BR9814027B1 - uso de lisofosfatidil etanolamina (18:1) e lisofosfatidilinositol para retardar a senescência e para intensificar o amadurecimento de frutas. - Google Patents
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Description
"USO DE LISOFOSFATIDIL ETANOLAMINA (18:1) ELISOFOSFATIDILINOSITOL PARA RETARDAR A SENESCÊNCIA E PARAINTENSIFICAR O AMADURECIMENTO DE FRUTAS"
Antecedentes da Invenção
Vários agentes químicos e biológicos estão sendocorrentemente usados em frutas de crescimento comercial paracontrole de tempo de amadurecimento de frutas. Tais agentespodem ser usados para uma variedade de propósitos. Um propó-sito é sincronizar o amadurecimento de fruto para auxiliarem eficiente colheita de fruto do campo. Um outro propósitoé evitar a queda de fruto de modo que o fruto permaneça so-bre a planta até o apropriado período de tempo de amadureci-mento. Um outro propósito de agentes de amadurecimento defruto é aperfeiçoar o desenvolvimento de cor no fruto de mo-do que o fruto tenha uma cor melhor e mais uniforme comoesperado por consumidores de varejo do fruto. Nos EstadosUnidos, é prática corrente para muitos tipos de frutas seremtratadas com um ou mais tais agentes durante os processos decultivo.
Alguns agentes anteriormente usados para controlede amadurecimento de fruto são agentes puramente sintéticosverificados terem os efeitos desejados sobre o fruto emquestão. Infelizmente, devido a assuntos de potencial toxi-dez e oncogenicidade, vários tais agentes químicos sintéti-cos de amadurecimento de fruto tanto foram banidos como ti-veram seu uso agudamente restringido devido a resistênciacomercial ou de consumidor aos produtos. 0 agente mais popu-lar sendo correntemente usado para aperfeiçoar amadurecimen-to é ethephon, um composto sintético, que é vendido sob onome de Ethrel, uma marca registrada de Rhone-Poulenc Ag.Co. (Research Triangle Park, NC). Embora este agente estimu-le amadurecimento, ele também causa o amolecimento de fruto.Assim, fruto tratado com ethephon tem uma vida de prateleiramuito pobre. Há uma necessidade crítica por um agente deamadurecimento que seja ambientalmente seguro e que não cau-se amolecimento de fruto. Em adição, consumidores são dis-postos a pagar um preço premium por frutos amadurecidos devinha. Entretanto, frutos amadurecidos de vinha não podemser transportados longas distâncias porque estes frutosamolecem e têm vida de prateleira pobre. Por isso, pode serbenéfico aperfeiçoar-se a vida de prateleira de frutos ama-durecidos de vinha.
Existe também um tremendo interesse na indústriade plantas (especialmente nos vegetais frescos e indústriasde flor de corte) em encontrar um produto ambientalmente se-guro para retardar senescência e promover vida de prateleiraou vaso. Presentemente, compostos ambientalmente tóxicostais como tiossulfato de prata estão sendo usados para au-mentar a vida de vaso de flores de corte. Entretanto, o usode tiossulfato de prata está sendo restringido devido a con-ceitos ambientais. Por isso, é desejado desenvolver-se al-ternativas para tiossulfato de prata, que sejam muito maisprováveis de serem facilmente aceitos por interesses comer-ciais e público consumidor.Lisofosfatidil etanolaminas (daqui por diante re-feridas como "LPE") compreendem um grupo de compostos quemostraram promissores no controle de amadurecimento de fru-to, aperfeiçoamento de estabilidade de fruto durante estoca-gem, e aumentando a vida de prateleira de fruto estocado.Métodos para uso de LPF purificada de ovo (daqui por diantereferido como "LPEovo" para aperfeiçoar amadurecimento e es-tabilidade de frutos são mostrados nas patentes US 5 126155 e 5 100 341, que são aqui incorporadas por referência.LPE é derivada de fosfatidil etanolamina, um lipídio nor-malmente encontrado em membranas de células. Fosfatidil eta-nolamina é um fosfolipídio com duas metades ácido graxo queé abundante em gema de ovo. A remoção de um ácido graxo defosfatidil etanolamina através de fosfolipase A2 rende LPE.
LPE também está naturalmente presente em tecido deplanta e animal, especialmente rico em gema de ovo e tecidode cérebro. Ela é comercialmente disponível de Avanti PolarLipids, Inc., (Alabaster, Alabama). Existem numerosos dife-rentes ácidos graxos que podem ser encontrados em LPE puri-ficada de fontes naturais. Os ácidos graxos podem variar nocomprimento de uma cadeia assim como o grau de insaturação.Entretanto, a relativa aficácia de várias espécies de LPE etambém de diferentes tipos de lisofosfo lipídios outros quenão LPE no controle de amadurecimento de frutos e aperfeiço-amento de estabilidade de frutos não foi examinada.
Sumário da InvençãoA presente invenção refere-se a um processo de re-tardo de senescência em fruto ou tecidos de plantas. 0 pro-cesso envolve aplicação ao fruto e outros tecidos de plan-ta, tanto antes como após colheita, de uma composição con-tendo um lisofosfo lipídio e um agente ativante. A composi-ção contém uma quantidade de um liso fosfo lipídio que éeficaz em retardar senescência em fruto e outros tecidos deplanta. 0 liso fosfo lipídio preferido contido na composiçãoé lisofosfafatidil insoitol e/ou lisofosfatidil etanolamina(18:1) . Em adição a conter o liso fosfo lipídio, a composi-ção também pode conter um agente ativante, tal como etanol,tergitol ou sylgard 309.
