BRPI0820912B1 - Uso de um agente farmacológico ligado a um peptídeo tat, uso de um inibidor de degranulação de mastócito ou anti-histamínico e kit compreendendo um agente farmacológico - Google Patents

Abstract

COADMINISTRAÇÃO DE UM AGENTE LIGADO A UM PEPTÍDEO DE INTERNALIZAÇÃO COM UM ANTI- INFLAMATÓRIO. A invenção fornece métodos para liberar os agentes farmacológicos ligados a um peptídeo de internalização, em que uma resposta inflamatória induzível pelo peptídeo de internalização é inibida pela co-administração de um anti- inflamatório ou ligando o peptídeo de internalização à biotina ou molécula similar. Tais métodos são estabelecidos como premissa em parte nos resultados descritos nos exemplos em que a administração de um agente farmacológico ligado ao tat em dosagens elevadas é seguida proximamente por uma resposta inflamatória, que inclui a desgranulação de mastócito, liberação de histamina e sequelas típicas de liberação de histamina, como vermelhidão, calor, inchamento, e hipotensão.

Description

Este pedido reivindica a prioridade ao Pedido provisório US N°. 60/992.678 depositado em 5 de dezembro de 2007, incorporado por referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA A UMA “LISTAGEM DE SEQUÊNCIA”

A listagem de sequência fornecida no arquivo SEQLIST026373000910US.txt, de tamanho 16.385 bytes e criado em 18 de novembro de 2008, é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Muitos fármacos são exigidos serem captados por células ou passar através de células e/ou serem captados por organelas celulares para alcançar seu alvo terapêutico pretendido. Muitas moléculas maiores e algumas pequenas têm capacidade limitada de passar através das membranas celulares. A capacidade de passar através das membranas celulares pode ser aumentada ligando um agente farmacológico a um peptídeo de internalização (também conhecido como domínios de transdução de proteína, ou domínios de translocação de membrana). Estes peptídeos incluem tat, peptídeo de antennapedia e peptídeos ricos em arginina. Estes peptídeos são peptídeos básicos curtos presentes em muitas proteínas celulares e virais e servem para mediar a translocação através das membranas. Uma característica comum destes peptídeos é sua natureza altamente catiônica. Tais peptídeos foram relatados por facilitar a captação de muitos peptídeos e proteínas diferentes em células, bem como oligonucleotídeos, ácidos nucléicos de peptídeo e pequenas moléculas e nanopartículas. A captação em células e organelas e através da barreira hematocefáfica foi relatada.

Como uma aplicação de peptídeos de internalização, um peptídeo tat foi ligado a um inibidor de peptídeo de interação entre a proteína de densidade-95 pós-sináptica (PSD-95) e NMDARs (Aarts e col., Science 298, 846-850 (2002)). O peptídeo quimérico resultante foi testado em um modelo celular e animal de acidente vascular. O peptídeo quimérico foi captado em células neuronais e descoberto reduzir dano cerebral isquêmico no modelo animal. Este resultado conduziu à proposta para usar antagonistas de peptídeo de PSD-95/NMDAR ligado a um peptídeo de internalização para tratar acidente vascular e outras doenças mediadas por excitotoxidade.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção fornece um método de liberar um agente farmacológico a um indivíduo, o método. O método compreende administrar o agente farmacológico ligado a um peptídeo de internalização ao indivíduo; e administrar um agente anti- inflamatório ao indivíduo, em que o agente anti- inflamatório inibe uma resposta inflamatória induzida pelo peptídeo de internalização. Opcionalmente, o agente anti- inflamatório é um antistamínico ou corticosteróide. Opcionalmente, o peptídeo de internalização é um peptídeo tat. Opcionalmente, o peptídeo tat tem uma sequência de aminoácido compreendendo GRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 1), YGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 2), FGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 3), ou GRKKRRQRRRPQ (ID. de SEQ. N°: 4). Opcionalmente, o agente farmacológico é um peptídeo. Opcionalmente, o agente farmacológico é KLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 5).

A invenção também fornece o uso de um agente anti- inflamatório na manufatura de um medicamento para inibir uma resposta inflamatória induzida por um peptídeo de internalização ligado a um agente farmacológico.

A invenção também fornece um kit compreendendo um agente farmacológico ligado a um peptídeo de internalização, e um agente anti-inflamatório que inibe uma resposta inflamatória induzida pelo peptídeo de internalização.

A invenção também fornece um peptídeo de internalização ligado à biotina tendo capacidade reduzida para induzir uma resposta inflamatória comparada ao peptídeo de internalização sem a biotina.

A invenção também fornece um método de liberação de um agente farmacológico a um indivíduo, o método compreendendo administrar o agente farmacológico ligado a um peptídeo de internalização ao indivíduo; em que o peptídeo de internalização biotinilado, e a biotinilação reduz a capacidade do peptídeo de internalização induzir uma resposta inflamatória relativa ao peptídeo de internalização sem a biotina.

A invenção também fornece um método para tratar ou efetuar profilaxia de uma doença mediada por excitoxidade compreendendo administrar a um indivíduo tendo ou em risco da doença um agente farmacológico que inibe a ligação de PSD95 à NDMAR 2B ligado a um peptídeo de internalização em um regime eficaz para tratar ou efetuar profilaxia da doença; e administrar ao indivíduo um agente anti- inflamatório, em que o agente anti-inflamatório inibe uma resposta inflamatória induzida pelo peptídeo de internalização. Opcionalmente, o agente farmacológico é um peptídeo PL de um receptor de NMDAR. Opcionalmente, o peptídeo de internalização é um peptídeo tat. Opcionalmente, o peptídeo de internalização tem uma sequência de aminoácido compreendendo GRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 1), YGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 2), FGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 3) ou GRKKRRQRRRPQ (ID. de SEQ. N°: 4). Opcionalmente, o indivíduo é fêmea. Opcionalmente, a doença é acidente vascular. Em alguns métodos, o indivíduo está em risco de ataque isquêmico cerebral transitório como resultado de se submeter à cirurgia de coração.

A invenção ainda fornece um método para tratar ou efetuar profilaxia de uma doença mediada por excitotoxidade compreendendo administrar a um indivíduo tendo ou em risco da doença um agente farmacológico que inibe a ligação de PSD95 à NDMAR 2B ligado a um peptídeo de internalização em um regime eficaz para tratar ou efetuar profilaxia da doença; em que o peptídeo de internalização é biotinilado, e a biotinilação reduz a capacidade do peptídeo de internalização para induzir uma resposta inflamatória.

A invenção ainda fornece um método para tratar ou efetuar profilaxia de uma doença mediada por excitotoxidade compreendendo administrar a um indivíduo fêmea tendo ou em risco da doença um agente farmacológico que inibe a ligação de PSD95 à NDMAR 2B ligado a um peptídeo de internalização em um regime eficaz para tratar ou efetuar a profilaxia da doença. Opcionalmente, o peptídeo de internalização é um peptídeo tat.

A invenção ainda fornece uma melhoria em um método para liberar um agente farmacológico ligado a um peptídeo de internalização a um indivíduo, em que o peptídeo de internalização é biotinilado ou administrado com um imunossupressor que inibe uma resposta inflamatória induzida pelo peptídeo de internalização. Opcionalmente, o peptídeo de internalização é um peptídeo tat.

A invenção ainda fornece um método para inibir uma resposta inflamatória, o método compreendendo: administrar um agente anti-inflamatório ao um indivíduo que foi ou será administrado um agente farmacológico ligado a um peptídeo de internalização; em que o agente anti-inflamatório inibe uma resposta inflamatória induzida pelo peptídeo de internalização.

A invenção ainda fornece um método para liberar um agente farmacológico a um indivíduo, o método compreendendo: administrar o agente farmacológico ligado a um peptídeo de internalização a um indivíduo, em que ao indivíduo foi ou será administrado um agente anti- inflamatório, em que o agente anti-inflamatório inibe uma resposta inflamatória induzida pelo peptídeo de internalização.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Diferença de gênero em tamanho de infarto no modelo P3V0 de acidente vascular no rato. Machos salinos: ratos de acidente vascular machos tratados com solução salina (controle). Machos NA1: Ratos de acidente vascular machos tratados com Tat-NR2B9c, isto é, o peptídeo YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 6), contendo a sequência de Tat e os 9 aminoácidos carbóxi terminais da subunidade NR2B. Fêmeas salinas: ratos de acidente vascular fêmeas tratados com solução salina (controle). Fêmeas NA1: Ratos de acidente vascular fêmeas tratados com Tat-NR2B9c, isto é, o peptídeo YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 6), contendo a sequência de Tat e 9 aminoácidos carbóxi terminais da subunidade NR2B. Eixo Y: Tamanho de infarto, medido (em termos de porcentagem) relativo ao tamanho de infarto em ratos machos tratados com solução salina sozinha.

Figura 2: Peptídeos contendo a sequência de Tat causam a degranulação de mastócito. CI: Ionóforo de Cálcio (controle positivo). NA-1: Tat-NR2B9c, isto é, o peptídeo YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 6), contendo a sequência de Tat e 9 aminoácidos carbóxi terminais da subunidade NR2B. NR2B9c: peptídeo KLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 5), sequência de ligação PSD-95 de NMDA subunidade NR2B, desprovido da sequência de Tat. AA: peptídeo YGRKKRRQRRRKLSSIEADA (ID. de SEQ. N°: 7), idêntico à Tat- NR2B9c, mas com 2 mutações pontuais no domínio de ligação PSD-95 tornando-o incapaz de ligar PSD-95. A degranulação foi medida pela atividade relativa de triptase (% sobre controle). As barras indicam a média ± S.D. de 3-6 repetições independentes.

Figura 3: Degranulação de mastócito por peptídeos contendo a sequência de Tat é dependente de dose. CI: Ionóforo de Cálcio (controle positivo). NA-1: Tat-NR2B9c, isto é, o peptídeo YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 6), contendo a sequência de Tat e 9 aminoácidos carbóxi terminais da subunidade NR2B. AA: peptídeo YGRKKRRQRRRKLSSIEADA (ID. de SEQ. N°: 7), idêntico a TAT- NR2B9C, mas com 2 mutações pontuais no domínio de ligação PSD-95 que tornando-o incapaz de ligar PSD-95.

Figura 4: Degranulação de mastócito por peptídeos contendo variantes de sequência de Tat. CI: Ionóforo de Cálcio (controle positivo). Tat-NR2B9c: o peptídeo YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 6), contendo a sequência de Tat e 9 aminoácidos carbóxi terminais da subunidade NR2B. TAT: Sequência de peptídeo tat YGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 2). 2B9c: peptídeo KLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 5), sequência de ligação PSD-95 de NMDA subunidade NR2B desprovida da sequência de Tat. AA: peptídeo YGRKKRRQRRRKLSSIEADA (ID. de SEQ. N°: 7), idêntico a Tat- NR2B9c, mas com 2 mutações pontuais no domínio de ligação PSD-95 tornando-o incapaz de ligar PSD-95. F-Tat NR2B9c: peptídeo FGRKKRRQRRRKLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 8). Tat- NR2B9c K>A: YGRKKRRQRRRALSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 9). F- Tat-NR2B9c K>A: FGRKKRRQRRRALSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 10).

Figura 5: Conjugados de peptídeos compreendendo a falha de sequência de Tat para provocar a degranulação de mastócito. Figura 6: Queda observada na pressão sanguínea observada após a administração de 50 mg/kg Tat-NR2B9c aos cães beagle.

DESCRIÇÃO DETALHADA DEFINIÇÕES

Um “peptídeo quimérico” significa um peptídeo tendo dois peptídeos componentes não naturalmente associados um com o outro unidos a outro como uma proteína de fusão ou por ligação química.

Uma “proteína de fusão” ou polipeptídeo refere-se a um polipeptídeo composto, isto é, uma única sequência de aminoácido contígua, composta de sequências de dois (ou mais) polipeptídeos heterólogos distintos que não são normalmente fundidos juntos em uma única sequência de polipeptídeo.

O termo “domínio PDZ” refere-se a um domínio de proteína modular de aproximadamente 90 aminoácidos, caracterizado pela identidade de sequência significativa (por exemplo, pelo menos 60%) à proteína sináptica de cérebro PSD-95, a proteína de junção septada de drosófila Discs-Large (DLG), e a proteína de junção estanque epitelial ZO1 (ZO1). Os domínios PDZ também são conhecidos como repetições de homologia Discs-Large (“DHRs”) e repetições GLGF. Os domínios PDZ geralmente parecem manter uma sequência consenso de núcleo (Doyle, D.A., 1996, Cell 85:1067-76). Proteínas contendo domínio PDZ de exemplo e sequências de domínio PDZ divulgadas no Pedido US N°. 10/714.537, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

O termo “proteína PL” ou “proteína de ligante de PDZ” refere-se a uma proteína natural que forma um complexo molecular com um domínio PDZ, ou a uma proteína cujo terminal carbóxi, quando separadamente expresso da proteína inteira (por exemplo, como um fragmento de peptídeo de 3-25 resíduos, por exemplo, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 14 ou 16 resíduos), forma tal complexo molecular. O complexo molecular pode ser observado in vitro usando o “ensaio A” ou “ensaio G” descrito, por exemplo, no Pedido US N°. 10/714.537, ou in vivo.

