BRPI0810760B1 - dispositivo para detecção de um analito, e, método - Google Patents

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(54) Titulo: DISPOSITIVO PARA DETECÇÃO DE UM ANALITO, E, MÉTODO (51) lnt.CI.: B01L 3/00 (30) Prioridade Unionista: 03/05/2007 US 60/915884,14/03/2008 US 61/036537 (73) Titular(es): CLONDIAG GMBH (72) Inventor(es): THOMAS KAISER; KLAUS-PETER MÕBIUS; TORSTEN SCHULZ; THOMAS UHLIG; ALEXANDER VON SCHENKZU SCHWEINSBERG; EUGEN ERMANTRAUT; JENS TUCHSCHEERER (85) Data do Início da Fase Nacional: 30/10/2009 “DISPOSITIVO PARA DETECÇÃO DE UM ANALITO, E, MÉTODO”

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido U.S. No. 60/915.884, depositado em 3 de Maio de 2007 e Pedido U.S. No. 61/036.537, depositado em 14 de Março de 2008, cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade.

O presente pedido está relacionado ao pedido provisório U.S. 60/826.678, depositado em 22 de Setembro de 2006, à continuação U.S. do Pedido de Patente Internacional PCT/EP2005/004923, depositado em 6 de Maio de 2005, o qual designa os Estados Unidos e reivindica prioridade ao Pedido de Patente Alemã DE 10 2004 022 263, depositado em 6 de Maio de

2005, à continuação U.S. tendo no. de série 11/593.021 e sendo depositada em 6 de Novembro de 2006, aos Pedidos de Patente Internacionais PCT/EP2006/068153 e EP06/068155, depositado em 6 de Novembro de

2006, o qual designa os Estados Unidos e reivindica prioridade ao Pedido de Patente Alemã DE 10 2005 052 752, depositado em 4 de Novembro de 2005, ao pedido internacional sendo depositado em 6 de Novembro de 2006 e ao pedido provisório U.S. 60/867.019, depositado em 22 de Novembro de 2006. Cada um dos pedidos precedentes é incorporado aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a ensaios (por exemplo, ensaios para um ou mais analitos em uma amostra).

FUNDAMENTO

Ensaios podem ser realizados para determinar a presença de um ou mais analitos em uma amostra. Arranjos podem ser usados para realizar múltiplos ensaios (por exemplo, para cada um de múltiplos analitos diferentes) sobre uma amostra. Arranjos típicos incluem um substrato tendo múltiplas zonas de teste espaçadas, cada uma tendo um composto sonda diferente, tal como um polinucleotídeo, anticorpo ou proteína. Em uso, o arranjo é contatado com uma amostra a qual, então, interage com os locais do arranjo. Para cada local, a interação pode incluir, por exemplo, ligação de um analito correspondente aos compostos de sonda do local e/ou uma reação química entre o analito correspondente e os compostos de sonda. A reação resulta em um produto detectável (por exemplo, um precipitado). A presença e extensão de interação dependem se um analito correspondente está presente na amostra.

Tipicamente, a interação é detectada opticamente (por exemplo, através de fluorescência). Por exemplo, detecção óptica pode ser realizada usando um detector de formação de imagem (por exemplo, um CCD) tendo múltiplos elementos sensíveis à luz (por exemplo, pixéis) espaçados uns dos outros em pelo menos uma (por exemplo, duas) dimensões. Cada um dos elementos sensíveis à luz é posicionado para receber luz de uma localização espacial diferente do substrato. Assim, a luz simultaneamente detectada por múltiplos elementos sensíveis à luz pode ser combinada para formar dados de imagem em pelo menos uma (por exemplo, duas) dimensões do substrato. Os dados de imagem podem ser avaliados para determinar a presença e/ou extensão de interação em múltiplos locais do arranjo. SUMÁRIO

A presente invenção se refere a ensaios (por exemplo, ensaios para múltiplos analitos em uma amostra).

Em um aspecto, um método compreende:

contanto de um arranjo de zonas de teste espaçadas com uma amostra líquida, as zonas de teste estando dispostas entre uma superfície interna de um primeiro substrato e uma superfície interna de um segundo substrato de um dispositivo microfluídico, pelo menos um dos substratos sendo flexível em cada zona de teste compreendendo um composto sonda configurado para participar em um ensaio para um analito alvo, redução de uma distância entre as superfícies internas dos primeiro e segundo substratos em locais correspondendo às zonas de teste e seqüencialmente, determinação óptica da presença de uma interação em cada uma das múltiplas zonas de teste para as quais a distância entre as superfícies internas no local correspondente é reduzida, a interação em cada zona de teste sendo indicativa da presença, na amostra, de um analito alvo.

O método pode ainda compreender, para cada uma de múltiplas zonas de teste, determinação da presença de um respectivo analito baseado na interação opticamente determinada.

Para cada uma de pelo menos algumas das zonas de teste, a interação em cada uma de múltiplas zonas de teste pode ser uma reação de ligação entre o analito e o composto sonda da zona de teste.

Determinação óptica pode compreender detecção de luz de cada uma das zonas de teste usando um detector de grandeza zero.

Detecção de luz de cada uma das zonas de teste usando um detector de grandeza zero pode consistir essencialmente de detecção de luz com o detector de grandeza zero.

O método pode ainda compreender, para cada um de múltiplos locais para os quais a distância entre as superfícies internas dos primeiro e segundo substratos foi reduzida, subseqüentemente, aumento da distância entre as superfícies internas após a etapa de determinação óptica na zona de teste.

Redução de uma distância pode compreender redução seqüencial da distância entre as superfícies internas dos primeiro e segundo substratos em locais correspondendo às zonas de teste. Nessa modalidade, o método pode ainda compreender, para cada um de múltiplos locais para os quais a distância entre as superfícies internas dos primeiro e segundo substratos foi reduzida, subseqüentemente, aumento da distância entre as superfícies internas após a etapa de detecção óptica de ligação na zona de teste.

Determinação óptica pode compreender detecção seqüencial da interação em cada uma de múltiplas zonas de teste para as quais a distância entre as superfícies internas no local correspondente é reduzida. Em uma modalidade, detecção óptica compreende, simultaneamente, detecção de luz de não mais do que um número N de zonas de teste, onde N < 5 ou N < 3 ou N = 1. Alternativamente, determinação óptica compreende detecção de luz de cada uma das zonas de teste usando um detector de grandeza zero. Detecção de luz de cada uma das zonas de teste usando um detector de grandeza zero pode consistir essencialmente de detecção de luz com o detector de grandeza zero.

Detecção óptica pode compreender translação de dispositivo microfluídico com relação a uma zona de detecção óptica de um detector óptico usado para realizar a determinação óptica.

Redução de uma distância compreende translação do dispositivo microfluídico com relação a um elemento que aplica uma força compressiva ao dispositivo microfluídico. Translação do dispositivo microfluídico com relação ao elemento pode compreender rotação de pelo menos uma porção do elemento.

Cada zona de teste pode ser alongada e definir um eixo — principal, ainda, translação do dispositivo microfluídico pode compreender translação do dispositivo ao longo de um eixo de translação geralmente perpendicular ao eixo principal de cada uma de múltiplas zonas de teste. Por exemplo, o eixo de translação e o eixo principal de múltiplas zonas de teste são perpendiculares a dentro de 10° ou menos ou mesmo dentro de 5° ou menos.

Ainda, o eixo de translação e o eixo principal da maioria ou mesmo todas as zonas de teste pode ser geralmente perpendicular.

O método pode ainda compreender, durante a etapa de translação, leitura de informação contida em um código de referência do dispositivo microfluídico e determinação, baseado na informação de leitura, de uma propriedade de cada uma de múltiplas zonas de teste.

Determinação pode compreender determinação, para cada uma de múltiplas zonas de teste, de um valor indicativo de quando a zona de teste está em uma zona de detecção de um detector óptico usado para realizar a detecção óptica. Ainda, determinação pode compreender determinação de uma propriedade físico-química de zonas de teste do dispositivo microfluídico. Por exemplo, a propriedade físico-química é indicativa de um analito que pode ser determinado por cada uma de múltiplas zonas de teste. Ainda, determinação pode compreender determinação de uma identidade de reagentes armazenados dentro do dispositivo microfluídico antes de uso.

Uma proporção de um comprimento ao longo do eixo principal para uma largura ao longo de uma dimensão perpendicular das zonas de teste pode ser de pelo menos 2,5 ou mesmo pelo menos 5.

A etapa de detecção óptica pode ser realizada sem primeiro contato das zonas de teste com um líquido sem a amostra após a etapa de contato.

Determinação óptica pode compreender excitação e detecção de fluorescência das zonas de teste.

contato de um arranjo de zonas de teste espaçadas com uma amostra, as zonas de teste estando dispostas entre primeira e segunda superfícies, cada zona de teste compreendendo um composto sonda configurado para participar em um ensaio para um respectivo analito, redução de uma distância entre as superfícies internas em locais correspondendo às zonas de teste e seqüencialmente, determinação óptica do resultado do ensaio em cada uma de múltiplas zonas de teste para as quais a distância entre as superfícies internas no local correspondente é reduzida.

O método pode ainda compreender, para cada uma de múltiplas zonas de teste, determinação da presença de um respectivo analito baseado no resultado do ensaio.

Para cada uma de pelo menos algumas das zonas de teste, o resultado do ensaio pode ser indicativo de uma reação de ligação entre o analito e o composto sonda da zona de teste.

Determinação óptica pode compreender detecção de luz de cada uma das zonas de teste usando um detector de grandeza zero.

Detecção de luz de cada uma das zonas de teste usando um detector de grandeza zero pode consistir essencialmente de detecção de luz com o detector de grandeza zero.

O método pode ainda compreender, para cada um de múltiplos locais para os quais a distância entre as superfícies internas foi reduzida, subseqüentemente, aumento da distância entre as superfícies internas após a etapa de determinação óptica na zona de teste.

Redução de uma distância pode compreender redução seqüencial da distância entre as superfícies intemas em locais correspondendo às zonas de teste.

Em outro aspecto, um sistema compreende:

—-----------------------um leitor para dispositivo microfiuídico configurado para receber um dispositivo microfiuídico compreendendo um arranjo de zonas de teste espaçadas estando dispostas entre uma superfície interna de um primeiro substrato e uma superfície interna de um segundo substrato do dispositivo microfiuídico, pelo menos um dos substratos sendo flexível, cada zona de teste compreendendo um composto sonda configurado para participar em um ensaio para um analito alvo, um detector óptico configurado para detectar luz de pelo menos uma das zonas de teste quando a pelo menos uma zona de teste está em uma zona de detecção do dispositivo microfluídico, um translador configurado para realizar translação pelo menos um do dispositivo microfluídico e da zona de detecção do detector óptico um com relação ao outro, um compressor configurado para reduzir uma distância entre as superfícies internas dos primeiro e segundo substratos em locais correspondendo à zona de detecção do dispositivo óptico, um processador configurado para receber um sinal do detector óptico, o sinal indicativo de luz detectada a partir de uma zona de teste.

O sistema pode ser configurado para detectar opticamente, de modo simultâneo, luz de não mais do que um número N de zonas de teste, onde N<5ouN<3ouN=l.

O detector pode ser um detector de fluorescência.

Em outro aspecto, um dispositivo de ensaio compreende primeiro e segundo substratos que definem um canal entre os mesmos, pelo menos um dos substratos sendo flexível, o canal compreendendo um arranjo de zonas de teste espaçadas, cada zona compreendendo um composto sonda configurado para participar em um ensaio para um analito alvo.

Em outro aspecto, um artigo de manufatura compreende: um substrato e

---------------------múltiplas zonas de teste alongadas, cada zona de teste compreendendo um respectivo composto sonda configurado para participar em um ensaio para um analito alvo, cada zona de teste definindo um eixo principal e uma largura perpendicular ao mesmo e os eixos principais das zonas de teste sendo geralmente paralelos.

Em outro aspecto, um método compreende:

introdução de uma amostra líquida em um orifício de um capilar e introdução de pelo menos uma porção da amostra líquida em uma rede microfluídica do dispositivo microfluídico através de redução de uma pressão que atua sobre uma interface de amostra líquido-gás da amostra líquida.

O método pode ainda compreender, subseqüente à etapa de introdução da amostra líquida no orifício de um capilar, conexão do capilar a um dispositivo microfluídico; a amostra líquida permanecendo dentro do capilar.

A redução de uma pressão pode ser realizada através de compressão de pelo menos uma porção da rede microfluídica para deslocar o gás da mesma e, subseqüentemente, descompressão da pelo menos uma porção da rede microfluídica.

A rede microfluídica pode ser, pelo menos em parte, definida por e entre primeiro e segundo substratos geralmente planos, pelo menos um dos substratos sendo deformável quando de aplicação de pressão externa para comprimir pelo menos uma porção da rede microfluídica e pelo menos um substrato tendendo a reassumir sua posição anterior quando de liberação da pressão externa para permitir descompressão da pelo menos uma porção da rede microfluídica.

Ainda, a rede microfluídica pode ser, pelo menos em parte, definida por um canal microfluídico incluindo uma entrada e uma região de detecção em comunicação de fluido com a entrada e um trajeto de fíuxo microfluídico em comunicação de fluido com a região de detecção, em que o trajeto de fluxo microfluídico tem uma parede sendo pelo menos parcialmente deformável quando de aplicação de pressão externa para comprimir a pelo menos uma porção do trajeto de fluxo microfluídico e a parede tende a reassumir sua posição anterior quando de liberação da pressão externa para permitir descompressão da pelo menos uma porção do trajeto de fluxo microfluídico.

