BRPI0621744A2 - meio de cultivo para propagação de plantas de abacaxi (ananas comosus) in vitro; meio de cultivo para indução de mudas de abacaxi (ananas comosus) in vitro; e extrato cru de mudas de abacaxi (ananas comous) - Google Patents

Abstract

MEIO DE CULTIVO PARA PROPAGAçãO DE PLANTAS DE ABACAXI (ANANáS COMOSUS) IN VITRO; MEIO DE CULTIVO PARA INDUçãO DE MUDAS DE ABACAXI (ANANáS COMOSUS) IN VITRO; E EXTRATO CRU DE MUDAS DE ABACAXI (ANANáS COMO US). Trata-se de invenção que se refere ao campo da biotecnologia e, em particular, à obtenção de metabólits secundá rios, por meio de indução, tal como a bromelina de plantas do gênero Ananas spp. previamente estabelecidas in vitro. O objetivo da invenção é o desenvolvimento de um processo inovador para extrair bromelina dos tecidos naturais da planta do abacaxi estabelecida e induzida in vitro com uma maior atividade protcolítica (200 a 600%) e em altas concentrações, em comparação com a proteína que é gerada de forma natural na planta e que é atualmente extraída por metodologias tradicionais. Neste processo, é feito uso de mudas de abacaxi estabelecidas e induzidas in vitro, as quais são maceradas em uma solução tampão de fosfato para realizar sua extração. Posteriormente, são submetidas a processos de filtração, centrifugação, congelamento e liofilização a fim de se obter assim um extrato cru de bromelina caracterizado por altos rendimentos em termos de proteína e atividade específica.

Description

"MEIO DE CULTIVO PARA A PROPAGAÇÃO DE PLANTAS DE ABACAXI (ANANAS COMOSUS) IN VITRO; MEIO DE CULTIVO PARA INDUÇÃO DE MUDAS DE ABACAXI (ANANAS COMOSUS) IN VITRO; E EXTRATO CRU DE MUDAS DE ABACAXI (ANANAS COMOUS)".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia e, em particular, à obtenção de metabólitos secundários por indução, tal como a bromelina de plantas do gênero Ananas spp. previamente estabelecidas in vitro.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

O objetivo da invenção é o desenvolvimento de um processo inovador para extrair bromelina dos tecidos naturais da planta do abacaxi estabelecidos e induzidos in vitro, com uma maior atividade proteolítica e em altas concentrações, em comparação com a proteína que é gerada de forma natural na planta e que é extraída atualmente por metodologias tradicionais.

Neste processo, são utilizadas mudas de abacaxi estabelecidas e induzidas in vitro, as quais são maceradas em uma solução tampão de fosfato para realizar sua extração. Posteriormente, são submetidas a processos de filtração, centrifugação, congelamento e liofilização a fim de se obter assim um extrato cru de bromelina caracterizado por altos rendimentos em termos de proteína e atividade específica.

ANTECEDENTES

Atualmente, existem alimentos chamados de nutracêuticos, que, além do valor nutritivo, trazem benefícios para a saúde, como é o caso do abacaxi (Ananas comosus L.), que é fonte de uma mistura de cisteína protease, a mais abundante sendo a bromelina, proteína que apresenta efeitos benéficos sobre as enfermidades como o câncer e a trombose coronária (Mackay e outros, 2003).

A bromelina, como nutracêutico, tem várias ações farmacológicas, como a de inibir a agregação plaquetária e a de aumentar a absorção de outros medicamentos. A bromelina é bem absorvida na forma oral e a evidência clínica e farmacológica indica que seus efeitos terapêuticos melhoram, quando administrada em altas doses. Todavia, seus mecanismos de ação não são completamente conhecidos; de fato, foi demonstrado que é um complemento alimentício efetivo e seguro (Mackay e outros, 2003).

A bromelina pode ajudar no tratamento da trombose coronária, que é caracterizada por um bloqueio dos vasos sangüíneos por coágulos estruturados por uma proteína chamada de fibrina e que é responsável pelo menos pela metade das mortes em países desenvolvidos como a Grã Bretanha. Os ataques ao coração são muitas vezes causados por um bloqueio dos vasos sangüíneos que irrigam o coração. Uma situação similar é observada nos acidentes vasculares cerebrais (Feltron, 1980).

