BRPI0518405B1 - conjunto de esferas para detectar uma cepa de hpv e/ou para diferenciar entre duas ou mais cepas de hpv, método para preparar o conjunto de esferas, método para diagnosticar infecção por hpv em um sujeito humano, uso do conjunto de esferas e método para detectar e/ou para diferenciar entre duas ou mais cepas de hpv particulares em uma amostra biológica - Google Patents

Abstract

DETECÇÃO DE VÍRUS PAPILOMA HUMANO (HPV) UTILIZANDO SONDAS DE ÁCIDO NUCLÉICO, MICROCONTAS E SEPARADOR DE CÉLULAS ATIVADO FLUORESCENTE (FACS). A presente invenção refere-se genericamente ao campo de ensaios de detecção e diagnóstico. Mais particularmente, a presente invenção provê métodos e reagentes incluindo biochips para detectar a presença de, ou distinguir entre um ou mais analisados em uma amostra.

Description

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção

A presente invenção relaciona-se geralmente ao campo ensaios de detecção e diagnóstico. Mais particularmente, a presente invenção fornece métodos, e reagentes incluindo biochips para detectar a presença de, ou distinguir entre, um ou mais analisados em uma amostra.

Descrição da Técnica Anterior

Detalhes bibliográficos de referências fornecidas no presente relatório descritivo estão listados no final do relatório descritivo.

Referência a qualquer técnica anterior nesse relatório descritivo não é, e não deveria ser tomado como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão que essa técnica anterior faça parte do conhecimento geral comum em qualquer país.

A necessidade de métodos de triagem confiáveis e rápidos para detectar analisados múltiplos em um único ensaio é vital não apenas nos campos de diagnóstico clínico, mas também para uso em triagem, por exemplo, para toxinas ambientais e triagem de drogas.

Tal área que está necessitando desesperadamente de métodos de triagem melhorados e reagentes está no campo de doenças infecciosas. Por exemplo, uma estimativa conservadora do uso mundial de testes de diagnóstico para doenças sexualmente transmissíveis, tal como Vírus Papilloma Humano (HPV), é aproximadamente de 20.000.000 testes por ano.

Muitos dos testes existentes para triagem para as causas de doenças infecciosas consomem tempo, trabalho intenso, caro, freqüentemente específico para apenas um patógeno específico e/ou não pode diferenciar entre cepas diferentes de patógenos.

HPV é o patógeno causador principal para câncer cervical. Entretanto, o táxon HPV compreende muitas “cepas” do patógeno, apenas algumas das quais estão associadas ao desenvolvimento do câncer cervical e outros carcinomas. Por conseguinte, as cepas de HPV são tipicamente classificadas como cepas de “alto risco”, incluindo as 13 cepas que respondem por aproximadamente 98% dos casos cervicais, ou cepas de “baixo risco” que não são tipicamente associadas ao desenvolvimento do câncer cervical.

Atualmente, o câncer cervical é detectado por um esfregaço Pap. Nessa técnica, células são coletadas do cérvix por raspagem ou lavagem. Essas células são então colocadas em uma lâmina de vidro de microscópio para produzir o “esfregaço”. Um patologista então examina a lâmina, procurando por células aberrantes. O esfregaço Pap, entretanto, é um ensaio de alguma forma insatisfatório por determinar o risco de câncer cervical equivocadamente, uma vez que a técnica tem uma taxa de negativo falso de aproximadamente 20% e a técnica não pode distinguir táxon de “alto risco” e “baixo risco”.

De acordo com a presente invenção, um ensaio de detecção é fornecido que é capaz de detectar um analisado em uma amostra e/ou diferenciar um número de analisados diferentes. Adicionalmente, os reagentes e métodos da presente invenção descritos aqui são relativamente rápidos e baratos se comparados com alguns ensaios de detecção existentes.

Sumário da Invenção

Ao longo desse relatório descritivo e as reivindicações que se seguem, a não ser que o contexto exija o contrário, a palavra “compreender”, e variações tais como “compreende” e “compreendendo”, irão ser entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro mencionado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.

Seqüências de Nucleotídeo e aminoácidos são referidas por um número identificador de seqüência (SEQ ID NO:). O SEQ ID Nos: corresponde numericamente aos identificadores de seqüência <400>1 (SEQ ID NO:1), <400>2 (SEQ ID NO:2), etc. Um sumário dos identificadores de seqüência é fornecido na Tabela 1. Uma listagem de seqüência é fornecida após as reivindicações.

A presente invenção fornece ensaios que capacitam a detecção de um ou mais analisados e/ou que diferenciam entre membros em uma classe de analisados. Em particular, análise de multiplexar baseadas nas propriedades dos analisados e dos componentes do ensaio é empregada para identificar ou distinguir entre analisados.

Por conseguinte, um aspecto da presente invenção fornece um conjunto de esferas para detectar um ou mais analisados e/ou para diferenciar entre dois ou mais membros em uma classe de analisados, onde o conjunto de esferas compreende uma pluralidade de subconjuntos de esferas onde: (a) as esferas de cada subconjunto são homogêneas no tocante a tamanho; (b) as esferas em cada subconjunto são acopladas a um reagente que irá especificamente reagir com um dado analisado de interesse em uma amostra a ser testada; (c) o reagente em cada esfera é rotulado com o mesmo rótulo com cada subconjunto de esferas tendo uma intensidade fluorescente diferente para criar uma mistura heterogênea de subconjuntos de esferas baseados em intensidade fluorescente; e (d) ao menos dois subconjuntos de esferas são misturados para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade de subconjunto e, portanto, o reagente ao qual a esfera foi acoplada é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade fluorescente e discriminação de analisado.

Em outro aspecto, a presente invenção contempla um método para detectar e/ou diferenciar entre dois ou mais analisados em uma amostra, compreendendo as etapas de: (a) colocar a amostra em esferato com um conjunto de esferas específico para os analisados de interesse; (b) incubar o conjunto de esferas com a amostra por um tempo e sob condições suficientes para permitir que o(s) analisado(s) na amostra reaja especificamente com um reagente em uma esfera no conjunto de esferas; e (c) detectar e/ou diferenciar analisados na amostra que são ligados a um reagente na esfera.

Em um aspecto relacionado, os reagentes podem ser rotulados com um ou mais flurocromos que adicionalmente permite diferenciação entre membros em uma classe de analisados. Em um aspecto preferido, a presente invenção fornece métodos e conjunto de esferas que são capazes de detectar e/ou distinguir entre analisados em uma amostra biológica, onde os analisados são específicos para um patógeno infeccioso.

Amostras biológicas contempladas aqui incluem sangue, soro, saliva, fezes, urina, fluido de tecido, sêmen, exsudato, pus, fluido respiratório e muco e esfregões de feridas tópicas, cânceres e lesões.

O termo “patógeno” refere-se a um microorganismo ou vírus que infecta e coloniza uma amostra. Patógenos exemplares incluem vírus, bactéria, fungo e microorganismos eucarióticos. Um vírus inclui um Lentivírus (por exemplo, vírus da AIDS, HIV-I, HIV-II, HTLV-IV), Retrovírus e vírus da gripe aviária. Em uma modalidade preferida, “patógeno” inclui um microorganismo ou vírus que infecta um organismo multicelular tal como um animal ou planta. Por conseguinte, em uma modalidade, o analisado pode estar relacionado como um patógeno de animal ou planta. Entretanto, a presente invenção abrange a detecção e/ou diferenciação de entidades não patogênicas que colonizam organismos multicelulares tais como colonizadores simbiontes, endófitos, gastrointestinais e similares. Os métodos da presente invenção também são aplicáveis à detecção de analisados em uma amostra que é indicativa da presença de agentes terapêuticos ou substâncias de abuso. Os métodos e reagentes da presente invenção também podem ser usados na detecção de um analisado em uma amostra que não é derivada de uma amostra biológica isolada de um animal ou uma planta. Como tal, os reagentes e métodos da presente invenção também se estendem à detecção de um ou mais analisados e/ou diferenciação entre analisados em amostras ambientais, incluindo ar, água e amostras de solo, incluindo solo extraterrestre, poeira ou amostras similares, amostras industriais e similares em adição às amostras biológicas listadas acima.

Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece métodos de diagnóstico, e reagentes para HPV em pessoas e é capaz de detectar e diferenciar entre cepas diferentes para distinguir táxon de HPV de “alto risco” de táxon de HPV de “baixo risco”. Por conseguinte, em uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção fornece conjunto de esferas que são capazes de distinguir entre pluralidade de diferentes cepas de HPV. Como tal, em um aspecto, os analisados são específicos para uma pluralidade de táxons de HPV e os métodos e reagentes são específicos para a detecção de um ácido nucléico ou antígenos ou anticorpos que são específicos para a pluralidade de táxons de HPV.

Em uma modalidade ainda mais particular, iniciadores de ácidos nucléicos ou sondas capazes de se ligar a uma porção de específica de cepa de um genoma HPV são imobilizados sobre esferas em cada subconjunto de esferas. Iniciadores direcionados para regiões conservadas em um genoma de HPV flanqueando uma região de específica de cepa são então usados para amplificar do genoma HPM. Subconjuntos de esferas específicos para qualquer cepa de HPV são então usados para detectar ou distinguir a cepa de HPV.

Conseqüentemente, outro aspecto da presente invenção é direcionado a um conjunto de esferas para detectar uma ou mais cepas de HPV e/ou para diferenciar entre duas ou mais cepas de HPV, onde o conjunto de esferas compreende uma pluralidade de subconjuntos de esferas onde: (a) as esferas de cada subconjunto são homogêneas no tocante a tamanho; (b) as esferas em cada subconjunto são acopladas a uma sonda de captura de ácido nucléico que é capaz de se ligar a uma região específica de cepa de HPV de um genoma de HPV; (c) a sonda de captura em cada esfera é rotulada com o mesmo rótulo que cada subconjunto de esferas tendo uma intensidade fluorescente diferente para criar uma mistura heterogênea de esferas baseadas em intensidade fluorescente; e (d) ao menos dois subconjuntos de esferas são misturados para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade do subconjunto, portanto, a cepa de HPV é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade fluorescente e discriminação de seqüência.

Outro aspecto da presente invenção contempla um método para detectar e/ou diferenciar entre duas ou mais cepas de HPV em uma amostra, compreendendo as etapas de: (a) colocar a amostra em esferato com um conjunto de esferas compreendendo uma pluralidade de subconjuntos de esferas onde: (i) as esferas de cada subconjunto são homogêneas no tocante a tamanho; (ii) as esferas em cada subconjunto são acopladas a uma sonda de captura de ácido nucléico que é capaz de se ligar a uma região específica de cepa de HPV de um genoma de HPV; (iii) a sonda de captura em cada esfera é rotulada com o mesmo rótulo com cada subconjunto de esferas tendo uma intensidade fluorescente diferente para criar uma mistura heterogênea de esferas baseados em intensidade fluorescente; e (iv) ao menos dois subconjuntos de esferas são misturados para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade de subconjunto e, portanto, a cepa de HPV é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade e discriminação de seqüência. (b) incubar o conjunto de esferas com uma amostra por um tempo e sob condições suficientes para permitir que as sondas se liguem ao genoma de HPV amplificado para gerar um replicon compreendendo uma região de específica de cepa; (c) detectar e/ou diferenciar os amplicons gerados na amostra que são ligados às esferas para dessa maneira identificar ou distinguir entre as duas ou mais cepas de HPV.

Em um preferido aspecto, as esferas nos conjunto de esferas são distinguíveis com base no tamanho, o nível de intensidade fluorescente, o tipo de flurocromo e o reagente que é capaz de reagir com um analisado específico.

O método da presente invenção em relação à detecção do HPV pode ser usado para distinguir entre 2 a 16 cepas de HPV incluindo entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16 cepas. Em uma particularmente preferida modalidade, o conjunto de esferas compreende ao menos 16 subconjuntos de esferas para cepas de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.

Sondas de captura adequadas são aquelas listadas na Figura 9 e representadas na SEQ ID Nos:5 até 20.

A determinação de se a ligação ocorreu entre um analisado e um reagente presente em uma esfera pode ser feita usando qualquer metodologia que permita a diferenciação entre diferentes esferas no conjunto de esferas. Em uma modalidade particularmente preferida, o método de diferenciação entre diferentes esferas nos conjunto de esferas é citometria de fluxo.

A presente invenção adicionalmente contempla kits de diagnóstico para uso de acordo com os reagentes e métodos da presente invenção. Em particular, a presente invenção se estende a biochips e a miniaturização dos componentes de fase sólida do ensaio para gerar reagentes de nanoensaio. Em uma modalidade, o conjunto de esferas ou

parte do mesmo, ou outros reagentes, é imobilizado para uma fase sólida tal como um biochip. O biochip pode também ser considerado como um “biolab” no qual ao menos parte do ensaio é realizada e/ou resultados registrados.

