BRPI0108882B1 - combinação farmacêutica - Google Patents

Abstract

"combinação farmacêutica, composição farmacêutica, e, uso da dita combinação". a presente invenção diz respeito à medicina humana e, em particular, a uma combinação farmacêutica do fator de crescimento epidérmico (egf) com um peptídeo mimético do fator de liberação do hormônio do crescimento (ghrp), que é útil na prevenção e/ou restauração da lesão tecidual causada pela irrigação sangüínea deficiente de um órgão determinado, devida a diferentes condições patológicas. a mencionada combinação pode ser usada dentro da mesma composição farmacêutica ou aplicada separadamente a um mesmo paciente como parte de um tratamento único que favoreça a vitalidade celular nos órgãos quando estes sejam submetidos a perda parcial ou total no suprimento de sangue oxigenado durante um período de tempo. esta combinação também atenua a formação de espécies tóxicas e metabólitos nos referidos órgãos, o que é particularmente útil aos tecidos submetidos a prolongados períodos de isquemia. a combinação farmacêutica pode ser aplicada, além disso, para fins profiláticos, a pacientes com condições que possam conduzir à disfunção ou lesão múltipla de órgãos de várias origens, como queimaduras, politraumatismos, síndrome da angústia respiratória, neonatos hipóxicos, choque hipovolêmico, enterocolite necrotizante, assim como a pacientes submetidos a grandes intervenções cirúrgicas.

Description

“COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA” A presente invenção diz respeito à medicina humana e, em particular, a uma combinação farmacêutica do Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) com um peptídeo mimético do Fator de Liberação do Hormônio do Crescimento (GHRP), que é útil na prevenção e/ou restauração da lesão tecidual causada pela irrigação sanguínea deficiente de um órgão determinado, devida a diferentes condições patológicas.

Todos os órgãos e tecidos de animais ou seres humanos são suscetíveis a lesões letais irreversíveis como conseqüência da insuficiência parcial ou total do fornecimento de sangue arterial ou de falha da drenagem venosa. Em tais casos, desencadeia-se uma cascata de eventos fisiopatológicos, cuja expressão final é freqüentemente a morte celular, que irrevogavelmente compromete a função do órgão o a vida do paciente. A formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) é um constituinte fisiopatológico de numerosos processos que ocorrem com estados de hipoperfusão hística, isquemia-reperfusão ou inflamação (peritonite, pancreatite etc.), assim como grandes traumas, queimaduras, hipovolemia aguda e em procedimentos cirúrgicos de revascularização e transplante de órgãos. No processo de isquemia-reperfusão manifesta-se a importância das EROs e a peroxidação dos lipídeos das membranas nos referidos processos patológicos (T. D. Lucas e I. L. Szweda. Cardiac reperfusion injury: ageing, lipidperoxidation and mitochondrial dysfunction. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1998, 95 (2): 510-514). A conseqüência imediata mais importante da isquemia é a depleção da ATP celular (Bums, T. A., Davies, R. D., McLaren, J. A., Cerundolo, L., Morris, J. P., Fuggle, V. S. Apoptosis in ischemia/reperfusion injury ofhuman renal allografts, Transplantation. 1998, 66 (7): 872-876).

Durante o processo isquêmico, as reservas de ATP são degradadas em hipoxantina e logo em xantinas, que constituem substratos da xantina oxidase (XO). A entrada abrupta de abundante quantidade de oxigênio durante a reperfusão, provoca a oxidação das purinas geradas durante a isquemia em uma reação catalisada pela XO, processo principalmente responsável pela geração de ânion superóxido e peróxido de hidrogênio na fase de reperfusão (Paller, M. S., Hoidall, J. R., Ferris, J. E. Oxygen free radicais in ischemic acute renal failure in the rat. J. Clin. Invest. 1994, 74: 1156-1164).

Outros dois eventos básicos contribuem para a formação das EROs e para complicar a hemodinâmica da microvasculatura; estes são: a ativação das células endoteliais e o recrutamento/aderência intravascular de neutrofilos circulantes (Redl, H., Gasser, H., Hallstrom, S., Schiag, G. Radical related cell injury. In Pathobiology of shock, sepsis and organ failure. G. Schiag, H. Redl, editores. Springer-Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1993,92-110).

As células endoteliais da microvasculatura superexpressam marcadores pró-inflamatórios que incluem as citoquinas pró-inflamatórias, as quimiocinas, os fatores pró-coagulantes e agentes vasoativos (Ledebur, H. C., Parks, T. P. Transcriptional regulation of the intracellular adhesion molecule 1 gene by inflammatory cytokines in human endothelial cells: essential roles of a variant NF-kB site and p65 hornodimers. J. Biol. Chem. 1995, 270: 933-943).

As EROs são responsáveis pela ativação do NF-kB nas células inflamatórias infiltrantes (Conner, E. M., Brand, S. J., Davis, J. M., Kang, D. Y., Grisham, Μ. B. Role of reactive metabolites of oxygen and nitrogen in inflammatory bowel disease: toxins, mediators, and modulators of gene expression. Inflamm. Bowel Dis. 1996, 2: 133-147), enquanto a infiltração dos tecidos hipóxicos por neutrófilos ativa o sistema da enzima mieloperoxidase (MPO), o qual incrementa de modo significativo a lesão celular (Kurose, I., Argenbright, L. W., Wolf, R., Lianxi, L., Granger, D. N. Ischemia/reperfusion-induced microvascular dysfunction: role of oxidants and lipid mediators. Am. J. Physiol. 1997, 272: H2976-H2982). Neste ambiente hostil, a parede endotelial acaba prejudicada, são ativados os mecanismos trombogênicos locais e falha a microcirculação, o que resulta no agravamento do processo de base pela cascata de amplificação das lesões que são produzidas. A consequência biológica mais importante da hipoxia ou anoxia pela isquemia, é a inviabilidade parcial ou total de um tecido ou órgão. A morte celular neste evento ocorre por necrose e/ou apoptose. Estas formas de morte celular podem coexistir em um mesmo tecido e na mesma situação topográfica (Tredger, M. J. Ischaemia-reperfusion injury of the liver: treatment in theory and practice. Biofactores 1998, 8 (1-2): 161-164). A viabilidade dos tecidos depende também de fatores relacionados com a integridade do endotélio (Collard, D. C., Agah, A., Stahl, L. G. Complement acíivation following reoxigenetion of hypoxic human endothelial cells: role of intracellular reactive oxygen species, NF-kappaB and new protein synthesis. Immunopharmacology 1998, 39 (1): 39-50). Os fenômenos relacionados com a hiper-reatividade do endotélio e das células inflamatórias, e a conseqüente liberação de óxido nítrico, citoquinas e agentes pró-inflamatórios, bem como de substâncias modificadoras do tônus vascular e da hemodinâmica, constituem componentes etiopatogênicos da síndrome de resposta inflamatória sistêmica e da disfunção múltipla de órgãos (Kowal-Vem, A., McGill, V., Gamelli, R. L. Ischemic necrotic bowel disease in thermal injury. Archives ofSurgery 1997, 132 (4): 440-443). A enfermidade por queimadura, o choque hipovolêmico, os politraumas, são entidades freqüentes em urgências médicas e o maior desafio quanto ao cuidado intensivo e intervenção multidisciplinar que se requer para salvar a vítima. No paciente de queimadura, por exemplo, o evento de isquemia-reperfusão do intestino delgado parece ser o responsável pela instauração da síndrome de resposta inflamatória sistêmica (Wang, P., Ba, Z. F., Cioffi, W. G., Bland, K. I. e Chaudry, I. H. Is gut the “motor”for producing hepatocellular dysfunction after trauma and hemorrhagic shock? Journal of Surgical Research 1998, 74: 141-148). O fracasso da função intestinal de obstrução tem especial significado clínico por ser este órgão o limite entre um lúmen séptico / tóxico e o meio interno (Sheridan, R. L., Ryan, C. M., Yin, L. M., Hurley, J., Tompkins, R. G. Death in the burn unit. Sterile multiple organ failure. Burns 1998, 24 (4): 307-311). Observações clínicas e experimentais têm demonstrado a importância que tem a preservação de uma perfusão adequada e do trofismo da mucosa intestinal, para a conservação de sua integridade (Tabata, T., de Serres, S., Meyer, A. A. Differences in IgM synthesis to gut bacterial peptidoglycan polysaccharide after burn injury and gut ischemia. Journal of Burn Care and Rehabilitation 1996, 17 (3): 231-236). Evidências recentes consideram o intestino como um órgão gerador de citoquinas e ao que parece a resposta inflamatória local ou sistêmica pode ser desencadeada inclusive na ausência de bactérias na circulação. A disfimção múltipla de órgãos constitui a primeira causa de morte em pacientes submetidos a cuidados intensivos e é a maior complicação do paciente de queimadura, provocando até uns 70% de mortalidade em unidades especializadas.

