,6 e 1733,4 (C=O), 1651,8 (NO₂), 1261,4 (C(O)OR, aromático), 915,5 (ONO₂) cm’¹. HRMS: Requer: 376,0645 (M⁺+23), Encontrado: 376,0640 (^+23). Ή RMN δ (CDC13): 2,37 (3H, s, OCOCH3), 3,93 (1H, dd, J 6,0, 11,5 e 6,0 Hz, IS6a-H), 4,09 (3H, m, IS1H [αβ] e IS6H [β]), 4,58 (1H, d, J 4,5Hz, IS3-H), 5,03 (1H, t, J 5,0 e 5,5 Hz, IS4-H), 5,38 (1H, m, IS5-H), 5,45 (1H, d, J 3,0 Hz, IS2-H), 7,12 (1H, d, J 8,0 Hz, Ar-H), 7,33 (1H, t, J 7,5 e 8,0 Hz, Ar-H), 7,60, (1H, t, J 7,5 e 8,0 Hz, ArH), 8,01 (1H, d, J 7,5 Hz, Ar-H). ¹³C RMN ppm (CDC13): 20,40 (OCOCH₃), 68,88 e 72,84 (ISC-1 e ISC-6), 77,50 (ISC-5), 80,83 (ISC-4), 81,08 (ISC-2), 122,19 (ArC-1), 123,41, 125,61, 131,37, 133,92 (metina aromática), 150,24 (ArC-2), 163,09 (ArOCO(Me)), 169,17 (ArC(O)OR).

Método Experimental: Estudos de Hidrólise Usando Soluções de Plasma/Enzima

As soluções de plasma/soro reunidas (4 ml) foram preparadas na concentração correta através da diluição do plasma com tampão de fosfato no pH 7,4 (por exemplo, para uma solução a 10 % 0,4 ml de plasma/soro foi adicionado a 3,6 ml de tampão de fosfato pH 7,4). Após o equilíbrio da amostra de plasma/soro a 37±0,5°C, 100 μΐ de uma solução estoque de composto de teste em acetonitrila (1 x IO'⁴ M) foram adicionados e alíquotas de 250 μΐ foram removidas em intervalos de tempo especificado. As amostras foram transferidas para tubos de Eppendorf de 1,5 ml contendo 500 μΐ de uma solução a 2 % p/v de nSC>4.7H₂O (água: acetonitrila, 1:1). Os tubos foram turbilhonados por 2 minutos, depois centrifugados a 10.000 rpm por 3 minutos na temperatura ambiente. O sobrenadante foi retirado por aspiração e analisado por HPLC. As concentrações do composto de teste e metabólitos foram determinadas com relação às curvas de calibração conduzidas naquele dia na mesma faixa de concentração e sob as mesmas condições experimentais. De modo a imitar condições durante a primeira passagem das drogas após os compostos selecionados pela absorção intestinal serem incubados em tampão de fosfato a 37 °C na presença de microssomos do fígado humano (HLM) e epitélio intestinal (HIM). O destino metabólico dos ésteres sob estas condições também foi determinado por RPHPLC medindose a concentração da droga e metabólitos no meio como uma função de tempo. A identidade das enzimas participantes foi confirmada usando-se uma enzima purificada no caso do plasma (BuChE) e repetindo-se as experiências de hidrólise na presença de inibidores específicos de estearase - isoOMPA para BuChE e BNPP para carboxilesterase. As atividades de BuChE do plasma e das amostras de microssomos foram determinadas usando o ensaio de Ellman (Ellman et al., 1964).

Procedimento de HPLC

A cromatografia líquida de alto desempenho foi realizada usando um sistema que consiste de uma bomba Waters 600 e um controlador, autoamostrador Waters 717 e um detector de série de fotodiodo Waters 2996 controlado pelo software Empower. Uma coluna Hichrom Nucleosil Cl8 (4,0 x 250 mm) foi usada. A fase móvel foi filtrada antes do uso e espargida com hélio por todos os ensaios. O método gradiente final usado foi como segue:

Tempo (min)	Taxa de Fluxo (ml/min)	Tampão em % (pH 2,5)	Acetonitrila em %
0	1	80	20
10	1	20	80
15	1	60	40
17	1	80	20
20	1	80	20

