WO2007148951A1 - Proceso para la producción de bromelina por medio de sustancias inductoras de proteínas en planta de piña - Google Patents

Proceso para la producción de bromelina por medio de sustancias inductoras de proteínas en planta de piña Download PDF

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology and in particular to obtaining secondary metabolites by induction, such as bromelain from plants of the genus Ananas spp., Previously established in vitr &.
  • the object of the invention is the development of an innovative process for extracting bromelain from the natural tissues of the established and induced pifia plant m vitro, with a higher proteolytic activity and in high concentrations ⁇ compared to the protein that is generated in a way natural in the plant and that is currently extracted by traditional methodologies.
  • pineapple seedlings established and induced in vitro are used, which are macerated in a phosphate buffer to extract them. Subsequently they are subjected to filtering, centrifuging, frozen and lyophilized processes to obtain a crude extract of bromelain characterized with high yields in terms of specific protein and activity.
  • nutraceuticals which in addition to the nutritional value provide health benefits, is the case of the pifia ⁇ Ananas c ⁇ mosus L.) which is the source of a mixture of cysteine proteases, the most abundant is bromelain, a protein that has effects beneficial on diseases such as cancer and coronary thrombosis (Mackay et al., 2003).
  • Bromelain as a nutraceutical has several pharmacological actions, such as inhibiting platelet aggregation and increasing the absorption of other medications. Bromelain is well absorbed orally and clinical and pharmacological evidence indicates that its therapeutic effects improve when administered in high doses. Although its mechanisms of action are not yet fully known, it has been shown to be an effective and safe food supplement (Mackay et al., 2003).
  • Bromelain can help in the treatment of coronary thrombosis that is characterized by a blockage of blood vessels by clots structured by a protein tub called fibrin and which is responsible for at least half of the deaths in developed countries such as England.
  • Heart attacks are often caused by a blockage of blood vessels that supply the heart.
  • a similar situation is observed in cerebral vascular accidents (Felton, 1980).
  • Blood clot formation is a process that occurs naturally in normal individuals but is controlled by a delicate balance between clot formation and its degradation. Bromelain appears to selectively promote the natural degradation of blood clots, without causing bleeding in subjects who have blockages in blood vessels.
  • the blood contains a natural protease that degrades clots called plasmin, which must be activated from its inactive form, the plasminogen. If this natural system is unbalanced, plasma levels may be low, allowing clots to persist and block blood vessels.
  • plasmin plasmin
  • Research by Steven Tanssing in Hawaii has shown that bromelain can stimulate the conversion of plasminogen to plasmin, which allows efficient breakdown of fibrin clots (Fernández, 2001).
  • Bromelain also has an "antithrombotic" property by which it blocks the conversion of prothrombin to thrombin, thereby reducing clot formation.
  • the anti-inflammatory effect of bromelain is related to this system. It has been suggested that bromelain is a better anti-inflammatory drug than non-steroidal drugs ⁇ as is aspirin. While aspirin inhibits the synthesis of all prostaglandins, bromelain is more selective and inhibits the production of only those that increase inflammation, without affecting the anti-inflammatory On the other hand, trauma and prolonged stress tend to shift the balance towards proinflammatory prostaglandins ⁇ a process that is counteracted by bromelifla that tends to restore the lost balance (Fernández, 2001).
  • Bromelain has industrial applications such as meat tenderizer, dessert preparation, low calorie jellies and in the beer manufacturing process among others. They also have medical applications for being a protein whose enzymatic activity allows it to provide benefits in diseases such as coronary thrombosis ⁇ gastric and intestinal ulcers as a modulator of the immune system and in the treatment of cancer.
  • Bromelain is a protease that has been found in plant tissues of the Brome ⁇ iaceae family, of which pifia (Anmtas c ⁇ mosus L.) is the best known. This enzyme plays a very important physiological role ⁇ by intervening in metabolic reactions and protecting the plant from attack by pests and diseases, it also has a special influence on nitrogen metabolism during the flowering stage (Chávez et al., 1998).
  • Bromelain belongs to the group of cysteine proteases and according to Murachi et al. (1964), among its most important properties are:
  • the enzyme is a glycoprotein that contains mannose ⁇ xylose, fucose and N-acetyl-D-glucosamine, has one oligosaccharide per molecule, which is covalently bound to the peptide chain (Feinstein and Whitaker, 1964).
  • Bromelain obtained from waste stems, has one reactive sulfhydryl group per molecule, which is essential for enzymatic catalysis (Murachi and Inagami, 1965).
  • the proposed amino acid sequences in the active site are:
  • bromelain obtained from stems are indicated, the data suggest that the enzyme is a basic protein with a molecular weight of approximately 33, OOO Da (Yasuda et al., 1970).
  • bromelain begins with the grinding of stems of plants grown on soil for the extraction and purification of the metabolite.
  • the bromelain preparation process mentioned in US3002891 consists in obtaining bromelain from pifia stem juice, resulting in an enzyme with satisfactory solubility, activity and color compared to the extractions made from the juice of the fruit of pifia.
  • US3446626 protects a method of preparing a bromelain solution for "antimortem" injection that is supplied to animals in order to soften the meat.
  • Bromelain is prepared in an injectable solution with a pH of 7.5 and applied 6 hours before the death of the animal to cause tenderization or softening of the meat.
  • Patent US3455787 mentions the extraction of bromelain from a stem of pee which involves grinding the stem, extracting the liquid by means of pressure and centrifugation to precipitate fine crystals. Subsequently, the excess liquid is centrifuged again. During the cooling of the centrifuge organic solvents and salts are used, as well as soluble detergents to carry out the precipitation.
  • Heinicke and Gortner reported a ketone method to extract bromelain, in which the stem juice was cooled from 0-4 ° C, centrifuged and the supernatant pooled, repeated extraction twice and subsequently dried under vacuum and macerated reducing to acetone powder, obtaining 2-5g of extract for each kilogram of fresh sample.
  • the tests showed that by means of fractionation with ammonium sulfate they obtained less protein 0.871g but with more proteolytic activity 1.64 U / mg '1 .
  • Murachi et al. Reported a purification procedure from the crude stem protein extract, which was suspended in potassium phosphate buffer pH 6.1 for 30 minutes, the suspension was centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes, the precipitate was discarded and The supernatant was divided into different fractions, which were treated differently in order to compare the purity of the bromelain obtained.
