BRPI0809008A2

BRPI0809008A2 - Melhoria do desempenho de plantas tolerantes ao frio e a sais com o gene snac2 do fator de transcrição do arroz

Info

Publication number: BRPI0809008A2
Application number: BRPI0809008-4A
Authority: BR
Inventors: Honghong Hu; Lizhong Xiong
Original assignee: Univ Huazhong Agricultural
Priority date: 2007-03-12
Filing date: 2008-03-11
Publication date: 2014-09-16
Also published as: CN101045929A; AU2008226264A1; CN100526465C; US20100186108A1; WO2008110073A1; CA2680742A1; MX2009009846A; EP2120533A1; EP2120533A4

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MELHORIA DO DESEMPENHO DE PLANTAS TOLERANTES AO FRIO E A SAIS COM O GENE SNAC2 DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO DO ARROZ".

Campo Técnico

A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia de

plantas e, mais particularmente, ao isolamento de clones, à confirmação da função e ao uso de um fragmento de DNA (gene) do arroz. O dito gene está associado com à tolerância da planta ao estresse causado pelo frio e por sais. O desempenho de tolerância ao frio e a sais de uma planta transgênica 10 é notavelmente melhorado através da transferência de uma região de tradução completa (Seqüência codificadora) do gene ligado a um promotor forte (UbiquitinI) do milho a uma planta.

Técnica Antecedente

O crescimento de plantas é naturalmente sujeito à influência do ambiente. Por exemplo, a seca, os danos causados por sais e a baixa temperatura sempre levam à grande redução da produção das plantas de cultivo, atribuindo assim um desafio ao desenvolvimento da agricultura em muitas áreas. Para lidar com ou para se adaptar ao efeito adverso do ambiente, as plantas percebem as alterações das condições ambientais extracelulares e sinalizam as células através de várias vias. Em resposta, as células induzem a expressão de alguns genes que respondem para gerar algumas proteínas funcionais, substâncias de osmorregulação e fatores de transcrição para a transmissão de sinais e para a regulação da expressão gênica, dos quais todos protegem as células dos danos causados por estresse de seca, alta salinidade, temperatura baixa e similares, de forma que as plantas são capazes de produzir respostas correspondentes para alterações ambientais (Xiong e outros, Cell signaling during cold, drought and salt stress. Plant Cell.

14 (supl), S165-S183, 2002). O fato destes genes funcionais poderem ser expressos de forma apropriada durante uma resposta a um estímulo ambiental é precisamente regulado por fatores de regulação, particularmente, fatores de transcrição. Foi descoberto atualmente que a expressão de membros de famílias de fatores de transcrição tais como AP2/EREBP, Dedo de Zinco, Myb, bZIP e NAC pode ser induzida ou inibida sob estresses ambientais diferentes. Portanto, foi considerado que estes desempenham uma função muito importante na regulação e no controle da resposta de uma planta ao estresse ambiental. Além disso, o isolamento e a identificação dos fatores 5 de transcrição, que desempenham uma função crítica na regulação e no controle e podem ser aplicados para melhorar plantas de cultivo resistentes ao estresse, têm uma enorme contribuição para a produção de plantas de cultivo. Atualmente, foram feitas tentativas para aumentar o desempenho das plantas durante o estresse. Por exemplo, plantas transgênicas de Arabi10 dopsis que superexpressam DREB1A exibiam maior tolerância à temperatura baixa e à seca que as plantas do tipo selvagem (Liu Q e outros, "Two transcription factors, DREB1 e DREB2, with an EREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal transduction pathways in drought- and Iowtemperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis." Plant 15 Cell. 1998, 10: 1391-1406). O grupo de pesquisa de Thomashow na Michigan State University (U.S.A.) também cultivou plantas com maior tolerância ao frio através da transformação genética com o gene CBF1 de Arabidopsis.

O arroz é uma das plantas de cultivo alimentares mais importantes. O arroz com maior desempenho de tolerância ao frio e a sais possui 20 significância importante para o ser humano. Portanto, existe uma necessidade urgente para descobrir fatores de transcrição associados ao desempenho de tolerância ao frio e a sais de forma a cultivar variedades melhoradas tolerantes ao frio e à refrigeração.

Sumário da Invenção Um objetivo da presente invenção é isolar um fragmento de DNA

que contém segmentos codificadores completos de um gene de fator de transcrição associado à tolerância do arroz ao frio e a sais, cloná-lo, e utilizar o gene para aumentar a tolerância ao estresse do arroz e de outras plantas. Uma análise estrutural deste gene mostrou que este pertence à família dos 30 fatores de transcrição NAC específica à planta e refere-se ao estresse, tal como o chamado SNAC2.

A presente invenção refere-se ao isolamento e ao uso de um fragmento de DNA que contém o gene SNAC2, que confere à planta maior capacidade de tolerância em condições de estresse tal como temperatura baixa e similar. O dito fragmento de DNA é, por exemplo, mostrado na SEQ ID NO: 1, a seqüência de DNA altamente homóloga substancialmente equi5 valente à SEQ ID NO: 1 ou o subfragmento de seqüência mostrado na SEQ ID NO: 1 que possui substancialmente a mesma função.

