BRPI0714545A2 - neurotrofinas modificadas pàs-traducionalmente - Google Patents

Abstract

PATENTE DE INVENÇçO PARA NEUROTROFINAS MODIFICADAS PàS-TRADUCIONALMENTE. A presente invenção descreve que as neurotrofinas passam por modificações pós-traducionais, e que essas modificações pós-traducionais medeiam a atividade pró-apoptótica e/ou pró-neurítica das neurotrofinas. Essasmodificações pós-traducionais particularmente incluem a nitração e a formação de dímeros de conformações dímeros de conformaçõe diferentes, assim como de oligômeros anormais, tais como terâmenros tetrâmeros e octâmeros. A invenção também se refere a compsotos que competem com tais neurotrofinas modificadas, bem como compostos que se ligam às referidas neurotrofinas modificadas. Sendo assim, a invenção oferece agentes úteis para o tratamento das condições ou doenças que envolvem dor crônica e/ou perda neuronal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "NEUROTROFINAS MODIFICADAS PÓS- TRADUCIONALMENTE".

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se ao campo de neurotrofinas, e mais particularmente, a neurotrofinas modificadas pós- traducionalmente, bem como às aplicações biológicas, biotecnológicas, médicas, clínicas, terapêuticas e diagnosticas destas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO As neurotrofinas, mais especificamente, o Fator de Crescimento Nervoso (NGF), são vitais para a diferenciação e sobrevivência de populações neuronais específicas durante o desenvolvimento, e modulam a plasticidade neural no sistema nervoso maduro [1, 2]. Paradoxalmente, o NGF também é descrito como indutor da apoptose dos neurônios durante o desenvolvimento, e elimina neurônios danificados e células gliais em condições patológicas [3, 4]. O NGF vem sendo descrito como um mediador da inflamação tecidual e da dor crônica [5], que se acumula em várias patologias que experimentam neuroinflamação [6-8].

O NGF exerce suas ações por meio de dois receptores transmembrana não relacionados, o receptor tirosina quinase TrkA5 e o receptor neurotrofina p75 (p751N,K). O TrkA e um receptor tirosina quinase que ativa vias de sinalização bem caracterizadas, promovendo a sobrevivência neuronal, a diferenciação e a plasticidade [2, 9, 10], ao passo que p75NTR é um membro da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral que pode agir como um receptor de morte celular sinalizando a apoptose [4, 11]. Além disso, o p75NTR também pode agir como um co-receptor para Trk A, B e C, ou interagir com outros receptores (sortilina, Nogo-R) para modular diversos efeitos biológicos, incluindo sobrevivência, reestruturação citoesquelética e alongamento axonal [4, 12]. Sendo assim, as neurotrofinas nativas, como o NGF, vêm sendo descritas como capazes de induzir a apoptose dependente do p75NTR.

O p75NTR é fortemente expresso em neurônios motores no estágio embriônico, mas seus níveis de expressão cessam gradativamente após o nascimento [13]. Nenhum dentre TrkA e p75NTR é expresso pelos neurônios motores adultos, ainda que o p75NTR possa ser expresso novamente após a axotomia [14- 16] e em condições patológicas que envolvem a degeneração do neurônio motor, tal como a esclerose lateral amiotrófica (ALS) [17, 18]. Além disso, o p75NTR está envolvido na morte dos neurônios motores induzida por axotomia [14, 19, 20]. A expressão anormal de p75NTR e de NGF pode contribuir para a morte dos neurônios motores adultos observada em camundongos transgênicos ALS superexpressando a superóxido dismutase Cu- Zn mutante (SOD-I) [18, 21-25]. Mais recentemente, surgiram as pró-

neurotrofinas como potenciais indutores da apoptose dependente da ptrNTR- pela sinalização através de um complexo formado pelo p75NTR e pela sortilina [14, 15].

Por exemplo, a WO 2005/014039 expressa e segue essa hipótese "pro-neurotrofina", sem considerar a possibilidade de qualquer modificação pós-traducional da neurotrofina madura: consulte, por exemplo, a página 46, linhas 24-28 do pedido PCT conforme publicado, que afirma <r visto que os NGFs maduros endógenos foram encontrados apenas em concentrações baixísssimas nos extratos teciduais e quase fracassaram em atender ao limite de detecção em meios de cultura, os precursores do BGF (19-21, 28 e 32 kDa) são os mediadores mais prováveis da apoptose para neurônios motores expressando p75NTR ». Sendo assim, antes da invenção, a principal hipótese era de que a pro-neurotrofina, tal como o pró-NGF, era o fator endógeno que levava à apoptose neuronal.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Os inventores identificaram, isolaram e purificaram uma nova espécie de fator de crescimento que media a inflamação, a dor crônica e a neuropatologia. Os inventores verificaram que, durante tais condições ou doenças, as neurotrofínas, como o NGF, reagem com espécies nitrantes endógenas, como o peroxinitrito, levando à nitração dessas neurotrofínas, e mais particularmente, à formação de resíduos nitrados de tirosina e/ou triptofano nas referidas neurotrofínas, e que tal modificação nitrativa da molécula de neurotrofina induz mudanças conformacionais significativas no dímero nativo, que, por sua vez, promove a formação de oligômeros anormais de alto peso molecular (como tetrâmeros e/ou octâmeros) comparáveis àqueles encontrados em tecidos em degeneração. Assim, os inventores identificaram, isolaram e purificaram neurotrofinas modificadas, que possuem uma conformação, estrutura e atividades biológicas visivelmente diferentes das neurotrofinas não modificadas nativas.

Sendo assim, os inventores constataram que tal neurotrofina modificada é um agente-chave como mediador inflamatório, e pode desempenhar importante papel na indução da dor crônica e na morte neuronal na neuropatologia.

Logo, a invenção refere-se a tais neurotrofinas modificadas, e mais particularmente, a neurotrofinas nitradas. A invenção refere-se também a aglutinantes, que são compostos ou composições capazes de ligar-se a tais neurotrofinas modificadas, e mais particularmente, a aglutinantes específicos, capazes de ligar-se a pelo menos uma de tais neurotrofinas modificadas, sem que ocorra reação cruzada com a(s) neurotrofina(s) nativa(s) não modificada(s).

A invenção também se refere às aplicações biológicas, biotecnológicas, médicas, clínicas, terapêuticas e diagnosticas de tais neurotrofinas modificadas, e de tais aglutinantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. Diagrama de fitas da estrutura do NGF (PDB código 1BET). Os dois monômeros NGF (verde e azul) se interagem através de uma interface em grande parte hidrófoba [39]. O diagrama mostra a localização dos dois resíduos de tirosina e dos três resíduos de triptofano presentes no NGF de camundongo. As cadeias laterais Tyr e Trp de um monômero (verde) são desenhadas em uma representação em bastões e marcadas (rosa). Glull (vermelho) do monômero NGF oposto também é representado.

Figura 2. Atividade apoptótica aperfeiçoada do NFG tratado com peroxinitrito. (A) Culturas de neurônios motores puros mantidos com GDNF (1 ng/mL) foram expostas a concentrações crescentes de NGF previamente tratado com peroxinitrito (1 mM; NGF-ONOO") ou peroxinitrito decomposto (NGF-ROA). As linhas tracejadas representam o DP de NONE (privação de fatores tróficos). (B) Culturas de neurônios motores foram expostas ao NGF (10 ng/mL) previamente tratado com as concentrações de peroxinitrito indicadas. As linhas tracejadas representam o DP de NONE (privação de fatores tróficos). (C) Culturas de neurônios motores foram tratadas com concentrações cada vez maiores de NGF-ROA ou NGF-ONOO" (1 mM) na presença de DETA-NONOato doador de óxido nítrico (10 μΜ, NO). As linhas tracejadas representam o DP de NONE (privação de fatores tróficos). (D) Culturas de neurônios motores foram expostas ao NGF (100 ng/mL), BSA (100 ng/mL), FGF-I (10 ng/mL) ou FGF-2 (lOng/mL) previamente tratado com peroxinitrito (1 mM; barras pretas, ONOO") ou peroxinitrito decomposto (1 mM barras brancas, ROA). As linhas tracejadas representam o DP de GDNF. A sobrevivência dos neurônios motores foi determinada 48 h após o tratamento. Os dados são expressos como a porcentagem de GDNF, média ± DP. * Significativamente diferente de GDNF (p<0,05).

Figura 3. Apoptose mediada por NGF tratado com peroxinitrito dependente do p75NTR. (A) Os anticorpos de bloqueio para p75NTR (a-p75, 1:100, Chemicon #AB1554) e o inibidor geral da caspase DEVD-fmk (10 μΜ) impediram a morte dos neurônios motores induzida por NGF (100 ng/mL) previamente tratado com peroxinitrito (1 mM; NGF- ONOO"). Anticorpos para p75NTR foram adicionados uma vez imediatamente após o plaqueamento dos neurônios motores, enquanto que DEVD-fmk foi adicionado a cada 24 horas. Os dados são expressos como a porcentagem de GDNF, média ± DP. As linhas tracejadas representam o DP de GDNF. * Significativamente diferente de GDNF (p<0,05). (B) Oligonucleotídeos de sentido negativo e de sentido trocado foram adicionados a culturas de neurônios motores purificados no momento do plaqueamento. após 24 h, as culturas foram expostas ao NGF-ONOO" (100 ng/mL) ou a NGF (100 ng/mL) mais DETA-NONOato (10 μΜ) (NGF+NO). Os oligonucleotídeos de sentido negativo (barras pretas) bloquearam completamente a perda de neurônios motores induzida por ambos os tratamentos, ao passo que os oligonucleotídeos de sentido trocado (barras brancas) não tiveram efeito sobre a sobrevivência neuronal. Os dados são expressos como a porcentagem do respectivo GDNF, média ± DP. * Significativamente diferente do respectivo GDNF (ρ<0,05). (C) A apoptose dos neurônios motores induzida por NGF-ONOO" requer a produção endógena de peroxinitrito. As culturas de neurônios motores foram tratadas com NGF tratado com 1 mM peroxinitrito (100 ng/mL) na presença de L-NAME (1 mM) ou MnTBAP (100 μΜ). As linhas tracejadas representam o DP de GDNF. Os dados são expressos como a porcentagem de GDNF, média ± DP. * Significativamente diferente de GDNF (p<0,05). A sobrevivência dos neurônios motores foi determinada em todos os casos 48 h após o tratamento. Figura 4. Oligomerização e nitração do NGF

induzidas por peroxinitrito. (A) SDS-PAGE mostrando a formação de espécies de alto peso molecular do NGF após o tratamento com concentrações aumentadas de peroxinitrito (ONOO"; 0,25 mM a 1 mM). Como controle, NGF foi tratado com peroxinitrito decomposto (1 mM; ROA). O NGF foi tratado com peroxinitrito a uma concentração de 0,2 mg/mL. 10 μg de proteína foram aplicados em cada pista e a separação eletroforética foi realizada em géis de poliacrilamida a 15% sob condições de desnaturação e redução. A Figura mostra um gel representativo corado com Azul Coomasie. (B) NGF tratado com 1 mM de peroxinitrito (NGF-ONOO") ou seus produtos de degradação (NGF-ROA) foi analisado por cromatografia de exclusão por tamanho combinado com o espalhamento de luz multiângulo em tempo real (MALS). A massa molar absoluta versus tempo (ou volume) de eluição foi sobreposta com os sinais provenientes do detector LS 90°. NGF-ROA (azul) foi eluído como um único pico com uma massa correspondendo ao dímero (33,0±1,2 KDa). Em contrapartida, NGF-ONOO" foi eluído como três picos correspondendo ao dímero (33,2±0,6 KDa, 85% da proteína), tetrâmero (68,5±3,5 KDa, 13%) e octâmero (125,0± 10,0 KDa, 2%). (C) Western blot mostrando o aumento da imunoreatividade para nitrotirosina. 100 ng de NGF tratado como em (A) foram analisados por "imunoblotting" usando anticorpos policlonais anti-nitrotirosina (anti-NitroTir). Após a separação, a membrana foi desenvolvida com anticorpos policlonais anti-NGF. io Figura 5. Cromatogramas de HPLC de fase

inversa do NGF nativo (A) e tratado com peroxinitrito (Β). O NGF nativo eluiu como dois picos em 36,3 e 38,1 minutos. O tratamento com peroxinitrito (1 mM) levou a uma separação incompleta de vários produtos. A nitrotirosina não-ionizada absorve a 360 nm. O NGF tratado com peroxinitrito teve absorbância aumentada a 360 nm (b), mas, no entanto, nenhuma absorbância a 360 nm foi observada no cromatograma do NGF nativo (A).

Figura 6. Espectrometria de massa das frações coletadas pela HPLC. (A) A espectrometria de massa por tempo de vôo com ionização por "Electrospray" do eluente do NGF nativo a 36,3 minutos revelou uma massa de 13.252 Da, correspondendo à Cadeia A do NGF. O sinal de massa a 13.078 Da condiz com a falta do resíduo de arginina C-terminal. (B) A espectrometria de massa do eluente a 38,6 minutos do NGF tratado com peroxinitrito apresentou um aumento de 89 Da na massa da Cadeia A (de 13.252 para 13.341 Da). O eluente a 39,9 minutos correspondeu à Cadeia B e também apresentou um aumento de 90 Da (de 12.357 para 12.449 Da).

Figura 7. Espectrometria de massa Q-Tof das frações coletadas por HPLC digeridas por tripsina. As amostras purificadas por HPLC foram digeridas, analisadas pela espectrometria de massa Q-Tof e pesquisas de íons MS/MS subseqüentes foram realizadas por Mascot. (A) eluente do NGF não tratado nativo em 36,3 minutos, (B) eluente do NGF tratado com peroxinitrito em 38,6 minutos apresentando peptídeos modificados que indicam a nitração de Tyr52 e Trp99. Modificações similares foram observadas para o eluente em 39,9 minutos do NGF tratado com peroxinitrito. O ácido piro- glutâmico (Piro-Glu) é uma modificação comum da glutamina (Q) no N-terminal de um peptídeo.

Figura 8. Nitração e oligomerização do NGF induzida pelo tratamento com tetranitrometano. (A) cromatograma por HPLC do NGF tratado com tetranitrometano (TNM). O NGF tratado com TNM em excesso de quarenta vezes foi eluído como dois picos em 37,9 e 39,9 minutos. A absorbância em 360 nm indicou a presença de nitrotirosina nos picos eluídos. (B) Espectros desconvolucionados do eluente em 37,9 minutos apresentaram um aumento de massa na Cadeia A do NGF de 45 Da (para 13.297 Da) e 90 Da (para 13.342 Da) comparado ao do NGF nativo (13.252 Da; Figura 5A). O sinal de massa a 13.168 Da correspondeu à Cadeia A nitrada dupla que carece do resíduo de arginina C-terminal. Espectros desconvolucionados do eluente em 39,9 minutos demonstraram desvios de massa similares para a Cadeia B. (C) O espectro de massa Q-Tof do eluente digerido com tripsina em 37,9 minutos indicou a nitração de Tyr52 e Tyr79. A análise do eluente em 39,9 minutos indicou a mesma modificação na Cadeia B. (D) SDS-PAGE mostrando a formação de espécies de alto peso molecular de NGF após o tratamento com TNM (NGF-TNM). 100 ng de proteína foram analisados em cada pista e a separação eletroforética foi realizada em géis de poliacrilamida a 15% sob condições de desnaturação e redução. A figura mostra um gel representativo corado com prata.

Figura 9. Morte dos neurônios motores dependente do p75NTR induzida por NGF tratado com tetranitrometano. (A) Culturas de neurônios motores puros mantidos com GDNF (1 ng/mL) foram expostas a concentrações aumentadas de NGF previamente tratado com veículo ou TNM em excesso de 40 vezes (NGF-TNM). As linhas tracejadas representam o DP de NONE (privação de fatores tróficos). (B) Os anticorpos de bloqueio para p75NTR (a-p75, 1:100, Chemicon #AB1554) impediram a morte dos neurônios motores induzida por NGF-TNM (100 ng/mL). Anticorpos para p75NTR foram adicionados com NGF-TNM, 3 horas após o plaqueamento dos neurônios motores. As linhas tracejadas representam o DP de GDNF. A sobrevivência dos neurônios motores foi determinada 48 h após o tratamento. Os dados são expressos como a porcentagem de GDNF, média ± DP. * Significativamente diferente de GDNF (p<0,05).

Figura 10. Urato aboliu o efeito do peroxinitrito sobre a atividade apoptótica do NGF. (A) O urato impediu, de maneira dependente da dose, a nitração e oligomerização do NGF com tirosina. O NGF foi exposto ao peroxinitrito decomposto (1 mM; ROA) ou ao peroxinitrito (1 mM) na presença do veículo ou concentrações aumentadas de urato 20 a 1000 μΜ). As amostras (100 ng) foram analisadas por gel de poliacrilamida a 15%-SDS e Western Blot usando um anticorpo policlonal para a nitrotirosina. (B) NGF tratado com peroxinitrito na presença de urato não afetou a sobrevivência neuronal. As culturas de neurônios motores foram expostas ao NGF (100 ng/mL) previamente tratado com peroxinitrito (1 mM) na presença do veículo (NGF-ONOO") ou urato (200 μΜ; NGF- ONOO"-urato). Para eliminar a possibilidade de um efeito direto do urato não reagido sobre a sobrevivência dos neurônios motores, a concentração esperada de urato presente nos meios de cultura após a adição de NGF-ONOO"-urato foi adicionada às culturas expostas ao NGF-ONOO'. O urato (100 nM) não impediu a perda de neurônios motores induzida por NGF-ONOO" (100 ng/mL). A sobrevivência dos neurônios motores foi determinada 48 h após o tratamento. As linhas tracejadas representam o SD de GDNF. Os dados são expressos como a porcentagem de GDNF, média ± DP. * Significativamente diferente de GDNF (p<0,05). Figuras 11 e 12. Seqüências de aminoácidos

do NGF

Figura 11A: NGF de camundongo (AAA39818;

SEQ ID NO:3)

Figura 11B: NGF humano (CAA37703; SEQ ID

NO:4)

Figura 12A: NGF de camundongo maduro

(SEQ ID NO:l)

Figura 12B: NGF humano maduro (SEQ ID

NO: 2)

Os resíduos Tyr (Y) e Trp (W) são representados por caracteres negritos e sublinhados nas Figuras 12A e 12B:

na figura 12A (NGF de camundongo maduro), são mostrados os resíduos Trp21, Tyr52, Trp76, Tyr79, Trp99 do NGF de camundongo maduro (a numeração dos resíduos sendo calculada por referência à seqüência da proteína neurotrofina madura);

na figura 12B (NGF humano maduro), são mostrados os resíduos Trp21, Tyr52, Trp76; Tyr79 e Trp99 do NGF humano maduro (a numeração dos resíduos sendo calculada por referência à seqüência da proteína neurotrofina madura);

Figura 13. Análise por western blotting dos meios condicionados a partir de astrócitos em repouso ou estimulados (FGF1, 10 ng/mL; e LPS, 5 microg/mL) usando um anticorpo específico que se liga ao NGF nitrado, sem provocar reação cruzada com NGF não nitrado (pista 1: NGF não nitrado; pista 2: NGF nitrado; pista 3: meios condicionados de astrócitos em repouso; pista 4: meios condicionados a partir de astrócitos estimulados).

