KR20080037093A

KR20080037093A - 피롤 치환된 2-인돌리논의 고체 염 형태

Info

Publication number: KR20080037093A
Application number: KR1020087006545A
Authority: KR
Inventors: 창쿠안 캘빈 순; 마이클 홀리
Original assignee: 화이자 프로덕츠 인크.
Priority date: 2005-09-19
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2008-04-29
Also published as: CN103601720A; BRPI0616374B8; US20150158849A1; CA2621569A1; AR056521A1; CY1109326T1; AU2006293644A1; CA2621569C; EP1928858A1; SI1928858T1; US20120142749A1; JP4519114B2; ES2328407T3; HK1125101A1; TW200745093A; NZ566033A; ZA200801431B; TWI310766B; KR101050906B1; PT1928858E

Abstract

본 발명은 3-피롤 치환된 2-인돌리논 화합물인 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (2-피롤리딘-1-일-에틸)-아미드의 고체 염 형태에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 아미드의 포스페이트 염의 다형체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 키나아제 관련 장애의 치료에 있어서 염 및 다형체의 용도에 관한 것이다.

단백질 키아나제, 염, 다형체, 포스페이트

Description

피롤 치환된 2-인돌리논의 고체 염 형태{SOLID SALT FORMS OF A PYRROLE SUBSTITUTED 2-INDOLINONE}

본 발명은 3-피롤 치환된 2-인돌리논 화합물인 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (2-피롤리딘-1-일-에틸)-아미드의 고체 염 형태에 관한 것이다. 전술한 화합물은 단백질 키나아제 ("PK")의 활성을 조절한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 비정상적 PK 활성과 관련된 장애의 치료에 유용하다. 상기 화합물의 염을 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법이 개시된다. 또한, 본 발명은 아미드의 포스페이트 염의 다형체에 관한 것이다.

하기는 오로지 배경 정보로서 제공되며 본 발명에 대한 선행 기술로서 인정되는 것은 아니다.

고체, 예컨대 약제는 종종 한 가지가 넘는 결정형을 가지며, 이는 다형성으로서 공지되어 있다. 결정 팩킹이 상이한 다수의 고체상으로 화합물이 결정화되는 경우 다형성이 발생한다. 수많은 예가 약제의 고체 상태의 특성에 대한 표준 참고 문헌에 인용되어 있다 [Byrn, S. R., Solid-State Chemistry of Drugs, New Your, Academic Press (1982)]; [Kuhnert-Brandstatter, M., Thermomiscroscopy In The Analysis of Pharmaceuticals, New York, Pergamon Press (1971)] 및 [Haleblian, J. K. 및 McCrone, W. Pharmaceutical applications of polymorphism. J. Pharm . Sci., 58, 911 (1969)]. Byrn은, 일반적으로, 다형체가 상이한 물리적 특성, 예컨대 용해도, 및 물리적 및 화학적 안정성을 나타낸다고 서술한다.

분자 팩킹의 상이함으로 인하여, 다형체는 약물 방출, 고체 상태 안정성, 및 약제 제조에 영향을 미치는 방식에서 상이할 수 있다. 다형체의 상대적 안정성 및 상호 전환은 시판 약물의 선택에 특히 중요하다. 적절한 다형체는 물리적 안정성의 논점에 따라 정해질 수 있다. 예를 들어, 시판 약물의 선택은 바람직한 특성, 예컨대 탁월한 물리적 안정성 또는 대규모로 제조될 수 있는 능력을 갖는 적절한 다형체의 이용가능성 및 선택에 의존할 것이다. 고체 제형의 성능은 제품의 저장 수명 동안 다형체 전환에 의해 제한을 받지 않아야 한다. 기정 약물의 관측가능한 결정 구조를 예측하거나 또는 바람직한 물리적 특성을 갖는 다형체의 존재를 예측하는 신뢰할 수 있는 방법이 존재하지 않는다는 점을 주목하는 것이 중요하다.

PK는 단백질의 티로신, 세린, 및 트레오닌 잔기 상의 히드록시기의 인산화에 촉매 작용을 하는 효소이다. 상기 외견상 단순한 활성의 결과는 압도적인데, 왜냐하면 세포 일생 (예를 들어, 세포 성장, 분화, 및 증식)의 실질적으로 모든 측면은 어떠한 방식으로든 PK 활성에 의존하기 때문이다. 더욱이, 비정상적 PK 활성은, 비교적 생명에 비위협적인 질환 (예컨대 건선)으로부터 극도로 치명적인 질환 (예컨대 교아세포종 (뇌암))에 이르기까지 다수의 장애와 관련되어 왔다.

PK의 한 부류인 수용체 티로신 키나아제 (RTK)는 분자 표적 치료의 우수한 후보인데, 왜냐하면 이는 세포 증식 및 생존을 조절하는 데 핵심적 역할을 하고 다수의 악성 종양에서 종종 조절 곤란하기 때문이다. 조절 곤란의 메커니즘은 과잉 발현 (유방암에 있어서 Her2/neu, 비-소세포 폐암에 있어서 표피 성장 인자 수용체), 활성화 돌연변이 (위장관 간질 종양에 있어서 KIT, 급성 골수성 백혈병에 있어서 fms-관련 티로신 키나아제 3/Flk2 (FLT3)), 및 활성화의 자가분비 고리 (흑색종에 있어서 혈관 내피 성장 인자/VEGF 수용체 (VEGF/VEGFR), 육종에 있어서 혈소판 유래 성장 인자/PDGF 수용체 (PDGF/PDGFR))를 포함한다.

비정상적으로 조절된 PTK는 유사한 인간 및 갯과 동물의 암에서 기술되어 왔다. 예를 들어, Met 종양 유전자의 비정상적 발현은 인간 및 갯과 동물 모두의 골육종에서 발생한다. 흥미롭게도, c-kit의 막근접 (JM) 도메인에서 유사한 활성화 돌연변이가 인간 위장관 간질 종양 (GIST)의 50 ∼ 90％에서 그리고 갯과 동물의 진행성 MCT (비만세포종)의 30 ∼ 50％에서 관측된다. 비록 인간 GIST에서의 돌연변이는 JM 도메인에서의 결실로 이루어지고 갯과 동물의 MCT에서의 돌연변이는 JM 도메인에서의 내부 직렬 중복 (ITD)으로 이루어지지만, 상기 모두는 리간드 결합의 부재 하에 KIT의 항시적 인산화를 야기한다. PTK 및 이의 리간드, VEGF, PDGF, 및 FGF는 고형 종양에 있어서, 혈관신생으로서 공지된 신생혈관증식을 매개한다. 결과적으로, RTK를 억제함에 의해, 종양으로의 새로운 혈관의 성장이 억제될 수 있다.

종양으로의 혈관 성장을 억제하는 분자의 종류인, 항혈관신생제는 통상의 항암 약물과 비교시 신체에 대한 독성이 훨씬 덜하다. 본원에서 참고로 인용하는 미 국 특허 6,573,293은 기타 화합물 중에서도, 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (2-피롤리딘-1-일-에틸)-아미드 (이후 “화합물 I”)를 개시한다. 이는 하기 구조를 갖는다:

화합물 I

화합물 I은 PK 조절 능력을 나타내는 소 분자이다. 따라서, 상기 화합물은 비정상적 PK 활성과 관련된 장애를 치료하는 데 유용하다. 이는 RTK, PDGFR, VEGFR, KIT, 및 FLT3의 억제제이다. 화합물 I은 KIT 인산화를 억제하고, 세포 증식을 정지시키고, 각종 형태의 돌연변이 KIT를 시험관내에서 발현하는 악성 비만세포주의 세포 주기 정지 및 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 화합물 I 및 관련 분자는 다양한 인간 종양 유래의 세포주로부터 발생하는 종양 이종 이식에 대한 임상 전 모델에 효과적이다.

화합물 I은 반려 동물, 주로 개의 암 치료에 유용하며, 또한, 특히 인간의 암 치료에도 유용하다. 상기 암의 비제한적인 예로서 백혈병, 뇌암, 비-소세포 폐암, 편평세포 암종, 성상세포종, 카포시 육종, 교아세포종, 폐암, 방광암, 두경부암, 소세포 폐암, 신경교종, 결장직장암, 비뇨생식기암, 및 위장관 간질암을 들 수 있다. 또한, 화합물 I은 비만세포의 과잉 발현과 관련된 질환, 예컨대 비제한적인 예로서, 인간에서의 비만세포증 및 개에서의 비만세포종의 치료에 유용하다.

화합물 I은 개에서의 다수의 자발적 악성 종양에 대하여 임상적으로 효과적인 것으로 최근 밝혀졌다. 연구에서, 22 개의 갯과 동물의 MCT 중 11 개가 화합물 I의 처리에 대해 지속적 목표 반응 (부분 반응 및 완전 반응)을 나타내었고; 상기 MCT 중 9 개가 c- kit의 JM 도메인에서 ITD를 가졌다.

화합물 I은 쉽게 결정화된다. 이의 용해도는 25℃의 pH 6의 포스페이트 완충제 중 약 10 ㎍/㎖이다. 상기 화합물이 합성되는 경우, 합성의 마지막 단계 동안 매우 미세한 입자가 용액으로부터 침전된다. 잇따른 여과에 의한 상기 미립자의 단리는 느렸고, 여과 이후 딱딱한 덩어리가 생성되었다. 물리적 안정성 및 바람직한 물리적 특성을 갖는 화합물 I의 염에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 요약

본 발명의 화합물 I의 염 형태를 포함한다. 화합물 I의 5종의 상이한 염 형태가 합성되었고 본원에 기재되어 있다 (표 1 참고). 이는 화학식 I의 히드로클로라이드, 푸마레이트, 시트레이트, 포스페이트, 및 아스코르베이트 염을 포함한다. 상기 염의 특성화에 기초하여, 1:1의 포스페이트 염인, 화합물 I 포스페이트가 매우 바람직한 특징을 갖는 염 형태로서 식별되었다. 다형체 선별은, 본원에서 형태 I 내지 X로 일컬어지는, 화합물 I 포스페이트의 10종의 다형체의 존재를 밝혔다.

하나의 측면에서, 본 발명은 화합물 I의 2종의 염 형태를 제공하며, 여기서 상기 염 형태는 시트레이트 및 포스페이트 염, 및 이의 용매화물 및 다형체 중에서 선택된다. 하나의 실시양태에서, 분자식 C₂₂H₂₅FN₄O₂·H₃O₄P를 갖는 포스페이트 염 형태가 선택된다. 또다른 실시양태에서, 약 285 내지 약 290℃의 융점을 갖는 포스페이트 염 형태가 선택된다. 화합물 I 포스페이트는 하기 구조를 갖는다:

화합물 I 포스페이트

또다른 실시양태에서, 분자식 C₂₂H₂₅FN₄O₂·C₆H₈O₇을 갖는 시트레이트 염인, 화합물 I 시트레이트가 선택된다. 더욱 또다른 실시양태에서, 약 178 내지 약 183℃의 융점을 갖는 시트레이트 염 형태가 선택된다. 화합물 I 시트레이트는 하기 구조를 갖는다:

화합물 I 시트레이트

본 발명의 제 2 측면은 화합물 I의 포스페이트 염 또는 시트레이트 염, 또는 이의 용매화물 또는 다형체, 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명의 제 3 측면은, 단백질 키나아제를 화합물 I의 포스페이트 또는 시트레이트 염, 또는 이의 용매화물 또는 다형체와 접촉시키는 것을 포함하는, 단백질 키나아제의 촉매 활성의 조절 방법이다. 단백질 키나아제는 수용체 티로신 키나아제, 비-수용체 단백질 티로신 키나아제, 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 제 4 측면은, 화합물 I의 포스페이트 염 또는 시트레이트 염, 또는 이의 용매화물 또는 다형체, 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 유기체에게 투여하는 것을 포함하는, 유기체에서의 단백질 키나아제 관련 장애의 예방 또는 치료 방법이다. 하나의 실시양태에서, 유기체는 인간이다. 또다른 실시양태에서, 유기체는 반려 동물이다. 더욱 또다른 실시양태에서, 반려 동물은 고양이 또는 개이다. 단백질 키나아제 관련 장애는 수용체 티로신 키나아제 관련 장애, 비-수용체 단백질 티로신 키나아제 관련 장애, 및 세린/트레오닌 단백질 키아나제 관련 장애로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 단백질 키나아제 관련 장애는 EGFR 관련 장애, PDGFR 관련 장애, IGFR 관련 장애, c-kit 관련 장애, 및 FLK 관련 장애로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 상기 장애의 비제한적인 예로서 백혈병, 뇌암, 비-소세포 폐암, 편평세포 암종, 성상세포 종, 카포시 육종, 교아세포종, 폐암, 방광암, 두부암, 경부암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 신경교종, 비만세포증, 비만세포종, 결장직장암, 비뇨생식기암, 위장관암, 당뇨병, 자가면역 장애, 과다증식 장애, 재협착, 섬유증, 건선, 폰 히펠-린다우 질환, 골관절염, 류마티스 관절염, 혈관신생, 염증 장애, 면역 장애, 및 심혈관 장애를 들 수 있다.

