BR122022022359B1 - Métodos para expansão ex vivo de linfócitos infiltrantes de tumor e uso de linfócitos expandidos - Google Patents

Abstract

São reveladas composições e métodos para expansão ex vivo de linfócitos infiltrantes de tumor para uso em terapia celular adotiva (ACT). Também são descritas composições e método para a identifica-ção de um agente para expansão ex vivo de linfócitos infiltrantes de tumor para uso em ACT. Também são revelados métodos para o tratamento de câncer utilizando os linfócitos infiltrantes de tumor expandidos por meio dos métodos revelados.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US 61/955,970, depositado em 20 de março de 2014, e Pedido de Patente Provisório US 61/973,002 depositado em 31 de março de 2014, que são incorporados neste documento por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES

[002] Terapia celular adotiva (ACT) com linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) é uma forma promissora de imunoterapia baseada em células T. Preparação de TIL envolve a ressecção cirúrgica e expansão de TIL de tumores de melanoma. Diante de expansão de TIL adequada, os pacientes são submetidos a quimioterapia de linfodepleção, e transferência adotiva TIL seguida por doses elevadas de IL-2. O Departamento de Cirurgia no Instituto Nacional do Câncer foi pioneiro neste tratamento para o melanoma metastático e relatou uma taxa de resposta de cerca de 50% em pacientes tratados, com ~ 20% de pacientes que alcançaram respostas completas duráveis (Rosenberg SA, et al. Clinical Cancer Research: um boletim oficial da American Association for CancerResearch. 2011 17 (13): 4550-7). A interessante durabilidade de respostas a ACT é uma característica marcante deste tratamento e parece ser superior aos tratamentos existentes para melanoma. ACT depende de infiltração de células T em tumores antes da colheita, expansão ex vivo bem-sucedida de TIL e função efetora anti- tumoral potente após a transferência. Embora TIL ACT seja eficaz para o melanoma, taxas de resposta duráveis necessitam de aperfeiço- amento. Encurtar o período de expansão para o crescimento inicial de TIL e melhorar a especificidade a tumor de TILs expandidos pode aumentar as taxas de resposta em pacientes tratados com TIL autólogo.

SUMÁRIO

[003] São reveladas composições e métodos para expansão ex vivo de linfócitos infiltrantes de tumor para uso em terapia celular adotiva (ACT, do inglês adoptive cell therapy). Em algumas modalidades, os métodos envolvem a cultura de linfócitos para produzir lin- fócitos expandidos em um meio de cultura compreendendo um ago- nista de receptor do tipo toll (TLR, do inglês toll like receptor), em uma quantidade eficaz para melhorar a especificidade de tumor dos linfócitos expandidos. Em algumas modalidades, os métodos envolvem a cultura de linfócitos para produzir linfócitos expandidos em um meio de cultura compreendendo um peptídeo estimulador ou pepti- domimética. Em algumas modalidades, a peptidomimética é um pep- toide ou híbrido peptídeo-peptoide. Em algumas modalidades, o pep- toide ou híbrido peptídeo-peptoide é estabilizado por uma interligação de hidrocarboneto.

[004] Também são revelados métodos para o tratamento de câncer utilizando os linfócitos infiltrantes de tumor expandidos por meio dos métodos revelados. Em algumas modalidades, os métodos envolvem a obtenção de linfócitos infiltrantes de tumor autólogos a partir do indivíduo, cultura de linfócitos em um meio de cultura compreendendo um agonista receptor do tipo toll (TLR) para produzir linfócitos expandidos, tratamento do indivíduo com quimioterapia de mieloablativa de linfodepleção, e administração dos linfócitos expandido ao mamífero.

[005] Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido. Em alguns casos, o câncer é um melanoma, câncer de ovário, câncer de mama, e câncer colorretal. O câncer pode ser metastático, recorrente, ou uma combinação dos mesmos.

[006] O agonista TLR é em algumas modalidades um ligante para um TLR selecionado a partir do grupo que consiste em TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, e TLR9. Por exemplo, o agonista TLR pode ser um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em Pam3CSK4, Pam3CSK4, poli I:C, Ribomunyl, e CpG ODN.