O método foi validado por linearidade, precisão e para os metabólitos por LOQ e LOD. Desenvolver um método que fornece uma boa separação da aspirina e do ácido salicílico foi uma tarefa lenta ao passo que a escolha inicial de uma coluna spherisorb ODS Cl8 com tampão com pH 3,19 forneceu resíduos extremos e baixa separação (o tampão com um pH de 3,19 foi escolhido ao passo que este é mais próxima ao seu pKa - o da aspirina é de 3,5 e do ácido salicílico é de 2,97^[2Í). Isto foi eventualmente resolvido usando-se a coluna hichrom nucleosil e tampão no pH 2,5. Como a aspirina é um ácido fraco com um pKa de 3,5, reduzir o pH do tampão abaixo do seu pKa diminui a retenção ao passo que o composto se toma mais hidrofóbico. A coluna de nucleosila forneceu uma excelente forma de pico e resolução dos dois compostos. Inicialmente, os sais monoidratados foram usados os quais produziram um grande pico do tampão aos 18 minutos. Usando os sais diidratados eliminou o pico. Embora próximo ao final deste trabalho, alguns grandes picos do tampão começaram a aparecer novamente.

Também existem métodos para medir a inibição de agregação de plaquetas, TXB₂, expansão de plaqueta GP2B3A, MDA e os dados correspondentes que demonstram que os compostos chave têm uma atividade semelhante à aspirina.

Estudos de agregação do sangue integral

Uma alíquota de 500 pl de sangue foi misturada com 500 μΐ de solução salina fisiológica e deixada incubar a 37 °C por 10 minutos no reservatório de incubação de um Agregômetro de sangue integral Chrono-Log modelo 591/592. A amostra foi depois transferida ao recipiente de ensaio, a linha de base foi estabelecida e um volume apropriado de reagente como acima foi adicionado. A agregação foi monitorada durante 6 minutos com a saída de impedância registrada em um registrador de gráfico. Quando do teste de inibidores, o sangue integral foi pré-incubado com concentrações apropriadas de inibidor em DMSO a 37 °C por uma extensão de tempo especificada de antes de adicionar o estimulante (10 minutos com agitação). Três agentes de agregação diferentes, AA (0,5 mM), ADP (10 μΜ) e Colágeno (5 μg/ml) foram usados. Onde nenhuma resposta de agregação foi observada na presença de um inibidor uma experiência de controle foi realizada sem nenhum inibidor presente. O DMSO em altas concentrações (acima de 0,25 %) pode induzir uma carga dependente da concentração em plaqueta do cálcio ionizado citoplásmico. Antes de cada experiência um controle foi operado usando PRP para obter respostas de agregação normais. Uma amostra também foi incubada por 10 minutos a 37 °C com 10 μΐ de DMSO para garantir que esta não teve nenhum efeito inibidor na resposta de agregação. Dois metabólitos de ISAS, ácido salicílico e isossorbida foram 5 examinados para determinar se estes tiveram um efeito inibidor nas plaquetas.

Neste modelo, as ISAS apresentaram uma potência significantemente maior do que a aspirina ou ISDA na inibição da agregação de plaquetas para todos os estímulos de agregação.

Agregação de plaquetas do plasma rico em plaquetas

Sangue foi coletado de voluntários sadios os quais não tomaram nenhuma droga conhecidas afetar a função das plaquetas por pelo menos 14 dias antes do estudo. O plasma rico em plaquetas (PRP) e as suspensões de plaquetas lavadas (2,5 x 10⁸ plaquetas/ml) foram preparadas à partir do sangue como previamente descrito.

A agregação de plaquetas foi medida através da agregometria de luz como previamente descrito. Em resumo, o PRP e as amostras de plaquetas lavadas (2,5 x 10⁸/ml) foram colocadas em um lumi-agregômetro de cálcio ionizado em sangue integral (Chronolog Corp., Havertown, PA, E.U.A), e (BIO/DATA CORPORATION) e incubadas por 10 minutos a 37 °C, com agitação a 900 r.p.m., antes da adição de agentes de agregação. A agregação foi iniciada pela adição dos agonistas, e monitorada pelo software Aggro-Link por pelo menos 6 minutos. Para as experiências que usam os inibidores, a agregação foi iniciada após 10 minutos de pré-incubação com estes compostos

Para estudar a potência de agregação da ADP, as curvas de concentração-resposta (0,3 a 10 μΜ) foram geradas. O colágeno em diferentes concentrações (3 a 5 pg/ml) também foi usado para induzir a agregação de plaquetas. As concentrações sub-máximas de agonistas, isto é, as concentrações que forneceram aproximadamente 95 % da agregação máxima foram usadas para estudar os efeitos dos inibidores de agregação. Os resultados foram expressos em mudanças de porcentagem em uma transmissão de luz máxima, com 100 % representando a transmissão de luz do meio de plaquetas sozinho.

