BRPI0616374A2 - formas de sal sólido para um pirrol substituìdo 2-indolinona, composição farmacêutica compreendendo as mesmas, método para modulação de atividade catalìtica de proteìna quinase, proteìna quinase, métodos pra preparação de cristais e de polimorfos e uso - Google Patents

Abstract

FORMAS DE SAL SóLIDO PARA UM PIRROL SUBSTITUIDO 2-INDOLINONA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMPREENDENDO AS MESMAS, MéTODO PARA MODULAçãO DE ATIVIDADE CATALITICA DE PROTEINA QUINASE, PROTEINA QUINASE, MéTODOS PARA PREPARAçãO DE CRISTAIS E DE POLIMORFOS E USO. A presente invenção refere-se a formas de saí sólido de um composto 3-pirrol substituído 2-indolinona, (2-pirroíidina-1-iI-etil)-amida de ácido 5-[5-fíúor-2-oxo-1 ,2-di-h idro-indol-(3Z)-iíidenometiíjl-2 ,4-d imetil- 1 H-pirroí-3- carboxílico. Também refere-se a polimorfos do saí fosfato da amida. A invenção ainda refere-se ao uso dos sais e polimorfos no tratamento de distúrbios relacionados com proteína quinase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMAS DESAL SÓLIDO PARA UM PIRROL SUBSTITUÍDO 2-INDOLINONA, COM-POSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO AS MESMAS, MÉTODOPARA MODULAÇÃO DE ATIVIDADE CATALÍTICA DE PROTEÍNA QUI-NASE, PROTEÍNA QUINASE, MÉTODOS PARA PREPARAÇÃO DE CRISTAIS E DE POLIMORFOS E USO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a formas de sal sólido de umcomposto 3-pirrol substituído 2-indolinona, (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida deácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pir-rol-3-carboxílico. Os compostos antecedentes modulam a atividade de prote-ína quinases ("PKs"). Os compostos desta invenção são, por essa razão,úteis no tratamento de distúrbios relacionados com uma atividade anormalde PK. Composições farmacêuticas compreendendo sais deste composto emétodos de preparação das mesmas são descritos. A presente invençãotambém é direcionada a polimorfos da forma de sal de fosfato da amida.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O que segue, é oferecido apenas como informação de antecedentes e não deve ser admitido como sendo técnica anterior para a presente invenção.

Sólidos, incluindo fármacos, freqüentemente têm mais de umaforma cristalina, e isso é conhecido como polimorfismo. Polimorfismo ocorrequando um composto cristaliza em uma multiplicidade de fases sólidas quediferem em uma compactação de cristaí. Numerosos exemplos são citadosnas referências padrão de propriedades em estado sólido de fármacos, B-yrn, S. R., Solid-State Chemistry of Drugs, New York, Academic Press(1982); Kuhnert-Brandstatter, M., Thermomiscroscopy In The Analysis ofPharmaceuticals, New York, Pergamon Press (1971) e Haleblian, J. K. eMcCrone, W. Pharmaceutical applications of polymorphism. J. Pharm. Sci.,58, 911 (1969). Byrn afirma que, em geral, polimorfos exibem característicasfísicas diferentes incluindo solubilidade e estabilidade física e química.

Devido a diferenças na compactação molecular, polimorfos po-dem diferir nas formas que influenciam a liberação de fármacos, estabilidadeno estado sólido, e produção farmacêutica. A estabilidade relativa e as inter-conversões dos polimorfos são particularmente importantes para a seleçãodo fármaco comercializado. Um polimorfo adequado pode articular a ques- tão da estabilidade física. Por exemplo, a seleção do fármaco comercializa-do pode depender da disponibilidade e seleção de um polimorfo adequadopossuindo características desejáveis, tais como uma excelente estabilidadefísica ou uma habilidade para ser produzido em larga escala. O desempe-nho da forma de dosagem do sólido não deve ser limitado a transformaçõespolimórficas durante a vida na prateleira do produto. É importante observarque não existe método confiável para predizer as estruturas de cristal obser-váveis de um fármaco dado ou para prever a existência de polimorfos compropriedades físicas desejáveis.

Pks são enzimas que catalisam a fosforilação dos grupos hidróxina tirosina, serina, e resíduos de treoninas das proteínas. As conseqüênciasdesta atividade aparentemente simples são surpreendentes, uma vez quevirtualmente todos os aspectos da vida celular (por exemplo, crescimentocelular, diferenciação, e proliferação) em uma forma ou outra dependem daatividade de PK. Além disso, atividade anormal de PK foi relatada para umasérie de distúrbios, variando de doenças relativamente não fatais tais comopsoríase para doenças extremamente mortais tais como glioblastoma (cân-cer cerebral).

Receptores de tirosina quinase (RTKs), uma classe de PK1 sãoexcelentes candidatos para terapia molecular direcionada, porque eles de-sempenham papéis-chave no controle da proliferação celular e da sobrevi-vência e são freqüentemente desregulados em várias malignidades. Os me-canismos de desregulação incluem superexpressão (Her2/neu no câncer demama, receptor de fator de crescimento epidérmico em câncer pumonar cé-lulas não-pequenas), mutações ativadoras (KIT em tumores de estroma gas- trointestinal, tirosina quinase3/Flk2 (FLT3) relacionada com fms em leucemiamielogênica aguda), e laços autócrinos de ativação (receptor VEGF de fatorde crescimento endotelial vascular (VEGF/VEGFR) em melanoma, receptorPDGF/fator de crescimento de derivado de plaquetas (PDGF/ PDGFR) emsarcoma).

mano e canino comparáveis. Por exemplo, expressão anômala do oncogeneMet ocorre tanto no osteosarcoma humano quanto no canino. De maneirainteressante, mutações de ativação comparáveis no domínio da justamem-brana (JM) do c-kit são vistas em 50 a 90% tumores de estroma gastrointes-tinal de humano (GISTs) e em 30 a 50% de MCTs caninos avançados (tu-mores de mastócitos). Embora as mutações em GISTs humanos consistamem deleções no domínio de JM e aqueles em MCTs caninos consistam emduplicações em tandem internas (ITDs) no domínio de JM, ambos levando afosforilação constitutiva de KIT na ausência de ligação de ligando. As RTKse seus ligandos, VEGF, PDGF, e FGF mediam a neovascularização, conhe-cida como angiogenese, em tumores sólidos. Consequentemente, por inibi-ção de RTKs, o crescimento de novos vasos sangüíneos dentro do tumorpode ser inibido.

o crescimento de vasos sangüíneos dentro do tumor, têm muito baixa toxi-dade para o corpo comparada com fármacos anticâncer convencionais. Pa-tente US 6,573,293, incorporada aqui por referência, descreve, dentre ou-tros compostos, (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico (em seguida"composto I"). Tem a seguinte estrutura:

RTKs aberrantemente reguladas foram descritas em câncer hu-Agentes de antiangiogenese, uma classe de moléculas que inibe

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Composto I

Composto I é uma molécula pequena que apresenta a habilida-de de modulação de PK. O composto é consequentemente útil no tratamen-to de distúrbio relacionado com a atividade anormal de PK. É um inibidor deRTKs, PDGFR, VEGFR, KIT, e FLT3. Composto I foi mostrado para inibir afosforilação de KIT, deter a proliferação celular, e induzir a parada do ciclocelular e apoptose em linhagens de células -tronco malignas in vitro expres-sando várias formas do KIT mutante. Composto I e moléculas relacionadassão eficazes em modelos pré-clinicos contra xenoenxertos de tumor origi-nando-se das linhagens celulares de diversas origens de tumor humano.

Composto I é útil no tratamento de cânceres em animais domés-ticos, principalmente cães, e também é útil no tratamento de, inter alia, cân-cer em humanos. Tais cânceres incluem, mas não estão limitados a, leuce-mia, câncer de cérebro, câncer de pulmão não-pequenas células, carcinomacelular escamoso, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, câncerpulmonar, câncer de bexiga, câncer de pescoço e cabeça, câncer pulmonarcélulas pequenas, glioma, câncer colorretal, câncer geniturinário, e câncerde estroma gastrointestinal. Também, o composto I é útil para tratamento dedoenças relacionadas com a superexpressão das células-tronco, incluindomas não limitadas a, mastocitose em humanos e tumores de mastócitos em cães.

Composto I foi recentemente mostrado como sendo eficaz con-tra um número de malignidades espontâneas em cães. No estudo, 11 de 22MCTs caninos mostraram respostas objetivas duráveis (respostas parciais erespostas completas) para tratamento com composto I, 9 destes MCTs pos-suíam ITDs no domínio JM de c-kit.

Composto I prontamente cristaliza. Sua solubilidade é de cercade 10 μg/mL em pH 6 de tampão fosfato a 25°C. Quando o composto foisintetizado, partículas muito finas precipitaram-se da solução durante a últi-ma etapa da síntese. Subsequente isolamento destas partículas finas porfiltração foi lento, e um bolo duro resultou após filtração. Existe uma neces-sidade para um sal do composto I que tenha estabilidade física e proprieda-des físicas desejáveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOA invenção compreende formas de sais do composto I. Cincodiferentes formas de sal do composto I foram sintetizadas e estão descritasaqui. (Vide tabela I). Estes incluem os sais de cloridrato, fumarato, citrato,fosfato, e ascorbato do composto I. Baseado na caracterização destes sais,o sal de fosfato 1:1, fosfato de composto I, foi identificado como uma formade sal com características altamente desejáveis. A triagem de polimorfosrelevou a existência de 10 polimorfos do fosfato de composto I, aqui nomea-das de formas I até X.

Em um aspecto, esta invenção provê duas formas de sais docomposto I, onde a forma de sal é selecionada dentre sais de citrato e defosfato, e solvatos e polimorfos dos mesmos. Em uma forma de concretiza-ção, a forma de sal de fosfato com uma fórmula molecular deC22H25FN4O2 H3O4P é selecionada. Em outra forma de concretização, a formade sal de fosfato com um ponto de fusão de cerca de 285 a cerca de 290°Cé selecionada. Fosfato de composto I tem uma estrutura de fosfato de composto I

Em outra forma de concretização, o sal de citrato, citrato de compostoI, que tem uma fórmula molecular de C22H25FN4O2 C6H8O7 é selecionado.Em ainda outra forma de concretização, a forma de sal de citrato com umponto de fusão de cerca de 178 a cerca de 183° C é selecionada. Citrato docomposto I tem uma estrutura de<formula>formula see original document page 7</formula>

Um segundo aspecto da invenção é uma composição farmacêu-tica incluindo o sal de fosfato ou o sal de citrato de composto I, ou solvatosou polimorfos dos mesmos, e um veículo farmaceuticamente aceitável ouexcipiente.

Um terceiro aspecto da invenção é um método de modulação daatividade catalítica de proteína quinases incluindo contatar a referida proteí-na quinase com os sais de fosfato ou citrato de composto I, ou solvatos oupolimorfos dos mesmos. A proteína quinase pode ser selecionada dentre ogrupo consistindo em receptores de tirosina quinase, não receptores de pro-teína tirosina quinase, e serina/treonina proteína quinases.