O termo “receptor de NMDA”, ou “NMDAR”, refere-se a uma proteína associada à membrana que é conhecida por interagir com NMDA. O termo inclui assim várias formas de subunidade descritas aqui. Tais receptors podem ser humanos ou não humanos (por exemplo, camundongo, rato, coelho, macaco).

Uma “porção PL” refere-se à sequência de aminoácido do C-terminal de uma proteína PL (por exemplo, o C-terminal 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 20 ou 25 resíduos contíguos) (“sequência PL C-terminal”) ou a uma sequência interna conhecida para ligar um domínio PDZ (“sequência PL interna).

Um “peptídeo PL” é um peptídeo compreendendo ou consistindo de, ou baseado de outra maneira em, uma porção PL que especificamente se liga a um domínio PDZ.

Os termos “isolado” ou “purificado” significa que a espécie objeto (por exemplo, um peptídeo) foi purificado dos contaminantes que estão presentes em uma amostra, tal como uma amostra obtida de fontes naturais contendo a espécie objeto. Se uma espécie objeto é isolada ou purificada é a espécie macromolecular predominante (por exemplo, polipeptídeo) presente em uma amostra (isto é, em uma base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição), e preferivelmente a espécie objeto compreende pelo menos aproximadamente 50% (em uma base molar) de todo a espécie macromolecular presente. Geralmente, uma composição isolada, purificada ou substancialmente pura compreende mais de 80 a 90% de todas as espécies macromoleculares presentes em uma composição. Mais preferivelmente, a espécie objeto é purificada à homogeneidade essencial (isto é, a espécie contaminante não pode ser detectada na composição por métodos de deteção convencionais), em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. O termo isolado ou purificado não exclui necessariamente a presença de outros componentes pretendidos atuar em combinação com uma espécie isolada. Por exemplo, um peptídeo de internalização pode ser descrito como isolado apesar de estar ligado a um peptídeo ativo.

Um “peptidomimético” refere-se a um composto químico sintético que tem substancialmente as mesmas características estruturais e/ou funcionais de um peptídeo consistindo de aminoácidos naturais. O peptidomimético pode conter análogos inteiramente sintéticos, não naturais de aminoácidos, ou pode ser uma molécula quimérica de aminoácidos de peptídeo parcialmente naturais e análogos parcialmente não naturais de aminoácidos. O peptidomimético pode também incorporar qualquer quantidade de substituições conservativas de aminoácido natural tão longas como tais substituições também não substancialmente alteram a estrutura mimética e/ou atividade inibitória ou ligação. As composições miméticas de polipeptídeo podem conter qualquer combinação de componentes estruturais não naturais, que são tipicamente de três grupos estruturais: a) grupos de ligação de resíduo diferentes de ligação de amida natural (“ligação de peptídeo”) ligações; b) resíduos não naturais no lugar de resíduos de aminoácido naturais; ou c) resíduos que induzem a mimetização estrutural secundária, isto é, induzir ou estabilizar uma estrutura secundária, por exemplo, uma conformação beta volta, gama volta, beta folha, alfa hélice, e similares. Em um peptidomimético de um peptídeo quimérico compreendendo um peptídeo ativo e um peptídeo de internalização, a parte ativa ou a parte de internalização ou ambas podem ser um peptidomimético.

O termo “ligação específica” refere-se a uma ligação entre duas moléculas, por exemplo, um ligante e um receptor, caracterizadas pela capacidade de uma molécula (ligante) se associar com outra molécula específica (receptor) mesmo na presença de muitas outras diversas moléculas, isto é, para mostrar ligação preferencial de uma molécula a outra em uma mistura heterogênea de moléculas. A ligação específica de um ligante a um receptor é também evidenciada pela ligação reduzida de um ligante detectavelmente marcado ao receptor na presença de excesso de ligante não marcado (isto é, um ensaio de competição de ligação).

A excitotoxidade é o processo patológico pelo qual os neurônios são danificados e mortos por superativação de receptores para o neurotransmissor excitatório glutamato, tal como os receptores de NMDA, por exemplo NMDAR 2B. O termo “indivíduo” inclui humanos e animais veterinários, tais como mamíferos.

O termo “agente” inclui qualquer elemento, composto, ou entidade, incluindo, mas não limitado a, por exemplo, farmacêutico, terapêutico, farmacológico, cosmecêutico, fármaco, toxina, produto natural, composto sintético, ou composto químico.

O termo “agente farmacológico” significa um agente tendo uma atividade farmacológica. Os agentes incluem os compostos que são fármacos conhecidos, os compostos para os quais a atividade farmacológica foi identificada, mas que estão sofrendo avaliação terapêutica adicional. Um agente quimérico compreende um agente farmacológico ligado a um peptídeo de internalização. Um agente pode ser descrito como tendo atividade farmacológica se exibe uma atividade em um sistema de avaliação que indica que o agente ativo é ou pode ser útil na profilaxia ou tratamento de uma doença. O sistema de avaliação pode ser in vitro, celular, animal ou humano. Os agentes podem ser descritos como tendo atividade farmacológica apesar de teste adicional poder ser exigido para estabelecer utilidade profiláctica ou terapêutica real em tratamento de uma doença.

Um peptídeo tat significa um peptídeo compreendendo ou consistindo de GRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 1), em que não mais do que 5 resíduos são deletados, substituídos ou introduzidos dentro da sequência, que retém a capacidade para facilitar a captação de um peptídeo ligado ou outro agente em células. Preferivelmente quaisquer mudanças de aminoácido são substituições conservativas. Preferivelmente, quaisquer substituições, deleções ou inserções internas no agregada deixam o peptídeo com uma carga catiônica líquida, preferivelmente similar a da sequência acima. Os aminoácidos de um peptídeo tat podem ser derivatizados com biotina ou molécula similar para reduzir uma resposta inflamatória, como descrito abaixo.

A co-administração de agentes farmacológicos ligados a um peptídeo de internalização e um agente anti-inflamatório significa que os dois agentes são administrados suficientemente proximamente em tempo que o agente anti- inflamatório possa inibir uma resposta inflamatória induzível pelo peptídeo de internacionalização.

Estatisticamente significativo refere-se a um p-valor que é < 0,05, preferivelmente < 0,01 e mais preferivelmente < 0,001.

I. GERAL

A invenção fornece métodos para liberar os agentes farmacológicos ligado a um peptídeo de internalização, em que uma resposta inflamatória induzível pelo peptídeo de internalização é inibida pela co-administração de um anti- inflamatório ou ligando o peptídeo de internalização à biotina ou molécula similar. Tais métodos são estabelecidos como premissa em parte nos resultados descritos nos exemplos em que a administração de um agente farmacológico ligado ao tat em altas dosagens é proximamente seguida por uma resposta inflamatória, que inclui a degranulação de mastócito, liberação de histamina e sequelas típicas de liberação de histamina, tal como vermelhidão, calor, inchamento, e hipotensão. Embora a prática dos métodos da invenção não é dependente de uma compreensão de mecanismo, é acreditado que a degranulação de mastócito é provocada pela interação direta entre o peptídeo tat catiônico e mastócitos ao invés de ser provocado por uma resposta de anticorpo IgE. A resposta inflamatória pode ser inibida ao co-administrar um agente anti-inflamatório com o agente farmacológico ligado ao tat ou outro peptídeo de internalização. Uma variedade de agentes anti-inflamatórios amplamente utilizados incluindo antistamínicos e corticosteróides são apropriados. Alternativamente, os inventores descobriram que a capacidade de peptídeos de internalização para induzir uma resposta inflamatória pode ser reduzida ligando-os à biotina ou molécula similar.

A invenção ainda fornece o método para tratar ou efetuar profilaxia de doenças caracterizadas por excitotoxidade, tal como acidente vascular. Tais doenças podem ser tratadas usando um agente farmacológico que inibe a interação entre NMDARs com a proteína pós-sináptica de densidade 95 ligada a um peptídeo de internalização. Preferivelmente, em tais métodos, o agente farmacológico é co-administrado com um agente anti-inflamatório para inibir uma resposta imune induzível pelo peptídeo de internalização, ou o peptídeo de internalização é ligado à biotina ou molécula similar, por razões acima discutidas. Independente se um agente anti-inflamatório ou peptídeo de internalização biotinilado é usado em tais métodos, o tratamento ou profilaxia pode ser administrado aos indivíduos machos e fêmeas. A administração aos indivíduos fêmeas é estabelecida como premissa em parte nos resultados descritos no exemplo em que o tratamento em um modelo de rato de acidente vascular foi descoberto por ser pelo menos tão eficaz em indivíduos fêmeas quanto machos. A praticabilidade de administrar um agente farmacológico que inibe interações entre PSD95 e NMDAR a um indivíduo fêmea contrasta com resultados precedentes em que os inibidores de nNOS foram descobertos ineficazes para tratar a doença excitotóxicas em indivíduos fêmeas. A administração de inibidores de nNOS foi relatada para proteger contra efeitos prejudiciais de acidente vascular em ratos machos, mas ferimento de célula aumentado em ratos fêmeas em um modelo MCAO. McCullough e col., Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 25:502-512 (2005).

II. AGENTES FARMACOLÓGICOS

Os peptídeos de internalização podem ser ligados a qualquer agente farmacológico para promover a captação do agente através das membranas de célula, membranas intracelulares, tais como membrana nuclear, e/ou a barreira hematocefáfica. A união de um peptídeo de internalização a um agente farmacológico melhora a biodisponibilidade no local pretendido relativo ao uso do agente farmacológico sozinho. A liberação aumentada devido aos peptídeos de internalização unidos pode permitir doses diminuídas de agentes farmacológicos, o ataque eficaz de agentes farmacológicos a um compartimento celular específico, tal como núcleo, e/ou toxidade reduzida devido ao uso de doses menores.

Os peptídeos de internalização são particularmente úteis para agentes farmacológicos que exigem entrar células e/ou núcleo. Os agentes farmacológicos que têm baixa biodisponibilidade, altas dosagens ou meia-vidas curtas, ou fármacos neuroativos que precisam cruzar a barreira hematocefáfica para exercer a atividade, são especialmente apropriados para união de peptídeos de internalização. Os peptídeos são um tipo de agente farmacológico que são favoráveis à união de internalização, por exemplo, através do uso de uma ligação de peptídeo que resulta em um peptídeo quimérico compreendendo uma sequência de aminoácido derivada do agente farmacológico, e uma sequência de aminoácido do peptídeo de internalização. Os ácidos nucléicos, e moléculas orgânicas pequenas (menos de 500 Da) são outros exemplos de compostos que podem ser ligados aos peptídeos de internalização.

Alguma orientação para a seleção de agentes farmacológicos, métodos para união e uso dos mesmos é fornecida pela literatura científica e de patente em relação aos peptídeos de internalização, tais como tat (veja, por exemplo, US 6.316.003 e US 5.804.604). A tabela abaixo lista os nomes de agentes farmacológicos (alguns dos 5 quais são fármacos aprovados), os distúbios são úteis para tratar, se a doença é aguda ou crônica, as rotas de administração de fármacos (à extensão estabelecida) e comentários em problemas com fármacos existentes que podem em parte ser superados pelo transporte melhorado através 10 das membranas conferidas por um peptídeo de internalização. Tabela 1

Uma classe de agentes de interesse particular inibe as interações entre PSD-95 e um ou mais NMDARs. Tais agentes são úteis para reduzir efeitos prejudiciais de acidente vascular e outras condições neurológicas mediadas pelo menos em parte pela excitotoxidade de NMDAR. Tais agentes incluem os peptídeos tendo uma sequência de aminoácido incluindo ou baseado na porção PL de um receptor de NMDA ou domínio PDZ de PSD95. Tais peptídeos podem também inibir interações entre PSD-95 e nNOS e col. receptores de glutamato (por exemplo, receptores de cainita ou receptores de AMPA). Os peptídeos preferidos inibem a interação entre os domínios PDZ 1 e 2 de proteína de densidade 95 pós- sináptica (PSD-95) (sequência de aminoácido humano fornecida por Stathakism, Genomics 44 (1): 71-82 (1997)) e a sequência de PL C-terminal de uma ou mais subunidades de receptor de NMDA 2 incluindo a subunidade NR2B do receptor N- metil-D-aspartato neuronal (Mandich e col., Genomics 22, 216-8 (1994)). NMDAR2B tem a ID 4099612 de GenBank, C-terminal de 20 aminoácidos FNGSSNGHVYEKLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 11) e uma porção PL ESDV (ID. de SEQ. N°: 12). Os peptídeos preferidos inibem as formas humanas de PSD-95 e receptores NMDAR humanos. Entretanto, a inibição pode também ser mostrada de variantes de espécie das proteínas. Uma lista de receptores de NMDA e glutamato que podem ser usados aparece abaixo: Tabela 2: Receptores de NMDA com sequências PL

Alguns peptídeos inibem interações entre PSD-95 e múltiplas subunidades de NMDAR. Em tais exemplos, o uso de peptídeo não necessariamente exige uma compreensão das contribuições respectivas dos NMDARs diferentes para neurotransmissão excitatória. Outros peptídeos são específicos para um único NMDAR.