Inibição da síntese de TXB2.

A aspirina inibe a agregação de plaquetas atenuando-se a síntese mediada por cicloxigenase de PGH2, que é convertida em células para o agregador mais forte de TXA₂ através de tromboxano sintase. O TXA₂ é altamente evanescente e inadequado para medições diretas mas seu metabólito TXB₂ é geralmente acreditado fornecer um índice útil do precursor. O tratamento de aspirina do tecido in vivo ou in vitro é refletido em uma depressão do TXB₂. De modo a comparar os compostos da invenção com aspirina neste sentido, o sangue integral não tratado foi deixado coagular na presença de aspirina ou dos compostos de teste no decorrer de 1 hora a 37 °C. As amostras foram depois centrifugadas. O soro foi coletado e a TXB₂ foi medida usando kits de ensaio imunossorvente ligado por enzimas (ELISA) obtidos da Cayman Chemicals. As experiências foram realizadas com aspirina em concentração descendentes de valores que forneceram a inibição completa da síntese de TXB₂. Nestes ensaios, ISAS foi significantemente mais potente do que a aspirina como refletido em um IC₅o menor.

Citometria de Fluxo

De modo a analisar a expressão do receptor na superfície das plaquetas individuais e para minimizar a ativação das plaquetas causada pelos procedimentos de preparação da amostra, nenhuma etapa de agitação ou turbilhonamento foi usada. A abundância de GPIIb/IIIa ativado e selectina P na superfície das plaquetas na presença e ausência de inibidores foi medida pela citometria de fluxo. As amostras de plaquetas foram primeiro ativadas com os agonistas, colágeno ou ADP. Quando a agregação de plaquetas alcançou 50 % de transmissão de luz máxima, a reação foi terminada pela diluição de 10 vezes com solução salina fisiológica. As plaquetas restantes foram usadas como controle. Na maioria das experiências, as plaquetas foram pré-incubadas com inibidores por 10 minutos antes da adição dos agonistas. As amostras de plaquetas foram depois incubadas no escuro sem agitação por 5 minutos na temperatura ambiente na presença de concentrações saturadas (10 pg/ml) de selectina P (CD62P-APC). Os receptores de plaquetas GPIIb/IIIa ativados foram medidos usando o anticorpo monoclonal PAC-1 na mesma concentração como acima. O PAC-1 especificamente reconhece um epítopo no complexo GPIIb/IIIa de alta afinidade de plaquetas ativadas na ou próximo da plaqueta. Após a incubação, as amostras foram diluídas em fluido FACS Flow e analisadas dentro de 5 minutos usando um BD FACSArray (BD Biosciences, Oxford, RU). A citometria de fluxo foi realizada em amostras de plaqueta tingidas únicas como anteriormente descrito³. O instrumento foi ajustado para medir o tamanho (dispersão dianteira), granulosidade (dispersão lateral) e fluorescência celular. Uma entrada de análise de duas dimensões da dispersão dianteira e lateral foi puxada de modo a incluir plaquetas únicas e excluir os agregados de plaquetas e micropartículas. A ligação de anticorpos foi medida analisando-se as plaquetas individuais por fluorescência. A intensidade média de fluorescência foi determinada após a correção para a autofluorescência celular. Para cada amostra, a fluorescência foi analisada usando uma escala logarítmica.

Os histogramas de fluorescência foram obtidos para 10.000 eventos individuais. Os dados foram analisados usando um software Cytometer RXP e expressos como uma porcentagem da fluorescência de controle em unidades arbitrárias.