Além disso, a presente invenção também refere-sea um processo de aperfeiçoamento de amadurecimento e estabi-lidade de fruto. O processo envolve aplicação a plantas in-teiras antes de colheita, de uma composição contendo umliso fosfolipídio e um agente ativante. A composição contemuma quantidade de liso fosfolipídio que é eficaz em aperfei-çoamento de amadurecimento e estabilidade de fruto. 0 lisofosfolipídio preferido na composição é lisofosfafatidil ino-sitol e/ou lisofosfafatidil etanolamina (18:1). Em adição aconter o liso fosfo lipídio, a composição também pode conterum agente ativante tal como etanol, tergitol ou sylgard 309.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é um gráfico mostrando inibição deatividade PLD de repolho parcialmente purificado através devárias concentrações de LPE com diferentes cadeias acila.A Figura 2 é um gráfjco mostrando a especificidadeestrutural de LPE (18:1) para sua inibição de atividade PLDrepolho parcialmente purificada.
A Figura 3 é um gráfico mostrando inibição de ati-vidade de PLD de repolho parcialmente purificada como umafunção de concentração de LPE.
A Figura 4 é um gráfico mostrando o efeito de con-centração de substrato sobre a inibição de PLD repolho par-cialmente purificada por LPE (18:1).
A Figura 5 é um gráfico mostrando o efeito de di-ferentes lisofosfo lipídios sobre atividade PLD de repolhoparcialmente purificada.
A Figura 6 é um gráfico mostrando o relativo teorde clorofila de folhas tratadas co m LPA, LPC, LPEovo ouLPI.
Descrição Detalhada da Invenção.
A presente invenção refere-se a um processo deaperfeiçoamento de amadurecimento e estabilidade de fruto eretardo de senescência em fruto e outros tecidos de plantausando-se liso fosfolipídios, incluindo, mas não limitado a,LPE (18:1) e/ou lisofosfafatidil inositol (daqui por diantereferido como "LPI"). Como aqui usado , o termo "liso fosfo-lipídos" refere-se a derivados de fosfolipídios tendo umúnico ácido graxo removido por fosfolipase A2. Como aquiusado, o termo "tecidos de planta" refere-se a qualquer par-te ou órgão de uma planta viva. Exemplos incluem fruto, fio-res, raízes, caules, hipocotilos, foLhas, pefcíolos, pétalas,etc.
O processo da presente invenção envolve tratamentode fruto e outros tecidos de planta antes ou após colheitacom uma composição contendo um lisofosfolipídio tendo a fór-mula :
<formula>formula see original document page 7</formula>
onde R1 é selecionado do grupo consistindo em aciloxi C5-22 ealcoxi C5-22; R2 é selecionado do grupo consistindo em hidro-gênio, hidroxila, aciloxi Ci_5 e alcoxi Ci_5; e R3 é selecio-nado do grupo consistindo em hidrogênio, colina, etanolami-na, inositol e serina, onde Ri e R2 são intercambiáveis umcom outro. Compostos preferidos tendo a fórmula (I) indicadaacima são LPE (18:1) e LPI.
Preferivelmente, a composição contem um carreadoraceitável para o lisofosfo lipídio, tal como água. Entretan-to, outros carreadores, tais como solventes orgânicos tambémpodem ser usados. A composição contem uma quantidade de li-sofosfo lipídio que é eficaz em aperfeiçoamento de amadure-cimento e estabilidade de fruto e em retardo de senescênciaem fruto e outros tecidos de planta. Mais especificamente, aquantidade de lisofosfolipídio na composição pode ser decerca de 0,5 a cerca de IOOOmg por 1 litro da composição,preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 500 mg por 1 litroda composição, mais preferivelmente de cerca de 5 a cerca de250mg por 1 litro da composição e mesmo mais preferivelmentede cerca de 5 a cerca de IOOmg por 1 litro da composição. Acomposição pode ser aplicada ao fruto ou tecidos de plantacomo um spray ou simplesmente em forma líquida.
Em adição a conter os lisofosfolipídios, a compo-sição também pode conter um ou mais compostos ativantes.Como aqui usado , o termo "compostos ativantes" refere-se aagentes que aperfeiçoam a tomada de capacidade de umedeci-mento e eficácia do ingrediente ativo, que é o lisòfosfoli-pídio. Exemplos de compostos ativantes que podem ser usadosno processo da presente invenção incluem etanol, tergitol esylgard 309 (disponível de Dow Corning Co., Midland, MI) . Oscompostos ativantes estão presentes na quantidade de cercade 0,05 a cerca de 2,0% v/v da composição.
O lisofosfolipídio preferido, LPE (18:1), é umaespécie de LPE tendo um ácido graxo de 18 carbonos contendouma única ligação dupla. LPE (18:1) foi verificada ser par-ticularmente superior a outras espécies de LPE em promoçãode amadurecimento de fruto e retardo de senescência de frutoe tecidos de planta. LPI foi verificado ser comparável a LPE(18:1) e superior e LPEs outras que não LPE (18:1) em aper-feiçoamento de amadurecimento de fruto e em retardo de se-nescência de fruto e outros tecidos de planta.