Figura 14. O peroxinitrito aumenta o

crescimento neurítico, promovendo a atividade do NGF. Explantes dos gânglio da raiz dorsal de embriões de ratos El5 (que expressam tanto TrkA como p75NTR) foram cultivados em meios neurobasais na ausência de fatores tróficos (NONE) ou na presença de NGF (100 ng/mL), NGF tratado com peroxinitrito (100 ng/mL; nitroNGF-P) ou NGF tratado com tetranitrometano (nitroNGF-TNM). Após 24 horas, as culturas foram fixadas com paraformaldeído a 4% e processadas para imunofluorescência contra GAP-43. Note que os gânglios tratados com nitroNGF apresentaram crescimento neurítico aumentado quando comparado aos tratados com NGF.

DESCRIÇÃO DETALHADA A invenção descreve que as neurotrofinas passam por modificações pós-traducionais. Até o conhecimento presente dos inventores, a invenção é a primeira descrição de uma modificação pós-traducional de uma neurotrofina, e mais particularmente, do NGF.

Os inventores demonstram que essas modificações pós-traducionais levam a dímeros de conformação diferente, bem como a oligômeros anormais, como tetrâmeros e octâmeros. Tais neurotrofinas modificadas diferem-se das neurotrofinas nativas não modificadas (saudáveis) quanto à estrutura, à conformação e à atividade biológica.

Tais neurotrofinas modificadas possuem um efeito pró-apoptótico sobre os neurônios motores, e/ou um efeito de crescimento pró- neurítico sobre os gânglios sensoriais. Além disso, essas neurotrofinas modificadas podem exercer esses efeitos a concentrações baixíssimas: a probabilidade de uma neurotrofina modificada induzir e/ou estimular tais efeitos é fortemente aumentada se comparado à probabilidade que poderia ter (se houver) a neurotrofina não modificada, a partir da qual ela se deriva, mesmo quando tal neurotrofina não modificada é usada na presença de óxido nítrico exógeno adicionado.

Os inventores também demonstram que, sob condições in vivo, essas modificações pós-traducionais resultam visivelmente da nitração da neurotrofina madura por espécies nitrantes endógenas, tal como o peroxinitrito. O peroxinitrito (ONOO), produto de reação do óxido nítrico e dos radicais superóxido, é formado in vivo principalmente em condições patológicas associadas à produção aumentada de óxido nítrico.

Ao que consta do conhecimento dos inventores, também é a primeira vez que tais neurotrofinas modificadas são identificadas, isoladas e purificadas. Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se, dessa forma, a essas neurotrofinas modificadas, e mais particularmente, a essas neurotrofinas nitradas.

Estudos anteriores, como o de Frazier et ai. [52], relataram que a nitração do NGF por tetranitrometano (TNM) não modificou a atividade biológica do NGF, pelo menos conforme avaliado pela indução do crescimento neurítico em gânglios sensoriais. A invenção demonstra de maneira precisa que, justo pelo contrário, a nitração do NGF ou de outra neurotrofina, por um agente de nitração, como TNM e/ou peroxinitrito, modifica profundamente sua atividade biológica.

Antes da invenção, nunca foi imaginado que é a modificação pós-traducional das neurotrofinas, como o NGF (a saber, a nitração e/ou a oligomerização anormal do NGF) que media a atividade pró-apoptótica exercida pelo NGF sobre os neurônios motores. O ensinamento da técnica anterior abrangia apenas o NGF não modificado e/ou suas formas precursoras, como o pró-NGF; vide, por exemplo, Pegar e col., 2004 [25].

As neurotrofinas modificadas pós- traducionalmente que foram identificadas pelos inventores possuem uma atividade apoptótica dos neurônios motores e/ou uma atividade de crescimento neurítico a concentrações baixíssimas. A capacidade de tal neurotrofina modificada em induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico (por exemplo, a partir de gânglios sensoriais) é fortemente aumentada se comparado à capacidade que pode ser exercida (se mesmo houver) pela neurotroflna nativa não modificada, a partir da qual ela se deriva, mesmo quando a referida neurotrofina nativa não modificada é utilizada na presença de óxido nítrico exógeno adicionado. O(s) efeito(s) nas neurotrofinas modificadas, tal como a NGF modificada, é(são) detectáveis a concentrações baixíssimas. Por exemplo, o NGF nitrado induz significativamente a apoptose dos neurônios motores a concentrações tão baixas quanto 1 ng/mL (vide a Figura 2A e os comentários associados). Quando usada em associação com óxido nítrico, ou uma fonte de óxido nítrico, a atividade apoptótica de uma neurotrofina modificada é aumentada ainda mais.

Por exemplo, o NGF nitrado utilizado junto com óxido nítrico (NGF-ONOO" + NO) induz significativamente a perda de neurônios motores a apenas 1 pg/mL (vide a Figura 2C e os comentários associados). A nitração do NGF por peroxinitrito in vitro aumentou a capacidade do NGF em induzir a apoptose dos neurônios motores em 10.000 vezes na presença de óxido nítrico.

Além do mais, as atividades exercidas por uma neurotrofina nitrada sobre a apoptose dos neurônios motores e/ou sobre o crescimento neurítico a partir dos gânglios sensoriais parecem ser bastante específicas, uma vez que outros fatores de crescimento nitrados além das neurotrofinas nitradas, como o FGF nitrado, não exercem nenhum efeito apoptótico sobre os neurônios motores (por exemplo, nitro-FGF-1, nitro-FGF-2; vide a Figura 2D e os comentários associados). Dessa forma, a invenção refere-se a neurotroflnas modificadas, que são indutores e/ou estimuladores altamente potentes da apoptose dos neurônios motores e/ou do crescimento neurítico. Essas neurotroflnas modificadas foram isoladas, identificadas e caracterizadas pelos inventores. As neurotroflnas modificadas podem ser caracterizadas pelo fato de que pelo menos um resíduo selecionado dentre seus resíduos Tyr e Trp compreende ao menos um grupo nitro. As neurotroflnas modificadas podem, como alternativa ou em adição, serem caracterizadas pelo fato de poderem ser obtidas pela modificação nitrativa pós-traducional de uma neurotrofina nativa, pela adição, à referida neurotrofina nativa, de ao menos um grupo nitro em pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, sendo que a referida neurotrofina nativa é uma pró-neurotrofina nativa ou uma neurotrofina madura nativa, de preferência, uma neurotrofina madura nativa.

No presente documento, entende-se por neurotrofina nativa ou pró-neurotrofina nativa a neurotrofina ou pró-neurotrofina correspondendo à neurotrofina de ocorrência natural ou pró-neurotrofina que é observada em um mamífero saudável, ou no mínimo em um mamífero que não sofre de nenhuma apoptose anormal dos neurônios motores. Na presente invenção, uma neurotrofina ou pró-neurotrofina nativa corresponde assim à neurotrofina ou pró-neurotrofina normal "saudável". Logo, tal neurotrofina ou pró-neurotrofina nativa não é nitrada. O termo "neurotrofina" nesta invenção designa o grupo que consiste do NGF (fator de crescimento nervoso), BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT-4 (neurotrofina-4; que também é chamado de NT-4/5, isto é, neurotrofina-4/5) e NT-6 (neurotrofina-6). Na ausência de qualquer indicação adicional, esse termo abrange a neurotrofina madura, bem como a pró-neurotrofina. Na presente invenção, as neurotrofinas preferidas são as neurotrofinas maduras.

A invenção também se refere aos fragmentos conservadores e às variantes conservadoras. O fragmento conservador é um fragmento que reteve pelo menos um grupo nitro em pelo menos um resíduo, de preferência, em pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp. Ele também reteve a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico. Uma variante conservadora deriva-se de uma neurotrofina modificada ou de um fragmento conservador da invenção, por pelo menos uma substituição e/ou deleção e/ou adição de aminoácido, mas reteve pelo menos um grupo nitro em pelo menos um resíduo, de preferência, em pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp. A referida variante conservadora também reteve a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico.

No presente pedido, salvo indicação ao contrário, o termo "neurotrofina modificada" ou "neurotrofina nitrada" abrange uma neurotrofina modificada da invenção, bem como qualquer fragmento conservador da mesma, bem como qualquer variante conservadora de tal neurotrofina modificada ou de tal fragmento conservador.

As neurotrofinas nitradas da invenção podem ser obtidas colocando-se uma neurotrofina nativa ou uma pró- neurotrofina nativa em contato com um agente de nitração.

Um fragmento conservador da invenção pode

ser obtido:

- pela clivagem de uma neurotrofina modificada da invenção, ou colocando-se fragmentos de uma neurotrofina nativa ou de uma pró-neurotrofina nativa em contato com um agente de nitração, por meio do que uma população de fragmentos candidatos é obtida, e

- pela seleção, dentre a referida população de fragmentos candidatos de um fragmento, de qual deles reteve pelo menos um grupo nitro em pelo menos um resíduo, de preferência, em pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e que tenha a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico.

Uma variante conservadora da invenção pode

ser obtida:

- pela substituição e/ou deleção e/ou adição de pelo menos um aminoácido de uma neurotrofina modificada da invenção ou de um fragmento conservador da invenção, ou colocando-se uma variante de uma neurotrofina nativa ou de uma pró-neurotrofina nativa ou de um fragmento de neurotrofina nativa ou de um fragmento de pró-neurotrofina nativa em contato com um agente de nitração,

por meio do que uma população de variante(s) candidata(s) é obtida, e

- pela seleção, dentre a referida população de variante(s) candidata(s) de uma variante, de qual delas reteve pelo menos um grupo nitro em pelo menos um resíduo, de preferência, em pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e que tenha a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico.

Qualquer agente de nitração considerado apropriado pode ser utilizado. Pode-se utilizar um ou vários agentes de nitração. O(s) agente(s) de nitração sendo utilizado(s) é(são) agente(s) que compreende(m) ao menos um grupo nitro, e que são capazes de induzir a adição do referido ao menos um grupo nitro em uma proteína neurotrofina, ou um fragmento ou variante desta, de preferência em pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp da referida neurotrofina, ou fragmento ou variante desta. De preferência, o referido agente de nitração é tetranitrometano e/ou peroxinitrito. A neurotrofina a ser nitrada (ou seu fragmento ou variante) pode se originar de qualquer origem considerada apropriada pelos versados na técnica. Ela pode ser um peptídeo natural, polipeptídeo ou proteína, ou um fragmento de um polipeptídeo ou proteína natural, ou um peptídeo recombinante, polipeptídeo ou proteína, ou um peptídeo ou polipeptídeo sintético. Qualquer método de síntese de peptídeo ou polipeptídeo conhecido pelos versados na técnica pode ser empregado. Exemplos de métodos de síntese, tal como a síntese de fase sólida de Merrifield, podem ser encontrados, por exemplo, em « Solid Phase Peptide Synthesis » (J.M. Steward & J.D. Young, 1969, Ed. W.H. Freeman Co., San Francisco), ou em « Peptide synthesis » (M. Bodansky e col. 1976, John Wiley & Sons, 2nd Edition). Origens naturais de neurotrofina incluem particularmente as células astrocíticas, por exemplo, células gliais astrocíticas tipo II. As neurotrofinas também se encontram comercialmente disponíveis, tal como o NGF murino, que é disponibilizado pela Harlan (Indianápolis; EUA).

As neurotrofinas recombinantes, ou fragmentos ou variantes da neurotrofina, também podem ser produzidas por pessoas com conhecimento regular na técnica, por exemplo, pela infecção e/ou transfecção e/ou transformação de células hospedeiras apropriadas (por exemplo, células de fibroblastos) com um DNAc que codifica a referida neurotrofina ou fragmento ou variante, sob condições apropriadas para a expressão da proteína ou polipeptídeo ou peptídeo codificado por esse DNAc. Por exemplo, a produção do NGF recombinante humano foi descrita em Johnson e col. 1986 (Cell 47(4):545-554; production from mouse fibroblasts), em Allen e col. 2001 (J. Biochem. Biophys. Methods. 47:239-255; production from baculovirus and insect cell systems), em Rattenholl e col. 2001 (Eur. J. Biochem. 268:3296- 3303 ; production from a bacterial system).

A referida neurotrofina (ou um fragmento ou variante conservador desta) entra em contato com o referido agente de nitração sob condições (mais particularmente, sob condições de pH e duração) apropriadas para o referido agente de nitração induzir a adição de pelo menos um grupo nitro em pelo menos um dos resíduos Trp e Tyr da referida neurotrofina, ou fragmento ou variante.

A capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico pode ser avaliada por qualquer meio disponível ao versado na técnica. Por exemplo, a capacidade de induzir e/ou estimular o crescimento neurítico pode ser avaliada expondo-se os gânglios sensoriais à referida neurotrofina nitrada, ou fragmento ou variante desta, e terminando-se o nível de crescimento neurítico, de modo a determinar se a referida exposição à referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) induz ou aumenta o número de neuritos desenvolvendo-se a partir dos referidos gânglios sensoriais. Para determinar se o número de neuritos aumenta, quando da exposição à referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta), comparado às condições do controle, um aumento estatisticamente significativo do número de neuritos pode ser observado.

Por exemplo, a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores pode ser avaliada expondo-se os neurônios motores à referida neurotrofina nitrada, ou fragmento ou variante desta, e contando-se as células não apoptóticas, por exemplo, as células que apresentam neuritos intactos com diâmetro maior do que quatro corpos de células, e/ou as células apoptóticas, de modo a determinar se a referida exposição à referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) induz ou aumenta o número de neurônios motores sofrendo apoptose. Para determinar se o número de células não apoptóticas diminuiu e/ou se o número de células apoptóticas aumenta, quando da exposição à referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta), comparado às condições de controle, uma diminuição estatisticamente significativa do número de células não apoptóticas e/ou um aumento estatisticamente significativo do número de células apoptóticas, respectivamente, pode ser observado. Para tais determinações, geralmente são formados controles apropriados que não compreendem a exposição à referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta), como por exemplo, colocando-se neurônios motores ou gânglios sensoriais similares em condições experimentais similares, mas sem exposição à referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta), ou pela exposição a uma neurotrofina de controle que foi submetida a um agente de nitração decomposto (por exemplo, peroxinitrito decomposto) e que é adicionado na ordem de adição inversa. Detalhes da cultura ilustrativa e das condições experimentais podem ser encontrados descritos nos exemplos adiante (vide, por exemplo, a Figura 2A e os comentários relacionados a ela, bem como o parágrafo intitulado "culturadas de neurônios motores purificados").

O termo "estatisticamente significativo" ou "de forma significativa" é utilizado aqui no seu significado usual na área de estatística (por exemplo, teste t, teste z, valor do qui-quadrado, ou razão F, etc.), isto é, para comparar um valor com outro, e determinar se esses valores se diferem. O termo "estatisticamente significativo" ou "de forma significativa", portanto, abrange o fato de que o perito na técnica pode levar em conta o desvio padrão (se houver), que mede a quantidade de espalhamento de dados em uma distribuição de freqüência. O valor de ρ desejado é geralmente definido em um nível alfa de 5%, ou no nível alfa

mais estrito de 1%.

Os monômeros de cada uma das neurotrofinas compartilham uma série de características químicas, inclusive tamanhos moleculares similares (13,2-15,9 kDa, e excepcionalmente 21 kDa para NT-6), identidades de seqüência primária que se aproximam de ou excedem 50%, pontos isoelétricos na faixa de 9-10, e seis meias-cistinas conservadas nas mesmas posições conservadas que dão origem a três pontes dissulfeto intracadeias. Essas três pontes dissulfeto formam um nó de cistina característico (vide a figura 1). De preferência, a referida neurotrofina é o NGF ou o BDNF. Mais preferencialmente, a referida neurotrofina é o NGF. As seqüências de aminoácidos do NGF murino e do NGF humano são apresentadas nas Figuras 11A, 12A (NGF murino) e IlB e 12Β (NGF humano).

De preferência, a referida neurotrofina é uma neurotrofina humana, mais preferencialmente, um NGF humano.

0 produto da reação de nitração pode compreender compostos não reagidos e/ou subprodutos. Se desejado ou necessário, a referida modificação nitrativa pós- traducional é seguida pela separação e/ou isolamento da neurotrofina nitrada a partir dos compostos não reagidos e/ou subprodutos.

O produto da reação de nitração pode compreender várias espécies de monômeros/oligômeros na neurotrofina nitrada. Se desejado ou necessário, a referida modificação nitrativa pós- traducional é seguida da separação e/ou do isolamento de cada uma dessas diferentes espécies de monômeros/oligômeros, por meio do que essas espécies são separadas e/ou isoladas uma das outras.

A referida separação e/ou isolamento pode ser realizado, por exemplo, por cromatografia HLPC e/ou por espectrometria de massa das frações do eluente da HPLC (espectrometria de massa por tempo de vôo com ionização por "electrospray"), por meio do que cada espécie de monômero ou oligômero pode ser obtida na forma pura.

Métodos que podem ser apropriados para obter uma única espécie de monômero/oligômero em uma forma pura podem incluir separação líquida usando exclusão por tamanho, troca iônica, imunoafinidade ou cromatografia de fase inversa. Também é possível aplicar eletroforese em condições não desnaturalizantes e a imunoprecipitação.

