BRPI0808413A2 - Sal de hidrocloreto de 5-[3-(3-hidroxifenóxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenilhe xanamida, composição farmacêutica contendo o mesmo, bem como uso - Google Patents

Description

“SAL DE HIDROCLORETO DE 5-[3-(3-HIDROXIFENÓXI)AZETIDIN-1-IL]-5- METIL-2.2-DIFENILHEXANAMIDA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO O MESMO, BEM COMO USO”

A invenção diz respeito ao sal de 5-[3-(3-hidroxifenóxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2- difenilhexanamida e a processos para a preparação de, intermediários usados na preparação de, composições que contém, e os usos de, ditos compostos.

A invenção também diz respeito às formas derivadas do sal de 5-[3-(3- hidroxifenóxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenilhexanamida, incluindo hidratos, solvatos, e polimorfos dos mesmos.

Os receptores muscawnicos colinérgicos são membros da superfamília de receptores de acopIãmentoTia proteína-G e são adicionalmente subdivididos em 5 subtipos, M1 a M5. Os subtipos de receptores muscarínicos são vastamente e diferentemente expressos no corpo. Genes foram clonados para todos os 5 subtipos e destes, os receptores M1, M2 e M3 foram caracterizados farmacologicamente de forma ampla em tecidos de animais e humanos. Os receptores são expressos no cérebro (córtex e hipocampo), glândulas e nos gânglios dos nervos parassimpáticos e simpáticos. Os receptores M2 são expressos no coração, cérebro posterior, músculo liso e nas sinapses do sistema nervoso autônomo. Os receptores M3 são expressos no cérebro, glândulas e músculo liso. Nas vias aéreas, o estímulo de receptores M3 causa a contração do músculo liso das vias aéreas levando a broncoconstricção, enquanto o receptor M3 da glândula salivar estimula o aumento de secreção de muco e fluido, levando ao aumento da salivação. Os receptores M2 expressos no músculo liso são conhecidos por serem pró-contráteis enquanto os receptores M2 pré-sináticos modulam a liberação de acetilcolina a partir dos nervos parassimpáticos. O estímulo de receptores M2 expressos no coração produz braquicardia.

Antagomistas muscarínicos de longa e curta ação são usados no controle de asma e COPD; estes incluem o agente de curta ação Atrovent® (brometo de ipratrópio) e Oxivent® (brometo- de oxitrópio) e o agente de longa ação Spiriva® (brometo de tiotrópio). Estes compostos produzem broncodilatação após administração por inalação. Além disso, para melhoramentos nos valores espirométricos, o uso de antimuscarínico na doença obstrutiva crônica pulmonar (COPD) está associado com melhoramentos no escore de estado de saúde e qualidade de vida. Como uma conseqüência da vasta distribuição de receptores muscarínicos no corpo, a exposição sistêmica a antagonistas muscarínicos está associada com efeitos tais como, boca seca, constipação, midríase, retenção urinária (todas predominantemente mediadas por meio de bloqueadores de receptores M3) e taquicardia (mediada por bloqueio de mediadores de M2). Um efeito colateral comumente relatado após administração por inalação de dose terapêutica dos antagonistas muscarínicos não seletivos usados clinicamente, atuais é a boca seca e enquanto isto é relatado apenas como brando em intensidade isto limita a dose do agente de inalação dado.

Consequentemente, ainda existe a necessidade de melhorar os antagonistas de receptores M3 que devem ter um perfil farmacológico apropriado, por exemplo, em 5 termos de potência, farmacocinética ou duração de ação. Neste contexto, a presente invenção diz respeito a novos antagonistas de receptores M3. Existe uma necessidade de antagonistas de receptores M3 que possuam um perfil farmacológico adequado para uma administração pela rota de inalação.

A invenção diz respeito ao sal de 5-[3-(3-hidroxifenóxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2- difenilhexanamida e suas forma derivadas.

Preferencialmente, a invenção diz respeito a uma forma cristalina do sal de 5- [3-(3-hidroxifenóxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenilhexanamida.

Preferencialmente, a invenção diz respeito a uma forma cristalina não solvatada do sal de 5-[3-(3-hidroxifenóxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenilhexanamida.

Preferencialmente, o sal de hidrocloreto da invenção possui um padrão de di

fração de raio-X caracterizado pelos seguintes picos principais de padrão de difração de raio-X expressos em termos de ângulo teta-2 quando medidos usando-se radiação Κσ1 Cu ( comprimento de onda = 1,5406 Á).

Ângulo teta-2*

Ίΰ

11,2 ^3J

18,3

19,7

Preferencialmente, o sal de hidrocloreto da invenção possui um padrão de difração de raio-X caracterizado pelos seguintes picos principais de padrão de difração de raio-X expressos em termos de ângulo teta-2 quando medidos usando-se radiação Κσ1 Cu ( comprimento de onda = 1,5406 Á).

Ângulo teta-2*

7^

9J

ΪΤ2

13J 14^8 18^

19,7 Preferencialmente, o sal de hidrocloreto da invenção possui um padrão de difração de raio-X caracterizado pelos seguintes picos principais de padrão de difração de raio-X expressos em termos de ângulo teta-2 quando medidos usando-se radiação Κσ1 Cu ( comprimento de onda = 1,5406 Á).

Ângulo teta-2*

~7\5

11,2

13.7

14.8

18.3

19,7

23.4

28,3

Foi verificado agora que o sal de hidrocloreto da invenção é um antagonista do

receptor M3, que é particularmente útil para o tratamento de doenças e/ou condições mediadas por M3, e mostra potência boa, em particular quando administrado por via da rota de inalação. O sal de hidrocloreto da invenção é particularmente adequado para uma administração pela rota da inalação. Em particular, o sal de hidrocloreto da invenção pode ser formulado para uma administração usando inalador de pó seco.

O sal de hidrocloreto da invenção exibe propriedades que incluem aquelas da estabilidade do estado sólido e compatibilidade com certos excipientes de produto de droga que confere esta superioridade para sua base livre correspondente.

O sal de hidrocloreto da invenção pode ser preparado a partir de 5-[3-(3- hidroxifenóxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenilhexanamida de acordo com processos convencionais para a preparação de sais, tais como aqueles descritos no “Handbook of Pharmaceutical Salts, Prorperties, Selection and Use. Publicado por Wiley-VCH, 2002. Editado por P. Heinrich Stahl, Camille G Wermuth. ISBN 3-906390-26-8”.

O sal de hidrocloreto de 5-[3-(3-hidroxifenóxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2- 20 difenilhexanamida pode existir tanto nas formas solvatadas quanto nas não solvatadas. O termo “solvato” é usado aqui para descrever um complexo molecular que compreende o sal de hidrocloreto da invenção e uma quantidade estequiométrica de uma ou mais moléculas de solvente aceitáveis farmaceuticamente, por exemplo, etanol. O termo “hidrato” é empregado quando o dito solvente é água.

Incluídos no escopo da invenção estão complexos, tais como, complexos de

inclusão droga-hóspede, clatratos em que, ao contrário dos solvatos mencionados anteriormente, a droga e o hóspede estão presentes em quantidades estequiométricas e não estequiométricas. Também incluídos são os complexos de drogas que compreendem dois ou mais componentes inorgânicos e/ou orgânicos que podem estar em quantidades estequiométricas e não estequiométricas. Os complexos resultantes podem ser ionizados, parcialmente ionizados, ou não ionizados. Para uma revisão de tais complexos, vide J Pharm Sci1 64 (8), 1269-1288 por Haleblian (Agosto de 1975).

Polimorfos e hábitos/morfologia do sal de hidrocloreto da invenção são também incluídos dentro do escopo da invenção.

O termo “sal de hidrocloreto da invenção” inclui 5-[3-(3-hidroxifenóxi)azetidin-1- il]-5-metil-2,2-difenilhexanamida e suas formas derivadas.