Uma lista de abreviações usadas aqui é fornecida na Tabela 1. <DRAW-CODE>>

Um sumário dos identificadores de seqüência usados aqui é mostrado na Tabela 2. Tabela 2 - Identificadores de Seqüência

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é uma representação gráfica representando um citômetro de fluxo típico. A figura 2 é uma representação gráfica mostrando um diagrama esquemático do protocolo de extração de DNA usado no método de diagnóstico de HPV. A figura 3 é uma representação gráfica que mostra o protocolo PCR que é usado para amplificar o HPV e o DNA humano de uma amostra de DNA. GP5+ e GP6+ referem-se aos iniciadores de HPV universais que se ligam a seqüências conservadas (Y) no HPV e geram um amplicon que compreende uma região que é variável entre cepas de HPV (X1-16). Iniciadores LC1_F e LC1_R amplificam uma região de DNA genômico humano (Z) que serve como um controle nas etapas de hibridização posteriores. Iniciadores GP6+ e LC1_R compreendem um rótulo fluorescente que é incorporado no amplicon gerado. A figura 4 é uma representação gráfica mostrando a diferenciação de micro-esferas na base de tamanho. Seis agrupamentos correspondendo às micro-esferas compreendendo diâmetros de 3,0 μm, 3,5 μm, 4,1 μm, 5,0 μm, 5,6 μm e 6,8μm, são mostrados. A figura 5 é uma representação gráfica mostrando a diferenciação de micro-esferas do mesmo tamanho na base da intensidade do rótulo fluorescente. Intensidades TMR relativas de 0%, 4%, 20% e 100% poderiam ser claramente distinguidas. A Figura 6 é um diagrama esquemático mostrando cada um dos agentes de ligação usados no conjunto. O conjunto compreende micro-esferas compreendendo diâmetros de 3,0 μm, 3,5 μm, 4,1 μm, 5,0 μm, 5,6 μm e 6,8μm e intensidades de sinal de rótulo fluorescente de 0%, 4%, 20% e 100%. No caso de esferas de tamanho menor, isto é 3,0 μm, 3,5 μm, 4,1 μm, intensidades de TMR de 0% e 100% foram usadas; para as micro-esferas de 5.0 μm intensidades de TMR de 0%, 20% e 100% foram usadas; e para as micro-esferas maiores, de 5,6 μm e 6,8μm de diâmetro, todas as intensidades de sinal foram usadas. A Figura 7 é uma representação gráfica mostrando como 17 agentes de ligação foram distinguidos usando citometria de fluxo na base do tamanho da partícula e intensidade do rótulo florescente. Agrupamentos 1 a 4 correspondem a partículas de 6,8 μm com intensidades de rótulo de 0%, 4%, 20% e 100% respectivamente; Agrupamentos 5 a 8 correspondem a partículas de 5,6 μm com intensidades de rótulo de 0%, 4%, 20% e 100% respectivamente; Agrupamentos 9 a 11 correspondem a partículas de 5,0 μm com intensidades de rótulo de 100%, 20% e 0% respectivamente; Agrupamentos 12 e 13 correspondem a partículas de 4,1 μm com intensidades de rótulo de 100% e 0% respectivamente; Agrupamentos 14 e 15 correspondem a partículas de 3,5 μm com intensidades de rótulo de 100% e 0% respectivamente; Agrupamentos 16 e 17 correspondem a partículas de 3,0 μm com intensidades de rótulo de 0% e 100% respectivamente. A Figura 8 é uma representação gráfica mostrando a qual do conjunto de agentes de ligação um amplicon foi ligado. Os resultados mostram ligação à seqüência conservada viral, Y, a seqüência de controle humano Z e a seqüência específica de cepa viral X16. A Figura 9 é uma representação das sondas de captura (iniciadores) específicas para cepas de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. As Figuras 10A até G fornecem Qplots (marca registrada) de amostras humanas detectando a presença ou ausência de HPV.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção fornece ensaios e reagentes incluindo biochips que capacitam a detecção de um ou mais analisados e/ou diferenciar entre membros em uma classe de analisados. Em particular, analisados são identificados ou distinguidos por um método de análise de multiplexar baseado nas propriedades dos analisados e dos componentes do ensaio. Os ensaios de diagnóstico e detecção e reagentes da presente invenção têm aplicação particular no diagnóstico de infecções patogênicas em sujeitos eucarióticos multicelulares. Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um ensaio de diagnóstico para HPV em sujeitos humanos e é capaz de diferenciar entre táxons de HPV de forma a distinguir infecções HPV de “alto risco” de infecções HPV de “baixo risco”. Adicionalmente, a presente invenção também fornece um método para diagnosticar ou determinar o risco de desenvolvimento de uma doença associada a uma infecção por um analisado em um sujeito eucariótico multicelular incluindo, entre outras coisas, câncer cervical em um sujeito humano.

É para ser entendido que a não ser que de outra forma indicado, a presente invenção não se limita a protocolos de ensaio ou diagnóstico específico, visto que pode variar. É também para ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não tem a intenção de ser limitadora.

Deve ser notado que, como usado no presente relatório descritivo, as formas singulares “um”, “uma” e “o, a” incluem aspectos plurais a não ser que o contexto diga da outra forma. Desse modo, por exemplo, referência a “um analisado” inclui um único analisado como também dois ou mais analisados; um “substrato distinguível fisioquimicamente” inclui um único substrato como também dois ou mais substratos; e assim por diante.

Por conseguinte, em um aspecto, a presente invenção fornece um conjunto de esferas que é capaz de detectar, e/ou diferenciar, entre dois ou mais analisados em uma amostra, o conjunto de esferas compreendendo: (a) as esferas de cada subconjunto são homogêneas no tocante a tamanho; (b) as esferas em cada subconjunto são acopladas a um reagente que irá especificamente reagir com um dado analisado de interesse em uma amostra a ser testada; (c) o reagente em cada esfera é rotulado com o mesmo rótulo com cada subconjunto de esferas tendo uma intensidade fluorescente diferente para criar uma mistura heterogênea de subconjuntos de esferas baseados em intensidade fluorescente; e (d) ao menos dois subconjuntos de esferas são misturados para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade de subconjunto e, portanto, o reagente ao qual a esfera foi acoplada é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade fluorescente e discriminação de analisado.

Em um aspecto relacionado, os reagentes podem ser adicionalmente diferencialmente rotulados para criar sub- populações adicionais de esferas baseadas na incorporação de flurocromos diferentes.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos ou conjuntos de esferas para a detecção e/ou diferenciação de um analisado.

Em um aspecto preferido, os métodos ou conjuntos de esferas da presente invenção são capazes de detectar e/ou diferenciar analisados patogênicos.

A presente invenção também fornece métodos para detectar e/ou diferenciar entre um ou mais analisados em uma amostra compreendendo as etapas de: (a) colocar a amostra em esferato com um conjunto de esferas específico para os analisados de interesse; (b) incubar o conjunto de esferas com a amostra por um tempo e sob condições suficientes para permitir que o(s) analisado(s) na amostra reaja especificamente com um reagente em uma esfera no conjunto de esferas; e (c) detectar e/ou diferenciar analisados na amostra que são ligados a um reagente na esfera.

Como usado aqui, o termo “analisado patogênico” refere-se a um microorganismo ou vírus que infecta de forma putativa, coloniza ou tenha esferaminado de outra forma a amostra. Analisados patogênicos exemplares incluem vírus, bactérias, fungo e microorganismos eucarióticos. Em uma modalidade preferida, “analisado” inclui microorganismos ou vírus que infectam um organismo multicelular tal como um animal ou planta. Por conseguinte, em uma modalidade o analisado patogênico pode estar relacionado como um patógeno animal ou planta. Entretanto, a presente invenção abrange a detecção e/ou diferenciação de analisados não patogênicos que colonizam organismos multicelulares tais como simbiontes microbiais de animais (por exemplo, Lactobacillus spp., bactéria ruminante), simbiontes microbiais de insetos (por exemplo, Streptomyces spp., Wolbachia spp.), simbiontes microbiais de esponjas (por exemplo, alga verde, dinoflagelados, cianobactéria) e o similar; endófitos de plantas (por exemplo, Mycorrhiza, Rhizobium spp., Frankia spp., Streptomyces spp.); e o similar. Adicionalmente, o analisado pode ser um analisado que não está associado a um organismo multicelular. Tais analisados incluem bactéria, fungo, vírus, protistas, nematódeos e o similar que coloniza ambientes particulares incluindo ambientes “naturais” tais como solo, oceanos, água corrente, gelo, rocha, ventos hidrotérmicos e ar; ambientes de cuidado com a saúde incluindo hospitais, equipamento hospitalar, equipamento cirúrgico, vestimentas da equipe que trabalha com cuidados da saúde e similar; ambientes “industriais” incluindo instalações de fabricação, instalações farmacêuticas, cervejarias, estabelecimentos vinícolas e similares; ambientes “laboratoriais” incluindo meios de fermentação, culturas, bancadas, equipamento e similar.

Por conseguinte, amostras contempladas pela presente invenção incluem amostras industriais tais como ar, água e solo e similar e amostras biológicas tais como sangue, soro, saliva, fezes, urina, fluido de tecido, sêmen, exsudato, pus, fluído respiratório e muco e esfregões de ferida tópica, cânceres e lesões. Em adição, uma amostra pode ser uma amostra extraterrestre tal como de um meteorito ou em outro planeta. Com relação ao último, o ensaio da presente invenção pode ser adaptado para uso em um veículo remoto interplanetário para teste de solo ou poeira ou amostras de gelo ou para testar material de núcleo em um planeta.

Em uma modalidade preferida, o analisado compreende uma bactéria, fungo, vírus e/ou parasita eucariótico que infecta um sujeito animal. “Sujeitos animais” contemplados aqui incluem qualquer animal, preferivelmente um mamífero e mais preferivelmente um primata incluindo um primata inferior e ainda mais preferivelmente, um humano. Para conveniência, um “animal” também especificamente inclui espécies de animais tais como gado, cavalos, ovelha, porcos, cabras e jumentos assim como animais de laboratório incluindo camundongos, ratos, coelhos, porquinhos da índia e hamsters.

Analisados humanos exemplares que podem ser detectados usando os reagentes e métodos da presente invenção incluem vírus tais como vírus papilloma humano (HPV), coronavírus incluindo o vírus SARS, vírus influenza, vírus da gripe aviária, HIV incluindo HIV-1, HIV-II ou HLTV-IV, Lentivírus em geral, vírus da hepatite e similar, os agentes patogênicos de doenças sexualmente transmissíveis tais como clamídia, gonorréia, Mycoplasma spp. e sífilis; patógenos contidos em alimentos tais como Listeria spp., Samonella spp., E coli (particularmente E coli HO 567), Shigella spp., Brucella spp., Staphylococcus aureus (MRSA) e enterococci incluindo Enterococcos Resistente à Vancomicina (VRE); patógenos adquiridos ambientalmente tais como Legionella spp., Giardia spp.,

Critospiridium spp., Bacillus anthacis (antraz) e similar.

Em um aspecto, a amostra na qual o analisado é detectado é preferivelmente uma amostra derivada de um sujeito multicelular que é infectado ou colonizado, de modo putativo, pelo analisado. Portanto, em um aspecto, a amostra é preferivelmente uma “amostra biológica”. Amostras biológicas exemplares que de forma alguma limitam a presente invenção incluem amostras de tecido ou célula tais como talos de células, biópsias e similar e amostras de fluido do corpo incluindo sangue, urina, linfo, fluido amniótico, fluido cerebrospinal e similar.

Em outro aspecto, os métodos da presente invenção também são aplicáveis à detecção de um “analisado” em uma amostra que não é exclusivamente derivada de um organismo eucariótico multicelular. Como tal, a presente invenção se estende a detectar, e/ou diferenciar entre, um ou mais táxons ou cepas particulares de analisados em amostras tais como amostras ambientais (incluindo amostras de ar, água e solo), amostras industriais, amostras laboratoriais e similares. Por exemplo, os métodos da presente invenção podem ser usados para determinar a microflora procariótica, microflora eucariótica e/ou carga viral de uma amostra de solo, água ou ar ou uma amostra derivada de uma superfície ou objeto artificial.

Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, o analisado a ser detectado é HPV ou uma cepa do mesmo e a amostra é preferivelmente uma amostra biológica derivada de um sujeito humano. Em uma adicionalmente preferida modalidade, a amostra biológica compreende uma ou mais células do sujeito, sangue ou urina.

Mais preferivelmente, a amostra biológica compreende células cervicais coletadas do sujeito.

HPV é descrito em detalhe por Geahart e outros (www.emedicine.com/MED/topic1037.htm, 2004) que é reproduzido em parte abaixo. O HPV produz tumores epiteliais da pele e membranas mucosas. Mais de 100 tipos de HPV foram detectados, e os genomas de quase 70 foram seqüenciados completamente. O sistema de classificação atual, que é baseado em similaridades em suas seqüências de genoma, geralmente se correlaciona com as 3 categorias usadas para descrever o HPV clinicamente: anogenital e/ou de mucosa, não-genital cutâneo, e epidermoplasia verruciforme (EV). Um banco de dados de seqüências genômicas de HPV e árvore filogênica estão disponíveis via Internet no Banco de Dados de Seqüência de HPV.

As infecções de HPV de mucosa são classificadas adicionalmente como: latente (assintomática), subclínica, ou clínica. Lesões clínicas são grosseiramente aparentes, enquanto infecções latentes são detectadas apenas por testes para DNA viral. Lesões sub-clínicas são identificadas pela aplicação de 5% de ácido acético e inspeção sob ampliação. A maioria das infecções por HPV são latentes; infecções clinicamente aparentes usualmente resultam em verrugas em vez de malignidades.

O HPV de tipos 6 e 11 é tipicamente rotulado como de baixo risco porque infecção com esses tipos têm baixo potencial oncogênico e usualmente resulta na formação de condilomata e lesões pré-cancerígenas de baixo-grau. HPV de tipos 16 e 18 surgiram como os tipos de alto-risco de HPV porque eles são responsáveis pelas lesões intra- epiteliais de grau mais elevado que podem progredir para carcinomas, particularmente aquelas na categoria anogenital e/ou de mucosa.

