BRPI0618583A2

BRPI0618583A2 - enzima altamente funcional tendo especifidade ao substrato modificada

Info

Publication number: BRPI0618583A2
Application number: BRPI0618583-5A
Authority: BR
Inventors: Hitoshi Sakuraba; Youichi Tajima; Mai Ito; Seiichi Aikawa; Fumiko Aikawa
Original assignee: Tokyo Metropolitan Org Med Res; Seiichi Aikawa; Fumiko Aikawa
Priority date: 2005-11-18
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2011-09-06
Also published as: US8323640B2; EP1961816A1; US7935336B2; WO2007058381A1; US20130064805A1; US9193964B2; EP1961816A4; IL190988A; IL190988A0; US20140171493A1; US20100166728A1; TWI500765B; US20110171198A1; ES2547726T3; JP4368925B2; JPWO2007058381A1; EP1961816B1; AU2006316122A1; TW200804601A; CA2626092A1

Abstract

ENZIMA ALTAMENTE FUNCIONAL TENDO ESPECIFIDADE AO SUBSTRATO MODIFICADA. Revelado é uma proteína tendo uma atividade <244>- galactosidase, que não mostra nenhum efeito colateral adverso alérgico, mostra uma alta estabilidade no sangue e pode ser tomada em uma célula de um órgão afetado, e assim é adequada como uma enzima para terapia de substituição enzimática na doença de Fabry. A proteína adquire uma atividade <244>-galactosidase por modificar a estrutura do sítio ativo de uma <244>-N-acetilgalactosaminidase humana selvagem.

Description

"ENZIMA ALTAMENTE FUNCIONAL TENDO ESPECIFIDADE AO SUBSTRATO MODIFICADA"

Campo Técnico

A presente invenção relaciona-se a uma proteína recombinante tendo atividade α-galactosidase.

Técnica Antecedente

Para deficiência enzimática hereditária, para a qual nenhum tratamento radical tem sido conhecido to date, terapia de substituição enzimática em que uma enzima é produzida por engenharia genética e é então administrada em um vaso sangüíneo por gotejamento intravenoso ou semelhante tem sido desenvolvido. Como um exemplo de deficiência enzimática hereditária cuja prevalência é relativamente alta e que é designada como doença especificada (doença intratável), doença de Fabry (deficiência de a-galactosidase hereditária, que é um de um grupo de doenças genéticas e também chamadas de doença lisossomal), é bem conhecido (refere-se a Kenneth J. Dean et al, Fabry Disease, "Practical Enzymology of the Sphingolipidoses", EUA, Aln R. Liss, Inc., 1997, p. 173-216).

Doença de Fabry é um distúrbio metabólico glicolipídeo que desenvolve como segue: Como um resultado de uma diminuição na atividade de uma enzima chamada "a- galactosidase", que é uma das enzimas presentes em um lisossoma, que é uma das organelas intracelulares humanas, e defic iência da enzima, um glicolipídeo chamado globotriaosilceramida (também referido como ceramida triexosida) , que é um substrato in vivo da enzima, não é decomposto e acumulado no corpo (por exemplo, vasos sangüíneos, peles, córnea, nervos, rins, e coração).

Desde um gene codificando α-galactosidase está situado no cromossomo X, a doença tem um modo de herança cromossomal X. Assim, nesta doença, uma característica clínica clara é observada principalmente nos homozigotos em homens. É acreditado que "doença de Fabry clássica", que toma um curso clínico típico, desenvolve em cerca de um a 40.000 crianças masculinas. Sintomas tais como dor na mão e no pé, hipoidrose, angioceratoma, e opacidade córnea aparecem durante o termo juvenil e adolescente; esses sintomas progridem e então causam danos em órgãos sistêmicos tais como falência renal, falência do coração, e distúrbio cerebrovascular durante a adolescência e dali em diante; e essas se tornam à causa de morte. Em adição, uma doença que não toma tal curso clínico típico como "doença de Fabry clássica" e que desenvolve tardiamente e toma um curso relativamente moderado, é "doença de Fabry variante". Em pacientes com este tipo de doença, a atividade a- galactosidase residual é observada apesar de ser baixa. Como uma doença de Fabry variante, por exemplo, "doença de Fabry cardíaca" é conhecida. O acúmulo de glicolipídeo acima mencionado principalmente ocorre no coração. Assim, hipertrofia cardíaca ocorre, e distúrbios tais como falência cardíaca e arritmia são causadas. Por outro lado, em pacientes mulheres Fabry heterogizotos, vários tipos de características clínicas são observadas de acordo com as características do cromossomo X. Especificamente, causas variando de casos sérios que são similares àqueles de hemozigotos em homens para casos em que substancialmente nenhum sintoma é observado existir. Entretanto, de acordo com a pesquisa recente, tem e tornado claro que a maioria das mulheres heterozigotas 'pacientes Fabry desenvolvem alguns sintomas quando elas se tornam velhas. Existe um ponto de vista que eles devem ser tratados não como "veículos" mas como "pacientes".

Recentemente, terapia de substituição enzimática por doença de Fabry tem também sido estabelecida, e uma a- galactosidase humana recombinante produziu em uma célula derivada de mamíferos tem sido grandemente utilizada como um ingrediente ativo de um agente terapêutico de doença de Fabry na terapia acima (refere-se a Eng CM et al, Am J Hum Genet., 68:711-722 (2001); Eng CM et al., N Engl J Med, 345: 9-16 (2001); e Schiffmann R et al., Proc Natl Acad Sci EUA, 97: 365-370 (2000)).

Além disso, um método em que uma a-galactosidase humana recombinante produzido utilizando uma célula (por exemplo, levedura) outra que uma célula animal como um hospedeiro é utilizado para o tratamento médico (terapia de substituição enzimática) de doença de Fabry (refere-se a Publicação de Pedido de Patente Não Examinado No. 2002- 369692), um método de terapia gênica em que uma enzima é substituída por introdução de um gene codificando a a- galactosidase humana em uma célula de um tecido afetado para expressar o gene (refere-se a Publicação do Pedido de Patente Não Examinada Japonesa (Tradução do Pedido PCT) No. 2002-522509), e semelhante têm também sido proposto.

Revelação da Invenção

Entretanto, desde que um agente enzimático existente utilizado na substituição enzimática para tratamento de doença de Fabry é sempre administrado a pacientes que originalmente não têm uma enzima (a- galactosidase humana), a enzima contida no agente terapêutico é reconhecida como uma substancia estranha em muitos pacientes administrados com o agente enzimático, e então, um anticorpo é produzido. Como um resultado, efeitos colaterais adversos, principalmente, reações alérgicas são expressas em uma alta freqüência. Esta similarmente ocorre no caso onde a enzima é substituída utilizando um método da terapia gênica.

Em adição, tal um agente enzimático utilizado na substituição enzimática é administrado nos vasos sangüíneos, mas α-galactosidase por si mesma é instável no sangue.

Conseqüentemente, na terapia atual, o agente enzimático deve ser freqüentemente administrado (uma vez a cada duas semanas), e ele pode ser necessário para aumentar a dose por administração. Além disso, α-galactosidase humana tem um número relativamente pequeno de cadeias de açúcar (cadeias de açúcar tipo N) ao qual resíduo mano-6-fosfato (M6F) pode estar ligado, as cadeias de açúcar sendo necessárias para a- galactosidase humana para serem incorporadas em uma célula (mais especificamente, em um lisossomo em uma célula) em um órgão afetado. Assim, é difícil para a α-galactosidase humana para ser tomada do sangue e incorporado em uma célula. Em particular, a eficiência de incorporação no rim ou coração, que é o principal órgão afetado na doença de Fabry, é baixo, e então o efeito terapêutico para nefropatia ou cardiopatia é insuficiente. Conseqüentemente, a fim de permitir uma certa quantidade de enzima para ser incorporado em uma célula alvo na terapia, uma grande quantidade de enzima é requerida. Conseqüentemente, é necessário administrar um agente enzimático utilizado na substituição enzimática mais freqüentemente e em uma quantidade maior. Tal terapia põe um grande dificuldade em pacientes fisicamente, mentalmente, e economicamente, e então adversamente afeta a "qualidade de vida (ADV)".

Conseqüentemente, é um objeto da presente invenção prover, como uma enzima que pode ser utilizada para terapia de substituição enzimática para doença de Fabry, uma proteína tendo atividade α-galactosidase, que não mostra nenhum afeito colateral adverso alérgico, mostra uma alta estabilidade no sangue (no plasma), e pode ser facilmente incorporado em uma célula de um órgão afetado.

Os presentes inventores conduziram estudos intensivos a fim de resolver os problemas acima. Como um resultado, os presentes inventores focaram na "α-N- acetilgalactosaminidase (α-NAGA)", que tem uma especificidade ao substrato diferente daquela de a- galactosidase mas que tem uma estrutura tri-dimensional muito similar àquela da α-galactosidase como um todo. Os presentes inventores têm encontrado que quando a especificidade do substrato de α-NAGA é convertida de forma que para ter atividade α-galactosidase por mudança na estrutura do sitio ativo de α-NAGA utilizando uma técnica de recombinação gênica, uma excelente nova enzima altamente funcional para tratar a doença de Fabry que pode ser utilizada para resolver os problemas acima pode ser criada. Este achado resultou na conclusão da presente invenção.

Mais especificamente, a presente invenção é como segue: (1) uma proteína que tem atividade a-galactosidase adquirida por mudança na estrutura do sítio ativo de a-N- acetilgalactosaminidase humana selvagem.

Um exemplo da proteína é uma proteína tendo a especificidade de substrato de a-galactosidase.

(2) Uma proteína tendo atividade a-galactosidase, a proteína sendo composta de uma seqüência aminoácida em que pelo menos um dos 188° aminoácido e o 191° aminoácido na seqüência aminoácida de α-Ν-acetilgalactosaminidase humana selvagem é substituída com outro aminoácido, ou uma seqüência aminoácida em que um ou vários aminoácidos exceto o 188° aminoácido e o 191° aminoácido incluiu a seqüência aminoácida substituída são apagadas, substituídas, ou adicionadas.

Um exemplo de proteína é uma proteína em que o 188° aminoácido é substituído com ácido glutâmico ou ácido aspártico na substituição com outro aminoácido.

Em adição, outro exemplo de proteína é uma proteína em que o 191° aminoácido é substituído com um selecionado do grupo consistindo de leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, e metionina na substituição com outro aminoacido.

Além disso, outro exemplo de proteína é uma proteína em que o 188° aminoácido é substituído com ácido glutâmico, e o 191° aminoácido é substituído com leucina na substituição com outro aminoácido.

(3) Uma proteína descrita por (a) ou (b) :

(a) uma proteína contendo qualquer uma das seqüências aminoácidas descritas por (i) ou (iii):

(i) uma seqüência aminoácida composta do 18° aminoácido para o 411° aminoácido incluído em uma seqüência aminoácida em que o 188° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que serina na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2;

(ii) uma seqüência aminoácida composta do 18° aminoácido a 411° aminoácido em uma seqüência aminoácida em que o 191° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que alanina na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2; e

(iii) uma seqüência aminoácida composta do 18° aminoácido a 411° aminoácido incluído em uma seqüência aminoácido em que o 188° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que serina e o 191° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que alanina na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2; ou

(b) uma proteína contendo uma seqüência aminoácida em que um ou vários aminoácidos outros que o aminoácida ou aminoácidos localizados no sítio de substituição ou sítios são apagados, substituídos, ou adicionados em qualquer uma das seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii), e tendo atividade α-galactosidase.

Um exemplo de proteína é uma proteína em que o aminoácido outro que serina é ácido glutâmico ou ácido aspártico.

Em adição, outro exemplo da proteína é uma proteína em que o aminoácido outro que alanina é uma selecionada do grupo consistindo de leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, e metionina.

Além disso, outro exemplo da proteína é uma proteína em que o aminoácido outro que serina é ácido glutâmico, e o aminoácido outro que alanina é leucina.

(4) um gene codificando a proteína de acordo com qualquer um dos itens (1) a (3).

(5) Um gene contendo DNA descrito por (a) ou (b) :

(a) DNA contendo qualquer uma das seqüências bases descritas por (i) a (iii):

(i) uma seqüência base composta da 52a a 1.236a bases inclusas em uma seqüência base em que as 562a a 564a bases são substituídas com bases representando um códon de aminoácido outro que serina na seqüência base mostrada na seqüência No. 1;

(ii) uma seqüência base composta das 52a a 1,236a bases inclusas na seqüência base em que as 571a a 573a bases são substituídas com bases representando um códon de um aminácido outro que alanina na seqüência base mostrada na seqüência No. 1; e

(iii) uma seqüência base composta de 52a a 1,236a bases inclusas em uma seqüência base em que 562a a 564a bases são substituídos com bases representando um códon de um aminoácido outro que serina e as 571a a 573a bases são substituídas com bases representando um códon de um aminoácido outro que alanina na seqüência base mostrada na seqüência No. 1; ou

(b) DNA que codifica uma proteína tendo atividade α-galactosidase e que hibridiza com DNA composto de uma seqüência base complementar ao DNA contendo qualquer uma das seqüências bases descritas por (i) a (iii) sob uma condição rigorosa, em que bases correspondentes às bases nos locais de substituição são idênticas às bases nos sítios de substituição.

Um exemplo do gene é um gene em que o aminoácido outro que serina é ácido glutâmico ou ácido aspártico.

Em adição, outro exemplo do gene é um gene em que o aminoácido outro que alanina é um selecionado do grupo consistindo de leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, e metionina.

Além disso, outro exemplo do gene é um gene em que o aminoácido outro que serina é ácido glutâmico, e o aminoácido outro que alanina é leucina.

(6) Um vetor recombinante contendo o gene de acordo com o item (4) ou (5).

(7) Um transformante contendo o vetor recombinante de acordo com o item (6).

(8) Um método de produzir uma proteína tendo uma atividade α-galactosidase, em que a estrutura do sítio ativo da α-Ν-acetilgalactosaminidase selvagem humana é mudada a fim de que o substrato de α-galactosidase pode ser ligado ao sitio ativo.

(9) Um método de produzir uma proteína tendo atividade α-galactosidase incluindo um passo de cultivar o transformante para o item (7), e um passo de coletar a proteína tendo atividade α-galactosidase do produto cultivado resultante.

(10) Uma composição farmacêutica contendo a proteína de acordo com qualquer um dos itens (1) a (3) .

(11) Um agente terapêutico para doença de Fabry contendo a composição farmacêutica de acordo com o item (10) como um ingrediente ativo.

(12) Uma composição farmacêutica contendo o gene de acordo com o item (4) ou (5).

(13) Um agente terapêutico gênico para doença de Fabry contendo a composição farmacêutica de acordo com o item (12) como um ingrediente ativo.

(14) Um método de tratar doença de Fabry, em que a composição farmacêutica de acordo com o item (10) ou (12) é administrado a um paciente Fabry.

Breve Descrição dos Desenhos

Fig. 1 inclui visões esquemáticas mostrando as estruturas gerais tridimensionais de uma subunidade da a-GAL selvagem e uma subunidade de α-NAGA selvagem.

Fig. 2A inclui visões esquemáticas mostrando as estruturas do sítio ativo da α-GAL selvagem e o sítio ativo da α-NAGA selvagem. Note que os aminoácidos (mostrado por um modelo bastão (exceto um substrato)) mostrado na figura são o mesmo tipo de aminoácidos no caso onde a seqüência aminoácida do sitio ativo da α-GAL selvagem é comparada com aquele da α-NAGA selvagem.

Fig. 2B inclui visões esquemáticas mostrando as estruturas do sitio ativo da α-GAL selvagem e o sitio ativo da α-NAGA selvagem. Note que os aminoácidos (mostrado por um modelo bastão (exceto um substrato)) mostrado na figura são diferentes tipos de aminoácidos no caso onde a seqüência aminoácida do sitio ativo da α-GAL selvagem é comparada com aquele da α-NAGA selvagem.

Fig. 2C inclui visões esquemáticas mostrando aminoácidos constituindo o sitio ativo de α-GAL e aminoácidos constituindo o sitio ativo da α-NAGA selvagem, e sítios de interação dos aminoácidos com um substrato.

Fig. 3 inclui visões esquemáticas mostrando a comparação entre o número de sítios de N-glicosilação e locações dos mesmos na subunidade da α-GAL selvagem e aquelas na subunidade da α-NAGA selvagem.

Fig. 4 incluir visões esquemáticas em que os sítios de N-glicosilação (mostrado por um modelo bastão (exceto um substrato)) nas subunidades da α-GAL selvagem e α-NAGA selvagem são mostrados nas estruturas tridimensionais das subunidades.

Fig. 5 é um gráfico mostrando os resultados obtidos por comparação da estabilidade de α-GAL no sangue com de um mutante α-NAGA com tempo na base da proporção residual da atividade α-GAL. Fig. 6 (a) é um visão esquemática mostrando um estado em que α-NAGA selvagem é ligada a um substrato de a- NAGA, e Fig. 6 (b) é uma visão esquemática mostrando um estado em que α-NAGA (S188E/A191L), que é um α-NAGA mutante, é ligada a um substrato de a-GAL.