Um gene da presente invenção ou um gene homólogo do mesmo pode ser obtido através da verificação de uma biblioteca de cDNA ou de DNA genômico com um gene SNAC2 clonado utilizado como uma sonda. O gene SNAC2 da presente invenção e quaisquer segmentos de DNA de interesse ou segmentos de DNA homólogos dos mesmos também podem ser obtidos através da amplificação do DNA genômico, do mRNA e do cDNA utilizando a tecnologia da PCR (reação em cadeia da polimerase). Dessa maneira, pode ser isolada uma seqüência que contém o gene NAC2. Através da transformação de plantas com a dita seqüência isolada em qualquer vetor de expressão que pode direcionar a expressão de um gene exógeno em planta, podem ser produzidas plantas transgênicas com maior tolerância a estresses de baixa temperatura e salinidade alta. De acordo com a presente invenção, no processo de construção do gene do presente pedido de patente dentro do vetor de expressão da planta, qualquer promotor forte ou promotor que pode ser induzido pode ser adicionado na posição que precede o nucleotídeo de início da transcrição ou alternativamente, pode ser utilizado um intensificador. Tal região intensificadora pode ser o código de início ATG e o código de início de regiões contíguas e similares, contanto que a região intensificadora esteja no mesmo quadro que a seqüência codificadora para garantir a tradução de uma seqüência completa.

O vetor de expressão que carrega um gene SNAC2 da presente invenção pode ser introduzido em células vegetais através de técnicas de biotecnologia convencionais tais como plasmídeo Ti, vetor viral de planta, 30 transformação de DNA direta, microinjeção, eletroporação e similares (Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, Nova York, pp. 411-463; Geiserson e Corey, 1998, Plant Molecular Biology (2â Edição)).

O vetor de expressão que contém um gene SNAC2 da presente invenção pode ser utilizado para transformar um hospedeiro, que é uma ampla variedade de plantas incluindo o arroz, para cultivar variedades de plantas que possuem excelente resistência a sais e ao frio.

O gene da presente invenção é expresso através da indução do estresse e, portanto, seu promotor é um promotor do tipo que pode ser induzido. Através da inserção de um segmento promotor da presente invenção e qualquer gene de interesse em um vetor de expressão apropriado e da 10 transformação de um hospedeiro vegetal, é possível induzir a expressão do gene sob condições de estresse, melhorando assim o desempenho de tolerância das plantas em resposta ao estresse.

A presente invenção será demonstrada adicionalmente de acordo com o que é descrito a seguir em associação às modalidades específicas.

Breve Descrição das Figuras

A SEQ ID No: 1 na Listagem de Seqüências mostra a seqüência do fragmento de DNA isolado e clonado de acordo com a presente invenção, que compreende a região que codifica o gene SNAC2.

A figura 1 mostra um fluxograma do isolamento e da identifica

ção do gene SNAC2.

A figura 2 mostra o nível de expressão do gene SNAC2 medido através da hibridização por Northern em pontos de tempo diferentes sob estresses diferentes incluindo seca, sal, frio e ABA.

A figura 3 mostra a expressão do gene SNAC2 em plantas

transgênicas, em que com a primeira faixa está o controle e o resto são plantas transgênicas independentes transgenicamente.

A figura 4 mostra o crescimento de famílias transgênicas que superexpressam SNAC2 no estágio de muda na fase de recuperação após a submissão ao estresse de temperatura baixa, em que a metade de cada balde vermelho pequeno é plantada com os controles, a outra metade é plantada com plantas transgênicas. O estresse te temperatura baixa referese a uma condição em que a planta é submetida a 12 h de luz/12 h de escuridão em uma incubadora a 4°C durante 5 dias, seguidos pela recuperação do crescimento sob condições normais.

A figura 5 mostra o crescimento de famílias transgênicas que 5 superexpressam SNAC2 no estágio de muda em salinidade alta, em que a figura 5A é uma fotografia tirada das mudas que germinaram durante 4 dias antes de serem transplantadas para um meio MS contendo 150 mM de NaCI onde cresceram durante 18 dias e a figura 5B mostra os resultados estatísticos em relação ao peso e ao comprimento das raízes das plantas (B).

A figura 6 ilustra um ensaio de transativação em levedura e um

ensaio de híbrido isolado de levedura que demonstram que o SNAC2 possui características de ativação da transcrição e de ligação ao DNA, em que a figura 6A é o ensaio de transativação; a figura 6B é o ensaio de híbrido isolado de levedura.

A figura 7 ilustra uma localização subcelular do gene SNAC2

nas células vegetais. A figura 7A é um diagrama esquemático de um vetor construído; a figura 7B é constituída das inspeções visuais com microscopia confocal, dentre as quais a figura 7B(i) é uma observação da seção de calo corada com o corante fluorescente iodeto de propídio, a figura 7B(ii) é uma

imagem da expressão de GFP sob fluorescência verde, a figura 7B(iii) é o resultado combinado das fluorescências vermelha e verde.

A Figura 8 ilustra o vetor PU1301.

A Figura 9 ilustra o vetor pCAMBIA1391-EGFP.