Como mostrado nas patentes US 5 126 155 e 5 110341, LPE é eficaz em aperfeiçoamento de amadurecimento e es-tabilidade de fruto. O exato mecanismo através do qual estesefeitos são obtidos é somente parcialmente entendido. Foimostrado na patente US 5 126 155 e 5 110 341 que LPE foi ob-servada estimular produção de etileno e suprimir respiraçãoem fruto. Foi especulado que estes efeitos podem ser respon-sáveis pelo aperfeiçoado amadurecimento e estabilidade defruto tratado com LPE. Senescência retardada de fruto e te-cidos de planta tratados com LPE foi verificada estar rela-cionada com reduzido vazamento de eletrólitos através demembranas (5). Assim, os inventores suspeitam que LPE poderegular um processo chave de deterioração de membrana em se-nescência e envelhecimento de planta.
Vazamento aumentado de eletrólitos durante senes-cência de planta tem sido atribuído à ruptura de fosfolipí-dios de membrana (1,2). Reduzido vazamento de eletrólitos emfolhas, flores e frutos pós-colheita tratados com LPE sugereque LPE pode proteger integridade de membrana através deinibição de degradação de lipídio de membrana (3) . Baseadonas cinéticas de liberação de vários produtos lipolíticos invivo e in vitro, fosfolipase D (daqui por diante referidacomo "PLD") foi proposta mediar a degradação seletiva defosfolipídios de mebrana, que é um evento rápido e inicialocorrendo em tecidos senescentes (4-9) . Um aumento em ex-pressão de PLD foi observado eai tecidos de folha senescentee a expressão de PLD foi caracterizada através de modos com-plexos incluindo um aumento em PLD associada com membrana,expressão diferencial de variantes PLD, e mudanças em quan-tidades de proteína PLD e ARNm (10).
Como aqui descrito, os inventores demonstram que olisofosfolipídio LPE pode inibir a atividade de PLD parcial-mente purificada em uma maneira altamente específica emplantas. Como os exemplos abaixo demonstram, os lisofosfoli-pídios LPE (18:1) e LPI são inibidores particularmente for-tes de PLD. Em adição, tratamento de plantas com LPE (18:1)ou LPI está associado com reduzida produção de etileno. LPIfoi verificado ser particularmente eficaz no retardo de se-nescência em folhas, como evidenciado pelo alto teor de clo-rofila de folhas senescentes tratadas com LPE, em relação aum controle assim como comparado a folhas tratadas com LPEou LPC. Consequentemente, lisofosfolipídios, tais como, masnão limitado a, LPE (18:1) e LPI são agentes particularmenteatraentes para retardo de senescência de fruto e tecidos deplanta. Os inventores também demonstram que LPE (18:1) e LPIsão particularmente eficazes em aperfeiçoamento de amadure-cimento e estabilidade de fruto.
A título de exemplo e não de limitação, exemplosda presente invenção serão dados agora.
EXEMPLO 1:Inibição específica de PLD por LPE(18:1) e LPI
Exemplo Ia: Compostos Químicos e Materiais dePlanta
Lisofosfolipídios naturais purificados de gema deovo, fígado bovino, e LPE de soja e sintética com difrentescadeias acila (14:0, 16:0, 18:0, 18:1) foram obtidos deAvanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama). Todos os outroscompostos químicos fosfolipídios e materiais usados foramobtidos de Sigma (St. Louis, MO). Fosfolipídios e ácido gra-xo foram dissolvidos em clorofórmio:metanol:KOH (95:5:1,v/v). Após água ser adicionada, solventes orgânicos foramexpelidos através de fluxo de gás nitrogênio. Concentraçõesde solução estoque foram ajustadas para ImM com água antesde serem adicionadas à mistura de reação PLD. A solução LPEpara tratamento de fruto e tecidos de planta foi preparadaem massa através de sonificação de pulverizado LPE suspensoem água sem o uso de solventes orgânicos.
PLD de repolho parcialmente purificada, que comu-mente tem sido usada para investigação de aspectos bioquími-cos e fisiológicos de PLD (11,12), foi dissolvida em 50mMTris (pH 8,0) e adicionada à mistura de reação com uma con-centração final de 0,6μg/ml de modo a examinar-se o efeitode LPE sobre atividade PLD.
Em adição a PLD de repolho parcialmente purifica-da, os inventores também investigaram o efeito de LPE sobreas atividades de PLD associada a membrana e PLD solúvel queforam obtidas de duas fontes de plantas, isto é, repolho(Brassica oleracea L. Blue Vintage) e mamona (Ricinus communisL. Cv. Hale). Plantas de mamona foram cultivadas em jarros deplásticos contendo uma mistura de vermiculita e "parlayed"(1:1, v/v), as quais foram sub-irrigada a 22°C com soluçãonutriente Hoagland sob luzes fluorescentes, brancas, frias(15C^moles minuto_1m"2) com um fotoperíodo de 14 horas (10) .Repolho foi obtido fresco do mercado.
Exemplo Ib: Fracionamento de Tecido
Folhas inteiramente expandidas de plantas de_ma-mona de dois meses de idade e repolho foram colhidas^rapi-damente congeladas em nitrogênio líquido, e homogeneizadascom um,almofariz e pistilo resfriados sobre gelo (13). Umtampão de extração contendo Tris-HCl 50mM (pH 8,0), Kcl10mM, EDTA ImM, PMSF 0,5mM, e DTT 2mM foi adicionado àsamostras pulverizadas. Após trituração por 5 minutos adicio-nais, o homogenato foi centrifugado em 6000g por 10 minutospara remoção de debris. 0 sobrenadante foi centrifugado a100 00Og por 3 0 minutos para fracionar o extrato em PLD so-lúvel e associado a membrana. 0 sobrenadante resultante foicoletado como a fração solúvel e a pelota como a fração demembrana. A fração de membrana foi lavada uma vez com tampãoextrato para remover contaminantes solúveis. As amostras dePLD solúvel e PLD associada a membrana foram adicionadas àsmisturas de reação em concentrações finais de 100μg/ml e10μg/ml, respectivamente.