O sal de hidrocloreto da invenção é um composto ativo farmaceuticamente valioso, que é adequado para terapia e profilaxia de vários distúrbios nos quais os receptores muscarínicos estão envolvidos ou nos quais o antagonismo desse receptor pode induzir benefício, em particular doenças das vias aéreas alérgicas e não alérgicas (por exemplo, asma, COPD...) mas também no tratamento de outras doenças tais como doença inflamatória do intestino, doença irritável do intestino, doença diverticular, enfermidade motora, úlceras gástricas, exame radiológico do intestino, tratamento simpático de BPH (hiperplasia prostática benigna), ulceração gástrica induzida por MSAID, incontinência urinária (incluindo a de premência, de frequência, incontinência de urgência, bexiga super-ativa, sintomas do trato urinário inferior e noctúria), cicloplegia, doença de Parkinson e midriática.

O sal de hidrocloreto da invenção pode ser administrado de acordo com a invenção em animais, preferencialmente em mamíferos em particular em humanos como produto farmacêutico para terapia e ou profilaxia. O mesmo pode ser administrado por si, em misturas com um outro ou na forma preparações farmacêuticas que como constituinte ativo contém uma dose eficaz do sal de hidrocloreto da invenção, em adição a aditivos e ou excipientes inócuos farmaceuticamente usuais.

O sal de hidrocloreto da invenção pode ser liofilizado, seco por pulverização, seco de forma evaporativa para proporcionar um plugue sólido, pó ou filme de material amorfo ou cristalino. A secagem por frequência de rádio ou microondas pode ser usada para esse propósito.

O sal de hidrocloreto da invenção pode ser administrado individualmente ou em combinação com outras drogas e será geralmente administrado como uma formulação em associação com um ou mais excipientes aceitáveis farmaceuticamente. O termo “excipiente” é usado aqui para descrever qualquer ingrediente diferente do sal de hidrocloreto da invenção. A escolha do excipiente será em grande extensão dependente do modo particular de administração. O sal de hidrocloreto da invenção pode ser administrado diretamente na corrente sanguínea, no músculo, ou em um órgão interno. Meios adequados para administração parenteral incluem a intravenosa, intra-arterial, intraperitonial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracranial, intramuscular e subcutânea. Dispositivos adequados para administração parenteral incluem injeções com agulha (incluindo microagulhas), injeções sem agulha e técnicas de infusão. Formulações parenterais são tipicamente soluções aquosas que podem conter excipientes tais como sais, carboidratos e agentes tamponantes (preferencialmente para um pH de 3 a 9), mas para algumas aplicações, eles podem ser mais adequados formulados como uma solução estéril não aquosa ou como uma forma seca a ser usada em conjunto com um veículo adequado tal como água sem pirogênio estéril.

A preparação de formulações parenterais sob condições estéreis, por exemplo, por liofilização, pode prontamente ser efetuado usando técnicas farmacêuticas padrões bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

Formulações para administração parenteral podem ser formuladas para liberação modificada e/ou imediata. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada a um alvo e programada. Desse modo, o sal de hidrocloreto da invenção pode ser formulado como um sólido, semissólido, ou líquido tixotrópico para administração como depósito implantado que proporciona liberação modificada do composto ativo. Exemplos de tais formulações incluem stents revestidos com droga e microesferas de ácido PGLApoli(dl-láticocoglicólico).

Os sais de hidrocloreto da invenção também podem ser administrados topicamente na pele ou mucosa, isto é, dermatologicamente ou transdermicamente. Formulações típicas para este propósito incluem géis, hidrogéis, loções, soluções, cremes, ungüentos, pós para polvilhamento, pensos, espumas, filmes, adesivos de pele, pastilhas, esponjas, fibras, bandagens e microemulsões. Os Iipossomas também podem ser usados. Carreadores típicos incluem álcool, água, óleo mineral, petrolato líquido, petroIato branco, glicerina, polietileno glicol, propileno glicol. Os intensificadores de penetração podem ser incorporados - vide, por exemplo, J Pharm Sci1 88 (10), 955-958 por Finnin e Morgan (Outubro de 1999).

Outros meios de administração tópica incluem distribuição por eletroporação, iontoforese, fonoforese, sonoforese e injeção sem agulha ou microagulha (por exemplo, Powderject ™, Bioject ™, etc.).

As formulações para administração tópica podem ser formuladas para serem de liberação modificada e/ou imediata. As formulações de liberação modificada incluem a liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada a um alvo e programada.

O sal de hidrocloreto da invenção também pode ser administrado intranasalmente ou por inalação, tipicamente na forma de um pó seco (individualmente, como uma mistura, por exemplo, em uma mistura seca com lactose, ou como uma partícula 5 de componente misturada, por exemplo, misturada com fosfolipídios, tais como, fosfatidilcolina) a partir de um inalador de pó seco ou como um pulverizador de aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, pulverizador, atomizador (preferencialmente um atomizador usando forças eletrohidrodinâmicas para produzir uma névoa fina), ou nebulizador, com ou sem o uso de um propulsor, tal como, 1,1,1,2- 10 tetrafluoroetano ou 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano. Para uso intranasal, o pó pode compreender um agente bioadesivo, por exemplo, quitosana ou ciclodextrina.

O recipiente pressurizado, bomba, pulverizador, atomizador ou nebulizador contém uma solução ou suspensão do(s) composto(s) da invenção compreendendo, por exemplo, etanol, etanol aquoso, ou um agente alternativo adequado para dispersar, 15 solubilizar ou estender a liberação do ativo, um propulsor(es) como solvente e um surfactante adicional, tal como, trioleato de sorbitana, ácido oléico, ou um ácido oligoléctico.

Antes do uso em uma formulação de suspensão ou de pó seco, o produto de droga é micronizado para um tamanho adequado para a distribuição por inalação (tipi20 camente menor que 5 mícrons). Isto pode ser alcançado por qualquer método de cominuição apropriado, tal como, moinho a jato espiral, moinho a jato com leito fluidizado, processamento com fluido supercrítico para formar nanopartículas, homogeneização a alta pressão ou secagem por pulverização.

Cápsulas (feitas, por exemplo, a partir de gelatina ou hidroxipropilmetilcelulo25 se), blisters e cartuchos para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura de pó de sal de hidrocloreto da invenção, uma base de pó adequada, tal como, lactose ou amido e um modificador de desempenho, tal como, Ileucina, manitol ou estereato de magnésio. A lactose pode estar anidra ou na forma de monohidrato, preferencialmente o último. Outros excipientes adequados incluem dex30 trana, glicose, maltose, sorbitol, xilitol, frutose, sucrose e trealose.

Uma formulação adequada para o uso em um atomizador que usa forças eletrohidrodinâmicas para produzir uma névoa fina pode conter de 1pg a 20mg do sal de hidrocloreto da invenção por atuação e o volume de atuação pode variar de 1μΙ_ a 100pL. Uma formulação típica pode compreender o sal de hidrocloreto da invenção, 35 propileno glicol, água estéril, etanol e cloreto de sódio. Solventes alternativos que podem ser usados no lugar de propileno glicol incluem glicerol e polietileno glicol.

Os flavorizantes adequados, tais como, mentol e levomentol, ou adoçantes, tais como, sacarina ou sacarina sódica, podem ser adicionados àquelas formulações da invenção planejadas para administração intranasal/inalação.

As formulações para administração intranasal/inalação podem ser formuladas para serem de liberação modificada e/ou imediata que usam, por exemplo, PGLA. As formulações de liberação modificada incluem a liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada a um alvo e programada.