Fig. 7 inclui visões esquemáticas mostrando as estruturas do sítio ativo da α-NAGA selvagem e o sítio ativo de α-NAGA (S188E/A191L), que é um mutante α-NAGA.

Melhores Formas para Realizar a Invenção

A presente invenção será agora descrita em detalhe, mas o objetivo da presente invenção não é restrito pelas descrições abaixo. Em adição as exemplificações descritas abaixo, várias modificações podem ser feitas a presente invenção sem se afastar do propósito da presente invenção.

Esta descrição inclui a totalidade da especificação do Pedido de Patente Japonês No. 2005-333660, que reivindica a prioridade deste pedido. Em adição, todas as publicações, por exemplo, antes dos documentos técnicos, publicações de pedido de patentes não examinados, publicações de patente, e outros documentos de patente citados nesta descrição são incorporados nesta descrição como referências.

1.Resumo da presente invenção

A presente invenção provê uma proteína recombinante servindo como uma excelente nova enzima altamente funcional que pode ser utilizada para terapia de substituição enzimática para doença de Fabry. Para existir agentes enzimáticos utilizados na substituição enzimática para tratamento da doença de Fabry, α-galactosidase humana recombinante produzida em uma célula derivada de mamíferos, tais como (ovário de hamster Chinês) células CHO ou um fibroblasto humano, é utilizado. Entretanto, o uso da α-galactosidase recombinante humana causa problemas tais como efeitos colaterais adversos alérgicos, instabilidade no sangue, e baixa eficiência de incorporação em uma célula de um órgão afetado, e então colocar uma grande dificuldade em pacientes na terapia atual. Conseqüentemente, umas soluções para esses problemas têm sido desejadas.

A fim de resolver esses problemas, os presentes inventores estudaram se ou não uma enzima outra que a a- galactosidase (α-GAL) pode ser utilizada como uma enzima utilizada na substituição enzimática para tratar a doença de Fabry. Especificamente, os presentes inventores focaram na "a-N-acetilgalactosaminidase (α-NAGA)", que é uma enzima lisossomal similarmente a α-GAL (que é, a localização da a- NAGA em uma célula sendo a mesma que de α-GAL) , que tem um substrato especificamente diferente daquele de α-GAL, mas que tem uma estrutura tri-dimensional muito similar aquela de α-GAL como um todo.

α-GAL utilizado para ser chamado de a- galactosidase A. Foi acreditado que uma isozima chamada de α-galactosidase B tendo propriedades bioquímicas que são muito similares àquelas da α-GAL existente. Foi conhecido que α-galactosidase B tem estabilidade mais alto que aquela de a-GAL, mas não tem a habilidade de decompor globotriaosilceramida, que é acumulada no corpo por doença de Fabry. Subseqüentemente, se torna claro que a- galactosidase B é atualmente α-Ν-acetilgalactosaminidase (a- NAGA) . É bem conhecido que a-NAGA é codificado por um gene que é considerado ser derivado do mesmo gene ancestral como que de um gene codificando α-GAL. 0 cDNA do mesmo tem sido clonado, e é conhecido que o gene codifica uma proteína composta de 411 resíduos aminoácidos contendo um peptídeo sinal composto de 17 resíduos aminoácidos. Em adição, quando a estrutura da α-NAGA humana é comparada com aquela da α-GAL humana, a estrutura da· α-NAGA humana tem a homologia de 57,9% em termos do nível de seqüência base, e 52,2% em termos do nível da seqüência aminoácida. Além disso, como uma α-GAL humana, α-NAGA humano é uma enzima que existe na forma de um homodímero.

Na base do conhecimento acima, os presentes inventores primeiro construíram três modelos estruturais tridimensionais de α-NAGA e α-GAL, e comparada às estruturas.

Mais especificamente, um modelo estrutural tri- dimensional da α-NAGA humana foi construído com referência a informação estrutural da α-NAGA de galinha (ID:1KTC) registrada no Banco de Dado de Proteína (PDB (http://www.rcsb.orq/pdb/), e esta estrutura foi comparada com a estrutura tri-dimensional da α-Gal humana (ID:1R47) registrado em PDB. Como um resultado, foi encontrado que a estrutura tri-dimensional da α-NAGA humana foi muito similar para a estrutura tridimensional da α-Gal humana em termos de ambos, a estrutura inteira e o sitio ativo. Relativo ao sitio ativo, para ser exato, somente uns poucos resíduos aminoácidos são diferentes de cada outra. Entretanto, entre esses resíduos aminoácidos, existem resíduos, aminoácidos importantes que estão presentes em um sítio de ligação- substrato e que afeta a diferença entre a especificidade ao substrato de α-GAL e a especificidade do substrato de a- NAGA. Foi encontrado que, neste respeito, há uma diferença significante na estrutura tri-dimensional entre o sítio ativo da α-GAL e o sítio ativo de a-NAGA.

Então, α-NAGA é uma enzima que difere de α-GAL na estrutura de uma parte do sítio de ligação-substrato no sítio de ativo, mas é muito similar a α-GAL em termos da estrutura e em termos de propriedades com respeito às outras partes incluindo o sítio catalítico (refere-se a Figs. 1, 2A, e 2B) . Dessa forma, o mecanismo de reação catalítico de α-NAGA é muito similar ao mecanismo de reação catalítico de α-GAL em termos de, por exemplo, os tipos de reação de substrato utilizados e produto de reação produzido.

Conseqüentemente, como descrito acima, os presentes inventores focaram na α-NAGA e encontraram que quando a especificidade do substrato da α-NAGA é modificada a fim de ter atividade α-galactosidase por mudar a estrutura do sítio ativo (em particular, o sítio de ligação-substrato) por manipulação gênica de α-NAGA (por exemplo, quando, entre resíduos aminoácidos relacionados ao reconhecimento do substrato da α-NAGA, resíduos aminoácidos chaves são mudadas de resíduos aminoácidos do tipo α-NAGA para resíduos aminoácidos do tipo α-GAL), uma excelente nova enzima altamente funcional para tratar doença de Fabry pode ser criada.

As reações porque os presentes inventores focaram em α-NAGA ainda incluem os seguintes pontos (i) a (iii):

(i) α-NAGA é a enzima responsável da doença Shindler e doença de Kanzaki (note que uma doença que desenvolve devido a anormalidade da mesma enzima como uma enzima que desenvolve doença de Shindler e que tem um fenótipo clínico diferente daquele de doença de Shindler é chamado doença de Kanzaki), e deficiência de α-NAGA é uma causa de desenvolvimento da doença de Shindler e doença de Kanzaki. Em geral, entretanto, o desenvolvimento da doença de Shindler e doença de Kanzaki é muito raro mesmo em pacientes de Fabry.

Conseqüentemente, quase todos os pacientes Fabry têm α-NAGA normalmente. Assim, é acreditado que mesmo quando uma proteína em que somente a especificidade do substrato de α-NAGA é modificada na especificidade de substrato de a-GAL é administrada como um agente enzimático utilizado na substituição enzimática, a antigenicidade do mesmo raramente aparece como no caso onde α-NAGA selvagem é administrada, e então não existe nenhuma probabilidade substancial que uma reação adversa imune tal como o efeito colateral alérgico ser induzido.

(ii) α-NAGA também funciona na forma de um homodímero similarmente ao α-GAL, mas em geral, a estabilidade na forma dimera de α-NAGA é mais alta que de a- GAL. 0 modelo estrutural tri-dimensional construído pelos presentes inventores também suporta esta estabilidade. Especificamente, foi confirmado que, no dímero de a-NAGA humana, duas ligações devido a interação eletroestática foram observadas entre Asp45 e Arg350 em duas subunidades, enquanto tais ligações não forma observadas em a-GAL. Conseqüentemente, é acreditada que, como em α-NAGA, um mutante α-NAGA também tem alta estabilidade no sangue (no plasma), comparado com α-GAL, e é muito adequado para terapia de substituição enzimática. Em adição, se a proporção dimera existente é aumentada por causa da estabilidade acima, é esperado que a eficiência da incorporação em um lisossomo em uma célula é também aumentada na relação ao ponto (iii) acima. Além disso, é vantajoso que, antes da administração, o efeito pode ser mantido como uma preparação enzimática para um longo período.

(iii) É necessário que uma enzima utilizada na terapia de substituição enzimática seja incorporada em um lisossomo em uma célula de um órgão afetado. Em geral, o transporte de uma membrana celular para um lisossomo é feito através de um receptor M6P independente de cálcio, que reconhece manose-6-fosfato (M6P) presente em porções de cadeia de açúcar da enzima. Conseqüentemente, uma enzima tendo um grande número de cadeias de açúcar (cadeias de açúcar do tipo N) ao qual o resíduo do resíduo M6P pode ser ligado é preferível porque uma alta eficiência de incorporação em um lisossomo pode ser alcançada. Com respeito ao número das cadeias de açúcar acima, se tornou claro que, a partir da análise da estrutura cristal do raio X, em α-GAL, três cadeias de açúcar por subunidade (três locações de Asnl39, Asnl92, e Asn215; seis cadeias de açúcar no caso onde um dimero é formado) estão presentes. Em contraste, em α-NAGA, cinco cadeias de açúcar por subunidade (dez cadeias de açúcar no caso onde um dimero é formado) estão presentes (refere-se a Figs. 3 e 4). Entre essas cadeias de açúcar, três cadeias de açúcar (três locações de Asnl24, Asnl77, e Asn201) correspondem às locações das cadeias de açúcar em α-GAL, e duas outras cadeias de açúcar (duas locações de Asn359 e Asn385) são especificas para a- NAGA. Conseqüentemente, é acreditado que α-NAGA é tomado do sangue e incorporado em um lisossomo em uma célula de um órgão afetado em uma eficiência mais alta que aquela no caso de a-GAL.

Dos pontos de vistas acima, os presentes inventores focaram no 188° aminoácido (serina (Ser)) e 191° aminoácido (Ala (alanina)) entre o grupo resíduo aminoácido constituindo o sítio ligante de substrato da α-NAGA. Os presentes inventores preparam uma enzima recombinante (enzima mutante) em que a 188a serina (Ser) é substituída com ácido glutâmico (Glu) e a 191a alanina é substituída com leucina (Leu) (refere-se aos Exemplos 1 e 2) . Subseqüentemente, esta enzima recombinante foi expressa utilizando um fibroblasto derivado de um paciente Fabry, coletado, e analisado. Como um resultado, alta atividade a- GAL foi observada (refere-se ao Exemplo 2). Em adição, a estabilidade desta enzima recombinante no sangue foi significantemente mais lata que aquela de α-GAL selvagem (refere-se ao Exemplo 2 e Fig. 5). Pelo uso tal como enzima recombinante tendo uma especificidade de substrato modificada, um agente enzimático utilizado na substituição enzimática para tratar Doença de Fabry que é superior a existência de agentes enzimáticos podem ser providos.

Note que, nesta descrição, a menos que de outra forma declarada, os termos "α-galactosidase" e "a-GAL" significa "α-galactosidase A humana", e os termos "a-N- acetilgalactosaminidase" e "a'NAGA" significa "a-N- acetilgalactosaminidase humana". As ordens "o 188°" e "o 191°" representa locações baseadas na seqüência aminoácida de α-NAGA mostrada na seqüência No. 2.

2. Proteína

Uma proteína da presente invenção é uma enzima mutante de α-Ν-acetilgalactosaminidase (α-NAGA). Mais especificamente, a proteína da presente invenção é uma proteína que tem adquirido atividade α-galactosidase (a-GAL) por mudar a estrutura do sítio ativo (em particular, o sítio ligante do substrato) da α-NAGA selvagem, e preferivelmente, uma proteína tendo a especificidade do substrato de a-GAL.

Aqui, a frase "tem adquirido atividade a-GAL" significa que, no sítio de ligação do substrato de α-NAGA, a reatividade de ligação para um substrato de α-GAL se torna relativamente mais alto que a reatividade de ligação a um substrato de α-NAGA. Conseqüentemente, a mudança estrutural acima não é limitada a uma mudança estrutural que a faz impossível para α-NAGA para ligar com o substrato de a-NAGA. Alternativamente, a mudança estrutural pode ser uma mudança estrutural que faz a reatividade ligante para o substrato de α-GAL signif icantemente mais alto que a reatividade de ligação ao substrato de α-NAGA, que tem originalmente sido relativamente significantemente mais alto que a reatividade de ligação ao substrato de α-GAL. Além disso, a frase "tendo a especificidade de substrato de α-GAL" significa que a estrutura (em particular, as posições e os tipos de resíduos aminoácidos que desempenham um papel importante na reatividade de ligação a um substrato) do sítio ativo da proteína na mesma como aquela de α-GAL.

Na presente invenção, o termo "substrato de α-GAL" significa um composto natural tal como um glicolipídeo, por exemplo, globotriaosilceramida, que tem um resíduo de galactose ligado a terminação não redutora por ligação a, ou um composto sintético, por exemplo, 4-metilumbeliferil-a-D- galactosideo. 0 termo "substrato de α-NAGA' significa um composto natural tal como um oligossacarídeo, glicoproteína, ou glicolipídeo tendo um resíduo N-acetilgalacto.samina ligada a terminação não redutora pela ligação a, ou um composto sintético, por exemplo, 4-metilumbeliferil-a-N- acetil-D-galactosaminida.

Aqui, uma reação catalítica de α-GAL selvagem é mostrada pela reação de fórmula (1), e uma reação catalítica de α-NAGA selvagem é mostrada pela reação de fórmula (2). <formula>formula see original document page 22</formula>

[Na fórmula (1), quando o substrato é um composto natural, R1 representa "um grupo derivado de um açúcar complexo", e quando o substrato é um composto sintético, R1 representa "um grupo 4-metilumbeliferil".]

<formula>formula see original document page 22</formula>

[Na fórmula (2) , quando o substrato é um composto natural, R2 representa "um grupo derivado de um complexo açúcar", e quando o substrato é um composto sintético, R2

representa "um grupo 4-metilumbeliferil".] Exemplos da proteína da presente invenção preferivelmente incluem proteínas que são compostas de uma seqüência aminoácida em que pelo menos um do 188° aminoácido e 191° aminoácido incluso na seqüência aminoácida de a-NAGA selvagem é substituído com outro aminoácido (mais preferivelmente, uma seqüência aminoácida em que ambos, 188° aminoácido e 191° aminoácido são substituídos com outros aminoácidos) ou uma seqüência aminoácida em que um ou vários aminoácidos exceto o 188° aminoácido e o 191° aminoácido incluiu na seqüência aminoácida acima são apagadas, substituídas, ou adicionadas e que têm atividade a-GAL. Informação na seqüência aminoácida (seqüência No. 2) da subunidade da α-NAGA selvagem (homodímero) e informação na seqüência base (seqüência No. 1) codificando a seqüência aminoácida acima são publicados, por exemplo, como "número de acesso: NA_000262" em GenBank, e registrada como "nome de entrada:NAGAB_HUMAN", número de acesso: P17050" em Swiss- Prot (disponível em http://tw.expasy.org/uniprot/) .

Similarmente, informação na seqüência aminoácida (seqüência No. 13) da subunidade da α-GAL selvagem (homodímero) e informação na seqüência base (seqüência No. 12) codificando a seqüência aminoácida são publicadas, por exemplo, como "número de acesso: NP_000160" no GenBank, e registrado como "nome de entrada: AGAL_HUMAN", número de acesso: P06280" em Swiss-Prot (disponível em http://tw.expasy.org/uniprot/) .

Aqui, exemplos da "seqüência aminoácida em que um ou vários aminoácidos são apagados, substituídos, ou adicionados" acima preferivelmente incluíram seqüências aminoácidas em que cerca de um a dez aminoácidos, e preferivelmente cerca de um a cinco aminoácidos são apagados, substituídos ou adicionados.

Além disso, com respeito "a proteína composta de uma seqüência aminoácida em que um ou vários aminoácidos são apagados, substituídos ou adicionados", é importante que a proteína pode estavelmente exibir atividade α-GAL. Dessa forma, por exemplo, todos dos ou alguns dos (preferivelmente, todos dos) os 28° a 31° aminoácido, o 77° a 81° aminoácido, o 117° a 127° aminoácido, o 150° a 158° aminoácido, o 192° aminoácido, o 209° a 220° aminoácidos, e a 242° a 254° aminoácidos (em particular, o 156° a 217° ácidos aspárticos (Asp: D)), todos dos quais é acreditado serem importantes para o desempenho da ligação (desempenho de ligação ao substrato) com um resíduo α-galactose em um substrato de α-GAL e a reatividade catalítica para o substrato; o 45° ácido aspártico (Asp: D) e a 350a arginina (Arg: R) , ambos dos quais é acreditado serem importantes para formar um homodímero; e os 124°, 177°, 201°, 359°, e 385° aminoácidos (todos dos quais sendo asparagina (Asn: N) ) , todos dos quais são sítios de ligação de cadeia de açúcar do tipo N, são preferivelmente aminoácidos que não são mutados (apagados, substituídos, ou adicionados) a partir da seqüência aminoácida da α-NAGA selvagem.