Infecção por HPV sozinha não causa transformação 5 maligna de tecido infectado. Co-fatores, tais como o uso de tabaco, radiação ultravioleta, gravidez, deficiência de folato, e baixa imunidade foram implicados nesse processo.

A Tabela 3 lista uma variedade de doenças e os subtipos de HPV associados. 10 Tabela 3 - Doenças e Subtipos de HPV Associados

Papilomavírus são espécies altamente específicas e não infectam outras espécies, mesmo sob condições de laboratório. Humanos são o único reservatório conhecido para HPV.

Papilomavírus são vírus não envolvidos de simetria icosaedral com 72 capsômeros que circundam o genoma contendo DNA circular de fita dupla com aproximadamente 8000 pares de base.

Considera-se Papilomavírus como tendo 2 modos de replicação, isto é, replicação estável do genoma epissomal em células basais e replicação de fuga, ou vegetativa, em células mais diferenciadas para gerar um vírus progenitor. Embora todas as células de uma lesão contenham o genoma viral, a expressão de genes virais é estreitamente ligada ao estado de diferenciação celular. A maioria dos genes virais não é ativada até que o ceratinócito infectado deixe a camada basal. A produção de partículas de vírus pode ocorrer apenas em ceratinócitos altamente diferenciados; Portanto, a produção de vírus apenas ocorre na superfície epitelial onde as células são finalmente deixadas no ambiente.

Considera-se que as lesões de HPV surgem da proliferação de ceratinócitos basais infectados. A infecção tipicamente ocorre quando as células basais são expostas ao vírus infeccioso através de uma barreira epitelial perturbada como ocorreria durante a relação sexual ou após minúsculas abrasões da pele. As infecções por HPV não mostraram ser citolíticas, em vez disso, partículas virais são liberadas como resultado de degeneração de células em descamação. Além disso, o vírus HPV pode sobreviver por muitos meses e a baixas temperaturas sem hospedeiro.

A multiplicação do vírus é geralmente confinada ao núcleo. Conseqüentemente, células infectadas usualmente exibem um alto grau de atipia nuclear. Coilocitose (do Grego koilos, significando vazio) descreve uma combinação de limpeza perinuclear (halo) com um núcleo picnótico ou encolhido (rasinóide) e é um aspecto característico de infecção por papilomavírus produtiva.

O genoma HPV existe como um DNA epissomal circular separado dos núcleos das células hospedeiras em lesões de HPV benignas ou de baixo-risco, como àquelas tipicamente associadas a HPV dos tipos 6 e 11. Os genomas do HPV de alto-risco tipos 16 e 18 são tipicamente integrados à célula de DNA hospedeira em lesões malignas. A presente invenção, entretanto, estende-se a qualquer cepa de HPV incluindo, mas não se limitando a cepas 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. A integração do genoma viral no genoma da célula hospedeira é considerada um marco de transformação maligna. Proteínas de HPV E6 e E7 de sorotipos de alto-risco mostraram inativar as proteínas supressoras do tumor do hospedeiro p53 e Rb, dessa forma resultando em proliferação de células hospedeiras desregulada e transformação maligna.

Portanto, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar, e/ou diferenciar entre, uma ou mais cepas de HPV em uma amostra biológica, o método compreendendo as etapas de: (i) obter uma amostra biológica que compreende, de forma putativa, HPV de um sujeito humano; (ii) isolar o ácido nucléico da amostra; (iii) amplificar o ácido nucléico da amostra usando iniciadores que geram um amplicon que é distinto para cada cepa de HPV; (iv) opcionalmente amplificar uma seqüência de ácido nucléico de controle; (v) efetuar rotulação dos amplicons mencionados nas etapas (iii) e/ou (iv); (vi) hibridizar os amplicons rotulados a um conjunto de esferas cobertas com reagentes onde cada membro do conjunto de esferas compreende uma molécula de ácido nucléico tendo complementaridade com uma seqüência nucleotídica de uma particular cepa de HPV, ligada ou associada de outra forma com uma esfera distinguível fisioquimicamente; e (vii) determinar à qual dos reagentes um amplicon ligou-se; onde a associação de um amplicon com um reagente particular é indicativa da presença de uma cepa de HPV particular na amostra.

A presente invenção capacita a detecção de DNA de HPV amplificado ou, com o uso de uma transcriptase reversa, o RNA correspondente. Conseqüentemente, a presente invenção contempla esferas com RNA ou DNA ou análogos químicos dos mesmos.

O método da presente invenção se baseia, em parte, na detecção e/ou diferenciação entre uma ou mais cepas particulares de um sujeito analisado em uma amostra. Referência aqui a “cepas particulares de um sujeito analisado” incluem qualquer variante de espécies ou táxon de um analisado. Exemplos de “cepas” de um analisado incluem sub-espécies do analisado, variantes do analisado com níveis diferentes de virulência, variantes do analisado que indica prognósticos diferentes quando infectando ou colonizando um hospedeiro, variantes bioquímicas do analisado e similar.

Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção pode ser adaptado para detectar e/ou diferenciar entre cepas particulares de HPV que são associadas a alto- risco ou a alto potencial oncogênico em humanos (cepas de alto-risco) e aquelas que são associadas a baixo risco de carcinoma ou baixo potencial oncogênico (cepas de baixo- risco). Por conseguinte, o termo cepa de HPV de “alto risco” inclui qualquer cepa de HPV que é associada ao desenvolvimento de carcinoma, incluindo câncer cervical, em sujeitos humanos. Como indicado acima, cepas de HPV de alto-risco exemplares que de forma alguma limitam a invenção incluem HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. Sondas de captura adequadas nas esferas para essas cepas de HPV são mostradas na Figura 9.

O termo “sonda” e “iniciadores” podem ser usados de modo intercambiável nesse contexto. Cepas de HPV de “baixo- risco” incluem aquelas que não são associadas ou apenas fracamente associadas ao aumentado risco de carcinoma em sujeitos humanos. Tipicamente, as cepas de HPV de “baixo- risco” são as cepas formadoras de verruga, incluindo HPV 6 e HPV 11.

As esferas da presente invenção são acopladas a reagentes que irão especificamente interagir com um dado analisado de interesse em uma amostra. Em um aspecto, os reagentes da presente invenção são ácidos nucléicos e os analisados na amostra que especificamente reagem com o reagente são também ácidos nucléicos.

Conseqüentemente, esse aspecto da presente invenção usa iniciadores que são direcionados a regiões conservadas de uma cepa de HPV, mas que flanqueiam seqüências genômicas de cepa específica. As seqüências de cepa específica são referidas como seqüências “variáveis” uma vez que elas variam entre cepas comparadas às seqüências conservadas que são constantes entre cepas. Após amplificação, os amplicons são colocados em esferato com subconjuntos de esferas no conjunto de esferas onde cada esfera de cada subconjunto carrega um ácido nucléico iniciador de captura ou sonda capaz de hibridizar aos amplicons de cepa específica. A multiplexagem usando tamanho de esfera, intensidade de fluorescência e especificidade de ligação de DNA capacita identificação, separação e distinção de cepas de HPV.

Por conseguinte, outro aspecto da presente invenção contempla um conjunto de esferas para detectar uma ou mais cepas de HPV e/ou para diferenciar entre duas ou mais cepas de HPV, onde o conjunto de esferas compreende uma pluralidade de subconjuntos de esferas onde: (a) as esferas de cada subconjunto são homogêneas no tocante a tamanho; (b) as esferas em cada subconjunto são acopladas a uma sonda de captura de ácido nucléico que é capaz de se ligar a uma região específica de cepa de HPV de um genoma de HPV; (c) a sonda de captura em cada esfera é rotulada com o mesmo rótulo que cada subconjunto de esferas tendo uma intensidade fluorescente diferente para criar uma mistura heterogênea de esferas baseadas em intensidade fluorescente; e (d) ao menos dois subconjuntos de esferas são misturados para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade do subconjunto, portanto, a cepa de HPV é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade fluorescente e discriminação de seqüência.

Outro aspecto da presente invenção contempla um método para detectar e/ou diferenciar entre duas ou mais cepas de HPV em uma amostra, compreendendo as etapas de: (a) colocar a amostra em esferato com um conjunto de esferas compreendendo uma pluralidade de subconjuntos de esferas onde: (i) as esferas de cada subconjunto são homogêneas no tocante a tamanho; (ii) as esferas em cada subconjunto são acopladas a uma sonda de captura de ácido nucléico que é capaz de se ligar a uma região específica de cepa de HPV de um genoma de HPV; (iii) a sonda de captura em cada esfera é rotulada com o mesmo rótulo que cada subconjunto de esferas tendo uma intensidade fluorescente diferente para criar uma mistura heterogênea de esferas baseados em intensidade fluorescente; e (iv) ao menos dois subconjuntos de esferas são misturados para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade de subconjunto e, portanto, a cepa de HPV é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade e discriminação de seqüência. (b) incubar o conjunto de esferas com uma amostra por um tempo e sob condições suficientes para permitir que as sondas se liguem ao genoma de HPV amplificado para gerar um replicon compreendendo uma região de específica de cepa; (c) detectar e/ou diferenciar os amplicons gerados na amostra que são ligados às esferas para dessa maneira identificar ou distinguir entre as duas ou mais cepas de HPV.

Os amplicons aos quais as sondas de captura de ácido nucléico são específicas podem também ser rotulados com uma molécula repórter, fluorescente.

Ácidos nucléicos podem ser isolados da presente amostra usando qualquer método que é conveniente com relação à natureza da própria amostra e o analisado. Como usado aqui, o termo “ácido nucléico” refere-se a DNA e/ou RNA. Tipicamente, DNA é isolado, embora sob algumas circunstâncias que seriam evidentes àqueles versados na técnica, pode ser mais preferível isolar RNA, por exemplo, quando o analisado de interesse é um vírus RNA. Se RNA é isolado, o RNA pode ser amplificado, ou o RNA pode ser transcrito de forma reversa no cDNA usando métodos padrões, para amplificação e análise subseqüentes.

Preferivelmente, o “ácido nucléico” é DNA. DNA pode ser isolado da amostra usando quaisquer meios convenientes. Por exemplo, no caso de um vírus tal como HPV em uma amostra de célula humana, guanidina ou um agente funcionalmente equivalente pode ser usado para lisar as células. Um método baseado em guanidina exemplar para lise de célula e extração de DNA é o método de Nelson e Krawetz (Anal. Biochem. 207(1):97-201, 1992). Soluções de lise baseadas em guanidina também são comercialmente disponíveis de fornecedores tais como Qiagem, por exemplo, QIAamp, PAXgene e similar. Entretanto, métodos de lise podem mudar dependendo da natureza da amostra e analisado. Por exemplo, para a detecção de um analisado em uma amostra ambiental tal como solo ou amostra sedimentar, um sistema de lise de célula baseado em esfera de vidro pode ser mais apropriado, tal como o método de Kuske e outros (Appl. Environ. Microbiol. 64(7):2463-2472, 1998). Em qualquer evento, o protocolo de lise apropriado para um dado analisado e amostra seria prontamente determinado por àquele versado comumente na técnica sem experimentação indevida.

Após lise das células, o DNA pode ser purificado por qualquer meio conveniente que poderia ser prontamente evidente àquele versado na técnica (por exemplo, veja os kits acima comercialmente disponíveis). Em uma modalidade preferida da invenção, o DNA é purificado usando uma quantidade limitada de um agente de ligação de DNA tal como, mas não se limitando a, sílica. Pelo uso de uma quantidade limitada do agente de ligação de DNA, uma quantidade uniforme de DNA pode ser isolada de diferentes amostras como a quantidade de DNA recuperada em cada caso é igual à quantidade máxima de DNA que pode ser ligada pela quantidade limitada de agente de ligação de DNA. O DNA ligado ao agente de ligação de DNA pode então ser recuperado ou eluído do agente de ligação de DNA usando quaisquer meios convenientes.

Embora DNA seja um ácido nucléico preferido, RNA pode também ser isolado da amostra usando qualquer protocolo de isolamento de RNA padrão. Isolamento de RNA tipicamente envolve uma etapa de ruptura de célula e uma etapa de isolamento de RNA. Técnicas de ruptura de célula exemplares que são adequadas para o isolamento de RNA incluem aquelas apresentadas em Ambion Technical Bulletin #183 (www.ambion.com/techlib/tb/tb183.htlm). Adicionalmente, uma variedade de kits de isolamento de RNA que são adequados para uma variedade de tipos de amostra são apresentadas em www.ambion.com/techlib/basics/products/rnaisolcompchart.ht ml. Entretanto, deveria ser entendido que a presente invenção não é de forma alguma limitada por esses métodos específicos e kits para isolamento e purificação de RNA e a presente invenção é compatível com quaisquer métodos de isolamento de RNA que seriam evidentes àqueles versados na técnica.

O conjunto de esferas pode compreender, em relação a detecção de HPV tantos subconjuntos de esferas quantas cepas de HPV. Conseqüentemente, o ensaio pode empregar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 subconjuntos de esferas cada para cepas de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.

Esferas adicionais também podem ser usadas para controles. Sondas de captura adequadas são reveladas na Figura 9.