Com o objetivo de reduzir a morte celular em processos de isquemia-reperfusão de alguns órgãos, uma ampla gama de compostos naturais ou sintéticos, purificados ou recombinantes, tem sido ensaiada a nível pré-clínico e, em alguns casos, chegou-se até as fases clínicas. Para o caso particular da isquemia intestinal, foram ensaiados experimentalmente inibidores da angiotensina II (Tadros, T., Taber, D. L., Heggers, J. P., Hemdon, D. N. Angíotensin II inhibitor DuP753 attenuates burn and endotoxin-induced gut ischemia, lipid peroxidaíion, mucosal permeability and bacterial translocation. Ann. Surg. 2000; 231: 566-576), antagonistas do fator ativador de plaquetas (Sun, Z., Wang, X., Deng, X., Lasson, A., Soltesz, V., Boijesson, A., Andersson, R. Beneficiai effects of lexipafant, a PAF aníagonist on gut barrier dysfunction caused by intestinal ischemia and reperfusion in rats. Dig. Surg. 2000; 17: 57-65), estimulantes da produção de óxido nítrico (Ward, D. T., Lawson, S. A., Gallagher, C. M., Conner, W. C., Shea-Donohue, D. T. Sustained nitric oxide production via L-arginine administration ameliorates effects of intestinal ischemia-reperfusion. J. Surg. Res. 2000; 89: 13-19), bem como agentes antioxidantes como o alopurinol, e em combinação com as vitaminas C e E (Kacmaz, M., Otzurk, H. S., Karaayvaz, M., Guven, C., Durak, I. Enzymatic antioxidant defense mechanism in rat intestinal tissue is changed after ischemia-reperfusion. Effects of allopurinol plus antioxidant combination. Can. J. Surg. 1999; 42: 427-431). Não obstante, as estratégias orientadas para estimular os mecanismos naturais de autoproteção celular são escassas (Pialli,S. B., Hinmn, C. E., Luquette, Μ. H., Nowicki, P. T., Besner, G. E. Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor protects rat intestine from ischemia I reperfusion injury.J. Surg. Res. 1999; 87: 225-231). A grave deterioração morfofimcional que sofre os rins diante da isquemia, tem determinado a avaliação do efeito nefroprotetor de alguns agentes sintéticos como os denominados lazaróides, que, em geral, parecem mitigar as lesões e a disfunção renal de pós-reperfusão (De Vecchi, E., Lubatti, L., Beretta, C., Ferrero, S., Rinaldi, P., Galli, K. M., Trazzi, R., Paroni, R. Protection from renal ischemia-reperfusion injury by the 2-metilaminochroman U83836. Kidney Int. 1998, 54: 857-863). Outros estudaram o efeito potencial nefroprotetor da administração da teofílina como agente antagonista dos receptores da adenosina (Jenik, A. G., Ceriani, J. M., Gorenstein, A., Ramirez, J. A., Vain, N., Armadans, M., Ferraris, J. R.

Randomized, double-blind, placebo-controlled trial of the effect of theophyline on renal function in term neonates with perinatal asphyxia. Pediatrics 2000; 105: E45). A administração do peptídeo natriurético atrial (Auriculin) não reduziu a mortalidade em pacientes afligidos de insuficiência renal aguda de origem isquêmica, como tampouco reduziu o número de complicações em órgãos distantes (Weisberg, L. S., Allgren, R. L., Genter, F. C., Kumik, B. R. Cause of acute tubular necrosis affects its prognosis. The Auriculin Anaritide Acute Renal Failure Study Group. Arch. Intern. Med.\ 1997; 157: 1833-1839). Um efeito neffoprotetor devido à sua atividade biológica intrínseca foi descrito ao se administrar uma elevada dose da enzima superóxido dismutase (SOD) em pacientes receptores de aloenxertos renais (Schneeberger, H., Schleibner, S., Illner, W. D., Messmer, K., Land, W. The impact of free-radical mediated repefusion injury on acute and chronic rejection events following cadaveric renal transplantation. Clin. Transpl. 1993; 219-232).

Um efeito benéfico da administração sistêmica do fator de crescimento epidérmico (EGF) e do fator de crescimento transformador do tipo alfa (TGF-α) no tratamento de insuficiência renal aguda de origem isquêmica e tóxica, foi ilustrado no documento de patente U.S. 5.360.790.

Mesmo que a administração parenteral de fatores de crescimento com efeito neffoprotetor tenha sido com freqüência bem sucedida em modelos experimentais de insuficiência renal isquêmica, não foram obtidos resultados animadores na ordem clínica. Em um ensaio multicêntrico encaminhado para avaliar a eficácia da administração do fator de crescimento insulinóide I (IGF-I) em pacientes com insuficiência renal aguda, incluído o de etiologia isquêmica, não foi demonstrada eficácia com relação ao grupo tratado com o placebo (Hirschberg, R., Kopple, J., Lipsett, P., Benjamin, E., Minei, J., Albertson, T., Munger, M., Meztler, M., Zaloga, G., Murray, M., Lowry, S. et al. Multicenter clinicai trial of recombinant human insulin-like growth factor I in patients with acute renal failure. Kidney Int. 1999; 55: 2423-2432). Em outro ensaio clínico independente para a mesma condição renal, empregando IGF-1 novamente, o tratamento não apresentou a eficácia esperada e o estudo foi interrompido antes de sua conclusão (Kopple, J. D., Hirschberg, R., Guler, Η. P., Pike, M. e o Chiron Study Group: lack of effect of recombinant human insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in patients with acute renal failure (ARF). J. Am. Soc. Nephrol. 1996; 7: 1375).