Os peptídeos podem incluir ou ser baseados em uma porção PL do C-terminal de quaisquer das subunidades acima e ter uma sequência de aminoácido compreendendo [S/T]-X- [V/L]. Esta sequência preferivelmente ocorre no C-terminal dos peptídeos da invenção. Os peptídeos preferidos têm uma sequência de aminoácido compreendendo [E/D/N/Q]-[S/T]- [D/E/Q/N]-[V/L] (ID. de SEQ. N°: 38) em seu C-terminal. Os peptídeos de exemplo compreendem: ESDV (ID. de SEQ. N°: 12), ESEV (ID. de SEQ. N°: 29), ETDV (ID. de SEQ. N°: 39), ETEV (ID. de SEQ. N°: 40), DTDV (ID. de SEQ. N°: 41), e DTEV (ID. de SEQ. N°: 42) como os aminoácidos C-terminais. Dois peptídeos particularmente preferidos são KLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 5), e KLSSIETDV (ID. de SEQ. N°: 43). Tais peptídeos têm geralmente 3-25 aminoácidos (sem um peptídeo de internalização), comprimentos de peptídeo de 5-10 aminoácidos, e particularmente 9 aminoácidos (também sem um peptídeo de internalização) são preferidos. Em alguns tais peptídeos, todos os aminoácidos são do C-terminal de um receptor de NMDA (não incluindo aminoácidos de um peptídeo de internalização).

Outros peptídeos que inibem as interações entre PDS95 e NDMARs incluem peptídeos do domínio PDZ 1 e/ou 2 de PSD- 95 ou um subfragmento de qualquer um destes que inibe interações entre PSD-95 e um receptor de NMDA, tal como NMDA 2B. Tais peptídeos ativos compreendem pelo menos 50, 60, 70, 80 ou 90 aminoácidos do domínio PDZ 1 e/ou domínio PDZ 2 de PSD-95, que ocorrem dentro de aproximadamente aminoácidos 65-248 de PSD-95 fornecido por Stathakism, Genomics 44 (1): 71-82 (1997) (sequência humana) ou NP_031890.1, GL6681195 (sequência de camundongo) ou regiões correspondentes de outras variantes de espécie.

A atividade farmacológica apropriada de peptídeos, peptidomiméticos ou outro agente pode ser confirmada, se desejado, usando o modelo animal descrito nos exemplos. Opcionalmente, os peptídeos ou peptidomiméticos podem também ser avaliados para a capacidade de inibir interações entre PSD-95 e NMDAR 2B usando ensaios descritos por exemplo, na US 20050059597, que são incorporados pro referência. Os peptídeos úteis têm tipicamente os valores IC50 de menos do que 50 μM, 25 μM, 10 μM, 0,1 μM ou 0,01 μM em tal ensaio. Os peptídeos preferidos têm tipicamente um valor IC50 entre 0,001-1 μM, e mais preferivelmente 0,050,5 ou 0,05 a 0,1 μM.

Os peptídeos tais como aqueles apenas descritos podem opcionalmente ser derivatizados (por exemplo, acetilados, fosforilados e/ou glicosilados) para melhorar a afinidade de ligação do inibidor, para melhorar a capacidade do inibidor ser transportado através de uma membrana celular ou para melhorar a estabilidade. Como um exemplo específico, para os inibidores em que o terceiro resíduo de C-terminal é S ou T, este resíduo pode ser fosforilado antes do uso do peptídeo.

Os agentes farmacológicos também incluem as moléculas pequenas que inibem interações entre PSD95 e NMDAR 2B, e/ou as outras interações descritas acima. Os inibidores de molécula pequena apropriados são descritos no Pedido International co-pendente N°. PCT/US2006/062715 (número da publicação de inserção) e 60/947.892 depositado em 3 de julho de 2007, cada um incorporado por referência em sua totalidade. Estas moléculas foram identificadas por avaliação in silico de uma biblioteca de composto para ligar a PSD95, e a ligação de compostos de exemplo foi verificada experimentalmente.

Muitos compostos apropriados são descritos no Pedido Provisório US N°. 60/947.883, incorporado aqui por referência em sua totalidade. Uma classe de exemplo de compostos apropriados tem a fórmula:

em que R1 é um membro selecionado do grupo consistindo de ciclohexila substituído com 0-4 R7, fenil substituído com 0-4 R7, -(CH2)u-(CHR8R9), um alquil C1-6 ramificado (isopropila, isobutila, 1-isopropil-2-metil-butil, 1-etil- propil), e -NH-C(O)-(CR10R11)vH; cada R7 é independentemente um membro selecionado do grupo consistindo de C1-6 alquil, C1-6 alcóxi, -C(O)R12, OH, COOH, -NO, indolina N-substituída e um peptídeo de translocação de membrana celular; cada R8 e R9 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, OH, ciclohexano, ciclopentano, fenila, fenila substituída e ciclopentadieno; cada R10 e R11 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, ciclohexano, fenila e um peptídeo de translocação de membrana celular; R12 é um membro selecionado do grupo consistindo de C16 alquila e arila; e cada um de u e e v é independentemente 0 a 20; em que um de R2, R3, R4, R5 e R6 é -COOH, e em que o restante de R2, R3, R4, R5 e R6 são cada um independentemente selecionados do grupo consistindo de F, H, OCH3 e CH3. Tal composto é 0620-0057, a estrutura a qual é:

III. PEPTÍDEOS DE INTERNALIZAÇÃO

Os peptídeos de internalização são uma classe bem conhecida de peptídeos relativamente curtos que permitem muitas proteínas celulares ou virais atravessarem as membranas. Os exemplos incluem a proteína antenapedia (Bonfanti, Cancer Res. 57, 1442-6 (1997)) (e variantes da mesma), a proteína tat de vírus da imunodeficiência humana, a proteína VP22, o produto do gene UL49 de vírus simplex de herpes tipo 1, Penetratin, SynB1 e 3, Transportan, Amphipathic, gp41NLS, polyArg, e diversas toxinas de proteína de bactérias e plantas, tais como ricina, abrina, modeccina, toxina de difteria, toxina de cólera, toxina de antraz, toxinas lábeis ao calor, e a exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA). Outros exemplos são descritos nas seguintes referências (Temsamani, Drug Discovery Today, 9 (23): 1012-1019, 2004; De Coupade, Biochem J., 390:407418, 2005; Saalik Bioconjugate Chem. 15:1246-1253, 2004; Zhao, Medicinal Research Reviews 24(1): 1-12, 2004; Deshayes, Cellular and Molecular Life Sciences 62:1839-49, 2005) (todos incorporados por referência).

Um peptídeo de internalização preferido é tat de vírus HIV. Um peptídeo tat relatado em trabalhos anteriores compreende ou consiste da sequência de aminoácido padrão YGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 2) encontrada na proteína de HIV Tat. Se os resíduos adicionais flanqueando tal porção de tat estão presentes (além do agente farmacológico) os resíduos podem ser, por exemplo, aminoácidos naturais flanqueando este segmento de uma proteína tat, aminoácidos espaçadores ou ligantes de um tipo tipicamente usado para unir dois domínios de peptídeo, por exemplo, gly (ser)4 (ID. de SEQ. N°: 44), TGEKP (ID. de SEQ. N°: 45), GGRRGGGS (ID. de SEQ. N°: 46), ou LRQRDGERP (ID. de SEQ. N°: 47) (veja, por exemplo, a Tang e col. (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686; Hennecke e col. (1998), Protein Eng. 11, 405-410)), ou podem ser quaisquer outros aminoácidos que não significativamente reduzem a capacidade de conferir a captação da variante sem os resíduos de flanqueamento. Preferivelmente, o número de aminoácidos de flanqueamento diferentes de um peptídeo ativo não excede dez de cada lado de YGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 2). Um peptídeo tat apropriado compreendendo resíduos de aminoácido adicionais flanqueando o C-terminal de YGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 2) é YGRKKRRQRRRPQ (ID. de SEQ. N°: 48). Entretanto, preferivelmente, nenhum aminoácido de flanqueamento está presente.

As variantes do peptídeo tat acima tendo capacidade reduzida de ligar os canais de cálcio tipo N são descritas por 60/904507, depositado em 03/02/2007. Tais variantes podem compreender ou consistir de uma sequência de aminoácido XGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 49), em que X é um aminoácido diferente de Y ou nada (neste caso G é um resíduo N-terminal livre). Um peptídeo tat preferido tem o resíduo N-terminal Y substituído com F. Assim, um peptídeo tat compreendendo ou consistindo de FGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 3) é preferido. Outro peptídeo tat variante preferido consiste de GRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 1). Outros peptídeos tat que facilitam a captação de um agente farmacológico sem inibir canais de cálcio tipo N incluem aqueles apresentados na tabela.

X pode representar um terminal amino livre, um ou mais aminoácidos, ou uma parte conjugada.

Os peptídeos de internalização podem ser unidos aos agentes farmacológicos por métodos convencionais. Por exemplo, os agentes podem ser unidos aos peptídeos de internalização por ligação química, por exemplo, através de um acoplamento ou agente de conjugação. Numerosos tais agentes estão disponíveis comercialmente e são revistos por S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and crossLinking, CRC Press (1991). Alguns exemplos de reagentes de de ligação cruzada incluem propionato de J-succinimidil 3- (2-piridilditio) (SPDP) ou bismaleimida N,N’-(1,3- fenileno); N,N’- etilene-bis-(iodoacetamida) ou outro tal reagente tendo 6 a 11 pontes de carbono metileno (que relativamente são específicas para grupos sulfidrila); e 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno (que forma ligações irreversíveis com grupos amino e tirosina). Outros reagentes de ligação cruzada incluem p,p’-difluoro-m,m’- dinitrodifenilsulfona (que forma ligações cruzadas irreversíveis com grupos amino e fenólicos); adipimidato de dimetila (que é específico para grupos amino); fenol-1,4- disulfonilcloreto (que reage principalmente com grupos amino); hexametilenodiisocianato ou diisotiocianato, ou azofenil-p-diisocianato (que reage principalmente com grupos amino); glutaraldeído (que reage com diversas cadeias laterais diferentes) e disdiazobenzidina (que reage primeiramente com tirosina e histidina).

Para os agentes farmacológicos que são peptídeos de união para um peptídeo de internalização pode ser conseguido gerar uma proteína de fusão compreendendo a sequência de peptídeo fundida, preferivelmente em seu N- terminal, a um peptídeo de internalização.

Os peptídeos farmacológicos, opcionalmente fundidos aos peptídeos tat, podem ser sintetizados pela síntese de fase sólida ou métodos recombinantes. Os peptidomiméticos podem ser sintetizados usando uma variedade de procedimentos e metodologias descritos na literatura científica e de patente, por exemplo, Organic Synthesis Collective Volumes, Gilman e col. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17 - 27; Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234.

IV. RESPOSTA INFLAMATÓRIA AOS PEPTÍDEOS DE INTERNALIZAÇÃO

Os presentes inventores descobriram que os peptídeos de internalização, tais como tat têm a capacidade induzir uma resposta inflamatória em administração a um indivíduo. A resposta inflamatória é geralmente detectável dentro de 1, 5, 10, 20, 30, ou 60 min de administrarção do peptídeo, mas tipicamente desaparece dentro de 24 horas de administração do peptídeo (supondo que o peptídeo não é readministrado). A resposta inflamatória é dependente de dose. A resposta inflamatória tipicamente retorna em intensidade similar na readministração do peptídeo.

A resposta inflamatória é caracterizada por uma degranulação de mastócitos e liberação consequente de histamina e outros mediadores de inflamação, tais como quimiocinas, citocinas, leucotrienos, lipases, proteases, quininas, citocinas, derivados de ácido araquidônico, tais como prostaglandinas, interleucinas, e/ou óxido nítrico. A histamina e/ou outros mediadores liberados de inflamação causam vários sintomas de inflamação incluindo vermelhidão da pele, calor, inchamento, hipertensão e/ou pulso reduzido. A liberação de histamina pode também resultar em vasodilatação, broncoconstricção, ativação de músculo liso, separação de células endoteliais (responsáveis por urticárias), dor, coceira, permeabilidade capilar aumentada, hipersecreção glandular, espasmo de músculo liso, e/ou infiltração de tecido de células inflamatórios, bem como secreção de ácido gástrico, e liberação diminuída de neurotransmissores, tais como histamina, acetilcolina, norepinefrina, e serotonina.