Preparação de amostras biológicas para hidrólise e medição da liberação de aspirina

As amostras de sangue humano foram coletadas por venipuntura em tubos Li-Heparin Sarstedt Monovette (9 ml). As amostras de plasma foram obtidas através da centrifugação de sangue a 10.000 rpm por cinco minutos e foram congeladas em alíquotas até o necessário para testar. Os microssomos hepáticos humanos reunidos (HLM) foram diluídos a 5 ml com tampão de fosfato com pH de 7,4 (0,1 M) fornecendo uma solução de estoque de 2 mg/ml. As alíquotas foram congeladas até o necessário para testar. Os microssomos do intestino humano reunidos (HIM) foram diluídas a 5 ml com tampão de fosfato com pH de 7,4 (0,1 M) fornecendo uma solução de estoque de 80 pg/ml. As alíquotas foram congeladas até o necessário para testar.

Atividade de Colinoestearase

A atividade de butirilcolinoestearase (BChE) em HLM e HIM foi determinada de maneira espectrofotométrica (405 nm) a 37 °C através do método de Ellman (Ellman et al., 1964). Iodeto de butiriltiocolino (BTCI) (0,5 mM) foi usado como o substrato. A reação ocorreu em uma placa de 96 reservatórios com um volume final de 250 μΐ. Inicialmente, o tampão de fosfato com pH de 8,0 (0,1 M) e os microssomos foram misturados e incubados por 30 minutos. DTNB (0,3 mM) e BTCI foram adicionados e a reação foi medida. O ensaio também foi realizado usando estouros de sonificação (4x5 segundos) nos microssomos e colocando no gelo por 1 minuto no meio. Isto garante que os microssomos estão abertos à penetração dos reagentes^[5]. A atividade foi calculada de acordo com a Eqn 1:

Atividade Enzimática Amostra-Branco (μπιοΙ/L/inin) = in c, ,

J-^υ r ° (coeficiente abs)

Eqn 1

A tabela 2 mostra os compostos com numeração e a quantidade de aspirina como uma porcentagem da concentração do éster inicial em moles medida na produção da aspirina de pico após a adição de ésteres candidatos ao plasma humano tamponado a 37 °C no pH 7,4 (tampão de fosfato).

Tabela 2:

Composto V íTY°	Meia-vida e % molar da aspirina liberada em 10% do plasma humano	Meia-vida e % molar da aspirina liberada em 10% do plasma humano
O CH... aa; 'Vjõ'' Benzoato de 2-metila, R= *	2,17 min	46,02%	0,83 min	58,53 %
0 OH i\| ’ A A Salicilato, R= (ISAS) 2	4,90 min	72,23%	1,14 min	85,36 %
O JL ...CH, ' 1J ' benzoato de 3-metila, R= 3	9,72 min	38,34%	1,21 (min)	53,66%
O ''‘CH, λ Acetato, R= “	3,63 min	1,17%	0,57 (min)	1,19%
O Pentanoato, R= *5	3,76 min	6,82%	0,66 (min)	6,71 %
0 A.,·^ I,[ „J Benzoato, R = 6	3,32 min	18,93%	0,64 min	28,51 %
O Nicotinato, R= ^7	1,29 min	2L58 %	0,37 min	17,92 %
O 1........ .· γ η ^!k.,^N iso-nicotinato, R=	3,68 min	18,76 %	0,33 min	27,62 %
A benzilóxi-benzoato, R= 9	20,63 min	12,87 %	4,27 m	18,89%
O NiHj 2-aminobenzoato, R=	50,22 min	2,82 %	1,55 (min)	4,68 %
O OMe 2-metoxibenzoato, R= ü	3,59 min	5,16%	0,99 (min)	7,08 %

J. OMè li J 3-metoxibenzoato, R= “ 1	3,28 min	18,91 %	085 (min)	17,00%
''' ''j··' -¾) 4-metoxibenzoato, R= Ofvte 13	3,17 min	2,53 %	1,10 (min)	3,75 %
p 4-metilbenzoato, R=	6,23 min	15,85 %	2,16 min	14,49 %
.1 4-nitrobenzoato, R= 15	2,86 min	18,46%	1,’37 min	22,25 %
° r Aspirinato, R= ÇÍS-OA} Í.6	4,43 min	51,0%	0,68 min	60,47 %
não substituído, R= (Isossorbida-2-aspirinato) 0Ί	4,08 min	2,95 %	Não testado	Não testado
(3-(2-bromo-acetóxi))-benzoato, R= 0
o q Br A. .X . η	1,85 min	74,2 %	n/a	n/a
18
o J Ciclopropanoato, R= 19	1,9 min	<2%	n/a	n/a
O._cn p-cianobenzoato, R= 20	Não testado	Não testado	4,3 min	<1 %
O 11 .. XX₂₁ p-fenilbenzoato, R= ·4*·	Não testado	Não testado	>1 hora	<1 %
.,-¾... , Cl li T
'jl.....	Não testado	Não testado	1,4 min	45%
6-cloronicitinoato, R= 22
0
u 1	Não testado	Não testado	2,7 min	48%
Ol 5 5t· 2-cloro-6-cloronicitinoato, R= -£*3