Com respeito ao 188° resíduo aminoácido, o outro resíduo aminoácido alternativo não é particularmente limitado enquanto o resíduo aminoácido não é serina (Ser: S) . Por exemplo, ácido glutâmico (Glu: E) e ácido aspártico (Asp: D) sao preferíveis, e ácido glutâmico é mais preferível. Similarmente, com respeito ao 191° resíduo aminoácido, o outro resíduo aminoácido alternativo não é particularmente limitado contanto que o resíduo aminoácido não seja alanina (Ala: A).

Por exemplo, leucina (Leu: L) , valina (Vai: V) , isoleucina (lie: I), fenilalanina (Phe: F) , e metionina (Met: M) são preferíveis, e leucina é mais preferível.

Particularmente preferível, entre esses, como os aminoácidos alternativos, o 188° aminoácido é ácido glutâmico e o 191° aminoácido é leucina. Note que preferivelmente, os aminoácidos após a substituição não afetam substancialmente a estrutura composta de outros aminoácidos que não são substituídos. A partir deste ponto de vista, o 188° resíduo aminoácido é ácido glutâmico e o 191° resíduo aminoácido é leucina.

Por substituindo o 188° aminoácido e o 191° aminoácido, ambos dos quais estão presentes no sítio de ligação do substrato, como descrito acima, os efeitos seguintes podem ser alcançados. Especificamente, como exemplificado na Fig. 6, com respeito ao 188° resíduo aminoácido, a interação com o grupo N-acetil (em particular, o átomo de oxigênio) no substrato de α-NAGA pode ser removida, e em adição, uma ação de ligação com o grupo hidroxil no substrato de α-GAL pode ser gerado. Com respeito ao 191° resíduo aminoácido, a interação com o grupo N-acetil (em particular, o grupo metil) no substrato de α-NAGA pode ser removido, e em adição, o espaço de ligação do substrato (em particular, o espaço em que o grupo N-acetil é tomado) pode ser restrito. Como um resultado, a enzima recombinante (proteína recombinante) obtida após a substituição dos aminoácidos tem uma reatividade de ligação para o substrato de α-GAL mais alto que a reatividade de ligação para o substrato de α-NAGA, e então pode ser uma enzima tendo atividade α-GAL significantemente mais alta que a atividade α-NAGA. Pelo menos a enzima recombinante tendo uma seqüência aminoácida em que o 188° aminoácido (serina) é substituído com ácido glutâmico e o 191° aminoácido (alanina) é substituído com leucina é particularmente preferível a partir do ponto de vista que os efeitos acima descritos podem ser satisfatoriamente alcançados.

Em adição, a proteína da presente invenção é preferivelmente uma proteína descrita por (a) ou (b) :

(a) uma proteína contendo qualquer uma das seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii):

(i) uma seqüência aminoácida composta do 18° aminoácido ao 411° aminoácido incluído em uma seqüência aminoácida em que o 188° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que serina na seqüência aminoácida em seqüência No. 2;

(ii) uma seqüência aminoácida composta do 18° aminoácido ao 411° aminoácido incluído em uma seqüência aminoácida em que o 191° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que alanina na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2; e

(iii) uma seqüência aminoácida composta do 18° aminoácido ao 411° aminoácido incluído em uma seqüência aminoácida em que o 188° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que serina e o 191° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que alanina na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2; ou

(b) uma proteína contendo uma seqüência aminoácida em que um ou vários aminoácidos outros que o aminoácido ou aminoácidos localizados no sítio ou sítios de substituição são apagados, substituídos, ou adicionados em qualquer uma das seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii), e tendo atividade α-galactosidase.

A seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2 é uma seqüência aminoácida composta de 411 aminoácidos constituindo α-NAGA selvagem.

Especificamente, a proteína descrita por (a) é uma proteína composta de uma seqüência aminoácida contendo uma seqüência aminoácida variando do 18° aminoácido ao 411° aminoácido excluindo o Io aminoácido ao 17° aminoácido, que constituem o peptídeo sinal da α-NAGA selvagem, incluído em uma seqüência aminoácida em que pelo menos um aminoácido é substituído como descrito em (i) a (iii) na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2. Como descrito acima, cada um do 188° resíduo aminoácido e o 191° resíduo aminoácido é um dos aminoácidos constituindo o sítio de ligação de substrato.

Aqui, um exemplo preferível da seqüência aminoácida contendo uma seqüência aminoácida variando do 18° aminoácido ao 411° aminoácido é uma seqüência aminoácida em que um peptideo sinal esta ligado ao N-terminal da seqüência aminoácida variando do 18° aminoácido ao 411° aminoácido. 0 peptideo sinal não é limitado enquanto o peptideo sinal pode permitir a proteína passar através da membrana da célula de um órgão afetado. Por exemplo, um peptideo sinal de uma enzima lisossomal tal como α-NAGA selvagem ou a-GAL selvagem, ou um peptideo sinal de uma secretase tal como preprotripsina é preferível. 0 peptideo sinal da a-NAGA selvagem ou α-GAL selvagem é mais preferível. 0 peptideo sinal da α-NAGA selvagem é um peptideo composto do Io aminoácido ao 17° aminoácido incluído na seqüência aminoácida da α-NAGA selvagem mostrada na seqüência No. 2. 0 peptideo sinal da α-GAL selvagem é um peptideo composto do Io aminoácido ao 31° aminoácido incluído na seqüência aminoácida da α-GAL selvagem mostrada na seqüência No. 13. 0 peptideo sinal da preprotripsina é um peptideo composto da seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 15.

Como a proteína descrita por (a), entre as proteínas contendo uma seqüência aminoácida descrita por (i), (ii), ou (iii), uma proteína contendo a seqüência aminoácida descrita por (iii) é particularmente preferível.

Um exemplo preferível da proteína descrita por (a) é uma proteína em que "o aminoácido outro que serina" descrito em (i) e (iii) é ácido glutâmico ou ácido aspártico. Similarmente, outros exemplos preferíveis da proteína descrita por (a) é uma proteína em que "o aminoácido outro que alanina" descrito em (ii) e (iii) é um selecionado do grupo consistindo de leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, e metionina.

Além disso, um exemplo particularmente preferível da proteína descrita por (a) é uma proteína em que "o aminoácido outro que serina" descrito em (i) a (iii) é ácido glutâmico e "o aminoácido outro que alanina" descrito em (i) a (iii) é leucina. Um exemplo preferível da proteína é uma proteína (α-NAGA (S188E/A191L)) em que, na seqüência aminoácida da α-NAGA selvagem (seqüência No. 2), o 188° serina é substituído com ácido glutâmico e o 191° alanina é substituído com leucina (refere-se a Fig. 7 e seqüência No. 4). Em geral, com respeito a notação alfabética de aminoácidos, um aminoácido é denotado por três letras (por exempo, "Ser") ou uma letra (por exemplo, "S") . A letra do alfabeto localizada antes de um número (por exemplo, "188") representando a locação de um aminoácido do N-terminal representa notação um-último de um aminoácido antes substituído, e a letra do alfabeto localizada após o número representa uma notação de uma letra de um aminoácido após a substituição. Conseqüentemente, a notação "S188E" representa o caso onde o 188° Ser é substituído com Glu.

A proteína descrita por (b) não é limitada desde que a proteína contenha uma seqüência aminoácida em que um ou vários (por exemplo, cerca de um a dez, e preferivelmente, cerca de um a cinco) aminoácidos outros que o aminoácido ou aminoácidos localizados no sítio ou sítios de substituição são apagados, substituídos, ou adicionados em qualquer uma das seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii) incluídos na proteína descrita por (a), e tem atividade α-galactosidase. Aqui, o termo "o sitio de substituição" significa, entre os 394 resíduos aminoácidos constituindo as seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii), o resíduo aminoácido correspondente a locação do 188° aminoácido na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2 (entretanto, a seqüência aminoácida sendo limitada a seqüência aminoácida descrita por (i) ou (iii) ), e o resíduo aminoácido descrito por (i) ou (iii) ), e o resíduo aminoácido correspondente a locação do 191° aminoácido na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2 (entretanto, a seqüência aminoácida sendo limitada a seqüência aminoácida descrita por (ii) ou (iii)), Mais especificamente, o resíduo aminoácido formar significa o 171° resíduo aminoácido na seqüência aminoácida descrita por (i) ou (iii), e o resíduo aminoácido último significa o 174° resíduo aminoácido na seqüência aminoácida descrita por (ii) ou (iii).

Note que é importante que a proteína descrita por (b) é uma proteína que pode estavelmente exibir atividade a- GAL. Então, por exemplo, resíduos aminoácidos que são acreditados ser importantes para desempenho de ligação (desempenho de ligação a substrato) com um resíduo a- galactose em um substrato de α-GAL e a reatividade catalítica ao substrato são preferivelmente resíduos aminoácidos que não são mutados (apagados, substituídos, ou adicionados) a partir das seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii). Exemplos preferíveis de resíduos aminoácidos incluem, entre os resíduos aminoácidos constituindo as seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii), resíduos aminoácidos correspondendo as ligações dos 28° a 31° aminoácidos, os 77° a 81° aminoácidos, os 117° a 127° aminoácidos, os 150° a 158° aminoácidos, o 192° aminoácidos, os 209° a 220° aminoácidos, e os 242° a 254° aminoácidos (em particular, os 156° e 217° ácido aspárticos (Asp: D) ) na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2.

Similarmente, resíduos aminoácidos que são acreditados ser importantes para formar um homodímero são também preferivelmente resíduos aminoácidos que são não mutadas (apagadas, substituídas, ou adicionadas) a partir das seqüências aminoácidas por (i) a (iii). Exemplos preferíveis dos resíduos aminoácidos incluem, entre os resíduos aminoácidos constituindo as seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii), resíduos aminoácidos correspondendo a locações do 45° aminoácido e o 350° aminoácido (especificamente, o 45° ácido aspártico (Asp: D) e o 350° arginina (Arg: R) na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2.

Além disso, resíduos aminoácidos que são sítios de ligação de cadeia de açúcar do tipo N são também preferivelmente resíduos aminoácidos que não são mutados (apagados, substituídos, ou adicionados) a partir das seqüências aminoácidas por (i) a (iii). Exemplos preferíveis de resíduos aminoácidos incluem, seqüências descritas por (i) a (iii), resíduos aminoácidos correspondendo às locações dos 124°, 177°, 201°, 359°, e 385° aminoácidos (todos dos quais sendo asparagina (Asn: N)) na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2.

Na presente invenção, a atividade α-GAL pode ser medida como segue. Por exemplo, uma proteína alvo é permitida ser expressa com uma célula derivada de mamíferos, tais como célula CHO ou um fibroblasto humano, e é coletado.

A proteína (solução enzimática) é então misturada com 4- metilumbeliferil-a-D-galactosideo (um substrato sintético obtido da α-D-galactose e 4-metilumbeliferona (substrato fluorogênico)), e a mistura é permitida reagir sob uma condição acídica. Neste caso, a quantidade de 4- metilumbeliferona liberada por uma unidade quantitativa da solução enzimática por unidade de tempo é detectada para medir a atividade a-GAL.

Atividade α-NAGA podem também ser medida como na atividade α-GAL. Uma proteína alvo é permitida ser expressa e é coletada. A proteína (solução enzimática) é então misturada com 4-metilumbeliferil-a-N-acetil-D- galactosaminida (um substrato sintético obtido de a-N- acetil-D-galactosamina e 4-metilumbeliferona (substrato fluorogênico)), e a mistura é permitida reagir sob uma condição acídica. Neste caso, a quantidade de 4- metilumbeliferona que pode ser liberada por unidade de tempo por uma unidade quantitativa da solução enzimática é detectada para medir a atividade a-NAGA.

Nos métodos acima de medir atividade α-GAL e atividade α-NAGA, vários tipos de métodos de detecção conhecidos podem ser empregados para detectar o substrato fluorogênico. Por exemplo, um método de detecção utilizando um fluorfotômetro ou semelhante é preferível. A proteína alvo pode ser expressa por incorporação de um gene codificando a proteína em um vetor de expressão conhecido ou semelhante, e então introduzindo o vetor em uma célula. Como os métodos de medida, especificamente, os métodos descritos no Exemplo 3 e Exemplo 4 abaixo podem ser preferivelmente exemplificados.

3. Gene recombinante

Exemplos preferíveis de um gene codificando a proteína descrita acima da presente invenção incluem, mas não são limitados a, genes contendo DNA descrito por (a) ou (b)abaixo. Os DNAs descritos por (a) e (b) são preferivelmente genes estruturais da proteína da presente invenção. O gene contendo qualguer desses DNAs podem totalmente se constituir de DNA. Alternativamente, o gene pode conter o DNA como uma parte do mesmo e pode ainda conter outras seqüências bases conhecidas (tal como um promotor transcricional, a seqüência SD, a seqüência Kozak, e um terminador) requeridas para expressão gênica. Então, o gene não é limitado ao mesmo.

(a) DNA contendo qualquer uma das seqüências de bases descritas por (i) a (iii);

(i) uma seqüência base composta das 52a a 1, 236a bases incluídas em uma seqüência base em que as 562a a 564a bases "age" são substituídos com bases representando um códon de um aminoácido outro que serina na seqüência base mostrada na seqüência No. 1; (ii) uma seqüência base composta das 52a a 1,236a bases incluídas em uma seqüência base em que as 571a a 573a bases "gcc" são substituídas com bases representando um códon de um outro aminoácido que alanina na seqüência base mostrada na seqüência No. 1; e

(iii) uma seqüência base composta das 52a a 1,236a bases incluídas em uma seqüência base em que a 562a a 564a bases "agc" são substituídas com bases representando um códon do aminoácido outro que serina e as 571a a 573a bases são substituídas com bases representando um códon de um aminoácido outro que alanina na seqüência base mostrada na seqüência No. 1; ou

(b) DNA que codifica uma proteína tendo atividade α-galactosidase e que hibridiza com DNA composto de uma seqüência de base complementar ao DNA contendo qualquer uma das seqüências de base descritas por (i) a (iii) sob uma condição rigorosa, em que bases correspondentes às bases nos sítios de substituição descritos acima são idênticas às bases nos sítios de substituição.

Na presente invenção, o termo "códon" significa não somente a ligação tripla da base (triplete) da seqüência de RNA após transcrição, mas também a ligação tripla da base de uma seqüência de DNA. Conseqüentemente, códons de uma seqüência de DNA são denotados utilizando timina (T) ao invés de uracila (U) .

A seqüência base mostrada na seqüência No. 1 é uma seqüência base composta de 1,236 bases codificando α-NAGA selvagem. Mais especificamente, o DNA descrito por (a) é DNA composto de uma seqüência base contendo uma seqüência base variando da 52a base a 1,236a base excluindo a Ia base a 51a base, que codifica um peptideo sinal da α-NAGA selvagem, em uma seqüência base em que bases são substituídas como descrito em (i) a (iii) na seqüência base mostrada na seqüência No. 1.

Aqui, um exemplo preferível da seqüência base contendo uma seqüência base variando da 52a base a 1,236a base é uma seqüência base em que uma seqüência base (polinucleotídeo) codificando um peptideo sinal está ligado ao lado 5' da seqüência base variando da 52a base a 1,236a base. 0 peptideo sinal não é limitado desde que o peptideo sinal pode permitir a proteína passar através de uma membrana celular de um órgão afetado. Por exemplo, um peptideo sinal de uma enzima lisossomal tal como a-NAGA selvagem ou α-GAL selvagem, ou um peptideo sinal de uma secretase tal como preprotripsina é preferível. Um peptideo sinal da α-NAGA selvagem ou α-GAL selvagem é mais preferível. Uma seqüência base codificando o peptideo sinal da α-NAGA selvagem é uma seqüência base composta da Ia base a 51a base na seqüência base da α-NAGA selvagem na seqüência No. 1. Uma seqüência base codificando o peptideo sinal da α-GAL selvagem é uma seqüência base composta da Ia base a 93a base na seqüência base da α-GAL selvagem mostrada na seqüência No. 12. Uma seqüência base codificando o peptideo sinal da preprotripsina é uma seqüência base mostrada na seqüência No. 14. Como o DNA descrito por (a), entre os DNAs contendo a seqüência base descrita por (i), (ii), ou (iii) , contendo DNA a seqüência base descrita por (iii) é particularmente preferível.

Em adição, como o DNA descrito por (a), DNA em que "as bases representando um códon de um aminoácido outro que serina" descrita em (i) e (iii) são bases representando um códon de ácido glutâmico ou ácido aspártico é preferível. Similarmente, como o DNA descrito por (a) , DNA em que "as bases representando um códon de um aminoácido outro que serina" descrito em (i) e (iii) são bases representando um códon de ácido glutâmico ou ácido aspártico é preferível. Similarmente, como o DNA descrito por (a) , DNA em que "as bases representando um códon de um aminoácido outro que alanina" descrito em (ii) e (iii) são bases representando um códon de um selecionado do grupo consistindo de leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, e metionina é também preferível. Aqui, com respeito as bases representando um códon de cada dos aminoácidos acima (em que a base disposta na terminação esquerda é definida como uma base na lateral 5'), bases representando um códon de ácido glutâmico são "gag" ou "gaa" (preferivelmente "gag"), e bases representando um códon de ácido aspártico são "gat" ou "gac". Similarmente, bases representando um códon de leücina são "ctc", "ctt", "cta", ou "ctg" (preferivelmente "ctc"), bases representando um códon de valina são "gtt", "gtc", "gta", ou "gtg", bases representando um códon de isoleucina são "att", "ate", ou "ata", bases representando um códon de fenilalanina são "ttt" ou "ttc", e bases representando um códon de metionina são "atg". Bases representando um códon de serina incluem "agt" na sadição a "age" acima mencionada. Bases representando um códon de alanina incluem "gct", "gea", e "gcg" em adição a "gcc" acima mencionada.