  • the present invention considers the use of plants established in vrtro and induced by stress substances to produce the protein.
  • no papers were found that mention or express a direct induction to obtain bromelain in pineapple, it has only been done for the purpose of studying the response of the plant to various environmental factors, including the drought that is considered as one of the environmental phenomena more harmful to human life, so it began with the identification and molecular characterization of some proteins whose appearance coincides with stress.
  • plants In response to the water deficit in the soil caused by sodium chloride, plants produce a growth-regulating molecule, abscisic acid (AB A). This is transported by the xylem from the root to mature leaves where it induces the closure of stomata to avoid a greater loss of water.
  • AB A abscisic acid
  • osmotine which presents homology with other proteins involved in defense mechanisms in plants, such as protease inhibitors, corn amylas and salt-inducible NP24 protein in tomatoes (Singh et al. ., 1989).
  • Another mechanism of protein induction is the attack of pathogens or wounds caused to the plant. This is defended using various strategies, such as the synthesis of secondary metabolites (MS) and the expression of proteins with toxic activities towards the pathogen.
  • MS secondary metabolites
  • An activator of this defense has been the AS (salicylic acid) since it has been used successfully at the commercial level in the control and prevention of certain pathogens as well as in the resistance to stress caused by extreme temperatures, by the presence of heavy metals and by herbicides
  • PR proteins resistance proteins
  • AS jasm ⁇ mco acid
  • NO nitric oxide
  • ethylene Leszefc S. and Jankiewicz. , 2003.
  • the general object of the present invention constitutes a process for obtaining bromelain with a higher proteolytic activity and in greater concentration in the plant tissue of the pifia plant obtained and induced in vitro, in comparison with the protein generated by the plant. ⁇ mmpo naturally and that is extracted in a traditional way.
  • the present process of obtaining bromelain by means of protein-inducing substances in pifia plants ⁇ Ananas comosus comprises the following steps:
  • Ananas comosus plants are selected in the field, which must be 1-2 years old, 50 cm tall, a leaf diameter of 90 cm, and have at least 2 children originating from the root, where said grandfather has a height of 15 to 20 cm, a diameter of 4-6 cm, a weight of 200-50Og and 5 months of age; These characteristics allow the selection of a young grandfather that facilitates the establishment m vitr ⁇ .
  • the children selected from the previous stage are detached manually, and already in the laboratory, their leaves and peduncles are removed from the rosette to discover the apical meristem and immediately immersed in a 20% sodium hypochlorite solution for 20 minutes. j are then taken to a laminar flow hood to perform continuous washing with sterile water at room temperature, to remove residues of sodium hypochlorite.
  • the apical meristems are selected that have not been damaged by sodium hypochlorite, to obtain explants of 6x6x4 mm, for which perimetral cuts are made with the purpose of removing the oxidized external tissue by the effect of sodium hypochlorite.
  • the sown explants are incubated in a growth chamber, at 27 ⁇ 2 o C, a photoperiod of 16 h / light and Sh / darkness for 30 days, where an 1-2 cm high shoot is obtained with at At least four leaves, but these shoots should not yet have axillary shoots.
  • This stage is repeated at least once, depending on the number of shoots that you want to obtain, therefore the shoots obtained from this stage are carried out the same propagation conditions through which their parents passed. Once the desired number of shoots has been obtained, the shoots go to the next stage, which is the induction of bromelain.
  • a selection of the seedlings obtained in the previous stage is made which have a size of 1-2 cm in height, an average of 3-5 leaves and a weight of 120-250 mg, which are sown in yitro in a modified Murashige & Skoog (1962) culture medium, considered for this stage "MS induction" added with 30 g / L sucrose, 2 g / L gel-rite and Sucrose (30 - 90g / L) as inducer of osmotic stress.
  • the shoots are placed in a growth chamber at 27 ⁇ 2 o C, at a photoperiod of 16 h / light and 8 h / dark, for 7- 45 days, which is when the shoots have a size of 2-5 cm, a 6-10 leaf formation and a complete root system ..
  • Bromelain extraction The plants are washed in running water to remove the remains of the crop, then undergo a first extraction, passed through a filter press to obtain a first juice that has 60-80% bromelain, which It is stored at (0-5 ° C).
  • the resulting bagasse which obviously still contains bromelain, is dissolved in an extraction buffer, which contains cold potassium phosphate (K 2 PO 4 ) (0-5 ° C) to prevent denaturation of the enzyme, at a concentration of 0.03 at 0.2 M, at pH of
  • a gram of crude extract, obtained by the process described above, consists of: 0.42-3.7 mg phenolic compounds. chlorophyll of. 0.9-1 jO38 mg. and total protein of 0.053-0.106 Ug.
  • a gram of crude extract has an enzymatic activity of 4.5-6.5 U / mg of protein, enzymatic activity that has not been found in conventional extracts and a Deperoxidases activity of 0.9-7-2.3-U / mg-protein .
  • the crude extract that is. obtained from this injection can be used for biotechnological and pharmaceutical applications for presenting high enzymatic activity.
  • the invention also comprises two novel culture media, propagation and induction.
  • the modification to the culture medium of Murashige and Skoog (1962), is that the nitrate solution is not prepared to be in stock, but is prepared at the time of application in the preparation of the medium, as indicated, in the following process of preparing the medium from stock solutions:
  • the objective of this stage was to induce the production of bromeiin in pineapple plants by means of inducing substances (Sucrose, NaCl and Salicylic Acid) with high enzymatic activity.
  • the parameters evaluated are the protein concentration, total ( ⁇ g protein / g tissue) according to the Bradford method, the specific activity of the enzyme (U / mg protein) by the Dapeau method (1976), at 7, 15, 30 and 45 days during induction.
  • the induction began with the selection of previously established outbreaks in vitro presented a size of 2 cm with an average of 3 leaves and weighing 120 mg. These plants were planted in an induction MS without growth regulator and adding sodium chloride NaCl at 0.1 - 4.5 g / L as a water stress inducer,
  • Sucrose at 30 - 90 g / L As an inducer of osmotic stress and salicylic acid at 0.001 -2.0 mM as an inducer of resistance to pathogens, these inducing substances are added in combination (two or more inductors) or separately (a single inducer) depending on the treatment (Table 5).
