BRPI0720476A2 - Antagonistas de ativina-actrii e usos para aumentar níveis de células vermelhas do sangue - Google Patents

Antagonistas de ativina-actrii e usos para aumentar níveis de células vermelhas do sangue Download PDF

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Description

“ANTAGONISTAS DE ATIVINA-ACTRII E USOS PARA AUMENTAR NÍVEIS DE CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE”
Pedidos relacionados
Este pedido reivindica o benefício para pedido de patente provisório U.S. 60/875.682, depositado em 18 de dezembro de 2006, cujo pedido é por meio disso incorpo- rado pela referência na sua íntegra.
Antecedentes da invenção
A célula vermelha do sangue madura, ou eritrócito, é responsável pelo transporte de oxigênio nos sistemas circulatórios de vertebrados. As células vermelhas do sangue car- regam altas concentrações de hemoglobina, uma proteína que liga oxigênio nos pulmões em pressão parcial relativamente alta de oxigênio (p02) e libera oxigênio para áreas do cor- po com uma p02 relativamente baixa.
As células vermelhas do sangue maduras são produzidas a partir de células tronco hematopoiéticas pluripotentes em um processo denominado eritropoiese. Em indivíduos após o parto, a eritropoiese ocorre principalmente na medula óssea e na polpa vermelha do baço. A ação coordenada de vários caminhos de sinalização controla o equilíbrio da prolife- ração, diferenciação, sobrevivência e morte celular. Em condições normais, as células ver- melhas do sangue são produzidas em uma taxa que mantém uma massa de células verme- lhas no corpo, e a produção pode aumentar ou diminuir em resposta a vários estímulos, in- cluindo maior ou menor tensão de oxigênio ou demanda do tecido. O processo de eritropoi- ese começa com a formação de células precursoras comprometidas com linhagem e conti- nua através de uma série de tipos de células precursoras distintas. Os estágios finais de eritropoiese ocorrem a medida que os reticulócitos são liberados na corrente sanguínea e perdem suas mitocôndrias e ribossomos, assumindo ao mesmo tempo a morfologia da célu- la vermelha do sangue madura. Um nível elevado de reticulócitos, ou uma razão elevada de reticulócito: eritrócito, no sangue é indicativo de maiores taxas de produção célula vermelha do sangue.
Eritropoietina (Epo) é amplamente reconhecida como o regulador positivo mais sig- nificativo de eritropoiese em vertebrados após o nascimento. Epo regula a resposta eritro- poiética compensatória para menor tensão de oxigênio no tecido (hipóxia) e baixos níveis de células vermelhas do sangue ou baixos níveis de hemoglobina. Em humanos, níveis de Epo elevados promovem formação de célula vermelha do sangue estimulando a produção de progenitores eritróides na medula óssea e baço. No camundongo, Epo melhora a eritropoie- se principalmente no baço.
Várias formas de Epo recombinante são usadas por médicos para aumentar os ní- veis de células vermelhas do sangue em uma variedade de quadros clínicos e, particular- mente, no tratamento de anemia. A anemia é uma condição amplamente definida caracteri- zada por níveis menores que normal de hemoglobina ou células vermelhas do sangue na corrente sanguínea. Em alguns exemplos, anemia é causada por um distúrbio primário na produção ou sobrevivência das células vermelhas do sangue. Mais comumente, a anemia é secundária em doenças de outros sistemas (Weatherall & Provan (2000) Lancet 355, 1 169- 5 1 175). A anemia pode resultar de uma menor taxa de produção ou maior taxa de destruição de células vermelhas do sangue ou da perda de células vermelhas do sangue em virtude de hemorragia. A anemia pode resultar de uma variedade de distúrbios que incluem, por exem- plo, insuficiência renal crônica, síndrome mielodiblástica, artrite reumatóide e transplante de medula óssea.
O tratamento com Epo causa tipicamente um aumento nas hemoglobinas em cerca
de 1-3 g/dL em humanos saudáveis por um período de semanas. Quando administrado a indivíduos anêmicos, este regime de tratamento fornece frequentemente aumentos substan- ciais nos níveis de hemoglobina e células vermelhas do sangue e leva a melhorias na quali- dade de vida e sobrevivência prolongada. Epo não é uniformemente efetiva, e muitos indiví- 15 duos são refratários mesmo a altas doses (Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 43- 50). Acima de 50% de pacientes com câncer têm uma resposta inadequada à Epo, aproxi- madamente 10% com doença renal em estágio final são hiperresponsivos (Glaspy et al. (1997) J Clin Oncol 15, 1218-1234; Demetri et al. (1998) J Clin Oncol 16, 3412-3425), e me- nos que 10% com síndrome mielodiblástica responsdem favoravelmente (Estey (2003) Curr 20 Opin Hematol 10, 60-67). Diversos fatores, incluindo inflamação, deficiência de ferro e vita- mina, diálise inadequada, toxicidade do alumínio e hiperparatiroidismo podem predizer uma resposta terapêutica deficiente e os mecanismos moleculares de resistência a Epo ainda não são claros.
Assim, é um objetivo da presente revelação fornecer composições e métodos alter- nativos para aumentar níveis de células vermelhas do sangue em pacientes.
Sumário da invenção
Em parte, a revelação demonstra que antagonistas de ativina, bem como antago- nistas de ActRIIa e ActRIIb, podem ser usados para aumentar níveis de célula vermelha do sangue e hemoglobina. Em particular, a revelação demonstra que uma forma solúvel de 30 ActRIIa age como um inibidor de ativina e, quando administrada in vivo, aumenta os níveis de células vermelhas do sangue na corrente sanguínea. Um efeito mais suave foi observado com uma forma solúvel de ActRIIb, que liga ativina A com menos afinidade do que ActRIIa solúvel. Embora ActRIIa e ActRIIb solúveis possam afetar os níveis de células vermelhas do sangue através de um mecanismo sem ser antagonismo de ativina, entretanto, a revelação 35 demonstra que agentes terapêuticos desejáveis podem ser selecionados com base no anta- gonismo de ativina ou antagonismo de Actrll ou ambos. Tais agentes são coletivamente re- feridos como antagonistas de ativina-ActrlI. Portanto, em certas modalidades, a revelação fornece métodos para usar antagonistas de ativina-actrll, incluindo, por exemplo, polipeptí- deos ActRIIa de ligação de ativina, polipeptídeos ActRIIb de ligação de ativina, anticorpos anti-ativina, anticorpos anti-ActRIla, anticorpos anti-ActRIlb, moléculas e aptâmeros peque- nos que alvejam ativina, ActRIIb ou ActRIIa1 e ácidos nucléicos que diminuem a expressão de ativina, ActRIIb, ou ActRIIa, para aumentar níveis de célula vermelha do sangue e hemo- globina em pacientes e para tratar distúrbios associados com baixos níveis de célula verme- lha do sangue ou hemoglobina em pacientes que necessitam destes. Como descrito no pe- dido de patente U.S. número de série 1 1/603.485, aqui incorporado pela referência, anta- gonistas de ativina-ActRIla podem ser usados para promover crescimento ósseo e aumentar a densidade óssea. Da maneira aqui descrita, os efeitos de tais antagonistas nos níveis de células vermelhas do sangue são mais rápidos e ocorrem em doses mais baixas do que os efeitos de tais antagonistas no osso. Assim, em certas modalidades, a revelação fornece métodos para usar um antagonista de ativina-ActRIla para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina sem causar um aumento significativo na densidade óssea. Por exemplo, um método pode causar um aumento menor que 3%, 5%, 10% ou 15% na densidade óssea. Este efeito seletivo pode ser atingido usando, por exemplo, doses mais baixas de antagonista de ativina-ActRIla, doses menos freqüentes, ou usando um antago- nista de ativina-ActRIla com uma meia-vida sérica mais curta em doses e frequências calcu- lados para fornecer uma menor concentração de soro.
Em certos aspectos, a revelação fornece polipeptídeos compreendendo um polipep- tídeo Actrll de ligação de ativina solúvel que se liga à ativina. O polipeptídeo de ativação de ativina pode ser um polipeptídeo ActRIIa ou um polipeptídeo ActRIIb. Os polipeptídeos Actrll pode ser formulado como uma preparação farmacêutica compreendendo o polipeptídeo Ac- trll de ligação de ativina e um carreador farmaceuticamente aceitável. O polipeptídeo Actrll de ligação de ativina pode se ligar à ativina com uma K0 menor que 1 micromolar ou menor que 100, 10 ou 1 nanomolar. Opcionalmente, o polipeptídeo Actrll de ligação de ativina liga seletivamente ativina versus GDF11 e/ou GDF8, e, opcionalmente, com uma K0 que é pelo menos 10 vezes, 20 vezes ou 50 vezes menor com relação a ativina do que com relação a GDF11 e/ou GDF8. Embora sem querer ficar preso a um mecanismo particular de ação, espera-se que este grau de seletividade para inibição de ativina com relação a inibição de GDF11/GDF8 seja responsável pelos efeitos no osso ou eritropoiese sem um efeito consis- tentemente mensurável no músculo. Em muitas modalidades, um polipeptídeo Actrll será selecionado para causar menos que 15%, menos que 10% ou menos que 5% de aumento no músculo em doses que atingem efeitos desejáveis nos níveis de células vermelhas do sangue. A composição pode ser pelo menos 95% pura, com relação a outros componentes de polipeptídeo, avaliada por cromatografia por exclusão de tamanho e, opcionalmente, a composição é pelo menos 98% pura. Um polipeptídeo Actrlla de ligação de ativina para uso em uma preparação como esta pode ser qualquer um daqueles aqui revelados, tal como um polipeptídeo com uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 7 ou 12, ou com uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 5 ou 13. Um polipeptídeo Actrlla de ligação de ativina pode incluir um fragmento funcional de um polipeptídeo ActRIIa natural, tal como um que compreende pelo menos 10, 20 ou 30 aminoácidos de uma seqüência selecionada de SEQ ID NOs: 1-3 ou uma seqüência de SEQ ID NO: 2, faltando os aminoácidos 10 a 15 do terminal C (a “cauda”). Um polipeptídeo Actrllb de ligação de ativina para uso em uma preparação como esta pode ser qualquer um 10 daqueles aqui revelados, tal como um polipeptídeo com uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16, 17, 20, ou 21 ou com uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16, 17, 20, ou 21. Um polipeptídeo Actrllb de ligação de ativina pode incluir um fragmento funcional de um polipeptídeo ActRIIb natural, tal como um que 15 compreende pelo menos 10, 20 ou 30 aminoácidos de SEQ ID NOs: 15-17 ou uma seqüên- cia faltando os aminoácidos 10 a 15 do terminal C (a “cauda”) tal como SEQ ID NO: 17.
Um polipeptídeo Actrll de ligação de ativina solúvel pode incluir uma ou mais altera- ções na seqüência de aminoácidos (por exemplo, no domínio de ligação de elemento de ligação) com relação a um polipeptídeo Actrll de ocorrência natural. Exemplos de polipeptí- 20 deos ActRIIa e ActRIIb alterados são fornecidos em WO 2006/012627, pp. 59-60 e pp. 55- 58, respectivamente, que é aqui incorporado pela referência. A alteração na seqüência de aminoácidos, por exemplo, pode alterar a glicosilação do polipeptídeo durante a produção em uma célula de mamífero, inseto ou outro eucarioto ou alterar a clivagem proteolítica do polipeptídeo com relação ao polipeptídeo Actrll de ocorrência natural.
Um polipeptídeo Actrll de ligação de ativina pode ser uma proteína de fusão que
tem, como um domínio, um polipeptídeo Actrll, (por exemplo, uma porção de ligação de e- Iemento de ligação de uma ActRIIa ou ActRIIb) e um ou mais domínios adicionais que forne- cem uma propriedade desejável, tais como melhor farmacocinética, purificação mais fácil, alvejamento em tecidos particulares, etc. Por exemplo, um domínio de uma proteína de fu- 30 são pode melhorar uma ou mais de estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absor- ção/administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos de proteí- na, multimerização da proteína de fusão, e/ou purificação. Uma proteína de fusão de Actrll de ligação de ativina pode incluir um domínio Fc de imunoglobulina (tipo selvagem ou mu- tante) ou uma albumina sérica ou outra porção de polipeptídeo que fornece propriedades 35 desejáveis tais como melhor farmacocinética, maior solubilidade ou maior estabilidade. In uma modalidade preferida, uma fusão Actrll-Fc compreende um Iigante relativamente não estruturado posicionado entre o domínio Fc e o domínio Actrll extracelular. Este Iigante não estruturado pode corresponder à região grosseiramente não estruturada de 15 aminoácidos na extremidade terminal C do domínio extracelular de Actrll (a “cauda”), ou pode ser uma seqüência artificial de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos ou ter um comprimento de entre 5 e 15, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos que são relativamente livres de estrutura secundária, ou um 5 mistura de ambos. Um Iigante pode ser rico em resíduos de glicina e prolina e, por exemplo, pode conter uma seqüência única de treonína/serina e glicinas ou seqüências repetitivas de treonina/serina e glicinas (por exemplo, TG4 (SEQ ID NO: 22) ou SG4 (SEQ ID NO: 23)). Uma proteína de fusão pode incluir uma subsequência de purificação, tal como um marca- dor de epítopo, um FLAG tag, uma seqüência de poli-histidina, e uma fusão de GST. Opcio- 10 nalmente, um polipeptídeo Actrll solúvel inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modifi- cados selecionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGIado, um aminoáci- do farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conju- gado a uma fração lipídica, e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgâ- nico. Uma preparação farmacêutica também pode incluir um ou mais compostos adicionais 15 tal como um composto que é usado para tratar um distúrbio ósseo. Preferivelmente, uma preparação farmacêutica é substancialmente livre de pirogênio. Em geral, é preferível que uma proteína Actrll seja expressa em uma linhagem celular de mamífero, que faça media- ção apropriada à glicosilação natural da proteína Actrll, de maneira a diminuir a probabilida- de de uma resposta imune desfavorável em um paciente. Linhagens celulares humana e 20 CHO foram usadas com sucesso e espera-se que outros sistemas de expressão de mamífe- ro comuns sejam usados.
Da maneira aqui descrita, proteínas ActRIIa designadas ActRIIa-Fc (uma forma com um Iigante mínimo entre a porção ActRIIa e a porção Fe) têm propriedades desejáveis, inclu- indo ligação seletiva à ativina versus GDF8 e/ou GDF11, ligação de elemento de ligação de 25 alta afinidade e meia-vida sérica maior que duas semanas em modelos animais. Em certas modalidades a invenção fornece polipeptídeos Actrll-Fc e preparações farmacêuticas com- preendendo tais polipeptídeos e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em certos aspectos, a revelação fornece ácidos nucléicos que codificam um poli- peptídeo Actrll de ligação de ativina solúvel, tal como um polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb. 30 Um polinucleotídeo isolado pode compreender uma seqüência de codificação para um poli- peptídeo Actrll de ligação de ativina solúvel, tal como descrito anteriormente. Por exemplo, um ácido nucléico isolado pode incluir uma seqüência que codifica um domínio extracelular (por exemplo, domínio de ligação de elemento de ligação) de uma Actrll e uma seqüência que codificaria parte ou todo o domínio transmembrana e/ou o domínio citoplasmático de 35 uma Actrll, mas para um códon de parada posicionado no domínio transmembrana ou no domínio citoplasmático, ou posicionado entre o domínio extracelular e o domínio transmem- brana ou domínio citoplasmático. Por exemplo, um polinucleotídeo isolado pode compreen- der uma seqüência de polinucleotídeo ActRIIa de comprimento total tal como SEQ ID NO: 4 ou 5 ou uma seqüência de polinucleotídeo ActRIIb de comprimento total tal como SEQ ID NO: 18, ou uma versão parcialmente truncada de ActRIIa ou ActRIIb1 o dito polinucleotídeo isolado compreendendo adicionalmente um códon de término de transcrição em pelo menos 5 seiscentos nucleotídeos antes do terminal 3’ ou posicionado de outra forma, de maneira tal que a tradução do polinucleotídeo origina um domínio extracelular opcionalmente fundido a uma porção truncada de uma Actrll de comprimento total. Uma seqüência de ácido nucléico preferida para ActRIIa é SEQ ID NO: 14. Os ácidos nucléicos aqui revelados podem ser ope- ravelmente ligados a um promotor para expressão, e a revelação fornece células transfor- 10 madas com tais polinucleotídeos recombinantes. Preferivelmente, a célula é uma célula de mamífero tal como uma célula CHO.
Em certos aspectos, a revelação fornece métodos para preparar um polipeptídeo Actrll de ligação de ativina solúvel. Um método como este pode incluir expressar quaisquer dos ácidos nucléicos (por exemplo, SEQ ID NO: 4, 5 14, 18, ou 19) aqui revelados em uma 15 célula adequada, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). Um método co- mo este pode compreender: a) cultivar uma célula em condições adequadas para expressão do polipeptídeo Actrll solúvel, em que a dita célula é transformada com uma construção de expressão Actrll solúvel; e b) recuperar o polipeptídeo Actrll solúvel assim expresso. Poli- peptídeos Actrll solúveis podem ser recuperados como frações brutas, parcialmente purifi- 20 cadas ou altamente purificadas. A purificação pode ser atingida por uma série de etapas de purificação, incluindo, por exemplo, um, dois, três ou mais dos seguintes, em qualquer or- dem: cromatografia de proteína A, cromatografia de troca aniônica (por exemplo, sefarose Q), cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, fenilsefarose), cromatografia por exclusão de tamanho, e cromatografia de troca catiônica.