Exemplo Ic: Ensaio de Atividade PLDA atividade de PLD de repolho parcialmente purifi-cada foi ensaiada através de medição de teor de fósforo con-tido em fosfatidil etanol (daqui por diante referida como"PEOH") e ácido fosfatídico (daqui por diante referido como"PA") liberados a partir do substrato fosfatidil colina (da-qui por diante referido como "PC") (13) . Para este ensaio,2C^moles de PC de ovo em clorofórmio foram secados sob umacorrente de gás nitrogênio. 0 lipídio foi emulsif içado emIml de H2O por sonificação em temperatura ambiente. Uma mis-tura de ensaio de enzima padrão conteve IOOmM Mes/NaOH (pH6,5), 50mM CaCl2, 0, 5mM SDS, 20μ1 substrato (0,4μΓηο1ε3 PC),1% etanol, e 20μ1 PLD em um volume total de 200μ1 (14) . Amistura de ensaio foi então incubada a 30°C por 3 0 minutosno banho de água. A reação foi interrompida por adição de750μ1 clorofórmio:metanol (1:2). Clorofórmio (200μ1) foiadicionado à mistura seguido por 200μ1 de Kcl (2M) . Apósformação de vórtice, as fases de clorofórmio e aquosa foramseparadas por centrifugação em 12000g por 5 minutos. A faseclorofórmio foi coletada e secada. As amostras secadas foramdissolvidas em 50μ1 de clorofórmio antes de serem feitaspontos sobre uma placa de TLC (sílica gel G) . A placa foidesenvolvida com solvente clorofórmio:metanol:NH4OH(65:35:5). Lipídios sobre placas foram visualizados atravésde exposição a vapor de iodo. Pontos correspondendo aos pa-drões lipídios PEOH, PA e PC foram raspados em frascos e asquantidades foram determ inadas através de medição de teorde fósforo como descrito em Rouser et al. (15). PEOH, o pro-duto de reação de trans-fosfatidilação, foi usado como o in-dicador de atividade PLD antes que PA, o produto de reaçãohidrolítica, uma vez que o primeiro não é facilmente metabo-lizado.
A atividade PLD associada com as frações de mem-brana e solúvel obtida de tecidos de repolho e mamona forammedidas por quantificação da liberação de PEOH e PA rádio-rotulados a partir do substrato PC (10) . Para este propósi-to, 0,4μ0ί de L-3-fosfatidil colina,1,2-di-[1-C14] palmitoí-Ia (Amersham (Arlington Heights, IL)) foram misturados com20μτηοΐ63 de PC de ovo em clorofórmio. A condição de ensaio eseparação de produto de reação foram as mesmas como descritoacima. Radioatividade em PEOH, PA e PC raspados da TLC foiquantificada por espectroscopia de cintilação.
Exemplo Id: Tratamento LPE e Produção Etileno Fruto
Tratamento pós-colheita de tecidos de fruto comLPEovo (que é purificada de ovo e consiste principalmente emLPE 16:0 e LPE 18:0) foi anteriormente verificado retardarsenescência e aperfeiçoar vida de prateleira de frutos(3,16). Entretanto, o impacto de diferentes cadeias acila deLPE sobre senescência de fruto não foi investigado . No pre-sente estudo, complementarmente ao efeito de diferentes ca-deias acila de LPE sobre atividade PLD, os inventores in-vestigaram o efeito de diferentes cadeias acila de LPE sobreprodução de etileno de frutos uva do monte. Frutas uva domonte inteiramente amadurecidas (Vaccinium macrocapon Ait.iStevens') foram colhidas durante o outono e mantidas em umasala resfriada. Frutas uva do monte pós-colhidas seleciona-das randomicamente (15 frutas por amostra) foram imersas emsoluções LPE com diferentes cadeias acila (ΙΟΟμΜ) por 30 mi-nutos, então secadas com ar e deixadas em temperatura ambi-ente (26±2°C) . Após dois dias, uvas do monte foram incubadasem um jarro de vidro selado por 24 horas de modo a medir-seprodução de etileno. Etileno foi quantificado com um croma-tográfo de gás equipado com um detetor de ionização de chama(Shimadzu 9AM, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)(3).
Exemplo Ie: Efeito de lisofosfolipídios sobre teorde clorofila de folha
Para avaliar a relativa eficácia de várias espéci-es de lisofosfolipídios em retardo de senescência em folhas,soluções de tratamento contendo ácido lisofosfatídico (LPA),lisofosfatidil colina (LPC), LPE, LPI, ou água foram aplica-das a folhas. 0 teor de clorofila de cada amostra foi medidoatravés de processos padrões (10) após uma senescência deoito dias. Os relativos teores de clorofila foram expressoscomo a porcentagem do controle.