O método pode ainda compreender combinação da amostra líquida com o um ou mais reagentes presentes dentro da rede microfluídica para formar misturas. A mistura pode compreender pelo menos 90% da amostra líquida que foi introduzida na rede microfluídica. O um ou mais reagentes incluem um rótulo detectável que reage com a amostra para formar um complexo incluindo o rótulo e um analito presente na amostra.

O método pode ainda compreender detecção óptica de um sinal indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro de um subconjunto da amostra líquida, o subconjunto estando presente dentro de uma zona de detecção do dispositivo microfluídico.

O método pode ainda compreender deslocamento do subconjunto de amostra líquida da zona de detecção e introdução de um subconjunto diferente da amostra líquida na zona de detecção e detecção óptica de um sinal indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro do diferente subconjunto. Deslocamento do subconjunto e introdução do subconjunto diferente podem ser realizados comprimindo pelo menos uma porção da rede microfluídica, a porção comprimida sendo pelo menos parcialmente compensada ao longo da rede a partir da zona de detecção. Compressão da pelo menos uma porção pode compreender compressão de uma primeira porção da rede microfluídica e, sem liberar primeiro completamente a compressão, mover, para um local da compressão ao longo da rede microfluídica, uma quantidade suficiente para realizar as etapas de deslocamento e introdução.

O método pode ainda compreender realização da etapa de detecção óptica de um sinal indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro do diferente subconjunto sem primeiro liberar completamente a compressão da rede microfluídica.

O método pode ainda compreender, intermediariamente às etapas de introdução da amostra líquida no orifício do capilar e introdução de pelo menos a porção da amostra líquida na rede microfluídica, impedir que a amostra líquida saia do capilar. Impedir que a amostra líquida saia do capilar pode compreender aumento da pressão que atua sobre a interface de amostra líquido-gás.

Em algumas modalidades, a rede microfluídica não suporta o fluxo capilar da amostra líquida. Uma superfície interior da rede microfluídica que é definida por pelo menos um dos primeiro e segundo substratos pode ser hidrofóbica.

O analito pode ser uma partícula, por exemplo, uma célula.

O método pode ainda compreender movimento de pelo menos um do dispositivo microfluídico e um detector óptico um com relação ao outro e, subseqüentemente, detecção de um sinal óptico indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro de um subconjunto diferente da amostra líquida.

O capilar pode ser um capilar end to end compreendendo primeira e segunda extremidades abertas, o orifício do capilar compreende um volume total V e a etapa de introdução de pelo menos uma porção da amostra líquida compreende introdução de pelo menos 90% da amostra líquida na rede microfluídica.

Em outro aspecto, um método compreende:

introdução de uma amostra líquida em uma rede microfluídica disposta entre uma superfície intema de um primeiro substrato é uma superfície intema de um segundo substrato de um dispositivo microfluídico, pelo menos um dos substratos sendo flexível, a amostra líquida compreendendo múltiplas partículas, formação de uma mistura compreendendo pelo menos uma porção da amostra líquida e um rótulo óptico através de redução seqüencial de uma distância entre as superfícies internas dos primeiro e segundo substratos em múltiplas posições dentro da rede microfluídica, formação de múltiplos complexos, cada complexo compreendendo uma das múltiplas partículas e pelo menos um dos rótulos ópticos e detecção de complexos presentes dentro de um subconjunto da mistura.

O método pode ainda compreender detecção de complexos presentes dentro de cada um de múltiplos diferentes subconjunto da mistura.

Um volume total os múltiplos diferentes subconjuntos pode ser de pelo menos 90% de um volume da amostra líquida introduzida ao dispositivo microfluídico.

O método pode ainda compreender introdução de um volume total V de amostra líquida ao dispositivo microfluídico e em que um volume total da mistura é de pelo menos 90% do volume V.

O método pode ainda compreender detecção de complexos presentes dentro de pelo menos 90% do volume total da mistura.

As partículas podem ser células.

Os rótulos ópticos podem ser rótulos fluorescentes.

Em outro aspecto, um método compreende:

introdução de um volume total V de uma amostra líquida a uma rede microfluídica disposta entre uma superfície interna de um primeiro substrato e uma superfície interna de um segundo substrato de um dispositivo microíluídico, pelo menos um dos substratos sendo flexível, a amostra líquida compreendendo múltipla partículas, formação de uma mistura dentro da rede microfluídica, a mistura compreendendo pelo menos cerca de 90% do volume V de amostra líquida e um rótulo óptico, formação de múltiplos complexos, cada complexo compreendendo uma das múltiplas partículas e pelo menos um dos rótulos ópticos e detecção de complexos presentes dentro de um subconjunto da mistura.

A mistura pode compreender pelo menos cerca de 95% do volume V de amostra líquida.

O método pode ainda compreender detecção de complexos presentes dentro de cada um de múltiplos diferentes subconjuntos das misturas.

Um volume total dos múltiplos diferentes subconjuntos pode ser de pelo menos 90% do volume da amostra líquida introduzida no dispositivo microfluídico.

Em outro aspecto, um dispositivo para detecção de um analito compreende: um cartucho tendo um canal micro fluídico incluindo uma entrada e uma região de detecção em comunicação de fluido com a entrada; um trajeto de fluxo microfluídico tendo uma parede pelo menos parcialmente deformável e em comunicação de fluido com a região de detecção do canal; e uma cobertura tendo um elemento de vedação configurado para vedar a entrada e formar um circuito de fluido incluindo a entrada, o canal microfluídico e o trajeto de fluxo microfluídico.

A cobertura e o cartucho do dispositivo podem ser configurados para fechar irreversivelmente após formação do circuito de fluido.

— — ---------------------------------Altemativamente, a cobertura pode ser flexivelmente presa ao cartucho.

Ainda, a cobertura e o cartucho podem ser configurados para se encaixar em uma primeira posição relativa, de modo que a cobertura pode ser removida e encaixar em uma segunda posição relativa, de modo que a cobertura é irreversivelmente fechada após formação do circuito de fluido.

A região de detecção pode ser ligada através de pelo menos uma superfície do cartucho e pelo menos uma superfície de uma tampa. A tampa pode incluir um filme transparente sobre a região de detecção. Ainda, a tampa pode ser adesivamente fixada ao cartucho.

Em outro aspecto, um dispositivo para detecção de um analito compreende um cartucho tendo um canal microfluídico incluindo uma entrada de capilar tendo um anticoagulante sobre uma superfície interna, uma câmara incluindo um reagente e uma região de detecção em comunicação de fluido com a entrada; um trajeto de fluxo microfluídico tendo uma parede pelo menos parcialmente deformável e em comunicação de fluido com a região de detecção do canal; e uma cobertura tendo um elemento de vedação configurado para vedar a entrada e formar um circuito de fluido incluindo a entrada, o canal microfluídico e o trajeto de fluxo microfluídico.

Em outro aspecto, um detector de fluorescência inclui uma fonte de luz; uma lente condensadora que obtém um ângulo sólido de 10° ou mais e uma lente objetiva que obtém um ângulo sólido de 10° ou mais e sendo configurada para formar uma imagem de um objeto microscópico.

A lente condensadora e/ou a lenta objetiva pode obter um ângulo sólido de 10° a 15°, tal como 12° a 14°, por exemplo, 13,5°.

O detector de fluorescência pode ainda incluir uma abertura. A abertura pode ser configurada para permitir um ângulo sólido de 10° ou mais (por exemplo, 10° ou 15° ou 12° ou 14° ou 13,5°).

O detector de fluorescência pode ainda incluir pelo menos um filtro.—Filtros podem ser escolhidos com relação a—um conjunto predeterminado de comprimentos de onda de emissão. Por exemplo, um filtro pode ser selecionado para passar luz com um comprimento de onda específico e outro filtro pode ser selecionado para passar luz com um comprimento de onda específico diferente, por exemplo, dependendo dos comprimentos de onda de emissão de corantes usados para rotulação de reagentes no cartucho.

Em outro aspecto, um sistema para detecção de um analito compreende:

Um cartucho tendo: um canal microfluídico incluindo uma entrada e uma região de detecção em comunicação de fluido com a entrada; um trajeto de fluxo microfluídico tendo uma parede pelo menos parcialmente deformável e em comunicação de fluido com a região de detecção do canal; e uma cobertura tendo um elemento de vedação configurado para vedar a entrada e formar um circuito de fluido incluindo a entrada, o canal microfluídico e o trajeto de fluxo microfluídico; e um detector de fluorescência incluindo uma fonte de luz; uma lente condensadora que obtém um ângulo sólido de 10° ou mais; e uma lente objetiva que obtém um ângulo sólido de 10° ou mais.

O detector de fluorescência pode incluir uma câmera.

Ainda, o detector de fluorescência pode incluir um ou mais filtros de emissão selecionáveis.

Em outro aspecto, um método para detecção de um analito em uma amostra líquida compreende:

introdução da amostra líquida em um canal microfluídico, desse modo, formando uma porção líquida aquosa encerrada pelo canal e ligado em uma primeira extremidade por um fluido de transporte;

formação de um circuito de fluxo, de modo que o fluido de transporte proporciona comunicação de fluido entre as primeira e segunda extremidades da porção líquida; e

-------------aplicação de uma pressão diferencial às primeira e segunda extremidades da porção líquida via o fluido de transporte.

Em outro aspecto, um método para detecção de um analito em uma amostra líquida compreende:

introdução da amostra líquida em um canal microfluídico, desse modo, formando uma porção líquida contínua encerrada pelo canal e ligado em uma primeira extremidade por um fluido de transporte, a amostra líquida compreendendo múltiplas partículas, formação de um circuito líquido, de modo que o fluido de transporte proporciona comunicação de fluido entre as primeira e segunda extremidades da porção líquida, formação de uma mistura compreendendo pelo menos uma porção da amostra líquida e um rótulo óptico aplicando uma pressão diferencial às primeira e segunda extremidades da porção líquida via o fluido de transporte, formação de múltiplos complexos, cada complexo compreendendo uma das muitas partículas e pelo menos um dos rótulos ópticos e detecção de complexos presentes dentro de um subconjunto da mistura.

Em seguida, outras modalidades exemplificativas dos dispositivos e métodos (por exemplo, dos dispositivos, sistemas e métodos para detecção de um analito) serão explicadas.

Uma porção do circuito de fluido pode ser formada por uma parede elasticamente deformável.

Aplicação de uma pressão diferencial às primeira e segunda extremidades da porção líquida pode incluir compressão da parede elasticamente deformável.

A amostra líquida pode ser selecionada conforme desejado, baseado nos analitos a serem determinados. Amostras exemplificativas incluem água, soluções aquosas, soluções orgânicas, soluções inorgânicas, fluidos corporais de seres humanos e outros animais, por exemplo, urina, escarro, saliva, fluido cérebro-espinhal, sangue íntegro e materiais derivados de sangue, tais como plasma e soro.

Os analitos a serem determinados podem ser selecionados conforme desejado. Por exemplo, os analitos podem se relacionar à medicina (por exemplo, diagnóstico); pesquisa (por exemplo, descoberta de droga), indústria (por exemplo, monitoramento de qualidade da água ou alimento) ou ciência forense. Analitos exemplificativos a serem determinados incluem marcadores (por exemplo, marcadores diagnósticos ou marcadores prognósticos) de condições fisiológicas, tal como doenças. Tais marcadores incluem marcadores cardíacos (por exemplo, peptídeos natriuréticos e membros da família troponina), marcadores de câncer (por exemplo, proteínas da matriz nuclear), marcadores genéticos (por exemplo, polinucleotídeo), marcadores de sépsis, marcadores neurológicos e marcadores indicativos de condições patogênicas. Os analitos podem ser indicativos da presença de patógenos (por exemplo, bactérias, vírus ou fungos).

Em uma modalidade típica, um ou mais dos analitos compreendem partículas, tais como vírus, bactérias, células, fungos ou esporos. Por exemplo, qualquer uma das partículas descritas no Pedido de Patente Internacional PCT/EP2006/068153 (o qual é incorporado por referência em sua totalidade) pode ser detectada. Exemplos de partículas que ocorrem naturalmente incluem, inter alia, células procariotas (por exemplo, células bacterianas, tais como Escherichia coli ou Bacillus subtilis), células eucariotas (por exemplo, células de levedo, tal como Saccharomyces cerevisiae, células de inseto, tais como Sf9 ou High 5, linhagens de células imortalizadas, tais como células HeLa ou Cos e células primárias, tais como células de sangue de mamífero) ou vírus (por exemplo, partículas de fago, tal como fago Ml3 ou T7). fm uma modalidades, as partículas podem ser células.

Os rótulos ou compostos sonda ou moléculas de captura podem ser selecionadas conforme desejado, baseado nos analitos a serem determinados. Rótulos ou compostos sonda adequados para determinação da presença de um analito são descritos no pedido provisório U.S. 60/826.678 depositado em 22 de Setembro de 2006, o qual é incorporado por referência em sua totalidade. Um rótulo ou molécula de captura ou uma sonda ou uma molécula sonda ou uma sonda molecular é entendido como denotando uma molécula ou um complexo o qual é usado para a detecção de outra molécula em virtude de um comportamento de ligação característico ou uma reatividade particular. Compostos sonda exemplificativos incluem biopolímeros, tais como peptídeos, proteínas, antigenos, anticorpos, carboidratos, ácidos nucleicos e/ou análogos dos mesmos e/ou polímeros misturados dos biopolímeros mencionados acima.