As limitadas possibilidades técnicas alcançadas até o presente para a conservação adequada dos órgãos e tecidos, constituem a primeira restrição de disponibilidade e acesso a novos órgãos. Outra complicação reside no fato de que alguns agentes empregados para a conservação ex-vivo dos órgãos tenham apresentado efeitos contraditórios (Schlumpf-R; Candinas-D; Weber-M, Rothlin-M; Largiader-F. Preservation of kidney transplants with a modified UW solution initial clinicai results. Swiss-Surg. 1995(4): 175-180; debate 180-1); e ainda a deterioração do órgão ao ser implantado no receptor constitui a primeira causa do fracasso do transplante imediatamente após o tratamento com imunossupressores (Barber, E., Menéndez, S., León, O. S., Barber, M. O., Merino, N., Calunga, J. L., Cruz, E. e Bocci, V. Prevention of renal injury after induction of ozone tolerance in rats submitted to warm ischemia. Mediators of Inflammation 1999; 8: 37-41). Outra contrapartida aos métodos atuais para a conservação de órgãos reside em sua interferência com os mecanismos de agregação plaquetária, o que se associa aos sangramentos profusos (Salat, A., Mueller, M. R., Boehm, D., Stangl, P., Pulaki, S., Laengle, F. Influence oflJWsolution on in vitro platelet aggregability Transpl-Int. 1996; 9 Supl. 1: S429-431). Uma restrição, até o presente, no transplante de alguns órgãos, é o vasospasmo e a trombose no órgão pós-reperfundido (Jeng-LB, Lin-PJ, Yao-PC, Chen-MF, Tsai-KT, Chang-CH. Impaired endothelium-dependent relaxation of human hepatic aríeries afíer preservation with the University of Wisconsin solution. Arch-Surg. janeiro de 1997; 132(1): 7-12). Em resumo, ainda que não se disponha de métodos ou formulações para garantir uma efetiva proteção celular diante da isquemia, sendo muitos destes agentes altamente dispendiosos e pouco eficazes (Rentsch, M., Post, S., Palma, P., Gonzalez, A. P., Menger, M. D., Messmer, K. Intravital studies on beneficiai effects of warm Ringer’s lactate rinse in liver transplantation. Transpl.-Iní. 1996; 9(5): 461-467). O fracasso destes ensaios clínicos com IGF-1 na nefroproteção isquêmica alimentou a hipótese de que a administração de um único fator de crescimento é incapaz de prevenir ou atenuar os lesões conseqüentes do evento isquêmico, enquanto se tenha enfatizado na necessidade de formulações combinadas de diferentes peptídeos com efeito protetor (Playford, R. J. Peptides and gastrointestinal mucosa integrity. Gut 1995, 37: 595-597). A prevenção exercida pela administração sistêmica do fator de crescimento epidérmico (EGF) contra as lesões teciduais que se seguem ao episódio isquêmico foi descrita anteriormente na patente européia numero EP 0 357240 Bl. Não obstante, referido efeito de neuroproteção exercido pela referida molécula só se obtém com doses tão elevadas quanto 1 mg/kg. Uma dose inferior (de 0,1 mg/kg) ainda é alta, e seu efeito terapêutico de proteção é considerado reduzido pelos inventores. Isso impõe várias restrições à referida invenção, a primeira pelo elevado custo do tratamento, levando em conta que o efeito é alcançado com injeções repetidas (entre 4 e 5 administrações em diferentes períodos de um modelo animal). Isto significa que um ser humano adulto com um peso médio de 70 kg, consumiría 70 mg do agente ativo em uma só inoculação, a qual não seria clinicamente eficaz. A segunda restrição da invenção é do tipo farmacológico. Os exemplos apresentados (limitam-se apenas à neuroproteção central) evidenciam uma estreita janela terapêutica do EGF para o efeito neuroprotetor desejado, isto é, não chega a estabelecer-se uma dose média eficaz (ED50), enquanto a margem terapêutica é tão estreita que não permite que o inventor estabeleça uma curva de dose-resposta. Uma terceira restrição se relaciona com o risco de toxicidade a que se expõe o paciente com a dose de 1 mg/kg, entre outros riscos, sabe-se que elevadas doses de EGF reduzem o ritmo cardíaco, alteram a hemodinâmica central (Keiser, J. A., Ryan, N. J. Hemodynamic effect of EGF in conscious rats and monkeys. PNAS USA 1996; 93(10): 4957-4961), e podem inibir o ciclo celular (Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. Am. J. Surg. 1993, 165: 728-737). Finalmente, a eficácia da invenção é questionável por causa da incapacidade do EGF e de outros fatores de crescimento polipeptídicos de atravessar a barreira hemato-encefálica. O efeito protetor potencial de uma intervenção profilática pré-isquêmica com EGF em episódios de isquemia parcial ou total, seguida por reperfusão no intestino delgado e no fígado, parece não ter sido estabelecido.

Estudos precedentes demonstraram que a administração parenteral de EGF exerce um efeito protetor em diferentes tecidos e órgãos internos contra a lesão produzida pela interrupção abrupta do fluxo sanguíneo arterial. De forma semelhante, foi demonstrado certo efeito de proteção em alguns órgãos internos de animais expostos a substâncias químicas cujo mecanismo de ação envolve a interrupção da síntese de ATP e a formação de EROs. Esta observação permitiu atribuir ao EGF um efeito antioxidante. A administração repetida de EGF logo após estabelecida a lesão tecidual provocada por isquemia local ou por agentes tóxicos, favorece a regeneração morfológica e, em certas ocasiões, funcional em alguns tecidos de forma parcial. Não obstante, tanto o efeito de proteção profilática quanto de regeneração somente se observam quando o fator é administrado em doses elevadas e ainda com uma reduzida margem terapêutica. Para alguns órgãos más sensíveis à isquemia, como os rins, os efeitos protetores de tais doses são reduzidos. O efeito de proteção descrito para o EGF é observado apenas se o tempo de isquemia for menor do que 60 minutos. Em períodos de isquemia mais prolongados, nao e detectado o efeito de proteção. Esta constitui uma situação restritiva para o uso do EGF por si só como agente protetor no episódio de isquemia-reperfusão, enquanto na prática médica esta janela de eficácia temporal é pouco útil. Em outra posição, o estímulo dos eventos regeneradores em alguns órgãos só é possível se forem empregados esquemas de administração parenteral repetida de doses relativamente elevadas de EGF. Os resultados sobre este efeito regenerador nem sempre foram animadores, o que reforça o conceito da necessidade de terapias combinadas ou multivalentes para conseguir uma apropriada restituição morfofiincional do órgão logo após o ataque isquêmico. A ineficácia do EGF neste enfoque terapêutico pode relacionar-se com seu rápido esclarecimento e eliminação nos poucos minutos após a sua inoculação.

Ainda que se tenha enfatizado a necessidade de se estabelecer combinações farmacologicamente aditivas ou sinérgicas para incrementar as possibilidades terapêuticas dos fatores de crescimento, cujo efeito clínico individual seja limitado, ainda não se conhece nenhuma formulação de uso parenteral com estas características para qualquer indicação médica. A novidade da presente composição farmacêutica se baseia na atividade farmacológica que se estabelece entre o fator de crescimento epidérmico (EGF) e um peptídeo mimético do fator de liberação do hormônio de crescimento (GHRP). Referida combinação de princípios ativos favorece a vitalidade celular nos órgãos quando estes resultam privados parcial ou totalmente da provisão de sangue oxigenado por períodos de minutos até horas. Esta combinação também atenua a formação de espécies e metabólitos tóxicos em tecidos ou órgãos hipóxicos ou anóxicos, o que permite a sobrevida tecidual ante prolongados períodos de isquemia. A combinação destes agentes também apresenta uma potente atividade de readaptação fisiológica sobre vários tecidos quando sua administração tem fins terapêuticos.

Tonencionãüã combinação pode ser empregada dentro de uma mesma composição farmacêutica ou pode ser aplicada a um mesmo paciente separadamente como parte de um único tratamento.