Exemplo If: Resultados e DiscussãoInibição de Atividade PLD por LDE Com Diferentes Cadeias AcilaOs inventores estudaram se I.PE um Êosfolipídioocorrendo naturalmente, atua como um mediador de lipídio bi-ologicamente ativo através de inibição de atividade PLD invitro em uma maneira específica. Os efeitos inibidores deLPE sobre PLD repolho parcialmente purificada foram ensaia-dos usando-se PC como substrato. A atividade PLD foi inibidapor LPE com diferentes cadeias acila nas concentrações de 40e 2 00μΜ (Fig. 1). A extensão de inibição aumentou com o com-primento e a insaturação de cadeias acila. LPE com uma ca-deia acila de 18:1 foi o inibidor mais eficaz entre as espé-cies tratadas e a resultante atividade PLD foi 16% e 11% docontrole nas concentrações LPE de 40 e 200μΜ, respectivamen-te. Por outro lado, LPE 14:0, que é raramente presente emtecidos de planta, teve efeito muito pequeno. Os efeitos deLPE com outras cadeias acila incluindo 18:2 e 18:3 podem serinteressantes para teste mas estas formas de LPE não são co-mercialmente disponíveis no momento. Uma dramática inibiçãode PLD por LPE (18:1), comparada a outras moléculas LPE tes-tadas, sugere que uma configuração específica de LPE é ne-cessária para este efeito inibidor.
Especificidade Estrutural de LPE (18:1) Para SuaInibição de PLD
0 efeito de diferentes componentes de moléculasLPE sobre atividade PLD foi testado para determinar se qual-quer especificidade estrutural foi necessária para inibiçãode LPE. 0 grupo cabeça (etanolamina) e cadeia acila (18:1ácido graxo) por si próprios não tiveram efeito sobre ativi-dade PLD (Fig. 2) . Estes resultados indicam que somente amolécula LPE intacta é capaz de inibir PLD, e uma perda dequaisquer componentes estruturais resulta em completa inefi-cácia; assim indicando sua especificidade estrutural. Defato , fosfatidil etanolamina (PE) teve algum efeito estimu-lador sobre atividade PLD. Na presença de 200μΜ PE, ativida-de PLD foi 126% do controle (Fig. 2) . Uma vez que PE é elaprópria um substrato preferencial de PLD (17) , o aumento ematividade PLD pode ser explicado por seu efeito estimulantedireto sobre PLD e/ou uma hidrólise preferencial de PE porPLD.
Dependência-Dose e Cinéticas de Inibição de PLDPor LPE (18:1)
Inibição de PLD por LPE foi dependente-dose (Fig.3). LPE (18:1) mostrou um dramático efeito inibidor na con-centração ΙΟμΜ resultando em 50% de atividade do controle eum gradual aumento de inibição com aumentada concentraçãoaté 2 0 0μΜ. Concentrações LPE de 10 e 200μΜ refletem 0,5 e 10moles porcento de fosfolipídio total em misturas de reação,respectivamente.
De modo a caracterizar inibição de PLD, os efeitosde concentração de substrato sobre inibição de PLD foramanalisados na presença e ausência de LPE (Fig. 4). Condiçõesnormais de ensaio utilizam a concentração de saturação desubstrato (2mM PC). 0 efeito inibidor de LPE (18:1) foi man-tido mesmo na concentração de substrato de 4mM (Fig. 4) . Aaparente Km para PLD foi 1, 7mM e não se altera na presençade LPE. Entretanto, a presença de LPE (18:1) resultou em umadramática diminuição em Vmax (2,9μΐΐΐο1ε3 minuto^mg"1 proteí-na), comparado ao controle (Vmax de 20, C^moles minuto^mg"1proteína). Estes resultados sugerem inibição não-competitivade PLD por LPE.
Inibição In Situ de PLD Por LPE (18:1)
Uma vez que PLD está presente não somente em umaforma solúvel na cytosol mas também em uma forma associada amembrana, os inventores determinaram inibição in situ de LPEsobre PLD associado a membrana extraído de folhas de repolhoe mamona. Atividades específicas de PLD de repolho associadoa membrana e solúvel foram diminuídas para 59% e 51% do con-trole na presença de LPE (18:1), respectivamente (Tabela1) . Atividades de PLD de mamona solúvel e associado a mem-brana também foram diminuídas para 31% e 30% do controle,respectivamente. Estes resultados indicam que ambas ativida-des de PLD solúvel e associado com membrana são inibidas porLPE. A inibição de PLD associada com membrana e frações so-lúveis foi, entretanto, menos pronunciada que a inibição dePLD de repolho parcialmente purificada por LPE (Fig. 1 e Ta-bela 1) . Isto talvez seja devido à presença de alguns fa-tores interferindo ou à presença das outras formas de PLDque são menos sensíveis a LPE. Purificação parcial de PLD,por isso, foi sugerida ser crítica em caracterização de me-canismo regulador de PLD (18). Por esta razão, no presenteestudo, os inventores usaram PLD de repolho parcialmente pu-rificada, que é comercialmente disponível. Entretanto, oefeito inibidor observado de LPE sobre PLD associado a mem-brana e solúvel extraído de tecidos de folha suporta os re-sultados obtidos com PLD parcialmente purificada.
Tabela 1. Inibição de atividades de PLD associadoa membrana e solúvel (nmol minuto"1mg'1 proteína) porLPE (18:1). Dados são média ± SE de duas extrações separadas(experimentos duplicata de cada extração) preparadas de fo-lhas de repolho e mamona.