Marcadores ou rótulos detectáveis que podem ser usados de acordo com a invenção incluem qualquer composto o qual gera, direta ou indiretamente, um composto ou sinal detectável em uma reação química, física ou enzimática. De preferência, os rótulos podem ser selecionados, inter alia, a partir de rótulos enzimáticos, rótulos coloridos, rótulos fluorescentes, rótulos cromogênicos, rótulos luminescentes, rótulos radioativos, haptenos, biotina, complexos de metal, metais e ouro coloidal, com rótulos fluorescentes sendo particularmente preferidos. Todos esses tipos de rótulos são bem estabelecidos na técnica. Um exemplo de uma reação física que é mediada por tais rótulos é a emissão de fluorescência. Conseqüentemente, os rótulos ópticos podem ser rótulos fluorescentes.

Os métodos podem ainda compreender rotulação de um analito com um primeiro rótulo óptico e um segundo rótulo óptico, em que os primeiro e segundo rótulos ópticos são diferentes. Os primeiro e segundo — rótulos ópticos podem ser primeiro e segundo róLulos fluorescentes os quais têm comprimentos de onda de emissão distintos. O rótulo pode ser u anticorpo. Por exemplo, o método pode ainda compreender rotulação do analito com um primeiro anticorpo fluorescente como um rótulo óptico e um segundo anticorpo fluorescente, em que os primeiro e segundo anticorpos fluorescentes têm comprimentos de onda de emissão distintos.

Detecção do analito pode incluir registro de uma primeira imagem do analito em um comprimento de onda de emissão do primeiro anticorpo fluorescente; leitura de uma segunda imagem do analito no comprimento de onda de emissão do segundo anticorpo fluorescente; e comparação das primeira e segunda imagens.

Os métodos podem ainda compreender detecção de complexos 5 presentes dentro de cada um de diferentes subconjuntos da mistura. Por exemplo, dentro de cada mistura do dispositivo microfluídico, partículas, se presentes, podem se combinar com o rótulo detectável para formar complexos. Após um período de incubação adequado para permitir formação de complexo, a presença de complexos é detectada. Exemplos de detecção de complexos são descritos no Pedido de Patente Internacional PCT/BP2006/068153, o qual é incorporado por referência em sua totalidade.

Um volume total dos múltiplos subconjuntos diferentes pode ser de pelo menos 90% de um volume da amostra líquida introduzida no dispositivo microfluídico.

Os métodos podem ainda compreender introdução de um volume V de amostra líquida no dispositivo microfluídico, em que um volume total da mistura pode ser de pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% do volume V.

Os métodos podem ainda compreender detecção de complexos presentes dentro de pelo menos 10% do volume total da mistura, por exemplo, dentro de 10% a 90%, 15% a 50% ou 20% a 30% do volume total da mistura.

——---------O canal microfluídico pode incluir uma entrada e uma região de detecção em comunicação de fluido com a entrada. Ainda, o canal microfluídico pode ser um canal microfluídico de um dispositivo microfluídico.

Os métodos podem primeiro compreender, antes de introdução de uma amostra líquida em um canal microfluídico, introdução de uma amostra líquida em um orifício de um capilar.

O capilar é, tipicamente, um capilar padrão (por exemplo, um capilar end to end, tal como um capilar plástico). Um capilar end to end inclui um orifício interno e primeira e segunda aberturas em uma extremidade do orifício. O orifício do capilar pode compreender um inibidor de coagulação, tal como heparina. Por exemplo, o capilar pode ser revestido com anti-coagulante, tal como com heparina. Em geral, o orifício do capilar é configurado para conter um volume total V de amostra líquida. O volume V é, tipicamente, cerca de 25 microlitros ou menos (por exemplo, cerca de 20 microlitros ou menos, cerca de 15 microlitros ou menos, cerca de 10 microlitros ou menos, cerca de 5 microlitros ou menos). Em geral, o volume V é cerca de 1 microlitro ou mais (por exemplo, cerca de 3 ou 5 ou 7,5 microlitros ou mais).

Os métodos podem ainda compreender, intermediariamente às etapas de introdução da amostra líquida no orifício do capilar e introdução da amostra líquida no canal microfluídico, da amostra líquida restante dentro do capilar.

Os métodos podem ainda compreender detecção óptica de um sinal indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro de um subconjunto da amostra líquida, o subconjunto estando presente dentro de uma zona de detecção ou região de detecção do dispositivo microfluídico.

Em algumas modalidades, a saída do capilar se abre para uma câmara de reação com um volume predeterminado, por exemplo, de cerca de 5 pL, 10 pL ou 20 pL. Em algumas modalidades, a câmara de reação inclui uma pelota de reagente. A pelota de reagente pode incluir rótulos, por exemplo, anticorpos rotulados com um corante fluorescente e tendo uma afinidade por antígenos a serem detectados dentro da amostra. Por exemplo, para detecção de uma série de células T auxiliares em uma amostra líquida, a pelota de reagente pode incluir um anticorpo anti-CD4+ rotulado com um primeiro corante fluorescente (tal como ficoeritrina) e um anticorpo antiCD3+ rotulado com um segundo corante fluorescente, tal como sais (ficoeritrina-Cy5) e reagentes de estabilização, etc. Em algumas modalidades, a superfície interna da primeira zona é coberta com reagentes necessários para processamento da amostra. Um ensaio exemplificativo para detecção de partículas, tais como células em uma amostra líquida, é descrito, por exemplo, no WO 2007/051861, o qual é incorporado por referência em sua totalidade. Conforme descrito no WO 2007/051861, detecção pode ocorrer no canal microfluídico. Assim, o canal microfluídico é pelo menos parcialmente transparente opticamente. Por exemplo, o canal microfluídico pode ser coberto por uma camada pelo menos parcialmente transmissível opticamente.

Introdução da amostra líquida pode ser realizada através de compressão da parede elasticamente deformável. Compressão da parede elasticamente deformável pode compreender compressão de uma primeira porção do circuito de fluido e, sem primeiro liberar completamente a compressão, mover um local da compressão ao longo do circuito de fluido em uma quantidade suficiente para realizar as etapas de deslocamento e introdução.

Os métodos podem ainda compreender realização da etapa de detecção óptica de um sinal indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro do diferente subconjunto primeiro com liberação completa da compressão.

Os métodos podem ainda compreender, intermediariamente às pelo menos a porção da amostra líquida no canal microfluídico, de impedir a amostra líquida de sair do capilar.

Em algumas modalidades, uma região de detecção do canal microfluídico não suporta fluxo capilar da amostra líquida.

Ainda, pelo menos uma parte de uma superfície interior do canal microfluídico pode ser hidrofóbica.

Os métodos podem ainda compreender movimento de pelo menos um do dispositivo microfluídico e um detector óptico um com relação ao outro e, subseqüentemente, detecção de um sinal óptico indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro de um subconjunto diferente da amostra líquida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 ilustra um dispositivo microfluídico.

A Fig. 2 é uma vista lateral do dispositivo microfluídico da

Fig. 1.

A Fig. 3a mostra vistas superiores de duas zonas de teste do dispositivo microfluídico da Fig. 1.

As Figs. 3b a 3g ilustram um método para formação da zona de teste da Fig. 3 a.

As Figs. 4 e 5 são vistas laterais de um sistema configurado para operar o dispositivo microfluídico da Fig. 1. A Fig. 5 é apenas uma vista lateral parcial.

A Fig. 6 ilustra dados de intensidade de fluorescência como uma função da posição ao longo de um canal do dispositivo microfluídico da Fig. 1.

A Fig. 7 ilustra um dispositivo microfluídico.

As Figs. 8a e 8b são, cada uma, vistas superiores de duas zonas de teste do dispositivo microfluídico da Fig. 7.

----------A Fig. 9 ilustra um dispositivo microfluídico.

A Fig. 10a é uma vista lateral seccional transversal do dispositivo microfluídico da Fig. 9 e também ilustra um tubo capilar contendo material de amostra líquida.

A Fig. 10b ilustra o dispositivo microfluídico da Fig. 10a com o tubo capilar tendo sido conectado a uma entrada do dispositivo microfluídico, a amostra líquida não tendo entrado em uma rede microfluídica do dispositivo microfluídico.

A Fig. 10c ilustra o dispositivo microfluídico da Fig. 10b com uma porção da amostra líquida tendo sido extraída do capilar de amostra para a rede microfluídica do dispositivo microfluídico.

A Fig. lOd ilustra o dispositivo microfluídico da Fig. 10c com a etapa de extração da amostra líquida do capilar de amostra para a rede microfluídica do dispositivo microfluídico tendo sido terminada.

A Fig. lOe ilustra o dispositivo microfluídico da Fig. lOd com uma porção da amostra líquida sendo movida uma distância Δ1 ao longo de um comprimento da rede microfluídica.

A Fig. lOf ilustra o dispositivo microfluídico da Fig. lOe e detecção de um analito presente dentro de uma porção da amostra líquida.

A Fig. 11 ilustra um sistema de operação para operação do dispositivo microfluídico de qualquer uma das Figs. 1, 7 e 9. O sistema de operação pode incluir qualquer uma ou todas as características do sistema de operação das Figs. 4 e 5.

As Figs. 12A-12D mostram uma representação esquemática de um circuito microfluídico.

As Figs. 13A-13B mostram vistas em corte de um cartucho tendo um circuito de fluido.

As Figs. 14A-14B mostram vistas em corte de um detector de fluorescência.

—------^L----------A Fig. 15 mostra um esquema do trajeto óptico de um detector.

As Figs. 16A-16B mostram representações de um ensaio de contagem de célula usando um detector de fluorescência.

A Fig. 17 mostra uma sobreposição de duas imagens derivadas de um ensaio de contagem de célula usando um detector de fluorescência. DESCRIÇÃO DETALHADA

Um método para ensaio de uma amostra para determinar a presença (por exemplo, qualitativa e/ou quantitativamente) de múltiplos analitos inclui introdução de uma amostra em um canal de um dispositivo microfluídico. O dispositivo microfluídico pode ter um único canal ou múltiplos canais, dependendo do design e complexidade do ensaio. Em algumas modalidades, o canal pode ser definido entre superfícies internas opostas de primeiro e segundo substratos do dispositivo.

Em geral, um dispositivo para realização de ensaios pode incluir um trajeto de fluxo microfluídico que está ligado a pelo menos uma superfície deformável. Por exemplo, onde o trajeto de fluxo microfluídico é definido como estando entre superfícies internas opostas de primeiro e segundo substratos do dispositivo. O segundo substrato pode ser relativamente flexível comparado com o primeiro substrato. Em outro exemplo, uma porção do trajeto de fluxo microfluídico pode incluir uma zona compressível. A zona compressível pode ser um comprimento do circuito de fluido ao longo do qual pelo menos uma parede do circuito é compressível ou deformável. Quando uma força compressiva localizada é aplicada à superfície deformável, a superfície deforma. Sob uma força suficiente, a superfície deformável pode ser comprimida até um grau que interrompe do trajeto de fluxo microfluídico. Movimento do local da deformação de superfície com relação ao trajeto de fluxo microfluídico pode mover o líquido dentro do trajeto de fluxo microfluídico, particularmente quando a superfície deformável é comprimida até um grau que interrompe o trajeto de fluxo microfluídico.---------------------------------------------------------Em algumas modalidades, o segundo substrato pode ser relativamente flexível comparado ao primeiro substrato. Múltiplas zonas de teste podem ser espaçadas ao longo do canal. Cada zona de teste inclui um composto sonda imobilizado configurado para participar em um ensaio para um respectivo analito. Tipicamente, cada ensaio inclui interação de um composto sonda com o respectivo analito ou com um respectivo complexo incluindo o analito e um reagente (por exemplo, um rótulo óptico).

Para determinar o resultado do ensaio para cada zona de teste, a superfície externa do segundo substrato pode ser submetida a uma força compressiva localizada. A força compressiva causa uma redução localizada da distância que separa as superfícies internas dos primeiro e segundo substratos. O local da redução de distância localizada se sobrepõe a uma zona de detecção óptica definida dentro do canal. À medida que a distância é reduzida, material móvel (por exemplo, amostra, sondas ópticas não ligadas e/ou reagentes) é deslocado entre os substratos na zona de detecção. O dispositivo microfluídico sofre translação, de modo que as zonas de teste passam seqüencialmente através da zona de detecção. Para cada zona de teste, o resultado do ensaio é opticamente determinado (por exemplo, através de fluorescência) à medida que a zona de teste passa através da zona de detecção. A presença de cada analito é determinada (por exemplo, quantitativa e/ou qualitativamente) baseado no resultado do ensaio.

Os resultados do ensaio podem, tipicamente, ser determinados sem primeiro contatar as zonas de teste com uma solução de lavagem após contato das zonas de teste com a amostra.

Os analitos a serem determinados podem ser selecionados conforme desejado. Por exemplo, os analitos podem se relacionar à medicina (por exemplo, diagnóstico); pesquisa (por exemplo, descoberta de droga), indústria (por exemplo, monitoramento de qualidade da água ou alimento) ou ciência tivos ar serem determinados incluem marcadores (por exemplo, marcadores diagnósticos ou marcadores prognósticos) de condições fisiológicas, tal como doenças. Tais marcadores incluem marcadores cardíacos (por exemplo, peptídeos natriuréticos e membros da família troponina), marcadores de câncer (por exemplo, proteínas da matriz nuclear), marcadores genéticos (por exemplo, polinucleotídeo), marcadores de sépsis, marcadores neurológicos e marcadores indicativos de condições patogênicas. Os analitos podem ser indicativos da presença de patógenos (por exemplo, bactérias, vírus ou fungos).