Por intermédio da presente invenção se consegue, de forma simultânea, incrementar a capacidade autodefensiva das células mediante pré-condicionamento profilático e prevenir a cascata de eventos moleculares lipoperoxidativos, pró-inflamatórios e citotóxicos que podem conduzir à morte celular (por apoptose ou necrose), que ocorre em órgãos e tecidos submetidos à isquemia-reperfiisão, choque hipovolêmico, hipoperfusão hística, deficiência hemodinâmica da macro e da microvasculatura e da sépsis. A combinação permite manter a viabilidade e o funcionamento total do(s) órgão(s) ou tecido(s) em questão, bem como o rápido restabelecimento regenerador ou de adaptação dos tecidos quando tenham sofrido deterioração morfológica e funcional como conseqüência dos estados mórbidos antes mencionados, ou quando não hajam sido profilaticamente tratados.

Adicionalmente ficou comprovado que a combinação da invenção acelera a adaptação intestinal logo após extensas enterectomias. A combinação farmacêutica pode ser aplicada com finalidade profilática em todos aqueles pacientes com entidades que podem conduzir à disfunção ou deficiência múltipla de órgãos de diversas origens, tais como pacientes de queimaduras, politraumatizados, com a síndrome da angústia respiratória, neonatos hipóxicos, choque hipovolêmico, enterocolite necrotizante, etc. Também pode ser aplicada a pacientes submetidos a grandes intervenções cirúrgicas, de urgência ou não, e de alto risco. Aplica-se também na cirurgia de transplante e revascularizadora, na qual necessariamente a oxigenação de um ou de vários órgãos é comprometida por r isquemia total ou parcial e é realizada imediatamente a reperfiisão. E apiicaver lamoem no controle e prevenção das consequências dõsTénomenos tromboembólicos.

Em sua vertente terapêutica, como combinação trófico-regeneradora, pode-se aplicar a pacientes com síndrome de intestino curto, e em todos aqueles processos já mencionados em que, por alguma razão, não se tenha realizado uma intervenção profilática. Pode ser empregada para estimular a restauração morfofuncional do fígado submetido a hepatectomia parcial e no tratamento da insuficiência renal aguda de origem isquêmica.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, ela compreende uma formulação farmacêutica injetável que combina como princípios ativos os agentes peptídicos fator de crescimento epidérmico (EGF) e um peptídeo mimético do fator de liberação do hormônio de crescimento (GHRP), os quais apresentam capacidade citoprotetora de forma aditiva, em que um deles tenha mostrado de forma direta atenuar a formação de metabólitos citotóxicos em um contexto celular onde haja ocorrido hipoxia ou anoxia por insuficiência no abastecimento de sangue ou por agentes tóxicos que bloqueiem a respiração celular. A combinação exerce, deste modo, um efeito de proteção mediado por mecanismos múltiplos sobre os tecidos, envolvendo a interrupção da cascata fisiopatológica de lesão em vários pontos. Uma administração única e profilática da composição da invenção nas doses requeridas é suficiente para colocar em marcha mecanismos de citoproteção e estimular a sobrevida celular. A combinação pode ser empregada de forma terapêutica, afinal, mediante injeções reiteradas, ou sistemas de instilação contínua para restaurar a arquitetura e a função tecidual quando já haja ocorrido a lesão.

Na mencionada combinação entre o EGF e um peptídeo secretagogo do hormônio de crescimento (GHRP-6), o efeito protetor descrito para o EGF é substancialmnte otimizado e ampliado, tomando - dcGncccsõáíiO-accr-ciriprcgcr^cm arras doses, üestê modo, coni uma dosagem da presente formulação se consegue por em marcha diferentes mecanismos biológicos protetores, os quais conseguem estabelecer um prolongado efeito sinérgico citoprotetor. A versatilidade dos mecanismos de ação protetora desta composição farmacêutica justifica sua administração a uma ampla gama de pacientes que hajam sofrido episódios isquêmicos como conseqüência de trombose, embolismos, ou de ambos, edemas, hemorragias, choque hipovolêmicos, etc. Nestas condições, o tratamento deve ser aplicado logo que possível com vistas a reduzir a área de necrose do órgão ou tecido.

Em outro cenário, o tratamento pode ser aplicado a receptores de enxertos, para permitir um apropriado pré-acondicionamento do organismo do hospedeiro, o qual se estabelece depois da administração profilática de um bolo em dose única ocorrendo entre os 5 e os 10 minutos seguintes. O efeito protetor conferido aos tecidos isquêmicos mediante a presente composição, permite tomar opcional a administração concomitante de qualquer agente antioxidante ou sintético, de compostos quelantes de ferro, assim como de enzimas envolvidas na defesa antioxidante. A presente combinação pode ser administrada concomitantemente com agentes trombolíticos ou fibrinolíticos referidos como ativadores do plasminogênio, e na eventualidade da reperfusão induzida por métodos mecânicos, incluídos os angioplásticos.

Igualmente, a composição da invenção acelera a restauração morfológica e funcional dos tecidos logo após estabelecida a morte tecidual, e favorece o processo de readaptação celular no intestino.

De forma mais particularizada, a invenção proporciona uma formulação farmacêutica injetável que combina as propriedades biológicas do EGF um peptídeo secretagogo do hormônio de crescimento, ambos em cuuceritrações eficazes, o JbUi4 retendo' compreende o polipeptideo obtido por via natural, por síntese química ou mediante a tecnologia do ADN recombinante; O peptídeo secretagogo referido é o Growth Hormone Releasing Peptide (GHRP-6), obtido por síntese química e cuja seqüência aminoacídica é a seguinte: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2.

Igualmente inclui o uso terapêutico de ambos os princípios ativos nas mencionadas patologias, já não fazendo parte de uma única composição farmacêutica, senão aplicados ambos a um paciente como parte de um único método de tratamento. A presente invenção é aplicável com fins profiláticos ou terapêuticos. Quanto ao seu uso profilático, a faixa de concentrações de EGF a serem empregadas na combinação pode variar entre 0,5 e 50 pg/ml quando do preparo como solução, ou como sal liofilizado e recolocado em suspensão em um veículo apropriado. A concentração do GHRP-6 pode abranger de 2 até 100 pg/ml no mesmo veículo. Recomendam-se doses entre 0,5 e 1 μg/kg de cada substância, com fins profiláticos. As vias de administração podem ser endovenosa profunda ou periférica, intra-arterial ou intraperitoneal. Os veículos a serem empregados podem ser solução salina fisiológica a 0,9%, solução de Ringer lactada, plasma, albumina e dextrose isotônica, ou misturas destes. A administração ao paciente deve ser na forma de bolo pelas vias indicadas. Recomenda-se a administração do bolo tão urgente quanto seja possível ante o episódio isquêmico, quando este já tenha sido diagnosticado. Por outro lado, o tratamento deve ser administrado a pacientes em choque, politraumatizados, com síndrome de esmagamento muscular, queimaduras e traumas cirúrgicos maiores de forma urgente, ainda que não se disponha de verificações clínicas de comprometimento isquêmico em órgãos internos, e quando se presuma que haja risco de hipoperfusão tecidual central ou periférica. Estes órgãos são principalmente o estômago, o intestino, o fígado, cérebro-cerebelo, músculos esqueléticos e os rins.

Esias especracações sãõ aplicáveis também a pacientes com pancreatite aguda para prevenir ou reduzir complicações ulteriores. Inclui-se ademais sua aplicação a pacientes com risco de angústia respiratória do adulto. A freqüência de administração com fins profiláticos pode variar de acordo com a magnitude do quadro e com o processo patológico em questão, o que dependerá do critério dos facultativos. A administração do bolo pode ser repetida a cada 3 horas e até 4 vezes em 24 horas. Os princípios ativos também podem ser administrados em formulações de ação prolongada. Não obstante, é preferível que a formulação a ser administrada seja preparada imediatamente antes de seu emprego, mediante a recolocação em suspensão dos liofilizados de ambos os princípios ativos, em uma das soluções recomendadas de forma estéril e apirogênica.

