TWI310766B - Solid salt forms of a pyrrole substituted 2-indolinone - Google Patents

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1310766 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域:j 發明領域 本發明是關於一經3-吡咯取代之2-吲哚酮化合物， 5 5-[5-氟-2-側氧-1,2-二氫』弓丨哚-(3Z)-亞基甲基]·2,4·二曱基4 氫-吼σ各-3-缓酸(2-吼洛°定-1-基乙基)·醯胺。該前述化合物古周 節蛋白激酶(“PKs”)的活性。本發明的該等化合物因此可用 於治療有關異常的PK活性的病症。包含這種化合物的鹽的 藥學組成物和製備它們的方法是被揭露。本發明也針對該 10 醯胺的磷酸鹽型態的同素異形體。 發明背景 下面被提供的只是作為背景信息及不被承認是對本發 明的先前技術。 15 固體，包括藥物，常具有多於一個的晶形，及這是已 知的同質多晶形性。當一化合物在多種不同的晶體堆積的 固相中結晶時，同質多晶形性會發生。許多例子在藥物固 態性質的標準參考資料中被引用，如Byrn, S. R., Solid-State

Chemistry of Drugs, New York, Academic Press (1982)、 20 Kuhnert-Brandstatter, M., Thermomiscroscopy In The Analysis of Pharmaceuticals, New York, Pergamon Press (1971) and Haleblian, J. K. and McCrone, W. Pharmaceutical applications of polymorphism. J. Pharm. Sci., 58, 911 (1969)。Byrn聲明，通常同素異形體顯示出不同的包括溶解 5 1310766 度的物理性質，和物理與化學穩定性。 因為在分子堆積中的差別，同素異形體可在影響藥品 釋放的方式、固態穩定性的方式和藥物製造的方式上不 同。同素異形體的相對穩定性和同素異形體的相互轉變對 5 一種上市藥品的選擇特別重要。例如，一種上市藥品的選 擇可取決於可利用性和具有所欲特性（諸如極好的物理穩 定性或可被大規模製造的能力）的一適當同素異形體的選 擇。在該產品的保存期限内，該固體劑量型態的性能不應 受到同素異形體的轉變而被限制。重要注意的是沒有可靠 10 的方法來預測一給定藥品的可見的晶體結構或預測具所欲 物理性質的同素異形體的存在。 P K S是能催化在蛋白質的酪胺酸、絲胺酸和蘇胺酸殘基 上羥基的磷酸化反應的酵素。這個表面上簡單的活性的結 果是難以相信的，因為事實上以一種方式或另一種的細胞 15 生命的所有方面（例如細胞生長、分化和增殖)取決於PK活 性。此外，異常的PK活性與各病症的一宿主有關，該等病 症是從相對地對生命沒有威脅的疾病，諸如牛皮癬，到非 常致命的疾病諸如神經膠母細胞瘤（腦癌）。 受體酪胺酸激酶(RTKs)，PK的一種，是用於分子靶向 20 治療非常好的候選物，因為它們在控制細胞增殖和存活上 起了關鍵作用，並在多種惡性腫瘤中經常失調。該失調的 機制包括過度表達（乳腺癌中的Her2/neu、非小細胞肺癌中 的表皮生長因子受體）、激活突變（胃腸道間質瘤中的KIT、 急性骨髓性白血病中的fms相關的赂胺酸激酶3/Flk2 6 1310766 (FUr3))'及活化的自有分泌（黑色素瘤中的血管内皮生長因 子7 VEGF受體(VEGF/VEGFR)、肉瘤中的血小板衍生的生長 因子/PDGF受體(pdgf/pdGFR))。 被異常調節的RTKs被描述在對比之人類癌和犬類癌

5中。例如’ Met致癌基因的異常表達在人類肉骨瘤和犬類肉 月瘤中都會發生。有趣地是，c-kit的近膜(JM)域的激活突 I見於5〇°/°-90%之人類胃腸道間質瘤（GISTs)及見於 3〇%-50%之高級犬類河01^ (肥胖細胞腫瘤）。儘管在人類 ISTS中的突變由在該JM域的脫失構成，及在犬MCTs中的 10犬變由在該jM域的内源性串連複製(ITDs)構成，在缺少配 位基結合下，二者都產生連續的kit磷酸化。該RTKs和它 們的配位基，VEGF、PDGF> FGF調節在實性瘤中的新生 就疋已知的血官形成。因此，透過抑制，可抑 制在腫瘤内新生血管的生長。 15 20 抗血管生成劑，一種抑制腫瘤内血管生長的分子，具 有與傳統抗癌藥物相比對身體較少的毒性。在此併入本案 以為參考資料的美國專利6,573,293揭露在其它化合物之’中 :5似_2_側氧_丨，2_二氫_吲哚叫亞基甲基]从二甲 基-1氫-吡咯-3-羧酸（2-口比咯复、 “几入 谷疋1基乙基）醯胺（此後稱為 化合物I”）。它具有如下結構： 7 1310766 ο

化合物I是一顯示ΡΚ調節能力的小分子。該化合物因此 9 用於治療與異常ΡΚ活性相關的病症。它是RTKs、PDGFR、 5 VEGFR、KIT和FLT3的一抑制劑。化合被指出抑制KIT 磷酸化、阻止細胞增殖並誘導在體外惡性肥胖細胞系（表現 不同的突變體KIT型態）中細胞週期中止和凋亡。化合物^口 相關分子在潛伏期模式中能有效對抗由不同人類腫瘤來源 的細胞系引起的腫瘤異體移植物。 10 化合物1用於治療伴侣動物（主要是狗）的癌，也可用於 - 治療尤其是人的癌。這些癌包括但不限制在白血病、腦癌、 • 非小細胞肺癌、鱗狀上皮細胞瘤、星狀細胞瘤、Kaposi氏 肉瘤、神經膠母細胞瘤、肺癌、膀胱癌、頭頸癌、小細胞 肺癌、神經膠瘤、結腸癌、泌尿道癌和胃腸道癌。化合物工 15也用於治療有關於肥胖細胞過度表現的疾病，包括但不限 制在人的肥大細胞增多症和犬的肥胖細胞瘤。 化合物I在近期被指出在臨床上有效對抗很多在狗中 自發的惡性腫瘤。在該研究中，22個犬MCTs中的11個顯示 出對化合物I治療的持續的客觀反應（部分緩解和完全緩 20解）；這些MCTs的9個具有在c-kit的JM域中的ITDs。 1310766 化合物I容易結晶。在25°C時pH是6的磷酸鹽緩衝液中 它的溶解度約是lOpg/ml。當該化合物被合成時，在合成的 最後步驟中，非常細的顆粒從溶液中被沉澱出來。接下來 透過過濾這些細顆粒的分離很慢，及在過濾後產生一硬的 5 滤泥。有一對一具有物理穩定性和所欲的物理性質的化合 物I的鹽的需求。 I：發明内容3 發明概要 本發明包含化合物I的各式鹽的型態。在這裏合成和描 10 述化合物I的五個不同的鹽的型態（見表1)。這些包括化合物 I的氫氯化物鹽、反-丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽和抗壞 血酸鹽。基於這些鹽的特徵，該1:1的磷酸鹽、化合物I的磷 酸鹽被認為是具高所欲特徵的一鹽的型態。同素異形體篩 選揭示了化合物I磷酸鹽的10個同素異形體的存在，本文被 15 命名為型態I至型態X。 在一方面，這個發明提供了化合物I的兩種鹽的型態， 其中該鹽的型態從該檸檬酸鹽和磷酸鹽，及它們的溶劑化 物和同素異形體。在一具體例中，具一C22H25FN4(VH3P04 的分子式和一 494的分子量的磷酸鹽型態是被選擇。在另一 20 具體例中，具一熔點從約是285°C至約290°C的磷酸鹽型態 是被選擇。化合物I磷酸鹽具有的一結構是： 9 1310766

化合物i鱗酸鹽

在另一具體例中，具有一 c22h25fn4o2_c6h8o7的分子式 和一 589的分子量的該檸檬酸鹽（化合物I檸檬酸鹽）是被選 擇。在再另一具體例中，具一熔點是從約178°C至約183°C 的該檸檬酸鹽型態是被選擇。化合物I檸檬酸鹽的一結構 疋·

l^N^0 HO〇C、 Η

HOOC——OH

^COOH 化合物I檸檬酸鹽 10 本發明的第二方面是一藥學組成物，包含化合物I磷酸 鹽或化合物I擰檬酸鹽，或它們的溶劑化物或同素異形體， 及一藥學上可接受的載劑或賦形劑。 本發明的第三方面是一用來調節蛋白激酶的催化活性 的方法，方法包含使該蛋白激酶與該化合物I磷酸鹽或化合 10 1310766 物1檸檬酸鹽，或它們的溶劑化物或同素異形體接觸。可從 由受體赂胺酸激酶、非受體蛋白胳胺酸激酶和絲胺酸/蘇胺 酸蛋白激酶構成的群組中選擇該蛋白激酶。 本發明的第四方面是一預防或治療—有機體中與一蛋 5白激_相關的病症之方法，方法包含對該有機體投藥以一 治療上有政劑量的一藥學組成物，該藥學組成物包含化合 物I磷酸鹽或化合物丨檸檬酸鹽，或它們的溶劑化物或同素異 形體，及一藥學上可接受的載劑或賦形劑。在一具體例中， 該有機體是一人。在另一具體例中，該有機體是一伴侣動 10 物。在又另一具體例中，該伴侣動物是一貓或一狗。該蛋 白激酶相關病症可從由一受體酪胺酸激酶相關病症、一非 受體蛋白酪胺酸激酶相關病症及與一絲胺酸/蘇胺酸蛋白 激酶相關病症構成的群組中選擇。該蛋白激酶相關病症可 從由〆EGFR相關病症、一 pDGFi^a關病症、一 IGFR相關 15病症、一 c-kit相關病症及FLK相關病症構成的群組中選擇。 這些病症包括（透過例子和不限制在）白血病、腦癌、非小細 胞肺癌 '鱗狀上皮細胞瘤、星狀細胞瘤、尺叩“氏肉瘤、 神經膠母細胞瘤、肺癌、膀胱癌、頭癌、頸癌、黑色素瘤、 卵巢癌别列腺癌、乳腺癌、小細胞肺癌、神經膠瘤、肥 20大細胞增多症、肥胖細胞瘤、結腸癌、泌尿道癌、胃腸道 癌、糖尿病、一自體免疫病症、一過度增殖病症、再狹窄、 纖雉化、牛皮癬、νΰη Heppel-Lindau疾病、骨關節炎、風 濕性關節炎、血管生成、一炎性病症、一免疫病症及一心 血管病症。 11 1310766 本發明的第五方面是一製備鹼5-[5-氟-2-側氧-1，2-二氫 -吲哚-(3Z)-亞基曱基]-2,4-二甲基-1氫-吼咯-3-曱酸(2-»比咯 啶-1-基乙基)-醯胺的磷酸鹽晶體之方法，該方法包含在一 包含一溶劑或一溶劑的混合物的溶液中對該驗引入一化學 5 計量的磷酸，迫使該磷酸鹽在溶液中結晶，從該溶劑溶液 中分離該磷酸鹽晶體，及乾燥該晶體。該磷酸是以一超過 該鹼的40%莫爾的量被引入。該溶劑可包含異丙醇。從溶 劑溶液中分離該晶體的步驟可包含對該溶液加入乙腈和旋 蒸該溶液。從溶劑溶液中分離該晶體的步驟也可包含過濾。 10 本發明的第六方面是一製備鹼5-[5-氟-2-側氧-1，2-二氫 -吲哚-(3Z)-亞基曱基]-2,4-二甲基-1氫-吼咯-3-曱酸(2-吡咯 啶-1-基乙基)-醯胺的檸檬酸鹽晶體之方法，該方法包含在 一包令—溶劑或一溶劑的混合物溶液對該域中引入一化學 計量擰檬酸，迫使該檸檬酸鹽在溶液中結晶，從溶液中分 15 離該檸檬酸鹽晶體，及乾燥該晶體。該檸檬酸是以一超過 該鹼的40%莫爾的量被引入。該溶劑可包含曱醇。從溶劑 溶液中分離該晶體的步驟可包含對該溶液加入乙腈和旋蒸 該溶液。從溶劑溶液中分離該晶體的步驟可包含過濾。 在一第七方面中，本發明提供了化合物I的磷酸鹽的同 20 素異形體型態I-X(如本文所描述的）。在一具體例中，提供 了型態I。 本發明的一第八方面是一包含化合物I磷酸鹽的型態I 同素異形體和一藥學上可接受的載劑或賦形劑的藥學組成 物。 12 1310766 本發明的一第九方面是一用於調節蛋白激酶的催化活 性的方法，包含使該蛋白激酶與化合物I磷酸鹽的型態I同素 異形體接觸。 本發明的一第十方面是一預防或治療在一有機體中與 5 一蛋白激酶相關的病症之方法，該方法包含對該有機體投 藥以一治療上有效劑量之化合物I磷酸鹽的型態I同素異形 體。在一具體例中，該有機體是一人或一伴侣動物。在另 一具體例中，該伴侣動物是一貓或一狗。這些病症包括（透 過例子和不限制在）肥胖細胞瘤和肥大細胞增多症。 10 本發明的一第十一方面是一製備化合物I磷酸鹽同素 異形體之方法，包含對一溶劑或一溶劑混合物的溶液引入 該磷酸鹽，選擇性地，對該溶液加入一橋連溶劑，及從該 溶劑溶液中分離該同素異形體晶體。該溶液可包含水加上 乙腈。該橋連溶劑可是甲醇。