[007] Também são descritas composições e método para a identificação de um agente para expansão ex vivo de linfócitos infiltrantes de tumor para uso em ACT. Os métodos podem envolver contato de linfócitos infiltrantes de tumor com um peptídeo candidato ou peptido- mimética de uma biblioteca de peptídeo ou peptidomimética pela capacidade de se ligarem seletivamente aos linfócitos infiltrantes de tumor. Em algumas modalidades, a peptidomimética é um peptoide ou híbrido peptídeo-peptoide. Em algumas modalidades, o peptoide ou híbrido peptídeo-peptoide é estabilizado por uma interligação de hidrocarboneto. O método pode ainda envolver varredura do efeito de um peptídeo de ligação ou peptidomimética sobre a proliferação dos linfócitos infiltrantes de tumor. Em algumas modalidades, a identificação de um peptídeo candidato ou peptidomimética que aumenta a proliferação dos linfócitos infiltrantes de tumor identifica um agente para expansão ex vivo de linfócitos infiltrantes de tumor para uso em ACT. Agentes identificados por estes métodos podem ser usados para expandir os linfócitos infiltrantes de tumor para uso em ACT.

[008] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção estão estabelecidos nos desenhos acompanhantes e a descrição abaixo. Outros recursos, objetos e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[009] Figuras 1A a 1D mostram exemplos de corpos peptoides.

[0010] Figura 2 mostra um esquema para a preparação de um corpo peptoide que compreende um ligante que é ligado a uma resina e um segundo ligante que compreende uma sequência peptoide- peptoide.

[0011] Figura 3 mostra um esquema para a preparação de um corpo peptoide que compreende um ligante que é ligado a uma resina e um segundo ligante que é um promotor de ligação de folhas beta.

[0012] Figuras 4A a 4C mostram exemplos de híbridos peptoide- peptídeo interligados.

[0013] Figura 5 mostra um exemplo de placa de varredura da biblioteca posicional.

[0014] Figura 6 mostra um exemplo de um esquema de reação para estabilizar o esqueleto de híbrido peptoide-peptídeo similar a grampo-beta cíclico usando um grupo meta-xilenila.

[0015] Figura 7 mostra um exemplo de um esquema de reação para estabilizar o esqueleto de híbrido peptoide-peptídeo similar a grampo-beta cíclico, por interligação e aumento de cadeias laterais propargil que estão em cadeias laterais de peptídeo mais próximas.

[0016] A Figura 8 mostra um exemplo de um esquema de reação para estabilizar esqueleto de híbrido peptoide-peptídeo similar a gram- po-beta cíclico usando uma azida e um alcina.

[0017] Figura 9 mostra um exemplo de um esquema de reação para estabilizar o esqueleto híbrido peptoide-peptídeo similar a grampo beta cíclico híbrido usando metátese de fechamento de anel (RCM).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0018] Transferência adotiva de células (ACT) é uma forma muito eficaz de imunoterapia e envolve a transferência de células imunes com atividade anti-tumoral em doentes com câncer. ACT é uma abordagem de tratamento que envolve a identificação, in vitro, de linfócitos com atividade antitumoral, a expansão in vitro destas células para grandes números e a sua infusão no hospedeiro portador de câncer. Os linfócitos utilizados para a transferência adotiva podem ser deriva dos a partir do estroma de tumores ressecados (linfócitos infiltrantes de tumor ou TILs). Eles podem também ser derivados ou a partir de sangue, se eles são geneticamente manipulados para expressar receptores de células antitumoral T (TCRs) ou receptores de antígenos quiméricos (CARs), enriquecidos com culturas de células de tumores de linfócitos mistos (MLTCs), ou clonados utilizando antígeno autólogo de células e tumores apresentando peptídeos derivados. ACT no qual os linfócitos são originários a partir do hospedeiro portador de câncer a ser infundido é denominado ACT autólogo. US 2011/0052530 refere- se a um método para a realização de terapia celular adotiva para promover a regressão do câncer, principalmente para o tratamento de pacientes que sofrem de melanoma metastático, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade para estes métodos.

[0019] São reveladas composições e métodos para expansão ex vivo de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) para uso em ACT. Em algumas modalidades, os métodos envolvem a cultura de linfócitos para produzir linfócitos expandidos em um meio de cultura compreendendo um agonista de receptor do tipo toll (TLR, do inglês toll like receptor), em uma quantidade eficaz para melhorar a especificidade de tumor dos linfócitos expandidos. O agonista TLR é em algumas modalidades um ligante para um TLR selecionado a partir do grupo que consiste em TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, e TLR9. Por exemplo, o agonista TLR pode ser um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em Pam3CSK4, Pam3CSK4, poli I:C, Ribomunyl, e CpG ODN.