A formação de coá gulos sangüíneos é um processo que ocorre naturalmente em indivíduos normais, mas que é controlado por um delicado equilíbrio entre a formação de coágulos e sua degradação. A bromelina parece promover seletivamente a degradação natural de coágulos de sangue, sem causar hemorragias em pessoas que apresentam bloqueios em vasos sangüíneos. O sangue contém uma protease natural que degrada coágulos chamados de plasmina, a qual deve ser ativada a partir de sua forma inativa, o plasminógeno. Se este sistema natural não estiver equilibrado, os níveis de plasminas poderão ser baixos, permitindo que os coágulos persistam e bloqueiem os vasos sangüíneos. Investigações realizadas por Steven Tanssing, no Havaí, demonstraram que a bromelina pode estimular a conversão do plasminógeno em plasmina, o que permite desfazer eficientemente os coágulos de fibrina (Fernández, 2001).

A bromelina também apresenta uma propriedade "antitrombótica" mediante a qual é bloqueada a conversão de protrombina em trombina, reduzindo assim a formação de coágulos. O efeito antiinflamatóiio da bromelina está relacionado com este sistema. Foi insinuado que a bromelina é uma droga antiinflamatóia melhor que as drogas não esteroidais, tal como a aspirina. Enquanto a aspirina inibe a síntese de todas as prostaglandinas, a bromelina é mais seletiva e inibe a produção apenas daquelas que aumentam a inflamação, sem afetar as antiinflamatórias. De sua parte, o trauma e o estresse prolongado tendem a deslocar o equilíbrio para as prostaglandinas proinflamatórias, processo que é neutralizado por bromelina que tende a restabelecer o equilíbrio perdido (Fernández, 2001).

A bromelina apresenta aplicações industriais como amaciante de carnes, preparação de sobremesas, gelatinas de baixo teor calóricoe no processo de fabricação de cerveja, entre outros. Também apresenta aplicações médicas por ser uma proteína cuja atividade enzimát ica permite proporcionar benefícios em enfermidades como a trombose coronária, úlceras gástricas e intestinais, como modulador do sistema imunológicoe no tratamento de câncer.

A bromelina é uma protease que foi encontrada em tecidos de plantas da família Bromeliaceae, das quais o abacaxi (Ananas comosus L.) é a mais conhecida. Esta enzima desempenha um papel fisiológco muito importante, ao intervir nas reações metabólicase ao proteger o vegetal do ataque de pragas e enfermidades, e também influi de maneira especial no metabolismo nitrogenado durante a etapa de floração (Chavéz e outros, 1998).

Propriedades bioquímicas da bromelina são as seguintes:

A bromelina pertence ao grupo das cisternas proteases e, segundo Murachi e outros (1964), entre suas propriedades mais importantes estão:

• pH ótimo de aproximadamente 7 (Inagami e Murachi, 1963). Estabilidade: A enzima mantém sua atividade sobre a caseína a 50°C por 24 horas em uma faixa de pH de 4 a 10. É estável em soluções de 25% de metanol (v/v) a 25 0C por 20 min, e perde 50% da atividade ao se aquecer a solução enzimática a 55 0C por 2 0 min em um pH de 6 (Whitaker y El-Gharbawi, 1963).

• A liofilização causa 27% de perda da atividade. (Murachi e outros, 1964).

• Pureza: foi purificada por cromatografia líquida e a homogeneidade da enzima foi verificada mediante a ultracentrifugação, sedimentação, eletroforese de disco em gel de acrilamida e análise difusional. (Murachi e Tachibana, 1966).

O principal resíduo amino terminal é a valina (Val) e a carboxila terminal é a flicina (Gly). A enzima é uma glicoproteína que contém manosa, xilosa, fucosa e N- acetil-D-glicosamina, tem um oligossacarídeo por molécula, o qual é covalentemente unido à cadeia peptídica (Feinstein e Whitaker, 1964).

A bromelina, obtida de talos do deserto, tem um grupo sulfidrilo reativo por molécula, o qual é essencial para a catálise enzimática (Murachi e Inagami, 1965).

As seqüências proposta s de aminoácidos no Iug ar ativo são: Cys-Gly-Ala-Cys-Trp (Chao e Liener, 1967) Asn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Trp (Hussain e Lowwe, 1968).

Propriedades físicas da bromelina.

São indicadas as propriedades físicas da bromelina obtida de talos; os dados sugerem que a enzima é uma proteína básica com um peso molecular de aproximadamente 33.000 Da (Yasuda e outros, 1970).

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a: Por Sedimentação-Difusão.

b: Por constante de Sedimentação e Viscosidade intrínseca,

c: Por método de Archibald (Yasuda e outros, 1970).

Processos tradicionais de obtenção.

Atualmente e de forma tradicional, o processo de obtenção de bromelina inicia com a moagem de talos de plantas cultivadas sobre solo para a extração e a purificação do metabólito.