OEt ι	OEt 24	Não testado	Não testado	3,1 min	<1%
3,5~dietoxibenzoato, R=	f 0
	0 >=N			Não testado	Não testado	<1 min	72%
3-metilisoxazol-4-oato, R=	HjC		25
	0	X li—Q		Não testado	Não testado	<1 min	68%
h₃c 4-metil-l,2,3-tiadiazol-5-oato, R=		26
	O
nipecotoato de NBOC, R=		,NBOC	27	Não testado	Não testado	4,1 min	<1%
3-acetamidobenzoato, R=	0 O	H N	0	23	Não testado	Não testado	1,3 min	21%
p-benziloxibenzoato, R=	0		OBn	29	Não testado	Não testado	> 5min	<1%
m-benziloxibenzoato, R=	0		OBn	30	Não testado	Não testado	2,5 min	<1%
Compostos substituídos por nitrato O,
0 lí o	•Q H / I \ ° : A ^H OR			Meia-vida e % molar da aspirina liberada em 10% do plasma humano	Meia-vida e % molar da aspirina liberada em 10% do plasma humano
R= ONO₂, ISMNA, REFERÊNCIA	0,90 min	7,13%	0,22 min	5,89 %

(2-nitroximetil)-benzoato, R= θ -ONO^ AÃ.	Não testado	Não testado	3,02 min	81 %
31
(3-nitroximetil)-benzoato, R= O
'ΌΝΟ₂	Não testado	Não testado	2,7 min	78%
32
(4- nitroximetil)-benzoato, R= 0
	5,99 min	2%	Não testado	Não testado
ΑΑ-^νο. 33
(Nitróxi)-acetato, R= 0
	3,61 min	<0,5%	Não testado	Não testado

Resultados dos testes no plasma dos animais de teste

A triagem de hidrólise quantitativa do Is-2-aspirinato-5salicilato 2 (0,1 mM) foi estudada usando plasmas de porquinhos-da-índia, hamster, coelhos e macacos. O propósito deste teste foi determinar uma 5 espécie adequada para o teste biológico e desenvolvimento pré-clínico. Os resultados também foram esperados confirmar o papel das enzimas humanas já identificadas porque são distribuídas de maneira variada em animais de laboratório.

Tabela 3: Hidrólise de Is-2-aspirinato-5-salicilato usando várias espécies

Concentração da pródroga (mM)	Fonte de Plasma	Aspirina	Tempo de desaparecimento da droga (min)
0,1	Porquinho-da-índia	(pequenas quantidades v)	Presente após 1 hora
0,1	Coelho	(pequenas quantidades v)	10
0,1	Hamster	(grandes quantidades)	20
0,1	Macaco	(grandes quantidades)	5

Uma vez que um método gradiente foi desenvolvido com sucesso, a hidrólise de 2 em 50 % de plasma de coelho foi operada ao passo que o coelho é um modelo potencial para os estudos de agregação de plaquetas. O ensaio de Ellman revelou a atividade de BChE a 1,1 pmol/L/min. Os resultados sugerem que o hamster e o macaco seriam candidatos adequados para os testes pré-clínicos. Visto que o plasma destas espécies têm níveis similares de BuChE aos seres humanos, o papel desta enzima no metabolismo humano também é sustentado.

Resultados da Hidrólise para Is-2-aspirinato-5-salicilato, ISAS (2) na presença de microssomos do intestino ou fígado.