Exemplos

No estágio inicial da presente invenção foi obtido o clone de cD

NA 99C10 derivado da variedade de arroz MingHui 63 (uma variedade de arroz que é amplamente cultivada na China). Este cDNA na forma que é obtido é um cDNA de comprimento completo do gene SNAC2, que é um fator de transcrição associado com à resistência à seca. São mostradas a seguir

as razões pelas quais este cDNA foi utilizado: (1) foi observado após uma análise utilizando uma técnica de chip de cDNA que a quantidade de expressão do clone de cDNA 99C10 na variedade de arroz "ZhongHan 5" (uma variedade de arroz disponível publicamente fornecida pela Shanghai Academy of Agricultural Sciences, China) era aumentada em 3,5 vezes após um tratamento de estresse de seca durante 15 dias. Os resultados do sequenciamento indicavam que o gene era OsNAC6 (número de acesso AK068392).

Em vista da diferença significativa na quantidade de expressão do clone após o tratamento para seca e suas características funcionais, foi considerado que o gene representado pelo clone 99C10 estava envolvido na regulação e no controle da expressão do gene sob estresses; (2) de acordo com a análise do perfil de expressão do gene sob estresse (ver a figura 2), foi observa10 do que o nível de expressão do gene era notavelmente maior durante os tratamentos para estresse; (3) as plantas transgênicas com superexpressão do gene de comprimento completo possuem tolerância significativamente maior ao frio e à salinidade alta (ver as figura s 4 e 5). Tudo isso mostra que o gene SNAC2 é um gene associado ao estresse envolvido na regulação e 15 no controle da resistência não somente à seca, mas também à salinidade alta e ao frio.

A presente invenção se tornará mais evidente com as descrições dos exemplos a seguir, que estão relacionados com aos métodos para o isolamento e para a clonagem do fragmento de DNA que compreende a região 20 codificadora completa do gene SNAC2 e para a verificação da função do gene SNAC2 com base nos resultados anteriores no estágio inicial da presente invenção (fluxograma destes métodos como mostrado na figura 1). Partindo da descrição e dos exemplos a seguir, um perito na arte pode determinar as características básicas da presente invenção e considerar que 25 quaisquer alterações e modificações podem ser feitas adicionalmente na presente invenção para a adaptação aos vários usos e condições sem se afastar do espírito e do âmbito da presente invenção.

Exemplo 1: Isolamento e Clonagem do Fragmento de DNA que Contém o Segmento do Gene SNAC2 Os iniciadores do gene F

(5-T AGAATT CGACG AGG AGCT GGT GAT GC-3,

SEQ ID NO: 5, iniciador específico mais o sítio de clivagem enzimática EcoR l)e

R (5-T AGGAT CCCCT CGT CGT CGTT CAGT CC-3,

SEQ ID NO: 6, iniciador específico mais o sítio de clivagem enzimática BamH\) foram planejados de acordo com o quadro aberto de leitura do vetor 5 pGAD-Rec2 com base na seqüência do clone de cDNA de comprimento completo. Os produtos da PCR obtidos foram digeridos duplamente, purificados com clorofórmio:isopentanol e ligados ao vetor pGAD-Rec2 submetido à mesma digestão dupla. A E. coli ϋΗ10β (obtida na Invitrogen Inc.) foi transformada e os clones positivos foram selecionados e verificados com o 10 mesmo método de digestão enzimática, produzindo o vetor de transformação de levedura pGAD-SNAC2.

Exemplo 2: Detecção da Expressão que Pode ser Induzida do Gene SNAC2 Endógeno do Arroz

A variedade de arroz "Zhonghan 5" como uma matéria-prima foi tratada separadamente sob estresse causado por seca, frio e alta salinidade assim como ABA no estágio de 3 folhas. O tratamento de seca foi realizado através da imersão da raiz da muda em 20% de polietileno glicol (de nome comercial PEG6000) durante Oh, 0,5h, 1 h, 2h, 4h, 6h, antes da amostragem. O tratamento com frio foi realizado colocando a muda em uma incubadora a 4°C durante Oh, 1 h, 8h, 12h, antes da amostragem. O estresse causado por alta salinidade foi realizado através da imersão da raiz da muda em 200 mM/L de solução de NaCI durante Oh, 4h, 8h, 16h, antes da amostragem. O tratamento com ABA foi realizado através da imersão da raiz da muda em 100 μΜ/L de solução de ABA durante Oh, 0,5h, 3h, 6h, 12h, 24h antes da amostragem. Os RNAs totais das folhas foram extraídos (utilizando o reagente Trizol, Invitrogen), então submetidos à transferência em membrana do RNA (de acordo com os métodos experimentais de "Molecular Cloning", Science Press, Peking, 1999) e finalmente um híbrido de Northern com SNAC2 foi utilizado como uma sonda. O resultado mostrou que a expressão do gene SNAC2 clonado na presente invenção pode ser induzida pela seca, pelo frio, pela alta salinidade e pelo ABA (mostrado como na figura 2), portanto considerado um fator de transcrição associado ao estresse. Exemplo 3: Construção e transformação do vetor de superexpressão do gene SNAC2