Conseqüentemente, outro aspecto da presente invenção é direcionado a um conjunto de esferas para detectar uma ou mais cepas de HPV e/ou para diferenciar entre duas ou mais cepas de HPV, onde o conjunto de esferas compreende uma pluralidade de subconjuntos de esferas onde: (a) as esferas de cada subconjunto são homogêneas no tocante a tamanho; (b) as esferas em cada subconjunto são acopladas a uma sonda de captura de ácido nucléico selecionada da lista consistindo nas SEQ ID NOs: 5 até 20 que é capaz de se ligar a uma região específica de cepa de HPV de um genoma de HPV; (c) a sonda de captura em cada esfera é rotulada com o mesmo rótulo que cada subconjunto de esferas tendo uma intensidade fluorescente diferente para criar uma mistura heterogênea de esferas baseadas em intensidade fluorescente; e (d) ao menos dois subconjuntos de esferas são misturados para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade do subconjunto, portanto, a cepa de HPV é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade fluorescente e discriminação de seqüência.

Ainda um aspecto adicional da presente invenção contempla um método para detectar e/ou diferenciar entre duas ou mais cepas de HPV em uma amostra, compreendendo as etapas de: (a) colocar a amostra em esferato com um conjunto de esferas compreendendo uma pluralidade de subconjuntos de esferas onde: (i) as esferas de cada subconjunto são homogêneas no tocante a tamanho; (ii) as esferas em cada subconjunto são acopladas a uma sonda de captura de ácido nucléico que é selecionada da lista consistindo nas SEQ ID Nos: 5 até 20 que é capaz de se ligar a uma região específica de cepa de HPV de um genoma de HPV; (iii) a sonda de captura em cada esfera é rotulada com o mesmo rótulo que cada subconjunto de esferas tendo uma intensidade fluorescente diferente para criar uma mistura heterogênea de esferas com base em intensidade fluorescente; e (iv) ao menos dois subconjuntos de esferas são misturados para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade de subconjunto e, portanto, a cepa de HPV é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade e discriminação de seqüência. (b) incubar o conjunto de esferas com uma amostra por um tempo e sob condições suficientes para permitir que as sondas se liguem ao genoma de HPV amplificado para gerar um replicon compreendendo uma região de específica de cepa; (c) detectar e/ou diferenciar os amplicons gerados na amostra que são ligados às esferas para dessa maneira identificar ou distinguir entre as duas ou mais cepas de HPV.

Por conseguinte, os conjuntos de esfera podem compreender em relação HPV 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 subconjuntos de esferas cada com uma molécula de ácido nucléico selecionada da listagem consistindo nas SE ID NOs:5 até 20. Referência à essas seqüências de cepa específica de HPV em SE ID NOs:5 até 20 incluem moléculas de ácido nucléico tendo ao menos 90% de identidade a essas seqüências ou capazes de hibridizar as mesmas ou suas formas complementares sob condições de baixa severidade. Referência a ao menos 90% inclui 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100%.

Os métodos da presente invenção residem, em parte, em amplificar um ácido nucléico de uma amostra usando iniciadores que se ligam a seqüências conservadas dentre diferentes cepas do sujeito analisado, mas que geram um amplicon que compreende uma distinta seqüência de nucleotídeo para cada cepa do analisado. De fato, os iniciadores usados na presente invenção se ligam às seqüências que são conservadas dentre cepas do sujeito analisado que flanqueiam regiões que são pelo menos parcialmente não-conservadas ou polimórficas entre cepas. Esquematicamente, a região amplificada no analisado tem a estrutura geral de: C-X-C’ Onde: C é uma seqüência de nucleotídeo que é conservada entre duas ou mais cepas do analisado e é o sítio de ligação do iniciador dianteiro; X é uma seqüência de nucleotídeo, parte ou inteira da mesma compreende variação entre diferentes cepas do analisado; C’ é uma seqüência de nucleotídeo que é conservada entre duas ou mais cepas do analisado e é o sítio de ligação do iniciador “reverso”.

Amplificação dos sítios iniciadores tais como aqueles descritos acima efetivamente permitem o uso de um conjunto de iniciadores “universal”, que se liga a C e C’ para amplificar X de uma variedade de cepas do analisado. Adicionalmente, deveria ser notado que o amplicon amplificado usando os iniciadores universais pode compreender ambas as regiões: conservada e variável.

Em uma modalidade preferida, iniciadores são usados que amplificam as seqüências de HPV. Mais preferivelmente esses iniciadores são GP5+ é 5’ TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC 3’ (SEQ ID NO:1) e GP6+ é 5’ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 3’ (SEQ ID NO:2). Esses iniciadores geram um amplicon de HPV que compreende ambos uma região conservada (definida como Y na Figura 3), e uma região que é variável dentre diferentes cepas de HPV (definida como X na Figura 3).

A presente invenção também contempla a amplificação de seqüências de controle. Em uma modalidade, a seqüência de controle pode incluir uma região do genoma do sujeito da qual uma amostra biológica é derivada. Entretanto, a presente invenção não é de forma alguma limitada a essas seqüências de controle particulares e outras seqüências de controle que seriam evidentes àqueles versados na técnica também são contempladas. Adicionalmente, os métodos da presente invenção podem também ser realizados sem a amplificação de uma seqüência de controle.

Em uma modalidade preferida, a seqüência de controle é amplificada do genoma de um sujeito humano usando os iniciadores LC1_F, que compreendem a seqüência de nucleotídeo 5’ TACACACAGGTGTACACAGA 3’ (SEQ ID NO:3) e LC1_R que compreende a seqüência 5’ ACCAAGTACTCTACGTGTTG 3’ (SEQ ID NO:4).

DNA isolado pode ser amplificado usando qualquer protocolo de amplificação de DNA. Uma variedade de métodos exemplares para a amplificação de DNA que de forma alguma limitam a invenção é apresentada em “ DNA Amplification: Current Technologies and Applications” (Demidov e Broude Eds., Horizon Bioscience, 2004).

RNA isolado pode ser amplificado usando quaisquer métodos de RNA conhecidos na técnica e um número de tecnologias de amplificação de RNA foram desenvolvidas. Duas categorias principais dessas são: (i) aquelas que utilizam ciclagem termal tal como RT-PCR e (ii) ensaios isotérmicos tais como amplificação baseada em seqüência de ácido nucléico (NASBA) (Compton, Nature 350:91-92, 1991; Kievits e outros, J. Virol. Methods 35:273-286, 1991) e amplificação mediada por transcrição (TMA) (Hill, J. Clin. Ligand Assay 19:43-51, 1996). Ensaios isotérmicos podem ser subdivididos, baseados em se: (i) eles copiam e amplificam a seqüência alvo, tal como TMA, NASBA e replicação de seqüência de auto-sustentação (3SR) (Guatelli e outros, Proc. Natl Acad. Sci.USA 87:1874-1878, 1990; Chadwick e outros, J Viral Methods 70:59-70, 1998; para exame, veja Chan e Fox, Ver. Med. Microbiol. 10:185-196, 1999), ou (ii) eles geram um sinal dependente de alvo que pode ser adicionalmente amplificado, por exemplo, ensaios invasores (Lyamichev e outros, Nat. Biotechmol. 17: 292- 296, 1999; Ryan e outros, Mol. Diagn. 4: 135-144, 1999). Existem várias outras tecnologias de amplificação que não cabem prontamente nessas categorias, tais como Q beta replicase (Lizardi e outros, Biotechnology 6:1197-1202, 1988) e DNA ramificado (Todd e outros., J. AIDS Hum. Retrovirol. 10:S35-S34, 1995; Pawlostsky e outros., J. Virol. Methods 79:227-235, 1999). Entretanto, deveria ser entendido que a presente invenção contempla qualquer método de amplificação de RNA que seria evidente àquele versado na técnica. Adicionalmente, deveria ser entendido que a presente invenção também contempla o uso de transcriptase reversa ou um equivalente funcional do mesmo para converter RNA em DNA que pode então ser subseqüentemente amplificado.

De acordo com a presente invenção, os amplicons mencionados nas etapas (iii) e/ou (iv) dos métodos descritos supra, são rotulados. Os amplicons da presente invenção podem ser rotulados usando qualquer meio conveniente. Métodos exemplares incluem ambos os métodos de pré e pós-síntese. Métodos de rotulação de pré-síntese incluem rotulação de um iniciador PCR que é subseqüentemente usado para amplificação do, e dessa forma incorporado em, um amplicon via PCR. Nesse método, o rótulo é tipicamente fixado à extremidade 5’ de um iniciador adequado para a amplificação do amplicon, embora rotular em outras posições no iniciador, tal como rotulação 3’ ou rotulação não-terminal, é também contemplado.

Um ligador químico também pode ser usado entre o rótulo e o polinucleotídeo que é rotulado. Seqüências de ligadores apropriadas irão ser prontamente determinadas por àqueles versados na técnica, e são prováveis incluir ligadores tais como amino modificadores C6, C7 e C12 e ligadores compreendendo grupos de tiol. Como irá ser prontamente determinado, um iniciador pode compreender o ligador e rótulo, ou o ligador sozinho, ao qual o rótulo pode ser fixado em uma etapa adiante.

Métodos de rotulação pós-amplificação incluem sistemas de rotulação de entalhe onde um polinucleotídeo rotulado é sintetizado do amplicon usando polimerase Klenow, ou um equivalente funcional do mesmo, de iniciadores aleatórios. Nucleotídeos rotulados, ou nucleotídeos compreendendo um grupo ligador, podem ser incorporados no polinucleotídeo sintetizado por polimerase Klenow durante a síntese.

Em qualquer evento, outros métodos de rotulação deveriam ser prontamente evidentes àqueles versados na técnica e deveria ser entendido que a presente invenção não é de forma alguma definida ou limitada pela escolha do método de rotulação.

Preferivelmente, o rótulo usado é um “marcador fluorescente” ou “fluoróforo”. Muitos marcadores fluorescentes diferentes serão familiares àqueles versados na técnica, e a escolha do marcador fluorescente de forma alguma limita a invenção. Em uma modalidade preferida da presente invenção os marcadores fluorescentes da presente invenção compreendem qualquer marcador fluorescente que pode ser fixado a um polinucleotídeo e que é excitável usando uma fonte de luz selecionada do grupo abaixo: (i) Lasers de íon de argônio: compreende uma linha azul de 488 nm, que é adequada para a excitação de muitos corantes e flurocromos que ficam fluorescentes na região verde até a vermelha. Lasers de argônio, sintonizáveis, também estão disponíveis que emitem em uma variedade de comprimentos de onda (458 nm, 488 nm, 496 nm, 515 nm e outros). (ii) Lasers de diodo: têm um comprimento de onda de emissão de 635 nm. Outros lasers de diodo que estão agora disponíveis operam a 532 nm. De maneira interessante, esse comprimento de onda excita iodeto de propídio (PI) de forma ótima. A coloração de PI é amplamente usada para análise de DNA, esferagem viva/morta e determinação de ploidia. Lasers de diodo azul emitindo luz aproximadamente 476 nm também estão disponíveis. (iii) Lasers de gás HeNe : operam com a linha vermelha de 633 nm. (iv) Lasers HeCd: operam a 325 nm. (v) Lâmpada de arco de mercúrio de 100W: a mais eficiente fonte de luz para excitação de corantes UV como Hoechst e DAPI.

Em modalidades mais preferidas da presente invenção os marcadores fluorescentes são selecionados de : hidróxi cumarina, amino cumarina, metoxiciumarina, azul cascada, amarelo Lucifer, NBD, Ficeritin (PE), PerCP, aloficocianina, hoechst 33342, DAP1, SYTOX Azul, hoescht 33258, cromomicina A3, mitramicina, YOYO-1, SYTOX Verde, SYTOX laranja, 7-AAD, acridina laranja, TOTO-1, To-PRP-1, tiazol laranja, TOTO-3, TO-PRO-3, LDS 751, corantes Flúor Alexa incluindo Alexa Fluoro-350, -430, -488, -532, -546, - 555, -556, -594, -633, -647, -660, -680, -700 e -750; corantes BoDipy, incluindo BoDipy 630/650 e BoDipy 650/665; corantes CY, particularmente Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 e Cy7; 6-FAM (Fluoresceína); PE-Cy5, PE-CY7, Fluoresceína dT; Hexaclorofluoresceína (Hex); 6-carboxi-4’, 5’-dicloro-2’, 7’-dimetoxifluoresceína (JOE); corantes Oregon verde, incluindo 488-X e 514; corantes rodamina, incluindo X- rodamina, Lisamina, Rodamina B, Rodamina Verde, Rodamina Vermelha e ROX; TRICTC, Tetrametilrodamina (TMR);

Carboxitetrametilrodamina (TAMRA); Tetraclorofluoresceína (TET); Vermelho 6B, FluorX, BODIPY-FL e Vermelho Texas. Em modalidades particularmente preferidas da presente invenção, o marcador é Cy5 que é particularmente conveniente para prática da presente invenção.

Entretanto, em modalidades alternativas da invenção, rótulos radioativos ou não-radioativos podem ser usados para rotular o amplicon. Rótulos radioativos convenientes incluem 32P e 3H. Esses rótulos podem ser incorporados no amplicon e/ou iniciador usando quaisquer meios convenientes. Uma variedade de métodos de rotulação não-radioativos também pode ser usada. Métodos de rotulação não-radioativos exemplares que de forma alguma limitam a presente invenção são apresentados em Speel (Histochem. Cell. Biol. 112:89-113, 1999).