본 발명의 제 5 측면은 염기 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (2-피롤리딘-1-일-에틸)-아미드의 포스페이트 염 결정의 제조 방법이고, 이는 화학량론적 양의 인산을 용매 또는 용매의 혼합물을 포함하는 용액 중 염기에 도입하는 단계, 용액 중 포스페이트 염이 결정화되도록 하는 단계, 용매 용액으로부터 포스페이트 염 결정을 분리하는 단계, 및 결정을 건조하는 단계를 포함한다. 인산은 염기에 대하여 40％의 몰 과량인 양으로 도입될 수 있다. 용매는 이소프로판올을 포함할 수 있다. 용매 용액으로부터 결정을 분리하는 단계는 아세토니트릴을 용액에 첨가하고 용액을 회전 증발 (rotovapping)시키는 것을 포함할 수 있다. 용매 용액으로부터 결정을 분리하는 단계는 또한 여과도 포함할 수 있다.

본 발명의 제 6 측면은 염기 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (2-피롤리딘-1-일-에틸)-아미드의 시트레이트 염 결정의 제조 방법이고, 이는 화학량론적 양의 시트르산을 용매 또는 용매의 혼합물을 포함하는 용액 중 염기에 도입하는 단계, 용액 중 시트레이트 염이 결정화되도록 하는 단계, 용매 용액으로부터 시트레이트 염 결정을 분리하는 단 계, 및 결정을 건조하는 단계를 포함한다. 시트르산은 또한 염기에 대해 약 40％의 몰 과량인 양으로 도입될 수 있다. 용매는 메탄올을 포함할 수 있다. 용매 용액으로부터 결정을 분리하는 단계는 아세토니트릴을 용액에 첨가하고 용액을 회전 증발시키는 것을 포함할 수 있다. 용매 용액으로부터 결정을 분리하는 단계는 여과를 포함할 수 있다.

제 7 측면에서, 본 발명은 화합물 I의 포스페이트 염의 다형체 형태 I ∼ X (본원에 기재된 바와 같음)를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 형태 I이 제공된다.

본 발명의 제 8 측면은 화합물 I 포스페이트의 형태 I 다형체 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명의 제 9 측면은, 단백질 키나아제를 화합물 I 포스페이트의 형태 I 다형체와 접촉시키는 것을 포함하는, 단백질 키나아제의 촉매 활성의 조절 방법이다.

본 발명의 제 10 측면은, 화합물 I 포스페이트의 형태 I 다형체의 치료 유효량을 유기체에게 투여하는 것을 포함하는, 유기체에서의 단백질 키나아제 관련 장애의 예방 또는 치료 방법이다. 하나의 실시양태에서, 유기체는 인간 또는 반려 동물이다. 또다른 실시양태에서, 반려 동물은 고양이 또는 개이다. 상기 장애의 비제한적인 예로서 비만세포종 및 비만세포증을 들 수 있다.

본 발명의 제 11 측면은 화합물 I 포스페이트의 다형체의 제조 방법이고, 이는 포스페이트 염을 용매 또는 용매의 혼합물을 포함하는 용액에 도입하는 단계, 임의로 용액에 연결 (bridging) 용매를 첨가하는 단계, 및 용매 용액으로부터 다형체 결정을 분리하는 단계를 포함한다. 용액은 물 + 아세토니트릴을 포함할 수 있다. 용액은 메탄올을 포함할 수 있다. 연결 용매는 메탄올일 수 있다.

본 발명의 제 12 측면은 비정상적 PK 활성에 의해 매개되는 질환의 치료에 유용한 약제의 제조에 있어서 화합물 I의 포스페이트 또는 시트레이트 염 또는 포스페이트 염의 형태 I 다형체의 용도이다.

도 1. 화합물 I의 염에 대한 흡습 데이터.

도 2. 화합물 I 시트레이트 및 화합물 I 포스페이트에 대한 분말 X-선 회절 패턴.

도 3. 다형체 선별 연구로부터 얻어진 10종의 유일한 고체의 분말 X-선 회절 패턴 (실시예 5 참고). 표 5 및 6에 지칭된 바와 같은 형태 I ∼ 형태 X가 제공된다.

도 4. CH₂Cl₂로부터의 고체 (형태 VI, 침전 직후), 헥산으로부터의 고체 (형태 VII, 밤새 정치 후), 및 아세토니트릴로부터의 고체 (형태 VIII, 3 일 정치 후)에 대한 TGA 곡선.

도 5. 실시예 7에서 평가된 MCT로부터의 PCR 생성물의 아가로스 겔 전기 이동의 결과. 레인 1 ∼ 5는 표 8의 환자 1 ∼ 5에 해당하고; 레인 6 ∼ 14는 표 8의 환자 6 ∼ 14에 해당한다. 대조군은 48-bp의 ITD를 함유하는 C2 갯과 동물의 비만세포로부터 생성된 PCR 생성물 (레인 15) 및 정상 갯과 동물의 소뇌로부터 생성된 PCR 생성물 (야생형; 레인 16)로 이루어진다.

도 6. 화합물 I 포스페이트의 단회 투여 이후 MCT에서 인산화된 KIT 및 인산화된 세포외 신호 조절 키나아제 (ERK)1/2의 감소.

정의. 달리 명시하지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에 사용된 하기 용어는 하기 기재된 의미를 갖는다:

온도에 대하여 사용된 용어 "C"는 섭씨 온도를 의미한다.

용어 "촉매 활성"은 RTK 및/또는 CTK의 직간접적인 영향 하에 티로신의 인산화 속도 또는 STK의 직간접적인 영향 하에 세린 및 트레오닌의 인산화 속도를 말한다.

용어 "반려 동물"은 인간과 가까이 지내는 길들여진 동물, 예컨대 비제한적인 예로서, 고양이 및 개를 말한다.

용어 "접촉"은 화합물이 PK의 촉매 활성에 영향을 미칠 수 있는 방식으로, 직접적으로, 즉, 키나아제 자체와 상호작용함에 의해, 또는 간접적으로, 즉, 키나아제의 촉매 활성이 그에 의존하는 또다른 분자와 상호작용함에 의해, 본 발명의 화합물 및 표적 PK를 접합시키는 것을 말한다.

용어 "IC₅₀"은 PK 활성의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도를 의미한다.

용어 "조절" 또는 "조절하는"은 RTK, CTK, 및 STK의 촉매 활성의 변형을 말한다. 특히, 조절은 RTK, CTK, 또는 STK가 노출되는 화합물 또는 염의 농도에 따라 RTK, CTK, 및 STK의 촉매 활성의 활성화 또는 억제, 바람직하게는 RTK, CTK, 및 STK의 촉매 활성의 활성화, 또는 더 바람직하게는 RTK, CTK, 및 STK의 촉매 활성의 억제를 말한다.

용어 "PK"는 수용체 단백질 티로신 키나아제 (RTK), 비-수용체 또는 "세포" 티로신 키나아제 (CTK) 및 세린-트레오닌 키나아제 (STK)를 말한다.

용어 "다형체"는 결정 격자 내의 분자의 상이한 배열 및/또는 확립으로 인하여 여러 상이한 형태로 발생하는, 물질의 고체상을 말한다. 다형체는 전형적으로 상이한 화학적 및 물리적 특성을 갖는다.

용어 "약학적 허용 부형제"는 약학 조성물에 첨가된, 본 발명의 화합물 이외의 임의의 물질을 말한다.

용어 "약학 조성물"은 본원에 기재된 바와 같은, 본 발명의 1종 이상의 염 또는 상기 염의 다형체와 기타 화학적 성분, 예컨대 생리학적/약학적 허용 담체 및 부형제와의 혼합물을 말한다. 약학 조성물의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.

용어 "생리학적/약학적 허용 담체"는 유기체에게 심각한 자극을 초래하지 않으며, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 방해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.

용어 "다형체"는 또한 화합물의 상이한 비용매화된 결정형으로서도 정의될 수 있다. 상기 용어는 또한 용매화물 (즉, 용매 또는 물을 함유하는 형태), 무정형 (즉, 비결정질 형태) 및 탈용매화된 (desolvated) 용매화물 (즉, 용매화물로부터 용매를 제거함에 의해서만 제조될 수 있는 형태)도 포함한다.

용어 '용매화물'은 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 약학적 허용 용매 분자, 예를 들어, 에탄올을 포함하는 분자 복합체를 기술하기 위해 사용된다. 용어 '수화물'은 상기 용매가 물인 경우 사용된다.

샘플 중 특정 다형체의 양에 대한 용어 "실질적으로 없음"은 기타 다형체가 약 15 중량％ 미만의 양으로 존재함을 의미한다. 또다른 실시양태에서, "실질적으로 없음"은 약 10 중량％ 미만을 의미한다. 또다른 실시양태에서, "실질적으로 없음"은 약 5 중량％ 미만을 의미한다. 더욱 또다른 실시양태에서, "실질적으로 없음"은 약 1 중량％ 미만을 의미한다. 당업자는 문구 "약 15 중량％ 미만의 양으로"는 관심을 갖는 다형체가 약 85 중량％ 초과의 양으로 존재함을 의미한다는 점을 이해할 것이다. 마찬가지로, 문구 "약 10 중량％ 미만"은 관심을 갖는 다형체가 약 90 중량％ 초과의 양으로 존재함을 의미하는 등이다.

용어 "치료 유효량"은 치료되는 장애의 하나 이상의 증상을 예방, 경감 또는 개선하거나, 또는 치료되는 대상체의 생존을 연장시킬, 투여되는 화합물의 양을 말한다. 암의 치료에 있어서, 치료 유효량은

(1) 종양의 크기를 감소시키고;

(2) 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 늦추거나, 또는 중단)하고;

(3) 종양 성장을 억제 (즉, 어느 정도 늦추거나, 또는 중단)하고/거나

(4) 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화 (또는 제거)하는 효과를 갖는 양을 말한다.

화합물 I의 상이한 염 형태가 합성되어 더 우수한 물리적 특성을 갖는 형태를 수득할 수 있다. 염기 화합물은 용액 중 존재할 수 있다. 용액은 일반적으로 용매이다. 하나의 실시양태에서, 용액은 알콜이다. 또다른 실시양태서, 용매는 이소프로판올, 메탄올, 아세토니트릴, 또는 물 + 아세토니트릴일 수 있다. 용액은 또한 용매의 혼합물을 포함할 수 있다.