Um quarto aspecto da invenção é um método para prevençãoou tratamento de um distúrbio relacionado com a proteína quinase em umorganismo incluindo administrar ao referido organismo uma quantidade tera-peuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo o salde fosfato ou o sal de citrato de composto I, ou solvatos ou polimorfos dosmesmos, e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente. Em umaforma de concretização, o organismo é de um ser humano. Em outra formade concretização,o organismo é de um animal doméstico. Em também outraforma de concretização, o animal doméstico é um gato ou um cão. O distúr-bio relacionado com a proteína quinase pode ser selecionado dentre o grupoconsistindo em um distúrbio relacionado com receptor de tirosina quinase,um distúrbio relacionado com não receptor de proteína tirosina quinase, eum distúrbio relacionado com proteína serina/treonina quinase. O distúrbiorelacionado com proteína quinase pode ser selecionado dentre o grupo con-sistindo em um distúrbio relacionado com EGFR, um distúrbio relacionadocom PDGFR, um distúrbio relacionado com IGFR1 um distúrbio relacionadocom c-kit, e um distúrbio relacionado com FLK. Tais distúrbios incluem, atítulo de exemplos e não-limitação, leucemia, câncer de cérebro, câncerpulmonar em células não-pequenas, carcinoma celular escamoso, astroci-toma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, câncer pulmonar, câncer de bexiga,câncer de cabeça, câncer de pescoço, melanoma, câncer de ovário, câncerde próstata, câncer de mama, câncer pulmonar células pequenas, glioma,mastocitose, tumor de mastócitos, câncer de colorretal, câncer geniturinário,câncer gastrointestinal, diabetes, uma doença autoimune, uma doença dehiperproliferação, restenose, fibrose, psoríase, doença de von Heppel-Lindau, osteoartrite, artrite reumatoide, angiogênese, um distúrbio inflamató-rio, um distúrbio imunológico, e um distúrbio cardiovascular.

Um quinto aspecto da invenção é um método de preparação decristais de sal de fosfato de base de (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3- car-boxílico que inclui a introdução de uma quantidade estequiométrica de ácidofosfórico para a base na solução incluindo um solvente ou uma mistura desolventes, forçando o sal de fosfato em solução a cristalizar, separando oscristais de sal de fosfato da solução solvente, e secando os cristais. O ácidofosfórico pode ser introduzido em uma quantidade que é 40% de excessomolar para a base. O solvente pode incluir isopropanol. A etapa de separa-ção dos cristais da solução solvente pode incluir adição de acetonitrila paraa solução e submetendo a solução a evaporador rotativo. A etapa de sepa-ração dos cristais da solução de solvente pode incluir também filtração.

Um sexto aspecto da invenção é um método de preparação decristais de sal de citrato da base de (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3- car-boxílico que inclui a introdução de uma quantidade estequiométrica de ácidocítrico para a base em uma solução incluindo um solvente ou uma misturade solventes, forçando o sal de citrato em solução a cristalizar, separandoos cristais de sal de citrato da solução solvente, e secando os cristais.O áci-do cítrico pode também ser introduzido em cerca de 40% de excesso molarpara a base. O solvente pode incluir metanol. A etapa de separação doscristais da solução do solvente pode incluir a adição de acetonitrila para asolução e submetendo a solução a evaporador rotativo. A etapa de separa-ção dos cristais da solução do solvente pode incluir filtração.

Em um sétimo aspecto, a invenção provê os polimorfos formas I-X (como descritos aqui) do sal de fosfato de composto I. Em uma forma deconcretização, forma I é provida.

Um oitavo aspecto da invenção é uma composição farmacêuticaincluindo o polimorfo de forma I do fosfato de composto I e um veículo far-maceuticamente aceitável ou excipiente.

Um nono aspecto da invenção é um método para a modulaçãoda atividade catalítica da proteína quinase incluindo contatar a referida pro-teína quinase com o polimorfo de forma I do fosfato de composto I.

Um décimo aspecto da invenção é um método de prevenção outratamento de um distúrbio relacionado com proteína quinase em um orga-nismo, administrando ao referido organismo uma quantidade terapeutica-mente eficaz de polimorfo de forma I de fosfato de composto I. Em uma for-ma de concretização, o organismo é de um ser humano ou de um animaldoméstico. Em outra forma de concretização, o animal doméstico é um gatoou um cão. Estes distúrbios incluem, a título de exemplo, e não-limitação,tumor de mastócitos e mastocitose.

Um décimo primeiro aspecto da invenção é um método de pre-paração de polimorfos do fosfato de composto I, que inclui introduzir o sal defosfato a uma solução incluindo um solvente ou uma mistura de solventes,opcionalmente, adicionando um solvente de ligação em ponte a solução, eseparando os cristais polimorfos da solução de solvente. A solução podeincluir água mais acetonitrila. A solução pode compreender metanol. O sol-vente de ligação em ponte pode ser metanol.

Um décimo segundo aspecto da invenção é o uso dos sais defosfato ou citrato de composto I ou o polimorfo de forma I do sal de fosfatona preparação de um medicamento que é útil no tratamento de uma doençamediada por uma atividade anormal de PK.DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Dados de sorção de umidade para sais do composto I.

Figura 2. Padrões de difração de raios X do pó do citrato decomposto I e fosfato de composto I.

Figura 3. Padrões de difração de raios X do pó dos dez únicossólidos obtidos do estudo de triagem de polimorfos (Vide exemplo 5). Daforma I até forma X como designado nas Tabelas 5 e 6 são apresentadas.

Figura 4. Curvas de TGA de sólidos de CH2CI2 (Forma Vl1 ime-diatamente após precipitação), Hexano (Forma VII, após permanecer duran-te a noite), e acetonitrila (Forma VIII, após permanecer por 3 dias).

Figura 5. Resultados de eletroforese em gel de agarose de pro-dutos de PCR de MCTs avaliados no exemplo 7. Trilhas de 1 a 5 correspon-dem a pacientes de 1 a 5 na tabela 8; Trilhas de 6 a 14 correspondem a pa-cientes 6-14 na Tabela 8. Controles consistidos em produtos de PCR gera-dos da linhagem de células-tronco caninas C2 contendo um ITD 48-pb (Tri-lha 15) e de cerebelo canino normal (tipo selvagem; Trilha 16).

Figura 6. Reduções em MCT fosforilado KIT e quinase reguladade sinal regulado extracelular fosforilado (ERK)I/2 após uma dose única defosfato de composto I.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições. Salvo indicado os seguintes termos utilizados norelatório e reivindicações têm os significados discutidos abaixo:O termo "C" quando usado em referência à temperatura significacentígrados ou Celsius.

O termo "atividade catalítica" refere-se a taxa de fosforilação datirosina sob a influência, direta ou indireta, de RTKs e/ou CTKs ou a fosfori-lação da serina e treonina sob a influência, direta ou indireta, de STKs.

O termo "animal doméstico" refere-se a animais domesticadosoferecendo companhia a seres humanos, e inclui, mas não é limitado a, ga-tos e cães.O termo "contatar" refere-se a levar um composto da presenteinvenção e um PK alvo juntos de tal maneira que o composto possa afetar aatividade catalítica de PK1 quer diretamente, isto é, por interação com a pró-pria quinase, ou indiretamente, isto é, por interação com outra molécula emque a atividade catalítica da quinase é dependente.

O termo "IC50" significa a concentração de um composto de tes-te que realiza uma inibição meia-máxima da atividade de PK.

O termo "modulação" ou "modulando" refere-se à alteração naatividade catalítica de RTKs, CTKs, e STKs. Em particular, modulação refe-re-se à ativação ou inibição da atividade catalítica de RTKs, CTKs, e STKs,preferivelmente a ativação da atividade catalítica de RTKs, CTKs, e STKs,dependendo da concentração dos compostos ou sal aos quais RTK, CTK,ou STK são expostos ou, mais preferivelmente, a inibição da atividade cata-lítica de RTKs, CTKs, e STKs.

O termo "PK" refere-se ao receptor de proteína tirosina quinase(RTKs), ou não receptor de tirosina quinase "celular" (CTKs) e serina-treonina quinases (STKs).

O termo "polimorfo" refere-se à fase sólida de uma substância,que ocorre em várias formas distintas devido às diferentes modalidades e/ouconfirmações da molécula em retículo de cristal. Polimorfos tipicamente têmdiferentes propriedades físicas e químicas.

O termo "excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se aqualquer substância diferente de um composto da invenção, adicionado auma composição farmacêutica.

O termo "composição farmacêutica" refere-se à mistura de umou mais dos sais da presente invenção ou os polimorfos dos tais sais, comodescrito aqui, com outros componentes químicos, tais como veículos fisiolo-gicamente/farmaceuticamente aceitáveis e excipientes. O propósito da com-posição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.

O termo "veículo fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável"refere-se a um veículo ou diluente que não causa irritação significante a umorganismo e não anula a atividade biológica ou propriedade do compostoadministrado.

O termo "polimorfo" pode também ser definido como diferentesformas do cristal não-solvatado de um composto. O termo também incluisolvatos (isto é, formas contendo solvente, ou água), formas amorfas (isto é,formas não-cristalinas), e solvatos dessolvatados (isto é, formas que podemapenas ser feitas por remoção do solvente de um solvato).

O termo 'solvato' é usado para descrever um complexo molecu-lar incluindo um composto da invenção e uma ou mais moléculas do solven-te farmaceuticamente aceitável, por exemplo, etanol. O termo 'hidrato' éempregado quando o referido solvente é água.

O termo "substancialmente livre" em relação à quantidade deum certo polimorfo em uma amostra significa que outros polimorfos estãopresentes em uma quantidade inferior a cerca de 15% em peso. Em outraforma de concretização, "substancialmente livre" significa inferior a cerca de10% em peso. Em outra forma de concretização, "substancialmente livre"significa inferior a cerca de 5% em peso. Em ainda outra forma de concreti-zação, "substancialmente livre" significa inferior a cerca de 1% em peso. Oversado na técnica deve entender que a frase "em uma quantidade inferior acerca de 15% em peso" significa que o polimorfo de interesse está presenteem uma quantidade de mais que cerca de 85% em peso. Do mesmo modo,a frase "inferior a cerca de 10% em peso " significa que o polimorfo de inte-resse está presente em uma quantidade de mais do que cerca de 90% empeso, e assim por diante.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quan-tidade do composto que foi administrada que irá impedir, aliviar, ou melhorarum ou mais dos sintomas do distúrbio que foi tratado, ou prolongar a sobre-vivência do indivíduo que foi tratado. Em referência ao tratamento do câncer,uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a que quantidade quetem o efeito de:

(1) reduzir o tamanho do tumor;

(2) inibir (isto é, retardar em alguma extensão, ou parar) a me-tástase do tumor;

(3) inibir (isto é, retardar em alguma extensão, ou parar) ocrescimento do tumor, e/ou,

(4) aliviar, em alguma extensão (ou eliminar) um ou mais sin-tomas associados com o câncer.