Em certos aspectos, um antagonista de ativina-ActrlI aqui revelado, tal como um
polipeptídeo Actrlla de ligação de ativina solúvel ou polipeptídeo Actrllb de ligação de ativina solúvel, pode ser usado em um método para promover a produção de célula vermelha do sangue ou aumentar os níveis de células vermelhas do sangue em um sujeito. Em certas modalidades, a revelação fornece métodos para tratar um distúrbio associado a baixas con- 30 tagens de célula vermelha no sangue ou a baixos níveis de hemoglobina (por exemplo, uma anemia), ou para promover a produção de célula vermelha do sangue em pacientes que necessitam desta. Um método pode compreender administrar a um sujeito que necessita deste, uma quantidade efetiva de antagonista de ativina-ActrlI. Em certos aspectos, a reve- lação fornece usos de antagonistas de ativina-actrll para preparar um medicamento para o 35 tratamento de um distúrbio ou condição da maneira aqui descrita. Em certos aspectos, a revelação fornece um método para identificar um agente que estimula a produção de células vermelhas do sangue. O método compreende: a) identificar um agente teste que se liga à ativina ou um domínio de ligação de elemento de ligação de um polipeptídeo Actrll; e b) ava- liar o efeito do agente nos níveis de células vermelhas do sangue, hemoglobina, e/ou níveis precursores de célula vermelha do sangue (por exemplo, níveis de reticulócito).
Descrição resumida dos desenhos 5 A figura 1 mostra a purificação de ActRIla-hFc expressa em células CHO. A proteí-
na purifica as um pico bem definido único, visualizado por coluna de classificação por tama- nho (painel esquerdo) e SDS-PAGE corada com Coomassie (painel direito) (raia esquerda: padrões de peso molecular; raia direito: ActRIla-hFc).
A figura 2 mostra a ligação de ActRIla-hFc à ativina e GDF-11, medida por ensaio BiaCore™
A figura 3 mostra os efeitos de ActRIla-hFc nas contagens de célula vermelha do sangue em primatas não humanos fêmeas. Macacos cinomolgos fêmeas (quatro grupos de cinco macacos cada) foram tratados com placebo ou 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg de ActRIla-hFc no dia 0, dia 7, dia 14 e dia 21. A figura 3A mostra contagens de célula verme- 15 Iha do sangue (RBC). A figura 3B mostra níveis de hemoglobina. A significância estatística está relacionada a linha de base para cada grupo de tratamento. No dia 57, dois macacos permaneceram em cada grupo.
A figura 4 mostra os efeitos de ActRIla-hFc nas contagens de célula vermelha do sangue em primatas não humanos machos. Macacos cinomolgos machos (quatro grupos de 20 cinco macacos cada) foram tratados com placebo ou 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg de ActRIla-hFc no dia 0, dia 7, dia 14 e dia 21. A figura 4A mostra contagens de célula verme- lha do sangue (RBC). A figura 4B mostra níveis de hemoglobina. A significância estatística está relacionada a linha de base para cada grupo de tratamento. No dia 57, dois macacos permaneceram em cada grupo.
Figura 5 mostra os efeitos de ActRIla-hFc nas contagens de reticulócito em prima-
tas não humanos fêmeas. Macacos cinomolgos (quatro grupos de cinco macacos cada) fo- ram tratados com placebo ou 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg de ActRIla-hFc no dia 0, dia 7, dia 14 e dia 21. A figura 5A mostra contagens absolutas de reticulócito. A figura 5B mostra a porcentagem de reticulócitos com relação a RBCs. A significância estatística está relaciona- 30 da a linha de base para cada grupo. No dia 57, dois macacos permaneceram em cada gru- po.
A figura 6 mostra os efeitos de ActRIla-hFc nas contagens de reticulócito em prima- tas não humanos fêmeas. Macacos cinomolgos (quatro grupos de cinco macacos cada) fo- ram tratados com placebo ou 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg de ActRIla-hFc no dia 0, dia 7, 35 dia 14 e dia 21. A figura 6A mostra contagens absolutas de reticulócito. A figura 6B mostra a porcentagem de reticulócitos com relação a RBCs. A significância estatística está relaciona- da a linha de base para cada grupo. No dia 57, dois macacos permaneceram em cada gru- A figura 7 mostra resultados do experimento clínico humano descrito no exemplo 5, onde a área sob a curva (AUC) e dose administrada de ActRIla-hFc têm uma correlação linear, indiferentemente se ActRIla-hFc foi administrado intravenosamente (IV) ou subcuta- neamente (SC).
A figura 8 mostra uma comparação de níveis séricos de ActRIla-hFc em pacientes administrados IV ou SC.
A figura 9 mostra níveis de fosfatase alcalina óssea (BAP) em resposta a diferentes níveis de dose de ActRIla-hFc. BAP é um marcador para crescimento ósseo anabólico.
A figura 10 representa a mudança mediana da linha de base de níveis de hemató- crito do experimento clínico humano descrito no exemplo 5. ActRIla-hFc foi administrada intravenosamente (IV) na dosagem indicada.
A figura 11 representa a mudança mediana da linha de base de níveis de hemoglo- bina do experimento clínico humano descrito no exemplo 5. ActRIla-hFc foi administrada intravenosamente (IV) na dosagem indicada.
A figura 12 representa a mudança mediana da linha de base da contagem de RBC (célula vermelha do sangue) do experimento clínico humano descrito no exemplo 5. ActRIla- hFc foi administrada intravenosamente (IV) na dosagem indicada.
A figura 13 representa a mudança mediana da linha de base da contagem de reticu- lócito do experimento clínico humano descrito no exemplo 5. ActRIla-hFc foi administrada intravenosamente (IV) na dosagem indicada.
Descrição detalhada da invenção
1. Aspectos gerais
A superfamília de fator de crescimento transformador (TGF-beta) contém uma vari- edade de fatores de crescimento que compartilham elementos de seqüência e motivos es- truturais comuns. Sabe-se que estas proteínas mostram efeitos biológicos em uma grande variedade de tipos celulares tanto em vertebrados quanto em invertebrados. Membros da superfamília realizam importantes funções durante o desenvolvimento embrionário na for- mação padrão e especificação de tecido e podem influenciar uma variedade de processos de diferenciação, incluindo adipogênese, miogênese, condrogênese, cardiogênese, hemato- poiese, neurogênese e diferenciação celular epitelial. A família é dividida em duas ramifica- ções gerais: as ramificações BMP/GDF e TGF-beta/Ativina/BMP10, cujos membros têm efei- tos complementares frequentemente diversos. Manipulando a atividade de um membro da família TGF-beta, é frequentemente possível causar mudanças fisiológicas significativas em um organismo. Por exemplo, as criações de gado Piedmontese e Belgian Blue carregam uma mutação perda-de-função no gene GDF8 (também chamado miostatina) que causa um aumento acentuado na massa muscular. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1 ):71-4. Além disso, em humanos, alelos inativos de GDF8 estão associados com maior massa muscular e, reportadamente, força excepcional. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8.
Ativinas são fatores de crescimento de polipeptídeo dimérico que pertencem à su- perfamília TGF-beta. Existem três formas de ativina principais (A, B, e AB) que são ho- mo/heterodímeros de duas subunidades β estreitamente relacionadas (/?A /?α· ββ ββ, e βA ββ, respectivamente). O genoma humano também codifica uma ativina C e uma ativina E, que são principalmente expressas no fígado, e formas heterodiméricas contendo /?c ou /?E tam- bém são conhecidas. Na superfamília TGF-beta, ativinas são fatores exclusivos e multifun- cionais que podem estimular a produção de hormônio em células ovarianas e placentárias, auxiliar na sobrevivência da célula neuronal, influenciar positiva ou negativamente o pro- gresso do ciclo celular dependendo do tipo celular e induzir diferenciação mesodérmica pelo menos em embriões de anfíbios (DePaoIo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963). Além disso, observa-se que o fator de diferenciação eritróide (EDF) isolado das células Ieu- cêmicas monocíticas humanas estimuladas é idêntico a ativina A (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). Sugere-se que ativina A promove eritropoiese na medula óssea. Em diver- sos tecidos, a sinalização de ativina é antagonizada por seu heterodímero relacionado, inibi- na. Por exemplo, durante a liberação do hormônio folículo estimulante (FSH) a patir da pitui- tária, ativina promove a secreção e síntese de FSH, enquanto a inibina previne a secreção e síntese de FSH. Outras proteínas que podem regular a bioatividade de ativina e/ou se ligar à ativina incluem folistatina (FS), proteína relacionada a folistatina (FSRP) e a2- macroglobulina.
Os sinais de TGF-/? são mediados por complexos heterodiméricos de receptores de quinase serina/treonina tipo I e tipo II, que fosforilam e ativam proteínas Smad à jusante me- 25 diante estímulo de elemento de ligação (Massague, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 :169- 178). Estes receptores tipo I e tipo Il são proteínas transmembranas compostas de um do- mínio extracelular de ligação de elemento de ligação com região rica em cisteína, um domí- nio transmembrana, e um domínio citoplasmático com especificidade serina/treonina predita. Os receptores tipo I são essenciais para sinalização; e receptores tipo Il são exigidos para 30 ligar elementos de ligação e para expressão de receptores tipo I. Os receptores de ativina tipo Iell formam um complexo estável após a ligação do elemento de ligação, resultando na fosforilação de receptores tipo I por receptores tipo II.
Dois receptores tipo Il relacionados (Actrll), ActRIIa e ActRIIb, foram identificados como os receptores tipo Il para ativinas (Mathews e Vale, 1991 , Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Além das ativinas, ActRIIa e ActRIIb podem interagir bioquimí- camente com diversas outras proteínas da família TGF-/?, incluindo BMP7, Nodal, GDF8, e GDF11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee e McPherron, 2001 , Proc. Natl. Acad. Sei. 98:9306-931 1 ; Yeo e Whitman1 2001 , Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 é o principal receptor tipo I para ativinas, particular- mente para ativina A, e ALK-7 pode servir como um receptor para ativinas igualmente, parti- cularmente para ativina B.
Da maneira aqui demonstrada, um peptídeo Actrlla solúvel (sActRIla), que mostra substancial preferência na ligação a ativina A, ao contrário de outros membros da família TGF-beta, tal como GDF8 ou GDF11, é efetivo para aumentar os níveis de células verme- lhas do sangue in vivo. Embora sem querer ficar preso a nenhum mecanismo particular, es- pera-se que o efeito de sActRIla seja causado principalmente por um efeito antagonista de ativina, dando a ligação de ativina muito forte (constante de dissociação picomolar) exibida pelo construção sActRIla particular usados nestes estudos. Independente do mecanismo, é aparente a partir desta revelação que antagonistas de ActRIIa de ativina aumentam os ní- veis de células vermelhas do sangue em roedores, macacos e humanos. Deve-se notar que a hematopoiese é um processo complexo, regulado por uma variedade de fatores, incluindo eritropoietina, G-CSF e homeostase do ferro. Os termos "aumentar dos níveis de células vermelhas do sangue" e "promover a formação de célula vermelha do sangue" referem-se a métricas clinicamente observáveis, tais como hematócrito, contagens de célula vermelha do sangue e medições de hemoglobina, e pretende-se que sejam neutros ao mecanismo pelo qual tais mudanças podem ocorrer.
Da maneira aqui também demonstrada, um polipeptídeo Actrllb solúvel (sActRIlb) é efetivo em aumentar os níveis de reticulócito in vivo, um efeito que, por um período de tem- po maior, espera-se que cause maiores níveis de hemotócrito.
Os dados aqui relatados com relação a primatas não humanos são reproduzíveis igualmente em camundongos, ratos e humanos e, portanto, esta revelação fornece métodos para usar polipeptídeos Actrll e outros antagonistas de ativina-actrll para promover a produ- ção de célula vermelha do sangue e aumentar os níveis de células vermelhas do sangue em mamíferos que variam de roedores a humanos. Antagonistas de ativina-actrll incluem, por exemplo, polipeptídeos ActRIIa solúveis de ligação de ativina, polipeptídeos ActRIIb solúveis de ligação de ativina, anticorpos que se ligam a ativina (particularmente as subunidades A e B de ativina, também referidos como βΑ ou βΒ) e rompem a ligação de ActRIIa e/ou ActRIIb, anticorpos que se ligam a ActRIIa e rompem a ligação de ativina, anticorpos que se ligam a ActRIIb e rompem a ligação de ativina, proteínas não anticorpo selecionadas para ligação de ativina, ActRIIb ou ActRIIa (ver, por exemplo, W0/2002/088171, W0/2006/055689, e W0/2002/032925 para exemplos de tais proteínas e métodos para projetar e seleção das mesmas), peptídeos randomizados selecionados para ligação de ativina, ActRIIb, ou ActRII-
a, frequentemente fixados em um domínio Fe. Duas proteínas diferentes (ou outras frações) com atividade de ligação de ativina, ActRIIb, ou ActRIIa1 especialmente Iigadores de ativina que bloqueiam os sítios de ligação tipo 1 (por exemplo, um receptor de ativina tipo I solúvel) e tipo Il (por exemplo, um receptor de ativina tipo Il solúvel), respectivamente, podem ser ligadas uma na outra para criar uma molécula de ligação bifuncional. Aptâmeros de ácido nucléico, moléculas pequenas e outros agentes que inibem o eixo de sinalização ativina- 5 Actrll são incluídos como antagonistas de ativina-actrll. Várias proteínas têm atividade anta- gonista de ativina-ActrlI, incluindo inibina (isto é, subunidade alfa inibina), embora inibina não antagonize universalmente ativina em todos os tecidos, folistatina (por exemplo, folista- tina-288 e folistatina-315), FSRP, ativina C, alfa(2)-macroglobulina e uma ativina A mutante M108A (mudança de metionina para alanina na posição 108). Em geral, formas alternativas 10 de ativina, particularmente aquelas com alterações no domínio de ligação do receptor tipo I, podem se ligar a receptores tipo Il e não conseguem formar um complexo ternário ativo, agindo assim como antagonistas. Adicionalmente, ácidos nucléicos, tais como moléculas antissentido, RNAsis ou ribozimas que inibem ativina A, B, C ou E, ou, particularmente, a expressão de ActRIIa ou ActRIIb, podem ser usados como antagonistas de ativina-actrll. Os 15 antagonistas de ativina-ActrlI a serem usados podem exibir a seletividade para inibir a sina- lização mediada por ativina versus outros membros da família TGF-beta e, particularmente, com relação a GDF8 e GDF11.
Em geral, os termos usados nesta especificação têm seus significados usuais na técnica, no contexto desta invenção e no contexto específico onde cada termo é usado. Cer- 20 tos termos são discutidos a seguir ou em outra parte na especificação, para fornecer orien- tação adicional ao profissional em descrever as composições e métodos da invenção e co- mo preparar e usá-las. O escopo ou significado de qualquer uso de um termo será aparente a partir do contexto específico no qual o termo é usado.
"Cerca de" e "aproximadamente", em geral, devem significar um grau de erro acei- tável para a quantidade medida, dada a natureza ou precisão das medições. Tipicamente, graus de erro exemplares estão em 20 porcento (%), preferivelmente em 10%, e mais prefe- rivelmente em 5% de um valor dado ou faixa de valores.
Alternativamente e particularmente, em sistemas biológicos, os termos "cerca de" e "aproximadamente" podem significar valores que estão em uma ordem de magnitude, prefe- 30 rivelmente em 5 vezes e, mais preferivelmente, em 2 vezes de um valor dado. Quantidades numéricas aqui fornecidas são próximas, a menos que de outra forma declarada, significan- do que o termo "cerca de" ou "aproximadamente" podem ser inferidos quando não expres- samente declarados.
Os métodos da invenção podem incluir etapas de comparar seqüências umas com as outras, incluindo seqüência tipo selvagem para um ou mais mutantes (variantes de se- qüência). Tais comparações compreendem tipicamente alinhamentos de seqüências de po- límero, por exemplo, usando programas e/ou algoritmos de alinhamento de seqüência que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, BLAST, FASTA e MEGALIGN, para citar al- guns). Os versados na técnica percebem facilmente que, em tais alinhamentos, onde uma mutação contém uma inserção ou deleção de resíduo, o alinhamento de seqüência introdu- zirá uma "folga" (tipicamente representada um hífen, ou "A") na seqüência de polímero que não contém o resíduo inserto ou deletado.
"Homólogo", em todas as suas formas gramaticais e variações de ortografia, refere- se ao relacionamento entre duas proteínas que possuem uma "origem evolucionária co- mum," incluindo proteínas das superfamílias na mesma espécie de organismo, bem como proteínas homólogas de espécie diferente de organismo. Tais proteínas (e seus ácidos nu- cléicos que codificam) têm homologia de seqüência refletida por sua similaridade de se- qüência, quer em termos de identidade percentual ou pela presença de resíduos ou motivos específicos e posições conservadas.
O termo "similaridade de seqüência", em todas as suas formas gramaticais, refere- se ao grau de identidade ou correspondência entre as seqüências de ácido nucléico ou ami- noácidos que podem ou não compartilhar uma origem evolucionária comum.
Entretanto, no uso comum e na aplicação imediata, o termo "homólogo", quando modificado com um advérbio tal como "altamente", pode referir-se a similaridade de seqüên- cia e pode ou não estar relacionado a uma origem evolucionária comum.
2. Polipeptídeos Actrll
Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos Actrll. Da maneira aqui usada, a palavra "Actrll" refere-se à família de receptores de ativina tipo II. Esta família inclui tanto o receptor de ativina tipo Ila quanto o receptor de ativina tipo Nb.
Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos ActRIIa. Da maneira aqui usada, a palavra "ActRIla" refere-se a uma família de proteínas do receptor de ativina tipo Ila (ActRIla) de quaisquer espécie e variantes derivadas de tais proteínas ActRIIa por mutagênese ou outra modificação. Entende-se aqui que a referência ActRIla é uma refe- rência a qualquer uma das formas identificadas atualmente. Membros da família ActRIla são em geral proteínas transmembranas, compostas de um domínio extracelular de ligação de elemento de ligação com uma região rica em cisteína, um domínio transmembrana, e um domínio citoplasmático com atividade quinase serina/treonina predita.
