BR122024000188A2

BR122024000188A2 - Método para produzir óleo com ácidos graxos saturados reduzidos, e, óleo microbiano

Info

Publication number: BR122024000188A2
Application number: BR122024000188-8A
Authority: BR
Inventors: Zhiyong Sun; Alan Sothern; Kevin Berryman; Mercia Valentine; Michael Milway; Laura Purdue; Roberto E. Armenta
Original assignee: MARA Renewables Corporation
Priority date: 2016-06-10
Filing date: 2016-06-16
Publication date: 2024-02-27
Also published as: US20210040519A1; EP3469087A1; AU2020203821B2; AU2020203821A1; AU2023248065A1; AU2016410102B2; CA3027005A1; US10385370B2; CN109196108B; US20170356018A1; EP3469087A4; CN109196108A; EP4074184A1; US10851395B2; WO2017212322A1; AU2022201863B2; AU2016410102A1; US20180208954A1; CN114480519A; US11959120B2

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para produzir óleos com ácidos graxos saturados reduzidos. Os métodos incluem a cultura de micro-organismos produtores de óleo num meio de fermentação na presença de um ou mais agentes antiespumantes sob uma taxa de consumo de carbono controlada, em que a cultura produz óleos que compreendem ácidos graxos, e em que menos do que 35% dos ácidos graxos no óleo são ácidos graxos saturados.

Description

FUNDAMENTOS

[001] Os óleos microbianos têm atraído uma atenção significativa comercial e do consumidor como uma fonte sustentável, ambientalmente amigável e vegetariana de lipídios nutricionais para fornecer ácidos graxos essenciais, tais como DHA, DPA e EPA para seres humanos e animais. A produção acadêmica e industrial atual de óleo microbiano depende da descoberta de cepa de produção e/ou modificação genética para produzir óleo microbiano com composições desejadas e/ou propriedades físicas. No entanto, é desafiador personalizar o perfil de ácidos graxos dos óleos com propriedades físicas e nutricionais desejadas. A personalização do óleo é particularmente difícil de alcançar apenas através de condições de fermentação, sem modificação genética dos micro-organismos. Os óleos microbianos são tipicamente cera a condições de temperatura ambiente. Os óleos microbianos solidificados exigem aquecimento para fundir os mesmos para facilitar a manipulação. O óleo de manipulação a altas temperaturas, no entanto, pode ser difícil ou inviável para as instalações de refino de óleo comestível existentes. Além disto, a estabilidade de lipídio e a qualidade podem ser afetadas negativamente devido à exposição prolongada a temperaturas elevadas. Este óleo aquecido provavelmente requer processamento adicional para manter a qualidade lipídica, tal como a adição de antioxidantes e a aplicação de inertização rigorosa com nitrogênio. Todas estas exigências de processamento adicionais podem afetar a qualidade de lipídio final do óleo e aumentar os custos de processamento.

SUMÁRIO

[002] Métodos para produzir óleos com ácidos graxos saturados reduzidos são fornecidos no presente documento. Os métodos incluem cultivar micro-organismos produtores de óleo na presença de um ou mais agentes antiespumantes sob uma taxa de consumo de carbono controlada, em que a cultura produz óleos que compreendem ácidos graxos, e em que menos do que 35% dos ácidos graxos nos óleos são ácidos graxos saturados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[003] A Figura 1 é um gráfico que mostra a taxa de consumo de carbono não restrita durante uma fermentação com baixo teor de DHA.

[004] A Figura 2 é um gráfico que mostra o perfil de tempo de composições de ácido graxo durante a fermentação microbiana de óleo com taxa de consumo de carbono não restrita.

[005] A Figura 3 é um gráfico que mostra a taxa de consumo de carbono controlada durante uma fermentação microbiana com alto teor de DHA.

[006] A Figura 4 é um gráfico que mostra o perfil de tempo de composições de ácido graxo durante a fermentação microbiana de óleo com taxa de consumo de carbono controlada.

[007] A Figura 5 é um gráfico que mostra a taxa de consumo de carbono controlada e a adição de antiespumante contínua durante uma fermentação microbiana com alto teor de DHA/alto teor de MUFA.

[008] A Figura 6 é um gráfico que mostra o perfil de tempo das composições de ácido graxo durante a fermentação microbiana de óleo com taxa de consumo de carbono controlada e adição de antiespumante contínua.

[009] A Figura 7 é um gráfico que mostra o efeito de adição de antiespumante contínua ao perfil de ácido graxo durante a fermentação microbiana.

[0010] A Figura 8 é um gráfico que mostra a correlação entre o teor de SFA nos óleos microbianos com alto teor de DHA e seu ponto de fluidez. DESCRIÇÃO DETALHADA

[0011] É descrito no presente documento um processo de fermentação microbiana que produz óleos em ácidos graxos ômega-3 (isto é, C22:6 (n-3) ácido docosa-hexaenoico, DHA), ácidos graxos ômega-6 (isto é, C22:5 (n-6) ácido docosapentaenoico, DPA) e ácidos graxos ômega-7 (isto é, C16:1 (n-7) ácido palmitoleico e C18:1 (n-7) ácido vacênico) e com baixo teor de ácidos graxos saturados (isto é, C16:0 ácido palmítico e C14:0 ácido mirístico). Tais perfis de ácido graxo não apenas satisfazem a necessidade de os óleos serem classificados e usados como óleos nutricionais ricos em DHA ou ricos em ômega-3, os óleos também têm composição nutricional aprimorada e valor devido ao teor aumentado de ácidos graxos ômega-7. Os óleos também aprimoraram propriedades de fluxo frio aprimoradas devido ao teor reduzido de ácidos graxos saturados no óleo. Em comparação com os óleos produzidos com o uso dos métodos de fermentação anteriores, o valor nutricional aprimorado dos óleos é mostrado por um aumento em teor de ácido graxo ômega-3 (isto é, DHA) e um aumento de teor de ácido graxo ômega-7 (isto é, ácido palmitoleico e ácido vacênico) (Figura 1). As propriedades de fluxo frio aprimoradas incluem fusão pontos de fusão, turvação e fluidez aprimorados. Por exemplo, conforme descrito no presente documento, os óleos produzidos pelos métodos fornecidos incluem um ponto de fluidez reduzido tão baixo quanto -9 °C, uma gama de pontos de fluidez muito mais baixos do que de lipídios típicos produzidos por condições de processo de fermentação anteriores, que variaram entre 18 °C e 21 °C (Tabela 1).