15 本發明的一第十二方面是在一藥劑的製備中化合物I 磷酸鹽或化合物I擰檬酸鹽或磷酸鹽型態I同素異形體的使 用，該藥劑用於治療透過異常PK活性調節的一疾病。 圖式簡單說明 第1圖是化合物I的鹽的水氣吸著數據。 20 第2圖是化合物I檸檬酸鹽和化合物I磷酸鹽的粉末X射 線繞射圖形。 第3圖是從該同素異形體篩選研究（見實施例5)得到十 個單獨的固體的粉末X射線繞射圖形。在表5、表6和表7中 指明的型態I至型態X是被顯示。 13 1310766 第4圖是來自CHfl2(型態VI，在沉澱之後馬上地）、己 燒(型態VII，在靜置一夜後)和乙腈(型態VIII，在靜置3天後） 的固體的TGA曲線。 第5圖是來自這個研究中評估的mcTs的PCR產物的洋 5菜糖膠體電泳結果。帶1-5對應表1中的患者1-5 ;帶6-14對 應表1中的患者6_14。由PCR產物構成的對照組是從含有一 48-bp ITD(帶15)的C2犬肥胖細胞系和從正常犬小腦（野生 型；帶16)產生。 第6圖是在一化合物I磷酸鹽單一劑量之後在厘匸丁磷酸 1〇化的KIT和磷酸化的細胞外信號調節激酶(ERK)l/2中的減 少。 t實施方式j 較佳實施例之詳細說明 定義：除非另外聲明，用在說明書和申請專利範圍的 15下面術語具有如下論述的意義： 當用於關於溫度時，該術語“c，是指攝氏溫度或攝氏 的。 該術語“催化活性”是指在直接或間接的腿⑻或 CTKs的影響下路胺酸的鱗酸化速率，或在直接或間接的 20 STks影響下絲胺酸和蘇胺酸的磷酸化速率。 該術語“伴估動物，，是關於為人提供陪伴的被·的動 物，及包括但不限制在貓和狗。 該術語“接觸，，是關於把本發明的-化合物與一乾PK以 »玄化D物此直接影響（也就是透過與該激酶本身的交互作 14 1310766 用）或間接影響（透過與該激酶的催化活性所取決之另一分 子的交互作用）該PK的催化活性的方式放在一起。 - 該術語“IC5Q”是指一測試化合物的濃度達到一該PK活 . 性的半-最大抑制的濃度。 5 該術語“調節（modulation)”或“調節（modulating)”是關 - 於改變RTKs、CTKs和STKs的催化活性。特別是，調節 (modulating)是關於RTKs、CTKs和STKs的催化活性的活化 • 或抑制，較佳地是該RTKs、CTKs和STKs的催化活性的活 化’取決於該RTKs、CTKs和STKs所被暴露在的該化合物 1〇 或鹽的濃度，或更佳地是該RTKs、CTKs和STKs的催化活 性的抑制。 該術語“PK”是關於受體蛋白酪胺酸激酶(RTKs)、非受 體或“細胞，，酪胺酸激酶（CTKs)和絲胺酸-蘇胺酸激酶 (STKs)。 §亥術語“同素異形體”是關於一物質的固相，由於在晶 • 格中該等分子的不同排列及/或構形，固相以一些有區別的 型態存在。同素異形體一般具有不同的化學性質和物理性 質。 該術語“藥學上可接受的賦形劑，，是關於被加入一藥學 2〇 級成物中之不同於本發明的一化合物的任何物質。 該術語“藥學組成物”是關於一個或多個本發明的鹽或 如本文所描述的這些鹽的該等同素異形體，和其它諸如生 理上/藥學上可接受的載劑和賦形劑的化學成分的一混合 物。一藥學組成物的目的是使對一有機體投藥以一化合物 15 1310766 更為容易。 該術語“生理上/藥學上可接受的載劑”是關於一對一有 機體不會引起大的刺激及不會取消該被投藥的化合物的生 物活性與性質的載劑或稀釋劑。 5 該術語“同素異形體”也可被定義為一化合物的不同的 非溶劑化晶體型態。該術語也包括溶劑化物(也就是含有溶 劑或水的型態）、非晶（amorphous)型態（也就是非晶 (noncrystalline)型態）及去溶劑化溶劑化物（也就是只能透過 除去一溶劑化物中的水而產生的型態）。 10 該術語“溶劑化物”被用來描述一分子複合物，該分子 複合物包含本發明的一化合物和一個或多個藥學上可接受 的溶劑分子，例如乙醇。當該溶劑是水時所使用的術語是 “水合物”。 該術語“實質地不含有”是關於一樣品中一特定同素異 15 形體的量，是指其它同素異形體以一小於約15wt%的量存 在。在另一具體例中，“實質地不含有”是指小於約10wt%。 在另一具體例中，“實質地不含有”是指小於約5wt%。在又 另一具體例中，“實質地不含有”是指小於約lwt%。在此技 藝中具通常技術的某些人士會懂得短語“以一小於約15 w t % 20 的量存在”是指該感興趣的同素異形體是以一大於約85wt% 的量存在。同樣地，該短語“小於約l〇wt%”是指該感興趣的 同素異形體是以一大於約90wt%的量存在，等等。 該術語“治療上有效的量”是關於被投藥的化合物的 量，它會防止、減輕或改善被治療病症的一個或多個症狀， 16 1310766 或延長被治療的受試者的存活。關於癌的治療，一治療上 有效的量是關於具有以下作用的量： (1) 減低腫瘤的大小； (2) 抑制（就是減緩至某種程度，或停止）腫瘤轉移； 5 (3)抑制（就是減緩至某種程度，或停止）腫瘤生長；及/ 或 (4)減輕與癌有關的一個或多個症狀到某種程度（或消 除）。 為得到一具較好物理性質的型態，可合成化合物I的不 10 同鹽的型態。該鹼化合物可在溶液中。該溶液通常是一溶 劑。在一具體例中，該溶液是一醇。在另一具體例中，該 溶劑可是異丙醇、曱醇或乙腈。該溶液也可包含多種溶劑 的一混合物。 使用一化學計量添加/結晶技術，該等鹽可被結晶。相 15 對離子的化學計量被引入溶液中的該鹼。在一具體例中， 對於該域，相對離子的量是以一 1:1的比例引入該鹼。在另 一具體例中，相對離子的量是超過該鹼的從0%至約60%莫 爾。在另一具體例中，相對離子的量是超過該鹼的從10% 至約50%莫爾。在又另一具體例中，相對離子的量是超過 20 該鹼的約40%莫爾。該等相對離子可包括氫氯化物、反-丁 烯二酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽和抗壞血酸鹽離子。在一具 體例中，該相對離子是該磷酸鹽離子。在另一具體例中， 該相對離子是該檸檬酸鹽離子。 一熟悉此項技術之人士瞭解，透過多種包括冷卻、蒸 17 1310766 兔、叹濕4等的普通技術，會使溶液中的鹽結晶。透過一 熟悉此項技術之人士瞭解的各種方法，可從樣品中除去過 量的溶劑。在一具體例中，透過加入乙腈(ACN)和旋蒸該溶 液’從該溶液中除去該等溶劑。在約40°C至約6〇t可旋蒸 5 5亥溶液。在另一具體例中’在旋蒸之前可對該溶液加入額 外的溶劑(例如’異丙醇和甲基乙基酮）。為防止光誘導異構 化，該等結晶可在黑暗中操作。在一具體例中，透過過濾 該等晶體被分離。在另一具體例中，過濾可在周圍實驗室 氛圍下進行。 10 透過這些方法，化合物I的抗壞血酸鹽、檸檬酸鹽、反 -丁烯二酸鹽、氫氣化物和填酸鹽被結晶。下面提供了結晶 方法的特定例子。Η p L C分析可被用來測量該合成樣品的純 度。透過一熟悉此項技術之人士瞭解的測試，包括熔點測 里私末X射線繞射和動態水氣吸著重量測量法，可測量該 15等化合物的物理性質。下面描述了這些測試的參數。 本文描述了五種鹽的型態（見表1}。化合物丨的這些鹽常 书疋吸濕的。例如，如表1中所示，在80〇/〇的濕度時，該氫 氯化物鹽約含20%的水，該反_丁烯二酸鹽約含9%的水，及 β亥抗壞金酸鹽約含6.5%的水。這些特徵使在一藥物配方中 20遠鹽的利用變得困難並會縮短一個配方的保存期限。可 是’這兩種鹽，該攝酸鹽和該擰檬酸鹽，意外地被發現在 80%的相對濕度時分別含有約1%的水和約38%的水的低的 吸濕。 基於這些鹽的特徵，該1:1的磷酸鹽、化合物丨磷酸鹽被 18 1310766 認為具高所欲特點的一鹽的型態，該等特點包括好的結晶 度、低吸濕、結晶的簡易、好的純度和缺少水合物。化合 物I磷酸鹽的十個同素異形體，在本文被命名為型態I至X， 也被描述。該檸檬酸鹽也被證實所欲的特點，諸如低吸濕 5 和好的結晶度。 本發明的化合物的同素異形體是所欲的，因為一化合 物的一特別的同素異形體可具有比相同化合物的其它同素 異形體型態較好的物理性質和化學性質。例如，在某些溶 劑中一同素異形體可具有增加的溶解度。這種經增加的溶 10 解度可使本發明的化合物的配製或投藥更容易。不同的同 素異形體也可能具有不同的機械性質（例如不同的壓縮 性、壓實性、可壓性），它們可影響該藥的壓片性能及因此 影響該藥品的配製。在相同的溶劑中，相對於其它同素異 形體，一特別的同素異形體也可能顯示不同的溶解速度。 15 不同的同素異形體也可能具有不同的物理（從介穩的同素 異形體到一更穩定的同素異形體的固態轉變）和化學（反應 性)穩定性。本發明一具體例規劃了化合物I磷酸鹽的型態I 同素異形體，如本文所描述的。 在本發明一具體例中，考慮了純的、單一的同素異形 20 體及包含兩個或多個不同同素異形體的混合物。一純的、 單一的同素異形體可能實質地不含有其它同素異形體。 本發明的一些具體例考慮了包含如本文所描述的一個 或多個化合物I的鹽或這些鹽的同素異形體，及一藥學上可 接受的載劑或賦形劑的藥學組成物。 19 1310766 同素異形體是由經濃縮的化合物i磷酸鹽溶液產生。該 經濃縮溶液可在每mL溶液中有60mg/mL至100mg/ml範圍 内的化合物I碌酸鹽。在一具體例中，約70mg的化合物I被 溶解在1 mL構酸中。 5 透過多種一熟悉此項技術之人士瞭解的方法包括例如 慢蒸發、冷卻一過飽和溶液、從一反溶劑中沉澱等等，可 從一溶劑中沉澱該同素異形體晶體。在一具體例中，透過 把溶液加入一反溶劑中產生該等同素異形體晶體。該反溶 劑可是水加上乙腈(ANC)、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、THF、 10 乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷(CH2C12)、異丙醇(IPA)甲基乙 基酮(MEK)和二噁烷。在一具體例中，一額外的溶劑(舉例 來說，曱醇）可被加入。在另一具體例中，在分離等晶體之 前允許該等樣品靜置一夜。在又另一具體例中，在分離該 專晶體之前允許該等樣品靜置三天。 15 使用一熟悉此項技術之人士瞭解的包括PXRD動態水 氣吸著重量測量法、微差掃描熱量法、熱解重量分析和光 顯微學的標準方法可表現該等晶體的特徵。這些技術被描 述在下面。 適合於本發明的化合物的輸送和製備它們的方法的藥 20 學組成物對那些熟悉此項技術之人士顯然是很容易。這種 組成物和製備它們的方法可在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)中找到。 一藥學上可接受的賦形劑的選擇在很大程度上取決於 20 1310766 諸如特定的投藥模式、該賦形劑在溶解度和穩定性上的影 響、及該劑量型態的本質等因素。賦形劑的例子包括但不 限制在碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類的澱粉、纖維素 衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。 5 供包含化合物I之藥學上可接受的組成物配製的載劑 與賦形劑在技術中是熟悉的並被揭露的，例如，美國專利 No.6,573,293，它在這裏以全文而被併入。對於這類投藥方 法在此技藝中也是已知的並也被描述，例如，美國專利 No.6,573,293。類似的方法也可用於由本發明的化合物I的 10 鹽或這些鹽的該等同素異形體構成的藥學上可接受的組成 物的配製和投藥。 適當的配方取決於所選擇之投藥的程序。對於注射， 本發明的該等化合物可配製在水溶液中，較佳地是在生理 上親和的緩衝液中，諸如Hank溶液、Ringer溶液或生理鹽 15 水缓衝液。對於透黏膜投藥，對障壁能滲透的適當的滲透 劑被用在配方中。這些滲透劑通常在此技藝中是已知的。 對於非經口之投藥，舉例來說，透過食團注射或連續輸液， 配方可以個體劑量型態呈現，諸如在安瓿中或多劑量容器 中。該等組成物可以諸如在油性或水載劑中之懸浮液、溶 20 液或乳液的型態呈現，及可含有配方材料，諸如懸浮劑、 安定劑或分散劑。 本發明的該等化合物可直接被投藥至血流中、肌肉中 或一内器官中。對於非經口投藥的適當的方式包括靜脈 内、動脈間、腹膜内、鞘内的、室内、尿道内、胸骨内、 21 1310766 顧内、肌内、滑臈腔内及皮下的。對於非經口投藥的適當 的裝置包括針（包括顯微操作用針)注射器、無針注射器及輸 液技術。非經口配方一般是水溶液，它可含有賦形劑，諸 如鹽、碳水化合物和緩衝劑(較佳地是調節到一從3至9的卩11 5值）’但是對一些應用，它們更適合被配製成一滅菌非水溶 液或一被乾燥的型態得配方，來用於與—適當的載劑(諸如 滅菌、無熱原(pyrogen)的水)一起使用。額外地，本發明的 化合物的懸浮液可在一親脂性載劑中製備。適當的親脂性 載劑包括脂肪油（諸如芝麻油）' 合成脂肪酸酯（諸如油酸乙 10 脂和三酸甘油酯）、或諸如脂質體的材料。 本發明的該等化合物可被口服。口服可包括吞嚥，藉 此該化合物進入胃腸道，及/或透過頰的、舌的或舌下投 藥，這些該化合物直接從口進入血流。有關口服，透過組 合本發明的該等化合物與技術中已知的藥學上可接受的載 15 劑，該等化合物能被配製。適於口服的配方包括固體、半 固體和液體系統，諸如片劑；含有多顆粒或奈米顆粒、液 體或粉末的軟或硬膠囊；錠劑（包括液體填充）；咀嚼片；凝 膠；快速分散劑量型態；膜；小卵（ovules);喷霧；及頰/ 黏附貼布。 2〇 本發明的該等化合物也可對皮膚或黏膜局部投藥、皮 下（皮膚）投藥、或透皮投藥。供這種用途的一般的配方包括 凝膠、水凝膠、洗劑、溶液、乳油、軟膏、散佈劑、敷料、 泡沫、膜、皮膚貼布、粉片、植埋片、海綿、纖維、端帶 和微乳液。也可用到脂質體。一般載劑包括醇、水、礦物 22 1310766 油、液態石蠟、白石蠟脂、甘油、聚乙二醇和丙二醇。透皮 促進劑可被併入一見，例如j Pharm Sci, 88(10)，955-958, by Finnin and Morgan (October 1999)。其它局部投藥方式包括 透過電穿孔、電泳、超聲波導入(phonophoresis)、超聲波導 5 入（sonophoresis)和顯微操作用針或無針（舉例來說， Powderject™、Bioject™等等）注射的輸送。 本發明的該等化合物可配製成用於直腸投藥，諸如例 如使用傳統栓劑基體（諸如可可脂或其它甘油酯）的栓劑或 閉尿灌腸劑。 1〇 本發明的該等化合物也可以非溶劑化和溶劑化型態存 在。 本發明的該等具體例考慮了一方法，這個方法是用於 一PK催化活性的調節，包含使該PK與化合物I的一個或多 個鹽或本發明的這些鹽的同素異形體接觸。這種“接觸’’能 15 “在體外”實現，也就是，在一測試管中，一培養皿等等。 在一測試管中，接觸可僅包括僅一化合物和一感興趣的PK 或可包括整個細胞。也可在細胞培養皿中供養細胞或使細 胞生長，及在那種環境下使細胞與一化合物接觸。在這個 上下文中，一特定化合物影響一PK相關病症的能力，也就 20 是該化合物的IC5G ’如下被定義的，在該化合物被嘗試使用 在更複雜的活機體之前，可被測量。關於有機體外的細胞， 為獲得與該等化合物接觸的PKs，多種方法存在並對熟悉此 項技術之人士是熟知的，包括但不限制在，直接細胞顯微 注射和眾多的穿膜載劑技術。 23 1310766 本發明的具體例考慮了-方法，該方法用來治療和預 防-有機體中(舉例來說伴㈣物或—人)_蛋白激酶相 關的病症，包含投藥以一治療上有效量之一藥學組成物， 該藥學組成物包含化合物I的鹽的一個或多個或本發明的 5這些鹽的同素異开>體，及對於該有機體而言一藥學上可接 受的載劑或賦形劑。 在本發明一具體例中，該蛋白激酶相關病症由一受體 酪胺酸激酶相關病症、一非受體酪胺酸激酶相關病症、和 一絲胺酸-蘇胺酸激酶相關病症構成的群組中選擇。在本發 10明的另一具體例中，該蛋白激酶相關病症由一EGFR相關病 症、一 PDGFR相關病症、一 IGFR相關病症和一 FLK相關病 症構成的群組中選擇。 該催化活性是透過這個發明的一化合物來調節的受體 蛋白激酶的是由 EGF、HER2、HER3、HER4、IR、IGIMR、 15 IRR、PDGFRtx、PDGFRp、CSFIR、C-kit、C-fms、Flk-1R、 Flk4、KDR/Flk-1、Flt-1、FGFR-1R、FGFR-2R、FGFR-3R 和FGFR-4R構成的群組中選擇。該催化活性是透過這個發 明的一化合物來調節的細胞酿胺酸激酶是由Src、Frk、、