Os compostos sonda das zonas de teste podem ser selecionados conforme desejado, baseado nos analitos a serem determinados.

Compostos sonda exemplificativos incluem polinucleotídeos, anticorpos e proteínas.

O líquido de amostra pode ser selecionado conforme desejado, baseado nos analitos a serem determinados. Amostras exemplificativas incluem água, soluções aquosas, soluções orgânicas, soluções inorgânicas, fluidos corporais de seres humanos e outros animais, por exemplo, urina, escarro, saliva, fluido cérebro-espinhal, sangue íntegro e materiais derivados de sangue, tais como plasma e soro.

Fazendo referência às Figs. 1, 2 e 4, um dispositivo microfluídico 100 e um sistema de operação 500 podem ser usados para ensaiar uma amostra a fim de determinar a presença (por exemplo, qualitativa e/ou quantitativamente) de múltiplos analitos. O dispositivo microfluídico 100 inclui primeiro e segundo substratos 102, 104 que definem uma rede microfluídica 107 incluindo uma entrada 106 e, em comunicação com a mesma, um canal 110 e um reservatório 108. Múltiplas zonas de teste 112i espaçadas estão dispostas dentro do canal 110. Cada zona de teste 112i inclui um ou mais reagentes (por exemplo, compostos sonda) configurados para participar em um ensaio para um analito. O canal 110 também inclui uma zona de referênc i all 7. O di spositi vo 100 também inc lui um p adrão de referência 114 incluindo múltiplos sinais indicativos 116j. O padrão de referência 114 proporciona informação relacionada às propriedades espaciais das zonas de teste 112i.

O sistema de operação 500 inclui um alojamento 502, um detector 504, um leitor de padrão de referência 506 e um processador em comunicação com o detector 504 e leitor de padrão 508. O detector 504 é um detector de fluorescência óptica que detecta a interação entre uma amostra e as zonas de teste 112i. O detector 504 inclui uma fonte de luz 550 (por exemplo, um diodo que emite luz ou um diodo a laser) e um detector sensível à luz de grandeza zero 552 (por exemplo, um tubo fotomultiplicador ou um fotodiodo, tal como um fotodiodo de avalanche). O leitor de padrão de referência 506 lê o padrão de referência 114 do dispositivo 100 durante operação do sistema 500.

Será discutido agora o dispositivo microfiuídico 100 e o sistema 500 em maiores detalhes.

O primeiro substrato 102 é, tipicamente, transmissível opticamente (por exemplo, transparente) com relação a um comprimento de onda de luz útil para excitação e detecção de fluorescência a partir de rótulos fluorescentes. Por exemplo, o primeiro substrato 102 pode transmitir pelo menos cerca de 75% (por exemplo, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%) de luz incidente em pelo menos uma faixa de comprimento de onda entre cerca de 350 nm e cerca de 800 nm. O primeiro substrato 102 pode ser formado, por exemplo, de um polímero, vidro ou sílica. O segundo substrato 104 é, tipicamente, formado de um material maleável ou flexível (por exemplo, um polímero elastomérico). O primeiro substrato 102 pode ser menos flexível do que o segundo substrato 104. Por exemplo, o primeiro substrato 102 pode ser substancialmente rígido (por exemplo, suficientemente rígido para facilitar manipulação do dispositivo 100).

-----O canal 110 é um canal capilar. Uma amostra 113 aplicada à entrada 106 migra ao longo do canal 110 através de força capilar. O canal 110 é orientado ao longo de um eixo principal al. O reservatório 108 inclui uma abertura 111 para impedir desenvolvimento de gás na frente da amostra.

Cada zona de teste 112i inclui, tipicamente, um reagente (por exemplo, um composto sonda) configurado para proporcionar uma interação detectável na presença de um analito. A interação pode incluir, por exemplo, ligação de um analito correspondente a um composto sonda do local de teste e/ou uma reação química entre o analito correspondente e o composto sonda. A reação resulta em um produto detectável (por exemplo, um precipitado). Compostos sonda exemplificativos incluem proteínas, anticorpos e polinucleotídeos. Compostos sonda adequados para determinação da presença de um analito são descritos no pedido provisório U.S. 60/826.678, depositado em 22 de Setembro de 2006, o qual é incorporado por referência em sua totalidade.

Fazendo referência também à Fig. 3a, cada zona de teste 112i é alongada tendo um eixo principal a2 orientado geralmente perpendicular a um eixo principal al do canal 110. Tipicamente, uma proporção de um comprimento ao longo de um eixo principal a2 para uma largura w ao longo de uma dimensão perpendicular das zonas de teste 112 é pelo menos 2,5 (por exemplo, pelo menos 5). O comprimento ao longo do eixo 2a é, tipicamente, pelo menos cerca de 200 pm (por exemplo, pelo menos cerca de 350 mícrons) e, tipicamente, cerca de 2000 pm ou menos (por exemplo, cerca de 1000 pm ou menos, cerca de 750 pm ou menos). A largura w é, tipicamente, pelo menos cerca de 25 pm (por exemplo, pelo menos cerca de 50 mícrons) e, tipicamente, cerca de 500 pm ou menos (por exemplo, cerca de 250 pm ou menos, cerca de 150 pm ou menos). Em uma modalidade exemplificativa, as zonas de teste 112 têm cerca de 500 pm de comprimento e cerca de 100 pm de largura.

--------Conforme visto na Fig. 2, ns zonas dértesteYT2í são espaçadas das zonas de teste adjacentes por uma distância d7 ao longo do canal 110. A distância d7 entre as zonas de teste 112i é discutida ainda abaixo com relação a uma zona de detecção do detector 504.

As zonas de teste 112i podem ser formadas conforme desejado. Em geral, os reagentes são contatados com o primeiro substrato. Então, os reagentes e substrato sofrem translação relativa lateralmente para formar uma zona de teste alongada.

Fazendo referência às Figs. 3b-3g, um método para formação de zonas de teste 112i inclui distribuição de reagentes a partir de um spotter para capilar 400 sobre um primeiro substrato 102. Na Fig. 3b, uma quantidade (por exemplo, entre cerca de 2 e 8 pl, entre cerca de 3 e 5 μΐ) de solução reagente 402, contendo um ou mais compostos sonda, é introduzida em uma ponta distai 404 de um capilar de um spotter para capilar. A ponta distai 404 tem, tipicamente, um diâmetro de entre cerca de 80 e 120 pm (por exemplo, cerca de 100 pm). Solução reagente 402 e substrato 102 são inicialmente separados (por exemplo, não em contato) por uma distância dl. Tipicamente, dl é pelo menos cerca de 250 pm (por exemplo, cerca de 500 pm).

Na Fig. 3c, a ponta 404 e substrato 102 são mantidos em uma menor separação d2, de modo que a solução reagente 402 contata um local do substrato 102. Na menor separação d2, a ponta distai 404 está adjacente ao local do substrato 102 (por exemplo, tocando, de modo que d2 seja zero). A ponta distai 404 e substrato 102 são mantidos durante um tempo (por exemplo, cerca de 1 segundo ou menos, cerca de 0,5 segundos ou menos, cerca de 0,25 segundos ou menos) na separação d2 na posição adjacente (por exemplo, tocando). Em algumas modalidades, o tempo durante o qual a ponta distai 402 é mantida na posição adjacente (por exemplo, tocando) é indistinguível de zero.

---------Na Fig. 3d, a ponta distai 404 e substrato 102 são movidos para uma separação intermediária d3 na qual a ponta distai 404 e o substrato permanecem conectados através da solução reagente 402 da ponta distai 404. Tipicamente, a separação intermediária d3 tem cerca de 20 pm.

Na Fig. 3e, a ponta distai 404 e substrato 102 são mantidos na separação intermediária d3 durante um tempo de incubação, de modo que pelo menos um pouco (por exemplo, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 40%) da solução reagente 402 na ponta distai evapora, de modo que apenas uma porção restante 402' de solução reagente 402 resta, tipicamente, apenas cerca de 75% ou menos (por exemplo, cerca de 50% ou menos) de solução reagente 402 evapora para deixar solução 402' restante. O tempo de incubação depende da natureza da solução 402 (por exemplo, a concentração de composto sonda e pressão de vapor do solvente) e ambiente da ponta distai 404 (por exemplo, a umidade relativa e temperatura). Tempos de incubação típicos são mais longos (por exemplo, pelo menos 5 vezes mais longo, pelo menos 10 vezes mais longo, pelo menos 20 vezes mais longo, pelo menos cerca de 35 vezes mais longo) do que o período de tempo durante o qual a ponta e o substrato estão na posição d2 adjacente. Tempos de incubação exemplificativos são pelo menos cerca de 5 segundos (por exemplo, pelo menos cerca de 10 segundos, pelo menos cerca de 20 segundos, pelo menos cerca de 25 segundos).

Na Fig. 3f, após o tempo de incubação na separação intermediária 3 d, pelo menos um da ponta distai 404 e substrato 102 são movidos lateralmente um com relação ao outro para distribuir solução reagente 402' ao longo de um eixo principal a2. Na Fig. 3g, ao término do movimento lateral, a ponta distai 402 e substrato 102 são separados, de modo que eles não estão mais conectados pela solução reagente. Por exemplo, a ponta distai 404 e substrato 102 podem ser retomados para a separação dl inicial. O método pode ser repetido (por exemplo, usando uma solução de teste alongadas em cada um de múltiplos locais do substrato.

Em geral, a separação vertical da ponta distai e substrato é alterada movendo a ponta distai com relação ao substrato. Em geral, a translação lateral da ponta distai e substrato é realizada fazendo translação do substrato com relação à ponta distai. Soluções reagentes, compostos sonda e dispositivos de distribuição exemplificativos são descritos no pedido provisório U.S. 60/826.678, depositado em 22 de Setembro de 2006, o qual é incorporado por referência em sua totalidade.

Conforme observado na Fig. 3a e também se referindo às Figs. 8a e 8b, o método para produção de zonas de teste alongadas 112i proporciona uma distribuição mais homogênea de compostos sonda do que um método de distribuição que omite a etapa de movimento lateral da ponta distai e substrato. As zonas de teste 112i incluem uma primeira porção 119 e uma segunda porção 121. A distribuição de compostos sonda na primeira porção 119 é mais homogênea do que na segunda porção 121 ou nas zonas de teste 312i, as quais foram preparadas sem a etapa de movimento lateral.

Retomando à Fig. 1, a zona de referência 117 produz uma resposta detectável pelo detector 504 independente da presença de qualquer analito em uma amostra. A zona de referência 117 inclui, tipicamente, um meio fluorescente (por exemplo, um polímero ou molécula fluorescente imobilizada). A zona de referência 117 é discutida ainda abaixo com relação à operação do sistema 500.

Sinais indicativos 116j de padrão de referência 114 são configurados para serem lidos pelo leitor de padrão de referência 506 do sistema 500. Sinais indicativos 116j são compostos de material magnético (por exemplo, tinta magnética). O leitor de padrão 506 pode detectar a presença de sinais indicativos 116j. O padrão de referência 114 é discutido ainda abaixo com relação à operação do sistema 500.

------Retornando à Fig.

sistema de operação 500 inclui uma abertura 510 para receber o dispositivo 100, um sistema de compressão incluindo um rolo de compressão 516 e rolos de suporte 518, 520 e um acionador de translação 512 incluindo uma mola amortecida 514. Quando o dispositivo 100 é recebido dentro do alojamento 500, o detector 504 define uma zona de detecção óptica 524 dentro do canal 110. Em uso, o dispositivo 100 sofre translação com relação à zona de detecção 524. Zonas de teste 112i passam seqüencialmente para dentro e para fora da zona de detecção. O detector 504 detecta seqüencialmente a interação entre uma amostra e zonas de teste 112i sucessivas. O detector 504 também capta a zona de referência 117.

Fazendo referência à Fig. 6, o detector 504 produz um sinal

600 como uma função da distância (relativa ou absoluta) de que o dispositivo

100 sofre translação. O sinal 600 inclui um pico 617 indicativo da zona de referência 117 e picos 612i indicativos da interação em cada zona 112i. Simultaneamente, o leitor de padrão 506 produz um sinal 602 indicativo de sinais indicativos 116i como uma função da distância que o dispositivo 100 sofre translação. Em virtude do fato de os sinais indicativos 116i serem relacionados espacialmente com as zonas de teste 112i, o processador 508 pode determinar quando a zona de detecção 524 coincide com uma zona de teste particular mesmo se essa zona de teste não exibe sinal (por exemplo, conforme para a zona de teste 112a, a qual exibe um sinal 612a que é indistinguível de zero). A zona de referência 117 e o sinal 617 correspondente podem ser usados alternadamente ou em combinação com o sinal 602 para determinar quais regiões de sinal 600 correspondem à zonas de teste particulares.

Em seguida, foi discutido o sistema de compressão. Em uso, o sistema de compressão comprime o dispositivo 100 para reduzir a distância entre os substratos 102, 104 dentro do canal 110. Quando o dispositivo 100 é —— recebido dentro do alojamento 102, uma superficie externa 132 do primeiro substrato 102 é orientada em direção aos rolos de suporte 518, 520 e uma superficie externa 134 do segundo substrato 104 é orientada em direção ao rolo compressor 516. Uma distância d4 entre os rolos de suporte 518, 520 e o rolo de compressão 516 é menos do que uma espessura tl (Fig. 5) do dispositivo 100. Em virtude do fato de o segundo substrato 104 ser relativamente flexível quando comparado com o primeiro substrato 102, o rolo de compressão 516 comprime o segundo substrato 104, causando uma redução local na distância d6 entre a superfície interna 103 do segundo substrato 104 e a superfície interna 105 do primeiro substrato 102.