Com relação a seu uso terapêutico, a preparação da combinação farmacêutica é realizada como foi descrito anteriormente. Entretanto, são estabelecidas diferenças quanto à finalidade, estratégia de dosagem, de administração e dose eficazes. O emprego desta composição com fins terapêuticos é indicado para restaurar todos aqueles tecidos que tenham sofrido lesão isquêmica e naquelas que se tenha produzido a morte celular focal (infarto) ou difusa. Também é recomendado para restaurar rapidamente a função celular quando os tecidos tenham sido expostos a períodos breves de isquemia e as lesões teciduais não tenham sido letais, o que permite interromper a cascata de complicações. É incluído, além disso, o uso da formulação para favorecer a regeneração de órgãos ou tecidos que, por traumas ou cirurgia, resultem comprometidos. E recomendado seu emprego durante os primeiros dias de praticada a cirurgia do transplante para atenuar o efeito da isquemia quente ou fria sobre o órgão enxertado e favorecer suas funções fisiológicas e tróficas. A preparação é recomendada para combater e corrigir a smdrome cie Intestino curto, e portanto para acelerar o processo de readaptação e reorganização do epitélio intestinal. Para estas indicações, recomenda-se o emprego de infusões contínuas e não de bolos únicos como no esquema profilático. As infusões devem ser administradas na forma de venóclise nos veículos anteriormente descritos, com uma duração de 3 a 4 horas, administrando-se duas infusões a cada dia com um intervalo de pelo menos 8 horas entre elas. As doses recomendadas para estas indicações oscilam entre 0,01 pg/kg/h até 5 pg/kg/h.

EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO EXEMPLO 1. DEMONSTRAÇÃO DO EFEITO CITOPROTETOR DA ADMINISTRAÇÃO SISTÊMICA DO HEXAPEPTÍDEO SECRETAGOGO GHRP-6 SOBRE A MUCOSA GÁSTRICA EM UM MODELO DE ESTRESSE AGUDO.

Ratos machos da linha OF-1 (20 a 23 g de peso corporal) foram selecionados aleatoriamente para uma administração única intraperitoneal do GHRP (0,1 pg/animal) ou para receber solução salina fisiológica 0,9% pela mesma via. A alimentação foi retirada 14 horas antes de se iniciar a experiência. Dez minutos mais tarde, os animais foram submetidos a natação forçada em água fria (2 a 4°C) em constante agitação, pelo espaço de 30 minutos. Os animais foram insensibilizados com éter e sacrificados. Foi realizado estudo histológico fixando as amostras em formalina neutra a 10% e empregando-se as colorações de H&E e PAS/azul ciano. A avaliação in situ da mucosa foi realizada empregando-se uma câmara de vídeo acoplada ao estereomicroscópio. A imagem do estômago foi transferida para o computador para sua análise morfológica posterior mediante o sistema DIGIPAT. Os critérios de erosão, hemorragia parietal e úlcera oxíntica foram estabelecidos de acordo com a literatura internacional (Playford, R. J. Peptides and gastrointestinal mucosa integrity. Gut 1995, 37: 595-597). As úlceras foram identificadas por seu aspecto definido, circünscntcT “e “dè fundo hemorrágico. Foram consideradas no estudo microscópico aquelas que mais interessaram além do terço superior da zona glandular. A determinação de hemoglobina luminal foi realizada pelo método de cianometemoglobina (Reactivos Spinreact, Barcelona) e foi expressa em g/dl. As avaliações foram realizadas às cegas, empregando-se uma identificação artificial. A intervenção profilática com o GHRP-6 reduziu significativamente a intensidade da lesão à mucosa, bem como o número de úlceras na mucosa oxíntica (Tabela 1). TABELA 1. EFEITO PROTETOR SOBRE A MUCOSA GÁSTRICA DO GHRP-6 Utilizaram-se 20 animais em cada grupo. * p<0,01 estabelecido pelo teste t de Student de duas caudas. Nível de significação estabelecido de p<0,05. Esta experiência demonstrou o efeito citoprotetor do hexapeptídeo GHRP-6 em um modelo de lesão gástrica agida, induzida por estresse, em cuja fisiopatologia o evento de isquemia-reperfusão à mucosa do órgão desempenha um importante papel. EXEMPLO 2. EFEITO PROTETOR DA ADMINISTRAÇÃO PROFILÁTICA DA COMBINAÇÃO ENTRE O EGF E O HEXAPEPTÍDEO SECRETAGOGO GHRP-6 EM UM MODELO DE ISQUEMIA-REPERFUSÃO RENAL.

DESCRIÇÃO EXPERIMENTAL

Foi explorado o efeito nefroprotetor de cada um dos peptídeos, bem como de sua combinação no modelo de isquemia-reperfusão renal bilateral quente. Em uma primeira fase, foi estabelecido um período de isquemia de uma hora, seguido por uma fase de reperfusão de 3 horas. Ratos Wistar fêmeas (200 a 220 g) foram aleatoriamente designados para os seguintes grupos experimentais (N = 10) na primeira fase. Todos os tratamentos foram aplicados por via intraperitoneal e 30 minutos antes de se iniciar a isquemia.

Grupo I: Simuladores isquêmicos.

Grupo II: Isquemia tratada com solução salina fisiológica 0,9%.

Grupo III: Isquemia tratada com EGF em uma dose de 20 pg / ratazana.

Grupo IV: Isquemia tratada com GHRP-6 em uma dose de 50 μ / ratazana Grupo V: Combinação entre EGF (5 pg) e GHRP-6 (10 pg). MODELO DE ISQUEMIA: Foi realizado sob anestesia profunda, comprimindo-se o pedículo de ambos os rins com micropinças vasculares atraumáticas por 60 minutos. Transcorridas 3 horas de reperfusão, os animais foram evolucionados até os 30 minutos seguintes. AVALIAÇÃO DA FUNCÀO RENAL: Foi determinada a intensidade do filtrado glomerular (IGF) e do fluxo plasmático renal (FPR) mediante a saturação plasmática com os marcadores de inulina e ácido p-amino hipúrico durante a fase de reperfusão. O coeficiente de clareamento (C) de cada marcador foi determinado mediante a seguinte fórmula: (C) = Uv(m) x [PM]u / [PM]p em que LIV(m) representa o volume de urina excretada por minuto.

[PM]u e [PM]p representam as concentrações plasmáticas e urinárias de cada um dos marcadores. Os dados foram expressos em ml/minuto/g em peso. DETERMINAÇÃO DO VOLUME DE DIURESE: Introduziu-se um cateter logo após a oclusão da uretra. A extremidade livre do cateter foi conectada a um tubo graduado, e determinou-se o volume de urina excretada durante 10 minutos. DETERMINAÇÕES BIOQUÍMICAS: Amostras de "tecido renal toram maceradas em soluçào tampào de KCl/histidina (pH 7,3) e o sobrenadante foi empregado na determinação da atividade das enzimas fosfolipase A2, catalase, bem como do metabólito malondialdeído (MDA). DETERMINAÇÕES HISTOLÓGICAS: Amostras de tecido renal foram fixadas em formalina neutra a 10% c processadas em parafina para sua coloração. As avaliações foram realizadas por patologistas alheios ao ensaio e considerando-se os seguintes parâmetros: número de gloméruios que entraram em colapso, hemorragia cortical. hemorragia medular, lesão tubular grave e lesão intersticial grave. Como se apresenta na Tabela 2, o evento de isquemia-reperfusào provocou uma deterioração marcante na capacidade renal de formar e excretar urina. A intervenção com EGF demonstrou atenuar o processo oligúrico, ainda que de forma não significativa em relação aos controles tratados com soluçào salina a 0.9%. De sua parte, a administração deGHRP-6 elevou em quatro vezes a produção de urina em relação ao grupo tratado com solução salina a 0,9%. evidenciando-se uma significativa proteção do tecido renal. A administração da combinação de ambos os peptideos demonstrou prevenir completamente o colapso da função renal, de modo que foram obtidos valores de diurese semelhantes aos do grupo de referência não isquêmico.