염은 화학량론적 첨가/결정화 기술의 이용으로 결정화될 수 있다. 화학량론적 양의 반대 이온이 용액 중 염기에 도입된다. 하나의 실시양태에서, 반대 이온의 양은 염기에 대하여 1:1의 비이다. 또다른 실시양태에서, 반대 이온의 양은 염기에 대하여 0％ 내지 약 60％의 몰 과량이다. 또다른 실시양태에서, 반대 이온의 양은 염기에 대하여 약 10％ 내지 약 50％의 몰 과량이다. 더욱 또다른 실시양태에서, 반대 이온의 양은 염기에 대하여 약 40％의 몰 과량이다. 반대 이온은 히드로클로라이드, 푸마레이트, 시트레이트, 포스페이트, 및 아스코르베이트 이온을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 반대 이온은 포스페이트 이온이다. 또다른 실시양태에서, 반대 이온은 시트레이트 이온이다.

용액 중 염은 그 후 당업자에게 공지된 각종 통상의 기술, 예컨대 냉각, 증발, 침수 (drowning)에 의해 결정화될 수 있다. 과량의 용매는 당업자에게 공지된 방법에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 용매는 아세토니트릴 (ACN)을 첨가하고 용액을 회전 증발시킴에 의해 용액으로부터 제거된다. 용액은 약 40℃ 내지 약 60℃에서 회전 증발될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 추가의 용매 (예를 들어, 이소프로판올 및 메틸 에틸 케톤)가 용액에 첨가된 후, 회전 증발될 수 있다. 결정화는 어두운 곳에서 수행되어 광 유도의 이성화를 방지할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 결정은 여과에 의해 제거된다. 또다른 실시양태에서, 여과는 주위 실험실 분위기에서 수행될 수 있다.

상기 방법에 의해, 화합물 I의 아스코르베이트, 시트레이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 및 포스페이트 염이 결정화되었다. 결정화 방법의 구체예는 하기 제시된다. 생성되는 샘플의 순도를 측정하기 위해 HPLC 분석이 이용될 수 있다. 화합물의 물리적 특성은 당업자에게 공지된 시험, 예컨대 융점 측정, 분말 X-선 회절, 및 동적 흡습 중량 측정에 의해 측정될 수 있다. 상기 시험에 대한 파라미터는 하기 기재되어 있다.

상기 5종의 염 형태가 본원에 기재되어 있다 (표 1 참고). 화합물 I의 상기 염은 종종 흡습성이다. 예를 들어, 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 80％의 습도에서, 히드로클로라이드 염은 약 20％가 물이었고, 푸마레이트 염은 약 9％가 물이었으며, 아스코르베이트 염은 약 6.5％가 물이었다. 상기 특징은 약학 제형물 중 염의 사용을 어렵게 만들 수 있고, 제형물의 저장 수명을 단축시킬 수 있다. 그러나, 2 종의 염, 포스페이트 및 시트레이트 염은 예기치 못하게도 저 수분 흡수성을 가져서, 80％의 상대 습도에서, 각각 약 1％ 및 약 3.8％의 물을 갖는 것으로 발견되었다.

상기 염의 특성화에 기초하여, 1:1의 포스페이트 염인, 화합물 I 포스페이트가 매우 바람직한 특징, 예컨대 우수한 결정화도, 저 수분 흡수성, 결정화의 용이함, 우수한 순도, 및 수화물의 결핍을 갖는 염 형태로서 식별되었다. 본원에서 형태 I 내지 X로 일컬어지는, 화합물 I 포스페이트의 다형체도 기재되어 있다. 시트레이트 염도 바람직한 특징, 예컨대 저 수분 흡수성 및 우수한 결정화도를 증명하였다.

본 발명의 화합물의 다형체가 바람직한데, 왜냐하면 화합물의 특정 다형체는 동일한 화합물의 기타 다형체 형태보다 더 우수한 물리적 및 화학적 특성을 가질 수 있기 때문이다. 예를 들어, 하나의 다형체는 특정 용매 중 증가된 용해도를 가질 수 있다. 상기 추가된 용해도는 본 발명의 화합물의 제형화 또는 투여를 용이하게 할 수 있다. 상이한 다형체는 또한 상이한 기계적 특성 (예를 들어, 상이한 압축성, 치밀성, 타정성)을 가질 수 있고, 이는 약물의 타정 성능에 영향을 미쳐, 이에 따라 약물의 제형화에 영향을 미칠 수 있다. 특정 다형체는 또한 또다른 다형체와 비교시, 동일한 용매 내에서 상이한 용해 속도를 나타낼 수 있다. 상이한 다형체는 또한 상이한 물리적 (준안정성 다형체로부터 더 안정한 다형체로의 고체 상태 전환) 및 화학적 (반응성) 안정성을 가질 수 있다. 본 발명의 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은, 화합물 I 포스페이트의 형태 I 다형체에 관한 것이다.

본 발명의 실시양태에서, 순수한 단일 다형체 뿐만 아니라 2종 이상의 상이한 다형체를 포함하는 혼합물이 고려된다. 순수한 단일 다형체에는 기타 다형체가 실질적으로 없을 것이다.

본 발명의 일부 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은, 화합물 I의 1종 이상의 염, 또는 상기 염의 다형체, 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

다형체는 화합물 I 포스페이트의 농축 용액으로부터 생성되었다. 농축 용액에는 용액 ㎖당 화합물 I 포스페이트가 60 내지 100 ㎎ 범위로 존재할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 약 70 ㎎의 화합물 I이 1 ㎖의 인산에 용해될 수 있다.

다형체 결정은 당업자에게 공지된 각종 방법, 예컨대 느린 증발, 과포화 용액의 냉각, 역용매로부터의 침전 등에 의해 용매로부터 침전될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 다형체 결정은 용액을 역용매에 첨가함에 의해 생성된다. 역용매는 물 + 아세토니트릴 (ANC), 에탄올, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, THF, 에틸 아세테이트, 헥산, 메틸렌 클로라이드 (CH₂Cl₂), 이소프로필 알콜 (IPA), 메틸 에틸 케톤 (MEK), 및 디옥산일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 추가의 용매 (예를 들어, 메탄올)가 첨가될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 샘플이 밤새 정치되게 한 후 결정을 제거한다. 더욱 또다른 실시양태에서, 샘플이 3 일 동안 정치되게 한 후 결정을 제거한다.

결정은 당업자에게 공지된 표준 방법, 예컨대 PXRD 동적 흡습 중량 측정, 시차 주사 열량 측정, 열 중량 측정 분석, 및 광학 현미경 검사의 이용으로 특성화될 수 있다. 상기 기술은 하기 기재되어 있다.

본 발명의 화합물의 전달에 적절한 약학 조성물 및 이의 제조 방법은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 상기 조성물 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19 판 (Mack Publishing Company, 1995)에 서 찾을 수 있다.

약학적 허용 부형제의 선택은 인자, 예컨대 특정 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 제형의 특성에 크게 의존할 것이다. 부형제의 비제한적인 예로서 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당 및 전분 유형, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성유, 및 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있다.

화합물 I을 포함하는 약학적 허용 조성물의 제형화를 위한 담체 및 부형제는 선행 기술에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 본원에서 그 전문을 인용하는 미국 특허 제 6,573,293호에 개시되어 있다. 이의 투여 방법도 선행 기술에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 6,573,293호에 기재되어 있다. 유사한 방법이 또한 본 발명의 화합물 I의 염, 또는 상기 염의 다형체의 약학적 허용 조성물을 제형화하고 투여하는 데 이용될 수 있다.

적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 의존한다. 주사를 위해, 본 발명의 화합물은 수용액, 바람직하게는 생리학적 친화성 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거액, 또는 생리 식염수로 제형화될 수 있다. 경점막 투여를 위하여, 투과될 장벽에 대한 적절한 침투물이 제형물에 사용된다. 상기 침투물은 선행 기술에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 일시 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위하여, 제형물은 단위 제형, 예컨대 앰플 또는 다회용 용기 중 존재할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액, 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화 물질, 예컨대 현탁화제, 안정제, 또는 분산제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 혈류, 근육, 또는 내장에 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적절한 방법으로서 정맥내, 동맥내, 복막내, 경막내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내, 윤활내 및 피하를 들 수 있다. 비경구 투여에 적절한 장치로서 침 (예컨대 현미침) 주사기, 무침 주사기 및 주입 기술을 들 수 있다. 비경구 제형물은 전형적으로, 부형제, 예컨대 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 3 내지 9의 pH로 조절됨)를 함유할 수 있는 수용액이나, 일부 용도에 있어서, 이는 무균성 비-수용액으로서 또는 적절한 비히클, 예컨대 무균성 비 발열성 물과 함께 사용되는 건조 형태로서 더 적절하게 제형화될 수 있다. 추가로, 본 발명의 화합물의 현탁액은 친지질성 비히클로 제조될 수 있다. 적절한 친지질성 비히클로서 지방 오일 (예컨대 참기름), 합성 지방산 에스테르 (예컨대 에틸 올레이트 및 트리글리세라이드), 또는 리포솜과 같은 물질을 들 수 있다.

본 발명의 화합물은 경구 투여될 수 있다. 경구 투여는 화합물이 위장관으로 유입될 수 있도록 삼키는 것, 및/또는 화합물이 입으로부터 직접 혈류에 유입되게 하는 볼, 혀, 또는 설하 투여를 포함할 수 있다. 경구 투여를 위하여, 본 발명의 화합물을 선행 기술에 잘 공지된 약학적 허용 담체와 배합함에 의해 화합물을 제형화할 수 있다. 경구 투여에 적절한 제형물로서 고체, 반-고체, 및 액체 시스템, 예컨대 정제; 다입자 또는 나노입자, 액체, 또는 분말을 함유하는 연질 또는 경질 캡슐; 로젠지 (예컨대 액체 충진됨); 씹는 과자; 겔; 신속 분산 제형; 필름; 배주 (ovule); 분무제; 및 볼/점막 부착 패치를 들 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 피부 또는 점막으로 국소, 진피(내), 또는 경피 투여될 수 있다. 상기 목적에 전형적인 제형물로서 겔, 히드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고, 살포제, 드레싱, 포말, 필름, 피부 패치, 웨이퍼, 이식물, 스폰지, 섬유, 붕대 및 마이크로에멀젼을 들 수 있다. 리포솜도 사용될 수 있다. 전형적 담체로서 알콜, 물, 광유, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜을 들 수 있다. 투과 촉진제가 도입될 수 있고 - 예를 들어, [Finnin 및 Morgan, J Pharm Sci, 88 (10), 955-958, (October 1999)]를 참고하라. 국소 투여의 기타 방법으로서 전기 천공, 전리 요법, 음파 영동, 초음파 영동 및 현미침 또는 무침 (예를 들어, Powderject™, Bioject™ 등) 주사에 의한 전달을 들 수 있다.

본 발명의 화합물은 직장 투여용으로, 예를 들어, 통상의 좌제 기제, 예컨대 카카오 기름 또는 기타 글리세라이드를 이용하는, 예컨대 좌제 또는 정체 관장제로서 제형화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 비용매화 및 용매화 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 실시양태는 또한, PK를 본 발명의 화합물 I의 1종 이상의 염 또는 상기 염의 다형체와 접촉시키는 것을 포함하는, PK의 촉매 활성의 조절 방법에 관한 것이다. 상기 "접촉"은 "시험관내", 즉, 시험관, 또는 페트리 접시 등 내에서 달성될 수 있다. 시험관 내에서, 접촉은 오로지 화합물 및 관심을 갖는 PK만을 포함하거나, 또는 이는 전 세포를 포함할 수 있다. 세포는 또한 세포 배양 접시 내에서 유지되거나 성장되고, 상기 환경에 있는 화합물과 접촉될 수 있다. 상기 문맥에서, 더 복잡한 살아있는 유기체에 대한 화합물의 생체내 사용이 시도되기 이전에 특정 화합물이 PK-관련 장애에 영향을 미치는 능력, 즉, 하기 정의된 화합물의 IC₅₀이 측정될 수 있다. 유기체 밖의 세포에 대하여, PK를 화합물과 접촉시키는 다양한 방법, 예컨대 비제한적인 예로서, 직접적인 세포 미세 주사 및 다수의 경막 담체 기술이 존재하고, 당업자에게 잘 공지되어 있다.