Formas de sal diferentes do composto I podem ser sintetizadaspara obter uma forma com melhores propriedade físicas. O composto debase pode estar em solução. A solução é geralmente um solvente. Em umaforma de concretização, a solução é um álcool. Em outra forma de concreti-zação, o solvente pode ser isopropanol, metanol, acetonitrila, ou água maisacetonitrila. A solução pode incluir também uma mistura de solventes.

Os sais podem ser cristalizados utilizando uma técnica de adi-ção/cristalização estequiométrica. Uma quantidade estequiométrica do con-traíon é introduzida para a base em solução. Em uma forma de concretiza-ção, a quantidade de contraíon está em uma relação de 1:1 para a base.

Em outra forma de concretização, a quantidade de contraíon é de 0% a cer-ca de 60% de excesso molar para a base. Em outra forma de concretização,a quantidade de contraíon é de cerca de 10% a cerca de 50% de excessomolar para a base. Em ainda outra forma de concretização, a quantidade decontraíon é de cerca de 40% de excesso molar para a base. Os contraíonspodem incluir íons de: cloridrato, fumarato, citrato, fosfato, e ascorbato. Emuma forma de concretização, o contraíon é o íon fosfato. Em outra forma deconcretização o contraíon é o íon citrato.

O sal em solução é então forçado a cristalizar por uma varieda-de de técnicas comuns incluindo resfriamento, evaporação, imersão, etc.,conhecidos de um versado na técnica. Excesso de solventes pode ser re-movido das amostras por métodos conhecidos por um versado na técnica.Em uma forma de concretização os solventes são removidos da solução poradição de acetonitrila (ACN) e submetendo a evaporador rotativo a solução.

A solução pode ser submetido a evaporador rotativo de cerca de 40°C acerca de 60°C.Em outra forma de concretização, solventes adicionais po-dem ser adicionados para a solução (por exemplo, isopropanol e metil etilcetona) antes de submeter a rotovap (evaporador rotativo). As cristalizaçõespodem ser conduzidas no escuro para prevenir isomerização induzida porluz. Em uma forma de concretização, os cristais são removidos por filtração.

Em outra forma de concretização, filtração pode ser realizada em atmosferaambiente de laboratório.

Por estes métodos, o sal ascorbato, citrato, fumarato, cloridrato,e fosfatos do composto I foram cristalizados. Exemplos específicos de mé-todos de cristalização são providos abaixo. Análise HPLC pode ser usadapara determinar por teste conhecido para um versado na técnica, incluindodeterminação do ponto de fusão, difração do pó de raio X, e gravimetria di-nâmica de sorção de umidade. Parâmetros para estes testes estão descritosabaixo.

Essas cinco formas de sal estão descritas aqui (Ver tabela 1).

Estes sais do composto I são freqüentemente higroscópicos. Por exemplo,como pode ser visto na tabela 1, a 80 por cento de umidade, o sal de clori-drato foi cerca de 20 por cento de água, o sal de fumarato foi cerca de 9 porcento de água, e o sal de ascorbato foi cerca de 6,5 por cento de água. Es-sa característica pode fazer uso do sal em uma formulação farmacêuticadifícil e podem encurtar o período de vida útil na prateleira de uma formula-ção. Entretanto, dois sais, os sais de fosfato e de citrato, foram verificadoscomo contendo inesperadamente uma absorção de umidade baixa, conten-do cerca de 1 por cento de e cerca de 3,8 por cento de água a 80 por centode umidade relativa, respectivamente.

Baseado na caracterização destes sais, o sal de fosfato 1:1, fos-fato de composto I, foi identificado como uma forma de sal com característi-cas altamente desejáveis, incluindo boa cristalinidade, baixa absorção deumidade, facilidade de cristalização, boa pureza, e falta de hidrato. Dez po-limorfos do fosfato de composto I, aqui chamados de formas de I até X, sãotambém descritos. O sal de citrato também demonstrou características dese-jáveis, tais como baixa absorção de umidade e boa cristalinidade.

Polimorfos dos compostos da presente invenção são desejáveisporque um polimorfo particular do composto pode ter melhores propriedadefísicas e químicas que outras formas polimórficas do mesmo composto. Porexemplo, um polimorfo pode ter aumento de solubilidade em certos solven-tes. Tal adição de solubilidade pode facilitar a formulação ou administraçãodos compostos da presente invenção. Polimorfos diferentes podem tambémter diferentes propriedades mecânicas (por exemplo, diferente compressibi-lidade, compactação, capacidade de formação dos comprimidos), que po-dem influenciar o desempenho de formação em comprimidos do fármaco, edeste modo influenciar a formulação do fármaco. Um polimorfo particularpode também exibir diferentes taxas de dissolução em um mesmo solvente,relativa a outro polimorfo. Polimorfos diferentes podem também ter diferen-tes estabilidades físicas (estado sólido de conversão de polimorfo metaestá-vel para um polimorfo mais estável) e químicas (reatividade). Uma forma deconcretização da presente invenção contempla o polimorfo de forma I dofosfato de composto I, como descrito aqui.

Em formas de concretização da presente invenção, polimorfossimples, puros, bem como misturas incluindo dois ou mais diferentes poli-morfos são contemplados. Um polimorfo simples, puro, pode ser substanci-almente livre de outros polimorfos.

Algumas formas de concretização da presente invenção con-templam composições farmacêuticas incluindo um ou mais dos sais docomposto I ou os polimorfos de tais sais, como descrito aqui, e um veículofarmaceuticamente aceitável ou excipiente.

Polimorfos foram gerados a partir de soluções concentradas defosfato de composto I. As soluções concentradas podem estar em uma taxade 60 a 100 mg de fosfato de composto I por ml de solução. Em uma formade concretização, cerca de 70 mg do composto I podem ser dissolvidos em1 ml de ácido fosfórico.

Os cristais de polimorfos podem ser precipitados de um solventepor vários métodos incluindo, por exemplo, evaporação lenta, resfriandouma solução supersaturada, precipitação de antissolventes, etc., que sãoconhecidos de um versado na técnica. Em uma forma de concretização, oscristais de polimorfos são gerados por adição da solução para um antissol-vente. O antissolvente pode ser água mais acetonitrila (ANC), etanol, meta-nol, acetona, acetonitrila, THF, acetato de etila, hexano, cloreto de metileno(CH2CI2)1 álcool isopropílico (IPA), metil etil cetona (MEK)1 e dioxano. Emuma forma de concretização, um solvente adicional (por exemplo, metanol)pode ser adicionado. Em outra forma de concretização, as amostras sãodeixadas permanecer em suspensão durante a noite antes de remover oscristais. Em outra forma de concretização, as amostras são deixadas per-manecer por três dias antes de remover os cristais.

Os cristais podem ser caracterizados utilizando métodos padrãoconhecidos por um versado na técnica, incluindo gravimetria dinâmica desorção de umidade de PXRD, calorimetria diferencial de varredura, análisegravimétrica térmica, e microscopia ótica. Estas técnicas estão descritas a-baixo.

Composições farmacêuticas adequadas para a distribuição dos15 compostos da presente invenção e métodos para suas preparações vão serprontamente visíveis para os versados na técnica. Tais composições e mé-todos de suas preparações podem ser encontrados, por exemplo, em Re-minqton's Pharmaceutical Sciences, 19a. ed. (Mack Publishing Company,1995).

A escolha de um excipiente farmaceuticamente aceitável será,em grandes medidas, dependente de fatores tais como o modo particular deadministração, o efeito do excipiente na solubilidade e estabilidade, e a na-tureza da forma de dosagem. Exemplos de excipientes incluem, sem limita-ção, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de ami-dos, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais, e polietileno glicóis.

Veículos e excipientes para formulação de composições farma-ceuticamente aceitáveis incluindo composto I são bem-conhecidos na técni-ca e são descritos, por exemplo, na Patente US 6.573.293, que é incorpora-da aqui em sua totalidade. Métodos de administração para tais são tambémconhecidos na técnica e também descritos, por exemplo, na Patente US6.573.293. Métodos similares poderiam também ser usados para formular eadministrar as composições farmaceuticamente aceitáveis dos sais do com-posto I, ou os polimorfos de tais sais, desta invenção.

Adequada formulação é dependente da via de administraçãoescolhida. Por injeção, os compostos da presente invenção podem ser for-mulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamen-te compatíveis tais como solução de Hank1 solução de Ringer, ou tampãosalino fisiológico. Para administração transmucosal, agentes de penetraçãoapropriados para a barreira ser permeada são usados na formulação. Taispenetrantes são geralmente conhecidos na técnica. Para administração pa-renteral, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua, formulaçõespodem ser apresentadas em unidade de formas de dosagem, tais como emampolas ou em recipientes de várias doses. As composições podem tomartais formas como suspensões, soluções, ou emulsões em veículo oleoso ouaquoso, e pode conter materiais de formulação tais como agentes de colo-cação em suspensão, de estabilização ou dispersantes.

Os compostos da invenção podem ser administrados diretamen-te dentro da corrente sangüínea, dentro do músculo, ou dentro do órgão in-terno. Adequados meios para administração parenteral incluem, intravenoso,intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraes-ternal, intracranial, intramuscular, intrassinovial e subcutâneo. Dispositivosadequados para uma administração parenteral incluem: agulhas injetoras(incluindo microagulhas), injetores livres de agulha e técnicas de infusão.Formulações parenterais são tipicamente soluções aquosas que podem con-ter excipientes tais como sais, carboidratos e agentes de tampão (preferi-velmente ajustando a um pH de 3 a 9), mas, para algumas aplicações, elespodem ser adequadamente formulados como uma solução não aquosa es-téril ou como uma forma seca a ser usada em conjunto com um veículo a-dequado tal como água estéril livre de pirogênios. Adicionalmente, suspen-sões dos compostos da presente invenção podem ser preparadas em umveículo lipofílico. Veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos taiscomo óleo de sésamo, ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como oleatode etila e triglicerídeos, ou materiais tais como lipossomas.

Os compostos da invenção podem ser administrados oralmente.Administração oral pode envolver a ingestão, de modo que o composto entreno trato gastrointestinal, e/ou administração bucal, lingual, ou sublingual pa-ra que o composto entre na corrente sangüínea diretamente a partir da bo-ca. Para administração oral, os compostos podem ser formulados por com-binação de compostos da presente invenção com veículos farmaceutica-mente aceitáveis bem-conhecidos na técnica. Formulações adequadas paraadministração oral incluem: sistemas sólidos, semissólidos e líquidos taiscomo comprimidos; cápsulas macias ou duras contendo múltiplas ou nano-partículas, líquidos, ou pós; pastilhas expectorantes (incluindo carregadascom líquido); mastigáveis; géis; formas de dosagem de dispersão rápida;membranas; óvulos; pulverizantes; e curativos bucais/mucoadesivos.

Os compostos da invenção podem ser administrados topicamen-te, (intra) dermicamente, transdermicamente à pele ou mucosa. Formula-ções típicas para esse fim incluem: géis, hidrogéis, loções, soluções, cre-mes, unguentos, pós de polvilhamento, curativos, espumas, membranas,curativos da pele, hóstias "wafers", implantes, esponjas, fibras, bandagens emicroemulsões. Lipossomas podem também ser usados. Veículos típicosincluem álcool, água, óleo mineral, petróleo líquido, petrolato, glicerina, poli-etileno glicol e propileno glicol. Melhoradores de penetração podem ser in-corporados - vide, por exemplo, J Pharm Sei, 88 (10), 955-958, por Finnin eMorgan (October 1999). Outros meios de administração tópica incluem adistribuição por eletroporação, iontoforese, fonoforese, sonoforese e inje-ções de microagulhas ou livre de agulhas (por exemplo Powderject®, Bio-ject®, etc.).