Os estudos da hidrólise no plasma do sangue humano indicara que ISAS (2) é uma pró-droga de aspirina bem sucedida. Este trabalho ajudou a ampliar a análise para incluir as preparações de microssomos do fígado e intestino de modo a auxiliar quanta liberação de aspirina ocorrería em outros tecidos durante a fase de absorção, principalmente no epitélio gástrico e em seguida, no fígado. A droga foi incubada na presença de Microssomos do Fígado Humano e Microssomos do Intestino Humano, 9 μΜ e 56 μΜ de aspirina foram produzidos (Figura 13) e (Figura 14) respectivamente. Isto fez surgir a questão de que isto foi devido à presença de BChE ou a alguma outra enzima porque considerando que o sangue humano contem somente butirilcolinoestearase, o fígado e o epitélio intestinal também contêm carboxilesterases (CE)- principalmente CE-1 no fígado e CE-2 no intestino. As preparações de microssomos foram portanto pré-incubadas com isoOMPA, um inibidor de BChE estabelecido antes da adição do pró-droga de modo que permite um tempo suficiente para inibir qualquer BChE que pode estar presente nas preparações de microssomos. Os ensaios de hidrólise foram depois realizados como previamente descrito para observar qual efeito se houve algum sobre a produção de aspirina. O uso de inibidor de BChE específico não diminui a produção de aspirina sugerindo que alguma outra enzima está envolvida. O ensaio de Ellman foi realizado em ambas as preparações microssômicas de modo a determinar que níveis de BChE estejam presentes, se houver. Somente quantidades mínimas foram encontradas (Tabela 3,1) e não puderam ser atribuídos aos altos níveis de produção de aspirina.

Tabela 4

HLM (mg/ml)	Atividade (gmol)/L/min) sem sonificação	Atividade (gmol/L/min) com sonificação	HIM (gg/ml)	Atividade (gmol)/L/min) sem sonificação	Atividade (gmol/L/min) com sonificação
0,04	0	-	16	0,16	0,18
0,08	0	-	32	0,33	-
0,2	-	0,93
0,4	2,86	1,68
0,8	4,93	3,03

Branco de plasma feminino = 14,98 pmol/L/min. O plasma contem aproximadamente 5 mg/1 de BuchE, portanto isto é o equivalente de 0,0125 pg/ml de BChE.

Usando a carboxilesterase de fígado de coelho, a hidrólise da droga foi medida e 5,99 μΜ de aspirina foi produzida (Figura 18) níveis similares para HLM.

BNPP um inibidor de carboxilestearase conhecido foi incubado com HIM e HLM por 10 minutos antes da adição da droga de modo a silenciar a atividade de carboxilestearase. Uma diminuição notável na produção de aspirina foi vista e após 60 minutos, a droga não desapareceu. Pode ser concluído que ISAS é um substrato para CE-1 e CE-2 bem como BuChE. Estas enzimas pertencem à mesma família mas têm uma diferença notável na especificidade do substrato. Por exemplo, as enzimas marcadas são ineficazes na hidrólise de substratos positivamente carregados tais como aqueles favorecidos por BuChE, incluindo ésteres de colino. Estas enzimas não são normalmente agrupadas. Surpreendentemente, no caso de ISAS, a CE-2 presente nas preparações de HIM apresenta a mesma especificidade e eficácia que BuChE e é tão bom quanto um vetor para a liberação de aspirina. O resultado indica que mais do que uma enzima é capaz de liberar a aspirina dos compostos.

Tabela 5: Comparação da produção de aspirina com diferentes amostras biológicas usando ISAS

Meio biológico	Cone, de droga (mM)	Aspirina (μΜ)	Ácido salicílico (μΜ)	Desaparecimento da droga (min)
Plasma humano a 50 % (fêmea)	0,1	22	4	10
Plasma de coelho a 50 %	0,1	2,6	25	20
Carboxilestearase (16,4 μ/ml)	0,1	5,7	53	5
HIM (80 pg/ml)	0,1	27	9	5
HIM (40 gg/ml)/BNPP (14μΜ)	0,1	2,2	0	9,4 μΜ restante

HLM (0,2 mg/ml))	0,1	9	34	10
HLM/BNPP (11,6 pM)	0,11	2,7	3,0	2,8 μΜ restante
HLM/isoOMPA (10pM	0,11	8,5	33	10

Tabela 6: Comparação da produção de aspirina usando amostras biológicas diferentes com Is-2-aspirinato-5-(3-nitróxi-metil) benzoato 21.

