BRPI0620240A2 - anticorpo monoclonal, uso do mesmo e composição farmaceutica - Google Patents

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL, USO DO MESMO E COMPOSIçãO FARMACeUTICA. A presente invenção fornece anticorpos de afinidade muito alta, ou fragmentos de ligação de antígeno desses, que neutralizam TGF<225>1, TGF-<225>2, e TGF<225>3 maduros humanos. Os anticorpos da invenção são úteis para tratar distúrbios proliferativos celulares em um mamífero.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO MONOCLONAL, USO DO MESMO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA".

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se ao tratamento de doenças, distúrbios e condições proliferativas celulares associadas com TGF-β. Em particular, a invenção fornece anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mes- mos que neutralizam TGF-β1,-β2, e -β3 maduros, humanos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A família de proteínas TGF-β consiste em três isoformas distin- tas (TGF-βΙ, -β2, e -β3) cujas vias ativam e regulam respostas de múltiplos genes que influenciam estados de doença tais como, por exemplo, condi- ções celulares proliferativas, inflamatórias e cardiovasculares. Ai expressão de isoforma de TGF-β no câncer é complexa e variável com diferentes com- binações de isoformas de TGF-β que têm papéis diferentes em cânceres particulares. Por exemplo, TGF-βΙ e -β3 desempenham um papel maior no câncer ovariano e sua progressão do que TGF^2; enquanto que a expres- são de TGF-βΙ e β2 é maior em tumores de condrossarcoma de grau eleva- do do que -β3. No câncer de mama humano, TGF-βΙ e β3 são altamente expressos, com a expressão de β3 se correlacionando com a sobrevida glo- bal - pacientes com metástases nodais e expressão positiva de TGF- β3 1 têm evolução prognostica ruim. Entretanto, no câncer de cólon, TGF-βΙ e β2 são mais altamente expressos do que β3 e estão presentes em níveis circu- lantes maiores do que em indivíduos livres de câncer. No câncer de glioma, TGF- β2 é essencial para a migração celular. Conseqüentemente, existe uma necessidade de modular a expressão de múltiplas isoformas de TGF-β em condições de proliferação celular tais como câncer.

US 5.571.714 descreve o uso de anticorpos anti-TGF no trata- mento de malignidades e câncer metastático e, em particular, descreve um anticorpo de murino designado 1D11.16 (ATCC No. HB9849-), que é dito se ligar a ambos TGF-βΙ e -β2. Esse documento estabelece que o anticorpo 1D11.16 se liga ao TGF^2 com um Ka de apenas 3,4 χ 108 L/mol (Kd = 1/Ka). O tratamento de distúrbios proliferativos celulares, tais como malignidades e cânceres, pode ser melhorado pelo uso de anticorpos que neutralizam TGF-β1, -β2, e -β3 maduros, humanos, com cinética de ligação e afinidade melhoradas. Estabilidade física e química substanciais, farmaco- cinética adequada e boa solubilidade também são desejáveis para um pro- duto farmacêutico. Conseqüentemente, permanece uma necessidade não atingida por anticorpos que têm características adequadas para o tratamento farmacêutico de distúrbios proliferativos celulares.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece composições de anticorpo mono- clonal que neutralizam TGF-β1, -β2 e -β3 maduros humanos com um Kd menor do que 4 pM para TGF-β1 maduro humano e uma Kd menor do que 8 pM para TGF-β2 maduro humano e uma kd menor do que 4 pM para TGF-β3 maduro humano. A invenção também fornece anticorpos que têm as seguin- tes combinações de seqüências de região variável de cadeia leve (LCRV) e de região variável de cadeia pesada (HCVR): SEQ ID NO: 27 e 51, 27 e 59, 27 e 60, 27 e 61, 27 e 62, 27 e 63, 27 e 64, 28 e 52, 29 e 51, 30 e 53, 31 e 54, 32 e 55, 33 e 56, 34 e 51, 34 e 57, 35 e 58, 36 e 51, 36 e 69, 36 e 75, 37 e 51, 38 e 51, 39 e 51, 40 e 51, 41 e 64, 41 e 67, 42 e 66, 43 e 68, 44 e 66, 45 e 51, 45 e 69, 46 e 70, 46 e 71, 47 e 71, 48 e 72, 49 e 73, 50 e 65, ou 50 e 74.

A invenção também inclui fragmentos de ligação de antígeno de tais anticorpos, assim como anticorpos e fragmentos que têm regiões de ar- cabouços e constantes humanas ou humanizadas. Os anticorpos e fragmen- tos da invenção são úteis para tratar doenças, distúrbios e condições prolife- rativas celulares.

Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção neu- tralizam TGF-β1 maduro humano, TGF-β2 maduro humano e TGF-β3 madu- ro humano, e têm um IC50 menor do que ou igual a cerca de 100 pM para TGF-βΙ maduro humano, uma IC50 menor do que ou igual a cerca de 400 pM para TGF-β2 maduro humano e um IC50 menor do que ou igual a cerca de 200 pM para TGF-β3 maduro humano em um ensaio de neutralização de Célula HT-2 in vitro.

Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção com- preendem uma região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma região vari- ável de cadeia leve (LCVR), em que a dita HCVR compreende um peptídeo em CDRH1 com a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 96 ou SEQ ID NO: 100, um peptídeo em CDRH2 com a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 102 e um peptídeo em CDRH3 com a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 98 e em que a dita LC- VR compreende um peptídeo em CDRL1 com a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, ou SEQ ID NO: 93, um peptídeo em CDRL2 com a seqüência mostrada na SEQ ID NO:89 ou SEQ ID NO: 94 e um peptídeo em CDRL3 com a seqüência mostrada na SEQ ID N0:90 ou SEQ ID NO:95.

Em uma modalidade, anticorpos da presente invenção ainda compreendem uma região de arcabouço humana.

Em outra modalidade, os anticorpos da presente invenção compreen- dem uma HCVR com a seqüência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 64, 68, 69, 70 e 74 e uma LCVR com a seqüência selecio- nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 41, 43, 45, 46, e 50.

Em outra modalidade, os anticorpos da presente invenção com- • preendem uma HCVR com a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 69 e uma LCVR a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 45.

Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção com- preendem uma cadeia pesada a seqüência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83 e 85 e uma cadeia leve com a seqüência selecionada a partir do grupo do grupo que consiste em SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, e 84.

Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção com- preendem uma cadeia pesada a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 81 e uma cadeia leve com a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 80.

A invenção fornece um método de tratar distúrbios proliferativos celulares em um mamífero, preferivelmente um primata e mais preferível- mente um ser humano, que compreende administrar a um mamífero que necessita de tal tratamento uma quantidade eficaz de um anticorpo da in- venção ou um fragemento do mesmo.

A invenção fornece um método de tratar uma doença ou condi- ção, na qual a fibrogênese e/ou angiogênese mediadas por TGF-β estão implicadas, em um mamífero, preferivelmente um primata e mais preferivel- mente um ser humano, incluindo síndrome mielodisplásica (MDS)/distúrbio mieloproliferativo (MPD), câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovari- ano, carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, mieloma múltiplo, câncer colorretal, outras malignidades hematológicas (leucemia de células pilosas, CML, AML, etc), que compreende administrar a um mamífero que necessita de tal tratamento uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção ou um fragmento do mesmo. Isso pode ainda compreender administrar ao mamífe- ro uma quantidade eficaz de um agente terapêutico diferente dos anticorpos anti-TGF-β, tal como um agente quimioterápico, agente antiangiogênico ou quimioterápico citotóxico.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método para tratar um paciente com câncer de mama metastático que superexpressa HER-2, que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um anti- corpo da invenção e de um anticorpo que bloqueia a sinalização através do receptor de HER-2, isto é trastuzumab.

A presente invenção também fornece uma composição farma- cêutica que compreende um anticorpo da invenção em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Essa invenção também fornece o uso de um anticorpo da inven- ção para a produção de um medicamento para tratamento de distúrbios pro- liferativos celulares em mamíferos. Além disso, essa invenção fornece uma composição farmacêutica adaptada para tratamento de distúrbios proliferati- vos celulares que compreende um anticorpo da invenção em combinação com um ou mais excipientes, veículos ou diluentes farmaceuticamente acei- táveis do mesmo. A invenção também fornece o uso de um anticorpo da in- venção para a produção de um medicamento para tratamento de uma doen- ça ou condição capaz de ser melhorada ou prevenida pela neutralização das atividades de TGF-β.

Essa invenção também fornece o uso de um anticorpo da inven- ção para a produção de um medicamento para tratamento de uma doença ou condição na qual a fibrogênese e/ou angiogênese mediadas por TGF-β estão implicadas, em um mamífero, preferível mente um primata e mais pre- ferivelmente um ser humano, incluindo MDS/MPD, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, mieloma múltiplo, câncer colorretal, outras malignidades hematológicas (leu- cernia de células pilosas, CML, AML, etc), que compreende administrar a um mamífero que necessita de tal tratamento uma quantidade eficaz de um anti- corpo da invenção ou um fragmento do mesmo. Isso pode ainda compreen- der administrar ao mamífero uma quantidade eficaz de um agente terapêuti- co diferente dos anticorpos anti-TGF-β, tal como um agente quimioterápico, agente antiangiogênico ou agente citotóxico ou uma citocina. Além disso, essa invenção fornece uma composição farmacêutica adaptada para o tra- tamento de condições nas quais a neutralização ou redução de atividades de TGF-β poderia ser benéfica em um mamífero, incluindo MDS/MPD, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, mieloma múltiplo, câncer colorretal, outras malignidades 1 hematológicas (leucemia de células pilosas, CML, AML1 etc), que compreen- de um anticorpo da invenção em combinação com um ou mais excipientes, veículos ou diluentes. farmaceuticamente aceitáveis. A invenção também fornece o uso de um anticorpo da invenção para a produção de um medica- mento para tratar uma doença ou condição capaz de ser melhorada ou pre- venida pela neutralização ou redução de atividades de TGF-β.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIGS. IAeB mostram as seqüências de aminoácidos das regi- ões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve dos anticorpos preferidos da invenção, respectivamente. Os domínios de CDR estão em negrito.

FIGURAS. 2A e B mostram o alinhamento da seqüência de ami- noácidos dos domínios de CDR dos anticorpos preferidos da presente in- venção. As variações estão em negrito e sublinhadas.

FIGURA 3 lista as seqüências de aminoácidos de cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo monoclonal da invenção, isto é mAb 12.7.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O termo um "anticorpo monoclonal" refere-se a uma composição com uma população de anticorpos homogênea, que compreende quatro ca- deias peptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interli- gadas por ligações de dissulfeto. A porção aminoterminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100-110 ou mais aminoácidos. Essa região variável de cada cadeia inclui três regiões de determinação de com- plementaridade (CDRs) que reconhecem e se ligam a um antígeno em parti- cular. Um "anticorpo monoclonal" pode ser um anticorpo intacto (que com- preende uma cadeia leve completa e uma cadeia pesada completa), um an- ticorpo substancialmente intacto, ou uma porção ou fragmento de um anti- corpo que compreende uma porção de ligação de antígeno, por exemplo, um fragmento Fab, ou fragmento F(ab')2 de um anticorpo. Além disso, um "anti- corpo monoclonal" pode ser um fragmento variável de cadeia única (scFv), que consiste na região variável de cadeia pesada (VH) e na região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo unidas por um Iigante peptídico flexível.

Uma "população de anticorpo homogênea" refere-se a uma po- pulação de anticorpo homogênea ou substancialmente homogênea (isto é, pelo menos cerca de 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% ou 98% ou o mais preferi- velmente pelo menos 99% dos anticorpos na população poderiam competir em um ensaio de ELISA pelo mesmo antígeno ou epitopo). Anticorpos po- dem ou não ser glicosilados e ainda estão dentro dos limites da invenção. Anticorpos monoclonais podem ser homogêneos se eles tiverem seqüência de aminoácido idêntica embora eles possam diferir em uma modificação pós-traducional, por exemplo padrão de glicosilação.