Estes resultados provam o efeito sinérgico de ambos os peptideos como nefroprotetores em um período de isquemia relativamente breve.

TABELA 2. PRODUÇÃO DE URINA LOGO APÓS A REPERFUSÃO

Dados expressos como valor médio e desvio padrão. ** Significa diferença de p<0,01 com relação ao grupo de controle isquêmico tratado com solução salina a 0,9%.

Significa clilerença dè p<0,05 com relação ao grupo de controle tratado com solução salina a 0,9%. Teste de U Mann-Whitney. O estudo histológico do tecido renal demonstrou que o episódio isquêmico causou lesão em todas as estruturas renais, particularmente no grupo de controle tratado com solução salina. De forma geral, a intervenção com EGF e com o hexapeptídeo GHRP-6 apresentou um modesto efeito de atenuação. Contudo, a comparação qualitativa de ambos os grupos indicou um efeito nefroprotetor do GHRP-6 superior ao do EGF. Como se acha ilustrado na tabela 3, a combinação de ambos os agentes exerce um potente efeito protetor ao impedir de forma dramática as lesões em todas as estruturas do tecido renal. TABELA 3. PERCENTUAL DE ANIMAIS POR GRUPO COM LESÃO HISTOPATOLÓGICA RENAL. ** Significa a diferença p<0,01 em relação ao grupo isquêmico tratado com solução salina fisiológica. * Significa a diferença p<0,05 em relação ao grupo isquêmico tratado com solução salina fisiológica. * Significa a diferença p<0,01 entre os grupos tratados com EGF e GHRP-6 em relação ao grupo que recebeu a combinação de ambos os peptídeos.

Comparações efetuadas por ANOVA de uma via e pelo teste de faixas múltiplas de Duncan.

Os testes de funcionabilidade renal, dados na capacidade de filtração glomerular e de fluxo plasmático renal efetivo confirmam as descobertas histopatõlógicas obtidas. Cònfirma-se que ambos os peptídeos administrados de forma independente atenuam de forma parcial a deterioração funcional do órgão, enquanto a combinação confere proteção total. Observa-se novamente que a administração do hexapeptideo GHRP-6 confere maior proteção do que o EGF. Estes dados acham-se ilustrados na Tabela 4.

TABELA 4. FUNÇÃO RENAL (*) Significa diferença entre o grupo tratado com a combinação de peptídeos e o grupo que recebeu solução salina fisiológica (p<0.01). (*) Significa diferença entre o grupo tratado com a combinação e aqueles que receberam cada peptídeo de forma independente (p<0,05). (#) Significa diferença (p<0,05) entre o grupo tratado com GHRP-6 e o grupo de controle isquêmico que recebeu solução salina.

As comparações foram realizadas por ANOVA de uma via e posterior teste de Duncan.

Realizou-se um estudo posterior em uma segunda fase, no qual se estabeleceu um período de isquemia mais prolongado, o que proporciona a oportunidade de avaliar a eficácia da combinação em um modelo de lesão mais forte e próximo da prática médica. A metodologia experimental foi a mesma empregada na primeira fase. No presente estudo foi estabelecido um tempo de isquemia de três horas com igual período de reperfusão. Como se observa na Tabela 5. logo após três horas de isquemia, o fracasso da funçào renal é absoluto. O volume de urina coitado nos grupos de controle salino e medicados com EGF é desprezível,’ ãlem de mostrar aspecto hematúrico. Observou-se nefroproteção parcial no grupo tratado com GHRP-6, enquanto a diurese foi significativamente superior à detectada nos grupos anteriores. Não obstante, esta resultou ser significativamente inferior aos valores de referência. O emprego da combinação permitiu uma apropriada nefroproteção, com valores de diurese comparáveis com aqueles obtidos do grupo simulador não isquêmico.

TABELA 5: PRODUÇÃO DE URINA LOGO APÓS A REPERFUSÃO

Dados expressos como média e desvio padrão. (*) Significa diferença (p<0,05) entre o grupo tratado com GHRP-6 e o grupo de controle submetido a isquemia e tratado com solução salina. (*) Significa diferença entre o grupo que recebeu a combinação peptídica, o controle isquêmico e o tratado com EGF (p<0,01). (#) Significa diferença entre o grupo de tratamento combinado em relação ao tratado com GHRP-6. Teste de ANOVA de uma via e posterior teste de Duncan. Nível de significação estabelecido de p<0,05.

As descobertas histológicas apoiam os resultados do nível de diurese detectado. O comprometimento do tecido renal foi grave e massivo nos animais do grupo tratado com EGF. Uma leve atenuação das lesões foi observada no tecido renal de animais que receberam o GHRP-6. A administração combinada dos peptídeos surtiu um efeito de proteção morfológica favorável. Os dados são apresentados na Tabela 6.

Tabela 6: Porcento de animais por gruipo com dano renal histopatológico (♦ ) Significa diferença entre o grupo que recebeu GHRP e o grupo de controle isquêmico que recebeu solução salina a 0.9% (p<0,05). (*) Significa diferença entre o grupo que recebeu a combinação de peptídeos contra o resto dos grupos submetidos a isquemia (p<0.05 / p<0,01). Nível de significação estabelecido de p<0,05. Teste de ANOVA de uma via e posterior análise de Duncan.

Novamente, a análise do funcionamento renal, com base na capacidade de filtração glomerular e na intensidade de fluxo plasmático, demonstrou a superioridade da intervenção profilática com a combinação de ambos os peptídeos. Os índices de clareamento de ambos os marcadores foram encontrados em faixas comparáveis com os detectados no grupo de simuladores não isquêmicos (Tabela 7).

______________TABELA 7JUNÇÃO RENAL (*) Significa diferença entre o grupo que recebeu a combinação de peptídeos e o restante dos grupos isquêmicos (p<0,01). (*) Significa diferença entre o grupo que recebeu GHRP-6 e o grupo de controle isquêmico tratado com solução salina a 0,9% (p<0,05). Teste de ANOVA de uma via e posteriormente Duncan. Nível de significação estabelecido de p<0,05. Com este estudo fica demonstrado que uma administração única e profilática de ambos os peptídeos confere um nível limitado de proteção aos rins submetidos a isquemia. Fica confirmada uma superioridade relativa do GHRP-6 com relação ao EGF. Foi demonstrada a eficaz neffoproteção conferida pela combinação de ambos os agentes em um esquema de dosificação única e profilática. EXEMPLO 3. EFEITO PROTETOR DA COMBINAÇÃO ENTRE EGF E GHRP-6 EM UM MODELO DE ISQUEMIA-REFERFUSÃO INTESTINAL.

Foram empregados ratos machos Sprague Dawley (220-250 g) que foram aleatoriamente designados para os seguintes grupos de tratamento. I: isquemia-reperfusão e tratado com solução salina a 0,9%. II: isquemia-reperfusão e tratado com EGF 500 pg/rato. III: isquemia-reperfusão e tratado com GHRP-6 100 pg/rato. IV: isquemia-reperfusão e tratado com combinação de EGF (5 pg) / GHRP-6 (2 pg) por rato.