O processo de preparação de bromelina que menciona a patente US3002891 consiste da obtenção de bromelina a partir do suco de talo de abacaxi, resultando em uma enzima com solubilidade, atividade e cor satisfatória em comparação com as extrações que são realizadas a partir do suco do fruto de abacaxi.

A Patente US3446626 protege um método de preparação de uma solução de bromelina para injeção "antimortem" que é administrada em animais a fim de amaciar a carne. A bromelina é preparada em uma solução injetável com um pH de 7,5 e é aplicada 6 horas antes da morte do animal para promover o amolecimento ou o amaciamento da carne. A Patente US3455787 menciona a extração de bromelina a partir do talo de abacaxi que envolve a trituração do talo, a extração do líquido por meio de pressão e a centrifugação para precipitar cristais finos. Posteriormente, o líquido restante é centrifugado novamente. Durante o esfriamento da centrifugação, são utilizados sais e solventes orgân icos, assim como detergentes solúveis para realizar a precipitação.

Outra maneira de se obter a bromelina é mencionada na Patente US3699001, na qual é extraído o suco em se submetendo os talos a um tratamento a baixas temperaturas, realizando uma precipitação fracionada a partir do suco clarificado com compostos orgâni cos e da liberação de Bromelina precipitada com compostos orgânicos frios.

Heinicke e Gortner reportaram um método cetônco para extrair bromelina, no qual o suco do talo foi esfriado de 0-4°C, centrifugado e o sobrenadante foi coletado, repetindo-se duas vezes a extração, sendo posteriormente secado a vácuo e macerado, sendo reduzido a pôde acetona, obtendo-se 2-5 g de extrato para cada quilograma de amostra fresca. As provas demonstraram que, por meio do fracionamento com sulfato de amônio, foi obtida uma quantidade menor de proteína 0,871 g, mas com mais atividade proteolítica de 1,64 U/mg"1.

Murachi e colaboradores reportaram um procedimento de purificação a partir do extrato cru de proteínas do talo que foi suspenso em uma solução tampão de fosfato de potá ssio de pH de 6.1 por 30 minutos, a suspensão foi centrifugada em 5000 rpm durante 20 minutos, o precipitado foi descartado e o sobrenadante foi dividido em diferentes frações, as quais foram tratadas de diferente maneira com a finalidade de comparar a pureza da bromelina obtida.

Estes processos descritos relatam que a proteína é obtida a partir de plantas colhidas no campo e apresentam a desvantagem de ser um extrato cru, não purificado, o que faz com que contenham diversas moléculas que apresentam atividades reduzidas e de baixa qualidade nos extratos.

Processo de obtenção por indução.

A presente invenção considera a utilização de plantas estabelecidas in vitro e induzidas por substân cias ao estresse para produzir a proteína. A esse respeito, não foram encontrados trabalhos que mencionem ou expressem uma indução direta para se obter a bromelina no abacaxi, tendo sido unicamente realizados para fins de estudar a resposta da planta a diversos fatores ambientais, entre eles, a seca que é considerada como um dos fenômenos ambientais mais nocivos para a vida humana, por meio do que se iniciou com a identificação e caracterização molecular de algumas proteínas cuja aparição coincide com o estresse. Como resposta ao déficit hídrico no solo provocado pelo cloreto de sódio, as plantas produzem uma molécula reguladora do crescimento, o ácido abscíssico (ABA). Este é transportado pelo xilema a partir da raiz para as folhas maduras onde é induzido o fechamento de estornas para evitar assim uma maior perda de água.

Existem indutores de proteínas por meio de estresse hídrico que buscam resistência ante um déficit hídrico nas plantas, como o milho, onde é expressa a quinase CK2, aumentando a tolerância dos embriões ante um estresse hídrico.

Como é o caso da cevada, onde são expressas proteínas 14-3-3 que atuam como reguladores de tolerância frente à ressecação da planta. Por outro lado, há outra série de trabalho sobre a indução de proteínas por estresse osmóico em raízes de cevada. Neste caso, os tratamentos com sal induzem ou incrementam a síntese de várias proteínas, destacando-se duas delas de 26 e 27 kD de peso molecular.

Em estudos posteriores, a atenção foi centrada na proteína de 26 kD conhecida como osmotina, esta apresentando homologia com outras proteínas involucradas em mecanismos de defesa em plantas, como inibidores de protesases, amilas de milho e a proteína N P24 induzível por sal no tomate (Singh e outros, 1989).