본 발명의 실시양태는, 본 발명의 화합물 I의 1종 이상의 염 또는 상기 염의 다형체 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 유기체에게 투여하는 것을 포함하는, 유기체 (예를 들어, 반려 동물 또는 인간)에서의 단백질 키나아제 관련 장애의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 단백질 키나아제 관련 장애는 수용체 티로신 키나아제 관련 장애, 비-수용체 티로신 키나아제 관련 장애, 및 세린-트레오닌 키나아제 관련 장애로 이루어진 군 중에서 선택된다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 단백질 키나아제 관련 장애는 EGFR 관련 장애, PDGFR 관련 장애, IGFR 관련 장애, 및 FLK 관련 장애로 이루어진 군 중에서 선택된다.

그 촉매 활성이 본 발명의 화합물에 의해 조절되는 수용체 단백질 키나아제는 EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1R, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R 및 FGFR-4R로 이루어진 군 중에서 선택된다. 그 촉매 활성이 본 발명의 화합물에 의해 조절되는 세포 티로신 키나아제는 Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr 및 Yrk로 이루어진 군 중에서 선택된다. 그 촉매 활성이 본 발명의 화합물에 의해 조절되는 세린-트레오닌 단백질 키나아제는 CDK2 및 Raf로 이루어진 군 중에서 선택된다.

본 발명의 더욱 또다른 실시양태에서, 단백질 키나아제 관련 장애는 편평세포 암종, 성상세포종, 카포시 육종, 교아세포종, 폐암, 방광암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 신경교종, 결장직장암, 비뇨생식기암, 위장관암, 비만세포증, 및 비만세포종으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 단백질 키나아제 관련 장애는 당뇨병, 자가면역 장애, 과다증식 장애, 재협착, 섬유증, 건선, 폰 히펠-린다우 질환, 골관절염, 류마티스 관절염, 혈관신생, 염증 장애, 면역 장애, 및 심혈관 장애로 이루어진 군 중에서 선택된다.

본 발명에 사용하기에 적절한 약학 조성물은 활성 성분이 의도하는 목적, 예를 들어, PK 활성의 조절 또는 PK-관련 장애의 치료 또는 예방을 달성하기에 충분한 양으로 함유된 조성물을 포함한다.

치료 유효량의 측정은, 특히 본원에 제공된 상세한 개시 내용에 비추어, 충분히 당업자의 능력 이내에 있는 것이다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대하여, 치료 유효량 또는 투여량은 세포 배양 어세이로부터 초기에 측정될 수 있다. 그 후, 세포 배양에서 측정된 IC₅₀을 포함하는 순환 농도 범위가 달성되게 하는 투여량을 제형화하여 동물 모델에 사용할 수 있다. 상기 정보는 그 후 인간 또는 반려 동물에 유용한 투여량을 더 정확하게 측정하기 위하여 사용될 수 있다.

실제로, 투여될 화합물의 양은 체중 kg당 약 0.001 내지 약 100 ㎎의 범위이고, 상기 총 투여량은 한 번에 또는 분할 투여로 제공된다. 투여되는 조성물의 양은, 물론, 치료될 대상체, 고통의 심각성, 투여 방식, 처방하는 내과 의사 또는 수의사의 판단 등에 의존할 것이다. 국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우에, 약물의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관계가 없을 것이고, 선행 기술에 공지된 기타 절차가 이용되어 정확한 투여량 및 간격을 측정할 수 있다.

본 발명의 실시양태는 또한, 본 발명의 화합물 I의 1종 이상의 염 또는 상기 염의 다형체 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 반려 동물의 암의 치료 방법에 관한 것이다.

추가로, 본원에 기재된 바와 같은, 화합물 I의 염 또는 상기 염의 다형체는 유기체, 예컨대 반려 동물 또는 인간의 신체 내의 효소에 의해 대사되어 대사 산물을 생성하고 이것이 단백질 키나아제의 활성을 조절할 수 있음이 고려된다. 상기 대사 산물은 본 발명의 범위 이내에 있다.

본 발명의 화합물은 단독으로 또는 본 발명의 1종 이상의 기타 화합물과 함께 또는 1종 이상의 기타 약물과 함께 (또는 이의 임의의 조합물로서) 투여될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은, 화합물 I의 염 또는 상기 염의 다형체는 상기 기재된 질환 및 장애의 치료를 위한 기타 화학 요법제와 배합될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 오로지 플루오로우라실과 배합되거나 또는 류코보린 (leukovorin) 또는 기타 알킬화제와 더 배합될 수 있다. 본 발명의 화합물은 기타 항대사 물질 화학 요법제, 예컨대 비제한적인 예로서, 엽산 유사체 또는 퓨린 유사체와 함께 사용될 수 있다. 화합물은 또한 천연 생성물 기재의 화학 요법제, 항생 물질 화학 요법제, 효소 화학 요법제, 백금 배위 착물, 및 호르몬 및 호르몬 안타고니스트와 함께 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 고형 종양 암 또는 백혈병의 치료를 위한 미토잔트론 (mitoxantrone) 또는 파클리탁셀 (paclitaxel)과 함께 사용될 수 있음이 고려된다.

추가의 상술 없이, 당업자는, 전술한 기재 내용을 이용하여, 본 발명을 이의 최대 범위까지 실행할 수 있는 것으로 여겨진다. 하기 설명된 실시예는 각종 화합물의 제조 방법 및/또는 본 발명의 각종 공정의 수행 방법을 기재하며, 이는 단지 예시적인 것으로서 해석될 것이고, 전술한 개시 내용을 어떠한 방식으로도 제한하는 것이 아니다. 당업자는 반응물, 및 반응 조건 및 기술 모두에 대한 절차로부터의 적절한 변형을 신속하게 이해할 것이다.

실시예 1. 화합물 I, 즉 5-(5- 플루오로 -2-옥소-1,2- 디히드로 -인돌-3- 일리덴메틸 )-2,4-디메틸-1H-피롤-3- 카르복실산 (2- 피롤리딘 -1-일-에틸)-아미드의 합성

미국 특허 6,574,293 (실시예 129)에 기재된 바와 같이, 5-플루오로-1,3-디히드로-인돌-2-온을 5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (2-피롤리딘-1-일-에틸)-아미드와 축합하여 화합물 I을 제공하였다.

규모 증대 절차. 5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (61 ｇ), 5-플루오로-1,3-디히드로-인돌-2-온 (79 ｇ), 에탄올 (300 ㎖) 및 피롤리딘 (32 ㎖)을 4.5 시간 동안 환류하였다. 아세트산 (24 ㎖)을 혼합물에 첨가하고 30 분 동안 환류를 지속하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고 진공 여과에 의해 고체를 수집하며 에탄올로 2 회 세정하였다. 고체를 12 N의 염산 (6.5 ㎖)을 함유하는 물 (400 ㎖) 중 40％의 아세톤 중 130 분 동안 교반하였다. 진공 여과에 의해 고체를 수집하고 물 중 40％의 아세톤으로 2 회 세정하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (86 ｇ, 79％의 수율)을 오렌지색 고체로서 제공하였다.

5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (100 ｇ) 및 디메틸포름아미드 (500 ㎖)를 교반하고, 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (221 ｇ), 1-(2-아미노에틸)피롤리딘 (45.6 ｇ) 및 트리에틸아민 (93 ㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 진공 여과에 의해 고체 생성물을 수집하고 에탄올로 세정하였다. 64℃에서 1 시간 동안 에탄올 (500 ㎖) 중 교반함에 의해 고체를 슬러리 세정하고 실온까지 냉각시켰다. 진공 여과에 의해 고체를 수집하고, 에탄올로 세정하며, 진공 하에 건조시켜 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (2-피롤리딘-1-일-에틸)-아미드 (101.5 g, 77％의 수율)를 제공하였다.

실시예 2. 화합물 I의 염의 합성.

실시예 2A. 화합물 I 포스페이트 .

2.67 mmol의 화합물 I을 40 ㎖의 0.092 M의 인산 (1:1의 염을 추정하는 약 40％의 몰 과량) 및 40 ㎖의 이소프로판올과 함께 플라스크에 첨가하였다. 그 후, 아세토니트릴을 30 ㎖의 분액으로 지속적으로 수용액에 첨가하였고, 이때 용액을 60℃에서 회전 증발시켜 물을 제거하였다. 전부, 120 ㎖의 아세토니트릴을 사용하여 용액으로부터 물을 제거하였다. 결정을 여과하고 공기 건조시켰다. 결정은 자유 유동성 (free flowing)이고 오렌지색이었으며; 1.09 ｇ이 83％의 수율로 수집되었다.

실시예 2B. 화합물 I 시트레이트.

2.64 mmol의 화합물 I을 34 ㎖의 0.1M의 시트르산 (3.4 mmol) 및 35 ㎖의 메탄올과 함께 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액을 50℃에서 회전 증발시켰다. 상기 용액의 부피를 감소시키는 것은 불량한 결정화도를 갖는 결정을 생성하였고, 따라서 20 ㎖의 이소프로판올 및 10 ㎖의 메틸 에틸 케톤을 첨가하여 고체를 용해시켰다. 상기 혼합물을 60℃에서 회전 증발시키고 오렌지색 결정을 생성하였다. 결정을 여과하고 공기 건조시켰다. 상기 공정에 대한 수율을 약 60％였고, 이는 여과 이전에 용매 부피를 더 감소시킴에 의해 개선될 수 있었다.

실시예 3. 화합물 I의 염의 물리적 특성.

방법. 화합물 I의 염의 물리적 특성을 측정하기 위한 시험은 융점 측정, HPLC 순도, 분말 X-선 회절, 및 동적 흡습 중량 측정을 포함하였다.

분말 X-선 회절 (PXRD). Scintag X2 고급 회절 시스템 (lab 259-1088, Scintag DMS/NT 1.30a 및 마이크로소프트 윈도우 NT 4.0 소프트웨어에 의해 제어됨)을 이용하여 분말 XRD를 수행하였다. 시스템은 구리 X-선 공급원 (45 kV 및 40 mA)을 이용하여 1.5406 Å의 CuKα₁ 방출을 제공하고 고체 상태의 펠티에 (Peltier)가 검출기를 냉각시켰다. 2 및 4 mm의 튜브 발산 및 산란 방지 슬릿 (slit) 및 0.5 및 0.2 mm 너비의 검출기 산란 방지 및 수광 슬릿을 이용하여 광선 조리개를 조절하였다. 단계당 1 초의 계산 시간으로 0.03°/단계의 단계 스캔을 이용하여 2로부터 35°2-세타까지 데이터를 수집하였다. 9 mm 직경의 삽입부를 갖는 Scintag 둥근, 상부 충전식 스테인레스 강철 샘플 홀더를 실험에 이용하였다. 분말을 홀더 내에 채우고 유리 슬라이드에 의해 가볍게 가압하여 샘플 표면 및 받침 표면 사이의 평탄성을 보장하였다.