O termo “reagente” como usado aqui deveria ser entendido como compreendendo um polinucleotídeo imobilizado a uma esfera. Mais particularmente, cada reagente compreende um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência que é complementar a um amplicon gerado de acordo com métodos descritos aqui, que é ligado ou associado de outra maneira com uma esfera distinguível fisioquimicamente. Um reagente pode também compreender uma seqüência que é complementar a seqüência de controle como definido aqui previamente, isto é, uma seqüência amplificada do genoma de um organismo multicelular (Z) ou o amplicon de uma seqüência de nucleotídeo que é conservada entre cepas do analisado (Y).

Por conseguinte, um conjunto de esferas de reagentes pode compreender: [B1-cX1, B2-cX2, B3-cX3...Bn-cXn, By-cY, Bz-cZ] onde:

Bi...Bn, By, Bz são, individualmente, esferas distinguíveis fisioquimicamente; cXn é um polinucleotídeo imobilizado a uma esfera onde o polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeo que é complementar a uma seqüência de nucleotídeo que é complementar a uma seqüência de ácido nucléico particular que é específica a um analisado ou uma cepa particular do sujeito analisado e onde n é o número de analisados ou cepas particulares de um sujeito analisado a ser detectado usando o conjunto de esferas; cY é um membro opcional do conjunto de esferas e é um polinucleotídeo imobilizado a uma esfera onde o dito polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeo que é complementar a uma seqüência que é conservada entre os analisados ou cepas de um sujeito analisado; cZ é um membro opcional do conjunto de esferas e é um polinucleotídeo imobilizado a uma esfera onde o polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeo que é complementar a uma seqüência de controle que é amplificada de um sujeito multicelular.

Preferivelmente, o sujeito analisado é HPV e a seqüência de DNA de controle é uma seqüência DNA genômica.

Por “complementar”, é para ser entendido que o polinucleotídeo imobilizado do reagente deveria hibridizar a um amplicon gerado de acordo com os métodos descritos aqui sob condições de baixas severidades. Preferivelmente o polinucleotídeo imobilizado deveria ligar-se a amostra e padrão sobre condições de severidades médias, e mais preferivelmente o polinucleotídeo imobilizado deveria ligar-se a amostra e padrão sobre condições de severidades elevadas.

A referência aqui a baixa severidade inclui e abrange pelo menos aproximadamente 0 a pelo menos aproximadamente 15% v/v formamida (incluindo 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13% e 14% v/v formamida) e de pelo menos aproximadamente 1 M a pelo menos aproximadamente 2 M sal para hibridização, e pelo menos aproximadamente 1 M a pelo menos aproximadamente 2 M sal para condições de lavagem. Genericamente, severidade baixa está a partir de aproximadamente 25-30°C a aproximadamente 52°C, como 25, 26, 27, 28, 39, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 e 52°C. A temperatura pode ser alterada e temperaturas mais elevadas utilizadas para substituir formamida e/ou fornecer condições de severidade alternativas. Condições de severidade alternativas podem ser aplicadas, onde necessário, como severidade média, que inclui e abrange pelo menos aproximadamente 16% v/v a pelo menos aproximadamente 30% v/v formamida, incluindo 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, e 30% v/v formamida, e de pelo menos aproximadamente 0.5 M a pelo menos aproximadamente 0.9 sal para hibridização e pelo menos aproximadamente 0.5 M a pelo menos aproximadamente 0.9 M de sal para condições de lavagem, ou elevada severidade, que inclui e abrange de pelo menos aproximadamente 31% v/v a pelo menos aproximadamente 50% v/v formamida e de pelo menos aproximadamente 0.01 M a pelo menos aproximadamente 0.15 M de sal para hibridização, e pelo menos aproximadamente 0.01 M a pelo menos aproximadamente 0.15 M sal para condições de lavagem. Em geral, a lavagem é realizada Tm = 69,3 + 0,41 (G+C)% (Marmur e Dopty, J. Mol. Biol. 5:109, 1962). Entretanto, o

Tm de um DNA dúplex diminui em 1°C com cada aumento de 1% no número de pares de base de má combinação (Bonner e Laskey, Eur. J. Biochem. 46:83, 1974). Formamida é opcional nessas condições de hibridização. Por conseguinte, níveis particularmente preferidos de severidade são definidos como a seguir: baixa severidade é 6 x tampão SSC, 0,1% peso/v SDS a 25-42°C; uma severidade moderada é 2 x tampão SSC, 0,1% peso/v SDS em uma temperatura na faixa de 20°C a 65°C; elevada severidade é 0,1 x tampão SSC, 0,1% peso/v SDS em uma temperatura de pelo menos 65°C.

As esferas B1. Bn, By, Bz, dos conjuntos de esfera de reagente são individualmente esferas fisioquimicamente distinguíveis. O termo “fisioquimicamente distinguíveis” se refere a qualquer característica física ou química que permita que uma esfera, por exemplo, B1 seja diferenciada de outra esfera, por exemplo, B2. Por conseguinte, as esferas fisioquimicamente distinguíveis permitem diferenciação de reagentes específicos.

Em uma modalidade preferida, a esfera compreende uma “micropartícula”. Como será evidente para aqueles versados na técnica, quase qualquer material, homogêneo ou de outro modo pode ser utilizado para a micropartícula. As micropartículas consideradas aqui também podem compreender mais de uma substância, e como tal podem compreender invólucros, ligas ou misturas de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas. Materiais particularmente úteis que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção e que representam modalidades preferidas da presente invenção incluem materiais selecionados da lista que consiste em: sílica (por exemplo: quartzo ou vidro), látex, titânia, dióxido de estanho, ítria, alumina, e outros óxidos de metal binário (como ZnO), perovskites e outros óxidos de metal piezoelétricos (como BaTiO3), ZnS, sacarose, agarose e outras esferas poliméricas. Em uma modalidade particularmente preferida, a micropartícula compreende sílica.

Em uma modalidade preferida, o termo “fisioquimicamente distinguível” se refere a uma diferença mensurável em qualquer entre tamanho de esfera, presença ou ausência de um rótulo opticamente detectável, específico e/ou a intensidade de um rótulo opticamente desejável.

A esfera considerada pela presente invenção pode ser produzida em qualquer formato tridimensional regular ou irregular, conveniente. Entretanto, é genericamente prático sintetizar esferas pequenas ou partículas esferoidais. Tais esferas ou partículas esferoidais também são mencionadas aqui como “esferas”. Por conseguinte, em modalidades preferidas da presente invenção, as “micropartículas” da presente invenção são substancialmente esféricas ou esferoidais ou compreendem uma “microesfera”.

Embora as esferas da presente invenção possam ser mencionadas como “microesferas”, o tamanho efetivo das partículas depende de uma variedade de fatores e as partículas podem ou não efetivamente compreender medições na faixa de micrômetro. Em uma modalidade preferida a esfera compreende um diâmetro (ou medição equivalente em uma partícula não esferoidal) de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 30 μm, incluindo 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 550 nm, 600 nm, 650 nm, 700 nm, 750 nm, 800 nm, 850 nm, 900 nm, 950 nm, 1,0μm, 1,1 μm, 1,2 μm, 1,3 μm, 1,4 μm, 1,5 μm, 1,6 μm, 1,7 μm, 1,8 μm, 1,9 μm, 2,0 μm, 2,1 μm, 2,2 μm, 2,3 μm, 2,4 μm, 2,5 μm, 2,6 μm, 2,7 μm, 2,8 μm, 2,9 μm, 3,0 μm, 3,1 μm, 3,2 μm, 3,3 μm, 3,4 μm, 3,5 μm, 3,6 μm, 3,7 μm, 3,8 μm, 3,9 μm, 4,0 μm, 4,1 μm, 4,2 μm, 4,3 μm, 4,4 μm, 4,5 μm, 4,6 μm, 4,7 μm, 4,8 μm, 4,9 μm, 5,0 μm, 5,1 μm, 5,2 μm, 5,3 μm, 5,4 μm, 5,5 μm, 5,6 μm, 5,7 μm, 5,8 μm, 5,9 μm, 6,0 μm, 6,1 μm, 6,2 μm, 6,3 μm, 6,4 μm, 6,5 μm, 6,6 μm, 6,7 μm, 6, 8 μm , 6 ,9 μm, 7,0 μm, 7,1 μm, 7,2 μm, 7,3 μm, 7,4 μm, 7,5 μm, 7,6 μm, 7,7 μm, 7,8 μm, 7,9 μm, 8,0 μm, 8,1 μm, 8,2 μm, 8,3 μm, 8,4 μm, 8,5 μm, 8,6 μm, 8,7 μm, 8,8 μm, 8,9 μm, 9,0 μm, 9,1 μm, 9,2 μm, 9,3 μm, 9,4 μm, 9,5 μm, 9,6 μm, 9,7 μm, 9,8 μm, 9,9 μm, 10 μm, 11μm, 12μm, 13μm, 14μm, 15μm, 16μm, 17μm, 18μm, 19μm, 20μm, 21μm, 22μm, 23μm, 24μm, 25μm, 26μm, 27μm, 28μm, 29μm, 30μm. Mais preferivelmente, a esfera compreende um diâmetro (ou medição equivalente em uma partícula não esferoidal) entre 1 μm e 10 μm.

Em uma modalidade particularmente preferida, as esferas são esferas AmpaSand (marca registrada: Genera Biosystems) produzidas por Genera Biosystems. Essas esferas são comercialmente disponíveis e são descritas em www.generabiosystems.com/generabiosystems/technology/AmpaSa ndBeads/. Entretanto, a presente invenção não deve ser considerada de modo algum limitada ao uso dessas constas, especificamente.

As esferas podem ser distinguidas com base na presença ou ausência de um ou mais “rótulos opticamente detectáveis”. Tipicamente, uma esfera específica pode compreender 0, 1, 2, 3, 4, 5 rótulos opticamente detectáveis. Como utilizado aqui, o termo “rótulo opticamente detectável” se refere a qualquer molécula, átomo ou íon que emite fluorescência, fosforescência e/ou incandescência. Rótulos opticamente detectáveis, convenientes, incluem aqueles que emitem nas faixas ultravioleta (faixa de comprimento de onda de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 3 nm), visível (faixa de comprimento de onda de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 800 nm, quase infravermelho (NIR) (faixa de comprimento de onda de aproximadamente 800 nm a aproximadamente 1500 nm) e/ou infravermelho (IR) (faixa de comprimento de onda de aproximadamente 1500 nm a aproximadamente 10 μm). Entretanto, devido à facilidade de detecção, em uma modalidade particularmente preferida, o rótulo opticamente detectável é detectável na faixa de comprimento de onda visível.

Em modalidades preferidas adicionais da presente invenção, o rótulo opticamente detectável compreende um ou mais rótulos selecionados da lista que consiste em: um fluoróforo, uma partícula semicondutora, partícula de fósforo, uma partícula dopada, ou um ponto de quantum ou nanocristal.

Em qualquer modalidade particularmente preferida da presente invenção, o rótulo opticamente detectável é um fluoróforo. Como utilizado aqui, o termo “fluoróforo” se refere a qualquer molécula que apresenta a propriedade de fluorescência. Para fins da presente invenção, o termo “fluorescência” pode ser definido como a propriedade de uma molécula em absorver luz de um comprimento de onda específico e emitir novamente luz de um comprimento de onda mais longa. A mudança de comprimento de onda se refere a uma perda de energia que ocorre no processo. O termo “fluoróforo” pode abranger uma faixa de rótulos opticamente detectáveis como fluoróforos químicos e corantes bem como pontos de quantum.

Um rótulo particularmente conveniente, opticamente detectável que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção é embutir partículas fluorescentes de semicondutores. Essas partículas de rótulo, opticamente detectáveis, podem ser tão pequenas que suas propriedades e emissão se tornam dependentes de tamanho. Tais partículas de rótulo, opticamente detectáveis, são mencionadas na técnica como nanopartículas semicondutoras, pontos de quantum, fios de quantum, hastes de quantum ou nanocristais ou partículas-Q. Entretanto, como utilizado aqui, o termo “Ponto de quantum” ou “QD” deve ser entendido como abrangendo todas essas partículas. Além disso, rótulos opticamente detectáveis compreendendo QDs podem compreender partículas aproximadamente esferoidais ou esféricas, ou partículas esféricas ou esferoidais revestidas. Entretanto, o termo QD não deve ser considerado de modo algum como limitado a um formato esférico, esferoidal, circular, cilíndrico ou qualquer outra morfologia de um “ponto”. Por exemplo, como utilizado aqui QDs podem compreender também outras morfologias incluindo, dentre outras coisas, partículas semelhantes a haste, elipsoidal, ou semelhantes a haste revestida ou elipsoidal.

QDs consistem em um núcleo cristalino de escala de nanômetro de material semicondutor; versões biologicamente ativas são tipicamente circundadas por uma camada externa e invólucro de proteção. Por exemplo, QDs podem compreender cristalitos semicondutores que têm aproximadamente 2 nm a aproximadamente 30 nm de diâmetro e podem conter aproximadamente 50-500.000 átomos dentro do cristal, incluindo cristais luminescentes compreendendo materiais como ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, PbS, PbSe, PbTe, HgS, HgSe, HgTe, Si, ZnO.