[0012] Aplicando as condições de processo descritas no presente documento, incluindo a adição de antiespumante controlada, bem como taxa de consumo de carbono controlada, os micro-organismos foram capazes de produzir óleos com quantidades significativamente maiores de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) e ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e ácidos graxos saturados reduzidos (SFA) em comparação com óleos produzidos por meio de métodos de fermentação anteriores. Devido a estas alterações em composição de ácido graxo, os óleos tinham um ponto de fusão, ponto de turvação e ponto de fluidez reduzidos. Consequentemente, os óleos exibiram propriedades de fluxo frio significativamente aprimoradas. Além disto, os óleos contêm um valor nutricional aprimorado devido ao aumento em PUFA (DHA e DPA) e aumento em MUFA (ácidos graxos ômega-7).

[0013] Conforme usado no presente documento, o termo ponto de fusão se refere à temperatura na qual o óleo se torna completamente claro. Conforme usados no presente documento, o termo ponto de turvação se refere à temperatura do óleo na qual o óleo começa a cristalizar. Conforme usado no presente documento, o ponto de fluidez é um índice da temperatura mais baixa na qual o movimento do espécime de teste (por exemplo, óleo) é observado sob condições de teste prescritas. Estas temperaturas podem ser determinadas por métodos conhecidos que incluem os estabelecidos pela AOCS (American Oil Chemistry Society) e ASTM (American Society of Testing and Materials), que estabelecem especificações para determinar os pontos de fusão, turvação e fluidez de fluidos, tais como lipídios e óleos. Por exemplo, o ponto de fusão pode ser determinado com o uso de Método Oficial Cc 1-25 da AOCS, o ponto de turvação pode ser determinado com o uso de Método Oficial Cc 6-25 da AOCS e o ponto de fluidez pode ser determinado com o uso de Método Oficial D97 da ASTM.

[0014] É fornecido no presente documento um método para produzir óleos com ácidos graxos saturados reduzidos. O método inclui a cultura de micro-organismos produtores de óleo num meio de fermentação na presença de um ou mais agentes antiespumantes sob uma taxa de consumo de carbono controlada, em que a cultura produz óleos que compreendem ácidos graxos, e em que menos do que 35% dos ácidos graxos nos óleos são ácidos graxos saturados.

[0015] Os agentes antiespumantes adequados incluem, mas sem limitação, agentes antiespumantes à base de óleo mineral, agentes antiespumantes à base de óleo vegetal, agentes antiespumantes à base de silício, agentes antiespumantes à base de emulsão de óleo/água, agentes antiespumantes à base de polietileno glicol (PEG) e agentes antiespumantes à base de polipropileno glicol. Os agentes antiespumantes à base de óleo vegetal adequados incluem, mas sem limitação, óleo de soja e óleo de colza. Os agentes antiespumantes à base de silício adequados incluem, sem limitação, polidimetil siloxano.

[0016] Durante a cultura, o agente ou agentes antiespumantes podem ser adicionados ao meio de fermentação de modo contínuo ou intermitente. Opcionalmente, o um ou mais agentes antiespumantes são adicionados de modo contínuo ao meio de fermentação ao longo da cultura. Opcionalmente, o um ou mais agentes antiespumantes são adicionados de modo intermitente ao meio de fermentação ao longo da cultura. Opcionalmente, os agentes antiespumantes são adicionados a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 minutos ou qualquer duração de tempo entre 1 e 30 minutos inclusive, ao longo da cultura. Opcionalmente, os agentes antiespumantes são adicionados a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 segundos ou qualquer duração de tempo entre 1 e 60 segundos inclusive, ao longo da cultura. Opcionalmente, o um ou mais agentes antiespumantes são adicionados ao meio de fermentação a uma taxa de 0,0075 a 0,05 g/l por hora.

[0017] Conforme descrito no presente documento, o método inclui cultivar os micro-organismos produtores de óleo em meio de fermentação na presença de um ou mais agentes antiespumantes sob uma taxa de consumo de carbono controlada. Opcionalmente, a taxa de consumo de carbono é controlada para estar entre 1,5 e 4,5 g/l por hora. Opcionalmente, a taxa de consumo de carbono é controlada para estar entre 0,01 a 0,15 g de carbono por g de biomassa por hora. A taxa de consumo de carbono pode ser controlada por uma variedade de métodos. Opcionalmente, a taxa de consumo de carbono é controlada por meio de aeração, agitação, contrapressão de recipiente ou uma combinação dos mesmos. Opcionalmente, a taxa de consumo de carbono é controlada por meio de agitação contínua de uma fonte (ou fontes) de carbono ao longo da cultura.

[0018] Os óleos produzidos pelos métodos fornecidos têm propriedades de fluxo frio aprimoradas, por exemplo, têm temperaturas de ponto de fusão, turvação e fluidez aprimoradas. Deste modo, os óleos produzidos pelos métodos fornecidos podem ter um ponto de fusão de 20 a 33 °C ou qualquer temperatura entre 20 e 33 °C inclusive. Assim, os óleos podem ter uma temperatura de fusão de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 °C ou qualquer fração da mesma. Opcionalmente, os óleos produzidos pelos métodos fornecidos têm um ponto de turvação de 5 a 20 °C ou qualquer temperatura entre 5 e 20 °C inclusive. Desta forma, os óleos podem ter uma temperatura de ponto de turvação de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 °C ou qualquer fração da mesma. Opcionalmente, os óleos produzidos pelos métodos fornecidos têm um ponto de fluidez de -10 a 15 °C ou qualquer temperatura entre -10 e 15 °C inclusive. Assim, os óleos podem ter uma temperatura de ponto de fluidez de -10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 °C ou qualquer temperatura fracional entre as mesmas.