Outro mecanismo de indução de proteínas é pelo ataque de patógenosou feridas causadas à planta. Esta se defende utilizando diversas estratégias, assim como a síntese de metabólitos secundários (MS) e a expressão de proteínas com atividades tóxicas para o patógeno.Um ativador desta defesa foi o AS (ácido salicílico), já que foi utilizado com êxito a nível comercial no controle e na prevenção de certos patógeios, assim como na resistência ao estresse causado por temperaturas extremas, pela presença de metais pesados e por herbicidas.

A dita resistência é medida por diferentes proteínas PR (proteínas de resistência), ao parecer ativada através de vias distintas, umas dependentes de AS, outras de ácido jasmônico (JA), óxido nítrico (NO) ou etileno (Leszek S. e Jankiewicz, 2003).

No caso de aplicação exógenade compostos ativadores, sabe-se que cada composto químico induz a expressão de diferentes proteínas PR. Tal é o caso do tabaco onde a aplicação exógera de AS dá lugar à indução de proteínas de defesa (PR) como PR-1, quitinase e b-l,3-gliconase (Leszek S. e Jankiewicz, 2003). Não obstante, os indutores anteriormente mencionados não provocam proteínas com atividade enzimática.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O objetivo geral da presente invenção constitui um processo para a obtenção de bromelina com uma maior atividade proteolítica e em maior concentração no tecido vegetal da planta do abacaxi obtida e induzida in vitro, em comparação com a proteína que gera a planta de campo de forma natural e que se extrai de forma tradicional.

O presente processo de obtenção de bromelina por meio de substânci as indutoras de proteínas em plantas de abacaxi (Ananas comosus) compreende as seguintes etapas:

Seleção do material vegetativo

São selecionadas plantas de Ananas comosus no campo, as quais devem ter 1-2 anos de idade, 50 cm de altura, um diâmetro foliar de 90 cm, e que tenha pelo menos 2 rebentos originados de raiz, onde o dito rebento tem uma altura de 15 a 20 cm, um diâmetro de 4-6 cm, um peso de 200-500 g e 5 meses de idade; as ditas características permitem a seleção de um rebento jovem que facilita o estabelecimento in vitro. Estabelecimento do cultivo

Os rebentos selecionados da etapa anterior são desprendidos de maneira manual, e já no laboratório, são eliminados suas folhas e seus pedúnculos da roseta para expor o meristema apical, sendo imediatamente submersos em uma solução de hipoclorito de sódio a 20% durante 20 minutos, e então levados para um recipiente de fluxo laminar para realizar lavagens contínuas com água estéril em uma temperatura ambiente para eliminar os resíduos do hipoclorito de sódio.

Depois são selecionados os meristemas apicais que não foram danificados pelo hipoclorito de sódo, para obter explantes de 6x6x4 mm, para o qual são feitos cortes perimetrais com o propósito de eliminar o tecido externo oxidado pelo efeito do hipoclorito de sódio.

Os ditos explantes são semeados em um meio de cultivo Musashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de estabelecimento" adicionado com 1 mg/L de BAP (6-Bencilaminopurina), 30 g/L de sacarose, 2 g/L de gel- rite e um pH de 5,7 ± 0,01.

Finalmente, os explantes semeados são incubados em uma câ mara de crescimento, a 27_+2°C, um fotoperíodo de 16 h/luz e 8 h/escudirão durante 30 dias, onde é obtido um broto de 1-2 cm de altura com pelo menos quatro folhas, embora os ditos brotos ainda não devam ter brotos axilares.

Multiplicação de propágalos

Aos brotos da etapa anterior, (mantendo as condições de assepsia), é aplicado um corte longitudinal central, de tal maneira que sejam obtidas duas partes, as quais são semeadas in vitro em um meio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de propagação" adicionado com 4-8 mg/L de BAP (6-Bencilaminopurina), 30 g/L de sacarose, 2 g/L de gel-rite e um pH de 5,7 ±_ 0,01.

Estes brotos são incubados em uma câmar a de crescimento a 27±2°C, em um fotoperíodo de 16 h/luz e 8 h/escudirão durante 30 dias, período no qual cada broto tem uma produção de 4-12 brotos laterais de 0,5-0,7 cm de altura.

Esta etapa é repetida pelo menos uma vez, segundo o número de brotos que se deseje obter; portanto, nos brotos obtidos desta etapa são realizados as mesmas condições de propagação pelas quais passaram seus progenitores. Uma vez obtida a quantidade de brotos desejados, os brotos passam à seguinte etapa que é a indução de bromelina.

Indução de bromelina

Nesta etapa é realizada uma seleção das mudas obtidas na etapa anterior, as quais possuem um tamanho de 1-2 cm de altura, uma média de 3-5 folhas e um peso de 120-250 mg, as quais são semeadas in vitro em um meio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de indução" adicionado com 30 g/L de sacarose, 2 g/L de gel-rite e Sacarose (30-90 g/L) como indutor de estresse osmótico.