Csk、Abl、ZAP70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack、Yes、Fyn、 20 Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk構成的群組中選擇。該催 化活性是透過這個發明的一化合物來調節的絲胺酸_蘇胺 醆蛋白激酶是由CDK2和Raf構成的群組中選擇。 在本發明的又另一具體例中，該蛋白激酶相關病症是 由鱗狀上皮細胞瘤、星狀細胞瘤、Kaposi氏肉瘤、神經膠 24 1310766 母細胞瘤、肺癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、 如列腺癌、乳腺癌、小細胞肺癌、神經膠瘤、結腸癌、泌 尿道癌、胃腸道癌、肥大細胞增多症和肥胖細胞瘤構成的 群組中選擇。在本發明一具體例中，該蛋白激酶相關病症 5是由糖尿病'一自體免疫病症、一過度增殖病症、再狹窄、 纖維化、牛皮癬、von Heppel-Lindau疾病、骨肉瘤、風濕 性關節炎、血管形成、一炎性病症、一免疫病症和一心血 管病症構成的群組中選擇。 適合於使用在本發明的藥學組成物包括了以對達到打 10算之用途而言為充足的一量存在的活性成分的組成物，該 打算之用途舉例來說，P K活性調節或一 p κ相關病症的治療 或預防。 一治療上有效量的決定對那些熟悉此項技術之人士而 言是能力所及的，尤其是根據本文提供的詳細的揭露内 15容。有關本發明用到的任何化合物、該治療上有效量或劑 量最初能從細胞培養測定來估計。因而，該劑量能被配製 為用於動物模型中，使得能達到一包括在細胞培養中測量 的該ICso的循環濃度範圍。這些信息然後被用來在人或伴侶 動物中更準確的決定使用劑量。 20 實際上’被投藥的該化合物的量是體重的約 0.001mg/kg至約l〇〇mg/kg，這種全部劑量一次給完或以分 開的劑量給完。所投藥的一組成物的量當然取決於治療的 目標、折磨的嚴重性、投藥的方式、開藥方的醫生或獸醫 的判斷等等。在局部投藥或選擇性攝取的情形中，該藥ρ 25 1310766 的有效局部濃度可能與血漿濃度無關，及可使用其它在技 術中已知的程序來判斷正確的劑量的量和時間間隔。 本發明的具體例也考慮-治療伴侣動物癌的方法，該 方法包含投藥以-包含化合物I的—個或多個鹽，或本發明 的這些鹽的同素異形體，及-藥學上可接受的載劑或賦形 劑的藥學組成物。