[0019] Conforme descrito no presente documento, a cultura dos micro-organismos produtores de óleo no meio de fermentação na presença de um ou mais agentes antiespumantes sob uma taxa de consumo de carbono controlada produz óleos que têm ácidos graxos em que menos de 35% do ácido graxo nos óleos são ácidos graxos saturados. Opcionalmente, menos do que 20% dos ácidos graxos nos óleos são ácidos graxos saturados. Opcionalmente, menos do que 25% dos ácidos graxos nos óleos são ácidos graxos saturados. Opcionalmente, menos do que 30% dos ácidos graxos nos óleos são ácidos graxos saturados. Assim, opcionalmente, menos do que 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 35% dos ácidos graxos nos óleos são ácidos graxos saturados. O percentual de ácidos graxos saturados é expresso no todo como um percentual dos ácidos graxos no óleo. Opcionalmente, de 30% a 35% dos ácidos graxos nos óleos são ácidos graxos saturados e os óleos são fluíveis a uma temperatura entre 9 e 15 °C. Opcionalmente, de 25% a 30% dos ácidos graxos nos óleos são ácidos graxos saturados e os óleos são fluíveis a uma temperatura entre -9 °C e 9 °C. Opcionalmente, menos do que 25% dos ácidos graxos nos óleos são ácidos graxos saturados e os óleos são fluíveis a uma temperatura entre 0 °C e 4 °C.

[0020] Os ácidos graxos saturados nos óleos produzidos pelo método descrito no presente documento incluem, mas sem limitação, C12:0 (ácido láurico), C14:0 (ácido mirístico), C15:0 (ácido pentadecílico), C16:0 (ácido palmítico), C17:0 (ácido margarárico) e C18:0 (ácido esteárico). Opcionalmente, a quantidade de C14:0 (ácido mirístico) produzida pela cultura de micro-organismos produtores de óleo nos métodos fornecidos é de 8 a 12% do total de ácidos graxos saturados. Opcionalmente, a quantidade de C16:0 (ácido palmítico) produzida pela cultura de micro-organismos produtores de óleo nos métodos fornecidos é de 14 a 22% do total de ácidos graxos saturados. Opcionalmente, a quantidade de C12:0 (ácido láurico), C15:0 (ácido pentadecílico), C17:0 (ácido margárico) e C18:0 (ácido esteárico) produzida pelos micro-organismos produtores de óleo cultivados nos métodos fornecidos é de 0 a 2% do total de ácidos graxos saturados

[0021] Os métodos fornecidos também produzem óleos com ácidos graxos ômega-7. Os óleos fornecidos no presente documento têm ácidos graxos ômega-7 superiores em comparação com óleos de controle produzidos por meio de métodos de fermentação anteriores. Os termos superior, aumenta, eleva ou elevação se referem a aumentos acima de um controle. Por exemplo, os níveis de controle são níveis antes, ou na ausência, de adição de um agente. Tipicamente, os óleos produzidos por meio de micro-organismos (isto é, óleos de controle) com o uso de outros métodos de fermentação têm menos do que 5% de ácidos graxos ômega-7. Conforme descrito no presente documento, a cultura dos micro-organismos produtores de óleo no meio de fermentação na presenta de um ou mais agentes antiespumantes sob uma taxa de consumo de carbono controlada, opcionalmente, produz óleos com de 10 a 30% de ácidos graxos ômega-7. Assim, do total de ácidos graxos nos óleos produzidos pelos métodos fornecidos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30% ou mais do total de ácidos graxos podem ser ácidos graxos ômega-7. Os ácidos graxos ômega-7 nos óleos incluem, por exemplo, ácido palmitoleico (C16:1(n-7)), ácido cis-vacênico (C18:1(n-7)) ou uma combinação dos mesmos.

[0022] Os óleos produzidos pelos métodos fornecidos também podem incluir ácido alfa linolênico, ácido araquidônico, ácido docosa-hexanonoico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido gama-linolênico, ácido linoleico, ácido linolênico ou uma combinação dos mesmos. Opcionalmente, os óleos compreendem ácidos graxos selecionados a partir do grupo que consiste em ácido palmítico (C16:0), ácido mirístico (C14:0), ácido palmitoleico (C16:1(n-7)), ácido vacênico (C18:1(n-7)), ácido docosapentaenoico (C22:5(n-6)), ácido docosa-hexaenoico (C22:6(n-3)) e combinações dos mesmos.

[0023] O óleo que é produzido com o uso dos métodos fornecidos pode ser obtido a partir de uma variedade de micro-organismos. O óleo pode ser derivado de uma população de micro-organismos, por exemplo, algas, fungos, bactérias e protistas produtores de óleo. Os micro-organismos são, opcionalmente, selecionados a partir do gênero Oblongichytrium, Aurantiochytrium, Thraustochytrium, Schizochytrium e Ulkenia ou quaisquer misturas dos mesmos. Opcionalmente, o micro-organismo é um traustochytrid da ordem Thraustochytriales, mais especificamente, Thraustochytriales do gênero Thraustochytrium. Micro-organismos exemplificativos incluem Thraustochytriales, conforme descrito nas Patentes NosUS 5.340.594 e 5.340.742, que são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. O micro-organismo pode ser uma espécie de Thraustochytrium, tais como as espécies Thraustochytrium depositadas como ATCC N° de Acesso PTA-6245 (isto é, ONC-T18), conforme descrito na Patente N° US 8.163.515, que é incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade. Assim, opcionalmente, os micro-organismos são da família Thraustochytriaceae. Opcionalmente, os micro-organismos são do gênero Thraustochytrium. Opcionalmente, os micro-organismos são ONC- T18.

[0024] As microalgas são reconhecidas no campo para representar um grupo diverso de organismos. Para os propósitos deste documento, o termo microalgas é usado para descrever micro-organismos unicelulares derivados de ambientes aquáticos e/ou terrestres (algumas cianobactérias são terrestres/de habitação em solo). Os ambientes aquáticos se estendem a partir de ambientes oceânicos a lagos e rios de água doce e também incluem ambientes salgados, tais como estuários e foz de rios. As microalgas podem ser fotossintéticas; opcionalmente, as microalgas são heterotróficas. As microalgas podem ser de natureza eucariótica ou de natureza procariótica. As microalgas podem ser não móveis ou móveis.

