BRPI0714161A2 - mÉtodos para melhorar o efeito adverso de envelhecimento em cÉlulas de mamÍferos, para tratar uma doenÇa de pele ou condiÇço da pele em um mamÍfero, para tratar uma condiÇço de inflamaÇço em um mamÍfero, e para melhorar o efeito adverso de envelhecimento sobre a pele humana - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA MELHORAR O EFEITO ADVERSO DE ENVELHECIMENTO EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS, PARA TRATAR UMA DOENÇA DE PELE OU CONDIÇçO DA PELE EM UM MAMÍFERO, PARA TRATAR UMA CONDIÇçO DE INFLAMAÇçO EM UM MAMÍFERO, E PARA MELHORAR O EFEITO ADVERSO DE ENVELHECIMENTO SOBRE A PELE HUMANA. A presente invenção provê métodos e composições para atuar contra os efeitos adversos do envelhecimento em células de mamíferos in vitro e in vivo, especialmente células da pele humana e pele humana, e o tratamento de doenças hiperproliferativas e da pele relacionadas em mamíferos por administração de composições contendo derivados de purina 6,9-di-substituída.

Description

"MÉTODOS PARA MELHORAR O EFEITO ADVERSO DE ENVELHECIMENTO EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS, PARA TRATAR UMA DOENÇA DE PELE OU CONDIÇÃO DA PELE EM UM MAMÍFERO, PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO DE INFLAMAÇÃO EM UM MAMÍFERO, E PARA MELHORAR O EFEITO ADVERSO DE ENVELHECIMENTO SOBRE A PELE HUMANA"

Pedido Relacionado A presente invenção é uma continuação do pedido de patente US 11/774.652, depositado em 9 de julho de 2007, que reivindica prioridade para o pedido US provisório 60/806.871, depositado em 10 de julho de 2006, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Campo Técnico

A presente invenção provê métodos e composições para atuar contra os efeitos adversos de envelhecimento em células de mamíferos in vitro e in vivo, especialmente incluindo células da pele humana, e tratamento de doenças hiperproliferativas e da pele relacionadas em mamíferos por administração de composições contendo derivados de purina 6,9-di- substituída.

Fundamentos

O envelhecimento celular ou senescência celular é um atributo

universal de células não transformadas normais, que é manifestado por mudanças morfológicas acompanhadas por uma perda dependente da idade do potencial ou capacidade proliferativa, incluindo a falha das células para responder aos fatores de crescimento exógenos. Várias teorias foram propostas para explicar o fenômeno da senescência celular. Evidência experimental sugere que a perda dependente da idade do potencial ou capacidade proliferativa pode ser a função de um programa genético (ver, por exemplo, Smith et al., Mech. Age. Dev. 13, 387 (1980); e Kirkwood et al., Theor. Biol. 53, 481 (1975)). Esta evidência inclui estudos de fusão de células com fíbroblastos humanos in vitro que demonstram que o fenótipo senescente celular quiescente é dominante sobre o fenótipo proliferativo (ver, por exemplo, Pereira-Smith et al., Somatic Cell Genet. 8, 731 (1982); e Norwood et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1, 223 (1974)) e que síntese de proteína em células senescentes, antes da fusão com células jovens, é necessária para a inibição da síntese de DNA dentro do núcleo jovem de heterodicarion (ver, por exemplo, Burmer et al., Exp. Cell Res. 145, 708 (1983); e Drescher- Lincoln et al., Exp. Cell Res. 153, 208 (1984)). Também, microinjeção de mRNA de fíbroblastos senescentes em fíbroblastos jovens inibe a capacidade da célula jovem de sintetizar DNA (ver, por exemplo, Lumpkin et al., Science 232, 393 (1986)) e entrada da célula jovem na fase S do ciclo celular (Lumpkin et al., Exp. Cell Res. 160, 544 (1985)). Além disso, espécies de mRNA únicas são ampliadas em fíbroblastos senescentes in vitro (ver, por exemplo, Wellinger et al., J. Cell Biol., 34, 203 (1986); Flemming et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85, 4099 (1988); West et al., Exp. Cell Res. 184, 138 (1989); e Giordano, Exp. Cell Res. 185, 399 (1989)). Também é sugerido que um programa genético alterado existe em fíbroblastos humanos senescentes, que envolve a repressão da expressão de c-fos ao nível transcripcional (ver, por exemplo, Seshadri et., Science 247, 205 (1990)). Assim, parecem existir diferentes genotípicas, bem como fenotípicas, entre células jovens e velhas.

Em anos recentes, aminopurinas 6-substituídas assumiram uma considerável signifícância bioquímica. Alguns compostos deste tipo promovem o crescimento de planta e pertencem ao grupo de reguladores do crescimento denominados "citocininas" (Letham, Ann. Rev. Plant. Physiol. 18, 349 (1967)). Em biotestes com base na indução da divisão celular em culturas de tecido de planta, o composto citocinina o mais ativo é a citocinina de ocorrência natural tomy-zeatina (6-((E)-4-hidróxi-3-metilbut-2- enilamino)purina. Letham, Planta 74, 228 (1967)). Citocininas intimamente relacionadas a zeatina ocorrem como bases em RNA solúvel (Skoog et al., Science 154, 1354 (1966)). Nos RNAs de serina e tirosina de levedura, plantas e animais, a citocinina é adjacente ao anticódon. O crescimento de culturas de células de mamíferos é inibido por determinadas adenosinas N6- substituídas com atividade de citocinina (Grace et al., Proc. Am. Assoc.

Câncer Res. 8, 23 (1967)). Com segmentos de caules, mudas de folhas e uvas em desenvolvimento, 6-benzilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina (BPA) é relatado para lembrar um crescimento maior do que a citocinina 6- benzilaminopurina (BA). Em biotestes de culturas de tecidos e algumas espécies de horticultura, BPA também demonstra ser mais ativo (Werbrouck et al., Physiol. Plant 98, 291 (1996)).

Além disso, algumas purinas 6-(amino substituído) (incluindo cinetina e zeatina) mostram ter propriedades anti-envelhecimento significativas e outras, e verificou-se serem utilizáveis para tratar de células de mamíferos, incluindo a pele humana e/ou células da pele humana. A aplicação tópica das composições permitiu a melhora da aparência cosmética da pele, estas composições também podem ser usadas para tratamento da pele e doenças ou condições relacionadas. De modo importante, estas purinas 6- (amino substituído), nas quantidades usadas, não aumentam substancialmente a taxa de crescimento e capacidade proliferativa total de células de mamíferos tratadas. Ver, por exemplo, patentes US 5.371.089 (6 de dezembro de 1994) e 5.602.139 (11 de fevereiro de 1997) (melhora da aparência cosmética da pele); patente US 5.614.407 (25 de março de 1997) (diminuem ou retardam mudanças morfológicas que normalmente acompanham o envelhecimento de células de mamíferos em culturas); e patentes US 5.021.422 (4 de junho de 1991) e 5.164.394 (17 de novembro de 1992) (tratamento de certas doenças hiperproliferativas da pele). Todas as patentes acima listadas são aqui incorporadas por referência. As ações anti-envelhecimento de purinas 6- (amino substituído) sobre a pele humana também foram demonstradas por Rattan e Clark (Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 665-672 (1994)) em fibroblastos humanos cultivados, onde a presença de cinetina (N6-furfuril- adenina) retardou o início e diminuiu a extensão de muitas características morfológicas e bioquímicas associadas com a passagem em série de células. A efetividade destas purinas 6-(amino substituído) na manutenção da função de células normais no envelhecimento das células provê a base de seu uso na conservação da vitalidade da pele em envelhecimento. Mais recentemente, estudos clínicos conduzidos na Universidade da Califórnia, Irvine pelo Dr. Gerald Weinstein (Cosmetic Dermatologyl 5, 29-32 (2003)) mostraram que produtos tópicos de cinetina na faixa de concentração de 0,005 a 0,10% (Kinerase®) melhoraram a aparência da pele facial fotodanificada de modo brando a moderado. Tratamentos após 12 e 24 semanas produziram melhora significativa na aparência da textura da pele, hiperpigmentação mosqueada, e rugas finas comparados a linha de base como avaliado por tanto o médico clínico como os indivíduos. Os tratamentos também produziram uma melhora na função da barreira da pele, como avaliado por um decréscimo na perda de água transepidérmica.

Prevenir, reverter ou retardar o processo de envelhecimento celular tem sido um objetivo persistente, embora elusivo, da ciência biológica, que poderia ter várias conseqüências significativas e práticas. A prevenção do envelhecimento de células na pele humana ou outros órgãos pode estar associada com a conservação da integridade estrutural e funcional e também integridade cosmética. Se as células cultivadas puderem ser tratadas de modo a reter as características de células jovens, a produção de produtos valiosos por estas células em cultura poderia ser melhorada. Embora purinas 6-(amino substituído), especialmente cinetina

e zeatina, tenham propriedades anti-envelhecimento e outras, pode ser desejável prover outros compostos reguladores do crescimento, de diferenciação, e/ou anti-senescentes. Pode ser especialmente desejável se tais compostos tiverem seletividade e eficiência melhoradas (isto é, menos tóxicos e/ou mais eficientes) do que purinas 6-(amino substituído) atualmente usadas. A presente invenção provê estes compostos anti-envelhecimento melhorados.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se aos derivados de purina 6,9-di- substituída de fórmula geral:

R9

e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmos, em que R^ é furfurila, furfurila substituída com metóxi, fenila, fenila substituída com metóxi, e benzila substituída com metóxi; e em que R9 é 2-tetrahidropiranila ou 2-tetrahidrofuranila. Grupos furfurila substituída com metóxi incluem, por exemplo, 3-metoxifurfurila, 4-metoxifiirfurila e 5-metoxifurfurila. Grupos fenila substituída com metóxi incluem, por exemplo, 2-metoxifenila, 3- metoxifenila, 4-metoxifenila, 2,3-dimetoxifenila, 2,4-dimetoxifenila, 2,5- dimetoxifenila, 3,4-dimetoxifenila, 3,5-dimetoxifenila, 2,3,4-trimetoxifenila e 2,3,5-trimetoxienila. Grupos benzila substituída com metóxi incluem, por exemplo, 2-metoxibenzila, 3-metoxibenzila, 4-metoxibenzila, 2,3- dimetoxibenzila, 2,4-dimetoxibenzila, 2,5-dimetoxibenzila, 3,4- dimetoxibenzila, 3,5-dimetoxibenzila, 2,3,4-trimetoxibenzila, e 2,3,5- trimetoxibenzila. O derivado de purina 6,9-di-substituída preferido é 6- furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina (também referido como N6- furfuril-9-(2-tetrahidropiranil) adenina ou piranil cinetina), que tem a fórmula geral Verificou-se que estes derivados de purina 6,9-di-substituída

possuem propriedades anti-senescentes, antiinflamatórias e/ou imunossupressoras.

utilizáveis como composições cosméticas para inibir o envelhecimento e a senescência, melhorar a aparência cosmética de células epidérmicas de mamíferos, como queratinócitos ou fibroblastos, e/ou melhorar o efeito adverso em células epidérmicas de mamíferos, como queratinócitos ou fibroblastos. Eles são especialmente utilizáveis como composições cosméticas para inibir o envelhecimento e senescência e/ou melhorar a aparência cosmética de células epidérmicas humanas e/ou pele humana. Assim, a presente invenção provê um método para melhorar o efeito adverso de envelhecimento em células de mamíferos, referido método compreendendo aplicar uma quantidade eficiente de um derivado de purina 6,9-di-substituída à células de mamíferos, em que o derivado de purina 6,9-di-substituída é da fórmula geral

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção são

\

NH

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R6 é furfurila, furfurila substituída com metóxi, fenila, fenila substituída com metóxi e benzila substituída com metóxi; e em que R9 é 2-tetrahidropiranila ou 2-tetrahidrofuranila.

também são utilizáveis para tratar de determinadas doenças de pele, incluindo doenças hiperproliferativas da pele. Composições contendo estes derivados de purina 6,9-di-substituída podem, por exemplo, ser usadas para tratamento de condições da pele como lupus, eczema alérgico, eczema tóxico, dermatite atópica, ictiose, papiloma, doença de Bowen, queratoses seborréicas, queratoses actínicas, carcinoma de células basais e escamosas, e semelhantes. Assim, a presente invenção também provê um método para tratar doenças de pele em células de mamíferos, referido método compreendendo aplicar uma quantidade eficiente de um derivado de purina 6,9-di-substituída à células de mamíferos necessitando deste tratamento, em que o derivado de purina 6,9-di- substituída tem a fórmula geral

furfurila, furfurila substituída com metóxi, fenila, fenila substituída com metóxi, e benzila substituída com metóxi; e em que R9 é 2-tetrahidropiranila ou 2-tetrahidrofuranila.

também são utilizáveis para tratar condições relacionadas à inflamação. Estas condições relacionadas à inflamação incluem, por exemplo, inflamação, lesões (por exemplo, acelerar a cicatrização das mesmas), dor e outras respostas imunológicas resultantes de inflamação (por exemplo, prover o

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção

Re

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R^ é

20

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção alívio das mesmas), e/ou tratar doenças de pele com inflamação (por exemplo, dermatite atópica, líquen plano, hiperpigmentação, lesões de herpes simplex, e outras). Assim, a presente invenção provê também um método para tratar condições de inflamação em células de mamíferos, referido método compreendendo aplicar uma quantidade efetiva de um derivado de purina 6,9- di-substituída às células de mamíferos necessitando deste tratamento, em que o derivado de purina 6,9-di-substituída é da fórmula geral

R9

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R^ é furfurila, furfurila substituída com metóxi, fenila, fenila substituída com metóxi e benzila substituída com metóxi; e em que R9 é 2-tetrahidropiranila ou 2-tetrahidrofuranila.

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção podem ser usados em composições na forma de compostos livres das fórmulas acima ou como sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos podem ser formados com, por exemplo, metais alcalinos, amônio, ou aminas. Os derivados ou seus sais podem estar na forma de uma mistura de racematos ou isômeros opticamente ativos; eles também podem estar na forma de sais de adição com ácidos.