  • the inductors were added to the modified MS medium, it was sterilized at 121 ° C, at a pressure of 1.2 kg / cm 2 for 20 minutes.
  • the treatments containing salicylic acid, the modified MS medium was first sterilized and subsequently the acid was added, which was sterilized by filtration, under aseptic conditions in laminar flow hood.
  • the shoots are seeded under aseptic conditions inside 460 ml bottles containing 30 ml of induction MS, said bottles are closed and sealed with transparent tape to avoid any air filtration and consequently contamination thereof.
  • the treatments are transferred to a quarter of growth under controlled conditions at 27 + 2 ° C and a photoperiod of 16 hours / light and 8 hours / darkness for a period of 7, 15, 30 and 45 days.
  • the enzymatic extraction is carried out in order to obtain a crude extract.
  • Three 30 ug / ml samples are taken for each treatment to determine the specific activity in triplicate.
  • bromelain which suggests that it is a rapid response protein because it has enzymatic activity at 7 days of induction and has a maximum in specific activity.
  • the plants adapt to their conditions, so that bromelain is produced in smaller quantities, after 45 days of induction the plants are subjected to a. stress due to the shortage of. the. nutrients from the environment and start producing bromelain again but in smaller quantities than at the beginning.
  • the next step is to mix and homogenize for 1 minute at 2000 rpm the juice of the first extraction with that of the second extraction and centrifuge at 10,000 rpm for. 20 min. at 4 ° C, to subsequently recover the supernatant with an approximate volume of 800 ml which is frozen at -80 ° C and lyophilized (10% solids) for conservation.
  • sucrose inducer in a range of 30-90g / L; in this case the addition of. sucrose in the medium causes an osmotic stress in the plant which it uses as a natural response for the production of bromelain.
  • inducers in the propagation of pineapple plants in vitro, greater enzymatic activity is generated from 200 to 600% compared to the bromelain produced naturally in traditionally grown pine plants.
  • bromelain to a purification process makes its production much more profitable and minimizes the losses of the raw material during the purification process.

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Abstract

La. presente invención se relaciona, con el campo de la biotecnología y en particular con la obtención de metabolitos secundarios por inducción, tales como la bromelina de plantas del género Ananas spp., previamente establecidas in vitro. El objeto de la invención, es el desarrollo de un proceso innovador para extraer bromelina de los tejidos naturales de la planta de piña establecidos e inducidos in vitro con una mayor actividad, proteolítica (200 a un 600 %)-y en altas concentraciones, en comparación con la proteína que se genera de forma natural en la planta y que es extraída actualmente por metodologías tradicionales. En este proceso se utilizan plántulas de pina. establecidas e inducidas in vitro, las cuales se maceran en un amortiguador de fosfatos para realizar su extracción. Posteriormente se someten a procesos de filtrado, centrifugado, congelado y liofilizado para obtener así un extracto crudo de bromelina caracterizado con altos rendimientos en términos de proteína y actividad específica.

Description

PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE BROMELINA POR MEDIO DE
SUSTANCIAS INDUCTORAS DE PROTEÍNAS EN PLANTA DE PEÑA ESTABLECD3AS in vitro.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con el campo de la biotecnología y en particular con la obtención de metabolitos secundarios por inducción, tales como la bromelina de plantas del género Ananas spp., previamente establecidas in vitr&.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la invención es el desarrollo de un proceso innovador para extraer bromelina de los tejidos naturales de la planta de pifia establecidos e inducidos m vitro, con una mayor actividad proteolítica y en altas concentraciones^ en comparación con la proteína que se genera de forma natural en la planta y que es extraída actualmente por metodologías tradicionales.
En este proceso se utilizan plántulas de pina establecidas e inducidas in vitro, las cuales se maceran en un amortiguador de fosfatos para realizar su extracción. Posteriormente se someten a procesos de filtrado, centrifugado, congelada y liofilizado para obtener así un extracto crudo de bromelina caracterizado con altos rendimientos en términos de protema y actividad especifica.
ANTECEDENTES
Actualmente existen alimentos llamados nutracéuticos, que además del valor nutritivo aportan beneficios a la salud, es el caso de la pifia {Ananas cσmosus L.) que es fiíente de una mezcla de cistein proteasas, la más abundante es la bromelina, proteína que presenta efectos benéficos sobre enfermedades como cáncer y trombosis coronaria (Mackay y col., 2003). La bromelina como nutracéutíco tiene varias acciones farmacológicas, como inhibir la agregación plaquetaria y aumentar la absorción de otros medicamentos. La bromelina es bien absorbida en forma oral y la evidencia clínica y farmacológica indica que sus efectos terapéuticos mejoran cuando se administra en altas dosis. Aunque todavía no se conocen completamente sus mecanismos de acción, sí se ha demostrado que es un complemento alimenticio efectivo y seguro (Mackay y col., 2003).
La bromelina puede ayudar en el tratamiento de la trombosis coronaria que se caracteriza por un bloqueo de los vasos sanguíneos por coágulos estructurados por tina proteína llamada fibrina y que es responsable de al menos, la mitad de las muertes en países desarrollados como Gran Bretaña. Los ataques al corazón son a menudo causados por un bloqueo de los vasos sanguíneos que irrigan el corazón. Una situación similar se observa en los accidentes vasculares cerebrales (Felton, 1980).
La formación de coágulos sanguíneos es un proceso que ocurre naturalmente en individuos normales pero que está controlado por un delicado balance entre la formación de coágulos y su degradación. La bromelina parece promover selectivamente la degradación natural de coágulos de sangre, sin causar hemorragias en sujetos que presentan bloqueos en vasos sanguíneos. La sangre contiene una proteasa natural que degrada coágulos llamada plasmina, la cual debe ser activada desde su forma inactiva, el plasminógeno. Si este sistema natural no está balanceado, los niveles de plasminas pueden estar bajos, permitiendo que los coágulos persistan y bloqueen los vasos sanguíneos. Investigaciones realizadas por Steven Tanssing en Hawai, han demostrado que la bromelina puede estimular la conversión de plasminógeno en plasmina, lo cual permite deshacer eficientemente los coágulos de fibrina (Fernández, 2001).