O termo "quantidade eficaz" é tido como significando uma dose de um composto necessária para se obter o efeito farmacológico desejado.

O termo "epitopo" refere-se àquela porção de uma molécula ca- paz de ser reconhecida e ligada por um anticorpo em uma ou mais das regi- ões de ligação ao antígeno do anticorpo. Epitopos consistem freqüentemen- te em um agrupamento de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm características estru- turais tridimensionais específicas assim como características de carga espe- cíficas.

O termo "Kd" refere-se à constante de dissociação de uma inte- ração anticorpo-antígeno em particular. Ela é calculada pela fórmula Wkon = Kd. O termo "kon" refere-se à associação ou constante de ligação (on rate), ou taxa de reação específica, da reação ativadora, ou formadora de comple- xo, medida em unidades: M-1sec-1. O termo "IW refere-se à dissociação ou constante de desligamento (off rate), ou taxa de reação específica para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno, medida em unidades: 1/segundo. A afinidade de um anticorpo monoclonal da presente invenção está freqüentemente correlacionada com uma kott menor do que com uma kon maior, entretanto, não estando limitado pela teoria, modalida- des de ambas e I^on melhoradas são abrangidas. Em uma modalidade mais preferida, anticorpos monoclonais da presente invenção são anticorpos de alta potência ou fragmentos dos mesmos, geralmente exibindo valores de kott baixos.

• O termo "neutralizar" como usado aqui com relação a uma ativi- dade de um anticorpo monoclonal da invenção significa a habilidade de an- tagonizar, impedir, evitar, reprimir, retardar, interromper, eliminar, parar, re- duzir ou reverter substancialmente, por exemplo, a progressão ou severida- de daquilo que está sendo inibido incluindo, mas não-limitado, a atividade ou propriedade biológica, uma doença ou condição. A inibição ou neutralização é preferivelmente pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou maior.

Com relação às capacidades de ligação e neutralização de anti- corpos da invenção, o TGF-β referido aqui é a forma madura, humana, bio- logicamente ativa de TGF-βΙ, TGF-p2, e TGF-p3 (SEQ ID NO: 1, 2, e 3). Veja também, por exemplo, No. de acesso NCBI: P01137, NP_003229, e NP_003230 que descrevem as seqüências de DNA e aminoácido de, res- pectivamente, TGF-βΙ, -β2, e -β3 humanos (incluindo seus domínios precur- sores e porções maduras). Um TGF-βΙ, -β2, ou -β3 homodimérico ligado por dissulfeto maduro contém dois polipeptídeos de 112 aminoácidos e tem uma massa molecular prevista de aproximadamente 25 kDa. Anticorpos da in- venção se ligam e neutralizam tais isoformas de TGF-β maduras, mas não mostram ligação significativa de isoformas de TGF-βΙ, -β2, e -β3 latentes sob condições similares.

Melhorias na afinidade e na cinética de ligação solucionam pro- blemas de anticorpos, por exemplo, por auxiliar a aumentar os perfis farma- cocinéticos e de segurança; pela redução da dose, toxicidade, e custo da terapia; e pela melhora da eficácia biológica. A constante de dissociação (Kd) de um anticorpo pode ser encontrada usando métodos na técnica, por e- xemplo, Kinexa® (veja, por exemplo, Darling, et ai, 2004 ASSAY and Drug Development Technologies 2:647-57) ou BIAçore® AB (Upsala, Suécia), ou adaptando Karlsson et al., 1991 J. Immunol. Methods 145, 299-340. O termo "kon" refere-se aqui à associação ou constante de ligação "on-rate", ou taxa de reação específica, da reação ativadora, ou formadora de complexo de anticorpo: antígeno, M"1sec"1. O termo "W refere-se aqui à dissociação ou constante de desligamento "off rate", ou taxa de reação específica, para a dissociação de um anticorpo de um complexo anticorpo:antígeno (sec"1). O termo "Kd" refere-se aqui à constante de dissociação de um complexo de anticorpo:antígeno em particular calculado como Kd = IWkon- Ka é o inverso de Kd.

A Kd de um anticorpo da invenção para TGF-βΙ humano maduro está na faixa de cerca de 0,0001 pM a cerca de 5,0 pM. Mais preferivelmen- te, está na faixa de cerca de 0,001 pM a cerca de 3,0 pM. O mais preferivel- mente, está na faixa de cerca de 0,01 pM a cerca de 0,5 pM. A Kd de um anticorpo da invenção para TGF^2 maduro humano está na faixa de cerca de 0,01 pM a cerca de 5,0 pM. Mais preferivelmente, na faixa de cerca de 0,05 pM a cerca de 2,0 pM, e o mais preferivelmente, está na faixa de cerca de 0,1 pM a cerca de 1,5 pM. A Kd de um anticorpo da invenção para TGF- β3 maduro humano está na faixa de cerca de 0,005 pM a cerca de 3 pM. Mais preferivelmente, ela está na faixa de cerca de 0,05 pM a cerca de 2,8 pM. O mais preferivelmente, ela está na faixa de cerca de 0,2 pM a cerca de 2 pM. Preferivelmente os anticorpos da invenção são caracterizados por uma Kd de 4,0 x 10"12 M ou menos para TGF-β1 maduro humano, uma Kd de 8,0 x 10"12 M ou menos para TGF-β2 maduro humano, e uma Kd de 4,0 x 10" 12M ou menos para TGF-P3 maduro humano.

A Kd de um anticorpo da invenção para TGF-β1 é pelo menos 2 vezes maior do que a Kd de 1D11.16 para TGF-β1, mais preferivelmente é pelo menos 25 vezes maior, e o mais preferivelmente é pelo menos 50 ve- zes maior. Para ser claro, afinidade maior significaria um valor de Kd menor. A Kd de um anticorpo da invenção para TGF2 é pelo menos 1,5 vezes maior do que a Kd de 1D11.16 para TGF-β2, mais preferivelmente é pelo menos 10 vezes maior, e o mais preferivelmente é pelo menos 20 vezes maior. A Kd de um anticorpo da invenção para TGF-β3 é pelo menos 4 vezes maior do que a Kd de 1D11.16 para TGF-β3, mais preferivelmente é pelo menos 6 vezes maior, e o mais preferivelmente é pelo menos 10 vezes mai- or.

A Kd de um Fab da invenção para TGF-β1 maduro humano está na faixa de cerca de 0,009 pM a cerca de 75,0 pM, está mais preferivelmen- te na faixa de cerca de 240 a cerca de 1, mas preferivelmente na faixa de cerca de 50 a cerca de 2, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 0,018 pM a cerca de 50 pM, e está o mais preferivelmente na faixa de cerca de 0,02 pM a cerca de 25 pM. A Kd de um Fab da invenção para TGF-β2 maduro humano está na faixa de cerca de 0,0045 pM a cerca de 60 pM, mais preferivelmente está na faixa de cerca de 0,002 pM a cerca de 45 pM, e o mais preferivelmente está na faixa de cerca de 0,02 pM a cerca de 35 pM. A Kd de um Fab da invenção para TGF-βΙ é pelo menos 30 vezes maior do que a Kd de 1D11.16 para TGF-βΙ, mais preferivelmente é pelo menos 300 vezes maior, e o mais preferivelmente, é pelo menos 1500 vezes maior. A Kd de um Fab da invenção para TGF-β2 é pelo menos 10 vezes maior do que a Kd de 1D11.16 para TGFβ2, mais preferivelmente é pelo menos 100 vezes maior, o mais preferivelmente é pelo menos 500 vezes maior.

Anticorpos da invenção exibem Koff para TGF-βΙ maduro huma- no preferivelmente na faixa de cerca de 110 a cerca de 1 (todos os valores para Roff são χ 10"6 s'1), mais preferivelmente na faixa de cerca de 50 a cerca de 6, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 15 a cerca de 4; pa- ra TGF-P2 maduro humano preferivelmente na faixa de cerca de 20 a cerca de 4; e para TGF-p3 maduro humano na faixa de cerca de 90 a cerca de 1, mais preferivelmente na faixa de cerca de 50 a cerca de 4, e ainda mais pre- ferivelmente na faixa de cerca de 35 a cerca de 6. Anticorpos da invenção exibem aumento de koff sobre 1D11.16 para TGF-βΙ, -β2, e -β3 na faixa de cerca de 2 a cerca de 50 vezes, mais preferivelmente na faixa de cerca de 2,5 a cerca de 25 vezes, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 3 a cerca de 15 vezes.

Em outra modalidade, um anticorpo da invenção tem uma kon maior do que 5 para TGF-βΙ maduro humano, maior do que 2,8 para TGF- β2 maduro humano, e maior do que 1,56 para TGF^3 maduro humano (to- dos dos valores para kon são χ 107 M1 s"1). A kon para TGF-βΙ maduro hu- mano está preferivelmente na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 60, mais pre- ferivelmente na faixa de cerca de 2 a cerca de 45, e ainda mais preferivel- mente na faixa de cerca de 3 a cerca de 30; para TGF^2 está preferivel- mente na faixa de cerca de 1 a cerca de 40, mais preferivelmente na faixa de cerca de 1 a cerca de 25, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 1 a cerca de 15; e para TGF^3 maduro humano está preferivelmente na faixa de cerca de 1,2 a cerca de 20, mais preferivelmente na faixa de cerca de 1,2 a cerca de 10, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 1,2 a cerca de 5. Anticorpos da invenção exibem um aumento médio de kon so- bre 1D11.16 para TGF-βΙ, -β2, e -β3 preferivelmente na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 40 vezes, mais preferivelmente na faixa de cerca de 2 a cerca de 15 vezes, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 2 a cerca de 10 vezes. Em uma modalidade preferida, um anticorpo da invenção se liga à TGF-βΙ mais que a TGF^2 e β3.

Um anticorpo é dito "neutralizar" seu antígeno se a ligação do anticorpo ao antígeno resultar em inibição ou redução, completa ou parcial, de uma função biológica do antígeno. Neutralização da atividade biológica de uma isoforma de TGF-β é avaliada por medir a inibição ou redução, com- pleta ou parcial, de um ou mais indicadores in vitro ou in vivo de atividade de TGF-β, tal como, ligação ao receptor, um efeito inibidor sobre o crescimento celular; quimiotaxia, apoptose, fosforilação de proteína intracelular, ou trans- dução de sinal. O mais preferivelmente, a habilidade de neutralizar a ativida- de de TGF-β é avaliada, como descrito aqui, por um ensaio de proliferação de célula HT-2 ou por medir a inibição de fosforilação de Smad2.

Anticorpos da invenção neutralizam TGF-β1 maduro humano, TGF-β2 maduro humano, e TGF-β3 maduro humano, e tem uma IC50 de menos do que ou igual a cerca de 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM, 17.5 pM, 10 pM, 4 pM, ou 3pM para TGF-β1 maduro humano, uma IC50 de menos do que ou igual a cerca de 400 pM, 345 pM, 200 pM, 100 pM, 77,5 pM, 50 pM, 40 pM, ou 23 pM para TGF-β2 maduro humano, e um do que IC50 de menos do que ou igual a cerca de 200 pM, 115 pM, 105 pM, 75 pM, 50 pM, 45 pM, ou 35 pM para TGF-β3 maduro humano em um ensaio de neutralização de célula HT-2 in vitro.