O Exemplo 2 anterior mostrou que a expressão do gene SNAC2 da presente invenção pode ser induzida pela seca, pelo frio, pela alta salinidade e pelo ABA. Para ilustrar melhor a função deste gene, o gene SNAC2 foi superexpresso no arroz e verificado através do fenótipo de plantas transgênicas. O processo compreende as etapas a seguir de: digestão dupla do plasmídeo pGEM-SA/AC2 com o clone positivo obtido no Exemplo 1 com SamHI e KpnY, recuperação de fragmentos exógenos; ao mesmo tempo, clivagem enzimática do vetor de transformação genética pU1301 com o promotor forte do milho Ubiquitinl (que é reconstruído com base em um vetor de transformação genética vegetal comum pCAMBIA1301 do Australia CAMBIA Laboratory (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture), que carrega o promotor forte do milho Ubiquitinl com características constitutivas e de superexpressão, mediadas por Agrobacterium) da mesma maneira; extração e purificação dos produtos clivados enzimaticamente como clorofórmio:isopentanol (24:1) após a clivagem enzimática. A reação de ligação foi realizada através da utilização dos fragmentos da clivagem enzimática que compreendem o gene SNAC2 e o vetor pU1301 clivado enzimaticamente (mostrado como a Figura 8), transformando E. coli DHIOp (obtida na Invitrogen Inc.). Os clones positivos foram verificados através da clivagem enzimática para a obtenção de um vetor transformado.

O vetor transformado foi introduzido na variedade de arroz "ZhongHua 11" (uma variedade de arroz disponível publicamente fornecida 25 pelo China National Rice Research Institute) utilizando um sistema de transformação genética de arroz mediado por Agrobacterium. Uma planta transgênica foi então finalmente obtida através do pré-cultivo, da infestação, do co-cultivo, da verificação do calo com resistência à higromicina, da diferenciação, do enraizamento, do estabelecimento de mudas e do transplante. O 30 sistema de transformação genética de arroz (subespécies de arroz japônica) mediado por Agrobacterium foi otimizado com base no método relatado por Hiei e outros (Ver: Efficient transformation of Rice, Oryza sativa L., mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA1 1994, Plant Journal 6:271-282).

A planta de arroz transgênica obtida foi denominada de T050U. A presente invenção obteve no total 23 plantas de arroz transgênicas inde5 pendentes.

Exemplo 4: Verificação de Resistência ao Frio da Família T2 Transgênica para o Gene SNAC2 no Estágio de Muda

Para verificar se a resistência ao frio de plantas de arroz transgênicas foi aumentada e se tal aumento estava relacionado a um gene SNAC2 introduzido, a expressão do gene SNAC2 em uma parte das plantas de arroz transgênicas foi detectada através da tecnologia de hibridização de Northern na presente invenção (a figura 3 mostra os resultados da hibridização de Northern, em que o método era o mesmo que o utilizado no Exemplo 2) e uma parte das famílias de plantas da geração T2 da presente invenção foi verificada em relação à resistência ao frio. As etapas específicas eram as seguintes: as sementes das famílias da geração T2 foram germinadas em meio MS contendo 50 mg/mL de higromicina durante 5 dias, após os quais as mudas que possuíam substancialmente o mesmo nível de germinação foram transplantadas em pequenos baldes vermelhos, dos quais a metade foi plantada com plantas superexpressas transgênicas e a outra metade foi plantada com plantas de controle do tipo selvagem. Quando as plantas cresceram até o estágio de 4 folhas, estas foram submetidas ao tratamento de baixa temperatura a 4°C. Após 5 dias de tratamento, foi observado que não ocorreram quaisquer alterações significativas nos fenótipos das plantas transgênicas ou das plantas de controle. Entretanto, após estas terem sido mudadas para as condições normais para a recuperação do crescimento durante 3 dias, foi observado que a maior parte das plantas de controle tinha folhas que estavam enroladas e ficaram murchas, enquanto apenas algumas das folhas das plantas transgênicas ficaram murchas; 7 dias após a recuperação do crescimento, quase todas as plantas de controle morreram, enquanto, em contraste, quase 50% da família superexpressa transgênica sobreviveram (figura 4). Isto provou que o gene SNAC2 estava, sem dúvida, relacionado à resistência ao frio e sua superexpressão podia aumentar a resistência ao frio de plantas transgênicas e que o aumento da resistência de plantas de arroz transgênicas estava certamente relacionado ao gene SNAC2 introduzido.

Exemplo 5: Verificação de Resistência à Salinidade da Família T2 Transgênica para o Gene SNAC2 no Estágio de Muda

Foi provado no Exemplo 4 que o desempenho de resistência ao frio de plantas transgênicas para o gene SNAC2 da presente invenção no estágio de muda era significativamente maior que o do controle. Para verifi10 car se SNAC2 é capaz de proteger as plantas contra outros estresses, o desempenho de crescimento das plantas em um ambiente de alta salinidade foi comparado neste exemplo. A comparação é instruída como a seguir: a geração T2 da família de superexpressão transgênica foi germinada em meio MS contendo 50 mg/L de higromicina durante 4 dias, então as mudas transgêni15 cas e as mudas de controle, que tinham o mesmo crescimento, foram transplantadas em caixas quadradas pequenas possuindo meio MS contendo 150 mmols/L de NaCI para manter o crescimento. O crescimento foi observado e 18 dias depois, foi feita uma medida no comprimento da raiz e na altura das plantas de cada muda jovem. Foi observado que não havia diferença no 20 comprimento da raiz entre a planta transgênica com superexpressão de SNAC2 ou com expressão que pode ser induzida de SNAC2 e a planta de controle crescida na condição de alta salinidade. Entretanto, havia uma diferença evidente na altura da planta. O crescimento da planta de controle era substancialmente inibido na condição de alta salinidade, atingindo apenas 25 60% daquele da família de superexpressão transgênica (figura 5). Isto mostrava que a muda transgênica com superexpressão de SNAC2 tinha maior tolerância à salinidade que a planta de controle, sugerindo que a planta transgênica para SNAC2 da presente invenção pode aumentar substancialmente a resistência à salinidade nas plantas.