La bromelina también presenta una propiedad "antitrombótica" mediante la cual bloquea la conversión de protrombina en trombina, reduciendo de este modo la formación de coágulos. El efecto antiinfiamatorio de la bromelina está relacionado con este sistema. Se ha sugerido que la bromelina es una droga antiinflamatoria mejor que las drogas no esteroidales^ tal como lo es la aspirina. Mientras que la aspirina inhibe la síntesis de todas las prostaglandinas, la bromelina -es más selectiva e inhibe la producción sólo de aquellas que aumentan la inflamación, sin afectar las antiinflamatorias. Por su parte, el trauma y el estrés prolongado tienden a desplazar el balance hacia las prostaglandinas proinflamatorias^ proceso que es contrarrestado por bromelifla que tiende a restablecer el equilibrio perdido (Fernández, 2001).
La bromelina presenta aplicaciones industríales como ablandador de carnes, preparación de postres, gelatinas de bajo contenido calórico y en el proceso de fabricación de cerveza entre otros. También presentan aplicaciones médicas por ser una proteína cuya actividad enzimática le permite proporcionar beneficios en enfermedades como trombosis coronaria^ ulceras gástricas e intestinales como modulador del sistema inmunológico y en el tratamiento de cáncer.
La bromelina es una proteasa que se ha encontrado en tejidos de plantas de la familia Bromeíiaceae, de las cuales la pifia (Anmtas cσmosus L.) es la más conocida. Esta enzima juega un papel fisiológico muy importante^ al intervenir en reacciones metabólicas y proteger el vegetal del ataque de plagas y enfermedades, también influye de manera especial en el metabolismo nitrogenado durante la etapa de floración (Chávez y col., 1998).
Propiedades bioquímicas; de Ia bromelina son las siguientes: La bromelina pertenece al grupo de las cistein proteasas y según Murachi y col. (1964), entre sus propiedades más importantes se encuentran:
• pH óptimo aproximadamente 7 (Inagami y Murachi 1963).
• Estabilidad: La enzima mantiene su actividad sobre caseína a 50° C por 24 horas en un rango de pH de 4 a 10. Es estable en soluciones 25% de metanol (v/v) a 25° C por 20 min, y pierde un 50% de actividad al calentarse la solución enzimática a 55° C por 20 min a pH 6 (Whitaker y El-Gharbawi, 1963).
• La liofilización causa un 27% de pérdida de la actividad. (Murachi y col., 1964). • Pureza: Ha sido purificada por cromatografía líquida y la homogeneidad de la enzima se ha verificado mediante ultracentrifugación, sedimentación, electroforesis de disco en gel de acrilamida y análisis difusional. (Murachi y Tachibana, 1966). El principal residuo amino terminal es la valina (Val) y el carboxilo terminal es glicina
(GIy). La enzima es una glicoproteína que contiene mañosa^ xilosa, fucosa y N-acetil- D-glucosamina, tiene un oligosacárido por molécula, el cual está covalentemente unido a la cadena peptídica (Feinstein y Whitaker, 1964).
La bromelina, obtenida de tallos de desecho, tiene un grupo sulfhidrilo reactivo por molécula, el cual es esencial para la catálisis enzimática (Murachi e Inagami, 1965). Las secuencias propuestas de aminoácidos en el sitio activo son:
Cys-Gly-Ala-Cys-Tϊp (Chao y Liener, 1967)
Asn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Trp (Husain y Lowe, 1968)
Propiedades físicas de la brometina.
Se indican las propiedades físicas de la bromelina obtenida de tallos, los datos sugieren que la enzima es una proteína básica con un peso molecular de aproximadamente 33,OOO Da (Yasuda y col., 1970).
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a: Por Sedimentación-Difusión. b: Por constante" de Sedimentación y Viscosidad intrínseca. c: Por método de Archibald (Yasuda y col., 1970).
Procesos tradicionales de obtención.
Actualmente y de forma tradicional, el proceso de obtención de bromelina inicia con la molienda de tallos de plantas cultivadas sobre suelo para- la extracción y purificación del metábolito.
El proceso de preparación de bromelina que menciona la patente US3002891, consiste en la obtención de bromelina a partir de jugo de tallo de pifia dando como resultado una enzima con solubilidad, actividad y color satisfactorio en comparación con las extracciones que se realizan a partir del jugo del fruto de pifia. La patente US3446626 protege un método de preparación de una solución de bromelina para inyección "antimortem" que se suministra a animales a fin de suavizar la carne. Se prepara la bromelina en una solución inyectable con un pH de 7.5 y se aplica 6 horas antes de la muerte del animal para causar la tenderización o suavización de la carne.
La Patente US3455787 menciona la extracción de bromelina a partir de tallo de pifia que involucra moler el tallo, extraer el líquido por medio de presión y centrifugación para precipitar cristales finos. Posteriormente, el líquido sobrante es centrifugado nuevamente. Durante el enfriamiento del centrifugado se utilizan solventes orgánicos y sales, así como detergentes solubles para realizar la precipitación.
Otra manera de obtener bromelina se menciona en la patente US3699001 en la cual se extrae el jugo, sometiendo los tallos a un tratamiento a bajas temperaturas, realizando una precipitación fraccionada a partir del jugo clarificado con compuestos orgánicos y liberación de Bromelina precipitada con compuestos orgánicos fríos.
Heinicke y Gortner reportaron un método cetónico para extraer bromelina, en el que el jugo de tallo se enfrió de 0-4° C, se centrifugó y el sobrenadante se colectó, repitiéndose dos veces la extracción y posteriormente se secó a vacío y se maceró reduciéndose a polvo de acetona, obteniéndose 2-5g de extracto por cada kilogramo de muestra fresca. Las pruebas demostraron que por medio del fraccionamiento con sulfato de amonio obtuvieron menos cantidad de proteína 0.871g pero con más actividad proteolítica 1.64 U/mg'1.
Murachi y colaboradores, reportaron un procedimiento de purificación a partir del extracto crudo de proteínas del tallo, el cual fue suspendido en amortiguador fosfato de potasio pH 6.1 por 30 minutos, la suspensión se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos, el precipitado se desechó y el sobrenadante se dividió en diferentes fracciones, las cuales fueron tratadas de diferente manera con Ia finalidad de comparar la pureza de la bromelina obtenida.