另外地，考慮了化合物等鹽魏些_該等同素 異形體(如本文所描述的）會透過一有機體(諸如—伴估動物 或-人)體内的酵素被代謝，而產生一能調節該蛋白激酶、、舌 10性的代謝物。這些代謝物是在本發明範圍之内。 本發明的化合物可單獨投藥或與本發明其他之—個或 多個化合物組合或與一個或多個其它藥品組合(或它們的 任何的組合)。也考慮到如本文所描述的化合物：的鹽或這些 鹽的同素異形體可與其它用於上面討論的疾病和病症的治 15療的化學治療劑組合。例如，本發明的一化合物可與氣尿 錢單獨組合或還可與菊白葉酸或其它烧化劑組合。本發 明的-化合物可用於與其它抗代謝物化學治療劑（諸如: 不限制在類葉酸或嗓呤類似物）組合。-化合物也可用於與 基於化學治療劑的天然產物、抗生素化學治療劑、酵素化 子療劑 '鉑配位錯合物和激素及激素拮抗劑組合。也考 慮了本發明的-化合物可用於與治療實性癌或白血病的米 托蒽酿或太平洋紫杉醇組合。 处在沒有更詳盡的細節下，據信一熟悉此項技術之人士 I使用㈣的描述實施本發明至它的最大範圍^下面詳細 26 1310766 的具體例描述了如何準備本發明的不同的化合物及/或完 成本發明的各種方法，且只應被解釋為示範性的，及無論 以什麼方式，前述的揭露内容不會形成限制。那些熟悉此 項技術之人士會迅速地考慮到在無論是關於反應物還是關 5 於反應條件和技術的程序中適當的變化。 實施例 實施例1.合成化合物I，也就是5-f5-氟-2-側氣-1,2-二氤 -吲哚-(3Z)-亞基甲基1-2,4-二曱基-1氫-吡咯-3-羧酸(2-吼咯 ’ 啶-1-基乙基)-醯胺 10 如在美國專利6,574,293(實施例129)中描述的，5-氟 -1，3-二氫哚-2-酮與5-曱醯基-2,4-二甲基-1氫^比咯-3-羧 酸(2-吡咯啶-1-基乙基)-醯胺冷凝得到化合物I。 MS +ve APCI 397 [M++ 1] 擴大程序：5-甲醯基-2,4-二曱基-1氫-η比咯-3-羧酸 15 (61g) ' 5-氟-1,3-二氫引0朵-2-i§l(79g)、乙醇(300mL)和吼咯 I °定(32mL)被回流4.5小時。加入乙酸(24mL)至混合物中並回 流持續30分鐘。該混合物被冷卻至室溫並透過真空過濾收 集該等固體，該等固體用乙醇洗滌兩次。該等固體在含有 12N鹽酸（6_5mL)的40%丙酮水溶液中（400mL)攪拌130分 20 鐘。透過真空過濾收集該等固體並用40%丙酮水溶液洗滌 兩次。該等固體在真空下乾燥得到一橙色固體5-[5-氟-2-側 氧-1,2-二氫哚-(3Z)-亞基曱基]-2,4-二甲基-1氫-吼咯-3-羧酸(86g，79%的產率）。W-NMR (二曱亞砜-d6) δ2.48, 2.50 (2xs, 6Η, 2xCH3), 6.80, 6.88, 7_68, 7.72 (4xm, 4Η，芳香的和 27 1310766 乙稀基)，10.88 (s, 1H，CONH)，12.12 (s，1H，COOH), 13.82 • (s，1H，吡咯nh)。MS m/z 299 [M-l]。 5_[5-氟-2-側氧-l，2-二氫-吲哚_(3z)_亞基甲基]_2,4_二 ’ 甲基-1氫-吼咯_3_羧酸（1〇〇g)和二曱基曱醯胺(5〇〇mL)係被 • 攪拌並加入苯并三唑-1-基氧三（二甲基胺基)鱗六氟磷酸鹽 (22lg)、1-(2-胺乙基)吡咯啶(45.6g)和三乙胺(93mL)。該混 s物在周圍溫度下授拌2小時❶透過真空過濾收集該固體並 % 用乙醇洗滌。透過在64。(：下於乙醇中（500mL)攪拌一小時來 水體-洗滌該等固體並冷卻至室溫。透過真空過濾收集該等 固體’用乙醇洗滌，並在真空下乾燥得到5_[5_氟_2側氧_丨,2_ 一氫·叫卜朵-(3Z)-亞基甲基]_2,4_二甲基_1氫_。比咯_3_曱酸 (2-°比哈啶小基乙基)-醯胺（101.5 g, 77%產率）。h-NMR (二 甲亞石風-d6) δ 1.60 (m，4H，2xCH2), 2.40’ 2.44 (2xs, 6H， 2xCH3)，2.50 (m, 4H，2xCH2), 2.57, 3.35 (2xm，4H，2xCH2)， ' 15 7·53, 7·70, 7.73, 7.76 (4xm，4H,芳香的和乙烯基)，10.88 (s， • 1Ή，C〇NH), 13.67 (s，1H,吡咯NH)。MS m/z 396 [M+l]。 合成化合物I的各藉镑 化合物I磷酸鹽 2·67毫莫爾化合物I與40mL 0.092M磷酸(約超過假定一 20 1:1的鹽的一40%莫爾）和40mL異丙醇加入一燒瓶中。然 後’以30mL小劑量持續在該水溶液中加入乙腈，60°C旋蒸 該溶液來除去水。總共用到120mL乙腈來除去該溶液中的 水。過濾該等晶體並風乾。晶體是自由流動的和橙色的； 收集到1.09g並得到一83%的產率。 28 1310766 實施例2B ·化合物I婷橿醅释 2.64毫莫爾化合物^34mL 〇 1M檸檬酸(3 4毫莫爾）和 35mL甲醇加入一燒瓶中。5〇t下旋蒸這個溶液。減少這個 溶液的體積產生結晶度差的晶體，所以加入2〇mL異丙醇和 5 10mL曱基乙基酮來溶解該固體。在60T：下旋蒸這個混合物 並產生橙色晶體。過濾該等晶體並風乾。這個方法的產率 約是60%，透過更進一步在過濾之前減少溶劑體積能改進 這個方法。 實施例3.化合物I的各釋睡的物理性質 10 方法：用來測量化合物I的該等鹽的物理性質的測試包 括溶點測董、HPLC純度、粉末X射線繞射和動態水氣吸著 重量測量法。 粉末X射線繞射：使用一 Scintag X2 Advanced

Diffraction System (lab 259-1088，Scintag DMS/NT l_30a和 15 Microsoft Windows NT 4.0軟體控制）來進行粉末XRD。該系 統使用一銅X射線源（45kV和40mA)來提供1 ·546〇Α的

CuKo^的發射和一固態Peltier冷卻檢波器。使用管發散和 2mm與4mm的抗散射開縫及檢波器抗散射與〇.5mm與 0.2mm寬度的接收缝來控制射束孔徑。使用一〇 〇3。/步驟的 2〇 步驟掃描與一個1秒/步驟的計數時間從2。至35。的2Θ角度收 集數據。該等實驗利用Scintag外圓角、頂端裝料之不錄鋼 樣品支架與9mm直徑插入物。粉末被裝進該支架並透過— 載玻片輕輕地擠壓’來確保在該樣品表面和該支架之間表 面之間的共面性。 29 1310766 動態水氣吸著重量測量法(D M S G):在一溫度控制的大 氣微量天平上收集DMSG等溫線。在該天平的樣品板上放 入約10mg樣品。濕度從室内相對濕度（RH)繼續變化至 0%RH，增加至9〇%RH，然後在3%RH步驟中，RH又減少 5至〇%。然後每兩分鐘測量該質量。當樣品質量的改變在1〇 分鐘内小於0.5g時，使該RH轉換至下一個目標值。使用 Visual Basic program dmsgscn2.exe控制該數據收集和輸出 該信息至一 Excel試算表。 結果：表1指出了化合物I的抗壞血酸鹽、檸檬酸鹽、 10 反-丁浠二酸鹽和鱗酸鹽的數據總結。HPLC分析顯示該等 鹽具有相對高的純度，及經過鹽的形成過程未引起在純度 中的顯著變化。 表1.有關化合物I之合成的籩的總結 相對離子 鹽 經結晶的 熔點(°c) 80%RH時的 水％ HPLC純度* 異構物％* 無（自由驗） NA 257 -1% 97.8 0.63 氫氣化物 是 96 -20% 97.7 2.29 反-丁烯二酸鹽 是 ΝΑ -9% 97.3 1.96 檸檬酸鹽 是 181 -3.8% 98.2 1.38 磷酸鹽 是 288 -1% 抗壞血酸鹽 是 245 -6.5% *HPLC峰下的區域百分比 15 該氫氯化物、反-丁稀二酸鹽和抗壞血酸鹽是非常吸濕 的（見第1圖）。其它兩種鹽（檸檬酸鹽和磷酸鹽）具有較低的 30 1310766 水氣吸著輪廓，在70%相對濕度實吸收小於3%的水。 該粉末X射線圖形指出該磷酸鹽和該檸檬酸鹽具有相 對高的結晶度（見表2和表3 ;及第2圖）。

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表2.化合物I磷酸鹽的PXRD峰 2Θ角1 相對強度2 (角度） (任意的） 11.1 14.0 11.7 60.1 12.1 8.5 13.0 19.4 14.0 29.0 14.5 8.1 15.4 15.6 17.2 20.6 17.8 9.0 18.4 19.7 19.5 27.1 19.8 8.2 20.8 50.5 21.7 8.0 22.0 16.1 22.7 14.8 22.9 8.6 23.2 16.9 23.4 13.9 24.5 45.1 25.9 50.7 27.0 100.0 27.3 12.0 29.2 11.6 31.3 7.7 32 1 : ± 0_1〇 2 :透過歸一化它的強度至它在27.0°角度的最強峰的強度為100來決定每 個峰的相對強度。 1310766