동적 흡습 중량 측정 (DMSG). 온도 조절된 대기 중 미량 천칭 상에서 등온 DMSG를 수집하였다. 대략 10 ㎎의 샘플을 저울의 샘플 접시에 위치시켰다. 습도를 실내 상대 습도 (RH)로부터 0％의 RH까지 순차적으로 변화시킨 후, 90％의 RH까지 증가시키고, 이어서 3％ RH의 단계로 0％까지 RH를 다시 감소시켰다. 그 후 매 2 분마다 질량을 측정하였다. RH를 다음 표적 값까지 변화시켰고, 이때 샘플 질량의 변화는 10 분 내에 0.5 ㎍ 미만이었다. 비주얼 베이직 프로그램 dmsgscn2.exe를 이용하여 데이터 수집을 조절하고 정보를 엑셀 스프레드시트로 보냈다.

결과. 표 1은 화합물 I의 아스코르베이트, 시트레이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 및 포스페이트 염에 대한 데이터의 요약을 보여준다. HPLC 분석은 염이 비교적 고순도였고, 염 형성 과정을 통해 순도에 있어서 어떠한 유의한 변화도 유도되지 않았음을 보여주었다.

히드로클로라이드, 푸마레이트, 및 아스코르베이트 염은 매우 흡습성이었다 (도 1 참고). 나머지 2 개의 염 (시트레이트 및 포스페이트)은 더 낮은 흡습 프로파일을 가졌고, 70％의 상대 습도에서 3％ 미만의 물을 흡수하였다.

분말 X-선 패턴은 포스페이트 및 시트레이트 염이 비교적 고 결정화도를 가짐을 나타내었다 (표 2 및 3; 및 도 2 참고).

실시예 4. 화합물 I 포스페이트의 제조 및 특성화.

실시예 4A. 화합물 I 포스페이트의 제조.

화합물 I 유리 염기를 사용하여 포스페이트 염을 제조하였다. 화합물 I 포스페이트의 샘플 (제품 번호 35282-CS-51)을 상기 기재한 바와 같이 제조하였다. 4 ㎖의 0.977 M의 인산을 플라스크 중 1.095 ｇ의 유리 염기에 첨가한 직후 4 ㎖의 아세토니트릴을 첨가하였다. 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 고온 플레이트 상에서 약간 가열하였다. 40 ㎖의 물을 첨가하고 교반하면서 약 1 시간 동안 가열하는 것은 고체를 완전히 용해시키지 않았다. 고체를 여과하고 10 ㎖의 아세토니트릴로 세정하였다. PXRD는 이것이 화합물 I의 포스페이트 염임을 보여주었다.

실시예 4B. 화합물 I 포스페이트의 특성화.

제품 35282-CS-51은 화합물 I 포스페이트의 다형체 형태 I로서 일컬어졌다. 이는 고 결정화도, 우수한 유동성, 및 큰 결정 크기를 가졌다. 화합물 I 유리 염기의 용융 온도 (유리 염기 다형체 형태 A, 256℃; 유리 염기 다형체 형태 B, 259℃)에서의 용융 사건의 부재 및 고체의 고 융점 (281 ∼ 297℃)의 존재 모두는 제품 35282-CS-51의 결정이 상이한 염 형태이고 화합물 I의 유리 염기가 아님을 나타내었다. 제품의 순도는 HPLC에 의해 99.6％였다.

실시예 4C. 화합물 I 포스페이트의 용해도 측정.

화합물 I 포스페이트 (제품 35282-CS-51)의 1 ∼ 2 ㎎의 샘플을 10 ㎖의 유리 바이알 (용기 중량이 측정됨)로 옮기고 측량하였다 (0.1 ㎎까지 정확하게). 용매를 바이알에 단계별 양식으로 첨가하고 (각 바이알에 1종의 용매), 이때 각 단계에서 0.5 ㎖의 용매를 첨가하였다. 사용된 용매는 완충제 (pH = 2), 완충제 (pH = 5), 물, 메탄올, 테트라히드로퓨란 (THF), 아세토니트릴, 및 아세톤이었다. 각 첨가 이후, 바이알에 뚜껑을 덮고 진탕시켰다. 고체의 용해가 시각적으로 관측되었다. 명백한 용해가 관측되지 않는 경우, 더 많은 용매를 즉시 첨가하였다. 용해가 명백한 경우, 바이알을 작업대 상에 적어도 30 분 동안 정치시킨 후 그 다음 용매를 첨가하였다. 흑백 배경에 대하여 결정이 보이지 않을 때까지 상기 단계를 반복하였다. 그 후, 화합물의 중량을 최종 부피 및 마지막 첨가 이전의 부피로 나눔에 의해 용해도를 괄호로 묶었다. 10 ㎖의 용매의 첨가 이후 고체가 잔류하는 경우, 용해도는 (중량/최종 부피) 미만인 것으로 표시되었다. 고체가 첫번째 용매의 첨가 이후 완전히 용해된 경우, 용해도는 (중량/용매 부피) 초과인 것으로 표시되었다. 모든 실험은 실온에서 수행되었다.

각종 용매 중 화합물 I 포스페이트의 측정된 용해도는 유리 염기의 용해도와 함께 ㎎/㎖ 단위로 표시되어 표 4에 기재되어 있다. 화합물 I 포스페이트의 용해도는 물을 제외한 동일한 용매 중 화합물 I 유리 염기의 것보다 더 낮다 (다양한 pH 수준에서). 화합물 I 포스페이트의 용해도는 용액의 pH 값에 의존하고, pH 2 이하에서 상당히 더 높아진다 (> 3 mg/㎖). 화합물 I 포스페이트 (제품 35282-CS-51)의 융점은 약 281 ∼ 297℃이고, 이는 화합물 I 유리 염기의 융점 (유리 염기 다형체 형태 A, 256℃; 유리 염기 다형체 형태 B, 260℃)보다 실질적으로 더 높다. 하나의 중요한 결과는 화합물 I 포스페이트의 물과의 습윤성이 화합물 I 유리 염기의 것보다 훨씬 더 우수하다는 점이다.

실시예 5. 화합물 I 포스페이트의 다형체의 생성.

실시예 4C에서 관측된 화합물 I 포스페이트의 저 용해도는 고농도 (60 ∼ 100 ㎎/㎖, 짙은 오렌지-적색)의 화합물 I 포스페이트의 용액이 각종 용매로부터 화합물 I 포스페이트의 다형체를 침전시키는 데 유용할 것임을 나타내었다. 상기 농축 용액은 화합물 I 유리 염기를 약 1 M의 인산에 용해시킴에 의해 제조되었다. 예를 들어, 약 70 ㎎의 화합물 I 유리 염기는 1 ㎖의 1M의 인산에 용해될 수 있었다. 그러나, 사용된 화합물 I 유리 염기 및 인산의 양은 용액의 목적 농도 및 배치 크기에 의존하였다. 침전물이 침전 직후 진공 여과되는 예에서, 약 1 ㎖의 목적 용액을 그 후 약 10 ㎖의 10종의 역용매에 떨어뜨려 염 결정을 침전시켰다. 상기 용매는 물 + 아세토니트릴 (ANC), 에탄올, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, THF, 에틸 아세테이트, 헥산, 메틸렌 클로라이드 (CH₂Cl₂) 및 이소프로필 알콜 (IPA)이었다. 침전물이 밤새 또는 3 일 동안 정치된 후 진공 여과되는 실시예에서, 메틸 에틸 케톤 (MEK) 및 디옥산의 추가의 용매가 사용되었다. 일부 유기 용매, 예를 들어, 에틸 아세테이트, 헥산, CH₂Cl₂는 물과 섞이지 않고, 용매의 두 층이 관측되었다. 심지어 첨가 이후 수분에도 오로지 약간의 침전이 계면에서 관측되었다. 상기 경우, 약 1 ㎖의 메탄올을 연결 용매로서 첨가하여, 두 층 간의 혼화성을 증가시켰다. 메탄올은 혼화성을 잘 증가시키는 것으로 보였는데, 왜냐하면 무색 유기 층이 메탄올의 첨가 직후 황색이 되었기 때문이다. 그 후, 바이알을 손에 의해 약 1 분 동안 격렬하게 진탕시켰다. 유기 용매로부터 침전된 고체를 침전 직후 (20 분 이내) 및 밤새 또는 3 일 동안 정치시킨 이후 모두에 진공 여과하여 준안정성 다형체 및 안정성 다형체 모두를 단리하였다. 그 후, 분말을 분석하였다. 상이한 고체를 발견 순서대로 번호를 매겼다.

실시예 6. 화합물 I 포스페이트의 다형체의 특성화.

실시예 6A. 특성화 방법.

상기 다형체 선별 절차로부터 얻어진 모든 분말을 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 PXRD에 의해 분석하였다. 새로운 PXRD 패턴이 관측되는 경우, 보완적 기술, 예컨대 동적 흡습 중량 측정 (실시예 3에서도 기재되어 있음), 시차 주사 열량 측정, 열 중량 측정 분석 (필요에 따라), 및 광학 현미경 검사를 또한 이용하여 고체를 특성화하였다.

시차 주사 열량 측정 (DSC). DSC 열량계 (TA 장치 2920)를 이용하여 DSC 데이터를 얻었다. 분말 (1 ∼ 5 ㎎)을 알루미늄 DSC 접시에 채워 넣었다. 알루미늄 뚜껑을 접시 상부에 위치시키고 오무렸다 (crimped). 상기 오무려진 접시를 기준으로서의 빈 접시와 함께 샘플 셀 내에 위치시켰다. 달리 명시하지 않는 한 10℃/분 의 속도로 30℃로부터 300 또는 350℃까지 온도를 증가시켰다.

열 중량 측정 (TGA). 고해상 분석기 (TA 장치 모델 2950)를 이용하여 TGA 실험을 수행하였다. NT용 TA Instruments Thermal Solutions^TM (버젼 1.3L)을 데이터 수집에 이용하고, NT용 Universal Analysis^TM (버젼 2.4F)을 데이터 분석에 이용하였다. 샘플 (5 ∼ 10 ㎎)을 알루미늄 접시 상에 위치시키고, 이를 또한 백금 측량 접시 상에 위치시킨 후 가열하였다. 알루미늄 및 백금 접시의 중량을 단 후 샘플을 올려 놓았다. 10℃/분 의 속도로 30℃로부터 300℃까지 선형으로 온도를 증가시켰다.

편광 현미경 겸사. Olympus BHSP 편광 현미경 상에서 현미경 검사를 수행하였다. 분말을 실리콘 오일에 현탁시키고 현미경 슬라이드 및 커버 슬립 사이에 분산시켰다. 관측 이전에, 커버 슬립을 슬라이드에 대하여 가볍게 문질러 입자가 잘 분산되게 하였다.

실시예 6B. 침전 직후 특성화.