Além disso, como o DNA descrito por (a) acima, DNA em que "as bases representando um códon de um aminoácido outro que serina" descrito em (i) a (iii) são bases representando um códon de ácido glutâmico, e "as bases representando um códon de um aminoácido outro que alanina" descrita em (i) a (iii) são bases representando um códon de leucina é particularmente preferível. Um exemplo preferível de tal DNA é DNA composto de uma seqüência base (seqüência No. 3) em que as 562a a 564a bases, que são bases representando um códon de serina, incluído na seqüência base de α-NAGA selvagem (seqüência No. 1) são substituídas com bases representando um códon de ácido glutâmico ("age" —» "gag") , e as 571a a 573a bases, que são bases representando um códon de alanina, incluída na seqüência base da a-NAGA selvagem (seqüência No. 1) são substituídas com bases representando um códon de leucina ("gcc" "ctc"). Nesta exemplificação, as 562a a 564a bases após substituição não são limitados a "gag" mencionada acima e podem outras bases desde que as bases representam um códon de ácido glutâmico.

Similarmente, a 571a a 573a bases após substituição não são limitados a "ctc" acima mencionado e podem ser outras bases desde que as as bases representam um códon de leucina.

Tal DNA mutante pode ser preparado de acordo com um método de mutagênese sitio-direcionado descrito em, por exemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997).

Especificamente, tal DNA pode ser preparada por um método conhecido tal como um método Kunkel ou um método duplex Gapped utilizando um kit para introdução de uma mutação utilizando o método de mutagênese sitio-direcionado. Exemplos preferíveis do kit incluem Kit de Mutagênese Sitio-Direcionada QuickChange® (fabricada por Stratagene), Sistema de Mutagênese Sitio-Direcionada GeneTailor® (fabricada por Invitrogen Corporation), e Sistema de Mutagênese Sitio-Direcionado TaKaRa (por exemplo, Mutan-K ou Mutan-Super Express Km: fabricada por Takara Bio Inc.).

Alternativamente, como descrito nos Exemplos abaixo, tal DNA pode ser preparado por desempenhar uma reação em cadeia da polimerase (PCR) sob uma condição apropriada utilizando um iniciador PCR que é desenhado tal que uma mutação de sentido trocado é introduzida para produzir bases representando um códon de um aminoácido desejado, e utilizando, como um padrão, por exemplo, DNA contendo uma seqüência base codificando α-NAGA selvagem. Exemplos preferíveis de um tal iniciador PCR incluem iniciadores oligonucleotídeos sintéticos mostrados na seqüência Nos. 8 e 10, que são descritos no Exemplo 1 abaixo. Um DNA polimerase para o PCR não é limitado, mas um DNA polimerase com alta eficiência é preferível. Exemplos preferíveis dos mesmos incluem Pwo DNA (Polymerase Roche Diagnostics Κ.Κ.), Pfu DNA polimerase (Promega), platina Pfx DNA polimerase (Invitrogen Corporation), KOD DNA polimerase (Toyobo Co., Ltd.), e KOD-plus-polimerase (Toyobo Co., Ltd.) . Condições de reação para o PCR podem ser apropriadamente determinadas de acordo com, por exemplo, a temperatura ótima da DNA polimerase utilizada, e o comprimento e o tipo de DNA a ser sintetizado. Por exemplo, sob condições de ciclo preferíveis, um ciclo consistindo de ''5 a 30 segundos a 90°C a 98°C (desnaturação térmica e dissociação) —> 5 a 30 segundos a 50°C a 65°C (anelamento)→ 30 a 1,200 segundos a 65°C a 80°C (síntese e extensão)" é feita um total de 20 a 200 vezes.

0 DNA descrito por (b) pode ser obtido como segue. Um. método de hibridização conhecido tal como colônia de hibridização, placa de hibridização, ou Southern blotting é feita utilizando DNA contendo qualquer uma das seqüências bases descritas por (i) a (iii) (isto é, DNA descrito por (a)), DNA composto de uma seqüência base complementar a este DNA, ou um fragmento do mesmo como um padrão, e o DNA descrito por (b) pode ser obtido de uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica. Uma biblioteca preparada por um método conhecido pode ser utilizada. Alternativamente, uma biblioteca de cDNA comercialmente disponível ou biblioteca genômica pode ser utilizada. A biblioteca não é limitada a este.

Com respeito a um procedimento detalhado do método de hibridização, refere-se a, por exemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) como necessário.

O termo "condição rigorosa" durante o desempenho de um método de hibridização significa uma condição durante lavagem após hibridização, e especificamente, uma concentração de sal de um tampão na variação de 15 a 330 mM e uma temperatura que varia de 25°C a 65°C, e preferivelmente, uma concentração de sal que varia de 15 a 150 mM e uma temperatura que varia de 45°C a 55°C. Mais especificamente, um exemplo da condição rigorosa é uma concentração de sal de 80 mM e uma temperatura de 50oC. Além disso, em adição a concentração de sal, a temperatura, e semelhantes, em consideração de outras condições tais como a concentração padrão, o comprimento do padrão, e o tempo de reação, condições para obter o DNA descrito por (b) pode ser apropriadamente determinado.

O DNA a ser hibridizado tem uma seqüência base tendo uma homologia de preferivelmente pelo menos 40% ou mais, mais preferivelmente 60%, ainda preferivelmente 90% ou mais, particularmente preferivelmente 95% ou mais, e mais preferivelmente 99% ou mais relativo a seqüência base do DNA descrito por (a).

Além disso, no DNA descrito por (b) , bases correspondentes a bases nos sítios de substituição descritos acima são os mesmos como as bases nos sítios de substituição.

Aqui, o termo "sítios de substituição" significa sítios substituições de bases feitas em qualquer uma das seqüências bases descritas por (i) a (iii) contido no DNA descrito por (a). Especificamente, o termo "sítios de substituição" significa sítios de bases (triplete) representando um códon após a mudança causada pelas substituições de base. Mais especificamente, o termo "sítios de substituição" significa, entre 1,185 bases constituindo as seqüências bases descritas por (i) a (iii), bases correspondendo às locações das 562a a 564a bases na seqüência base mostrada na seqüência No. 1 (entretanto, as seqüências base sendo limitadas às seqüências bases descritas por (i) e (iii)), e bases correspondendo às locações das 571a a 573a bases na seqüência base mostrada na seqüência No. 1 (entretanto, as seqüências base sendo limitadas para as seqüências base descritas por (ii) e (iii)) . Mais especificamente, as bases formadoras significam as 511a a 513a bases nas seqüências de bases descritas por (i) e (iii) acima, e as bases formadoras significam as 520a a 522a bases nas seqüências base descritas por (ii) e (iii) acima.

Em adição, o termo "bases correspondendo..." na frase "bases correspondendo as bases nos sítios de substituição" significam bases (triplete) que são localizadas de modo que as faces das bases (triplete) complementares às bases nos sítios de substituição em um híbrido preparado por hibridização do DNA descrito por (b) com uma fita complementar ao DNA descrito por (a) . Por exemplo, quando a seqüência base do DNA descrito por (b) não tem uma mutação tal como deleção ou adição, como comparado com o DNA descrito por (a) (que é, quando o comprimento (o número de bases) do DNA descrito por (a) é o mesmo como o comprimento (o número de bases) do DNA (b)), a 511a a 513a bases e/ou a 520a a 522a bases na seqüência base do DNA descrito por (b) são o acima "bases correspondendo..." na frase "bases correspondendo as bases nos sítios de substituição".

É importante que o DNA descrito por (b) seja o DNA codificando uma proteína tendo atividade α-GAL. Dessa forma, por exemplo, bases representando um códon de um resíduo aminoácido que é acreditado ser importante para o desempenho de ligação (desempenho de ligação ao substrato) com um resíduo de α-galactose em um substrato de α-GAL e a reatividade catalítica para o substrato são preferivelmente bases que são não mutadas (apagadas, substituídas, ou adicionadas) a partir das seqüências de base das seqüências de base descritas por (i) a (iii) incluem bases correspondendo as locações das 82a a 93a bases (4 códons), a 229a a 243a bases (5 códons), a 349a a 381a bases (11 códons), a 448a a 474a bases (9 códons), a 574a a 576a bases (1 códon), a 625a a 660a bases (12 códons), e a 724a a 762a bases (13 códons) na seqüência base mostrada na seqüência No. 1 entre as seqüências base descritas por (i) a (iii). Entre essas bases, bases correspondendo a 466a a 468a bases e 649a a 651a bases, que representam códons de resíduos aminoácidos de um sítio catalítico, são particularmente preferidos.

Além disso, no DNA descrito por (b), bases representando um códon de um resíduo aminoácido que é acreditado ser importante para formar um homodimero são também preferivelmente bases que não são mutadas (apagadas, substituídas, ou adicionadas) a partir dessas seqüências base descritas por (i) a (iii). Exemplos preferíveis de tais bases das seqüências bases descritas por (i) a (iii) incluem bases correspondendo as locações de 133a a 135a bases e a 1,0481a a 1,050a bases na seqüência base mostrada na seqüência No. 1 entre as seqüências base descritas por (i) a (iii)·

Além disso, no DNA descrito por (b) , bases representando um códon de um resíduo aminoácido que é um sítio ligante de cadeia de açúcar tipo N são também preferivelmente bases que não são mutadas (apagadas, substituídas, ou adicionadas) das seqüências base descritas por (i) a (iii). Exemplos preferivelmente de tais bases das seqüências base descritas por (i) a (iii) incluem bases correspondentes às locações da 370a a 372a bases, a 529a a 531a bases, a 601a a 603a bases, a 1, 075a a 1, 077a bases, e a 1,153a a 1,155a bases na seqüência base mostrada na seqüência No. 1 entre as seqüências base descritas por (i) a (iii) ·

Em exemplo particularmente preferível do DNA descrito por (b) é DNA composto de uma seqüência base que não é completamente o mesmo como a seqüência base do DNA descrito por (a) , mas em que a seqüência aminoácida após tradução ser completamente a mesma seqüência aminoácida do DNA descrito por (a) (isto é, DNA obtido por desempenho de uma mutação silenciosa no DNA descrito por (a) ) . Com respeito a um gene codificando a proteína da presente invenção, códons correspondendo a cada dos aminoácidos após tradução não são particularmente limitados. Conseqüentemente, o gene codificando a proteína da presente invenção pode conter DNA representando códons que são geralmente utilizadas (preferivelmente, códons cuja freqüência de uso é alta) em mamíferos, tal como o humano, após transcrição. Alternativamente, o gene pode conter DNA representando códons que são geralmente utilizados (preferivelmente, códons cuja freqüência de uso é alta) em, por exemplo, um microorganismo, tal como E. coli ou levedura, ou uma planta, após transcrição.

4. Vetor recombinante e transformante A fim de expressar a proteína da presente invenção; primeiro, é necessário incorporar o gene descrito acima da presente invenção em um vetor de expressão para construir um vetor recombinante. Neste passo, como necessário, um promotor transcricional, (a seqüência SD no caso onde um hospedeiro é uma célula procariótica) , e a seqüência Kozak (no caso onde um hospedeiro é uma célula eucariótica) pode ser ligada jusante do gene a ser incorporado no vetor de expressão em avanço. Um terminador pode ser ligado jusante do mesmo em avanço. Além disso, uma seqüência reforçadora, um sinal de splicing, um sinal de adição poli-A, um marcador seletivo, e semelhantes podem também ser ligados em avanço. Os elementos acima, tal como um promotor transcricional, requerido para expressar um gene pode ser originalmente contido no gene. No caso esses elementos são originalmente contidos no vetor de expressão, os elementos contidos no vetor de expressão pode ser utilizados. Então, a forma de uso desses elementos não é particularmente limitada. Como um método de incorporar o gene em um vetor de expressão, vários tipos de métodos utilizando uma técnica de recombinação gênica conhecida, por exemplo, um método utilizando uma enzima de restrição, ou um método utilizando uma topoisomerase, pode ser empregada. O vetor de expressão não limitada desde que o vetor de expressão pode manter um gene codificando uma proteína da presente invenção. Exemplos de vetor de expressão incluem DNA plasmidial, DNA bacteriófago, DNA retrotransposon, um vetor retrovírus, e cromossomo DNA artificial. Um vetor que pode ser adequadamente combinado com uma célula hospedeira utilizada pode ser aproximadamente selecionado e utilizado.

Subseqüentemente, o vetor recombinante construído é introduzido em um hospedeiro para obter um transformante, e o transformante é cultivado. Então, a proteína da presente invenção pode ser expressa. 0 termo "transformante" utilizado na presente invenção significa um produto em que um gene estranho é introduzido em um hospedeiro. Por exemplo, o transformante incluir um produto em que um gene estranho é introduzido por introdução de plasmídeo DNA ou semelhante em um hospedeiro (transformação) e um produto em que um gene estranho é introduzido por infectar um hospedeiro com um vírus ou um fago (transdução).

0 hospedeiro não é limitado desde que o hospedeiro pode expressar uma proteína da presente invenção após o vetor recombinante ser introduzido do mesmo, e pode ser apropriadamente selecionada. Exemplos dos mesmos incluem hospedeiros conhecidos tal como células animais, por exemplo, uma célula humana e uma célula de camundongo, células de plantas, bactéria, levedura, e células de planta.

Quando uma célula animal é utilizada como um hospedeiro, por exemplo, um fibroblasto humano, uma célula CHO, uma célula COS-7 de macaco, Vero, uma célula L de camundongo, um rato GH3, uma célula FL humana, ou semelhantes é utilizado. Alternativamente, células de inseto tais como célula Sf9 ou uma célula Sf21 pode também ser utilizada.

Quando uma bactéria é utilizada como um hospedeiro, por exemplo, E. coli ou Bacillus subtilis é utilizada.

Quando levedura é utilizada como um hospedeiro, por exemplo, Saccharomyces eerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe é utilizado.

Quando uma célula de planta é utilizada como um hospedeiro, por exemplo, uma célula BY-2 tabaco é utilizada.

O método de obter um transformante não é limitado e pode ser aproximadamente selecionado em consideração da combinação dos tipos de hospedeiro e vetor de expressão utilizada. Exemplos preferíveis do método incluem um método de eletroporação, um método de lipofeccção, um método de choque pode aquecimento, um método polietileno glicol (PEG), um método de fosfato de cálcio, um método dietilaminoetil dextran (DEAE-dextran) , e um método de infecção de um vírus tais como um DNA de vírus ou um RNA de vírus.

No transformante resultante, o tipo de códon de um gene contido no vetor recombinante não é limitado. O tipo de códon pode ser idêntico a ou diferente do tipo de códon de um hospedeiro que é atualmente utilizado.

5. Método de produção de proteína

Uma proteína da presente invenção pode ser produzida por mudança da estrutura do sítio ativo (em particular, o sítio ligante do substrato) da α-NAGA selvagem 10 a fim de que o substrato de α-GAL pode ser ligado ao mesmo. Se o substrato de α-GAL pode ser ligado ao sítio ativo, o substrato pode ser hidrolisado por uma catálise devido ao sítio catalítico da α-NAGA selvagem.

Tal uma mudança estrutural é feita como segue. Por exemplo, como descrito acima, a seqüência aminoácida constituindo o sítio ativo (sítio de ligação ao substrato) da α-NAGA selvagem, (i) a 188° serina é substituído com outro aminoácido tal com ácido glutâmico ou ácido aspártico, (ii) o 191° alanina é substituído com outro aminoácido tais como leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, ou metionina, ou (iii) ambos o 188° serina e o 191° alanina são substituídos como descrito em (i) e (ii) acima por uma técnica de recombínação gênica. A mudança estrutural pode ser alcançada pela mudança da estrutura tri-dimensional das cadeias laterais dos aminoácidos antes e depois da substituição. Conseqüentemente, a especificidade ao substrato da α-NAGA selvagem pode ser mudada. Em particular, a mudança estrutural acima é preferivelmente feita por substituição do 188° serina com ácido glutâmico e por substituição do 191° alanina com leucina. Assim, a especificidade do substrato de α-GAL pode ser transmitido para α-GABA. Na mudança estrutural acima, uma substituição aminoácida que causa uma mudança estrutural tri-dimensional significante é a substituição de do 191° alanina com, por exemplo, leucina. Mais especificamente, a cadeia lateral do 191° aminoácido seja mudada de "-CH3", que é a cadeia lateral de alanina, a uma cadeia lateral grande, tal como CH2-CH(CH3)-CH3", que é a cadeia lateral de leucina. Como um resultado, o espaço do sitio ativo em que o grupo N-acetil em um substrato de α-NAGA é incorporado é restrito, assim diminuindo o desempenho de ligação da proteína com o substrato. Ao contrário, o desempenho de ligação com um substrato de α-GAL é aumentado Conseqüentemente.