Atividade neutralizante melhorada aumenta os perfis de farma- cocinética e segurança; reduz a dosagem, toxicidade, e custo da terapia; e 1 melhora a eficácia biológica. Em uma modalidade preferida, a IC50 de um anticorpo da invenção no ensaio de proliferação/neutralização de célula HT- 2 como descrito aqui é de menos do que cerca de 20 pM para TGF-β1, me- nos do que cerca de 325 pM para TGF-β2, e de menos do que cerca de 125 pM para TGF-β3. Contra TGF-β1, um anticorpo da invenção preferivelmente tem uma IC50 na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 50 pM, mais preferivelmen- te na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 30 pM, e o mais preferivelmente na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 20 pM. Contra TGF-β2, um anticorpo da invenção tem preferivelmente uma IC50 na faixa de cerca de 1 a cerca de 400 pM, mais preferivelmente na faixa de cerca de 10 a cerca de 350 pM, e o mais preferivelmente na faixa de cerca de 15 a cerca de 325 pM. Contra TGF-β3, um anticorpo da invenção tem preferivelmente uma IC50 na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 200 pM, mais preferivelmente na faixa de cerca de 1 a cerca de 150 pM, e o mais preferivelmente na faixa de cerca de 10 a cerca de 125 pM.

Em outra modalidade, anticorpos da invenção exibem em média um aumento de IC5o sobre 1D11.16 em um ensaio de proliferação de célula HT-2 para TGF-βΙ na faixa de cerca de 100 a cerca de 600 vezes, mais pre- ferivelmente na faixa de cerca de 200 a cerca de 500 vezes, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 300 a cerca de 400 vezes; para TGF-P2 na faixa de cerca de 10 a cerca de 400 vezes, mais preferivelmente na faixa de cerca de 25 á cerca de 300 vezes, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 50 a cerca de 200; e para TGF-P3 na faixa de cerca de 2 a cer- ca de 200 vezes, mais preferivelmente na faixa de cerca de 4 a cerca de 50 vezes, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 6 a cerca de 25.

A concentração de um anticorpo necessária para neutralizar uma atividade de TGF-β é dependente de vários parâmetros, tal como, por exemplo, concentração de citocina, tipo celular, condições de crescimento e, tipo de atividade estudada. O caráter de neutralização de um anticorpo da invenção é avaliado por medir o grau de inibição da fosforilação da proteína Smad2 em um modelo de xenoenxerto de tumor humano U87MG, como descrito aqui. Em outra modalidade preferida, um anticorpo da invenção tem uma TED50 (dose terapêutica eficaz) em tal ensaio na faixa de cerca de 100 a cerca de 200 mg/kg, mais preferivelmente na faixa de cerca de 50 a cerca de 80 mg/kg; e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 5 a cerca de 25 mg/kg.

Certos anticorpos e fragmentos da invenção têm CDRs específi- cas: vhcdr1 xix2wmn [seq id no: 10, onde ΧΊ é t ou S; e X2 é e ou y]; vhcdr2 Qifpx1X2GstNYX3EMX4EG [seq id no: 11, onde xi é a, ou f; x2 é s1 t, ou l; X3 é n, g, s, D, ou a; x4 é f, ou y]; vhcdr3 gxignyaldamdy [seq id no: 12, onde xi é D, i, μ, y, l, v, q, ou f]; VLCDR1 rasesvdxix2gnsfmh [seq id no: 13, onde xi é s, y, f, ou l; x2 é y ou w]; vlcdr2 x1asnles [seq id no: 14, onde x1 é l, ou y]; e VLCDR3 x1qx2x3edplt [seq id no: 15, onde x1 é q, t, ou c; x2 é n, ou H;X3 é N, I, Μ, D, Τ, ou A].

Ainda abrangidos são anticorpos criados com CDRs das tais fórmulas após manipulação das CDRs (na orientação apropriada) em se- qüências de arcabouços de anticorpo humano ou humanizado para produzir composições da invenção que neutralizam TGF-βΙ, -β2, e -β3 maduros, hu- manos. Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para incor- porar CDRs específicas dentro de seqüências de arcabouços. Como descri- to, seqüências de arcabouços humanas ou humanizadas variáveis podem ser derivadas de qualquer domínio variável germinativo ou rearranjado ou, por exemplo, domínio variável sintético baseado em seqüências consenso de domínios variáveis humanos conhecidos. Seqüências de arcabouços de domínio variável preferidas são aquelas que não afetam significativamente as propriedades biológicas de uma modalidade de anticorpo anti-TGF-βΙ, - β2, e -β3 - isto é, a habilidade de se ligar com alta afinidade e neutralizar TGF-βΙ, -β2, e -β3 maduros humanos. Preferivelmente, tais arcabouços não fazem surgir adicionalmente reações imunogênicas significativas quando administrados a um ser humano. Seqüências de arcabouço podem ser se- qüências de anticorpos humanos de ocorrência natural ou seqüências con- senso de vários anticorpos humanos.

Exemplos não-limitantes de seqüências de arcabouço para a re- gião variável de cadeia pesada de modalidades de anticorpo da invenção incluem o segmento VH, DP-5 (Tomlinson, et ai 1992 J. Moi Bioi 227:776- 98) e o segmento J, JH4, JH1 ou JH5 (Ravetch, et ai 1981 Cell 27:583-91). O segmento Vk, L1 (Cox, et al. 1994 Eur. J. Immunoi 24:827-36) e o seg- mento J, Jk4 (Hieter, et al. 1982 J. Biol. Chem. 10:1516-22) são exemplos não-limitantes de seqüências de arcabouço para a região variável de cadeia leve.

Em uma modalidade preferida, o arcabouço FR1 de HCVR compreende [SEQ ID NO: 16]; e o arcabouço FR2 de HCVR compreende [SEQ ID NO: 17]; o arcabouço FR3 de HCVR compreende [SEQ ID NO: 18]; e o arcabouço FR4 de HCVR compreende [SEQ ID NO: 19]. Em outra moda- lidade preferida, o arcabouço FR1 de LCVR compreende [SEQ ID NO: 20]; o arcabouço FR2 de LCVR compreende [SEQ ID NO: 21], o arcabouço FR3 de LCVR compreende [SEQ ID NO: 22]; e o arcabouço FR4 de LCVR com- preende [SEQ ID NO: 23]. Em outra modalidade preferida, um arcabouço de HCVR compreende [SEQ ID NO: 86] em que X1 é S, Y, F, ou L; X2 é Y ou W;

X3 é A, ou F; X4 é S, T, ou L; X5 é N, G, S, D, ou A; X6 é F, ou Y; e X7 é D, I, Μ, Y, L, V, Q1 ou F. Em outra modalidade preferida, um arcabouço de LCVR compreende [SEQ ID NO: 87] em que Xi é T ou S; X2 é E, ou Y; X3 é L1 ou Y; X4 é Q1 T, ou C; X5 é N, ou H; e X6 é Ν, I, M, D, T, ou A.

Em outra modalidade preferida, regiões de arcabouço e cons- tantes podem conter alterações, deleções, adições, substituições, ou qual- quer combinação dos mesmos quando comparadas com seqüências huma- nas. Regiões de arcabouço e constantes nas quais 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 são substituídos, deletados ou adicionados em qualquer combinação são preferidas. Em outra modalidade, o arcabouço tem 85-99% de identidade de seqüência a um arcabouço descrito aqui.

Em uma modalidade, uma região constante de cadeia pesada preferida para uso com uma composição de ligação de anticorpo da inven- ção é uma região constante de IgG. Em uma modalidade mais preferida, a região constante de IgG é uma região constante de IgGI ou uma região constante de lgG4 (ainda mais preferivelmente são regiões constantes de [SEQ ID NO: 24]; ou [SEQ ID NO: 25]). Uma seqüência de região constante de cadeia leve preferida da invenção é [SEQ ID NO: 26]. Em outra modali- dade preferida, anticorpo, composições de ligação contêm região constante de cadeia pesada de IgGI ou a região constante de cadeia pesada de lgG4 e a região constante de cadeia leve kappa.

Também abrangidas são seqüências de polinucleotídeo que co- dificam anticorpos da invenção. Quando se manipula anticorpos usando CDRs da invenção, a identificação de resíduos dentro de arcabouços de an- ticorpos que provavelmente influenciam seqüências dòadoras e aceptoras de ligação de antígeno pode ser determinada por alinhar a moldes de se- qüência derivados de repertórios de anticorpo. "Resíduos invariantes" (Kabat et al., 1991) e "resíduos chave" (Chothia et ai, 1989) podem ser identifica- dos, e atribuições de classes canônicas dos Ioops de ligação de antígeno doadores L1-L3, H1 e H2, respectivamente, podem ser determinadas por rastreamento de uma seqüência proposta contra moldes de seqüência (veja, por exemplo, Martin & Thornton, 1996 Mol. Biol. 263:800-15). Resíduos na interface VH/VL (Chothia et al., 1985) e resíduos conhecidos por serem es- truturalmente conservados nos sítios centrais (Chothia et al., 1998) são comparados com resíduos doadores e aceptores correspondentes. Resíduos de arcabouço doador e aceptor não-pareados nesses sítios são analisados com base em informação de outros anticorpos de estrutura conhecida (Ber- man, et al., 2000 Nucl. Acids Res. 28(1): 235-42). A seleção de arcabouços humanos como moldes para humanização de regiões V não-humanas pode definir decisões subseqüentes relacionadas a quais resíduos humanizar. A escolha de moldes homólogos de anticorpos com estrutura cristalina conhe- cida, a partir de seqüências germinativas, não-germinativas ou consenso derivadas de bases de dados disponíveis pode ser empregada (veja, por exemplo, Routledge et ai (Routledge, et ai, 1993 em Protein Engineering of Antibodv Molecules for Prophvlactic and Therapeutic Applications in Man (Clark, M., ed) pp. 14-44, Academic Titles, Nottingham, UK; e B. Lo, 2004 Antibodv Engineering: Methods and Protocols. Humana Press)). Outra forma de manipular anticorpos é escolher a seqüência germinativa humana mais próxima como o arcabouço para receber CDRs doadoras (Tomlinson et al., 1992) usando uma estratégia "best-fit" para buscar seqüências germinativas em bases de dados. O método de arcabouço de linhagem germinativa é útil porque seqüências germinativas humanas não apresentam hipermutações somáticas, que são potencialmente imunogênicas. Moléculas de ácido nu- cléico que codificam anticorpos da invenção variantes de uma combinação de regiões de arcabouço e CDRs da invenção inseridas dentro de arcabou- ços humanos modificados podem ser manipuladas usando uma estratégia de linhagem germinativa humana consenso onde um subgrupo humano é usado como o arcabouço (veja, por exemplo, Presta et al., 1993 J. Immunol 151:2623-32; Couto et al., 1994 Hybridoma, 13:215-9; Couto et al., 1995 Câncer Res. (Supl.), 55, 5973s-7s; Werther et al., 1996 J. Immunol., 157:4986-95; O'Connor et ai, 1998 Protein Engng 11:321-8).

Fragmentos de anticorpo (como descrito), ou parte de uma se- qüência ou SEQ ID NO aqui contida, também são abrangidos. Tais fragmen- tos de proteína e/ou polipeptídeo podem ser "auto-suficientes", ou compre- ender parte de um polipeptídeo ou proteína maior, do qual os fragmentos formam uma porção ou região, por exemplo, uma região contínua única de uma SEQ ID NO: aqui contida tal como, por exemplo, conectados em uma proteína de fusão. Polinucleotídeos que codificam tais fragmentos também são abrangidos.

Anticorpos da invenção são manipulados por qualquer método conhecido na técnica, tal como, por exemplo, síntese química; ou engenha- ria recombinante, genética ou molecular e não são restritos por método de criação. Tipicamente, ácidos nucléicos que codificam anticorpos da invenção incluem uma seqüência de polinucleotídeo de controle de expressão operati- vãmente ligada às seqüências codificantes, incluindo regiões promotoras associadas naturalmente ou heterólogas. Prefèrivelmente seqüências de controle de expressão são sistemas promotores eucarióticos em vetores que transformam ou transfectam células hospedeiras eucarióticas, mas seqüên- cias de controle para hospedeiros procarióticos também podem ser usadas. Uma vez que o vetor é incorporado em uma célula hospedeira apropriada, ela é propagada sob condições adequadas para expressar seqüências, e, conforme desejado, para a coleta e purificação das cadeias leves, cadeias pesadas, dímeros de cadeia leve/cadeia pesada, ou anticorpos intactos, fragmentos de ligação ou outras formas de imunoglobulina. Seqüências de DNA de região constante são isoladas por métodos conhecidos na técnica a partir de uma variedade de células humanas, mas preferivelmente a partir de células B imortalizadas. Células de fontes adequadas para as seqüências de polinucleotídeo e células hospedeiras para expressão e secreção de imuno- globulina são obtidas a partir de fontes conhecidas na técnica.