O termo "polipeptídeo ActRIla" inclui polipeptídeos que compreendem qualquer po- lipeptídeo de ocorrência natural de um membro da família Actrlla, bem como quaisquer vari- antes deste (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas peptidomiméticas) que man- têm uma atividade útil. Ver, por exemplo, WO/2006/012627. Por exemplo, polipeptídeos Ac- tRIla incluem polipeptídeos derivados da seqüência de qualquer ActRIla conhecida com uma seqüência pelo menos cerca de 80% idêntica à seqüência de um polipeptídeo ActRIla e, opcionalmente, pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais de identidade. Por e- xemplo, um polipeptídeo Actrlla da invenção pode se ligar e inibir a função de uma proteína Actrlla e/ou ativina. Um polipeptídeo ActRIla pode ser selecionado pela atividade em promo- ver formação de célula vermelha do sangue in vivo. Exemplos de polipeptídeos ActRIla in- cluem polipeptídeo precursor de ActRIla humano (SEQ ID NO: 1) e polipeptídeos ActRIla humanos solúveis (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 3, 7 e 12).
A seqüência de proteína precursora de ActRIla humana é da maneira a seguir:
MGAAAKLAFAVFLISCS SGAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEP CYGDKDKRRHCFATWKglSGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSP EVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPYYNILLYSLVPL MLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLE VKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHEN ILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAE TMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGL ALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGL VLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVL RDYWQKHAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVGERITQMQRLTNIIT TEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL (SEQ ID NO: 1)
O peptídeo de sinal está sublinhado em linha única; o domínio extracelular está em negrito e os sítios de glicosilação potenciais ligados a N estão sublinhados em linha dupla.
A seqüência de polipeptídeo processado solúvel ActRIla humano (extracelular) é da
maneira a seguir:
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISG SIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFP EMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2)
O terminal C "cauda" do domínio extracelular está sublinhado. A seqüência com a "cauda" deletada (uma seqüência Δ15) é da maneira a seguir:
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISG SIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFP EM (SEQ ID NO:3)
A seqüência de ácido nucléico que codifica proteína precursora de ActRIla humana é da maneira a seguir (nucleotídeos 164-1705 de acesso ao Genbak NM_001616): ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCTCCTGTT
CTTCAGGTGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTT
TAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCG
TGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGA
ATATTTCTGGTTCCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGA
TATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCT
GAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTT
cttattttccagagatggaagtcacacagcccacttcaaatccagttac
ACCTAAGCCACCCTATTACAACATCCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTT ATGTTAATTGCGGGGATTGTCATTTGTGCATTTTGGGTGTACAGGCATC ACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTCCAACTCAAGACCCAGGACC ACCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACCACTGCAGTTATTAGAA GTGAAAGCAAGGGGAAGATTTGGTTGTGTCTGGAAAGCCCAGTTGCTTA ACGAATATGTGGCTGTCAAAATATTTCCAATACAGGACAAACAGTCATG GCAAAATGAATACGAAGTCTACAGTTTGCCTGGAATGAAGCATGAGAAC ATATTACAGTTCATTGGTGCAGAAAAACGAGGCACCAGTGTTGATGTGG ATCTTTGGCTGATCACAGCATTTCATGAAAAGGGTTCACTATCAGACTT TCTTAAGGCTAATGTGGTCTCTTGGAATGAACTGTGTCATATTGCAGAA ACCATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATACCTGGCCTAA AAGATGGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTAAAAA TGTGCTGTTGAAAAACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTG GCCTTAAAATTTGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCATGGACAGG TTGGTACCCGGAGGTACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAA CTTCCAAAGGGATGCATTTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTA GTCCTATGGGAACTGGCTTCTCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAG ATGAATACATGTTGCCATTTGAGGAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCT TGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTGCATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTA AGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAATGGCAATGCTCTGTGAAACCA TTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCCAGGTTATCAGCTGGATG TGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAACAAATATTATTACC ACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAATGTTGACTTTC CTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA (SEQ ID NO: 4)
O seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo solúvel ActRIla (extra- celular) é da maneira a seguir: ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATT GGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGA CAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGT TCCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCT ATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTT TTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCA GAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCAC CC (SEQ ID NO: 5)
Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos ActRIIb. Da maneira aqui usada, a palavra "ActRIlb" refere-se a uma família de proteínas do receptor de ativina tipo Nb (ActRIlb) de quaisquer espécie e variantes derivadas de tais proteínas ActRIIb por mutagênese ou outra modificação. Entende-se aqui que a referencia a ActRIlb é uma referência a qualquer uma das formas identificadas atualmente. Em geral, membros da famí- lia ActRIlb são proteínas transmembranas, compostas de um domínio extracelular de liga- ção de elemento de ligação com uma região rica em cisteína, um domínio transmembrana, e um domínio citoplasmático com atividade quinase serina/treonina predita.O termo "polipeptí- deo ActRIlb" inclui polipeptídeos que compreendem qualquer polipeptídeo de ocorrência natural de um membro da família Actrllb, bem como quaisquer variantes deste (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas peptidomiméticas) que mantêm uma atividade útil. Ver, por exemplo, W0/2006/012627. Por exemplo, polipeptídeos ActRIlb incluem polipeptí- deos derivados da seqüência de qualquer ActRIlb conhecida com uma seqüência pelo me- nos cerca de 80% idêntica à seqüência de um polipeptídeo ActRIlb e, opcionalmente, pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais de identidade. Por exemplo, um.polipeptídeo Actrllb da invenção pode se ligar e inibir a função de uma proteína Actrllb e/ou ativina. Um polipeptídeo ActRIlb pode ser selecionado pela atividade em promover a formação de célula vermelha do sangue in vivo. Exemplos de polipeptídeos ActRIlb incluem precursor de poli- peptídeo ActRIlb humano (SEQ ID NO: 15) e polipeptídeos ActRIlb solúveis humanos (por exemplo, SEQ ID NO: 16, 17, 20, e 21).
A seqüência de proteína precursora ActRIlb humana é da maneira a seguir: mtapwvalallwgslwpgsgrgeaetreciyynanwelertínIqsglerc
EGEQDKRLHCYASWAgsSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQ VYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVT YEPPPTAPTLLT VLA Y SLLPIG GLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIK ARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLL QFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETM SRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLA VRFEPGKPPGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLV LWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIK DHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTS DCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI (SEQ ID NO: 15)
O peptídeo de sinal está sublinhado por uma única linha; o domínio extracelular es- tá em negrito e os sítios de glicosilação potenciais ligados a N estão em caixas.
A seqüência de polipeptídeo processado (extracelular) solúvel ActRIlb humana é da maneira a seguir:
SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSS GTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHL PEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 16)
O terminal C "cauda" do domínio extracelular está sublinhado. A seqüência com a “cauda” deletada (uma seqüência Δ15) é da maneira a seguir:
SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSS GTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHL PEA (SEQ ID NO: 17)
A seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína precursora ActRIlb huma-
na é da maneira a seguir: (nucleotídeos 5-1543 de acesso ao Genbak NM_001 106) ATGACGGCGCCCTGGGTGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGGC
CCGGCTCTGGGCGTGGGGAGGCTGAGACACGGGAGTGCATCTACTACAA
CGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGGCCTGGAGCGCTGC
GAAGGCGAGCAGGACAAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGGCCAACA
GCTCTGGCACCATCGAGCTCGTGAAGAAGGGCTGCTGGCTAGATGACTT
CAACTGCTACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCACTGAGGAGAACCCCCAG
GTGTACTTCTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAGCGCTTCACTC
ATTTGCCAGAGGCTGGGGGCCCGGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGAC
AGCCCCCACCCTGCTCACGGTGCTGGCCTACTCACTGCTGCCCATCGGG
GGCCTTTCCCTCATCGTCCTGCTGGCCTTTTGGATGTACCGGCATCGCA
AGCCCCCCTACGGTCATGTGGACATCCATGAGGACCCTGGGCCTCCACC
ACCATCCCCTCTGGTGGGCCTGAAGCCACTGCAGCTGCTGGAGATCAAG
GCTCGGGGGCGCTTTGGCTGTGTCTGGAAGGCCCAGCTCATGAATGACT
TTGTAGCTGTCAAGATCTTCCCACTCCAGGACAAGCAGTCGTGGCAGAG
TGAACGGGAGATCTTCAGCACACCTGGCATGAAGCACGAGAACCTGCTA
CAGTTCATTGCTGCCGAGAAGCGAGGCTCCAACCTCGAAGTAGAGCTGT
GGCTCATCACGGCCTTCCATGACAAGGGCTCCCTCACGGATTACCTCAA
GGGGAACATCATCACATGGAACGAACTGTGTCATGTAGCAGAGACGATG
TCACGAGGCCTCTCATACCTGCATGAGGATGTGCCCTGGTGCCGTGGCG
AGGGCCACAAGCCGTCTATTGCCCACAGGGACTTTAAAAGTAAGAATGT
ATTGCTGAAGAGCGACCTCACAGCCGTGCTGGCTGACTTTGGCTTGGCT
GTTCGATTTGAGCCAGGGAAACCTCCAGGGGACACCCACGGACAGGTAG
GCACGAGACGGTACATGGCTCCTGAGGTGCTCGAGGGAGCCATCAACTT
CCAGAGAGATGCCTTCCTGCGCATTGACATGTATGCCATGGGGTTGGTG
CTGTGGGAGCTTGTGTCTCGCTGCAAGGCTGCAGACGGACCCGTGGATG
AGTACATGCTGCCCTTTGAGGAAGAGATTGGCCAGCACCCTTCGTTGGA GGAGCTGCAGGAGGTGGTGGTGCACAAGAAGATGAGGCCCACCATTAAA GATCACTGGTTGAAACACCCGGGCCTGGCCCAGCTTTGTGTGACCATCG AGGAGTGCTGGGACCATGATGCAGAGGCTCGCTTGTCCGCGGGCTGTGT GGAGGAGCGGGTGTCCCTGATTCGGAGGTCGGTCAACGGCACTACCTCG GACTGTCTCGTTTCCCTGGTGACCTCTGTCACCAATGTGGACCTGCCCC CTAAAGAGTCAAGCATCTAA (SEQ ID NO: 18) A seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo (extracelular) ActRIla solú- vel é da maneira a seguir:
TCTGGGCGTGGGGAGGCTGAGACACGGGAGTGCATCTACTACAACGCCA ACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGGCCTGGAGCGCTGCGAAGG CGAGCAGGACAAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGGCCAACAGCTCT GGCACCATCGAGCTCGTGAAGAAGGGCTGCTGGCTAGATGACTTCAACT GCTACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCACTGAGGAGAACCCCCAGGTGTA CTTCTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAGCGCTTCACTCATTTG CCAGAGGCTGGGGGCCCGGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGACAGCCC CCACC (SEQ ID NO: 19)
Em uma modalidade específica, a invenção diz respeito a polipeptídeos Actrll solú- veis. Da maneira aqui descrita, o termo "polipeptídeo Actrll solúvel" refere-se em geral a polipeptídeos compreendendo um domínio extracelular de uma proteína Actrlla ou ActRIlb. O termo "polipeptídeo Actrll solúvel", da maneira aqui usada, inclui qualquer domínio extra- celular de ocorrência natural de uma proteína Actrlla ou ActRIlb, bem como quaisquer vari- antes deste (incluindo mutantes, fragmentos e formas peptidomiméticas). Um polipeptídeo Actrll de ligação de ativina é um que mantém a capacidades de se ligar a ativina, incluindo, por exemplo, ativina AA, AB, BB, ou formas que incluem uma subunidade C ou E. Opcio- nalmente, um polipeptídeo Actrll de ligação de ativina se ligará a ativina AA com uma cons- tante de dissociação de 1 nM ou menos. Em geral, o domínio extracelular de uma proteína Actrll que se liga a ativina é solúvel e, pode assim, ser denominado um polipeptídeo Actrll de ligação de ativina solúvel. Exemplos de polipeptídeos ActRIla de ligação de ativina solú- veis incluem os polipeptídeos solúveis ilustrados em SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 e 13. SEQ ID NO:7 é referida como ActRIla-hFc e é descrita adicionalmente nos exemplos. Outros exem- plos de polipeptídeos ActRIla de ligação de ativina solúveis compreendem um seqüência de sinal além do domínio extracelular de uma proteína ActRIla, por exemplo, a seqüência líder melitina de mel de abelha (SEQ ID NO: 8), a líder ativador de plasminogênio tecidual (TPA) (SEQ ID NO: 9) ou a líder ActRIla nativa (SEQ ID NO: 10). O polipeptídeo ActRIla-hFc ilus- trado em SEQ ID NO: 13 usa um líder TPA. Exemplos de polipeptídeos ActRIlb de ligação de ativina solúveis incluem os polipeptídeos solúveis ilustrados em SEQ ID NOs: 16, 17, 20. Os polipeptídeos ActRIlb de ligação de ativina podem t. compreender uma seqüência de sinal além do domínio extracelular de uma proteína Actrllb, por exemplo, a seqüência líder melitina de mel de abelha (SEQ ID NO: 8) ou líder ativador de plasminogênio tecidual (TPA) (SEQ ID NO: 9).
Fragmentos funcionalmente ativos de polipeptídeos Actrll podem ser obtidos triando polipeptídeos produzidos recombinantemente a partir do fragmento correspondente do ácido nucléico que codifica um polipeptídeo Actrll. Além do mais, os fragmentos podem ser quimi- camente sintetizados usando técnicas conhecidas na tecnologia tal como química f-Moc ou t-Boc de fase sólida de Merrifield convencional. Os fragmentos podem ser produzidos (re- combinantemente ou por síntese química) e testados para identificar aqueles fragmentos de 5 peptidila que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína Actrll ou sinaliza- ção mediada por ativina.
Variantes funcionalmente ativos de polipeptídeos Actrll podem ser obtidos triando bibliotecas de polipeptídeos modificados produzidos recombinantemente a partir de ácidos nucléicos mutagenizados correspondentes que codificam um polipeptídeo Actrll. Os varian- tes podem ser produzidos e testados para identificar aqueles que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína Actrll ou sinalização mediada por ativina. Em certas modalidades, uma variante funcional dos polipeptídeos ActRIla compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 75% idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecio- nada de SEQ ID NOs: 2 ou 3. Em certos casos, o variante funcional tem uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 ou 3. Em certas modalidades, uma variante funcional dos polipeptídeos ActRIlb compreende uma seqüência de aminoáci- dos que é pelo menos 75% idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 ou 17. Em certos casos, o variante funcional tem uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 17 ou 18. Variantes funcionais podem ser produ- zidas modificando a estrutura de um polipeptídeo Actrll com tais propósitos como melhorar a eficácia terapêutica, ou estabilidade (por exemplo, vida em prateleira ex vivo e resistência a degradação proteolítica in vivo). Tais polipeptídeos Actrll modificados, quando selecionados para manter a ligação de ativina, são considerados equivalentes funcionais dos polipeptí- deos Actrll de ocorrência natural. Polipeptídeos Actrll modificados também podem ser pro- duzidos, por exemplo, por substituição, deleção ou adição de aminoácido. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma íeucina com uma isoleucina ou vali- na, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado (por exemplo, mutações conservativas) não terão um efeito importante na atividade biológica da molécula resultante. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem em uma família de amino- ácidos que são relacionados em suas cadeias laterais. Pode-se determinar facilmente se uma mudança na seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo Actrll resulta em um homó- logo funcional avaliando a capacidade do variante de polipeptídeo Actrll produzir uma res- posta em células de uma maneira similar ao polipeptídeo Actrll tipo selvagem.
Em certas modalidades, a presente invenção contempla mutações específicas dos polipeptídeos Actrll de maneira a alterar a glicosilação do polipeptídeo. Tais mutações po- dem ser selecionadas de maneira a introduzir ou eliminar um ou mais sítios de glicosilação, tais como sítios de glicosilação ligados a O ou ligados a N. Os sítios de reconhecimento de glicosilação ligados a asparagina compreendem em geral uma seqüência de tripeptídeo, 5 asparagina-X-treonina ou asparagina-X-serina (onde "X" é qualquer aminoácido) que é re- conhecida especificamente por enzimas de glicosilação celular apropriadas. A alteração também pode ser realizada pela adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na seqüência do polipeptídeo Actrll tipo selvagem (para sítios de glicosilação liga- dos a O). Uma variedade de substituições de aminoácidos ou deleções de uma ou ambas 10 da primeira ou terceira posições de aminoácidos de um sítio de reconhecimento de glicosila- ção (e/ou deleção de aminoácido na segunda posição) resulta em não glicosilação na se- qüência de tripeptídeo modificada. Um outro meio de aumentar o número de frações de car- boidrato em um polipeptídeo Actrll é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos no polipeptídeo Actrll. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(s) pode(m) 15 ser anexado a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxila livres; (c) grupos sulfidrila livres tal como aquele de cisteína; (d) grupos hidroxila livres tais como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina; (e) resíduos aromáticos tais como aqueles de fenilalanina, tirosina ou trip- tofano; ou (f) o grupo amida de glutamina. A remoção de uma ou mais frações de carboídra- to presente em um polipeptídeo Actrll pode ser realizada química e/ou enzimaticamente. A 20 deglicosilação química pode envolver, por exemplo, exposição do polipeptídeo Actrll ao composto ácido trifluormetanossulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento re- sulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares, com exceção do açúcar de ligação (N- acetilglucosamina ou N- acetilgalactosamina), deixando ao mesmo tempo a seqüência de aminoácidos intacta. A clivagem enzimática de frações de carboidrato em polipeptídeos Ac- 25 trll pode ser atingida pelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicosidases descritas por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. A seqüência de um polipeptídeo Actrll pode ser ajustada, da maneira apropriada, dependendo do tipo de sistema de expressão usado, visto que as células de mamífero, de levedura, de inseto e de planta podem todas introduzir padrões de glicosilação diferentes que podem ser afetados pela seqüência de aminoácidos 30 do peptídeo. Em geral, proteínas Actrll para uso em humanos pode ser expressa em uma linhagem celular de mamífero que fornece glicosilação própria, tal como linhagens celulares HEK293 ou CHO, embora espera-se que outras linhagens celulares de expressão de mamí- feros sejam igualmente usadas.