<table>table see original document page 19</column></row><table>
Inibição de Produção de etileno de Fruto Por LPECom Diferentes Cadeias Acila
Previamente, LPEovo (extraído de gema de ovo) foiverificado retardar senescência de fruto como indicado pordiminuídas taxas de produção de etileno quando comparado aocontrole (3). Uma vez que os inventores verificaram que aeficácia inibidora de LPE sobre PLD foi dependente do com-primento e insaturação de cadeia acila de LPE (Fig. 1) , osefeitos de LPE com diferentes cadeias acila sobre senescên-cia de fruto foram testados. Frutas uva do monte foram tra-tadas com LPE com 14:0, 16:0, 18:0 e 18:1 comprimentos decadeias, e produção de etileno por estas frutas foi monito-rada. A inibição de produção de etileno aumentou com compri-mento de cadeia acila e a insaturação de LPE (Tabela 2) .LPE(18:1) resultou na diminuição mais dramática (40%) emprodução de etileno 2 dias após tratamento. Interessantemen-te, este padrão de inibição de produção de etileno por vári-os tipos de LPE foi similar ao padrão de inibição de PLD porvários tipos de LPE (Fig. 1) . Estes resultados indicam queinibição de atividade PLD e produção de etileno são consis-tentemente dependentes do comprimento de cadeia acila e ainsaturação de LPE. Estes resultados sugerem que LPE(18:1) ésuperior a outras espécies LPE testadas em inibição de PLDe retardo de senescência de fruto.
Tabela 2. Inibição de produção de etileno em fru-tas uva do monte por LPE (ΙΟΟμΜ) com diferentes cadeias aci-la. Valores são média ± SE de três réplicas
<table>table see original document page 20</column></row><table>Regulação Estruturalmente Seletiva de PLD por Li-sofosfolipídios
Endereçando a se a inibição de PLD pode ocorreratravés de uma ampla faixa de lisofosfolipídios, o efeitoinibidor de LPE sobre PLD foi comparado a inibição por rela-cionados lisofosfolipídios presentes em células de planta(Fig. 5). Lisofosfatidil colina (daqui por diante referidacomo "LPC"), lisofosfatidil glicerol (daqui por diante refe-rido como "LPG") e lisofosfatidil serina (daqui por diantereferida como "LPS") não afetam significantemente atividadePLD. Entretanto, LPI mostrou efeitos inibidores um pouco si-milares àqueles de LPE. Enquanto isso, ácido lisofosfatídico(daqui por diante referido como "LPA") aumentou significan-temente atividade PLD (Fig.5). Por exemplo, em concentraçãode 2 00μΜ de LPI e LPA, e atividade PLD foi 31% e 169% docontrole, respectivamente. 0 único lisofosfolipídio sintéti-co testado na Fig. 5 foi LPA. Todos os outros lisofosfolipí-dios foram de fontes naturais contendo primariamente 16:0 ou18:0 ácidos graxos. Em adição a LPA (16:0) (Fig.5), os inven-tores também testaram LPA (18:1) e encontraram resultadossimilares a partir de dois tipos de LPA. No presente estu-do, LPE mas não LPC teve um forte efeito inibidor sobre PLD(Fig.5). Estes resultados indicam que o efeito regulador delisofosfolipídios individuais sobre enzima PLD é muito espe-cífico e estruturalmente seletivo.Em adição a LPE, os resultados sugerem que LPItambém pode ser um mediador lipídio para retardo de senes-cência em plantas.
Senescência de Folha Retardada Por LPI
0 teor de clorofila de folhas senescentes tratadascom LPI foi verificado ser muito maior que folhas tratadascom LPA, LPC ou LPEovo (Fig. 6) . Este resultado indica queLPI é particularmente eficaz no retardo de senescência defolha.
Em resumo de exemplo 1, para o conhecimento do in-ventor, este é o primeiro estudo mostrando uma regulaçãoinibidora específica de PLD por LPE (18:1) e LPI, que visadiretamente a atividade de enzima PLD. Esta é uma verifica-ção significante uma vez que não existem inibidores especí-ficos conhecidos de PLD em plantas e animais (19) . Foi tam-bém mostrado que tratamento de frutas de plantas comLPE(18:1) reduz produção de etileno mais que espécies LPEcom menores comprimentos de cadeia alquila ou um maior graude insaturação. Porque ambos, etileno e PLD estão associadoscom senescência em plantas, é razoavelmente esperado queLPE(18:1) e LPI sejam particularmente eficazes em retardo desenescência em fruto e tecidos de planta que outras espéciesde LPE.
EXEMPLO 2:
Retardo de Senescência e Aperfeiçoamento de Vidade Prateleira de FloresEspigas florescentes de snapdragon (Antirrhinummajus L.cv. Potomac White) foram colhidas e liberadas de umcultivador comercial por toda a noite (20) . No recebimento,a extremidade de caule de espigas foram recortadas sob águadestilada e deixadas reidratar por 2 horas. Após reidrata-ção, espigas foram cortadas para um comprimento de 4Ocm e asfolhas sobre os 18cm inferiores da espiga foram removidas.Isto evitou que folhas se tornem fonte de contaminação bac-terial e de fungo no vaso . Todas as espigas foram entãoreunidas e randomicamente selecionadas para tratamento.LPE(18:1), LPI e LPEovo foram preparadas em água destilada.Sonificação foi usada para facilitar dissolução de LPE e ou-tros lisofosfolipídios em água.