Todos os tratamentos foram efetuados por via intraperitoneal e 30 minutos antes de iniciada a isquemia.

Modelo experimental e determinações Sob anestesia, empregando-se manta termorregulável e condições de assepsia, foi praticada uma laparotomia até expor-se cuidadosamente o tronco de primeira ordem da artéria mesentérica superior, a qual foi ocluída com micropinças vasculares para produzir isquemia da parte correspondente ao jejuno e ao íleo pelo período de duas horas. Estabeleceu-se um período de reperfusão de três horas. No seu término, os animais foram sacrificados com dose excessiva de anestesia e submetidos a estudo de necropsia, com ênfase para o intestino delgado, o fígado, os rins e os pulmões. Ao se ressecar o intestino delgado, foi observada a extensão da lesão hemorrágica mucosa e/ou luminal. Foi praticada a sua dissecação e se expôs a face luminal, coletando-se cuidadosamente o conteúdo para posterior determinação do conteúdo de hemoglobina. A mucosa foi lavada extensivamente em PBS frio, pH 7,2, pesada e seccionada para a determinação de proteínas totais pelo método de Lowry. Outras amostras foram empregadas para a quantificação do ADN total d processamento histológico. O tecido foi fixado em formalina neutra a 10% para ser processado em parafina e colorido com H&E. A análise do nível de lesão mucosa foi realizada às cegas empregando-se a escala de Chiu e colaboradores. Nesta é estabelecido um índice de lesão crescente à mucosa entre os graus 0 (intacta) até 5 (desnudação total). Outros fragmentos foram processados mediante microdissecação estereomicroscópica e coloridos com o reagente de Schiff, quantificando-se o número de imagens apoptóticas em 200 criptas. Para confirmar definitivamente o efeito de proteção conferido pelos tratamentos, foi estudada em um ensaio independente a sobrevida dos animais até as 96 horas de iniciada a reperfusão.

Um período de isquemia de duas horas sobre a área do jejuno e do íleo provocou uma lesão da mucosa de caráter transmural, grave edema e abundante sangramento luminal no grupo de animais que receberam solução salina a 0,9%. Como é apresentado na Tabela 8, todos os segmentos estudados histologicamente neste grupo apresentarem um padrão de lesão classificável como de grau 5, caracterizado por desnudação total até às criptas. O tratamento com a elevada dose de EGF ensaiada apresentou um efeito mínimo de proteção que, na ordem clínica, não é significativo. A administração do hexapeptídeo GHRP-6 demonstrou que previne de forma parcial a deterioração do órgão. O padrão de lesão da mucosa resultou ser menos extenso e mais superficial. Novamente, a combinação de ambos os peptídeos preveniu de forma dramática as lesões à mucosa intestinal (Tabela 8). Todos os indicadores estudados confirmam o nível significativo de proteção exercido pela combinação de ambos os peptídeos. TABELA 8. PARÂMETROS INTESTINAIS ESTUDADOS_____________________________ Dados expressos como valor médio e desvio padrão. (*) Significa diferença entre o grupo que recebeu a combinação de peptídeos e o grupo de controle isquêmico tratado com solução salina fisiológica (p<0,01). (*) Significa diferença entre o grupo que recebeu o hexapeptídeo GHRP-6 e o grupo de controle tratado com solução salina (p<0,05). ANOVA de uma via e posterior teste de Duncan. Nível de significação de p<0,05. O estudo histológico dos principais órgãos parenquimatosos confirmou a correspondência entre o nível de lesão intestinal e o comprometimento em cada um deles. As principais lesões atenuadas pela combinação de peptídeos foram: (I) prevenção ou redução do infiltrado neutrofilico nos pulmões, (II) atenuação de transformações necróticas e hidrópicas agudas nos hepatócitos, e (III) prevenção do colapso glomerular e lesão do epitélio tubular. Estas transformações, não obstante, foram observadas de forma mais grave nos grupos tratados de forma independente com cada peptídeo.

Em um segundo ensaio, cujo objetivo central foi determinar a proteção intestinal expressa na sobrevida dos animais, seguiu-se a mesma metodologia experimental, com a diferença de que se procedeu à sutura da incisão. Logo depois da sutura, todos os animais receberam uma administração intraperitoneal de 5 ml de solução Ringer lactada. Os animais foram monitorados até que se concluíssem as 96 horas de estabelecida a reperfiisão. Foi confirmada a proteção proporcionada pela combinação de ambos os peptídeos, enquanto os 100% dos animais tratados sobreviveram (Tabela 9).

TABELA 9. PERCENTUAL DE SOBREVIVÊNCIA EM CADA GRUPO

Uma importante observação destes resultados se relaciona com a proteção conferida pela combinação farmacêutica aos principais órgãos alvo associados com a lesão intestinal por isquemia/reperfusão: pulmões e rins.

Para o caso dos pulmões, constatou-se uma dramática redução na intensidade da infiltração neutrofilica, na lesão alveolar, bem como endotelial. Estes marcadores são típicos do pulmão angustiado e redundam comumente incompatíveis com a vida. De forma semelhante nos rins, observou-se redução das zonas hemorrágicas, da lesão tubular e glomerular.

Este estudo demonstra a utilidade da intervenção profílática com a combinação de ambos os peptídeos para prevenir as lesões intestinais derivadas do episódio de isquemia-reperfusão. A proteção conferida pelo método referido é de caráter sistêmico, enquanto se demonstra a prevenção de mudanças histopatológicas em vários órgãos distantes que não tenham sido submetidos diretamente à isquemia, porém sobre os que a geração de EROs e mediadores pró-inflamatórios tenham repercussão negativa. A prevenção absoluta da letalidade no grupo tratado com a combinação peptídica confirma seu efeito potente de proteção multiorgânica.

EXEMPLO 4. EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO TERAPÊUTICA DA COMBINAÇÃO ENTRE EGF E O HEXAPEPTÍDEO GHRP-6 EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE QUEIMADURA GRAVE A região dorsal de ratos machos da linhagem Balb/c (22 a 25 g) foi depilada e submetida a escaldadura hipodérmica, que compreendeu 25% da superfície corporal, mediante imersão em água estabilizada em 95 a 97°C pelo espaço de 5 segundos. O procedimento foi realizado empregando-se a combinação de diazepam/cetamina e breve exposição a máscara de éter. Imediatamente após cada animal recebeu uma administração intraperitoneal de 1,5 ml de solução salina fisiológica a 0,9% para prevenir o colapso circulatório. Este modelo animal reproduz de maneira estável extensas lesões necróticas na mucosa intestinal que podem chegar a ter caráter transmural, assim como hemorragia luminal, o que teve como resultado a utilidade para se estudar o efeito de cada um dos peptídeos e de sua combinação no processo de maturação intestinal. Transcorridas 24 horas, os animais sobreviventes foram aleatoriamente distribuídos pelos seguintes grupos de tratamento: I: Referência. Simuladores não queimados (N = 5) e tratados com a solução salina fisiológica a 0,9%. II: Queimados, tratados com solução salina fisiológica a 0,9%. (N = 7 ratos) III: Queimados, tratados com EGF (N = 10 ratos; 0,1 pg/animal). IV: Queimados, tratados com GHRP-6 (N = 9 ratos; 0,1 pg/animal). V: Queimados, tratados com a combinação peptídica (N = 10 ratos) entre EGF (0,01 pg) e GHRP-6 (0,01 pg).