Esta revelação contempla adicionalmente um método de produzir mutantes, particu- Iarmente conjuntos de mutantes combinatórios de um polipeptídeo Actrll, bem como mutan- tes truncados; reuniões de mutantes combinatórios são especialmente usadas para identifi- car seqüências de variante funcional. O propósito de triar tais bibliotecas combinatórias pode ser para produzir, por exemplo, variantes de polipeptídeo Actrll que se ligam a ativina ou outros elementos de ligação. Uma variedade de ensaios de triagem é fornecida a seguir, e tais ensaios podem ser usados para avaliar variantes. Por exemplo, um variante de polipep- tídeo Actrll pode ser triado pela capacidade de se ligar a um elemento de ligação de Actrll, prevenir a ligação de um elemento de ligação Actrll a um polipeptídeo Actrll ou interferir na sinalização causada por um elemento de ligação Actrll.
A atividade de um polipeptídeo Actrll ou seus variantes também pode ser testada em um ensaio com base em células ou in vivo. Por exemplo, o efeito de um variante de poli- peptídeo Actrll na expressão de genes envolvidos na hematopoiese pode ser avaliado. Da maneira necessária, isto pode ser realizado na presença de uma ou mais proteínas de ele- mento de ligação de Actrll recombinante (por exemplo, ativina), e as células podem ser transfectadas de maneira a produzir um polipeptídeo Actrll e/ou variantes deste e, opcio- nalmente, um elemento de ligação Actrll. Similarmente, um polipeptídeo Actrll pode ser ad- ministrado a um camundongo ou outro animal, e uma ou mais medições sanguíneas, tais como uma contagem de RBC, hemoglobina, ou contagem de reticulócito podem ser avalia- das.
Podem ser produzidas variantes combinatoriamente derivadas que têm uma potên- cia seletiva ou em geral maior com relação a um polipeptídeo Actrll de ocorrência natural. Similarmente, a mutagênese pode dar origem a variantes que têm meias-vidas intracelulares muito diferentes daquelas que correspondem a um polipeptídeo Actrll tipo selvagem. Por exemplo, a proteína alterada pode tornar-se tanto mais estável quanto menos estável a de- gradação proteolítica ou outros processos celulares que resultam na destruição ou, de outra forma, na inativação de um polipeptídeo Actrll nativo. Tais variantes, e os genes que os co- dificam, podem ser utilizados para alterar níveis de polipeptídeo Actrll modulando a meia- vida dos polipeptídeos Actrll. Por exemplo, uma meia-vida curta pode dar origem a efeitos biológicos mais transientes e, quando parte de um sistema de expressão indutível, pode permitir controle mais rigoroso dos níveis de polipeptídeo Actrll na célula. Em uma proteína de fusão Fe, as mutações podem ser realizadas no Iigante (se houver) e/ou na porção Fc para alterar a meia-vida da proteína.
Uma biblioteca combinatória pode ser produzida por meio de uma biblioteca dege- nerada de genes que codificam uma biblioteca de polipeptídeos, em que cada qual inclui pelo menos uma porção de seqüências de polipeptídeo Actrll potenciais. Por exemplo, uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos pode ser enzimaticamente ligada nas seqüências de genes, de maneira tal que o conjunto degenerado de seqüências de nucleotídeo de polipep- tídeo Actrll potenciais sejam expressos como polipeptídeos individuais ou, alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para exibição de fago).
Existem muitas maneiras pelas quais a biblioteca de homólogos potenciais pode ser produzida a partir de uma seqüência de oligonucleotídeo degenerada. A síntese química de uma seqüência de gene degenerada pode ser realizada em um sintetizador de DNA auto- mático, e os genes sintéticos podem a seguir ser ligados em um vetor apropriado para ex- pressão. A síntese de oligonucleotídeos degenerados é bem conhecida na técnica (ver, por 5 exemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273- 289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic acid Res. 1 1 Ali). Tais técnicas foram empregadas na evolução direcionada de outras proteínas (ver, por exemplo, Scott et al., (1990) Science 10 249:386-390; Roberts et al.,(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; bem como patente U.S. 5.223.409, 5.198.346 e 5.096.815).
Alternativamente, outras formas de mutagênese podem ser utilizadas para produzir uma biblioteca combinatória. Por exemplo, variantes de polipeptídeo Actrll podem ser pro- 15 duzidos e isolados de uma biblioteca triando pelo uso, por exemplo, mutagênese de varre- dura de alanina e similares (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-1 18; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597- 601 ; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; e Cunningham et al., 20 (1989) Science 244:1081-1085), por mutagênese de varredura de Iigante (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); por mutagênese de saturação (Meyers et al., (1986) Science 232:613); por mutagênese por PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1 : 1 1-19); ou por mutagênese aleatória, incluindo mutagênese química, etc. (Miller et al., (1992) A Short 25 Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; e Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). A mutagênese de varredura de ligante, particularmente em um ajuste combinatório, é um método atrativo para identificar formas truncadas (bioativa) de polipeptídeos Actrll.
Uma ampla faixa de técnicas são conhecidas na técnica para triar produtos genéti- 30 cos de bibliotecas combinatórias feitas por mutações pontuais e truncações e, no que diz respeito ao assunto, para triar bibliotecas de DNAc para produtos de gene com uma certa propriedade. Tais técnicas serão em geral adaptáveis para triagem rápida das bibliotecas genéticas produzidas pela mutagênese combinatória de polipeptídeos Actrll. As técnicas mais amplamente usadas para triar grandes bibliotecas genéticas compreendem tipicamente 35 clonar a biblioteca genética em vetores de expressão replicáveis, transformar células apro- priadas com a biblioteca resultante de vetores, e expressar os genes combinatórios em con- dições nas quais a detecção de uma atividade desejada favorece o isolamento relativamente fácil do vetor que codifica o gene cujo produto foi deletado. Ensaios preferidos incluem en- saios de ligação de ativina e ensaios de sinalização celular mediados por ativina.
Em certas modalidades, os polipeptídeos Actrll da invenção podem compreender adicionalmente modificações pós-translacionais além de quaisquer que estejam naturalmen- te presente nos polipeptídeos Actrll. Tais modificações incluem, mas sem limitações, aceti- lação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Em função disso, os poli- peptídeos Actrll modificados podem conter elementos não aminoácidos, tais como polietile- no glicóis, lipídeos, poli- ou mono- sacarídeo e fosfatos. Efeitos de tais elementos não ami- noácidos na funcionalidade de um polipeptídeo Actrll podem ser testados da maneira aqui descrita para outras variantes de polipeptídeo Actrll. Quando um polipeptídeo Actrll é produ- zido nas células clivando uma forma nascente do polipeptídeo Actrll, o processamento pós- translacional também pode ser importante para dobramento e/ou função corretos da proteí- na. Diferentes células (tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 ou HEK293) têm maquinário celular e mecanismos característicos específicos para tais atividades pós- translacionais e podem ser escolhidas para garantir a modificação e processamento corretos dos polipeptídeos Actrll.
Em certos aspectos, variantes funcionais ou formas modificadas dos polipeptídeos Actrll incluem proteínas de fusão com pelo menos uma porção dos polipeptídeos Actrll e um ou mais domínios de fusão. Exemplos bem conhecidos de tais domínios de fusão incluem, 20 mas sem limitações, poli-histidina, Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, pro- teína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Fe), proteí- na de ligação da maltose (MBP) ou albumina sérica humana. Um domínio de fusão pode ser selecionado de maneira a conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, alguns domí- nios de fusão são particularmente usados para isolamento das proteínas de fusão por cro- 25 matografia de afinidade. Com o propósito de purificação da afinidade, matrizes relevantes para cromatografia de afinidade, tais como resinas conjugadas com glutationa, amilase, e níquel ou cobalto são usadas. Muitas das tais matrizes estão disponíveis na forma de "esto- jo", tais como o sistema de purificação de GST da Pharmacia e o sistema QIAexpress™ (Qiagen) usado com sócios de fusão (HIS6). Como um outro exemplo, um domínio de fusão 30 pode ser selecionado de maneira a facilitar a detecção dos polipeptídeos Actrll. Exemplos de tais domínios de detecção incluem as várias proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP) bem como "marcadores de epítopos," que são usualmente seqüências pequenas de peptí- deo seqüências para as quais um anticorpo específico está disponível. Marcadores de epí- topos bem conhecidos, para os quais anticorpos monoclonais específicos estão facilmente 35 disponíveis incluem FLAG, hemaglutinina do vírus influenza (HA), e marcadores c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão têm um sítio de clivagem de protease, tal como para Fator Xa ou Trombina, que permite a protease relevante digerir parcialmente as proteínas de fusão e liberar por meio disto as proteínas recombinantes daí. As proteínas liberadas podem ser isoladas do domínio de fusão por separação cromatográfica subsequente. Em certas modalidade preferidas, um polipeptídeo Actrll é fundido com um domínio que estabiliza o polipeptídeo Actrll in vivo (um domínio “estabilizador”). “Estabilizando" significa qualquer 5 coisa que aumente a meia-vida sérica, independendo se isto é em decorrência da menor destruição, menor desobstrução pelo rim, ou outro efeito farmacocinético. Sabe-se que fu- sões com a porção Fc de uma imunoglobulina conferem propriedades farmacocinéticas de- sejáveis em uma ampla faixa de proteínas. Similarmente, fusões a albumina sérica humana podem conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser 10 selecionados incluem domínios de multimerização (por exemplo, dimerização, tetrameriza- ção) e domínios funcionais (que conferem uma função biológica adicional, tal como estímulo adicional de crescimento muscular).
Como um exemplo específico, a presente invenção fornece uma proteína de fusão compreendendo um domínio extracelular solúvel de ActRIla fundido a um domínio Fc (por exemplo, SEQ ID NO: 6).
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG PFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A) HYTQKSLSLSPGK*
Como um exemplo específico adicional, a presente invenção fornece uma proteína de fusão compreendendo um domínio extracelular solúvel de ActRIlb fundido a um domínio Fc (por exemplo, SEQ ID NO: 21). SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLD DFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais mutações em resíduos tais como Asp-265, Iisina 322 e Asn-434. Em certos casos, o domínio Fc mutante com uma ou mais destas mutações (por exemplo, mutação Asp-265) reduziu a capacidade de se ligar ao re- ceptor Fcy com relação a um domínio Fc tipo selvagem. Em outros casos, o domínio Fc mu- 25 tante com uma ou mais destas mutações (por exemplo, mutação Asn-434) aumentou a ca- pacidade de se ligar ao receptor Fe relacionado a MHC classe I (FcRN) com relação ao do- mínio Fc tipo selvagem.
Entende-se que diferentes elementos das proteínas de fusão podem estar arranja- dos de qualquer maneira que seja consistente com a funcionalidade desejada. Por exemplo, um polipeptídeo Actrll pode ser colocado no terminal C de um domínio heterólogo, ou, alter- nativamente, um domínio heterólogo pode ser colocado no terminal C de um polipeptídeo Actrll. O domínio de polipeptídeo Actrll e o domínio heterólogo não precisam ser adjacentes em uma proteína de fusão, e domínios adicionais ou seqüências de aminoácidos podem 5 estar incluídos nos terminais C ou N tanto no domínio quanto entre os domínios.
Em certas modalidades, os polipeptídeos Actrll da presente invenção contém uma ou mais modificações que são capazes de estabilizar os polipeptídeos Actrll. Por exemplo, tais modificações melhoram a meia-vida in vitro dos polipeptídeos Actrll, melhoram a meia- vida circulatória dos polipeptídeos Actrll ou diminuem a degradação proteolítica dos polipep- 10 tídeos Actrll. Tais modificações de estabilização incluem, mas sem limitações, proteínas de fusão (incluindo, por exemplo, proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo Actrll e um domínio estabilizador), modificações de um sítio de glicosilação (incluindo, por exemplo, adição de um sítio de glicosilação a um polipeptídeo Actrll), e modificações de fração de carboidrato (incluindo, por exemplo, remoção de frações de carboidrato de um polipeptídeo 15 Actrll). Da maneira aqui usada, o termo "domínio estabilizador" não se refere apenas a um domínio de fusão (por exemplo, Fe) como no caso de proteínas de fusão, mas também inclui modificações não proteináceas tal como uma fração de carboidrato, ou fração não proteiná- cea, tal como polietileno glicol.
Em certas modalidades, a presente invenção disponibiliza formas isoladas e/ou pu- rificadas dos polipeptídeos Actrll, que são isoladas ou, de outra forma, substancialmente isentas de outras proteínas. Os polipeptídeos Actrll serão em geral produzidos por expres- são de ácidos nucléicos recombinantes.
3. Ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos ActRII
Em certos aspectos, a invenção diz respeito a ácidos nucléicos isolados e/ou re- combinantes que codificam quaisquer dos polipeptídeos ActRII (por exemplo, polipeptídeos ActRIla solúveis e polipeptídeos ActRIlb solúveis), incluindo fragmentos, variantes e proteí- nas de fusão funcionais aqui revelados. Por exemplo, SEQ ID NO: 4 codifica os polipeptí- deos precursores de ActRIla humano de ocorrência natural, enquanto SEQ ID NO: 5 codifica o domínio extracelular de ActRIla processado. Por exemplo, SEQ ID NO: 18 codifica os poli- peptídeos precursores de ActRIlb humano de ocorrência natural, enquanto SEQ ID NO: 19 codifica o domínio extracelular de ActRIlb processado. Os ácidos nucléicos em questão po- dem ser de fita única ou de fita dupla. Tais ácidos nucléicos podem ser moléculas de DNA ou RNA. Estes ácidos nucléicos podem ser usados, por exemplo, em métodos para preparar polipeptídeos ActRII ou como agentes terapêuticos diretos (por exemplo, na abordagem de terapia genética).
Em certos aspectos, entende-se adicionalmente que os ácidos nucléicos em ques- tão que codificam polipeptídeos ActRIla incluem ácidos nucléicos que são variantes de SEQ ID NO: 4 ou 5. Em certos aspectos, entende-se adicionalmente que os ácidos nucléicos em questão que codificam polipeptídeos ActRIlb incluem ácidos nucléicos que são variantes de SEQ ID NO: 18 ou 19. Seqüências de nucleotídeo variantes incluem seqüências que diferem por uma ou mais substituições de nucleotídeo, adições ou deleções, tais como variantes alélicas.
Em certas modalidades, a invenção diz respeito a seqüências de ácido nucléico iso- ladas ou recombinantes que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idênticas a SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19. Versados na tecnologia perceberão que as seqüências de ácido nucléico complementares para SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19, e as vari- 10 antes de SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19 estão também no escopo desta invenção. Em modali- dades adicionais, as seqüências de ácido nucléico da invenção podem ser isoladas, recom- binante, e/ou fundidas com uma seqüência de nucleotídeo heteróloga, ou em uma biblioteca de DNA.
Em outras modalidades, ácidos nucléicos da invenção também incluem seqüências de nucleotídeo que hibridizam em condições de alto rigor para a seqüência de nucleotídeo designada em SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19, seqüência de complemento de SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19, ou fragmentos destas. Da maneira discutida anteriormente, versados na tecno- logia entenderão facilmente que condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridi- zação do DNA podem ser variadas. Versados na tecnologia entenderão facilmente que as condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridização do DNA podem ser variadas. Por exemplo, poderia ser realizada a hibridização a 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de 45 0C, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50 °C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de um baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC a 50 0C até um alto rigor de cerca de 0,2 x SSC a 50 0C. Além do mais, a tem- peratura na etapa de lavagem pode ser aumentada de baixas condições rigorosas à tempe- ratura ambiente, cerca de 22 0C, para altas condições rigorosas em cerca de 65 0C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou temperatura ou concentração de sal po- dem ser mantidos constantes enquanto a outra variável é mudada. Em uma modalidade, a invenção diz respeito a ácidos nucléicos que hibridizam em baixas condições rigorosas de 6 x SSC à temperatura ambiente seguido por uma lavagem a 2 x SSC à temperatura ambien- te.
Ácidos nucléicos isolados que diferem dos ácidos nucléicos da maneira apresenta- da em SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19 em virtude da degeneração no código genético estão também no escopo da invenção. Por exemplo, inúmeros aminoácidos são projetados por 35 mais que um triplete. Códons que especificam o mesmo aminoácido, ou sinônimos (por e- xemplo, CAU e CAC são sinônimos para histidina) pode resultar em mutações "silenciosa" que não afetam a seqüência de aminoácidos da proteína. Entretanto, espera-se que poli- morfismos de seqüência de DNA que leva a mudanças na seqüência de aminoácidos das proteínas em questão possam existir entre as células de mamífero. Versados na tecnologia perceberão que estas variações em um ou mais nucleotídeos (até cerca de 3-5 % dos nu- cleotídeos) dos nucléicos que codificam uma proteína particular podem existir entre indiví- duos de uma dada espécie em virtude de variação alélica natural. Todas e quaisquer varia- ções de nucleotídeo como essas e polimorfismos de aminoácido resultantes estão no esco- po desta invenção.
Em certas modalidades, os ácidos nucléicos recombinantes da invenção podem ser operacionalmente ligados a uma ou mais seqüências de nucleotídeo regulatórias em uma construção de expressão. Seqüências de nucleotídeo regulatórias serão geralmente apro- priadas para a célula hospedeira usada para expressão. Inúmeros tipos de vetores de ex- pressão apropriados e seqüências regulatórias adequadas são conhecidos na tecnologia por uma variedade de células hospedeiras. Tipicamente, a dita uma ou mais seqüências de nu- cleotídeo regulatórias podem incluir, mas sem limitações, seqüências promotoras, seqüên- cias líder ou de sinal, sítios de ligação ribossômica, seqüências de início e término transcri- cionais, seqüências de início e término translacionais, e seqüências melhoradoras ou ativa- doras. Promotores constitutivos ou indutíveis como conhecido na tecnologia são contempla- dos pela invenção. Os promotores podem ser tanto promotores de ocorrência natural quanto promotores híbridos que combinam elementos de mais que um promotor. Uma construção de expressão pode estar presente em uma célula em um epissoma, tal como um plasmídeo, ou a construção de expressão pode ser inserida em um cromossomo. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável para permitir a sele- ção de células hospedeiras transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são bem conhecidos na tecnologia e variarão com a célula hospedeira usada.