Exemplo 6: Gene SNAC2 que possui Propriedades de Ativação da Transcrição e de Ligação ao DNA

As 3 repetições em tandem da região promotora OsERDI de 90 bp

(5'

CCCCGCGCGACGTCGACAAGTCGACAAGTGCGAGGAGCTAGCCATGT

GGGTCGTGCCCGCGCGCGCCACGGCACGGCAACCCCGGAAACG-3',

SEQ ID N0:7) compreendendo as seqüências centrais CATGTG e CACG foram sintetizadas no local com sítios de EcoR\ e Sacl em ambas as extremidades e foram ligadas diretamente no vetor de levedura pHIS2. Os clones positivos foram verificados e selecionados com o mesmo método de digestão enzimática, produzindo o vetor de transformação de levedura pHIS2-cis. 10 As etapas específicas para a execução do ensaio de transativa

ção eram as seguintes:

1. O gene SNAC2 de comprimento completo foi fundido ao vetor de expressão de levedura pDEST32 (obtido na Invitrogen Inc.).

Os iniciadores do gene foram planejados de acordo com o quadro aberto de leitura do vetor pDEST32 com base na seqüência do clone de cDNA de comprimento completo (utilizando o software Primer 5.0). Os produtos da PCR obtidos foram purificados por PEG8000, antes de serem submetidos a uma reação de recombinação BP com um vetor intermediário pDONR221 (obtido na Invitrogen Inc.). O sistema de reação estava em um volume de 5 pL, incluindo 200 ng do produto da PCR, 50 ng de pDONR221, 2 pL de 5X BP Clonase Reaction Buffer e 2 pL de BP Clonase Mix e foi incubado para reação a 25°C durante aproximadamente 5 h. Uma E. coli DH10p (obtida na Invitrogen Inc.) foi transformada com o produto de reação para selecionar os clones positivos. Os plasmídeos dos clones positivos desejados foram finalmente submetidos a uma reação de recombinação LR, de forma que o fragmento gênico carregado pelo plasmídeo do clone positivo desejado foi fundido ao vetor de expressão de levedura pDEST32. A dita reação de recombinação LR é instruída como a seguir: uma E. coli DHIOp (obtida na Invitrogen Inc.) foi transformada a 25°C durante aproximadamente 5 h com 100 ng de plasmídeo positivo da reação BP, 50 ng de pDEST32, 2 pL de 5X LR Clonase Buffer e 2 pL de LR Clonase Mix e os clones positivos foram selecionados. 2. Preparação e transformação de levedura competente (CLONTECH1 Yeast Protocols Handbook) através do método de acetato de lítio (LiAc)

1) Reagente e Fórmula A. Meio YPD:

20 g de Difco peptona 10 g de Extrato de levedura 20 g de glicose

diluídos com água destilada até 1 L e esterilizados durante 15 minutos.

B. Meio SD/Leu:

6,7 g de Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos 20 g de Pó de Ágar 20 g de glicose

0,69 g de -Leu DO Supplement (obtido na CLONTECH Inc.)

diluídos com água destilada até 1 L e esterilizados durante 15 minutos.

C. Tampão 10 TE: 0,1 M de Tris-HCI, 10 mM de EDTA, pH 7,5, esterilizado

D. 10 LiAc: 1 M de acetato de lítio, pH 7,5, esterilizado

E. Solução de PEG/LiAc

Concentração Final Para preparar 10 mL de solução

PEG4000 40% 8 mL de 50% de PEG

Tampão TE 1X 1mLde10XTE

LiAc 1X ImLdeIOXLiAc

2) Etapas:

A. A colônia isolada de levedura com diâmetro de 2 a 3 mm foi

dispersa com 1 mL de solução de YPD e então transferida para um frasco triangular contendo 10 mL de meio YPD.

B. Cultivada sob a rotação de 250 rpm a 30°C durante 16 a 18 h, de forma que a D0600>1,5.

C. Aproximadamente 5 mL da solução de levedura mencionada

anteriormente foram transferidos para outro frasco triangular contendo 50 mL de meio YPD e a concentração foi detectada para obter D0600 = 0,2-0,3.

D. Cultivados a 30°C durante 3 h (230 rpm), neste ponto D0600 = 0,4 a 0,6 (se a D0600<0,4, a cultura pode estar com problema).

E. A solução de levedura foi transferida para um tubo de centrífuga de 50 ml_ e centrifugada a 1000xg durante 5 minutos à temperatura ambiente.

F. O sobrenadante foi descartado, as células foram ressuspen

sas com água duplamente destilada esterilizada e centrifugadas a 1000xg durante 5 minutos à temperatura ambiente.