Descrição Detalhada

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção têm a

fórmula geral Rfi

em que R6 é furfurila, furfurila substituída com metóxi, fenila, fenila substituída com metóxi e benzila substituída com metóxi; e em que R9 é 2-tetrahidropiranila ou 2-tetrahidrofuranila. Grupos furfurila substituída com metóxi incluem, por exemplo, 3-metoxifurfurila, 4-metoxifurfurila, e 5- metoxifurfiirila. Grupos fenila substituída com metóxi incluem, por exemplo, 2-metoxifenila, 3-metoxifenila, 4-metoxifenila, 2,3-dimetoxifenila, 2,4- dimetoxifenila, 2,5-dimetoxifenila, 3,4-dimetoxifenila, 3,5-dimetoxifenila, 2,3,4-trimetoxifenila e 2,3,5-trimetoxifenila. Grupos benzila substituída com metóxi incluem, por exemplo, 2-metoxibenzila, 3-metoxibenzila, 4- metoxibenzila, 2,3-dimetoxibenzila, 2,4-dimetoxibenzila, 2,5- dimetoxibenzila, 3,4-dimetoxibenzila, 3,5-dimetoxibenzila, 2,3,4- trimetoxibenzila e 2,3,5-trimetoxibenzila. O derivado de purina 6,9-di- substituída preferido é 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina. Verificou-se que estes derivados de purina 6,9-di-substituída possuem propriedades anti-senescentes, antiinflamatórias e/ou imunossupressoras quando contatados com células de mamíferos, incluindo células humanas.

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção são utilizáveis como composições cosméticas para inibir o envelhecimento e a senescência e/ou melhorar a aparência cosmética de células epidérmicas de mamíferos, como queratinócitos ou fibroblastos. Eles são especialmente utilizáveis como composições cosméticas para inibir o envelhecimento e/ou a senescência e/ou melhorar a aparência cosmética de células epidérmicas humanas e/ou da pele humana.

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção também são utilizáveis para tratamento de determinadas condições ou doenças de pele, incluindo (mas não limitadas a) doenças hiperproliferativas da pele. Composições contendo estes derivados de purina 6,9-di-substituída podem, por exemplo, ser usadas para tratamento de lupus, eczema alérgico, eczema tóxico, dermatite atópica, ictiose, papiloma, doença de Bowen, queratose seborréica, carcinoma de células basais e escamosas, acne, eritema, e outras.

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção também são utilizáveis para tratar inflamação, acelerar a cicatrização de lesões, prover alívio de dor e outras respostas imunológicas resultantes de inflamação, e/ou tratar condições ou doenças de pele com inflamação (por exemplo, dermatite atópica, líquen plano, hiperpigmentação, lesões de herpes simplex, eritema, e outras).

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção podem ser usados em composições na forma de compostos livres das fórmulas acima ou como sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos; um único ou uma mistura de tais derivados de purina 6,9-di-substituída pode ser usado. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados com, por exemplo, metais alcalinos, amônio, ou aminas. Os derivados ou seus sais podem estar na forma de uma mistura de racematos ou isômeros opticamente ativos; eles também podem estar na forma de sais de adição com ácidos.

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção estão geralmente contidos em uma composição veículo apropriada para aplicação às células de interesse (por exemplo, pele humana) e em uma quantidade apropriada para uso prolongado. Tais composições incluem, por exemplo, composições cosméticas e farmacêuticas. Geralmente, as composições compreendem cerca de 0,005 a cerca de 20 por cento de ingrediente ativo, preferivelmente cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento, e mais preferivelmente cerca de 0,1 a cerca de 2 por cento. As composições, especialmente as composições cosméticas e farmacêuticas, podem estar na forma de soluções, cremes, aerossóis, loções leitosas, loções, géis, emplastros, cataplasmas, xampus, bastões, unguentos, pastas, espumas, tinturas, pulverizações, e outras. A forma da composição não é crítica contanto que seja apropriada para seu uso pretendido.

Os veículos cosméticos e farmacêuticos ou carreadores apropriados para administração dos compostos providos aqui incluem quaisquer veículos conhecidos dos versados na técnica como sendo apropriados para o modo particular de administração. Além disso, os compostos podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos. O composto ativo é incluído no veículo em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente e/ou cosmeticamente utilizável na ausência de efeitos tóxicos graves no indivíduo tratado. A concentração efetiva pode ser determinada empiricamente testando os compostos usando sistemas in vitro e in vivo, incluindo cultura de tecidos e camundongos sem pelos ou outros modelos de animal apropriados. Efeitos terapeuticamente e/ou cosmeticamente utilizáveis incluem, mas não são limitados a, retardar, tornar mais lento, prevenir, reverter, reduzir, e de outro modo modificar de um modo benéfico, um estado de doença ou efeitos cosméticos adversos associados com o envelhecimento de células de mamíferos, especialmente células humanas, e ainda mais especialmente células de pele humana. Estes efeitos cosméticos podem incluir, por exemplo, melhorar a aparência da pele humana já danificada por envelhecimento ou exposição ao sol/vento, prevenir (ou tornar mais lenta) a ocorrência de tal dano primeiramente na pele não danificada, e/ou prevenir (ou tornar mais lenta) a ocorrência de outros destes danos na pele já danificada. Estes efeitos terapêuticos podem incluir, por exemplo, melhorar a condição da pele humana já danificada por um estado de doença, prevenir (ou tornar mais lenta) a ocorrência deste estado de doença primeiramente, e/ou prevenir (ou tornar mais lenta) a re-ocorrência de tais estados de doença adicionais.

A concentração do composto ativo na composição dependerá das taxas de absorção, inativação, excreção do composto ativo, do programa de dosagem, e da quantidade administrada bem como outros fatores conhecidos dos versados na técnica. Tipicamente, uma dosagem terapeuticamente e/ou cosmeticamente efetiva deve liberar uma concentração de pelo menos cerca de 0,005 por cento, preferivelmente pelo menos cerca de 0,05, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 0,1 por cento do composto ativo ao tecido tratado. O ingrediente ativo pode ser administrado de uma vez, ou pode ser dividido em um número de doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. Compreende-se que a dosagem exata e duração do tratamento é uma função do tecido sendo tratado e podem ser determinadas empiricamente usando protocolos de teste conhecidos ou por extrapolação de dados de teste in vivo ou in vitro. Deve ser notado que as concentrações e valores de dosagem podem também variar de acordo com a idade do indivíduo tratado. Deve ser ainda compreendido que, para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados no tempo de acordo com a necessidade individual e o critério profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições, e que as faixas de concentração especificadas aqui são exemplares somente e não pretendem limitar o escopo ou prática das composições reivindicadas.

Para tratamento da pele, os compostos podem ser formulados como composições cosméticas ou farmacêuticas para aplicação local ou tópica à pele em que derivados de purina 6,9-di-substituída são misturados com um veículo farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitável. As composições podem ser providas na forma géis, cremes, loções, sólidos, soluções, suspensões, aerossóis, e outras. As composições para tratar pele humana são formuladas para aplicação tópica com um derivado de purina 6,9- di-substituída em uma faixa de concentração efetiva, entre cerca de 0,008 a cerca de 20 por cento, preferivelmente cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento, e mais preferivelmente cerca de 0,1 a cerca de 2 por cento em um creme, unguento, loção, gel, solução, base sólida ou veículo conhecido na técnica ser não tóxico e dermatologicamente aceitável. A concentração ou fração de peso do derivado de purina 6,9-di-substituída dissolvido, colocado em suspensão, dispersado, ou de outro modo misturado em uma composição para uso com pele humana será de tal modo que o derivado de purina 6,9-di-substituída é liberado em uma concentração efetiva, geralmente pelo menos cerca de 0,005 por cento, preferivelmente pelo menos cerca de 0,05 por cento, e preferivelmente pelo menos cerca de 0,1 por cento em células ativas da pele (por exemplo, fibroblastos) de modo que os efeitos adversos do envelhecimento são reduzidos, revertidos ou retardados. O limite superior deve ser ajustado de modo que a taxa de divisão celular ou capacidade proliferativa total das células não é substancialmente aumentada, particularmente de modo que as células ou tecidos tratados não demonstrem quaisquer sinais típicos de alterações cancerosas ou pré-cancerosas ou quaisquer mudanças cosmeticamente indesejáveis, como o desenvolvimento de lesões. Embora o limite superior possa ser de até cerca de 20 por cento, limites superiores mais baixos (como 10 por cento, 2 por cento, ou mesmo 1 por cento) são geralmente preferidos uma vez que os efeitos anti- envelhecimento são evidentes nestas taxas mais baixas e o risco de aumento indesejável na taxa de divisão de células ou capacidade proliferativa total das células é minimizado. Geralmente, veículos emolientes ou lubrificantes que ajudam a hidratar a pele são mais preferidos do que veículos voláteis, como etanol, que ressecam a pele.

Exemplos de bases ou veículos apropriados para preparar composições para uso com pele humana são petrolato, petrolato mais silicones voláteis, lanolina, creme frio (USP), e unguento hidrofílico (USP). As composições podem ser preparadas contendo uma quantidade efetiva de um ou mais derivados de derivado de purina 6,9-di-substituída formulados para aplicação tópica, como emulsificados, colocados em suspensão ou de outro modo misturados com um unguento ou base de creme apropriado.

A escolha de um veículo aceitável é determinada em grande

parte pelo modo como o derivado de purina 6,9-di-substituída deve ser administrado. Estes métodos incluem administração tópica. Veículos farmaceuticamente apropriados e dermatologicamente aceitáveis para aplicação tópica incluem os apropriados para uso em loções, cremes, soluções, suspensões, géis, sólidos e outros, Geralmente, o veículo é ou de natureza orgânica ou uma emulsão aquosa e capaz de ter o derivado de purina 6,9-di-substituída dispersado, colocado em suspensão ou dissolvido no mesmo. O veículo pode incluir, por exemplo, emolientes farmaceuticamente aceitáveis, melhoradores de absorção pela pele, protetores UV, antioxidantes, tampões, agentes colorantes, fragrâncias, emulsificadores, cargas, agentes de espessamento, solventes, e outros.

Segue-se uma relação mais detalhada e descrição destas formas (que não pretende ser exaustiva):

(1) Loções: As loções contêm uma concentração efetiva de um ou mais derivados de purina 6,9-di-substituída. A concentração efetiva é preferivelmente efetiva para liberar os derivados de purina 6,9-di-substituída em uma concentração de entre cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento em células ativas da pele, particularmente os fibroblastos na derme. As loções podem conter também de cerca de 1 a cerca de 50 por cento, preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 15 por cento, de um emoliente e o resto água, um tampão apropriado, um álcool C2 ou C3, ou uma mistura de água ou o tampão e o álcool. Quaisquer emolientes conhecidos dos versados na técnica como apropriados para aplicação à pele humana podem ser usados. Estes incluem, mas não estão limitados aos seguintes: (a) Óleos e ceras de hidrocarboneto incluindo (mas não limitadas a) óleo mineral, petrolato, parafina, ceresina, ozoquerita, cera microcristalina, polietileno, e per-hidroesqualeno.

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(b) Oleos de silicone incluindo (mas não limitados a) dimetilpolissiloxanos, metilfenilpolissiloxanos, copolímeros de silicone-glicol solúveis em água e solúveis em álcool.

(c) Gorduras e óleos de triglicerídeo, incluindo os derivados de fontes vegetais, animais e marinhas. Exemplos incluem (mas não estão limitados a) óleo de rícino, óleo de girassol, óleo de semente de algodão, óleo de milho, azeite, óleo de fígado de bacalhau, óleo de amêndoa, óleo de abacate, azeite de dendê, óleo de gergelim e óleo de soja.

(d) Esteres de acetoglicerídeo incluindo (mas não limitados a) monoglicerídeos acetilados.

(e) Glicerídeos etoxilados incluindo (mas não limitados a)monoestearato de glicerila etoxilado.

(f) Esteres alquílicos de ácidos graxos tendo 10 a 20 átomos de carbono. Esteres metílicos, isopropílicos e butílicos de ácidos graxos são utilizáveis aqui. Exemplos incluem (mas não estão limitados a) laurato de hexila, laurato de isohexila, palmirato de isohexila, palmirato de isopropila, miristato de isopropila, oleato de decila, oleato de isodecila, estearato de hexadecila, estearato de decila, isoestearato de isopropila, adipato de diisopropila, adipato de diisohexila, adipato de dihexildecila, sebacato de diisopropila, lactato de laurila, lactato de miristila, e lactato de cetila.

(g) Esteres alquenílicos de ácidos graxos tendo 10 a 20 átomos de carbono. Exemplos dos mesmos incluem (mas não estão limitados a) miristato de oleíla, estearato de oleíla e oleato de oleíla.

(h) Ácidos graxos tendo 9 a 22 átomos de carbono. Exemplos apropriados incluem (mas não estão limitados a) ácidos pelargônico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, isoesteárico, hidroxiesteárico, oléico, linoleico, araquidônico, beênico e erúcico.

(i) Álcoois graxos tendo 10 a 22 átomos de carbono incluindo (mas não limitados a) álcoois laurílico, miristílico, cetílico, hexadecílico, estearílico, isoestearílico, hidroxiestearílico, oleílico, ricinoleílico, behenílico, erucílico e 2-octil dodecílico.

(j) Éteres de álcool graxo incluindo (mas não limitados a) álcoois graxos etoxilados de 10 a 20 átomos de carbono, como (mas não limitados a) álcoois laurílico, cetílico, estearílico, isoestearílico, oleílico e de colesterol tendo fixados ao mesmo de 1 a 50 grupos óxido de etileno ou 1 a 50 grupos óxido de propileno ou misturas dos mesmos.

(k) Éter-ésteres incluindo (mas não limitados a) ésteres de ácido graxo de álcoois graxos etoxilados.