Em certos aspectos da invenção, o ácido nucléico em questão é fornecido em um vetor de expressão compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipep- tídeo ActRII e operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência regulatória. As se- qüências regulatórias são reconhecidas na tecnologia e são selecionadas para direcionar expressão do polipeptídeo ActRII. Consequentemente, o termo seqüência regulatória inclui promotores, melhoradores, e outros elementos de controle de expressão. Seqüências regu- latórias exemplares são desertas em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por exemplo, qualquer de uma ampla variedade de seqüências de controle de expressão que controlam a expressão de um se- qüência de DNA quando operacionalmente ligada a ela pode ser usada nestes vetores para expressar seqüências de DNA que codificam um polipeptídeo ActRII. Tais seqüências de controle de expressão usadas incluem, por exemplo, os promotores precoces e tardios de SV40, promotor tet, promotor precoce imediato de adenovírus ou citomegalovírus, promoto- res de RSV1 o sistema Iac1 o sistema trp, o sistema TAC ou TRC1 promotor de T7 cuja ex- pressão é dirigida por T7 RNA polimerase, as regiões operadora e promotora principais de fago lambda, as regiões de controle para proteína revestida de fd, o promotor para 3- fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de ácido fosfatase, por 5 exemplo, Pho5, os promotores dos fatores de α-conjugação levedura, o promotor poliedro do sistema de baculovírus e outras seqüências conhecidas por controlar a expressão de genes de células procarióticas e eucarióticas ou seus vírus, e várias combinações destes. Deve-se entender que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou o tipo de proteína desejada a ser 10 expressa. Além do mais, o número de cópia do vetor, a capacidade de controlar qual núme- ro de cópia e a expressão de qualquer outra proteína codificada pelo vetor, tal como marca- dores de antibiótico, podem também ser considerados.
Um ácido nucléico recombinante da invenção pode ser produzido ligando o gene clonado, ou uma porção deste, em um vetor adequado para expressão tanto em células 15 procarióticas, células eucarióticas (levedura, ave, inseto ou mamífero), quanto em ambas. Veículos de expressão para produção de um polipeptídeo ActRII recombinante incluem plasmídeos e outros vetores. Por exemplo, vetores adequados incluem plasmídeos dos ti- pos: plasmídeos derivados de pBR322, plasmídeos derivados de pEMBL, plasmídeos deri- vados de pEX, plasmídeos derivados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para ex- 20 pressão em células procarióticas, tal como E. coli.
Alguns vetores de expressão de mamífero contêm tanto seqüências procarióticas par facilitar a propagação do vetor na bactéria, quanto uma ou mais unidades de transcrição eucariótica que são expressas nas células eucarióticas. Os vetores derivados de pcD- NAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, 25 pSVT7, pko-neo e pHyg são exemplos de vetores de expressão de mamífero adequados para transfecção de células eucarióticas. Alguns desses vetores são modificados com se- qüências dos plasmídeos bacterianos, tal como pBR322, para facilitar seleção de replicação e resistência a medicamento tanto em células procarióticas quanto eucarióticas. Alternati- vamente, derivados de vírus tais como o papiloma vírus bovino (BPV-I), ou vírus Epstein- 30 Barr (pHEBo, derivado de pREP e p205) podem ser usados para expressão transiente de proteínas em células eucarióticas. Exemplos de outros sistemas de expressão viral (incluin- do retroviral) podem ser encontrados a seguir na descrição de sistemas de distribuição de terapia genética. Os vários métodos empregados na preparação dos plasmídeos e na trans- formação de organismos hospedeiros são bem conhecidos na tecnologia. Para outros sis- 35 temas de expressão adequados tanto para células procarióticas quanto eucarióticas, bem como procedimentos recombinante em geral, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Em alguns exemplos, pode-se desejar expressar os polipeptídeos recombinantes pelo uso de um sistema de expressão de baculovírus. Exemplos de tais sistemas de expres- são de baculovírus incluem vetores derivados de pVL (tais como pVL1392, pVL1393 e p- VL941), vetores derivados de pAcUW (tal como pAcUWI), e vetores derivados de pBlueBac (tal como o /?-gal contendo pBlueBac III).
Em uma modalidade preferida, um vetor seria projetados para produção dos poli- peptídeos ActRII em questão em células CHO, tal como um vetor Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif), vetores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) e vetores pCI-neo (Promega, Madison, Wise). Conforme ficaria aparente, as construções genéticas em questão podem ser usadas para causar expressão dos polipeptídeos ActRII em questão em células propa- gadas na cultura, por exemplo, para produzir proteínas, incluindo proteínas de fusão ou pro- teínas variantes, para purificação.
Esta revelação também diz respeito a uma célula hospedeira transfectada com um gene recombinante incluindo uma seqüência e codificação (por exemplo, SEQ ID NO: 4, 5, 18, ou 19) para um ou mais dos polipeptídeos ActRII em questão. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polipeptídeo ActRII da in- venção pode ser expresso em células bacterianas tais como E. coli, células de inseto (por exemplo, usando um sistema de expressão de baculovírus), levedura, ou células de mamífe- ro. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas pelos versados na tecnologia.
Consequentemente, a presente invenção diz respeito adicionalmente a métodos de produzir os polipeptídeos ActRII em questão. Por exemplo, uma célula hospedeira transfec- tada com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo ActRIla ou ActRIlb pode ser cultivado em condições apropriadas para permitir que ocorra expressão do polipeptídeo Ac- tRIl. O polipeptídeo ActRII pode ser secretado e isolado de uma mistura de células e meio contendo o polipeptídeo ActRII. Alternativamente, o polipeptídeo ActRII pode ser retido cito- plasmicamente ou em uma fração de membrana e as células colhidas, Iisadas e as proteína isoladas. Uma cultura celular inclui células hospedeiras, meio e outros subprodutos. Os mei- os adequados para cultura celular são bem conhecidos na tecnologia.
Os Polipeptídeos ActRII em questão podem ser isolados a partir do meio de cultura celular, células hospedeiras, ou ambos, usando técnicas conhecidas na tecnologia para puri- ficar proteínas, incluindo cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração de gel, ultafiltração, eletroforese, purificação de imunoafinidade com anticorpos específicos para epítopos particulares dos polipeptídeos ActRII e purificação de afinidade com um agente que liga a um domínio fundido ao polipeptídeo ActRII (por exemplo, uma coluna A de proteína pode ser usada para purificar uma fusão de ActRIIa-Fc ou ActRIIb-Fc). Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo ActRII é um proteína de fusão contendo um domínio que facilita sua purificação. Em uma modalidade preferida, a purificação é obtida por uma série de etapas de cromatografia de coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais das seguintes, em qual- quer ordem: cromatografia A de proteína, cromatografia de sefarose Q, fenilcromatografia de sefarose, cromatografia de exclusão de tamanho, e cromatografia de troca catiônica. A puri- ficação pode ser completa com filtração viral e troca de tampão. Da maneira aqui demons- trada, proteína ActRIla-hFc foi purificada a uma pureza de >98 % da forma determinada por cromatografia de exclusão por tamanho e >95 % da maneira determinada por SDS PAGE. Este nível de pureza foi suficiente para obter resultados desejáveis em camundongos, ratos e primatas não humanos.
Em uma outra modalidade, um gene de fusão que codifica uma seqüência líder de purificação, tal como uma seqüência de sítio de clivagem poli-(His)/enteroquinase no N- terminal da porção desejada do polipeptídeo ActRII recombinante, pode permitir a purifica- ção da proteína de fusão expressa por cromatografia de afinidade usando uma resina metá- lica Ni2+. A seqüência líder de purificação pode então ser subsequentemente removida por tratamento com enteroquinase para fornecer o polipeptídeo ActRII purificado (por exemplo, ver Hochuli et al., (1987) J. Cromatografia 41 1 : 177; e Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).
Técnicas para preparar genes de fusão são bem conhecidas. Essencialmente, a junção de vários fragmentos de DNA que codificam diferentes seqüências de polipeptídeos é realizada de acordo com técnicas convencionais, empregando terminais de ponta romba ou ponta escalonada para ligação, digestão de enzima de restrição para fornecer terminais apropriadas, enchimento de terminais coesivos da maneira apropriada, tratamento de fosfa- tase alcalina para evitar junções indesejáveis, e ligação enzimática. Em uma outra modali- dade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizado- res de DNA automatizados. Alternativamente, amplificação de PCR de fragmentos de gene pode ser realizada usando iniciadores âncora que dão origem a saliências complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem subsequentemente ser anelados para gerar uma seqüência de gene quimérico (ver, por exemplo, Current Protocols in Mole- cular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
4. Antagonistas Alternativos de Ativina e ActRII
Os dados aqui apresentados demonstram que antagonistas de sinalização de ativi- na-ActRIl podem ser usados para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue ou he- moglobina. Embora polipeptídeos ActRIla e ActRIlb solúveis, e particularmente ActRIIa-Fc e ActRIIb-Fc, sejam antagonistas preferidos, e embora tais antagonistas possam afetar os níveis de célula vermelha do sangue através de um mecanismo sem ser antagonismo de ativina (por exemplo, inibição de ativina pode ser um indicador da tendência de um agente para inibir as atividades de um espectro de moléculas, incluindo, talvez, outros membros da superfamília TGF-beta, e tal inibição coletiva pode levar ao efeito desejado em hematopoie- se), espera-se que outros tipos de antagonistas de ativina-ActRIl sejam usados, incluindo anticorpos anti-ativina (por exemplo, ativina βΑ, βΒ, βο e /?e), anticorpos anti-ActRIla, anticor- pos anti-ActRIlb, antissentido, RNAi ou ácidos nucléicos ribozima que inibem a produção de ActRIla e/ou ActRIlb, e outros inibidores de ativina, ActRIlb ou ActRIla, particularmente a- queles que interrompem ligação de ativina-ActRIla e/ou ativina-ActRIlb.
Um anticorpo que é especificamente reativo com um polipeptídeo ActRII (por e- xemplo, um polipeptídeo ActRIla ou ActRIlb solúvel) e que tanto liga competitivamente ao Iigante com o polipeptídeo ActRII quanto de outra forma inibe sinalização mediada por Ae- tRIl pode ser usado como um antagonista de atividades de polipeptídeo ActRII. Similarmen- 10 te, um anticorpo que é especificamente reativo com um polipeptídeo de ativina /?A, /?β· βο ou ou qualquer heterodímero deste, e que interrompe a ligação de ActRIla e/ou ActRIlb po- de ser usado como um antagonista.
Usando imunógenos derivado de um polipeptídeo ActRIla, polipeptídeo ActRIlb ou um polipeptídeo ativina, antissoro anti-proteína/anti-peptídeo ou anticorpos monoclonais podem ser feitos por protocolos padrões (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Um mamífero, tais como um camundongo, um hamster ou coelho pode ser imunizado com uma forma imunogênica do ativina, polipeptídeo ActRIla ou ActRIlb, um fragmento antigênico que é capaz de elicitar uma resposta do anticorpo, ou uma proteína de fusão. Técnicas para conferir imunogenici- dade em uma proteína ou peptídeo incluem conjugação a carreadores ou outras técnicas bem conhecidas na tecnologia. Uma porção imunogênica de um ActRII ou polipeptídeo ati- vina pode ser administrada na presença de adjuvante. O progresso de imunização pode ser monitorado por detecção de tituladores de anticorpo em plasma ou soro. ELISA ou outros imunoensaios padrões podem ser usados com o imunógeno como antígeno para avaliar os níveis de anticorpos.
Após a imunização de um animal com uma preparação antigênica de um ativina, polipeptídeo ActRIla ou ActRIlb, antissoro pode ser obtido e, se desejado, anticorpos poli- clonais podem ser isoladas do soro. Para produzir anticorpos monoclonais, células que pro- duzem anticorpo (linfócitos) podem ser colhidas de um animal imunizado e fundidas por pro- 30 cedimentos de fusão de célula somática padrões com células imortalizantes, tal como célu- las de mieloma para produzir células de hibridoma. Tais técnicas são bem conhecidas na tecnologia, e incluem, por exemplo, a técnica de hibridoma (originalmente desenvolvidas por Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), a técnica de hibridoma célula B humana (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), e a técnica de hibridoma EBV para produzir 35 anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Células de hibridoma podem ser selecionadas imuno- quimicamente para produção de anticorpos especificamente reativos com um ativina, poli- peptídeo ActRIla ou ActRIlb e anticorpos monoclonais isolados de uma cultura compreen- dendo tais células de hibridoma.
O termo "anticorpo" da maneira aqui usada deve incluir anticorpos totais, por exem- plo, de qualquer isotipo (IgG, IgA1 IgM, IgE, etc), e inclui fragmentos ou domínios de imuno- 5 globulinas que são reativos com um antígeno selecionado. Anticorpos podem ser fragmen- tados usando técnicas convencionais e os fragmentos selecionados para utilidade e/ou inte- ração com um epítopo específico de interesse. Assim, o termo inclui segmentos de porções preparadas recombinantemente ou proteoliticamente clivadas de uma molécula do anticorpo que são capazes de reagir seletivamente com uma certa proteína. Exemplos não Iimitantes 10 de tais fragmentos proteolíticos e/ou recombinante incluem Fab, F(ab')2, Fab' , Fv1 e anti- corpos de cadeia única (scFv) contendo um domínio V[L] e/ou V[H] unido por um Iigante peptídeo. Os scFv's podem ser covalentemente ou não covalentemente ligados para formar anticorpos tendo dois ou mais sítios de ligação. O termo anticorpo também inclui policlonal, monoclonal, ou outras preparações purificadas de anticorpos e anticorpos recombinantes. O 15 termo "anticorpo recombinante", significa um anticorpo, ou domínio de ligação de antígeno de uma imunoglobulina, expresso de um ácido nucléico que foi construído usando as técni- cas de biologia molecular, tais como um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano desenvolvidos a partir de um anticorpo de cadeia única. Domínio único e anticorpos de cadeia única estão também incluídos no termo "anticorpo recombinante".
Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é um anticorpo monoclonal e,
em certas modalidades, a invenção produz métodos disponíveis para gerar anticorpos inédi- tos. Por exemplo, um método para gerar um anticorpo monoclonal que liga especificamente a um polipeptídeo ActRIla, polipeptídeo ActRIlb, ou polipeptídeo ativina pode compreender administrar a um camundongo uma quantidade de uma composição imunogênica compre- 25 endendo o polipeptídeo do antígeno efetivo para estimular uma resposta imune detectável, obtendo células que produzem anticorpo (por exemplo, células do baço) do camundongo e fundindo as células que produzem anticorpo com células mieloma para obter hibridomas de produção de anticorpo, e testar os hibridomas de produção de anticorpo para identificar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que liga especificamente ao antígeno. Uma 30 vez obtido, um hibridoma pode ser propagado em uma cultura celular, opcionalmente nas condições de cultura onde as células derivadas de hibridoma produzem o anticorpo mono- clonal que liga especificamente ao antígeno. O anticorpo monoclonal pode ser purificado da cultura celular.
O adjetivo "especificamente reativo com" da maneira usada na referência a um an- ticorpo deve significar, como é geralmente entendido na tecnologia, que o anticorpo é sufici- entemente seletivo entre o antígeno de interesse (por exemplo, um ativina, polipeptídeo Ac- tRIla ou ActRIlb) e outros antígenos que não são de interesse que o anticorpo seja usado, para no mínimo, detectar a presença do antígeno de interesse em um tipo particular de a- mostra biológica. Em certos métodos que empregam o anticorpo, tal como aplicações tera- pêuticas, pode ser desejável um grau mais alto de especificidade na ligação. Anticorpos monoclonais geralmente têm uma maior tendência (comparado aos anticorpos policlonais) 5 de discriminar efetivamente entre os antígenos desejados e polipeptídeos de reação cruza- da. Uma característica que influencia a especificidade de uma interação anticorpo:antígeno é a afinidade do anticorpo com o antígeno. Embora a especificidade desejada possa ser atingida com uma faixa de diferentes afinidades, geralmente anticorpos preferidos terão uma afinidade (uma constante de dissociação) de cerca de 10 6, 10'7, 10'8, 10'9 M ou menos.
Além do mais, as técnicas usadas para selecionar anticorpos a fim de identificar um
anticorpo desejável pode influenciar nas propriedades do anticorpo obtido. Por exemplo, se um anticorpo deve ser usado para ligar um antígeno em solução, pode-se desejar testar a ligação da solução. Uma variedade de diferentes técnicas é disponível para testar interação entre anticorpos e antígenos para identificar anticorpos particularmente desejáveis. Tais téc- 15 nicas incluem ensaios de ligação de ressonância de plasma superficiais ELISAs, (por exem- plo, o ensaio de ligação Biacore™, Biacore AB, Uppsala, Suécia), ensaios sanduíche (por exemplo, o sistema de conta paramagnético de IGEN International, Inc., Gaithersburg1 Mar- yland), western blots, ensaios de imunoprecipitação, e imunoistoquímica.