A referida nitração da neurotrofina pode ser realizada colocando-se a referida neurotrofina em contato com um agente de nitração, tal como peroxinitrito e/ou tetranitrometano, sob condições que permitam a adição de ao menos um grupo nitro, de preferência, em pelo menos um resíduo Tyr ou Trp. Por exemplo, a referida nitração pode ser realizada em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4, contendo bicarbonato de sódio 20mM.

A referida neurotrofina pode estar, por exemplo, a uma concentração de 0,2 a 1 mg/mL.

A referida neurotrofina pode, por exemplo, ser sujeita a pelo menos uma adição de bólus (1 microL) de uma solução de peroxinitrito a uma concentração de 0,25 a 2 mg/mL em uma solução de NaoH 0,01 M. Várias adições de bólus podem ser realizadas, por exemplo, até dez adições de bólus (cada uma de 1 microL) da referida solução de peroxinitrito. Adições de bólus sucessivas de peroxinitrito causam uma aparência dependente da dose dos oligômeros de números de mer crescentes. Isso pode ser observado, por exemplo, no SDS-ÇAGE por uma aparência dependente da dose de três espécies de altíssimo peso molecular (vide a Figura 4A para NGF nitrado) ou pela cromatografia por exclusão de tamanho HPLC combinada com o espalhamento de luz multiângulo em tempo real (MALS) (33,2±0,6 kDa para o dímero de NGF nitrado; 68,5±3,5 kDa para o tetrâmero de NGF nitrado; 68,5±3,5 kDa para o octâmero de NGF nitrado; vide a Figura 4B). Surpreendentemente, o dímero de NGF tratado com peroxinitrito elui antes do dímero de NGF nativo (conforme avaliado pela cromatografia por exclusão de tamanho HPLC combinada com a análise MALS), refletindo a existência de mudanças conformacionais. Essa aparência dependente da dose dos oligômeros de números de mer crescentes é acompanhada por uma diminuição progressiva na intensidade da coloração do NGF nativo.

As adições de bólus sucessivas de peroxinitrito também induzem uma nitração dependente da dose da neutrofina colocada em contato (vide a Figura 4C para NGF nitrado). O NGF nativo elui como dois picos por HPLC de fase inversa, em 36,3 e 38,1 min (vide a Figura 5A), correspondendo à cadeia A do NGF e à cadeia B do NGF. O NGF nitrado elui mais tarde, por exemplo, em 38,6 min ou um pouco depois, devido à presença das espécies de NGF de pesos moleculares aumentados.

Sendo assim, além de demonstrar que as neurotrofinas passam por modificações pós-traducionais, os inventores demonstram que essas modificações pós-traducionais resultam visivelmente da nitração, e mais particularmente, da nitração da tirosina. A nitração não era a única possibilidade de modificação química que poderia levar em conta tais modificações pós-traducionais.

De fato, a nitração da tirosina não é a única modificação oxidativa da tirosina conhecida por alterar a atividade biológica de uma proteína, outras modificações oxidativas na tirosina são conhecidas, como a clorinação, a brominação e a hidroxilação para 3-cloro, 3-bromo ou 3-hidroxitirosina (que são promovidas com condições inflamatórias).

Outros processos oxidativos desencadeados por espécies de nitrogênio radioativas, como a oxidação do tiol, o rompimento dos agrupamentos ferro-enxofre e a oxidação dos centros dos metais de transição podem, em muitos casos, ser mais relevantes que a nitração na promoção da célula/disfunção/morte. Além disso, o papel do peroxinitrito na nitração biológica foi questionado recentemente (Pfeiffer e col. 2000 J. Biol. Chem. 275:6346-6352 ; Thomas e col. 2002 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 99:12691-12696).

Além do mais, a invenção descreve não apenas a nitração dos resíduos de tirosina, mas também a nitração de outros resíduos, como o triptofano (bem como, para algumas neurotrofinas, a oxidação da metionina). A invenção também descreve uma mudança conformacional na molécula de neurotrofina, que leva a dímeros nitrados conformacionalmente diferentes, bem como à oligomerização anormal (formação de, por exemplo, espécies de tetrâmeros e octâmeros).

Mais preferencialmente, uma forma isolada da neurotrofina modificada está em uma configuração molecular que não impede sua atividade pró-apoptótica e/ou sua atividade de crescimento pró-neurítico. O produto obtido após a nitração da neurotrofina (ou o fragmento ou variante da neurotrofina) pode ser isolado dos demais componentes da mistura de reação, por exemplo, por cromatografia HPLC de fase inversa (vide, por exemplo, a Figura 5B para NGF nitrado). Os eluentes assim obtidos podem compreender uma única espécie de oligômero de neurotrofina nitrada, ou uma mistura de oligômeros de neurotrofina nitrada, mas podem ser destituídos de qualquer outro composto que não seja a neurotrofina nitrada. Se desejado, tal eluente, ou tais eluentes, podem ser adicionalmente purificados, por exemplo, por cromatografia HPLC, para isolar as diferentes espécies de oligômeros umas das outras, ou pelo menos para isolar uma certa mistura de espécie de outra espécie ou mistura de espécie. 0(s) eluente(s) pode(m) ser formulado(s) em outra forma que não a forma líquida, por exemplo, numa forma sólida. Técnicas apropriadas para obter uma formulação de estado sólido de um produto que inicialmente encontra-se disponível no estado líquido, sem perder a estrutura e a conformação do produto, são conhecidas pelos peritos na área. Tal técnica por compreender, por exemplo, separação de membranas e/ou evaporação e/ou cristalização e/ou concentração por congelamento. De preferência, uma forma isolada da neurotrofina modificada não compreende nenhuma pró-neurotrofina não nitrada e/ou nenhuma neurotrofina madura não-nitrada.

De preferência, ela não compreende nenhuma neurotrofina não- reagida, como o dímero de NGF não nitrado, e também nenhum agente de nitração remanescente. De forma vantajosa, ela não compreende nenhuma pró-neurotrofina nitrada e/ou não-nitrada (pró-NGF, pró-BDNF, pró-NT-3, pró-NT-4). Mais particularmente, ela não compreende nenhum pró-NGF nitrado e/ou não-nitrado (acredita-se que grande parte, ou mesmo todos os produtos à base de NGF comercialmente disponíveis sejam de fato uma mistura de NGF maduro e de pró-NGF). Mais preferencialmente, ela está numa forma substancialmente pura (como definido abaixo), mais preferencialmente, em uma forma pura, que não contém nenhum outro composto além do(s) monômero(s) e/ou oligômero(s) de neurotrofina nitrada. Uma proteína "isolada" é uma proteína que é substancialmente separada dos demais componentes que a acompanham naturalmente, por exemplo, proteínas e seqüências genômicas flanqueantes das espécies de origem, e que é substancialmente separada dos demais componentes químicos ou compostos possivelmente presentes ou formados durante a síntese protéica e/ou as reações de nitração. O termo "isolado" abrange proteínas ou polipeptídeos de ocorrência natural, assim como proteínas ou polipeptídeos sintetizados quimicamente, e proteínas e polipeptídeos sintetizados por sistemas heterólogos. "Substancialmente puro" geralmente significa que a proteína está isolada dos demais compostos, tais como proteínas contaminantes, ácidos nucléicos, ou outros compostos biológicos derivados do organismo de origem, ou de substâncias químicas ou compostos que estejam presentes ou que são formados durante a síntese protéica e/ou as reações de nitração. A pureza, ou "isolamento", pode ser avaliada por métodos convencionais, geralmente por peso, e será geralmente ao menos de cerca de 70% puro, mais geralmente, pelo menos cerca de 80% puro, freqüentemente pelo menos cerca de 85% puro, mais freqüentemente pelo menos cerca de 90% puro, de preferência pelo menos cerca de 95% puro, mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% puro, e nas concretizações mais preferidas, pelo menos 99% puro. Veículos ou excipientes serão geralmente adicionados, ou a formulação pode ser estéril e/ou compreender componentes tampão.

Uma molécula substancialmente pura inclui formas isoladas da molécula. Uma proteína isolada será geralmente uma composição homogênea de moléculas, mas, em algumas concretizações, irá conter uma pequena heterogeneidade. Essa heterogeneidade é normalmente encontrada nas extremidades ou porções poliméricas que não são vitais à função ou atividade biológica desejada.

A neurotrofina modificada da invenção pode consistir de um monômero, ou de um oligômero, tal como um dímero, um trímero, um tetrâmero, um pentâmero, um hexâmero, um heptâmero, um octâmero. Uma das neurotrofinas modificadas preferidas da invenção está na forma de um monômero, ou de um dímero, ou de tetrâmero, ou de um hexâmero ou de um octâmero. Como alternativa, uma neurotrofina modificada da invenção pode consistir de ao menos duas espécies de oligômeros diferentes, por exemplo, ao menos três espécies de oligômeros diferentes. Uma neurotrofina modificada da invenção pode, dessa forma, consistir de ao menos duas, por exemplo, pelo menos três espécies de oligômeros diferentes selecionadas dentre o grupo que consiste de dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, hexâmero, heptâmero, octâmero.

Uma das neurotrofínas modificadas preferidas da invenção consiste de ao menos duas espécies de oligômeros diferentes selecionadas dentre dímero, tetrâmero e octâmero. Uma das neurotrofínas modificadas preferidas da invenção pode, então, consistir de duas espécies de oligômeros, tal como dímero e tetrâmero, ou dímero e octâmero, ou tetrâmero e octâmero. Outras neurotrofínas preferidas da invenção podem, dessa forma, consistir de três espécies de oligômeros, tal como dímero, tetrâmero e octâmero. Ainda outras neurotrofínas preferidas da invenção podem, dessa forma, consistir de quatro espécies de oligômeros diferentes, tal como dímero, tetrâmero, hexâmero e octâmero.

Uma neurotrofina modificada da invenção pode

ser em uma forma sólida, ou em uma forma líquida.

Uma neurotrofina, tal como NGF, BDNF, NT3, NT-4, tem uma estrutura dimérica que consiste de dois monômeros ligados de forma não covalente. Quando tal estrutura dimérica é sujeita à nitração, a nitração de pelo menos um dos monômeros, de preferência dos dois monômeros, ocorre pela adição de ao menos um grupo nitro em pelo menos um resíduo, de preferência selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp. Por conseguinte, quando o produto modificado pós- traducionalmente está em solução, agregados dos dímeros da neurotrofina modificada podem se formar, os referidos agregados estando em textura dinâmica, sendo que as espécies de oligômeros diferentes podem atingir o equilíbrio entre si, para formar uma mistura de ao menos duas estruturas de oligômeros diferentes selecionadas dentre dímero(s), tetrâmero(s), hexâmero(s), octâmero(s).

A referida neurotrofina modificada^ pode, ^essa forma, estar na forma de uma mistura de oligômeros consistindo de ao menos duas estruturas de oligômeros diferentes selecionadas dentre estruturas de dímero, tetrâmero, hexâmero e octâmero, de preferência dentre estruturas de dímero, tetrâmero e octâmero. Dependendo das condições específicas de nitração e/ou do agente de nitração específico sendo utilizado, o produto resultante pode, contudo, consistir de uma única espécie de oligômero. Por exemplo, quando a concentração do material inicial da neurotrofina é baixa, o produto da neurotrofina modificada resultante pode consistir de uma única espécie de oligômero de neurotrofina nitrada, notavelmente, de uma única espécie de dímero de neurotrofina nitrada. Por exemplo, quando o NGF é usado a uma concentração de 0,2-0,4 mg/mL como material inicial, o produto resultante da nitração (por exemplo, por peroxinitrito e/ou tetranitrometano) pode consistir de uma única espécie de dímero de NGF nitrado. Tal dímero de neurotrofina modificada difere-se do dímero de NGF nativo (saudável) não apenas pela presença de ao menos um grupo nitro, mas também por uma conformação molecular diferente. Isso é evidenciado, por exemplo, pela cromatografia por exclusão de tamanho HPLC combinada com a análise de espalhamento de luz multiângulo em tempo real (MALS), destacando-se o dímero de NGF modificado (vide a Figura 4B). O dímero de neurotrofina modificada também mostra uma atividade biológica que é drasticamente diferente da do dímero de neurotrofina nativa não modificada a partir do qual ele se deriva, uma vez que o dímero de neurotrofina modificada é capaz de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento dos neuritos, ao passo que o dímero de neurotrofina nativa não modificada não apresenta tal atividade, ou apenas a um nível baixíssimo, que é significativamente inferior ao observado no dímero de neurotrofina nitrada. Por exemplo, o dímero de NGF nitrado da invenção tem uma atividade apoptótica que é cerca de 10.000 vezes maior do que a do dímero de NGF nativo não modificado do qual ele se deriva.

A referida neurotrofina, da qual se deriva a neurotrofina modificada, pode ser BDNF, NT-3, NT-4/5 e/ou NT- 6. De preferência, ela é BDNF maduro, NT-3 madura, NT-4/5 madura ou NT-6 madura.

Como alternativa, a referida neurotrofina, da qual se deriva a neurotrofina modificada, pode ser o NGF. De preferência, ela é o NGF maduro. O NGF é um homodímero de aproximadamente 27 kDa [38, 39]. O monômero de NGF de camundongo tem 118 aminoácidos, apesar de que cadeias mais curtas truncadas tanto no terminal C quanto no terminal N também foram identificadas [38, 40]. O NGF de camundongo contém dois resíduos de tirosina nas posições 52 e 79 (vide a Figura 1) [41]. Conservado em todos os membros da família de neurotrofinas, o Tyr52 participa nos contatos hidrófobos na interface do dímero e também está envolvido na ligação do p75NTR [39, 42]. Estudos de mutagênese direcionados ao sítio revelaram a importância estrutural desse resíduo de tirosina em determinar uma conformação protéica estável [43]. Por outro lado, o Tyr79 é conservado na maioria dos NGFs, mas não nos outros membros da família das neurotrofinas [41]. No NGF de camundongos, essa tirosina faz contato com resíduos do mesmo protômero e também poderiam interagir com o N-terminal do segundo protômero [39]. Uma vez que esses resíduos de tirosina encontram-se altamente conservados, a modificação desses resíduos com peroxinitrito tem importantes conseqüências na atividade biológica do NGF.

Seqüências ilustrativas de um NGF de camundongo e de um NGF humano são ilustradas nas Figuras IlA e 11B, respectivamente.

As seqüências de um NGF maduro de camundongo e de um NGF humano maduro são ilustradas nas Figuras 12A e 12B, respectivamente.

A seguir, faz-se referência a resíduos específicos do NGF, mais particularmente, aos resíduos Tyr e Trp específicos. Esses resíduos são identificados por sua posição no aminoácido, tal como, por exemplo, Tyr52 ou Trp99. As posições dos resíduos são aqui calculadas por referência à seqüência da proteína madura, por exemplo, para o NGF de camundongo, por referência à seqüência da SEQ ID NO:l que é ilustrada na Figura 12A, ou para o NGF humano, por referência à seqüência de SEQ ID NO: 2, que é ilustrada na Figura 12B. A Figura 12A mostra os 3 resíduos Trp e os 2 resíduos Tyr que estão contidos no NGF de camundongo (Trp21, Tyr52, Trp76, Tyr79, Trp99).

A Figura 12B mostra os 3 resíduos Trp e os 2 resíduos Tyr que estão contidos no NGF humano (Trp21, Tyr52, Trp76; Tyr79, Trp99).

De forma vantajosa, uma neurotrofina modificada da invenção é um NGF nitrado, em que ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp compreende ao menos um grupo nitro.

O referido NGF nitrado pode ser um promotor de NGF nitrado em uma forma pura, por exemplo, uma cadeia A de NGF nitrado, ou uma cadeia B de NGF nitrado (a cadeia B carece dos oito resíduos N-terminais presentes na cadeia A).

O referido NGF nitrado pode ser um oligômero de NGF nitrado de cadeia A de NGF nitrado e/ou cadeia B de NGF nitrado, em uma forma pura. Tal oligômero de NGF nitrado pode ser um dímero de NGF nitrado (consistindo de duas cadeias A de NGF nitrado, ou de uma cadeia A nitrada e uma cadeia B de NGF nitrado, ou de duas cadeias B nitradas). Queira observar que o dímero de NGF tratado com peroxinitrito elui antes do dímero de NGF nativo (conforme avaliado pela cromatografia por exclusão de tamanho HPLC combinada com a análise MALS), refletindo a existência de mudanças conformacionais (vide a Figura 4B). Tal oligômero de NGF nitrado pode ser um trímero de NGF nitrado, um tetrâmero de NGF nitrado, um pentâmero de NGF nitrado, um hexâmero de NGF nitrado, um heptâmero de NGF nitrado, um octâmero de NGF nitrado. Ele é selecionado, de preferência, a partir do grupo que consiste de um dímero de NGF nitrado, um tetrâmero de NGF nitrado, um hexâmero de NGF nitrado, um octâmero de NGF nitrado. Mais preferencialmente, ele é selecionado dentre o grupo que consiste de um dímero de NGF nitrado, um tetrâmero de NGF nitrado, um octâmero de NGF nitrado.

Como mencionado acima, o referido oligômero de NGF nitrado pode ser na forma de uma mistura de oligômeros, tal como, por exemplo, uma mistura de oligômeros consistindo de ao menos duas espécies de oligômeros diferentes selecionadas dentre espécies de dímero, tetrâmero, hexâmero e octâmero, mais preferencialmente, uma mistura de oligômeros consistindo de ao menos duas espécies de oligômeros diferentes selecionadas dentre espécies de dímero, tetrâmero e octâmero, mais preferencialmente, uma mistura de oligômeros consistindo das espécies de dímero, tetrâmero e octâmero.

O referido pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp que compreendem ao menos um grupo nitro pode ser um resíduo Tyr, por exemplo, Tyr52 ou Tyr79 do NGF murino, ou Tyr52 ou Tyr79 do NGF humano, ou qualquer resíduo equivalente de outras espécies. Se a referida neurotrofina for um NGF de camundongo (SEQ ID NO: 1), o referido pelo menos um resíduo Tyr é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Tyr52 e Tyr79 do NGF de camundongo (vide a Figura 12A). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF de camundongo. Se a referida neurotrofina for um NGF humano (SEQ ID NO: 2), o referido pelo menos um resíduo Tyr é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Tyr52, Tyr79 do NGF humano (vide a Figura 12B). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF humano.