Estos procesos
Figure imgf000006_0001
mencionan que obtienen la proteína a partir de plantas cosechadas en campo y presentan la desventaja de ser un extracto crudo, no purificado, lo que provoca que contengan diversas moléculas que presentan actividades reducidas y baja calidad en los extractos.
Proceso de obtención por inducción. La presente invención considera la utilización de plantas establecidas in vrtro e inducidas por sustancias a estrés para producir la proteína. A este respecto, no se encontraron trabajos que mencionen o expresen una inducción directa para obtener bromelina en pina, únicamente se ha hecho para fines de estudiar la respuesta de la planta a diversos factores ambientales, entre ellos la sequía que es considerada como uno de los fenómenos ambientales más nocivos para la vida humana, por lo que se inició con la identificación y caracterización molecular de algunas proteínas cuya aparición coincide con el estrés. Como respuesta al déficit hídrico en el suelo provocado por el cloruro de sodio, las plantas producen una molécula reguladora del crecimiento, el ácido abscísico (AB A). Este es transportado por el xilema desde la raíz a hojas maduras en donde induce el cierre de estomas para evitar de esta manera una mayor pérdida de agua.
Existen inductores de proteínas por medio de estrés hídrico que buscan resistencia ante un déficit hídrico en las plantas como el maíz en donde se expresa la quinasa CK2 aumentando la tolerancia de los embriones ante un estrés hídrico.
Como el caso de la cebada, en donde se expresan proteínas 14-3-3 que actúan como reguladores de tolerancia frente la desecación de la planta. Por otro lado, hay otra serie de trabajos sobre la inducción de proteínas por estrés osmótico en raíces de cebada. En este caso los tratamientos con sal inducen o incrementan la síntesis de varias proteínas, destacando dos de ellas de 26 y 27 kD de peso molecular.
En estudios
Figure imgf000007_0001
la atención se centró en la proteína de 26 kD conocida como osmotina, ésta presenta homología con otras proteínas involucradas en mecanismos de defensa en plantas, como inhibidores de proteasas, amilas de maíz y la proteína NP24 inducible por sal en el tomate (Singh y col., 1989). Otro mecanismo de inducción de proteínas es por el ataque de patógenos o heridas causadas a la planta. Esta se defiende utilizando diversas estrategias, como la síntesis de metabolitos secundarios (MS) y la expresión de proteínas con actividades tóxicas hacia el patógeno. Un activador de esta defensa ha sido el AS (ácido salicílico) ya que se ha utilizado con éxito a nivel comercial en el control y prevención de ciertos patógenos así como en la resistencia al estrés causado por temperaturas extremas, por presencia de metales pesados y por herbicidas.
Dicha resistencia es mediada por diferentes proteínas PR (proteínas de resistencia), al parecer activada a través de distintas vías, unas dependientes de AS, otras de ácido jasmάmco (JA), óxido nítrico (NO) o etileno (Leszefc S. y Jankiewicz., 2003).
En el caso de aplicación exógena de compuestos activadores, se sabe que cada compuesto químico induce la expresión de diferentes proteínas PR. Tal es el caso del tabaco donde la aplicación exógena de AS da lugar a la inducción de proteínas de defensa (PR) como PR-I, quitinasa y b -1,3-gluconasa (Leszek S. y Jankiewicz., 2003). Sin embargo, los inductores anteriormente mencionados no provocan proteínas con actividad enzimática.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El objeto general de la presente invención constituye un proceso para k obtención de bromelina con una mayor actividad proteolítica y en mayor concentración en el tejido vegetal de la planta de pifia obtenida e inducida in vitro,, en comparación con la proteína que genera la planta de <mmpo de forma natural y que se extrae de forma tradicional.
El presente proceso de obtención de bromelina por medio de sustancias inductoras de proteínas en plantas de pifia {Ananas comosus), comprende las siguientes etapas:
Selección del material vegetativo
Se seleccionan plantas de Ananas comosus en campo, las cuales deben tener 1 -2 años de edad, 50 cm de altura, un diámetro foliar de 90 cm, y que tenga al menos 2 hijuelos originados de raíz, donde dicho hijuelo tiene una altura de 15 a 20 cm, un diámetro de 4-6 cm, un peso de 200-50Og y 5 meses de edad; dichas características permiten la selección de un hijuelo joven que facilita el establecimiento m vitrσ.
Establecimiento del cultivo
Los hijuelos seleccionados de la etapa anterior se desprenden de manera manual, y ya en el laboratorio, se eliminan sus hojas y pedúnculos de la roseta para descubrir el meristemo apical e inmediatamente se sumergen en una solución de hipoclorito de sodio al 20 % durante 20 minutoSj después son llevados a una campana de flujo laminar para realizar lavados continuos con agua estéril a una temperatura ambiente, para eliminar residuos del hipoclorito de sodio.
Después se seleccionan los meristemos apicales que no hallan sido dañados por el hipoclorito de sodio, para obtener explantes de 6x6x4 mm, para lo cual se hacen cortes perimetrales con el propósito de eliminar el tejido externo oxidado por el efecto del hipoclorito de sodio.
Dichos expíantes son sembrados en un medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de establecimiento" adicionado con lmg/L de BAP (6-Beneilaminopurina), 30 g/L de sacarosa, 2 g/L de gel-rite y un pH de 5.7 ± 0.01.
Finalmente, los explantes sembrados son incubados en una cámara de crecimiento, a 27± 2o C, un fotoperíodo de 16 h/luz y Sh/oscuridad durante 30 días, en donde se obtiene un brote de 1-2 cm de altura con al menos cuatro hojas, pero dichos brotes aun no deben de tener brotes axilares.
Multiplicación de propágalos
Los brotes de la etapa anterior, (manteniendo las condiciones de asepsia), se les aplica un corte longitudinal central, de tal manera que se obtienen dos partes, las cuales son sembradas τn vitrσ en un medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de propagación" adicionado con 4-8 mg/L de BAP (6-Bencilaminopurina), 30 g/L de sacarosa, 2 g/L de gel-rite y un pH de 5.7 ± 0.01. Estos brotes son incubados en una cámara de crecimiento a 27± 2a C, a un fotoperíodo de 16 Muz y 8h/oscuridad durante 30 días, periodo en el cual, cada brote tiene una producción de 4-12 brotes laterales, de 0.5-0.7 cm de altura.