V. AGENTES ANTI-INFLAMATÓRIOS

Uma grande variedade de agentes anti-inflamatórios está prontamente disponível para inibir o tipo de resposta inflamatória notado acima (veja, por exemplo, a Patente US N°. 6, 204.245, incorporada por referência). Uma classe de agente anti-inflamatório é composta de antistamínico. Tais agentes inibem a interação de histamina com seus receptores desse modo inibindo as sequelas resultantes de inflamação notadas acima. Muitos antistamínicos estão comercialmente disponíveis, alguns no balcão da farmácia. Os exemplos de antistamínicos são azatadina, azelastina, burfrolina, cetirizina, ciproheptadina, doxantrozol, etodroxizina, forscolina, hidróxizina, cetotifeno, oxatomida, pizotifeno, proxicromil, piperazinas N,N’-substituídas ou terfenadina. Os antistamínicos variam em sua capacidade de bloquear antistamina no SNC, bem como receptores periféricos, com a segunda e terceira geração de antistamínicos tendo seletividade para receptores periféricos. Acrivastina Astemizol Cetirizina Loratadina Mizolastina, Levocetirizina, Desloratadina, Fexofenadina são exemplos de antistamínicos de segunda e terceira geração. Os antistamínicos estão extensamente disponíveis em formulações orais e tópicas.

Outra classe de agente anti-inflamatório útil para inibir a resposta imune é corticosteróide. Estes compostos são reguladores transcripcionais e são poderosos inibidores dos sintomas inflamatórios usados pela liberação de histamina e outros compostos resultando da degranulação de mastócito. Os exemplos de corticosteróide são cortisona, hidrocortisona (Cortef), Prednisona (Deltasone, Meticorten, Orasona), Prednisolona (Delta-Cortef, Pediapred, Prelona), Triamcinolona (Aristocort, Kenacort), Metilprednisolona (Medrol), Dexametasona (Decadron, Dexona, Hexadrol), e Betametasona (Celestone). Os corticosteróides estão extensamente disponíveis em formulações orais, intravenosas e tópicas.

Outra classe de agente anti-inflamatório são inibidores de degranulação de mastócito. Esta classe de compostos inclui derivados de 2-carboxilatocromo-5’-il-2- hidróxipropano, tais como cromoglicato de bis (acetóximetil), cromoglicato disódio e nedocromil.

Os fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) podem também ser usados. Tais fármacos incluem compostos de aspirina (acetilsalicilatos), salicilatos de não aspirina, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, meclofenamato, naproxeno, naproxeno sódio, fenilbutazona, sulindac e tometina. Entretanto, os efeitos anti-inflamatórios de tais fármacos são menos eficazes do que aqueles dos antistamínicos ou corticosteróides.

Os fármacos aniinflamatórios mais fortes, tais como azatioprina, ciclofosfamida, leukerano, ciclosporina podem também ser usados, mas não são preferidos, pois são de atuação lenta e/ou associadas com efeitos colaterais. Os agentes anti-inflamatório biológicos, tais como Tysabri® ou Humira®, podem também ser usados, mas não são preferidos pelas mesmas razões.

VI. CONJUGAÇÃO

A resposta inflamatória induzível por um peptídeo de internalização pode ser alternativamente (ou adicionalmente) reduzida ligando o peptídeo de internalização à biotina ou molécula similar para formar um conjugado. O conjugado retém uma capacidade de facilitar a captação de um agente farmacológico ligado em células, mas induz uma resposta inflamatória reduzida comparada ao mesmo peptídeo de internalização sem a biotina. Os peptídeos de internalização conjugados podem ser avaliados para confirmar a captação desejada e a falta de (ou diminuição em) uma resposta imune resultante.

Alternativas à biotina que podem ser usadas para formar conjugados de um peptídeo de internalização incluem acetil, benzoil, grupo alquila (alifático), piroglutamato, grupo alquila com grupo cicloalquila na extremidade, biotina com espaçador de alquila, (5,6)-FAM. A biotina ou outra molécula pode ser ligada ao peptídeo de internacionalização através de uma química de amida, química de sulfamida, química de sulfona, e/ou química de alquilação.

VII. PACIENTES FAVORÁVEIS AO TRATAMENTO/PROFILAXIA

Uma ampla variedade de pacientes é favorável ao tratamento pelos métodos da invenção como exemplificado pelos agentes farmacológicos e condições associadas listadas na Tabela 1. Os métodos são de uso particular em tais pacientes tendo uma condição que agravaria qualquer inflamação resultando de um peptídeo de internalização, por exemplo, um paciente sofrendo de hipertensão, pulso elevado ou outros sinais ou sintomas de inflamação. Os métodos são também particularmente úteis nos métodos de tratamento exigindo uma dose elevada de agente farmacológico ligado ao peptídeo de internalização. Estritamente é a dose do peptídeo de internalização ao invés do agente farmacológico ligado que determina a presença e extensão da resposta inflamatória, se existente. Entretanto, a dose de peptídeo de internalização é naturalmente determinada pela dose do agente farmacológico ligado. Por exemplo, uma resposta inflamatória pode se tornar visível em uma dose maior do que 1,5 mg/kg de peptídeo de internalização. No tratamento de algumas doenças, a dose eficaz de agente farmacológico e consequentemente peptídeo de internalização ligado é muito baixa para induzir uma resposta inflamatória na maioria dos pacientes. Não obstante, a sensibilidade de pacientes individuais a uma resposta inflamatória pode variar, e o tratamento com um agente anti-inflamatório suave, tal como uma histamina, pode ainda ser uma precaução válida.

Uma classe de pacientes de interesse particular é aquela tendo ou em risco de uma doença ou uma condição caracterizada por excitotoxidade. Tais doenças e condições incluem acidente vascular, epilepsia, hipóxia, ferimento traumático ao SNC não associado com acidente vascular, tal como ferimento de cérebro traumático e ferimento de medula espinhal, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Os métodos da invenção são apropriados para tratar pacientes machos e fêmeas tendo ou em risco de tais doenças e condições.

Um acidente vascular é uma condição resultando da circulação sanguínea danificada no SNC apesar da causa. As causas potenciais incluem embolismo, hemorragia e trombose. Algumas células neuronais morrem imediatamente como resultado de circulação sanguínea danificada. Estas células liberam suas moléculas componentes incluindo glutamato, que por sua vez ativa os receptores de NMDA, que levantam níveis intracelulares de cálcio, e níveis intracelulares de enzima conduzindo a uma morte celular neuronal adicional (a cascata de excitotoxidade). A morte de tecido de SNC é referida como infartação. O volume de infartação (isto é, o volume de células neuronais inoperantes resultando do acidente vascular no cérebro) pode ser usado como um indicador da extensão de dano patológico resultando do acidente vascular. O efeito sintomático depende do volume de um infartação e onde no cérebro está localizado. O índice de inabilidade pode ser usado como uma medida de dano sintomático, tal como a escala de resultado de acidente vascular de Rankin (Rankin, Scott J Med; 2: 200-15 (1957)) e o índice de Barthel. A escala de Rankin é baseada em avaliar diretamente as condições globais de um paciente como segue. Tabela 4 0 Nenhum sintoma. 1 Nenhuma inabilidade significativa apesar dos sintomas; capaz de realizar todos os deveres e atividades usuais. 2 Inabilidade ligeira; incapaz de realizar todas as atividades precedentes, mas capaz de tomar conta de si próprio sem auxílio. 3 Inabilidade moderada exigindo alguma ajuda, mas capaz de andar sem auxílio. 4 Inabilidade moderate à severa; incapaz de andar sem auxílio e incapaz de atender a próprias necessidades corporais sem auxílio. 5 Inabilidade severa; confinado à cama, incontinente, e exigindo cuidado e atenção constantes.

O índice de Barthel é baseado em uma série de perguntas sobre a capacidade do paciente de realizar 10 atividades básicas da vida diária resultando em uma contagem entre 0 e 100, uma contagem mais baixa indicando mais inabilidade (Mahoney e col., Maryland State Medical Journal 14:56-61 (1965)).

Alternativamente a severidade/resultados de acidente vascular pode ser medida usando a escala de acidente vascular de NIH, disponível no site ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf.

A escala é baseada na capacidade de um paciente realizar 11 grupos de funções incluindo avaliações do nível do paciente de consciência, funções motoras, sensoriais e linguagem.

Um acidente vascular isquêmico refere-se mais especificamente a um tipo de acidente vascular causado pelo bloqueio de circulação sanguínea ao cérebro. A condição subjacente para este tipo de bloqueio é mais geralmente o desenvolvimento de depósitos gordos cobrindo as paredes de vasos. Esta condição é chamada aterosclerose. Estes depósitos de gordura podem causar dois tipos de obstrução. A trombose cerebral refere-se a um trombo (coágulo sanguíneo) que se desenvolve na parte bloqueada do vaso. “Embolismo cerebral” refere-se geralmente a um coágulo sanguíneo que se forma em outra posição no sistema circulatório, geralmente no coração e grandes artérias do peito e pescoço. Uma porção do coágulo sanguíneo então se solta, entra na circulação sanguínea e percorre através dos vasos sanguíneos do cérebro até alcançar os vasos muito pequenos para passar. Uma segunda causa importante de embolismo é uma pulsação irregular, conhecida como fibrilação arterial. Cria condições em que os coágulos podem se formar no coração, desalojar e viajar ao cérebro. As causas potenciais adicionais de acidente vascular isquêmico são hemorragia, trombose, dissecção de uma artéria ou veia, uma parada cardíaca, choque de qualquer causa incluindo hemorragia, e causas iatorgênicas, tais como ferimento cirúrgico direto aos vasos sanguíneos do cérebro ou vasos conduzindo ao cérebro ou cirurgia cardíaca. O acidente vascular isquêmico conta por aproximadamente 83% de todas os casos de acidente vascular.

Os ataques isquêmicos transitórios (TIAs) são acidentes vasculares menores ou de advertência. Em um TIA, as condições indicativas de um acidente vascular isquêmico estão presentes e os sinais de aviso de acidente vascular típicos se desenvolvem. Entretanto, a obstrução (coágulo sanguíneo) ocorre por um curto período de tempo e tende a resolver sozinha através de mecanismos normais. Os pacientes submetendo-se à cirurgia de coração estão em risco particular de ataque isquêmico cerebral transitório.

O acidente vascular hemorrágico conta por aproximadamente 17% de casos de acidente vascular. Resulta de um vaso enfraquecido que rompe e sangra emvolta do cérebro. O sangue acumula e comprime o tecido do cérebro circunvizinho. Os dois tipos gerais de acidentes vasculares hemorrágicos são hemorragia intracerebral e hemorragia subaraquinóide. O acidente vascular hemorrágico resulta da ruptura de um vaso sanguíneo enfraquecido. As causas potenciais de ruptura de um vaso sanguíneo enfraquecido incluem uma hemorragia hipertensiva, em que a hipertensão causa uma ruptura de um vaso sanguíneo, ou outra causa subjacente de vasos sanguíneos enfraquecidos, tais como uma malformação vascular de cérebro rompida incluindo um aneurisma cerebral, malformação arteriovenosa (AVM) ou malformação cavernosa. Os acidentes vasculares hemorrágicos podem também surgir de uma transformação hemorrágica de um acidente vascular isquêmico que enfraquece os vasos sanguíneos no infarto, ou uma hemorragia de tumores primários ou metastáticos no SNC contendo vasos sanguíneos anormalmente fracos. O acidente vascular hemorrágico pode também sugir de causas iatorgênicas, tais como ferimento cirúrgico direto a um vaso sanguíneo do cérebro. Um aneurisma é uma expansão de uma região enfraquecida de um vaso sanguíneo. Se deixado não tratado, o aneurisma continua a enfraquecer até que rompa e sangre no cérebro. Uma malformação arteriovenosa (AVM) é um conjunto de vasos sanguíneos anormalmente formados. Uma malformação cavernosa é uma anomalia venosa que pode causar uma hemorragia de estruturas venosas enfraquecidas. Quaisquer destes vasos podem romper, também causando sangramento no cérebro. O acidente vascular hemorrágico pode também resultar de trauma físico. O acidente vascular hemorrágico em uma parte do cérebro pode conduzir ao acidente vascular isquêmico em outra através da falta de sangue perdido no acidente vascular hemorrágico.

VIII. LIBERAÇÃO DE AGENTE FARMACOLÓGICO COM UM AGENTE ANTI-INFLAMATÓRIO

Nos métodos em que um agente farmacológico ligado a um peptídeo de internalização é administrado com um agente anti-inflamatório, as duas entidades são administradas suficientemente próximas em tempo, de modo que o agente anti-inflamatório possa inibir uma resposta inflamatória induzível pelo peptídeo de internalização. O agente anti- inflamatório pode ser administrado antes, ao mesmo tempo ou após o agente farmacológico, mas é preferivelmente administrado antes. O tempo preferido depende em parte da farmacocinética e farmacodinâmica do agente anti- inflamatório. O agente anti-inflamatório é preferivelmente administrado em um intervalo antes do agente farmacológico, tal que o agente anti-inflamatório esteja se aproximando da concentração de soro máxima no momento que o agente farmacológico é administrado. Tipicamente, o agente anti- inflamatório é administrado entre 6 horas antes do agente farmacológico e uma hora após. Geralmente, o agente anti- inflamatório está presente em uma concentração de soro detectável em algum ponto dentro do período de tempo de uma hora após a administração do agente farmacológico. A farmacocinética de muitos agentes anti-inflamatórios é extensamente conhecida e o sincronismo relativo de administração do agente anti-inflamatório pode ser ajustado consequentemente. O agente anti-inflamatório é geralmente administrado oralmente, intravenosamente ou topicamente dependendo do agente em questão. Se o agente anti- inflamatório é administrado ao mesmo tempo que o agente farmacológico, os dois podem ser administrados como uma formulação combinada ou separadamente.