Os compostos da presente invenção podem ser formulados paraadministração retal, tal como supositórios ou utilizando enemas de retenção,por exemplo, bases de supositório convencional tais como manteiga de ca-caue outros glicerídeos.

Os compostos da presente invenção podem também existir emformas não-solvatadas e solvatadas.

As formas de concretização da presente invenção também con-templam um método para a modulação da atividade catalítica de um PK in-cluindo contatar o referido PK com um ou mais sais do composto I ou ospolimorfos de tais sais da presente invenção. Tal "contato" pode ser realiza-do "in vitro," isto é, em um tubo de teste, uma placa de Petri, ou outros. Emum tubo de teste, o contato pode envolver apenas um composto e uma PKde interesse ou pode envolver todas células. Células podem também sermantidas ou cultivadas em pratos de cultura e contatadas com um compostonessa forma de concretização. Nesse contexto, a habilidade de um compos-to particular em afetar uma distúrbio relacionado com PK, isto é, um IC5o docomposto, definida abaixo, pode ser determinado antes do uso dos compos- tos ser empreendida in vivo com organismos vivos mais complexos. Paracélulas fora do organismo, vários métodos existem, e são bem-conhecidosdos versados na técnica, para levar PKs em contato com compostos incluin-do, mas não limitados a, microinjeção direta de células e várias técnicas detransporte de transmembrana.

Formas de concretização da presente invenção contemplam ummétodo para tratamento ou prevenção do distúrbio relacionado com proteínaquinase em um organismo (por exemplo, animal doméstico ou um ser hu-mano) incluindo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz deuma composição farmacêutica incluindo um ou mais sais do composto I ou os polimorfos de tais sais da presente invenção e um veículo farmaceutica-mente aceitável ou excipiente para o organismo.

Em uma forma de concretização da presente invenção, o distúr-bio relacionado com proteína quinase é selecionado dentre o grupo consis-tindo em um distúrbio relacionado com receptor de tirosina quinase, um dis- túrbio relacionado com não receptor de tirosina quinase, e um distúrbio rela-cionado com serina-treonina quinase. Em outra forma de concretização dapresente invenção, o distúrbio relacionado com proteína quinase é selecio-nado do grupo consistindo em um distúrbio relacionado com EGFR, um dis-túrbio relacionado com PDGFR, um distúrbio relacionado com IGFR, e umdistúrbio relacionado com FLK.

O receptor de proteína quinase de que a atividade catalítica émodulada por um composto da invenção é selecionada do grupo consistindoem EGF1 HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRat PDGFRp, CSFIR,C-Kit, C-fms, Flk-IR, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3Re FGFR-4R. A tirosina quinase celular de que a atividade catalítica é modu-lada por um composto da invenção é selecionada do grupo consistindo emSrc, Frk, Btk1 Csk, Abi, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck,Blk, Hck, Fgr e Yrk. A serina-treonina proteína quinase de que a atividadecatalítica é modulada por um composto da invenção é selecionada do grupoconsistindo em CDK2 e Raf.

Em ainda outra forma de concretização da presente invenção, odistúrbio relacionado com proteína quinase é selecionado do grupo consis-tindo em carcinoma celular escamoso, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, gli-oblastoma, câncer pulmonar, câncer de bexiga, câncer de colo e cabeça,melanoma, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de mama, câncerpulmonar pequenas células, glioma, câncer colorretal, câncer geniturinário,câncer gastrointestinal, mastocitose, e tumores de mastócitos. Em uma for-ma de concretização da presente invenção, o distúrbio relacionado com pro-teína quinase é selecionado do grupo consistindo em diabetes, uma doençaautoimune, uma doença de hiperproliferação, restenose, fibrose, psoríase,doença von Heppel-Lindau, osteoartrite, artrite reumatoide, angiogênese,uma doença inflamatória, uma doença imunológica, e uma doença cardio-vascular.

Composições farmacêuticas adequadas para o uso na presenteinvenção incluem composições onde os ingredientes ativos estão contidosem uma quantidade suficiente para atingir o fim pretendido, por exemplo, amodulação da atividade de PK ou o tratamento ou prevenção de um distúr-bio relacionado com PK.

Determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz estábem dentro da capacidade daqueles versados na técnica, especialmente àluz da descrição detalhada provida aqui. Para qualquer composto utilizadonos métodos da invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz ou do-sagem podem ser estimadas inicialmente a partir das análises de culturacelular. Então, a dosagem pode ser formulada para uso em modelos de a-nimais de modo a atingir uma taxa de concentração circulante que inclui IC5ocomo determinado na cultura celular. Tal informação pode então ser utiliza-da para determinar mais corretamente as dosagens úteis em seres huma-nos ou animais domésticos.

Em prática, a quantidade do composto a ser administrado variade cerca de 0,001 a cerca de 100 mg por kg do peso corporal, tal dosagemtotal é dada de uma só vez ou em dosagens divididas. A quantidade decomposição administrada irá depender, como evidente, do paciente a sertratado, da severidade da aflição, da maneira de administração, do julga-mento do médico ou veterinário, etc. Em casos da administração local ouabsorção seletiva, a concentração local eficaz do fármaco não pode estarrelacionada com a concentração de plasma e outros procedimentos conhe-cidos na técnica podem ser empregados para determinar a quantidade dedosagem e intervalo corretos.

Formas de concretização da presente invenção também con-templam um método de tratamento de câncer em animais domésticos inclu-indo administrar uma composição farmacêutica incluindo um ou mais dossais do composto I ou os polimorfos de tais sais da presente invenção e umveículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente.

Adicionalmente, contempla-se que os sais do composto I ou ospolimorfos de tais sais, como descrito aqui, sejam metabolizados por enzi-mas no corpo de um organismo tal como um animal doméstico ou um serhumano de modo a gerar um metabólito que poderia modular a atividadedas proteínas quinases. Estes metabólitos estão dentro do escopo da pre-sente invenção.

Compostos da invenção podem ser administrados sozinhos ouem combinação com um ou mais outros compostos da invenção ou emcombinação com um ou mais outros fármacos (ou como qualquer combina-ção deles). É também contemplado que os sais do composto I ou os poli-morfos de tais sais, como descrito aqui, possam ser combinados com outrosagentes quimioterápicos para tratamento das doenças e distúrbios discuti-dos acima. Por exemplo, um composto da presente invenção pode ser com-binado com fluorouracil sozinho ou em combinação com mais dentre Ieuco-vorin ou outros agentes alquilantes. Um composto da presente invenção po-de ser utilizado em combinação com outros agentes quimioterápicos antime-tabólicos tais como, sem limitação, análogos de ácido fólico ou análogos depurina. Um composto também pode ser usado em combinação com um pro-duto natural baseado em agentes quimioterápicos, agentes quimioterápicosantibióticos, agentes quimioterápicos enzimáticos, complexos de coordena-ção de platina, e hormônio e antagonista de hormônio.Também é contem-plado que um composto da presente invenção possa ser utilizado em com- binação com mitoxantrona ou paclitaxel para o tratamento do câncer de tu-mor sólido ou leucemias.

Sem mais elaboração, acredita-se que um versado na técnica,utilizando a descrição precedente, pratique a invenção na sua extensão má-xima. Os seguintes exemplos detalhados descrevem como preparar os vá-rios compostos e/ou realizar os vários processos da invenção e devem serinterpretados como meramente ilustrativos, e não limitações da descriçãoprecedente de qualquer forma. Aqueles versados na técnica irão prontamen-te reconhecer variações apropriadas de ambos os procedimentos tanto parareagentes como para as condições de reação e técnicas.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Síntese do composto I. isto é. (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-(5-flúor-2-oxo-1.2-di-hidro-indol-3-ilidenometin-2.4-dimetil-1 H-pirrol-3- carboxílico

Como descrito na Patente US 6.574.293 (exemplo 129) 5-flúor-1,3-di-hidro-indol-2-ona foi condensada com 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-ácido carboxílico (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida para resultar o composto I.

Procedimento de escalonamento. Ácido 5-Formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3- carboxílico (61 g), 5-flúor-1,3-di-hidro-indol-2-ona (79 g), etanol (300ml) e pirrolidina (32 ml) foram refluxados por 4,5 horas. Ácido acético (24 ml)foi adicionado a mistura e refluxo foi continuado por 30 minutos. A misturafoi resfriada para temperatura ambiente e os sólidos coletados por filtração avácuo e lavados duas vezes com etanol. Os sólidos foram agitados por 130minutos em 40% de acetona em água (400 ml) contendo ácido clorídrico a12 N (6,5 ml).Os sólidos foram coletados por filtração a vácuo e lavados du-as vezes com 40% de acetona em água. Os sólidos foram secos a vácuopara resultar ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3- carboxílico (86 g, 79% de rendimento) como um sólidolaranja.

Ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-di-metil-1H-pirrol-3-carboxílico (100 g) e dimetilformamida (500 ml) foram agi-tados e hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfônio(221 g), 1-(2-aminoetil)pirrolidina (45,6 g) e trietilamina (93 ml) foram adicio-nados. A mistura foi agitada por 2 horas à temperatura ambiente. O produtosólido foi coletado por filtração a vácuo e lavado com etanol. Os fluidos sóli-dos foram lavados por agitação em etanol (500 ml) por uma hora a 64°C eresfriados para temperatura ambiente. Os sólidos foram coletados por filtra-ção a vácuo, lavados com etanol, e secos sob vácuo para resultar(2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3- carboxílico (101,5 g, 77% de rendimento).

Exemplo 2. Síntese dos sais do composto I.

Exemplo 2A. fosfato de composto I.

2,67 mmols do composto I foram adicionados ao frasco com40 ml de ácido fosfórico a 0,092 M (cerca de 40% de excesso molar assu-mindo um sal 1:1) e 40 ml de isopropanol. Então, acetonitrila foi continua-mente adicionada à solução aquosa em alíquotas de 30 ml, como a soluçãofoi submetida ao evaporador rotativo a 60°C para remover a água. No todo,120 ml de acetonitrila foram utilizados para remover a água da solução. Oscristais foram filtrados e secos em ar. Cristais foram de escoamento livre ede cor laranja; 1,0 9 grama foi coletado para um rendimento de 83%.

Exemplo 2B. Citrato do composto I.

2,64 mmols do composto I foram adicionados ao fraco com34 ml de ácido cítrico a 0,1 M (3,4 mmols) e 35 ml de metanol. Essa soluçãofoi submetida ao evaporador rotativo a 50°C. Reduzindo o volume desta so-lução produz-se cristais de cristalinidade pobre, então 20 ml de isopropanole 10 ml de metil etil cetona foram adicionados para dissolver o sólido. Essamistura foi submetida ao evaporador rotativo a 60°C e produziu cristais la-ranjas. Os cristais foram filtrados e secos em ar. O rendimento para esseprocesso foi de cerca de 60%, e poderia ter sido ainda melhorado, atravésda redução do volume de solvente antes da filtração.Exemplo 3. Propriedades físicas dos sais do composto I.