Para o tratamento de LPE, a extremidade cortadadas espigas foram mantidas por 24 horas em uma solução deLPE nas diferentes concentrações. A seguir, elas foramtransferidas para água destilada e mantidas naquela água por3 semanas. Espigas foram observadas para abertura de brotosflorais e também para sintomas de senescência (definhamentoe acastanhamento) . Se o colo da flor torna-se definhado, aflor foi considerada ser não-comercializável. Uma espiga foiconsiderada comercializável tanto quanto ela permaneceu túr-gida (nãodef inhada) e quando mais que 50% das florzinhaspermaneceram saudáveis. No final do estudo, o teor de águade folhas de espiga foi determinado como um indicador deturgidez e saúde de folha através de medição de razão depeso fresco versus seco.Como mostrado abaixo na Tabela 3, tratamento deLPEovo (LPE purificado de ovo) foi capaz de retardar senes-cência como comparado a controle; no primeiro 37-52% de es-pigas definharam enquanto no controle 76% das mesmas defi-nharam após 7 dias de tratamento. Tratamento com LPE(18:1) eLPI foi particularmente efetivo no aumento de vida de vasode flores de boca-de-leao; somente 30-39% e 15-22% de espi-gas definharam, respectivamente, nestes dois tratamentos.LPE (18:1) e LPI nao somente aumentaram vida de vaso de flormas também aperfeiçoaram a sensibilidade das flores a esteslipídios. Por exemplo, 5mg/L de LPI e LPE(18:1) renderammais prolonamento de vida de vaso de flor que 2 5mg/L de LPE-ovo, indicando que LPI e LPE (18:1) sao formas mais ativasentre lisofosfolipídios para o retardo de senescencia. Flo-res tratadas com LPI e LPE(18:1) permaeceram comercializá-veis até 13 dias enquanto flores tratadas com áua e florestratadas com LPEovo permaneceram comercializáveis por 4 diase 7 dias, respectivamente. Teor de água de espigas tratadascom LPE(18:1) e LPI foi maior que aquele de espigas tratadascom LPEovo e água em 18 dias após tratamento. Estes dadossão consistentes a aperfeiçoada vida de prateleira de florestratadas com LPE(18:1) eLPI. Estes dados suportam queLPE(18:1) e LPI são superiores a LPEovo.Tabela 3
<table>table see original document page 25</column></row><table>
Dados são média ± SE de dois experimentos independentes.
Cada experimento foi feito com 12 espigas por tratamento.
**Vida de vaso: dias quando > 50% de espigas permaneceram comercializáveisEspigas florescendo de cravo (Dianthus caryo-phyllus L. Cv. White Sim) obtidas de um plantador comercialforam tratadas com vários lipídios como descrito acima parabocas-de-leão. Como com bocas-de-leão, LPI e LPE (18:1) em25mg/L foram superiores a LPEovo e controle em prolongamentode vida de vaso de cravos (Tabela 4). LPEsoja (LPE purifica-da de soja) também rendeu melhor vida de prateleira que LPE-ovo(LPE purificada de ovo). LPEsoja consiste em 64% LPE in-saturada, tal como LPE(18:1), LPE(18:2), e LPE(18:3) e 3 0%LPE saturada tal como LPE(16:0) e LPE(18:0), e 2% LPI (dis-ponível de avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Alabama),enquanto LPEovo contem principalmente (>94%)LPE saturada talcomo LPE(16:0) e LPE(18:0). Este resultado suporta a conclu-são do inventor de que LPE (18:1) e LPI são superiores a ou-tras espécies LPE em prolongamento de vida de vaso de flores.
<table>table see original document page 26</column></row><table>*Dados são média ± SE de 3 6 flores por tratamento. (9 flo-res/ replicação)
Exemplo 3:Retardamento de Senescência de Fruto
Frutos verdes maduros de tomate (Lycopersicon es-culentum cv. H9144) foram colhidos de plantas de três mesesde idade. Frutos colhidos foram imersos nas soluções de Ii-sofosfolipídios indicadas na Tabela 5 abaixo, na concentra-ção de 100mg/L em etanol 1% por 20 minutos. Os tomates con-troles foram imersos em água destilada contendo etanol 1%.Após imersão, os frutos foram estocados em temperatura am-biente por 3 semanas. Produção de gás etileno foi medida 7dias após tratamento. A taxa de produção de etileno pelosfrutos aumentou gradualmente quando os frutos começaram aamadurecer. Enquanto verde maduro em dia 0 não teve produçãode etileno, os frutos controles não-tratados produziram eti-leno na taxa de l,26nl/g.h_1 após 7 dias de tratamento (verTabela 5 abaixo). Frutos tratados com LPEovo mostraram pro-dução de etileno similar a controle. Enquantoambos frutostratados com LPE(18:1) e LPI mostraram supressão de produçãode etileno, e esta taxa foi somente cerca de metade do con-trole, em frutos tratados com LPEovo, supressão de produçãode etileno correlacionou-se com prolongamento de vida deprateleira de frutos. Consistente com esta espectativa, asporcentagens de frutos podres após 3 semanas de incubaçãotambém indicaram que LPE(18:1) e LPI são particularmentemais eficazes que LPEovo e o controle no aumento de vida deprateleira de tomates. LPEsoja foi verificada ser melhor queLPEovo em termos de prolongamento de vida de prateleira defrutos (24% de frutos podres em LPEovo e 15% em LPEsoja) .
Tabela 5
<table>table see original document page 28</column></row><table>
Toda solução preparada em etanol 1% (v/v)
**Dados são média ± SE de dois experimentos independentes.
Cada experimento teve 9 frutos por tratamento.