O referido pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp que compreendem ao menos um grupo nitro pode ser um resíduo Trp, por exemplo, Trp99 ou Trp21 ou Trp76 do NGF de camundongo, ou Trp99 ou Trp21 ou Trp76 do NGF humano, ou qualquer resíduo equivalente de outras espécies.

O número de resíduos Tyr e Trp da referida neurotrofina que portam um grupo nitro (ao menos um grupo nitro em cada um dos referidos resíduos) pode ser de pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito ou pelo menos nove.

Todos os resíduos Tyr e Trp da referida neurotrofina podem portar ao menos um grupo nitro.

Se a referida neurotrofina for um NGF de camundongo, os referidos pelo menos dois resíduos Tyr são, de preferência, os resíduos Tyr52 e Tyr79 do NGF de camundongo (vide a Figura 12 A).

Se a referida neurotrofina for um NGF humano, os referidos pelo menos dois resíduos Tyr são, de preferência, os resíduos Tyr52 e Tyr79 do NGF humano (vide a Figura 12B).

Se a referida neurotrofina for um NGF de camundongo, o referido pelo menos um resíduo Trp é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Trp99, Trp21 e Trp76 do NGF de camundongo (vide a Figura 12A). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp99 ou Trp21 do NGF de camundongo. Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp99 do NGF de camundongo. Se a referida neurotrofina for um NGF humano, o referido pelo menos um resíduo Trp é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Trp21, Trp76, Trp99 do NGF humano (vide a Figura 12B). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp21 ou Trp99 do NGF humano. Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp99 do NGF humano.

Se a referida neurotrofina for um NGF de camundongo, os referidos ao menos dois resíduos Trp são preferencialmente selecionados dentre os resíduos Trp99, Trp21 e Trp76 do NGF de camundongo (vide a Figura 12A). Mais preferencialmente, os referidos ao menos dois resíduos Trp são os resíduos Trp99 e Trp21 do NGF de camundongo. Se a referida neurotrofina for um NGF humano, os referidos ao menos dois resíduos Trp são preferencialmente selecionados dentre os resíduos Trp21, Trp76, Trp99 do NGF humano (vide a Figura 12B). Mais preferencialmente, os referidos ao menos dois resíduos Trp são os resíduos Trp21 e Trp99 de NGF humano.

Se a referida neurotrofina for um NGF de camundongo, os referidos ao menos três resíduos Trp são preferencialmente os resíduos Trp99, Trp21 e Trp76 do NGF de camundongo (vide a Figura 12A).

Se a referida neurotrofina for o NGF humano, os referidos ao menos três resíduos Trp são preferencialmente os resíduos Trp21, Trp76, Trp99 do NGF humano (vide a Figura 12B).

Quando o número de resíduos Tyr e Trp que portam um grupo nitro é de ao menos dois ou superior, esses resíduos podem ser ao menos um resíduo Tyr e ao menos um resíduo Trp (ao menos um grupo nitro em cada um dos referidos resíduos). Se a referida neurotrofina for um NGF de camundongo, o referido pelo menos um resíduo Trp é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Trp99, Trp21 e Trp76 do NGF de camundongo (vide a Figura 12A). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp99 ou Trp21 do NGF de camundongo. Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp99 do NGF de camundongo. Se a referida neurotrofina for um NGF de camundongo, o referido pelo menos um resíduo Tyr é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Tyr52 e Tyr59 do NGF de camundongo (vide a Figura 12A). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF de camundongo. Todas as combinações desses resíduos Tyr e Trp são contempladas pelo presente pedido. Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp99 ou Trp21 do NGF de camundongo, e o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF de camundongo.

Tabela 1: Combinações ilustrativas dos resíduos

Tyr e Trp do NGF de camundongo

NGFde camundongo Trp21 Trp76 Trp99 Tyr 5 2 X X X Tyr79 X X X

Se a referida neurotrofina for um NGF humano,

o referido pelo menos um resíduo Trp é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Trp21, Trp76, Trp99 do NGF humano (vide a Figura 12B). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp21 ou Trp99 do NGF humano. Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp99 do NGF de camundongo. Se a referida neurotrofina for um NGF humano, o referido pelo menos um resíduo Tyr é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Tyr52, Tyr59 do NGF humano (vide a Figura 12B). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF humano.

Todas as combinações desses resíduos Tyr e Trp são contempladas pelo presente pedido. Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Trp é o resíduo Trp99 ou Trp21 do NGF humano, e o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF humano.

Tabela 2: Combinações ilustrativas dos resíduos

Tyr e Trp do NGF humano

NGF humano Trp21 Trp76 Trp99 Tyr52 X X X Tyr79 X X X

Uma neurotrofina modificada da invenção pode

compreender ao menos um resíduo Tyr e ao menos dois resíduos Trp que portam um grupo nitro (ao menos um grupo nitro em cada um dos referidos resíduos).

Se a referida neurotrofina for um NGF de camundongo, os referidos ao menos dois resíduos Trp são preferencialmente selecionados dentre os resíduos Trp99, Trp21 e Trp76 do NGF de camundongo (vide a Figura 12A). Mais preferencialmente, os referidos ao menos dois resíduos Trp são os resíduos Trp99 e Trp21 do NGF de camundongo.

Se a referida neurotrofina for um NGF de camundongo, o referido pelo menos um resíduo Tyr é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Tyr52 e Tyr59 do NGF de camundongo (vide a Figura 12A). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF de camundongo. Todas as combinações desses resíduos Tyr e Trp são contempladas pelo presente pedido. Mais preferencialmente, os referidos ao menos dois resíduos Trp são os resíduos Trp99 e Trp21 do NGF de camundongo, e o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF de camundongo.

Se a referida neurotrofina for um NGF humano, os referidos ao menos dois resíduos Trp são preferencialmente selecionados dentre os resíduos Trp21, Trp76, Trp99 do NGF humano (vide a Figura 12B). Mais preferencialmente, os referidos ao menos dois resíduos Trp são os resíduos Trp21 e Trp99 de NGF humano.

Se a referida neurotrofina for um NGF humano, o referido pelo menos um resíduo Tyr é preferencialmente selecionado dentre os resíduos Tyr52, Tyr59 do NGF humano (vide a Figura 12B). Mais preferencialmente, o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF humano.

Todas as combinações desses resíduos Tyr e Trp são contempladas pelo presente pedido. Mais preferencialmente, os referidos ao menos dois resíduos Trp são os resíduos Trp99 e Trp21 do NGF humano, e o referido ao menos um resíduo Tyr é o resíduo Tyr52 do NGF humano.

Uma neurotrofina modificada da invenção pode compreender ao menos dois resíduos Tyr e ao menos dois resíduos Trp da referida neurotrofina que portam um grupo nitro (ao menos um grupo nitro em cada um dos referidos resíduos).

Uma neurotrofina modificada da invenção pode compreender ao menos um resíduo Tyr e ao menos três resíduos Trp da referida neurotrofina que portam um grupo nitro (ao menos um grupo nitro em cada um dos referidos resíduos).

Evidentemente, qualquer combinação do número de resíduos Tyr e do número de resíduos Trp é contemplada pela presente invenção. Por exemplo, o NGF de camundongo tem três resíduos Trp e dois resíduos Tyr (vide a Figura 12A); e o NGF humano tem dois resíduos Tyr e três resíduos Trp (vide a Figura 12B).

A referida neurotrofina nitrada pode compreender ao menos um resíduo Met que é oxidado (por exemplo, Met=O). Se a referida neutrofina for o NGF de camundongo, o referido ao menos um resíduo Met é preferencialmente o resíduo Met9 do NGF de camundongo (maduro) (vide a Figura 12A; resíduo M na posição 9 na SEQ ID N0:1). Uma neurotrofina modificada da invenção pode ser em uma forma não-glicosilada, ou em uma forma glicosilada.

A invenção também se refere a aglutinantes, que são compostos ou composições que se ligam a pelo menos uma neurotrofina modificada da invenção, mais particularmente, a pelo menos uma neurotrofina nitrada da invenção. As neurotrofinas nitradas particularmente compreendem NGF nitrado, BDNF nitrado, NT-3 nitrada, NT-4/5 nitrada e NT-6 nitrada. Um aglutinante ilustrativo seria um anticorpo. A invenção refere-se mais particularmente a aglutinantes específicos, que se ligam especificamente a tal(is) neurotrofina(s) modificada(s).

Aglutinantes específicos da invenção particularmente incluem os compostos ou composições que se ligam a pelo menos uma neurotrofina modificada, mais particularmente a pelo menos uma neurotrofina nitrada (por exemplo, NGF nitrado, BDNF nitrado, NT-3 nitrada, NT-4/5 nitrada, NT-6 nitrada), sem ligar-se à neurotrofina nativa não modificada da qual se deriva a referida pelo menos uma neurotrofina modificada (por exemplo, NGF nativa não-nitrado, BDNF nativo não-nitrado, NT-3 nativo não nitrada, NT-4/5 não- nitrada, NT-6 nativa não-nitrada, respectivamente). Tal aglutinante específico pode se ligar, por exemplo, a pelo menos duas neurotrofinas nitradas da invenção (por exemplo, NGF nitrado e BDNF nitrado), sem ligar-se aos dois dímeros de neurotrofina não-nitrada, dos quais se derivam as referidas pelo menos duas formas nitradas (por exemplo, os dímeros de NGF e BDNF não-nitrado).

Mais preferencialmente, um aglutinante específico da invenção não se liga a nenhuma neurotrofina não-nitrada (ele não se liga a nenhum NGF não-nitrado, a nenhum BDGN não-nitrado, a nenhuma NT-3 não-nitrada, a nenhuma NT-4/5 não-nitrada e a nenhuma NT-6 não-nitrada).

De preferência, um aglutinante específico da invenção se liga a um NGF nitrado da invenção, sem se ligar ao dímero de NGF não-nitrado, do qual se deriva o referido NGF nitrado. Mais preferencialmente, tal aglutinante específico "nitro- NGF" não se liga a nenhum dímero de NGF não-nitrado. Mais preferencialmente, tal aglutinante específico "nitro-NGF" não se liga a nenhuma neurotrofina não-nitrada (ele não se liga a nenhum NGF não-nitrado, a nenhum BDGF não-nitrado, a nenhuma NT-3 não-nitrada, a nenhuma NT-4/5 não-nitrada e a nenhuma NT-6 não-nitrada).

Tal aglutinante específico "nitro-NGF" pode, contudo, ligar-se também a pelo menos uma neurotrofina nitrada selecionada dentre o BDNF nitrado, a NT-3 nitrada, a NT-4/5 nitrada e a NT- 6 nitrada da invenção.

De preferência, um aglutinante ou aglutinante específico da invenção não se liga à glicose. De preferência, ele não compreende nenhum sítio de ligação funcional para a glicose.

De preferência, um aglutinante ou aglutinante específico da invenção modula, mais preferencialmente inibe ou bloqueia a atividade de pelo menos uma da(s) neurotrofina(s) modificada(s) à(s) qual(is) se liga o referido aglutinante ou aglutinante específico. O referido aglutinante ou aglutinante específico pode, por exemplo, inibir ou bloquear o efeito pró- apoptótico que é exercido pela referida pelo menos uma neurotrofina modificada sobre os neurônios motores e/ou inibir ou bloquear o efeito de estimulação e/ou indução do crescimento neurítico exercido pela referida pelo menos uma neurotrofina modificada sobre os gânglios sensoriais.

De preferência, um aglutinante ou aglutinante específico da invenção não se liga à pró-neurotrofina não-nitrada (isto é, a pró-neurotrofina nativa), da qual se deriva a neurotrofina madura nativa não modificada. Mais preferencialmente, um aglutinante ou aglutinante específico da invenção não se liga a nenhuma pró-neurotrofina não nitrada (isto é, a nenhuma pró- neurotrofina nativa).

Um aglutinante ou aglutinante específico da invenção pode, contudo, se ligar à neurotrofina nitrada, bem como à pró- neurotrofina nitrada.

Outros aglutinantes ou aglutinantes específico da invenção podem se ligar à neurotrofina nitrada sem se ligar à pró-neurotrofina nitrada.

Mais preferencialmente, um aglutinante ou aglutinante específico da invenção não se liga à p75NTR e/ou ao TrkA.

O referido aglutinante pode, por exemplo, se ligar a um epítopo nitrado selecionado dentre QYFFETK (SEQ ID NO: 7), sendo que o resíduo Tyr (Y) na posição 2 desses epítopos porta ao menos um grupo nitro. Esse resíduo Tyr corresponde ao Tyr52 do NGF de camundongo, ou ao Tyr52 do NGF humano. Esse resíduo Tyr encontra-se altamente conservado.

O referido aglutinante ou aglutinante específico da invenção pode, de forma vantajosa, ser um anticorpo, ou uma substância química que mimetiza a função de tal anticorpo.

Anticorpo e mimetizadores de anticorpos:

O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal (por exemplo, um soro policlonal), incluindo, mas sem a isto se limitar, um anticorpo totalmente formado, um anticorpo de cadeia única, fragmento Fab e anticorpo quimérico, anticorpo humanizado.

O anticorpo da presente invenção também pode ser usado em combinação com outros agentes terapêuticos, tais como proteínas, anticorpos e/ou com moléculas direcionadoras para almejar especificamente um certo tipo de célula e/ou marcadores de detecção, tal como um radioisótopo, para detectar facilmente o referido anticorpo.

Os meios que possibilitam a produção de anticorpos são conhecidos pelos versados na técnica.

Os animais podem ser imunizados com uma neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta), ou um derivado funcional antigênico desta, de acordo com um método conhecido. Animais apropriados particularmente compreendem mamíferos, mais particularmente, mamíferos não humanos, como coelhos. Por exemplo, um mamífero é injetado por via intraperitoneal ou subcutânea com a referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) ou com um derivado funcional antigênico desta. A referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta), ou derivado funcional antigênico desta, pode ser diluída com, ou suspensa em um volume apropriado de PBS (Solução Salina Tamponada de Fosfato), soro fisiológico ou similar. Um volume apropriado de um adjuvante convencional pode ser misturado com o produto, caso seja necessário ou desejado. Adjuvantes convencionais ilustrativos particularmente compreendem o adjuvante de Freund (completo ou incompleto), géis minerais, como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas, como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina do molusco "keyhole limpet", dinitrofenol, e possivelmente, adjuvantes humanos úteis, como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Pode ser útil conjugar a referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) a uma proteína que seja imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH), soroalbumina, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja, utilizando-se um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfoccinimida (conjugação por meio de resíduos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (por meio de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico ou SOCl2. A solução é ministrada aos animais diversas vezes, por exemplo, a cada 4 a 21 dias. Além disso, um veículo apropriado também pode ser utilizado quando da imunização com um imunógeno.

Os anticorpos policlonais são populações heterogêneas de moléculas de anticorpos, que podem ser derivados dos soros de animais imunizados com a referida ao menos uma neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta), ou um derivado funcional antigênico desta.

Anticorpos monoclonais (mAB), que são populações homogêneas de anticorpos para um antígeno específico, podem ser obtidos por qualquer técnica que possibilite a produção de moléculas de anticorpos por linhagens celulares contínuas em cultura.

Dentre elas está a técnica do hibridoma, de Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497; e

Pat. US No. 4,376,110, a técnica do hibridoma de células B humanas (Kosbor e col. (1983) Immunology Today 4:72 ; Cole e col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 80:2026- 2030, e a técnica do hibridoma-EBV Cole e col. (1985) Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96). Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclasse destas. O hibridoma produzindo um mAB da presente invenção pode ser cultivado in vitro ou in vivo. A produção do mAb da invenção particularmente compreende a coleção de imunócitos, tais como esplenócitos, de um animal imunizado, e a fusão desses imunócitos com um parceiro de fusão.

Como a célula parceira a ser fusionada com o imunócito acima, pode-se utilizar uma célula de mieloma de mamífero. Exemplos de uma linhagem celular de uma célula de mieloma que é preferencialmente utilizada na presente invenção incluem várias linhagens celulares conhecidas, tal como a linhagem celular do mieloma murino SP2/0-Agl4, ou uma linhagem celular de linfócitos B não-maligna / de mieloma de camundongo fusionada, tal como a linhagem celular ATCC HB8464. A fusão celular dos imunócitos acima com células de mieloma pode ser realizada basicamente de acordo com um método conhecido, por exemplo, o método de Kohler e Milstein e col. ( Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Mais especificamente, a fusão celular acima é realizada em uma solução de cultura de nutrição convencional na presença, por exemplo, de um acelerador de fusão celular. Como o acelerador de fusão celular, pode-se utilizar, por exemplo, polietileno glicol (PEG), vírus hemaglutinante do Japão (HJV) ou similar. Se desejado, um adjuvante, como dimetilsulfóxido, também pode ser utilizado em adição para melhorar ainda mais a eficiência de fusão.

Qualquer proporção de imunócitos para células de mieloma pode ser definida para uso na presente invenção. Por exemplo, prefere-se que o número de imunócitos seja de 1 a 10 vezes maior do que o de células de mieloma. Como a solução de cultura a ser utilizada para a fusão celular acima, por exemplo, uma solução de cultura RPMl 1640 ou uma solução de cultura MEM que seja apropriada para o crescimento da linhagem celular de mieloma acima, ou outras soluções de cultura convencionais utilizadas para esse tipo de cultura celular, podem ser utilizadas. Além do mais, um fluido de soro, tal como o soro fetal bovino (FCS), pode ser utilizado em combinação com a mesma.

A fusão celular é realizada misturando-se quantidades suficientes dos imunócitos e células de mieloma mencionados anteriormente na solução de cultura supracitada, adicionando-se uma solução (a uma concentração geral de 30 a 60% (p/v)) de PEG (por exemplo, com um peso molecular médio de aproximadamente 1000 a 6000) pré-aquecida a aproximadamente 37°C, e então misturando-se a solução, de modo a formar células fusionadas alvo (hibridomas). Depois, uma solução de cultura apropriada é adicionada sucessivamente, e então a etapa de remover o sobrenadante por centrifugação é repetida, de modo que os reagentes para a fusão celular, ou similares, desfavoráveis para o crescimento dos hibridomas sejam removidos.