결과는 표 5에 요약되어 있다. 침전은 산성 용액이 역용매와 혼합된 직후에 발생하였다. 처음에, 침전물은 성긴 솜 모양이었다. 색은 일반적으로 황색 또는 연한 오렌지색이었다. 생성되는 고체는 점착성이었다. 상기 고체의 현미경 관측은 이것이 편광 하에 우수한 복굴절성을 갖는 매우 작은 미결정으로 이루어졌음을 나타내었다. 적어도 6 가지 상이한 PXRD 패턴이 9종의 용매 시스템으로부터 얻어진 고체 상에서 관측되었다 (도 3 참고). 상기 분자 상의 아미드 측쇄는 유연하고, 이는 유리 염기 형태 B 및 이의 히드로클로라이드 염에서 상이한 입체 형태를 취한다. 따라서, 상이한 고체 형태의 분자는 입체 형태 다형체일 수 있다. 에틸 아세테이트, 헥산, 및 IPA로부터 침전된 고체의 PXRD 패턴은 동일한 것으로 보였다. 그러나, 기타 PXRD 패턴과의 상세한 비교는 상기 3종의 용매로부터의 고체의 낮은 회절 신호로 인하여 어려웠다. 결과적으로, 이는 새로운 형태로서 지정되지 않았다. 메탄올로부터의 침전물은 기준 제품 35282-CS-51 (형태 I로서 지정됨)에서와 동일하다. 모든 침전물의 TGA 데이터는 1.7 ∼ 4.7％ 수준의 잔류 용매를 지시하였다. 상기 고체 중, CH₂Cl₂로부터의 것은 결정 중 보유된 용매를 갖는 고체인 것으로 보였다. TGA 곡선은 약 125℃의 온도에서 샘플 중량의 갑작스러운 감소를 보여주었다 (도 4 참고). 상기 사건은 DSC에 의해 거의 동일한 온도에서 흡열로서 기록되었다. 또한, 상기 분말은 잘 정의된 형태의 결정으로 이루어지고 자유 유동성이었으며, 이는 기타 다수의 침전물과 매우 상이한 특성이다. 분말은 PXRD에 의해 중간 결정화도를 나타내었으나, 편광 현미경에 의해 관측시 우수한 결정화도를 나타내었다. 기타 제품은 매우 미세한 미결정으로 이루어졌다. 상기 분말의 DSC 곡선 상에서, 샘플이 샘플 셀에 로딩되자마자 넓고 얕은 흡열이 관측되었다. 상기 관측 결과는 TGA에서의 가열 초기로부터 점차적인 중량 손실로서 TGA에 의해 반영된다. 따라서, 상기 제품에 대하여, 잔류 용매는 아마도 표면 흡착된 용매이고 결정 격자 내의 용매가 아니었다.

실시예 6C. 용매 중 3 일 까지 정치시킨 후 침전.

본 결과는 표 6에 요약되어 있다. 용매 중 3 일까지의 정치 시간 이후, 새로운 솜털 같지 않은 (non-fluffy) 오렌지-적색 고체상이 나타났다. 메탄올로부터의 침전물을 제외한, 모든 유기 용매로부터 얻어진 솜털 같은 (fluffy) 침전물은 변형을 겪었다. 명백히, 침전 직후 침전된 고체는, 이들이 시간이 지나면서 더 안정한 고체 형태 (형태 I)로 전환된다는 점에서, 상기 경우 준안정성이었다. 상기 전환은 대부분의 용매 시스템 중 수 시간 내에 완료되는 것으로 보였다. 그러나, 2 가지 고체 형태의 혼합물이 얻어지는 것을 피하기 위하여, 이를 훨씬 더 긴 기간 동안 정치되게 하여 과정의 완료를 보장하였다. TGA 곡선은 헥산 및 아세토니트릴 각각으로부터 얻어진 고체에 대하여 약 124℃ 및 153℃에서 갑작스러운 중량 손실을 보여주었고, 이는 DSC에서의 동일한 온도에서의 흡열과 결부된다. 따라서, 이는 또한 결정 격자 내에 감금된 용매를 함유하는 것으로 보였다. 보유된 용매의 화학량론은 아세토니트릴의 경우 약 0.6이고 헥산의 경우 약 0.14이다. 3 일 동안 정치된 후 침상 결정이 아세토니트릴로부터 자랐다. 아세토니트릴 보유 고체의 PXRD 패턴은 유일한 한편, 헥산 용매화물의 PXRD 패턴은 앞서 식별된 CH₂Cl₂ 보유 고체와 유사하다 (도 3). 양쪽 용매 보유 고체 (헥산 및 아세토니트릴)는 TGA 접시 상에서 중량이 감소되었다. 해당 보유된 용매가 가열에 의해 제거된 후 양쪽 고체의 유일한 PXRD 패턴이 관측되었고 (표 7, 도 3), 이는 고체로부터의 용매 분자의 제거가 용매화물 결정의 구조 변화를 야기하였음을 나타낸다 (따라서, 용매 분자는 결정 표면 상 뿐만 아니라 결정 격자 내에 존재한다). 그러나, 아세토니트릴 탈용매화물의 PXRD 패턴은 신호 강도가 낮았다. 아세토니트릴 탈용매화물의 DSC 프로파일은, 아세토니트릴 용매화물의 DSC 프로파일과 비교시, 74℃ 및 174℃에서 2 회의 추가의 열 사건을 나타낸 한편, 153℃에서의 탈용매화 사건은 부재하였다. 탈용매화 이후 샘플의 냉각은 174℃에서 강력한 변화를 겪는 고체를 변화시켰을 것이다.

기타 유기 용매가 사용되는 경우, 침전물의 더 긴 정치 기간은 형태 I (제품 35282-CS-51)의 것과 동일한 PXRD 패턴을 갖는 고체를 제공하였으나, 결정의 형태는 상이하였다 (표 6). 동일한 PXRD 패턴은 상기 고체가 동일한 결정 격자 구조를 가짐을 나타내었다. 상이한 형태는 용매 효과로 인한 것임에 틀림없다. 형태 I이 본원에 기록된 모든 비-용매화된 다형체 중 가장 안정한 고체상임이 명백하다. 기타 용매가 없는 고체 형태는 준안정성이었고, 용매와 접촉시 급속히 형태 I로 전환되었다. CH₂Cl₂로부터의 고체는 헥산으로부터의 고체보다 더 용이하게 유동하는 것으로 보였다. TGA, 형태, 및 유동성은 이들이 2 가지 상이한 고체임을 나타내었다.

실시예 7. 갯과 동물의 비만세포종에서의 KIT 인산화의 억제.

목적. 암에 대한 표적 치료의 개발은 분자 표적에 대한 약물 효과를 직접적으로 평가하고 상기 효과를 종양 생물학 및 약물 약동학과 상호 관련시킬 기회를 제공한다. 이는 종양학적 약물 개발에 도움이 될 수 있는데, 왜냐하면 이는 약력학/약동학 관계를 확립하고 표적 작용제의 치료 효과에 대한 결정적인 정보를 제공하기 때문이다. 상기 연구의 목적은, KIT 인산화를 직접적인 표적 억제의 마커로서 이용하여, 수용체 티로신 키나아제 억제제인 화합물 I 포스페이트의 단회 투여가 진행성 MCT를 갖는 갯과 동물 환자의 갯과 동물 비만세포종 (MCT)에서의 이의 분자 표적 KIT의 활성에 미치는 효과를 평가하는 것이었다. 또한, ERK1/2 (KIT 신호 전달의 다운스트림의 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK))의 인산화, 화합물 I 포스페이트의 혈장 농도, 및 c- kit의 돌연변이 상태를 연구하여, 상기 파라미터가 화합물 I 포스페이트의 처리 이후 KIT 인산화 상태와 어떻게 상호 관련되는 지를 측정하였다.

연구 약물. 화합물 I 포스페이트는 20 ㎎으로 표시된 정제로 이용가능하였다.

연구 디자인. 본 연구는 재발 또는 전이 등급의 II/III MCT를 갖는 개에서의 표적 조절 연구의 증거가 되었다. 환자는 3.25 ㎎/kg의 화합물 I 포스페이트의 단회 경구 투여량을 투여받았다. 6 mm의 펀치 생검 도구를 이용하여, 화합물 I 포스페이트의 투여 이전 및 처리 이후 8 시간 (h)에 종양으로부터의 샘플을 얻었다. 가능한 경우, 복수 개의 생검을 취하였다. 각 샘플을 액체 질소 중 급속 냉동시키고 분석 이전에 -70℃에서 저장하였다. 화합물 I 포스페이트의 혈장 수준의 분석을 위한 혈액 샘플을 종양 생검과 동시에 얻었다 (하기 참고).

화합물 I 포스페이트의 혈장 수준. 혈액 샘플을 경정맥으로부터 추출하여 상부가 적색인 혈청 수집 진공 유리관 내에 위치시켰다. 견본을 실온에서 정치시키고, 응고되게 하며, 1500 rpm에서 4℃에서 10 분 동안 원심분리하고, 냉동 바이알 (cryovial)로 옮기고, -70℃에서의 분석 동안 혈장을 냉동시켰다. 간략히, 갯과 동물의 혈장 중 혈장 샘플 (20 ㎕) 또는 화합물 I 포스페이트 표준을, 96 웰 폴리프로필렌 플레이트 (일리노이주, 웨스트몬트 소재의 오로켐 테크날러지 (Orochem Technology)) 중 DL-프로프라놀롤 히드로클로라이드 (내부 표준)를 함유하는 메탄올 (200 ㎕)과 혼합하였다. 플레이트를 1 분 동안 와동(vortex)에 의해 혼합하고, 샘플을 4000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 10 ㎕의 상청액을 LC/MS/MS 시스템 상부로 주입하였고, 여기서 BetaBasic C-18 (5 ㎛, 100 X 4.6 mm) 역상 고성능 액체 크로마토그래피 칼럼 (캘리포니아주, 포스터 시티 소재의 키스톤 사이언티픽 (Keystone Scientific)) 상에서 분리가 일어났다. 0.2 내지 500 ng/㎖ 범위의 화합물의 공지된 양을 이용하여 생성된 표준 곡선에 기초하여 각 갯과 동물의 혈장 샘플 중 화합물 I 포스페이트 및 내부 표준의 양을 측량하였다.

c- kit 돌연변이 분석. 대부분의 샘플에 대하여, 제조업체의 지시에 따라 TRIzol (캘리포니아주, 칼스바드 소재의 인비트로겐 (Invitrogen))을 이용하여 RNA를 추출하였다. 그 후, dNTP, 무작위 프라이머, 5X First Strand Buffer, 0.1 M의 DTT, 및 Superscript Taq 폴리머라제 (모두 위스콘신주, 매디슨 소재의 프로메가 (Promega) 사제)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 생성하였다. 각 샘플에 대하여 cDNA를 측량하였다. 나머지 샘플에 대하여, 게놈 DNA를 앞서 기재되어 있는 바와 같이 제조하였다 ([Downing, S., Chien, M. B., Kass, P. H., Moore, P. F., 및London, C. A. Prevalence and importance of internal tandem duplications in exons 11 and 12 of c-kit in mast cell tumors of dogs. Am. J. Vet. Res., 63: 1718-1723, 2002]; 본원에서 그 전문을 참고로 인용함). 양쪽 반응을 위하여, PCR을 94℃ (1 분), 59℃ (1 분), 및 72℃ (1 분)로 이루어진 40 주기 동안 가동하고, 반응 말기에 72℃에서 5 분 연장하였다. 갯과 동물의 C2 비만세포주로부터 생성된 c-kit cDNA 및 정상 갯과 동물의 소뇌로부터 생성된 cDNA를 대조군으로서 이용하였다.

PCR 생성물을 4％의 아가로스 겔 상의 전기 이동에 의해 분리하였고; 예측된 야생형 c-kit PCR 생성물은 cDNA로부터의 PCR의 경우 196 bp의 크기이고, 게놈 DNA PCR의 경우 190 bp의 크기이다. ITD가 명백하지 않은 (오로지 단일 밴드가 존재하는) 경우에 있어서, Promega PCR Wizard Clean-Up 키트 (프로메가)를 이용하여 PCR 생성물을 겔 정제하고, P1 (정방향) 및 P5 또는 P2 (역방향) 프라이머 모두를 이용하여 캘리포니아-다비스 대학의 핵심 서열 분석 장치에서 서열 분석하여, 매우 작은 ITD, 결실, 또는 점 돌연변이의 존재를 배제하였다. DNASIS 서열 분석 프로그램을 이용하여 서열 배열 및 비교를 수행하였다.