(1) Lanolina e derivados incluindo (mas não limitados a) lanolina, óleo de lanolina, cera de lanolina, álcoois de lanolina, ácidos graxos de lanolina, lanolato de isopropila, lanolina etoxilada, álcoois de lanolina etoxilados, colesterol etoxilado, álcoois de lanolina propoxilados, lanolina acetilada, álcoois de lanolina acetilados, linoleato de álcoois de lanolina, ricinoleato de álcoois de lanolina, acetato de ricinoleato de álcoois de álcoois de lanolina, acetato de álcoois-ésteres etoxilados, hidrogenólise de lanolina, lanolina hidrogenada etoxilada, lanolina de sorbitol etoxilada e bases de absorção de lanolina líquida e semi-sólida.

(m) Álcoois poli-hídricos e derivados de poliéter incluindo (mas não limitados a) propileno glicol, dipropileno glicol, polipropileno glicol (M.W. 2.000-4.000), polioxietileno polioxipropileno glicóis, polioxipropileno polioxietileno glicóis, glicerol, glicerol etoxilado, glicerol propoxilado, sorbitol, sorbitol etoxilado, hidroxipropil sorbitol, polietileno glicol (M.W. 200-6.000), metóxi polietileno glicóis 350, 550, 750, 2.000, 5.000, homopolímeros de poli[óxido de etileno) (M.W. 100.000-5.000.000), polialquileno glicóis e derivados, (2-metil-2,4-pentanodiol) hexileno glicol, 1,3-butileno glicol, 1,2,6-hexanotriol, (2-etil-l,3-hexanodiol) eto-hexadiol USP, derivados de vicina glicol Ci5-Ci8 e polioxipropileno de trimetilolpropano.

(n) Esteres de álcool poli-hídrico incluindo (mas não limitados a) ésteres de ácido mono- e di-graxo de etileno glicol, ésteres de ácido mono- e di-graxo de dietileno glicol, polietileno glicol (M.W. 200-6.000), ésteres de mono- e di-graxos, ésteres de ácido mono- e di-graxo de propileno glicol, monooleato de polipropileno glicol 2000, monoestearato de polipropileno glicol 2000, monoestearato de propileno glicol etoxilado, ésteres de ácido mono- e di-graxo glicerílicos, ésteres de ácido poli-graxo de poliglicerol, monoestearato de glicerila etoxilado, monoestearato de 1,3-butileno glicol, diestearato de 1,3-butileno glicol, ésteres de ácido graxo de polioxietileno glicol, ésteres de ácido graxo de sorbitano, e ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano.

(o) Ésteres de cera incluindo (mas não limitados a) cera de abelha, espermacete, miristato de miristila, e estearato de estearila e derivados de cera de abelha, incluindo, mas não limitados a, cera de abelha de polioxietileno sorbitol, que são produtos da reação de cera de abelha com sorbitol etoxilado de teor de óxido de etileno variado que formam uma mistura de éter-ésteres.

(p) Ceras vegetais (incluindo mas não limitadas a) ceras de carnaúba e de candelila.

(q) Fosfolipídeos incluindo (mas não limitados a) lecitina e

derivados.

(r) Esteróis incluindo (mas não limitados a) colesterol e ésteres de ácido graxo de colesterol.

(s) Amidas incluindo (mas não limitadas a) amidas de ácido graxo, amidas de ácido graxo etoxilado, e alcanolamidas de ácido graxo sólidas. As loções também podem conter de cerca de 1 a cerca de 10 por cento, mais preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 5 por cento, de um emulsifícador. Os emulsificadores podem ser não iônicos, aniônicos ou catiônicos. Exemplos de emulsificadores não iônicos satisfatórios incluem (mas não estão limitados a) álcoois graxos tendo 10 a 20 átomos de carbono, álcoois graxos tendo 10 a 20 átomos de carbono condensados com 2 a 20 moles de óxido de etileno ou óxido de propileno, fenóis alquílicos com 6 a 12 átomos de carbono na cadeia alquila condensada com 2 a 20 moles de óxido de etileno, ésteres de ácidos mono- e di-graxos de óxido de etileno, ésteres de ácidos mono- e di-graxos de etileno glicol em que a porção ácido graxo contém de 10 a 20 átomos de carbono, dietileno glicol, polietileno glicóis de peso molecular 200 a 6.000, propileno glicóis de peso molecular 200 a 3.000, glicerol, sorbitol, sorbitano, polioxietileno sorbitol, polioxietileno sorbitano e ésteres de cera hidrofílicos. Emulsificadores aniônicos apropriados incluem (mas não estão limitados a) os sabões de ácido graxo, por exemplo, sabões de sódio, potássio e trietanolamina, em que a porção ácido graxo contém de 10 a átomos de carbono. Outros emulsificadores aniônicos apropriados incluem (mas não estão limitados a) metal alcalino, amônio ou sulfatos de alquil amônio substituídos, arilsulfonatos de alquila, e sulfonatos de éter etóxi alquílicos tendo 10 a 30 átomos de carbono na porção alquila. Os sulfonatos de éter etóxi alquílicos contém de 1 a 50 unidades óxido de etileno. Dentre os emulsificadores catiônicos satisfatórios estão amônio quaternário, compostos morfolínio e piridínio. Alguns dos emolientes descritos nos parágrafos precedentes também têm propriedades emulsificantes. Quando uma loção é formulada contendo um emoliente, um outro emulsifícador não é necessário, contudo ele pode ser incluído na composição.

O resto da loção é geralmente água ou um álcool C2 ou C3, ou uma mistura de água e o álcool. As loções podem ser formuladas simplesmente misturando todos os componentes juntos. Preferivelmente, o derivado de purina 6,9-di-substituída é dissolvido, colocado em suspensão ou de outro modo uniformemente dispersado na mistura.

Outros componentes convencionais destas loções podem ser incluídos. Um aditivo é um agente de espessamento em um nível de cerca de 1 a cerca de 10 por cento da composição. Exemplos de agentes de espessamento apropriados incluem, mas não estão limitados a, polímeros de carboxipolimetileno reticulados, etil celulose, polietileno glicóis, goma tragacanto, goma caraia, gomas xantano e bentonita, hidroxietil celulose e hidroxipropil celulose.

Um exemplo preferido de uma composição apropriada para aplicação à pele facial humana como uma loção contém cerca de 0,5 a cerca de 10 por cento de um derivado de purina 6,9-di-substituída desta invenção (preferivelmente puranil cinetina) em uma base preparada misturando 10 partes de monoestearato de glicerol, 10 partes de álcool cetílico, 30 partes de espermacete, 10 partes de Tween 20 (derivado de polioxialquileno de monoestearato de sorbitano), 10 partes de Span 20 (monolaurato de sorbitano), 12,5 partes de glicerina e 100 partes de água.

(2) Cremes. Os cremes são formulados para conter uma concentração efetiva de um ou mais derivados de purina 6,9-di-substituída. A concentração efetiva é tipicamente uma quantidade efetiva para liberar os derivados de purina 6,9-di-substituída ao tecido tratado a entre cerca de 0,5 a cerca de 10 por cento a células ativas da pele, particularmente os fibroblastos na derme. Os cremes também contêm de cerca de 5 a cerca de 60 por cento, preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 25 por cento, de um emoliente e o restante é água ou outro veículo não tóxico apropriado, como um tampão isotônico. Os emolientes, como descrito acima para as loções, também podem ser usados nas composições de creme. O creme também pode conter um emulsificador apropriado, como descrito acima. O emulsificador é incluído na composição em um nível de cerca de 3 a cerca de 50 por cento, preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 20 por cento.

(3) Soluções e Suspensão. As soluções são formuladas para conter uma quantidade efetiva de um ou mais derivados de purina 6,9-di- substituída que é tipicamente uma quantidade efetiva para liberar os derivados

de purina 6,9-di-substituída a entre cerca de 0,5 a cerca de 10 por cento a células ativas da pele, particularmente os fibroblastos da derme; o resto é água, um solvente orgânico apropriado ou outro tampão ou solvente apropriado. Materiais orgânicos apropriados utilizáveis como o solvente ou uma parte de um sistema de solvente são como se segue: propileno glicol, polietileno glicol (M.W. 200-600), polipropileno glicol (M.W. 425-2025), glicerina, ésteres de sorbitol, 1,2,6-hexanotriol, etanol, isopropanol, dietil tartrato, butanodiol e misturas dos mesmos. Este sistemas de solvente também podem conter água.

As composições que são formuladas como soluções ou suspensões podem ser aplicadas à pele, ou, podem ser formuladas como um aerossol e aplicadas à pele como uma pulverização. As composições de aerossol ainda contêm de cerca de 25 a cerca de 60 por cento, preferivelmente de cerca de 30 a cerca de 50 por cento, de um propelente apropriado. Exemplos destes propelentes são os hidrocarbonetos clorados, fluorados e clorofluorados de baixo peso molecular. Óxido nitroso, dióxido de carbono, butano e propano também são usados como gases propelentes. Estes propelentes são usados como entendido na técnica em uma quantidade e sob uma pressão apropriadas para expelir os conteúdos do recipiente.

(4) Géis. As composições de gel podem ser formuladas simplesmente misturando o agente de espessamento apropriado às

composições de solução ou suspensão previamente descritas. Exemplos de agentes de espessamento apropriados foram previamente descritos com respeito às loções.

As composições gelificadas contêm uma quantidade efetiva de um ou mais derivados de purina 6,9-di-substituída que é tipicamente uma quantidade efetiva para liberar os derivados de purina 6,9-di-substituída a entre 0,05 a cerca de 10 por cento a células ativas da pele, particularmente os fibroblastos da derme; de cerca de 5 a cerca de 75 por cento, preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 50 por cento, de um solvente apropriado como previamente descrito; de cerca de 0,5 a cerca de 20 por cento, preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 10 por cento de agente de espessamento; o resto sendo água ou outro veículo aquoso.

(5) Sólidos: As composições e formas sólidas podem ser formuladas como composições tipo adesivas pretendidas para aplicação aos lábios ou outras partes do corpo. Estas composições contêm uma quantidade efetiva de um ou mais derivados de purina 6,9-di-substituída. A quantidade é tipicamente uma quantidade efetiva para liberar os derivados de purina 6,9-di- substituída em entre cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento a células ativas da pele, particularmente os fibroblastos da derme. Os sólidos também contêm de cerca de 50 a cerca de 98 por cento, preferivelmente de cerca de 60 a cerca de 90 por cento, dos emolientes previamente descritos. Esta composição pode conter ainda de cerca de 1 a cerca de 20 por cento, preferivelmente de cerca de 6 a cerca de 15 por cento, de um agente de espessamento apropriado, e, se desejado ou necessário, emulsificadores e água ou tampões. Os agentes de espessamento previamente descrito com respeito a loções são apropriadamente empregados nas composições na forma sólida.

Outros ingredientes, como conservantes, incluindo metil- parabeno ou etil-parabeno, perfumes, corantes ou outros, que são conhecidos na técnica como proporcionando uma estabilidade desejável, fragrância ou cor, ou outras propriedades desejáveis, como blindagem dos raios actínicos do sol, a composições para aplicação à pele também podem ser empregados em qualquer um destes tipos de composições para aplicação tópica ou outra.

A composição também pode incluir outros ingredientes ativos melhoradores dos efeitos adversos da idade, como retinóides, cinetina, e/ou zeatina diferentes dos derivados de purina 6,9-di-substituída, mas não deve incluir ingredientes, como auxina, que potencializam ou induzem propriedades de indução de divisão celular. As composições preferidas contêm, como o único ingrediente melhorador dos efeitos adversos da idade, um ou mais derivados de purina 6,9-di-substituída.

Composições para uso com a pele humana preferivelmente podem ser aplicadas uma vez por dia ou, se necessário para obter o resultado desejado, mais freqüentemente, às áreas da pele para a qual o tratamento é procurado. Compreende-se que o regime de tratamento exato depende do indivíduo tratado e pode ser verificado empiricamente dependendo da formulação e, particularmente, da idade do indivíduo tratado. Qualquer regime é aceitável contanto que os efeitos melhoradores da idade desejados sejam obtidos sem efeitos colaterais prejudiciais substanciais ou prolongados indesejáveis.

Os métodos para tratar a pele humana são praticados aplicando-se à pele, preferivelmente diariamente, uma composição da invenção apropriada para tratamento da pele humana, como discutido acima, durante um período indefinido, geralmente tão longo quanto a pessoa desejar desfrutar da melhora dos efeitos adversos do envelhecimento da pele. Uma vez que a aplicação diária à pele de uma composição deve ser requerida durante pelo menos cerca de um mês, e até pelo menos cerca de um ano, dependendo da idade da pessoa, da condição da pele à qual a composição é aplicada, e da concentração de derivado de purina 6,9-di-substituída na composição, antes dos efeitos benéficos (por exemplo, retardo de mudanças morfológicas relacionadas com a idade em fibroblastos da camada de células basais da pele) começarem a tornar-se evidentes na superfície da pele. Se a aplicação do derivado de purina 6,9-di-substituída for terminada, os efeitos de envelhecimento melhorados pelo método podem novamente seguir após algum tempo.

Para fibroblastos (ou outras células ativas, como queratinócitos) da pele humana, o método é praticado aplicando-se à superfície externa da pele uma composição que é formulada como um creme, unguento, loção, gel, solução, perfume, sólidos fisiologicamente aceitáveis, ou outra forma apropriada para aplicação à superfície externa da pele, em que a composição contém um ou mais derivados de purina 6,9-di-substituída em uma concentração efetiva para fornecer à derme da pele uma efetiva concentração eficaz para melhorar os efeitos adversos do envelhecimento em células ativas (por exemplo, fibroblastos) na derme, em que a pele tratada envelhece mais lentamente do que a pele não tratada e/ou torna-se mais jovem na aparência do que antes do tratamento como manifestado pela redução de rugas e/ou perda da firmeza ou outros indicadores cosméticos da idade. Estas concentrações são tipicamente cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento (preferivelmente cerca de 0,1 a cerca de 2 por cento), A concentração exata, que pode ser determinada empiricamente, é uma função do veículo ou veículo de liberação e a forma em que a composição é apresentada à superfície da pele.