[0020] Em algumas modalidades, os métodos envolvem a cultura de linfócitos para produzir linfócitos expandidos em um meio de cultura compreendendo um peptídeo ou peptidomimética em uma quantidade eficaz para melhorar a especificidade de tumor dos linfócitos expandidos. Em algumas modalidades, a peptidomimética é um peptoide ou híbrido peptídeo-peptoide. Em algumas modalidades, o peptoide ou híbrido peptídeo-peptoide é estabilizado por uma interligação de hidrocarboneto.

[0021] A porção peptoide pode proporcionar resistência à proteóli- se e a porção de peptídeo dos híbridos peptoide-peptídeo pode proporcionar a capacidade de atingir a estrutura secundária similar a grampo beta secundária. Estas duas contribuições podem resultar em um híbrido que é um bom candidato a fármaco para terapias em que a proteólise é geralmente uma limitação da terapia. Como aqui descrito, estes híbridos de peptídeo-peptoide também pode ser utilizados para expansão ex vivo de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) para uso em ACT.

[0022] Exemplos de híbrido de peptídeo-peptoide são descritos no documento WO 2013/192628 por McLaughlin et al., que é aqui incorporado como referência para a biblioteca de corpos peptoides descritos neste documento. Os corpos peptoides em WO 2013/192628 são híbridos peptoides-peptídeo cíclicos, que podem proporcionar uma biblioteca de esqueleto usando uma abordagem combinatória em pares. Os híbridos peptoides-peptídeo cíclico podem adotar uma estrutura similar a grampo beta secundária. Este design similar a grampo beta cíclico resulta da alternância das subunidades peptídeo-peptoide em duas fitas-beta antiparalelas. Por exemplo, o híbrido de peptídeo- peptoide revelado pode ter a estrutura química, por exemplo, mostrada na fórmula I: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, em que R1-R6 são, independentemente, grupos orgânicos.

[0023] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo cíclico tem a estrutura química mostrada na fórmula II:. ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mes mo, em que os grupos R são, independentemente, grupos orgânicos, R' é um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0024] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo cíclico tem a estrutura química mostrada na fórmula III: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, em que os grupos R são, independentemente, grupos orgânicos, R' é um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0025] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo cíclico tem a estrutura química mostrada na fórmula IV: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, em que os grupos R são, independentemente, grupos orgânicos, R' é um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0026] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo cíclico tem a estrutura química mostrada na fórmula V:, em que os grupos R são, independentemente, grupos orgânicos; R' é um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0027] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo cíclico tem a estrutura química mostrada na fórmula VI:, em que os grupos R são, independentemente, grupos orgânicos, R' é independentemente um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0028] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo cíclico tem a estrutura química mostrada na fórmula VII: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, em que os grupos R são, independentemente, grupos orgânicos, R' é independentemente um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0029] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo cíclico tem a estrutura química mostrada na fórmula VIII:

[0030] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, em que os grupos R são, independentemente, grupos orgânicos, R' é independentemente um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0031] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo cíclico tem a estrutura química mostrada na fórmula IX: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mes- mo, em que os grupos R são, independentemente, grupos orgânicos, R' é um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0032] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo cíclico tem a estrutura química mostrada na fórmula X: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mes- mo, em que os grupos R são, independentemente, grupos orgânicos, R' é um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0033] Em algumas modalidades, os grupos R de pelo menos duas sequências de peptoide-glicina adjacentes são grupos 4- piperidinila, por exemplo, um composto de Fórmula II em que x é 2:

[0034] Os grupos R dos híbridos peptoides-peptídeo cíclico de Fórmula I até XII acima, podem ser de quase qualquer estrutura tal que não contêm uma fração que interrompe a ligação de hidrogênio complementar da estrutura em folha beta dentro do híbrido peptoide- peptídeo cíclico. O grupo R pode ser equivalente para as cadeias laterais de aminoácidos, a porção não-amina de um aminoácido, ou porção modificada não-amina de um aminoácido. O grupo R pode ser um açúcar, tal como, um mono-sacarídeo ou di-sacarídeo, ou um ácido graxo, ou variante modificada do mesmo. O grupo R pode ser, mas não está limitado a, Ci-Ci2alquila, Ci-Ci2hidroxialquila, Ci- Ci2aminoalquil Ci-Ci2 de alquil de ácido carboxílico, C2- Ci2alquiloxialquila, C2-Ci2alquenila, C2-Ci2hidroxialcenila, C2- Ci2aminoalcenila, Ci-Ci2alcenil ácido carboxílico, C3- Ci4alquiloxialquenila, Ce-Ci4 arila, Ce-Cuhidroxiarila, Ce-Cuaminoarila, C6-Ci4 aril ácido carboxílico, C?-Ci5alquiloxiarila, C4-Ci4heteroarila, C4- Ci4hidroxiheteroarila, C4-Ci4aminoheteroarila, C4-Ci4heteroaril ácido carboxílico, C5-Ci5alcóxi-, C?-Ci5alquilarila, C?-Ci5hidroxialquilarila, C7- Ci5aminoalquilarila, C7-Ci5alquilaril ácido carboxílico, Cs- Ci5alcoxialquilarila, ou um produto quimicamente transformado de qualquer um destes grupos R, tais como, ésteres,tioésteres, amidas, tióis, ou sulfonamidas, em que grupos alquil podem ser linea- res,ramificados, multiplamente ramificados, cíclicos ou políclicos. Por exemplo, R pode ser, um resíduo de uma amina primária, que pode ser, mas não se limita a, grupos a partir da incorporação de 4- aminopiperidina, etanolamina, alilamina, 1,4-diaminobutano, piperponi- lamina, 4, (2- aminoetil) benzeno, isobutilamina, triptamina, 4- morfolinoanilina, 5-amino-2-metoxipiridina, (R) -metilbenzilamina, 1- (2- aminopropil) -2-pirrolidinona, furfurilamina, benzilamina, 4- clorobenzilamina, 4-metoxibenzilamina, metoxietilamina, ácido 2- aminoadípico, N-etilasparagina, ácido 3-aminoadípico, hidroxilisina, beta-alanina, ácido propiónico alo-hidroxilisina, ácido 2-aminobutírico, 3-hidroxiprolina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-hidroxiprolina piperidí- nico, 6- ácido aminocaproico, isodesmosina, ácido 2-amino- heptanoico, alo-isoleucina, ácido 2-aminoisobutírico, N-metilglicina, ácido 3-aminoisobutirico, N-metilisoleucina, 2-aminopimélico, ácido 6- N-metillisina, ácido 2,4-diaminobutírico, N-metilvalina, desmosina, norvalina, ácido 2,2'-diaminopimélico, norleucina, ácido 2,3- diaminopropiónico, ornitina, N-etilglicina, ou equivalentes protegido deste, como uma unidade peptoide N-R no híbrido peptoide-peptídeo cíclico.

[0035] Em algumas modalidades, os híbridos peptoide-peptídeo podem ser produzidos em um suporte sólido, tal como uma resina. Os híbridos podem então ser clivados a partir da resina de suporte para uso nos métodos descritos. As Figuras 1 e 2 ilustram exemplo Hydridspeptoide-peptídeo como intermediários ligados a resina.

Exemplo híbridos peptoide-peptídeo

[0036] Modalidade 1: Um híbrido peptoide-peptídeo com uma conformação similar a grampo beta, compreendendo uma pluralidade de sequências alternadas de peptoide-peptídeo, cada um tendo pelo menos um resíduo peptoide e um resíduo de amino ácido, em que as sequências de peptoide-peptídeo formam, pelo menos, duas fitas beta antiparalelas entre uma pluralidade de ligantes, e em que pelo menos um ligante é um promotor de ligação de folhas beta.

[0037] Modalidade 2: O híbrido de acordo com a modalidade 1, em que pelo menos um do ligante é o resíduo de amino ácido a partir da condensação do precursor de ligante da estrutura: (T4); em que em que R' é um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico ligado a uma resina ou outro substrato e R" é H ou um grupo protetor de ácido carboxílico.

[0038] Modalidade 3: O híbrido de acordo com a modalidade 2, em que R" é t-butila, alila, ou benzila.

[0039] Modalidade 4: O híbrido de acordo com a modalidade 2, em que o grupo de ligação orgânico ligado a uma resina ou outro substra¬to compreende um grupo -NH(CH2)2- de vedação.

[0040] Modalidade 5: O híbrido de acordo com a modalidade 1, em que um do ligante é dois resíduos de peptoides.

[0041] Modalidade 6: O híbrido de acordo com modalidade 1, em que o híbrido peptoide-peptídeo cíclico é: em que OS grupos R são, independentemente, grupos orgânicos, R' é independentemente um grupo orgânico, ou um grupo de vedação orgânico a uma resina ou outro substrato, e x é 1 a 3.