KIT 및 ERK 인산화의 분석. 종양 생검을 액체 질소 중 동결시키고, 이후 액체 질소 냉각된 냉동 절구 및 절굿공이를 이용하여 분쇄한 후, 사용시까지 -70℃에서 저장하였다. KIT의 분석을 위하여, 분쇄된 종양을 앞서 기재되어 있는 바와 같이 균질화하고, 용해하며, KIT에 대한 아가로스 결합된 항체 (SC-1493AC; 캘리포니아주, 산타 크루즈 소재의 산타 크루즈 바이오테크날러지 (Santa Cruz Biotechnology))를 이용하여 1 ㎎의 출발 종양 용해물로부터 면역 침전시켰다 ([Abrams, T. J., Lee, L. B., Murray, L. J., Pryer, N. K., Cherrington, J. M. SU11248 inhibits KIT and platelet-derived growth factor receptor beta in preclinical models of human small cell lung cancer. Mol. Cancer Ther. 2: 471-478, 2003]; 본원에서 그 전문을 참고로 이용함). 복수 개의 생검이 이용가능한 경우, 반복 면역 침전/웨스턴 블롯 분석을 개별 생검에 대하여 수행하였다. 각 샘플 중 인산화된 KIT의 양을, 갯과 동물의 KIT의 티로신 721에 해당하고, 자가 인산화 부위이며, 따라서 KIT 키나아제 활성에 대한 대용물인, 뮤린 KIT의 포스포티로신 719에 대한 항체 (3391; 매사추세츠주, 베벌리 소재의 셀 시그널링 테크날러지 (Cell Signaling Technology))를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. 총 KIT의 분석을 위하여, 블롯을 제거하고, 재 차단하며, KIT에 대한 항체 (A-4542; 캘리포니아주, 카핀테리아 소재의 DAKO 코포레이션 (DAKO Corp.))를 이용하여 재 프로브 검사하였다. p42/44 ERK의 분석을 위하여, KIT 분석에 이용된 동일한 종양 용해물을 포스포-Thr 202/Tyr 204 ERK1/2에 대한 항체 (9101B; 셀 시그널링 테크날러지)를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 프로브 검사한 후, 제거하고 총 ERK에 대한 항체 (9102; 셀 시그널링 테크날러지)를 이용하여 재 프로브 검사하였다. KIT 및 ERK1/2 양쪽에 대한 평가가능한 종양 생검 쌍은 그에 대하여 검출가능한 총 단백질이 쌍의 양쪽 생검 중 존재하는 것으로 고려되었다. 3 명의 맹검 관측자에 의해 육안으로 JM 상태 및 혈장 농도에 대한 표적 조절의 점수가 매겨졌다. 처리 전 생검과 비교시 처리 후 취해진 생검 샘플 중 총 단백질 신호에 대한 포스포-단백질 신호에서의 ≥ 50％의 감소는 표적 조절에 대하여 양성인 것으로 매겨진 한편, < 50％의 감소는 음성인 것으로 매겨졌다.

결과. 화합물 I 포스페이트의 단회 투여량의 경구 투여 이후 발생한 KIT 티로신 인산화의 감소 여부를 측정하는 주 목적을 갖는 본 임상 연구에 14 마리의 개를 등록하였다. KIT 키나아제 활성에 대한 대용물로서 기능하는, KIT의 자가 인산화 부위에 대한 포스포-특이적 항체를 이용하여 KIT 티로신 인산화를 평가하였다. 또한, c- kit JM 돌연변이 상태 (ITD+ 또는 ITD-)를 기준선 종양 생검으로부터 측정하고, 화합물 I 포스페이트의 혈장 농도를 투여 이후 8 시간에 측정하여 상기 파라미터를 KIT 인산화의 억제와 상호 관련시켰다. 14 마리 개 중 11 마리가 KIT 표적 조절에 대하여 평가가능하였다. 평가 불가능한 것으로 여겨지는 3 마리의 개는 하나 또는 양쪽 생검에서 검출 불가능하거나 크게 감소된 총 KIT 단백질을 가졌고, 따라서 표적 조절에 대하여 점수를 매길 수 없었다. 연구에 동록된 모든 개에 대한 데이터는 표 8에 요약되어 있다.

분석된 14 마리의 개 중, 5 마리 (36％)는 PCR 분석에 의하여 ITD를 가졌고 (도 5, 레인 1-5); 모든 5 개의 종양은 ITD의 증거를 가졌다. 흥미롭게도, 환자 2는 야생형 c-kit 대립 유전자를 명백하게 잃었다. ITD의 증거를 갖지 않는 나머지 9 마리의 개로부터의 PCR 생성물 (도 5, 레인 6-14)을 직접 서열 분석하였고, 어떠한 것도 임의의 돌연변이 유형 (삽입, 결실, 또는 점 돌연변이)을 나타내지 않았다. 레인 3, 6, 8, 및 9에 대하여, 게놈 DNA를 PCR 반응에 사용하였고, 약간 더 작은 (190 bp) 야생형 생성물이 야기되었다.

기준선에서의 MCT에서 발현된 총 KIT 및 인산화된 KIT의 수준은 동물 간에 다양하였다. 더 높은 KIT 발현은 더 높은 종양 등급과 상호 관련되었다. 6 개의 등급 II 종양 중 1 개와 비교시, 8 개의 등급 III 종양 중 4 개가 높은 KIT 발현을 가졌다 (도 6). 예를 들어, 환자 2로부터의 종양 (등급 III)에서의 총 KIT 발현은 환자 11로부터의 종양 (등급 II)에서의 것보다 현저하게 더 높았다. 등급 III 종양을 갖는 개는 등급 II 종양을 갖는 개보다 기준선에서 더 높은 수준의 인산화된 KIT의 더 빈번한 발생을 나타내었고, 이는 진행성 종양에서의 c- kit ITD 돌연변이의 증가된 빈도 및 그 결과 리간드 독립적으로 인산화된 KIT의 상승된 수준과 일치한다. 등급 III 종양을 갖는 평가가능한 7 마리의 개 중 5 마리는 기준선에서 높은 수준의 인산화된 KIT를 가졌고; 이들 중 4 마리는 c- kit에서 ITD의 존재에 대하여 양성이었다. 오로지 하나의 등급 II 종양만이 유의하게 인산화된 KIT를 가졌고; 상기 동물은 또한 ITD-돌연변이의 c- kit를 발현하였다.

처리 전 샘플과 비교시 화합물 I 포스페이트의 처리 이후 취해진 생검 샘플에 있어서, 총 KIT에 대하여 인산화된 KIT에서의 ≥ 50％의 감소의 기준을 이용하는 표적 조절에 대하여, 11 마리의 평가가능한 개 중 8 마리가 양성으로 매겨졌다. 화합물 I 포스페이트에 의한 처리 이전 및 이후에 취해진 종양 생검의 면역 침전물에서의 인산화된 KIT 및 총 KIT의 예가 도 6에 도시되어 있다. 5 개의 종양 (도 6, 왼쪽)은 표적 조절에 대하여 양성으로 매겨진 한편, 2 개의 종양 (도 6, 오른쪽)은 음성으로 매겨졌다. 화합물 I 포스페이트의 처리 이후 KIT 인산화의 억제에 대하여 음성으로 매겨진 생검 쌍 모두는 양성으로 매겨진 것보다 기준선에서 현저하게 덜 인산화된 KIT를 가졌다 (도 6).

화합물 I 포스페이트의 억제가 KIT 인산화에 의해 조절되는 신호 전달 경로다운스트림에 미치는 효과를 평가하기 위하여, 인산화된 MAPK ERK1/2의 수준을 KIT 분석에 이용된 동일한 생검 쌍의 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. 14 개의 종양 중 11 개가 포스포-ERK1/2 표적 조절에 대하여 평가가능하였다 (이들 중 2 개는 또한 KIT 표적 조절에 대하여 평가 불가능하였다). 11 개의 평가가능한 것 중, 7 개는 기준선 종양 샘플과 비교시, 화합물 I 포스페이트의 투여 이후 샘플링된 종양 중 포스포-ERK1/2 대 총 ERK1/2의 비의 감소를 나타내었다 (도 6 참고). ERK 표적 조절은 저 ERK를 갖는 MCT보다 비교적 높은 기준선 ERK 발현 및 인산화를 갖는 MCT에서 더 빈번하게 검출되었다.

설치류 모델에서의 임상 전 작업에 기초하여, 표적 억제를 위한 화합물 I의 치료 범위는 24 시간의 투여 기간 중 12 시간 동안 50 ∼ 100 ng/㎖인 것으로 생각되었다. 3.25 ㎎/kg의 단회 투여 이후 8 시간째 화합물 I 포스페이트의 혈장 농도 (대략 Cmax)는 33.2 내지 186 ng/㎖의 범위였고, 이때 평균은 105 ± 9 ng/㎖였다 (표 8). 한 마리의 동물에 있어서, 화합물 I 포스페이트의 혈장 농도는 기타 샘플의 범위 밖에 있었다 (0.3 ng/㎖). 14 마리의 개 중 12 마리가 화합물 I의 I 상 임상 연구에서 확립된 치료 범위 내에 있는 것으로 고려되는 혈장 수준을 가졌다 [London, C. A., Hannah, A. L., Zadovoskaya, R., Chien M. B., Kollias-Baker, C., Rosenberg, M., Downing, S., Post, G., Boucher, J., Shenoy, N., Mendel, D. B., 및 Cherrington, J. M. Phase I dose-escalating study of SU11654, a small molecule receptor tyrosine kinase inhibitor, in dogs with spontaneous malignancies. Clin. Cancer Res., 2755-2768, 2003]. KIT 표적 조절의 증거를 갖는 개에서의 평균 혈장 농도 (79.2 ± 41 ng/㎖) 및 KIT 표적 조절에 대하여 득점되지 않은 개에서의 평균 혈장 농도 (137 ± 36 ng/㎖)는 유의하게 상이하지 않았다 (P = 0.08).

검토. 상기 상관 관계 연구는 화합물 I 포스페이트의 단회 임상 유효 투여량이 갯과 동물의 MCT에서의 KIT의 인산화에 미치는 효과 및 이어서 MAPK를 통한 신호 전달에 미치는 영향을 연구함에 의해 비슷한 임상 집단에서의 표적 조절을 조사하기 위하여 고안되었다. 상기 연구에서 달성된 화합물 I 포스페이트의 혈장 농도는, 임상 전 약동학 연구에 기초하여 예측된 Cmax 근처인 것으로 측정되었고, 이는 화합물 I의 유효 투여량 및 요법을 조사하는 I 상 임상 연구에서 측정된 약물 수준과 일치하였다 (표 8).

화합물 I 포스페이트의 단회 경구 투여 이후 인산화된 KIT의 감소에 의해 측정시, 11 개의 평가가능한 MCT 생검 쌍 중 8 개 (73％)가 KIT 활성화를 검출가능하게 억제하였다. 처리 이후 검출가능한 KIT 표적 조절을 보여주지 않은 3 마리의 환자는 기준선에서 낮은 수준의 KIT 및 포스포-KIT를 발현한 MCT를 가졌다. 상기 환자에 있어서 유의한 표적 조절의 결핍은 검출 방법에서의 기술적 한계의 탓일 수 있고; 비인산화된 KIT와 비교시 인산화된 KIT에 대한 포스포-특이적 항체의 민감성이 낮은 기준선 KIT 발현을 갖는 샘플에 불충분한 것일 수 있다. KIT 활성의 억제는 c-kit ITD 유전자형보다 기준선 KIT 인산화와 더 밀접하게 상호 관련되었다. 세포 어세이에 기초하여, 야생형 KIT 및 ITD 돌연변이 KIT 모두는 생체내에서 화합물 I 포스페이트에 의해 억제될 것으로 예측되었는데, 왜냐하면 시험관내에서 화합물 I은 야생형 KIT 및 ITD 돌연변이 KIT의 인산화를 비슷한 효능으로 차단하였기 때문이다.