No estado relaxado (por exemplo, estado não comprimido) (Fig. 2), a distância d6 é, tipicamente, pelo menos cerca de 25 pm (por exemplo, pelo menos cerca de 50 pm, pelo menos cerca de 75 pm). No estado não comprimido, a distância d6 é, tipicamente, cerca de 500 pm ou menos (por exemplo, cerca de 250 pm ou menos). No estado de distância localmente reduzida (por exemplo, estado localmente comprimido) (zona de teste 112e na Fig. 4), a distância d6 é, tipicamente, cerca de 15 pm ou menos (por exemplo, cerca de 10 pm ou menos, cerca de 5 pm ou menos, por exemplo, cerca de 2,5 pm ou menos). Exemplos de detecção de fluorescência realizada entre superfícies separadas por um estado de distância reduzida são descritos na continuação U.S. do Pedido de Patente Internacional PCT/EP2005/004923, o qual é incorporado por referência em sua totalidade.

Conforme visto nas Figs. 4 e 5, o sistema de compressão reduziu a distância d8 dentro do canal 100 apenas sobre uma porção do comprimento do canal 110. Tipicamente, a distância d8 é cerca de 5 vezes o comprimento ou menos (por exemplo, cerca de 3 vezes o comprimento ou menos, cerca de 2 vezes o comprimento ou menos, cerca do mesmo) que a distância d7 que separa as zonas de teste 112i.

Tipicamente, a distância d7 é larga o bastante, de modo que a

504 abrange menos do que todas (por exemplo, 5 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos) as zonas de teste 112i dentro do canal 110. Em uma modalidade exemplificativa, d7 é larga o bastante para que uma largura da zona de detecção 524 ao longo do eixo principal al do canal 110 não contate simultaneamente mais de 3 (por exemplo, não mais do que duas, não mais do que uma) zonas de teste 112i. Uma largura da zona de detecção 524 perpendicular ao eixo principal al do canal 110 é, tipicamente, cerca da mesma ou menor do que (por exemplo, não mais do que 75% de, não mais do que 50% de, não mais do que 30% de) o comprimento das zonas de teste 112i ao longo do eixo a2 das mesmas.

Em uso, líquido de amostra é aplicado à entrada 106. A força capilar extrai a amostra ao longo do canal 110 em direção ao reservatório 108. O líquido de amostra contata as zonas de teste 112i ao longo do canal 110. Analitos dentro da amostra interagem com compostos sonda das zonas de teste. Após um tempo de incubação adequado, o dispositivo 100 é inserido no alojamento 500 para comprimir a mola 514 do acionador de translação 512. Durante inserção do dispositivo 100, o rolo de compressão 516 e rolos de suporte 520 são espaçados, de modo que o dispositivo 100 não é comprimido. Uma vez que o dispositivo 100 está totalmente inserido, a zona de detecção 524 é posicionada sobrepondo aproximadamente a zona de referência 117. O rolo de compressão 516 comprime localmente o canal 110 (Fig. 5).

Quando as interações entre os analitos da amostra e as zonas de teste 112i estão prontas para ser determinadas (por exemplo, após um período de incubação), o acionador de translação 512 realiza translação do dispositivo 100 com relação à zona de detecção 524 do detector 524 (Fig. 4). Zonas de teste 112i passam seqüencialmente através da zona de detecção 524 e são iluminadas com luz da fonte de luz. O rolo de compressão 516 está disposto de modo que a redução localizada da distância d6 corresponde espacialmente à zona de detecção 524. Conseqüentemente, o detector de luz detecta seqüencialmente a luz das zonas de teste 112i enquanto cada uma está no estado de distância localmente reduzida (por exemplo, estado localmente reduzido) (zona de teste 112e na Fig. 4). A fluorescência proveniente de cada zona de teste pe coletada por uma lente e detectada por um detector de luz. A redução localizada seqüencial da distância d6 e determinação óptica continuam até que cada zona de teste tenha sofrido translação através da zona de detecção 524.

Além dos compostos sonda de cada uma das zonas de teste e analitos, outros materiais estão presentes no canal 110 entre a superfície interna 103 do segundo substrato 104 e superfície interna 105 do primeiro substrato 102. Exemplos de tais materiais incluem concomitantes de amostra e reagentes (por exemplo, sondas ópticas não ligadas ou não reagidas). Esses materiais produzem, tipicamente, emissão de fundo (por exemplo, fluorescência ou luz dispersa) que não está associada à interação da amostra com as zonas de teste 112i. A intensidade da emissão de fundo é geralmente proporcional à quantidade de tais materiais que restam entre as superfícies internas no local correspondendo à zona de detecção 524. A intensidade do sinal óptico que é indicativo da interação em cada zona de teste, contudo, está espacialmente localizada na proximidade dessa zona de teste. O detector recebe e detecta a fluorescência indicativa da interação e a emissão de fundo.

Fazendo referência às Figs. 9, 10a e 11, um dispositivo microfluídico 700 e um sistema de operação 500' podem ser usados para ensaiar uma amostra a fim de determinar a presença (por exemplo, qualitativa e/ou quantitativamente) de um ou mais analitos. Em uma modalidade típica, um ou mais dos analitos compreendem partículas tais como vírus, bactérias, células, fungos ou esporos. Por exemplo, qualquer uma das partículas descritas no Pedido de Patente Internacional PCT/EP2006/068153 (o qual é incorporado por referência em sua totalidade) pode ser detectada.

O dispositivo microfluídico 700 inclui primeiro e segundo substratos 702, 704 que definem uma rede microfluídica 707 incluindo uma entrada 706 e, em comunicação com a mesma, múltiplos canais 710a, 710b, 710c, cada um tendo um respectivo reservatório 708a, 708b, 708c. Cada reservatório inclui um material reagente 709a, 709b, 709c (por exemplo, um composto sonda) configurado para participar em um ensaio para um analito. O dispositivo 700 inclui um padrão de referência 114 incluindo múltiplos sinais indicativos 116j (não mostrados nas Figs. 9, 10a, 11) os quais podem ser os mesmos conforme aqueles discutidos acima.

O sistema de operação 500' inclui um alojamento 502', um detector 504', um leitor de padrão de referência (não mostrado) e um processador em comunicação com o detector 504' e leitor de padrão. O detector 504 é um detector de fluorescência óptica que detecta complexos compreendendo um analito (por exemplo, uma partícula) e um rótulo detectável (por exemplo, um rótulo óptico). Exemplos de rótulos adequados são descritos no Pedido de Patente Internacional PCT/EP2006/068153, o qual é incorporado por referência em sua totalidade. O detector 504' inclui uma fonte de luz 550' (por exemplo, um diodo que emite luz ou diodo a laser) e um detector óptico 552' (por exemplo, um detector de primeira grandeza, tal como uma série de diodos ou um detector multidimensional (por exemplo, um detector de formação de imagem, tal como um detector acoplado à carga)). O detector óptico, típica e de modo seletivamente espaçado, detecta luz de uma respectiva zona de detecção definida dentro de cada canal do dispositivo microfluídico.

Será discutido agora o dispositivo microfluídico 700 e o sistema 500' em maiores detalhes.

O primeiro substrato 702 é, tipicamente, opticamente transmissivo (por exemplo, transparente) com relação a um comprimento de onda de luz útil para excitação e detecção de fluorescência a partir de rótulos fluorescentes. Por exemplo, o primeiro substrato 702 pode transmitir pelo menos cerca menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%) de luz incidente em pelo menos uma faixa de comprimento de onda entre cerca de 350 nm e cerca de 800 nm. O primeiro substrato 702 pode ser formado, por exemplo, de um polímero, vidro ou sílica. O segundo substrato 704 é, tipicamente, formado de um material flexível ou maleável (por exemplo, um polímero elastomérico). O primeiro substrato 702 pode ser menos flexível do que o segundo substrato 704. Por exemplo, o primeiro substrato 702 pode ser substancialmente rígido (por exemplo, suficientemente rígido para facilitar manipulação do dispositivo 700).

Canais 710a-710c suportam, tipicamente, o movimento de amostra líquida nos mesmos mas, tipicamente, não são canais capilares (isto é, tipicamente, líquido não se move dentro dos canais do dispositivo 700 através de ação capilar). Por exemplo, uma ou superfícies internas dos canais podem ser hidrofóbicas para inibir movimento capilar da amostra líquida. Altemativamente ou em combinação, as dimensões internas dos canais podem ser muito grandes para permitir que forças capilares acionem movimento substancial da amostra nos mesmos. Naturalmente, em algumas modalidades, os canais podem ser canais capilares.

O dispositivo 700 é mostrado com 3 canais e reservatórios correspondentes mas, em geral, tem um número N de canais e reservatórios correspondentes, onde N é pelo menos 1 e é, tipicamente, menos do que 20.

Cada reservatório 708i inclui, tipicamente, um reagente 735i (por exemplo, um rótulo detectável, tal como um rótulo óptico) configurado para proporcionar uma interação detectável na presença de um analito. A interação pode incluir, por exemplo, ligação de um analito correspondente a um rótulo para formar um complexo compreendendo o analito e um ou mais dos rótulos. Exemplos de tais complexos são descritos no Pedido de Patente Internacional PCT/EP2006/068153 (o qual é incorporado por referência) em sua totalidade. Cada reagente é, tipicamente, configurado para permitir detecção de um analito diferente.------------------------------------------------------------------------Fazendo referência às Figs. 10b-lOf, o dispositivo 700 pode ser operado como segue. Uma quantidade de amostra líquida 738 (por exemplo, um líquido biológico, tal como sangue, saliva ou urina) é introduzido em um capilar 736. O capilar 737 é, tipicamente, um capilar padrão (por exemplo, um capilar extremidade-à-extremidade, tal como um capilar plástico). Um capilar extremidade-à-extremidade inclui um orifício interno e primeira e segunda aberturas, uma em cada extremidade do orifício.

O capilar pode ser revestido com anti-coagulante, tal como com heparina. Exemplos de capilares adequados incluem capilares revestidos com heparina de 20 μΐ disponíveis da Kabe Labortechnik (Nümbrecht-Elsenroth, Qeutschland; http://www.kabelabortechnik.de/index.php?sprache=de&akt seite=startseite produkte.php).

Em geral, o orifício do capilar é configurado para conter um volume total VV de amostra líquida. O volume V é, tipicamente, cerca de 20 microlitros ou menos (por exemplo, cerca de 20 microlitros ou menos, cerca de 15 microlitros ou menos, cerca de 10 microlitros ou menos). Em geral, o volume V é cerca de 5 microlitros ou mais (por exemplo, cerca de 7,5 microlitros ou mais).

Conforme visto na Fig. 10b, a entrada 706 do dispositivo 700 é configurada para acomodar o capilar 736. Amostra 737, tipicamente, permanece dentro do capilar 736 e não entra no dispositivo microfluídico até submetida a uma força de introdução.

Conforme visto na Fig. 10c, uma força de introdução pode ser aplicada à amostra 737 através de redução de uma distância entre as superfícies internas de substratos 702, 704 para reduzir um volume dentro da rede microfluídica. Por exemplo, a Fig. 10c ilustra um rolo se movendo ao longo de uma porção da rede microfluídica. Tipicamente, a compressão faz com que as superfícies internas opostas contatem uma com a outra. À medida que o volume dentro do cana] aumenta após descompressão de uma determinada região de canal, uma redução na pressão do gás que atua sobre uma superfície interna 739 da amostra líquida 737 faz com que a amostra seja forçada para a rede microfluídica. A compressão e descompressão podem ser realizadas em um único movimento contínuo do roto 716 ao longo da rede microfluídica ou podem ser realizadas seqüencialmente em múltiplas etapas, conforme em um modo peristáltico.

Conforme visto na Fig. lOd, substancialmente todo (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, essencialmente todo) o volume V de amostra líquida 737 é extraído da rede microfluídica. Em uma modalidade exemplificativa, pelo menos 90% do volume V são extraídos da rede.

Amostra líquida, dentro da rede microfluídica, entra em cada um dos canais 71 Oi e reservatório 708i e mobiliza os reagentes dentro de cada reservatório para formar uma mistura. Tipicamente, formação da mistura é auxiliada por movimento macroscópico da amostra líquida dentro da rede microfluídica. Tal movimento macroscópico é, tipicamente, causado por compressão e descompressão do dispositivo microfluídico para reduzir uma distância intema entre os substratos 702, 704. A compressão e descompressão podem ser realizadas de um modo peristáltico através de movimentos repetidos de pelo menos um dos rolo 716 e dispositivo microfluídico 700 um com relação ao outro.

Em geral, o volume total das misturas formadas pela combinação de reagentes 73 5i nos N canais do dispositivo 700 inclui pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, essencialmente toda) da quantidade de amostra líquida introduzida no dispositivo 700. Em uma modalidade exemplificativa, o volume total das misturas formadas pela combinação de reagentes 735i nos N canais do dispositivo 700 inclui pelo menos cerca de 90% da quantidade de amostra líquida introduzida na dispositivo 700.

Dentro de cada mistura do dispositivo microfluídico, partículas, se presentes, se combinam com o rótulo detectável para formar complexos. Após um período de incubação adequado para permitir formação de complexo, a presença de complexos é detectada. Cada reagente 73 5i é, tipicamente, configurado para permitir detecção de um analito diferente. Exemplos de detecção de complexos são descritos no Pedido de Patente Internacional PCT/EP2006/068153, o qual é incorporado por referência em sua totalidade.