A proteína da presente invenção pode ser produzida especificamente por um método incluindo um passo de cultura o transformante descrito acima e um passo de coletar uma proteína tendo atividade α-galactosidase do produto cultivada resultante. Aqui, o termo "produto cultivado" significa todo de um sobrenadante de cultura, células cultivadas, bactérias cultivadas, células rompidas, e bactéria rompida. A cultura do transformante pode ser feita de acordo com um método normal utilizado para cultivar um hospedeiro. A proteína alvo é acumulada no produto cultivado.

Como um meio utilizado para a cultura, um meio natural conhecido ou meio sintético pode ser utilizado desde que o meio contenha, por exemplo, uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e sais inorgânicos, todos dos quais podem ser utilizados pelo hospedeiro, e o transformante pode ser cultivado eficientemente.

A fim de prevenir a separação de um vetor recombinante contido no transformante e a separação de um gene codificante uma proteína alvo, a cultura pode ser feita em um estado em que uma pressão seletiva é aplicada.

Especificamente, no caso onde um marcador seletivo é um gene de resistência a droga, uma droga correspondente pode ser adicionada ao meio. No caso onde um marcador seletivo é um gene complementar auxotrófico, um fator nutricional correspondente pode ser removido do meio. Por exemplo, no caso onde um fibroblasto humano transduzido com um vetor contendo o gene resistente G418 é cultivado, G418 (sulfato G418) pode ser adicionado durante cultura, como necessário.

No caso onde, por exemplo, um transformante transformado com um vetor de expressão em que um promotor induzível é utilizado como um promotor é cultivado, um indutor apropriado (por exemplo, isopropil β-D- tiogalactopiranosídeo (IPTG)) pode ser adicionado ao meio, como necessário.

As condições de cultura do transformante não são particularmente limitadas desde que produtividade da proteína alvo e crescimento do hospedeiro não são interrompidos. Em geral, a cultura é feita em uma temperatura que varia de 10°C a 40°C, e preferivelmente que varia de 20°C a 37°C por 5 a 100 horas. 0 pH pode ser ajustado utilizando um ácido inorgânico ou orgânico, uma solução alcalina, ou semelhantes. Exemplos do método de cultura incluem cultura sólida, cultura estática, cultura agitada, e cultura de agitação em aeração.

Quando a proteína alvo é produzida em bactéria ou em células, a proteína alvo pode ser coletada, por disrupting a bactéria ou a célula. Como um método de romper a bactéria ou as células, por exemplo, um tratamento de alta-pressão utilizando uma pressão "French" ou um homogeneizador, um tratamento ultrassônico, um tratamento de moagem utilizando esferas de vidro ou semelhantes, um tratamento de enzima utilizando lisossoma, celulase, pectinase, ou semelhantes, um tratamento congela-descongela, um tratamento com uma solução hipotônica, ou um tratamento induzindo bacteriólise utilizando um fago pode ser empregado. Após a ruptura, o resíduo rompido (que contém uma fração insolúvel em um extrato celular) da bactéria ou as células pode ser removido, como necessário. Exemplos do método de remoção o resíduo inclui separação centrífuga e filtração. Além disso, a eficiência da remoção do resíduo pode ser aumentado utilizando, por exemplo, um floculante ou um filtro de apoio, como necessário. 0 sobrenandante obtido após a remoção do resíduo em uma fração solúvel no extrato celular, e pode ser utilizado como uma solução de proteína bruta.

Quando a proteína alvo é produzida em bactéria ou em células, alternativamente, as bactérias de células podem ser recuperadas por, por exemplo, separação centrífuga ou separação de membrana, e então, a proteína pode ser utilizada sem romper a bactéria ou as células.

Em contraste, quando a proteína alvo é produzida fora da bactéria ou fora das células, a solução de cultura é utilizada sem tratamento adicional, ou a bactéria ou as células são removidas por, por exemplo, separação centrífuga ou filtração. Subseqüentemente, a proteína alvo é coletada do produto cultivado por, por exemplo, extração pode precipitação por sulfato de amônio, como necessário. Além disso, de acordo com a necessidade, a proteína alvo pode ser isolada e purificada por diálise e cromatografia (tal como gel filtração, cromatografia de troca iônica, ou cromatografia por afinidade).

O rendimento de produção de uma proteína obtida por cultura de um transformante ou semelhante podem ser determinadas por, por exemplo, gel de eletroforese dodecil sulfato de sódio - poliacrilamida (SDS-PAGE) em termos de unidades por solução de cultura, as unidades por peso úmido ou peso seco de bactéria, as unidades por proteína em uma solução de enzima bruta, ou semelhantes.

Em adição ao sistema síntese de proteína utilizando um transformante descrito acima, uma proteína alvo pode ser produzida utilizando um sistema de síntese de proteína livre de célula em que nenhuma célula viva é utilizada.

O sistema síntese de proteína livre de célula é um sistema em que uma proteína alvo é sintetizada em um recipiente artificial tal como um tubo teste utilizando um extrato célula. Um sistema síntese de proteína livre de célula que pode ser utilizado também inclui um sistema de transcrição livre de célula em que RNA é sintetizado utilizando DNA como um modelo.

Neste caso, o extrato celular utilizado é preferivelmente derivado da célula hospedeira descrita acima. Exemplos do extrato celular que pode ser utilizado incluem extratos derivados das células eucarióticas e extratos derivados das células procarióticas. Mais especificamente, exemplos do extrato celular incluem extratos de uma célula CHO, um reticulócito de coelho, uma célula L de camundongo, uma célula HeLa, germe de trigo, germinação de levedura, ou E. coli. 0 extrato celular pode ser concentrado ou diluído para uso. Alternativamente, o extrato celular podem ser utilizado sem tratamento adicional. Então, o método de uso do extrato celular não é limitado.

0 extrato celular pode ser obtido por, por exemplo, ultrafiltração, diálise, e precipitação de polietileno glicol (PEG).

Alternativamente, tais sínteses de proteína livre de célula podem ser feitas utilizando um kit comercialmente disponível. Exemplos do kit incluem um kit de reagente PROTEIOS© (Toyobo Co., Ltd.), Sistema TNT® (Promega), um dispositivo síntese PG-Mate® (Toyobo Co., Ltd.), e RTS (Roche Diagnostics K.K.).

A proteína alvo produzida pela síntese de proteína livre de célula pode ser purificada por apropriadamente selecionando significa meios tal como cromatografia, como descrito acima.

6. Composição Farmacêutica

(i) Composição farmacêutica utilizada como agente enzimático utilizado na substituição enzimática ou semelhante

Como descrito acima, a proteína da presente invenção pode produzir vários efeitos excelentes com respeito ao tratamento da doença de Fabry, e então pode ser utilizado como um ingrediente ativo de um agente terapêutico para doença de Fabry. Isto é, a presente invenção provê um agente terapêutico para doença de Fabry contendo uma composição farmacêutica para a doença de Fabry contendo uma composição farmacêutica contendo a proteína descrita acima da presente invenção. Um exemplo específico preferível deste agente terapêutico é um agente enzimático que pode ser utilizado para terapia de substituição enzimática.

A proteína da presente invenção, que funciona como um ingrediente ativo na composição farmacêutica, pode ser utilizado na forma de um sal, um hidrato, ou semelhante, como necessário. Em adição, a proteína da presente invenção pode ser utilizada em um estado em que uma modificação química apropriada é feita em consideração da estabilidade de estoque (em particular, manutenção da atividade) como um gente terapêutico. Então, a forma de proteína da presente invenção não é limitada.

A composição farmacêutica pode conter componentes outros que a proteína da presente invenção. Exemplos de outros componentes incluem vários componentes farmacêuticos (tal como vários tipos de veículos farmaceuticamente aceitáveis) que são requeridos em acordo com o uso (a forma de uso) da composição farmacêutica. Os outros componentes podem ser apropriadamente contido desde que o efeito alcançado pela proteína da presente invenção e o semelhante não são impedidos.

No caso onde a composição farmacêutica é utilizada como um agente enzimático utilizado na substituição enzimática, a proporção de mistura da proteína da invenção presente, e os tipos e proporções de mistura de outros componentes utilizadas podem ser apropriadamente determinado em acordo com um método de preparação de um agente de enzima conhecido usado na substituição enzimática (em particular, um agente enzimático utilizado na terapia de substituição enzimática para doença de Fabry).

O método de administrar a composição farmacêutica não é limitado. Quando a composição farmacêutica é um agente enzimático utilizada na substituição enzimática, administração parenteral tal corno gotejamento intravenoso ser geralmente utilizada. Na preparação farmacêutica que pode ser utilizada em vários métodos de administração tal como administração parenteral, por exemplo, um excipiente, um enchimento, um extensor, um ligador, um umectante, um desintegrante, um lubrificante, um tensoativo, um dispersante, um tampão, um preservativo, um solubilizador, um antiséptico, um agente aromatizante, um agente suavizador, um agente estabilizante, e um agente isotonizante, todos dos que são geralmente utilizados na produção de medicina, pode ser apropriadamente selecionado e utilizado, e então, a composição farmacêutica pode ser preparada por um método existente.

A forma da composição farmacêutica não é limitada. Quando a composição farmacêutica é um agente enzimático utilizado na substituição enzimática, uma injeção intravenosa (incluindo infusão gotejante) é geralmente utilizada. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser provida na forma de, por exemplo, uma ampola de dose única ou um recipiente multi-dose.

Em geral, a dose da composição farmacêutica pode ser apropriadamente determinada em uma grande variação em consideração de não somente a proporção de mistura do ingrediente ativo na preparação farmacêutica, mas também a idade e peso corporal do sujeito (paciente) a ser administrado com a composição farmacêutica, o tipo de doença, o estado de doença, a rota de administração, o número de administrações, o termo de administração, e semelhantes. Em particular, no caso onde o agente terapêutico da presente invenção é um agente enzimático na substituição enzimática, o número de vezes de administração é preferivelmente cerca de um e cada dias a quatro semanas . Em tal caso, a quantidade de agente enzimático administrado a cada tempo é determinada tal que, por exemplo, preferivelmente cerca de 0,1 a 10 mg/kg, mais pref erivelmente cerca de 0,1 a 5 mg/kg, e ainda preferivelmente cerca de 0,2 a 1 mg/kg da proteína ou semelhantes (enzima recombinante) da presente ambição, que é um ingrediente ativo, pode ser administrado relativo ao peso corporal de um paciente.

Na presente invenção, a proteína (enzima recombinante) da presente invenção, cujas funções como um ingrediente ativo, tem estabilidade excelente no sangue e alta eficiência de incorporação em uma célula de um órgão afetada. Então, mesmo quando a proteína é uma quantidade menor que aquela nas composições farmacêuticas conhecidas, o efeito da substituição enzimática que é a mesma como ou mais forte que aquela alcançada pelas composições farmacêuticas conhecidas podem ser alcançadas. Em adição, efeitos colaterais adversos alérgicos da proteína da presente invenção são desprezíveis. Conseqüentemente, deficiências físicas, mental, e econômico em pacientes podem ser marcadamente reduzida.

(ii) Composição farmacêutica utilizada como agente gene terapêutico.

Como descrito acima, o gene da presente invenção codifica uma proteína da presente invenção que podem alcançar vários efeitos excelentes desde que o tratamento da doença de Fabry, e então podem ser utilizados como um ingrediente ativo de um agente terapêutico (agente gene terapêutico) de doença de Fabry.

Isto é, a presente invenção provê um agente gene terapêutico para doença de Fabry contendo, como um ingrediente ativo, uma composição farmacêutica contendo o gene descrito acima da presente invenção. No caso onde a composição farmacêutica é utilizada como um agente gene terapêutico, um método de administração direta por injeção ou um método de administrar um vetor em que um ácido nucléico é incorporado é utilizado. Exemplos do vetor incluem um vetor adenovirus, um vetor virus adeno- associado, um vetor herpesvirus, um vetor virus vaccinia, um vetor retrovirus, e um vetor lentivirus. Pelo uso desses vetores virus, os agentes genes terapêuticos podem ser administrados com alta eficiência. Um kit de transferência gênica comercialmente disponível (por exemplo, nome do produto: AdenoExpress, fabricado por Clontech) pode também ser utilizado.

Em adição, no caso onde a composição farmacêutica é utilizada como um agente gene terapêutico, a composição pode ser introduzida em um retículo endoplasmático fosfolipídeo tal como lipossomo, e o retículo endoplasmático pode ser administrado. Especificamente, um retículo endoplasmático em que um gene da presente invenção é mantido e é introduzido em uma célula pré-determinada por um método lipoinfecção. A célula resultante, é então administrada em, por exemplo, uma veia ou uma artéria. Alternativamente, tal uma célula pode ser localmente administrada em um órgão afetado por doença de Fabry. Por exemplo, no caso onde a composição farmacêutica é administrada a um adulto, a dose é preferivelmente cerca de 0,1 μg/kg, 1,000 mg/kg, e mais preferivelmente, cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg por dia relativo ao peso corporal do paciente .

7. Método de tratar doença de Fabry A presente invenção inclui um método de tratar doença de Fabry incluindo administrar a composição farmacêutica a um paciente de Fabry. A presente invenção também inclui o uso da composição farmacêutica para tratar doença de Fabry, e o uso da composição farmacêutica ou a proteína da presente invenção para produzir medicamento para tratar doença de Fabry.

A composição farmacêutica utilizada no método de tratamento da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica contendo uma proteína da presente invenção ("seção 6 (i)" acima), uma composição farmacêutica contendo um gene da presente invenção ("seção 6(ii)" acima), ou uma combinação dessas composições farmacêuticas. A composição farmacêutica não é limitada a este, e pode ser apropriadamente selecionada em consideração do estado de doença do paciente, a presença ou ausência de efeitos colaterais adversos, o efeito da administração, e semelhantes. Aqui, cada das composições farmacêuticas para ser administrada a um paciente Fabry pode ser administrada na forma de uso do agente enzimático utilizado na substituição enzimática ou o agente gene terapêutico descrito acima.

Em particular, quando as composições farmacêuticas são utilizadas em combinação como descrito acima, por exemplo, a proporção da quantidade de administração, o número de vezes de administração, e o termo de administração de cada das composições farmacêuticas pode ser apropriadamente determinadas de acordo com as condições de cada paciente. Por exemplo, um método preferível de administração e uma quantidade preferível de administração de cada das composições farmacêuticas e semelhantes são como descrito acima.

A presente invenção será agora descrita mais especificamente utilizando Exemplos, mas a presente invenção não é limitada a este.

[EXEMPLO 1]

<Seleção de sítios de mutação a ser introduzido em a-N-acetilgalactosaminidase (α-NAGA)>

A fim de desenhar uma nova enzima em que a especificidade ao substrato da α-NAGA humana é modificada em uma especificidade substrato similar aquela da α-GAL humana, sítios (locações de um aminoácido) de mutação a ser introduzido em α-NAGA humano forma determinados por comparação e estudo utilizando modelos estruturais tridimensionais de proteínas. 0 procedimento e resultados da determinação são especificamente descritos abaixo. 1. Dados utilizados

Os dados da seqüência aminoácida da α-NAGA humana e a-GAL humana são registrados em Swiss-Prot como descrito abaixo foram utilizados. Os dados estruturais tridimensionais da proteína de α-NAGA de galinha e a-GAL humana que são registradas no Banco de Dados de Proteína (PDB) como descrito abaixo foram utilizados.

(1) Dados da seqüência aminoácida Base de dados utilizados: Swiss-Prot (http://tw.expansy.org/uniprot/) nome de entradanúmero de acesso

α-NAGA humanaNAGAB_HUMANPl7050

α-GAL humanaAGAL HUMANP0 6280

(2) Dados estruturais tridimensionais da proteína Base da dados utilizada: Banco de Dados da Proteína (PDB)

(http://www.rcsb.org/pdb/)

_PDB ID_

α-NAGA de galinha 1 KTC (refere-se a *1 abaixo)

α-GAL humanalR47 (refere-se a *abaixo)

*1: Garman SC et al., Structure (Camb), 2002, 10(3): 425-34

*2: Garman SC et al., J. Mol. Biol., 2004, 19; 337 (2): 319-35

2. Construção do modelo estrutural tri-dimensional da α-NAGA humana

A construção de um modelo estrutural tri- dimensional da α-NAGA humana foi feita na base da estrutura tri-dimensional de α-NAGA de galinha utilizando um método de modelagem de homologia, que é um método existente (refere-se a Sutcliffe MJ et al., Prot. Eng., 1987, 1, 377-84; e Sutcliffe MJ et al., Prot. Eng., 1987, 1, 385-92). A estrutura tri-dimensional da α-NAGA derivada de galinha (o complexo com um substrato) registrado em PDB foi utilizado como uma estrutura tri-dimensional padrão. O grau de comparação (identidade) de aminoácidos entre α-NAGA humana e α-NAGA de galinha é 75%, que satisfaz a condição (identidade ≥ 30%) construir um modelo estrutural tri-dimensional pelo método de modelagem por homologia. A construção de um modelo estrutural tri-dimensional pelo método de modelagem por homologia foi feito utilizando MODELLER, para o qual existe um programa (capaz de ser utilizado por acesso a página da MODELLER CBSU (http://cbsuapps.tc.corne11.edu/modeller.aspx)). Além disso, um modelo de um complexo com um substrato de α-NAGA humana foi construído por ajuste de um substrato ligado a α-NAGA de galinha no modelo estrutural tri-dimensional construído da α-NAGA humana de acordo com a posição do substrato ligado a α-NAGA de galinha.