O agente anti-inflamatório é administrado em um regime de uma quantidade, frequência e rota eficaz para inibir uma resposta inflamatória a um peptídeo de internalização sob condições em que tal resposta inflamatória é conhecida por ocorrer na ausência do anti-inflamatório. Uma resposta inflamatória é inibida se há qualquer redução nos sinais ou sintomas de inflamação como resultado do agente anti- inflamatório. Os sintomas da resposta inflamatória podem incluir vermelhidão, calor, inchamento, dor, sensação de formigamento, coceira, náusea, prurido, boca seca, dormência, congestão de via aérea. A resposta inflamatória pode também ser monitorada pela medição de sinais, tais como pressão sanguínea, ou frequência cardíaca. Alternativamente, a resposta inflamatória pode ser avaliada medindo a concentração de plasma de histamina ou outros compostos liberados pela degranulação de mastócito. Como uma matéria prática, as doses, regimes e rotas de administração da maioria dos agentes anti-inflamatórios discutidos acima estão disponíveis na Referência Médica e/ou dos fabricantes, e tais anti-inflamatórios podem ser usados nos presentes métodos consistentes com tal orientação geral.

IX. MÉTODOS DE TRATAMENTO/PROFILAXIA a) Métodos de tratamento.

Um agente quimérico compreendendo um agente farmacológico unido a um peptídeo de internalização é administrado em uma quantidade, frequência e rota de administração eficazes para curar, reduzir ou inibir uma deterioração adicional de pelo menos um sinal ou sintoma de uma doença em um paciente tendo a doença sendo tratada. Uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de agente quimérico suficiente significativamente para curar, reduzir ou inibir uma deterioração adicional de pelo menos um sinal ou sintoma da doença ou condição a ser tratada em uma população de pacientes (ou modelos animais) sofrendo da doença tratada com um agente quimérico da invenção relativo ao dano em uma população de controle de paciente (ou modelos de animais) sofrendo dessa doença ou condição que não são tratados com um agente quimérico da invenção. A quantidade é considerada também terapeuticamente eficaz se um paciente tratado individual consegue um resultado mais favorável do que o resultado médio em uma população controle de pacientes comparáveis não tratados por métodos da invenção. Um regime terapeuticamente eficaz envolve a administração de uma dose terapeuticamente eficaz em uma frequência e rota de administração necessária para conseguir a finalidade pretendida.

Para um paciente sofrendo de acidente vascular ou outra condição isquêmica, o agente quimérico é administrado em um regime compreendendo uma frequência de quantidade e rota de administração eficazes para reduzir os efeitos prejudiciais de acidente vascular ou outra condição isquêmica. Quando a condição exigindo o tratamento é acidente vascular, o resultado pode ser determinado pelo volume de infartação ou índice de inabilidade, e uma dosagem é considerada terapeuticamente eficaz se um paciente tratado individual mostra uma inabilidade de dois ou menos na escala de Rankin e 75 ou mais na escala de Barthel, ou se uma população de pacientes tratados mostra uma distribuição significativamente melhorada (isto é, menos inabilidade) de classificações em uma escala de inabilidade do que uma população não tratada comparável, veja Lees e col., N Engl J Med 2006; 354: 588-600. Uma única dose de agente quimérico é geralmente suficiente para o tratamento de acidente vascular. b) Métodos de profilaxia

A invenção também fornece métodos e composições para a profilaxia de um distúrbio em um indivíduo em risco desse distúrbio. Geralmente tal indivíduo tem uma probabilidade aumentada de desenvolver o distúrbio (por exemplo, uma condição, doença, distúrbio ou doença) relativo a uma população de controle. A população de controle, por exemplo, pode compreender um ou mais indivíduos selecionados em aleatório da população geral (por exemplo, combinado pela idade, gênero, raça e/ou etinicidade) que não foram diagnosticadas ou têm um histórico familiar do distúrbio. Um indivíduo pode ser considerado em risco para um distúrbio se um “fator de risco” associado com esse distúrbio é descoberto por estar associado com esse indivíduo. Um fator de risco pode incluir qualquer atividade, traço, evento ou propriedade associados com um dado distúrbio, por exemplo, através de estudos estatísticos ou epidemiológicos em uma população de indivíduos. Um indivíduo pode assim ser classificado como estando em risco para um distúrbio mesmo se os estudos identificando os fatores de risco subjacentes não incluíram o indivíduo especificamente. Por exemplo, um indivíduo submetendo-se à cirurgia de coração está em risco de ataque isquêmico cerebral transitório, pois a frequência de ataque isquêmico cerebral transitório é aumentada em uma população de indivíduos que sofreram cirurgia de coração em comparação a uma população de indivíduos que não sofreram.

Outros fatores de risco comuns para acidente vascular incluem idade, histórico familiar, gênero, incidência prévia de acidente vascular, ataque isquêmico transitório ou derrame, hipertensão, fumo, diabetes, doença carotídea ou de outra artéria, fibrilação atrial, outras doenças cardíacas, tais como doença cardíaca, parada cardíaca, cardiomiopatia dilatada, doença de válvula do coração e/ou defeitos congenitais do coração; alto colesterol sanguíneo, e dietas ricas em gordura saturada, gordura trans ou colesterol.

Os agentes farmacológicos ligados a um peptídeo de internalização são administrados aos pacientes em risco de uma doença, mas ainda não tendo a doença em uma quantidade, frequência e rota suficiente para prevenir, atrasar ou inibir o desenvolvimento de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Uma quantidade profilaticamente eficaz significa uma quantidade de agente quimérico suficiente para significativamente prevenir, inibir ou atrasar pelo menos um sinal ou sintoma da doença em uma população de pacientes (ou modelos animais) em risco da doença relativa tratada com o agente comparado a uma população de controle de pacientes (ou modelos de animais) em risco da doença não tratada com um agente quimérico da invenção. A quantidade é considerada também profilaticamente eficaz se um paciente tratado individual consegue um resultado mais favorável do que o resultado médio em uma população de controle de pacientes comparáveis não tratados por métodos da invenção. Um regime profilaticamente eficaz envolve a administração de uma dose profilaticamente eficaz em uma frequência e rota de administração necessária para conseguir a finalidade pretendida. Por profilaxia de acidente vascular em um paciente em risco iminente de acidente vascular (por exemplo, um paciente se submetendo à cirurgia de coração), uma única dose de agente quimérico é geralmente suficiente.

X. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, DOSAGENS, E ROTAS DE ADMINISTRAÇÃO

Os agentes quiméricos da invenção podem ser administrados na forma de uma composição farmacêutica. As composições farmacêuticas são tipicamente manufaturadas sob as condições BPF. As composições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de dosagem unitária (isto é, a dosagem para uma única administração). As composições farmacêuticas podem ser manufaturadas por processos de mistura, dissolução, granulação, drageamento, suspensão, emulsificação, encapsulamento, captura ou liofilização convencionais. Por exemplo, os agentes quiméricos liofilizados da invenção podem ser usados nas formulações e composições descritas abaixo.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas na maneira convencional usando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitam o processamento de agentes quiméricos em preparações que podem ser farmaceuticamente usadas. A formulação apropriada é dependente da rota de administração escolhida.

A administração pode ser parenteral, intravenosa, oral, subcutânea, intraarterial, intracranial, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal ou intramuscular. A administração intravenosa é preferida.

As composições farmacêuticas para a administração parenteral são preferivelmente estéreis e substancialmente isotônicas. Para a injeção, os agentes quiméricos podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como a solução de Hank, solução de Ringer, ou solução salina fisiológica ou tampão de acetato (para reduzir o desconforto no local de injeção). A solução pode conter agentes formulatórios, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

Alternativamente os agentes quiméricos podem estar na forma de pó para a constituição com um veículo apropriado, por exemplo, água estéril livre de pirogênio, antes de usar.

Para a administração transmucosal, os penetrantes apropriados à barreira para permear são usados na formulação. Esta rota de administração pode ser usada para liberar os compostos à cavidade nasal ou para administração sublingual.

Para a administração oral, os agentes quiméricos podem ser formulados com veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, geís, xaropes, pastas, suspensões e similares, para a ingestão oral por um paciente a ser tratado. Para formulações sólidas orais, tais como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos, excipientes apropriados incluem preenchedores, tais como açúcares, tais como lactose, sacarose, manitol e sorbitol; preparações de celulose, tais como maido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulose, hidróxipropilmetil-celulose, carbóximetilcelulose de sódio, e/ou polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulagem; e agentes de ligação. Se desejado, os agentes de desintegração podem ser adicionados, tais como polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou sal do mesmo como alginate de sódio. Se desejados, as formas de dosagem sólidas podem ser técnicas padrão de utilização revestidas por açúcar ou revestidas entericamente. Para preparações líquidas orais, tais como, por exemplo, suspensões, elixires e soluções, os veículos, excipientes ou diluentes apropriados incluem a água, glicóis, óleos, álcoois. Adicionalmente, os agentes flavorizanres, conservantes, agentes de coloração e similares podem ser adicionados.

Além das formulações descritas previamente, os agentes quiméricos podem também ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iónica apropriadas, ou como derivados solúveis, por exemplo, como um sal uniformemente solúvel.

Alternativamente, outros sistemas de liberação farmacêuticos podem ser empregados. Os lipossomas e emulsões podem ser usados para liberar agentes quiméricos. Determinados solventes orgânicos, tais como dimetilsulfóxido também pode ser empregado, embora geralmente a custo de maior toxidade. Adicionalmente, os compostos podem ser liberadados usando um sistema de liberação prolongada, tal como matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos contendo o agente terapêutico.

As cápsulas de liberação prolongada podem, dependendo de sua natureza química, liberar os agentes quiméricos por algumas semanas até aproximadamente 100 dias. Dependendo da natureza química e estabilidade biológica do reagente terapêutico, as estratégias adicionais para a estabilização de proteína podem ser empregadas.

Enquanto os agentes quiméricos da invenção podem conter cadeias laterais carregadas ou terminais, podem ser incluídos em quaisquer das formulações descritas acima como ácidos ou bases livres ou como sais farmaceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são aqueles sais que substancialmente retêm a atividade biológica das bases livres e que são preparados pela reação com ácidos inorgânicos. Os sais farmacêuticos tendem a serem mais solúveis em solventes aquosos e outros próticos dos quais são as formas de base livre correspondentes.

Os agentes quiméricos compreendendo um peptídeo de internalização ligado a um agente farmacológico podem ser usados na mesma dosagem ou mais baixa em uma base molar como agente farmacológico sozinho, e podem ser administrados pela mesma rota que o agente farmacológico sozinho, e para o tratamento das mesmas doenças que o agente farmacológico sozinho.

Para o tratamento de acidente vascular, as faixas de dosagem preferidas incluem 0,001 a 20 μmol de peptídeo quimérico ou peptidomimético por quilo de peso corporal de paciente, opcionalmente 0,03 a 3 μmol de peptídeo quimérico por kilo de peso corporal do paciente. Em alguns métodos, 0,1 -20 μmol de peptídeo quimérico ou peptidomimético por quilo de peso corporal do paciente são administrados. Em alguns métodos, 0,1-10 μmol de peptídeo quimérico ou peptidomimético por quilo de peso corporal do paciente, mais preferivelmente aproximadamente 0,3 μmol de peptídeo quimérico por quilo de peso corporal do paciente. Em outros exemplos, a faixa de dosagens é de 0,005 a 0,5 μmol de peptídeo quimérico ou peptidomimético por quilo de peso corporal do paciente. A dosagem por quilo de peso corporal do paciente pode ser convertida de ratos aos humanos dividindo por 6,2 para compensar a área de superfície diferente para reunir relações. As dosagens podem ser convertidas de unidades de mols a gramas multiplicando pelo peso molar de um peptídeo quimérico ou peptidomimético. As dosagens apropriadas do peptídeo ou peptidomimético quimérico para uso em humanos podem incluir 0,001 a 5 mg/kg do peso corporal paciente, ou mais preferivelmente 0,005 a 1 mg/kg do peso corporal paciente ou 0,05 a 1 mg/kg, ou 0,09 a 0,9 mg/kg. Em peso absoluto para um paciente de 75 kg, estas dosagens se traduzem para 0,075-375 mg/kg, 0,375 a 75 mg, 3,75 a 75 mg ou 6,7 a 67 mg. Arredondado para englobar variantes, por exemplo, peso do paciente, a dosagem está geralmente dentro de 0,05 a 500 mg, preferivelmente 0,1 a 100 mg, 0,5 a 50 mg, ou 1-20 mg.