No caso de inaladores de pó seco e aerossóis, a dosagem unitária é determinada por meio de uma válvula que distribui uma quantidade medida. As unidades, de acordo com a invenção, são tipicamente arranjados para administrar uma dose medida ou “puff” contendo de O1OOImg a 10mg de sal de hidrocloreto da invenção. A dose total diária estará tipicamente na faixa de 0,001mg a 40mg a qual pode ser administrada em uma dose única ou, mais usualmente, como doses divididas ao longo do dia. O sal de hidrocloreto da invenção é particularmente adequado para administração por inalação. Em particular, o sal de hidrocloreto da invenção é adequado para uma formulação com lactose como um pó seco e pode, desse modo, ser administrado usando um inalador de pó seco.

O sal de hidrocloreto da invenção pode ser administrado de forma retal ou de forma vaginal, por exemplo, na forma de um supositório, supositório vaginal ou enema. A manteiga de cacau é uma base de supositório tradicional, mas várias alternativas podem ser usadas como apropriado.

As formulações para administração retal/vaginal podem ser formuladas para serem de liberação modificada e/ou imediata. As formulações de liberação modificada incluem a liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada a um alvo e programada.

O sal de hidrocloreto da invenção pode também ser administrado diretamente aos olhos ou ouvido, tipicamente na forma de gotas de uma suspensão micronizada ou solução em salina estéril, com pH ajustado, isotônica. Outras formulações adequadas para administração ocular e auricular incluem unguentos, biodegradáveis (por exemplo, esponjas de gel absorvível, colágeno) e implantes não degradáveis (por exemplo, silicone), pastilhas, lentes, e sistemas particulados ou vesiculados, tais como, niossomas e lipossomas. Um polímero tal como ácido poliacrílico reticulado, polivinilalcool, ácido hialurônico, um polímero celulósico, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose, hidróxietilcelulose, ou metil celulose, ou um polímero de heteropolissacarídeo, por exemplo, goma gelana, podem ser incorporados em conjunto com um conservante, tal como, cloreto de banzalcônio. Tais formulações também podem ser aplicadas por iontoforese.

As formulações para administração ocular/auricular podem ser formuladas para serem de liberação modificada e/ou imediata. As formulações de liberação modificada incluem a liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada a um alvo ou programada.

O sal de hidrocloreto da invenção pode ser combinado com entidades macromoleculares, tais como, ciclodextrina e derivativos adequados dos mesmos ou polímeros contendo polietileno glicol, para melhorar sua solubilidade, taxa de dissolução, mascaramento do sabor, biodisponibilidade e/ou estabilidade para uso em qualquer dos modos de administração anteriormente mencionados.

Complexos de droga ciclodextrina, por exemplo, são conhecidos por serem geralmente úteis para a maioria das formas de dosagem e rotas de administração. Tanto 10 os complexos de inclusão quanto os de não inclusão podem ser usados. Com uma alternativa para conduzir a complexação com a droga, a ciclodextrina pode ser usada como um aditivo auxiliar, isto é, como um carreador, diluente ou solubilizador. As mais comumente usadas para estes propósitos são as alfa-, beta- e gama-ciclodextrina, exemplos das quais podem ser encontrados nos pedidos de Patente Internacional Nos. 15 WO 91/11172, WO 94/02518 e WO 98/55148.

Visto que pode ser desejável administrar uma combinação de compostos ativos, por exemplo, para o propósito de tratar uma doença ou condição particular, está dentro do escopo da presente invenção que duas ou mais composições farmacêuticas, pelo uma das quais contendo o sal de hidrocloreto da invenção, pode convenientemente ser combinada na forma de adequados Kits para co-administração das composições.

Desse modo, o kit da invenção compreende duas ou mais composições farmacêuticas estáveis separadas, pelo menos uma das quais contendo o sal de hidrocloreto da invenção de acordo com a invenção, e meios para reter de forma separada ditas composições, tais como, um recipiente, frasco dividido, pacote dividido por lâmina. Um 25 exemplo de tal kit é o pacote de blister familiar usado para o empacotamento de comprimidos, cápsulas e semelhante.

O kit da invenção é particularmente adequado para administração de formas de dosagem diferentes, por exemplo, parenteral, para administrar as composições separadas em intervalos de dosagem diferentes ou para titular as composições separa30 das uma contra a outra. Para auxiliar a conformidade, o kit tipicamente compreende direções para administração e pode estar provido com um chamado auxílio de memória.

Para administração a pacientes humanos, a dose diária total de sal de hidrocloreto da invenção está tipicamente na faixa de 0,001 mg a 500 mg dependendo, claro, do modo de administração. Por exemplo, uma dose diária intravenosa pode apenas requerer de 0,001 mg a 40 mg. A dose total diária pode ser administrada em doses únicas ou divididas e pode, a critério médico, ficar fora da faixa típica dada aqui. As dosagens são com base em uma média de indivíduos humanos tendo um peso de aproximadamente 65 kg a 70 kg. Os médicos estarão prontamente capazes de determinar doses para indivíduos cujos pesos ficam fora desta faixa, tal como, crianças e idosos.

Para evitar dúvidas, as “referências” a tratamento aqui incluem referências a cura, paliativo e tratamento profilático.

De acordo com outra modalidade da presente invenção, o sal de hidrocloreto da invenção ou composições dos mesmos, também podem ser usados como uma combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para ser co-administrado para um paciente obter algum resultado final terapêutico desejado, tal como, o tratamento de processos de doenças patofisiologicamente relevantes incluindo, mas não limitado a (i) broncoconstrição, (ii) inflamação, (iii) alergia, (iv) destruição de tecido, (v) sinais e sintomas tais como falta de ar, tosse.

Como usado aqui, os termos “co-administração”, “co-administrado” e “em combinação com”, se referem ao sal de hidrocloreto da invenção e um ou mais outros agentes terapêuticos, devem significar, e se referem a, e incluem o que segue:

- administração simultânea de tal combinação de sal de hidrocloreto da invenção e agente(s) terapêutico(s) para um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados em conjunto em uma forma de dosagem única que libera os ditos componentes substancialmente ao mesmo tempo para o dito paciente.

- administração substancialmente simultânea de tal combinação de sal de hidrocloreto da invenção e agente(s) terapêutico(s) para um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados separados um do outro em formas de dosagens separadas que são tomadas substancialmente ao mesmo tempo pelo dito paciente, depois do que os componentes são liberados substancialmente ao mesmo tempo para o dito paciente,

- administração seqüencial de tal combinação de sal de hidrocloreto da invenção e agente(s) terapêutico(s) para um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados separados um do outro em formas de dosagens separadas que são tomadas em tempos consecutivos pelo dito paciente com um intervalo de tempo significante entre cada administração, depois do que os componentes são liberados substancialmente em tempos diferentes para o dito paciente; e

- administração seqüencial de tal combinação de sal de hidrocloreto da invenção e agente(s) terapêutico(s) para um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados em conjunto em uma forma de dosagem única que libera ditos componentes de uma maneira controlada, depois do que eles são administrados de forma concorrente, de forma consecutiva e/ou de forma sobreposta nos mesmos, e/ou diferentes, tempos pelo dito paciente,

onde cada parte pode ser administrada pela mesma rota ou diferente rota. Exemplos adequados de outros agentes terapêuticos que podem ser usados em combinação com o(s) composto(s) de fórmula (I), ou sais farmaceuticamente aceitáveis, formas derivadas ou composições dos mesmos, e incluem, mas não são limitados a:

(a)lnibidores 5-Llipoxigenase (5-LO) ou antagonista de proteína de ativação 5- Iipoxigenase (FLAP),

(b) Antagonistas de Ieucotrienos (LTRAs) incluindo os antagonistas de LTB4, LTC4, LTD4 e LTE4.