3. Comparação de estruturas tridimensionais contribuindo para a especificidade do substrato da a-GAL humana e aquela da α-NAGA humana.

A estrutura tri-dimensional da α-NAGA humana é similar aquela da α-GAL humana, e domínios catalíticos de ambos α-NAGA humana e α-GAL humana têm um estrutura (βα)8- barrel. Resíduos aminoácidos (resíduos catalíticos) requeridos para a ação catalítica existindo o sítio ativo (incluindo um sítio catalítico e um sítio de ligação a substrato) são localizados no lado C-terminal de cada fita da estrutura (βα) 8-barrel. Nas Figs. 1 e 2, estruturas tridimensionais da α-NAGA humana e α-GAL humana são mostradas por modelo fita, e resíduos aminoácidos do sítio catalítico e o sítio de ligação ao substrato em cada das estruturas são mostrados por um modelo bastão. A fim de comparar as relações posicionais entre um substrato e resíduos do sítio catalítico e o sítio de ligação ao substrato em termos da estrutura tri-dimensional, a estrutura tri-dimensional da α-NAGA foi sobreposta na estrutura tri-dimensional da α-GAL pelo método de sobreposição desenvolvido pelo Kabsch (refere-se a Kabsch W. et al., Acta Crystallogr; 1976: A32, 827-828; e Kabsch W. et al., Aeta Crystallogr; 1978: A34, 922-923). Subseqüentemente, no modelo da α-NAGA humana, resíduos aminoácidos relacionados para a ligação do substrato foram selecionados pela extração de resíduos aminoácidos adjacentes ao substrato. Os resultados são mostrados na Tabela 1. A coluna da direita da Tabela 1 mostra 14 resíduos aminoácidos selecionados da α-NAGA humana, e a coluna da esquerda da Tabela 1 mostram aminoácidos na α-GAL que posicionalmente corresponde aos 14 resíduos aminoácidos.

Tabela 1

<table>table see original document page 62</column></row><table> Glu203Serl88

Leu206Alal91

Tyr207Tyrl92

Arg227Arg213

Asp231(*)Asp217(*)

Asp266Asp252

(*) resíduo catalitico

Esses resíduos aminoácidos foram comparados com cada um por sobreposição da estrutura tri-dimensional da a- NAGA humana naquela da α-GAL para detectar resíduos que são idênticos a cada um e resíduos que são diferentes de cada um. Então, pontos comuns e pontos de diferença nas seqüências aminoácidas da α-GAL humana e α-NAGA humana foram clareadas.

4. Pontos comuns entre a α-GAL humana e α-NAGA humana

Como um resultado, ele foi encontrado que entre os -14 resíduos extraídos, 12 resíduos incluindo Aspl56 e Asp217, que são o sítio catalitico da α-NAGA humana, são idênticos entre α-NAGA e α-GAL. Átomos nesses resíduos aminoácidos nas estruturas tridimensionais sobrepostas são também satisfatoriamente sobrepostos com cada outra, e então, foi confirmado que as locações nas estruturas tridimensionais são também muito similares a cada uma. Fig. -2A mostra locações dos resíduos aminoácidos nas estruturas tri-dimensionais, os resíduos aminoácidos sendo comuns aos α-NAGA e α-GAL. Fig. 2C mostra a interação entre cada dos resíduos aminoácidos e um substrato. É acreditado que todos esses resíduos são relacionados ao substrato por uma ligação hidrogênio ou uma ligação hidrofóbica. Note que, na Fig. 2C, os aminoácidos que não são sublinhados são aminoácidos comuns a α-NAGA e a-GAL, e os aminoácidos sublinhados são aminoácidos diferentes entre α-NAGA e a-GAL.

5. Pontos de diferença entre α-GAL humana e α-NAGA humana

Existem dois resíduos que são diferentes entre α- GAL humana e α-NAGA humana (refere-se a Fig. 2C) . Em a-GAL, os resíduos aminoácidos correspondendo a Serl88 e Alal91 da α-NAGA foram Glu203 e Leu206, respectivamente. Fig. 2B mostra locações dos resíduos aminoácidos que são diferentes entre α-NAGA e α-GAL na estrutura tri-dimensional.

Como mostrado na Fig. 2C, em α-GAL, um "grupo -OH (um grupo hidroxil)" está ligado ao átomo de carbono na posição 2 do açúcar (anel de seis membros) no substrato de α-GAL, e em α-NAGA, em "grupo -NH-C(CH3)=0 (um grupo N- acetil)" é ligado ao átomo de carbono na posição 2 do açúcar (anel de seis membros) no substrato de α-NAGA.

É suposto que, em α-NAGA, o grupo hidroxil da cadeia lateral do Serl88 está ligado ao átomo de oxigênio do grupo N-acetil no substrato por uma ligação hidrogênio, e o grupo metil da cadeia lateral de Alal91 está ligado ao grupo metil do grupo N-acetil no substrato por uma ligação hidrofóbica. Na bases dessas suposições, é acreditado que Serl88 e Alal91 de α-NAGA são resíduos importantes para reconhecer o grupo N-acetil no substrato. Em contraste, tem sido relatado que, em a-GAL humana, GLu203 e Leu206, que são diferentes dos resíduos correspondentes de α-NAGA, são importantes para reconhecer um substrato de α-GAL (Garman SC et al, J. Mol. Biol., 2004, 19: 337 (2): 319-35). Além disso, tem sido deixado claro que, da análise da estrutura cristal do raio X, o grupo carboxil da cadeia lateral de Glu203 de α-GAL forma uma ligação de hidrogênio com um grupo hidroxil do substrato. Em adição, Leu206 de α-GAL é um resíduo tendo uma cadeia lateral grande, e ocupa uma parte do espaço do sítio de ligação ao substrato de α-GAL. Por outro lado, o grupo hidroxil (na posição 2) no substrato de α-GAL é um grupo funcional que não é grande. É óbvio que o grupo hidroxil é menor que, por exemplo, o grupo N-acetil no substrato de a- NAGA. Conseqüentemente, é acreditado que, na ligação entre α-GAL e o substrato, o tamanho do espaço do sítio de ligação ao substrato de α-GAL é adequado para o tamanho do grupo hidroxil no substrato. Conseqüentemente, foi acreditado que, em α-GAL, dois resíduos de Glu203 e Leu206 altamente contribui a especificidade ao substrato.

6. Verificação da especificidade do substrato por modelos tridimensionais

Além disso, a fim de verificar a interação de a- NAGA com um substrato e a interação de α-GAL com um substrato, modelos em que os substratos foram trocados com cada um, que é, (i) um modelo complexo combinando o substrato de α-GAL com α-NAGA, e (ii) um modelo complexo combinando o substrato de α-NAGA com α-GAL, foram construídos para examinar a influência dos dois resíduos que são diferentes entre α-NAGA e a-GAL nos substratos.

De acordo com os resultados, no modelo complexo em que o substrato de α-GAL foi ajustado na estrutura do modelo α-NAGA, a cadeia lateral de Serl88 de α-NAGA não interage com o grupo hidroxil na posição 2 do substrato de α-GAL. Em adição, uma libertação de espaço foi formado entre Alal91 e o substrato de α-GAL, e então, interação com o grupo hidroxil não foi observada. Por outro lado, no modelo complexo em que o substrato de α-NAGA foi ajustado na estrutura α-GAL, foi confirmado que o grupo N-acetil na posição 2 do substrato de α-NAGA colide contra Glu203 e Leu206 de α-GAL. Conseqüentemente, foi predito que a ligação ao substrato foi bloqueado pela presença desses dois resíduos.

Esses resultados preditos suportaram os resultados experimentais descritos acima. Então, foi sustentado que Serl88 e Alal91 de α-NAGA e Glu203 e Leu206 de α-GAL são importantes para a especificidade do substrato de α-NAGA e α-GAL, respectivamente.

7. Substituição do resíduo aminoácido para modificar a especificidade do substrato de α-NAGA humana para a especificidade do substrato similar aquele da α-GAL humana.

Como descrito acima, entre a α-GAL humana e α-NAGA humana, as seqüências aminoácidas são completamente idênticas incluindo o sítio catalítico exceto para os dois resíduos que reconhecem o grupo funcional ligado ao átomo de carbono na posição 2 do açúcar (anel de seis membros) em cada um dos substratos. Isto indica que é possível reter a atividade catalítica antes da substituição e mudar somente a especificidade do substrato da α-NAGA específica para a-GAL específica ou vice-versa por substituição desses dois resíduos que altamente contribuem para a especificidade do substrato. A fim de que a especificidade do substrato da a- NAGA humana é mudada e atividade de α-GAL é expressada pela α-NAGA, uma substituição de aminoácido nessas duas posições é importante. Por substituição da Serl88 de α-NAGA humana com Glu, o reconhecimento por uma ponte de hidrogênio com grupo N-acetil do substrato de α-NAGA pode ser removido, e uma interação por uma ponte de hidrogênio para o grupo hidroxil do substrato de α-GAL pode ser introduzido. Além disso, por substituição de Alal91 de α-NAGA humana com Leu, o espaço em que um grupo N-acetil é para ser incorporada na ligação de um substrato de α-NAGA é ocupada pela cadeia lateral grande de Leu, e então, a ligação do substrato é bloqueada por este obstáculo estérico. Foi predito que, em α-NAGA, o reconhecimento original de um substrato de α-NAGA pode ser removido e uma alta especificidade com um substrato de α-GAL pode ser provido pelos efeitos acima.

8. Avaliação do modelo de substituição de aminoácido α-NAGA humano

No caso onde Serl88 de α-NAGA foi substituído com Glu e Alal91 do mesmo foi substituído com Leu, a fim de confirmar o efeito na estrutura tri-dimensional periférica, um modelo mutante α-NAGA (α-NAGA S188E/A191L) foi construído, e a estrutura tri-dimensional do modelo mutante α-NAGA foi comparado a da α-NAGA selvagem. Como um resultado, foi confirmado que as substituições acima não afetam a estrutura tridimensional composta de resíduos aminoácidos periféricos. Conseqüentemente, foi suposto que o mutante α-NAGA que essas mutações foram introduzidas em a- NAGA humana pode existir sem problemas em termos da estrutura tri-dimensional.

Em adição, um modelo complexo em que um substrato de α-GAL foi ajustado na estrutura da α-NAGA mutante foi construído. Como um resultado, foi confirmado que a cadeia lateral de Glul88 da α-NAGA mutante existe dentro de uma distância em que a cadeia lateral de Glul88 pode formar uma ponte de hidrogênio com o grupo hidroxil na posição 2 do substrato (refere-se a Fig. 6(b)). Além disso, em um modelo complexo em que um substrato de α-NAGA é fitted na estrutura da α-NAGA mutante, foi suposto que o grupo N-acetil na posição 2 do substrato causa um obstáculo estérico com a cadeia lateral de Leul91, e então, o modelo complexo com a cadeia lateral de Leul91, e então, o modelo complexo tem uma estrutura a qual o substrato não pode estar ligada.

De acordo com os resultados acima, foi esperado que a α-NAGA mutante perde a especificidade ao substrato original de α-NAGA e adquire uma alta especificidade para o substrato de α-GAL (isto é, o mutante α-NAGA substancialmente perde a atividade α-NAGA e adquire a atividade α-GAL).

A estrutura do mutante α-NAGA construído (α-NAGA CARACTERIZADO pelo fato de que o composto da fórmula (I) compreende MD32Dw3Dh6M e (II) compreende MviD20Mvi.

47. Processo, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um alquil trissi- loxano (b) tem a fórmula:

MADrM

Onde M ou M^ = RfRgR1SiOiz2; e

D^= RjRkSÍ02/2.

onde cada Rf, cada Rg e cada R1 são independente- mente radicais de hidrocarboneto monovalentes tendo de um a sessenta átomos de carbono para permitir que M e MAsejam di- ferentes; e onde Rj e Rk são independentemente radicais de hidrocarboneto monovalentes tendo de dois a sessenta átomos de carbono; os subscritos estequiométricos r são positivos sujeito as limitações; que o átomo de silício de Da tem um grupo pendente que é diferente de hidrogênio, metila e poli- éter, e r é igual a um.

48. [Claim missing on original document]

49. Processo, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO por compreender ainda a rede de polímero de silicone reticulado que não contém um poliéter reticulado produzida na presença de pelo menos um primeiro componente fluido e é subseqüentemente intumescido, onde o intumesci- mento da rede de polímero de silicone reticulado que não contém um poliéter reticulado compreende diluir a rede de polímero de silicone reticulado, que foi produzido na pre- sença de pelo menos um primeiro componente de fluido, com pelo menos um segundo componente de fluido com a condição de que pelo menos um primeiro componente de fluido e/ou pelo No. 4".

[EXEMPLO 2]

1. Preparação do vetor retrovirus a-N- acetilgalactosaminidase (a-NAGA)

Um clone a-NAGA c DNA (Homo sapiens N- acetilgalactosaminidase, alfa, RNAm, Acesso ao Banco de Gene: BC000095, IMAGEM: 3504221) foi adquirido de Open Biosystems. A seqüência código de α-NAGA foi amplificada por PCR com uma composição mistura de reação e sob uma condição de reação descrita abaixo, utilizando a α-NAGA cDNA adquirida como um padrão com iniciadores. descritos abaixo e KOD-plus-polimerase (Toyobo Co., Ltd.). Iniciador NAGA-5' :

5'-GATGCTGCTGAAGACAGTGCTCTT-3 ' (seqüência No. 5)

Iniciador NAGA-3':

5'-TCACTGCTGGGACATCTCCAGGTT-3 ' (seqüência No. 6) cComposição da mistura reacional> Padrão (10 ng/pL):1 pL 10 χ tampão: 10 pL

2,5 mM dNTP: 10 pL

25 mM MgSO4:4 pL KOD-plus-polimerase: 1 pL Iniciador NAGA-5' (10 pM):1 pL Iniciador NAGA-3' (10 pM):1 pL

Água esterilizada:68 pL

Total: 100 pL <Condição de reação>

A mistura de reação foi aquecida a 94°C por dois minutos. Subseqüentemente, um ciclo consistindo de "desnaturação e dissociação térmica: 94°C (15 segundos) —> anelamento: 60°C (30 segundos) —> síntese e extensão: 68°C (90 segundos)" foi feito um total de 35 vezes, e a mistura de reação foi então arrefecida a 4°C.

O fragmento α-NAGA DNA preparado foi purificado por eletroforese em gel de agarose.

Um fragmento de α-NAGA DNA cujas terminações foram fosforiladas com polinucleotídeo quinase T4 (NEB) foi ligado com um vetor retrovírus pCX4Neo preparado por quebra com enzima de restrição Hpa I (terminação Blant) (NEB) e então desfosforilação utilizando Fosfatase Alcalina, Intestino de Bezerro (NEB) (Tsuyoshi Akagi et al, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 100, 13567-13572 (2003)). α-NAGA pCX4Neo obtido por reação de ligação foi transformado em células DH5a competentes (Invitrogen Corporation) e plaquear em uma placa LB contendo ampicilina. Colônias resistentes a ampicilina foram então obtidas.

Cada resultante das colônias resistentes foi suspensa em um meio LB. Um PCR de colônia foi feito com uma composição de mistura de reação e sob uma condição de reação descrita abaixo, utilizando a suspensão de bactéria como um padrão com iniciadores abaixo e PCR Máster Mix (fabricado por Promega).

Iniciador NAGA-5':

5'-GATGCTGCTGAAGACAGTGCTCTT-3'(seqüência No. 5) iniciador pCX4-3':

5'-AAACCGTTGCTAGCTTAAGTT-3'(seqüência No. 7) cComposição da mistura reacional>

Padrão (1 colônia/pL): 1 pL

PCR Máster Mix: 10 \ih

Iniciador NAGA-5' (10 μΜ)0,5 yL

Iniciador pCX4-3' (10 μΜ)0, pL

Água esterilizada:8 pL

Total: 20 pL

<Condição de reação>

A mistura de reação foi aquecida a 95°C por dois minutos. Subseqüentemente, um ciclo consistindo de "desnaturação e dissociação térmica: 95°C (30 segundos) —» anelamento: 55°C (30 segundos) —» síntese e extensão: 72°C (90 segundos)" foi feito um total de 40 vezes, e a mistura de reação foi então arrefecida a 4°C.

Um clone em que α-NAGA DNA foi incorporado na direção ara frente foi selecionado do produto amplificado resultante. Mais especificamente, em padrão E. colí em que um fragmento amplificado de 1,4 kb foi obtido foi selecionado como um clone em que o α-NAGA DNA foi incorporado na direção para frente. 0 clone E. coli selecionado de α-NAGA pCX4Neo foi cultivado para obter uma grande quantidade, isto é, 1 mg ou mais (1 mg/mL) , de plasmídeo DNA α-NAGA pCX4Neo.