A quantidade de agente quimérico administrada depende do indivíduo sendo tratado, o peso do indivíduo, a severidade da aflição, a maneira de administração e o julgamento do médico de prescrição. A terapia pode ser repetida intermitentemente enquanto os sintomas são detectáveis ou mesmo quando não são detectáveis. A terapia pode ser fornecida sozinho ou em combinação com outros fármacos. Para o tratamento de acidente vascular, a dose de agente farmacológico ligado a um peptídeo de internalização é administrada geralmente dentro de 24 horas do início de acidente vascular, preferivelmente dentro de 6 horas de início de acidente vascular.

XI. KITS

Os kits são fornecidos realizando os presentes métodos. Os kits incluem um ou mais agentes farmacológicos de interesse, unidos a um peptídeo de internalização. O peptídeo de internalização pode ser biotinilado, e/ou o kit pode conter um agente anti-inflamatório. O kit instantâneo opcionalmente contém meios para administrar os agentes farmacológicos e/ou agente anti-inflamatório. O kit pode também incluir um ou mais tampões, aditivos, preenchedores ou diluentes. O kit pode também fornecer uma ou mais instruções impressas no regime de administração e dosagem para serem seguidas.

XII. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO

A. Medir a atividade de internalização

As variantes do tat ou outro peptídeo de internalização podem ser testadas para a atividade de transporte em um animal. Os peptídeos de internalização podem ser testados sozinhos ou quando ligados a um agente ativo, tal peptídeo ativo, por exemplo, KLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 5). O peptídeo de internalização, opcionalmente ligado a um agente ativo, tal como um peptídeo, é marcado, preferivelmente com um marcador fluorescente, tal como cloreto de dansila. O peptídeo de internalização é então injetado perifericamente em um animal, tal como um rato. A injeção intraperitoneal ou intravenosa é apropriada, por exemplo. Aproximadamente uma hora após a injeção, os ratos foram sacrificados, perfusados com solução fixadora (3% de paraformaldeído, 0,25% de glutaraldeído, 10% de sacarose, 10 U/mL de heparina em solução salina). Os cérebros são então removidos, congelados e seccionados. As seções são analisadas por fluorescência usando um microscópio confocal. A atividade de internalização é determinada para fluorescência, opcionalmente relativa aos controles positivos e negativos. Um controle positivo apropriado é o peptídeo tat padrão ligado ao mesmo peptídeo ativo (se presente) como o peptídeo de internalização sob teste. Um controle negativo apropriado é peptídeo ativo fluorescentemente marcado não ligado a um peptídeo de internalização. O veículo não marcado pode também ser usado como um controle negativo.

Os experimentos similares podem ser realizados na cultura de célula para testar variantes de tat ou outro peptídeo de internalização (veja US20030050243). Uma variante de peptídeo tat fluorescentemente marcado, ligado opcionalmente a um peptídeo ativo é aplicada a uma cultura neuronal cortical. A captação é determinada usando a microscopia de fluorescência sobre diversos minutos após a aplicação. A captação aumentada pode ser determinada relativa aos controles positivos e negativos como descrito para as experimentos na captação em um animal.

2. Medir atividade no tratamento de acidente vascular

A atividade de agentes quiméricos compreendendo um peptídeo de internalização ligado a um agente pode ser testada em vários modelos animais de acidente vascular. Em tal modelo, em ratos machos adultos Sprague Dawley submetidos à oclusão média de artéria cerebral transitória (MCAO) por 90 minutos pelo método de sutura intraluminal (36,37). Os animais são jejuados durante a noite e injetados com sulfato de atropina (0,5 mg/kg IP). Após 10 minutos a anestesia é induzida. Os ratos são oralmente intubados, mecanicamente ventilados, e paralizados com brometo de pancurônio (0,6 mg/kg IV). A temperatura corporal é mantida em 36,5-37,5°C, com uma lâmpada de aquecimento. Os cateteres de polietileno na artéria femoral e veia são usados para continuamente registrar a pressão sanguínea e testar o sangue para medidas de gás e pH. MCAO transitório é conseguido por 90 min ao introduzir uma sutura de náilon de monofilamento 3-0 poli-L-lisina- revestido (Harvard Apparatus) no círculo de Willis através da artéria carotídea interna, eficazmente fechando a artéria cerebral média. Isto produz uma infartação extensiva englobando o córtex cerebral e gânglia basal. Os animais são tratados com um agente quimérico sob o teste ou um controle negativo ou positivo. O tratamento pode ser feito antes ou até uma hora após ter induzido a isquemia.

Um controle negativo pode a veículo. Um controle positivo pode ser o peptídeo Tat-NR2B9c, YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 6), previamente mostrado por ser eficaz. O agente quimérico é liberado em uma única injeção de bolus intravenosa de 45 min antes de MCAO (3 nmols/g). Após administrar compostos aos animais, o volume de infartação e/ou índice de inabilidade são determinados. Os volumes de infartação são geralmente determinados 24 h pós-tratamento, mas podem ser determinados em um tempo depois, tal como 3, 7, 14 ou 60 dias. O índice de inabilidade pode ser monitorado com o tempo, por exemplo, 2 h pós-tratamento, 24 h pós-tratamento, uma semana e um mês pós-tratamento. Os agentes quiméricos mostrando uma redução estatisticamente significativa no volume de infartação e/ou índice de inabilidade relativa aos animais de controle não tratados com os compostos são identificados como tendo atividade útil para praticar os métodos da invenção.

Os experimentos similares podem ser realizados no indivíduo animal para isquemia permanente. A isquemia permanente do vaso pial de artéria cerebral média pode ser realizada como descrita por Forder e col., Am J Heart Circ Physiol 288: H1989-H1996 (2005). Em resumo, a ECA direita é canulada com tubulação de polietileno PE 10. O crânio é exposto através de uma incisão mediana, e uma janela craniana de 6 a 8 mm é feita sobre córtex somatosensorial direito (2 mm caudal e 5 mm lateral ao bregma). As artérias pial são visualizadas injetando bolus pequenos (10-20 μL) da violeta azul de patente vital de tintura (10 mMol/L; Sigma) em solução salina normal, na ECA. As mesmas três ramificações arteriolares pial de MCA são cauterizadas eletricamente e as injeções de tintura são repetidas para assegurar a interrupção de fluxo através das arteríolas cauterizadas. A incisão é então fechada e o animal retornado a sua gaiola e permitido acesso livre ao alimento e água. Este modelo de isquemia permanente produz uma infartação pequena altamente reprodutível limitada ao córtex subjacente às artérias pial terminais coaguladas.

A artéria cerebral média esquerda pode ser fechada pelo método de sutura intraluminal descrito por Longa, Stroke 20, 84-91 (1989). Em resumo, a artéria carotídea comum esquerda (CCA) é exposta através de uma incisão de pescoço mediana e dissecada livre dos nervos e fascia circunvizinhos, de sua bifurcação à base do crânio. As ramificações ocipitais de artéria da artéria carotídea externa (ECA) são então isoladas, e estas ramificações dissecadas e coaguladas. A ECA é dissecada mais distalmente e coagulada junto com as ramificações de artéria linguais e maxilares terminais, que são então divididas. A artéria carotídea interna (ICA) é isolada e separada do nervo vago adjacente, e a artéria pterigopalatina é ligada perto de sua origem. A ponta de 4 cm de comprimento de sutura de náilon de monofilamento 3-0 (Harvard Apparatus) é arredondada ao queimar para conseguir um diâmetro de ponta de 0,33-0,36 mm e o comprimento de ponta de 0,5-0,6 mm e revestida com poli-L-lisina (Belayev e col., 1996). A sutura é introduzida através do CCA e avançada no ICA e então no círculo de Willis (aproximadamente 18-20 mm da bifurcação carotídea), eficazmente fechando a artéria cerebral média. A sutura de seda em torno da CCA é estanque em torno da sutura de náilon intraluminal para prendê-la e permanentemente fechar a artéria cerebral média.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

Impacto de gênero na eficácia neuroprotetora de Tat- NR2B9c

A eficácia neuroprotetora de Tat-NR2B9c foi avaliada em ratos machos e fêmeas usando o modelo de oclusão de 3 vasos in vivo pial (P3VO) de acidente vascular (Forder JP,

Munzenmaier DH, Greene AS. A proteção angiogênica de isquemia focal com bloqueio de receptor angiotensina II tipo 1 no rato. Am J Physiol Heart Circ Physiol abril 2005; 288 (4): H1989-H1996).

MÉTODOS Animais

Os ratos Sprague Dawley adultos (10-12 semanas de idade) (machos ~ 300g, fêmeas ~ 250g) foram jejuados por 12-18 horas antes de serem sujeitados a uma oclusão de vaso pial permanente de 3 ramificações terminais da Artéria Cerebral Média sobre o Córtex de Whisker Barrel (P3VO). Tat-NR2B9c foi testado em ratos machos mais um grupo de controle de solução salina (n=8 em cada grupo). Tat-NR2b9c e um controle de solução salina foram testados em ratos fêmeas (n=8 em cada grupo). O pesquisador foi cego ao grupo de tratamento durante o tempo de cirurgia através da análise de tamanho de infarto.

Procedimento geral

Os ratos foram anestesiados com uma injeção intramuscular de 0,5 ml/kg de cetamina (100 mg/kg), acepromazina (2 mg/kg), e xilazina (5 mg/kg), suplementado com um terço da dose inicial como necessário. Uma sonda de temperatura anal foi introduzida e o animal foi colocado em uma almofada de aquecimento mantida em 37°C. A artéria carotídea externa direita (ECA) foi canulada com tubulação de polietileno de PE 10 para injeções de corante. O crânio foi exposto através de uma incisão mediana, raspada livre de tecido, e o músculo temporal desconectado do crânio no lado direito. Usando um microscópio de dissecação e uma broca dental pneumática, uma janela craniana de 6x4 mm foi feita sobre o córtex somatosensorial direito (2 mm caudal e 5 mm lateral ao bregma) perfurando um retângulo através do crânio e tirando o pedaço de crânio enquanto mantém a dura intacta. Após ser banhado com fluido cerebrospinal artificial, bolus pequenos (10 a 20 μL) da patente de corante vital violeta azul (10 mmol/L; Sigma) em solução salina normal, foram injetados na artéria carotídea externa direita para demonstrar o trânsito através dos vasos de superfície do córtex. Três ramificações arteriolares críticas do MCA em torno do córtex de barris foram selecionadas e cauterizadas eletricamente através da dura. Após as cauterizações, as injeções de bolus e trânsitos de corante foram repetidos para assegurar que os trânsitos através das arteríolas cauterizadas estivessem bloqueados. O retângulo de crânio foi substituído sobre a janela e o escalpe foi suturado. O cateter foi removido da ECA, a ECA foi ligada, e o pescoço anterior foi suturado. Uma hora após a iniciação de oclusão focal, 0,3 ml de fármaco (3 nMol/g de peso corporal) ou controle de solução salina foi infundido através da veia da cauda em uma taxa de 0,06 ml/min. Cada rato foi retornado a sua gaiola individual sob uma lâmpada de aquecimento para manter a temperatura corporal até que o rato se recupere inteiramente. O alimento e água foram fornecidos ad libitum.

Colheita de tecido de cérebro e análise de tamanho de infarto

Vinte quatro horas de pós-cirurgia, os animais foram re-anestesiados com 1 mL de pentobarbital e o cérebro foi rapidamente colhido. Uma fatia coronal foi captada através da região de infarto e incubada em cloreto de trifeniltetrazolio 2% (TTC) por 15 minutos em 37°C. As imagens foram escaneadas e as fatias de cérebro foram armazenadas em -80°C. O tamanho de infarto foi medido como uma porcentagem do hemisfério para cada rato no estudo. Após obter as medidas de tamanho de infarto, os animais foram separados em seus grupos respectivos. As comparações foram feitas entre grupos de tratamento como médias ± SE.

RESULTADOS E CONCLUSÕES

O modelo P3V0 de acidente vascular no rato resulta em um infarto robusto e reprodutível em ratos SD machos e fêmeas. O peptídeo Tat-NR2B9c é neuroprotetor em ratos machos e fêmeas como visto em um tamanho de infarto significativamente diminuído 24 horas após sofrer cirurgia P3V0 (Figura 1). Tratamento com Tat-NR2B9c (3nM/g) 1h após acidente vascular dramaticamente reduziu os infartos em animais de ambos os gêneros (Figura 1). Esta resposta neuroprotetora pareceu ser mais pronunciada em fêmeas do que nos machos como visto por uma falta completa de infarto em ratos fêmeas tratados com a concentração equivalente de Tat-NR2B9c. Entretanto, os controles tratados com solução salina indicam que o tamanho de infarto médio em ratos fêmeas é menor (71%) do que os ratos machos.

EXEMPLO 2

Peptídeos contendo a sequência Tat induzem a degranulação de mastócito com histamina de liberação in vitro

MÉTODOS Cultura de célula

Os ratos C57 foram esterelizados com etanol 70%, e o fêmur foi dissecado longe da pele e tecido conectivo. As células de medula foram coletadas e ressuspensas em OPTI-MEM (Gibco) contendo 5% de FBS inativado por calor, 6% de meio condicionado por WEHI (como uma fonte de IL-3), e 55 μM de □-2mercaptoetanol. As células foram cultivadas em aproximadamente 1x106 células/mL. Após 2 dias, as células foram coletadas e centrifugadas onde o pélete foi colocado em uma placa fresca com o meio fresco. O meio de condição WEHI foi adicionado cada semana. As células foram cultivadas por aproximadamente 4 semanas após as quais eram >95% de mastócitos e foram usadas para o ensaio de degranulação de mastócito.