(c) Antagonista de receptor de histamina incluindo os antagonistas H1 e H3,

(d) Agentes simpatomiméticos vasoconstrictores de agonista de adrenoreceptor- a 1 e a2- para uso descongestionante,

(e) B-agonistas de curta e longa ação,

(f) Inibidores de PDE, por exemplo, inibidores de PDE3, PDE4, PDE5,

(g) Teofilina,

(h) Cromoglicato de sódio;

(i)Ambos os inibidores da COX, seletivo e não seletivo para COX-1 ou COX-2 (NSAIDs),

(j)Glicocorticosteróides orais e para inalação,

(k) Anticorpos monoclonais ativos contra entidades inflamatórias endógenas, (I)Agentes anti-fator de necrose tumoral (anti-TNF- a),

(m) Inibidores de molécula de adesão incluindo antagonistas VLA-4,

(n) Antagonistas de receptor de quinina-B1- e B2-,

(o) Agentes imunossupressivos,

(p) Inibidores de metaloproteases de matriz (MMP5),

(q)Antagonistas receptores de Taquiquinina NK1, NK2 e NK3 (r) Inibidores de elastase.

(s)Agonista de receptor de adenosina A2a,

(t)lnibidores de Uroquinase,

(u)Compostos que agem nos receptores de dopamina, por exemplo, agonistas

D2,

(v)Moduladores de vias de NFkB, por exemplo, inibidores IKK,

(w) Moduladores de vias de sinalização de citosina, tais como quinase p38 MAP ou quinase syk;

(x)Agentes que podem ser classificados como mucolíticos ou antitussivos,

(y) Antibióticos, (z)lnibidores de HDAC1

(aa)lnibidores de quinase Pl3, e

(bb)antagonistas CXCR2

De acordo com a presente invenção, combinação dos compostos de fórmula (I)

com:

- antagonistas de H3,

- agonistas B2,

- Inibidores de PDE4,

- esteróides, especialmente glicocorticosteróides,

- agonista de receptor de adenosina A2a,

- Moduladores de vias de sinalização de citoquina, tais como, quinase p38 MAP ou quinase syk;

- Antagonistas de Ieucotrienos (LTRAs) incluindo os antagonistas de LTB4, LTC4, LTD4 e LTE4, são preferidos.

De acordo com a presente invenção, combinação dos compostos de fórmula (I)

com:

- Glicocorticosteróides, em particular, glicocorticosteróides para inalação com efeitos colaterais sistêmicos reduzidos, incluindo prednisona, flunisolida, triancinolona, acetonida, beclometasona, dipropionato, budesonida, propionato de fluticasona, cicle

sonida e fluorato de mometasona, ou

- agonistas β2 incluindo, em particular, salbutamol, terbutalina, bambutenol, fenoterol, salmoterol, formoterol, tulobuterol e seus sais são adicionalmente preferidos.

Deve-se observar que todas as referências a tratamento aqui incluem, o tratamento paliativo ou profilático. A descrição, que segue, está relacionada com aplicações terapêuticas nas quais o sal de hidrocloreto da invenção pode ser aplicado.

O sal de hidrocloreto da invenção possui a habilidade de interagir com o receptor M3 e, por isso, possui uma ampla faixa de aplicações terapêuticas, como descrito mais abaixo, devido ao papel essencial que o sal de hidrocloreto desempenha na fisioIogia de todos os mamíferos.

Portanto, um aspecto adicional da presente invenção diz respeito ao sal de hi

drocloreto da invenção ou composições dos mesmos, para o uso no tratamento de doenças, distúrbios e condições nas quais o receptor M3 está envolvido. Mais especificamente, a presente invenção também está relacionada com o sal de hidrocloreto da invenção, para uso no tratamento de doenças, distúrbios e condições selecionadas a partir do grupo que consiste de:

- broncoconstricção aguda ou crônica, bronquite crônica, obstrução das vias aéreas pequenas e enfisema, - doença obstrutiva ou inflamatória das vias aéreas de qualquer tipo, etiologia ou patogênese, em particular uma doença obstrutiva ou inflamatória das vias aéreas que é um membro selecionado a partir do grupo que consiste de pneumonia eosinofílica crônica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD)1 COPD que inclui bronquite

crônica, enfisema pulmonar ou dispnéia associada ou não associada com COPD, COPD que é caracterizada por obstrução progressiva das vias aéreas, irreversível, síndrome de aflição respiratória adulta (ARDS), exacerbação por hiper-reatividade das vias aéreas em conseqüência de terapia com outras drogas e doença das vias aéreas que está associada com hipertensão pulmonar,

- bronquite de qualquer tipo, etiologia ou patogênese, em particular, bronquite

que é um membro selecionado a partir do grupo que consiste de bronquite aguda, bronquite Iaringotraqueal aguda, bronquite araquídica, bronquite catarral, bronquite crupal, bronquite seca.

- asma de qualquer tipo, etiologia ou patogênese, em particular, asma que é um membro selecionado a partir do grupo que consiste de asma atópica, asma não

atópica, asma alérgica, asma mediada por IgE bronquial atópica, asma bronquial, asma essencial, asma verdadeira, asma intrínseca causada por perturbações patofisiológicas, asma extrínseca causada por fatores ambientais, asma essencial de causa desconhecida oU não aparente, asma não atópica, asma brônquica, asma enfisematosa, as20 ma induzida por exercício, asma induzida por alergia, asma induzida por ar frio, asma ocupacional, asma infectiva causada por bactérias, fungos, protozoários ou infecção viral, asma não alérgica, asma incipiente, síndrome do bebê chiador e broquiolite,

- injuria aguda do pulmão,

- bronquiectasia de qualquer tipo, etiologia ou patogênese, em particular, bronquiectasia que é um membro selecionado a partir do grupo que consiste de bronquiectasia cilíndrica, bronquiectasia saculada, bronquiectasia fusiforme, bronquiectasia capilar, bronquiectasia cística, bronquiectasia seca e bronquiectasia folicular.

Um aspecto adicional da presente invenção ainda diz respeito ao uso do sal de hidrocloreto da invenção, para a fabricação de uma droga que possui uma atividade 30 antagonista M3. Em particular, a presente invenção está relacionada com o uso de sal de hidrocloreto da invenção, ou formas derivadas do mesmo, para a fabricação de uma droga para o tratamento de doenças e/ou condições mediadas por receptor M3, em particular, as condições e/ou doenças listadas acima.

Como uma conseqüência, a presente invenção proporciona um método particuIarmente interessante para tratar um mamífero, incluindo um ser humano, com uma quantidade eficaz do sal de hidrocloreto da invenção, ou uma composição do mesmo. Mais precisamente, a presente invenção proporciona um método particularmente interessante para o tratamento de doenças e/ou condições mediadas por receptor M3 em um mamífero, incluindo um ser humano, em particular as doenças e/ou condições listadas acima, compreendendo administrar a dito mamífero uma quantidade eficaz do sal de hidrocloreto da invenção.

Exemplo 1: hidrocloreto de amida de ácido 5-r3-(3-hidróxi-fenóxiy-azetidin-1-in

5-metil-2.2-difenil hexanóico

£rXr“

.HCl

Para uma solução de 5-[3-(3-hidroxi-fenóxi)-azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenil hexanóico (3,5 g, 7,8 mmol) em metanol (30 mL) foi adicionada uma solução de HCI 1,25 M em metanol (6,3 mL, 7,8 mmol). A solução foi agitada a temperatura ambiente por 3 10 horas e, a seguir, colocada em banho de gelo por 6 horas. Como nenhuma precipitação foi observada, a solução foi concentrada sob pressão reduzida para remover alguns solventes (17 mL) e a solução resultante foi agitada a temperatura ambiente para fornecer um precipitado. A suspensão foi filtrada, lavada com metanol (10 mL) e seca em um forno de vácuo a 40°C para gerar hidrocloreto de amida de ácido 5-[3-(3- 15 hidróxi-fenóxi)-azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenil hexanóico como um sólido branco, 2,55 g (67%).