Os hibridomas assim obtidos são selecionados cultivando-se os hibridomas em uma solução de cultura seletiva convencional, tal como uma solução de cultura HAT (uma solução de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). A cultura na solução de cultura HAT acima é continuada por um período de tempo suficiente para as células (células não fusionadas) que não sejam os hibridomas alvo morrerem (normalmente, de sete dias a várias semanas). Subseqüentemente, um método de diluição limitante convencional é realizado, de modo que a triagem e monoclonagem dos hibridomas que produzem um anticorpo alvo sejam efetuadas.

Além de um método com o qual os hibridomas acima são obtidos pela imunização de animais não humanos com antígenos, anticorpos humanos desejados com atividade de ligação com a referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) também podem ser obtidos (vide a Publicação de Patentejaponesa (Kokoku)

N. 1-59878 B (1989)) pela sensibilização de linfócitos humanos in vitro com a referida neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta), ou um derivado antigênico funcional desta, e fazendo com que os linfócitos sensibilizados se fusionem com as células de mieloma derivadas de humanos com um potencial de divisão permanente.

Os hibridomas assim preparados produzindo anticorpos monoclonais podem ser cultivados em passagem em uma solução de cultura convencional, ou podem ser armazenados por um longo período em nitrogênio líquido.

Um exemplo de método empregado para obter anticorpos monoclonais a partir dos hibridomas envolve cultivar os hibridomas e obter anticorpos monoclonais no sobrenadante de cultura de acordo com um método convencional. Outro método envolve administrar os hibridomas a mamíferos que são compatíveis com os hibridomas para fazê-los se proliferar, e obter anticorpos monoclonais nas ascites. O método anterior é adequado para obter anticorpos de alta pureza. Por outro lado, o último método é adequado para a produção em massa de anticorpos.

Um anticorpo monoclonal que pode ser utilizado na presente invenção pode ser um anticorpos monoclonal recombinante que é preparado pela clonagem do gene de anticorpo a partir do hibridoma, incorporação do gene a um vetor apropriado, introdução do vetor em um hospedeiro e induzindo o hospedeiro a produzir os anticorpos monoclonais recombinantes por técnicas de engenharia genética (por exemplo, vide Vandamme, A. M. e col., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767- 775, 1990).

Além da célula hospedeira acima, um animal ou planta transgênica também pode ser utilizado para produzir um anticorpo recombinante.

Além do anticorpo mencionado acima, anticorpos recombinantes de gene alterado artificialmente, como anticorpos quiméricos ou anticorpos humanizados, podem ser utilizados, por exemplo, para reduzir a heteroantigenicidade contra um humano. Esses anticorpos alterados podem ser produzidos utilizando-se um método conhecido. Os anticorpos quiméricos podem ser obtidos, por exemplo, ligando-se o DNA que codifica a região V do anticorpo a um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano, incorporando o produto a um vetor de expressão e então introduzindo o vetor em um hospedeiro para fazer com que o hospedeiro produza os anticorpos. Usando esse método conhecido, os anticorpos quiméricos úteis na presente invenção podem ser obtidos.

Os anticorpos humanizados também são chamados de anticorpos humanos reconformados, os quais são preparados enxertando-se uma CDR (região determinante de complementaridade) de anticorpo de um mamífero que não seja humano, tal como um camundongo, na CDR de um anticorpo humano. The general gene recombination technique thereof is also known (see European Patent Application Publication EP 125023 and WO 96/02576 , or any one of their US counterparts, such as e.g., US 6 068 040 ).

O anticorpo utilizado na presente invenção não se limita à molécula inteira, podendo ser um fragmento do anticorpo ou do produto modificado deste, contanto que ainda se ligue a pelo menos uma neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) e tenha mantido a capacidade de inibir e/ou bloquear o efeito apoptótico exercido pela referida pelo menos uma neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) sobre os neurônios motores e/ou a capacidade de inibir e/ou bloquear o efeito de estimulação e/ou indução exercido pela referida pelo menos uma neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) sobre os gânglios sensoriais.

Anticorpos multivalentes, preferencialmente bivalentes, e um anticorpo monovalente, estão incluídos. Exemplos do fragmento de um anticorpo incluem Fab, F(ab')2, Fv, Fab/c tendo um Fab e um Fc completo, e uma cadeia única Fv (scFv), sendo que o Fv da cadeia-H ou da cadeia L é ligado a um peptídeo de ligação apropriado. Especificamente, um fragmento de anticorpo é sintetizado tratando-se o anticorpo com uma enzima, tal como papaína ou pepsina, ou genes codificando esses fragmentos de anticorpos são construídos, os genes são introduzidos em vetores de expressão e os genes são então expressos por células hospedeiras apropriadas (vide, por exemplo, Rousseaux, J. e col., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669 , e Bird, R. E. e col., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

scFv é obtido ligando-se a região V da cadeia H e a região V da cadeia L dos anticorpos. No scFv, a região V da cadeia Hea região V da cadeia L são ligadas via uma ponte, ou de preferência, um peptídeo de ligação (Huston, J. S. e col., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). A região V da cadeia Hea região V da cadeia L em scFv podem ser derivadas de qualquer um daqueles descritos como anticorpos neste relatório descritivo. Como um peptídeo de ligação para ligar as regiões V, por exemplo, qualquer peptídeo de fita única compreendendo 12 a 19 resíduos de aminoácidos é utilizado.

Um DNA codificando scFv pode ser obtido como segue. A amplificação é realizada pelo método PCR usando, como modelos, o DNA inteiro, ou partes do DNA, codificando as seqüências de aminoácidos desejadas (de um DNA codificando a cadeia H ou a região V da cadeia H do anticorpo acima, e um DNA codificando a cadeia L ou a região V da cadeia L), e usando um par de iniciadores (primers) que especifica ambas as extremidades. A amplificação é então adicionalmente realizada pelo uso combinado de um DNA codificando uma parte de peptídeo de ligação e um par de iniciadores que se especifica para fazer ambas as extremidades se ligarem respectivamente à cadeia H e à cadeia L.

Além do mais, assim que um DNA codificando scFv é preparado, os vetores de expressão contendo os DNAs, e os hospedeiros transformados com os vetores de expressão, podem ser obtidos de acordo com o método convencional. Além disso, pelo uso do hospedeiro, scFv pode ser obtido de acordo com o método convencional.

Esses fragmentos de anticorpos podem ser produzidos usando hospedeiros por meio da obtenção se seus genes de maneira similar ao método acima, e então induzindo a expressão dos genes. O "anticorpo" na presente invenção também engloba esses fragmentos de anticorpos.

Embora as células de mamífero transgênicas (por exemplo, células do ovário de hamsters chineses) cultivadas em cultura sejam o padrão da indústria para a produção do mAb de seqüência completa, as células de mamíferos podem ser menos adequadas à produção de fragmentos de anticorpos, tal como Fab ou scFv, e sistemas de expressão procarióticos (por exemplo, E. colí) ou outros sistemas de expressão eucarióticos, tal como levedura ou células vegetais, podem ser preferencialmente utilizados.

Além do mais, o anticorpo utilizado na presente invenção pode ser um anticorpo bi-específico, que também pode ser preparado por técnicas de engenharia genética.

Os anticorpos expressos e produzidos conforme descrito acima podem ser isolados das células ou animais hospedeiros, e purificados a um nível uniforme. O isolamento e purificação dos anticorpos a serem utilizados na presente invenção podem ser realizados usando colunas de afinidade. Um exemplo de uma coluna que utiliza uma coluna de proteína A é a Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia). Outros métodos de isolamento e purificação convencionais empregados para proteínas podem ser utilizados, não havendo limitação quanto a seu uso. Por exemplo, uma coluna de cromatografia que não seja a coluna de afinidade acima, um filtro, ultrafiltração, um método de precipitação por sais, diálises e similares podem ser apropriadamente selecionados e combinados para uso, de modo que os anticorpos possam ser isolados e purificados (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring HarborLaboratory, 1988).

Substâncias químicas que mimetizam a(s) função(ões) de um anticorpo podem ser produzidas.

Há várias abordagens quanto à estrutura e produção de substâncias químicas que mimetizam a(s) função(ões) de um anticorpo da invenção. Uma abordagem utiliza uma estrutura de proteína alternativa, tal como o citocromo b562, ou estruturas compreendendo ácidos ribonucléicos (RNA) (Hsieh-Wilson e col. 1996, Acc. Chem. Res. 29:164-170).

Oligômeros não naturais, como benzodiazepinas, mimetizadores de ligações entre folhas beta, inibidores da protease e derivados de purina também foram testados quanto à capacidade de funcionar como mimetizadores de anticorpo. Biopolímeros não naturais, tais como oligocarbamatos, oligouréias e oligosulfonas, foram propostos como mimetizadores de anticorpos.

Moléculas com algumas das propriedades de reconhecimento dos anticorpos foram criados unindo-se vários substituintes a esqueletos, tal como xantese ou cubano, ou uma unidade de calixareno. Essas moléculas possuem múltiplos laços de peptídeos como o sítio de reconhecimento, mas construídos em volta da estrutura orgânica relativamente rígida formada pelo esqueleto.

A invenção se refere mais particularmente aos mimetizadores de anticorpos que possuem a capacidade de inibir e/ou bloquear o efeito apoptótico exercido por uma neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) sobre os neurônios motores e/ou de inibir e/ou bloquear o efeito de estimulação e/ou indução exercido por uma neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) sobre os gânglios sensoriais.

Sistemas biológicos para selecionar candidatos para a neurotrofina modificada da invenção: Há várias abordagens para a estrutura e produção dos sistemas biológicos que podem ser usados para selecionar moléculas que competem com uma neurotrofina modificada da invenção (ou de um fragmento conservador ou variante deste).

Um dos sistemas preferidos é um sistema de visualização ribossomal. Um sistema de visualização ribossomal compreende ao menos um ribossomo, ao menos uma proteína e ao menos um RNAm codificando essa proteína. Sistemas de visualização ribossomal vantajosos foram descritos em Hanes and Plückthun 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, vol. 94, páginas 4937-4942. Tais sistemas de visualização ribossomal podem ser aplicados a um anticorpo da invenção, mais particularmente, a um anticorpo específico da invenção, de forma vantajosa, a um scFv da invenção.

Dessa forma, a invenção também se refere a um sistema de visualização ribossomal, que consiste de ao menos um ribossomo, ao qual ao menos um scFv da invenção (mais particularmente, ao menos um scFv específico da invenção), bem como ao menos um RNAm codificando tal scFv, são ligados.

Tais sistemas biológicos, e mais particularmente, tais sistemas de visualização ribossomal, podem ser vantajosamente utilizados para selecionar compostos que se ligam a tal sistema biológico, e de preferência, compostos que competem com ao menos uma neurotrofina modificada da invenção (ou um fragmento conservador ou uma variante conservadora) para ligação com os referidos sistemas biológicos. Tais compostos são, dessa forma, identificados e isolados.

Os compostos preferidos são aqueles que se ligam a um sistema de visualização ribossomal da invenção (que, de preferência, compreende ao menos um ribossomo, ao menos um scFv específico da invenção e ao menos um RNAm codificando esse scFv), sem realizar reação cruzada com (isto é, sem ligar-se a) outro sistema de visualização ribossomal, sendo que o referido outro sistema de visualização ribossomal também compreende ao menos um ribossomo, ao menos um anticorpo (por exemplo, um scFv) e ao menos um RNAm codificando esse anticorpo, mas em que o referido anticorpo (o referido scFv) se liga a ao menos uma neurotrofina, sem se ligar a nenhuma das neurotrofinas modificadas que poderiam ser obtidas a partir disto, ao menos uma neurotrofina.

A invenção se refere mais particularmente aos compostos que possuem a capacidade de modular, de preferência, de inibir e/ou bloquear o efeito apoptótico exercido por uma neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) sobre os neurônios motores e/ou de modular, de preferência, de inibir e/ou bloquear o efeito de estimulação e/ou indução exercido por uma neurotrofina nitrada (ou fragmento ou variante desta) sobre os gânglios sensoriais.

Tais compostos podem exercer sua atividade de modulação, de preferência, sua atividade inibitória ou de bloqueio, competindo com as neurotrofinas nitradas endógenas para ligação com seu(s) alvo(s) endógeno(s), tal como, por exemplo, TrkA, p75NTR, ou outros receptores ou co-receptores, tal como sortilina.

Aplicações terapêuticas e de diagnóstico:

Uma neurotrofina modificada da invenção (ou um fragmento conservador ou variante desta) tem a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico a partir dos gânglios sensoriais. Fragmentos não conservadores de uma neurotrofina modificada podem ser produzidos pelos versados na técnica, por exemplo, pela síntese de peptídeos ou polipeptídeos. Variantes não conservadoras de uma neurotrofina modificada, ou de um fragmento de neurotrofina modificada, que se derivam da referida neurotrofina modificada, ou fragmento de neurotrofina modificada, por pelo menos uma substituição e/ou deleção e/ou adição de aminoácido, também podem ser produzidas pelos versados na técnica, por exemplo, pela síntese de peptídeos ou polipeptídeos.

Tais fragmentos ou variantes não conservadores perderam a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico, ou no mínimo não apresentam uma capacidade detectável para tal indução e/ou estimulação quando injetados em um mamífero. Tal fragmento ou variante não conservador pode ser antigênico por conta própria, ou pode ser associado a pelo menos um outro composto (tal como um adjuvante, adicionado em associação, ou por conjugação), para se tornar antigênico, ou para ter uma antigenicidade aumentada.

Tal fragmento ou variante não conservador pode, portanto, ser utilizado como um agente para imunização ativa. Quando administrado a um mamífero, tal como um ser humano que dele necessita, é capaz de induzir e/ou estimular uma resposta imunológica, e mais particularmente, uma resposta de anticorpo, pelo que os anticorpos ligando-se a pelo menos uma neurotrofina modificada da invenção (ou fragmento ou variante conservador desta) estão sendo produzidos pelo referido mamífero.

Fragmentos ou variantes não conservadores preferidos são aqueles capazes de induzir e/ou estimular uma resposta de anticorpo, por meio do que os anticorpos, que se ligam a pelo menos uma neurotrofina modificada da invenção (ou fragmento conservador ou variante desta) mas que não se ligam à neurotrofina nativa (saudável) não modificada, estão sendo produzidos pelo referido mamífero.

Tal fragmento ou variante não conservador é útil como um antígeno para induzir uma resposta imunológica de anticorpo para a terapia e/ou mitigação e/ou prevenção da apoptose dos neurônios motores e/ou do crescimento dos neuritos. Por conseguinte, tal neurotrofina modificada da invenção (ou um fragmento conservador ou variante desta) é útil como um agente para o tratamento e/ou mitigação e/ou prevenção da dor e/ou como um agente para o tratamento e/ou mitigação e/ou prevenção de uma doença ou problema neurodegenerativo. Compostos tais como os que podem ser identificados e isolados pela seleção com um sistema de visualização ribossomal da invenção podem competir com as atividades de uma neurotrofina modificada da invenção (ou um fragmento ou variante conservador desta), bloqueando e/ou inibindo assim a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico a partir dos gânglios sensoriais. Quando administrado a um mamífero, tal como um ser humano que dele necessita, tal composto é útil para bloquear e/ou inibir a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico a partir dos gânglios sensoriais.

Um aglutinante da invenção, tal como um anticorpo da invenção, e mais particularmente, um anticorpo específico da invenção, se liga a uma neurotrofina modificada da invenção (ou um fragmento conservador ou variante desta). Tal aglutinante é útil como um agente para imunização passiva. Quando administrado a um mamífero, tal como um ser humano que dele necessita, tal aglutinante irá se ligar à referida neurotrofina modificada da invenção (ou um fragmento conservador ou variante desta), com isso bloqueando e/ou inibindo a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico a partir dos gânglios sensoriais. Tal aglutinante é útil como um agente para bloquear e/ou inibir a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico a partir dos gânglios sensoriais.

Tal aglutinante é útil como um agente para a terapia de imunização passiva e/ou atenuação e/ou prevenção da apoptose dos neurônios motores e/ou do crescimento dos neuritos. Por conseguinte, tal aglutinante é útil como um agente para o tratamento e/ou mitigação e/ou prevenção da dor e/ou como um agente para o tratamento e/ou mitigação e/ou prevenção de uma doença ou problema neurodegenerativo.

A invenção também está relacionada a qualquer composição que compreenda:

- ao menos um elemento selecionado dentre o grupo que compreende os fragmentos não conservadores e as variantes não conservadoras da invenção, ou que compreenda

- ao menos um dos referidos compostos candidatos, ou que compreenda

- ao menos um elemento selecionado dentre o grupo que compreende os aglutinante da invenção (mais particularmente, os aglutinantes específicos da invenção, ainda mais particularmente os anticorpos, os mimetizadores químicos e os mimetizadores biológicos da invenção).

Tais composições podem compreender ainda pelo menos um elemento selecionado dentre excipiente, diluente, tampão, veículo farmacêutico, veículo fisiologicamente aceitável, adjuvantes.

A invenção também se refere a tais composições farmacêuticas, composições imunogênicas, composições imunológicas, fármacos ou vacinas.

Quando usado como antígeno para imunização ativa, pelo menos um elemento selecionado dentre o grupo que compreende os fragmentos não conservadores e os variantes não conservadores da invenção, ou um equivalente antigenicamente funcional destes, pode ser administrado a um mamífero, de preferência um humano, por uma variedade de vias. Quando utilizado para imunização passiva, o aglutinante da presente invenção (e mais particularmente um aglutinante específico, por exemplo, um mAb específico), ou um equivalente antigenicamente funcional deste, pode ser administrado a um mamífero, de preferência um humano, por uma variedade de vias. Essas vias particularmente incluem via oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, tópica, transdérmica, sublingual, intramuscular, retal, transbucal, intranasal, lipossomal, via inalação, vaginal, intra-ocular, via distribuição local (por exemplo, por cateter ou stent), subcutânea, intra-adiposa, intra- articular ou intratecal. O anticorpo também pode ser administrado ao hospedeiro localmente (por exemplo, via stents ou cateteres) e/ou por liberação gradual.