A invenção refere-se também a métodos para tratar de senescência da pele e os estados de doença mencionados acima bem como para melhorar os efeitos adversos do envelhecimento de células de mamífero, especialmente células humanas (e mais especialmente células da pele humana). O um ou mais derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção podem ser administrados profilaticamente ou terapeuticamente na forma das composições descritas acima e nas quantidades efetivas descritas acima.

Como usado aqui, melhorar o efeito adverso do envelhecimento de células de mamífero significa que o desenvolvimento de mudanças morfológicas que normalmente ocorrem com o envelhecimento em células de mamífero normais in vitro ou in vivo é diminuído, revertido e/ou retardado. Os efeitos adversos do envelhecimento também incluem mudanças relacionadas à idade na expressão de genes e biossíntese de proteína. O efeito melhorador referido aqui é obtido sem aumentar substancialmente a taxa de crescimento ou capacidade proliferativa total das células que são tratadas.

A melhora dos efeitos adversos do envelhecimento em células,

incluindo os efeitos em células in vitro ou in vivo, pode ser detectada como um retardo ou reversão do início das mudanças morfológicas e fenotípicas relacionadas à idade que normalmente ocorrem com o envelhecimento das células. Estas mudanças incluem as mudanças detectadas em células de cultura de tecidos, como a falha de células mais velhas em responder a fatores de crescimento exógenos e/ou o alto nível de autofluorescência encontrado nas células velhas. A medida que as células envelhecem demonstram uma perda dependente da idade do potencial proliferativo. Células de fibroblastos cultivadas que são velhas exibem muitas características relacionadas à idade, incluindo morfologia enfraquecida e irregular, tamanho anormalmente grande, crescimento esparso, rendimento de células baixo por área de unidade de substrato de cultura, uma freqüência significativa de células polinucleadas, dificuldade em tripsinização, a incapacidade de crescer até confluência, e/ou uma alta taxa de produção de resíduos no meio de cultura. Células jovens demonstram maior receptividade a fatores de crescimento e taxas mais altas de DNA e síntese de proteína do que células velhas. Células de fibroblasto de mamífero jovem, incluindo humano, em cultura de tecido, parecem mais saudáveis e limpas; possuem uma morfologia de forma de fuso fino, longo, regular; são firmemente compactadas em arranjos tornando-se confluentes nos substratos de cultura; não crescem em excesso uma com as outras, raramente tem mais de um núcleo; e produzem poucos resíduos no meio de cultura. Mudanças in vivo relacionadas com a idade incluem mudanças em tecidos de mamífero, como o desenvolvimento ou aumento em número ou profundidade de rugas, linhas, pele sem firmeza, descolorações, manchas irregulares, aspecto de couro, e/ou aparência amarelada associada com a aparência cosmética da pele bem como as mudanças associadas na integridade estrutural e funcional do tecido. As composições desta invenção são efetivas na melhora da aparência e condição da pele global, incluindo mudanças relacionadas à idade e mudanças que podem não estar intimamente relacionadas ao envelhecimento (por exemplo, acne, eritema, vermelhidão, e outras). Para os fins desta invenção, as mudanças que podem não estar intimamente relacionadas ao envelhecimento ou podem até ser independentes do envelhecimento são destinadas a serem incluídas em mudanças relacionadas com a idade.

Os métodos desta invenção podem ser usados em combinação com outros métodos terapêuticos ou cosméticos (especialmente os associados com tratamento da pele humana). Assim, os presentes métodos podem ser usados em combinação com, por exemplo, laser ou outros dispositivos ou tratamentos à base de luz.

Como usado aqui, a capacidade proliferativa total de células normais, como células de fibroblastos, é uma medida da capacidade proliferativa finita de células e refere-se ao número total de duplicação do número de células que uma cultura destas células pode sofrer antes que o crescimento da cultura cesse e é uma função da idade do doador do qual as células foram obtidas. As células obtidas de tecido fetal demonstram uma capacidade proliferativa maior em cultura do que células obtidas de tecido adulto.

Como usado aqui, a taxa de crescimento ou taxa de proliferação é uma medida da taxa em que as células se dividem. Uma unidade de medida reconhecida pelos versados na técnica é a recíproca de duplicação do tempo. Ao término do tempo de vida de uma cultura de células normais, a cessação do crescimento da cultura aparece muito rapidamente, diminuindo de valores quase normais característicos de células jovens a zero em apenas algumas duplicações.

Como usado aqui, alterar substancialmente a taxa de crescimento ou capacidade proliferativa total significa mudar, além da quantidade que está dentro da variação normal dentre células e tecidos, a taxa de divisão celular ou o número de duplicações de células. Em particular, a taxa de crescimento ou capacidade proliferativa total não é alterada de modo que as células tratadas sejam imortalizadas ou passem por uma transformação maligna. No caso de células tratadas in vivo, o tecido tratado não muda substancialmente o tamanho, espessura ou desenvolve células pré-cancerosas ou cancerosas. Métodos para avaliar a taxa de crescimento e capacidade proliferativa total são conhecidos dos versados na técnica. Qualquer um destes métodos, incluindo os exemplificados aqui, pode ser usado para avaliar a alteração na taxa de crescimento ou capacidade proliferativa total.

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção podem ser preparados geralmente

a partir de 6-cloro-9-substituídas purinas correspondentes por reação com a amina apropriada.

6-cloro-9-(2-tetrahidropiranil) purina, que pode ser usada para preparar os derivados de purina 6,9-di-substituída preferidos desta invenção, pode ser sintetizada a partir de 6-cloropurina e 3,4-di-hidropirano usando ácido p-toluenossulfônico de acordo com a literatura (Robins et al., J. Am. Chem. Soe. 83, 2574 (1961)). Partindo de benzilaminas não substituídas ou substituídas com metóxi, fenilaminas e furfurilaminas, não comercialmente disponíveis (ou de outra forma obtidas via Sigma Aldrich ou Fluorochem), podem ser preparadas a partir dos aldeídos correspondentes na presença de catalisador de metal apropriado. A purina 6-cloro-9-(2-tetrahidrofuranila) pode ser sintetizada a partir de 6-cloropurina e 3,4-di-hidrofurano usando ácido p-toluenossulfônico.

Os seguintes exemplos são incluídos para os fins ilustrativos somente e não são se destinam a limitar o escopo da invenção. Salvo indicado ao contrário, todas as concentrações, relações, e outros são expressos com base no peso. Todas as referências citadas aqui são incorporadas por referência em suas totalidades.

Exemplo 1. Este exemplo ilustra a preparação de purina 6- cloro-9-(2-tetrahidropiranila). Uma mistura de 6-cloropurina (60 g, 388 mmol) e ácido tósico monoidratado (1 g) em acetato de etila (750 ml) foi vigorosamente agitada a 50 0C. 3,4-Di-hidropirano (40 ml, 438 mmol) foi adicionado em gotas durante um período de 30 min, mantendo a temperatura de reação entre 55 - 60 0C (Robins et al., 1961). A solução foi agitada durante uma hora adicional durante este tempo ela foi deixada resfriar em temperatura ambiente. Amônia aquosa concentrada (35 ml) foi adicionada e a solução agitada durante 5 min. Solução verde-escuro homogênea foi subseqüentemente extraída com 2 χ 200 ml de água. O extrato de acetato de etila amarelo foi secado durante a noite sobre sulfato de sódio e então resfriado a -20 0C. Um sólido amarelo resultante foi secado novamente a vácuo sobre pentóxido de fósforo a 37 °C. Rendimento: 66,9 g (72,2%). MS (ES): [M+H]+ = 239 (100).

Exemplo 2. O exemplo também ilustra a preparação de 6- cloro-9-(2-tetrahidrofuranil) -purina. Uma mistura de 6-cloropurina (50 g, 323 mmol) e ácido p-toluenossulfônico (2,5 g, 14,5 mmol) em acetato de etila (200 ml) foi vigorosamente agitada em temperatura ambiente. 2,3-Di- hidrofurano (37,5 g, 535 mmol) foi adicionado em gotas durante um período de 30 min. A solução foi agitada durante uma hora adicional a qual 6- cloropurina foi completamente dissolvida (Lewis et al., J. Org. Chem.; 26; 1961; 3837). Subseqüentemente, amônia aquosa (150 ml) misturada com água em uma relação molar 1:1 foi adicionada. Solução amarela escura homogênea foi então extraída com 2 χ 100 ml de água. O extrato de acetato de etila amarelo foi secado durante a noite sobre sulfato de sódio. Então, a solução foi filtrada e evaporada. Após evaporação a vácuo, um óleo amarelo bruto foi secado a vácuo sobre pentóxido de fósforo a 37 0C. O produto bruto amarelo foi recristalizado a partir de éter de petróleo. Rendimento: 80%, sólido amarelo. Ponto de fusão: 92 - 95°C. TLC (tolueno: acetato de etila, 1:2 (v:v), ponto único. Pureza HPLC: >97%. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): 2,05 sep (1H, J = 6,8 Hz); 2,22 sep (1H, J = 6,8 Hz); 2,48 m (2H); 3,95 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,20 qq (1H, Ja = 7,4 Hz, Jb = 1,9 Hz); 6,40 m (1H); 8,78 s (1H); 8,80 s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 225 (100).

Exemplo 3. Este exemplo ilustra a preparação de 6- furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina. Para furfurilamina (100 g, 91 ml, 1030 mmol,), 30,3 g de 6-cloro-9-(2-tetrahidropiranil) purina (126,9 mmol) foram adicionados. O sólido completamente dissolveu em misturação completa. A solução homogênea foi aquecida a 90 0C durante 60 min e subseqüentemente resfriada em temperatura ambiente. Cloridrato de furfurilamina cristalino, incolor foi imediatamente depositado e filtrado. O filtrado restante foi evaporado a vácuo. Iso-octano (600 ml) foi adicionado ao óleo amarelo, agitado completamente e deixado permanecer em temperatura ambiente. O produto lentamente cristalizou durante cerca de 1 hora. O precipitado sólido branco foi filtrado, lavado com éter etílico (50 ml), e secado em ar durante a noite para remover o solvente. O produto bruto foi recristalizado em metanol. Rendimento: 24,4 g (81,52 mmol, 64,2%). Ponto de fusão: distinto a 144 - 145°C, sem decomposição. TLC (clorofórmio: metanol (95:5 (v:v))): ponto único (Rf = 0,35). TLC (clorofórmio): ponto único (Rf = 0,34). Pureza HPLC: 99+%. Análise elementar % (esperado/encontrado): C = 60,19/60,14, H = 5,72/5,70, N = 23,40/23,30. Exemplo 4. O exemplo também ilustra a preparação de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidrofuranil) purina. Para furfurilamina (1456 mg, 15 mmol) colocada em 100 ml de n-propanol, 6- cloro-9-(2-tetrahidrofuranil) purina (2247 mg, 10 mmol) e trietilamina (3,6 ml, 25 mmol) foram adicionadas. O sólido completamente dissolveu em misturação completa. A solução homogênea foi aquecida a 100 0C durante 3 horas e subseqüentemente resfriada em temperatura ambiente. Após evaporação a vácuo, o material resultante foi tratado com água (100 ml) e extraído em acetato de etila (100 ml). O extrato de acetato de etila foi evaporado e o resíduo subseqüentemente lavado com 50 ml éter dietílico. O produto bruto branco foi recristalizado em metanol. Rendimento: 85%, sólido branco. Ponto de fusão: 128 - 129°C. TLC (CHC13:metanol, 8:2 (v:v), ponto único. Pureza HPLC: >99%. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): 2,02 sep (1H, J = 6,8 Hz); 2,22 sep (1H, J = 6,8 Hz); 2,42 m (2H); 3,91 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,14 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,70 bs (2H); 6,23 dd (1H, Ja = 3,2 Hz, Jb = 0,9 Hz); 6,26 m (1H); 6,36 t (1H, J = 2,4 Hz); 7,53 m (1H); 8,19 bs (1H); 8,24 s (1H); 8,27 s (1H). MS (ES): [M+H]+= 286 (100).

Exemplo 5. Este exemplo ilustra a preparação de 6-(4- metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina. Uma mistura de 10 mmol de 6-cloro-9-(2-tetrahidropiranil) purina (preparada a partir de 1546 mg de 6- cloropurina), 12 mmol de 4-metoxibenzilamina e 5 ml de trietilamina foi refluxada em «-propanol durante 3 horas. Após evaporação a vácuo n- propanol, o material resultante foi tratado com água e extraído em acetato de etila. A fase de acetato de etila foi secada sobre Na2SO4, filtrada, evaporada e o resíduo subseqüentemente lavado com 30 ml de éter dietílico. Um resíduo sólido foi filtrado e o produto bruto recristalizado de metanol. Rendimento: 80%, sólido branco. Ponto de fusão: 137 - 138°C. TLC (CHCl3:metanol (8:2 (v:v))): ponto único. Pureza HPLC: >98%. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): 1,55 m (2H); 1,68 m (1H); 1,93 m (2H); 2,26 qq (Ja = 11,0 Hz, Jb = 4,3 Hz); 3,64 qq (1H, Ja = 11,0 Hz, Jb = 4,3 Hz); 3,70 s (3H); 4,00 d (1H, J = 11,0 Hz); 4,65 s (2H); 5,63 dd (1H, Ja = 11,0 Hz, Jb = 2,2 Hz); 6,85 d (2H, J = 8,8 Hz); 7,28 d (2H, J = 8,8 Hz); 8,23 s (1H); 8,29 bs (1H); 8,34 s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 340(100).