Métodos. Testes para determinar as propriedades físicas dossais do composto I incluindo a determinação do ponto de fusão, pureza deHPLC, difração do pó de raio X, e gravimetria dinâmica de sorção de umida-de.

Difração de pó de raio X (PXRD). XRD do pó foi realizado utili-zando um Scintag X2 Advanced Diffraction System (lab 259-1088, controla-do por Scintag DMS/NT 1.30a e software Microsoft Windows NT 4.0. O sis- tema utiliza uma fonte de raios X Copper (45 kV e 40 mA) para prover emis-são de CuKai de 1,5406Â e um detector resfriado tipo Peltier em estadosólido. A abertura do feixe foi controlada utilizando fendas de divergência detubo e antidispersão de 2 e 4 mm e fendas de detector antidispersão e derecepção de 0,5 e 0,2 mm de extensão. Dados foram coletados de 2 a 35° dois theta, utilizando uma etapa de varredura de 0,03°/etapa com um tempode contagem de um segundo por etapa. Suportes de amostra de aço inoxi-dável, de carregamento no tipo, redondos, Scintag1 com insertos de 9 mmde diâmetro foram utilizados para os experimentos. Pós foram embaladosdentro do suporte e foram gentilmente pressionados por uma superfície lisa de vidro para assegurar coplanaridade entre a superfície da amostra e a su-perfície do suporte.

Gravimetria dinâmica de sorção de umidade (DMSG). Isotermade DMSG foi coletada em uma temperatura controlada por microbalançaatmosférica. Amostras de aproximadamente 10 mg foram colocadas nos pratos de amostras da balança. A umidade foi seqüencialmente variada deumidade relativa ambiente (umidade relativa) a 0% de umidade relativa e foientão aumentada a 90% de umidade relativa seguido por uma diminuição deumidade relativa a 0% de novo em 3% de etapas de umidade relativa. Amassa foi então medida a cada dois minutos. A umidade relativa foi escalo-nada para o próximo valor-alvo quando a mudança da amostra de massa foiinferior a 0,5 μο em 10 min. O programa Visual Basic dmsgscn2.exe foi usa-do para controlar a coleta de dados e exportar a informação para planilha deExcel.

Resultados. A tabela 1 mostra um sumário dos dados de saisascorbato, citrato, fumarato, cloridrato, e fosfato de composto I. Análise deHPLC sugere que sais foram de pureza relativamente alta, e nenhuma mu-dança significante na pureza foi induzida através de processo de formaçãode sal.

Tabela 1. Sumário dos sais sintetizad

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* porcentagem de área sob os picos no HPLC

O sais de cloridrato, fumarato, e ascorbato foram muito higros-cópicos (vide figura 1). Os outros dois sais (citrato e fosfato) tiveram perfil debaixa absorção da umidade, absorvendo menos que 3% de água a 70% u-midade relativa.

Os padrões de pó de raio X indicam que os sais de fosfato ecitrato foram de cristalinidade relativamente alta. (Vide tabelas 2 e 3; e figura 2).Tabela 2

Picos de PXRD do fosfato de composto I

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*: ±0,1°

**: a intensidade relativa para cada pico é determinada pornormalização de sua intensidade onde o pico mais alto é oângulo de 27,0° como 100Tabela 3

Picos de PXRD do Citrato do composto I

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**: a intensidade relativa para cada pico é determinada pornormalização de sua intensidade onde o pico mais alto é o ângulo de 25,5°como 100

Exemplo 4. Preparação e caracterização de fosfato de composto I.

Exemplo 4A. Preparação do fosfato de composto I.

Base livre do composto I foi usada para preparar o sal de fosfa-to. A amostra (número de lote 35282-CS-51) do fosfato de composto I foipreparada como descrito acima. 4 ml de ácido fosfórico a 0,977 M foramadicionados a 1,0 95 g de base livre no frasco imediatamente seguido poradição de 4 ml de acetonitrila. Uma suspensão foi obtida. A suspensão foiaquecida ligeiramente em uma placa quente. Adicionando 40 ml de água eaquecendo enquanto agitando por cerca de uma hora não dissolveu comple-tamente o sólido. O sólido foi filtrado e lavado com 10 ml de acetonitrila.PXRD mostrou que era o sal de fosfato de composto I.)

Exemplo 4B.Caracterização do fosfato de composto I.

Lote 35282-CS-51 foi chamado polimorfo forma I do fosfato decomposto I. Apresentou alta cristalinidade, boa escoabilidade, e cristal detamanho grande. Tanto a ausência de evento de fusão na temperatura defusão da base livre do composto I (polimorfo de base livre forma A, 256°C;polimorfo de base livre forma B, 259°C) e a presença de pontos de fusãoelevados (281 - 297°C) dos sólidos sugerem que os cristais do Lote 35282-CS-51 sejam uma forma de sal diferente e não uma base livre do composto

I. A pureza do lote foi 99,6% por HPLC.

Exemplo AC. Estimativa de solubilidade do fosfato de composto I.Amostras de 1 a 2 mg do fosfato de composto I (lote 35282-CS-51) foram transferidas para frascos de vidro de 10 ml (dosados com tara) eforam pesados (precisão até 0,1 mg). Solventes foram adicionados aos fras-cos (um solvente para cada frasco) em uma forma de etapa cuidadosa, com0,5mL do solvente adicionado a cada etapa. Solventes utilizados foram:tampão (pH = 2), tampão (pH = 5), água, metanol, tetra-hidrofurano (THF),acetonitrila, e acetona. Após cada adição, o frasco foi nivelado e agitado. Adissolução do sólido foi visualmente observada. Se uma óbvia dissoluçãonão foi observada, mais solvente foi adicionado imediatamente. Se a disso-lução foi aparente, o frasco foi deixado na bancada por pelo menos 30 minu-tos antes da próxima adição de solvente. Essa etapa foi repetida até nãoexistirem mais cristais visíveis contra um fundo preto e um branco. A solubi-lidade foi então agrupada por uma divisão do peso do composto pelo volu-me final e o volume antes da última adição. Se um sólido sobrou após adi-ção de 10 ml de solvente, a solubilidade foi expressada como inferior ao pe-so dividido pelo volume final.Se o sólido foi dissolvido completamente apósa primeira adição de solvente, a solubilidade foi expressada como maior doque o peso dividido pelo volume solvente. Todos os experimentos foramconduzidos à temperatura ambiente.

As solubilidades estimadas do fosfato de composto I em váriossolventes são apresentadas na tabela 4 juntamente com as solubilidadesdas bases livres, expressadas como mg/ml. A solubilidade do fosfato decomposto I é inferior à da base livre do composto I no mesmo solvente, ex-ceto em água (em vários níveis de pH). A solubilidade do fosfato de compos-to I depende do valor do pH de uma solução, e torna-se consideravelmentemais elevada (> 3 mg/ml) em pH=2 ou inferior. O ponto de fusão do fosfatode composto I (lote 35282-CS-51) é de cerca de 281 a 297°C, que é subs-tancialmente mais elevado que o ponto de fusão da base livre do composto I(polimorfo de base livre forma A, 256°C; polimorfo de base livre forma B1260°C). Um importante resultado é que a molhabilidade do fosfato de com-posto I com água é muito melhor do que a da base livre do composto I.

Tabela 4. Solubilidade estimada da base livre do composto I e fosfato decomposto I em vários solventes a 23°C.

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a pH = 2 tampão é feito de HCI e KCI

b pH = 5 tampão é feito de ftalato de ácido de potássio e hidróxido de sódio.

cNão disponível mas esperado < 0,005 mg/ml.

d 1 g do fosfato de composto I é equivalente a 0,802 g da base livre do com-posto I.

e O valor do pH da solução final é 4,91.

Exemplo 5. Geração de polimorfos do fosfato de composto I.As baixas solubilidades do fosfato de composto I vistas no e-xemplo 4C indicaram que as soluções altamente concentradas (60 a 100 mg/ml, vermelho laranja escuro) de fosfato de composto I seriam benéficas paraprecipitar os polimorfos do fosfato de composto I de vários solventes. Tais soluções concentradas foram preparadas por dissolução de base livre docomposto I em cerca de ácido fosfórico a 1 M. Por exemplo, cerca de 70 mg deBase livre do composto I poderiam ser dissolvidos em 1 ml de ácido fosfóri-co a 1M. Entretanto, a quantidade de base livre do composto I e ácido fosfó-rico utilizada depende da concentração desejada e da quantidade de solu-ção. No exemplo em que o precipitado foi filtrado a vácuo imediatamenteapós precipitação, cerca de 1 ml da solução desejada foi então gotejado emcerca de 10 ml de dez antissolventes para precipitar os cristais de sais. Es-tes solventes incluíam água mais acetonitrila (ANC), etanol, metanol, aceto-na, acetonitrila, THF, acetato de etila, hexano, cloreto de metileno (CH2Cb),e álcool isopropílico (IPA). No exemplo em que o precipitado foi filtrado avácuo após ser colocado em suspensão durante a noite ou por três dias, ossolventes adicionais de metil etil cetona (MEK) e dioxano foram usados. Al-guns solventes orgânicos, por exemplo, acetato de etila, hexano, CH2CI2,não são miscíveis com água e duas camadas de solventes foram observa- das. Apenas uma pequena precipitação foi vista na superfície alguns minu-tos após adição. Nestes casos cerca de 1 ml de metanol foi adicionado co-mo um solvente de ligação em ponte, para aumentar a miscibilidade entreas duas camadas. Metanol pareceu trabalhar bem no aumento da miscibili-dade porque a camada orgânica incolor tornou-se amarela logo após a adi- ção de metanol. O frasco foi então agitado vigorosamente à mão por cercade um minuto. Ambos os sólidos dos solventes orgânicos foram filtrados avácuo imediatamente após precipitação (em 20 min) e após colocação emsuspensão durante a noite ou por três dias a fim de isolar ambos os doispolimorfos metaestáveis e estáveis.O pó foi então analisado. Os diferentessólidos foram numerados na ordem de descoberta.

Exemplo 6. Caracterização dos polimorfos do fosfato de com-

posto I.Exemplo 6A. Métodos de caracterização.

Todos os pós obtidos a partir da análise dos procedimentos dospolimorfos acima foram analisados por PXRD1 como descrito no exemplo 3acima. Quando um novo padrão PXRD foi observado, técnicas complemen-tares também foram usadas para caracterizar os sólidos, incluindo gravime-tria dinâmica de sorção de umidade (também descrita no exemplo 3), calo-rimetria diferencial de varredura, análise gravimétrica térmica (quando ne-cessário), e microscopia óptica.

Calorimetria diferencial de varredura (DSC). Dados de DSC fo-ram obtidos utilizando um calorímetro de DSC (TA Instruments 2920). Pó(de 1 a 5 mg) foi compactado em um prato de alumínio de DSC. Uma tampade alumínio foi colocada no topo do prato e foi pregada. O prato pregado foicolocado na célula de amostragem juntamente com um prato vazio comouma referência. Temperaturas foram aumentadas a 300 ou 350°C de 30°C auma taxa de 10°C/min. salvo especificado em contrário.