Um aglutinante da invenção (por exemplo, um Ab), e mais particularmente, um aglutinante específico da invenção (por exemplo, um mAb específico), também é útil para determinar a presença, ou a presença excessiva, de uma neurotroflna modificada da invenção (ou um fragmento conservador ou variante desta) em um animal, tal como um mamífero (por exemplo, um ser humano), e mais particularmente, em uma mostra coletada de tal animal. A presença excessiva de tal neurotrofina modificada da invenção (ou um fragmento conservador ou variante desta) indica a existência ou o risco de desenvolver uma doença ou problema neurodegenerativo, ou uma condição de dor. Um aglutinante da invenção (por exemplo, um Ab), e mais particularmente, um aglutinante específico da invenção (por exemplo, um mAb específico), é, portanto, útil para o diagnóstico da existência, ou do risco de desenvolver uma condição ou doença envolvendo a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico.

As doenças ou condições nas quais se torna útil bloquear e/ou inibir a apoptose dos neurônios motores particularmente compreendem condições ou doenças neurodegenerativas, ALS (Esclerose Lateral Amiotrófica), mal de Alzheimer, mal de Huntington, Esclerose Múltipla, qualquer doença ou condição que envolva um déficit de memória e/ou problemas de concentração, assim como condições ou doenças neuroinflamatórias.

As doenças ou condições nas quais se torna útil bloquear e/ou inibir o crescimento neurítico a partir dos gânglios sensoriais particularmente compreendem estados, condições ou sensações dolorosas, e mais particularmente:

dor neuropática (mais particularmente, enxaqueca, enxaqueca crônica, dor de cabeça por provável abuso de analgésicos PAAH, síndrome da fibromialgia primária PFMS, dor neuropática induzida por lesões nervosas, lesões no nervo ciático, lesões de constrição crônica),

- dor articular (mais particularmente, condições osteoartríticas, osteoartrose, osteoartrite),

- dor inflamatória,

- dor cancerosa.

A invenção também se refere a qualquer composição que compreenda ao menos um elemento selecionado dentre o grupo que compreende as neurotroflnas modificadas da invenção, seus fragmentos conservadores e as variantes conservadoras de tal neurotrofina modificada ou de tal fragmento conservador.

Tais composições podem compreender ainda pelo menos um elemento selecionado dentre excipiente, diluente, tampão, veículo farmacêutico, veículo fisiologicamente aceitável, adjuvantes. A invenção também se refere a tais composições farmacêuticas, composições imunogênicas, composições imunológicas, fármacos ou vacinas.

Tais composições são úteis para induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico. Dessa forma, elas são úteis para a prevenção e/ou tratamento e/ou mitigação das doenças ou condições e que a estimulação e/ou indução da apoptose dos neurônios motores e/ou do crescimento neurítico é desejada, de preferência, para a prevenção e/ou tratamento e/ou paliação de doenças ou condições nas quais a estimulação e/ou indução do crescimento neurítico é desejada, tais como doenças, condições ou traumas que resultam em neuropatia e lesões nervosas, inclusive derrames, lesões na medula espinhal e doenças neurodegenerativas.

O presente pedido também se refere a um método para determinar se há uma modificação pós-traducional anormal de uma estrutura de neurotrofína, em uma amostra suspeita de conter tal estrutura de neurotrofína, o qual compreende determinar se um aglutinante da invenção, tal como um anticorpo da invenção, mais particularmente, um aglutinante específico da invenção, tal como um anticorpo específico da invenção, liga-se a um alvo contido na referida amostra, por meio do que tal ligação indica a presença, na referida amostra, de uma estrutura de neurotrofína que sofreu modificação pós-traducional anormal.

A referida modificação pós-traducional anormal particularmente compreende a nitração da referida estrutura de neurotrofína, conforme explicado acima e como ilustrado adiante.

A presente invenção também se refere a um método e a um kit para o diagnóstico de uma doença ou condição que envolva a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico, tais como as doenças e condições acima listadas. O kit da invenção compreende ao menos um aglutinante da invenção, tal como pelo menos um anticorpo da invenção, mais particularmente, pelo menos um aglutinante específico da invenção, tal como pelo menos um anticorpo específico da invenção. O método de diagnóstico da invenção compreende determinar se um aglutinante da invenção, tal como um anticorpo da invenção, mais particularmente, um aglutinante específico da invenção, tal como um anticorpo específico da invenção, liga-se a um alvo (isto é, um ligante) contido no mamífero que é submetido ao referido diagnóstico, de preferência em uma amostra representativa coletada de tal mamífero (isto é, uma amostra suspeita de conter estrutura de neurotrofina), pelo que tal ligação indica o fato de o referido mamífero portar a referida doença ou condição, ou estar sob alto risco de desenvolver tal doença ou condição. Assim, no presente pedido, o termo "diagnóstico" abrange a determinação de qualquer doença ou condição existente, assim como o prognóstico de seu desenvolvimento, ou no mínimo, a avaliação da propensão do paciente em desenvolver tal doença ou condição.

Método de triagem:

A invenção também se refere a um método de triagem dos compostos capazes de inibir e/ou bloquear a atividade apoptótica que uma neurotrofina modificada da invenção (ou um fragmento conservador ou variante desta) pode ter sobre os neurônios motores, e/ou o efeito de crescimento neurítico que uma neurotrofina modificada da invenção (ou um fragmento conservador ou variante desta) pode ter sobre os gânglios sensoriais.

Os compostos candidatos podem ser selecionados quanto a sua capacidade de ligar-se a pelo menos um aglutinante da invenção (por exemplo, pelo menos um anticorpo da invenção), mais particularmente a pelo menos um aglutinante específico da invenção (por exemplo, pelo menos um anticorpo específico da invenção, tal como um mAb específico da invenção), ou a pelo menos um sistema de visualização ribossomal da invenção, pelo que tal capacidade de ligação indica o potencial de inibir e/ou bloquear a referida atividade apoptótica e/ou o referido efeito de crescimento neurítico.

Os compostos preferidos são aqueles que não se ligam a um mAb que é específico na neurotrofina nativa não modificada (isto é, um mAb, que se liga à neurotrofina nativa não modificada, sem se ligar à neurotrofina modificada que dela se deriva).

O termo "compreendendo", que é sinônimo do termo "incluindo" ou "contendo", é aberto, e não exclui elemento(s), ingrediente(s) ou etapa(s) de método adicional(is) não citado(s), ao passo que o termo "consistindo de" é um termo fechado, que exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente adicional não declarado de forma explícita. O termo "consistindo essencialmente de" é um termo parcialmente aberto, que não exclui elemento(s), etapa(s) ou componente(s) adicionais não citados, contanto que esse(s) elemento(s), etapa(s) ou componente(s) não afetem materialmente as propriedades básicas e novas da invenção. O termo "compreendendo" (ou "compreende(m)"), portanto, inclui o termo "consistindo de" ("consiste(m)" de"), bem como o termo "consistindo essencialmente de" ("consiste(m) essencialmente de"). Logo, o termo "compreendendo" (ou "compreende(m)"), no presente pedido, deve englobar mais particularmente o termo "consistindo de" ("consiste(m)" de") e o termo "consistindo essencialmente de" ("consiste(m) essencialmente de").

Cada uma das revelações relevantes de todas as referências aqui citadas é incorporada especificamente a título de referência. Os seguintes exemplos são apresentados a título de ilustração, e não a título de limitação.

EXEMPLOS

Resumo

A superexpressão do fator de crescimento nervoso (NGF) e a produção aumentada de peroxinitrito ocorrem em várias doenças neurodegenerativas. Os inventores investigaram se o NGF poderiam passar pela modificação oxidativa ou nitrativa pós-traducional que modularia sua atividade biológica. Comparado ao NGF nativo, o NGF tratado com peroxinitrito apresentou a capacidade excepcional de induzir a apoptose dos neurônios motores dependente do p75NTR a concentrações fisiologicamente relevantes. Embora o NGF nativo necessita de uma fonte externa de óxido nítrico (NO) para induzir a morte dos neurônios motores, o NGF tratado com peroxinitrito induziu a apoptose dos neurônios motores na ausência do NO exógeno. Contudo, o NO potencializou a atividade apoptótica do NGF modificado com peroxinitrito. Os anticorpos de bloqueio para p75NTR ou a infraregulação da expressão de p75 pelo tratamento de sentido negativo impediu a apoptose dos neurônios motores induzida pelo NGF tratado com peroxinitrito. Os inventores investigaram se as modificações oxidativas estavam induzindo esse ganho tóxico de função e verificaram a nitração da torisona induzida por peroxinitrito de maneira dependente da dose. Além do mais, o peroxinitrito desencadeou a formação de oligômeros estáveis de altíssimo peso molecular de NGF, apesar de nenhuma evidência da reticulação de 3,3'-ditirosina ter sido observada. A prevenção da nitração da tirosina pelo urato aboliu o efeito do peroxinitrito sobre a atividade apoptótica do NGF. Esses resultados indicam que a oxidação do NGF pelo peroxinitrito melhora a atividade apoptótica do NGF através do p75NTR em 10.000 vezes. Até onde sabemos, essa é a primeira modificação pós-traducional conhecida que transforma uma neurotrofina em um agente apoptótico.

Introdução

Os inventores investigaram se o NGF poderiam passar pela modificação oxidativa ou nitrativa pós-traducional, alterando sua atividade biológica. Nós relatamos que a oxidação do NGF pelo peroxinitrito in vitro provoca a nitração e induz a formação de oligômeros de altíssimo peso molecular. Além do mais, essas modificações oxidativas conferem a capacidade excepcional de induzir a apoptose dos neurônios motores dependente do p75NTR a concentrações fisiológicas relevantes. Nossos dados mostram que o estresse oxidativo pelo peroxinitrito pode modular criticamente a atividade da neurotrofina. Materiais e Métodos

Tratamento com peroxinitrito. O peroxinitrito encontra-se particularmente disponível pela Upstate (por exemplo, a Upstate USA, Charlottesville, VA 22903, EUA). A concentração de peroxinitrito foi determinada por espectrofotometria a 302 nm (ε = 1.670 M "1Cm"1). Soluções estoque diluídas foram recém-preparadas em NaoH 0,01 M. As reações do NGF (Harlan; Indianápolis, EUA) com diferentes concentrações de peroxinitrito (0,25 mM a 2 mM) foram realizadas a uma concentração protéica de 0,2 mg/mL a 1,0 mg/mL, obtendo resultados similares. A reação foi realizada em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4, contendo bicarbonato de sódio 20 mM. O NGF foi sujeito a 10 adições de bólus de peroxinitrito (cada uma de 1 μι) para atingir a concentração final desejada de peroxinitrito. Um bolo de solução estoque de peroxinitrito foi rapidamente adicionada ao topo do tubo de ensaio e misturado por agitação em vórtice por 3 segundos. O procedimento foi repetido 10 vezes. Para eliminar o possível efeito não específico do tratamento com peroxinitrito por causa das alterações de pH ou dos contaminantes, os experimentos de controle foram realizados utilizando-se NaoH ou peroxinitrito decomposto (adição em ordem inversa, ROA). O tratamento da soroalbumina bovina (Sigma), FGF-I (Sigma) e FGF-2 (R&D Systems) com peroxinitrito foi realizado conforme descrito anteriormente, a uma concentração de 0,2 mg/mL. Nitração do NGF por tetranitrometano. A

reação do NGF (Harlan) com um excesso molar de 40 vezes de tetranitrometano (Sigma) foi realizada a uma concentração protéica de 1 mg/mL em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 por 40 minutos. A reação foi terminada passando-se a mistura de reação por uma coluna Sephadex G-25 equilibrada com e desenvolvida em bicarbonato de amônio 0,05 M, pH 8,0.

Análise Eletroforética e Western Blot. SDS- PAGE foi realizado em minigéis de poliacrilamida a 15% sob condições de redução. As amostras foram fervidas por 5 min em tampão LaemLi antes da corrida. As proteínas foram visualizadas por coloração com Azul Coomassie ou Prata. Para a análise Western Blot, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Hybond-ECL, Amersham). As membranas foram bloqueadas por 2h em solução de bloqueio (BSA a 5%, Tween 20 a 0,1 % em solução salina tamponada com Tris (TBS), pH 7,4) seguido de uma incubação noturna com o anticorpo primário diluído em solução de bloqueio. Após a lavagem com Tween a 0,1% em TBS, a membrana foi incubada com anticorpo anti- coelho produzido em cabra conjugado com peroxidase (1:4000; Bio-Rad) por 1 h, e então lavada e revelada com o sistema de detecção quimioluminescente ECL (Amersham). Os anticorpos primários utilizados foram o anticorpo policlonal anti-NGF-β (1:3000; Chemicon) e o anticorpo policlonal para a nitrotirosina (1:3500; Upstate). Cromatografia de exclusão por tamanho combinada com espalhamento de luz multiângulo. Amostras de NGF tratadas com peroxinitrito (1 mM) ou peroxinitrito decomposto a uma concentração de 0,5 mg/mL foram injetadas em uma coluna de exclusão por tamanho Biosuite 125 HPLC (Waters) conectada em linha com um Detector de Espalhamento de Luz Multiângulo DAWN-EOS e um refratômetro OptilabRex (Wyatt Tech. Corp.). A coluna de HPLC foi equilibrada com e revelada em fosfato de sódio 50 mM, tampão sulfato de sódio 50 io mM, pH 7,2. A unidade de espalhamento de luz foi calibrada seguindo as instruções do fabricante. Um valor de 0,185 mL/g foi considerado para o dn/dc da proteína. As respostas do detector foram normalizadas medindo-se o sinal para a soroalbumina bovina monomérica. A temperatura da unidade de espalhamento de luz e do refratômetro foi mantida a 25 0C. A coluna e todas as conexões externas estavam à temperatura ambiente (aproximadamente 25°C). A vazão foi mantida a 0,5 mL/minuto durante todos os experimentos.

Estudos de Espectrometria de Massa. Amostras de NGF nativo ou NGF tratado com tetranitrometano ou peroxinitrito (1 mM) a uma concentração de 1 mg/mL foram separadas por cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa (HPLC). A fase estacionária era uma coluna Supelco de fase inversa Ci8 (15cm χ 4,6 mm, 5 μΜ). A fase móvel foi H20/CH3 CN e ácido trifluoroacético a 0,1 %. Um gradiente linear aumento de 5% para 60% orgânico durante 55 minutos foi utilizado para obter a separação. As amostras foram coletadas por um coletor de fração, concentradas in vácuo, e resuspensas para serem divididas para análise espectrométrica de massa para alterações de massa molecular totais ou análise da digestão tríptica. Para encontrar alterações totais no peso molecular, as frações coletadas foram resuspensas em acetonitrilo a 30% com ácido fórmico a 0,1% e então injetadas diretamente em um espectrômetro de massa de tempo de vôo com ionização por "electrospray" Waters/micromass LCT Classic. A fase móvel era acetonitrilo a 30%, ácido fórmico a 0,1% com vazão de 5 μί / min. A tensão capilar era de 3,018 kV, a temperatura de origem 80°C e a tensão do cone de amostra era de 45 V. As digestões trípticas foram realizadas por resuspensão em uma solução de RapiGest™ a 0,1% em tampão bicarbonato de amônio 50 mM e

TM

foram realizadas de acordo com o protocolo RapiGest SF Powder. Brevemente, as amostras foram reduzidas com DTT e bloqueadas com IAA antes da incubação com tripsina (1:50 μg de tripsina: μg de proteína) durante a noite a 37°C. Adicionou-se TFA às amostras protéicas digeridas a uma concentração final de 0,5% e as amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por dez minutos. Um sistema HPLC NanoAcquity Waters foi utilizado para injetar as amostras no espectrômetro de massa Waters Q-tof Ultima Global. As amostras foram carregadas a 2μΙ7ηιΐη sobre uma armadilha Júpiter Q 8 e então lavadas por seis minutos com água e ácido fórmico a 0,1 % a 1 μί/ηπη. As amostras foram eluídas usando um gradiente (0,26 μL/min) que começou em acetonitrilo a 2%, ácido fórmico a 0,1% e aumento para orgânico a ~2%/min durante 45 minutos. As amostras foram separadas sobre o material Waters BEH Cis em uma coluna de 10 cm New Objective pico-frit e então injetadas usando uma fonte Waters Nano Lockspray com a tensão capilar de eletrospray a 3,5 kV e tensão de origem de 70 kV. A espectrometria de massa em tandem dependente dos dados foi realizada com a energia de colisão que era dependente da m/z do íon pai. Os espectros MS foram pesquisados usando o mecanismo de pesquisa de íons MS/MS Mascot e os peptídeos relataram pontuações recebidas de identidade ou superior.

Culturas de neurônios motores purificadas. Os meios e soros foram adquiridos na Gibco-Invitrogen. As culturas de neurônios motores foram preparadas a partir da medula espinhal de ratos no 15° dia embriônico (El5) por uma combinação de centrifugação por gradiente metrizamida e "immunopanning" com um anticorpo monoclonado direcionado contra o

p75NTR de rato (Ig 192 mAb de camundongo) conforme descrito anteriormente [44], Os neurônios motores foram plaqueados a uma densidade de 350 células/cm em multiplacas de 4 poços (Nunclon) pré-recobertas com poliornitina-laminina. As culturas foram mantidas em meio Neurobasal™ suplementado com soro eqüino a 2%, L-glutamato a 25 mM, 2-mercaptoetanol a μΜ, L-glutamina a 0,5 mM e suplemento B-27 a 2% (Gibco- Invitrogen). A sobrevivência dos neurônios motores foi mantida pela adição de GDNF (1 ng/mL; Sigma) aos meios de cultura. A morte dos neurônios motores induzida pela privação do fator trófico (ΝΟΝΕ, sem GDNF) foi determinada em todos os experimentos como um controle, e nunca foi maior do que 50%. Tratamentos com os diferentes reagentes foram realizados 3 horas depois do plaqueamento dos neurônios motores. A sobrevivência dos neurônios motores foi avaliada após 48 hora pela contagem direta de todas as células que apresentavam neuritos intactos com mais de 4 corpos celulares de diâmetro, em uma área pré-fixada da placa.