表3.化合物I檸檬酸鹽的PXRD峰 2Θ角1 相對強度2 (角度） (任意的） 3.2 20.4 7.3 17.7 9.2 14.4 9.5 39.1 10.8 9.5 12.7 23.5 13.2 19.6 14.3 23.5 14.8 16.7 15.9 11.3 17.2 8.3 17.8 11.9 18.2 19.8 18.3 19.5 19.6 6.8 20.9 11.1 21.6 8.9 21.7 10.5 21.8 8.9 23.2 13.2 24.2 20.3 24.9 15.9 25.5 100.0 26.4 20.9 26.8 26.5 27.1 10.8 32.0 6.3 34.4 8.1 33 1 ： ±0.1° 2 :透過歸一化它的強度至它在25.5°角度的最強峰的強度為100來決定每 個峰的相對強度。 1310766 實施例4.化合物I磷酸鹽的事借釦牯性鑑定 實施例4Α·化合物I鱗酸鹽的率』備 自由鹼的化合物I被用來製備該磷酸鹽。如上所描述地 製備一化合物I磷酸鹽的樣品（批號35282-CS-51)。4mL的 5 0.977M填酸被加入至在一燒瓶中的i.〇59g自由驗中，接著 馬上加入4mL乙腈。得到一懸浮液。在一熱板上輕微加熱 該懸浮液。當攪拌約一小時並未完全溶解該固體時加入 40mL水並加熱。過濾該固體並用i〇mL乙腈洗滌。pXRD顯 示這是化合物I磷酸鹽。 10 實施例4B.化合物I碟酸鹽的牿枓德定

Lot 35282-CS-51被命名為化合物I磷酸鹽的同素異形 體型態I。它具有高的結晶度、好的流動性和大的晶體大 小。在化合物I自由鹼（自由鹼同素異形體型態A，256。(：； 自由驗同素異形體裂癌B ’ 259 C)的熔融溫度時溶融結果的 15不存在和該等固體的高熔點(281°C-297°C)的存在顯示，批 35282-CS-51的晶體是一不同的鹽型態且不是自由鹼化合 物I。透過HPLC測試’該批的純度是99.6%。 實施例4C.化合物酶藥洛解度的估真 化合物I磷酸鹽（批35282-CS-51)的樣品lmg-2mg被轉 20移至10mL的玻璃小瓶（量皮重（tared))並稱重（準確至 0 _ 1 mg)。以一逐步方式加入溶劑至該專小瓶（一溶劑加入每 一小瓶），及每一步中加入0.5mL溶劑。使用的溶劑是緩衝 液(pH=2)、緩衝液(PH=4)、水、甲醇、四氫呋喃（THF)、乙 腈和丙酮。每一個溶劑加入後，把該小瓶蓋帽並搖動。固 34 1310766 體的溶解可視覺觀察到。如果沒有觀察到明顯的溶解，立 即加入更多的溶劑。如果溶解很明顯，在溶劑的下—次加 入之前’放置該小瓶在檯上至少30分鐘。這個步驟重複進 行直到對著—黑色背景和一白色背景沒有晶體可見為止。 5該溶解度然後等於該化合物的重量除以最後的體積和最後 一次加入前的體積。如果在加入10mL溶劑後—固體仍存 在’該溶解度被表達為小於該重量除以最後的體積。如果 在第一次加入溶劑後該固體完全溶解，該溶解度被表達為 大於該重量除以溶劑體積。所有實驗都在室溫下操作。 10 化合物I磷酸鹽被估算的溶解度連同自由鹼的溶解度 被呈現在表4 ’以mg/mL表示。除了在水中（在不同的pH位 准），在相同溶劑中化合物I磷酸鹽的溶解度低於化合物工自 由鹼的溶解度。化合物I磷酸鹽的溶解度取決於一溶液的pH 值，及在pH是2或更低時溶解度變得相當高（3mg/mL)。化 15 合物I磷酸鹽（批35282-CS-51)的熔點約是300°C，它實質地 高於自由鹼的化合物I的熔點（自由鹼同素異形體型態A， 256°C ;自由鹼同素異形體型態B，260°C)。一重要的結果 是化合物I磷酸鹽與水的可濕性比自由鹼的化合物I更好。 35 1310766 由鹼和化合物I磷酸鹽 表4. 23°C時不同溶劑中的化合物工自 被估算的溶解度 溶劑 化二自由鹼的溶解度 (同素異形體型態A) (mg/mL) 化合物I麟酸鹽巧 溶解皮(mg/mL)d 1 緩衝液(pH=2)a 3.11 5.9-7.4 2 緩衝液(pH=5)b 0.005 3 水 NAC 〜0.29e (一些顆粒黏在小瓶壁上 及沒有溶解） 〜0.14 4 甲醇 —--.__ 0.21-0.31 5 THF 0.32-0.4 «<0.19 6 乙腈 «0.08 «<〇 13 7 丙酮 -------- «0.16 «<0.2 pH=2的缓衝液由HC1和KC1構成 PH=5的緩衝液由鄰苯二曱酸鉀和氫氧化 無法得_，被預期是<0.005mg/mI^ lg化合物I填酸鹽相當於0.802g化合物〗自由鹼 最後溶液的pH值是4.91

實施例5_彳^物I磷酸鹽同杳里拟辦的年十 10 在具體例4C中可見的化合物I磷酸鹽的低溶解度指出 經高濃縮的（60_100mg/mL，深撥紅色）化合物】碟酸鹽溶液 會受益於從不同的溶劑中沉澱化合物I磷酸鹽的同素異形 體。透過在約1M磷酸中溶解自由鹼的化合物〗來製備這樣的 經浪縮溶液。例如，約70mg自由驗的化合物1能溶解在㈣ 15的1M碟醆中。可是，使用的自由驗的化合物I和碟酸的量取 決於該溶夜所欲的濃度和批式產能。在該實施例中其中 在讀之後立即真空過遽該沉殿物，約lmL的該所欲溶液 …後被滴八十種約1〇mL2反溶劑來沉澱出該等鹽的晶 36 1310766 體。這些溶劑是水加上乙腈(ACN)、乙醇、甲醇、丙酮、乙 腈、THF、乙酸乙酯、二氯甲烷(CH2C12)和異丙醇(IPA)。在 該實施例中，其中在靜置整夜或三天后真空過濾該沉澱 物，使用甲基乙基酮(MEK)和二噁烷額外的溶劑。一些有 5 機溶劑，舉例來說，乙酸乙酯、己烷、CH2C12是不易與水 混合的並且溶劑的兩層是能觀察到的。在加入之後在界面 僅僅幾分鐘内只有少量的沉澱物可見。在那些情況下，加 入約1 mL甲醇作為一橋連溶劑，來增加在兩層之間的混合 性。為增加該混合性，甲醇看起來作用很好，因為隨著曱 10 醇的加入無色的有機層開始變黃。然後用手用力振盪該小 瓶約一分鐘。為分離介穩和穩定的同素異形體，在沉澱(20 分鐘之内）之後和靜置整夜或三天之後立即真空過濾該等 從有機溶劑中沉澱的固體。然後分析該粉末。為了探索不 同的固體被編號。 15 實施例6.化合物I磷酸鹽同素異形體的特性鑑定 實施例6A.特性鑑定方法 如上面的實施例3中所描述的，所有由上面的同素異形 體篩選步驟得到的粉末是以PXRD來分析。當觀察到一新的 PXRD圖形時，使用補充技術來表現該等固體的特徵，包括 20 動態水氣吸著重量測量法(也在實施例3中描述）、微差掃描 熱量法、熱解重量分析（當需要時)和光學顯微術。 微差掃描熱量法（DSC):使用一 DSC量熱器（TA Instruments 2920)得到DSC數據。在一I呂DSC盤内裝入粉末 (l-5mg)。一鋁蓋被放在該盤上並被捲曲。該被捲曲的盤被 37 1310766 連同一作為一參考的空盤被放在樣品管内。除非另外指 明，溫度以10°C/min的速度從30°C增加至300°C或350°C。 熱重量分析（TGA):使用一高解析度分析儀（TA Instruments 型 2950)操作 TGA 實驗。NT(版本 1.3L)的 TA 5 Instruments Thermal Solutions™用於數據收集，及NT(版本 2.4F)的Universal Analysis™用於數據分析。樣品（5-l〇mg) 被放在一鋁盤上，在被加熱之前，它還被放在一鉑稱重盤 上。在負載該等樣品之前，稱量鋁盤和鉑盤的重量的皮重。 溫度以10°C/min的速度線性地從30°C增加至300°C。使用乾 10 燥氮氣沖洗。 偏光顯微術：在一Olympus BHSP偏光顯微鏡上操作顯 微術。粉末被懸浮在聚矽氧油中並在一顯微鏡載玻片和一 蓋玻片之間分散。在觀察之前，輕輕地對著該載玻片摩擦 該蓋玻片，而使該等粒子有好的分散。 15 實施例6B.沉澱之後立即的牿神锶宗 該等結果在表5中總結。酸性溶液與該等反溶劑—混 合’沉澱就發生。首先，該等沉澱物是鬆的絮凝物。通常 該等顏色是黃色或淡橙色。該得到的固體是黏性的。這些 固體的顯微觀察指出它們是由在偏光下具好的雙折射率的 2〇 非常小的晶體構成。在由九個溶劑系統得到的固體上，至 少觀察到六個不同的PXRD圖形（見第3圖）。在這個分子上 該醯胺側鏈是可彎曲的，並在自由鹼的型態B和它的氫氣化 物鹽形式中採取不同構形。因此，該分子在不同的固體型 態中可能是構型同素異形體。從乙酸乙酯、己烷和IPA中沉 38 1310766 澱的固體的PXRD圖形看來是相同的。可是，因為來自這三 種溶劑的固體的低的繞射信號，一與其它P X R D圖形詳細的 比較是很難的。因此，它們並未指定為一新的型態。來自 甲醇的沉澱物與參考批35282-CS-51(被指定為型態I)相 5 同。所有沉澱物的TGA數據指出在一 1.7%-4.7%位准的剩餘 溶劑。這些固體中，來自CH2C12的那一個看來是在晶體中 一具保留溶劑的固體。該TGA曲線指出在一約125°C的溫 度，一樣品重量的一急劇減少（見第4圖）。透過DSC在約相 同溫度下這個結果被記錄為一吸熱。此外，這個粉末由具 10 定義明確的形態的晶體構成並能自由流動，來自其它批的 沉澱物有一非常不同的性質。透過PXRD該粉末顯示出中等 結晶性，但是當通過偏光顯微鏡觀察顯示好的結晶度。其 它批是由非常細的晶體構成。在這些粉末的DSC曲線上， 一旦該樣品被負載在試樣管，立即可見一寬的和淺的吸 15 熱。透過TGA這個觀察被反映為一從TGA加熱開始的逐步 失重。因此，關於這些批，剩餘溶劑可能是被表面吸附的 溶劑，而不是在晶格中的溶劑。 39 1310766