Exemplos de categorias de compostos de ácido nucléico que são antagonistas ati- vina ou ActRII incluem ácidos nucléicos antissentido, construções RNAi e construções de ácido nucléico catalítico. Um composto do ácido nucléico pode ser de fita única ou dupla. Um composto de fita dupla pode também incluir regiões de saliências ou não complementa- riedade, onde uma ou outra das fitas é fita única. Um composto de fita única pode incluir regiões de auto-complementariedade, significando que o composto forma uma assim cha- mada estrutura "grampo" ou “semicircular”, com uma região de estrutura helicoidal dupla. Um composto do ácido nucléico pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que é complementar com uma região consistindo em não mais que 1.000, não mais que 500, não mais que 250, não mais que 100, ou não mais que 50, 35, 25, 22, 20, 18 ou 15 nucleotídeos da seqüência de ácido nucléico de ActRII de comprimento total ou seqüência de ácido nu- cléico de ativina PA, ββ, βο, ou β€. A região de complementariedade seria preferivelmente pelo menos 8 nucleotídeos, e opcionalmente cerca de 18 a 35 nucleotídeos. Uma região de complementariedade faltaria em um íntron, uma seqüência de codificação ou um seqüência de não codificação do alvo transcrito, tal como a porção da seqüência de codificação. Ge- ralmente, um composto do ácido nucléico teria um comprimento de cerca de 8 a cerca de 500 nucleotídeos ou pares de base em comprimento, e opcionalmente o comprimento seria cerca de 14 a cerca de 50 nucleotídeos. Um ácido nucléico pode ser um DNA (particular- mente para usar como um antissentido), RNA ou RNA:DNA híbrido. Qualquer uma fita pode incluir uma mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não podem facilmen- te ser classificadas tanto como DNA quanto RNA. Similarmente, um composto de fita dupla pode ser DNA:DNA, DNA:RNA ou RNA:RNA, e qualquer uma fita pode também incluir uma mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não podem ser facilmente clas- sificado tanto como DNA quanto RNA. Um composto do ácido nucléico pode incluir qualquer de uma variedade de modificações, incluindo uma modificação ou modificações na espinha dorsal (a porção açúcar-fosfato em um ácido nucléico natural, incluindo ligações internucleo- tídeo) ou a porção base (a porção de purina ou pirimidina de um ácido nucléico natural). Um composto antissentido do ácido nucléico teria preferivelmente um comprimento de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos e conteria frequentemente uma ou mais modificações para melhorar características, tal como estabilidade no soro, em uma célula ou em um local onde o composto deve provavelmente ser distribuído, tais como o estômago no caso de compos- tos oralmente distribuídos e o pulmão pra compostos inalados. No caso de uma construção RNAi, a fita complementar para o alvo transcrito será geralmente RNA ou modificações des- te. A outra fita pode ser RNA, DNA ou qualquer outra variação. A porção duplex de fita dupla ou fita única "grampo" construção RNAi terá geralmente um comprimento de 18 a 40 nucleo- tídeos em comprimento e opcionalmente cerca de 21 a 23 nucleotídeos em comprimento, desde que ela sirva como um substrato Dicer. Ácidos nucléicos catalíticos ou enzimáticos podem ser ribossomas ou enzimas de DNA e podem também conter formas modificadas. Compostos de ácido nucléico podem inibir expressão do alvo por cerca de 50 %, 75 %, 90 % ou mais quando em contato com células em condições fisiológicas e a uma concentração onde um controle não sentido ou sentido tem pouco ou nenhum efeito. Concentrações prefe- ridas para testar o efeito de compostos de ácido nucléico são 1, 5 e 10 micromolar. Compos- tos de ácido nucléico podem também ser testados para efeitos, por exemplo, em níveis de célula vermelha do sangue.
5. Ensaios de Triagem
Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito ao uso de Polipeptídeos Ac- tRIl (por exemplo, polipeptídeos ActRIla ou ActRIlb solúveis) e polipeptídeo ativina para í- dentificar compostos (agentes) que são agonista ou caminho de sinalização dos antagonis- 30 tas de ativina ActRIla e/ou ativina ActRIlb. Compostos identificados através desta seleção podem ser testados para avaliar sua capacidade de modular níveis de célula vermelha do sangue, hemoglobina e/ou reticulócito in vivo ou in vitro. Estes compostos podem ser testa- dos, por exemplo, em modelos animais.
Existem inúmeras abordagens para seleciona agentes terapêuticos para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina alvejando sinalização de ativina e ActRII. Em certas modalidades, seleção de alta produção de compostos pode ser realizada para identificar agentes que perturbam efeitos mediados por ativina ou ActRII em uma linha- gem celular selecionada. Em certas modalidades, o ensaio é realizado para selecionar e identificar os compostos que inibem especificamente ou reduzem a ligação de um polipeptí- deo ActRIla ou ActRIlb em ativina. Alternativamente, o ensaio pode ser usado para identifi- car compostos que melhoram a ligação de um polipeptídeo ActRIla ou ActRIlb em ativina.
Em uma modalidade adicional, os compostos podem ser identificados pela sua capacidade de interagir com um ativina, polipeptídeo ActRIlb, ou polipeptídeo ActRIla.
Uma variedade de formatos de ensaio será suficiente e, sob a Iuz da presente reve- lação, aqueles não expressamente aqui descrito, no entanto, serão compreendido pelos versados na tecnologia. Da maneira aqui descrita, os compostos de teste (agentes) da ín- venção podem ser criados por qualquer método químico combinatorial. Alternativamente, os compostos em questão podem ser de biomoléculas de ocorrência natural sintetizadas in vivo ou in vitro. Compostos (agentes) a ser testados com relação à sua capacidade de agir como moduladores de crescimento do tecido podem ser produzidos, por exemplo, por bactéria, levedura, plantas ou outros organismos (por exemplo, produtos naturais), produzidos quimi- camente (por exemplo, pequenas moléculas, incluindo peptidomiméticas), ou produzidos recombinantemente. Compostos teste contemplados pela presente invenção incluem molé- culas orgânicas não peptidil, peptídeos, polipeptídeos, peptidomiméticos, açúcares, hormô- nios, e moléculas de ácido nucléico. Em uma modalidade específica, o agente teste é uma pequena molécula orgânica tendo um peso molecular de menos que cerca de 2,000 Dal- tons.
Os compostos de teste da invenção podem ser fornecidos como entidades únicas, discretas, ou fornecidos em bibliotecas de maior complexidade, tal como feito por substân- cias químicas combinatoriais. Estas bibliotecas podem compreender, por exemplo, álcoois, haletos de alquila, aminas, amidas, ésteres, aldeídos, éteres e outras classes de compostos 25 orgânicos. A apresentação de compostos teste no sistema teste podem ser tanto em uma forma isoladas quanto como misturas de compostos, especialmente nas etapas de seleção iniciais. Opcionalmente, os compostos podem ser opcionalmente derivatizados com outros compostos e têm grupos de derivatização que facilitam a isolação dos compostos. Exemplos não Iimitantes de grupos de derivatização incluem biotina, fluoresceína, digoxigenina, prote- 30 ína fluorescente verde, isótopos, poliistidina, gotas magnéticas, glutationa S transferase (GST), reticuladores fotoativáveis ou qualquer combinações destes.
Em muitos medicamentos para selecionar programas que testam bibliotecas de compostos e extratos naturais, ensaios de alta produção são desejáveis a fim de maximizar o número de compostos que sobreviveram em um dado período de tempo. Ensaios que são 35 realizados em sistemas sem célula como esses, podem ser derivados com proteínas purifi- cadas ou semipurificadas, são frequentemente preferidos como seleções "primárias" no qual eles podem ser gerados para permitir desenvolvimento rápido e detecção relativamente fácil de uma alteração em um alvo molecular que é mediado por um composto teste. Além do mais, os efeitos de toxicidade celular ou biodisponibilidade do composto teste podem ser geralmente ignorados no sistema in vitro, o ensaio em vez disso sendo focado basicamente no efeito do medicamento no alvo molecular como pode ser manifestado em uma alteração 5 de afinidade de ligação entre um polipeptídeo ActRIla e ativina e/ou entre um polipeptídeo ActRIlb e ativina.
Meramente para ilustra, em um ensaio de seleção exemplar da presente invenção, o composto de interesse é colocado em contato com um polipeptídeo ActRIla isolado e puri- ficado que é ordinariamente capaz de se ligar a ativina. À mistura do composto e polipeptí- 10 deo ActRIla é então adicionada uma composição contendo um agente de ligação ActRIla. A detecção e quantificação de complexos ActRIla/ativina fornece um meio para determinar o eficácia do composto na inibição (ou potencialização) de formação de complexo entre o po- lipeptídeo ActRIla e ativina. A eficácia do composto pode ser avaliada gerando curvas de resposta de dose a partir dos dados obtidos usando várias concentrações do composto tes- 15 te.
Além do mais, um ensaio controle pode também ser realizado para fornecer uma li- nha de base para comparação. Por exemplo, em um ensaio controle, ativina isolada e purifi- cada é adicionada a uma composição contendo o polipeptídeo ActRIla, e a formação do complexo ActRI la/ativina é quantificado na ausência do composto teste. Deve-se entender 20 que, em geral, a ordem na qual os reagentes podem ser misturados pode ser variada, e po- de ser misturado simultaneamente. Além do mais, no lugar de proteínas purificadas, extratos celulares e Iisatos podem ser usados para tornar um sistema de ensaio sem célula adequa- do. Compostos que afetam a sinalização de ActRIlb podem ser identificados de uma manei- ra similar usando um polipeptídeo ActRIlb e um agente de ligação ActRIlb.
Formação do complexo entre o polipeptídeo ActRII e ativina pode ser detectada por
uma variedade de técnicas. Por exemplo, modulação da formação de complexos pode ser quantificada usando, por exemplo, proteínas marcadas detectáveis tais como polipeptídeo ActRIla ou ActRIlb ou ativina radiomarcados (por exemplo, 32P, 35S, 14C ou 3H), marcados fluorescentemente (por exemplo, FITC), ou marcados enzimaticamente, por imunoensaio, ou por detecção cromatográfica.
Em certas modalidades, a presente invenção contempla o uso de ensaios polariza- ção de fluorescência e ensaios na medição de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), tanto direta quanto indiretamente, do grau de interação entre um poli- peptídeo ActRII e sua proteína de ligação. Adicionalmente, outros modos de detecção, tal 35 como aqueles com base em guias de onda óticas (Publicação PCT WO 96/26432 e patente U.S. 5.677.196), ressonância de plasma de superfície (SPR), sensores de carga de superfí- cie, e sensores de forca de superfície, são compatíveis com muitas modalidades da inven- ção.
Além do mais, a presente invenção contempla o uso de uma interação de ensaio trap, também conhecido como o "dois ensaios híbridos", para identificar agentes que inter- rompem ou potencializam a interação entre um polipeptídeo ActRII e sua proteína de Iiga- 5 ção. Ver por exemplo, patente U.S. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 2046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; e Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). Em uma modalidade específica, a presente invenção contempla o uso de sistemas de dois híbridos reverso para identificar compostos (por exemplo, pequenas moléculas ou peptídeos) que dissociam interações entre um poli- 10 peptídeo ActRII e sua proteína de ligação. Ver por exemplo, Vidal e Legrain, (1999) acids nucleics Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; e patentes U.S. 5.525.490, 5.955.280 e 5.965.368.
Em certas modalidades, os compostos em questão são identificados por suar capa- cidade de interagir com um polipeptídeo ActRII ou ativina da invenção. A interação entre o composto e o polipeptídeo ActRIla, ActRIlb, ou ativina pode ser covalente ou não covalente. Por exemplo, tal interação pode ser identificada no nível de proteína usando métodos bio- químicos in vitro, incluindo fotoreticulação, ligação de agente de ligação radiomarcados, e cromatografia de afinidade (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). Em cer- tos casos, os compostos podem ser selecionados em um mecanismo baseado no ensaio, tal como um ensaio para detectar compostos que se ligam a um ativina ou polipeptídeo ActRII. Isto pode incluir um evento de ligação de fase sólida ou fase de fluido. Alternativamente, o gene que codifica um ativina ou polipeptídeo ActRII podem ser transfectado com um sistema reportador (por exemplo, /?-galactosidase, luciferase, ou proteína fluorescente verde) em uma célula e selecionada contra a biblioteca opcionalmente por uma seleção de alta produ- ção ou com membros individuais da biblioteca. Outro mecanismo baseado em ensaios de ligação pode ser usado, por exemplo, ensaios de ligação que detectam mudanças em ener- gia livre. Ensaios de ligação podem ser realizados com o alvo fixado em um poço, gota ou chipe ou capturado por um anticorpo imobilizado ou resolvido por eletroforese capilar. Os compostos ligados podem ser detectados usando normalmente ressonância de plasma colo- rimétrica ou de fluorescência ou de superfície.
6. Usos terapêuticos Exemplares
Em certas modalidades, antagonistas de ativina-ActRIl (por exemplo, polipeptídeos ActRIla ou ActRIlb) da presente invenção podem ser usados para aumentar níveis de célula vermelha do sangue em mamíferos, tal como roedores e primatas, e particularmente pacien- 35 tes humanos. Em certas modalidades, a presente invenção diz respeito a métodos de tratar ou impedir anemia em um indivíduo que necessita destes para administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um antagonista ativina-ActRIla, tal como um poli- peptídeo ActRIla, ou uma quantidade terapeuticamente efetiva de um antagonista ativina- ActRIIb1 tal como um polipeptídeo ActRIlb. Em certas modalidades, a presente invenção diz respeito a métodos de promover a formação de célula vermelha do sangue em um indivíduo administrando ao individual uma quantidade terapeuticamente efetiva de um antagonista 5 ativina-ActRIl, particularmente um polipeptídeo ActRII. Estes métodos podem ser usados para tratamentos terapêuticos e profiláticos de mamíferos, e particularmente humanos.
Da maneira aqui usada, um produto terapêutico que "preveni" um distúrbio ou con- dição refere-se a um composto que, em uma amostra estatística, reduz a ocorrência do dis- túrbio ou condição na amostra tratada a relação a uma amostra controle não tratada, ou a- 10 trasa o início de ação ou reduz o gravidade de um ou mais sintomas do distúrbio ou condi- ção em relação a amostra controle não tratada. O termo "tratar" da maneira aqui usada inclui profilaxia de condição denominada ou atenuação ou eliminação da condição uma vez que ela foi estabelecida. De qualquer maneira, prevenção ou tratamento pode ser discernido no diagnóstico fornecido por um médico ou outro provedor de cuidado com a saúde e o resulta- 15 do visado de administração do agente terapêutico. Da maneira aqui mostrada, antagonistas ativina-ActRIla e antagonistas ativina-ActRIlb podem ser usados para aumentar níveis de célula vermelha do sangue, hemoglobina ou reticulócito em indivíduos saudáveis, e tais an- tagonistas podem ser usados em populações de paciente selecionadas. Exemplos de popu- lações de paciente apropriadas incluem aqueles com baixos níveis de célula vermelha do 20 sangue ou hemoglobina indesejáveis, tais como pacientes tendo uma anemia, e aqueles que correm o risco de desenvolver baixos níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglo- bina indesejáveis, tais como aqueles pacientes que estão próximos de passar por cirurgia principal ou outros procedimentos que podem resultar em perda de sangue substancial. Em uma modalidade, um paciente com níveis adequados de célula vermelha do sangue é trata- 25 do com um antagonista ativina-ActRIla para aumentar os níveis de célula vermelha do san- gue, e então o sangue é retirado e armazenado para uso posterior em transfusões. Em uma modalidade, um paciente com níveis adequados de célula vermelha do sangue é tratado com um antagonista ativina- ActRIlb para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue, e então o sangue é retirado e armazenado para uso posterior em transfusões.
Antagonistas Ativina-ActRIl aqui revelados, e particularmente proteínas ActRIIa-Fc
e ActRIlb, podem ser usados para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue em pacientes tendo uma anemia. Observando ao mesmo tempo os níveis de hemoglobina em humanos, um nível menor que normal para a categoria de idade e sexo apropriada pode ser indicativo de anemia, embora variações de indivíduos sejam levados em conta. Por exem- 35 pio, um nível de hemoglobina de 12 g/dl é geralmente considerado o limite inferior ao normal na população adulta em geral. Causas potencial incluem perda sanguínea, déficits nutricio- nais, reação a medicação, vários problemas com a medula óssea e muitas doenças. Mais particularmente, anemia foi associada com uma variedade de distúrbios que incluem, por exemplo, deficiência renal crônica, síndrome mielodisplástica, artrite reumatóide, transplante de medula óssea. Anemia pode também ser associada com as seguintes condições: tumo- res sólidos (por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer do cólon); tumores do sistema linfático (por exemplo, leucemia linfócita crônica, Iinfomas não de Hodgkins e de Hodgkins); tumores sistema do hematopoiético (por exemplo, síndrome de leucemia, mielo- displástica, mieloma múltiplo); terapia de radiação; quimioterapia (por exemplo regimes con- tendo platina); doenças inflamatórias e autoimunes, incluindo, mas sem limitações, artrite reumatóide, outras artrites inflamatórias, Iupus sistêmico eritematoso (SLE), doenças pele agudas ou crônicas (por exemplo psoríase), doença do intestino inflamatório (por exemplo doença de Crohn's e colite ulcerativa); doença ou insuficiência renal aguda ou crônica inclu- indo condições idiopáticas ou congênitas; doença do fígado aguda ou crônica; hemorragia aguda ou crônica; situações onde a transfusão de célula vermelha do sangue não é possível em virtude de aloanticorpos ou autoanticorpos do paciente e/ou por motivos religiosos (por exemplo alguns JehovahTs Witnesses); infecções (por exemplo malária, osteomielite); he- moglobinopatias, incluindo, por exemplo, doença falciforme, talassemia; medicamento uso ou abuso, por exemplo abuso de álcool; pacientes pediátrico com anemia de qualquer causa para evitar transfusão; e pacientes idosos ou pacientes passando por doença cardiopulmo- nar com anemia que não pode receber transfusões em virtude de preocupações com sobre- carga circulatória.