[0025] O termo thraustochytrid, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer membro da ordem Thraustochytriales, que inclui a família Thraustochytriaceae. As cepas descritas como thraustochytrids incluem os organismos a seguir: Ordem: Thraustochytriales; Família: Thraustochytriaceae; Gêneros: Thraustochytrium (Espécies: sp., arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum, striatum), Ulkenia (Espécies: sp., amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiata, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis), Schizochytrium (Espécies: sp., aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum, octosporuni), Japoniochytrium (Espécies: sp., marinum), Aplanochytrium(Espécies: sp., haliotidis, kerguelensis, profunda, stocchinoi), Althornia(Espécies: sp., crouchii), ou Elina(Espécies: sp., marisalba, sinorifica). As espécies descritas em Ulkeniasão consideradas como membros do gênero Thraustochytrium. As cepas descritas como sendo incluídas no gênero Thraustochytrium podem compartilhar traços em comum com e também serem descritas como incluídas no gênero Schizochytrium. Por exemplo, em algumas classificações taxonômicas ONC-T18 pode ser considerado dentro do gênero Thraustochytrium, enquanto em outras classificações pode ser descrito como dentro do gênero Schizochytrium porque compreende características indicativas de ambos os gêneros.

[0026] Conforme descrito, os micro-organismos fornecidos no presente documento são cultivados sob condições que produzem um composto de interesse (por exemplo, menos de 35% de ácidos graxos saturados). A cultura pode ser realizada por um a vários dias. Opcionalmente, o método inclui ainda a extração dos óleos a partir dos micro-organismos. Os métodos fornecidos incluem ou podem ser usados em conjunto com etapas adicionais para cultivar micro-organismos de acordo com os métodos conhecidos na técnica e obter os óleos a partir dos mesmos. Por exemplo, um Thraustochytrid, por exemplo, um Thraustochytrium, pode ser cultivado e extraído de acordo com os métodos descritos nas Publicações de Patente Nos US 2009/0117194, 2012/0244584 ou 2015/0176042, que são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade para cada etapa dos métodos ou composição usados no presente instrumento.

[0027] Para isolar os óleos de micro-organismos, os micro organismossão crescidos num meio de crescimento (também conhecido como meio de cultura). Qualquer um dentre uma variedade de meios é adequado para uso na cultura de micro-organismos. Opcionalmente, o meio fornece vários componentes nutricionais, incluindo uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio, para o micro-organismo. O meio para a cultura de Thraustochytrid pode incluir qualquer uma dentre uma variedade de fontes de carbono. Exemplos de fontes de carbono incluem ácidos graxos (por exemplo, ácido oleico), lipídios, gliceróis, trigliceróis, carboidratos, polióis, açúcares aminados e qualquer tipo de biomassa ou fluxo residual. Carboidratos incluem, mas sem limitação, glicose, celulose, hemicelulose, frutose, dextrose, xilose, lactulose, galactose, maltotriose, maltose, lactose, glicogênio, gelatina, amido (milho ou trigo), acetato, m-inositol (por exemplo, derivado de licor de maceração de milho), ácido galacturônico (por exemplo, derivado de pectina), L-fucose (por exemplo, derivado de galactose), gentiobiose, glucosamina, alfa-D-glicose-1-fosfato (por exemplo, derivado de glicose), celobiose, dextrina, alfa-ciclodextrina (por exemplo, derivada de amido) e sacarose (por exemplo, a partir de melaço). Os polióis incluem, mas sem limitação, eritritol e adonitol. Os açúcares aminados incluem, mas sem limitação, N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-glicosamina e N-acetil-beta- D-manosamina.

[0028] Os micro-organismos podem ser cultivados em solução salina ou meio que contém sal. O meio de cultura selecionado inclui, opcionalmente, NaCl ou sal marinho natural ou artificial e/ou água do mar artificial. Thraustochytrids podem ser cultivados, por exemplo, em meio que tenha uma concentração de sal de cerca de 0,5 g/l a cerca de 50,0 g/l, de cerca de 0,5 g/l a cerca de 35 g/l, ou de cerca de 18 g/l a cerca de 35 g/l. Opcionalmente, os Thraustochytrids descritos no presente documento podem ser cultivados sob condições de baixo teor de sal (por exemplo, concentrações de sal de cerca de 0,5 g/l a cerca de 20 g/l ou de cerca de 0,5 g/l a cerca de 15 g/l).

[0029] Alternativamente, o meio de cultura pode incluir sais de sódio que não contêm cloreto como uma fonte de sódio, com ou sem NaCl. Exemplos de sais de sódio sem cloreto adequados para utilização de acordo com os presentes métodos incluem, mas sem limitação, carbonato de sódio (carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, sulfato de sódio e misturas dos mesmos). Consulte, por exemplo, as patentes NosUS 5.340.742 e 6.607.900, cujo conteúdo integral de cada uma das mesmas é incorporado ao presente documento a título de referência. Uma porção significativa do sódio total, por exemplo, pode ser fornecida por sais sem cloreto de modo que menos do que cerca de 100%, 75%, 50% ou 25% do sódio total em meio de cultura são fornecidos por cloreto de sódio.

[0030] Os meios para culturas microbianas podem incluir qualquer uma dentre uma variedade de fontes de nitrogênio. Fontes de nitrogênio exemplificativas incluem soluções de amônio (por exemplo, NH4 em H2O), amônio ou sais de amina (por exemplo, (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, NH4NO3, NH4OOCH2CH3 (NH4Ac)), peptona, triptona, extrato de levedura, extrato de malte, farinha de peixe, glutamato de sódio, extrato de soja, ácidos casamino e grãos destiladores. As concentrações de fontes de nitrogênio em meio adequado tipicamente variam entre e incluindo cerca de 1 g/l e cerca de 25 g/l.

[0031] O meio inclui, opcionalmente, um fosfato, tal como fosfato de potássio ou fosfato de sódio. Sais inorgânicos e oligonutrientes em meio podem incluir sulfato de amônio, bicarbonato de sódio, ortovanadato de sódio, cromato de potássio, molibdato de sódio, ácido selenoso, sulfato de níquel, sulfato de cobre, sulfato de zinco, cloreto de cobalto, cloreto de ferro, cloreto de manganês e EDTA. As vitaminas, tais como cloridrato de piridoxina, cloridrato de tiamina, pantotenato de cálcio, ácido p- aminobenzoico, riboflavina, ácido nicotínico, biotina, ácido fólico e vitamina B12 podem ser incluídas.