V錄趄弈韧者溶猫囫銮#φ?Νίι TT^W ls?^*s^ /*«· c-· αίζ II 匕 >- N(黏的） Ν(黏的） N(黏的） 丨N(黏的） 1 N(黏的） Ν(黏的） 1 N(黏的） 該固體 顏色 橙色 黃色 橙紅色 黃色1 黃色 黃色 1淡橙色 1淡橙色 撥紅色 1 黃色 5? 00 ^ Q祕 Ον (N 81c, 226, 293 00 On CS 88c，155,222，! 228, 286 J 97c，142, 156， 1 172, 227, 230, 281 1 82c，161，175, 227, 292 CN fN όλ σν »· 00 σ·\ 123d,164,228 296 OS CN (N 04 <s <S <N 卜 TGA wt% ! 損失a 〇 oi 卜 »—t U-i CN ON rsi ν-> fS 卜 — ΓΛ rn C) 顯微觀察 不規則 聚集趙e 不規則 | 聚集體e i- 聚集體e 聚集體C 細的粒子 聚集體e 片狀+等徑+細的 1 _ _ 聚集體e PXRD結晶度 1 ¥ί w： -S- 有機溶劑 ! 水 + ACN ! 乙醇 丙酮 乙腈(ACN) THF 乙酸乙酯 己烧 CH2C12 PXRD圖形 指定名稱 型態I 型態II 型態I 型態ΠΙ | 型態IV 型態V 1 2 型態VIg 2 。一#娀忘装0枇伞|呶1>锇劄S 。蓬逛味»qi-fs J'itfji® cmxds .1 iS s.^^-^^ii^^^^^s^sx'aadsti^^-tB^l^w^^t.^slfs^is^aN., 。噠«屮4 s 4鉍*-©鹅蛛»她紱。 。^蘅效-45«龚^1#妫1«副钝屮祕 1ί 戚«劄璨*??。¥樊*|»|¥«紫« 丨妨拽奢«sliT^嫦ii^^^VDXlfIsf'tli 學^。靶拽哿钃忘^^癍^®^兹嬰丨Tusa^p 。^<琛忘«娀宕荃彰 « < 絮妹»^_ ¥i#s斟淼#?? "'w^^^iwTVol's-^^wtlE^tfettsirt^iss'tlE^^l-s^^^ss^wusa--^:, ¥¥«ρ09Ιί-ίϊ· » 40 1310766 表6化合物I磷睃鹽的 2Θ角1 相對強度β (角度） (任意的） 11.1 23.5 11.5 24.0 11.6 19.9 12.0 8.9 13.0 22.0 14.0 25.9 14.5 7.0 15.4 15.0 16.5 7.5 17.2 27.7 17.8 9.5 18.3 16.6 19.4 11.6 19.6 11.2 19.8 9.8 20.8 58.2 21.6 11.8 22.0 9.5 22.7 9.2 22.9 12.4 23.2 12.8 23.4 10.3 24.4 48.8 25.8 30.4 27.0 100.0 29.2 7.4 29.2 7.4 33.5 5.1

41 1 ： ±〇.Γ :透過歸一化它的強度至它在27.0°的角度的最強峰為100來決定每個峰 的相對強度。 1310766 實施Jj^c·在溶_劑中靜晋t夭后的沉澱物 這些結果被總結在表7中。在該溶劑中一靜置時間直到 二天之後’出現一新的非絨毛狀的橙紅色固相。除了從曱 醇得到的沉澱物，該等絨毛狀沉澱物可從所有有機溶劑中 5得到，歷經轉化下。顯然地，在沉澱之後立即就沉澱的該 等固體在這些情況下是介穩的’因為隨著時間的流逝它們 轉化為一更穩定的固體型態（型態I)。在大多數溶劑系統中 幾個小時内這個轉化看起來被完成。可是，為了保證該方 法的完成允許它們靜置一更長的時間週期，是為了避免得 10到一兩種固體型態的混合物。該TGA曲線指出分別從乙烷 和乙腈中得到的該等固體，在約124°C和153°C處出現突然 的失重，結合以一在DSC上類似的溫度的一吸熱。因此， 它們看起來在晶格中含有有限的溶劑。該被殘留的溶劍的 化學計量就乙腈而言是約0.6，及就己烧而言是約〇·μ。在 15靜置三天后從乙腈中生長出針狀晶體。該殘留有乙腈的固 體的PXRD圖形是獨特的，而由較早確定的己烷溶劑化物的 PXRD圖形類似於殘留有CHfU的固體（第3圖）。兩個殘留 有溶劑之固體（己烷和乙腈）在一TGA盤上失重。在相應的被 殘留的溶劑透過加熱被除去（表8，第3圖）後，觀察到兩個固 20體獨特的pxRD圖形，指出從該等固體中除去溶劑分子引起 該等溶劑化物晶體的結構變化（因此，在晶格中的該等溶劑 分子不僅僅是在晶體表面）。可是，乙腈去溶劑化物的PXRD 圖形在信號強度上是低的。當與該乙腈溶劑化物的DSC輪 廓相比，乙腈去溶劑化物的DSC輪廓顯示出在了 74°C和 42 1310766 174°C兩個額外的熱現象，而在153°C之去溶劑化現象是未 顯現的。在去溶劑化之後該樣品的冷卻可能已改變在174°C 經歷一能量變化的固體。 當使用其它有機溶劑，該等沉澱物的較長的靜置週期 5 產生和型態1(批35282-CS-51)相同PXRD圖形的固體，儘管 該等晶體的形態學是不同的（表7)。該相同PXRD圖形指出 這些固體具有相同的晶格結構。不同的形態學必定是由於 溶劑的影響。很明顯在這裏報導的所有非溶劑化同素異形 體中，型態I是最穩定的固相。其它不含溶劑的固體型態是 10 介穩的，並且當與溶劑接觸時迅速轉變為型態I。從CH2C12 得到的固體看起來比從己烷得到的更容易流動。該TGA、 形態學和流動性指出它們是不同的固體。 43 1310766

wSFsi弈»}#««画 s i_i^#^r^> 琛 tieN粂»<妨'# W 痍民.9_ ^ Κ〇 C*·· 游1丨 -ffi u m II >- 2 >- >- 2 >- 2 % 該固體 顏色 橙色 橙紅色 橙紅色 橙紅色 1- 橙紅色 橙紅色 橙紅色d 橙紅色e 淡橙色f 橙紅色 燈色 撥色 uP 鳍铌 mi 〇\ (N 124c, 228, 295 £； ΓΊ m 〇\ (N 153c, 229, 231, 239, 291 *Τ) 〇\ <Ν 卜 On Γ>) to Q\ (N wt%損失a 1 ΓΛ d 寸 CS 〇 Ό 〇 Ο) m d ο 顯微觀察 不規則 1 板狀 等徑(25/im)+細的 等徑(25μπι)+細的 聚集體e 板狀 針狀 矛頭狀 棒狀 板狀 PXRD結晶度 W 夺 Ψ§Γ 有機溶劑 (靜置週期） 水+ ACN 乙酸乙酯 (整夜） rOSH 'w/ IPA (整夜） | ch2ci2 (整夜） 乙醇 (3天） 乙腈 (3天） THF (3天） (IS) ΜΕΚ (整夜） 二噁烷 (整夜） 凾宕 i)D Oh ^ 型態I 型態I 1型態VIIs 1 I 魏I 型態I I型態I 型態I 型態VIIIg 型態I 型態I 型態I 型態I 二<ώ逛趑瓦·？_每)蹯5:±粼*<2<6)賤想。如祝^糞杧贫十S^J {。<834靼 f-i<dMK¾) s^w^q'T-ftsrie-i·S 咩 p 。¥«!*«*;钬丨 >tt!i拽#««!?卑喵嫦泼^禁^<01窜裙鉍ΙΕρϊί。却拽#««蜣^端彰忘凼&耍！-10&001^0 _拽#-«呶埤準妨賴«-9-<蛘f-KN-荃余；i礎<, «^spoglf-ff „ 44 1310766 表7.在去溶劑化後產生的固體的物理特性鑑定 PXRD圖形中 被指定的名稱 晶體產生方法 PXRD 結晶度 依據DSC的 熱現象ref 該固體顏色 型態IX ACN溶劑化物的 去溶劑化 差 74,174,229 231,239,291 橙色 型態X 己院溶劑化物的 去溶劑化 中 橙色 實施例7·在犬肥胖細胞瘤中KIT磷酸化的抑乍q 目的：對於癌的粗治療發展提供了直接評價藥品在該 5 分子乾上之效應，及找出該等效應與腫瘤生物學和藥品藥 物動力學之關聯的機會。這可能在腫瘤學藥品發展上是有 幫助的，因為它建立了一個藥力學/藥物動力學關係及提供 了關於一把劑的治療作用的關鍵信息。本研究的目的是評 價犬肥胖細胞瘤中受體酪胺酸激酶抑制劑化合物I磷酸鹽 10 的一單劑量在它的分子乾KIT活性上的影響，在具高級的 M C Ts的犬患者中使用ΚΙ T磷酸化作為一直接靶抑制作用的 標記。也研究了 ERKl/2( — KIT信號的有絲分裂原活化蛋白 激酶(MAPK)的下游）的磷酸化、化合物I磷酸鹽血漿濃度、 及c-kit的突變情況，以測量在化合物1磷酸鹽治療後，這些 15 參數與KIT磷酸化情況是如何相關的。 研究藥品：利用以20_1118刻痕藥片形式的化合物I磷酸 鹽。 研究設計：這個研究是一在具循環或轉移級別II/III MCTs的狗中把調節的試驗。患者接受一 3.25mg/kg的化合 20 物I磷酸鹽單一口服劑量。使用一6-mm的鑽取活組織儀器， 在化合物I鱗酸鹽給入之前和治療後8小時從腫瘤中得到樣 45 1310766 品。當可能時’獲取多個活組織。每一個樣品在分析前液 氮中冷凍並在-70°c存儲。供化合物I磷酸鹽的血漿位准分析 的血液樣品在得到腫瘤活組織的同時得到（見下面）。 化合物I磷酸鹽的血漿位準：血液樣品從頸靜脈抽取並 5放在一紅蓋血清收集真空玻璃管中。在室溫下保存樣品， 允許凝結，在4C以1500rmp離心10分鐘，轉移至冷凍管， 及血漿在-70°C進行的分析中被冷凍。簡要地，在犬血漿中 血聚樣品(20μ1)或化合物〗鱗酸鹽標準品與含有DL_鹽酸普 荼洛爾（内標準）的甲醇（2〇〇μ1)混合於一 96-孔聚丙烯板上 10 (0rochem Technology，Wesrmont, IL)。透過渦流該板被混合 1分鐘’及這些樣品以4〇〇〇rmp離心10分鐘。1〇微升該上層 液被注射入該LC/MS/MS系統中，其中在一 BataBasic (ϋ-18(5μηι，100x4.6mm)反相南效液相色譜柱（Keystone Scientific，Foster City, CA)發生分離。在每一個犬血漿樣品 15中化合物I鱗酸鹽的量和該内標準是基於使用從0.2ng/ml至 500ng/ml的已知化合物的量產生的標準曲線來確定數量。 c-kit調節分析：對於大多數樣品，根據製造商的說明 書使用 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA)來萃取RNA。使用 dNTPs、隨意的弓| 體、5X First Strand Buffer、0_1M DTT及 20 Superscript Taq聚合物酶（全部來自 Promega, Madison, WI) 然後從該RNA中產生cDNA。確定每一個樣品的cDNA數 量。有關剩餘的樣品，染色體組DNA是如前面所描述的來 製備（Downing, S., Chien, Μ· B·，Kass，P. H” Moore, P· F·， and London, C. A. Prevalence and importance of internal 46 1310766 tandem duplications in exons 11 and 12 of c-kit in mast cell tumors of dogs. Am. J. Vet. Res·，63: 1718-1723, 2002 ;以全 文的方式在此併入本案以為參考資料）。有關兩個反應，該 PCR運轉由94°C(1分鐘）、59°C(1分鐘)和72°C(1分鐘)構成的 5 40個週期，及在該反應的結束有5分鐘72°C的延伸。從犬C2 肥胖細胞系中產生的一 〇kit和從正常犬小腦中產生的 cDNA被用來作為對照組。 透過在一 4%洋菜糖膠體上的電泳來分離該pCR產物； 就來自cDNA的PCR，該期望的野生型c_kit PCR產物的大小 10是196bp，及染色體組DNAPCR的大小是190bp。有關那些 其中ITD不明顯的情況（只出現一單一帶），在University of California-Davis的核心排序設備上，該pcr產物是使用 Promega PCR Wizard Clean-up kit (Promega)純化的膠體，並 使用P1(向前)和P5或P2(相反）引體來排序，為排除非常小的 15 ITDs的存在、脫失或點突變。使用DNASIS序列分析程序操 作來進行序列校正和比較。 KIT和ERK攝酸化分析：使用一液氮冷卻cyromortar和 研蛛，腫瘤活組織在液氮中冷凍並接著被研成粉末，然後 在-70t：下保存直至使用。對於KIT的分析，來自lmg的起始 20 腫瘤溶解產物的經研成粉末的腫瘤是經均質化、經溶解的 及經免疫沉澱反應的，如前面所描述(Abrams，T.J.，Lee, L. B., Murray, L. J., Pryer, N. K., Cherrington, J. M. SU11248 inhibits KIT and platelet-derived growth factor receptor beta in preclinical models of human small cell lung cancer. Mol. 47 1310766