Os brotos são colocados em uma câ mara de crescimento a 21±2°C, em um fotoperíodo de 16 h/luz e 8 h/escudirão, durante 7-45 dias, que é quando os brotos apresentam um tamanho de 2-5 cm, uma formação de 6-10 folhas e um sistema radicular completo.

No transcurso desta etapa é recomendável avaliar a concentração da bromelina total ^g de proteína/g de tecido), de acordo com o método de Bradford, a atividade específica da enzima (U/mg de proteína) pelo método Dapeau (1976), aos 7, 15, 30 e 45 dias para que desta maneira se consiga saber o efeito do período de indução em relação à produção de bromelina. Quando se tem uma atividade enzimática de (5-6 U/mg de proteína), é o momento idôneo para fizer a extração da bromelina.

Extração da bromelina

As plantas são lavadas em água corrente para eliminar os restos do cultivo, sendo então submetidas a uma primeira extração e passadas através de um filtro prensa para obter um primeiro suco que tem de 60-80% de bromelina, o qual é armazenado a (0- 5°C).

O bagaço resultante, que obviamente ainda contém bromelina, é dissolvido em uma solução tampão de extração, que contém fosfato de potás sio (K2PO4) frio (05°C) para evitar a desnaturalização da enzima, em uma concentração de 0,03 a 0,2 M e em um pH de 5,3 a 7,2, deixando-se repousar de 20 a 30 minutos, para depois passar a mistura no filtro prensa e obter um segundo suco desta extração. Prossegue-se então com a mistura e a homogeneização do primeiro suco com o segundo suco, a 2000-5000 rpm durante 1-2 minutos, e posteriormente com a centrifugação a 5000-10000 rpm de 15-20 minutos a 0-4°C para eliminar o precipitado e recuperar o sobrenadante, que é conservado de -80 a 0°c e finalmente liofilizado, para o qual o dito extrato deve conter pelo menos de 10-15% de solides.

Extrato Cru de Bromelina

Um grama de extrato cru, obtido pelo processo anteriormente descrito, é constituído de compostos fenólicosde 0,42-3,7 mg, clorofila de 0,9-1,038 mg e proteína total de 0,053-0,106 μg. Portanto, um grama de extrato cru tem uma atividade enzimática de 4,5- 6,5 U/mg de proteína, atividade enzimá tica que não foi encontrada nos extratos convencionais e uma atividade de peroxidase de 0,97-2,3 U/mg de proteína.

O extrato cru obtido a partir desta invenção pode ser empregado para aplicações biotecnológica e farmacêuticas por apresentar uma alta atividade enzimática.

Devido à confusão que se originou na preparação do meio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado do tradicional, é importante assinalar que o modo de preparação se dá a partir de soluções mãe (Quando 1). A partir deste meio, foram preparados os meios MS de estabelecimento, MS de propagação e o MS de indução.

Portanto, a invenção também compreende dois meios de cultivo inovadores, o de propagação e o de indução. <table>table see original document page 12</column></row><table>

A modificação ao meio de cultivo de Murashige e Skoog (1962) consiste no fato de a solução de nitratos não ser preparada para se ter em estoque, mas é preparada no momento da aplicação na preparação do meio, como é indicado no seguinte processo de preparação do meio a partir de soluções mãe:

1. Em um vaso de precipitado, colocar 850 ml de H2O destilada, agregar o volume indicado das soluções concentradas:

Quadro 2. Componentes e quantidades de soluções concentradas.

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2. Pesar, acrescentar e agitar até dissolver os seguintes reativos: Quadro 3. Componentes e quantidades de sais do meio MS modificado.

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3. Ajustar o pH do meio em 5,7 com hidróxido de sódio (NaOH) a IN ou ácido clorídrico (HCl) a IN e aforar em 1 litro.

4. Agregar o gelificante (gel-rite) 2 g/L e aquecer até conseguir dissolvê-lo.

5. Esvaziar 30 ml de MS tradicional em frascos de capacidade de 460 ml e agregar os reguladores de crescimento, esterilizar a 121 °C, em uma pressão de 1,2 kg/cm2 por 15 minutos. Neste ponto, pode ser agregado o regulador de crescimento em quantidades de 1 mg/L de BAP e o MS é denominado de estabelecimento, ou se forem agregados 4-8 mg/L BAP, ele será denominado de MS de propagação.