A invenção abrange seqüências de polipeptídeos funcionais com similaridade ou identidade de seqüência substancial a uma seqüência conti- da aqui (por exemplo, pelo menos: 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma seqüência da invenção (ou fragmento)) usando métodos conhecidos na técnica tal como, por exem- plo, otimização de pareamentos de resíduos. Tais seqüências incluem qual- quer uma corri uma característica funcional de um anticorpo da invenção (por exemplo, ligação e neutralização de TGF-βΙ, -β2, e -β3 maduros huma- nos em um ensaio descrito aqui). Tais modalidades funcionalmente relacio- nadas incluem adições, substituições e/ou deleções de resíduos de aminoá- cidos de uma seqüência da invenção em uma CDR ou uma região constan- te. Substituições e/ou adições de aminoácidos podem ser baseadas em simi- laridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, e/ou natureza antipática dos resíduos envolvidos. Ainda, aminoácidos não-clássicos ou análogos químicos de aminoácidos podem ser substituídos ou adicionados na seqüência de polipeptídeo. Todas as tais variantes estão no escopo da- queles versados na técnica de biologia molecular dada nos ensinamentos aqui especificando fórmulas únicas ou seqüências de polipeptídeo e as limi- tações funcionais da invenção.

Modalidades preferidas da composição da invenção têm uma ou mais das seguintes características: Kd menor do que 2 x 10-13 M para TGF- β1, menor do que 5 x10-13 M para TGFβ2, menor do que 8 x 10-13 M para TGFβ3; koft menor do que 8 x 10-6 s-1 para TGF-β1, menor do que 11 x 10-6 s-1 para TGFβ2, menor do que 13 x 10-6 s-1 para TGFβ3; Κon maior do que 5 x 107 M-1 S-1 para TGF-βΙ, maior do que 2 x 107 M-1 s-1 para TGFβ2, e maior do que 1,5 x 107 M-1 s-1 para TGFβ3; aumento de Kd de uma composição de Fab para TGF-β1 com relação a Fab de 1D11.16 para TGF-βΙ de pelo me- nos 6000 vezes; aumento de Kd de uma composição de anticorpo com rela- ção a 1D11.16 maior do que cerca de 34 vezes para TGF-βΙ, maior que do que cerca de 13 vezes para TGFβ2, e maior do que cerca de 9 vezes para TGFβ3; IC50 maior do que cerca de 300 vezes maior do que aquele de um valor de IC50 de um 1D11.16 em um ensaio de HT-2; um valor de ED50 na faixa de cerca de 11 a cerca de 17 mg/kg em um modelo de xenoenxerto de tumor humano U87MG para a inibição de fosforilação de Smad2 de (como descrito aqui); menos do que 5,0% de agregação de uma composição da Tabela 2

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Exemplo 5: Especificidade

BIAcore é usado para avaliar a especificidade de anticorpos por entidades, tal como, por exemplo, a forma latente de TGF-βΙ, -β2 ou -β3. Todas as medidas são realizadas em temperatura ambiente. As amostras são dissolvidas em tampão HBS-EP (cloreto de sódio 150 mM, EDTA 3 mM, 0,01% (p/v) tensoativo P-20, e HEPES 10 mM, pH 7.4). Proteína A recombi- nante é imobilizada em todas as quatro células de fluxo de um chip sensor CM4 em um nível de 400-450 unidades de resposta (RUs) usando um kit de acoplamento de amina. A ligação é avaliada usando múltiplos ciclos analíti- co. Cada ciclo é realizado em uma taxa de fluxo de 100 uL/minuto consistin- (veja, por exemplo, Sakamaki, et ai, 1999 Blood 94(6):1961-70)), leucemia de células pilosas, e outras malignidades hematológicas, tais como, por e- xemplo, leucemia mielóide crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielóide aguda (AML), etc.)); câncer de pulmão de células não-pequenas; câncer de mama; câncer de próstata; (incluindo refratário a hormônio); câncer de ovário; câncer hepato- celular; câncer pancreático; mieloma múltiplo; câncer colorretal; um neo- plasma do cólon, abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pân- creas, peritônio, sistema endócrino (por exemplo, uma glândula adrenal, uma glândula paratireóide, da pituitária, dos testículos, do ovário, do timo, ou da tireóide), olhos, cabeça, pescoço, sistema nervoso, (central ou periférico), do sistema linfático, pelve, pele, baço, tórax, e sistema urogenital. Adicio- nalmente, um anticorpo da invenção é útil para doença do músculo esquelé- tico — tal como, por exemplo, tratamento de enfraquecimento muscular, (por exemplo, caquexia); promoção de crescimento muscular (por exemplo, após doença, trauma, reconstrução ou substituição).

Um agente "quimioterápico" é um composto químico útil no tra- tamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tal como ciclofosfamida e fluorouracila; antimetabolitos tal como fluorouracila e gencitabina; antibióticos tais como adriamicina; e agentes an- timitóticos, tal como vincristina e vinorelbina.

Um agente "antiangiogênico" refere-se a um composto que blo- queia, ou interfere com, em algum grau, o desenvolvimento de vasos san- güíneos. O agente antiangiogênico pode ser, por exemplo, uma pequena molécula ou anticorpo que se liga ao fator de crescimento ou receptor de fator do crescimento envolvido em promover angiogênese.

O termo "quimioterapia citotóxica" como usado aqui refere-se a uma substância que inibe ou evita a função de células e/ou causa destruição de células, incluindo isótopos radioativos (por exemplo, At.211, I1311 I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), e toxinas tais como toxinas de pequenas moléculas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes desses.

Um polinucleotídeo é "operativamente ligado" quando ele é co- locado em relação funcional com outro polinucleotídeo. Por exemplo, um promotor ou intensificador é operativamente ligado a uma seqüência codifi- cante se ele afeta a transcrição da seqüência. Um peptídeo é "operativa- mente ligado" a outro peptídeo quando os polinucleotídeos que os codificam são operativamente ligados, preferivelmente eles estão na mesma fase de leitura.

O termo "vetor" inclui uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual ele foi ligado, incluindo, mas não- Iimitado a, plasmídeos e vetores virais. Certos vetores são capazes de repli- cação autônoma em uma célula hospedeira dentro da qual eles estão inseri- dos enquanto que outros vetores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira por introdução na célula hospedeira, e assim, são replica- dos junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são ca- pazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operativa- mente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores de expressão") e vetores exem- plares são bem-conhecidos na técnica. Como usado aqui, as expressões "célula", "célula hospedeira",

"linhagem celular" e "cultura de células" são usadas intercambiavelmente e incluem uma célula individual ou cultura celular que é uma receptora de qualquer polinucleotídeo isolado da invenção ou qualquer(isquer) vetor(es) recombinante(s) que compreende(m) uma seqüência que codifica uma HC- VR, LCVR ou anticorpo monoclonal da invenção. Células hospedeiras inclu- em progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não neces- sariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou no complemento de DNA total) à célula parental original devido à mutação e/ou alteração na- tural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfor- madas, transduzidas ou infectadas in vivo ou in vitro com um ou mais veto- res recombinantes ou um polinucleotídeo que expressa um anticorpo mono- clonal da invenção ou uma cadeia leve ou cadeia pesada do mesmo. Uma célula hospedeira que compreende um vetor recombinante da invenção (tan- to incorporado estavelmente no cromossoma hospedeiro ou não) também pode ser referida como "célula hospedeira recombinante". Células hospedei- ras preferidas para uso na invenção são células CHO (por exemplo, ATCC CRL-9096), células NSO1 células SP2/0 e células COS (ATCC por exemplo., CRL-1650, CRL-1651), HeLa (ATCC CCL-2). Células hospedeiras adicionais para uso na invenção incluem células de planta, células de levedura, outras células de mamífero e células procarióticas.

Expressão e purificação de anticorpo

Para expressar um anticorpo da invenção, um DNA que codifica uma cadeia leve e/ou pesada parcial ou de extensão completa é inserido em um vetor de expressão tal que o gene seja operativamente ligado a seqüên- cias de controle transcricional e traducional. O vetor de expressão e seqüên- cias de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados, ou mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de ex- pressão por métodos padrão. Adicionalmente, o vetor de expressão recom- binante pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo monoclonal anti-TGF-β a partir de uma célula hospedeira. O gene da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo monoclonal anti-TGF-β pode ser cJonado no vetor tal que o peptídeo de sinal seja opera- tivamente ligado in-frame à terminação amino do gene da cadeia do anticor- po. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo.

Além do(s) gene(s) de cadeia pesada e/ou leve do anticorpo, um vetor de expressão recombinante da invenção carrega seqüências regulató- rias que controlam a expressão do(s) gene(s) da cadeia do anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "seqüência regulatória" pretende incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação), conforme necessário, que controlam a transcrição ou tradução do(s) gene(s) da cadeia do anticorpo. O desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências regulatórias pode depender de tais fatores, como a escolha da célula hospedeira a ser trans- formada, o nível de expressão desejado da proteína. Seqüências regulató- rias preferidas para expressão em célula de hospedeiro de mamífero inclu- em elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou intensificadores deriva- dos de citomegalovírus (CMV), Simian Vírus 40 (SV40), adenovírus (por e- xemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e vírus de poli- oma.

Além dos genes de cadeia pesada e/ou leve do anticorpo e se- qüências regulatórias, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de repli- cação) e um ou mais genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras dentro das quais o ve- tor foi introduzido. Por exemplo, tipicamente o gene marcador confere resis- tência a fármacos, tais como G418, higromicina, ou metotrexato, em uma célula hospedeira dentro da qual o vetor tenha sido introduzido. Genes mar- cadores selecionáveis incluem o gene de diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras DHFR-m/nt/s com seleção/amplificação por me- trotexato), o gene neo (para seleção de G418), e glutamina sintetase (GS) em uma linhagem celular negativa para GS (tal como NSO) para seleção / amplificação.

Para expressão das cadeias leve e/ou pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesada e/ou leve é(são) introduzidos em uma célula hospedeira por técnicas padrão, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano, transdu- ção, infecção ou similar. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção tanto em células procarióticas como eucarióticas, células eucarióticas são preferidas, e o mais preferivelmente células hospe- deiras de mamíferos, porque tais células, mais provavelmente irão montar e secretar um anticorpo apropriadamente enovelado e imunologicamente ati- vo. Células hospefeiras de mamíferos preferidas para expressar os anticor- pos recombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hamster Chi- nês (CHO) (incluindo células DHFR-CHO, descritas em Urlaub & Chasin1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980, usadas com um marcador se- lecionável de DHFR, por exemplo, como descrito em Kaufman & Sharp, J. MoL Biol. 159:601-21, 1982, e células GS-CHO, descritas em Enosawa, et al., Cell Transplantation 6: 537-540, 1997, usadas com um marcador sele- cionável de glutamina sintetase (GS)), células de mieloma NSO, células COS, e células SP2/0. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos por cultivo das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras, ou mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Anticorpos podem ser recuperados a partir da célula hospedeira e/ou do meio de cultura usando métodos de purificação padrão.

Células hospedeiras também podem ser usadas para produzir porções, ou fragmentos de anticorpos intactos, por exemplo, fragmentos Fab ou moléculas de scFv por técnicas que são convencionais. Será compreen- dido por um versado na técnica que variações no procedimento acima estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada de um anticorpo dessa invenção. Tecnologia de DNA recom- binante também pode ser usada para remover algum ou todo o DNA que codifica uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não são necessárias para ligação a TGF-β. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são abrangidas pelos anticorpos da invenção.