Tratamento de sentido negativo. O tratamento

com oligonucleotídeos de sentido negativo para infraregular a expressão de p75NTR foi realizado conforme descrito anteriormente [45]. Brevemente, oligonucleotídeos de sentido negativo e trocado de fosforotioato purificado por HPLC (5 μΜ; Integrated DNA Technologies) foram adicionados à suspensão celular de neurônios motores purificados e pipetados repetidamente antes da semeadura. Os oligonucleotídeos estiveram presentes durante todo o tempo de cultura. Para determinar a eficiência de absorção, as culturas foram incubadas com oligonucleotídeos de sentido negativo p75NTR com uma marca fluorescente 5' 56-FAM. As células foram transfectada para o estágio aquecido (37°C) de um microscópio confocal Zeiss LSM510 com CO2 a 5% constante. A fluorescência foi representada por imagem com uma objetiva de imersão em óleo 63X. A eficiência de absorção foi de >96% em todos os experimentos. As seqüências utilizadas foram: p75NTR sentido negativo, 5'-ACCTGCCCTCCTCATTGCA-3' (SEQ ID NO: 5) e p75NTR sentido trocado, 5'-CTCCCACTCGTCATTCGAC-3' (SEQ ID NO: 6) [45]. A seqüência de sentido negativo utilizada demonstrou ser eficaz na inibição da morte dos neurônios motores dependente do p75NTR in vivo [20].

Estatísticas. Cada experimento foi repetido ao menos três vezes, sendo os dados apresentados como média ± DP. A comparação dos meios foi realizada pela análise de variância unidirecional. O contraste em pares entre os meios utilizou o teste de Student-Newman-Keuls, sendo as diferenças declaradas como estatisticamente significativas se p<0,05. Todos os cálculos estatísticos foram realizados usando o programa SigmaStat (Jandel Scientific).

Secreção de nitro-NGF pelos astrócitos estimulados. Meios condicionados (concentrados em 40x por ultrafiltração) a partir de astrócitos estimulados ou em repouso (FGF1, lOng/mL; e LPS5 5 microg/mL) foram analisados por "western blotting" usando um anticorpo anti-nitro-NGF específico. NGF padrão (50 ng, Harlan) ou nitro-NGF (50 ng) foram carregados nas duas primeiras pistas. O anticorpo anti- nitro-NGF específico que foi utilizado é um anticorpo policlonal, que foi obtido pela imunização de coelhos contra o nitro-NGF que é obtido pela nitração do NGF de camundongo comercialmente disponível por peroxinitrito e pelo isolamento das espécies nitro- NGF que são dessa forma produzida. O anticorpo anti-nitro-NGF específico foi selecionado por ligar-se ao nitro-NGF sem que ocorra reação cruzada com o NGF padrão não nitrado.

O peroxinitrito aumenta o crescimento neurítico, promovendo a atividade do NGF. Explantes dos gânglios da raiz dorsal de embriões de ratos El5 (que expressam tanto TrkA como p75NTR) foram cultivados em meios neurobasais na ausência de fatores tróficos (NONE) ou na presença de NGF (100 ng/mL), NGF tratado com peroxinitrito (100 ng/mL; nitroNGF-P) ou NGF tratado com tetranitrometano (nitroNGF- TNM). Após 24 horas, as culturas foram fixadas com paraformaldeído a 4% e processadas para imunofluorescência contra GAP-43. Note que os gânglios tratados com nitroNGF apresentaram crescimento neurítico aumentado quando comparado aos tratados com NGF. Resultados

A oxidação por peroxinitrito melhora a atividade apoptótica do NGF

Em culturas mantidas com GDNF (1 ng/mL), os neurônios motores expressando p75NTR não são sensíveis ao NGF. No entanto, o NGF tratado com peroxinitrito induziu a morte dos neurônios motores a concentrações que chegam a valores tão baixos quanto 1 ng/mL (Figura 2A). O NGF tratado com peroxinitrito decomposto (ROA) não afetou a sobrevivência dos neurônios motores (Figura 2A). O tratamento com peroxinitrito melhorou a atividade apoptítica do NGF de maneira dependente da dose, atingindo um patamar a concentrações maiores do que 0,5 mM de peroxinitrito (Figura 2B). Conforme relatado anteriormente [25], na presença de uma concentração de estado estacionário de óxido nítrico <50 nM, gerado a partir do doador de óxido nítrico DETA-NONOato (10 μΜ), NGF-ROA induziu significativamente a perda de neurônios motores a concentrações superiores a 10 ng/mL (Figura 2C). Além do mais, na presença de óxido nítrico, o NGF modificado com peroxinitrito apresentou maior atividade apoptótica, induzindo 33% de perda de neurônios motores a apenas 1 pg/mL (Figura 2C). A adição de BSA, FGF-I ou FGF-2 tratado com peroxinitrito às culturas de neurônios motores não induziu a morte dos neurônios motores (Figura 2D), sugerindo-nos um efeito específico do NGF tratado com peroxinitrito.

A perda de neurônios motores induzida pelo NGF tratado com peroxinitrito foi bloqueada pelo inibidor geral da caspase DEVD- fmk (Figura 3A), indicando a ativação de um mecanismo apoptótico. Nós mostramos antes que o NGF induz a apoptose dos neurônios motores pela sinalização através de p75NTR [25]. A apoptose induzida pelo NGF tratado com peroxinitrito também dependia da ativação de p75NTR, uma vez que ela foi completamente impedida pela adição de anticorpos de bloqueio para p75NTR (Figura 3A) ou pela infraregulação da expressão de p75NTR pelo tratamento de sentido negativo (Figura 3B). Como controle, o tratamento de sentido negativo também bloqueou a apoptose dos neurônios motores induzida pelo NGF nativo na presença de óxido nítrico (Figura 3B). A apoptose dos neurônios motores induzida por diferentes estímulos apoptóticos, inclusive NFG, exige a produção endógena de peroxinitrito [25, 46-48]. A perda de neurônios motores induzida pelo NGF tratado com peroxinitrito foi impedida pelo inibidor da sintase de óxido nítrico geral (NOS), L-NAME (1 mM) ou pelo mimérico SOD e catalisador da decomposição de peroxinitrito, MnTBAP (100 μΜ) (Figura 3C), confirmando mais uma vez a execução de um mecanismo apoptótico similar.

Peroxinitrito induz a oligomerização e nitração do NGF

Em seguida, analisamos as modificações induzidas pelo tratamento com peroxinitrito sobre o NGF. A exposição de NGF a sucessivas adições em bólus de peroxinitrito provocou um surgimento dependente da dose de três espécies de alto peso molecular, conforme revelado pelo SDS-PAGE. A intensidade de coloração do NGF nativo diminuiu progressivamente com o aumento na concentração de peroxinitrito (Figura 4A). O tratamento do NGF com peroxinitrito decomposto (ROA) falhou ao induzir esse desvio de migração. A formação dos oligômeros de NGF foi confirmada em solução pela cromatografia de exclusão por tamanho HPLC conjugada à análise de espalhamento de luz multiângulo em tempo real (MALS) (Figura 4B). O NGF tratado com peroxinitrito decomposto (NGF-ROA) eluiu a partir da coluna de exclusão por tamanho como um único pico com uma massa correspondendo ao dímero (33,0±1,2 KDa). Em contrapartida, NGF tratado com peroxinitrito eluiu como três picos provavelmente correspondendo ao dímero (33,2±0,6 KDa), tetrâmero (68,5±3,5 KDa) e octâmero (125,0±10,0 KDa). Surpreendentemente, o dímero de NGF tratado com peroxinitrito eluiu antes do dímero nativo (NGF-ROA), refletindo a existência de mudanças conformacionais devido à nitração protéica.

O tratamento com peroxinitrito também induziu a nitração dependente da dose do NGF, conforme revelado pela reatividade com um anticorpo anti-nitrotirosina (Figura 4C). Os sítios específicos das modificações oxidativas foram determinados pela espectrometria de massa dos produtos de oxidação purificados. O NGF nativo eluiu como dois picos pela HPLC de fase inversa, a 36,3 a 38,1 minutos (Figura 5A), ambos identificados como a cadeia de polipeptídeos do NGF por espectrometria de massa. A Cadeia B carece dos oito resíduos N terminais presentes na Cadeia A e é conhecida por ser formada devido à proteólise limitada durante a purificação do NGF [40]. A oxidação do NGF por peroxinitrito resultou na separação incompleta de vários produtos conforme eluído pela HPLC de fase inversa (Figura 5B). A espectrometria de massa da fração tratada com peroxinitrito coletada em 38,6 minutos revelou várias espécies de peso molecular aumentado, se comparado ao espectro de massa do NGF não modificado (Fig. 6). Como descrito antes [40], algumas das cadeias de NGF não modificadas careciam do resíduo arginina C-terminal (Figura 6A). No NGF tratado com peroxinitrito, o menos desvio de massa foi um aumento de -90 Da da Cadeia A (de 13.252 Da para 13.341 Da), indicando a adição de dois grupos nitro (45 Da cada) (Figura 6B). Além disso, o tratamento com peroxinitrito pareceu induzir várias modificações adicionais, indicando até cinco grupos nitro e a oxidação da metionina. O NGF contém três triptofanos e duas tirosinas que poderiam explicar os cinco sítios de nitração (Tabela Inserida da Fig. 6B). Um padrão similar de modificações foi observado para a cadeia B do NGF.

Para identificar o(s) resíduo(s) que passam por modificação oxidativa, as amostras purificadas por HPLC foram digeridas e analisadas por espectrometria de massa. A comparação das digestões de NGF não tratadas e tratadas com peroxinitrito revelou a nitração dos dois resíduos de tirosina, Tyr52 e Trp99 (Figura 7), o que pode explicar a mudança de peso molecular total detectada de 90 Da. A oxidação do NGF pelo peroxinitrito também resultou em perda de fluorescência do triptofano, corroborando a nitração do triptofano. Outros resíduos de modificação oxidativa não foram detectados a partir das amostras digeridas, possivelmente indicando o íon m/z = 13.341 correspondendo ao NGF com Tyr52 e Trp99 nitrado, como sendo a espécie mais abundante. No entanto, isso também poderia ser devido à maior eficiência da ionização se comparado aos outros peptídeos. Um fato importante é que a formação de 3,3'-ditirosina quando da oxidação com NGF não foi observada pela espectrometria de massa, e a ausência desse aduto foi confirmada também pela ausência de fluorescência na excitação/emissão 320/410 nm.

A nitração da tirosina altera a atividade biológica do NGF?

A fim de avaliar se a nitração da tirosina era vital para modificar a atividade biológica do NGF, nós tratamos o NGF com tetranitrometano (TNM; excesso de 40 vezes). O TNM é geralmente usado para formar 3-nitrotirosina a pH alcalino em proteínas. Nas condições utilizadas, TNM induziu apenas a nitração da tirosina, conforme evidenciado pela espectrometria de massa (vide abaixo). O NGF tratado com TNM foi separado em dois produtos, eluindo-se em 37,9 e 39,9 minutos (Figura 8A). Conforme revelado pela espectrometria de massa, o tratamento com TNM aumentou o peso molecular da Cadeia A do NGF em 90 Da (de 13.252 para 13.342 Da; Figura 8B), indicando que o produto principal era uma espécie dupla nitrada. No entanto, a espécie nitrada única também podia ser observada a 13.297 Da (Figura 8B). O mesmo padrão foi observado para a Cadeia B do NGF. A espectrometria de massa em tandem dos produtos digeridos identificou Tyr52 e Tyr79 como os resíduos nitrados (Figura 8C), justificando a alteração do peso molecular total (Fig. 8B). A nitração do triptofano ou a formação de 3,3'-ditirosina não foi observada no NGF tratado com TNM. O padrão eletroforético do NGF tratado com excesso de 40 vezes de TNM foi similar ao observado no NGF tratado com peroxinitrito, induzindo a formação de oligômeros de NGF (Figura 8D). Em seguida, nós analisamos o efeito do NGF tratado com TNM sobre a sobrevivência dos neurônios motores. De forma similar ao NGF tratado com peroxinitrito, o NGF tratado com TNM induziu a perda de neurônios motores em 32% na ausência de óxido nítrico (Figura 9A). A morte dos neurônios motores induzida pelo NGF tratado com TNM também foi prevenida pela adição de anticorpos de bloqueio para p75NTR (Figura 9B), sugerindo o desencadeamento do mesmo mecanismo apoptótico. Tanto a nitração quanto a oligomerização do NGF foram constatadas como modificações comuns entre o NGF tratado com TNM e peroxinitrito.

Para determinar adicionalmente se a nitração conferia ao NGF a capacidade de induzir a morte dos neurônios motores, Nós tratamos o NGF com peroxinitrito na presença de urato. Esse composto, que é particularmente eficaz na inibição da nitração pelo peroxinitrito [49], impediu a nitração da tirosina e a oligomerização do NGF de maneira dependente da dose (Figura 10A). Além disso, o urato (200 μΜ) aboliu o efeito apoptótico do NGF tratado com peroxinitrito (Figura 10B). Como controle, 100 nM de urato (a concentração cuja presença era esperada no meio de cultura após a adição de 100 ng/mL de NFG-ONOCTurato) não preveniram a perda de neurônios motores induzida pelo NGF tratado com peroxinitrito (100 ng/mL) (Figura 10B), implicando em que o urato não reagido não estava afetando a sobrevivência dos neurônios motores. Secreção de nitro-NGF pelos astrócitos estimulados. O uso de um anticorpo específico que se liga ao NGF nitrado, sem que ocorra reação cruzada com o NGF não nitrado, apresenta bandas imunoreativas no meio condicionado a partir dos astrócitos reativos (vide a Figura 13, que mostra as espécies de NGF nitrado monoméricas e diméricas na análise Western blot do meio condicionado dos astrócitos estimulados com FGF/LPS). Essa análise mostra que o nitro-NGF é segregado sob condições inflamatórias. Atividade de promoção do crescimento

neurítico. A Figura 14 ilustra o fato de que a nitração do NGF aumenta a atividade de promoção do crescimento neurítico do NGF.

Discussão

Visto que a morte dos neurônios motores e a

reatividade dos astrócitos na ALS estavam associadas à produção aumentada de oxigênio reativo e espécies de nitrogênio [28, 50, 51], nós desejamos investigar se a oxidação ou nitração do NGF segregado poderia melhorar sua atividade apoptótica para os neurônios motores. A oxidação do NGF por peroxinitrito in vitro aumentou a capacidade de indução de apoptose dos neurônios motores em 10.000 vezes na presença de óxido nítrico. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de morte celular induzida por neurotrofina em cultura a concentrações flsiologicamente relevantes na faixa pg/mL. Níveis maiores de NGF implicaram na morte progressiva de neurônios motores ocorrendo na ALS [23- 25]. Nós relatamos anteriormente que os extratos de medula espinhal de camundongos SODl g93aALS contêm NGF suficiente para estimular a apoptose dependente do p75NTR dos neurônios motores cultivados na presença de uma fonte externa de óxido nítrico [25]. No entanto, os níveis de NGF medidos por ELISA na medula espinhal em degeneração de camundongos SODIgf93a estavam na faixa de picogramas por mL [25], uma concentração 10.000 vezes menor que a necessária para o NGF purificado induzir a apoptose em culturas de neurônios motores puras e similar à potência do NGF tratado com peroxinitrito.

Em um estudo anterior, a nitração do NGF por TNM não modificou a atividade biológica do NGF, conforme avaliado pela indução do crescimento neurítico em gânglios sensoriais [52]. A diferença na expressão dos receptores de NGF pode justificar os resultados aparentemente contraditórios. Os gânglios sensoriais expressam tanto TrkA quanto p75NTR [53, 54], enquanto que as culturas de neurônios motores puras expressam p75NTR sem expressão detectável de TrkA [55], A apoptose dos neurônios motores induzida pelo NGF nitrado por um mecanismo dependente da sinalização de p75NTR, como anticorpos de bloqueio para p75 ou infraregulação da expressão de p75 pelo tratamento de sentido negativo preveniu completamente a morte dos neurônios motores.

O ganho de atividade apoptótica pelo NGF foi associado de forma coerente à nitração da tirosina e à oligomerização anormal. O NGF de camundongo contém apenas dois resíduos de tirosina nas posições 52 e 79, ambas as quais são acessíveis ao solvente [41]. O grupo hidroxila de Tyr79 está envolvido nas interações de ligação do hidrogênio com Glul 1 do monômero de NGF oposto (Figura 1). Essa interação irá reduzir a ionização da hidroxila da tirosina e, dessa forma, tornará o resíduo menos suscetível à oxidação mediada pelo radical, que pode explicar porque Tyr79 era mais resistente à nitração do que Tyr52. O último foi imediatamente nitrado tanto por peroxinitrito quanto por TNM. Uma vez que Tyr52 encontra-se altamente conservado e é importante para a estabilização do NGF [43], sua nitração pode induzir mudanças conformacionais na proteína que poderiam facilitar as interações de proteínas aberrantes que levam à oligomerização.

Os oligômeros de NGF variavam de tamanho, de dímeros a octâmeros, conforme evidenciado pela cromatografia de exclusão por tamanho associada ao MALS em tempo real. Quando oligômeros de alto peso molecular purificados foram submetidos à cromatografia pela segunda vez, picos monoméricos e diméricos reapareceram, indicando a formação de oligômeros não covalentes. No entanto, tanto o tratamento com peroxinitrito quanto com TNM levou à formação de oligômeros superiores que eram estáveis em géis de SDS- PAGE, implicando na reticulação covalente, não dependente de tiol, de algumas subunidades. A oligomerização de NGF foi prevenida de maneira eficaz pelo urato. O urato é conhecido por prevenir a nitração da tirosina induzida por peroxinitrito competindo pelos radicais de dióxido de carbonato e nitrogênio, indicando que a formação dos radicais está envolvida na formação de oligômeros. Embora a reticulação da 3,3'-ditirosina seja um mecanismo pelo qual o peroxinitrito pode induzir a dimerização protéica [56, 57], oligômeros maiores precisariam de ao menos dois resíduos tirosina diferentes para serem reticulados. Se a reticulação resultasse apenas da geração dos radicais tirosina, a nitração de Tyr52 inibiria a oligomerização.