Esta etapa se repite al menos una vez, según el número de brotes que se desee obtener, por lo tanto los brotes obtenidos de esta etapa se les realizan las mismas condiciones de propagación por las que pasaron sus progenitores. Una vez obtenida la cantidad de brotes deseados, los brotes pasan a la siguiente etapa que es la inducción de bromeíina.
Inducción de bromelina
En esta etapa se realiza una selección de las plántulas obtenidas en la etapa anterior las cuales poseen un tamaño de 1-2 cm de altura, un promedio de 3-5 hojas y un peso de 120-250 mg, las cuales son sembradas in yitro en un medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de inducción" adicionado con 30 g/L de sacarosa, 2 g/L de gel-rite y Sacarosa (30 - 90g/L) como inductor de estrés osmótico.
Los brotes se colocan en una cámara de crecimiento a 27± 2o C, a un fotoperíodo de 16 h/luz y 8h/oscuridad, durante 7- 45 días, que es cuando los brotes presentan un tamaño de 2-5 cm, una formación de 6-10 hojas y un sistema radicular completo..
En el transcurso de esta etapa es recomendable hacer evaluación de la concentración de la bromelina total (μg proteína/g tejido) según el método de Bradford, la actividad específica de la enzima (U/mg proteína) por el método Dapeau (1976), a los 7, 15, 30 y 45 días para que de esta manera se logre saber el efecto del periodo de inducción en relación a la producción de bromelina. Cuando se tenga una actividad enzimática de (5- 6 U/mg de proteína), es el momento idóneo para hacer la extracción de la bromelina.
Extracción de la bromelina Las plantas se lavan en agua corriente para eliminar ios restos del cultivo, después se someten a una primera extracción, pasadas a través de un filtro prensa para obtener un primer jugo que tiene de 60-80% de bromelina, el cual es almacenado a (0-5° C). El bagazo resultante, que obviamente aun contiene bromelina, es disuelto en un amortiguador de extracción, que contiene fosfato de potasio (K2PO4) frío (0-5° C) para evitar la desnaturalización de la enzima, a una concentración de 0.03 a 0.2 M, a pH de
5.3 a 7.2, dejándose reposar de 20 a.30 minutos, para después pasar la mezcla al filtro prensa y obtener un segundo jugo de esta extracción; se prosigue a mezclar y homogenizar el primer jugo con el segundo jugo, a 2000- 5000 rpm durante 1-2 minutos, y después centrifugar a 5000-10 000 rpm de 15 -20 minutos, a 0-4° C para eliminar el precipitado y recuperar el sobrenadante el cual es conservado de -80 a 0° C y finalmente se liofíliza para lo cual dicho extracto debe contener por lo menos de un 10-15% de sólidos.
EXTRACTO CRUDO DEBROMELINA
Un gramo de extracto crudo, obtenido por el proceso antes descrito, se constituye de: compuestos fenólicos de 0.42- 3.7 mg,. clorofila de. 0.9-1 jO38 mg. y proteína total de 0.053-0.106 Ug.
Por lo tanto un gramo de extracto crudo tiene una actividad enzimática de 4.5-6.5 U/mg de proteína, actividad enzimática que no se ha encontrado en los extractos convencionales y una actividad deperoxidasas de 0.9-7-2.3-U/mg-de proteína.
El extracto crudo que se. obtiene a partir de esta inyención puede emplearse para aplicaciones biotecnológicas y farmacéuticas por presentar alta actividad enzimática.
Debido a la confusión que. se ha originado en la preparación, del medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado del tradicional, es importante señalar que el modo de preparación es a partir de soluciones madre (Cuadro 1). A partir de este medio se prepararon los medios MS de establecimiento, MS de propagación y el MS de inducción.
Por lo tanto la invención también comprende dos medios de cultivo novedosos, el de propagación y el de inducción.
Figure imgf000012_0001
La modificación al medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), consiste en que la solución de nitratos no se prepara para tenería en stock, sino que se prepara al momento de aplicarla en la preparación del medio, como se indica, en el siguiente proceso de preparación del medio a partir de soluciones madre:
1. En un vaso de precipitado- colocar 850ml de H2Q destilada, agregar el volumen indicado de las soluciones concentradas:
Figure imgf000013_0001
2. Pesar, añadir y agitar basta disolver los síguientes reactivos:
Figure imgf000013_0002
3. Ajustar el pH del medio a 5.7 con hidróxido de sodio (NaOH) a 1N o ácido clorhídrico (HC1) a 1N y aforar a 1 litro.
4. Agregar el gelificante (gel-rite) 2g/L y calentar hasta lograr disolverlo.
5. Vaciar 30ml MS tradicional a frascos de capacidad de 460ml y agregar los regaladores de crecimiento, esterilizara 121° C, a una presión de 1.2 kg/cm2 por 15 minutos. En este punto se puede agregar el regulador de. crecimiento en cantidades de Img/L de BAP y el MS es denominado de establecimiento o si se le agrega de 4-Smg/L BAP es denominado MS de propagación.
6. En caso de prepararse el MS de inducción se considera hasta el punto numero 4 y se adicionan las sustancias indαctoras ya sea el cloruro de sodio NaCl a 0.1 - 4.5g/L,
Sacarosa a 40 - 90g/L y ácido salicílico a 0.001 -2.0 mMen. combinación o por separado, una vez agregando el inductor se vacían 30mi a frascos de capacidad de 460 ml y se esteriliza a 121° C, a una presión de 1.2 kg/cm2 por 15 minutos, con excepción del medio contenga ácido salicílico, en ese -caso el medio es esterilizado sin el inductor y el inductor es agregado al medio hasta, que este es esterizado por filtración y bajo condiciones asépticas.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1. INDUCCIÓN DE BROMELINA
El objetivo de esta etapa fue inducir la producción de bromeiina en plantas de piña por medio de sustancias inductoras (Sacarosa, NaCl y Ácido- Salicítíco) con alta actividad enzimátíca.
Para realizar la evaluación de los inductores se realizó un diseño factorial de 3x3x3 con tres inductores a tres concentraciones diferentes y con tres tiempos de monitoreo (Cuadro 4), para cada tratamiento son asignadas tres unidades experimentales como repeticiones con tres plantas por unidad experimental. Las evaluaciones son realizadas utilizando a los inductores por separado o en combinación dando un total de 64 tratamientos.