Em um sistema preferido para expressão recombinante de um anticorpo da invenção, um vetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada como a cadeia leve do anticorpo é introduzido em cé- lulas GS-CHO por eletroporação. Dentro do vetor de expressão recombinan- te, os genes de cadeias pesada e leve são cada operativamente ligados a elementos regulatórios intensificadores/promotores (por exemplo, derivados de SV40, CMV, adenovírus e similares, tal como um elemento regulatório intensificador de CMV/promotor de AdMLP ou um elemento regulatório in- tensificador de SV40 / promotor de AdMLP) para direcionar altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene de DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram trans- fectadas com o vetor usando seleção/amplificação por metotrexato. As célu- las hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as cé- lulas hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo do meio de cultura. Anticorpos, ou porções de Iiga- ção de antígeno dos mesmos, da invenção podem ser expressos em um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (veja, por exemplo, Taylor, et ai, Nucleic Acids Res. 20:6287-95, 1992).

Uma vez expressos, os anticorpos intactos, seus dímeros, ca- deias leve e pesada individuais, ou outras formas de imunoglobulina da pre- sente invenção podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de troca de íon, afinidade, fase reversa, coluna de interação hidrofóbica, eletro- forese em gel, e similares. Imunoglobulinas substancialmente puras de pelo menos cerca de 90%, 92%, 94% ou 96% de homogeneidade são preferidas, e 98 a 99% ou mais homogeneidade o mais preferido, para usos farmacêuti- cos. Uma vez purificados, parcialmente ou até homogeneidade conforme desejado, os peptídeos podem então ser usados terapeuticamente ou profl· laticamente, como direcionado aqui.

Composição

Um anticorpo da invenção pode ser incorporado em composi- ções farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo. Os com- postos da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um veículo, diluente, e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em doses únicas ou múltiplas. As composições para administração são pro- jetadas para sérem apropriadas para o modo de administração selecionado, e diluentes, veículos, e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes dispersantes, tampões, tensoativos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidade, e similares são usados conforme apropriado. As ditas composições são feitas de acordo com técnicas con- vencionais, como por exemplo, em Reminqton, The Science and Practice of Pharmacy, 19e Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995; que fornece um compêndio de técnicas de formulação como são ge- ralmente conhecidas por versados.

Uma composição que compreende um anticorpo da invenção pode ser administrada a um indivíduo que exibe patologias ou distúrbios conforme descrito aqui usando técnicas de administração padrão incluindo administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdér- mica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou supositório.

A via de administração de um anticorpo da invenção pode ser parenteral. Preferivelmente, anticorpos da invenção podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para administração parenteral. O termo parenteral como usado aqui inclui administração intravenosa, intra- muscular, subcutânea, retal, vaginal ou intraperitoneal. Liberação sistêmica periférica por injeção intravenosa, intraperitoneal, ou subcutânea é preferida.

A composição deve ser tipicamente estéril e estável sob as con- dições de fabricação e armazenamento no recipiente fornecido,incluindo por exemplo, um frasco ou seringa lacrada. Portanto, composições podem ser esterilizadas por filtração após fazer a formulação, ou tornadas microbiologi- camente aceitáveis de outra maneira. Uma composição típica para infusão intravenosa poderia ter um volume de tanto quanto 250 - 1000 ml de fluido, tal como solução de Ringer estéril, salina fisiológica, solução de dextrose ou solução de Hank e uma dose terapeuticamente eficaz (por exemplo, 1 a 100 mg/mL, ou mais) de concentração de anticorpo. A dose pode variar depen- dendo do tipo e da severidade da doença. Como é bem-conhecido nas téc- nicas médicas, dosagens para qualquer indivíduo dependem de vários fato- res, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, do composto particular a ser administrado, sexo, momento e via de administra- ção, saúde geral, ou outros fármacos que estão sendo administrados con- comitantemente. Uma dose típica pode ser, por exemplo, na faixa de 0,001 a 1000 pg; entretanto, doses abaixo ou acima dessa faixa exemplar são pre- vistas, especialmente considerando os fatores mencionados acima. O regi- me de dose parenteral diária pode ser de cerca de 0,1 pg/kg a cerca de 100 pg/kg de peso corporal total, preferivelmente de cerca de 10 pg/kg a cerca de 5 mg/kg e mais preferivelmente de cerca de 10 □g/kg a 3 mg/kg de peso corporal por dia. O progresso pode ser monitorado por avaliação periódica. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorra. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis e não estão excluídos daqui. A dosagem desejada pode ser libera- da pela administração de uma massa única, pela administração de várias massas, ou por administração por infusão contínua de anticorpo, dependen- do do padrão de declínio farmacocinético que o praticante deseje obter.

Essas quantidades sugeridas de anticorpo são submetidas a uma grande quantidade de critérios terapêuticos. O fator chave em selecio- nar uma dose e cronograma apropriado é o resultado obtido. Fatores para consideração nesse contexto incluem o distúrbio particular sendo tratada, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de liberação do anticorpo, o tipo particular de anticorpo, o método de administração, e cronograma de administração, e outros fatores conhecidos de médicos.

Agentes terapêuticos da invenção podem se congelados ou liofi- lizados para armazenamento e reconstituídos em um veículo estéril adequa- do antes do uso. Liofilização e reconstituição podem levar a graus variados de perda de atividade de anticorpo. As dosagens podem ter que ser ajusta- das para compensar. Geralmente, pH entre 6 e 8 é preferido. Artigos manufaturados

Em outra modalidade da invenção, um artigo manufaturado con- tendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios ou condições descri- tas acima é fornecido. O artigo manufaturado compreende um recipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição da invenção que é eficaz para tratar o distúrbio ou condi- ção e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa per- furável por uma agulha de injeção hipodérmica). O agente ativo na composi- ção é um anticorpo anti-TGF-β da invenção. O rótulo sobre, ou associado com, o recipiente indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. O artigo manufaturado pode ainda compreender um segundo reci- piente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dex- trose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com instruções para uso.

Os seguintes exemplos são oferecidos apenas para fins ilustrati- • vos, e não são pretendidos para limitar o escopo da presente invenção de nenhuma fôrma.

Exemplo 1: Produção e Purificação de Anticorpo

Para expressão simultânea da cadeia leve e da cadeia pesada de anticorpos da invenção, ambos os genes que codificam a cadeia pesada e cadeia leve são clonados para formar em um vetor de dois genes com ca- da gene sob o controle de um promotor de hCMV-MIE separado. As se- qüências codificantes corretas são confirmadas por seqüenciamento de DNA de ambas as seqüências codificantes de cadeias leve e pesada.

O plasmídeo de expressão para a expressão simultânea da ca- deia leve e cadeia pesada de um anticorpo da invenção é Iinearizado pela enzima de corte simples Sal I, precipitado com acetato de sódio e etanol, lavado com etanol 70% gelado e seco ao ar em uma cabine de biosseguran- ça estéril. O pélete de DNA é então re-dissolvido com o meio de transfecção e usado para transfectar células CHO. A transfecção é realizada por eletro- porar a mistura célula-DNA usando o equipamento GenePulsar (BioRad, Hercules, CA) ajustado em 300 V e 1120 uFd. Clones que expressam um anticorpo da invenção são então gerados pela diluição limitante e posterior- mente expandidos para produção e purificação de anticorpo. Os anticorpos da invenção são então purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, que incluem precipitação em sulfato de amônio, cromatografia de troca de íon, afinidade, fase reversa, coluna de interação hidrofóbica, eletro- forese em gel e similares.

Exemplo 2: ELISA

ELISA é corrido usando placas de microtitulação revestidas Cos- tar 3366 (durante a noite a 4°C com 0,4 ug/ml de TGF-βΙ, TGF-p2, ou TGF- β3). A placa é então lavada (2X) antes de se adicionar (100 uL) de solução de bloqueio (BSA 10 mg/ml em tampão de lavagem) por poço. As diluições de Fab são incubadas em cavidades revestidos (1,5 h, 22°C). Após a lava- gem, conjugado de fosfatase alcalina kappa anti-humano é adicionado e in- cubado (1 h, 22°C). Um substrato colorimétrico é adicionado após lavagem intensa e a absorbância é medida (A560).

Em outro exemplo, as composições de ligação são testadas em um ensaio de ELISA competitivo. Tipicamente, um ensaio de fase em solu- ção é realizado no qual um composto que deveria competir com um antígeno pela ligação a um anticorpo, tal como um anticorpo, é combinado primeiro com o anticorpo na fase em solução, então o grau de ligação do anticorpo com o antígeno é subseqüentemente medido. Materiais: Tampão de reves- timento de carbonato (carbonato de sódio 50 mM pH 9.6). Antígenos: TGF- β1 (R&D Systems, Cat # 240-B/CF, 239 ug/ml), TGF-P2 (RDI, Cat #RDI- 1035, 50 ug/ml), e TGF-p3 (RDI, Cat # RDI-1036/CF, 50 ug/ml) diluídos para 0,4 ug/mL em tampão de revestimento. Tampão de lavagem (Tris 0,02 M pH 7,4, NaCI 0,15 M, Tween 20 0,1% e solução de bloqueio de BSA 10 mg/ml (Sigma A-4503) dissolvida em tampão de lavagem). As proteínas usadas como controles positivos são de camundongo anti-TGF-βΙ, -β2, ou -β3 hu- mano (R&D Systems, cat# 1D11), camundongo anti-TGF-p2 humano (R&D Systems, cat# BAF302) e camundongo anti-TGF-p3 humano (R&D Systems, cat# BAF243), que são diluídas para 1 ug/ml em tampão de bloqueio. O con- jugado de anticorpo de detecção é conjugado anti-/cappa de camundongo - peroxidase (Southern Biotech, cat# 1050-05), em uma concentração de tra- balho de 1:2000 em solução de bloqueio. O substrato da reação de cor são comprimidos de O-fenilenodiamina (OPD) (Sigma cat# P-6912) dissolvidos em tampão de substrato: Na2HPO4O1I M, pH para 5.0 com ácido cítrico 0,05 Μ. A solução de trabalho de OPD (isto é, o volume para uma placa de 196 cavidades) é feita recentemente antes do desenvolvimento de cada placa por dissolver 1x5mg comprimido de OPD em 12,5 mL de tampão de substra- to e então por 5 ul de H2O2 30%. Protocolo: uma única placa de 96 cavida- des é revestida com antígeno (TGF-βΙ, -β2, ou -β3 a 0,4 ug/ml e 50 uL dis- pensados por poço) lacrada com fita e armazenada (16-20h, 4°C). A placa é lavada (2X) em tampão de lavagem antes da adição de solução de bloqueio (100 uL por poço de BSA 10 mg/ml em tampão de lavagem). Após incuba- ção (~1hr-22°C), a placa é lavada (2X) com tampão de lavagem e então 100 uL de cada amostra (diluída em tampão) ou controle (diluída em PBS) são adicionados por poço e incubados (1,5h-22°C). Após a incubação, a placa é lavada (6X) com tampão de lavagem e então conjugado anti- kappa de ca- mundongo - peroxidase (diluído para 1:2000 em solução de bloqueio) ou SA-HRP (diluído 1:10.000 em solução de bloqueio) adicionado (100 uL/poço). Amostras de teste são deixadas incubar (1h-22°C) antes de adi- cionar 100 uL de substrato de OPD /poço. Após o desenvolvimento de cor (-10 min), a placa de 96 cavidades é medida em uma absorbância de 490nm.