6. No caso da preparação do MS de indução, se considera até o ponto número 4, sendo adicionadas as substâncias indutoras, seja o cloreto de sódioNaCl a 0,1- 4,5 g/L, a Sacarose a 40-90 g/L, ácido salicílico a 0,001-2,0 mM em combinação ou em separado, já que, com a agregação do indutor, são esvaziados 30 ml de frascos de capacidade de 460 ml e são esterilizados em 121 °C, em uma pressão de 1,2 kg/cm2 por 15 minutos, com exceção de o meio conter ácido salicílico; nesse caso, o meio é esterilizado sem o indutor e o indutor é agregado ao meio até que este seja esterilizado por filtração e em condições assépticas.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1. INDUÇÃO DE BROMELINA

O objetivo desta etapa foi a de induzir a produção de bromelina em plantas de abacaxi por meio de substâncias indutoras (Sacarose, NaCl e Ácido Salicílico) com alta atividade enzimática.

Para realizar a avaliação dos indutores, foi realizado um desenho fatorial de 3x3x3 com três indutores em três concentrações diferentes e com três tempos de monitoramento (Quadro 4), sendo, para cada tratamento, designadas três unidades experimentais como repetições com três plantas por umidade experimental. As avaliações são realizadas utilizando-se os indutores em separado ou em combinação, dando um total de 64 tratamentos.

Quadro 4. Desenho estatístico para os indutores de bromelina. <table>table see original document page 15</column></row><table>

Os parâmetros avaliados são a concentração da proteína total ^g de proteína/g de tecido), de acordo com o método de Bradford, e a atividade específica da enzima (U/mg de proteína) pelo método Dapeau (1976), aos 7, 15, 30 e 45 dias durante a indução.

A indução foi iniciada com a seleção dos brotos previamente estabelecidos in vitro que apresentaram um tamanho de 2 cm com uma média de 3 folhas e com um peso de 120 mg. Estas plantas foram semeadas em um MS de indução sem regulador de crescimento e agregando cloreto de sódio NaCl em 0,1-4,5 g/L, como indutor de estresse hídrico, Sacarose a 30-90 g/L, como indutor de estresse osmóíco, e ácido salicílico- a 0,001-2,0 mM, como indutor de resistência a patógenos, as ditas substâncias indutoras sendo acrescentadas em combinação (dois ou mais indutores) ou em separado (um único indutor), de acordo com o tratamento (Quadro 5).

Quadro 5. Tratamentos de indução de bromelina.

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*tratamento sem aplicação de substâncias indutoras, utilizado como prova testemunhai para verificar o efeito dos indutores sobre a produção de bromelina.

AS: Ácido salicílico. S AC: sacarose. NaCl: Cloreto de sódio.

Uma vez agregados os indutores ao meio, o MS modificado foi esterilizado a 121°C e em uma pressão de 1,2 kcm2 durante 20 minutos. Nos tratamentos que continham ácido salicílico, primeiro foi esterilizado o meio MS modificado e posteriormente foi acrescentado o ácido, o qual foi esterilizado por meio de filtração em condições assépticas no recipiente de fluxo laminar. Aqui, é recomendado agregar o ácido ao meio antes que seja esfriado para se conseguir a homogeneização do indutor com o meio antes que este seja solidificado.

Os brotos são semeados em condições assépticas dentro de frascos de 460 ml que contêm 30 ml de MS de indução, os ditos frascos sendo fechados e vedados com fita transparente para evitar qualquer filtração de ar e a contaminação dos mesmos.

Os tratamentos são deslocados para um compartimento de crescimento sob condições controladas a 27±2°C e um fotoperíodo de 16 h/luz e 8 h/escuridão por um período de 7, 15, 30 e 45 dias.

Uma vez transcorridos os primeiros 7 dias de indução, é executada a extração enzimáticas com a finalidade de se obter um extrato cru. São obtidas três amostras de 30 ug/ml por cada travamento para determinar por triplicação a atividade específica.

Durante a avaliação dos indutores, pode-se concluir que todos os indutores aplicados apresentaram diferentes estatísticas, isto é, todos os tratamentos aos quais foi aplicada uma substância indutora mostraram um efeito positivo ao produzir bromelina em maior atividade enzimática que os tratamentos sem indutores (testemunhos), o quadro 6 mostra as diferenças de médias dos tratamentos que foram estatisticamente significativos, isto é, aqueles que apresentaram as máximas atividades específicas durante os 15, 30 e 45 dias.

Quadro 6. Efeitos dos indutores sobre a produção de bromelina.

<table>table see original document page 19</column></row><table> Todas as Médias apresentam diferenças estatísticas (Tukey 95%). * Média estatisticamente importante.