Fazendo referência à Fig. lOf, detecção ocorre, tipicamente, dentro de um subconjunto de cada mistura dentro do dispositivo. Em geral, detecção pode ser realizada dentro de múltiplos diferentes subconjuntos de cada mistura. Por exemplo, diferentes subconjuntos de cada mistura podem ser movidos através da zona de detecção por meio de movimento do rolo 716 em um estado comprimido para mover uma porção fresca da mistura para cada zona de detecção. Isso pode ser realizado múltiplas vezes, de modo que substancialmente toda (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, essencialmente toda) de cada mistura possa ser submetida à detecção. Nessa modalidade, detecção é realizada com o rolo 716 em um estado comprimido. A mistura que já foi submetida à detecção entre no capilar 736, o qual atua como um recipiente de resíduos.

Em algumas modalidades, detecção é realizada explorando o dispositivo 700 com relação ao detector óptico, de modo que cada detecção compreende, seqüencialmente, um subconjunto diferente da solução. Isso pode ser realizado múltiplas vezes, de modo que substancialmente toda (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, essencialmente toda) de cada mistura possa ser submetida à detecção.

Nessa modalidade, detecção é realizada com o rolo 716 em um estado descomprimido.

---------------Métodos e dispositivos para realização de ensaios foram descritos. Exemplos de outras modalidades são discutidas a seguir.

Embora a entrada 106 tenha sido descrita como uma abertura desobstruída, outras configurações são possíveis. Por exemplo, uma entrada pode ser configurada com uma adaptação para seringa (por exemplo, uma adaptação hermética a gás) para receber uma seringa. Altemativamente, uma entrada pode ser configurada como uma gaxeta através da qual uma amostra pode ser introduzida por uma agulha. Como outra alternativa, a entrada pode ser adaptada com uma válvula unidirecional que permite que amostra seja introduzida, mas não saia. Como outra alternativa, a entrada pode ser configurada para receber um capilar padrão (por exemplo, um capilar extremidade-à-extremidade, tal como um capilar plástico). O capilar pode ser revestido com anti-coagulante, tal como com heparina. Exemplos de capilares adequados incluem capilares revestidos com heparina de 20 μΐ disponíveis da Kabe Labortechnik (Nümbrecht-Elsenroth, Deutschland; http://www.kabe-iabortechnik.de/index.php7sprache- de&akt seite=startseite produkte.php).

Embora um dispositivo microfluídico tenha sido descrito que enche através de ação capilar, outras modalidades podem ser usadas. Por exemplo, o sistema 500 pode ser projetado para reduzir um volume interno da rede microfluídica antes de aplicação da amostra à entrada. Quando a amostra é aplicada, o volume interno é aumentado, desse modo, extraindo a amostra. Tal diminuição de volume pode ser obtida, por exemplo, com o rolo de compressão 516. Por exemplo, o dispositivo microfluídico pode ser recebido dentro do alojamento 500, de modo que a mola amortecida 514 do acionador de translação 512 esteja em um estado comprimido. O rolo de compressão 516 é posicionado para comprimir o dispositivo 100 em um local correspondendo ao reservatório 108. Essa compressão reduz um volume interno do reservatório 108. A redução de volume é cerca de tão grande quanto (por exemplo, pelo menos cerca de 25% maior do que, pelo menos 50% maior do que) o volume de amostra a ser recebido dentro do dispositivo 100. Com o reservatório 108 no estado comprimido, um volume de amostra é aplicado à entrada 106 do dispositivo 100. O rolo de compressão 516 é retraído para longe da entrada 106 em direção a uma extremidade oposta 137 do dispositivo 100. À medida que o rolo 516 se move para longe do reservatório 108, o reservatório descomprime, desse modo, aumentando o volume interno da rede microfluídica. O aumento de volume cria um vácuo que suga a amostra para o dispositivo.

Embora dispositivos microfluídicos tendo um canal capilar tenham sido descritos, outras modalidades podem ser usadas. Por exemplo, o canal pode incluir um meio que ocupa pelo menos uma parte (por exemplo, a maioria ou toda) a seção transversal do canal ao longo de pelo menos uma porção de seu comprimento. Tipicamente, o meio é um ao qual múltiplos compostos sonda podem ser imobilizados para definir respectivas zonas de teste espaçadas (por exemplo, volumes de captura), cada uma tendo locais de captura dispostos em três dimensões. Poros ou vazios no meio permitem que líquido penetre ao longo do canal (por exemplo, através de ação capilar). Movimento de líquido ao longo do canal pode ser auxiliado por ou induzido, por exemplo, através de geração de um vácuo dentro do canal, conforme descrito acima. Tipicamente, compostos sonda são imobilizados com relação ao meio poroso para definir zonas de teste espaçadas ao longo do canal. Interação de analitos com compostos sonda das zonas de teste pode ser determinada seqüencialmente conforme descrito para as zonas de teste 112i do dispositivo 100. Em virtude do fato de cada zona de teste estar disposta em três dimensões, redução da distância entre as superfícies internas opostas do canal diminui o volume de captura ocupado pelos compostos sonda imobilizados da zona de teste. Detecção óptica é realizada com a zona de teste no estado de volume reduzido (isto é, distância reduzida).

-------Embora zonas de teste 112i tenham sido mostradas como alongadas, outras configurações são possíveis. Por exemplo, fazendo referência à Fig. 7, um dispositivo microfluídico 300 inclui múltiplas zonas de teste 312i, cada uma tendo uma configuração geralmente circular. Não sendo uma diferença no formato, as zonas de teste 312i podem ser idênticas às zonas de teste 112i do dispositivo 100. Não sendo uma outra diferença nas zonas de teste, os dispositivos 100 e 300 podem ser idênticos.

Embora um método para formação de zonas de teste 112i tenha sido descrito como movendo a ponta distai 404 e substrato 102 a partir de uma separação inicial dl (Fig. 3b) para uma separação adjacente d2 (Fig. 3c) e para uma separação intermediária d3 (Fig. 3d) antes de iniciar movimento lateral da ponta distai 404 e do substrato 102 (Fig. 3f), outras modalidades podem ser concretizadas. Por exemplo, a ponta distai 404 e substrato 102 podem ser movidos lateralmente com a ponta 404 e substrato 102 na separação adjacente d2. Nessa modalidade, a separação d2 é, tipicamente, maior do que zero.

Embora um método para formação de zonas de teste 112i tenha sido descrito como incluindo uma etapa de manutenção da ponta distai 404 e substrato 102 em uma separação intermediária d3 durante um tempo de incubação até apenas uma porção 402' restante de solução reagente 402 restar, outras modalidades podem ser concretizadas. Por exemplo, movimento lateral da ponta distai 404 e substrato 102 pode começar imediatamente tão logo a ponta distai 404 e substrato 102 sejam movidos da separação adjacente d2 (Fig. 3c) para a separação d3 (Fig. 3d). Em outras palavras, o tempo de incubação pode ser indistinguível de zero. Como outro exemplo, durante a incubação, evaporação de solução reagente pode ser reposta por solução reagente adicional introduzida na posta do capilar. Conseqüentemente, a quantidade total de reagente na ponta do capilar aumenta durante a incubação.

Embora um método para formação de zonas de teste 112i tenha sido descrito como incluindo um tempo de incubação com a ponta distai 404 e substrato 102 mantidos em uma separação d3, outras modalidades podem ser concretizadas. Por exemplo, a separação d3 pode variar durante o tempo de incubação. Por exemplo, a ponta 404 pode ser oscilada lateral ou verticalmente com relação ao substrato 102 durante o tempo de incubação. Altemativamente ou em combinação, a ponta 404 pode ser oscilada lateral ou verticalmente com relação ao substrato 102 durante movimento lateral. Tal oscilação pode intensificar o transporte de moléculas sonda para o primeiro substrato durante incubação ou movimento lateral.

Embora um método para formação de zonas de teste 112í tenha sido descrito como usando um distribuidor capilar, outros distribuidores podem ser usados. Por exemplo, material pode ser distribuído a partir de um distribuidor sólido (por exemplo, um haste sólida).

Embora um método para formação de zonas de teste 112i tenha sido descrito como introduzindo uma quantidade de solução reagente em uma ponta distai de um spotter de capilar (Fig. 2b) e mantendo a ponta e um substrato em uma menor separação d2, de modo que solução reagente 402 contate um local do substrato 102, outras modalidades podem ser concretizadas. Por exemplo, solução reagente pode ser introduzida na ponta distai apenas após a ponta distai e substrato serem mantidos em uma menor separação (por exemplo, após a ponta distai ser contatada com o substrato).

Embora um método e leitor de dispositivo microfluídico para redução seqüencial de uma distância entre as superfícies internas de um canal tenham sido descritos, outras configurações são possíveis. Por exemplo, um leitor de dispositivo microfluídico pode ser configurado para reduzir simultaneamente uma distância entre as superfícies internas ao longo da maioria (por exemplo, substancialmente todo ou todo) de um canal.

Subseqüentemente, o leitor realiza translação da zona de detecção de um detector ao longo do canal, de modo que diferentes zonas de teste são lidas — seqücncialmcntc.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Embora um dispositivo microfluídico tendo um primeiro substrato relativamente rígido e um segundo substrato relativamente flexível tenha sido descrito, outras modalidades podem ser usadas. Por exemplo, os substratos que definem ambas as superfícies internas opostas de um canal podem ser flexíveis. Em tais modalidades, uma porção do detector óptico pode formar parte do sistema de compressão. Por exemplo, o dispositivo microfluídico pode realizar translação entre um rolo de compressão e uma lente óptica do detector.

Embora um padrão de referência tenha sido descrito como proporcionando informação referente às propriedades espaciais de zonas de teste de um dispositivo microfluídico, o padrão de referência pode fornecer informação adicional ou alternativa. Por exemplo, um padrão de referência pode proporcionar informação relacionada às propriedades físico-químicas de zonas de teste de um dispositivo microfluídico. Tais propriedades incluem analitos para os quais zonas de teste são configuradas para ensaio. Outras propriedades incluem a identidade e propriedades de reagentes armazenados sobre o dispositivo e informação sobre a data (por exemplo, a data de validade) do dispositivo.

Embora um padrão de referência incluindo sinais indicativos magnéticos tenha sido descrito, outros sinais indicativos podem ser usados. Por exemplo, os sinais indicativos podem ser formados de regiões tendo densidade óptica ou refletância diferente quando comparado com o material adjacente. O leitor de padrão de referência é um leitor óptico tipicamente configurado para ler os sinais indicativos através de transmitância ou refletância.

Em outras modalidades, o primeiro substrato pode incluir um canal formado, por exemplo, via moldagem por injeção. O canal tem uma primeira dimensão (comprimento) substancialmente maior do que suas

-segunda e terceira dimensões (isto é, largura e profundidade). O canal pode ter ürha^eção transversal que é retangular, em formato de V (triangular), em formato de U ou outro formato. Em algumas modalidades, o formato e/ou dimensões da seção transversal do canal podem variar ao longo do comprimento do canal. O segundo substrato pode ser afixado ao primeiro substrato através de um adesivo. O segundo substrato pode ser formado, por exemplo, de uma fita transparente. O segundo substrato (por exemplo, a fita) pode ter uma rigidez mecânica, de modo que o contato mecânico com uma superfície externa do segundo substrato (por exemplo, a fita) não deforma substancialmente a superfície interna do segundo substrato.

Em determinadas modalidades, o canal pode ser definido pela superfície interna de um tubo, um conduto, um capilar ou semelhante. O canal pode ter uma seção transversal que é retangular, em formato de V (triangular) ou outro formato. Em algumas modalidades, o formato e/ou dimensões da seção transversal do canal podem variar ao longo do comprimento do canal. Uma porção do canal pode ser opticamente transparente.

Em algumas modalidades, o canal inclui uma ou mais marcas de referência e/ou alinhamento, tais como estruturas definidas ou moléculas imobilizadas configuradas para serem detectáveis com o sistema de detecção usado para o ensaio. As marcas de alinhamento podem incluir, por exemplo, glóbulos fluorescentes imobilizados, polímeros fluorescentes imobilizados, proteínas, ácidos nucleicos e semelhantes. Marcas de alinhamento também podem incluir estruturas físicas, tais como microestruturas e semelhantes.

O dispositivo pode ser configurado para formar um circuito de líquido após ter introduzido a amostra no canal. O circuito de fluido encerra a amostra líquida em um ciclo sem fim. Quando a amostra líquida está encerrada em um circuito de fluido e o volume de amostra líquida é menos do que o volume total do circuito de fluido, o volume restante no circuito de fluido pode ser ocupado por um fluido de transporte. O fluido de transporte pode ser um líquido que é substancialmente imiscível com o líquido de amostra (por exemplo, em virtude de hidrofilicidade/hidrofobicidade ou diferenças na densidade). O fluido de transporte pode ser um gás tal como, por exemplo, ar. Tipicamente, a amostra líquida estará presente no circuito de fluido em uma porção contínua.

Uma porção do circuito de líquido inclui uma zona compressível. A zona compressível pode ser um comprimento do circuito de fluido ao longo do qual pelo menos uma parede do circuito é compressível ou deformável. Quando uma força compressível localizada é aplicada à zona compressível, a parede deforma. Sob uma força suficiente, a parede pode ser comprimida até um grau que interrompe o circuito de fluido. Mais comumente, o circuito de fluido será interrompido em um local predeterminado, onde o canal está cheio de fluido de transporte.