Exemplo 3: Constantes cinéticas para Fabs

O instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Inst. Inc.) mede a cinética de ligação. Resumidamente, o antígeno é acoplado covalentemente a esfe- ras de azlactone e a ligação de um Fab livre da invenção às esferas é detec- tada no instrumento. Para medir Kd, tubos individuais contendo 20 pM de Fab (200 pM para anticorpo) com antígeno em diluição seriada decrescente (0-250 nM), são incubados (1-6d-25°C em PBS contendo BSA 1%, azida 0,02% e Tween20 0,01%). Após a incubação, Fab livre em cada amostra equilibrada é determinado no KinExA 3000 pelas instruções do fabricante. Valores de Kd são determinados usando o programa KinExA 3000. Para me- dir kon, Fabs individuais em 2 nM são misturados com 0-240 nM de antígeno usando o método de injeção de acordo com as instruções do fabricante, e o Fab não ligado é detectado. Os dados resultantes são usados para calcular a k^on com o programa KinExA 3000. A k^off é calculada usando a fórmula K^d = k^off/k^on. Dados dé afinidade obtidos sob as condições de KinExA© para mo- dalidades de Fab que se ligam à TGF Beta 1 são mostrados abaixo na Tabe- la 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 31</column></row><table>

De forma similares, os dados de Fab para afinidade de ligação de TGF-β2 sob as condições de KinExA © mostraram Kd<35 pM.

Exemplo 4: Constantes cinéticas para Anticorpos

Métodos alternativos de medir constantes cinéticas são mostrados, por exemplo: afinidade de um anticorpo da invenção para TGF-β1 (R&D Systems, Cat # 240-B/CF), TGF-β2 (RDI, Cat #RDI-1035), e TGF-β3 (RDI, Cat # RDI-1036/CF) é medida por BlAcore® 2000. As medidas de afinidade de ligação para anticorpos monoclonais de extensão completa da invenção são determinadas usando Biacore. Exceto quando observado, todos os rea- gentes e materiais são adquiridos de BlAcore® AB (Upsala, Sweden). Todas as medidas feitas em temperatura ambiente. As amostras são dissolvidas em tampão HBS-EP (cloreto de sódio 150 mM, EDTA 3 mM, 0,01% (p/v) tensoativo P-20, e HEPES 10 mM, pH 7,4). Proteína A recombinante é imo- bilizada em todas as quatro células de fluxo de um chip sensor CM4 em um nível de 400-450 unidades de resposta (RUs) usando um kit de acoplamento de amina. A ligação é avaliada usando múltiplos ciclos analíticos. Cada ciclo é realizado em uma taxa de fluxo de 50 pL/min consistindo nas etapas: inje- ção de 12 pL de anticorpo a 0,5 pg/mL, injeção de 250 pL de TGF-βΙ (co- meçando em 5 nM e usando diluições seriadas duas vezes até 0,13 nM para cada ciclo, com duas injeções para cada concentração) seguido por um re- tardo curto (5 min) ou longo (120 min) para dissociação, e regeneração u- sando duas injeções de 50 pL de cloridrato de glicina 10 mM, pH 1,5. As ta- xas de associação e dissociação por ciclo são feitas pelo ajuste dos dados do biossensor a partir de um modelo de associação simples usando CIampXP (Center for Biomolecular Interaction Analysis, Univ. de Utah) para extrair as constantes kon e koft; a constante de ligação no equilíbrio Kd é cal- culada a partir de Kd = koff/kon·

Anticorpos monoclonais de extensão completa da invenção fo- ram construídos por Fabs operativamente ligados a uma região Fc de IgG4 usando técnica padrão: mAb 3.A compreendendo LC de SEQ ID NO: 76 & HC de SEQ ID NO: 77; LC de mAb 4.17 de SEQ ID NO: 84 & HC de SEQ ID NO: 85; LC de mAb 12.4 de SEQ ID NO:78 & HC de SEQ ID NO: 79; LC de mAb 12.7 de SEQ ID NO: 80 & HC de SEQ ID NO: 81; e LC de mAb 12.8 de SEQ ID NO: 82 & HC de SEQ ID NO: 83. Quando mAbs são medidos usan- do o ensaio descrito, os resultados são conforme mostrado na Tabela 1 abaixo. Tabela 2

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Exemplo 5: Especificidade

BIAcore é usado para avaliar a especificidade de anticorpos por entidades, tal como, por exemplo, a forma latente de TGF-βΙ, -β2 ou -β3. Todas as medidas são realizadas em temperatura ambiente. As amostras são dissolvidas em tampão HBS-EP (cloreto de sódio 150 mM, EDTA 3 mM, 0,01% (p/v) tensoativo P-20, e HEPES 10 mM, pH 7.4). Proteína A recombi- nante é imobilizada em todas as quatro células de fluxo de um chip sensor CM4 em um nível de 400-450 unidades de resposta (RUs) usando um kit de acoplamento de amina. A ligação é avaliada usando múltiplos ciclos analíti- co. Cada ciclo é realizado em uma taxa de fluxo de 100 pL/minuto consistin- do nas seguintes etapas: injeção de 15 pL de uma composição de ligação de anticorpo a 1 pg/mL, injeção de 250 μL de TGF-βΙ 5 nM, TGF-p2 latente 5 nM, ou TGF-P3 5 nM seguido por um retardo curto (5 min) para dissociação, e regeneração' usando duas injeções de 50 μL de cloridrato de glicina 10 mM, pH 1,5. A quantidade de sinal após captura do anticorpo então Iigante é determinada usando o programa de controle do instrumento. Como o sinal é proporcional à massa de proteína capturada, a estequiometria do Iigante capturado é facilmente calculável. Sob tais condições, os dados para anti- corpos da invenção não mostram ligação específica significativa de isofor- mas latentes de TGF.

Exemplo 6: Ensaio de neutralização de célula HT-2

Para testar a habilidade de um anticorpo neutralizar a bioativi- dade de TGF-β, pode-se adaptar o ensaio de proliferação de célula HT-2 de Tsang, et ai, (1995 Cytokine 7:389-97). O ensaio de HT-2 avalia as caracte- rísticas de neutralização de um anticorpo sobre a bioatividade de TGF-β pela inibição e/ou diminuição significativa da proliferação celular da linhagem ce- lular HT2 dependente de IL4. Resumidamente, células HT-2 proliferam de uma maneira dependente da dose por IL-4 mas sofrem apoptose por TGF-β. A inibição da proliferação por TGF-β é bloqueada pela adição de um anticor- po anti-TGF-β. Células HT-2 humanas proliferam em resposta a IL-4, mas TGF-βΙ, -β2, ou -β3 inibem a proliferação induzida por IL-4. Conseqüente- mente, um anticorpo é neutralizante se ele impedir o efeito inibitório normal de TGF-β sobre células HT-2 induzidas por IL-4. Conseqüentemente, a proli- feração celular induzida por IL-4 deveria ocorrer livremente se quantidade suficiente de uma composição de ligação específica a TGF-βΙ, -β2, e -β3 fosse adicionada a uma mistura de células HT-2 contendo uma quantidade inibitória da proliferação celular de TGF-βΙ, -β2, ou -β3. A capacidade neu- tralizante de resposta à dose é feita usando o ensaio de HT-2 na presença de isoformas de TGF-β particulares e do sinal de proliferação de IL-4.

O grau de proliferação celular é determinado usando um ensaio de proliferação celular comercial (por exemplo, CeIITiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay de Promega). Células HT-2 são mantidas em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS1 penicilina/estreptomicina (100 U/ml e 100 ug/ml, respectivamente), beta-mercaptoetanol 50 uM e hlL-2 10 ng/ml (R&D Systems). As células são centrifugadas a 1000 RPM em uma centrífuga Jouvan CR422 e re-suspensas em PBS. Após lavar (2X) com PBS, as células são finalmente re-suspensas (0,15 χ 106 células/ml em meio de Ensaio (RPMI 1640 livre de vermelho de fenol suplementado com 2% de FBS, penicilina/estreptomicina (100 U/ml e 100 ug/ml, respectivamente) e beta-mercaptoetanol 50 uM). A cada poço de uma placa de 96 cavidades são adicionados 50 ul de células em um Meio de Ensaio. Concentrações variadas de um anticorpo da invenção são pré-incubadas com TGF-βΙ, -β2, ou -β3 recombinante (300 pg/ml em Meio de Ensaio). Após uma pré- incubação de 30 min, 50 ul da mistura de TGF-p/anticorpo são adicionados às células HT-2, seguido imediatamente por 50ul de Meio de Ensaio conten- do 6,0 ng/ml de IL-4 de murino (2,0 ng/ml final). Após incubação com o meio de ensaio (20-48 hr, 37°C em uma atmosfera com 5% de C02, umidificada), 35ul de solução aquosa CeIITiter 96 (Promega Corp) são adicionados. Após incubação adicional (2-3 hr, conforme acima), o ensaio é quantificado em um leitor de placa de ELISA a 490 nM usando o ensaio colorimétrico CeIITiter 96® (a quantidade de produto de formazana - medida pela quantidade de absorbância a 490nm - é diretamente proporcional ao número de células vivas). Comparado a 1D11.16; ATCC-HB9849, anticorpos da invenção exi- bem neutralização melhorada de morte celular induzida por TGF-βΙ-, -β2-, e -β3 e potência de neutralização (por exemplo, IC50 < 0,1 mg/mL ou <125 pM) como mostrada na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

<table>table see original document page 35</column></row><table> Exemplo 7: Ensaio de Neutralização de Xenoenxerto

Ao se ligar aos receptores TGF-pRI e TGF-pRIl, Iigantes de TGF-β a - tivam uma cascata de sinalização, na qual proteínas Smad-2 são fosforila- das para prodüzir efeitos biológicos a jusante, tal como, por exemplo, no câncer. Inibição e/ou diminuição significativa de fosforilação de Smad2 evi- dencia a neutralização das atividades biológicas de TGF-β através de ativa- ção transcricional (veja, por exemplo, Li1 et ai, 2005 World J Surg 29(3):306- 11). Para avaliar a eficácia de neutralização in vivo de um anticorpo, os ní- veis de Fosfo-Smad2 em um modelo de xenoenxerto e/ou em múltiplos ór- gãos ou tecido são feitos após exposição a um anticorpo da invenção para fornecer evidência de sua eficácia de neutralização em condições proliferati- vas celulares, tais como, por exemplo, câncer. O teste de eficácia in vivo é avaliado por medir o grau de inibição de fosfo-Smad2 usando um modelo de tumor humano U87MG altamente vascularizado (veja, por exemplo, Plow- man, et aí., 1997 "Human tumor xenograft models" em Anticancer Drug De- velopment Guide: Preclinical Screeninq, Clinicai Trials, and Approval; Tei- cher B (ed) pp 101-25. Humana Press: Totowa NJ). Camundongos "nude" nu/nu atímicos fêmeas (Charles River, -22-24 g) são postos em quarentena e mantidos (7d de alimentação e água ad libitum) antes da manipulação ex- perimental. O teste começa por injeções do flanco (s.c.) de células de glio- blastoma U87MG subconfluentes humanas (~5x106/por animal em 0,2 ml de meio de cultura misturado com Matrigel (BD Biosciences, 1:1 v/v)) para pro- mover crescimento do tumor. Os xenoenxertos são então monitorados até que o volume do tumor alcance -300 mm3 e então os animais são divididos randomicamente em grupos de tratamento (1 O/grupo) com dosagem inicia- da. A terapia de implantação pós-tumor começa quando mAb 12.7 é admi- nistrado (i.p.) em doses variadas (por exemplo, 1, 10, 100 ug/animal) em um veículo de solução salina duas vezes por semana (q4d) por uma duração de dosagem de suas semanas. Controles de solução salina e lgG4 humana (100 ug) são administrados em paralelo. 48H após a última dose, os animais são sacrificados com amostras de tumor e pulmão coletadas e congeladas em nitrogênio líquido. As amostras são subseqüentemente trituradas e Iisa- das para análise de fosforilação de Smad2 por ELISA usando anticorpos contra Smad2 fosforilada ou total. Sangue também é coletado em tubos tra- tados com EDTA através de punção cardíaca. Amostras de sangue são cen- trifugadas para se obter amostras de plasma (800 rpm, 4°C, 30 min; e então 3000 rpm, 4°C, 10 min), que são armazenadas (-80°C) até análise. Compa- ração estatística de fosforilação de Smad2 é realizada usando JMP5.1 (SAS lnstitute). Um teste ANOVA one-way e teste de Dunnett com um controle também são usados. Os níveis de fosfo-Smad2 são testados para avaliar a inibição do alvo induzida pelo tratamento com composições da invenção. O nível de fosfo-Smad2 é normalizado para a Smad total (ou proteína total) para minimizar variação introduzida pelo tamanho do tecido e processo de manuseio. Os dados desse modelo de xenoenxerto U87MG mostram uma inibição dependente da dose de fosforilação de Smad2, assim demonstrando eficácia de neutralização in vivo em modular os efeitos de TGF-β sobre a proliferação celular. Os dados mostram que uma dose de 10 Dg diminui a fosforilação de Smad2 em 60% (p=0,012), com 72% de inibição alcançável em doses de 100 Dg (p<0,0001). Além disso, uma diminuição de 75% na fosforilação de Smad2 é vista em tecido pulmonar em dose de 100 Dg de uma composição da invenção (p<0,001). Também há uma diminuição de- pendente da dose nos níveis de Fosfo-Smad2 (em relação a Smad total (T- Smad)) e níveis de Fosfo-Smad2 diminuídos em tecido de pulmão (na dose de 100 ug). Dados similares são obtidos quando os níveis de fosfo-Smad são normalizados tanto aos níveis de Smad total ou à raiz quadrada dos ní- veis de Smad total (tSmad), dessa forma indicando ainda que a porcenta- gem de inibição do crescimento do tumor está correlacionada com a libera- ção de dosagem de uma composição de ligação da invenção. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID NO: 1 é a cadeia madura humana da seqüência de ami- noácido de TGF-β1.