G. O sobrenadante foi descartado, as células de levedura foram misturadas de forma homogênea com 1 mL de 1xTE/1xLiAc recém

preparado.

H. 200 ng do DNA do plasmídeo de fusão foram colocados em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e 100 μΙ_ de células competentes de levedura foram adicionados e misturados de forma homogênea, então 600 μΙ_ de PEG/LiAc foram adicionados, misturados de forma homogênea através de

centrifugação em velocidade alta e cultivados a 30°C durante 30 min (200 rpm).

I. 70 pL de DMSO (100%) foram adicionados, invertidos suavemente várias vezes, colocados em banho de água a 42°C durante 15 min e então colocados em gelo durante 2 min.

J. Centrifugados a 14000 rpm durante 5 segundos à temperatura

ambiente, o sobrenadante foi descartado e as células foram dispersas com 500 pL de 1x tampão TE.

K. 100 pL de células transformadas foram revestidas uniformemente sobre uma placa de -Leu/SD, cultivados de forma invertida em uma

incubadora a 30°C durante 2 a 4 dias, até que os clones aparecessem.

3. Verificação da atividade de transcrição do gene SNAC2 e do mutante de deleção do mesmo com base na expressão do gene repórter LacZ no ensaio de beta-galactosidase

1) Reagente e Formulação

A. Tampão Z

Na2HPO4^H2O 16,1 g/L

NaH2PO4-H2O 5,5 g/L KCI 0,75 g/L

MgSO4TH2O 0,246 g/L

pH ajustado em 7,0 e esterilizado.

B. Solução estoque de X-gal (20 mg/mL)

C. Solução de tampão Z/solução de X-gal:

100 mL de tampão Z:

0,27 mL de β-mercaptoetanol 1,67mL de solução estoque de X-gal

2) Etapas:

A. Foi permitido que o clone transformado crescesse até 1 a 3

mm (30°C, 2 a 4 dias)

B. Papel de filtro Watman esterilizado redondo de tamanho apropriado foi colocado sobre a placa asséptica de 10 cm, aproximadamente 2,5 a 5 mL de tampão Z/solução de X-gal foram adicionados para umedecer

o papel de filtro e foi evitada a formação de bolhas.

C. Outro papel de filtro esterilizado limpo foi colocado através de uma pinça sobre a placa de Petri com o clone em crescimento e o papel de filtro foi ligeiramente pressionado para se aderir o clone ao papel de filtro.

D. Quando o papel de filtro estava umedecido, este foi descober

to através da pinça e o papel de filtro foi colocado em nitrogênio líquido durante 10 s com a superfície aderida com os clones com a face para cima, então foi descongelado à temperatura ambiente para romper as células de levedura.

F. O papel de filtro com a superfície aderida com os clones com

a face para cima foi colocado cuidadosamente sobre o papel de filtro umedecido anteriormente e foi evitada a formação de bolhas.

G. O papel de filtro foi colocado a 30°C (30 min a 8 h) e o fato do gene ter a função de ativação foi determinado de acordo com a ocorrência de ponto azul.

As etapas de implementação específicas do ensaio de um híbri

do de levedura eram como a seguir:

1. O gene SNAC2 de comprimento completo foi fundido ao vetor de expressão de levedura pGAD-Rec2 (obtido na CLONTECH Inc.).

Os iniciadores do gene F (5-TAGAATTCGACGAGGAGCT GGT GATGC-3, iniciador específico mais o sítio de clivagem enzimática EcoR\) e R (5-TAGGATCCCCTCGTCGTCGTTCAGTCC-3,

iniciador específico mais o sítio de clivagem enzimática BamH\) foram planejados de acordo com o quadro aberto de leitura do vetor pGAD-Rec2 com base na seqüência do clone de cDNA de comprimento completo. Os produtos da PCR obtidos foram digeridos duplamente, purificados com clorofór10 mio:isopentanol e ligados ao vetor pGAD-Rec2 submetido à mesma digestão dupla. A E. coli ϋΗ10β (obtida na Invitrogen Inc.) foi transformada e os clones positivos foram selecionados e verificados com o mesmo método de digestão enzimática, produzindo o vetor de transformação de levedura pGADSNAC2.

2. As 3 repetições da seqüência da região promotora OsERDI

de 90 bp contendo as seqüências centrais CATGTG e CACG foram ligadas no vetor pHIS2 (obtido na CLONTECH Inc.).

As 3 repetições em tandem da região promotora OsERDI de 90

bp

(5’

CCCCGCGCGACGTCGACAAGT CGACAAGTGCGAGGAGCTAGCCAT GT GGGTCGTGCCCGCGCGCGCCACGGCACGGCAACCCCGGAAACG-3') compreendendo as seqüências centrais CATGTG e CACG foram sintetizadas no local com sítios de EcoRI e Sacl em ambas as extremidades e foram 25 ligadas diretamente no vetor de levedura pHIS2. Os clones positivos foram verificados e selecionados com o mesmo método de digestão enzimática, produzindo o vetor de transformação de levedura pHIS2-cis.

3. As células competentes foram preparadas e a transformação foi realizada com um vetor de levedura (o método era o mesmo que o do ensaio de transativação). As células transformadas com o vetor binário desejado (preparando ao mesmo tempo o controle positivo e o controle negativo) foram revestidas sobre uma placa de Petri de SD/Leu-/Trp-, então cultivadas em uma incubadora a 30°C, até que o tamanho de colônia fosse de aproximadamente 2 mm.