Termogravimetria (TGA). Experimentos de TGA foram realiza-dos utilizando um analisador de alta resolução (TA Instruments modelo2950). O TA Instruments Thermal Solutions® para NT (versão 1.3L) foi utili-zado na coleta de dados, e o Universal Analysis® para NT (versão 2.4F) foiutilizado para análise de dados. Amostras (5-10 mg) foram colocadas dentrodo prato de alumínio que foi ainda colocado em um prato de balança de pla-tina antes de serem aquecidas. Os pesos dos pratos de alumínio e platinaforam tarados antes de carregar as amostras. As temperaturas foram au-mentadas de 30°C a 300°C linearmente a uma taxa de 10°C/min. Purga denitrogênio seco foi utilizada.

Microscopia de Luz Polarizada. Microscopia foi realizada em ummicroscópio de luz polarizada Olympus BHSP. Pó foi colocado em suspen-são em óleo de silicone e disperso entre uma superfície lisa de microscopiae uma cobertura de tira estreita. Antes de observação, a cobertura de tiraestreita foi gentilmente esfregada contra a superfície lisa para tornar boa adispersão das partículas.

Exemplo 6B. Caracterização imediatamente após precipitaçãoOs resultados foram resumidos na tabela 5. Precipitação tevelugar logo que a solução ácida foi misturada com os antissolventes. Primei-ro, os precipitados eram flocos soltos. As cores foram amarelo e laranja cla-ro em geral. O sólido resultante era pegajoso. A observação microscópicadestes sólidos indicaram que eles eram constituídos de cristais muito pe-quenos, com boa birrefração sob luz polarizada. Pelo menos seis diferentespadrões de PXRD foram observados nos sólidos obtidos dos nove sistemassolventes. (Vide figura 3). A cadeia lateral de amida nesta molécula é flexívele sofre diferentes conformações forma B de base livre e no seu sal de clori-drato.Consequentemente, a molécula nas diferentes formas sólidas podemser polimorfos conformacionais. Os padrões de PXRD dos sólidos precipita-dos do acetato de etila, hexano, e IPA pareciam os mesmos. Entretanto,uma comparação detalhada com outros padrões de PXRD foi difícil devidoaos baixos sinais de refração dos sólidos destes três solventes. Consequen-temente, eles não foram designados como uma forma nova. O precipitadodo metanol é o mesmo que o lote de referência 35282-CS-51 (designadocomo forma I). Dados de TGA de todos os precipitados indicaram resíduosde solvente a um nível de 1,7 a 4,7%. Dentre estes sólidos, um de CH2Cbparecia ser um sólido com solvente retido em cristais. A curva de TGA mos-trou uma diminuição abrupta do peso da amostra a uma temperatura de cer-ca de 125°C (vide figura 4). Este evento é registrado como uma endotermamais ou menos na mesma temperatura por DSC. Em adição, esse pó foiconstituído de cristais de morfologia bem definida e foi de livre escoamento,uma propriedade muito diferente da dos outros lotes de precipitado. O póexibiu cristalinidade média por PXRD mas boa cristalinidade quando obser-vado por microscópio de luz polarizada. Outros lotes foram constituídos decristalitos muito finos. Na curva de DSC destes pós, uma endoterma amplae superficial foi vista logo que a amostra foi carregada na célula de amostra.Essa observação é refletida por TGA como uma perda de peso gradual doinício do aquecimento em TGA. Por essa razão, para estes lotes, os solven-tes residuais foram provavelmente solventes adsorvidos na superfície e nãoforam solventes no retículo de cristal.<table>table see original document page 33</column></row><table>Exemplo 6C. Precipitação após permanecer por três dias em

solvente.

Estes resultados estão sumarizados na tabela 6. Depois de umtempo de permanência de até três dias no solvente, uma nova fase sólida não macia laranja-vermelha apareceu. Os precipitados fofos obtidos de to-dos os solventes orgânicos, exceto o precipitado de metanol, sofreram trans-formação. Aparentemente, os sólidos precipitados imediatamente após pre-cipitação foram metaestáveis nestes casos em que eles converteram-se emformas sólidas mais estáveis (forma I) ao longo do tempo. Esta conversãoparecia estar concluída em um par de horas na maioria dos sistemas de sol-vente. No entanto, eles foram deixados permanecer por um período de tem-po bem mais longo para garantir a conclusão do processo, a fim de evitarcolher uma mistura de duas formas sólidas. A curva de TGA mostrou perdade peso abrupta em cerca de 124°C e 153°C para os sólidos obtidos a partirde hexano e acetonitrila respectivamente, acoplados por uma endoterma auma temperatura similar em DSC. Portanto, eles também pareceram contersolvente contido em retículo de cristal. As estequiometrias dos solventesretidos são de cerca de 0,6 para acetonitrila e cerca de 0,14 para hexano.Cristais em forma de agulha foram cultivados a partir de acetonitrila após suspensão por três dias. Os Padrões de PXRD do sólido retendo acetonitrilaforam únicos enquanto o Padrão de PXRD do solvato de hexano é similar aodo sólido retendo CH2CI2 identificado anteriormente (figura 3). Ambos sóli-dos retendo solvente (hexano e acetonitrila) perderam peso em um prato deTGA. Padrões PXRD únicos de ambos os sólidos foram observados após a retirada correspondente do solvente que foi removido por aquecimento (ta-bela 7, figura 3), indicando que a remoção das moléculas de solvente dossólidos ocasionou mudanças estruturais dos cristais de solvato (consequen-temente, as moléculas de solvente estão em retículo de cristal não apenasem superfície de cristal). Entretanto, o padrão PXRD do dessolvato de ace-tonitrila foi baixo em intensidade de sinal. Perfil de DSC do dessolvato deacetonitrila exibiu dois eventos de aquecimento adicionais a 74° C e 174° C,quando comparado com o perfil de DSC do solvato de acetonitrila, enquantoo evento de dessolvatação a 153°C estava ausente. Resfriamento da amos-tra após dessolvatação pode ter mudado o sólido que sofreu uma mudançaenérgica a 174°C.

Quando os solventes orgânicos foram utilizados, o período depermanência mais longo dos precipitados tornou os sólidos do mesmo pa-drão PXRD como o da forma I (Lote 35282-CS-51) embora a morfologia doscristais fosse diferente (tabela 6). O mesmo padrão PXRD indicou que aque-les sólidos têm a mesma estrutura de retículo de cristal.

A morfologia deve ser diferente devido aos efeitos do solvente.É aparente que a forma I é a fase sólida mais estável dentre todos os poli-morfos não-solvatados relatados aqui. Outras formas sólidas livres do sol-vente foram metaestáveis e convertidas para forma I rapidamente quandoem contato com solvente. O sólido de CH2CI2 pareceu fluir mais facilmenteque o sólido de hexano. O TGA1 morfologia, e a escoabilidade indicaramque eles são dois sólidos diferentes.<table>table see original document page 36</column></row><table>Tabela 7. Caracterização física dos sólidos produzidos após dessolvatação.

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Exemplo 7. Inibicão de fosforilação de KIT em tumores de mas-tócitos caninos.

Propósito. O desenvolvimento de terapias direcionadas ao alvo paracâncer oferece a oportunidade de avaliar diretamente os efeitos dos fárma-cos nos alvos moleculares e correlacionar estes efeitos com a biologia dotumor e farmacocinética do fármaco. Isso pode ser instrumental no desen-volvimento da oncologia do fármaco porque estabelece um relacionamentofarmacodinâmico/farmacocinético e provê informações críticas em respeitoao impacto terapêutico de um agente alvo. O propósito deste estudo foi ava-liar o efeito de uma dosagem simples do inibidor de receptor de tirosina qui-nase do fosfato de composto I na atividade de seu KIT de alvo molecular emtumores de mastócitos caninos (MCT), em pacientes caninos com MCTsavançados utilizando fosforilação de KIT como um marcador de inibição di-reta do alvo. Também foi estudada a fosforilação de ERK1/2 (uma proteínaquinase ativada por mitogênios (MAPK) a jusante da sinalização de KIT),concentração de plasma do fosfato de composto I, e o estado mutacional dec-kit para determinar como estes parâmetros correlacionam-se com o estadode fosforilação de KIT após tratamento com fosfato de composto I.

Fármaco de estudo, fosfato de composto I foi utilizável emcomprimidos divididos de 20 mg.

Projeto do estudo. Este estudo foi uma prova de estudo demodulação de alvo em cães com grau recorrente ou metaestático de MCTsll/lll. Pacientes receberam uma dose única oral do fosfato de composto I a3,25 mg/kg. Utilizando um instrumento de biópsia perfurador de 6 mm, a-mostras foram obtidas do tumor antes da administração de fosfato de com-posto I e 8 horas (h) após tratamento. Quando possível, múltiplas biópsiasforam obtidas. Cada amostra foi congelada instantaneamente em nitrogêniolíquido e armazenada a -70° centígrados (C) antes de análise. Amostras desangue para análises de níveis de plasma de fosfato de composto I foramobtidas ao mesmo tempo que as biópsias de tumor (vide abaixo).

Níveis de plasma do fosfato de composto I. Amostras desangue foram retiradas da veia jugular e colocadas dentro de um tubo devidro de coleta de soro a vácuo red-top. Espécimes foram retirados à tempe-ratura ambiente, deixados coagular, centrifugados a 1500 rpm a 4°C por 10minutos, transferidos para criofrascos, e análise pendente do plasma conge-lado a -70°C. Brevemente, amostras de plasma (20 μl) ou padrões de fosfa-to de composto I no plasma canino foram misturados com metanol (200 μl)incluindo cloridrato de DL-propranolol (padrão interno) em uma placa de 96cavidades de polipropileno (Orochem Technology, Westmont, IL). A placa foimisturada por vórtice durante 1 min., e a amostra foi centrifugada por 10min. a 4000 rpm. Dez microlitros de sobrenadante foram injetados dentro desistema LC/MS/MS, em que ocorreu separação em uma coluna de cromato-grafia líquida de alto desempenho de fase reversa BataBasic C-18 (5 μητι,100 X 4,6 mm.) (Keystone Scientific, Foster City, CA). A quantidade de fos-fato de composto I e o padrão interno em cada amostra de plasma caninoforam quantificados baseados nas curvas padrão geradas utilizando quanti-dades conhecidas do composto variando de 0,2 a 500 ng/ml.

Análise de mutação de c-kit. Para a maioria das amostras,RNA foi extraído utilizando TRIzoI (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo comas especificações do fabricante. cDNA foi então gerado do RNA utilizandodNTPs, iniciadores aleatórios, tampão 5X First Strand, 0,1 M de DTT, e po-Iimerase de Superscript Taq (todos de Promega, Madison, Wl). O cDNA foiquantificado para cada amostra. Para as amostras restantes, DNA genômicofoi preparado como descrito previamente (Downing, S., Chien, M. B., Kass,P. H., Moore, P. F., e London, C. A. Prevalence and importance of internaitandem duplications in exons 11 and 12 of c-kit in mast cell tumors of dogs.Am. J. Vet. Res., 63:1718-1723, 2002; que é incorporado por referência emsua totalidade). Para ambas reações, o PCR foi realizado por 40 ciclos con-sistindo em 94°C (1 min), 59°C (1 min), e 72°C (1 min), com uma extensãode 5 min. a 72°C no final da reação. Um cDNA de c-kit gerado da linha decélula mastro canino C2 e cDNA gerado de cerebelo canino normal foramusadas como controles.

Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em umgel de agarose a 4%; o esperado produto de PCR de c-kit de tipo livre temum tamanho de 196 pb de PCR de cDNA e 190 pb no tamanho de PCR deDNA genômico. Para estes casos em que um ITD não foi óbvio (apenasuma pequena banda estava presente), os produtos de PCR foram purifica-dos por gel utilizando o Promega PCR Wizard Clean-Up kit (Promega) e se-quenciados utilizando ambos iniciadores P1 (dianteiro) e P5 ou P2 (reverso)nas instalações de sequenciamento de núcleos na Universidade da Califor-nia-Davis, para excluir a presença de ITDs muito pequenos, deleções, oupontos de mutações. Alinhamento de seqüência e comparação foram reali-zados utilizando o programa de análise de seqüência DNASIS.

Análise de fosforilação de KIT e ERK. Biópsias de tumor fo-ram congeladas em nitrogênio líquido e mais tarde pulverizadas utilizando"crymorfor" resfriado de nitrogênio líquido e trituradas, então armazenadas a-70°C até serem utilizadas. Para a análise de KIT, tumores pulverizados fo-ram homogenizados, lisados, e imunoprecipitados de 1 mg de Iisado de tu-mor de partida, como descrito previamente (Abrams, T. J., Lee, L. B., Mur-ray, L. J., Pryer, N. K., Cherrington, J. M. SU11248 inhibits KIT e platelet-derived growth factor receptor beta in preclinical models of human small cellIung câncer. Mol. Câncer Ther. 2: 471-478, 2003; que incorporada por refe-rência em sua totalidade) utilizando um anticorpo conjugado de agarose pa-ra KIT (SC-1493AC; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Quandomúltiplas biópsias foram obteníveis, repetir a imunoprecipitação/análise deWestern blot foi realizada em biópsias separadas. A quantidade de KIT fos-forilado em cada amostra foi determinada por Western blot utilizando umanticorpo para fosfotirosina 719 de KIT de murinos (3391; Cell Signaling Te-chnology, Beverly, MA), que corresponde à tirosina 721 do KIT canino e éuma autofosforilação local e, deste modo, um substituto para atividade dequinase de KIT. Para análise do KIT total, os blots foram extraídos, bloque-ados novamente, e ressondados com um anticorpo para KIT (A-4542; DAKOCorp., Carpinteria, CA). Para análise de p42/44 ERK, os mesmos Iisados detumor utilizados para análise de KIT foram sondados por Western blot comum anticorpo para fosfo-Thr 202/Tir 204 ERK1/2 (9101B; Cell Signaling Te-chnology) e então extraídos e ressondados com um anticorpo para ERK to-tal (9102; Cell Signaling Technology). Pares de biópsia para tumores paraambos KIT e ERK1/2 foram consideradas como aquelas para que a proteínatotal detectável estava presente em ambas as biópsias do par. Modulaçãoalvo foi classificada a olho nu por três observadores cegos para estado deJM e concentração de plasma. Redução de > 50% em sinal de fosfoproteínarelativo ao sinal de proteína total na amostra de biópsia tirada após trata-mento comparada com a biópsia pré-tratamento foi pontuada como positivapara modulação alvo, considerando que a redução de <50% foi pontuada negativa.

Resultados. Quatorze cães foram incluídos neste estudo clíni-co, com o principal objetivo de determinar se uma redução na fosforilaçãoda KIT tirosina ocorreu após administração oral de uma dose única de fosfa-to de composto I. Fosforilação de KIT tirosina foi avaliada utilizando um anti- corpo específico fosfodirecionado contra um local de autofosforilação emKIT, servindo como substituto para atividade de KIT quinase. Em adição,estado mutacional de c-kit JM (ITD+ ou ITD-) foi determinado pela biópsiade tumor basal, e concentrações de plasma de fosfato de composto I forammedidas 8 horas após dosagem para correlato destes parâmetros com inibi- ção de fosforilação de KIT. Onze dos 14 cães foram avaliáveis para modula-ção do KIT alvo. Os três cães considerados não avaliáveis tiveram KIT pro-teína total não detectável ou fortemente reduzida em uma ou ambas bióp-sias e por isso não poderiam ser pontuadas por modulação alvo. Os dadospara todos os cães incluídos neste estudo estão na tabela 8.Tabela 8 Sumário de dados de todos os paciente envolvidos

<table>table see original document page 41</column></row><table>

a NE1 Não avaliável, P-KIT1 Fosfo-Tir721 KIT, P-ERK1/2, Fosfo-Thr202/Tir204 ERK1/2

Dos 14 cães analisados, 5 (36%) tiveram um ITD por análise dePCR (figura 5, Trilhas de 1 a 5); todos os cinco tumores tiveram evidência deum ITD. De maneira interessante, o paciente 2 teve aparentemente perdado alelo de tipo selvagem c-kit. Os produtos de PCR dos nove cães restan-tes que não tiveram evidência de ITD (figura 5, Trilhas de 6 a 14) foram dire-tamente sequenciados, e nenhum demonstrou qualquer tipo de mutação(inserção, deleção, ou mutação de ponto). Para trilhas 3, 6, 8, e 9, DNA ge-nômico foi usado da reação de PCR, resultando em um produto de tipo sel-vagem um pouco menor (190 pb ).

O nível de KIT total e fosforilado expressado no MCTs na linhade base variou entre animais. A maior expressão de KIT correlacionou commaior grau de tumor. Quatro de oito tumores de grau Ill tiveram alta expres-são de KIT, comparados a um dos seis tumores de grau Il (figura 6). Porexemplo, a expressão de KIT total no tumor do paciente 2 (grau III) foi mar-cadamente mais elevada do que no tumor do paciente 11 (grau II). Cãescom tumores de grau Ill também tiveram uma alta incidência de altos níveisde KIT fosforilado na linha de base quanto aqueles com tumores de grau II,consistente com o aumento da freqüência de mutações de c-kit ITD em tu-mores avançados e consequentemente níveis elevados de KIT fosforiladoindependente de ligando. Cinco dos sete cães avaliáveis com tumores degrau III tiveram altos níveis de KIT fosforilado na linha de base; quatro des-tes foram positivos para presença de um ITD em c-kit. Apenas 1 tumor degrau II teve significante KIT fosforilado; esse animal também expressou c-kitde ITD mudado.

Oito dos 11 cães avaliados pontuaram positivo para modulaçãoalvo utilizando critério de uma redução > 50% em KIT fosforilado relativo aoKIT total na amostra da biópsia retirada após tratamento com fosfato decomposto I quando comparado com a amostra do pré-tratamento. Exemplosde KIT fosforilado e KIT total em imunoprecipitados de biópsias de tumorretiradas antes e depois de tratamento com fosfato de composto I são mos-trados na figura 6. Cinco tumores (figura 6, esquerda) foram marcados comopositivos para modulação alvo, considerando que dois tumores (figura 6,direita) foram marcados como negativos. Pares de biópsia que foram mar-cados como negativos para inibição da fosforilação de KIT após tratamentocom fosfato de composto I todos tinham KIT fosforilado menos acentuada-mente na linha de base quanto aqueles que marcaram positivo (figura 6).

Para avaliar os efeitos de inibição do fosfato de composto I so-bre vias de sinalização a jusante regulados por fosforilação de KIT, níveis deMAPK ERK1/2 fosforilado foram avaliados por análise de Western blot dosmesmos pares de biópsia utilizados por análise de KIT. Onze dos 14 tumo-res foram avaliados de modulação alvo de fosfo-ERK1/2 (dois destes nãoforam avaliáveis para modulação do KIT alvo). Destes 11 avaliáveis, 7 mos-traram uma redução na relação de fosfo-ERK1/2 para ERK1/2 total em tu-mores amostrados após a administração do fosfato de composto I, compa-rado com amostras de tumor de linha de base (vide figura 6). Modulaçãoalvo de ERK foi mais freqüentemente detectada em MCTs com expressãode ERK de linha de base relativamente alta e fosforilação quanto naquelescom baixa ERK.

Com base em trabalhos pré clínicos em modelos de roedores, ataxa terapêutica do composto I à taxa de inibição do alvo foi consideradapara ser de 50 a 100 ng/ml por 12 h de um período de dosagem de 24-h.Aconcentração de plasma do fosfato de composto I em 8 h (aproximadamen-te Cmax) após dose única a 3,25 mg/kg variou de 33,2 a 186 ng/ml, comuma média de 105 ± 9 ng/mL (tabela 8). Em um animal, a concentração noplasma do fosfato de composto I estava fora da taxa de outras amostras(0,3 ng/ml). Doze da 14 cães tiveram níveis de plasma considerados comoestando em uma taxa terapêutica estabelecida em um estudo clínico da fase1 do composto I. (London, C. A., Hannah, A. L., Zadovoskaya, R., Chien M.B., Kollias-Baker, C., Rosenberg, M., Downing, S., Post1 G., Boucher, J., Shenoy1 N., Mendel, D. B., e Cherrington1 J. M. Phase I dose-escalatingstudy of SU11654, a small molecule receptor tyrosine kinase inhibitor, indogs with spontaneous malignancies. Clin. Câncer Res., 2755-2768, 2003).A concentração média de plasma para cães com evidência de modulaçãodo alvo KIT (79,2 ± 41 ng/ml) e aqueles que não pontuaram para modulação de alvo KIT 137 ± 36 ng/ml) não foram significantemente diferentes (P =0,08).

Discussão. Esse estudo correlativo foi projetado para investigara modulação alvo em uma população clínica comparável para estudar osefeitos de uma única dose clinicamente eficaz de fosfato de composto I na fosforilação de KIT em MCTs caninos e o subsequente impacto na sinaliza-ção através de MAPKs. As concentrações no plasma do fosfato de compos-to I alcançadas neste estudo foram medidas próximo ao Cmax esperado,baseados em estudos pré-clínicos farmacocinéticos e foram consistentescom o nível de fármaco medidos no estudo clínico da fase I investigando a dose eficaz e regime do composto I (tabela 8).

Oito dos 11 (73%) pares avaliáveis de biópsia de MCT tiveraminibição detectável de ativação de KIT como medido pela redução em KITfosforilado após uma dose oral simples de fosfato de composto I. Os trêspacientes que não mostraram modulação do alvo de KIT detectável após tratamento tiveram MCTs que expressaram níveis baixos de KIT e fosfoKITna linha de base. A falta de modulação alvo significativa nestes doentes po-de ser atribuível aos limites técnicos nos métodos de detecção; a sensibili-dade de anticorpo específico de fosfo em KIT fosforilado relativo a KIT nãofosforilado pode ser insuficiente nas amostras com baixa expressão de KITde linha de base. Inibição de atividade de KIT correlacionada mais proxi-mamente com fosforilação de KIT de linha de base quanto com genótipo dec-kit ITD. Baseado em análises celulares, seria previsível que ambos KITtipo selvagem e mutante de ITD seriam inibidos por fosfato de composto I invivo, porque composto I in vitro bloqueou a fosforilação de KIT tipo selva-gem e mutante de ITD com potência comparável.