O ponto de fusão do exemplo 1 foi determinado por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) usando um calorímetro diferencial de varredura da Perkin-Elmer. A amostra foi aquecida a 20°C/minuto, da temperatura ambiente para 300°C, em um cadinho de alumínio de 50 pL ventilado. O traçado de DSC é mostrado na Figura 3. O ponto de fusão foi evidenciado por uma forte endoterma a 218,7°C (começo em 215,3°C).

Método de Difração de Raio-X do Pó

O padrão de difração de raio-X do pó foi medido usando-se um difratômetro de raio-X de pó D4 da Bruker-AXS Ltd. ajustado com um conversor de amostra automáti25 co, um goniômetro teta-teta, fenda de divergência de feixes automática, e um detector PSD Vantec-1. A amostra foi preparada para análise pela montagem em um suporte de espécime de pastilha de silicone de teste inferior. O espécime foi girado enquanto irradiado com raios-X Cu Κσ1 (comprimento de onda = 1,5406 Ángstrons) com o tubo de raio-X operado a 40kV/35mA. As análises foram realizadas com o goniômetro correndo 30 em ajuste de modo contínuo para uma etapa de 0,2 segundo contado por 0,0018°sobre uma faixa de dois teta de 2° a 55°. O padrão medido é mostrado na Figura 1. O padrão de difração de raios-X do pó resultante com localização de picos e intensidades (erro de ângulo 2Θ é +/- 0,1 grau) é mostrado na tabela 1:

Tabela 1

10

Angulo Teta-2 Intensidade Angulo Teta-2 Intensidade O Y% Y% 7,5 15,9 22,8 59,4 9,1 55,6 23,4 65,9 11,2 42,5 24,1 50,9 13,7 65,6 24,5 25,5 13,9 21,8 25,0 14,6 14,2 5,5 25,8 17,0 14,8 40,6 26,5 21,2 15,3 27,0 27,6 18,4 16,2 29,2 27,7 16,6 16,4 23,1 28,3 28,1 17,7 14,1 29,5 17,8 18,3 64,1 30,5 14,2 19,0 36,7 30.9 35,1 19,3 52,3 31,3 12,4 19,5 14,2 32,0 16,6 19,7 100,0 33,6 18,6 20,1 20,9 34,8 12,6 20,3 35,4 35,2 14,2 21,3 28,0 38,4 15,8 21,5 18,7 39,1 13,4 21,8 60,9 40,9 14,4 Determinação da Estrutura do Cristal por Difração c

e Raio-X em Cristal Unico

A estrutura do cristal do Exemplo 1 foi determinada por difração de Raio-X em Cristal único a temperatura ambiente usando um difratômetro de raio-X em Cristal Único da Bruker SMART APEX e radiação Mo ka. As intensidades foram integradas1 a partir de várias séries de exposições onde cada exposição cobriu 0,3° em ω, com um tempo de exposição de 30 s e o ajuste total de dados foi maior que um hemisfério. Os dados foram corrigidos por absorção usando um método de multivarredura2. A estrutura do cristal foi resolvida sucessivamente por métodos diretos usando SHELXS-97,3 no Grupo de Espaço Ρ2ι2Ί21 e refinado pelo método dos Mínimos Quadrados usando SHELXS-97.4

1. Software SMART v5.622 (controle) e SAINT v6.02 (integração), BrukerAXS Inc., Madison, Wl 1994. 2. SADABS, programa para correção e escalonagem dos dados de detector de área, G. M. Sheldrick, University of Gõttingen, 1997 (com base no método de R. H. Blessing, Acta Cryst. 1995, A51, 33-38).

3. SHELXS-97, Programa para Solução de Estrutura de Cristal. G. M. Sheldrick, University of Gõttingen, Alemanha, 1997, release 97-2.

4. SHELXS-97, Programa para Refinamento de Estrutura de Cristal. G. M. Sheldrick, University of Gõttingen, Alemanha, 1997, release 97-2.

Cálculo do Padrão de Difração de Raio-X do Pó da Estrutura do Cristal do Exemplo 1

Os ângulos 2Θ intensidades relativas foram calculadas a partir da Estrutura de Cristal Única do Exemplo 1 usando o módulo “Difração por Reflexão de Pó” da Accelrys MS Modeling™ [versão 3.0].

Os parâmetros de pertinentes de simulação foram:

Comprimento de onda = 1,5406 Á (Cu Κσ);

Fator de Polarização = 0,5;

Perfil Pseudo-Voigt = (U = 0,01, V = -0,001, W = 0,002)

O padrão calculado representa aquele de uma fase pura do Exemplo 1 uma vez que o mesmo é derivado a partir de uma estrutura de cristal única. Uma comparação dos padrões medidos e calculados é mostrada na Figura 2 e demonstra que a massa é representada pela estrutura de cristal única. A leve discrepância entre as intensidades de pico pode ser atribuída aos efeitos de orientação preferida ser o do padrão medido. A Figura 2 mostra padrões PXRD do Exemplo 1 (TOP: padrão medido BOTTOM: Padrão calculado a partir da estrutura de cristal única).

Preparação 1: 5-r3-(3-hidroxifenoxi)azetidin-1-in-5-metil-2.2-difenilhexanamida

Uma suspensão de 5-[3-(3-hidroxifenoxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenilhexanonitrila (0,16 g, 0,38 mmol, 1 equiv.), álcool t-amílico (18 mL, 12 ml/g) e KOH (0,41 g, 7,26 mmol, 20 equiv.) foi aquecida a 80°C por 2 dias depois do que a HPLC mostrou a completação da reação. A reação foi resfriada a temperatura ambiente e, a seguir, foram divididas entre água e TBME, a camada aquosa foi acidificada para pH 8 com HCI aquoso, as camadas foram separadas e a camada orgânica foi concentrada para fornecer 5-[3-(3-hidroxifenoxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenilhexanamida como um óleo incolor, 0,11 g (68%). 1HRNM (400 MHz1 CDCI3) δ: 1,10 (s, 6Η), 1,22-1,34(m, 2Η), 2,42-2,55 (m, 2H), 3,28-3,40 (m, 2H), 3,65-3,88 (m, 2H), 4,70-4,80 (m, 1H), 5,55-5,70 (brs, 2H), 6,23-6,36 (m, 2H), 6,45-6,53 (m, 1H), 7,03-7,12 (m, 1H), 7,19-7,39 (m, 10H); LRMS ESI m/z 445 [m+H]+

Preparação 2: 5-r3-(3-hidroxifenoxi)azetidin-1-il1-5-metil-2.2-difenilhexanonitrila

Ao ácido metanossulfônico (200 mL, 5 mL/g), a temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio, foi adicionada 5-[3-(3-metoxifenoxi)azetidin-1-il]-5-metil2,2-difenilhexanonitrila (40 g, 90,8 mmol, 1 equiv) e, a seguir, metionina-DL (40,6g, 272 mmol, 3 equiv) resultando em uma solução. A solução foi agitada por 3 dias a tempera10 tura ambiente e por 1 dia a 30°C antes de adicionar mais metionina (5,42 g, 36 mmol, 0,4 equiv) e mantida a 30°C por mais 2 dias depois do que a HPLC indicou completação de reação (<5% SM).

A mistura foi diluída com i-PrOAc (400 mL) e, a seguir, com água cuidada (400 mL). As camadas foram misturadas por 15 minutos e, a seguir, separadas. A camada 15 orgânica foi lavada com NaOH 1M (400 mL) e, a seguir, com água (2 x 200 mL) antes de secar sobre MgSO4 e concentrar para obter um sólido branco sob pressão reduzida a 40°C. O sólido foi ressuspendido em tolueno (160 mL, 4 mL/g) a -5°C por 1 hora e, a seguir, foi filtrado, lavado com tolueno frio (80 mL, 2 mL/g) e seco em um forno de vávuo a 50°C por 2 dias para gerar 5-[3-(3-hidroxifenoxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2- 20 difenilhexanonitrila como um sólido branco, 29,3 g (76%). A análise por HPLC mostrou área >98%.