SEQ ID NO: 2 é a cadeia madura humana da seqüência de ami- noácido de TGF-β2.

SEQ ID NO: 3 é a cadeia madura humana da seqüência de ami- noácido de TGF-β3.

SEQ ID NO: 4 é uma seqüência de aminoácido de VHCDR1 de um anticorpo da invenção.

SEQ ID NO: 5 é uma seqüência de aminoácido de VHCDR2 de um anticorpo da invenção.

SEQ ID NO: 6 é uma seqüência de aminoácido de VHCDR3 de um anticorpo da invenção.

SEQ ID NO: 7 é uma seqüência de aminoácido de VLCDR1 de um anticorpo da invenção.

SEQ ID NO: 8 é uma seqüência de aminoácido de VLCDR2 de um anticorpo da invenção.

SEQ ID NO: 9 é uma seqüência de aminoácido de VLCDR3 de um anticorpo da invenção.

SEQ ID NO: 10 é a seqüência de aminoácido de VHCDR1 de anticorpos da invenção.

SEQ ID NO: 11 é a seqüência de aminoácido de VHCDR2 de anticorpos da invenção.

SEQ ID NO: 11 é a seqüência de aminoácido de VHCDR3 de anticorpos da invenção.

SEQ ID NO: 13 é a seqüência de aminoácido de VLCDR1 de anticorpos da invenção.

SEQ ID NO: 14 é a seqüência de aminoácido de VLCDR2 de anticorpos da invenção.

SEQ ID NO: 15 é a seqüência de aminoácido de VLCDR3 de anticorpos da invenção.

SEQ ID NO: 16 é uma seqüência de aminoácido de arcabouço de FR1 de HCVR humana.

SEQ ID NO: 17 é uma seqüência de aminoácido de arcabouço de FR2 de HCVR humana.

SEQ ID NO: 18 é uma seqüência de aminoácido de arcabouço de FR3 de HCVR humana.

SEQ ID NO: 19 é uma seqüência de aminoácido de arcabouço de FR4 de HCVR humana.

SEQ ID NO: 20 é uma seqüência de aminoácido de arcabouço de FR1 de LCVR humana.

SEQ ID NO: 21 é uma seqüência de aminoácido de arcabouço de FR2 de LCVR humana.

SEQ ID NO: 22 é uma seqüência de aminoácido de arcabouço de FR3 de LCVR humana.

SEQ ID NO: 23 é uma seqüência de aminoácido de arcabouço de FR4 de LCVR humana.

SEQ ID NO: 24 é uma seqüência de aminoácido de região cons- tante de cadeia pesada humana.

SEQ ID NO: 25 é outra seqüência de aminoácido de região constante de cadeia pesada humana.

SEQ ID NO: 26 é uma seqüência de aminoácido de região cons- tante de cadeia leve humana.

SEQ ID NO: 27-50 são seqüências de aminoácido de região va- riável de cadeia leve (LCVR) humanizada para anticorpos particulares da presente invenção.

SEQ ID NO: 51-75 são seqüências de aminoácido de região va- riável de cadeia pesada (HCVR) humanizada para anticorpos particulares da presente invenção.

SEQ ID NO: 76-85 são seqüências de aminoácido de cadeias pesada e leve (HC & LC) humanizadas para anticorpos particulares da pre- sente invenção.

SEQ ID NO: 86-87 são seqüências de aminoácido de cadeias pesada e leve (HC & LC) humanizadas para anticorpos particulares da pre- sente invenção.

SEQ ID NO: 88-102 são as seqüências de aminoácido das C- DRs de cadeia pesada e leve para anticorpos preferidos da presente invenção.

SEQ ID NO: 103-112 são as seqüências de DNA que codificam LCVRs e HCVRs preferidas da presente invenção. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

ELI LILLY AND COMPANY

"ANTICORPO MONOCLONAL, USO DO MESMO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTI- CA"

X-17188 US 60/753,956 2005-12-23 112

Patentin version 3.3 1 112 PRT

homo sapiens 1

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15

vai Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25 30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45

Pro Tyr Ile Trp ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys vai Leu Ala Leu

50 55 60

Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80

Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro

85 90 95

Lys vai Glu Gln Leu Ser Asn Met lie Val Arg ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110

<210> 2 <211> 112

<212> PRT

<213> homo sapiens

<110> <120>

<130> <150> <151> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <400> <400> 2

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn vai Gln Asp Asn Cys Cys 1 5 10 15

Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

lie His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 65 70 75 80

Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro

85 90 95

Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110

<210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3

1 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 1 5 10 15

vai Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

vai His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr vai Leu Gly Leu

50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala ser Ala ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80

Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr vai Gly Arg Thr Pro 85 90 95 Lys vai Glu Gln Leu Ser Asn Met vai vai Lys Ser cys Lys Cys Ser 100 105 110

<210> 4 <211> 5 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> synthetic construct <400> 4

Thr Tyr Trp Met Asn 1 5

<210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 5

Gln lie Phe Pro Ala Ser Gly ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe Glu 1 5 10 15

Gly

<210> 6 <211> 12 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 6

Gly Asp Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 7 <211> 15

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético

<400> 7

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético

<400> 8

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético

<400> 9

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Leu Thr 1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa até a posição 1 = Thr ou Ser <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> C2)..C2)

<223> Xaa até a posição 2 = Glu ou Tyr

<400> 10 xaa xaa Trp Met Asn

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <220>

<221> MISC—FEATURE

<222> C5)..C5)

<223> Xaa até a posição 5 = Ala ou Phe <220>

<221> MISC—FEATURE

<222> C6)..C6)

<223> Xaa até a posição 6 = Ser, Thr1 ou Leu <220>

<221> MISC—FEATURE

<222> C12)..C12)

<223> xaa até a posição 12 = Asn, Gly, Ser, Asp, ou Ala <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> C15)..C15) <223> xaa até a posição 15 = Phe ou Tyr

<400> 11

Gln lie Phe Pro xaa Xaa Gly Ser Thr Asn Tyr Xaa Glu Met xaa Glu

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <220>

<221> MISCL.FEATURE

<222> C2)..(2)

<223> xaa até a posição 2 = Asp, Ile, Met, Tyr, Leu, vai, Glη, ou Phe

<400> 12

Gly xaa Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> xaa até a posição 8 = Ser, Tyr, Phe, ou Leu <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9)

<223> Xaa até a posição 9 = Tyr ou Trp

<400> 13

Arg Ala Ser Glu Ser vai Asp Xaa Xaa Gly Asn ser Phe Met His 1 5 10 15

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <220>

<221> MISC_FEÁTURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa até a posição 1 = Leu ou Tyr

<400> 14

xaa Ala ser Asn Leu Glu Ser 1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> xaa até a posição 1 = Gln, Thr, ou Cys <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa até a posição 3 = Asn ou His <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4)

<223> Xaa ate a posição 4 = Asn1 lie, Met, Asp, Thr, ou Ala <400> 15

Xaa Gln xaa xaa Glu Asp Pro Leu Thr 1 5

<210> 16 <211> 30 <212> PRT

<213> homo sapiens <400> 16

Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

<210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> homo sapiens ' <400> 17

Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10

<210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 18

Arg vai Thr Met Thr Thr Asp Thr ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15

Leu Arg ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 19

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 20 <211> 23 <212> PRT

<213> homo sapiens <400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20

<210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 21

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15

<210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 22

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 30 1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> homo sápiens <400> 23

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10

<210> 24 <211> 328 <212> PRT

<213> homo sapiens <400> 24

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro ser Ser Lys Ser 1 5 10 15

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60

Ser Ser vai Val Thr Val Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80

lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys vai Asp Lys Lys 85 90 95

vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys vai 130 135 140

vai Val Asp vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn ser Thr Tyr Arg vai vai Ser vai Leu Thr vai Leu His 180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Asp Glu Leu 225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300

Phe ser Cys Ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly 325

<210> 25 <211> 326 <212> PRT

<213> homo sapiens <400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys ser Arg 1 5 10 15

ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser ser vàl vai Thr Val Pro ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg vai Glu ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val vai

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160

Gly vai Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

lie Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320

Leu ser Leu Ser Leu Gly 5 325

<210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 26

Arg Thr vai Ala Ala Pro Ser vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser vai Thr Glu Gln Asp ser Lys Asp ser

50 55 60

Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys vai Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

<210> 27 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 27 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly vai Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 28

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético

<400> 28

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 1 5 · 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly vai Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Met 85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 29 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 29

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro ser ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly vai Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Gln Asn Asn 85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 30 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu ser Val Asp Ser Tyr 20 25 BO

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Cys Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 31 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro ser Ser Leu ser Ala ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala ser Glu ser Val Asp ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu ser Gly vai Pro Ser 50 55 60

30 Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asp

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 32 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala ser Glu Ser vai Asp ser Tyr 15 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala ser Asn Leu Glu Ser Gly vai Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 33 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu ser vai Asp Ser Tyr 20 25 BO

Gly Asn ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu ser Gly vai Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 34 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 34

Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 35 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser vai Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 36 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 36 Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro ser Ser Leu Ser Ala ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Trp Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser vai Gly 1 5 · 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala ser Glu Ser Val Asp Phe Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly vai Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 38 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser vai Asp Leu Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ile 85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 39 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala ser Glu Ser vai Asp Ser Trp 20 25 30

Gly Asn ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 40 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 40

Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro ser ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly vai Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu lie Lys 100 105 110

<210> 41 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser vai Asp Phe Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 42

<211> 111

<212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser vai Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala ser Asn Leu Glu Ser Gly vai Pro ser

50 55 60

Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 43 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

20 <223> constructo sintético ' <400> 43

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Gly Asn ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

30 Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

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<223> constructo sintético <400> 44

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Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

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85 90 95

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<223> constructo sintético <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro ser ser Leu ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

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Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu ser Gly vai Pro Ser

50 55 60

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85 90 95

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35 40 45

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85 90 95

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20 25 30

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35 40 45

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35 40 45

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Asp

Gly

Lys

Arg 65 Ser

Glu

è

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Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

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20 25 30

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50 55 60

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85 90 95

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Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