Cancer Ther_ 2: 471 -478, 2003;以全文的方式在此併入本案 以為參考資料）使用一對KIT的洋菜糖共軛的抗體 (SC-1493AC; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。當 利用多個活組織，重複的免疫沉澱反應/Western雜合分析在 5 分開的活組織上操作。每一個樣品中經磷酸化的KIT的量透 過Western雜合測定，使用一對鼠KIT磷酸化酪胺酸719的抗 體（3391; Cell Signaling Technology，Beverly, MA)，它相對 應於犬KIT酪胺酸721並且是一個自身磷酸化部位，並因此 作為一KIT激酶活性的代用品。有關全部KIT分析，該等點 10 與一對KIT (A-4542; DAKO Corp·，Carpinteria，CA)的抗體 被剝去、重組塊並重複雜交。有關p42/44 ERK的分析，透 過Western雜合探查用於KIT分析的相同的腫瘤溶解產物與 一對磷化-Thr 202/Tyr 204 ERK1/2 (9101B; Cell Signaling Technology)的抗體，及然後用一對全部ERK的抗體(9102; 15 Cel1 signaling Technology)來剝去並重複雜交。有關KIT和 ERK1/2之可評估的腫瘤活組織對被認為是那些其中可查明 的全部蛋白質出現在該對的兩個活.組織中。透過三個觀察 者的眼睛評價靶調節，而不考慮該JM情況和血漿濃度。治 療後與治療前的活組織相比，在活組織樣品中的碟化_蛋白 20質信號相對於全部蛋白質信號之^50%的減低，被評價為陽 性（關於靶調節）’而一<50%的減低被評價為陰性。 結果：十四隻狗參加這個臨床研究，及主要的目的是 測量是否在口服投藥一單一劑量的化合物〗鱗酸鹽後，發生 在KIT酷胺酸構酸化中的一減低。使用一碟化_特異抗體直 48 1310766

接對著一KIT中的自身磷酸化部位來評估ΚΙΤ酪胺酸磷酸 化，作為一KIT激酶活性的代用品。此外，從基線腫瘤活、組 織測量c-kit JM突變情況(ITD+4ITD_)，及在給定相關的這 些參數與KIT磷酸化抑制作用的劑量後，測量化合物丨磷酸 鹽的血漿濃度8小時。14隻狗中的11隻可供KIT靶調節評 估。被認為不可評估的三隻狗在一個或兩個活組織中，具 有不可察覺的或非常減低的全部KIT蛋白質，及不能用於粑 調節評估。所有參與研究的狗的數據總結在表8。 表8.所有參與的患者的總結數據

患者 編號 腫瘤惡 性程度 是否存在 c-kitITD 突變 血漿化合物I 磷酸鹽劑量後 (ng/mL) P-KIT減低 劑量後a P-ERK1/2 減低劑量後 1 III 是 81.0 是 否 2 III 是 33.2 是 否一__ 3 II 是 83.5 NE 是 4 III 是 98.0 是 是 5 III 是 116.0 是 是 6 III 否 121.0 是 是 7 III 否 186.0 NE NE 8 ΙΠ 否 0.3 是 否 9 II 否 103.0 NE NE 10 II 否 111.0 否 是 11 II 否 158.0 否 是 12 II 否 65.3 是 是 13 II 否 95.4 否 否 14 III 否 119.0 是 NE 10 a NE、無法評估、P-KIT、磷化-Tyr721 KIT、P-ERK1/2、磷化-Thr202/Tyr204 ERK1/2。 49 1310766 經分析的14隻狗中，透過一 PCR分析（第5圖，帶15) 5隻(36%)具有一ITD ;全部五個腫瘤具有—ITD證據。有趣 地是，患者2明顯失去該野生型c_kit交替基因。來自剩餘的 九隻狗的PCR產物不具有一ITD證據（第5圖，帶614)，pcR 5產物被直接排序，及沒有顯示任何種類的突變（附著、脫失 或點突變）。關於帶3、6、8和9，為得到該pcr反應，使用 染色體組DNA，結果得到一稍微較小（190bp)的野生型產產 物。 在基線處的在MCTs中表達的全部及經碟酸化kit的位 10准在各動物之間變化。較高的KIT表達與較高的腫瘤惡性程 度相關聯。與六個惡性程度II腫瘤中的一個相比較，八個惡 性程度III腫瘤中的四個具有高KIT表達（第6圖）。例如，在 患者2(惡性程度III)腫瘤中的全部KIT表達明顯高於患者 11(惡性程度II)腫瘤中的全部KIT表達。具惡性程度ΙΠ的腫 15瘤的狗也具有比那些具惡性程度π腫瘤的狗一在基線處經 磷酸化KIT高位准的較高發生率，與在晚期腫瘤中從中增加 的c-kit突變頻率相連貫並因此提高了配位基無關的經磷酸 化KIT的位准。在基線處’可評估的七隻具惡性程度in腫瘤 的狗中的五隻具有高位准的經填酸化KIT ;在c-kit中關於一 2〇 ITD的存在，這些中的四隻是陽性。只有一惡性程度π腫瘤 具有顯著的經磷酸化KIT ;這種動物也表達了 ITD經突變的 c-kit。 當與治療前的樣品相比，在化合物酸鹽治療後，使 用在經磷酸化KIT中一 >50%的減低相對於在活組織樣品中 50 1310766 全部KIT的標準十一隻可評估的狗中的八隻在靶調節上被 評估為陽性。用化合物I磷酸鹽治療之前和之後的在免疫沉 殿反應中經磷酸化KIT和全部KIT的例子被顯示於第6圖 中。五個腫瘤（第6圖，左)在靶調節中被評估為陽性，然而 5兩個腫瘤（第6圖，右)被評估為陰性。在化合物I鱗酸鹽治療 後，對於KIT磷酸化的抑制作用，被評估為陰性的活組織全 部比那些被評估為陽性的具有在基線處顯著地較少的經磷 酸化KIT(第6圖）。 為了評估在下游信號通路上透過KIT磷酸化控制的化 10合物I磷酸鹽抑制作用的影響，透過用於KIT分析的相同活 組織對的Western雜合分析評估該經碟酸化ΜΑΡΚ ERK1 /2 的位准。十四個腫瘤中的十一個被評估為磷化_ERKi/2靶調 節（這些中的兩個就KIT乾調節也是無法評估的）。在十一個 可評估的中，與基線腫瘤樣品相比，在化合物I攝酸鹽投藥 15 之後，7個指出一在填化-ERK1/2比上在臌瘤樣品中全部 ERK1/2的比率的減低（見第6圖）。在MCTs中更經常檢測到 ERK靶調節’及比那些具低的REK相對高的基線ERK表達 和磷酸化。 基於在齧齒類模型中的臨床前工作，有關靶抑制作用 2〇 的化合物I治療範圍，一24小時給藥週期的12小時中，被認 為是50-100ng/mL。在一3_25mg/kg的單一劑量之後，化合 物I磷酸鹽的血漿濃度在8小時（大約是峰濃度）是從33.2至 186ng/mL，及平均值為105 ± 9 ng/mL的（表8)。在一動物 中，化合物I磷酸鹽的血漿濃度在其它樣品之外的範圍（0.3 51 1310766 ng/mL)。十四隻狗中的十二隻具有的血聚位准被認為是由 化合物I臨床研究I期中建立的治療範圍（London, C. A., Hannah, A. L., Zadovoskaya, R., Chien Μ. B., Kollias-Baker, C., Rosenberg, M., Downing, S., Post, G., Boucher, J., 5 Shenoy, N., Mendel, D. B., and Cherrington, J. M. Phase I dose-escalating study of SU11654, a small molecule receptor tyrosine kinase inhibitor, in dogs with spontaneous malignancies. Clin· Cancer Res·，2755-2768, 2003)。具KIT 乾調節（79.2 ± 41 ng/ml)證據的狗的平均血漿濃度和那些沒 10 有被評估為KIT把調節（137 土 36 ng/ml)的，是相當地不同的 (Ρ = 0·08)。 討論：透過研究化合物I磷酸鹽一單一臨床有效劑量在 犬MCTs中KIT磷酸化中的影響’這個相關研究被設計為調 查在一對比族群中的輕調節，及接下來的經由MAPKs在信 15 號上影響。在這個研究中達到的化合物I磷酸鹽的血漿濃度 被測量是接近所期望的峰濃度（基於臨床前藥物動力學研 究)和與在臨床研究I期測量的藥品位准一致，該臨床研究調 查了化合物I有效劑量和化合物I的攝生（表8)。 十一隻（73%)可評估MCT活組織對中的八隻具有可察 20覺的活化抑制作用，這是藉由在一單一口服劑量的化合 物I磷酸鹽之後，透過在經磷酸化ΚΙΤ中的一減低來測量。 在治療之後，沒有可察覺的KIT靶調節的三個患者具有在基 線處顯示處低位准的KIT和磷化_Kn^MCTs。在這些患者 中缺乏相當的靶調節可能是歸於在探測方法中的技術限 52 1310766 制；為得到經磷酸化KIT的磷化-特異性抗體的敏感性相對 於非經磷酸化KIT可在樣品中不充足及低的基線KIT表 達。KIT活性的抑制作用與低的基線KIT表達比與c-kit ITD 基因型更接近。基於細胞測定，它會預測野生型和ITD突變 5 KIT會透過體内化合物I磷酸鹽被抑制，因為在體外化合物I 阻斷了野生型和ITD突變KIT的磷酸化及可比較的能力。 化合物I磷酸鹽也影響一KIT的信號通路下游。已被報 導的是，在GIST中c-kit中的突變和造血惡性腫瘤從相互和 從野生型KIT來活化不同信號通路。在犬MCTs中，除一腫 10瘤樣品外的所有在基線處具有可察覺的經磷酸化ERK1/2。 在十一個可評估的腫瘤活組織對中的七個中，ERK1/2被抑 制，是在治療之後透過在經磷酸化ERK1/2中的一減低來測 量的。對於ERK1/2抑制作用不是所有的腫瘤評估是陽性 的’也對KIT填酸化是陽性的。ERK1/2乾調節與腫瘤惡性 15程度或c_kitITD突變的存在或缺少不相關。就KIT靶調節來 說’在基線處表達高ERK1/2和經磷酸化ERK1/2的位准的腫 瘤中，可察覺到更頻繁的ERK1/2靶調節。 在MCTs治療之後化合物I構酸鹽的一個分子把抑制作 用的察覺作為在這個設定中對化合磷酸鹽的靶調節的 20試驗。這個發現的臨床相關研究透過在分子靶的抑制作用 和治療範圍中企漿藥品濃度之間來支持，及對在具在靶基 因中MCTs表達活化突變的犬患者中化合物工的卩前被報導 的臨床客觀反應，提供在這種患者族群中化合物城酸鹽的 概念試驗。因為具其它驗_(包魏癌、独,織肉瘤和 53 1310766 多發性骨«)的狗也在用化合物〗的治療上經歷持久客觀 反應’在這個血漿濃度的KIT抑制作用可合理地外推至透過 每些腫瘤表達的結果圓滿的其它接近關於化合物I的受體 赂胺酸激酶乾，基於在體外和體内化合物〗的能力，提供在 5那些腫瘤中的客觀反應的一分子原理。例如，犬乳腫瘤表 達VEGFR，在體外測定對細胞内KIT可比較的濃度中它可 被吲哚酮酪胺酸激酶抑制劑抑制(Lia〇, Α. T.，Chien, Μ. Β，