Os pacientes podem ser tratados com um regime de dosagem visado para restabe- lecer o paciente a um nível alvejado de hemoglobina, normalmente entre cerca de 10 g/dl e cerca de 12,5 g/dl, e tipicamente cerca de 11,0 g/dl (ver também Jacobs et al. (2000) Nep- hrol Dial Transplant 15, 15-19), embora níveis mais baixos alvejados possam causar pouco 25 efeitos colaterais cardiovasculares. Alternativamente, níveis hematócritos (porcentagem do volume de uma amostra sanguínea ocupada pelas células) podem ser usados como uma medida para a condição de células vermelhas do sangue. Níveis de hematócrito para indiví- duos saudáveis variam de 41 a 51 % para machos adultos e de 35 a 45 % para fêmeas a- dultas. Os níveis de hematócrito alvejados são normalmente em torno de 30-33 %. Além do 30 mais, níveis de hemoglobina/hematócrito variam de pessoa para pessoa. Assim, idealmente, o nível hemoglobina/hematócrito visado pode ser individualizado para cada paciente.
O efeito rápido nos níveis de célula vermelha do sangue dos antagonistas ativina- ActRIla aqui revelados indica que estes agentes agem por um mecanismo diferente que Epo. Consequentemente, estes antagonistas podem ser usados para aumentar os níveis 35 célula vermelha do sangue e de hemoglobina em pacientes que não respondem bem ao Epo. Por exemplo, um antagonista ativina-ActRIla pode ser benéfico para um paciente no qual a administração de uma dose normal para maior (>300 lU/kg/semana) de Epo não re- sulta no aumento de nível de hemoglobina até o nível alvejado. Pacientes com uma resposta a Epo inadequada são encontrados para todos os tipos de anemia, mas, números maiores de não respondedores foram observados particularmente de modo freqüente em pacientes com cânceres e pacientes com doença renal em estágio final. Uma resposta inadequada a Epo pode ser tanto constitutiva (isto é, observada no primeiro tratamento com Epo) ou ad- quirida (por exemplo, observada no tratamento repetido com Epo). Os antagonistas de ativi- na-ActRIl podem também ser usados para tratar pacientes que são suscetíveis a efeitos adversos de Epo. Os efeitos adversos primários de Epo são um aumento excessivo nos ní- veis de hematócrito ou de hemoglobina e policitemia. Elevados níveis de hematócrito podem levar a hipertensão (mais particularmente agravamento de hipertensão) e trombose vascu- lar. Outros efeitos adversos de Epo que foram reportados, alguns dos quais relacionados a hipertensão, são dor de cabeça, síndrome similar a influenza, obstrução dos desvio, infartos do miocárdio e convulsões cerebrais em virtude de trombose, encefalopatia hipertensiva, e aplasia de célula vermelha no sangue (Síngibarti, (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36- S43; Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty et al. (1997) Neu- rology 49, 686-689; Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523).
7. Composições farmacêuticas
Em certas modalidades, antagonistas de ativina-ActRIl (por exemplo, polipeptídeos ActRIla e ActRIlb) da presente invenção são formulados com um carreador farmaceutica- mente aceitável. Por exemplo, um polipeptídeo ActRII pode ser administrado sozinho ou como um componente de uma formulação farmacêutica (composição terapêutica). Os com- postos em questão podem ser formulados para administração de qualquer maneira conveni- ente para o uso em remédio humano ou veterinário.
Em certas modalidades, o método terapêutico da invenção inclui administrar a composição sistematicamente, ou localmente como um implante ou dispositivo. Quando administrada a composição terapêutica para uso nesta invenção, é claro, em uma forma isenta de pirogênio fisiologicamente aceitável. Agentes terapeuticamente usados sem ser o antagonistas ativina- ActRII que podem também opcionalmente ser incluídos na composição da maneira descrita anteriormente, podem ser administrados simultaneamente ou seqüenci- almente com os compostos em questão (por exemplo, polipeptídeos ActRIla e ActRIlb) nos métodos da invenção. Tipicamente, antagonistas de ativina-ActRIl seriam administrados parenteralmente.
Composições farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem compreender um ou mais Polipeptídeos ActRII em combinação com um ou mais soluções aquosas ou não aquosas isotônicas estéreis farmaceuticamente aceitáveis, dispersões, suspensões ou emulsões, ou pós estéreis que podem ser reconstituídos em soluções ou dispersões injetáveis estéreis imediatamente antes do uso, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do reci- piente visado ou agentes de suspensão ou de espessamento. Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farma- cêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polieti- Ieno glicol, e similares), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigida no caso de dispersões, e pelo uso de agentes tensoativos.
Adicionalmente, a composição pode ser encapsulada ou injetada em uma forma pa- ra distribuição a um sítio do tecido alvejado (por exemplo, medula óssea). Em certas moda- lidades, as composições da presente invenção podem incluir uma matriz capaz de distribuir um ou mais compostos terapêuticos (por exemplo, polipeptídeos ActRIla ou ActRIlb ) a um sítio do tecido alvejado (por exemplo, medula óssea), fornecendo uma estrutura para o de- senvolvimento do tecido e idealmente capaz de ser reabsorvida no corpo. Por exemplo, a matriz pode fornecer lenta liberação dos polipeptídeos ActRII. Tais matrizes podem ser for- madas de materiais atualmente no uso para outras aplicações médicas implantadas.
A escolha de material da matriz é baseada em biocompatibilidade, biodegradabili- dade, propriedades mecânicas, aparência cosmética e interface propriedades. A aplicação particular das composições em questão definirá a formulação apropriada. As matrizes po- tenciais para as composições podem ser biodegradáveis e sulfato de cálcio quimicamente definido, tricálciofosfato, hidroxiapatite, ácido polilático e polianidretos. Outros materiais po- tenciais são biodegradáveis e biologicamente bem definidos, tal como colágeno ósseo ou dérmico. Matrizes adicionais são compreendidas de componentes de proteínas puras ou matriz extracelular. Outras matrizes potenciais não são biodegradáveis e quimicamente de- finidas, tal como hidroxiapatite sinterizado, biovidro, aluminatos, ou outras cerâmicas. As matrizes podem ser compreendidas de combinações de qualquer dos tipos de material mencionados anteriormente, tal como ácido polilático e hidroxiapatite ou colágeno e tricálcio- fosfato. As biocerâmicas podem ser alteradas na composição, tal como em cálcio-aluminato- fosfato e processadas para alterar o tamanho do poro, tamanho de partícula, forma de partí- cula, e biodegradabilidade.
Em certas modalidades, métodos da invenção podem ser administrados oralmente, por exemplo, na forma de cápsulas, sachês, pílulas, comprimidos, pílulas em forma de lo- sango (usando uma base flavorizada, normalmente sacase e acácia ou tragacanto), pós, grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou água-em-óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (usando uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como enxaguante bucal e similares, cada qual contendo uma quantidade pre- determinada de um agente como um ingrediente ativo. Um agente pode também ser admi- nistrado como um bolo, eletuário ou pasta.
Em formas de dosagem sólidas para administração oral (cápsulas, comprimidos, pí- lulas, drágeas, pós, grânulos, e similares), um ou mais compostos terapêuticos da presente invenção podem ser misturados com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio, e/ou qualquer dos seguintes: (1) cargas ou extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e/ou ácido silícico; (2) gentes aglutinantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivi- nil pirrolidona, sacarose, e/ou acácia; (3) umectantes, tal como glicerol; (4) agentes de de- sintegração, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, batata ou amido de tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio; (5) agentes de retardamento de solução, tal como parafina; (6) acelaradoresde absorção, tal como compostos amônio quaternário; (7) agentes edulcorantes, tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caolim e argila de bentonita; (9) lubrificantes, tais como talco, cálcio estearato, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, sulfato Iauril de sódio, e misturas destes; e (10) agentes de coloração. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas podem também compreender agentes de tamponamento. Composições sólidas de um tipo similar podem também ser empregadas como cargas em cápsulas gelatina cheias macias e duras usando tais excipientes como lactose ou açúcares de leite, bem como polietileno glicóis de alto peso molecular e similares.
Formas de dosagem líquidas para administração oral incluem emulsões, microe- mulsões, soluções, suspensões, xaropes, e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além do ingrediente ativo, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes comumen- te usados na tecnologia, tal como água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsi- ficantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, ál- cool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, de amendoim, de milho, de germe, de oliva, rícino, e sésa- mo), glicerol, álcool tetraidrofurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano, e misturas destes. Além de diluentes inertes, as composições orais também podem incluir adjuvantes, tal como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes adoçantes, flavorizantes, corantes, perfumantes e conservantes.
Suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão, tal como álcoois isostearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol, e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metaidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto, e misturas des- tes.
As composições da invenção podem também conter adjuvantes, tal como conser- vantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes de dispersão. Prevenção da ação de microorganismos pode ser garantida pela inclusão de vários agentes antibacteria- nos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido sórbico fenol, e similares. Pode-se também ser desejável incluir agentes isotônicos, tal como açúcares, cloreto de só- dio, e similares nas composições. Além do mais, absorção prolongada da forma farmacêuti- ca injetável pode ser realizada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção, tal como monoestearato de alumínio e gelatina.
Entende-se que o regime de dosagem seria determinado pelo médico atendente considerando vários fatores que modificam a ação dos compostos em questão da invenção (por exemplo, polipeptídeos ActRIla e ActRIlb). Os vários fatores incluem, mas sem limita- ções, a contagem de célula vermelha do sangue do paciente, nível de hemoglobina ou ou- tras avaliações de diagnóstico, a contagem de célula vermelha do sangue alvejada deseja- da, a idade, sexo, e dieta, do paciente a gravidade de qualquer doença que possa contribuir com um nível de célula vermelha do sangue reduzido, tempo de administração, e outros fatores clínicos. A adição de outros fatores de crescimento conhecidos na composição final pode também afetar a dosagem. O progresso pode ser monitorado pela avaliação periódica de níveis de célula vermelha do sangue e de hemoglobina, bem como avaliação de níveis de reticulócitos e outros indicadores do processo hematopoiético.
Experimentos com primatas e humanos têm demonstrado que efeitos de ActRIIa-Fc nos níveis de célula vermelha do sangue são detectáveis quando o composto é dosado em intervalos e quantidades suficientes para obter as concentrações de soro de cerca de 100 ng/mL ou mais, por um período de pelo menos cerca de 20 a 30 dias. Dosagem para obter níveis de soro de 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1.000 ng/mL ou mais por um período de pelo me- nos 20 a 30 dias pode também ser usada. Efeitos nos ossos podem ser observados nos níveis de soro de cerca de 200 ng/mL, com efeitos substanciais começando em cerca de 1.000 ng/mL ou mais, por um período de pelo menos cerca de 20 a 30 dias. Assim, se for desejável obter efeitos em células vermelha do sangue tendo pouco efeito no osso, um es- quema de dosagem pode ser projetado para distribuir uma concentração de soro entre cerca de 100 e 1.000 ng/mL por um período de cerca de 20 a 30 dias. Em humanos, os níveis de soro de 200 ng/mL podem ser obtidos com uma dose única de 0,1 mg/kg ou mais e níveis de soro de 1.000 ng/mL podem ser obtidos com uma dose única de 0,3 mg/kg ou mais. A meia vida do soro observada da molécula é entre cerca de 20 e 30 dias, substancialmente maior do que a maioria das proteínas de fusão Fe, e assim um nível de soro efetivo susten- tado pode ser obtido, por exemplo, por dosagem com cerca de 0,05 a 0.5 mg/kg em uma base semanal ou bissemanal, ou doses mais altas podem ser usadas com intervalos mais longos entre as dosagens. Por exemplo, doses de 0,1 a 1 mg/kg devem ser usadas em uma base mensal ou bimensal.
Em certas modalidades, a presente invenção também fornece terapia genética para a produção in vivo de polipeptídeo ActRII. Tal terapia alcançaria seu efeito terapêutico por introdução da seqüência de polinucleotídeos ActRIla ou ActRIlb nas células ou tecidos tendo os distúrbios listados anteriormente. A distribuição de seqüência de polinucleotídeos ActRII pode ser obtida usando um vetor de expressão recombinante, tal como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. Preferido para distribuição de seqüência de polinucleo- tídeos ActRII é o uso de Iipossomas alvejadas.
Vários vetores virais que podem ser utilizados para terapia genética, conforme pre- ceituado aqui, incluem adenovírus, herpes vírus, vaccínia, ou um vírus de RNA, tal como um retrovírus. O vetor retroviral pode ser um derivado de um retrovírus de murino ou ave. E- xemplos de vetores retrovirais em que um único gene estranho pode ser inserido incluem, mas sem limitações: vírus de leucemia de murino Moloney (MoMuLV), vírus do sarcoma de murino Harvey (HaMuSV), vírus de tumor mamário de murino (MuMTV), e vírus de sarcoma de Rous (RSV). Inúmeros vetores retrovirais adicionais podem incorporar múltiplos genes. Todos estes vetores podem transferir ou incorporar um gene para um marcador selecioná- vel, de maneira tal que células tranduzidas podem ser identificadas e geradas. Vetores re- trovirais podem ser preparados específicos para o alvo anexando, por exemplo, um açúcar, um glicolipídeo, ou uma proteína. O alvejamento preferido é realizado usando um anticorpo. Versados na tecnologia perceberão que seqüência de polinucleotídeos específicas podem ser inseridas no genoma retroviral ou anexadas a um envelope viral para permitir distribui- ção específica ao alvo do vetor retroviral contendo o polinucleotídeo ActRII.
Alternativamente, células celulares de tecido podem ser diretamente transfectadas com plasmídeos que codificam os genes estruturais retrovirais gag, pol e env, por transfec- ção com fosfato de cálcio convencional. Estas células são então transfectadas com o plas- mídeo do vetor contendo os genes de interesse. As células resultantes liberam o vetor retro- viral no meio de cultura. Um outro sistema de distribuição alvejado para polinucleotídeos ActRII é um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidais incluem comple- xos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, gotas, e sistemas a base de lipídeo incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas misturadas e lipossomas. O sistema coloidal preferido desta invenção é um lipossoma. Lipossomas são vesículas de membrana artificial que são usadas como veículos de distribuição in vitro e in vivo. RNA, DNA e vírions intactos podem ser encapsulados no interior aquoso e ser distribuídos às células em uma forma biologicamente ativa (ver, por exemplo, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Métodos para transfectar gene eficientes usando um veículo de lipossoma são co- nhecidos na tecnologia, ver por exemplo, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. A composição do lipossoma é normalmente uma combinação de fosfolipídeos, normalmente em combinação com esteróides, especialmente colesterol. Outros fosfolipídeos ou outros lipídeos também podem ser usados. As características físicas de lipossomas dependem do pH, intensidade iônica e da presença de cátions divalentes.
Exemplos de lipídeos usado em produção de lipossoma incluem compostos de fos- fatidil, tal como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfig- nolipídeos, cerebrosódeos e gangliosídeos. Fosfolipídeos ilustrativos incluem fosfatidilcolina 5 de ovo, dipalmitoilfosfatidilcolina e distearoilfosfatidilcolina. O alvejamento de lipossomas também é possível com base, por exemplo, na especificidade so órgão, especificidade da célula, e especificidade da organela e é conhecido na tecnologia.
Exemplos
A invenção, sendo agora descrita no geral, será mais prontamente entendida pela referência aos seguintes exemplos, que são incluídos meramente com propósitos de ilustra- ção de certas modalidades e modalidades da presente invenção, e não pretende-se que limitem a invenção.
Exemplo 1 : Proteínas de Fusão ActRIIa-Fc
Os requerentes construíram uma proteína de fusão ActRIla solúvel que tem o do- mínio extracelular de ActRIla humano fundido em um domínio Fc humano ou de camundon- go, com um mínimo Iigante entre eles. As construções são referidas como ActRIla-hFc e ActRIla-mFc, respectivamente.
ActRIla-hFc é mostrada a seguir da forma purificada a partir de linhagens celulares de CHO (SEQ ID NO: 7):
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTG-
VEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG NMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGF 25 YPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCS VMHEAL HNHYTOKSLSLSPGK
As proteínas ActRIla-hFc e ActRIla-mFc foram expressadas em linhagens celulares de CHO. Três diferentes seqüências líderes foram consideradas:
(i) Melitina de abelha de mel (HBML): MKFLVNVALVFMWYISYIYA (SEQ ID NO: 8) (ii) Ativador de Tecido plasminogênico (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGA VFVSP
(SEQ ID NO: 9)
(iii) Nativa: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 10).
A forma selecionada emprega o líder de TPA e tem a seguinte seqüência não pro- cessada de aminoácido:
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAI-
LGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLD
DINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13)
Este polipeptídeo é codificado pela seguinte seqüência de ácido nucléico:
ATG G ATG CAAT G AAG AG AGG G CTCTG- CTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGT AGAT CAGAAACT CAGG AGT GT CTTTTTTT AATGCT AATTGGGAAAAAGACAGAACCAAT C AAACT G GTGTT G AACCGT GTTATG GT G AC AAAG ATAAACG GCGG CATT GTTTT G CTACC 10 T G GAAGAAT ATTT CTG GTT CCATT GAAT AGT G AAACAAG GTT GTTG G CTG G ATG ATATC A ACT G CT AT G ACAGG ACT GATT GT GT AG AAAAAAAAGACAG CCCT GAAGT AT ATTT CT GTT GCTGTGAGGG CAATATGTGT AAT G AAAAGTTTT CTTATTTT CCGGAG ATG GAAGT CACAC AG CCCACTT CAAAT CCAGTT ACACCT AAGCCACCCACCGGTGGT GGAACT CACACATGC CCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAA 15 AACCCAAGGACACCCT CAT GAT CT CCCGGACCCCT GAGGT CACAT GCGTGGTGGT GGA CGT G AG CCACG AAG ACCCT GAG GT CAAGTT CAACTGGT ACGTGG ACG G CGT GGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGT CCT CACCGT CCT GCACCAGGACT GGCT GAATG G CAAG G AGTAC AAGT GCAAGG T CT CCAACAAAGCCCTCCCAGT CCCCAT CGAGAAAACCAT CT CCAAAGCCAAAGGGCAG 20 CCCCG AG AACCACAGGT GT ACACCCT GCCCCCAT CCCGGGAGGAGAT GACCAAGAACC AGGT CAG CCT G ACCTGCCTGGT CAAAG G CTT CTAT CCCAG-
CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC G CCT CCCGT GCTGG ACT CCG ACGGCT CCTT CTTCCT CT AT AG CAAGCT CACCGTGG AC AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGC ACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (SEQ ID NO: 14)
Tanto ActRIla-hFc quanto ActRIla-mFc foram consideravelmente receptivas à ex- pressão recombinante. Da forma mostrada na figura 1, a proteína foi purificada como um único pico de proteína bem definido. Sequenciamento N-terminal revelou uma única se- 30 quência de -ILGRSTQE (SEQ ID NO: 11). A purificação pode ser alcançada por uma série de etapas da cromatografia de coluna, incluindo, for exemplo, três ou mais das seguintes, em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, cromatografia em sefarose Q, cromatogra- fia em fenilsefarose, cromatografia por exclusão de tamanhos e cromatografia de troca cati- ônica. A purificação pode ser completada com filtração viral e troca de tampão. A proteína 35 ActRIla-hFc foi purificada até uma pureza > 98 %, da forma determinada pela cromatografia por exclusão de tamanhos e > 95 %, da forma determinada por SDS PAGE.