O comportamento dos indutores com relação ao tempo é o seguinte.

Aos 7 dias surge a presença significativa da enzima, aos 15 dias a produção de bromelina é aumentada, aos 30 diminui, e aos 45 dias é aumentada.

A seguinte é uma suposição.

A planta, ao ficar armazenada, produz proteínas de defesa, neste caso, a bromelina, a qual supõe-se tratar de uma proteína de resposta rápid a por apresentar atividade enzimática aos 7 dias de indução e apresentar seu máxi mo em atividade específica aos 15 dias; ao cabo de 30 dias, as plantas se adaptam a suas condições, o que faz com que a bromelina seja produzida em menores quantidades, aos 45 dias de indução, as plantas são submetidas a um estresse por falta de nutrientes do meio, começando a produzir de novo a bromelina, mas em quantidades menores que aquelas do início.

EXEMPLO 2. PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO DE BROMELINA

Foram tomadas mudas cultivadas in vitro nos diferentes meios de cultivo assinalados na presente invenção, e foram enxaguadas com água corrente para eliminar o meio MS de indução. Foram pesados 330 de plantas, colocados em um extrator para sua moagem e obtidos 200 ml de suco (primeira extração) que foram armazenados em uma temperatura de 4°C. Ao bagaço obtido da extração foram adicionados 670 ml de solução tampão de extração (fosfato de potáss io monobásico e fosfato de potá ssio dibásico) em um pH de 6,1 e uma concentração de 0,05 M; ficou repousando durante 20 minutos para a posterior coleta da enzima com sua passagem através de um extrator e a conseqüentemente obtenção do segundo suco. O seguinte passo é o de misturar e homogeneizar durante 1 minuto a 2000 rpm o suco da primeira extração com o aquele da segunda extração e centrifugar a 10000 rpm durante 20 min a 4°C, para posteriormente recuperar o sobrenadante com um volume aproximado de 800 ml, o qual é congelado a - 80°C e liofilizado (10% de sólidos) para sua conservação.

O procedimento de extração foi aplicado para todos os tratamentos para os 30 quais foi determinada a quantidade de proteína presente (Bradford), sendo expressa em mg de proteína por ml de extrato. Foi utilizada uma curva padrão para os ensaios de proteínas. O padrão utilizado foi albumina de so ro bovino de 0,20-1,0 mg/ml.

Com base nos resultados, foram obtidas as seguintes atividades específicas comparando-as com a bromelina comercial de importação e a bromelina a partir de plantas in vitro induzidas.

Quadro 7. Tabela comparativa de atividade específica obtida por diferentes métodos

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Com a realização de provas distintas de indução de produção de bromelina, é obtida uma maior atividade específica utilizando como indutor a sacarose em uma faixa de 30-90g/L; neste caso, a adição de sacarose ao meio provoca um estresse osmótico na plana a qual utiliza como resposta natural para a produção de bromelina.

Com o uso dos indutores na propagação de plantas de abacaxi in vitro, é gerada uma maior atividade enzimática de 200 até 600% em comparação com a bromelina produzida de forma natural nas plantas de abacaxi tradicionalmente cultivadas.

A bromelina extraída através deste procedimento não exige métodos de purificação para aumentar sua atividade proteolítica específica, a qual já é maior do que a atividade proteolítica da bromelina obtida pelos métodos de extração atuais que incluem uma etapa de purificação.

A submissão da bromelina a um processo de purificação faz com que sua produção seja muito mais rentá vel e minimize as perdas de matéria-prima durante o processo de purificação.

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Claims (6)