[0032] O pH do meio pode ser ajustado entre 3,0 e 10,0, inclusive, com o uso de ácido ou base, quando apropriado, e/ou com o uso de fonte de nitrogênio. Opcionalmente, o meio pode ser esterilizado.

[0033] Geralmente um meio usado para a cultura de um micro organismoé um meio líquido. No entanto, o meio usado para a cultura de um micro-organismo pode ser um meio sólido. Além das fontes de carbono e nitrogênio, conforme discutido no presente documento, um meio sólido pode conter um ou mais componentes (por exemplo, ágar ou agarose) que fornecem suporte estrutural e/ou permitem que o meio esteja sob a forma sólida.

[0034] A biomassa resultante pode ser pasteurizada para inativar substâncias indesejáveis presentes na biomassa. Por exemplo, a biomassa pode ser pasteurizada para inativar substâncias degradantes de composto, tais como enzimas degradantes. A biomassa pode estar presente no meio de fermentação ou isolada do meio de fermentação para a etapa de pasteurização. A etapa de pasteurização pode ser executada aquecendo-se a biomassa e/ou o meio de fermentação a uma temperatura elevada. Por exemplo, a biomassa e/ou o meio de fermentação pode ser aquecido a uma temperatura de cerca de 50 °C a cerca de 95 °C (por exemplo, de cerca de 55 °C a cerca de 90 °C ou de cerca de 65 °C a cerca de 80 °C). Opcionalmente, a biomassa e/ou meio de fermentação podem ser aquecidos a partir de cerca de 30 minutos a cerca de 120 minutos (por exemplo, de cerca de 45 minutos a cerca de 90 minutos, ou de cerca de 55 minutos a cerca de 75 minutos). A pasteurização pode ser executada com o uso de um meio de aquecimento adequado, tal como, por exemplo, por injeção de fluxo direto.

[0035] A biomassa pode ser colhida de acordo com uma variedade de métodos, incluindo aqueles atualmente conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, a biomassa pode ser coletada a partir do meio de fermentação com o uso de, por exemplo, centrifugação (por exemplo, com uma centrífuga de ejeção sólida) e/ou filtração (por exemplo, filtração de fluxo cruzado). Opcionalmente, a etapa de colheita inclui o uso de um agente de precipitação para a coleta acelerada de biomassa celular (por exemplo, fosfato de sódio ou cloreto de cálcio).

[0036] A biomassa é opcionalmente lavada com água. A biomassa pode ser concentrada até cerca de 20% de sólidos. Por exemplo, a biomassa pode ser concentrada a partir de cerca de 1% a cerca de 20% de sólidos, de cerca de 5% a cerca de 20%, de cerca de 7,5% a cerca de 15% de sólidos, ou a qualquer porcentagem dentro das faixas recitadas.

[0037] Opcionalmente, os óleos podem ainda ser processados, por exemplo, por meio de winterização. Antes da winterização, os óleos ou ácidos graxos poli-insaturados são obtidos ou extraídos da biomassa ou micro organismos com o uso de um ou mais dentre uma variedade de métodos, incluindo aqueles atualmente conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, os métodos para isolar óleos ou ácidos graxos insaturados são descritos na Patente N° US 8.163.515, que é incorporada em sua totalidade ao presente documento a título de referência. Alternativamente, os óleos ou ácidos graxos poli-insaturados são isolados, conforme descrito na Publicação N° US 2015/0176042, que é incorporada em sua totalidade ao presente documento a título de referência. Opcionalmente, os um ou mais ácidos graxos poli-insaturados são selecionados a partir do grupo que consiste em ácido alfa linolênico, ácido araquidônico, ácido docosa-hexanonoico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido gama-linolênico, ácido linoleico, ácido linolênico e combinações dos mesmos.

[0038] Os óleos, lipídios ou derivados dos mesmos (por exemplo, ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) e outros lipídios) podem ser utilizados em qualquer uma dentre uma variedade de aplicações que exploram suas propriedades biológicas, nutricionais ou químicas. Assim, os óleos, lipídios ou derivados dos mesmos podem ser usados para produzir biocombustível. Opcionalmente, os óleos, lipídios ou derivados dos mesmos, são usados em produtos farmacêuticos, nutracêuticos, suplementos alimentícios, aditivos alimentícios animais, cosméticos e similares.

[0039] Opcionalmente, as frações líquidas de óleos ou as frações sólidas de óleos produzidos de acordo com os métodos descritos no presente documento podem ser incorporadas a um produto final (por exemplo, um suplemento alimentar, uma fórmula infantil, um produto farmacêutico, um combustível e similares). Opcionalmente, as frações sólidas são incorporadas em ração animal. Opcionalmente, as frações líquidas são incorporadas num suplemento alimentar, por exemplo, um suplemento nutricional ou dietético, tal como uma vitamina. Os suplementos alimentares adequados nos quais os óleos ou lipídios podem ser incorporados incluem bebidas tais como leite, água, bebidas desportivas, bebidas energéticas, chás e sucos; confeitos, tais como doces, geleias e biscoitos; alimentos e bebidas que contêm gordura, tais como produtos lácteos; produtos alimentícios processados, tais como arroz suave (ou mingau); fórmulas infantis; cereais de café da manhã; ou similares.

[0040] Opcionalmente, um ou mais dos óleos ou compostos (por exemplo, PUFAs) podem ser incorporados num produto nutracêutico ou farmacêutico. Exemplos de produtos nutracêuticos ou farmacêuticos incluem vários tipos de comprimidos, cápsulas, agentes bebíveis, etc. Opcionalmente, o produto nutracêutico ou farmacêutico é adequado para a aplicação tópica. As formas de dosagem podem incluir, por exemplo, cápsulas, óleos, granula, granula subtilae, pós, comprimidos, pílulas, losangos ou similares.

[0041] Os óleos ou porções de óleo dos mesmos produzidos de acordo com os métodos descritos no presente documento podem ser incorporados em produtos, conforme descrito no presente documento em combinação com qualquer um dentre uma variedade de outros agentes. Por exemplo, tais compostos podem ser combinados com um ou mais ligantes ou cargas, agentes quelantes, pigmentos, sais, tensoativos, hidratantes, modificadores de viscosidade, espessantes, emolientes, fragrâncias, conservantes, etc., ou qualquer combinação dos mesmos.