Uma vez que o circuito de fluido tenha sido interrompido, o local da amostra de fluido dentro do circuito de fluido pode ser manipulado movendo o local da interrupção com relação ao resto do circuito de fluido. Movimentação da interrupção diminui o volume do fluido de transporte para um lado da interrupção, com um aumento correspondente do volume de fluido de transporte para o outro lado da interrupção. As alterações no volume resultam em uma pressão diferencial sobre as extremidades da amostra líquida (isto é, onde a amostra líquida e fluido de transporte se encontram). A amostra líquida responde se movendo dentro do circuito de fluido para igualar as pressões.

Uma ou mais zonas de teste podem ser espaçadas ao longo do canal. Tipicamente, cada ensaio inclui interação do composto sonda com o respectivo analito ou com um respectivo complexo incluindo o analito e um reagente (por exemplo, um rótulo óptico).

O local da amostra dentro do canal pode ser controlado por um acionador ou rolo configurado para submeter uma porção da zona compressível a uma foiça compicssiva localizada. O dispositivo microfluídico sofre translação com relação ao acionador ou rolo, de modo que a amostra trafega para um local desejado dentro do canal. Altemativamente, o rolo pode ser movido enquanto o dispositivo permanece estacionário.

A Fig. 12A ilustra o circuito de fluido 10 em um estado fechado. O circuito de fluido 10 inclui uma primeira zona 1, canal microfluídico 2, segunda zona 3 e entrada 4. No estado fechado, a segunda zona 3 é hermeticamente conectada à entrada 4. A Fig. 12B mostra o circuito de fluido 10 em um estado aberto e pronto para aceitar amostra líquida 5 na entrada 4. Após a amostra líquida 5 ser contatada com a entrada 4, ação capilar extrai amostra líquida 5 para a primeira zona 1. As Figs. 12C-12D mostram o circuito de fluido em um estado fechado após a amostra ter sido aplicada. O rolo 6 está posicionado com relação à segunda zona 3, de modo que a segunda zona está em um estado descomprimido (conforme na Fig. 12C) ou em um estado comprimido (conforme na Fig. 12E). O local de amostra líquida 5 dentro do circuito de fluido 10 pode ser ajustado através de posicionamento do rolo 6, de modo que a segunda zona 3 esteja em um estado comprimido e, enquanto se mantém o estado comprimido, movendo o rolo 6 com relação à segunda zona 3 (ilustrada por setas na Fig. 12D). Em virtude do circuito de fluido ser fechado, o movimento do rolo 6 cria uma pressão diferencial sobre qualquer lado do rolo; a pressão diferencial induz ao movimento de amostra líquida, desse modo, restaurando pressões iguais. O circuito de fluido pode ser configurado para funcionar em um cartucho. Em determinados exemplos, o circuito de fluido pode ter um trajeto de fluxo microfiuídico capaz de compressão, através de deformação, de um canal microfiuídico incluindo uma região de detecção e um elemento de vedação que pode formar, reversível ou irreversivelmente, um circuito de fluido fechado.

As Figs. 13A-13B mostram uma vista em corte de um cartucho 100 exempli ficativo. O cartucho 100 inclui um substrato ! 01, cobertura 102 e um circuito de fluido incluindo primeira zona 103, condutos 108, canal 105, segunda zona 104 e conexão de entrada/hermética 109. O canal 105 pode ser coberto por uma camada transmissível opticamente pelo menos parcialmente. A primeira zona 103 pode ser, por exemplo, um capilar selecionado para conter um volume de amostra desejado (por exemplo, 1 pL a 20 pL, 2 a 10 pL ou cerca de 5 pL). O capilar pode ser revestido com um anticoagulante sobre sua superfície interna. A entrada 109 do capilar é configurada para receber a amostra 106. Em algumas modalidades, a saída no capilar se abre para uma câmara de reação 110 com um volume predeterminado, por exemplo, de cerca de 5 pL, 10 pL ou 20 pL. Em algumas modalidades, a câmara de reação 110 inclui uma pelota de reagente 107. A pelota de reagente pode incluir anticorpos rotulados com um corante fluorescente e tendo uma afinidade por antígenos a serem detectados dentro da amostra. Por exemplo, para detecção do número de células T auxiliares em uma amostra líquida, a pelota de reagente pode incluir um anticorpo anti-CD4+ rotulado com um primeiro corante fluorescente (tal como ficoeritrina) e um anticorpo antiCD3+ rotulado com um segundo corante fluorescente, tal como (ficoeritrinaCy4), sais e reagentes de estabilização, etc. Em algumas modalidades, a superfície interna da primeira zona é coberta com reagentes necessários para processamento da amostra. Um ensaio exemplificativo para detecção de partículas, tais como células, em uma amostra líquida é descrito, por exemplo, no WO 2007/051861, o qual é incorporado por referência em sua totalidade. O conduto 108, em comunicação de fluido com a câmara de reação 110, conecta a câmara de reação com a primeira extremidade do canal 105. Conforme descrito no WO 2007/051861, detecção pode ocorrer no canal. Assim, o canal é opticamente transparente pelo menos parcialmente. Por exemplo, o canal 105 pode ser coberto por uma camada opticamente transmissível pelo menos parcialmente. A segunda extremidade do canal 105 está conectada a uma primeira extremidade da segunda zona 104 via o conduto 108. A segunda zona é pelo menos parcialmente flexível, de modo que o diâmetro interno da segunda zona pode ser reduzido para zero. Por exemplo, a segunda zona pode ser um tubo de silicone elástico ou semelhante. A segunda extremidade da segunda zona é montada sobre uma cobertura 102 a qual é adaptada para ser aplicada ao substrato e suportar a segunda zona. Abrindo a cobertura, a conexão hermética 109 entre as primeira e segunda zonas é aberta, fechando a cobertura, a conexão hermética 109 entre as primeira e segunda zonas é fechada.

Na condição de remessa, o dispositivo pode estar fechado, isto é, a segunda zona forma uma conexão hermética com a primeira zona na conexão 109. Altemativamente, o dispositivo pode ser remetido em um estado aberto. Em algumas modalidades, o dispositivo inclui (por exemplo, para fins de segurança) um mecanismo configurado para impedir o cartucho de se tomar aberto após ele ser fechado primeiro. A conexão 109 é fechada quando um elemento de vedação na cobertura 102 forma uma conexão hermética a fluido com a extremidade do capilar 103. Em operação, o usuário abre a cobertura, desse modo, abrindo a primeira zona sobre sua primeira extremidade. O usuário contata a extremidade aberta da primeira zona com o líquido de amostra, por exemplo, uma gota de sangue, tal como produzido por um bastão de dedo. Assim, o capilar 103 se enche de amostra. O usuário fecha a cobertura, desse modo, fechando a conexão 109 entre as primeira e segunda zonas. Nesse ponto, o circuito de fluido inclui um volume predeterminado contínuo de líquido de amostra, a pelota de reagente e um volume contínuo de fluido de transporte (por exemplo, ar) dentro da câmara de reação, condutos, canal e segunda zona. O usuário coloca o dispositivo na máquina projetada para operação do dispositivo. A máquina inclui um acionador configurado para comprimir a segunda zona, um detector e um controlador. O acionador comprime a segunda zona, reduzindo seu diâmetro no ponto de compressão parã zèrõ. Quando o dispositivo e o acionador são movidos um com relação ao outro enquanto em um estado comprimido, a pressão no fluido de transporte aumentará sobre uma extremidade do volume de amostra, ao mesmo tempo em que diminui sobre a outra extremidade do volume de amostra. O volume de amostra se moverá dentro do circuito de fluido até que a pressão sobre cada extremidade do volume de amostra seja igual.

O canal 105 pode ser hidrofóbico, de modo que a amostra não se moverá no canal 105 sem aplicação de uma força externa. Em algumas modalidades, as paredes na proximidade da pelota de reagente 107 podem também ser hidrofóbicas. Quando usando materiais hidrofóbicos, a estabilidade a longo prazo da pelota de reagente pode ser pior comparado com um material hidrofóbico.

Em uma modalidade, o acionador é fixado dentro da máquina e o dispositivo é movido com relação ao meio para compressão. Conforme descrito no WO 2007/051861, o acionador é, por exemplo, um rolo.

O dispositivo pode ser movido dentro da máquina de modo 10 que a amostra se moverá na câmara de reação, desse modo, dissolvendo a pelota de reagente nessa câmara. Os anticorpos se ligarão aos respectivos antígenos presentes na amostra. Dependendo do tipo de amostra, antígenos podem estar localizados sobre partículas suspensas no líquido de amostra (por exemplo, sobre superfícies celulares em uma amostra de sangue). Em virtude dos anticorpos serem rotulados (por exemplo, com um corante fluorescente), uma vez ligados a seus respectivos antígenos, os antígenos se tomarão rotulados também. Veja, por exemplo, WO 2007/051861. Movendo adicionalmente o dispositivo com relação à máquina na mesma direção, a amostra é movida para o canal. Uma vez que o canal está cheio, detecção ocorre.

Desejavelmente, o detector é pequeno, barato e versátil; isto é, —---ele é adaptável à outras aplicações que não unicamente o uso descrito aqui. O detector pode ser um microscópio de fluorescência, de preferência um que tem dimensões externas muito pequenas e uma pequena altura com relação ao cartucho. O detector pode ser capaz de formar imagem de objetos com um tamanho > 5 pm e é configurado para detectar sinais do comprimento de onda os quais são emitidos pelos corantes fluorescentes usados no ensaio. A fonte de luz pode ser um LED de alta energia que emite luz em um espectro o qual é adequado para excitar os corantes fluorescentes usados no ensaio. Se diferentes corantes são usados, por exemplo, pelo menos dois corantes diferentes que emitem luz em dois comprimentos de onda diferentes, detecção seria possível em cada um de pelo menos dois comprimentos de onda diferentes. O detector pode incluir um mecanismo de foco e uma câmera.

Usualmente, fontes de luz muito fortes são usadas para microscopia por fluorescência. Em virtude de terem feixes de luz quase paralelos, apenas uma pequena porção da luz emitida é usada (ângulo sólido de —2°). Usando uma lente condensadora e lente detectora que coleta uma maior porção da luz emitida pela fonte, uma fonte menos poderosa (por exemplo, um LED) pode ser usada. Microscopia por fluorescência coloca, tradicionalmente, um valor muito alto sobre a fidelidade óptica; como tal, o campo tem ensinado não utilizar altos ângulos sólidos para lentes condensadoras. Na verdade, o campo tende a ensinar sistemas ópticos relativamente pesados, densos e complexos para obtenção de alta fidelidade óptica.

Com referência à Fig. 14, um detector 500 exemplificativo inclui um corpo principal 501 o qual inclui um primeiro trajeto óptico 502 e um segundo trajeto óptico 503. Em determinados exemplos, cada um dos trajetos ópticos, independentemente, pode ter um formato geralmente cilíndrico ou outra configuração adequada. O primeiro trajeto óptico 502 representa o trajeto óptico de excitação; o segundo trajeto óptico 503

-representa o trajeto óptico de detecção.

O primeiro trajeto óptico 502 conecta a fonte de luz 505 com o cartucho 516. A fonte de luz 505 pode ser um LED de alta energia (tal como um LED Platinum Dragon© (Osram)), com comprimentos de onda de emissão de 455 nm, 470 nm e 528 nm e um ângulo de visualização de 120° (emissor Lambertiano). Quando usando corantes fluorescentes, a fonte de luz é selecionada de acordo com o comprimento de onda de excitação dos corantes fluorescentes os quais são usados no ensaio. Por exemplo, quando usando ficoeritrina e ficoeritrina-Cy5, a fonte de luz é selecionada para emitir luz com um comprimento de onda em tomo de 520 nm, enquanto que para o uso de ficoeritrina e PerCP, a fonte de luz é selecionada para emitir luz em tomo de 480 nm. A lente condensadora 506 (por exemplo, feita de topázio, índice de refração de 1,533) condensa a luz emitida pelo LED no primeiro trajeto óptico 502. A abertura 502a é configurada para permitir um ângulo sólido máximo de 13,5° ou menos para iluminar o espelho dicróico 504. O trajeto óptico 502 também inclui um filtro de passe de banda 507 (filtro de excitação), permitindo que luz com um comprimento de onda entre 505 nm e 530 nm passe. Assim, o comprimento de onda de excitação restante seria em tomo de 528 nm.

O trajeto óptico 503 conecta a câmera CMOS com o objeto 516 via um espelho dicróico 504 e é configurado em um ângulo (mostrado como 90° na Fig. 14) com relação ao trajeto óptico 502. O trajeto óptico 503 também inclui um primeiro filtro de emissão 510. Em algumas modalidades, o filtro 510 é montado em um trocador de filtro 512. O trocador de filtro 512 pode inclui filtro(s) de emissão adicional(is), por exemplo, um filtro 513. Filtros de emissão 510 e 513 podem ser escolhidos com relação a uma configuração predeterminada de comprimentos de onda de emissão, por exemplo, os comprimentos de onda de emissão do(s) corante(s) fluorescente(s) usado(s) para rotulação de reagentes no cartucho. Por exemplo, os filtros 510 e 513 podem ser selecionados parapassar luz com comprimentos de õndã de 59Õ nm e 685 nm, respectivamente, correspondendo aos comprimentos de onda de emissão de ficoeritrina e ficoeritrina-Cy5. O trajeto óptico 503 inclui uma abertura 503a configurada para permitir um ângulo sólido máximo de 13,5° sobre o espelho dicróico 504.