화합물 I 포스페이트는 또한 KIT의 신호 전달 경로 다운스트림에도 영향을 미쳤다. GIST 및 조혈 악성 종양에서 c-kit의 돌연변이는 서로 및 야생형 KIT와 상이한 신호 전달 경로를 활성화하는 것으로 보고되었다. 갯과 동물의 MCT에 있어서, 하나를 제외한 모든 종양 샘플이 기준선에서 검출가능한 인산화된 ERK1/2를 가졌다. 처리 이후 인산화된 ERK1/2의 감소에 의해 평가시, 11 개의 평가가능한 종양 생검 쌍 중 7 개에서 ERK1/2가 억제되었다. ERK1/2 억제에 대하여 양성으로 매겨진 모든 종양이 KIT 인산화의 억제에도 양성인 것은 아니었다. ERK1/2 표적 조절은 종양 등급 또는 c- kit ITD 돌연변이의 유무와 상호 관련이 없었다. KIT 표적 조절과 마찬가지로, ERK1/2 표적 조절은 기준선에서 높은 수준의 ERK1/2 및 인산화된 ERK1/2를 발현한 종양에서 더 빈번하게 검출되었다.

MCT의 치료 이후 화합물 I 포스페이트의 분자 표적의 억제의 검출은 상기 환경에서의 화합물 I 포스페이트에 대한 표적 조절의 증거로서 기능한다. 상기 발견의 임상적 타당성은 분자 표적의 억제 및 치료 범위의 혈장 약물 농도 간의 상호 관계, 및 표적 유전자에서 활성화 돌연변이를 발현하는 MCT를 갖는 갯과 동물 환자에 있어서 화합물 I에 대한 앞서 보고된 임상적 목표 반응에 의해 지지되어, 상기 환자 집단에서의 화합물 I 포스페이트에 대한 개념의 증거를 제공한다. 기타 악성 종양 (예컨대, 포유동물 암종, 연조직 육종, 및 다발 골수종)을 갖는 개도 화합물 I에 의한 치료시 지속적인 목표 반응을 나타내었으므로, 상기 혈장 농도에서의 KIT의 억제는, 화합물 I의 시험관내 및 생체내 효능에 기초하여, 기타 종양에 의해 발현된 화합물 I의 기타 밀접하게 관련된 수용체 티로신 키나아제 표적의 성공적 억제로까지 합리적으로 추정되어, 상기 종양에서의 목표 반응에 대한 분자 이론을 제공할 수 있다. 예를 들어, 갯과 포유동물의 종양은 VEGFR을 발현하고, 이는 세포 시험관내 어세이에서 KIT에 대한 것과 비슷한 농도의 인돌리논 티로신 키나아제 억제제에 의해 억제된다 [Liao, A. T., Chien, M. B., Shenoy, N., Mendel, D. B., McMahon, G., Cherrington, J. M., 및 London, C. A. Inhibition of constitutively active forms of mutant kit by multitargeted indolinone tyrosine kinase inhibitors. Blood, 100: 585-593, 2002]. 화합물 I 포스페이트가 MCT에서의 야생형 c-kit 및 ITD 돌연변이 c-kit 모두를 억제하는 것은, 따라서, 다수의 상이한 종양 유형에 의해 비정상적으로 발현되고/거나 조절되는, 화합물 I 포스페이트의 관련 RTK 표적, VEGFR, 및 PDGFR의 억제에 대한 대용물로서 기능할 수 있다. 결국, 갯과 동물 종양에서의 임상적 목표 반응과 결부된, 분자 표적 억제는 인간 암에서의 관련 화합물의 개발을 활성화된 KIT, VEGFR, 또는 PDGFR을 발현하는 임상 집단에 향하게 한다.

실시예 8. 재발성 비만세포종을 갖는 개의 치료에서의 경구 화합물 I 포스페 이트의 다기관, 플라시보 대조군의, 이중 맹검 , 무작위 연구.

목적. 수술 이후 재발성 측정가능한 질환을 갖는 고객 소유 동물의 비만세포종의 치료를 위한 화합물 I 포스페이트 경구 정제의 유효성을 맹검, 음성 대조군 연구로 평가하였다. 상기 연구는 체중 kg당 3.25 ㎎의 유리 염기 등가물 (FBE)로 화합물 I 포스페이트를 하루 걸러 투여하여, 수정된 (RECIST) 반응 기준을 이용한 질환 반응에 대하여 평가하였다. 비만세포종에서의 c- kit 돌연변이의 유무를 상기 연구에서의 공변량으로서 평가하였다. 의사 결정 목적을 위하여, 연구의 지속 기간은 6 주였다.

백 오십 세 (153) 마리의 개를 2 개의 처리군 중 하나에 4:3의 비로 무작위로 추출하였다: T01 (n = 65인 플라시보) 및 T02 (n = 88인 화합물 I 포스페이트). 미국에서의 10 개의 수의학적 종양학 관례를 선택하고 사례 등록하였다. 등록을 위하여, 개는 재발성 비만세포종 (적어도 하나의 표적 병변이 최소한 20 mm의 최장 직경을 가져야 함) ± 국소적 림프절 병발을 가져야 했다. 3 개의 표적 병변 (측정가능한 비만세포종) 및 모든 비-표적 병변 (측정가능하거나 측정 불가능한 모든 나머지 병변)의 최대치가 2 명의 평가자에 의해 기준선으로서 식별되었다. 효능은 6 주째의 방문에서 목표 반응 (완전 반응 또는 부분 반응)에 기초한 것이었고, 여기서 표적 병변의 최장 직경의 2 명의 평가자 합계의 평균치 (평균 합계 LD)를 백분율 감소 또는 증가의 계산을 위한 기준선 평균 합계 LD에 비교하였다. 비-표적 병변의 평가는 주관적이었다. 완전 반응 (CR)은 모든 표적 병변 및 비-표적 병변의 소실 및 어떠한 새로운 병변도 출현하지 않음으로서 정의되었고; 부분 반응 (PR)은 기준선 평균 합계 LD와 비교시 표적 병변의 평균 합계 LD에 있어서 적어도 30％의 감소 및 비-표적 병변의 비-진행 및 어떠한 새로운 병변도 출현하지 않음으로서 정의되었다. 종양 및 먼 정상 피부로부터의 조직 샘플을 수집한 후 무작위 추출하여, c- kit 돌연변이 상태의 평가를 위해 제출하였다.

팔십 여덟 (86) 마리의 T02 및 65 마리의 T01 동물을 효능 분석에 포함시켰다. 데이터 분석 결과 플라시보 (T01)와 비교시 화합물 I 포스페이트 (T02)에 있어서 1차 종점 (목표 반응)에서의 통계적으로 유의한 개선이 나타났다. T01 동물 (7.9％; 5/63)과 비교시 T02 동물은 유의하게 더 큰 목표 반응률 (38.3％; 33/86)을 나타내었다 (p < 0.001). 거의 2 배로 많은 T01 동물 (66.7％; 42/63)이 T02 동물 (33.7％; 29/86)과 비교시 진행성 질환을 경험하였다. c- kit 돌연변이에 대하여 양성인 T02 군의 개는 c- kit 돌연변이에 대하여 음성인 개와 비교시 목표 반응을 나타낼 가능성이 거의 2 배였다 (각각 60％, 12/20 대 32.8％, 21/64).

결론적으로, 상기 연구는 고객 소유의 개의 재발성 비만세포종의 치료에 대한 화합물 I 포스페이트 경구 정제의 유효성을 증명하였다.

상기 예시적 실시예에 제공된 본 발명에서의 다수의 수정 및 변형이 당업자에게 떠오를 것으로 예상된다. 결론적으로, 하기 특허청구범위에 나타나는 제한만을 본 발명에 두어야 한다.

Claims

5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (2-피롤리딘-1-일-에틸)-아미드인 염기의 시트레이트 및 포스페이트 염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 염 형태, 또는 이의 용매화물 또는 다형체.
제1항에 있어서, 염이 하기 구조를 갖는 포스페이트 염인 염 형태, 또는 이의 용매화물 또는 다형체:
제2항에 있어서, 분자식 C₂₂H₂₅FN₄O₂·H₃PO₄를 갖고 융점이 약 285 내지 약 290℃인 염 형태.
CuKα₁ 방출 (파장 = 1.5406 옹스트롬)을 이용하여 얻어진 2 세타 각의 도 (± 0.1 도)로 표현된 피크 20.8, 24.5, 25.9, 및 27.0을 포함하는 분말 X-선 회절 스펙트럼을 갖는, 제2항의 포스페이트 염의 다형체 (형태 I).
제1항에 있어서, 염이 하기 구조를 갖는 시트레이트 염인 염 형태, 또는 이의 용매화물 또는 다형체:
제5항에 있어서, 분자식 C₂₂H₂₅FN₄O₂·C₆H₈O₇을 갖고 융점이 약 178 내지 약 183℃인 염 형태.
제5항에 있어서, CuKα₁ 방출 (파장 = 1.5406 옹스트롬)을 이용하여 얻어진 2 세타 각의 도 (± 0.1 도)로 표현된 피크 9.1, 9.4, 14.2, 25.4, 및 26.8을 포함하는 분말 X-선 회절 패턴을 갖는 염 형태.
제2항의 포스페이트 염, 제5항의 시트레이트 염, 또는 이의 용매화물 또는 다형체, 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
단백질 키나아제를 제2항의 포스페이트 염, 제5항의 시트레이트 염, 또는 이의 용매화물 또는 다형체와 접촉시키는 것을 포함하는, 단백질 키나아제의 촉매 활성의 조절 방법.
수용체 티로신 키나아제, 비-수용체 단백질 티로신 키아나제, 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제로 이루어진 군 중에서 선택되는, 제9항의 단백질 키나아제.
제8항의 약학 조성물의 치료 유효량을 유기체에게 투여하는 것을 포함하는, 유기체에서의 단백질 키나아제 관련 장애의 예방 또는 치료 방법.
제11항에 있어서, 단백질 키아나제 관련 장애가 비만세포종 또는 비만세포증인 방법.
(a) 화학량론적 양의 인산을 용매 또는 용매의 혼합물을 포함하는 용액 중 염기에 도입하는 단계;

(b) 용액으로부터 포스페이트 염을 결정화하는 단계; 및

(c) 용매 용액으로부터 포스페이트 염 결정을 분리하는 단계

를 포함하는, 제1항의 염기의 포스페이트 염 결정의 제조 방법.
(a) 포스페이트 염을 용매 또는 용매의 혼합물을 포함하는 용액에 도입하는 단계;

(b) 임의로, 연결 (bridging) 용매를 용액에 첨가하는 단계; 및

(c) 용매 용액으로부터 다형체 결정을 분리하는 단계

를 포함하는, 제2항의 포스페이트 염의 다형체의 제조 방법.
제14항에 있어서, 단계 (a)의 용매가 메탄올을 포함하는 방법.
(a) 화학량론적 양의 시트르산을 용매 또는 용매의 혼합물을 포함하는 용액 중 염기에 도입하는 단계;

(b) 용액으로부터 시트레이트 염 결정을 결정화하는 단계; 및

(c) 용매 용액으로부터 시트레이트 염 결정을 분리하는 단계

를 포함하는, 제1항의 염기의 시트레이트 염 결정의 제조 방법.
비정상적 PK 활성에 의해 매개되는 질환의 치료에 유용한 약제의 제조에 있어서, 제2항의 포스페이트 염, 제5항의 시트레이트 염, 또는 이의 용매화물 또는 다형체의 용도.