[0042] São revelados materiais, composições e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados na preparação de, ou são produtos dos métodos e composições revelados. Estes e outros materiais são revelados no presente documento, e entende-se que quando combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc. destes materiais são revelados, embora a referência específica de cada uma dentre as várias combinações e permutações individuais e coletivas destes compostos não seja explicitamente revelada, cada uma é especificamente contemplada e descrita no presente documento. Por exemplo, se um método for revelado e discutido e uma série de modificações que podem ser feitas a uma série de moléculas incluindo o método for discutida, toda combinação e permutação do método, e as modificações que são possíveis serão especificamente contempladas a menos que especificamente indicado ao contrário. Da mesma forma, qualquer conjunto ou combinação das mesmas também é especificamente contemplada e revelada. Este conceito se aplica a todos os aspectos desta revelação, incluindo, mas sem limitação, etapas em métodos que utilizam as composições reveladas. Assim, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser executadas, entende-se que cada uma destas etapas adicionais pode ser realizada com quaisquer etapas específicas do método ou combinação de etapas de método dos métodos revelados, e que cada combinação ou subconjunto de combinações é especificamente contemplado e deve ser considerado revelado.

[0043] As publicações citadas no presente documento e o material para o qual as mesmas são citadas são, pelo presente, especificamente incorporadas em sua totalidade a título de referência.

[0044] Os exemplos abaixo são destinados a ilustrar ainda mais os aspectos dos métodos e composições descritos no presente documento, e não pretendem limitar o âmbito das reivindicações.

EXEMPLOS

[0045] Uma cepa de thraustochytrid denominada T18 foi usada em todos os exemplos. Semelhante a outros thraustochytrids, esta cepa produz lipídios que contêm vários ácidos graxos principais, incluindo o C14:0 ácido mirístico, C16:0 ácido palmítico, C16:1 (n-7) ácido palmitoleico, C18:1 (n-9) ácido vacênico, C22:5 (n-6) ácido docosapentaenoico (DPA) e C22:6 (n-3) ácido docosa-hexaenoico (DHA). Conforme descrito no presente documento, dependendo das condições de fermentação aplicadas, o nível de síntese de cada um dos principais ácidos graxos pode ser alterado e, consequentemente, o teor relativo destes principais ácidos graxos dentro de todo o óleo pode ser variado. As diferentes condições de processo levam a síntese lipídica a perfis mais desejáveis de ácidos graxos, a saber maior DHA e maior MUFA e redução de SFA.

EXEMPLO 1. FERMENTAÇÕES MICROBIANAS SEM APLICAÇÃO DE TAXA DE CONSUMO DE CARBONO CONTROLADA

[0046] Este exemplo ilustra perfis típicos de ácidos graxos atingíveis por meio de fermentações microbianas com taxa de consumo de carbono não restrita. A fermentação foi realizada num fermentador de 500 l com volume de trabalho entre 150 l e 350 l, com o aumento do volume devido à alimentação do xarope de glicose durante a fermentação. O meio de fermentação inicial contido (por litro): glicose 60 g, peptona de soja 2 g; cloreto de sódio 1,65 g; heptaidrato de sulfato de magnésio 4 g; fosfato de potássio monobásico 2,2 g; fosfato de potássio dibásico 2,4 g; sulfato de amônio 20 g; di-hidrato de cloreto de cálcio 0,1 g; cloreto de ferro 0,003 g; pentaidrato de sulfato de cobre 0,003 g; di-hidrato de molibdato de sódio 0,0015 g; heptaidrato de sulfato de zinco 0,003 g; hexaidrato de cloreto de cobalto 0,0015 g; tetraidrato de cloreto de manganês 0,0015 g; hexaidrato de sulfato de níquel 0,0015 g; vitamina B12 0,00003 g; Biotina 0,00003 g; cloridrato de tiamina 0,006 g. Um antiespumante à base de silício foi usado moderadamente para suprimir a formação de espuma quando necessário, e menos de 0,3 g/l deste antiespumante foi usado durante toda a fermentação. A agitação, a aeração e a contrapressão do fermentador foram controladas de tal modo que a cultura teve uma taxa de consumo de carbono não restrita que foi de até 10 g/l-h (Figura 1). Carbono adicional sob a forma de xarope de glicose foi alimentado ao fermentador durante toda a cultura ou fermentação de tal forma que sempre houvesse glicose disponível nos meios para a cultura consumir.

[0047] Conforme demonstrado pelo perfil temporal da composição de ácidos graxos (Figura 2), o teor de DHA foi relativamente baixo, variando entre 20% e 23% do total de ácidos graxos, durante toda a fermentação. Com a taxa de consumo de carbono não restrita, o óleo final atingido continha apenas 21% de DHA, muito menos do que 35 a 40% de DHA, o que é necessário num óleo microbiano comercial rico em DHA.

[0048] A reprodutibilidade de tal perfil final com teor relativamente baixo de DHA foi demonstrada por dois lotes de fermentações de 500 l mostradas na Tabela 1. Embora o MUFA total (C16:1 n-7 ácido palmitoleico e C18:1 n-7 ácido vacênico) nestes perfis de ácidos graxos estivesse entre 15 e 20% e pudesse ser considerado significativo, o teor relativamente baixo de DHA representa este perfil geral indesejável como óleo comercial de algas rico em DHA. TABELA 1. PERFIL DE ÁCIDO GRAXO DE FERMENTAÇÃO MICROBIANA COM BAIXO TEOR DE DHA.