Exemplo 4:Retardamento de Senescência de Folha In-duzido por Ethephon
Ethephon, também conhecido como Ethrel, (Ethrel éuma marca registrada de Rhone-Poulenc Ag. Co. (Research Tri-angle Park, NC) ) é uma formulação aquosa que se decompõe emetileno e é amplamente usado para maximizar o rendimento defrutos de tomate maduros em operações uma vez-sobre colhei-tas. A presente invenção demonstra que LPE(18:1) é superiora LPEovo e outros lisofosfolipídios em proteção de folhas apartir de senescência de folha induzida por ethephon. Plan-tas de tomate cv. H9144 foram desenvolvidas em uma estufapor dois meses e meio para servir como fontes de amostras defolhas. Planta foi espargida para escorrer com ethephon em1000mg/L ou com ethephon plus misturas de lisofosfolipídioscomo mostrado na Tabela 6 abaixo. Soluções de lisofosfolipí-dos em 50mg/L foram preparadas em etanol 1% (v/v) e mistura-das com ethephon (lOOOmg/L). Plantas controles foram espar-gidas com ethephon sozinho em etanol 1% (v/v). Senescênciade folhas tratadas foi quantificada 10 a 14 dias após trata-mento através de medição de teor de clorofila e proteína.Tecido de folha espargido com ethephon mostrou dramáticaperda em teor de clorofila e proteína como mostrado na Tabe-la 6 abaixo. LPEovo retardou significantemente senescênciainduzida por ethephon. LPE(18:1) mostrouretardamento muitomelhor de senescência de folha causada por ethephon. LPIteve um pequeno efeito de retardamento sobre senescência defolha induzida por ethephon. Estes resultados demonstram queLPE(18:1) trabalha mesmo melhor que outras formas de LPEpara este propósito.
Tabela 6
<table>table see original document page 29</column></row><table>
Toda solução foi preparada em etanol 1% (v/v)."Dados são média ± SE de três experimentos independentes.Dados foram coletados 10 a 14 dias após tratamento.
Exemplo 5: Aperfeiçoamento de Amadurecimento deFruto
Este experimento foi conduzido para comparar osefeitos de LPEovo, LPE(18:1) e LPI sobre amadurecimento defruto. Plantas de tomate cv. H9478 foram desenvolvidas empotes por dois meses e meio sob luzes fluorescentes. Plantasinteiras tendo cerca de 10% de seus frutos no estágio deamadurecimento foram espargidas com uma solução contendo100mg/L de diferentes lisofosfolipídios tais como LPEovo,LPE(18:1) ou LPI. Todas as soluções contiveram etanol 1% esylgard 309 0,05% (Dow Corning Co., Midland, MI) como agen-tes ativantes. Plantas controles receberam água destiladacontendo etanol 1% e sylgard 309 0,05%. Frutos foram colhi-dos 10 dias após tratamento e graduados em verde, vermelhoparcial, e vermelho (indicando inteiro amadurecimento). LPE-ovo aperfeiçoou significantemente amadurecimento de frutocomparado ao controle como anteriormente mostrado nas paten-tes US 5 126 155 e 5 110 341 (ver Tabela 7). Entretanto, LPIe LPE(18:1) foram verificados mais eficazes que LPEovo. LPIe LPE(18:1) também aperfeiçoaram estabilidade de fruto atra-vés de prolongamento de vida de prateleira de frutos pós-colheita comparados a controle e LPEovo (ver Tabela 7).Tabela 7
<table>table see original document page 31</column></row><table>
*Todas as soluções foram preparadas em etanol 1% (v/v) esylgard 309 0,05%. Aplicações de espargimento foram feitas10 dias antes de colheita.
**Dados são média representando três experimentos indepen-dentes.
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Claims (11)
1. Método para retardar a senescência em fruta eem outros tecidos de plantas, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende a etapa de aplicar à fruta e a outros tecidos deplantas uma composição compreendendo lisofosfatidilinositolou lisofosfatidiletanolamina (18:1), um agente ativador oucombinações destes.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é uma soluçãoaquosa.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é aplicada antesou após a colheita.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a composição contém uma quan-tidade eficaz de lisofosfatidilinositol, lisofosfatidileta-nolamina (18:1) ou combinações destes para retardar a senes-cência em frutas e em outros tecidos de plantas.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição contém de cercade 0,5 a cerca de 1.000 mg por litro de lisofosfatidilinosi-tol, lisofosfatidiletanolamina (18:1) ou combinações destes.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente ativador é etanol,TERGIT0L® ou SYLGARD® 30 9.
7. Método para intensificar o amadurecimento e es-tabilidade de frutas CARACTERIZADO pelo fato de que compre-ende a etapa de aplicação pré-colheita a tecidos de plantasinteiras uma composição que compreende lisofosfatidilinosi-tol ou lisofosfatidiletanolamina (18:1), um agente ativadorou combinações destes.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é uma soluçãoaquosa.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que a composição contém uma quan-tidade eficaz de lisofosfatidilinositol, lisofosfatidileta-nolamina (18:1) ou combinações destes para intensificar oamadurecimento e estabilidade da fruta.
10. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que a composição contém de cercade 0,5 a cerca de 1.000 mg por litro de lisofosfatidilinosi-tol, lisofosfatidiletanolamina (18:1) ou combinações destes.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente ativador é etanol,TERGIT0L® ou SYLGARD® 309.
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