QDs têm fluorescência com um espectro de absorção amplo e um espectro de emissão estreito. Ao contrário de alguns outros fluoróforos, que têm espectros de absorção distintos, QDs absorvem luz sobre uma faixa espectral ampla, que permite que pontos de quantum sejam excitados com uma faixa de fontes de luz, como lasers, lâmpadas de arco, ou LEDs. Além disso, uma coleção de QDs diferentes pode ser utilizada em aplicações de multiplex utilizando somente uma única fonte de excitação. Entretanto, os espectros de emissão para cada ponto são tipicamente muito estreitos, na ordem de aproximadamente 30 nm, a cor exata dependendo da composição e diâmetro de partícula. Além disso, o espectro de emissão estreito de QDs permite resolução espectral de pontos adjacentes. Além dos benefícios acima, QDs são também relativamente fotoestáveis, mesmo durante excitação intensa, e são mais brilhantes do que fluoróforos.

À luz do acima, deve ser também entendido que apresente invenção abrange o uso de QDs de tamanho diferente.

Além disso, a presente invenção considera QDs que são tratados com procedimentos como tratamento térmico, modificação superficial, formação de liga, passivação de superfície ou cobertura com revestimentos superficiais para permitir que o QD emita com rendimento de quantum elevado e melhore a fotoestabilidade por longos períodos de tempo.

QDs são também comercialmente disponíveis a partir de companhias como Quantum Dot Corp. (QDC), que produz QDs como o conjugado de estreptividina Qdot [marca registrada] 605, contendo um núcleo de cádmio-seleneto que emite em 605 nm. Conjugados de Qdot que emitem em 525, 565, 585, e 655 nm são também disponíveis. Entretanto, deve ser entendido que a presente invenção não é limitada de modo algum pela composição específica do QD (ou qualquer outro rótulo opticamente detectável) e qualquer QD (comercial ou de outro modo) pode ser compatível com a presente invenção.

Há também muitos corantes fluorescentes que estão disponíveis na técnica, que podem ser utilizados como fluoróforos de acordo com a presente invenção. Uma propriedade importante de um corante fluorescente ou outro fluoróforo, que determina seu potencial para uso é o comprimento de onda de excitação do fluoróforo; deve casar os comprimentos de onda disponíveis da fonte de luz. Entretanto, muitos corantes fluorescentes diferentes e outros fluoróforos serão familiares para aqueles versados na técnica, e a escolha de marcador fluorescente de modo algum limita a presente invenção. Corantes fluorescentes particularmente convenientes que podem ser utilizados para a rotulação de um substrato incluem aqueles discutidos acima com relação à rotulação do amplicon de PCR. Entretanto, ao escolher rótulos fluorescentes, os espectros de emissão do rótulo fluorescente, utilizados para o(s) agente(s) de ligação devem ser distintos do espectro de emissão do rótulo utilizado para o(s) amplicon(s).

Duas técnicas de tingimento são comumente utilizadas para rotular de forma fluorescente esferas e microesferas - tingimento interno e tingimento externo (rotulação de superfície). As duas técnicas produzem esferas com propriedades exclusivas, cada uma vantajosa para diferentes aplicações. Tingimento interno produz partículas extremamente estáveis com emissões de fluorescência tipicamente estreitas. Essas esferas freqüentemente exibem uma maior resistência a fotoalvejamento. Como o fluoróforo está no interior das esferas, grupos de superfície estão disponíveis para uso em conjugar ligandos (proteínas, anticorpos, ácidos nucléicos, etc.) com a superfície da esfera. Por esse motivo, as esferas internamente rotuladas são tipicamente utilizadas em aplicações de imunoensaio e detecção de analisado. Rotulação de superfície envolve conjugação do fluoróforo com a superfície da esfera. Como os fluoróforos estão na superfície da esfera, eles são capazes de interagir com seu ambiente exatamente com os fluoróforos em uma célula colorida. O resultado é um padrão de esfera que exibe as mesmas propriedades de emissão e excitação que amostras de células coloridas, sob uma variedade de condições diferentes, como a presença de esferaminantes ou alterações em pH. A natureza “responsiva de modo ambiental” de esferas rotuladas superficialmente torna as mesmas adequadas de forma ideal para simular amostras biológicas. Esferas externamente rotuladas são freqüentemente utilizadas como controles e padrões em diversas aplicações utilizando detecção de fluorescência. Entretanto, a presente invenção considera a associação de uma esfera com um rótulo fluorescente através de qualquer meio.

Os termos “esferas fosforescentes”, “esferas de fósforo” e “fósforos” são utilizados intercambiavelmente aqui. O que constitui um rótulo opticamente detectável fosforescente seria facilmente entendido por uma pessoa versada na técnica. Entretanto, como exemplo, que de modo algum limita a invenção, fósforos adequados incluem pequenas partículas de ZnS, ZnS:Cu, óxido Eu e outros fósforos utilizados em dispositivos de exibição.

Um rótulo opticamente detectável compreendendo uma “esfera dopada” pode incluir uma partícula que compreende quantidades ocultas de um ou mais íons de terras raras, como Eu, Y, Yb, Sm e similares.

Como utilizado aqui, o termo “rótulo opticamente detectável” deve ser entendido como também abrangendo múltiplos rótulos opticamente detectáveis, misturas de esferas opticamente detectáveis, nanocristais revestidos, ligas e outras misturas complexas que seriam evidentes para o técnico especializado. O uso de todos esses rótulos opticamente detectáveis deve ser considerado como estando compreendido no escopo dos métodos e agentes descritos aqui.

Além disso, o rótulo opticamente detectável do reagente pode compreender um rótulo opticamente detectável incorporado na seqüência de polinucleotídeos imobilizada que é ligada ou de outro modo associada à esfera, em vez de ser um rótulo diretamente associado à esfera por si.

As esferas são genericamente rotuladas pelo oligonucleotídeo de sonda ou “marcador” imobilizado. Esse marcador contém uma amina interna (NH2) que é então modificado por conjugação com um éster de succinimidila de um corante. No conjunto atual, o corante utilizado é BODIPY-TMR. Pela mistura de marcadores rotulados e não rotulados e então conjugação dessa mistura com as esferas, pode-se produzir classes de esferas com diferentes níveis do marcador fluorescente. As razões convenientemente utilizadas estão em uma série de 1:5x; isto é, as diferentes classes são produzidas pelo uso da razão de marcadores não rotulados : rotulados. Isso é genericamente exemplificado abaixo na Tabela 4.

Tabela 4 - Razão de marcadores não rotulados: rotulados

O rótulo opticamente detectável pode ser aplicado a uma esfera em uma faixa de concentrações ou intensidades, desse modo fornecendo outra base na qual esferas específicas podem ser “fisioquimicamente distinguíveis”. Por exemplo, se a intensidade detectável máxima do sinal de um opticamente detectável específico for considerada como sendo 100%, o rótulo pode ser aplicado em uma faixa de esferas para fornecer intensidades de 0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%.

Em uma modalidade particularmente preferida, o conjunto de esferas de reagentes compreende esferas de 3,0 μm, 3,5 μm, 4,1 μm, 5,0 μm, 5,6 μm, e 6,8 μm, onde as esferas com 3,0 μm, 3,5 μm, e 4,1 μm de diâmetro são rotuladas a 0% e 100%, as esferas com 5,0 μm de diâmetro são rotuladas em 0%, 100% e 20% e as esferas com 5,6 μm e 6,8 μm de diâmetro são rotuladas em 0%, 100%, 20% e 4%.

O componente de polinucleotídeo imobilizado do reagente, por exemplo, cXn, cY e /ou cZ pode ser ligado a uma esfera utilizando qualquer meio conveniente.

O polinucleotídeo imobilizado pode ser encapsulado em esferas durante sua produção ou pode ser ligado a sua superfície pós-produção. O método de escolha utilizado para associar o polinucleotídeo à esfera dependerá do material utilizado, como seria facilmente determinado pelo técnico especializado. Além disso, tratamentos adicionais, incluindo silanização (revestimento do substrato com silanos), podem ser executados nas esferas antes da fixação do polinucleotídeo para aumentar a ligação do polinucleotídeo com a esfera.

Genericamente, esferas podem ser revestidas com qualquer composto que fixará covalentemente, ou absorverá de outro modo, à superfície da esfera e, além disso, o reagente também deve ter uma fração química para a fixação de um polinucleotídeo, como um grupo de tiol, amina ou carboxila. Os exemplos de compostos com essas características incluem silanos amino-terminados como amino-propil trimetóxi silano ou amino-propil trietóxi silano. Além dos silanos, compostos como poli-L-lisina que se fixam não covalentemente à superfície de vidro e adsorvem eletrostaticamente os grupos de fosfato do polinucleotídeo estão também compreendidos no escopo da presente invenção. Portanto, outros compostos, incluindo outros silanos apropriados para a fixação de um polinucleotídeo a uma superfície seriam facilmente identificados pelo técnico especializado, e a presente invenção não é limitada pela escolha do composto.

O polinucleotídeo pode ser fixado à esfera utilizando qualquer meio convencional, tipicamente isso é feito por adsorção física ou ligação química. Além disso, as esferas podem ser adicionalmente revestidas com um agente que promove ou aumenta a adsorção ou ligação do polinucleotídeo à superfície da esfera, como amino-silanos. Entretanto, outros agentes que executam essa função serão facilmente identificados por pessoas versadas na técnica.

Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléico é ligada à esfera através do Sistema de Fixação universal (UAS) (marca registrada: Genera Biosystems).

Resumidamente, esse sistema envolve o uso de uma molécula de ácido nucléico de “ponte” para ligar uma seqüência de “marcador” de ácido nucléico no substrato com uma seqüência alvo. A seqüência de “ponte” é parcialmente complementar à seqüência de marcador e parcialmente complementar à seqüência alvo, de tal modo que a seqüência de ponte pode se ligar às seqüências tanto marcador como alvo e reter as mesmas em alinhamento de tal modo que as seqüências de marcador e alvo podem ser ligadas utilizando um ligase. O UAS também é comercialmente disponível e é descrito em detalhe em www.generabiosystems.com/generabiosystems/technology/UAS/. Entretanto, a presente invenção não deve ser considerada de modo algum limitada a esse método específico de ligar uma molécula de ácido nucléico a um substrato.

A determinação de se a ligação ocorreu entre um amplicon e um reagente pode ser feita utilizando qualquer metodologia que permita a localização de um rótulo de amplicon ligado a um reagente fisioquimicamente distinguível específico. Em uma modalidade particularmente preferida, citometria de fluxo é utilizada.

Citometria de fluxo pode ser definida como uma tecnologia para medir propriedades de partículas ou células à medida que se movem, ou fluem em suspensão líquida. Uma analogia pode ser feita com um item mais familiar de equipamento de laboratório, o microscópio, para descrever adicionalmente essa tecnologia. A maioria dos microscópios tem os seguintes componentes: Uma fonte de luz

O microscópio típico utiliza uma lâmpada para iluminar o objeto. No citômetro de fluxo, a fonte de luz é freqüentemente um laser. Lasers são utilizados porque fornecem um feixe muito concentrado e intenso de luz monocromática. O tipo monocromático da luz é especialmente importante para fazer medições de fluorescência. O estágio

Em um microscópio, o estágio é móvel para permitir passagem do objeto para o campo de visualização de uma lente objetiva. No citômetro de fluxo, as células ou partículas existem em suspensão líquida. O líquido flui em resposta à pressão de ar, passam por uma lente objetiva, desse modo carregando as células ou partículas através do campo de visualização. A lente

Tanto no microscópio como no citômetro de fluxo, a lente coleta luz a partir do objeto. Os filtros

Alguns microscópios têm filtros para selecionar aquelas características da luz que são mais importantes para o observador. Isso é particularmente verdadeiro em relação a microscópios de fluorescência. Em fluorescência, moléculas de corante são excitadas por luz de um comprimento de onda característico que então produzem luz emitida de um comprimento de onda mais longo. Os filtros removem a luz de excitação para permitir que a luz de emissão seja vista ou medida. Os detectores

Em um microscópio, o detector de luz é observador. O citômetro de fluxo utiliza detectores de luz altamente sensíveis denominados tubos fotomultiplicadores (PMT’s). Os detectores devem ser capazes de medir os flashes breves de luz emitida a partir de células ou partículas que estão se movendo uma de cada vez através do campo de visualização da lenta objetiva em velocidades de até vários milhares por segundo.

A maioria dos citômetros de fluxo pode medir tanto Dispersão de Luz como Fluorescência.

A figura 1 mostra os principais componentes de um modelo específico de citômetro de fluxo. Um tanque na parte inferior fornece um tampão que transporta as células ou partículas através do instrumento, enquanto um segundo tanque coleta todo fluido de refugo. A finalidade do fluido transportador (normalmente denominado fluido de revestimento) é puxar a suspensão para fora de modo que as células ou partículas passem em fila única através do feixe de laser.

O laser à esquerda, frontal, ilumina as células ou partículas que fluem para cima a partir do tubo de teste com um feixe azul. Dispersão de luz dianteira é coletada por uma lente em linha com o feixe de laser (o próprio feixe de laser é bloqueado por uma pequena barra opaca) e refletido sobre um detector de luz. Dispersão de luz lateral, e fluorescência, são coletadas por uma lente localizada em um ângulo reto com relação ao feixe de laser. O instrumento ilustrado pode medir três cores de fluorescência nas regiões verde, laranja e vermelha do espectro. As cores são separadas por filtros que refletem ou transmitem somente os comprimentos de onda desejados para os detectores apropriados.

Finalmente, todos os sinais eletrônicos a partir dos detectores são passados para um computador (não mostrado) que registra os mesmos e exige os resultados. Uma vez que todas as medições são feitas em cada célula simultaneamente, correlações entre as mesmas podem ser determinadas. Além disso, uma medição pode ser feita para selecionar um subconjunto de células para estudo utilizando outra medição. Por exemplo, é possível examinar tanto fluorescência como tamanho de partícula.