Meio Biológico	Cone, droga (mM)	Aspirina (μΜ)	Ácido Salicílico (μΜ)	Desaparecimento da droga (min)
HP a 50 %	0,25	26	18	10
HP a 80 %	0,1	21	18	10
Soro humano purificado (0,15 mg/ml)	0,12	15	9	10
HLM (0,2 mg/ml)	0,13	5	6	10
HLM/iso-OMPA (14,4 pg/ml)	0,1	1,4	4,5	20
HLM/BNPP (10,6 μΜ)	0,1	0,3	0,9	13 pm restantes
HIM (80 pg/ml)	0,1	20	4	10
HIM/BNPP (11,6 pm)	0,11	0,22	1,3	11 pm restantes
HIM/isoOMPA (10,14 pm)	0,1	12,7	7,2	30

Resultados da hidrólise para Is-2-aspirinato-5-(4-nitróxi- metil)benzoato 22

Tabela 7: Efeito da posição de NO na produção de aspirina

Fonte biológica	2-nitóxi (5) (μΜ)	3-nitóxi (4) (μΜ)	4-nitóxi (6) (μΜ)
Plasma humano a 50 %	10,3	26	2
HIM (80 pg/ml	21,7	20	9,7

Resultados da hidrólise de ésteres de aspirina de referência com base em não-isossorbida.

A hidrólise de dois ésteres de aspirina com base em não5 isossorbida isto é, 2-metóxifenil-2-acetoxibenzoato (éster de guaicol) e éster fenílico do ácido 2’-acetoxibenzóico foram avaliadas em microssomos do intestino humano (40 pg/ml).Nenhum destes ésteres age como uma pró-droga de aspirina no plasma humano, isto é, a ação da estearase no plasma humano não leva à liberação de aspirina à partir destes ésteres.

Tabela 8: produção de aspirina de ésteres de aspirina com base em nãoisossorbida em HIM

Fonte biológica	Éster de aspirina Guaicol	Éster fenílico do ácido 2-acetoxibenzóico (pm)
HIM (40 pg/ml)	0,5 (pM)	7,7 (pM)
HIM (20 pg/ml)		5,3 (pM)

Os aspirinatos de fenila produziram quantidades insignificantes de aspirina em contacto com os microssomos do intestino humano, ilustrando que para estes substratos, a preferência de CE-2 é 15 levemente diferente para BuChE, na presença do qual a hidrólise ocorre sem a evolução de aspirina. Contudo, com relação ao ISAS e os análogos de nitroximetila, houve pouca produção de aspirina. Em outras palavras, estes compostos não são pró-drogas de aspirina no plasma humano e são pródrogas de aspirina ineficazes na presença de CE-2. Os dados ilustram que a interação entre CE-2 e as pró-drogas da invenção é especial em que a produção de aspirina eficaz ocorre.

Tabela 9: Comparação das quantidades de aspirina produzida à partir de Is-2aspirinato-5-salicilato e Is-2-aspirinato-5-(3-nitroximetil)benzoato

Meio Biológico	Is-2-asp-5-salicilato	Is-2-asp-5-(3-nitróximetil)benzoato
HP a 50 %	22	21
HLM (0,2 mg/ml)	9	5
HLM/iso-OMPA (14,4 pg/ml)	8,5	1,4
HLM/BNPP (10,6 μΜ)	2,7	0,3
HIM (80 pg/ml)	27	20
HIM/BNPP (11,6 pm)	2,2	0,22
HIM/isoOMPA (10,14 pm)	-	12,7

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto de aspirinato de isossorbida caracterizado pelo fato de que tem a estrutura geral:

5 em que Y é selecionado do grupo consistindo de
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

10 pelo fato de que Y é selcionado do grupo consistindo de
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Y é selcionado do grupo consistindo de
4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Y é selcionado do grupo consistindo de

Petição 870180140966, de 15/10/2018, pág. 19/21
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de estar na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.
6. Composto de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para uso como medicamento.
7. Composto de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de distúrbios cardiovasculares e cerebrovasculares, dor, febre, inflamação, doença de Alzheimer ou demência.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido nas reivindicações de 1 a 5, e pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
9. Uso do composto como definido nas reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratamento de distúrbios cardiovasculares e cerebrovasculares, dor, febre, inflamação, doença de Alzheimer ou demência.