EXEMPLO 2. FERMENTAÇÃO COM ALTO TEOR DE DHA COM TAXA DE CONSUMO DE CARBONO CONTROLADA

[0049] Este exemplo ilustra perfis de ácidos graxos com alto teor de DHA obtidos por meio de fermentações microbianas da mesma cepa com o uso de controle específico de taxa de consumo de carbono. A fermentação foi realizada num fermentador de 500 l. O meio de fermentação inicial continha a mesma formulação de nutrientes do exemplo 1, exceto que as concentrações de peptona de soja e cloreto de sódio foram aumentadas para 10 g/l e 9 g/l, respectivamente. Um antiespumante à base de silício foi usado moderadamente para suprimir a formação de espuma quando necessário, e menos de 0,3 g/l deste antiespumante foi usado durante toda a fermentação. A agitação, a aeração e a contrapressão do fermentador foram controladas de modo que a cultura só pudesse atingir a taxa de consumo de carbono restrita durante todo o ciclo, conforme demonstrado na Figura 3. A fonte de carbono adicional sob a forma de xarope de glicose foi alimentada ao fermentador durante toda a fermentação, de tal forma que sempre houvesse glicose disponível nos meios para a cultura consumir.

[0050] Conforme demonstrado pelo perfil temporal de composição de ácidos graxos (Figura 4), aplicando-se a taxa de consumo de carbono controlada, o teor de DHA pode ser controlado dentro de uma faixa relativamente alta, entre 33% e 40%, durante toda a fermentação. O perfil final de ácidos graxos continha 39,2% de DHA, que atendeu às exigências comerciais para lipídios ricos em DHA (DHA >35%). No entanto, este processo de fermentação produziu muito menos MUFA em comparação com o processo com taxa de consumo de carbono restrita mostrada no Exemplo 1. Com ácidos graxos saturados (SFA) sendo quase 50% de todo o perfil, o lipídio resultante teve um ponto de fluidez relativamente alto de 24 °C, tornando o óleo não fluível à temperatura ambiente.

[0051] A reprodutibilidade de tal perfil final com DHA relativamente alto e baixo teor de MUFA foi demonstrada por três lotes de fermentações que variam de escala de laboratório (7 l, lote n° 1), pequena escala-piloto (30 l, lote n° 2) e escala-piloto (500 l, lote n° 3), conforme mostra a Tabela 2. O alto teor de DHA atende a exigência comercial para óleo rico em DHA. No entanto, este óleo exige aquecimento e temperatura elevada durante o processamento, o que pode introduzir um custo adicional de processamento e comprometer a estabilidade a longo prazo do óleo. TABELA 2. PERFIL DE ÁCIDO GRAXO DE FERMENTAÇÃO MICROBIANA COM ALTO TEOR DE DHA/BAIXO TEOR DE MUFA.

EXEMPLO 3. FERMENTAÇÃO COM ALTO TEOR DE DHA COM TAXA DE CONSUMO DE CARBONO CONTROLADA E ADIÇÃO DE ANTIESPUMANTE CONTÍNUA

[0052] Este exemplo ilustra perfis de ácidos graxos com alto teor de DHA obtidos por fermentações microbianas da mesma cepa com o uso de uma combinação de taxa de consumo de carbono controlada e adição contínua de antiespumantes. A fermentação foi realizada num fermentador de 500 l. O meio de fermentação inicial continha a mesma formulação de nutrientes do exemplo 1, exceto que a concentração de cloreto de sódio foi aumentada para 9 g/l. Um agente antiespumante à base de óleo vegetal foi adicionado de modo contínuo ao longo da fermentação a uma taxa entre 0,014 g/l e 0,020 g/l-h. A agitação, a aeração e a contrapressão do fermentador foram controladas de tal forma que a cultura só pudesse atingir a taxa de consumo de carbono restrita durante a fermentação, conforme demonstrado na Figura 4. Carbono adicional sob a forma de xarope de glicose foi alimentado ao fermentador durante a fermentação de tal forma que sempre houvesse glicose disponível no meio para a cultura consumir.

[0053] Conforme demonstrado pelo perfil de tempo de composição de ácidos graxos (Figura 6), aplicando-se taxa de consumo de carbono controlada em combinação com adição contínua de antiespumante, não só o teor de DHA é controlado em torno de 40%, mas também a síntese de MUFA durante o estágio posterior da fermentação foi significativa e atingiu mais de 20% do total de lipídios no final. Com ácidos graxos saturados (SFA) sendo reduzidos abaixo de 30% de todo o perfil, o óleo resultante teve uma propriedade de fluxo a frio muito melhor, o que pode ser refletido pelo ponto de fluidez de -9 °C.

[0054] A reprodutibilidade de tal perfil final com teor de DHA relativamente alto e alto teor de MUFA foi demonstrada por três lotes de fermentações que variam a partir de escala de laboratório (7 l, lote N° 1) à escala-piloto (500 l, lotes N° 2 e N° 3), conforme mostrado na Tabela 3. O alto teor de DHA atende às exigências comerciais para óleo de alga rico em DHA. Entretanto, este óleo contém agora teor significativo de ômega-7 MUFA e teor muito menor de SFA. Tais alterações no perfil de ácidos graxos tornam o óleo muito mais fácil de manipular durante o processamento e fornecem um valor nutricional adicional. TABELA 3. PERFIL DE ÁCIDO GRAXO DE FERMENTAÇÃO MICROBIANA COM ALTO TEOR DE DHA/ALTO TEOR DE MUFA.

EXEMPLO 4. EFEITO DE ADIÇÃO DE ANTIESPUMANTE CONTÍNUA A PERFIL DE ÁCIDO GRAXO COM ALTO TEOR DE DHA

[0055] Este exemplo ilustra o efeito da adição contínua de antiespumante executando-se duas fermentações em paralelo, das quais uma recebeu adição contínua de antiespumante e a outra não. Todos os outros fatores de fermentação foram os mesmos, incluindo inóculo do mesmo frasco de semente, meio inicial idêntico, meio de alimentação, volume de trabalho, temperatura, pH, aeração e faixa de taxa de consumo de carbono controlada. Conforme mostrado na Figura 7, a adição contínua de antiespumante permitiu a síntese significativa de MUFA durante o estágio posterior da fermentação, resultando num óleo que era física e nutricionalmente mais favorável quando comparado com lipídios com alto teor de DHA/baixo teor de MUFA.