Em uma modalidade preferida, as esferas são detectadas e/ou separadas de acordo com o método da presente invenção utilizando citometria de fluxo. A presente invenção, entretanto, não é de modo algum limitada ao método ou aparelho de citometria de fluxo específico anteriormente descrito. Esse exemplo foi fornecido somente para fins ilustrativos, e a presente invenção não deve ser limitada a um instrumento ou método de acordo com o exemplo fornecido.

Utilizando citometria de fluxo, o tamanho de uma esfera dada pode ser determinado pela dispersão de luz do objeto.

A dispersão de luz é a interação de luz e matéria. Todos os materiais, incluindo esferas, dispersarão luz. É composto principalmente de luz que é refletida ou refratada. A posição a partir da qual um objeto é visualizado freqüentemente determina o que pode ser dito sobre ele. No citômetro de fluxo, detectores de dispersão de luz são normalmente localizados opostos ao laser (em relação à célula ou partícula), e para um lado do laser, em linha com a interseção de fluxo de fluido/feixe de laser. As medições feitas por esses detectores são denominadas dispersão de luz dianteira e dispersão de luz lateral, respectivamente.

A dispersão de luz dianteira provê algumas informações sobre o tamanho relativo de células ou partículas individuais, ao passo que a dispersão de luz lateral provê algumas informações sobre a granularidade relativa de esferas individuais. São freqüentemente utilizados em combinação para distinguir as categorias principais diferentes de células brancas em sangue de mamífero não separado, porém, são úteis em uma ampla variedade de outros ensaios também, como a determinação do tamanho de uma micropartícula.

Os presentes inventores determinaram que a citometria de fluxo é capaz de distinguir entre esferas com aproximadamente 3,0 μm, aproximadamente 3,5 μm, aproximadamente 4,1 μm, aproximadamente 5,0 μm, aproximadamente 5,6 μm, e aproximadamente 6,8 μm de diâmetro. Outras classes de esferas também podem ser distinguidas, como entre 5,0 e 5,6 e 5,6 e 6,8. Por conseguinte, os presentes inventores identificaram que citometria de fluxo pode diferenciar até pelo menos 6 tamanhos diferentes de esferas.

Além da detecção de tamanho, os citômetros de fluxo têm tipicamente um ou mais lasers e detectores para a detecção de fluorescência em uma amostra. Fluorescência é a propriedade de uma molécula em absorver luz de um comprimento de onda específico e emitir novamente luz de um comprimento de onda mais longo. A alteração de comprimento de onda se refere a uma perda de energia que ocorre no processo. É uma característica que torna a fluorescência extremamente útil: filtros podem ser utilizados para excluir a luz de excitação a partir do detector de luz ou do espectador. Desse modo, a única luz medida ou vista se origina do fluoróforo. A interferência de luz dispersa ou de fundo que atinge os detectores é extremamente baixa.

Há muitos corantes fluorescentes que são úteis para citometria de fluxo. Ligam-se uma variedade de componentes citoquímicos, como ácidos nucléicos; proteínas; receptores de membrana-célula, nuclear, e citoplásmicos específicos; moléculas de íons intracelulares; e muitos outros. Uma propriedade chave de um corante fluorescente que determina seu potencial para uso em um ensaio citométrico de fluxo é o comprimento de onda de excitação, isto é deve casar com os comprimentos de onda disponíveis da fonte de luz.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para diagnosticar uma infecção por um analisado patogênico em um sujeito, o método compreendendo: (i) obter uma amostra biológica a partir do sujeito que compreende, de forma putativa, o analisador patogênico; (ii) isolar o ácido nucléico da amostra; (iii) amplificar o ácido nucléico da amostra usando iniciadores que geram um amplicon que é distinto para o analisado ou uma cepa específica do analisado; (iv) opcionalmente amplificar uma seqüência de ácido nucléico de controle do sujeito; (v) efetuar opcionalmente rotulação do(s) amplicon(s) mencionados nas etapas (iii) e/ou (iv); (vi) hibridizar o(s) amplicon(s) rotulado a um conjunto de esferas de reagentes onde cada membro do conjunto de esferas compreende uma molécula de ácido nucléico tendo complementaridade com uma seqüência nucleotídica do analisado ou de uma particular cepa do analisado, ligada ou associada de outra forma com uma esfera distinguível fisioquimicamente; e (vii) determinar à qual dos reagentes um amplicon se ligou; onde a associação de um amplicon com um reagente particular é indicativa de uma infecção pelo analisado no sujeito.

Como utilizado aqui, o termo “sujeito” se refere a qualquer organismo que pode ser suscetível à infecção por outro analisado. Como tal, um “sujeito” inclui, porém não é limitado a animais, plantas, fungos e bactérias (que pode ser infectado por bacteriófago). Como utilizado aqui, o termo “animal” inclui preferivelmente um mamífero e mais preferivelmente um primata incluindo um primata inferior e ainda mais preferivelmente, um ser humano. Entretanto, o termo “animal” também especificamente inclui espécies de animais tais como gado, cavalos, ovelha, porcos, cabras e jumentos assim como animais de laboratório. Os exemplos de animais de teste de laboratório incluem camundongos, ratos, coelhos, porquinhos da índia e hamsters. Coelhos e animais roedores, como ratos e camundongos, fornecem um modelo de animal ou sistema de teste conveniente como o fazem os primatas e primatas inferiores. Animais não mamíferos como espécies aviárias, peixe-zebra, anfíbios (incluindo sapo- da-cana) e espécies de Drosophila como Drosophila melanogaster são também considerados.

O “sujeito” pode ser também um não animal como uma planta. O termo “planta” inclui, especificamente, plantas de valor agrícola como plantas de cereais (por exemplo, trigo, cevada, aveias, centeio, triticale e milho), arroz, árvores frutíferas (por exemplo, maçãs, bananas, mangas e laranjas), cana-de-açúcar, plantas de horticultura (por exemplo, batatas, cenouras e cebolas) e similares.

Entretanto, em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um método para diagnosticar infecção por HPV em um sujeito humano, o método compreendendo: (i) obter uma amostra biológica a partir do sujeito humano que compreende, de forma putativa, HPV; (ii) isolar o ácido nucléico da amostra; (iii) amplificar o ácido nucléico da amostra usando iniciadores que geram um amplicon que é distinto para o analisado ou uma cepa específica do analisado; (iv) opcionalmente amplificar uma seqüência de ácido nucléico de controle a partir do DNA genômico do sujeito humano; (v) efetuar opcionalmente rotulação do(s) amplicon(s) mencionados nas etapas (iii) e/ou (iv); (vi) hibridizar o(s) amplicon(s) rotulado(s) a um conjunto de esferas de reagentes onde cada membro do conjunto de esferas compreende uma molécula de ácido nucléico tendo complementaridade com uma seqüência nucleotídica de uma particular cepa de HPV, ligada ou associada de outra forma a um substrato distinguível fisioquimicamente; e (vii) determinar à qual dos reagentes um amplicon se ligou; onde a associação de um amplicon com um reagente particular é indicativa de infecção por HPV no sujeito humano.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção também considera um método para determinar o risco de um sujeito humano desenvolver uma doença associada a uma ou mais cepas de HPV, o método compreendendo: (i) obter uma amostra biológica a partir do sujeito humano que compreende, de forma putativa, HPV; (ii) isolar o ácido nucléico da amostra; (iii) amplificar o ácido nucléico da amostra usando iniciadores que geram um amplicon que é distinto para o analisado ou uma cepa específica do analisado; (iv) opcionalmente amplificar uma seqüência de ácido nucléico de controle a partir do DNA genômico do sujeito humano; (v) efetuar opcionalmente rotulação do(s) amplicon(s) mencionados nas etapas (iii) e/ou (iv); (vi) hibridizar o(s) amplicon(s) rotulado(s) a um conjunto de esferas de reagentes onde cada membro do conjunto de esferas compreende uma molécula de ácido nucléico tendo complementaridade com uma seqüência nucleotídica de uma particular cepa de HPV, ligada ou associada de outra forma a um substrato distinguível fisioquimicamente; e (vii) determinar à qual dos reagentes um amplicon se ligou; onde a associação de um amplicon com um reagente particular compreende um polinucleotídeo que é complementar a uma cepa de HPV associada a uma doença específica, é indicativa de um risco aumentado da doença no sujeito.

A rotulação dos amplicons como delineado na parte (v) é preferida. Conseqüentemente, tanto os amplicons como as esferas são rotuladas.

Doenças exemplares associadas a uma ou mais cepas específicas de HPV incluem aquelas apresentadas na Tabela 3. Por conseguinte, nesse aspecto, a presente invenção provê um método para diagnosticar um risco aumentado de um sujeito desenvolver uma doença específica por identificar especificamente qual cepa de HPV está infectando o sujeito. Em uma modalidade particularmente preferida, o método é adaptado para determinar o risco de um sujeito humano desenvolver câncer cervical.

A presente invenção considera ainda um kit de diagnóstico para uso de acordo com os métodos descritos aqui, incluindo diagnosticar infecção por HPV em um sujeito humano e/ou determinar o risco de um sujeito humano desenvolver uma doença associada a HPV, incluindo câncer cervical. O kit compreende um conjunto de esferas de reagentes que compreendem individualmente um polinucleotídeo que é complementar a uma seqüência de nucleotídeo de uma cepa específica de HPV, ligada ou de outro modo associada a um substrato fisioquimicamente distinguível. Opcionalmente, o kit também pode compreender iniciadores ligados a seqüências conservadas entre cepas diferentes de HPV, porém geram um amplicon que compreende seqüência de nucleotídeo distinta para cada cepa de HPV onde o amplicon gerado é complementar de forma putativa a um polinucleotídeo ligado a ou de outro modo associado a uma ou mais esferas fisioquimicamente distinguíveis do kit.

Em uma modalidade preferida, o conjunto de esferas de reagentes compreende pelo menos grupo de esferas, cada uma compreendendo um diâmetro de qualquer um entre aproximadamente 3,0 μm, aproximadamente 3,5 μm, aproximadamente 4,1 μm, aproximadamente 5,0 μm, aproximadamente 5,6 μm, e aproximadamente 6,8 μm. Em uma modalidade preferida adicional, cada grupo de tamanho de esferas compreende um ou mais subgrupos de microesferas cada um com um rótulo fluorescente em uma faixa de intensidades diferentes. Mais preferivelmente, o rótulo fluorescente é TMR e é aplicado em intensidades de aproximadamente 0%, aproximadamente 4%, aproximadamente 20% e aproximadamente 100%.

Em uma modalidade preferida adicional, o kit compreende os iniciadores GP5+ e GP6+ e opcionalmente iniciadores LC1_F e LC1_R.

O kit também pode ter a forma de um suporte, ou chip de fase sólida, comumente mencionado como um biochip. Todos ou parte dos reagentes utilizados no ensaio de subconjunto podem ser incorporados em um biochip ou miniaturizado em um nanoensaio. Embora citometria de fluxo seja particularmente útil em medir saídas do presente ensaio, o biochip pode ser utilizado para medir ou automatizar outros sinais como aqueles associados a ensaios de modo de galeria sussurrando.

Não obstante, intensidades fluorescentes ser um aspecto preferido do método de multiplexar, outras formas de identificação são abrangidas pela presente invenção.

Tal método alternativo inclui detecção de modo de galeria sussurrando (WGM). Nessa modalidade, um marcador fluorescente é incorporado em esferas de um subconjunto ou incorporado ou ligado a DNA na superfície das esferas. O marcador fluorescente pode excitar os WGMs com um laser ou fonte de luz branca não focalizada ou com fonte de luz branca não focalizada, filtrada.

WGMs permitem somente que certos comprimentos de onda de luz sejam emitidos a partir da partícula. O resultado desse fenômeno é que as faixas de emissão largas usuais (10-100 nm de largura) a partir, por exemplo, de um fluoróforo se tornam limitadas e parecem como uma série de picos agudos correspondendo eficazmente a padrões de modo estável de luz dentro da partícula. De acordo com a presente invenção, foi determinado que o perfil de WGM é extremamente sensível a alterações na superfície da partícula microesferoidal e que o perfil de WGM muda quando a partícula microesferoidal interage com analisados ou moléculas dentro de seu ambiente.

Por conseguinte, outro aspecto da presente invenção considera um método de detectar um analisado como um amplicon a partir de uma cepa de HPV compreendendo uma seqüência específica de cepa, o método compreendendo contatar pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra compreendendo de forma putativa, o analisado, em que cada partícula dentro de um conjunto de partículas microesferoidais compreende um rótulo opticamente detectável e um sócio de ligação putativo, imobilizado, do analisado (por exemplo, um iniciador ou sonda capaz de ligar, capturar, ou de outro modo imobilizar um amplicon a partir de uma cepa HPV) onde cada conjunto de partículas tem um perfil de WGM definido, onde a ligação do analisado com o sócio de ligação imobilizado resulta em uma alteração no perfil de WGM de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais que é indicativo da presença do analisado.

Os métodos da presente invenção podem ser aplicados para detectar modulação no perfil de WGM de uma partícula microesferoidal onde a modulação resulta de detecção de ligação ou outra associação de moléculas em uma amostra para ligação potencial de partículas imobilizadas na superfície da partícula microesferoidal. A detecção de reações de ligação entre um analisado e seu sócio de ligação com base em alterações sensíveis em perfis de WGM permite a identificação e isolamento dos analisados.