ActRIla-hFc e ActRIla-mFc mostraram uma alta afinidade em relação aos elemen- tos de ligação, particularmente, activina A. GDF-11 ou Activina A ("ActA") foram imobilizados em um chip Biacore CM5 usando procedimento de acoplamento de amina padrão. Proteínas ActRIla-hFc e ActRIla-mFc foram carregadas sobre o sistema, e a aglutinação foi medida. ActRIla-hFc aglutinou em activina com uma constante de dissociação (K0) de 5 x 10121 e a proteína aglutinou em GDF11 com uma K0 de 9,96 x 10~9. Veja figura 2. ActRIla-mFc se comportou de forma similar. A ActRIla-hFc foi muito estável em estudos farmacocinéticos. Ratos foram dosados com 1 mg / kg, 3 mg / kg ou 10 mg / kg da proteína ActRIla-hFc, e níveis de plasma da proteína foram medidos em 24, 48, 72, 144 e 168 horas. Em um estudo separado, ratos foram dosados com 1 mg / kg, 10 mg / kg ou 30 mg / kg. Em ratos, ActRIla- hFc teve uma meia-vida sérica de 11 -14 dias, e níveis de circulação do medicamento foram bastante altos depois de duas semanas (11 /yg / ml_, 110 pg / mL ou 304 μg / mL para admi- nistrações iniciais de 1 mg / kg, 10 mg / kg ou 30 mg / kg, respectivamente.) Em macacos cinomolgo, a meia-vida plasmática foi substancialmente maior que 14 dias, e níveis de circu- lação do medicamento foram 25 μg / mL, 304 μg / mL ou 1.440 μg / mL para administrações iniciais de 1 mg / kg, 10 mg / kg ou 30 mg / kg, respectivamente.
Exemplo 2: ActRIla-hFc Aumenta Níveis de Célula Vermelha do Sangue em Prima- tas Não Humanos
O estudo empregou quatro grupos de cinco machos e cinco fêmeas de macacos ci- nomolgo cada, com três por sexo por grupo agendados para término no dia 29, e dois por sexo por grupo agendados para término no dia 57. Em cada animal foi administrado o veícu- lo (Grupo I) ou ActRIIa-Fc em doses de 1, 10, ou 30 mg / kg (Grupos 2, 3 e 4, respectiva- mente) por meio de injeção intravenosa (IV) nos dias 1, 8, 15 e 22. O volume da dose foi mantido em 3 mL / kg. Várias medições dos níveis de célula vermelha do sangue foram ava- liadas dois dias antes da primeira administração e nos dias 15, 29 e 57 (para os dois ani- mais restantes) depois da primeira administração.
A ActRIla-hFc ocasiona aumentos estatisticamente significativos em parâmetros médios de célula vermelha do sangue (contagem de célula vermelha do sangue [RBC], he- moglobina [HGB] e hematócrito [HCT]) para machos e fêmeas, em todos os níveis de dose e pontos no tempo por todo o estudo, com elevações associadas nas contagens de reticulóci- to absoluta e relativa (ARTC; RTC). Veja figuras 3-6.
A significância estatística foi calculada para cada grupo de tratamento em relação à média para o grupo de tratamento no valor de referência.
Notavelmente, os aumentos nas contagens de célula vermelha do sangue e nos ní- veis de hemoglobina são grosseiramente equivalentes, em magnitude, aos efeitos relatados com eritropoietina. O início destes efeitos é mais rápido com ActRIIa-Fc do que com eritro- poietina. Resultados similares foram observados com ratos e camundongos.
Exemplo 3: ActRIla-hFc Aumenta Níveis de Célula Vermelha do Sangue em Paci- entes Humanos A proteína de fusão ActRIla-hFc descrita no Exemplo 1 foi administrada em pacien- tes humanos em um estudo aleatorizado, duplo cego, controlado em relação ao placebo, que foi conduzido para avaliar, primariamente, a segurança da proteína em mulheres sau- dáveis pós-menopausais. Quarenta e oito sujeitos foram aleatorizados em coortes de 6 para receber tanto uma única dose de ActRIla-hFc quanto placebo (5 ativos: 1 placebo). Os ní- veis de dose variaram de 0,01 até 3,0 mg / kg intravenosamente (IV) e de 0,03 até 0,1 mg / kg subcutaneamente (SC). Todos os sujeitos foram seguidos por 120 dias. Além da análise farmacocinética (PK), a atividade biológica de ActRIla-hFc também foi avaliada pela medi- ção de marcadores bioquímicos de formação e reabsorção óssea, e de níveis de FSH.
Para procurar mudanças em potencial, números de hemoglobina e RBC foram e- xaminados com detalhes para todos os sujeitos durante o curso do estudo, e comparados com os níveis de valor de referência. Contagens de plaqueta foram comparadas durante o mesmo tempo, como o controle. Não houve mudanças clinicamente significativas dos valo- res de referência durante o tempo para as contagens de plaqueta.
Análise de PK da ActRIla-hFc exibiu um perfil linear com dose, e a meia-vida média de aproximadamente 25 - 32 dias. A área debaixo da curva (AUC) para ActRIla-hFc foi line- armente relacionada à dose, e a absorção depois da dosagem SC foi essencialmente com- pleta (veja figuras 7 e 8). Estes dados indicam que SC é uma abordagem desejável para dosagem em virtude de ela fornecer equivalente biodisponibilidade e meia-vida sérica ao medicamento, ainda evitando o aumento em concentrações séricas de medicamento asso- ciadas com os primeiros poucos dias de dosagem IV (veja figura 8). ActRIla-hFc ocasionou um rápido e sustentado aumento dependente de dose nos níveis séricos de fosfatase alcali- na específica óssea (BAP), que é um marcador para crescimento ósseo anabólico, e uma diminuição dependente de dose em telopeptídeo colágeno tipo 1 C-terminal e nos níveis de ácido fosfatase 5b resistente ao tartrato, que são marcadores para reabsorção óssea. Ou- tros marcadores, tal como P1NP, mostraram resultados inconclusivos. Níveis de BAP mos- traram efeitos quase saturantes na dosagem de medicamento mais alta, indicando que efei- tos meio-máximo neste biomarcador ósseo anabólico podem ser alcançados em uma dosa- gem de 0,3 mg / kg, com aumentos que variam até 3 mg / kg. Calculado como um relacio- namento de efeito farmacodinâmico na AUC para o medicamento, o EC50 é 51,465 (dia * ng / mL). Veja figura 9. Estas mudanças no biomarcador ósseo foram sustentadas por aproxi- madamente 120 dias nos níveis mais altos da dose testada. Também houve uma diminuição dependente de dose nos níveis de FSH sérico consistente com a inibição de activina.
No total, houve uma redução muito pequena não relacionada a medicamento na hemoglobina durante a primeira semana do estudo, provavelmente, relacionada à flebotomia do estudo nos grupos de 0,01 e 0,03 mg / kg, sejam dados IV ou SC. Os resultados de he- moglobina SC e IV de 0,1 mg / kg foram estáveis ou mostraram modestos aumentos pelo dia 8 - 15. No nível de dose IV de 0,3 mg / kg houve um claro aumento nos níveis de HGB vistos, já no dia 2 e, frequentemente, com pico nos dias 15-29, que não foi visto nos sujei- tos com placebo. Neste ponto do estudo, esta mudança não alcançou significância estatísti- ca.
No total, ActRIla-hFc mostrou um efeito dependente de dose em contagens de célu- la vermelha do sangue e contagens de reticulócito. Para um resumo das mudanças hemato- lógicas, veja figuras 10-13.
Exemplo 4: Proteínas ActRIIa-Fc Alternativas Uma variedade de variantes de ActRIIa1 que pode ser usada de acordo com os mé-
todos aqui descritos, é descrita no Pedido de Patente Internacional, publicado como W02006/012627 (veja, por exemplo, pp. 55 - 58), aqui incorporado pela referência em sua íntegra. Uma construção alternativa pode ter uma deleção da cauda do C-terminal (os 15 aminoácidos finais) do domínio extracelular de ActRIIa. A seqüência para uma construção como esta é apresentada a seguir (parte Fc sublinhada) (SEQ ID NO: 12):
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTG- VEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG NMCNEKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSN 20 KALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
Exemplo 5: Proteínas de Fusão ActRIIb-Fc
Os requerentes construíram uma proteína de fusão ActRIIb solúvel que tem o do- mínio extracelular de ActRIIb humano fundido em um domínio Fc humano. Uma estrutura de 25 co-cristal de Activina e ActRIIb extracelular não mostrou nenhum papel para os 15 aminoá- cidos finais (C-terminal) (aqui referido como a "cauda") do domínio extracelular na aglutina- ção do elemento de ligação. Esta seqüência deixou de resolver na estrutura de cristal, suge- rindo que estes resíduos estão presentes em um laço flexível que não embala uniformemen- te no cristal. Thompson et al. EMBO J. 2003 Apr 1; 22(7): 1555-66. Esta seqüência também 30 é fracamente conservada entre ActRIIb e ActRIIa. Dessa maneira, estes resíduos foram omi- tidos na construção de fusão ActRIIb-Fc básica ou fundamental. Adicionalmente, a posição 64 na forma fundamental é ocupada por uma alanina que, no geral, é considerada a forma "tipo selvagem", embora um alelo A64R ocorra naturalmente. Assim, a fusão ActRIIb-Fc fun- damental tem a seqüência (parte Fc sublinhada) (SEQ ID NO: 20):
SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQS-
GLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDROECVATEENPOVYFCC
CEGNFCNERFTHLPEAGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKV SNKALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
OPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSP
GK
Surpreendentemente, descobriu-se que a cauda do C-terminal melhora activina e a aglutinação de GDF-11, assim, uma versão preferida de ActRIIb-Fc tem uma seqüência (parte Fc sublinhada) (SEQ ID NO: 21):
SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQS-
GLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCC
CEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD
TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLH
ODWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKG
FYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEA
LHNHYTOKSLSLSPGK
Uma variedade das variantes de ActRIIb a que pode ser usada de acordo com os métodos aqui descritos é descrita no Pedido de Patente Internacional, publicado como W02006/012627 (veja, por exemplo, pp. 59 - 60), aqui incorporado pela referência na sua íntegra.
Exemplo 6: ActRIlb-hFc Estimula Eritropoiese em Primatas Não Humanos
ActRIlb-hFc (IgGI) foi administrada uma vez por semana por 1 mês em macacos cinomolgo macho e fêmea por injeção subcutânea. Quarenta e oito macacos cinomolgo (24 / sexo) foram atribuídos a um dos quatro grupos de tratamento (6 animais / sexo / grupo) e foram administradas injeções subcutâneas de veículo ou de ActRIlb-hFc em 3, 10, ou 30 mg / kg uma vez por semana por 4 semanas (total de 5 doses). Parâmetros avaliados incluíram patologia clínica geral (hematologia, química clínica, coagulação, e urinálise). ActRIlb-hFc ocasionou significativos valores médios absolutos estatisticamente elevados de reticulócito pelo dia 15 em animais tratados. Pelo dia 36, ActRIlb-hFc ocasionou diversas mudanças hematológicas, incluindo elevados valores médios absolutos de amplitude de distribuição de reticulócito e de célula vermelha do sangue e concentração de hemoglobina corpuscular média mais baixa. Todos os grupos tratados e ambos os sexos foram afetados.
Estes efeitos são consistentes com um efeito positivo de ActRIlb-hFc na liberação de reticulócitos imaturos da medula óssea. Este efeito foi invertido depois que medicamento foi eliminado por lavagem dos animais tratados (pelo dia de estudo 56). Dessa maneira, conclui-se que ActRIlb-hFc estimula a eritropoiese.
Incorporação pela Referência
Todas as publicações e patentes aqui mencionadas são por meio dessa incorpora- das pela referência em suas íntegras, como se cada publicação ou patente individuais fosse indicada, de forma específica e individual, como incorporada pela referência.
Embora modalidades específicas do assunto em questão tenham sido discutidas, a especificação exposta é ilustrativa, e não restritiva. Muitas variações ficarão aparentes aos versados na técnica mediante revisão desta especificação e das seguintes reivindicações. O 5 completo escopo da invenção deve ser determinado pela referência às reivindicações, jun- tamente com seu completo escopo de equivalentes, e à especificação, juntamente com tais variações.

Claims (22)

1. Método para aumentar níveis de célula vermelha do sangue em um paciente hu- mano, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende administrar, em um paci- ente humano com necessidade deste, uma quantidade efetiva de um polipeptídeo ActRII selecionado do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 2; b) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 3; e c) um polipeptídeo que compreende pelo menos 50 aminoácidos consecutivos se- lecionados da SEQ ID NO: 2; d) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 16; e) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 17; e f) um polipeptídeo que compreende pelo menos 50 aminoácidos consecutivos sele- cionados da SEQ ID NO: 16.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo tem uma ou mais das seguintes características: í) aglutina em um elemento de ligação de ActRII com uma K0 de pelo menos 10'7 M; e ii) inibe sinalização de ActRII em uma célula.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo é uma proteína de fusão que inclui, além de um domínio de polipeptídeo de ActRII1 uma ou mais partes de polipeptídeo que melhoram um ou mais de estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção / administração, localização ou distribuição de tecido, for- mação de complexos protéicos e/ou purificação.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita proteína de fusão inclui uma parte de polipeptídeo selecionada do grupo que consiste em: um domínio Fc de imunoglobulina e uma albumina sérica.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo inclui um ou mais resíduos de aminoácido modificados selecionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um ami- noácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fração de lipídio e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânico.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o aumento nos níveis de célula vermelha do sangue é medido como um aumento nos níveis de hemoglobina no sangue.
7. Método para tratar uma anemia, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende administrar, em um sujeito com necessidade deste, uma quantidade efetiva de um antagonista de activina-ActRIl.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de activina-ActRIl é um polipeptídeo antagonista de activina ou de ActRII.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo antagonista de activina-ActRIl é selecionado do grupo que consiste em: a)um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 2; b) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 3; e c) um polipeptídeo que compreende pelo menos 50 aminoácidos consecutivos se- lecionados da SEQ ID NO: 2; d) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 16; e) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 17; e f) um polipeptídeo que compreende pelo menos 50 aminoácidos consecutivos sele- cionados da SEQ ID NO: 16.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo antagonista de activina-ActRIl tem um ou mais das seguintes características: i) aglutina em um elemento de ligação de ActRII com uma K0 de pelo menos 10‘7 M; e ii) inibe sinalização de ActRII em uma célula.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo antagonista de activina-ActRIl é uma proteína de fusão que inclui, além do dito polipeptídeo antagonista de activina-ActRIl, uma ou mais partes de polipeptídeo que melhoram um ou mais de estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção / administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos protéicos e/ou purificação.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita proteína de fusão inclui uma parte de polipeptídeo selecionada do grupo que consiste em: um domínio Fc de imunoglobulina e uma albumina sérica.
13. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo antagonista de activina ou de ActRII inclui um ou mais resíduos de ami- noácido modificados selecionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuiIa- do, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fração de lipídio e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânico.
14. Método de identificação de um agente que aumenta os níveis de célula verme- lha do sangue, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: a) identificar um agente de teste que aglutina em um domínio de elemento de Iiga- ção-aglutinação de um polipeptídeo ActRII competitivamente com um elemento de ligação de ActRI I; e b) avaliar o efeito do agente nos níveis da célula vermelha do sangue em um ani- mal.
15. Uso de um polipeptídeo antagonista de activina ou de ActRII, CARACTERIZADO pelo fato de que é para fazer um medicamento para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue em um paciente humano.
16. Método para aumentar os níveis da célula vermelha do sangue em um paciente humano, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende administrar no pacien- te uma quantidade efetiva de uma proteína de fusão ActRII-Fc, em que a proteína de fusão ActRII-Fc compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: a) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 90 % idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; b) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95 % idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; c) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; d) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7; f) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 90 % idêntica à seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; g) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95 % idêntica à seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; h) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; i) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; j) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e k) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o método ocasiona menos que 15 % de aumento na massa muscular esquelética do pacien- te.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRII-Fc é administrada para alcançar uma concentração sérica no paciente de pelo menos 100 ng / mL por um período de cerca de 20 a 30 dias.
19. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRII-Fc é administrada para alcançar uma concentração sérica no paciente na faixa de 100 ng / mL até 1.000 ng / mL.
20. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRII-Fc tem uma meia-vida sérica na faixa de 15 a 30 dias.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRII-Fc é administrada no paciente não mais frequentemente do que uma vez por semana.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRII-Fc é administrada no paciente não mais frequentemente do que uma vez por mês.
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