Exemplo 6. Este exemplo ilustra a preparação de 6-(2-

metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina. Uma mistura de 6-cloro-9- (2-tetrahidropiranil) purina (2387 mg, 10 mmol), preparada a partir de 1546 mg de 6-cloropurina, 2-metoxibenzilamina (1470 mg, 12 mmol) e 5 ml de trietilamina (35 mmol) foi refluxada em n-propanol durante 3 horas. O sólido completamente dissolveu em misturação completa. Após evaporação a vácuo de n-propanol, o material resultante foi tratado com água (100 ml) e extraído em acetato de etila (100 ml). O extrato de acetato de etila foi evaporado e o resíduo subseqüentemente lavado com 50 ml de éter de petróleo. O produto bruto branco foi recristalizado em metanol. Rendimento: 90%, sólido branco. Ponto de fusão: 106 - 108°C. TLC (CHC13:metanol, (8:2 (v:v), ponto único. Pureza HPLC: >98%. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): 1,56 m (2H); 1,71 m (1H); 1,94 m (2H); 2,27qq (1H, Ja = 12,3 Hz, Jb = 3,8 Hz); 3,67 m (1H); 3,83 s (3H); 4,20 m (1H); 4,71 bs (2H); 5,64 dd (1H, Ja = 11,3 Hz, Jb = 1,9 Hz); 6,83 tt (1 H, Ja = 7,4 Hz, Jb = 0,9 Hz); 6,97 dd (1H, Ja = 8,2 Hz, Jb = 0,7 Hz); 7,14 d (1H, J = 7,3 Hz); 7,20 tt (1H, Ja = 7,8 Hz, Jb = 1,7 Hz); 8,09 s (1H); 8,21 s (1H); 8,36 s (1H). MS (ES): [M+H]+= 340 (100).

Exemplo 7. Este exemplo ilustra a preparação de 6-(4- metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidrofuranil) purina. Uma mistura de 10 mmol de 6-cloro-9-(2-tetrahidrofuranil) purina (preparada a partir de 1546 mg de 6- cloropurina), 12 mmol de 4-metoxibenzilamina e 5 ml de trietilamina foi refluxada em w-propanol durante 3 horas. Após evaporação a vácuo n- propanol, o material resultante foi consequentemente tratado com água e extraído em acetato de etila. A fase de acetato de etila foi evaporada e o resíduo subseqüentemente lavado com 30 ml de éter dietílico. O resíduo sólido foi filtrado e o produto bruto cristalizado de metanol. Rendimento: 80%, sólido branco. Ponto de fusão: 182 - 183 0C. TLC (CHCl3:metanol (8:2 (v:v)): ponto único. Pureza HPLC: >98 %. 1H NMR (400 MHz, DMSO): 2,02 sxt (1H, J = 7,4 Hz); 2,21 sxt (1H, J = 7,4 Hz); 2,44 m (2H); 3,72 s (3H); 3,90 q (1H, J - 7,4 Hz); 4,15 q (J = 7,4 Hz); 4,67 s (H); 6,28 m (1H); 6,86 d (2H, J = 8,7 Hz); 7,31 d (2H, J - 8,7 Hz); 8,1 bs (1H); 8,19 s (1H); 8,29 s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 326 (100).

Exemplo 8. Este exemplo ilustra a preparação de 6-(2- metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidrofuranil) purina. Uma mistura de 2247 mg (10 mmol) de 6-cloro-9-(2-tetrahidropiranil) purina (preparada a partir de 1546 mg de 6-cloropurina), 2-metoxibenzilamina (1470 mg, 12 mmol) e 5 ml de trietilamina (35 mmol) foi refluxada em n-propanol durante 3 horas. O sólido completamente dissolveu em misturação completa. Após evaporação a vácuo de n-propanol, o material resultante foi tratado com água (100 ml) e extraído em acetato de etila (100 ml). O extrato de acetato de etila foi evaporado e o resíduo subseqüentemente lavado com 50 ml de hexano. O produto bruto branco foi recristalizado em metanol. Rendimento: 90%, sólido branco. Ponto de fusão: 97 - 99°C. TLC (CHC13metanol, 8:2 (v:v), ponto único. Pureza HPLC: >98%. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): 2,02 m (1H); 2,21 sep (1H, J = 6,8 Hz); 2,43 m (2H); 3,83 s (3H); 3,91 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,14 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,68 bs (2H); 6,26 m (1H); 6,83 tt (1H, Ja = 7,4 Hz, Jb = 0,9 Hz); 6,98 dd (1H, Ja = 8,2 Hz, Jb = 0,7 Hz); 7,12 d (1H, J = 7,3 Hz); 7,20 tt (1H, Ja = 7,8 Hz, Jb - 1,7 Hz); 8,05 bs (1H); 8,18 s (1H); 8,27 s (1H). MS (ES): [M+H]+= 326 (100). Exemplo 9. Este exemplo ilustra a preparação de 6-(3-

metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina. Uma mistura de 10 mmol de 6-cloro-9-(2-tetrahidropiranil) -purina, 12 mmol de 3-metoxibenzilamina e ml de trietilamina foi refluxada em «-propanol durante 3 horas. Após evaporação a vácuo de «-propanol, o material resultante foi tratado com água e extraído em acetato de etila. A fase de acetato de etila foi secada sobre Na2SO4, filtrada e subseqüentemente evaporada. Quando o resíduo oleoso foi tratado com 30 ml de w-hexano, produto em pó branco formado. O produto bruto foi cristalizado de metanol. Rendimento: 70%, sólido branco. Ponto de fusão: 134 - 135°C. TLC (CHCl3:CH3OH (85:15 (v:v)): ponto único. Pureza HPLC: >99%. 1H NMR (400 MHz, DMSO): 1,56 m (2H); 1,70 m (1H), 1,94 m (2H); 2,30 qq (1H, Ja = 11,0, Jb = 4,3 Hz); 3,67 tt (1H, Ja - 11,0 Hz, Jb = 4,3 Hz); 3,83 s (3H); 4,00 d (1H, J = 11 Hz); 4,71 s (2H); 5,64 dd (1 H, Ja = 11,0 Hz, Jb = 4,3 Hz); 6,83 t (1H, J = 7,7 Hz); 6,97 d (1H, J = 7,7 Hz); 7,14 d (J = 7,7 Hz); 7,20 tt (1H, Ja = 7,7 Hz, Jb = 1,5 Hz); 8,09 bs (1H); 8,21 s (1H); 8,36 s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 340 (100).

Exemplo 10. Este exemplo ilustra a preparação de 6-(4-metoxifenilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina. Uma mistura de 2387 mg (10 mmol) de 6-cloro-9-(2-tetrahidropiranil) purina (preparada a partir de 1546 mg de 6-cloropurina), 4-metoxifenilamina (1803 mg, 15 mmol) e 5 ml de diisopropilamina (35 mmol) foi refluxada em n- propanol (100 ml) durante 5 horas. O sólido completamente dissolveu em misturação completa. Após evaporação a vácuo de n-propanol, o material resultante foi tratado com água (50 ml) e extraído em acetato de etila (50 ml). O extrato de acetato de etila foi evaporado e o resíduo subseqüentemente lavado com 50 ml de éter de petróleo. Rendimento: 90%, sólido branco. Ponto de fusão: 150 - 1510C. TLC (acetato de etila: tolueno, 3:1 (v:v), ponto único. Pureza HPLC: >98%. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): 1,59 m (2H); 1,73 m (1H); 1,97 m (2H); 2,31 qq (1H, Ja = 12,3 Hz, Jb = 3,8 Hz); 3,69 m (1H); 4,02 m (1H); 5,68 dd (1H, Ja = 11,3 Hz, Jb = 1,9 Hz); 6,91 d (1H, J = 9,0 Hz); 7,78 d (1H, J = 9,0 Hz); 8,34 s (1H); 8,47 s (1H); 9,72 s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 326 (100).

Exemplo 11. Este exemplo ilustra a preparação de 6-(3- metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidrofuranil) purina. Uma mistura de 10 mmol de 6-cloro-9-(2-tetrahidrofiiranil) purina (preparada a partir de 1546 mg de 6- cloropurina), 12 mmol de 3-metoxibenzilamina, e 5 ml de trietilamina foi refluxada em «-propanol durante 3 horas. Após evaporação a vácuo de n- propanol, o material resultante foi tratado com água e extraído em acetato de etila. A fase de acetato de etila foi secada sobre Na2SO4, filtrada e evaporada. O resíduo foi subseqüentemente lavado com 30 ml de «-hexano. O sólido em pó branco foi filtrado e o produto bruto foi cristalizado de metanol. Após várias horas, cristais transparentes puros foram obtidos. Rendimento: 80%, sólido branco. Ponto de fusão: 87 - 88°C. TLC (CHCl3:metanol (8:2 (v:v)): ponto único. Pureza HPLC: >98 %. 1H NMR (400 MHz, DMSO): 2,02 sxt (1H, J = 7,4 Hz); 2,22 sxt (1H, J = 7,4 Hz); 2,45 m (2H); 3,84 s (3H); 3,91 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,14 q (1H, J - 7,4 Hz); 4,68 s (2H); 6,26 m (1H); 6,83 t (1H, J = 7,7 Hz); 6,98 d (1H, J = 7,7 Hz); 7,11 d (1H, J = 7,7 Hz); 7,20 t (1H, J = 7,7 Hz); 8,06 bs (1H); 8,17 s (1H); 8,27 s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 326 (100).

Exemplo 12. Este exemplo ilustra a preparação de 6-(2,5- dimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina. Uma mistura de 2387 mg (10 mmol) de 6-cloro-9-(2-tetrahidropiranil) purina, 2,5- dimetoxibenziamina (2006 mg, 12 mmol) e 5 ml de trietilamina (35 mmol) foi refluxada em n-propanol durante 3 horas. O sólido completamente dissolveu em misturação completa. Após evaporação a vácuo de n-propanol, o material resultante foi tratado com água (100 ml) e extraído com acetato de etila (100 ml). O extrato de acetato de etila foi evaporado e o resíduo subseqüentemente lavado com 50 ml de éter dietílico. Sólido branco foi filtrado e secado sob vácuo. Rendimento: 95%, sólido branco. Ponto de fusão: 150 - 152°C. TLC (acetato de etila: hexano, 1:2 (v:v), ponto único. Pureza HPLC: >98%. 1H- RMN (400 MHz, DMSO): 1,56 m (2H); 1,70 m (1H); 1,94 m (2H); 2,27qq (1H, Ja = 12,3 Hz, Jb = 3,8 Hz); 3,60 s (3H); 3,70 s (3H); 3,66 m (1H); 3,78 s (3H); 4,00 m (1H); 4,68 bs (2H); 5,64 dd (1H, Ja = 11,2 Hz, Jb = 2,0 Hz); 6,75 m (2H); 6,89 dd (1Η, Ja = 9,2 Hz, Jb = 1,9 Hz); 8,10 bs (1H); 8,21 s (1H); 8,36 s (1Η). MS (ES): [M+H]+ = 370 (100).

Exemplo 13. O exemplo ilustra a preparação de 6-(2,5- dimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidrofuranil) purina. Uma mistura de 2247 mg (10 mmol) de 6-cloro-9-(2-tetrahidrofuranil) purina (preparada a partir de 1546 mg de 6-cloropurina), 2,5-dimetoxibenziamina (2006 mg, 12 mmol) de e 5 ml de trietilamina (35 mmol) foi refluxada em n-propanol durante 3 horas. O sólido completamente dissolveu em misturação completa. Após evaporação a vácuo de n-propanol, o material resultante foi tratado com água (100 ml) e extraído em acetato de etila (100 ml). O extrato de acetato de etila foi evaporado e o resíduo subseqüentemente lavado com 50 ml de éter dietílico. O produto bruto branco foi recristalizado em metanol. Rendimento: 90%, sólido branco. Ponto de fusão: 103 - 104 °C. TLC (acetato de etila: hexano, 1:2 (v:v), ponto único. Pureza HPLC: >98%. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): 2,02 m (1H); 2,21 sep (1H, J = 6,8 Hz); 2,43 m (2H); 3,60 s (3H); 3,78 s (3H); 3,91 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,14 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,65 bs (2H); 6,26 m (1H); 6,74 m (2H); 6,90 d (1H, J = 8,8 Hz); 8,10 bs (1H); 8,18 s (1H); 8,28 s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 356 (100).

Exemplo 14. O exemplo ilustra a preparação de 6-(2,3,4- trimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina. Uma mistura de 2387 mg (10 mmol) de 6-cloro-9-(2-tetrahidropiranil) purina, cloridrato de 2,3,4- trimetoxibenziamina (2799 mg, 12 mmol) e 8 ml de trietilamina (57 mmol) foi refluxada em n-butanol (45 ml) durante 3 horas. O sólido completamente dissolveu em misturação completa. Após evaporação a vácuo de n-butanol, o material resultante foi tratado com água (50 ml) e extraído em acetato de etila (50 ml). O extrato de acetato de etila foi evaporado e o resíduo subseqüentemente lavado com 30 ml de éter dietílico. Sólido branco foi filtrado e recristalizado de metanol. Rendimento: 90%, sólido branco. Ponto de fusão: 142 - 143°C. TLC (acetato de etila: hexano, 1:2 (v:v), ponto único. Pureza HPLC: >98%. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): 1,57 m (2H); 1,72 m (1H); 1,95 m (2H); 2,27 qq (1H, Ja = 12,3 Hz, Jb = 3,8 Hz); 3,67 m (1H); 3,73 s (3H); 3,75 s (3H); 3,84 s (3H); 4,00 m (1H); 4,66 bs (2H); 5,63 dd (1H, Ja = 11,3 Hz, Jb = 1,9 Hz); 6,69 d (1H, J = 8,7 Hz); 6,91 d (1H, J = 8,7 Hz);

8,04 bs (1H); 8,20 s (1H); 8,34 s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 400 (100).

Exemplo 15. O exemplo ilustra a preparação de 6-(2,3,4- trimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidrofuranil) purina. Uma mistura de 2247 mg (10 mmol) de 6-cloro-9-(2-tetrahidrofuranil) purina (preparado de 1546 mg de 6-cloropurina), cloridrato de 2,3,4-trimetoxibenziamina (2799 mg, 12 mmol) e 8 ml de trietilamina (57 mmol) foi refluxada em n-butanol durante 3 horas. O sólido completamente dissolveu em misturação completa. Após evaporação a vácuo de n-butanol, o material resultante foi tratado com água (50 ml) e extraído em acetato de etila (50 ml). O extrato de acetato de etila foi evaporado e o resíduo subseqüentemente lavado com 50 ml de hexano. O produto bruto branco foi recristalizado em metanol. Rendimento: 90%, sólido branco. Ponto de fusão: 140 - 141°C. TLC (acetato de etila: hexano, 1:2 (v:v), ponto único. Pureza HPLC: >98%. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): 2,02 sep (1H, J = 6,8 Hz); 2,22 sep (1H, J = 6,8 Hz); 2,44 m (2H); 3,73 s (3H); 3,75 s (3H); 3,84 s (3H); 3,91 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,13 q (1H, J = 7,4 Hz); 4,65 bs (2H); 6,26 m (1H); 6,70 d (1H, J = 8,6 Hz); 6,90 d (1H, J = 8,6 Hz); 8,03 bs (1H); 8,19 s (1H); 8,26 s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 386 (100).