Uma característica da presente invenção é que as partículas microesferoidais podem ser excitadas com uma ampla gama de fontes de luz, facilitando a medição em muitos perfis de WGM diferentes.

Um “rótulo opticamente detectável” pode ser qualquer molécula, átomo ou íon que emite fluorescência, fosforescência e/ou incandescência. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o rótulo opticamente detectável é um fluoróforo, que pode abranger uma gama de rótulos opticamente detectáveis como fluoróforos químicos e corantes como também pontos de quantum.

Em uma modalidade específica, a presente invenção provê uma partícula microesferoidal compreendendo uma partícula de sílica ou látex que tem 1 μm a 100 μm de diâmetro, rotulado com um rótulo opticamente detectável, como um fluoróforo ou ponto de quantum, a partícula compreendendo ainda um sócio de ligação putativa de um analisado a ser detectado. Um exemplo é uma molécula de ácido nucléico de captura capaz de ligação com um amplicon de HPV gerado pela amplificação utilizando dois iniciadores para uma região conservada do genoma de HPV que flanqueiam uma região específica de cepa. O rótulo opticamente detectável é detectável em comprimentos de onda visíveis e a particular microesferoidal apresenta um ou mais perfis de WGM. Um ou mais dos perfis de WGM da particular microesferoidal detectavelmente modula quando analisados interagem com o sócio de ligação imobilizado na partícula. Qualquer tal alteração em perfil de WGM é indicativa da presença de um analisado que se ligou ao seu sócio de ligação.

A presente invenção é descrita adicionalmente pelos seguintes exemplos não limitadores:

EXEMPLO 1

Diagnóstico de HPV - isolamento de DNA e amplificação

Uma visão geral do protocolo de extração de DNA utilizado para isolar DNA para o método de diagnóstico de HPV é mostrado na figura 2.

Como mostrado na figura 3, PCR foi utilizado para amplificar a amostra de DNA. Os iniciadores GP5+ e GP6+ foram utilizados para gerar um amplicon para qualquer cepa de HPV que estava presente na amostra de DNA. O iniciador GP6+ compreendia um rótulo fluorescente, especificamente Cy5 para permitir visualização posterior da ligação de amplicon com os agentes de ligação. Os amplicons virais gerados compreendiam tanto uma região conservada (Y) que é conservada entre todas as cepas de HPV examinadas e uma região que é variável (isto é, específica à cepa) entre cepas de HPV, Xn, onde n representa uma região variável associada a cada cepa de HPV. Os sócios de ligação imobilizados nas esferas se ligam especificamente ao genoma específico de cepa de HPV.

Além disso, um amplicon do DNA genômico de sujeito humano também foi gerado utilizando os iniciadores LC1_F e LC1_R para servir como controle. Nesse caso, o iniciador LC1_R também transportou um rótulo Cy5.

EXEMPLO 2

Diagnóstico de HPV - Detecção multiplex

Os amplicons gerados no Exemplo 1 foram hibridizados a um conjunto de agentes de ligação, cada um contendo um polinucleotídeo que é complementar à região variável do amplicon viral putativo gerado de cada uma das cepas de HPV c, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 42, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 67 e 68 (X1 até X16). Vide a figura 9 para as seqüências de nucleotídeo dos ácidos nucléicos de captura imobilizados para as esferas. Além disso, o conjunto compreende um agente de ligação que compreende um polinucleotídeo o qual é complementar à região conservada dos amplicons virais de HPV (Y). Finalmente, um agente de ligação compreendendo um polinucleotídeo que é complementar à seqüência do amplicon de controle humano é incluído. O ácido nucléico de captura pode ser DNA ou RNA. Se RNA for utilizado, uma transcriptase reserva pode ser necessária para gerar RNA a partir do amplicon de DNA.

Cada um dos agentes de ligação no conjunto compreende uma microesfera ou esfera com um tamanho distinto e intensidade distinta de rótulo fluorescente (TMR). Esferas compreendendo diâmetros de 3,0 μm, 3,5 μm, 4,1 μm, 5,0 μm, 5,6 μm, e 6,8 μm podem ser diferenciadas entre si utilizando citometria de fluxo, como mostrado na figura 4.

Para cada tamanho dado de microesfera, um rótulo fluorescente (TMR) foi incorporado em intensidades relativas de 0%, 4%, 20% e 100%. Essas intensidades de rótulo poderiam ser claramente distinguidas utilizando citometria de fluxo como mostrado na figura 5. Uma máquina para ler as intensidades é mostrada na figura 1.

A figura 6 é um diagrama esquemático mostrando cada um dos agentes de ligação utilizados no conjunto. Como pode ser visto, o conjunto utilizando microesferas compreendendo diâmetros de 3,0 μm, 3,5 μm, 4,1 μm, 5,0 μm, 5,6 μm, e 6,8 μm e intensidades de sinal de rótulo fluorescente de 0%, 4%, 20% e 100%. Entretanto, no caso dos tamanhos de esfera menores, poucas classes de intensidade de sinal foram utilizadas. A figura 7 mostra como cada um desses agentes de ligação é distinguido com base tanto em tamanho como em intensidade de rótulo fluorescente.

A figura 8 mostra a associação de amplicons ligados com três agentes de ligação específicos no conjunto. Nessa figura, um amplicon é mostrado se ligando ao controle de DNA humano (Z), a seqüência conservada viral (Y) e a seqüência variável viral X7, que é indicativa da presença de cepa HPV 18 na amostra.

EXEMPLO 3

Comparação do método de detecção multiplex com diagnóstico de HPV tradicional

A Tabela 5, abaixo, provê uma visão geral comparando o método de detecção de HPV multiplex da 5 presente invenção com o método histológico atual para diagnóstico de HPV Tabela 5 Comparação de métodos de diagnóstico de HPV

EXEMPLO 4

Detecção de HPV em amostras humanas

As figuras 10a até G fornecem exemplos onde HPV é detectado ou sua ausência observada em amostras humanas.

Aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção descrita aqui é suscetível a variações e modificações diferentes daquelas especificamente descritas. Deve ser entendido que a invenção inclui todas essas variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos mencionados ou indicados nesse relatório descritivo, individual ou coletivamente, e todas e quaisquer combinações de quaisquer duas ou mais das etapas ou características.

BIBLIOGRAFIA

Bonner e Laskey, Eur. J. Biochem. 46:83, 1974 Chadwick e outros, J. Virol. Methods 70:59-70, 1998 Chan e Fox, Ver. Med. Microb. 10:185-196, 1999 Compton, Nature 350:91-92, 1991 Demidov e Broude (Eds.), “DNA amplification: current technologies and applications”, Horizon Bioscience, 2004 Gearhart e outros, www.emedicine.com/MED/topic1037.htm, 2004 Guatelli e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874 - 1878, 1990 Hill, J. Clin. Ligand Assay 19: 43 - 51, 1996 Kievits e outros, J. Virol. Methods, 35:273-286, 1991 Kuske e outros, Appl. Environ. Microbiol. 64(7):2462-2472, 1998 Lizardi e outros, Biotechnology 6:1197-1202, 1988 Lyamichev e outros, Nat. Biotechnol. 17:292-296, 1999 Marmur e Doty, J. Mol. Biol. 5:109, 1962 Nelson e Krawetz, Anal. Biochem. 207(1):97 - 201, 1992 5 Pawlotsky e outros, J. Virol. Methods 79:227-235, 1999 Ryan e outros, Mol. Diagn. 4:135-144, 1999 Speel, Histochem. Cell Biol. 112:89-113, 1999 Todd e outros, J. AIDS Hum. Retrovirol. 10:S35- 10 S44, 1995

Claims (11)

1. Conjunto de esferas para detectar uma cepa de HPV e/ou para diferenciar entre duas ou mais cepas de HPV, caracterizado pelo fato de que o conjunto de esferas compreende uma pluralidade de subconjuntos de esferas específicos para cepa de HPV em que: (a) as esferas de cada subconjunto são homogêneas no tocante a tamanho; (b) as esferas em cada subconjunto específico de cepa de HPV são ligados quimicamente a uma sonda de captura de ácido nucléico que é capaz de se ligar a uma região específica de cepa de HPV de um genoma de HPV;(b) as esferas em cada subconjunto específico de cepa de HPV são ligadas quimicamente a uma sonda de captura de ácido nucléico que é capaz de se ligar a uma região específica de cepa de HPV de um genoma de HPV; (c) cada subconjunto de esferas sendo distinguível por diferenças mensuráveis em tamanho de esfera, presença ou ausência de um rótulo opticamente detectável, e intensidade de um rótulo opticamente detectável, em que o rótulo opticamente detectável é fornecido na sonda de captura em cada esfera; e (d) ao menos dois subconjuntos de esferas, com uma sonda de captura de ácido nucléico selecionada da lista consistindo nas SEQ ID Nos: 5 até 20, são misturados juntas para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade de subconjunto e, portanto, a cepa de HPV é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade do rótulo e discriminação de sequência.

2. Conjunto de esferas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os marcadores rotulados e não rotulados são misturadosdas sondas rotuladas e não rotuladas serem misturadas em razões diferentes e conjugados com as esferas.

3. Conjunto de esferas, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cepa de HPV é selecionada entre as cepas 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.

4. Conjunto de esferas, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a cepa de HPV é selecionada entre 6, 11, 31 e 33.

5. Conjunto de esferas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende 16 subconjuntos específicos para cepas de HPV, cada um com uma sonda de captura de ácido nucléico selecionada da lista que consiste em SEQ ID NOS: 5 até 20.

6. Conjunto de esferas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os tamanhos de esfera são selecionados do grupo que consiste em 3,0 μm, 3,5 μm, 4,1 μm, 5,0 μm, 5,6 μm, e 6,8 μm.

7. Conjunto de esferas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as esferas são rotuladas com um fluorocromo selecionado do grupo que consiste em hidróxi cumarina, amino cumarina, metoxiciumarina, azul cascada, amarelo Lucifer, NBD, Ficeritin (PE), PerCP, aloficocianina, hoechst 33342, DAP1, SYTOX Azul, hoescht 33258, cromomicina A3, mitramicina, YOYO-1, SYTOX Verde, SYTOX laranja, 7-AAD, acridina laranja, TOTO-1, To-PRP-1, tiazol laranja, TOTO-3, TO-PRO- 3, LDS 751, corantes Flúor Alexa incluindo Alexa Fluro-350, -430, -488, -532, -546, -555, -556, -594, -633, -647, -660, -680, -700 e -750; corantes BoDipy, incluindo BoDipy 630/650 e BoDipy 650/665; corantes CY, particularmente Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 e Cy7; 6-FAM (Fluoresceína); PE-Cy5, PE-CY7, Fluoresceína dT; Hexaclorofluoresceína (Hex); 6- carboxi-4’, 5’-dicloro-2’, 7’-dimetoxifluoresceína (JOE); corantes Oregon verde, incluindo 488-X e 514; corantes rodamina, incluindo X-rodamina, Lisamina, Rodamina B, Rodamina Verde, Rodamina Vermelha e ROX; TRICTC, Tetrametilrodamina (TMR); Carboxitetrametilrodamina (TAMRA); Tetraclorofluoresceína (TET); Vermelho 6B, FluorX, BODIPY-FL e Vermelho Texas.

8. Método para preparar o conjunto de esferas, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de compreender selecionar uma pluralidade de subconjuntos de esferas, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7: em que ao menos dois subconjuntos de esferas são misturados juntos para produzir um conjunto de esferas, onde a identidade de subconjunto e, portanto, a cepa de HPV é identificável por citometria de fluxo baseada em tamanho, intensidade do rótulo e discriminação de sequência.

9. Método para diagnosticar infecção por HPV em um sujeito humano caracterizado por compreender: (i) isolar o ácido nucléico de uma amostra de um sujeito humano que compreende HPV de forma putativa; (ii) amplificar o ácido nucléico da amostra usando iniciadores que geram um amplicon que é distinto para o dito analisado ou uma cepa específica do analisado; (iii) opcionalmente amplificar uma seqüência de ácido nucléico de controle a partir do DNA genômico do sujeito humano; (iv) efetuar rotulação do(s) amplicon(s) mencionado(s) nas etapas (ii) e/ou (iii); (v) hibridizar o(s) amplicon(s) rotulado(s) para um conjunto de esferas, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; e (vi) determinar à qual dos reagentes um amplicon se ligou; onde a associação de um amplicon com um reagente particular é indicativa de infecção por HPV no sujeito humano.

10. Uso do conjunto de esferas, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um agente de diagnóstico para diagnosticar HPV e/ou para diferenciar entre duas ou mais cepas de HPV.

11. Método para detectar e/ou para diferenciar entre duas ou mais cepas de HPV particulares em uma amostra biológica, o método caracterizado por compreender as etapas de: (i) isolar o ácido nucléico de uma amostra biológica de um sujeito humano que compreende HPV de forma putativa; (ii) amplificar o ácido nucléico da dita amostra usando iniciadores que geram um amplicon que é distinto para cada cepa de HPV; (iii) opcionalmente amplificar uma sequência de ácido nucléico de controle; (iv) efetuar rotulação do(s) amplicon(s) mencionado(s) nas etapas (ii) e/ou (iii); (v) hibridizar o(s) amplicon(s) rotulado(s) a um conjunto de esferas, conforme definido em qualquer uma das 5 reivindicações 1 a 7; e (vi) determinar a qual dos reagentes um amplicon ligou-se; em que a associação de um amplicon com um reagente particular é indicativa da presença de uma cepa de 10 HPV particular na amostra.

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