Além do mais, 3,3'-ditirosina poderia não ser detectada pela fluorescência ou pela espectrometria de massa. Portanto, a oligomerização do NGF mais provavelmente envolvia outras formas de reticulação induzida por peroxinitrito. Na presença de dióxido de carbono, 30% do peroxinitrito forma o radical carbonato mais dióxido de nitrogênio, ambos os quais são oxidantes moderamente fortes que oxidam imediatamente tanto a tirosina quanto o triptofano para formar radicais [58]. Os radicais tirosil também se combinam, a velocidades limitadas por difusão, com o dióxido de nitrogênio para formar 3-nitrotirosina. A oxidação do triptofano produz vários produtos, inclusive N-formil quinurenina e quinurenina, que podem reticular as proteínas [59]. Por outro lado, os radicais tirosil também podem oxidar outros aminoácidos, inclusive o triptofano e a cisteína, por reações de transferência de elétrons intramoleculares [59, 60]. Dentro do NGF, Tyr52 encontra-se espacialmente próximo a Trp21 (Figura 1). Portanto, a oxidação de Tyr 52 poderia transferir o radical para Trp21 e, com isso, facilitar as reticulações covalentes entre as moléculas de NGF.

O NGF tratado com peroxinitrito estimulou potencialmente a apoptose dependente de p75 em neurônios motores. Tyr52 e Trp21 em NGF estão envolvidos na formação do bolso hidrófobo que se acopla ao domínio rico em cisteína 2 (CRD2) do p75NTR [42]. Visto que Trp21 é uma parte principal da interface com p75NTR, seus produtos de oxidação in vivo poderiam formar adutos covalentes para p75 e facilitar a sinalização apoptótica aberrante. No entanto, outros receptores também poderiam estar envolvidos na indução da apoptose pelo NGF tratado com peroxinitrito. O precursor de NGF (proNGF) se liga com menor afinidade que o NGF à p75NTR, mas forma um complexo de sinalização de alta afinidade pela ligação simultânea ao p75NTR e à sortilina [61]. Além disso, p75NTR pertence à superfamília de receptores TNFa [62], e outros membros dessa superfamília são conhecidos por exigirem a trimerização de seus domínios de morte intracelulares para ativação [63, 64]. De modo similar, os oligômeros de NGF poderiam recrutar receptores p75 adicionais e, dessa forma, promover a trimerização de seu domínio celular, e, com isso, ativar mais fortemente a sinalização apoptótica.

Devido ao fato de o tratamento com peroxinitrito do NGF resultar em um ganho de função, apenas uma pequena fração da proteína nitrada é necessária para induzir a sinalização apoptótica. O NGF tratado com peroxinitrito pode ser formado em condições patológicas e inflamatórias, onde a supraregulação do NGF coincide com a produção aumentada de peroxinitrito e outras espécies nitrantes. A ocorrência de NGF nitrado e modificado oxidativamente in vivo oferece um mecanismo novo promissor pelo qual a sinalização da neurotrofina poderia ser subvertida sob condições patológicas associadas ao estresse oxidativo aumentado.

Lista de Abreviações: ALS, esclerose lateral amiotrófica; FGF, fator de crescimento de fibroblasto; GDNF, fator neurotrófico derivado glial; HPLC, cromatografia líquida de alta pressão; MALS, espalhamento de luz multiângulo; NGF, fator de crescimento nervoso; NO, óxido nítrico; NOS, óxido nítrico sintase; ONOO- , peroxinitrito; p75NTR , receptor da neurotrofina p75; ROA, adição em ordem inversa; SODl, superóxido dismutase 1; TNM, tetranitrometano.

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.. <110> INSTITUT PASTEUR

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLOGICAS CLEMENTE ESTABLE FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE LA REPUBLICA

"· <120> NEUROTROFINAS MODIFICADAS PÓS-TRADUCIONALMENTE.

<130> B6826B - FP

<150> EP 06 291 195.3

<151> 2006-07-24

<160> 7

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Ser Ser Thr His Pro Val Phe His Met Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 10 15

ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp lie Lys 25 30

Gly Lys

Glu 35

Val Thr vai

Leu Ala Glu 40

vai Asn Ile

Asn 45

Asn Ser vai

Phe Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Ala Ser Asn Pro Val 50 55 60

Glu 65

Ser Gly Cys Arg

Gly 70

Ile Asp Ser Lys

His 75

Trp Asn Ser Tyr

Cys 80

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Thr Asp Glu Lys Gln 85 90 95

Ala Ala Trp

Arg 100

Phe lie Arg Ile

Asp 105

Thr Ala Cys vai

Cys Val 110

Leu

Ser Arg Lys Ala Thr Arg 115

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

Ser vai Ser vai Trp vai Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 25 30

Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu vai Asn Ile Asn Asn Ser vai 40 45

Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro vai 50 55 60

Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95

Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys vai Leu 100 105 110

Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120

<210> 3

<211> 307

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Met Leu Cys Leu Lys Pro Val Lys Leu Gly Ser Leu Glu vai Gly His 10 15

Gly Gln His Gly Gly vai Leu Ala Cys Gly Arg Ala vai Gln Gly Ala 25 30

Gly Trp His Ala Gly Pro Lys Leu Thr ser Val Ser Gly Pro Asn Lys 40 45

Gly Phe Ala Lys Asp Ala Ala Phe Tyr Thr Gly Arg Ser Glu vai His 50 55 60

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Gly Val Gln Ala Glu Pro Tyr Thr Asp Ser Asn Val Pro Glu Gly Asp 85 90 95 Ser vai Pro Glu Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr

Ala Leu Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Thr Ala Pro Ile Ala Ala Arg 115 120 125

Val Thr Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr vai Asp Pro Arg Leu Phe Lys 130 135 140

Lys Arg Arg Leu His Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro 145 150 155 160

Pro Thr Ser Ser Asp Thr Leu Asp Leu Asp Phe Gln Ala His Gly Thr 165 170 175

Ile Pro Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Thr His Pro 180 185 190

Val Phe His Met Gly Glu Phe Ser vai Cys Asp Ser Val Ser vai Trp 195 200 205

Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu vai Thr 210 215 220

vai Leu Ala Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser vai Phe Arg Gln Tyr Phe 225 230 235 240

Phe Glu Thr Lys Cys Arg Ala Ser Asn Pro Val Glu Ser Gly Cys Arg 245 250 255

Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr 260 265 270

Phe Val Lys Ala Leu Thr Thr Asp Glu Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe 275 280 285

Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Thr 290 295 300

Arg Arg Gly 305

<210> 4

<211> 241

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile 10 15

Gln Ala Glu Pro His Ser Glu ser Asn vai Pro Ala Gly His Thr Ile 25 BO

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Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu 85 90 95

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Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg 225 230 235 240 Ala <210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

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<400> 5

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<210> 6

<211> 19

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<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gln Tyr Phe Phe Glu Thr 1 5

Claims (48)

1. - Indutor e/ou estimulador da apoptose dos neurônios motores e/ou do crescimento neurítico, caracterizado por ser: - uma neurotrofina modificada em uma forma isolada, sendo que ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp compreende pelo menos um grupo nitro; ou - um fragmento conservador da referida forma isolada da neurotrofina modificada, sendo que o referido fragmento conservador reteve ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e sendo que o referido fragmento conservador reteve ao menos um grupo nitro no referido ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e reteve a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico; ou - uma variante conservadora da referida forma isolada da neurotrofina modificada ou do referido fragmento conservador, sendo que a referida variante conservadora deriva-se da referida neurotrofina modificada ou do referido fragmento conservador por pelo menos uma substituição e/ou deleção e/ou adição de aminoácido, mas reteve ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e sendo que a referida variante conservadora reteve ao menos um grupo nitro no referido ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e reteve a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico.

2. - Indutor e/ou estimulador da apoptose dos neurônios motores e/ou do crescimento neurítico, caracterizado por ser: - uma neurotrofina modificada, sendo que a referida neurotrofina modificada pode ser obtida pela modificação nitrativa pós-traducional de uma neurotrofina madura nativa, pela adição, na referida neurotrofina madura, de ao menos um grupo nitro em ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e sendo que a referida neurotrofina modificada se encontra em uma forma isolada; ou - um fragmento conservador da referida forma isolada da neurotrofina modificada, sendo que o referido fragmento conservador reteve ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e sendo que o referido fragmento conservador reteve ao menos um grupo nitro no referido ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e reteve a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico; ou - uma variante conservadora da referida forma isolada da neurotrofina modificada ou do referido fragmento conservador, sendo que a referida variante conservadora deriva-se da referida neurotrofina modificada ou do referido fragmento conservador por pelo menos uma substituição e/ou deleção e/ou adição de aminoácido, mas reteve ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e sendo que a referida variante conservadora reteve ao menos um grupo nitro no referido ao menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp, e reteve a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico.

3. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida neurotrofina modificada é um monômero de neurotrofina modificada.

4. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida neurotrofina modificada é um oligômero de neurotrofina modificada.

5. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida neurotrofina modificada é um dímero de neurotrofina modificada.

6. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida neurotrofina modificada é um tetrâmero de neurotrofina modificada, ou um hexâmero de neurotrofina modificada ou um octâmero de neurotrofina modificada.

7. - Indutor e/ou estimulador da apoptose dos neurônios motores e/ou do crescimento neurítico, caracterizado por ser uma mistura de: - pelo menos dois oligômeros de neurotrofina modificada de qualquer uma das reivindicações 4 a 6, sendo que os referidos pelo menos dois oligômeros são de espécies de oligômeros diferentes, e/ou - pelo menos um monômero de neurotrofina modificada da reivindicação 3, e pelo menos um oligômero de neurotrofina modificada de qualquer uma das reivindicações 4-6.

8. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender pelo menos um tetrâmero de neurotrofina modificada de qualquer uma das reivindicações 4-6 e/ou pelo menos um hexâmero de neurotrofina modificada de qualquer uma das reivindicações 4-6 e/ou pelo menos um octâmero de neurotrofina modificada de qualquer uma das reivindicações 4-6.

9. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a referida forma isolada da neurotrofina modificada não compreende nenhuma pró-neurotrofina não-nitrada.

10. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a referida forma isolada da neurotrofina modificada não compreende nenhuma neurotrofina madura não-nitrada.

11.- Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por estar em uma forma pura.

12. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por estar em uma configuração molecular que não impede sua atividade pró-apoptótica e/ou sua atividade de crescimento pró- neurítico.

13. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a referida neurotrofina é NGF, BDNF, NT-3 ou NT-4.

14. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a referida neurotrofina é o NGF maduro.

15. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a referida neurotrofina é o BDNF maduro, a NT-3 madura ou a NT-4 madura.

16. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp que compreendem ao menos um grupo nitro é um resíduo Tyr.

17. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo Tyr é Tyr52 ou Tyr79 do NGF murino, ou Tyr52 ou Tyr79 do NGF humano.

18. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido pelo menos um resíduo selecionado dentre os resíduos Tyr e Trp que compreendem ao menos um grupo nitro é um resíduo Trp.

19. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo Trp é o Trp99 ou Trp21 ou Trp76 do NGF de camundongo, ou é o Trp99 ou Trp21 ou Trp76 do NGF humano.

20. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois dos resíduos Tyr e Trp da referida neurotrofina portam um grupo nitro (ao menos um grupo nitro em cada um dos referidos resíduos).

21. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os referidos pelo menos dois resíduos são dois resíduos Tyr, ou um resíduo Tyr e um resíduo Trp.

22. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o número de resíduos Tyr e Trp da referida neurotrofina que portam um grupo nitro (ao menos um grupo nitro em cada um dos referidos resíduos) é de pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito ou pelo menos nove.

23. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que todos os resíduos Tyr e Trp da referida neurotrofina portam ao menos um grupo nitro.

24. - Indutor e/ou estimulador, de qualquer com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a referida neurotrofina modificada encontra-se em uma forma não-glicosilada ou em uma forma glicosilada.

25. - Fragmento não conservador de um indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, ou variante não conservadora de um indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, que se deriva do referido indutor e/ou estimulador por pelo menos uma substituição e/ou deleção e/ou adição de aminoácido, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento ou variante não conservadora perdeu a capacidade de induzir e/ou estimular a apoptose dos neurônios motores e/ou o crescimento neurítico.

26. - Fragmento ou variante não conservadora, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por ser para uso como um antígeno para induzir uma resposta imunológica de anticorpo para a terapia e/ou paliação e/ou prevenção da apoptose dos neurônios motores e/ou do crescimento dos neuritos.

27. - Fragmento ou variante não conservadora, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por ser para uso como agente para o tratamento e/ou paliação e/ou prevenção da dor e/ou de uma doença ou condição neurodegenerativa.

28. - Anticorpo que se liga a pelo menos um indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por não provocar reação cruzada com a neurotrofina nativa não modificada, da qual se deriva o referido indutor e/ou estimulador.

29. - Anticorpo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal.

30. - Anticorpo, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado por ser um anticorpo que se liga ao NGF nitrado.

31. - Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado por ser um scFv.

32. - Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado por ser para uso como um agente para a terapia de imunização passiva e/ou paliação e/ou prevenção da apoptose dos neurônios motores e/ou do crescimento dos neuritos.

33. - Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, caracterizado por ser para uso como um agente para o tratamento e/ou paliação e/ou prevenção da dor.

34. - Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, caracterizado por ser para uso como um agente para o tratamento e/ou paliação e/ou prevenção de uma doença ou condição neurodegenerativa.

35. - Sistema de visualização ribossomal, caracterizado por consistir de pelo menos um ribossomo, ao qual ao menos um scFv da reivindicação 31, bem como ao menos um RNAm codificando tal scFv, são ligados.

36. - Método para selecionar compostos capazes de inibir e/ou bloquear a atividade apoptótica que um indutor e/ou estimulador de qualquer uma das reivindicações 1 a possa ter sobre os neurônios motores e/ou o efeito de crescimento neurítico que um indutor e/ou estimulador de qualquer uma das reivindicações 1 a 24 possa ter sobre os gânglios sensoriais, caracterizado pelo fato de que os compostos candidatos são selecionados pela sua capacidade de ligar-se a pelo menos um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 28 a 31, ou a pelo menos um sistema de visualização ribossomal da reivindicação 35, por meio do que tal capacidade de ligação indica o potencial de inibir e/ou bloquear a referida atividade apoptótica e/ou o referido efeito de crescimento neurítico.

37. - Composição, caracterizada por compreender ao menos um fragmento ou variante não conservadora de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27 e/ou ao menos um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34.

38. - Fragmento ou variante não conservadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado por ser para uso no tratamento e/ou prevenção e/ou paliação de uma condição ou doença neurodegenerativa, tal como ALS (Esclerose Lateral Amiotrófica), doença de Alzheimer, doença de Huntington, qualquer doença ou condição que envolve um déficit de memória e/ou uma doença de concentração, bem como condições ou doenças neuroinflamatórias.

39. - Fragmento ou variante não conservadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado por ser para uso no tratamento e/ou prevenção e/ou paliação de um estado ou condição ou sensação dolorosa, e mais particularmente: - dor neuropática (mais particularmente, enxaqueca, enxaqueca crônica, dor de cabeça por provável abuso de analgésicos PAAH, síndrome da fibromialgia primária PFMS, dor neuropática induzida por lesões nervosas, lesões no nervo ciático, lesões de constrição crônica), - dor articular (mais particularmente, condições osteoartríticas, osteoartrose, osteoartrite), - dor inflamatória, - dor cancerosa.

40. - Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34, caracterizado por ser para uso no tratamento e/ou prevenção e/ou paliação de uma condição ou doença neurodegenerativa, tal como ALS (Esclerose Lateral Amiotrófica), doença de Alzheimer, doença de Huntington, qualquer doença ou condição que envolva um déficit de memória e/ou uma doença de concentração, bem como condições ou doenças neuroinflamatórias.

41. - Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34, caracterizado por ser para uso no tratamento e/ou prevenção e/ou paliação de um estado ou condição ou sensação dolorosa, e mais particularmente: - dor neuropática (mais particularmente, enxaqueca, enxaqueca crônica, dor de cabeça por provável abuso de analgésicos PAAH, síndrome da fibromialgia primária PFMS, dor neuropática induzida por lesões nervosas, lesões no nervo ciático, lesões de constrição crônica), - dor articular (mais particularmente, condições osteoartríticas, osteoartrose, osteoartrite), - dor inflamatória, - dor cancerosa.

42. - Composição, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por ser para uso no tratamento e/ou prevenção e/ou paliação de uma condição ou doença neurodegenerativa, tal como ALS (Esclerose Lateral Amiotrófíca), doença de Alzheimer, doença de Huntington, Esclerose Múltipla, qualquer doença ou condição que envolva um déficit de memória e/ou uma doença de concentração, bem como condições ou doenças neuroinflamatórias.

43. - Composição, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por ser para uso no tratamento e/ou prevenção e/ou paliação de um estado ou condição ou sensação dolorosa, e mais particularmente: - dor neuropática (mais particularmente, enxaqueca, enxaqueca crônica, dor de cabeça por provável abuso de analgésicos PAAH, síndrome da fibromialgia primária PFMS, dor neuropática induzida por lesões nervosas, lesões no nervo ciático, lesões de constrição crônica), - dor articular (mais particularmente, condições osteoartríticas, osteoartrose, osteoartrite), - dor inflamatória, - dor cancerosa.

44. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por ser para uso como um agente útil para a indução e/ou a estimulação da apoptose dos neurônios motores e/ou para a indução e/ou estimulação do crescimento neurítico.

45. - Indutor e/ou estimulador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por ser para uso no tratamento e/ou prevenção e/ou paliação de uma doença, condição ou trauma selecionado dentre o grupo que compreende neuropatia, lesão nervosa, derrames, lesões na medula espinhal e doenças neurodegenerativas.

46. - Composição, caracterizada por compreender ao menos um indutor e/ou estimulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

47. - Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada por ser para uso no tratamento e/ou prevenção e/ou paliação de uma doença, condição ou trama selecionado dentre o grupo que compreende neuropatia, lesão nervosa, derrames, lesões na medula espinhal e doenças neurodegenerativas.

48. - Método in vitro para o diagnóstico de uma condição ou doença neurodegenerativa e/ou de um estado ou condição ou sensação dolorosa, caracterizado por compreender: - colocar uma amostra biológica em contato com um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34, - determinar se o referido ao menos um anticorpo se liga a um ligante contido na referida amostra biológica, por meio do que tal ligação indica ou prognostica a referida doença, estado, condição ou sensação.