Exemplo 16. Vários estudos preliminares, a curto prazo, do efeito de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina em células de fibroblastos de pele humana cultivada foram realizados. O estudo inicial envolveu a adição de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina (40 a 400 μΜ) a fibroblastos da pele humana em uma cultura. A porcentagem de fixação das células à superfície do frasco de cultua não foi afetada após 6 horas de tratamento. Nas experiências restantes, relatadas neste exemplo, a 6- furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina foi adicionada diretamente no meio de cultura ao mesmo tempo que as células foram semeadas.

Uma faixa mais ampla de concentrações (de 0,01 a 500 μΜ) foi testada para determinar os efeitos de 6-furfurilamino-9-(2- tetrahidropiranil) purina sobre a sobrevivência de fibroblastos de pele humana cultivados após 3 dias de tratamento. Em concentrações entre 1 e 200 μΜ, pode-se notar um leve estímulo de crescimento e sobrevivência celular. Nenhuma toxicidade ou outros efeitos negativos foram aparentes devido ao tratamento das células com 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina.

O efeito de tratamento com 6-fxirfurilamino-9-(2- tetrahidropiranil) purina (0 a 400 μΜ) em crescimento a curto prazo de fibroblastos humanos jovens foi também avaliado. Crescimento celular foi similar em amostras não tratadas e em amostras tratadas com 40, 80, e 200 μΜ de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina. Em níveis de tratamento de cerca de 400 μΜ, pode-se notar uma leve diminuição em crescimento de células. Experimentos similares foram realizados para determinar a extensão de apoptose e coloração com beta-galactosidase em células tratadas e não tratadas com 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina. Não se nota sugestão de indução de apoptose ou senescência prematura de fibroblastos humanos tratados com várias doses de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina.

O efeito de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina em células senescentes também foi examinado. Um número igual de células senescentes foi semeado em frascos separados e então tratado com concentrações diferentes de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina (0 a 400 μΜ). Números de células foram determinados após 7 e 14 dias de tratamento usando um contador Coulter após tripsinização e recolocação em suspensão das células. Não foram observados efeitos negativos após 7 dias. Após 14 dias de tratamento, pode-se ter um leve efeito negativo sobre a sobrevivência de células senescentes com 200 μΜ ou mais 6-furfurilamino-9- (2-tetrahidropiranil) purina. Em menores concentrações, não foram observados efeitos negativos, apesar de se poder notar um leve aumento no número de células de células senescentes tratadas com 6-furfurilamino-9-(2- tetrahidropiranil) purina.

As células senescentes de passagem tardia com um ciclo de

vida de mais do que 95% também foram tratadas com concentrações diferentes de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina (0 a 200 μΜ) para avaliar mudanças relacionadas com a idade. Os padrões de coloração de actina foram examinados após três dias. Tratamento com 6-furfurilamino-9- (2-tetrahidropiranil) purina geralmente mudou o padrão de coloração de actina de um padrão altamente polimerizado para um padrão de filamento menos polimerizado. Padrões menos polimerizados e difusos de coloração de actina são geralmente associados com características jovens de fibroblastos humanos. Assim, 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina parece reverter algumas das mudanças relacionadas com a idade em organização de actina em células senescentes.

Os fibroblastos de pele humana senescente foram também tratados com 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina (0 a 400 μΜ) e avaliados para reversão mudanças relacionadas com a idade. Não se notam diferenças significantes no aparecimento de células após 7 e 30 dias de tratamento. As células tratadas eram geralmente de aparência mais jovem em termos de se tornarem mais finas e dispostas em arranjos após 30 dias de tratamento. Mesmo em maiores concentrações (200 e 400 μΜ), as células tratadas com 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina parecerem ser menores e terem menos resíduos intracelulares em comparação com células não tratadas.

Com base nestes estudos, 6-furfurilamino-9-(2- tetrahidropiranil) purina foi bem tolerada por fibroblastos de pele humana jovem e senescente e para ter efeitos positivos em termos de reversão de padrão de actina e morfologia de características das células senescentes para relativamente mais jovens. Não foi observada nenhuma indução significante de crescimento ou divisão celular adicional.

Exemplo 17. Atividade citotóxica in vitro de vários dos derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção foi determinada usando um teste de microtitulação com Calceína AM e um painel de linhagens celulares de diferente origem histogenética e de espécie; cinetina foi também examinada como um controle. Porque somente as células metabolicamente ativa clivagem Calceína AM (éster tetraacetoximetílico de calceína), a concentração intracelular de calceína corresponde ao número de células vitais na cultura.

As seguintes linhagens de célula foram usadas: osteosarcoma humano (HOS); carcinoma de mama MCF-7; leucemia mielóide humana K- 562; e fibroblastos de camundongo NIH3T3. As células foram mantidas em frascos de cultura de tecido plástico de 80 cm2 Nunc/Corning e cultivadas em meio de cultura celular (DMEM com 5 g/l de glicose, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 10% de soro de bezerro fetal, e bicarbonato de sódio).

As suspensões celulares foram preparadas e diluídas de acordo com o tipo de célula particular e a densidade de células alvos esperada (2,500 - 30,000 células por cavidade com base em características de crescimento celular) foram adicionados por pipeta (80 μΐ) em placas de microtitulação de 96 cavidades. Os inoculados foram deixados em um período de pré-incubação de 24 h a 37°C e 5% de CO2 para estabilização. Diluições de quatro vezes da concentração de teste pretendida foram adicionadas em tempo zero em alíquotas de 20 μΐ para as cavidades da placa de microtitulação. Os compostos de teste foram geralmente avaliados em seis diluições de 4 vezes. A maior concentração de cavidade usada no presente estudo foi 166,7 μΜ. Todas amostras foram examinadas em triplicatas. Incubações de células com os compostos testados foi durante 72 horas a 37°C, em 5% de atmosfera de CO2 e 100% de umidade. No final do período de incubação, calceína AM foi adicionada em uma concentração final de 1 μ^ηιΐ incubada durante 1 hora. Intensidade de fluorescência (FI) foi medida com um Labsystem Fia Reader Fluoroscan Ascent (Reino Unido). A sobrevivência das células (GI50) foi calculada usando a seguinte equação: GI50 = (FI cavidade exposta composto / FI médio

cavidade de controle ! FI ΓΠédlOcavjJacJe de controle ~ FI médÍOCOntrole em branco) x 100%. O

valor GI50, a concentração de fármaco letal a 50% das células, foi calculado a partir das curvas de resposta a dose obtidas.

Os seguintes resultados foram obtidos:

Composto GI50 (μηιοΐ/ΐ) para linhagem de célula testada HOS K-562 MCF7 NEH-3T3 Cinetina >166,7 164,1 >166,7 155,1 6-furfurilamino-9- (2-tetrahidropiranil) purina >166,7 >166,7 >166,7 <166,7 6-(3,5 -dimetoxibenzi lamino)-9-(2- tetrahidropiranil) purina >166,7 >166,7 >166,7 6-(4-metoxibenzilamino)-9- (2-tetrahidropiranil) purina >166,7 >166,7 >166,7 >166,7 6-(2,3-dimetoxibenzilamino)-9-(2- tetrahidropiranil) purina >166,7 >166,7 >166,7 6-(3-metoxibenzilamino)-9- (2-tetrahidrofuranil) purina >166,7 >166,7 >166,7 6-(4-metoxibenzilamino)-9- (2-tetrahidrofuranil) purina >166,7 >166,7 >166,7

Os derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção

mostram uma toxicidade mínima ou inexistente às células em concentrações de até 166,7 μΜ e assim são apropriadas para aplicações cosméticas.

Exemplo 18. Atividade citotóxica in vitro de vários dos derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção contra fibroblastos diplóides humanos foi determinada por teste MTT padrão otimizado para placas de 96 cavidades. O teste é com base em medida espectrofotométrica do produto de conversão metabólica de MTT por mitocôndrias de células vivas.

Os fibroblastos de prepúcio humano (linhagem de células BJ) em passagem média foram mantidos em frascos de cultura de tecido plásticos de 75 cm e cultivados em meio de cultura celular (DMEM com 5 g/l de glicose, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 10% de soro de bezerro fetal, e bicarbonato de sódio).

Cerca de 5.000 células foram semeadas por cavidade da placa de 96 cavidades. Após 24 h, o meio de cultura celular foi substituído com o meio de cultura celular contendo um composto de teste. Os compostos de teste foram avaliados em seis diluições de 2 vezes. A maior concentração de cavidade usada no presente estudo foi geralmente 200 μΜ. No caso de compostos com limitada solubilidade no meio de cultura, a maior concentração foi ajustada. Cada composto de teste foi examinado em cinco réplicas. Células com os compostos de teste foram incubadas durante 72 horas a 37°C em 5% de atmosfera de CO2 e 100% de umidade. No final do período de incubação, o meio de cultura foi substituído com o meio de cultura celular contendo MTT (0,5 mg/ml, e as células foram incubadas por mis 3 horas. O formazano formado foi solubilizado por DMSO e absorbância a 570 nm foi medida. A capacidade dos compostos testados de inibir a atividade redutora de MTT das células foi calculada como IC = (A cavidade exposta composto - A médio controle em branco)/ (A médÍOcavidade de controle ~ A médÍOcontrole em branco) ^ 100%. IC]o, a

concentração do fármaco causando 10% de diminuição em atividade redutora de MTT, foi calculada a partir das curvas de resposta a dose obtidas. Os seguintes resultados foram obtidos:

Composto Concentração máxima testada (μηιοί) IC10 (μιηοΐ/ΐ) 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina 200 >200 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidrofuranil) purina 200 >200 6-(4-metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 100 >100 6-(4-metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidrofiiranil) purina 100 >100 6-(3-metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidrofuranil) purina 100 >100 6-(2,4-dimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 25 >25 6-(3,5-dimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidrofuranil) purina 200 >200 6-(3,4-dimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 200 >200 6-(3,4-dimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidrofuranil) purina 200 >200 6-(2,3,4-trimetoxibenziIamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 37,5 >37,5 6-(2,3,4-trimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 200 >200 6-(2,4,5-trimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) 200 >200 purina 6-(2,4,5-trimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 200 >200 6-(2,4,6-trimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 50 >50 6-(3,4,5-trimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 100 >100 6-(3,4,5-trimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 200 >200

Os derivados de purina 6,9-di-substituída testados desta

invenção não mostraram efeito prejudicial sobre a atividade de mitocôndrias e a viabilidade celular em uma ampla faixa de concentrações e, assim, são apropriados para aplicações cosméticas.

Exemplo 19. Inibição de senescência por vários dos derivados

de purina 6,9-di-substituída desta invenção foi determinada; cinetina também foi avaliada como um controle. Fibroblastos diplóides humanos (células HCA de vários níveis de passagem: passagem 25 - HCA25 designado; passagem 45 - HCA45 designado; e passagem 80 - HCA80 designado) foram coloridos para atividade de β-galactosidade. O meio usado para o cultivo da célula foi removido, as células foram lavadas duas vezes em PBS, e fixadas em 2-3 ml de solução de fixação composta de 2% de formaldeído e 0,2% de glutaraldeído em PBS. As células foram incubadas em temperatura ambiente durante 5 minutos, e então lavadas duas vezes com PBS. As células foram subseqüentemente incubadas a 37°C (sem CO2) durante 1 a 16 horas em 2-3 ml da solução compreendendo ferricianureto de potássio (5 mM), ferricianureto de potássio (5 mM), MgCl2 (2 mM), X-gal (5-bromo-4-cloro-3- indolil-P-D-galactopiranosídeo) (1 mg/ml), em tampão cítrico/fosfato (pH 6,0). Os compostos de teste (cerca de 50 μΜ) foram adicionados no meio em cada passagem. Após este período de incubação, as amostras de célula foram observadas a fim de detectar a presença de células azuis, indicando que X-gal tinha clivado (células positivamente senescentes). Neste experimento, somente as células senescentes foram coloridas de azul devido à ação de β- galactosidade no substrato. Os resultados são apresentados abaixo:

Composto Células senescentes (%) HCA25 HCA50 HCA80 Cinetina 3 5 38 6-(2-metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 4 6 22 6-(3-metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 5 5 24 6-(4-metoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 4 3 26 6-(2,4-dimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil)j)urina 4 6 25 6-(2,3,4-trimetoxibenzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 4 5 31 6-(furfurilamino)-9-(2-tetrahidrofuranil) purina 3 4 12 6-(2,4-dimetoxifenilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 4 4 29 6-(3,4-dimetoxifenilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 5 7 28 6-(2,4,5-trimetoxifenilamino)-9-(2-tetrahidropiranil) purina 5 4 25

Os derivados de purina 6,9-di-substituída geralmente foram

mais efetivos do que cinetina na retenção de níveis menores de células senescentes após 80 passagens.

Exemplo 20. Atividade antiinflamatória de vários dos

derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção foi determinada; cinetina também foi avaliada como um controle. Glioma C6 de rato (ATCC No. CCL107) foi cultivado em monocamada em meio quimicamente definido isento de soro contendo meio essencial de Ham FlO/ mínimo (1:1 v/v), 2 mM de L-glutamina, 1% (v/v) vitaminas de meio essencial mínimo (IOOx), 1% (v/v) de aminoácidos não essenciais de meio essencial mínimo (IOOx), 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, e 30 nM selenita de sódio. Incubação foi realizada a 37°C em uma atmosfera umedecida. Os testes foram realizados na fase de crescimento logarítmico em uma densidade de 2,5 χ IO5 células/cm . A síntese cAMP intracelular foi induzida por adição de 5 mM (-)-isoproterenol; várias quantidades de compostos de teste foram adicionadas ao mesmo tempo como o (-)-isoproterenol. Após 30 min de incubação a 37°C, o meio foi removido e a quantidade celular de cAMP foi determinada usando o kit de imunoteste cAMP-enzima de Amersham. O valor I50 foi determinado a partir de uma curva de resposta a dose em duplicata.