O fosfato de composto I também afetou uma via de sinalizaçãoa jusante de KIT. Mutações em c-kit em GIST e malignidades hematopoiéti-cas têm sido relatadas para ativar diferentes vias de sinalização a jusante decada outro e de KIT tipo selvagem. Em MCTs caninos, apenas uma amostrade tumor tinha ERK1/2 fosforilado detectável na linha de base. Em 7 dos 11pares de biópsia de tumores avaliados, ERK1/2 foi inibido, como medidopela redução em ERK1/2 fosforilado após tratamento. Nem todos os tumo-res marcando positivo para inibição de ERK1/2 foram também positivos parainibição da fosforilação de KIT. Modulação alvo de ERK 1/2 não correlacio-na-se com grau de tumor ou a presença ou ausência de mutação de c-kitITD. Quanto a modulação do alvo de KIT, modulação alvo de ERK 1/2 foidetectada mais freqüentemente em tumores que expressaram altos níveisde ERK1/2 e ERK1/2 fosforilado na linha de base.

A detecção da inibição de um alvo molecular do fosfato de com-posto I após tratamento de MCTs serve como prova de modulação alvo parafosfato de composto I neste cenário. A relevância clínica desta descoberta éapoiada pela correlação entre a inibição do alvo molecular e concentraçõesde fármaco no plasma na faixa terapêutica, e respostas objetivas clínicasanteriormente relatadas para composto I em pacientes caninos com MCTsexpressando mutações ativadoras no gene alvo, fornecendo uma prova deconceito para fosfato de composto I nessa população de pacientes. Porquecães com outras malignidades (incluindo carcinoma mamário, sarcoma detecidos mols, e mieloma múltiplo) também experimentaram respostas objeti-vas duráveis no tratamento com composto I, inibição de KIT nessa concen-tração de plasma pode ser razoavelmente extrapolada para o sucesso dainibição de outros alvos de tirosina quinase receptor proximamente relacio-nados com o composto I expressado por estes tumores, baseado em potên-cia in vitro e in vivo do composto I, provendo uma racionalidade molecularpara respostas objetivas nestes tumores. Por exemplo, tumores caninosmamários expressam VEGFR1 que é inibido por inibidores de indolinona ti-rosina quinase nas concentrações comparáveis para KIT em análises celula-res in vitro. (Liao, A. T., Chien1 M. B., Shenoy, N., Mendel1 D. B., McMahon1G., Cherrington1 J. M., e London1 C. A. Inhibition of constitutively active formsof mutant kit by multitargeted indolinone tyrosine kinase inhibitors. Blood1100: 585-593, 2002) Inibição de fosfato de composto I de ambos c-kit tiposelvagem e mutante de ITD em MCTs pode, deste modo, servir como umsubstituto para inibição dos alvos de RTK relatados do fosfato de compostoI1 VEGFR1 e PDGFR1 que são aberrantemente expressados e/ou reguladospor muitos diferentes tipos de tumor. Finalmente, inibição de alvo molecular,ligada com respostas de objetivo clínico em tumores caninos, direciona odesenvolvimento de compostos relacionados em câncer humano na direçãode populações clínicas expressando KIT, VEGFR1 ou PDGFR ativados.

Exemplo 8 - Estudo de múltiplos centros, controlado por place-bo. ceqo-duplo. randomizado de fosfato de composto I oral no tratamento decães com tumores mastócitos recorrentes

Finalidade - A eficácia dos comprimidos orais de fosfato decomposto I para o tratamento de tumores mastócitos em animais de propri-edade dos clientes que tinham uma doença mensurável recorrente após ci-rurgia foi avaliada em um estudo controlado negativo, mascarado. O estudoavaliou a dosagem em intervalos de um dia de fosfato de composto I a 3,25mg de equivalentes de base livre (FBE) kg peso corporal na resposta à do-ença usando critérios de resposta modificados (RECIST). A presença ouausência de mutação c-kit em tumores de mastócitos foi avaliada como umacovariante neste estudo. Para fins de tomada de decisões, a duração doestudo foi de 6 semanas.

Cento e cinqüenta e três (152) cães foram randomizados emuma relação de 4:3 em um de dois grupos de tratamento: T01 (Placebo emque = 65) e T02 (fosfato de composto I em que η = 88). Dez práticas de on-cologia veterinária nos Estados Unidos foram selecionadas e os casos regis-trados. Para o alistamento, os cães precisavam ter tumores de mastócitosrecorrentes (pelo menos uma lesão alvo que tinha um diâmetro mais longomínimo de 20 mm) ± envolvimento de Iinfonodo regional. Um máximo de trêslesões alvo (tumores de mastócitos mensuráveis) e todas as lesões não alvo(todas as lesões restantes, mensuráveis ou não) foram identificadas como alinha de base por dois avaliadores. A eficácia foi baseada na resposta obje-tiva (resposta completa ou resposta parcial) na visita da semana 6 onde amédia da soma dos dois avaliadores do diâmetro mais longo das lesões alvo(LD de soma média) foi comparada com LD de soma média da linha de ba-se para cálculo da redução ou aumento percentual. A avaliação das lesõesnão alvo foi subjetiva. Uma resposta completa (CR) foi definida como o de-saparecimento de todas as lesões de alvo e não alvo e o não aparecimentode novas lesões; uma resposta parcial (PR) foi definida como pelo menosuma diminuição de 30% no LD de soma média de lesões alvo comparadocom o LD de soma média de linha de base e a não progressão de lesõesnão alvo e o não aparecimento de novas lesões. As amostras de tecido dotumor e da pele normal distante foram coletadas antes da randomização esubmetidas para avaliação do estado de mutação c-kit.

Oitenta e seis (86) animais T02 e 65 T01 foram incluídos naanálise da eficácia. A análise de dados indicou uma melhora estatisticamen-te significante no ponto final primário (resposta objetiva) para fosfato decomposto I (T02) comparado com placebo (T01). Os animais T02 tinha umataxa de resposta objetiva significantemente maior (38,3%, 33/86) comparadocom os animais T01 (7,9%; 5/63) (p<0,001). Quase duas vezes tantos ani-mais T01 (66,7%; 42/63) experimentaram doença progressiva comparadocom animais T02 (33,7%; 29/86). Os cães no grupo T02 que eram positivospara as mutações c-kit foram quase duas vezes mais prováveis de teremuma resposta objetiva comparado com os que foram negativos para a muta-ção c-kit. (60%, 12/20 vs. 32,8%, 21/64, respectivamente.Em conclusão, este estudo demonstrou a eficácia de comprimi-dos orais de fosfato de composto I para o tratamento de tumores de mastó-citos recorrentes em cães de propriedade dos clientes.

Numerosas modificações e variações na invenção como especi-ficada nos exemplos ilustrativos acima são esperadas como ocorrendo paraos versados na técnica. Consequentemente, somente estas limitações comoaparecem nas reivindicações seguintes devem ser colocadas na invenção.

Claims (17)

1. Formas de sal de uma base, caracterizadas pelo fato de quea base é (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico, e em que a formade sal é selecionada do grupo consistindo em sais citrato e fosfato, e solva-tos e polimorfos dos mesmos.

2. Forma de sal de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o sal é o sal de fosfato com a estrutura:e solvatos e polimorfos dos mesmos.

3. Forma de sal de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapelo fato de que possui uma fórmula molecular de C22H25FN4O2 H3PO4 e umponto de fusão de cerca de 285 a cerca de 290°C.

4. Polimorfo (forma 1) do sal de fosfato como definido na reivin-dicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido polimorfo possui um es-pectro de difração de raios X de pó compreendendo picos expressos emgraus (± 0,1 grau) de ângulo de dois theta de 20,8, 24,5, 25,9, e 27,0 obtidousando emissão de CuKai (comprimento de onda= 1,5406 Angstroms).

5. Forma de sal de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o sal é o sal de citrato com a estrutura:<formula>formula see original document page 48</formula>e solvatos e polimorfos dos mesmos.

6. Forma de sal de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que possui uma fórmula molecular de C22H25FN4O2C6H8O7 eum ponto de fusão de cerca de 178 a cerca de 183°C.

7. Forma de sal de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que possui um padrão de difração de raios X de pó compreen-dendo picos expressos em graus (± 0,1 grau) de ângulo de dois theta de 9,1,-9,4, 14,2, 25,4, e 26,8 obtidos usando emissão de CuKai (comprimento deonda = 1,5406 Angstroms).

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende o sal de fosfato, como definido na reivindicação 2, o sal de ci-trato, como definido na reivindicação 5, ou um solvato ou polimorfo do mes-mo, e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente.

9. Método para a modulação da atividade catalítica de proteína quinases, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a proteínaquinase com o sal de fosfato, como definido na reivindicação 2, o sal de ci-trato, como definido na reivindicação 5, ou um solvato ou polimorfo dos mes-mos.

10. Proteína quinase, como definido na reivindicação 9, caracte-rizada pelo fato de que a proteína quinase é selecionada do grupo consistin-do em receptor de tirosina quinase, não receptor de proteína tirosina quina-se, e serina/treonina proteína quinases.

11. Método de prevenção ou tratamento de um distúrbio relacio-nado com proteína quinase em um organismo, caracterizado pelo fato deque compreende a administração ao referido organismo de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica, como definido nareivindicação 8.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que o distúrbio relacionado com proteína quinase é um tumor demastócitos ou mastocitose.

13. Método de preparação de cristais de sal de fosfato comodefinido na base da reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compre-ende:(a) introduzir uma quantidade estequiométrica de ácido fosfó-rico à base em uma solução compreendendo um solventeou uma mistura de solventes;(b) cristalizar o sal de fosfato da solução; e(c) separar os cristais de sal de fosfato da solução de solven-te.

14. Método de preparação de polimorfos do sal de fosfato, comodefinidos na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) introduzir o sal de fosfato a uma solução compreendendoum solvente ou uma mistura de solventes;(b) opcionalmente adicionar um solvente de ligação em ponte àsolução, e(c) separar os cristais de polimorfo da solução de solvente.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe-lo fato de que o solvente da etapa (a) compreende metanol.

16. Método de preparação de cristais de sal de citrato da base,como definidos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compre-ende:(a) introduzir uma quantidade estequiométrica de ácido cítricoà base em uma solução compreendendo um solvente ouuma mistura de solventes;(b) cristalizar o sal de citrato da solução; e(c) separar os cristais de sal de citrato da solução de solvente.

17. Uso do sal de fosfato, como definido na reivindicação 2, osal de citrato, como definido na reivindicação 5, ou um solvato ou polimorfodo mesmo, caracterizada pelo fato de ser na preparação de um medicamen-to utilizável no tratamento de uma doença mediada por atividade PK anor-mal.