1HRNM (300 MHz, CDCI3) δ\ 0,98 (s, 6H), 1,35-1,44(m, 2H), 2,41-2,52 (m, 2H), 3,18-3,26 (m, 2H), 3,48-3,57 (m, 2H), 4,65-4,74 (m, 1H), 6,26-6,29 (m, 1H), 6,32-6,37 (m, 1H), 6,43-6,47 (m, 1H), 7,12 (t, J8,2 Hz,1H), 7,25-7,44 (m, 10H);

Preparação 3: 5-r3-(3-metoxifenoxi)azetidin-1-il1-5-metil-2.2-difenil

hexanonitrila

Ao THF (700 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio resfriada em banho de gelo foi adicionado ZrCI4 (80,4 g, 0,35 mol, 2,1 equiv.) em forma de porção (“portion-wise”) mantendo a temperatura abaixo de 15°C e resultando em uma suspensão marrom. A mistura foi, a seguir, mais resfriada em banho de gelo/MeOH antes da adição de MeMgCI (3M em THF, 493 mL, 1,48 mol, 9 equiv) por mais de 1 hora mantendo a temperatura abaixo de O0C. Para a solução Zr/Grignard foi adicionada lentamente uma so5 lução pré-formada de 5-[3-(3-metoxifenoxi)azetidin-1-il]-5-oxo-2,2-difenil-pentanonitrila (70 g, 0,164 mol, 1 equiv) em THF controlando a exoterma abaixo de 0°C. A suspensão marrom resultante foi mantida a O0C por 6,6 horas, antes o Me-THF (700 mL) foi adicionado seguido de resfriamento cuidadoso com NH4CI aquoso (pré-preparado com 400 mL de NH4CI saturado + 500 mL de água). Mediante separação a camada orgânica 10 foi lavada com água (3 x 350 mL), seca sobre MgSO4 e o solvente foi trocado em EtOH a 40°C sob pressão reduzida resultando em um precipitado de 210 mL de volume final (3 mL/g). A suspensão foi agitada a temperatura ambiente por 18 horas e, a seguir, resfriada em banho de gelo por 1 hora, filtrada, lavada com EtOH (140 mL, 2 mL/g) e seca em um forno de vácuo a 45°C por 5 horas para gerar 5-[3-(3- 15 metoxifenoxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenil-hexanonitrila como um sólido branco, 43,1 g (60%). A análise por HPLC mostra área >99%.

1HRNM (400 MHz, CDCI3) ó: 0,90-1,03 (m, 6H), 1,31-1,44(m, 2H), 2,41-2,56 (m, 2H), 3,07-3,24 (m, 2H), 3,42-3,54 (m, 2H), 3,77 (s, 3H), 4,63-4,74 (m, 1H), 6,28- 6,38 (m, 2H), 6,48-6,55 (m, 1H), 7,26-7,49 (m, 11H); LRMS APCI m/z 441 [m+H]+

Preparação 4: 5-r3-(3-metoxifenoxi)azetidin-1-il1-5-oxo-2.2-difenil-pentanonitrila

A uma suspensão de ácido 4-ciano-4,4-difenil-butírico (300 mL, 1,13 mol, 1 equiv.) em EtCN (3,0 L, 3 mL/g) a temperatura ambiente foi adicionado DMAP (13,82 g,

0,11 mol, 0,1 equiv.), hemi-oxalato de 3-(3-metoxifenoxi)azetidino (253,5 g, 1,13 mol,

1 equiv.) e, a seguir, WSCDI (325,2 g, 1,68 mol, 1,5 equiv.) resultante em uma leve efervescência, uma exoterma a 10°C e dissolução para uma solução. Após 2 horas a reação foi considerada completa por HPLC (nenhuma amina detectada). HCI 2 M (1,2L,

4 mL/g) foi adicionado e a mistura bifásica foi agitada por 10 minutos mediante separação, e lavagem da camada orgânica com NaOH 2M (1,5 L, 5 mL/g) e água (2 x 1,5 L).

A solução foi concentrada até secura sob pressão reduzida a 40°C e restituída com MeOH. Isto foi repetido para remover todo o EtCN, e a solução metanólica resultante aquecida de 2,5 L de volume foi deixada resfriar resultando em uma suspensão espessa. A suspensão foi resfriada em banho de gelo por 2 horas e, a seguir, foi filtrada, lavada com MeOH (600 mL, 2 mL/g) e o sólido foi seco a vácuo por 18 horas a 45°C para gerar 5-[3-(3-metoxifenoxi)azetidin-1-íl]-5-oxo-2,2-difenil-pentanonitrila como um sólido branco, 347 g (72%). A análise por HPLC mostra área >98%.

A um recipiente para hidrogenação adequado foi adicionado 1-Benzidril-3-(3- metoxifenoxi)azetidino (300 g, 0,87 mol, 1 equiv), Pd (20% wt em carbono) (60 g, 20% wt) e EtOH (6 L, 20 mL/g). A mistura foi colocada sob atmosfera de H2 a 60 psi e agitada a temperatura ambiente ate a completação da reação após 48 horas (<5% SM por HrLC).

A mistura reacional foi filtrada em Arbocel e lavada com EtOH abundante e, a seguir, concentrada para um volume de 1,2 L (4 mL/g) sob pressão reduzida a 40°C. A solução resultante foi adicionado ácido oxálico (39,11 g, 0,43 mmol, 0,5 equiv), em temperatura ambiente, na forma de porção resultando em suspensão espessa e uma exoterma a 15 °C, a mistura foi deixada agitar por 3 dias a temperatura ambiente.

A suspensão foi resfriada em um banho de gelo por 2 horas e, a seguir, foi filtrada, lavada com EtOH (600 mL, 2mL/g) e o sólido foi seco a vácuo a 50°C por 18 horas para gerar hemi-oxalato de 3-(metoxifenoxi)azetidino como um sólido branco, 165 g (85%). A análise por HPLC mostra área >96%.

A uma solução de éster de ácido 1-benzidril-azetidin-3-il metanossulfônico (1169 g, 3,68 mol, 1 equiv) em EtCN (2,33 L, 2 mL/g) a temperatura ambiente foi adicionado K2CO3 (610,6 g, 4,42 mol, 1,2 equiv.). Para a pasta resultante foi adicionada uma solução pré-formada de 3-metoxifenol (548,3 g, 4,42 mol, 1,2 equiv.) em EtCN

1HRNM (300 MHz, d6-dmso) δ: 2,07-2,16 (m, 2H), 2,69-2,77 (m, 2H), 3,70-3,78 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,94-4,00 (m, 1H), 4,21-4,29 (m, 1H), 4,42-4,45 (m, 1H), 4,92- 5,00 (m, 1H), 6,36-6,42 (m, 2H), 6,54-6,59 (m, 1H), 7,16-7,23 (m, 1H), 7,30-7,40 (m,

2H), 7,41-7,46 (m, 8H);

Preparação 5: Hemi-oxalato de 3-(metoxifenox0azetidino

o

Preparação 6: 1-Benzidril-3-(3-metoxifenoxi)azetidino (3,50 L, 3 mL/g) e a mistura foi aquecida a 80°C sob uma atmosfera de N2 por 18 horas, após o que a completação da reação foi observada (<5% de éster de ácido 1- benzidril-azetidin-3-il metanossulfônico por HPLC).