Os seguintes resultados foram obtidos: Composto Atividade antiinflamatória

I50 (μΜ) Efeito Cinetina - não ativo 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina 13 inibição 6-fenilamino-9- (2-tetrahidropiranil) purina 45 inibição 6-(3-metoxibenzilamino)-9- (2-tetrahidropiranil) purina 7 inibição 6-(3,5-dimetoxibenzilamino)-9-(2- tetrahidropiranil) purina 11 inibição Os derivados purina 6,9-di-substituída demonstraram atividade

antiinflamatória. Cinetina foi inativa no protocolo de teste.

Exemplo 21. Um número de testes relacionados com a

segurança de

6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina foram realizados usando protocolos e procedimentos convencionalmente aceitáveis. Os resultados destes estudos são sumarizados aqui.

Teste de Ames. Testes foram realizados usando DMSO como solvente e níveis de dose de 6-furíurilamino-9-(2-tetrahidropiranil) purina a 2,5, 5,0, 15, 50, 500, 1500, e 5000 com base no protocolo e

procedimentos padrões (Ames et al., Mutation Research, 31, 347 - 364 (1975); Maron et al., Mutation Research, 113, 173-215 (1983)). Usando auxótrofos TA98 e TAlOO de histidina de Salmonella typhimurium, na presença ou ausência de S9 de fígado de rato induzido por Aroclor, não foram observadas respostas mutagênicas positivas com 6-furfurilamino-9-(2- tetrahidropiranil)purina nos níveis testados.

Teste de triagem de aberração cromossômica in vitro. 6- Furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina foi testada no teste de triagem de aberração cromossômica usando células de ovário de hamster chinês (CH) tanto na ausência como na presença de um sistema de ativação de S9 induzido por Acrolor para avaliar seu potencial clastogênico. DMSO foi usado como o solvente e a taxa de dose estava na faixa de 0,272 a 272 μg/ml. A porcentagem de células com aberrações estruturais ou numéricas nas amostras tratadas com 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina não foi significativamente aumentada acima da das amostras de controle de solvente. Com base neste estudo, concluiu-se que 6-furfurilamino-9-(2- tetrahidropiranil)purina é negativa para a indução de aberrações cromossômicas estruturais e numéricas em células CHO.

Teste vascular da membrana corioalantóica. O potencial de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina para irritação ocular foi avaliado usando o procedimento descrito em Bagley et al., Alternative Methods in Toxicology, vol. 6 em Progress in Vitro Toxicology, 131-138 (1988). A membrana corioalantóica de ovos de galinha Leghorn branca, incubados durante 14 dias, foi dosada com 40 μΐ do composto de teste (e três concentrações mais baixas em água destilada) e então ainda incubada durante cerca de 30 minutos, tempo em que a membrana corioalantóica foi examinada para hemorragia vascular, injeção capilar, e/ou a presença de vasos fantasmas. O valor de RC50 (concentração calculada produzindo uma reação positiva em 50% dos ovos tratados) foi 105%. Sob as condições deste teste, um valor de RC50 de menos do que 1% pode ser considerado um irritante enquanto um valor de RC50 de mais do que 3% pode ser considerado não irritante. Assim, com base neste teste, verificou-se que o composto de teste é um não irritante.

Teste de viabilidade de MTT na epiderme. Usando sistema EpiDerm™ da Mat Tek Corporation (consistindo de queratinócitos epidérmicos derivados de humanos (NHEK) normais, que são cultivados para formar um modelo altamente diferenciado de múltiplas camadas, da epiderme humana), foi determinado que se podia esperar que 6-furfurilamino-9-(2- tetrahidropiranil)purina fosse classificada como não irritante.

Toxicidade oral aguda. Ratos Wistar do sexo feminino foram dosados oralmente com 2000 mg/kg de 6-furfurilamino-9-(2- tetrahidropiranil)purina e então observados /2, 1, 2, 3 e 4 horas após dosagem e depois uma vez por dia, durante 14 dias, sobre os efeitos de toxicidade e farmacológicos; todos os animais foram humanamente sacrificados usando CO7 após o estudo e examinados para patologia geral. Todos os animais sobreviveram à dose oral; as mudanças de peso durante o estudo foram normais; e os resultados da necropsia foram normais.

Teste com curativo adesivo para insulto repetido em humanos. Gel de teste (cerca de 0,2 ml) contendo cerca de 1 por cento de 6- furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina foi colocado em um curativo de oclusão quadrado de 2 cm e foi colocado em cada indivíduo nas costas e permaneceu durante 24 horas. Este procedimento foi repetido toda segunda- feira, quarta-feira e sexta-feira até nove (9) aplicações serem feitas na mesma área (fase de indução). A área foi examinada antes de cada nova aplicação. Cerca de 10-14 dias após o nono curativo ser removido, um curativo de desafio (fase de desafio) em uma nova área das costas e então examinado 24 e 72 horas após para reatividade. As respostas da pele foram baseadas em uma escala de seis pontos (0 = sem evidência de efeito; + = raramente perceptível; 1 = brando; 2 = moderado; 3 = marcado; e 4 = severo).

Cinqüenta e dois (52) indivíduos completaram as fases de indução e desafio (total de 10 aplicações por indivíduo). Dos indivíduos que completaram o estudo, somente um indivíduo teve uma classificação raramente perceptível (+) após aplicação na fase de desafio (em 24 horas somente; quando examinado em 72 horas não havia evidência de efeito); esta única resposta observada não foi considerada evidência de irritação ou alérgica por natureza. Todos os outros indivíduos não apresentaram qualquer evidência de irritação (isto é, 0 na escala) durante as fases de indução e de desafio. Nenhuma evidência de dermatite de contato alérgica induzida ou outra irritação em indivíduos humanos foi observada.

Exemplo 22. A segurança e eficácia dos derivados de purina 6,9-di-substituída desta invenção como tratamentos tópicos anti- envelhecimento na pele foram examinadas usando modelo de camundongo sem pelos (um modelo bem estabelecido para estudar os tratamentos de fotoenvelhecimento). Camundongas sem pelos SKH-I do sexo feminino (5 semanas de idade, 20-25 gramas, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram alojadas individualmente em gaiolas com topo de filtro, e aclimatadas durante 5-7 dias após a entrega. Os camundongos foram divididos em grupos de tratamento (n=6), incluindo dois grupos de controle diferentes (controle não tratado, controle com veículo) e um controle terapêutico (creme de ácido trans-retinóico a 0,05% comercialmente disponível). Água e ração de camundongo são providas ad líbitum.

Os grupos experimentais (6 camundongas por grupo) incluíam os seguintes tratamentos: (1) controle não tratado; (2) controle com veículo (loção MillCreek); (3) cinetina (0,1% em loção MillCreek); (4) 6- Furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina (0,1% em loção MillCreek); e (5) controle terapêutico (creme de ácido trans-retinóico a 0,05%). Os vários tratamentos foram aplicados diariamente (segunda-sexta-feira) durante 3 semanas na pele dorsal (cerca de 2 cm χ 2 cm) das camundongas sem pelos uma taxa de dosagem de cerca de 20 mg.

Em linha base (antes do Io. tratamento), e semanalmente, a pele dorsal foi medida para perda de água transepidérmica (TEWL), teor de umidade da pele, e elasticidade da pele. O possível efeito destas formulações tópicas sobre a proliferação de células da epiderme foi investigado usando bromodeoxiuridina como um marcador imuno-histoquímico de proliferação de células. O exame histológico da pele tratada e de controle também deve ser usado para determinar os efeitos cutâneos destas formulações tópicas.

Exames diários foram realizados para avaliar a possível ocorrência de eritema (irritação) dos sítios usando critérios de classificação estabelecidos, em que grau 0 = sem resposta; grau 1 = vermelhidão muito leve; grau 2 = vermelhidão leve; grau 3 = vermelhidão/irritação moderada; grau 4 - vermelhidão/irritação severa; grau 5 = vermelhidão/irritação muito severa; e grau 6 = necrose.

As medições do teor de umidade da pele e elasticidade da pele são métodos não invasivos importantes usados para caracterizar os efeitos de umectantes e efeitos anti-rugas sobre a pele. Um instrumento de combinação DermalLab™ foi usado para medir o teor de umidade e elasticidade da pele dos sítios da pele alvo em linhas de base e em intervalos semanais. Este instrumento foi equipado com sondas duais que são colocadas sobre a superfície da pele e uma medição quantitativa tomada dos respectivos parâmetros e as medições registradas em um computador integrado.

Todos os grupos de animais foram injetados com bromodeoxiuridina (100 mg/kg) I.P. 4 horas após a aplicação final. Os animais foram então sacrificados por inalação de CO2 3 horas depois seguido por deslocamento da cervical. Os sítios de teste foram excisados e 6 mm de biópsias de punção foram obtidas de cada sítio de tratamento e de sítios de controle não tratado. As biópsias foram colocadas em frascos rotulados contendo 4% de formalina tamponada neutra para incrustação em parafina e coloração anti-BrdU. As seções de parafina foram cortadas em espessura de 5 μΜ e coloridas usando o kit de imuno-histoquímica BrdU (X1545K de Exalpha Biologicals, Inc.) e um protocolo de coloração padrão. As lâminas foram fracamente contra- coloridas em hematoxilina de Mayer e classificadas sob um microscópio de luz para o número de células positivas BrdU por mm de epiderme para cada seção.

As biópsias da pele foram tomadas de cada sítio de tratamento e pele de controle não tratado. As biópsias foram fixadas em 4% de formalina tamponada neutra, incrustadas em parafina, e coloridas com hematoxilina e eosina. As seções da pele coloridas foram examinadas para determinar os efeitos do tratamento na epiderme, derme e histologia do extrato córneo. As biópsias também foram examinadas microscopicamente para células inflamatórias.

Irritação da pele. Os produtos de teste foram bem tolerados com tratamento prolongado durante 3 semanas. Somente o creme de ácido trans-retinóico causou irritação significativa (grau 3) após 1 a 3 semanas de tratamento. Todos os outros tratamentos estavam abaixo de grau 1,5 com tratamento com 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina estando abaixo do grau 1 durante o período de 3 semanas.

Teor de umidade da pele. O controle terapêutico mostrou uma diminuição significativa na condutância da pele e, assim, um teor de umidade diminuído da pele. Em contraste, os compostos de teste e o veículo sozinho produziram um aumento gradual no teor de umidade da pele. Na semana 3, o teor de umidade médio de todos os compostos de teste foi maior do que o controle não tratado ou com veículo. Geralmente, o tratamento com 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina produziu um dos maiores aumentos em umidade da pele dos compostos examinados.

Elasticidade da pele. Nenhuma mudança significativa na elasticidade da pele dos grupos de tratamento foi observada durante o período de teste de 3 semanas para qualquer um dos grupos de teste. Assim, a elasticidade da pele dos grupos de tratamento foi comparável à dos grupos de controle não tratados e de tratamento apenas com veículo.

Coloração com bromodeoxiuridina (BrdU). A coloração com bromodeoxiuridina da epiderme foi medida para determinar o efeito dos compostos de teste sobre a proliferação de células da epiderme. Não houve diferença estatística na coloração com BrdU epidérmica nos compostos de teste como comparado ao controle não tratado ou com veículo ou quaisquer diferenças na coloração com BrdU com os compostos de teste. Os tecidos tratados com controle terapêutico não tinham coloração com BrdU epidérmica, mas algumas áreas localizadas de coloração na derme, possivelmente relacionadas com a inflamação induzida por retinóides. Biópsias de tecidos foram obtidas ao término do estudo após 3 semanas de tratamento. A avaliação histológica mostrou a pele parecendo "saudável" com todos os compostos de teste. Em contraste, o controle terapêutico mostrou acentuada espessura aumentada da epiderme e mudanças inflamatórias na derme. A espessura do compartimento da pele das biópsias coloridas com H&E foi medida por microscopia ótica. A espessura da epiderme, derme e extrato córneo medida após 3 semanas de tratamento foi comparável à do controle não tratado ou tratado com veículo. Em contraste, o controle terapêutico aumentou tanto a espessura da epiderme como da derme.

Estes resultados fornecem evidência para tanto segurança como eficácia de 6-furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina para uso para melhorar a aparência cosmética e para conservar a vitalidade da pele em envelhecimento sem irritação.

Exemplo 23. Um estudo clínico foi conduzido para determinar a eficiência cosmética e tolerância dos indivíduos a 6-furíurilamino-9-(2- tetrahidropiranil)purina (0,10%) aplicada duas vezes por dia durante 12 semanas para melhorar os sinais clínicos e sintomas da pele facial fotodanificada. Quarenta indivíduos voluntários do sexo feminino com 40 a 65 anos de idade com sinais brandos a moderados de pele facial fotodanificada foram arrolados no estudo. Trinta e quatro indivíduos completaram o estudo; a idade média dos indivíduos competindo no estudo foi cerca de 54 anos. Os indivíduos foram instruídos a aplicar o produto de teste na pele facial total diariamente (isto é, de manhã cedo e aproximadamente 1 hora antes dormir), durante 12 semanas consecutivas. Os indivíduos também foram instruídos que, diferente dos filtros solares ou agentes de limpeza suave e o uso de cosméticos coloridos, nenhum outro produto ou medicação de cuidados com a pele tópicos deviam ser usados na face durante o estudo. O produto de teste compreendia 0,1 por cento de 6- furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina em loção MillCreek como veículo. Os indivíduos foram avaliados nas semanas 2, 4, 8 e 12. A pele facial tratada foi avaliada para sinais clínicos de envelhecimento da pele (por exemplo, rugas acentuadas e finas, aspereza, hiperpigmentação mosqueada) no início do estudo (linha base) bem como em 2, 4, 8 e 12 semanas. A auto- avaliação dos indivíduos de melhora acima da linha base (rugas, texturas, manchas irregulares, cor e melhora total) também foi obtida. Além disso, medições da perda de água transepidérmica (TEWL) e da umidade da pele foram tomadas nas bochechas de todos os indivíduos.