2. Preparação de mutante α-NAGA

Contanto que α-NAGA S188E/A191L, que é um mutante α-NAGA, primeiro, α-NAGA S188E foi preparado, e α-NAGA S188E/A191L foi então preparado utilizando α-NAGA S188E. a- S188E/A191L foi preparado com referência ao manual de instrução do Sistema de Mutagênese Direcionado do Sitio GeneTailor (Corporação Invitrogen), como necessário.

DNA metilase (4 U) . aNAGA S188E foi preparado por amplificar o DNA com uma composição de mistura reacional e sob uma condição de reação descrita abaixo, utilizando a-NAGA pCX4Neo metilado como um padrão com um iniciador NAGA S188E- GT-5' (uma porção em que uma mutação de sentido trocado S188E foi introduzida sendo sublinhado) que foi desenhado tal que a mutação sentido trocado (S188E) em que a 188a serina (S) foi substituída com ácido glutâmico (E) foi introduzida, um iniciador NAGA S188E-GT-3', e KOD-plus- polimerase.

Primeiro, α-NAGA pCX4Neo (100 ng) foi metilado com

Iniciador NAGA S188E-GT-5':

5'-CCCATCGCCTTCTCCTGCGAGTGGCCAGCCTATGA-3'

(seqüência No. 8)

Iniciador NAGA S188E-GT-3':

5'-GCAGGAGAAGGCGATGGGGCGGCCTGTG-3' (seqüência No.

9)

<Composição da mistura de reação>

Template (6 ng/pL) : 1 μΐ,

10 χ tampão: 5 μΐ,

2,5 mM dNTP: 5 pL

25 mM MgS04 : 2 μΐ.

KOD-plus-polimerase:1 μι

Iniciador NAGA S188E-GT-5' (10 μΜ) : 1 \iL

Iniciador NAGA S188E-GT-3' (10 μΜ):1 μΐ,

Água esterilizada: 34 Total: 50 \iL

<Condição de reação>

Δ mistura de reação foi aquecida a 94°C por dois minutos. Subseqüentemente, um ciclo consistindo de "desnaturação e dissociação térmica: 94°C (15 segundos) —» anelamento: 60°C (30 segundos) —» síntese e extensão: 68°C (8 minutos)" foi feito um total de 35 vezes, e a mistura de reação foi então arrefecida a 4°C.

O fragmento de DNA amplificado (α-NAGA S188E pCX4Neo) foi transformado em células DH5a-Tl competente (Corporação Invitrogen) tendo endonuclease McrBC que cliva DNA metilado. Desde α-NAGA pCX4Neo, que foi utilizado como um padrão, tenha sido metilado, α-NAGA pCX4Neo foi clivado por McrBC endonuclease e pode não formar colônias. Por outro lado, desde que um plasmídeo tendo uma mutação S188E não tenha sido metilada, o plasmídeo não foi clivado e pode formar colônias. As várias colônias formadas foram então cultivadas, e o plasmídeo DNA foi então extraído e purificado. A introdução da mutação S188E foi confirmada por um método conhecido de determinação de uma seqüência base utilizando um seqüenciador.

Depois, um mutante α-NAGA S188E/A191L foi preparado por amplificação por PCR com uma composição de mistura reacional e sob uma condição de reação descrita abaixo, utilizando o α-NAGA S188E pCX4Neo purificado como um padrão com um iniciador NAGA A191L-GT-5' (uma porção em que uma mutação em sentido trocado A191L foi introduzida sendo sublinhada) que foi desenhada tal que a mutação sentido trocado (A191L) em que a 191a alanina (A) foi substituída com leucina (L) foi introduzida, um iniciador NAGA A191L-GT- 3', e KOD-plus-polimerase.

Iniciador NAGA A191L-GT-5':

5'-TTCTCCTGCGAGTGGCCACTCTATGAAGGCGGCCT-3' (seqüência No. 10)

Iniciador NAGA A191L-GT-3':

5'-TGGCCACTCGCAGGAGAAGGCGATGGGG-3' (seqüência No.11)

<Composição da mistura de reação>

Template (6 ng/pL):l μL

10 χ tampão: 5 μL

2,5 mM dNTP: 5

25 mM MgSO4: 2 uL

KOD-plus-polimerase:1 μL

Iniciador NAGA A191L-GT-3' (10 μΜ) : 1 μL

Iniciador NAGA Al91L-GT-3 ' (10 μΜ):1 uL

Água esterelizada: 34 μL

Total: 50 μL

<Condição de reação>

A mistura de reação foi aquecida a 94°C por dois minutos. Subseqüentemente, um ciclo consistindo de "desnaturação e dissociação térmica: 94°C (15 segundos) -» anelamento: 60°C (30 segundos) —» síntese e extensão: 68°C (8 minutos)" foi feito um total de 35 vezes, e a mistura de reação foi então arrefecida a 4°C.

O fragmento de DNA amplificado (α-NAGA S188E/A191L pCX4Neo) foi transformado em células DH5a-Tl competente. 0 plasmídeo DNA foi então extraída e purificada. A introdução da mutação A191L em adição a mutação S188E foi confirmada por um método conhecido de determinação de uma seqüência base utilizando um seqüenciador.

3. Preparação de retrovírus recombinante expressando α-GAL-, a-NAGA-, e a-NAGA S188E/A191L

Células empacotadas de retrovírus (Phoenix Ampho Batch#: HEK293 de Rim Embrionário Humano Transformada F- 14727) foram adquiridas de Coleção de Cultura do Tipo Americana (ATCC) (Coligan, J. E. et al. Curr. Protocols Immunol., Supl. 31, 10.28.1-10.28.17 (1999)). As células Phoenix Ampho foram cultivadas em uma solução de cultura de Meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) (glicose High) + 10% do soro fetal bovino inativado por calor (SFB) a 37oC e um CO2 na concentração de 5%.

A fim de preparar retrovírus recombinante, vetor retrovírus de α-GAL pCX4Neo-, a-NAGA pCX4Neo-, ou a-NAGA S188E/A191L pCX4Neo foi transfectado em células Phoenix Ampho. Nesta transfecção, 2 mL de solução de cultura OPTI- MEM (Corporação Invitrogen) contendo 1 yg de vetor retrovírus, 1 yg de pCLAMP (RK Naviaux et al, J. Viral, 70, 5701-5705 (1996)), e 18 yL de Dofect-GTl (reagente de transfecção; Laboratórios Dojindo) foi adicionado às células Phoenix Ampho (5 χ 105/ placa de 60-mm), e a mistura foi incubada a 37°C por quatro horas. Subseqüentemente, o meio de cultura foi mudado para um meio de cultura normal, e a mistura resultante foi cultivada por 48 horas. Após o cultivo, o sobrenadante foi coletado e centrifugado a 1.000 rom por 10 minutos. Retrovírus recombinantes contidos no sobrenadante foi dispensado e estocado a -80°C.

4. Estabelecimento da cepa celular que expressa estavelmente fibroblastos derivados em paciente de Fabry (F377) que expressa α-GAL, a-NAGA, ou a-NAGA S188E/A191L

Cada retrovírus recombinante expressando α-GAL, a- NAGA, e a-NAGA S188E/A101L preparado na seção 2 acima foi infectado em fibroblastos humanos (células F377) derivados de um paciente de Fabry para estabelecer células expressando estavelmente. Especificamente, o estabelecimento foi alcançado por feito seguindo os passos (i) a (v) :

(i)1 χ IO5 células F377 foram plaqueadas em uma placa de 60 mm e cultivada a 37°C por uma noite.

(ii) Polibreno (Sigma H-9266, Brometo de Hexadimetrina) foi adicionado ao meio de cultura deforma que

a concentração final de Polibreno foi 2 μg/mL, e culto foi feito a 37°C por 30 minutos.

(iii) O meio de cultura foi removido. Subseqüentemente, 1 mL de uma solução viral foi adicionado e foi adsorvido a 37°C por 60 minutos.

(iv) A solução viral foi removida. Subseqüentemente, 5 mL de um meio de cultura foi adicionado, e cultivo foi feito por uma noite.

(v) Cultivo foi feito com um meio seletivo em que G418 (250 pg/mL) foi adicionado a um meio de cultura. Então, células F377 resistentes a G418 foram estabelecidas. 0 meio seletivo foi mudado uma vez a cada três dias por 14 dias ou mais. Se ou não a célula estabelecida expressava a proteína alvo foi confirmada pela atividade da enzima e um método de Western blotting (seção 5 abaixo).

5. Confirmação da expressão da proteína alvo por método de Western blotting

A fim de examinar se ou não as células F377 expressando α-NAGA ou a-NAGA S188E/A191L que estabelecidas utilizando retrovírus expressando a proteína alvo, Western blotting foi feito. Um anticorpo policlonal anti-a-NAGA obtida por um método conhecido de preparar um anticorpo foi preparado como um anticorpo utilizado neste Western blotting.

Amostras para o Western blotting foram preparadas como segue. Células F377 expressando α-NAGA ou a-NAGA S188E/A191L cultivadas em uma placa de 60 mm foram temporarimente recobertas, e ressuspensas em um tampão de lise Tritin-X (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, e 1% de Triton-X). A suspensão foi então sujeita a um tratamento ultrassônico, e centrifugada a 12.00 rpm por cinco minutos. O sobrenadante foi recuperado e utilizado como uma amostra. SDS-PAGE foi feito como segue. A concentração de uma proteína da amostra foi medida. Subseqüentemente, um volume equivalente de 2x tampão de amostra SDS (62,5 mM Tris-HCl pH 6.8, SDS 4%, glicerol 30%, e 0,2% de bromofenol azul (BPB)) foi adicionada a amostra contendo 5 ug da proteína. A mistura foi fervida por cinco minutos, e a amostra resultante foi então aplicada a um gel de 4% a 20% (PAG mino: Daiichi Purê Chemicals Co., LTD.). Eletroforese foi feita em uma corrente constante de 30 mA por duas horas. Após a eletroforese, a fim de transferir a proteína a uma membrana de difluoreto de polivinil (PVDF) (Immobilon-P, MILLIPORE), o gel foi imerso em um tampão blotting (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 192 mM de glicano, e 20% metanol) por 20 minutos, e colocado em uma membrana OVDF equilibrada com o tampão blotting. Transferência foi então feita utilizando uma unidade de transferência semi-seca Hoefer TE 70 (Amersham Biosciences) em uma corrente constante de 60 mA por uma hora.

Após o término da transferência, a membrana foi bloqueada com um tampão bloqueador (5% de leite desnatado em Salina Tamponada com Tris (TBS) (50 mM de Tris-HCl pH 7.4 e 100 mM NaCl)) por 30 minutos. Um anticorpo anti-NAGA policlonal (anticorpo primário) diluído por 500 vezes com o :tampão bloqueador foi então adicionado ao mesmo, e incubação foi feita a 4oC por uma noite.

A membrana obtida após a incubação com o anticorpo primário foi lavada com TBS por cinco minutos. Esta lavagem foi feita três vezes. Um anticorpo marcado IgG HRP anti- coelho (anticorpo secundário; Amersham Biosciences) diluído por 5.000 vezes com tampão bloqueador foi então adicionado ao mesmo, e incubação foi feita em temperatura ambiente por uma hora.

A membrana obtida após a incubação com o anticorpo secundário foi lavada com TBS por cinco minutos. Esta lavagem foi feita três vezes. Um reagente colorante aumentador de quimioluminescência (ECL) (Nacalai Tesque, Inc.) foi adicionado ao mesmo, e reação foi feita em temperatura ambiente por dois minutos. Subseqüentemente, a membrana foi desenvolvida por manter em contato com Hyperfilm® ECL em uma sala escura por um minuto.

De acordo com os resultados, foi confirmado que as células F377 expressando α-NAGA estabelecida e células F377 expressando α-NAGA S188E/A191L expressando α-NAGA selvagem com um peso molecular de cerca de 45 kD e um mutante α-NAGA (α-NAGA S188E/A191L), respectivamente.

[EXEMPLO 3]

<Transição da atividade enzimática de mutante a-

NAGA>

O fato de que o mutante α-NAGA (α-NAGA S188E/A191L) tem adquirido a especificidade ao susbtrato de α-GAL foi confirmado pelo seguinte procedimento.

Primeiro, um gene de α-NAGA selvagem ou um gene de α-NAGA S188E/A191L foi introduzido em fibroblastos (F377) derivado de um paciente Fabry, e atividade α-GAL e atividade α-NAGA foram medidas. Células F377 foram utilizadas como um controle negativo de atividade α-GAL, e fibroblastos (F652) derivados de um paciente com doença Kanzaki (deficiência a- NAGA) foram utilizados como um controle negativo de atividade α-NAGA. Em adição, fibroblastos (F592) derivados de um paciente normal foram utilizados como um controle positivo de atividade α-GAL e α-NAGA endógena.

As células cultivadas em uma placa 60 mm foram recuperadas e ressuspensas em água Milli-Q. A suspensão foi então sujeita a um tratamento ultrassônico para preparar um homogenato celular. Este homogenato foi utilizado como uma amostra de uma solução enzimática. A atividade enzimática foi determinada utilizando um substrato sintético composto de derivado 4-metilumbeliferona (4-MU), que é um substrato fluorogênico, por medir a quantidade de 4-MU liberado por 1 mL da solução enzimática por hora como uma intensidade de fluorescência. Mais especificamente, 4-MU-a-D-galactosídeo (4-MU-a-GAL; Calbiochem, CA) foi utilizado como o substrato sintético de α-GAL. 4-MU-a-N-acetil-D-galactosaminideo (4- MU-a-NAGA; Moscerdam Substrates, Rotterdam) foi utilizado como o substrato sintético de α-NAGA. Na medida da atividade α-GAL, como um inibidor de α-NAGA, que reage com 4-MU-a-GAL ao mesmo tempo, N-acetil-D-galactosamina (Sigma, MO) foi adicionado a solução substrato antecipadamente de forma que a concentração final do mesmo foi 117 mM.

Um tampão McIlvain (ácido citrico/ácido fosfórico, pH 4.6, 60 pL) contendo 4-MU-a-NAGA 1 mM foi adicionado a uma solução enzimática (10 yL) e misturada, e uma reação foi feita a 37°C por 30 minutos. A reação foi terminada por adição de 0,2 M de tampão Glicina (pH 10, 7, 700 yL) . A fim de detectar a quantidade de 4-MU liberado, a quantidade de 4-MU foi medida em um comprimento de excitação de 4 50 nm utilizando um espectrofotômetro. A atividade especifica de α-GAL ou α-NAGA foi determinado por divisão pela concentração da proteína (mg/mL) da solução enzimática. A atividade específica foi definida como uma atividade enzimática na célula.

De acordo com os resultados da medida da atividade enzimática, α-NAGA S188E/A191L, que tem sido sujeito a uma dupla mutação de S188E/A191L, exibiu alta atividade a-GAL.

Este resultado mostrou que α-NAGA S188E/A191L adquiriu a especificidade ao substrato de a-GAL.

Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Transição de atividade enzimática do mutante a-NAGA

<table>table see original document page 82</column></row><table>

(nmol/hr/mg proteína)

[EXEMPLO 4]

A estabilidade do mutante α-NAGA no sangue (no plasma) foi confirmada por um procedimento abaixo.

Primeiro, uma solução enzimática de α-NAGA S188E/A191L foi preparada como no Exemplo 3. Em adição, como um controle, outra solução enzimática foi preparada na mesma maneira como a solução enzimática acima utilizando células preparadas por introdução de um gene de α-GAL selvagem em F377. Plasma (50 pL) de um paciente normal foi adicionado a cada das soluções enzimáticas (50 pL) e misturado. Uma reação foi então começada a 37oC, e 10 pL da mistura de reação foi analisada em intervalos para medir atividade a- GAL. A atividade enzimática foi medida como no Exemplo 3. A atividade α-GAL de uma amostra analisada no tempo de mistura da solução enzimática com plasma foi definida como o padrão (100%), e uma diminuição na atividade enzimática com tempo foi representada uma porcentagem.

De acordo com os resultados, α-NAGA S188E/A191L tiveram uma excelente habilidade mantendo a atividade a-GAL no sangue (no plasma), como comparado com α-GAL selvagem. Este resultado mostrou que α-NAGA S188E/A191L tiveram uma alta estabilidade no sangue.

Os resultados são mostrados na Tabela 3. Em adição, gráficos dos resultados são mostrados na Fig. 5.

Tabela 3

Testes de estabilidade do mutante α-NAGA no sangue

<table>table see original document page 83</column></row><table>

Aplicabilidade Industrial

De acordo com a presente invenção, uma proteína que tem atividade α-galactosidase e que é vantajosa neste não efeito colateral adverso alérgico é mostrado, a estabilidade no sangue é alta, e a proteína pode ser facilmente incorporada em uma célula de um órgão afetado pode ser provido. Esta proteína é muito útil como excelente nova enzima altamente funcional para a terapia para doença de Fabry.

pode codificar a proteína acima, um vetor recombinante contendo o gene, um transformante ou transdutor contendo o vetor recombinante, e um método de produzir a proteína. Além disso, um agente terapêutico para doença de Fabry contendo a proteína pode ser provida.