Ensaio de degranulação de mastócito

A atividade de triptase foi determinada usando o Kit de Ensaio de Degranulação de Mastócito (CHEMICON, Temecula, CA). Após o isolamento, as células foram lavadas e ressuspensas em aproximadamente 1x106 células/mL em 1X tampão de ensaio. Para o tratamento com TAT-NR2B9C ou outros peptídeos, 50 μL de solução das seguintes concentrações: 0,125 mg/mL, 1,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, ou 125 mg/mL foram adicionados à suspensão de célula e 500 nM A23187 (Calcimycin), um indutor conhecido de liberação de triptase em mastócitos, foi usado como um controle positivo. As células foram incubadas em 37°C e 5% de CO2 por 60 minutos. A suspensão de célula foi centrifugada em 700 x g e o sobrenadante foi cuidadosamente coletado. Uma mistura de ensaio (fornecida no kit) foi preparada em uma placa de microtílulo de 96 poços. A reação colorimétrica foi iniciada adicionando 20 μL de Substrato de Triptase a cada poço experimental e controle. As amostras foram incubadas por 60 minutos em 37°C. A densidade ótica foi lida em 405 nm em um leitor de microplaca.

Os seguintes tratamentos foram usados para induzir a degranulação de mastócito. 1) Controle negativo (tampão de ensaio desprovido de qualquer peptídeo) 2) Controle positivo (o ionóforo de cálcio A23187) 3) Tat-NR2B9C 4) A sequência Tat-derivada de T-NR2B9C desprovida da sequência de ligação PSD-95 5) NR2B9c compreendendo a sequência de ligação PSD-95 de TAT-NR2B9C, mas desprovida da sequência de Tat, e 6) AA (um peptídeo de 20 aminoácido compreendido da sequência de Tat fundida aos 9 aminoácidos carbóxi terminais da subunidade de NMDA NR2B, mas com 2 mutações de aminoácido que torna incapaz de ligar PSD-95).

Todos os peptídeos foram aplicados em uma concentração de 125 mg/mL a fim aproximar as concentrações de soro máximas alcançadas em cães recebendo uma dose de 10 mg/kg de Tat-NR2B9C em alguns dos experimentos animais descritos abaixo (baseado em assumir um volume de sangue de 8% de peso corporal total).

RESULTADOS E CONCLUSÕES

Como visto na figura 2, os peptídeos contendo o domínio de transdução de Tat causaram a degranulação de mastócito, visto que o peptídeo NR2B9c, desprovido da sequência de Tat, não o fêz. Os ensaios de degranulação de mastócito in vitro foram realizados na ausência de anticorpos e portanto, nenhuma degranulação de mastócito não pode ser devida a um fenômeno imune. Notavelmente, usando RT-PCR e Western blotting, investigamos se os mastócitos continham a proteína PSD-95, o alvo terapêutico de Tat-NR2B9c. Fomos incapazes de detectar PSD-95 nestas células (resultados não mostrados), fornecendo evidência adicional que a degranulação de mastócito foi pouco susceptível ser causado por uma interação de TAT-NR2B9c com PSD-95.

Em um experimento adicional, determinamos que o grau de degranulação de mastócito por Tat-NR2B9c e pelo peptídeo AA foi dependente de dose. Especificamente, concentrações crescentes de Tat-NR2B9c evocaram a degranulação aumentado de mastócito como mostrado na Figura 3.

Em experimentos adicionais, investigamos o efeito de variação de sequência em Tat-NR2B9c na degranulação de mastócito. Usando o mesmo ensaio, os seguintes compostos foram testados (todos em 50 uM): Tabela 5

Como pode ser visto na figura 4, todos os compostos contendo a sequência de Tat e a sequência de peptídeo tat provoca a degranulação de mastócito, visto que NR2B9c sozinho não provocou esta reação.

EXEMPLO 3

Conjugados de Peptídeos contendo a falha de sequência de Tat para induzir a Degranulação de mastócito in vitro

O efeito de determinadas modificações, tais como conjugação aos peptídeos contendo Tat na degranulação de mastócito foi estudado usando os métodos descritos no Exemplo 2. Os peptídeos modificados incluíram Tat-NR12B9c, o D-isômero de Tat-NR2B9c (denominado D-Tat-NR2B9c), um Tat-NR2B9c conjugado à biotina, um AMP-KLSSIESDV conjugado à biotina (ID. de SEQ. N°: 5). Como mostrado na Figura 5, peptídeos AMP ou Tat conjugados à biotina falharam para induzir a degranulação de mastócito.

EXEMPLO 4

Tat-NR2B9c provoca níveis de histamina aumentados e uma resposta de histamina em estudos de animais em cães beagle

Uma estudo de toxidade intravenosa de 14 dias BPL foi conduzido em cães beagle naive (3/sexo/grupo) (CRM estudo N°. 501448) em que os animais receberam injeções diárias de 0, 0,25, 1,0, ou 10 mg/kg de Tat-NR2B9c. As amostras de sangue (aproximadamente 1 mL) foram coletadas de todos os animais nos dias 1, 6 e 12 em pré-dose, 5 e 15 minutos pós- injeção. As amostras de sangue foram coletadas por venipunção (jugular, safena e cefálica) em tubos contendo EDTA. As amostras foram então centrifugadas (dentro de 30 minutos de coleção) em uma centrífuga refrigerada (aproximadamente 4°C) em 2700 rpm por 10 minutos. O plasma foi separado em um segundo tubo com o marcador apropriado e armazenado em -80°C até a análise em CRM. As amostras de plasma foram usadas para investigar os níveis de histamina.

As amostras dos animais dosados intravenosamente com Tat- NR2B9c foram analisadas usando um método validado.

Todos os animais administrados com 10 mg/kg de Tat- NR2B9c exibiram sinais clínicos relacionados ao tratamento, consistindo de uma vermelhidão de focinho, gengivas (também notadas serem pálidas), barbatana, região periorbital e membros, e foram frequentemente associados com o inchamento. Estes efeitos foram associados com letargia e um pulso não palpável, caracterizado como uma reação hipotensiva severa pelo veterinário atendente. Estes efeitos foram observados diariamente, começando com o primeiro dia de doseamento e persistindo ao longo do período de doseamento de 14 dias, sem adaptação aparente pelos animais. Estes efeitos não foram devidos ao desenvolvimento de uma resposta imune baseada em anticorpo, já que estes animais não foram expostos a Tat-NR2B9c no primeiro dia de doseamento, e uma severidade aumentada da resposta sobre os 14 dias de tratamento não foi observada. Especificamente, os níveis aumentados de histamina foram observados imediatamente depois da primeira administração de Tat-NR2B9c a estes cães Beagle naive (veja a Tabela 6 para um sumário dos níveis de histamina de plasma de cão). Estes animais nunca tinham sido expostos a Tat-NR2B9c e assim não devem ter células T de memória ou anticorpos circulantes contra Tat-NR2B9c. Também, nenhum aumento consistente em níveis de histamina foi observado durante o estudo de toxidade de dose repetida por 14 dias em qualquer nível de dose, indicando que não há uma expansão de uma resposta específica de antígeno. Assim, os aumentos observados em níveis de histamina devido a Tat-NR2B9c são o resultado de degranulação direta de mastócitos ao invés de uma resposta de anticorpo antígeno específica. Tabela 6 Determinação de histamina em plasma de cão por imunoensaio de enzima DIA 12 Fêmeas

LLOQ = 0,180 ng/mL h = amostra foi hemolizada

Efeitos cardiovasculares de Tat-NR2B9c indicativo de liberação de histamina em cães

Em um estudo de telemetria cardiovascular de BPL em cães Beagle conscientes soltos (CRM Estudo N°. 691106), 6 animais (3 machos, 3 fêmeas) foram administrados doses crescentes de Tat-NR2B9c (0,25, 1,0, ou 5,0 mg/kg peptídeo bruto), com um período parado de 3 dias entre níveis de dose. Nenhum efeito na pressão sanguínea foi observado em 0,25 ou 1,0 mg/kg. Uma queda transitória na pressão sanguínea foi observada em 4 de 6 cães em 5 mg/kg, durando aproximadamente 30 minutos. A descoberta que uma queda na pressão sanguínea pode ter sido relacionado a dose indica que a queda não foi devida a uma resposta imune alérgica (anticorpo mediado). Além disso, o espaço de tempo entre a baixa dose (0,25 mg/kg) e a dose elevada (5,0 mg/kg) foi aproximadamente 6 dias, isto é, de insuficiente duração para permitir a geração de uma resposta imune. O efeito é assim causado por uma degranulação direta de mastócitos causando a liberação de histamina.

Para obter a informação cardiovascular detalhada ao nível de dose mais elevada testada no estudo de toxidade de dose repetida de cão de 14 dias (isto é, 10 mg/kg), um estudo de telemetria cardiovascular adicional de BPL em cães Beagle conscientes e soltos foi realizado (CRM Estudo N°. 691429). Seis animais (3 machos, 3 fêmeas) receberam o veículo na manhã e 10 mg/kg de Tat-NR2B9c na tarde do mesmo dia (pelo menos 4 horas entre doses). Os aumentos na frequência cardíaca foram observados por até 15 minutos pós-dose em animais tratados, com o efeito máximo observado em 10 minutos em machos e fêmeas. As diminuições nos valores de pressão sanguínea (até 62%) foram observadas em animais individuais em 5 a 10 minutos pós-dose. Os animais fêmeas usados neste estudo cardiovascular adicional foram obtidos da colônia de Charles River e eram animais não naive que tinham sido previamente usados no primeiro estudo cardiovascular para Tat-NR2B9c (CRM Estudo N°. 691106). Os efeitos observados em 10 mg/kg no CRM Estudo N°. 691429 foram comparáveis aos sinais clínicos observados no estudo de toxidade de cão de 14 dias (CRM Estudo N°. 501448), com os efeitos de pressão sanguínea mais severos observados para animais tratados do que aqueles observados ao nível de dose mais elevada (5 mg/kg) testado no CRM Estudo N°. 691106. Estes resultados indicam novamente uma degranulação direta de mastócitos.

Conduzimos os estudos não BPL dos efeitos de Tat- NR2B9c na pressão sanguínea em ratos anestesiados recebendo 50 mg/kg de Tat-NR2B9c. Esta dose foi selecionada para o rato como produziu o volume diminuído, taxa respiratória e volume minuto derivado. Em um experimento, 5 ratos Sprague Dawley machos receberam uma dose de bolus de 50 mg/kg de Tat-NR2B9c sobre 3 minutos. A pressão sanguínea foi monitorada através de um cateter arterial femural.

Todos os animais experimentaram reduções transitórias na pressão arterial média como mostrado na Figura 6. Outra experimento em que 6 animais foram testados similarmente, mostraram resultados similares. Como discutido acima no caso de cães, estas reações em ratos foram observadas também em animais naive que não tinham tido nenhuma oportunidade prévia de desenvolver uma resposta imune ao Tat-NR2B9c. Estes dados fornecem a evidência em uma segunda espécie de degranulação de mastócito pelos peptídeos contendo a sequência de Tat.

Reações inflamatórias indicativas de liberação de histamina em cães.

Um estudo não BPL foi conduzido para examinar uma faixa de dose para Tat-NR2B9c, administrada aos cães Beagle por uma única, injeção intravenosa lenta. Dois animais (um cão Beagle macho e um fêmea) foram dosados intravenosamente com Tat-NR2B9c em sete ocasiões. Houve um período de parada de 3-4 dias entre as doses. A primeira dose foi dada em 2,5 mg/kg. Já que os animais não mostraram nenhum sinal de toxidade, a segunda dose foi administrada em 7,5 mg/kg. O animal macho exibiu edema angioneurótico do tecido macio da cabeça e reação tipo urticaria, especialmente no aspecto ventral do abdômen. Não havia nenhuma reação no cão fêmea. Os sinais vitais (frequência cardíaca, pressão sanguínea, taxa respiratória e temperatura corporal) permaneceram dentro das faixas fisiológicas normais em ambos os animais. A terceira dose foi dada em 12,5 mg/kg. Após doseamento, o edema angioneurótico e a urticaria foram observados em ambos animais. A reação no cão macho foi avaliada por ser moderada, e no animal fêmea, a reação foi suave. A dose seguinte foi ajustada em 20,0 mg/kg. Após doseamento, o animal macho entrou em choque, onde a pressão sanguínea (PS) e o pulso foram não detectáveis. O animal foi tratado com administração i.v. de benadril e dexametasona. PS em 5 minutos pós-doseamento foi registrada como 37/13 mmHg (normal PS em um cão é ~ 160/90). Uma decisão foi feita para não dosar o animal fêmea.