Figure imgf000014_0001
Los parámetros evaluados son la concentración de la protema, total (μg proteína/g tejido) según el método de Bradford, la actividad específica de la enzima (U/mg proteína) por el método Dapeau (1976), a los 7, 15, 30 y 45 días durante la inducción.
La inducción se inició con la selección de los brotes previamente establecidos in vitro presentaron un tamaño de 2 cm con un promedio de 3 hojas y con un peso de 120 mg. Estas plantas se sembraron en un MS de inducción sin regulador de crecimiento y agregando cloruro de sodio NaCl a 0.1 - 4.5 g/L como inductor de estrés hídrico,
Sacarosa a 30 - 90 g/L. como inductor de estrés osmótico y ácido salicílico a 0.001 -2.0 mM como inductor de resistencia a patógenos, dichas sustancia inductoras son añadidas en combinación (dos o más inductores) o por separado (un sólo inductor) según el tratamiento (Cuadro 5).
Figure imgf000015_0001
Una vez agregados los inductores al medio MS modificado se esterilizó a 121° C, a una presión de 1.2 kg/cm2 durante 20 minutos. Los tratamientos que contenían ácido salicílico, primero se esterilizó el medio MS modificado y posteriormente se le añadió el ácido, el cual fue esterilizado por medio de filtración, bajo condiciones asépticas en campana de flujo laminar. Aquí se recomienda agregar el ácido al medio antes de que se enfríe para lograr la homogenización del inductor con el medio antes de que éste se solidifique.
Los brotes son sembrados en condiciones asépticas dentro de frascos de 460 ml que contienen 30 ml de MS de inducción, dichos frascos son cerrados y sellados con cinta transparente para evitar cualquier filtración de aire y consigo la contaminación de los mismos.
Los tratamientos son trasladados a un cuarta de crecimiento bajo condiciones controladas a 27+ 2° C y un fotoperíodo de 16 h/luz y 8h/oscuridad por un periodo de 7, 15, 30 y 45 días.
Una vez trascurridos los primeros 7 días de inducción se lleva a cabo la extracción enzimática con Ia finalidad de obtener un extracto crudo. Se toman tres muestras de 30 ug/ml por cada tratamiento para determinar por triplicado la actividad específica.
Durante la evaluación de los inductores se puede concluir que todos los inductores, aplicados presentaron diferencias estadísticas, es decir a todos los tratamientos que se les aplicó una sustancia inductora, mostraron un efecto positivo ai producir bromelína en mayor actividad enzimática que los tratamientos sin inductores (testigos), el cuadro 6 muestra las diferencias de medias de los tratamientos que resultaron ser estadísticamente significativos, es decir los que presentaron las máximas actividades especificas durante los 15, 30y 45 días.
Figure imgf000017_0001
El comportamiento de los inductores con respecto al tiempo es el siguiente.
A los 7 días hay la presencia, significativa de la. enzima, a. 15 días aumenta la producción de bromelina, a los 30 disminuye y a los 45-días aumenta.
La siguiente es una suposición: La planta al verse amenazada produce proteínas de defensa en este caso bromelina la cual da a suponer que se trata de una proteína de respuesta rápida por presentar actividad enzimática a los 7 días de inducción y presentar sα máximo en actividad específica a los 15 días, al cabo de 30 días las plantas se adaptan, a sus condiciones por lo que se produce bromelina en menores cantidades, a los 45 días de inducción las plantas se ven sometidas a un. estrés por la escasez de. lo. nutrientes del medio y comienzan a producir de nuevo la bromelina pero en cantidades menores a las del inicio.
EJEMPLO 2. PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE BROMELINA Se tomaron plántulas cultivadas in vitro en los diferentes medios de cultiva señalados en la presente invención, se enjuagaran con agua corriente, pata eliminar el medio MS de inducción. Se pesaron 330 g de plantas, se colocaron en un extractor para su molienda y se obtuvieron 200 mi de jugo (primera extracción) que fueron almacenados a una temperatura de 4 °C. Al bagazo obtenido de la extracción se le adicionaron 670 mi de amortiguador de extracción (fosfato de potasio monobásico y fosfato de potasio dibásico) a un pH de 6.1 y una concentración de 0.05M; dejándolo reposar durante 20 minutos para posteriormente colectar a la enzima pasándolo a través de un extractor y así obtener el segundo jugo. EL siguiente paso es mezclar y homogenizar durante 1 minuto a 2000 rpm el jugo de la primera extracción con el de la segunda extracción y centrifugar a 10000 rpm durante. 20 min. a 4° C, para, posteriormente recuperar el sobrenadante con un volumen aproximado de 800 mi el cual es congelado a -80° C y liofilizado (10% de sólidos) para su conservación.
El procedimiento de. extracción, se aplicó para todos los tratamientos, a los cuales se les determinó la cantidad de proteína presente (Bradford) expresándose en mg de proteína por mi de extracto. Se utilizó, una curva estándar para los ensayos de proteínas. El estándar utilizado fue albúmina de suero bovino de 0.20-1.0 mg/ml.
Se obtuvieron en base a los resultados, las siguientes actividades especificas comparándolas con la bromelina comercial de importación y bromelina a partir de plantas in vitro inducidas.
Figure imgf000018_0001
Al realizar distintas pruebas de inducción de producción de bromelina, se obtiene una mayor actividad especifica utilizando como inductor sacarosa en un rango de 30 - 90g/L; en este caso la adición, de. sacarosa al medio provoca un estrés osmótico en la planta la cual utiliza como respuesta natural para la producción de bromelina. Con el uso de los inductores en la propagación de plantas de pina in vitro se genera una mayor actividad enzimática desde, un 200 hasta, un 600% en comparación con la bromelina producida de forma natural en las plantas de pina cultivadas tradicionalmente.
La bromelina extraída a través, de. este procedimiento no requiere de métodos de. purificación para aumentar su actividad proteoíítica específica; la cual es ya mayor que la actividad proteolítica de la hromelina obtenida por los métodos de extracción actuales que incluyen una etapa de purificación.
El no someter a la bromelina a un proceso de purificación hace mucho más rentable su producción y minimiza las perdidas de la materia prima durante el proceso de purificación.