Mediante resfriamento a temperatura ambiente, NaOH 1M (5,85 mL, 5 mL/g) 5 foi adicionado e a solução resultante foi agitada por aproximadamente 15 minutos antes de permitir a separação. As camadas foram divididas e a camada orgânica foi lavada com NaOH 1M (3,51 L, 3 mL/g) e salmoura aquosa (116 g, de NaCI em 5,58 L de água, 5 mL/g). A camada orgânica foi colocada sob condições de destilação atmosférica e troca de solvente em MeOH pela concentração para volume baixo (2 mL/g) e, a 10 seguir, adições seqüenciais de MeOH, fornecendo uma suspensão (4 mL/g) com nenhum EtCN detectado por 1HRNM.

A suspensão foi resfriada a 0°c por 3 horas e, a seguir, foi lavada com MeOH (2,5 mL) e o sólido foi seco a vácuo a 50°C por 18 horas para gerar PF1261660 como um sólido branco, 944 g (74%). A análise por HPLC mostra área >99%.

Abreviações

rt = temperatura ambiente Me = metil Ph = fenil

SM = material de partida h = hora

mins = minutos d = dia

Atividade in vitro do sal de hidrocloreto da invenção Potência de ensaio

A potência de M3 é determinada em células CHO-K1 transfectadas com gene

NFAT-Betalactamase. As células CHO (Ovário de Hamster Chinês) que expressam de forma recombinante o receptor M3 muscarínico humano são transfectadas com 25mM de HEPES (Life Technologies 32430-027), contendo FCS a 10% ( Soro Fetal Bovino, Sigma F-7524), piruvato de sódio (Sigma S-8636), NEAA (Aminoácidos Não Essenciais, Invitrogen 11140-035) e 200 Mg/mL de Zeocina (Invitrogen R250-01).

Protocolo de Ensaio hMct g-Lac

As células são colhidas para ensaio quando elas alcançam 80-90% de confluência usando Solução para Dissociação de células sem enzima (Life Technologies 13151-014) incubada com as células por 5 min. a 37°C em atmosfera contendo CO2 a 35 5%. As células separadas são coletadas em meio de crescimento aquecido e centrifugado a 2000 rpm por 10 min. Lavadas em PBS (Salina Tamponada com Fosfato, Life Technologies 14190-094) e centrifugadas novamente como já descrito. As células são ressuspensas em meio de crescimento com 2 x 105 células/mL (composição como descrita acima). 20 pL dessa suspensão de células são adicionados para cada poço de uma placa de fundo claro com 384 poços escuros (Greinere Bio One 781091-PFI). O tampão de ensaio usado é o PBS suplementado com Pluronic F-127 (Sigma 9003-11-6) 5 e DMSO a 2,5%. O receptor M3 muscarínico que sinaliza é estimulado usando colina carbamila 80nM (Aldrich N240-9) e incubado com as células por 4h a 37° /CO a 5% e monitorado no final do período de incubação usando um leitor de placa + Tecan SpectralFIuor (λ - 405 nm na excitação, 450 nm e 503 nm na emissão). O composto a ser testado é adicionado ao ensaio no começo do período de incubação de 4h e a ativida10 de do composto é medida como a concentração dependente do sinal induzido de colina carbamila. As curvas de inibição são plotadas e os valores de IC50 são gerados usando um ajuste sigmóide de parâmetro-4 e convertidos para valores de Ki usando a correção de Cheng-Prusoff e para o valor de K0 para colina carbamila no ensaio.

Ensaio de Traquéia de Porquinho-da-índia Porquinhos-da-índia da variedade Dunkin-Hartley, do sexo masculino, pesando

de 350-450 g foram mantidos em uma concentração elevada de CO2, seguido pela exsanguinação da veia cava. As traquéias são dissecadas a partir da Iaringe para o ponto de entrada na cavidade do peito e, a seguir, são colocadas em solução de tampão de Krebs modificada, oxigenada, e fresca (Krebs contendo propranolol 10 μΜ, guanetidina10 μΜ e indometacina 3 μΜ) a temperatura ambiente. As traquéias são abertas pelo corte através da cartilagem oposta ao músculo traqueal. Tiras extensas com aproximadamente 3-5 anéis de cartilagem são cortadas. Uma rosca de algodão é fixa na cartilagem de uma extremidade da tira para a fixação do transdutor de força e uma presilha de algodão é preparada na outra extremidade para ancorar o tecido no banho para órgão (“organ bath”). As tiras são montadas em banhos para órgão de 5 mL preenchidos com tampão de Krebs aerados e aquecidos (37°C). A taxa de fluxo da bomba é ajustada é para 1,0 mL/min e os tecidos são lavados continuamente. Os tecidos são colocados sobre uma tensão inicial de 1000 mg. Os tecidos são re-tensionados após 15 e 30 minutos e, a seguir, são deixados equilibrar para uma tensão adicional de 30-45 minutos.

Os tecidos são submetidos a Estimulo Elétrico de Campo (EFS) dos seguintes parâmetros: trem de 10 s a cada 2 minutos, pulso de 0,1 ms de largura, 10 Hz e 10V30 V. A voltagem é elevada para 5V a cada 10 min dentro da faixa determinada até que uma resposta contrátil máxima para cada tecido seja observada. Esta voltagem máxi35 ma para cada tecido é então usada em todo o restante do experimento. Após o balanceamento por EFS por 20 min., a bomba é parada, e após 15 min as leituras de controle são tomadas por um período de 8-10 min (4-5 respostas). O composto é então adicionado para cada tecido como uma dose em bolus a 30xKi (determinado no receptor M3 de humano expresso em células de CHO em um ensaio de ligação por filtração), e deixado incubar por 2 h. O composto é lavado a partir do tecido usando uma lavagem rápida com Krebs modificado por 1 min e o fluxo é restaurado para 1 mL/min para o 5 restante do experimento. Ao final do experimento os tecidos são testados com histamina (1 μΜ) para determinar a viabilidade. As leituras tomadas durante o experimento são automaticamente coletadas usando software Notocord®. Os dados brutos são convertidos em respostas de porcentagem levando em consideração medições de inibição da resposta de EFS. Após o início da lavagem, os tempos tomados para o tecido se 10 recuperar em 25% da inibição induzida são registrados e usados como uma medida da duração de ação do composto. A viabilidade do tecido limita a duração do experimento para 16h após lavagem do composto. Os compostos são tipicamente testados em n = 2 a 5 para estimar a duração da ação.

Alternativamente o seguinte ensaio de Traquéia de Porquinho-da-índia pode ser usado:

As Traquéias são removidas dos porquinhos-da-índia da variedade DunkinHartley, do sexo masculino, (350-450 g) e após a remoção do tecido conectivo aderente, uma incisão é feita através da cartilagem oposta ao músculo traqueal e tiras extensas de traquéia com 3-5 anéis de cartilagem são preparadas. As tiras de traquéia são 20 suspensas entre um calibrador de cepa isométrico e um gancho de tecido fixo com o músculo no plano horizontal em banhos de 5 mL de tecido sob uma tensão inicial de 1 g e banhado em solução de Krebs (O2 a 95%/C02 a 5%) aerada e aquecida (37°C) contendo indometacina 3 μΜ e guanetidinalO μΜ.