As doses seguintes foram dadas a fim de melhor compreender o tipo de reações visto em doses precedentes. A quinta e sexta doses foram ajustadas em 2,5 e 5,0 mg/kg. Em 2,5 mg/kg com a exceção de vermelhidão de orelha e face do cão macho, nenhuma outra reação adversa foi observada em outro cão. Em 5,0 mg/kg, uma reação moderada foi vista no animal macho, enquanto não havia nenhuma reação no cão fêmea.

Concluiu-se que Tat-NR2B9c em doses elevadas é capaz de induzir hipotensão transitória profunda e reações de pele tipo urticaria. Estas reações pareceram ser dependentes de dose, e o animal macho pareceu ser mais sensível ao artigo teste do que o animal fêmea.

EXEMPLO 5

Tratamento com antistamínico previne os sintomas induzidos por Tat-NR2B9c em cães

Ambos os animais do exemplo 4 foram administrados em seguida 12,5 mg/kg de Tat-NR2B9c após o pré-tratamento com benadril em 1 mg/kg administrado 30 minutos antes de Tat- NR2B9c. Houve leve vermelhidão da pele interna das orelhas no animal macho. O animal macho também vomitou ~ 15-20 minutos após a administração de Tat-NR2B9c. Não houve nenhuma reação observada no cão fêmea. Consequentemente, o pré-tratamento com o fármaco antistamínico benadril preveniu as reações de urticaria e edema angioneurótico que foram observadas mais cedo em ambos animais no mesmo nível de dose de Tat-NR2B9c. Os resultados indicam que os antistamínicos tais como benadril, e corticosteróides, tais como dexametasona tratam eficazmente as consequências adversas de degranulação de mastócito.

Observados juntos, estes resultados fornecem evidência experimental direta que a administração de Tat-NR2B9c provoca uma elevação em níveis de histamina sanguínea em animais experimentais, que níveis de histamina aumentados são devidos à degranulação de mastócito, e que tratar esta resposta com medicamentações antistamínicas e com corticosteróides pode constituir e tornar eficaz meios pelos quais administrar Tat-NR2B9c e outros compostos contendo de domínios de translocação de proteína, tais como Tat.

EXEMPLO 6

Evidência direta que Tat-NR2B9c provoca elevações de histamina sanguínea em humanos

MÉTODOS

Realizamos um Estudo de Segurança, Tolerabilidade e Farmacocinética de Tat-NR2B9c em humanos. Os indivíduos eram machos normais, saudáveis, não fumantes ou indivíduos fêmeas pós-menopausa ou cirurgicamente estéreis com uma idade mínima de 18 anos. Os indivíduos foram administrados Tat-NR2B9c, lote #: 124-134-001B, ou foram dados placebo (solução salina tamponada de fosfato), lote #: 124-134- 001A, administrado como uma infusão intravenosa (10±1 minutos). Quatro indivíduos foram dosados em cada um dos coortes 1 a 3 e 10 indivíduos foram dosados em cada um dos coortes 4 a 8. Todos os 62 indivíduos completaram o estudo.

Os períodos de tratamento para cada coorte foram como segue: Coorte 1: 14 de setembro de 2006; Coorte 2: 26 de setembro de 2006; Coorte 3: 6 de outubro de 2006; Coorte 4: 20 de outubro de 2006; Coorte 5: 6 de novembro de 2006;

Coorte 6: 4 de dezembro de 2006; Coorte 7: 17 de dezembro de 2006; Coorte 8: 25 de fevereiro de 2007.

Pontos de tempo de extração de sangue:

Durante o período de estudo, 11 amostras de sangue foram coletadas para análise farmacocinética de cada indivíduo nos seguintes pontos de tempo: 0,00 (pré-dose), 0,08 (5 minutos), 0,17 a 0,25 (10 a 15 minutos, precisamente no final de cada infusão individual de fármaco), 0,33 (20 minutos), 0,50, 0,75, 1,00, 2,00, 6,00, 12,00, e 24,00 horas pós-dose. Além disso, 8 amostras de sangue foram coletadas para a análise de histamina de cada indivíduo nos seguintes pontos de tempo: 0,00 (pré-dose), e 0,08 (5 minutos), 0,17 (10 minutos), 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, e 24,00 horas pós-dose.

Avaliação de segurança:

A avaliação de segurança foi realizada em todos os indivíduos que receberam pelo menos 1 dose durante o curso do estudo. Os incidentes de todos os eventos adversos (AEs) foram tabulado por tratamento e número de indivíduo. Os valores absolutos para sinais vitais, parâmetros de eletrocardiograma (ECG), parâmetros de laboratório e examinações físicas foram também documentados e os valores fora da faixa normal foram sinalizados. Os deslocamentos de valores bases foram tabulados. AEs foram documentados usando os termos pesquisador e Dicionário Médico para Atividades Regulatórios (MedDRA).

RESULTADOS Parte 1: Efeitos de Tat-NR2B9c em níveis de histamina sanguínea:

Um resumo de resultados de histamina anormais por dose é ilustrado na Tabela 7. Sete de 8 indivíduos no grupo de dose de 3,75 mg/kg teve níveis de histamina maiores do que 10 nmol/L (média 24,3 nmol/L; máximo de 39,8 nmol/L) 10 minutos após o início da administração de NA 1, e 3 dos indivíduos ainda tiveram níveis de histamina maiores do que 10 nmol/L (média 15,3 nmol/L; máximo de 20,3 nmol/L) 15 minutos após o começo da administração de NA 1.

Diferente do grupo de dose de 3,75 mg/kg, nenhum grupo de tratamento teve níveis anormais significativos de histamina. O grupo placebo e o grupo de dose de 0,375 mg/kg cada um teve 1 indivíduo que teve um nível elevado de histamina em 1 ponto tempo, mas estes resultados estavam em avaliação e em 2,00 horas pós-dose, respectivamente. Todos os resultados anormais de histamina retornaram à faixa normal dentro de 24,00 horas de administração de fármaco. Tabela 7: Número de indivíduos com níveis de histamina > 10 nmol/L por grupo de tratamento

Parte 11: Dados de segurança

Quarenta indivíduos que participaram no estudo experimentaram um total de 168 efeitos adversos (AEs) durante o estudo. A maioria de AEs foi suave em severidade.

Trinta e quatro de 46 indivíduos de tratamento ativo (73,9%) experimentaram pelo menos 1 AE, enquanto 6 de 16 indivíduos de tratamento de placebo (37,5%) experimentaram pelo menos 1 AE. Os indivíduos nos grupos de dose de 2,60 e 3,75 mg/kg experimentaram significativamente mais AEs do que indivíduos nos grupos de dose mais baixa. Nenhum evento adverso sério (SAEs) foi relatado. Os AEs mais comuns experimentados pelos indivíduos que recebem Tat-NR2B9c foram febre (13/46; 28,3%), prurido (12/46; 26,1%), vermelhidão (10/46; 21,7%), e boca seca (9/46; 19,6%).

Todos AEs foram resolvvidos com aexceção de 2 exemplos de glicose de sangue aumentada, como os indivíduos foram perdidos para continuação.

A incidência de AEs nos grupos de dose de 2,60 e 3,75 mg/kg foi mais elevada do que a taxa de incidência de AE nos grupos de dose de placebo, 0,02, 0,08, 0,20, 0,375, 0,75 e 1,50 mg/kg. Em doses de Tat-NR2B9c; >2,60 mg/kg, diversos AEs foram frequentemente relatados. Estes incluíram: (1) diminuição na pressão sanguínea, (2) sensação de formigamento (parestesia), (3) dormência (hipoastesia), (4) vermelhidão (eritema), (5) erupção, (6) coceira (prurido), (7) boca seca, (8) náusea, (9) onda de calor, e (10) vermelhidão. O início destes AEs coincidiu com a administração do fármaco de estudo e foi relacionado provavelmente ao fármaco de estudo.

Em experimentos pré-clínicos com Tat-NR2B9c, os níveis de histamina elevados foram observados em grupos de dose elevada, e eram provavelmente a fonte de efeitos colaterais incluindo inchamento, vermelhidão e hipotensão. No estudo atual, os níveis de histamina foram elevados em 7 dos 8 indivíduos no grupo de dose mais elevada (3,75 mg/kg) 10 minutos após o começo da administração de fármaco intravenosa, e restante elevados em 3 destes indivíduos 15 minutos após a administração de fármaco, após o qual os níveis retornaram à faixa normal. Durante o mesmo prazo de tempo que os níveis de histamina foram elevados, a maioria dos AEs no grupo de dose de 3,75 mg/kg foram observados. Isto sugere que os níveis de histamina elevados foram a fonte dos AEs mais frequentemente relatados (incluindo a pressão sanguínea diminuída, formigamento, dormência, vermelhidão, prurido, coceira, boca seca, náusea, ondas de calor, e vermelhidão).

A maioria dos AEs listados foram também observados nos experimentos animais pré-clínicos onde a dose máxima tolerada (MTD) foi estabelecida em 12,5 e 100 mg/kg para cães e ratos, respectivamente. A maioria dos AEs nos grupos de dose de 2,60 e 3,75 mg/kg não foram observados, ou observados em somente 1 indivíduo nos grupos de dose entre 0,02 e 1,50 mg/kg. Isto sugere que os AEs que foram observados em doses mais elevadas de Tat-NR2B9c foram mínimos ou não presentes nesta faixa de dose mais baixa.

Embora a invenção seja descrita em detalhe para finalidades de clareza de compreensão, será óbvio que determinadas modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações adicionadas. Todas as publicações e documentos de patente mencionados neste pedido são incorporados aqui por referência em sua totalidade para todas as finalidades à mesma extensão como se cada um fosse individualmente denotado. A menos que de outra maneira aparente do contexto qualquer elemento, modalidade, etapa, característica ou aspecto da invenção pode ser realizado em combinação com qualquer outro.

Claims (19)

1. Uso de um agente farmacológico ligado a um peptídeo tat possuindo uma sequência de aminoácido compreendendo qualquer uma das ID. de SEQ. N°: 1, 2, 3, 4 ou 51 caracterizado por ser na preparação de um medicamento para uso no tratamento ou profilaxia de uma doença em combinação com um inibidor de degranulação de mastócito ou anti- histamínico para a inibição de uma resposta inflamatória da liberação de histamina resultante da degranulação de mastócitos que pode ser induzida pelo peptídeo tat.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente farmacológico ser utilizado em combinação com o inibidor de degranulação de mastócito.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente farmacológico ser utilizado em combinação com o anti-histamínico.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tat apresenta uma sequência de aminoácido compreendendo RKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 51) ou GRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 1).

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tat apresenta uma sequência de aminoácido compreendendo YGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 2).

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tat apresenta uma sequência de aminoácido compreendendo FGRKKRRQRRR (ID. de SEQ. N°: 3).

7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tat apresenta uma sequência de aminoácido compreendendo GRKKRRQRRRP (ID. de SEQ. N°: 4).

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente farmacológico é um peptídeo.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo apresenta uma sequência de aminoácido compreendendo KLSSIESDV (ID. de SEQ. N°: 5) ou KLSSIETDV (ID. de SEQ. N°: 43).

10. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente farmacológico ligado ao peptídeo tat possui a sequência de aminoácido ID. de SEQ. N°: 6.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de degranulação de mastócito ou anti-histamínico é administrado por via intravenosa, oral ou tópica.

12. Uso de um inibidor de degranulação de mastócito ou anti-histamínico caracterizado por ser na preparação de um medicamento para uso na inibição de uma resposta inflamatória da liberação de histamina resultante de desgranulação de mastócitos induzível por um agente farmacológico ligado a um peptídeo tat possuindo uma sequência de aminoácidos compreendendo qualquer uma das ID. de SEQ. N°: 1, 2, 3, 4 ou 51.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o inibidor de degranulação de mastócito é utilizado no preparo do medicamento.

14. Kit caracterizado por compreender um agente farmacológico possuindo a sequência que consiste em ID. de SEQ. N°: 5 ligado a um peptídeo tat possuindo uma sequência de aminoácidos consistindo em ID. de SEQ. N°: 2 ou 3, e um inibidor de degranulação de mastócito ou anti-histamínico para inibir uma resposta inflamatória da liberação de histamina resultante da degranulação de mastócito induzível pelo peptídeo tat de internalização.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um agente farmacológico inibir a ligação de PSD95 à NDMAR 2B, e um peptídeo possuindo uma sequência de aminoácido de ESDV (ID. de SEQ. N°:12) ou ETDV (ID. de SEQ. N°:39) no seu C-terminal e a doença é derrame ou ferimento traumático ao SNC não associado com derrame.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente farmacológico é um peptídeo possuindo a sequência de ID. de SEQ. N°: 5 ou ID. de SEQ. N°: 43.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente farmacológico ligado ao peptídeo tat possui a sequência de aminoácido de ID. de SEQ. N°: 6.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser para tratar ou efetuar profilaxia de uma doença em um sujeito fêmea.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser para efetuar profilaxia de um sujeito em risco de ataque isquêmico cerebral transitório ou derrame como resultado de se submeter à cirurgia de coração.

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