4. A mesma colônia foi cultivada por estriamento em uma placa de Petri de SD/Leu-/Trp-/His- contendo 0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM e 40 mM de 3-AT e o desempenho de crescimento foi observado.

Exemplo 7: Localização subcelularde SNAC2

Para determinar a localização da expressão do gene SNAC2 em uma célula, foi construída uma proteína de fusão GFP-NLS (sinal de localização nuclear). Ou seja, o perfil de expressão do gene na célula foi determinado de acordo com a expressão de GFP. Era sabido que o sinal de localização nuclear (NLS) do gene NAC pode estar localizado em 71-83 AA de acordo com os artigos publicados anteriormente sobre o gene NAC (Miki Fujita, Kazuo Shinozaki e outros, A Dehydration-induced NAC protein, RD26, is involved in a novel ABA-dependent stress-signaling pathway." Plant J (2004) 39, 863-876 e Honghong Hu e outros, "Over expressing a NAM1 ATAF and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice." Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 12987-12992). Neste contexto, a localização subcelular do gene foi determinada de acordo com a região de expressão na célula desta seqüência fundida com GFP. O fragmento de 1-144 AA da seqüência da presente invenção foi fundido com um vetor pCAMBIAI391-GFP (que carrega o promotor ubiquitinl), através do que a localização celular da proteína SNAC2 pode ser deduzida de acordo com a localização de expressão de GFP na célula em plantas transgênicas Psamc2:Z1S/V/4C2-GFP. O vetor pCAMBIAI 391-EGFP (ver a figura 9) foi reconstruído com base no pCAMBIAI 391 (um vetor de transformação genética de plantas comumente utilizado no mundo), em que o gene GUS carregado foi substituído pelo gene EGFP, com o promotor Ubiquitinl precedendo a GFP. O vetor pCAMBIAI391 era do Australia CAMBIA Laboratory (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture) e está disponível publicamente.

O método para a construção do vetor gênico fundido foi descrito como a seguir: os iniciadores PF (5-GGATCCCTCCTCTCCTCTTCCCAT, SEQ ID NO: 8, mais Iigante de sítio BamH\) e PR (5- GAATTCGTTCTTCTTGCGG, SEQ ID NO: 9, mais Iigante com EcoR\) foram planejados; o vetor pGEM-SNAC2 construído no Exemplo 1 anterior foi utilizado como molde. O gene SNAC2 foi amplificado através de um programa 5 de amplificação de pré-desnaturação a 94°C durante 3 min; 30 ciclos de 94°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, 72°C durante 3 min; extensão a 72°C durante 5 min; e o produto amplificado sofreu digestão dupla com EcoRI e Hindlll e foi ligado em um vetor pCAMBIAI391-EGFP que foi submetido à mesma digestão dupla. O calo de arroz foi transformado com o vetor de fu10 são p1391-GFP-NLS utilizando um método de transformação genética mediado por agrobactéria (o mesmo que o método utilizado no Exemplo 3), o calo com resistência foi obtido sob pressão seletiva com higromicina (métodos específicos que são descritos no Exemplo 3) e a expressão de GFP foi observada sob microscopia fluorescente (ver a figura 7A). O calo com resistên15 cia expressa foi dividido em partes e observado sob microscopia confocal para determinar a expressão intracelular de GFP. A figura 7B mostra que a GFP é expressa somente nos núcleos sob a observação por microscopia confocal, que indica que a seqüência de 1-144 AA já inclui o NLS1 de forma que a GFP podia ser localizada nos núcleos, isto é, a proteína SNAC2 foi 20 localizada nos núcleos. Este exemplo provou que o fragmento de 1-144 AA da seqüência de acordo com a presente invenção inclui um NLS intacto e que a proteína SNAC2 fica localizada no núcleo da célula.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> Huazhong Agricultural University 25 <120> MELHORIA DO DESEMPENHO DE PLANTAS TOLERANTES AO FRIO E A SAIS COM O GENE SNAC2 DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO DO ARROZ <130>

<141 > 2007-3 <160> 2

<170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 1529 <212> cDNA <213> Oryzasativa <220>

<221 > ORF

<222> (113)..(1024)