Os tecidos são posicionados entre eletrodos de fio de platina paralelo (~1 cm de abertura). Um fluxo constante 1 mL/min de solução de Krebs fresca (da composição acima) é mantida através dos banhos para tecido usando bombas peristálticas. Os tecidos são deixados equilibrar por uma hora com retensionamento para 1 g em 15 min e min a partir do início do período de equilíbrio. Ao final do equilíbrio, os tecidos são estimulados eletricamente por campo usando os seguintes parâmetros: 10 V e 10 Hz, pulso de 0,1 ms de largura com trens de 10s a cada 2 minutos. Em cada tecido uma curva de resposta de voltagem é construída na faixa de 10V - 30V (mantendo todos os outros parâmetros de estimulo constantes) para determinar um estímulo máximo razoável. Usando estas respostas EFS de parâmetros de estímulo são 100% mediados por nervo e 100% colinérgicos como confirmado pelo bloqueio com tetrodotoxina 1 μΜ ou atropina 1 μΜ. Os tecidos são então estimulados repetidamente em intervalos de 2 min até que as respostas sejam reproduzíveis. A bomba peristáltica é para 20 min antes da adição do composto de estudo e a contração muscular média nos últimos 10 minutos é registrada como resposta de controle. O composto do estudo é adicionado aos banhos de tecido, com cada tecido recebendo uma concentração única do composto e deixado equilibrar por 2h. Na adição posterior de 2 h a inibição da resposta EFS é registrada e as curvas IC50 são geradas usando uma faixa de concentrações de composto nas tiras 5 de traquéia do mesmo animal. Os tecidos são então rapidamente lavados e a perfusão de 1 mL/min com solução de Krebs é re-estabelecida. Os tecidos são estimulados por 16h adicionais e a recuperação da resposta de EFS e registrada. Ao final das 16h, histamina 10 μΜ é adicionada ao banho para confirmar a viabilidade do tecido. A concentração máxima razoável (concentração testada dando uma resposta de > 70% de inibi10 ção, mas menor que 100%) do antagonista é identificada a partir da curva Cl50 e o tempo para recuperação de 25% da inibição induzida (T25) é calculada nos tecidos que recebem esta concentração. Os compostos são tipicamente testados para n = 2 a n = 5 para estimar a duração de ação.

Claims (11)

1. Sal de hidrocloreto, CARACTERIZADO pelo fato de que é de 5-[3-(3- hidroxifenóxi)azètidin-1 -il]-5-metil-2,2-difénil-hexanamida.

2. Forma cristalina não solvatada, CARACTERIZADA pelo fato de que é a do sal de hidrocloreto de 5-[3-(3-hidroxifenóxi)azetidin-1-il]-5-metil-2,2-difenil-hexanamida.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que possui um padrão de difração de raio-X definido pelos seguintes picos padrões de difração de raio-X principais expressos em termos de ângulos 2-theta quando medidos usando radiação Cu Ka1 (comprimento de onda = 1,5406 Á). <table>table see original document page 24</column></row><table>

4. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA_pelo fato de que compreende pelo menos uma quantidade eficaz de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou de uma forma derivada do mesmo.

5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou uma forma derivada ou composição do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de ser para uso como um medicamento.

6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou uma forma derivada ou composição do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no tratamento de doenças, distúrbios e condições selecionadas a partir do grupo que consiste de: - bToncoconstricção aguda ou crônica, bronquite crônica, obstrução das vias aéreas pequenas e enfisema, - doença obstrutiva ou inflamatória das vias aéreas de qualquer tipo, etiologia ou patogênese, em particular uma doença obstrutiva ou inflamatória das vias aéreas que é um membro selecionado a partir do grupo que consiste de pneumonia eosinofílica crônica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), COPD que inclui bronquite crônica, enfisema pulmonar ou dispnéia associada ou não associada com COPD, COPD que é caracterizada por obstrução progressiva, irreversível das vias aéreas,, síndrome de aflição respiratória adulta (ARDS), exacerbação por hiper-reatividade das vias aéreas em conseqüência de terapia com outras drogas e doença das vias aéreas que está associada com hipertensão pulmonar, - bronquite de qualquer tipo, etiologia ou patogênese, em particular, bronquite que é um membro selecionado a partir do grupo que consiste de bronquite aguda, bronquite Iaringotraqueal aguda, bronquite araquídica, bronquite catarral, bronquite crupal, bronquite seca, bronquite asmática infecciosa, bronquite produtiva, bronquite estafilocócica ou estreptocócica e bronquite vesicular, - asma de qualquer tipo, etiologia ou patogênese, em particular, asma que é um membro selecionado a partir do grupo que consiste de asma atópica, asma não atópica, asma alérgica, asma mediada por IgE bronquial atópica, asma bronquial, asma essencial, asma verdadeira, asma intrínseca causada por perturbações patofisiológicãs, asfTTa extrínseca causada por fatores ambientais, asma essencial de causa desconhecida ou não aparente, asma brônquica, asma enfisematosa, asma induzida por exercício, asma induzida por alergia, asma induzida por ar frio, asma ocupacional, asma infecciosa causada por bactérias, fungos, protozoários ou infecção viral, asma não alérgica, asma incipiente, síndrome do bebê chiador e broquiolite, - injúria aguda do pulmão, _ - bronquiectasia de qualquer tipo, etiologia ou patogênese, em particular, bronquiectasia que é um membro selecionado a partir do grupo que consiste de bronquiectasia cilíndrica, bronquiectasia sacular, bronquiectasia fusiforme, bronquiectasia capilar, bronquiectasia cística, bronquiectasia seca e bronquiectasia folicular.

7. Uso de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou de uma forma derivada ou composição do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a fabricação de uma droga que possui uma atividade antagonista M3.

8. Uso de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou de uma forma derivada ou composição do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a fabricação de uma droga para o tratamento de doenças, distúrbios e condições selecionadas a partir do grupo como descrito na reivindicação6.

9. Método,,CARACTERIZADO pelo fato de ser para tratar um mamífero, incluindo um ser humano, com um antagonista M3 incluindo tratar o dito mamífero com uma quantidade eficaz de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou de uma forma derivada ou composição do mesmo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,_CARACTERIZADO pelo fato de que a doença, distúrbio ou condição é selecionada a partir do grupo como descrito na reivindicação 6.

11. Combinação de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou de uma forma derivada do mesmo,_CARACTERIZADA pelo fato de ser com um agente terapêutico selecionado a partir de: (a) Inibidores 5-Llipoxigenase (5-LO) ou antagonistas de proteína de ativação 5-lipoxigenase (FLAP)1 (b) Antagonistas de Ieucotrienos (LTRAs) incluindo os antagonistas de LTB4, LTC4, LTD4 e LTE4, (c) Antagonistas de receptor de histamina incluindo os antagonistas H1 e H3, (d) Agentes simpatomiméticos vasoconstrictores de agonísta de adrenoreceptor- a1 e a2- para uso descongestionante, (e) p2-agonistas de curta ou longa ação, (f) Inibidores de PDE, por exemplo, inibidores de PDE3, PDE4, PDE5, (g) Teofilina, (h) Cromoglicato de sódio; (i) Ambos inibidores da COX, seletivo e não seletivo para COX-1 ou COX-2 (NSAIDs), (j) Glicocorticosteróides orais e para inalação, (k) Anticorpos monoclonais ativos contra entidades inflamatórias endógenas, (I) Agentes anti-fator de necrose tumoral (anti-TNF- a), (m) Inibidores de molécula de adesão incluindo antagonistas VLA-4, (n) Antagonistas de receptor de quinina-B1- e B2-, (o) Agentes imunossupressivos, (p) Inibidores de metaloproteases de matriz (MMPs), (q) Antagonistas receptores de Taquiquinina NK1, NK2 e NK3 (r) Inibidores de elastase. (s) Agonista de receptor de adenosina A2a, (t) Inibidores de Uroquinase, (u) Compostos que agem nos receptores de dopamina, por exemplo, agonistas D2, (v) Moduladores de vias de NFKB, por exemplo, inibidores IKK, (w) Moduladores de vias de sinalização de citosina, tais como p38 MAP quinase ou quinase syk; (x) Agentes que podem ser classificados como mucolíticos ou antitussivos, (y) Antibióticos, (z) Inibidores de HDAC, (aa) Inibidores de quinase PI3, e (bb) Antagonistas de CXCR2.