1. Método para obter bromelina em plantas de abacaxi, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as seguintes etapas: A. Seleção do material vegetativo. Selecionar plantas de Ananas comosus em campo, as quais devem ter 1-2 anos de idade, 50 cm de altura, um diâmetro foliar de 90 cm, e que tenham pelo menos 2 rebentos originados da raiz, onde o dito rebento tem uma altura de 15 a 20 cm, um diâ metro de 4-6 cm, um peso de 200-500 g e meses de idade; B. Estabelecimento do cultivo. Desprender o rebento de maneira manual, e, já no laboratório, eliminar suas folhas e pedúnculos da roseta para expor o meristema apical; realizar a desinfecção dos meristemas centrais submergindo-os em uma solução de hipoclorito de sódio aos 20% durante 20 minutos, depois levá-los para um recipiente de fluxo laminar para realizar lavagens contínuas com á gua estéril a uma temperatura ambiente para eliminar resíduos do hipoclorito de sódo; selecionar os meristemas apicais que não foram danificados pelo hipoclorito de sódb, para se obter explantes de 6x6x4 mm, aos quais são feitos cortes perimetrais com o propósito de eliminar o tecido externo oxidado pelo efeito do hipoclorito de sódb; semear os ditos explantes em um meio de cultivo de Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de estabelecimento" adicionado com 1 mg/L de BAP (6- Bencilaminopurina), 30 g/L de sacarose, 2 g/L de gel-rite e um pH de 5,7 + 0,01; incubar os explantes em uma câmara de crescimento, a 27+2°C, um fotoperíodo de 16 h/luz e 8 h/escuridão durante 30 dias, onde é obtido um broto de 1-2 cm de altura com pelo menos quatro folhas, embora os ditos brotos ainda não devam ter brotos auxiliares; C. Multiplicação de propá gaios. Realizar um corte longitudinal central nos brotos mencionados anteriormente, de tal maneira que sejam obtidas duas partes; semear as partes obtidas do corte em um meio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de propagação" adicionado com 4-8 mg/L de BAP (6-Bencilaminopurina), 30 g/L de sacarose, 2 g/L de gel-rite e ajustado em um pH de 5,7 + 0,01; incubar os brotos em uma câmara de crescimento a 27+2°C, em um fotoperíodo de 16 h/luz e 8 h/escuridão durante 30 dias, período no qual cada broto tem uma produção de 4-12 brotos laterais, de 0,5-0,7 cm de altura; semear novamente (mantendo as condições de assepsia) os brotos de acordo com o número de brotos que se deseje obter, portanto, os brotos obtidos desta etapa são realizados nas mesmas condições de propagação pelas que passagem seus progenitores; D. Indução de bromelina. Selecionar mudas obtidas na etapa anterior as quais apresentam um tamanho de 1-2 cm de altura, uma média de 3-5 folhas e um peso de -120-250 mg; semear as mudas selecionadas em um meio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de indução" adicionado com 30 g/L de sacarose, 2 g/L de gel-rite e sacarose (30-90 g/L) como indutor de estresse osmóíco; incubar os brotos em uma câ mara de crescimento a 27+2°C, em um fotoperíodo de 16 h/luz e 8 h/escuridão, durante 7-45 dias, que é quando os brotos apresentando um tamanho de 2-5 cm, uma formação de 6-10 folhas e um sistema radicular completo; e E. Extração de bromelina. Extrair a bromelina quando se tenha uma atividade enzimática de 5-6 U/mg de proteína); submeter as mudas a uma primeira extração, passando-as de um filtro prensa para obter um primeiro suco que tem de 60 - -80% de bromelina, o qual é armazenado em 0-5°C; suspender o bagaço resultante, que obviamente ainda contém bromelina, em uma solução tampão de extração, que contém fosfato de potáss io (K2PO4) frio (0-5°C) para evitar a desnaturalização da enzima, em uma concentração de 0,03 a 0,2 M e em um pH de 5,3 a 7,2, deixando repousar de 20 a -30 minutos, para depois passar a mistura no filtro prensa e obter um segundo suco desta extração; misturar e homogeneizar o primeiro suco com o segundo suco, a 2000-5000 rpm durante 1-2 minutos, e depois centrifugar a 5000-10000 de 15-20 minutos, a 0-4° C para eliminar o precipitado e recuperar o sobrenadante, o qual é conservado de -80 a 0°C; liofilizar o extrato, o qual deve conter pelo menos de 10-15% de sólidos.

2. Meio de cultivo para propagação de plantas de abacaxi (Ananas comosus) in vitro, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende de 99% de meio Murashige & Skoog (1962) modificado, e 1 % de 4-8 mg/L de BAP.

3. Meio de cultivo para indução de mudas de abacaxi (Ananas comosus) in vitro, CARACTERIZADO pelo fato de que é constituído de 99% de meio de Murashige & Skoog (1962) modificado, e 1% de pelo menos uma substância indutora, tal como sacarose (30-90 g/L), ou cloreto de sódio (0,1 a 4,5 g/L), ou ácido salicílico (0,001-2,0 mM).

4. Extrato cru de mudas de abacaxi (Ananas comous), CARACTERIZADO pelo fato de ser obtido pelo método descrito na reivindicação 1.

5. Extrato cru de mudas de abacaxi (Ananas comous), de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de conter em um grama compostos fenólicos de 0,42-3,7 mg clorofila de 0,9-1,038 mg e bromelina de 0,053-0,106 μg.

6. Extrato cru de mudas de abacaxi (Ananas comous), de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de conter uma atividade enzimática de -4,5-6,5 U/mg de proteína, e uma atividade de peroxidase de 0,97-2,3 U/mg de proteína.