Em adição, a presente invenção provê um gene que

SEQUENCIA DE LISTAGEM LIVRE DE TEXTO

Seqüência No. 3: DNA recombinante

Seqüência No. 4: proteína recombinante

Seqüência No. 5: DNA sintético

Seqüência No. 6: DNA sintético

Seqüência No. 7: DNA sintético

Seqüência No. 8: DNA sintético

Seqüência No. 9: DNA sintética

Seqüência No. 10: DNA sintético

Seqüência No. 11: DNA sintético SEQÜÊNCIA DE LISTAGEM

<110> Tokyo Metropolitan Organization for Medicai Research Seiichi1 Aikawa Fumiko, Aikawa

<120> Uma enzima nova e altamente funcional obtida por converter uma especificidade ao substrato de uma enzima

<130> P05-0213

<150> JP 2005-333660

<151> 2005-11-18

<160> 15

<170> Patente na versão 3.3

<210> 1

<211> 1236

<212> DNA

<213> homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1).. (1236)

<400> 1

atg ctg ctg aag aca gtg ctc ttg ctg gga cat gtg gcc cag gtg ctg 48 Met Leu Leu Lys Thr Val Leu Leu Leu Gly His Vai Ala Gln Val Leu 15 10 15

atg ctg gac aat ggg ctc ctg cag aca cca ccc atg ggc tgg ctg gcc 96 Met Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala 20 25 30

tgg gaa cgc ttc cgc tgc aac att aac tgt gat gag gac cca aag aac 144 Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn 35 40 45

tgc ata agt gaa Cys I Ie Ser Glu 50

cag ctc ttc atg gag àtg gct gac cgg atg gca cag Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gin 55 60

192 gat gga tgg cgg gac atg ggc tac aca tac cta aac att gat gac tgc 240 Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys 65 70 75 80

tgg ate ggc ggt cgc gat gcc agt ggc cgc ctg atg cca gat ccc aag 288 Trp I Ie Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys 85 90 95

cgc ttc cct cat ggc att cct ttc ctg gct gac tac gtt cac tcc ctg 336 Arg Phe Pro His Gly I Ie Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu 100 105 110

ggc ctg aag ttg ggt ate tac gcg gac atg ggc aac ttc acc tgc atg 384 Gly Leu Lys Leu Gly I Ie Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met 115 120 125

ggt tac cca ggc acc aca ctg gac aag gtg gtc cag gat gct cag acc 432 Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp AJa Gln Thr 130 135 140

ttc gcc gag tgg aag gta gac atg ctc aag ctg gat ggc tgc ttc tcc 480 Phe Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser 145 150 155 160

acc ccc gag gag cgg gcc cag ggg tac ccc aag atg gct gct gcc ctg 528 Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu 165 170 175

aat gcc aca ggc cgc ccc ate gcc ttc tcc tgc age tgg cca gcc tat 576 Asn Ala Thr Gly Arg Pro I Ie Ala Phe Ser Cys Ser Trp Pro Ala Tyr 180 185 190

gaa ggc ggc ctc ccc cca agg gtg aac tac agt ctg ctg gcg gac ate 624 Glu Gly Gfy Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile 195 200 205

tgc aac ctc tgg cgt aac tat gat gac ate cag gac tcc tgg tgg age 672 Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp IIeGIn Asp Ser Trp Trp Ser 210 215 220

gtg ctc tcc ate ctg aat tgg ttc gtg gag cac cag gac ata ctg cag 720 Val Leu Ser I Ie Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp I Ie Leu Gln 225 230 235 240 cca gtg gcc ggc cct ggg cac tgg aat gac cct gac atg ctg ctc att 768 Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile 245 250 255

ggg aac ttt ggt ctc age tta gag caa tcc cgg gcc cag atg gcc ctg 816 Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu 260 265 270

tgg acg gtg ctg gea gcc ccc ctc ttg atg tcc aca gac ctg cgt acc 864 Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr 275 280 285

ate tcc gcc cag aac atg gac att ctg cag aat cca ctc atg ate aaa 912 I Ie Ser Ala Gln Asn Met Asp I Ie Leu Gln Asn Pro Leu Met I Ie Lys 290 295 300

ate aac cag gat ccc tta ggc ate cag gga cgc agg att cac aag gaa 960 I Ie Asn Gln Asp Pro Leu Gly I Ie Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu 305 310 315 320

aaa tet ctc ate gaa gtg tac atg cgg cct ctg tcc aac aag gct age 1008 Lys Ser Leu IIe Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser 325 330 335

gcc tta gtc ttc ttc age tgc agg acc gat atg cct tat cgc tac cac 1056 Ala Leu Val Phe Phe Ser Cys Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His 340 345 350

tcc tcc ctt ggc cag ctg aac ttc acc ggg tet gtg ata tat gag gcc 1104 Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala 355 360 365

cag gac gtc tac tca ggt gac ate ate agt ggc ctc cga gat gaa acc 1152 Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr 370 375 380

aac ttc aca gtg ate ate aac cct tca ggg gta gtg atg tgg tac ctg 1200 Asn Phe Thr Val IIe Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu 385 390 395 400

tat ccc ate aag aac ctg gag atg tcc cag cag tga 1236

Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln 405 410 <210> 2

<211> 411

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 2

Met Leu Leu Lys Thr Val Leu Leu Leu Gly His Val Ala Gln Val Leu 1 5 10 15

Met Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala 20 25 30

Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn 35 40 45

Cys I Ie Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln 50 55 60

Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys 65 70 75 80

Trp I Ie Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys 85 90 95

Arg Phe Pro His Gly IIe Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu 100 105 110

Gly Leu Lys Leu Gly IIe Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met 115 120 125

Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr 130 135 140 Phe Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser 145 150 155 160

Thr Pro GIu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu 165 170 175

Asn Ala Thr Gly Arg Pro I Ie Ala Phe Ser Cys Ser Trp Pro Ala Tyr 180 185 190

Glu Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp I Ie 195 200 205

Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser 210 215 220

Val Leu Ser Ile Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln 225 230 235 240

Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu I Ie 245 250 255

Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu 260 265 270

Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr 275 280 285

Ie Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys 290 295 300

Ue Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu 305 310 315 320 Lys Ser Leu I Ie Glu Val Tyr Wet Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser 325 330 335

Ala Leu Val Phe Phe Ser Cys Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His 340 345 350

Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala 355 360 365

Gln Asp Vai Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr 370 375 380

Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu 385 390 395 400

Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln 405 410

<210> 3

<211> 1236

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNArecombInante

<220>

<221> CDS

<222> (1).. (1236)

<400> 3

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144

tgc ata agt gaa cag ctc ttc atg gag atg gct gac cgg atg gca cag Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln 50 55 60

192

gat gga tgg cgg gac atg ggc tac aca tac cta aac att gat gac tgc Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys 65 70 75 80

240

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288

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432

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480

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528

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576

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624 Glu Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile 195 200 205

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cag gac gtc tac tca ggt gac ate ate agt ggc ctc cga gat gaa acc 1152 Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp I Ie Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr 370 375 380

aac ttc aca gtg ate ate aac cct tca ggg gta gtg atg tgg tac ctg 1200 Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu 385 390 395 400

tat ccc ate aag aac ctg gag atg tcc cag cag tga 1236

Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln 405 410

<210> 4

<211> 411

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Met Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala 20 25 30

Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn 35 40 45

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Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys 65 70 75 80

Trp Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys 85 90 95 Arg Phe Pro His Gly I Ie Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu 100 105 110

Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Het Gly Asn Phe Thr Cys Met 115 120 125

Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr 130 135 140

Phe Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser 145 1 50 155 160

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Asn Ala Thr Gly Arg Pro I Ie Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr 180 185 190

Glu GIy Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp I Ie 195 200 205

Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser 210 215 220

Val Leu Ser Ile Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln 225 230 235 240

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Gly Asn Phe Giy Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu 260 265 270 Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr 275 280 285

Ile Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys 290 295 300

I Ie Asn Gln Asp Pro Leu Gly I Ie Gln Gly Arg Arg I Ie His Lys Glu 305 310 315 320

Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser 325 330 335

Ala Leu Val Phe Phe Ser Cys Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His 340 345 350

Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala 355 360 365

Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr 370 375 380

Asn Phe Thr Val I Ie I Ie Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu 385 390 395 400

Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln 405 410

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<211> 24

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<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

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<220>

<223>

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<210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial

<220>

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<400> 7

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<210> 8

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<220>

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<210> 10

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<212> DNA

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<220>

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<210> 11

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<220>

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<210> 12

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<220>

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gac tgg gga gta gat ctg cta aaa ttt gat ggt tgt tac tgt gac agt 528 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 ttg gaa aat ttg gca gat ggt tat aag cac atg tcc ttg gcc ctg aat 576 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190

agg act ggc aga age att gtg tac tcc tgt gag tgg cct ctt tat atg 624 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Het 195 200 205

tgg ccc ttt caa aag ccc aat tat aca gaa ate cga cag tac tgc aat 672 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220

cac tgg cga aat ttt gct gac att gat gat tcc tgg aaa agt ata aag 720 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp I Ie Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240

agt ate ttg gac tgg aca tet ttt aac cag gag aga att gtt gat gtt 768 Ser I Ie Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg I Ie Val Asp Val 245 250 255

gct gga cca ggg ggt tgg aat gac cca gat atg tta gtg att ggc aac 816 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270

ttt ggc ctc age tgg aat cag caa gta act cag atg gce ctc tgg gct 864 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285

ate atg gct gct cct tta ttc atg tet aat gac ctc cga cac ate age 912 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg Hls Ile Ser 290 295 300

cct caa gcc aaa gct ctc ctt cag gat aag gac gta att gcc ate aat 960 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320

cag gac ccc ttg ggc aag caa ggg tac cag ctt aga cag gga gac aac 1008 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335

ttt gaa gtg tgg gaa cga cct ctc tca ggc tta gcc tgg gct gta gct 1056 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 atg ata aac cgg cag gag att ggt gga cct cgc tct tat acc ate gea 1104 Met I Ie Asn Arg Gln Glu I Ie Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr I Ie Ala 355 360 365

gtt gct tcc ctg ggt aaa gga gtg gcc tgt aat cct gcc tgc ttc ate 1152 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380

aca cag ctc ctc cct gtg aaa agg aag cta ggg ttc tat gaa tgg act 1200 Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400

tca agg tta aga agt cac ata aat ccc aca ggc act gtt ttg ctt cag 1248 Ser Arg Leu Arg Ser His I Ie Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415

cta gaa aat aca atg cag atg tca tta aaa gac tta ctt taa 1290

Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425

<210> 13 <211> 429 <212> PRT <213> homo <400> 13

Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 15 10 15

Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu 20 25 30

Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu 35 40 45

Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile 50 55 60 Ser GIu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Giu Gly 65 70 75 80

Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met 85 90 95

Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg 100 105 110

Phe Pro His Gly I Ie Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly 115 120 125

Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly 130 135 140

Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160

Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175

Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys Hls Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190

Arg Thr Gly Arg Ser I Ie Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205

Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220

His Trp Arg Asn Phe Ala Asp I Ie Asp Asp Ser Trp Lys Ser lie Lys 225 230 235 240 Ser Me Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255

Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270

Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285

Lle Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His I Ie Ser 290 295 300

Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu GIn Asp Lys Asp Val I Ie Ala Ile Asn 305 310 315 320

Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gin Gly Asp Asn 325 330 335

Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350

Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365

Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380

Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400

Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415 Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> homo sap i ens

<220>

<221> CDS <222> (1).. (45)

<400> 14

atg tct gca ctt ctg ate cta gct ctt gtt gga gct gea gtt gct Met Ser Aia Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala 15 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> homo sapίens

<400> 15

Met Ser Ala Leu Leu I Ie Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala 15 10 15

Claims

1. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade α-galactosidase adquirida por mudar a estrutura do sítio ativo da α-Ν-acetilgalactosaminidase humana selvagem.

2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína tem a especificidade ao substrato de α-galactosidase.

3. Proteína tendo atividade α-galactosidase, CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma seqüência aminoácida em que pelo menos um do 188° aminoácido e o 191° aminoácido na seqüência aminoácida da a-N- acetilgalactosaminidase humana selvagem é substituída com outro aminoácido, ou uma seqüência aminoácida em que um ou vários aminoácidos exceto o 188° aminoácido e o 191° aminoácido inclusos na seqüência aminoácida substituída são apagados, substituídos, ou adicionados.

4. Proteína, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o 188° aminoácido é substituído com ácido glutâmico ou ácido aspártico.

5. Proteína, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o 191° aminoácido é substituído com um selecionado do grupo consistindo de leucina, valina, isoleucina, fenilalanína, e metionina.

6. Proteína, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o 188° aminoácido é substituído com ácido glutâmico, e o 191° aminoácido é substituído com leucina.

7. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de ser descrita por (a) ou (b): (a) uma proteína contendo qualquer uma das seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii): (i) uma seqüência aminoácida composta do 18° aminoácido ao 411° aminoácido incluso em uma seqüência aminoácida em que o 188° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que serina na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2; (ii) uma seqüência aminoácida composta do 18° aminoácido ao 411° aminoácido incluso em uma seqüência aminoácida em que o 191° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que alanina na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2; e (iii) uma seqüência aminoácida composta do 18° aminoácido ao 411° aminoácido incluso em uma seqüência aminoácida em que o 188° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que serina e o 191° aminoácido é substituído com um aminoácido outro que alanina na seqüência aminoácida mostrada na seqüência No. 2; ou (b) uma proteína contendo uma seqüência aminoácida em que um ou vários aminoácidos outros que o aminoácido ou aminoácidos localizados no sítio ou sítios de substituição são apagados, substituídos, ou adicionados em qualquer uma das seqüências aminoácidas descritas por (i) a (iii), e tendo atividade α-galactosidase.

8. Proteína, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido outro que serina é ácido glutâmico ou ácido aspártico.

9. Proteína, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido outro que alanina é um selecionado do grupo consistindo de leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, e metionina.

10. Proteína, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido outro que serina é ácido glutâmico, e o aminoácido outro que alanina é leucina.

11. Gene, CARACTERIZADO pelo fato de codificar a proteína conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

12. Gene, CARACTERIZADO pelo fato de compreender DNA descrito por (a) ou (b): (a) DNA contendo qualquer uma das seqüências base descritas por (i) a (iii): (i) uma seqüência base composta das 52a a 1.236a bases inclusas em uma seqüência base em que as 562a a 564a bases são substituídas com bases representando um códon de um aminoácido outro que serina na seqüência base mostrada na seqüência No. 1; (ii) uma seqüência base composta das 52a a 1.236a bases inclusas em uma seqüência base em que as 571a a 573a bases são substituídas com bases representando um códon de um aminoácido outro que alanina na seqüência base mostrada na seqüência No. 1; e (iii) uma seqüência base composta das 52a a 1.236a bases inclusas em uma seqüência base em que as 562a a 564a bases são substituídas com bases representando um códon de um aminoácido outro que serina e as 571a a 573a bases são substituídas com bases representando um códon de um aminoácido outro que alanina na seqüência base mostrada na seqüência No. 1; ou (b) DNA que codifica uma proteína tendo atividade α-galactosidase e que hibridiza com DNA composto de uma seqüência base complementar ao DNA contendo qualquer uma das seqüências base descritas por (i) a (iii) sob uma condição rigorosa, em que bases correspondendo às bases nos sítios de substituição são idênticas . às bases nos sítios de substituição.

13. Gene, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido outro que serina é ácido glutâmico ou ácido aspártico.

14. Gene, de acordo com a reivindicação 12 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido outro que alanina é um selecionado do grupo consistindo de leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, e metionina.

15. Gene, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido outro que serina é ácido glutâmico, e o aminoácido outro que alanina é leucina.

16. Vetor recombinante CARACTERIZADO pelo fato de compreender o gene conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 11 a 15.

17. Transformante CARACTERIZADO pelo fato de compreender o vetor recombinante conforme descrito na reivindicação 16.

18. Método de produção de uma proteína tendo atividade α-galactosidase, CARACTERIZADO pelo fato de que a estrutura do sitio ativo da a-N-acetilgalactosaminidase humana selvagem é mudada a fim de que um substrato da a- galactosidase pode ser encontrada no sitio ativo.

19. Método de produzir uma proteína tendo atividade α-galactosidase, CARACTERIZADA pelo fato de compreender um passo de cultivar o transformante, conforme descrito na reivindicação 17, e um passo de coletar a proteína tendo atividade α-galactosidase a partir do produto cultivado resultante.

20. Composição farmacêutica, CARATERIZADA pelo fato de compreender a proteína conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

21. Agente terapêutico para doença de Fabry, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a composição conforme descrito na reivindicação 20 como um ingrediente ativo.

22. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de compreender o gene conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 11 a 15.

23. Agente terapêutico gênico para doença de Fabry, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a composição conforme descrito na reivindicação 22 como um ingrediente ativo.

24. Método de tratar a doença de Fabry, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição farmacêutica conforme descrita na reivindicação 20 a 22 é administrada a um paciente de Fabry.