O espelho dicróico 504 é configurado para separar o trajeto óptico de detecção 503 do trajeto óptico de excitação 502. Em algumas modalidades, ele é um espelho dicróico de curto passe que permite que luz com um comprimento de onda < 568 nm passe, enquanto que luz com um comprimento de onda > 528 nm é refletida. Assim, o espelho dicróico 504 permite que a luz do trajeto óptico de excitação passe, enquanto que a luz do objeto 516 é refletida no trajeto óptico de detecção. Novamente, as propriedades físicas do espelho dicróico 504 são selecionadas de acordo com os rótulos (por exemplo, os corantes fluorescentes) os quais são usados no ensaio.

Em algumas modalidades, o detector ainda inclui um mecanismo de focalização 514 que permite variação na distância da lente de detecção 508 e objeto continuamente em 5 mm ou menos, por exemplo, em 1 ou 2 mm.

Em algumas modalidades, a lente de detecção 508 é configurada para ter uma abertura óptica de detecção de 0,4 ou menos, por exemplo, 0,2 e uma abertura óptica de excitação de 0,5 ou menos, por exemplo, 0,4.

O detector também pode incluir um dispositivo de formação de imagem digital, tal como uma câmera CMOS com valor de cinza de 8 bits, com uma resolução, por exemplo, de 640 x 480 pixéis. Em outras modalidades, o dispositivo de formação de imagem digital pode ter uma resolução maior e/ou pode ser uma câmera CMOS colorida.

-----------------------Em algumas modalidades, a escala de reprodução do sistema de detecção está entre Γ: 1 e 1:10, por exemplo, 1:3, 1:4 ou 1:5.

Em algumas modalidades, a distância entre o objeto 516 e a lente de detecção 508 está entre 2 mm e 20 mm, por exemplo, 8 mm, 9 mm ou 10 mm.

Com referência à Fig. 15, em operação, a luz emitida da fonte de luz 505 é condensada via a lente 506 e filtrada via o filtro de excitação

507. Ela passa na abertura 502a, espelho dicróico 504, lente de detecção 508, abertura 509 e excita a objetiva 601. Em algumas modalidades, o objeto 516 é o canal cheio de líquido de amostra, por exemplo, sangue, o líquido incluindo um número de partículas, por exemplo, células T auxiliares, a serem detectadas. As partículas podem ser rotuladas com um ou mais anticorpos acoplados a corante fluorescente. Em outras modalidades, o objeto é um canal incluindo moléculas alvo rotuladas com um ou mais corantes fluorescentes e ligadas à moléculas sonda ou um arranjo de moléculas sonda imobilizadas sobre uma das superfícies do canal. O corante fluoresce sob a influência da luz de excitação do LED. A luz emitida os corantes fluorescentes passa para a abertura 509, lente de detecção 508 e é refletida via o espelho dicróico 504 no trajeto óptico de detecção 503. Ela passa para o filtro de detecção 510 (ou 513, dependendo da posição do trocador de filtro 512) adaptado para permitir a passagem de luz de um comprimento de onda da luz emitida a partir do corante fluorescente. Após a luz ter passado o filtro, ela é coletada pelo chip

CMOS da câmera CMOS 511 presa.

As Figs. 16A-16B ilustram como o detector pode ser usado para detecção, por exemplo, do número de células T auxiliares presentes em uma amostra de sangue. Detalhes para o dispositivo e reação podem ser encontrados acima e no WO 2007/051861, o qual é incorporado aqui por referência. No exemplo discutido, o cartucho é preparado com dois anticorpos rotulados: anticorpos anti-CD4 rotulados com ficoeritrina e anticorpos anti-------CD3 rotulados com ficoeritrina-Cy5. Uma vez que células T auxiliares mostram ambos os antígenos sobre sua superfície, células T auxiliares serão rotuladas com ambos os corantes fluorescentes. Outras células mostrando apenas um de ambos os antígenos sobre suas superfícies também podem estar presentes na amostra. Essas células serão rotuladas apenas com o corante fluorescente correspondente.

Após reação com os respectivos anticorpos rotulados com corante fluorescente, a amostra líquida compreendendo células fluorescentes

712 é movida para o canal de detecção 711. Em uma primeira posição (Fig. 16A), o detector 710 detecta uma primeira imagem 714 representando uma vista sobre uma porção 713 do canal 711. A porção 713 representa um volume predeterminado da amostra, por exemplo, 100 pL. A imagem 714 é tomada com um primeiro filtro o qual é configurado para permitir luz emitida pelos anticorpos anti-CD4+ rotulados com ficoeritrina presentes na amostra e bloquear a luz emitida pelos anticorpos anti-CD3 τ rotulados com ficoeritrinaCy5. Uma segunda imagem 715 sobre a mesma posição é tomada usando um segundo filtro, o qual é configurado para permitir anticorpos anti-CD3+ rotulados com ficoeritrina-Cy5 e bloquear a luz emitida pelos anticorpos antiCD4+ rotulados com ficoeritrina. As imagens 714 e 715 podem mostram um número diferente de sinais dentro da porção 713. Adicionalmente, em virtude de anormalidades no sistema óptico, ambas as imagens 714 e 715 poderíam estar fora de alinhamento uma com relação à outra.

Um software (por exemplo, Iconoclust pela Clondiag) pode ser usado para alinhar ambas as imagens 714 e 715, por exemplo, usando marcas de alinhamento no canal (não mostradas) ou analisando as relações entre sinais os quais estão presentes sobre ambas as fotografias. Adicionalmente, o software identifica e marca os sinais os quais foram detectados em ambas as fotografias (716). Na Fig. 16A, três sinais foram identificados como estando presentes em ambas as figuras. Isso significa que 3 células com ambos os antígenos foram encontradas na porção 713. Os resultados podem ser visualizados, usados para outros cálculos ou estatística ou podem ser armazenados para processamento adicional.

O detector 719 e canal 711 são movidos um com relação ao outro para visualizar outra porção 717 do canal 711 (Fig. 16B) e o procedimento de detecção é repetido. Imagens 718 e 719 são registradas usando os primeiro e segundo filtros, respectivamente. O software identifica e marca os sinais os quais foram detectados em ambas as fotografias (720).

Detecção pode ser repetida nas porções adicionais do canal de detecção, resultando em um conjunto de valores que representa o número de células em cada uma das porções. O número de células presentes na amostra, bem como parâmetros estatísticos correspondentes podem ser calculados a partir desse conjunto de valores. Por exemplo, uma média de três células por 100 pL corresponde a uma quantidade total de 150 células em um volume de amostra de 5 pL.

A Figura 17 mostra uma sobreposição de duas imagens detectadas durante um experimento de contagem de células T usando sangue como amostra líquida. Ambas as imagens são detectadas no mesmo local do canal (por exemplo, tais como imagens 714 e 715 na Fig. 5) usando dois filtros de detecção diferentes. 801 e 802 representam uma marca de alinhamento cuja imagem foi formada usando dois filtros de detecção diferentes. O deslocamento entre ambas as imagens pode ser claramente detectado e corrigido usando as marcas. 803 e 804 representam uma única célula a qual é deslocada pela mesma distância que as marcas de alinhamento 801 e 802. Uma vez que essa célula está presente em ambas as imagens, pode ser determinado que essa célula é rotulada com ambos os anticorpos e, assim, uma célula T auxiliar. 805 representa uma célula a qual é detectável apenas em uma de ambas as imagens da sobreposição. Assim, pode ser derivado que essa célula não mostra ambos os antígenos sobre sua superfície e, portanto, não c uma célula T auxiliar. Outras células sanguíneas também podem ser obsefvãdãíTnas imagens. Uma vez que elas não são rotuladas com quaisquer anticorpos fluorescentes, elas podem ser vistas apenas como uma sombra (806).

Outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações.

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Dispositivo para detecção de um analito, caracterizado pelo fato de compreender:

   um cartucho (100) tendo:

   5 um canal microfluídico (105) incluindo uma entrada (109) e uma região de detecção (711) em comunicação de fluido com a entrada (109);

   um trajeto de fluxo microfluídico (104) tendo uma parede pelo menos parcialmente deformável e em comunicação de fluido com a região de detecção (711) do canal (105); e

   10 uma cobertura (102) tendo: um elemento de vedação configurado para vedar a entrada (109) e formar um circuito de fluido incluindo a entrada (109), o canal microfluídico (105) e o trajeto de fluxo microfluídico (104).
2. 2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado

   15 pelo fato de que a cobertura (102) e o cartucho (100) são configurados para fechar irreversivelmente após formação do circuito de fluido ou em que a cobertura (102) é flexivelmente presa ao cartucho (100) ou em que a cobertura (102) e o cartucho (100) são configurados para se encaixar em uma primeira posição relativa, de modo que a cobertura (102) pode ser removida e

   20 se encaixar em uma segunda posição relativa, de modo que a cobertura (102) é irreversivelmente fechada após formação do circuito de fluido.
3. 3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região de detecção (711) é bgada através de pelo menos uma superfície do cartucho (100) e pelo menos uma superfície de uma tampa,

   25 em que a tampa inclui opcionalmente um filme transparente sobre a região de detecção (711) e é opcionalmente afixada adesivamente ao cartucho (100).
4. 4. Método reabzado pelo uso do dispositivo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender:

   introdução de uma amostra líquida em um canal microfluídico

   Petição 870180060551, de 13/07/2018, pág. 8/12 (105), desse modo, formando uma porção líquida contínua encerrada pelo canal (105) e ligado em uma primeira extremidade por um fluido de transporte, a amostra líquida compreendendo múltiplas partículas, formação de um circuito de fluido, de modo que o fluido de 5 transporte proporciona comunicação de fluido entre as primeira e segunda extremidades da porção líquida, formação de uma mistura compreendendo pelo menos uma porção da amostra líquida e um rótulo óptico através de aplicação de uma pressão diferencial às primeira e segunda extremidades da porção líquida via

   10 o fluido de transporte, formação de múltiplos complexos, cada complexo compreendendo uma das múltiplas partículas e pelo menos um dos rótulos ópticos, e detecção de complexos presentes dentro de um subconjunto da

   15 mistura.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que uma porção do circuito de fluido é formada por uma parede elasticamente deformável, em que a aplicação de uma pressão diferencial às primeira e segunda extremidades da porção líquida compreende compressão

   20 da parede elasticamente deformável.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de ainda compreender detecção de complexos presentes dentro de cada um de múltiplos diferentes subconjuntos da mistura, em que um volume total dos múltiplos diferentes subconjuntos é pelo menos 90% de um volume

   25 da amostra líquida introduzida no canal microfluídico (105), opcionalmente compreendendo detectar complexos presentes dentro de pelo menos 10% do volume total da mistura.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de compreender introdução de um volume total V

   Petição 870180060551, de 13/07/2018, pág. 9/12 de amostra líquida no canal microfluídico (105) e em que um volume total da mistura é de pelo menos 90% do volume V, opcionalmente pelo menos cerca de 95% do volume V de amostra líquida.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a

   5 7, caracterizado pelo fato de que as partículas são células e os rótulos ópticos são rótulos fluorescentes.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato de que o canal microfluídico (105) inclui uma entrada (109) e uma região de detecção (711) em comunicação de fluido com
10. 10 a entrada (109) e é um canal microfluídico (105) de um dispositivo microfluídico.

    10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo fato de ainda compreender, antes de introdução de uma amostra líquida em um canal microfluídico (105), introdução de uma amostra

    15 líquida em um orifício de um capilar (103), opcionalmente compreendendo ainda, intermediariamente às etapas de introdução da amostra líquida no orifício do capilar (103) e introdução da amostra líquida no canal microfluídico (105), conexão do capilar (103) ao dispositivo microfluídico, a amostra líquida permanecendo dentro do capilar (103), em que o orifício do

    20 capilar compreende opcionalmente um inibidor de coagulação.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizado pelo fato de ainda compreender detecção óptica de um sinal indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro de um subconjunto da amostra líquida, o subconjunto estando presente dentro de

    25 uma região de detecção (711) do dispositivo microfluídico.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11, caracterizado pelo fato de introdução da amostra líquida no canal microfluídico (105) é realizada através de compressão da parede elasticamente deformável, em que a compressão da parede elasticamente

    Petição 870180060551, de
13. 13/07/2018, pág. 10/12 deformável compreende compressão de uma primeira porção do circuito de fluido e, sem primeiro liberar completamente a compressão, movimento de um local da compressão ao longo do circuito de fluido em uma quantidade suficiente para desempenhar a etapa de introdução.

    5 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizado pelo fato de compreender realização da etapa de detecção óptica de um sinal indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro do subconjunto liberando primeiro completamente a compressão.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a amostra líquida é sangue.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de compreender, intermediariamente às etapas de introdução da amostra líquida no orifício do capilar (103) e introdução de pelo menos a porção da amostra líquida no canal microfluídico (105), impedir

    15 que a amostra líquida saia do capilar (103).
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 15, caracterizado pelo fato de que uma região de detecção do canal microfluídico (105) não suporte fluxo capilar da amostra líquida.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 20 a 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte de uma superfície interior do canal microfluídico (105) é hidrofóbica.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 17, caracterizado pelo fato de ainda compreender movimento de pelo menos um do dispositivo microfluídico e um detector óptico (500) um com relação

    25 ao outro e, subseqüentemente, detecção de um sinal óptico indicativo de uma quantidade de complexo presente dentro de um subconjunto diferente da amostra líquida.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, caracterizado pelo fato de que o capilar (103) é um capilar end to

    Petição 870180060551, de 13/07/2018, pág. 11/12 end compreendendo primeira e segunda extremidades abertas, o orifício do capilar (103) compreende um volume total V e a etapa de introdução de pelo menos uma porção da amostra líquida compreende introdução de pelo menos 90% da amostra líquida no canal microfluídico (105).

    Petição 870180060551, de 13/07/2018, pág. 12/12

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