G CCAAGCCCT CCT CT CCT CTT CCCAACACT AGT AGGAT AAAGCCACAGA GAGAGCAGTAGTAGTAGCGAGCTCGCCGGAGAACGGACGATCACCGG AGAAGGGGGAGAGAGATGAGCGGCGGTCAGGACCTGCAGCTGCCGCC 10 GGGGTTCCGGTTCCACCCGACGGACGAGGAGCTGGTGATGCACTACCT CTGCCGCCGCTGCGCCGGCCTCCCCATCGCCGTCCCCATCATCGCCG AGAT CGACCT CT ACAAGTT CGAT CCAT GGCAGCTT CCCCGGAT GGCGC T GT ACGGAG AGAAGG AGT GGT ACTT CTT CT CCCCGCG AG ACCGCAAGT ACCCGAACGGGTCGCGGCCGAACCGCGCCGCCGGGTCGGGGTACTG 15 GAAGGCGACCGGCGCCGACAAGCCGGTGGGCTCGCCGAAGCCGGTG GCGATCAAGAAGGCCCTCGTCTTCTACGCCGGCAAGGCGCCCAAGGG CGAGAAGACCAACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCGCCGACGTCGA CCGCTCCGCCCGCAAGAAGAACAGCCTCAGGTTGGATGATTGGGTGCT GTGCCGGATTTACAACAAGAAGGGCGGGCTGGAGAAGCCGCCGGCCG 20 CGGCGGTGGCGGCGGCGGGGATGGTGAGCAGCGGCGGCGGCGTCCA GAGGAAGCCGATGGTGGGGGTGAACGCGGCGGTGAGCTCCCCGCCG GAGCAGAAGCCGGTGGTGGCGGGGCCGGCGTTCCCGGACCTGGCGG CGTACTACGACCGGCCGTCGGACTCGATGCCGCGGCTGCACGCCGAC T CGAGCT GCT CGGAGCAGGTGCT GT CGCCGGAGTT CGCGT GCG AGGT 25 GCAGAGCCAGCCCAAGATCAGCGAGTGGGAGCGCACCTTCGCCACCG TCGGGCCCATCAACCCCGCCGCCTCCATCCTCGACCCCGCCGGCTCC GGCGGCCTCGGCGGCCTCGGCGGCGGCGGCAGCGACCCCCTCCTCC AGGACATCCTCATGTACTGGGGCAAGCCATTCTAGACGACCAAAAAAAA AAAAAAACAACCGCATTGGCAGCAATGGTGTCACTGAACACCGTGCAG 30 GCTAGCTAGCTTCATGGCCGGTGAACTTTGACTCAGGCGAGCCGCCGG AGTT GACT CAAAGAT AATT AAAAGAAGT GTTTT AAGTGG ATTGG ATT GGA TTAGACAGAGGAGATGAGGACTCGAGAAAGGCGGCGATGAGACCGTG GTTGGGGGGACCCTGGCCTGGACTGAACGACGACGAGGCAGCAGCAG AAAGAT GGTG CAATT G CAT C G G GTG G CAT GT CAGT GTGTGT GT ATAGTG G CAT GTACAT AGT ACAT G GT GATT GATT CGGTATACAG G GGG CT AG CTT TCCT GTTT CT GTTT CTT CATT G GTT AATTATTACTCCCATTATAAG GT CTT 5 CTT CAGGGTT GCT AGCTT AATT AATT AATT AATT AGCCCAGT GGTT GAAG T GT AAGT CAAAATT CAT CAAGT CAG AG ACT GGAAT AATACAAT ACAGT AC TGC

Claims

1. Planta transformada caracterizada pelo fato de que compreende uma construção de DNA recombinante que compreende um promotor funcional em uma célula vegetal posicionado para fornecer a expressão de um polinucleotídeo que possui uma seqüência com pelo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade em relação aquele nas posições 112-1023 da SEQ ID NO:1.

2. Planta transformada caracterizada pelo fato de que compreende uma construção de DNA recombinante que compreende um promotor funcional em uma célula vegetal posicionado para fornecer a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico ao codificado pela seqüência de polinucleotídeo nas posições 112-1023 da SEQ ID NO:1.

3. Planta transformada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita planta é uma planta de cultivo.

4. Processo de produção de uma planta transformada que possui uma propriedade melhorada, caracterizado pelo fato de que compreende a transformação de uma planta com uma construção recombinante que compreende um promotor funcional em uma célula vegetal posicionado para fornecer a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo útil para aumentar a tolerância ao frio, a tolerância à seca ou a tolerância a sais de uma planta, em que o dito polinucleotídeo possui uma seqüência com pelo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade em relação aquele nas posições 112-1023 da SEQ ID NO:1.

5. Processo de produção de uma planta transformada que possui uma propriedade melhorada, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende a transformação de uma planta com uma construção recombinante que compreende um promotor funcional em uma célula vegetal posicionado para fornecer a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo útil para aumentar a tolerância ao frio, a tolerância à seca ou a tolerância a sais de uma planta, em que o dito polipeptídeo é pelo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico ao codificado pela seqüência de polinucleotídeo nas posições 112-1023 da SEQ ID NO:1.

6. Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a dita planta transformada é uma planta de cultivo.

7. Planta que exibe uma propriedade melhorada quando comparada à planta de controle, caracterizada pelo fato de que a característica alterada é selecionada do grupo que consiste em maior tolerância ao frio, maior tolerância à privação de água e maior tolerância a sais ou combinações das mesmas, em que a planta possui maior expressão ou atividade de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que possui pelo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade aquele nas posições 112-1023 da SEQ ID NO:1.

8. Planta que exibe uma propriedade melhorada quando comparada à planta de controle, caracterizada pelo fato de que a característica alterada é selecionada do grupo que consiste em maior tolerância ao frio, maior tolerância à privação de água e maior tolerância a sais ou combinações das mesmas, em que a planta possui maior expressão ou atividade de um polipeptídeo pelo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou95% idêntico ao codificado pela seqüência de polinucleotídeo nas posições 112-1023 da SEQ ID NO:1.

9. Planta transformada de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a dita planta é uma planta de cultivo.