As administrações foram realizadas duas vezes por dia por via intraperitoneal e até o décimo dia após a queimadura. Ao finalizar o esquema de tratamento, todos os animais foram novamente pesados. Seis horas antes de serem sacrificados e submetidos a estudo de necropsia, cada animal recebeu uma injeção intraperitoneal de sulfato de vincristina (1 mg/kg) para apreender as células em metáfase. O intestino foi ressecado, pesado individualmente e alguns fragmentos foram coletados para se determinar seu conteúdo total de proteínas e ADN. Outros fragmentos foram obtidos de diferentes partes e fixados em formalina neutra a 10% para processamento histológico de rotina e para se realizar a microdissecção estereoscópica das criptas. Os espécimes histológicos foram utilizados para estudos morfométricos empregando-se o pacote tecnológico Digipat. Os parâmetros estudados foram os seguintes: Peso final.

Peso do intestino e do conteúdo total de proteínas e ADN. Número de metáfases por cripta. Número de criptas em fissão.

Altura das velosidades intestinais.

Profundidade das criptas.

Todos os animais designados para tratamento com os peptídeos individualmente administrados ou em combinação apresentaram um aumento significativo do peso corporal no final do esquema de administração. Esta diferença é particularmente relevante no grupo que recebeu a combinação peptídica (Tabela 10). Esta observação sugere o impacto do método na restituição da mucosa intestinal e no restabelecimento de sua função de absorção, mediado pela ação sinérgica e/ou atividade de seus componentes. TABELA 10. COMPORTAMENTO DO PESO CORPORAL.______________________________ Peso final registrado no décimo dia após a queimadura ter sido provocada e logo após as 20 administrações. Dados expressos como média e desvio padrão. (*) significa a diferença entre o peso inicial e o peso final p < 0,05. (#) significa a diferença entre o grupo tratado com a combinação e o restante dos grupos. ANOVA e teste de Duncan.

Os dados referidos na Tabela 11 demonstram o efeito restaurador favorável sobre a mucosa intestinal de cana um dos peptídeos com relação ao grupo tratado com solução salina. Não obstante, o efeito mais dramático foi detectado novamente no grupo que recebeu o tratamento combinado de ambos os peptídeos. TABELA 11. RESPOSTA REGENERATIVA DO INTESTINO.

Dados expressos como valor médio e desvio padrão. (*) Significa a diferença entre o grupo que recebeu a combinação de peptídeos e o grupo que recebeu solução salina (p < 0,01). (*) Significa a diferença entre os grupos que receberam cada peptídeo e o controle (p < 0,05). ANOVA e posterior teste de Duncan. O resultado mais importante do ponto de vista terapêutico neste estudo refere-se à capacidade do método da combinação peptídica de acelerar o processo de restauração e adaptação intestinal, expresso na estimulação do processo de fissão das criptas intestinais como o mecanismo do restabelecimento funcional das células da mucosa do órgão. Embora se observe que a administração de EGF estimula a proliferação celular expressa no incremento do número de metáfases, este evento é diferente do processo de fissão da cripta como unidade funcional do intestino delgado. O fato de que a atividade do hexapeptídeo GHRP-6 sobre os processos de fissão de criptas e de proliferação celular não tenha sido significativa, exclui a possibilidade de efeito anabólico mediado pelo GHRP-6 de forma direta ou indireta (Tabela 12). Este não mostrou exercer um efeito significativo sobre nenhum dos parâmetros estudados. Evidencia-se que a combinação do GHRP-6 com o EGF parece potencializar seu efeito trófico / regenerador sobre a mucosa intestinal. Se o GHRP-6 sensibiliza as células ao efeito do EGF, é motivo de pesquisa no presente.

Conjuntamente, na Tabela 12, apresentam-se os dados que ilustram o potente efeito da combinação na reconstituição morfológica do intestino. O aumento do tamanho das criptas e das vilosidades corresponde à extensão da superfície de absorção intestinal e, portanto, de assimilação de nutrientes. TABELA 12. RESTAURAÇÃO DA MUCOSA DO INTESTINO.

Dados expressos como média e desvio padrão. (*) Significa a diferença significativa entre o grupo que recebeu a combinação peptídica e o restante dos grupos (p < 0,05). (v) Significa a diferença entre o grupo tratado com EGF e o controle que recebeu solução salina a 0,9% (p < 0,05). ANOVA de uma via e teste de Duncan. A presente invenção proporciona as seguintes vantagens: 1. A presente combinação pode surtir efeitos profiláticos ou terapêuticos, o que depende das características do processo a ser tratado. As soluções análogas anteriores não apresentam esta possibilidade. Estes efeitos podem ser modulados por um profissional com conhecimento da técnica. 2. O princípio do método se baseia na estimulação de mecanismos de resposta endógenos ou orgânicos, enquanto a maioria das soluções anterior baseiam seu efeito no do produto administrado por si mesmo, geralmente um xenobiótico. 3. O anterior permite o uso de doses pequenas para se obter a resposta desejada. Portanto, com este método não existe risco algum de toxicidade. As soluções anteriores requerem o uso de altas doses para se conseguir, em certas ocasiões, modestos efeitos, as quais, além disso, possuem o risco de toxicidade. 4. A resposta é mediada pela união dos peptídeos com os receptores que são ativados nos diferentes tecidos, de modo que não é necessário um prolongado período de circulação nem de permanência dos componentes nos tecidos. Isso aumenta a segurança ouso da combinação. 5. Não existe contra-indicação alguma no uso do presente método, de mono que se pode empregar em uma ampla gama de pacientes e de condições patológicas. Não apresentam interações indesejáveis com outros medicamentos. Numerosas soluções análogas anteriores possuem um campo de aplicação mais restrito e exigem precauções para sua indicação. 6. O método pode ser empregado em pacientes com qualquer enfermidade de base ou, inclusive, em estados de co-morbidade. Estes aspectos são limitativos em numerosas soluções análogas anteriores. 7. O método é indicado para uma ampla gama de estados e condições, incluindo a pacientes submetidos a cirurgia de transplante. 8. A presente invenção apresenta uma ampla janela de proteção anti-isquêmica, enquanto se obtém proteção no contexto de prolongados períodos de isquemia, nos quais outras soluções análogas não surtem efeito, como a cirurgia de transplante, as revascularizações, alguns procedimentos de diagnóstico e conduta. 9. Possui uma ação farmacológica polivalente capaz de contra-atacar de forma simultânea vários pontos da cascata de lesões. Isto não é observado em nenhuma das soluções análogas anteriores. 10. A presente combinação possui efeitos tróficos e regenerativos para com numerosos órgãos epiteliais como o intestino, o fígado, o pâncreas e os rins. 11. A invenção é aplicável para acelerar o processo de adaptação do intestino ante a síndrome do intestino curto. Até o presente, não existe solução para esta entidade.

Claims (4)

1. Combinação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a) uma composição contendo um peptídeo com atividade do tipo de fator de crescimento epidérmico e b) uma composição contendo um peptídeo secretagogo do hormônio de crescimento GHRP-6.

2. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo com atividade do tipo de fator de crescimento epidérmico pode ser o fator de crescimento epidérmico (EGF), o fator de crescimento transformador do tipo alfa (TGF-α) ou o fator de crescimento do tipo fator de crescimento epidérmico que une a heparina (HB-EGF).

3. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o peptídeo com atividade do tipo de fator de crescimento epidérmico (EGF) está em uma concentração de 0,5 a 50 pg/ml de composição, quando preparado na forma de solução ou como sal liofilizado.

4. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o peptídeo secretagogo do hormônio de crescimento GHRP-6 está em uma concentração de 2 a 100 pg/ml de composição, quando preparado na forma de solução ou como sal liofilizado.