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<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 64

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<223> constructo sintético <400> 65

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115 120

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<400> 66

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115 120

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<220>

<223> constructo sintético

<400> 67

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<223> constructo sintético <400> 68

Gln vai Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

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115 120

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<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 69

Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser vai Lys vai Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Glu

20 25 30

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50 55 60

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100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val ser Ser 115 120

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<223> constructo sintético <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

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50 55 60

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<210> 71 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 71

Gln vai Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

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Gly Gln lie Phe Pro Ala Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Glu Met Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

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115 120

<210> 72 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 72

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Gly Gln lie Phe Pro Ala Ser Gly ser Thr Asn Tyr Ala Glu Met Phe

50 ■ 55 60

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Gln Gly Thr Leu Val Thr vai Ser ser 115 120

<210> 73 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 73

Gln vai Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

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Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Glu Met Phe 50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg ser Leu Arg ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Ile Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 74 <211> 121 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 74

Gln val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 Ser vai Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gln Ile Phe Pro Phe Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe 50 55 60

Glu Gly Arg vai Thr Met Thr Thr Asp Thr ser Thr ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Ile Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu vai Thr vai Ser ser 115 120

<210> 75 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 75

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

ser vai Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Phe Pro Ala ser Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Glu Met Phe 50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ile Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu vai Thr Val Ser ser 115 120

<210> 76 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 76

Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro ser ser Leu Ser Ala ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Phe Trp

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly vai Pro Ser 50 55 60

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Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys Arg

100 105 110

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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gln ser 145 150 155 160

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His Lys vai Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 77 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 77

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln lie Phe Pro Ala Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Glu Met Phe 50 55 60

Glu Gly Arg vai Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

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115 120 125

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165 170 175

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195 200 205

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420 425 430

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<210> 78 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 78

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser ser Leu ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu ser Val Asp Trp Trp 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

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Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 79 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 79

Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser vai Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr ser Tyr 20 25 30

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35 40 45

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165 170 175

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210 215 220

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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg vai Val

290 295 300

Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

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Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr ser Arg Leu Thr vai Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn vai Phe Ser Cys ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys ser Leu ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445

<210> 80 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 80

Asp ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr cys Arg Ala Ser Glu Ser vai Asp Phe Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

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130 135 140

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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp ser Thr

165 170 175

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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 81 <211> 447 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 81

Gln vai Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr ser Glu 20 25 30

Trp Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gln Ile Phe Pro Ala Leu Gly ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Tyr

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5 Met Glu Leu Arg ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ile Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu vai Thr vai Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160

ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

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Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335

lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu 340 345 350

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435 440 445

<210> 82 <211> 218 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 82

Asp ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Trp Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

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Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

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Thr Val Ala Ala Pro Ser vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125

Leu Lys ser Gly Thr Ala ser vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

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Gly Asn Ser Gln Glu Ser vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 83 <211> 447 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 83

Gln vai Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gln lie Phe Pro Ala Leu Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe 50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Ile Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu vai Thr Val Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai 145 150 155 160

Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

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275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Tyr Arg Val vai 290 295 300

Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380

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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr vai Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

<210> 84 <211> 218 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 84

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser vai Asp Phe Trp

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

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<210> 85

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético <400> 85

Gln vai Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Gln lie Phe Pro Phe Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe 50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ile Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr vai Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser

115 120 125

vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg ser Thr ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160

Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys vai Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys vai Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270

Glu vai Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Tyr Arg Val vai

290 295 300

Ser vai Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys 355 360 365

Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Arg Leu Thr vai Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445

<210> 86 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <220>

<223> misc_feature <222> (31)..(32)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220>

<221> misc_feature <222> (54)..(55)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220>

<221> misc_feature <222> (61)..(61)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220>

<221> misc_feature <222> (64)..(64)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220>

<221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <400> 86

Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Xaa 20 25 30

Trp Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

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Glu Gly vai Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Gly xaa Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr vai Ser ser 115 120

<210> 87 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <220>

<221> misc_feature <222> (Bl)..(32)

<223> xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220>

<221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220>

<221> misc_feature <222> (93)..(93)

<223> xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220>

<221> misc_feature <222> (95)..(96)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <400> 87

Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp xaa xaa 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

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<220>

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<220>

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1 5 10 15

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<220>

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Gly

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Gly

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Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys

35 40 45

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Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys

85 90 95

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Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala

115 120 125

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Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Gly '145 150 155 160

Cys Ala Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala

165 170 175

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Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala

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20 25 30

Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 30 50 55 60

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85 90 95

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130 135 140

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165 170 175

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210 215 220

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Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly

245 250 255

Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala 260 265 270

cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala 275 280 285

Gly Ala Gly Gly Ala Thr cys Cys Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly Thr

290 295 300

Thr cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala 305 310 315 320

Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala 325 330 <210> 105 <211> 363 <212> PRT <213> Arti fi ci al <220> <223> constructo sintético <400> 105 Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys

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35 40 45

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Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala 65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys 85 90 95

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100 105 110

Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala

115 120 125

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Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Gly 145 150 155 160

Cys Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala 165 170 175

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180 185 190

Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205

Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys

210 215 220

Cys Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Cys 225 230 235 240

Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Ala Gly Cys Cys

245 250 255

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Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr 275 280 285

Gly Cys Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Gly Thr Ala

290 295 300

Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys 305 310 315 320

Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys

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35 40 45

Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 50 55 60

Cys Thr Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Gly Ala 65 70 75 80

Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly

85 90 95

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115 120 125

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Thr Thr Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala 180 185 190

Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly

195 200 205

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245 250 255

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Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala 275 280 285 Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Thr cys Ala Cys Gly Thr

290 295 300

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Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala

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Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly 85 90 95

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Cys Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala

165 170 175

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Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala

195 200 205

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Cys Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Cys 225 230 235 240

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Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr

275 280 285

Gly Cys Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Gly Thr Ala 290 295 300

Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys 305 310 315 320

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Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 10 50 55 60

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' Ala Ala Gly Cys Thr Cys cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Thr Cys 145 150 155 160

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115 120 125

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Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Gly 145 150 155 160

Cys Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala 165 170 175

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Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala

195 200 205

Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys 210 215 220

Cys Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Cys 225 230 235 240

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Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr

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Gly Cys Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Gly Thr Ala 290 295 300

Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys 305 310 315 320

Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys 325 330 335

Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala

340 345 350

Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys 355 360

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Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr

20 25 30

Gly Thr cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Ala Gly Gly Ala 35 40 45

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Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Thr 20 85 90 95

Gly Gly cys Ala Ala Thr Ala Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys

100 105 110

Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala 115 120 125

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Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Thr Thr 145 150 155 160

Ala Cys Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Ala 30 165 170 175

Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala 180 185 190 Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly

195 200 205

Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr 210 215 220

Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys 225 230 235 240

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly

245 250 255

Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala 260 265 270

Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Thr Gly Cys Cys

275 280 285

Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly Thr 290 295 300

Thr Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala 305 310 315 320

Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala 325 330

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Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Thr 20 25 30

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys 35 40 45

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Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala 65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys 85 90 95

Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Cys

100 105 110

Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala 115 120 125

Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly 130 135 140

Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr 145 150 155 160

Thr Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala 165 170 175

Cys Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Thr Gly Thr Thr Cys

180 185 190

Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205

Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys 210 215 220

Cys Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Cys 225 230 235 240

Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Ala Gly Cys Cys 245 250 255

Thr Gly Cys Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr 275 280 285

Gly cys Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Gly Thr Ala 290 295 300

Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys 325 330 335 Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala 340 345 350 Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys 355 360 <210> 112 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> constructo sintético <400> 112 Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 50 55 60 Cys Thr Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Cys Ala Ala Thr Ala Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys 100 105 110 Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr 130 135 140 Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Thr Cys 145 150 155 160

Thr Thr Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Ala 165 170 175

Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala 180 185 190

Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly

195 200 205

Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr 210 215 220

Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys 225 230 235 240

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly 245 250 255

Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala

260 265 270

Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Thr Gly Cys Cys

275 280 285

Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly Thr 290 295 300

Thr Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala 305 310 315 320

Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala 325 330

Claims (12)

1. Anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, caracterizado pelo fato de que neutraliza TGF-β1 maduro humano, TGF-β2 maduro humano, e TGF-β3 maduro humano, e que tem um Kd de 4,0 x 10"12 M ou menos para TGF-β1 maduro humano, e um Kdde -8,0 x 10"12 M ou menos para TGF-β2 maduro humano, e um Kd de 4,0 x 10"12 M ou menos para TGF-β3 maduro humano.

2. Anticorpo monoclonal anti-TGF-β ou um fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que neutraliza TGF-βΙ maduro humano, TGF-$2 maduro humano, e TGF-ββ maduro humano, que tem um IC50 de menos que ou igual a cerca de 100 pM para TGF-βΙ maduro humano, e um IC50 de menos do que ou igual a cerca de 400 pM para TGF- β2 maduro humano, e um IC50 de menos do que ou igual a cerca de 200 pM para TGF-β3 maduro humano em um ensaio de neutralização de célula HT- -2 in vitro.

3. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antíge- no do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma região variável de cadeia leve (LCVR-), em que as ditas HCVR e LCVR com- preendem regiões determinantes da complementaridade (CDRs) que são selecionadas do grupo que consiste em: a) HCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos confor- me SEQ. ID NO: 96, HCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 97, HCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 98, LCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 88, LCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 89, LCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 90; b) HCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos con- forme SEQ. ID NO: 96, HCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 99, HCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 98, LCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 91, LCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 89, LCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 90; c) HCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos con- forme SEQ. ID NO: 100, HCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 101, HCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 98, LCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 92, LCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 89, LCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 90; d) HCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos con- forme SEQ. ID NO: 96, HCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 101, HCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 98, LCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 93, LCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 94, LCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 95; e, e) HCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos con- forme SEQ. ID NO: 96, HCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 102, HCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 98, LCVR CDR1 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 88, LCVR CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 89, LCVR CDR3 tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 95.

4. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antíge- no do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, carac- terizado pelo fato de que compreende uma HCVR e uma LCVR, em que as ditas HCVR e LCVR são selecionadas do grupo que consiste em: a) HCVR tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 64 e LCVR tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 41; b) HCVR tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 68 e LCVR tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 43; c) HCVR tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 69 e LCVR tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 45; d) HCVR tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 70 e LCVR tendo uma seqüência de aminoácidos conforme SEQ. ID NO: 46.

5. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antíge- no do mesmo de acordo a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma HCVR com uma seqüência conforme mostrado em SEQ ID NO: 69, e uma LCVR com uma seqüência conforme mostrado em SEQ ID NO: 45.

6. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que com- preende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que as ditas cadeia pe- sada e cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em: a) uma cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos conforme mostrada em SEQ ID NO: 77, e uma cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos confor- me mostrada em SEQ ID NO: 76; b) uma cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos conforme mostrada em SEQ ID NO: 79, e uma cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos confor- me mostrada em SEQ ID NO: 78; c) uma cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos conforme mostrada em SEQ ID NO: 81, e uma cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos confor- me mostrada em SEQ ID NO: 80; d) uma cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos conforme mostrada em SEQ ID NO: 83, e uma cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos confor- me mostrada em SEQ ID NO: 82; e) uma cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos conforme mostrada em SEQ ID NO: 85, e uma cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos confor- me mostrada em SEQ ID NO: 84.

7. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada com uma se- quência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 81 e uma ca- deia leve com uma seqüência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 80.

8. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antíge- no do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, carac- terizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

9. Fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o fragmento é um fragmen- to Fab.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o dito anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antí- geno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

11. Uso do dito anticorpo monoclonal ou um fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo-como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a produção de um medi- camento para tratar desordens proliferativas celulares em um indivíduo que necessite disso.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a dita desordem proliferativa celular é selecionada do grupo que consiste em síndrome mielodisplásica (MDS)/ desordem mieloproliferativa (MDP), câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, mieloma múltiplo, câncer colo-retal, leu- cemia das células pilosas, leucemia mielogênica crônica e leucemia mielo- gênica aguda.