Shenoy, Ν., Mendel, D. B., McMahon, G, Cherrington, J. M., and London, C. A. Inhibition of constitutively active forms 10 of mutant kit by multitargeted indolinone tyrosine kinase inhibitors. Blood, 100: 585—593，2002)。在MCTs中野生型和 ITD突變c-kit的化合物I鱗酸鹽抑制作用都能因此作為用於 化合物I磷酸鹽的相關RTK靶、VEGFR和PDGFR(是隨著多 種不同的腫瘤類型而被異常地表達及/或調節的）的抑制作 15用的代用品。最後，在犬腫瘤中與臨床客觀反應結合的分 子靶抑制作用指引了在人類癌中相關化合物朝向表達活化 的KIT、VEGFR和PDGFR的臨床族群的發展。 f施例8.在具週期性的肥胖細胞瘤的狗的治療中口服彳卜,合 酸鹽的多中心、安慰劑對照、嫜盲、隨機研究 2〇 目的：為治療委託人所有的動物的肥胖腫瘤細胞，這 些動物具有週期性的可測量的疾病，在一遮罩的、負的對 照研究中評估化合物I磷酸鹽口服片的有效性。該研究使用 經修改的（RECIST)反應標準評估每隔一天以3 Jmg自由鹼 的當量(FBE)/kg體重的化合物I磷酸鹽劑量在疾病反應。在 54 1310766 這個研究中肥胖細胞瘤中c-kit突變的存在或缺少被評估為 一互變量。為決策目的，該研究持續6周。 一百五十三（153)隻狗被隨機以一4:3的比率分成兩個 治療組：T01(安慰劑，其中n=650〇T〇2(化合物j磷酸鹽，其 5中n=88)。選擇十個在美國的獸醫腫瘤學慣例並登記情況。 在登記上，狗必須具有週期性的肥胖細胞瘤（至少一把損害 必須具有一最小長20mm的直徑)士區域淋巴結轉移。三個靶 損害的一個最大的（可測量肥胖細胞瘤）及所有非靶損害（所 有剩餘的損害，可測量或不可測量)在基線處透過兩個求值 10器被確定。功效是基於在第6周回訪的客觀反應（完全緩解 或4为緩解）’其中纪損害的最長直徑的兩個求值器總和的 平均值(Mean Sum LD)與為得到百分比增加或減少的計算 的Baseline Mean Sum LD相比較。非靶損害的估計是主觀 的。一完全緩解(CR)被定義為所有靶和非靶損害的消失及 15沒有新損害的出現；一部分緩解(PR)被定義為與Baseline Mean Sum LD和非靶損害的無進展組相比在靶損害的 Sum LD至少一30%的減少，及沒有新損害出現。在隨機化 之前，收集來自腫瘤和遠處正常皮膚的組織樣品並提交 c-kit突變情況的評估。 20 八十六（86)隻的T〇2和65只的T01動物被包括在該功效 分析中。該數據分析指出，與安慰劑(τ〇1)相比在化合物工 磷酸鹽（Τ01)主要的端點（客觀反應）中一統計地重要的改 進。與Τ01動物相比（7·9% ; 5/63)(ρ<〇 〇〇1)，τ〇2動物具有 一相當大的有效率（38.3%; 33/86)。與Τ02動物相比（33·7% ; 55 1310766 29/86)相比，接近二倍T01動物(66.7% ; 42/63)經歷進展。 與那些對於c-kit突變是陰性的相比（分別是6〇%，i2/2〇 vs. 32·8%，21/64) ’對於該c-kit突變在T02組中是正的狗幾乎可 能是具有一客觀反應的二倍。 5 總之’ 11個研究證明了，化合物I磷酸鹽口服片在委託 人所有的狗中的週期性的肥胖細胞瘤的治療上的有效性。 對熟悉此項技術之人士而言，在上面的示範實施例中 被提出的本發明的許多修飾和變化是被預期會發生的。因 此’只有出現在接下來的專利申請範圍中的這些限制應被 10 列于本發明中。 【圖式簡單說^明】 第1圖是化合物I的鹽的水氣吸著數據。 第2圖是化合物I檸檬酸鹽和化合物I磷酸鹽的粉末X射 線繞射圖形。 15 第3圖是從該同素異形體篩選研究（見實施例5)得到十 個單獨的固體的粉末X射線繞射圖形。在表5、表6和表7中 指明的型態I至型態X是被顯示。 第4圖是來自CH2ci2(型態VI，在沉澱之後馬上地）、己 烷(型態VII’在靜置一夜後)和乙腈(型態vm，在靜置3天後) 20 的固體的TGA曲線。 第5圖是來自這個研究中評估的厘^^的PCr產物的洋 菜糖膠體電泳結果。帶1-5對應表1中的患者ι_5 ;帶6—14對 應表1中的患者6-14。由PCR產物構成的對照組是從含有一 48-bp ITD(帶15)的C2犬肥胖細胞系和從正常犬小腦（野生 56 1310766 型；帶16)產生。 第6圖是在一化合物I磷酸鹽單一劑量之後在MCT磷酸 化的KIT和磷酸化的細胞外信號調節激酶(ERK) 1 /2中的減 少〇 5 【主要元件符號說明】 (無）

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Claims (1)

1^^^^ 95134445號專利利範圍修正本9y ^ 十、申請專利範圍： 1. 一種鹼的鹽型態及其溶劑化物與同素異形體，其中該鹼 是5-[5-敗-2-側氧]，2_二氫斗朵_(32)_亞基甲基]-2,4-二 甲基-1氫-吡咯_3_羧酸(2-吡咯啶_丨_基乙基醯胺，且其 5 巾4鹽型態係從由擰檬酸鹽和鱗酸鹽所構成的群組中 選擇。 2·如申請專利範圍第1項之鹽型態及其溶劑化物和同素異 形體，其中該鹽是具有下面結構的磷酸鹽：

3_如申請專利範圍第2項之鹽型態，係具有一 C22H25FN4〇2.H3P〇4的分子式，及一從約285t 至約290。〇 的熔點。 4.種如申請專利範圍第2項中所界定之磷酸鹽之同素異 形體(型態1)，其中該同素異形體具有一使用CuKal發射 (波長=1.5406埃)得到的粉末χ射線繞射圖形，該圖形包 含被表現在20.8、24.5、25·9和27.0的2Θ角的角度中（士0.1 度）的數個峰。 5·如申請專利範圍第1項之鹽型態及其溶劑化物和同素異 形體，其中該鹽是具如下結構的檸檬酸鹽： 58 1310766 Ο

6·如申請專利範圍第5項之鹽型態，係具一 C22H25FN402_C6H807的分子式，及一從約178°C至約 5 183°C的熔點。 7.如申請專利範圍第5項之鹽型態，係具有一使用CuKoil 發射（波長=1.5406埃)得到的粉末X射線繞射圖形，該圖 形包含被表現在9.1、9.4、14.2、25·4和26.8的2Θ角的角 度中（±0.1度）的數個峰。 10 8. —種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第2項中所界 定之磷酸鹽，如申請專利範圍第5項中所界定之檸檬酸 鹽，或其溶劑化物或同素異形體，及一藥學上可接受的 載劑或賦形劑。 9. 一種用於調節蛋白激酶之催化活性的方法，係包含使該 15 蛋白激酶與如申請專利範圍第2項中所界定之磷酸鹽、 如申請專利範圍第5項中所界定之檸檬酸鹽、或其溶劑 化物或同素異形體接觸。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該蛋白激酶是從由 59 1310766 受體酪胺酸激酶、非受體蛋白酪胺酸激酶和絲胺酸/蘇 胺酸蛋白激酶構成的群組中選擇。 11. 一種如申請專利範圍第2項中所界定之磷酸鹽、如申請 專利範圍第5項中所界定之檸檬酸鹽、或其溶劑化物或 5 同素異形體用於製備一藥物之用途，該藥物用以預防或 治療一有機體中一蛋白激酶相關病症。 12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該蛋白激酶相關病 症是肥胖細胞瘤或肥大細胞增多症。 13. —種製備如申請專利範圍第1項中所界定之鹼的磷酸鹽 10 晶體的方法，係包含： (a) 在一包令—溶劑或一溶劑混合物的溶液中，對 該驗引入一化學計量的碟酸； (b) 從溶液中結晶出該磷酸鹽；及 (c) 從該溶劑溶液中分離出該磷酸鹽晶體。 15 14. —種製備如申請專利範圍第2項中所界定之磷酸鹽的同 素異形體的方法，係包含： (a) 將構酸鹽引入一包含一溶劑或一溶劑混合物的 溶液中； (b) 選擇性地，對該溶液加入一橋接溶劑；及 20 (c) 從該溶劑溶液中分離出該等同素異形體晶體。 15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該步驟(a)之溶劑包 含甲醇。 16. —種製備如申請專利範圍第1項中所界定之鹼的檸檬酸 鹽晶體的方法，係包含： 60 1310766 (a) 在一包含一溶劑或一溶劑混合物的溶液中，對 該鹼引入一化學計量的檸檬酸； (b) 從溶液中結晶出該檸檬酸鹽晶體；及 (c) 從該溶劑溶液中分離出該檸檬酸鹽晶體。 5 17. —種如申請專利範圍第2項中所界定之磷酸鹽、如申請 專利範圍第5項之檸檬酸鹽、或其溶劑化物或同素異形 體用於製備一藥物之用途，該藥物在治療一透過異常PK 活性調控的疾病是有效用的。 61