EXEMPLO 5. APRIMORAMENTO DAS PROPRIEDADES DE FLUXO FRIO VARIANDO OS PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS LIPÍDICOS

[0056] Este exemplo ilustra a correlação entre o teor de SFA nos lipídios microbianos com alto teor de DHA e sua propriedade de fluxo frio, que é refletida por seus pontos de fluidez. Os pontos de fluidez de treze lotes de lipídios microbianos com alto teor de DHA (> 37%) foram plotados contra o teor de SFA de cada lipídio. Conforme visto na Figura 8, os lipídios produzidos sem adição de antiespumante contínua têm mais de 40% de SFA e os seus pontos de fluidez são à temperatura ambiente ou acima da mesma. O óleo produzido com adição contínua de antiespumante e taxa de consumo de carbono controlada mais baixa do que 35% de SFA. Uma diminuição nos pontos de fluidez pode ser observada quando a % de SFA é reduzida para 35% e abaixo. Quando o teor de SFA for reduzido, estes óleos exibirão muito pouco comportamento de cristalização e, consequentemente, permanecerão em estado líquido, mesmo em alguns casos a temperaturas abaixo de zero.

Claims

1. Método para produzir óleo com ácidos graxos saturados reduzidos caracterizadopelo fato de que compreende: realizar a cultura de micro-organismos produtores de óleo num meio de fermentação na presença de um ou mais agentes antiespumantes sob uma taxa de consumo de carbono controlada, em que a cultura produz um óleo que compreende ácidos graxos, e em que menos de 35% dos ácidos graxos no óleo são ácidos graxos saturados.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente antiespumante é um agente antiespumante à base de óleo mineral, agente antiespumante à base de óleo vegetal, agente antiespumante à base de silício, agente antiespumante à base de óleo/água, agente antiespumante à base de polietileno glicol (PEG) ou um agente antiespumante à base de polipropileno glicol.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente antiespumante é um agente antiespumante à base de óleo vegetal, e em que o agente antiespumante à base de óleo vegetal é óleo de soja ou óleo de colza.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente antiespumante é um agente antiespumante à base de silício, e em que o agente antiespumante é polidimetil siloxano.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes antiespumantes são contínua ou intermitentemente adicionados ao meio de fermentação ao longo da cultura.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente antiespumante é adicionado intermitentemente ao meio de fermentação ao longo da cultura.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente antiespumante é adicionado a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 minutos ao longo da cultura.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes antiespumantes são adicionados ao meio de fermentação a uma taxa de 0,0075 a 0,05 g/l por hora ao longo da cultura.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a taxa de consumo de carbono é controlada para estar entre 1,5 e 4,5 g/l por hora ao longo da cultura.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a taxa de consumo de carbono é controlada por meio de aeração, agitação, contrapressão de recipiente ou uma combinação dos mesmos.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a taxa de consumo de carbono é controlada por meio de adição contínua de uma ou mais fontes de carbono ao longo da cultura.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado o ponto de fusão do óleo é de 20 a 33 °C.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o ponto de turvação do óleo é de 5 a 20 C.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o ponto de fluidez do óleo é de -10 a 15 °C.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que menos de 20% dos ácidos graxos no óleo são ácidos graxos saturados.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que menos de 25% dos ácidos graxos no óleo são ácidos graxos saturados.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que menos de 30% dos ácidos graxos no óleo são ácidos graxos saturados.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que os lipídios são fluíveis a uma temperatura de 19 a 22 °C.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que 30% a 35% dos ácidos graxos no óleo são ácidos graxos saturados, e em que o óleo é fluível numa temperatura entre 9 e 15 °C.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que 25% a 30% dos ácidos graxos no óleo são ácidos graxos saturados em que o óleo é fluível a uma temperatura entre -9 °C e 9 °C.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que menos do que 25% dos ácidos graxos no óleo são ácidos graxos saturados, e em que o óleo é fluível a uma temperatura entre 0 °C e 4 °C.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que os ácidos graxos saturados compreendem C16:0 (ácido palmítico) e C14:0 (ácido mirístico).

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende ácidos graxos ômega- 7, e em que o óleo compreende ácidos graxos ômega-7 superiores em comparação com um óleo de controle.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o óleo de controle compreende menos do que 5% de ácidos graxos ômega-7.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende de 10 a 30% de ácidos graxos ômega-7.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que os ácidos graxos ômega-7 compreendem ácido palmitoleico (C16:1(n-7)), ácido vacênico (C18:1(n-7)) ou uma combinação dos mesmos.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a cultura é realizada por um a diversos dias.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que os micro-organismos são da família Thraustochytriaceae.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que os micro-organismos são do gênero Thraustochytrium.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que os micro-organismos são ONC-T18.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende ainda extrair o óleo dos micro-organismos.

32. Óleo microbiano caracterizado pelo fato de que o óleo é fluível à temperatura ambiente, em que o ponto de fluidez do óleo microbiano fluível é de -10 a 15 °C, e em que o óleo compreende (A) ácidos graxos saturados, em que menos do que 35% dos ácidos graxos são ácidos graxos saturados, (B) ácidos graxos ômega -7, em que de 10 a 30% dos ácidos graxos são ácidos graxos ômega-7, e (C) ácido docosa-hexaenoico (DHA), em que mais de 37% dos ácidos graxos são DHA.

33. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que os ácidos graxos saturados compreendem ácido mirístico e ácido palmítico.

34. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que de 8 a 12% dos ácidos graxos são ácido mirístico.

35. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que 14 a 22% dos ácidos graxos são ácido palmítico.

36. Óleo microbiano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que os ácidos graxos saturados compreendem ainda um ou mais dentre ácido láurico, ácido pentadecílico, ácido margárico e ácido esteárico, e em que menos de 2% dos ácidos graxos compreendem um ou mais dentre ácido láurico, ácido pentadecílico, ácido margárico e ácido esteárico.

37. Óleo microbiano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 36, caracterizado pelo fato de que o óleo tem um ponto de fusão de 20 a 33 °C.

38. Óleo microbiano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 37, caracterizado pelo fato de que o óleo tem um ponto de turvação de 5 a 20 °C.

39. Óleo microbiano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 38, caracterizado pelo fato de que o óleo é produzido por meio de cultura de micro-organismos produtores de óleo num meio de fermentação na presença de um ou mais agentes antiespumantes e sob uma taxa de consumo de carbono controlada, e em que os agentes antiespumantes e sob uma taxa de consumo de carbono controlado, e em que o óleo microbiano não é winterizado.