Perda de água transepidérmica (TEWL). TEWL refere-se à quantidade de perda de vapor de água através do extrato córneo. Um aumento nos valores TEWL sugere tanto perda de água evaporativa (por exemplo, suor ou evaporação) ou dano à barreira da pele. Um decréscimo nos valores TEWL sugere tanto melhora na função da barreira como a presença de uma barreira sobre a pele. As medições de TEWL foram tomadas usando um medidor TEWL (Courage & Khazaka, Kõln, Alemanha) sendo composto de uma sonda (contendo sensores de umidade e de temperatura) conectada a uma unidade de processamento central. Para cada indivíduo, a sonda foi colocada no centro de ambas bochechas e as medições tomadas em duplicata.

Medições da umidade da pele. Uma medição indireta do teor de umidade da pele foi feita medindo mudanças nas propriedades elétricas da pele. Medições de capacitância baseadas na impedância foram tomadas sobre a pele usando um NOVA DPM 9003® (NOVA Technologies, Gloucester, MA, USA). O instrumento realiza medições em freqüências pré-selecionadas variadas (até 1 MHz) da corrente alternante aplicada. Um valor diretamente relacionado à capacitância é determinado em unidades arbitrárias; um valor mais alto indica uma capacitância maior que indica um nível diminuído de umidade no sítio de teste. Medições em triplicata foram tomadas no centro de ambas bochechas para cada indivíduo de teste.

Avaliação do especialista da pele facial do indivíduo. Na visita da linha base (dia 0), um investigador avaliou cada face dos indivíduos para a presença de rugas finas, rugas acentuadas, aspereza, hiperpigmentação mosqueada, e outros parâmetros, usando uma escala de cinco pontos (0 = sem; 1 = mínima; 2 = suave; 3 = moderada; e 4 = severa). A severidade total da fotodano da pele (rugas, aspereza e hiperpigmentação mosqueada) foi avaliada usando uma escala de 10 pontos (0 = nenhuma; 1 - 3 = suave; 4-6 = moderada; 7-9 = severa); os indivíduos com classificações de severidade na linha base maiores do que 6 foram excluídos do estudo.

Em cada visita subsequente, o investigador avaliou a melhora total comparada à linha base usando uma escala de 6 pontos ( 1 = melhora excelente; 2 = melhora acentuada; 3 = melhora moderada; 4 = melhora leve; 5 = sem melhora; e 6 = pior).

Percepção da eficiência pelo indivíduo. Em cada visita subsequente, os indivíduos foram interrogados para completar um questionário de auto-avaliação para avaliar a melhora da linha base para textura da pele, cor da pele, manchas (isto é, manchas marrons), rugas finas, e melhora total usando uma escala de cinco pontos (1 = muito melhorada; 2 = um pouco melhorada; 3 = nenhuma troca; 4 = um pouco pior; e 5 = muito pior).

Resultados. Os seguintes resultados de teste, produzidos em

média sobre todos os indivíduos e relatados como valores médios, foram obtidos.

Linha base 2 semanas Semana 4 Semana 8 Semana 12 Il to 13,15 12,89 11,70* 13,08 9,54* Mudança com relação à linha base -1,98% -9,62% 0,11% -27,79% Umidade da pele (unidades arbitrárias) 118,03 125,37* 141,30* 158,04* 165,42* Mudança com relação à linha base 6,22% 20,96% 35,10% 4,21% * Diferença significativa (p<0,05) como comparada à linha

base.

Uma diminuição nos valores TEWL indica uma melhora na função da barreira da pele; um aumento nos valores TEWL pode indicar um rompimento nas propriedades da barreira. Um aumento em umidade da pele indica indiretamente um aumento nos níveis de umidade.

Para a avaliação do investigador das condições gerais da pele, os seguintes resultados foram obtidos usando uma escala de cinco pontos (O =

sem; 1 = mínima; 2 = suave; 3 = moderada; e 4 = severa).

Linha base Semana 2 Semana 4 Semana 8 Semana 12 Rugas finas 2,23 2,18 1,97* 1,74* 1,62* Mudança cora relação à linha base -1,28% -11,25% -21,79% -27,63% Rugas acentuadas 2,25 2,35 2,22 2,20 2,03* Mudança com relação à linha base 4,44% -4,76% -7,23% -13,75% Aspereza 1,68 1,05* 0,58* 0,23* 0,26* Mudança com relação à linha base -37,31% -63,79% -85,71% -83,64% Hiperpigmentação mosqueada 1,73 1,70 1,50* 1,23* 1,03* Mudança com relação à linha base -1,45% -15,63% -30,65% -40,68% Irritação da pele O 0 0 0 0 Mudança com relação à linha base 0 0 0 0 Acne 0,63 0,60 0,53 0,53 0,32* Mudança com relação à linha base -4,00% -13,64% -9,52% -45,00% Eritemat 0,60 0,40TT 0,31* 0,20* 0,21* Mudança com relação à linha base -33,33% -47,62% -66,67% -66,67%%

* Diferença significativa (p<0,05) como comparado à linha

base.

+ Se os dados foram limitados somente aos indivíduos tendo sinais de eritema em linha base, notou-se uma diferença significativa em todos os períodos de tempo. Quando os dados foram restritos somente a indivíduo não tendo nenhum sinal de eritema na linha base, não houve nenhum aumento significativo em qualquer período de tempo, indicando falta de indução de sinais visíveis de eritema.

ft Altamente sugestivo (p=0,056) de decréscimo significativo em eritema na 2 semanas.

Uma mudança percentual negativa nos parâmetros na tabela acima representa uma melhora no parâmetro relevante. Uma melhora significativa foi notada pelos avaliadores especialistas em um ou mais períodos de tempo para rugas finas e acentuadas, aspereza, hiperpigmentação mosqueada, acne, e eritema. Nenhuma irritação na pele foi observada.

A avaliação do investigador da condição da pele total com base na aparência cosmética relativa ao envelhecimento da pele usando uma escala de 10 pontos (0 = sem; 1-3 = suave; 4-6 = moderada; e 7-9 = severa) foi como a seguir: 4,10 em linha base; 4,05 em 2 semanas (-1,22% de mudança com relação à linha base); 3,56 em 4 semanas (-15,23% de mudança com relação à linha base); 3,20 em 8 semanas (-24,32% de mudança com relação à linha base); e 3,03 em 12 semanas (-27,97% de mudança com relação à linha base). As diferenças notadas nas semanas 4, 8 e 12 foram significativas (p<0,001). Uma mudança em porcentagem negativa na condição da pele total representa uma melhora na aparência cosmética com relação ao envelhecimento da pele.

A avaliação do investigador da melhora total na condição da pele (com relação à linha base) usando uma escala de 6 pontos (1 = melhora excelente; 2 = melhora acentuada; 3 = melhora moderada; 4 = leve melhora; 5 = sem melhora; e 6 = pior) foi como se segue: 4,95 em 2 semanas; 4,44 em 4 semanas (-10,61% de mudança com relação aos dados de 2 semanas); 4,11 em 8 semanas (-16,67% de mudança com relação aos dados de 2 semanas); e 4,12 em 12 semanas (-17,16% de mudança com relação aos dados de 2 semanas). As diferenças notadas como em 4, 8 e 12 semanas foram significantes (p < 0,001). Uma mudança percentual negativa na melhora global representa uma melhora nas condições da pele.

Os resultados da auto-avaliação dos indivíduos de condições da pele durante o estudo usando uma escala de cinco pontos (1 - bem melhorada; 2 = um pouco melhorada, 3 = sem mudança; 4 = um pouco pior; e

— bem pior) foram como a seguir:

2 semanas Semana 4 Semana 8 Semana 12 Textura da pele 2,21 2,03* 1,91* 1,74* Mudança relativa a dados de 2 semanas -8,97% -15,58% -23,38% Cor da pele 2,74 2,50* 2,23* 2,12* Mudança relativa dados de 2 semanas -5,32* -18,28% -22,58% Manchas irregulares /manchas marrons 2,70 2,58 2,26* 2,15* Mudança relativa a dados de 2 semanas -6,19% -18,95% -23,16% Rugas finas 2,62 2,11* 2,00* 1,88* Mudança relativa a dados de 2 semanas -18,68% -23,60% -28,09% Melhora global 2,36 2,14 1,97* 1,91* Mudança relativa a dados de 2 semanas -6,17% -16,25% -18,75%

*Diferença significativa (p<0,05) como comparado a dados de 2

semanas.

Uma mudança de porcentagem negativa nos parâmetros na

tabela acima representa uma melhora no parâmetro relevante. Os indivíduos relataram uma melhora significativa em um ou mais períodos de tempo para textura da pele, cor da pele, manchas irregulares, manchas marrons e rugas finas. Além disso, os indivíduos relataram uma melhora significativa nas semanas 8 e 12 na condição total e aparência de sua pele.

No todo, indivíduos experimentaram uma melhora significativa na condição da pele total e uma redução significativa nos efeitos adversos associados com envelhecimento durante o período do estudo com base em tanto a avaliação do especialista como a auto-avaliação. Irritação da pele e outros efeitos adversos não foram observados.

Exemplo 24. Este exemplo compara os dados clínicos para 6-

furfurilamino-9-(2-tetrahidropiranil)purina aplicada topicamente (0,10%) tomados do exemplo 23 com dados clínicos similares para cinetina topicamente aplicada (0,1%) de um estudo anterior. O protocolo para a experiência clínica anterior para cinetina foi similar ao protocolo como descrito no exemplo 23 para o composto da invenção; trinta e dois voluntários do sexo feminino completaram o estudo de cinetina anterior. Esta comparação é baseada nas avaliações dos especialistas e auto-avaliações da condição da pele para os dados das semanas oito e doze para alguns dos parâmetros avaliados em ambos os estudos. As comparações baseadas na avaliação do especialista são

como a seguir:

Melhora média da linha base Cinetina Composto da invenção Cinetina Composto da invenção TEWL 13% 1% 15% 28% Rugas finas 2% 22%* 6%* 28%* Rugas acentuadas 4% 7% 4% 14%* Aspereza 35% 86%* 52%* 84%* Hiperpigmentação mosqueada 25%* 31%* 25%* 41%* Condição da pele total 3% 24%* 4%* 28%*

* Melhoras clinicamente significativas (p<0,05)

As comparações baseadas na auto-avaliação do indivíduo são

como a seguir:

Indivíduos relatando me hora de linha base Dados da semana oito Dados da semana doze Cinetina Composto da invenção Cinetina Composto da invenção Textura 77% 83% 87% 88% Rugas finas 57% 83% 71% 88% Manchas irregulares 50% 60% 74% 63% Cor 53% 66% 71% 68%

20

Claims (20)

1. Método para melhorar o efeito adverso de envelhecimento em células de mamíferos, o referido método caracterizado pelo fato de compreender aplicar uma quantidade de um derivado de purina 6,9-di- substituída às células de mamíferos, em que o derivado de purina 6,9-di- substituída tem a fórmula geral R9 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R6 é furfurila, furfurila substituída por metóxi, fenila, fenila substituída por metóxi, e benzila substituída por metóxi; em que R9 é 2-tetrahidropiranila ou 2- tetrahidrofuranila; e em que a quantidade é eficaz para melhorar o efeito adverso de envelhecimento nas células de mamíferos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R6 é furfurila ou furfurila substituída por metóxi e R9 é 2- tetrahidropiranila.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R6 é furfurila e R9 é 2-tetrahidropiranila.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,1 a cerca de 2 por cento. \ NH

8. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,1 a cerca de 2 por cento.

9. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,1 a cerca de 2 por cento.

10. Método para tratar uma doença de pele ou condição da pele em um mamífero, o referido método caracterizado pelo fato de compreender aplicar uma quantidade eficaz de um derivado de purina 6,9-di- substituída às células da pele do mamífero em necessidade de tal tratamento, em que o derivado de purina 6,9-di-substituída tem a fórmula geral <formula>formula see original document page 58</formula> furfurila, furfurila substituída por metóxi, fenila, fenila substituída por metóxi, ou benzila substituída por metóxi; e em que R9 é 2-tetrahidropiranila ou 2- tetrahidrofuranila. mamífero, o referido método caracterizado pelo fato de compreender aplicar uma quantidade eficaz de um derivado de purina 6,9-di-substituída às células do mamífero necessitando de tal tratamento, em que o derivado de purina 6,9- di-substituída tem a fórmula geral <formula>formula see original document page 58</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R^ é

11. Método para tratar uma condição de inflamação em um ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que Re é furfurila, furfurila substituída por metóxi, fenila, fenila substituída por metóxi, ou benzila substituída por metóxi; e em que R9 é 2-tetrahidropiranila ou 2- tetrahidrofuranila.

12. Método para melhorar o efeito adverso de envelhecimento em células de mamíferos, o referido método caracterizado pelo fato de compreender aplicar uma quantidade de um derivado de purina 6,9-di- substituída às células de mamíferos, em que o derivado de purina 6,9-di- substituída tem a fórmula geral ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a quantidade é eficaz para melhorar o efeito adverso de envelhecimento nas células de mamíferos.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,1 a cerca de 2 por cento.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células de mamíferos são células de pele humana.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as células de mamíferos são células de pele humana.

17. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as células de mamíferos são células de pele humana.

18. Método para melhorar o efeito adverso de envelhecimento sobre a pele humana, o referido método caracterizado pelo fato de Compreender aplicar uma quantidade de um derivado de purina 6,9-di- substituída à pele humana, em que o derivado de purina 6,9-di-substituída tem a fórmula geral ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a quantidade é eficaz para melhorar o efeito adverso de envelhecimento na pele humana.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,05 a cerca de 10 por cento.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a quantidade é cerca de 0,1 a cerca de 2 por cento.