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Claims

REINVINDICACIONESHabiendo descrito de manera, suficiente y clara mi invención, considero como una novedad y por lo tanto, reclamo como de mi exclusiva propiedad lo contenido en las siguientes cláusulas:
1. Método para obtener bromelina en plantas de pina., según la cláusula 1 , caracterizada porque comprende los siguientes pasos:
A. Selección del materiaL vegetativo. Seleccionar plantas de. Ananas comosus en campo, las cuales deben tener 1 -2 años de edad, SO <;m de altura, un diámetro foliar de 90 cnv y que tenga, al menos 2 hijuelos originados de raíz, donde dicho hijuelo tiene una altura de 15 a 20 cm, un diámetro de 4-6 cm, un peso de 200- 50Og y 5 meses de. edad; B. Establecimiento del cultivo. Desprender el hijuelo -de manera manual, y ya en el laboratorio, eliminar sus hojas y pedúnculos de la roseta para descubrir el meristemo apical; llevar a cabo la desinfección del meristemos central sumergiéndolo en. una solución de Mpoclorito jde..sodio, .al 20 % durante 20. minutos, después llevarlos a una campana de flujo laminar para realizar lavados continuos con agua estéril.auna temperatura ambiente,,, para eliminar residuos del hipoclorito de sodio; seleccionar los meristemos apieales que no hayan sido dañados por el hipoclorito de sodio, para obtener explantes de 6x6x4 mm, para lo cual se hacen cortes perimetrales con el propósito -de eliminar el tejido externo oxidado por el efecto del hipoclorito de sodioς sembrar dichos explantes en un medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de establecimiento" adicionado con lmg/L de BAP (6- Bencilaminopurma), 30 g/L de sacarosa, 2 g/L de-gel-rite y un pH de 5.7 ± 0.01; incubar los explantes, en una camarade crecimiento,, a 27+ 2o C, un fotoperíodo de 16 h/luz y 8h/oscuridad durante 30 días, en -donde -se obtiene un brote de 1-2 cm de altura con. ai menos, cuatro hojas, pero dichos, brotes- aun no deben de tener brotes axilares;
C. Multiplicación de propágalos. Realizar un corte longitudinal central, a los brotes mencionados anteriormente de tal manera que se obtienen dos partes; sembrar las partes obtenidas del corte en un medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para, esta etapa "MS de propagación" adicionado con 4- 8 mg/L de BAP (6-Bencilaminopurina), 30 g/L 4e -sacarosa, 2 g/L de gel-rite y ajustado a un pude 5_7 ± 0.01; incubar los brotes. en una. cámara de crecimiento a 27± 2° C, a un fotoperíodo de 16 h/luz y 8h/oscuridad durante 30 días, periodo en el cual, cada brote tiene una producción da 4-12 brotes laterales, de 0.5-0.7 cm de altura; sembrar nuevamente (manteniendo -las condiciones de asepsia) los brotes según el número de brotes que se desee obtener,, por lo tanto los brotes obtenidos de esta etapa se les realizan las mismas condiciones de propagación por las que pasaron sus. progenitores;
D. Inducción de bromelina. Seleccionar plántulas obtenidas en la etapa anterior las cuales poseen un tamaño de 1-2 cm de altura,, un promedio de 3-5 hojas y un peso de 120-250 mg; sembrar las plántulas seleccionadas en un medio de cultivo Murashige SL Skoog. (1962) modificado, considerado, para, esta etapa "MS de inducción" adicionado con 30 g/L de sacarosa, 2 -gfL de gel-rite y sacarosa (30
- 90g/L) como inductor de .estrés osmótico; irκMharjΩS..hrolfis en una cámara de crecimiento a 27± 2° C, a un fotoperíodo de 16 h/íuz y 8h/oscuridad, durante 7- 45 días, que es cuando, los brotes presentan un tamaño de 2.-5 cm, una formación de 6-10 hojas y un sistema radicular completo; y E. Extracción de bromelina. Extraer la bromelina cuando se tenga una actividad enzimática de (5-6 U/mg de proteína; someter a las plántulas a una primera extracción, pasándolas a través de un filtro prensa para obtener un primer jugo que tiene de 60-80% de bromelina, el cual es almacenado a-(0-5° C); suspender el bagazo resultante^ que obviamente aun contiene bromelina,. en un amortiguador de extracción, que contiene fosfato de potasio (K2PO4) frío (0-5° C) para evitar la desnaturalización. de la enzima^ a una concentración de.0i)3 aθ.2 M, a pH de 5.3 a 7.2, dejándose reposar de 20 a 30 minutos, para después pasar la mezcla al filtro prensa y obtener un segundo jugo de esta, extracción; mezclar y homogenizar el primer jugo con el segundo jugo, a 200O-~5OOO rpm durante 1-2 minutos, y después centrifugar a 5000-10 000 rpm de 15 -20 minutos, a 0-4° C para eliminar el precipitado y recuperar el sobrenadante el cual es conservado de -80 a 0° C; liofilizar- el extracto, el cual debe contener- pot lo menos de un 10- 15% de sólidos.
2. Medio de cultivo para propagación de plantas de piña ,{Ananas comosus) in vitro, que comprende: de un 99% de. medio Murashige & Skoog.(1962). modificado, y un 1% de 4-8 mg/L de BAP.
3. Medio de cultivo para inducción de plántulas de piña (Ananas comosus) in vitro, por que se constituye de: un 99% de medio Murashige & Skoog (1962) modificado, y un 1% de, al menos, una sustancia inductora,. tales como sacarosa (30.-90 g/L); o cloruro de sodio (0.1 a 4.5 g/L); o ácido salicílico (0.001-2.0 mM).
4. Un extracto crudo de. plántulas, de. pina (Ananas comous), caracterizado porque es obtenido por el método descrito en la cláusula 1.
5. Un extracto crudo de de plántulas de pifia (Ananas comous), según la cláusula 4,. caracterizado por que contiene por en un gramo: compuestos fenólicos de 0.42- 3,7 mg, clorofila de 0.9-1.038 mg y bromelina de 0.053-0.106 μg.
6. Un extracto crudo de de plántulas de pifia {Ananas comous\ según la cláusula 5,_ caracterizado por que contiene una actividad enzimática de 4.5-6.5 U/mg de proteína, y una actividad de peroxidasas de 0.97-2.3-U/mg-de proteína.
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