[0042] Modalidade 7: O híbrido de acordo com a modalidade 6, em que R é independentemente Ci-Ci2alquila, Ci-Ci2hidroxialquila, Ci- Ci2aminoalquil Ci-Ci2 de alquil de ácido carboxílico, ‘2-Ci2alquiloxi- alquila, ‘2-Ci2alquenila, ‘2-Ci2hidroxialcenila, ‘2-Ci2aminoalcenila, Ci- Ci2alcenil ácido carboxílico, ‘3-Ci4alquiloxialquenila, C6-Ci4 arila, ‘6- Ci4hidroxiarila, ‘6-Ci4aminoarila, ‘6-Ci4aril ácido carboxílico, C7- Cisalquiloxiarila, C4-Ci4heteroarila, C4-Ci4hidroxiheteroarila, C4- Ci4aminoheteroarila, C4-Ci4heteroaril ácido carboxílico, Cs-Cisalcóxi-, Cy-Cisalquilarila, Cy-Cishidroxialquilarila, Cy-Cisaminoalquilarila, C7- Cisalquilaril ácido carboxílico, Cs-Cisalcoxialquilarila, ou qualquer estrutura quimicamente transformada da mesma.

[0043] Modalidade 8: O híbrido de acordo com a modalidade 7, em que a estrutura quimicamente transformada compreende um éster, tioéster, tiol, amida ou sulfonamida.

[0044] Modalidade 9: O híbrido de acordo com a modalidade 6, em que R é independentemente um resíduo de uma amina primária: 4- aminopiperidina; etanolamina; alilamina; i, 4-diaminobutano; piperpo- nilamina; 4; (2-aminoetil) benzeno; isobutilamina; triptamina; 4- morfolinoanilina; s-amino-2-metoxipiridina; (R) -metilbenzilamina; i- (2- aminopropil) -2-pirrolidinona; furfurilamina; benzilamina; 4- clorobenzilamina; 4-metoxibenzilamina; metoxietilamina. ácido 2- aminoadípico; N-etilasparagina; Ácido 3-aminoadípico; hidroxilisina; beta-alanina; alo-hidroxilisina ácido propiônico; ácido 2-aminobutírico; 3-hidroxiprolina; ácido 4-aminobutírico; 4-hidroxiprolina ácido piperi- dinico; ácido 6-aminocaproico; isodesmosina; ácido 2-amino- heptanoico; alo-isoleucina; ácido 2-aminoisobutírico; N-metilglicina; ácido 3-aminoisobutírico; N-metilisoleucina; ácido 2-aminopimélico; 6- N-methyllysine; ácido 2,4-diaminobutírico; N-metilvalina; desmosina; norvalina; ácido 2,2'-diaminopimélico; norleucina; ácido 2,3- diaminopropiónico; ornitina; N-etilglicina; ou quaisquer equivalentes protegido destes.

[0045] Modalidade i0: O híbrido de acordo com a modalidade 6, em que pelo menos um R é um resíduo de 4-aminopiperidina.

[0046] Modalidade ii: O híbrido de acordo com a modalidade i, em que todos os resíduos de aminoácidos são resíduos de glicina.

[0047] Híbridospeptoide-peptídeo podem ser adicionalmente esta- bilizados por ligação cruzada entre as cadeias laterais de aminoácidos, e/ou as N-substituições em glicinas, e/ou ciclização em espinha dorsal. Tais peptoides são aqui referidos como "peptoides interligados"; que, tais híbridos peptoide-peptídeo são aqui referidos como "híbridos peptoide-peptídeo interligados".

[0048] Interligação de peptoides ou híbridos peptoide-peptídeo envolve ligações cadeira lateral - cadeira lateral e/ou ciclização de espinha dorsal para estabilizar os peptoides ou os híbridos peptoide- peptídeo. Assim, a presente invenção estende-se a abordagem de estabilização de peptídeos utilizando ligações de cadeias laterais estabilizadas para peptoides estabilizadores ou híbridos peptoide- peptídicos.

[0049] Para a finalidade da presente invenção, o termo "cadeia lateral" inclui uma cadeia lateral de aminoácido, bem como a fração ligada ao átomo de N de a glicina N-substituído.

[0050] Vários possíveis ligações da cadeia lateral-cadeia lateral (aqui referido como ligação cruzada intramolecular) podem ser projetadas. A ligação cruzada intramolecular entre as duas cadeias laterais dos peptoides ou os híbridos peptoide-peptídeo da presente invenção pode ser mediada através de reações químicas entre as cadeias laterais, que também podem envolver produtos químicos adicionais.

[0051] Por exemplo, a ligação cruzada intramolecular pode ser mediada através de uma fração químico que não é uma parte das cadeias laterais e em que as cadeias laterais ligam-se uma à outra através da fração química. Um exemplo da fração química que forma a ligação cruzada intramolecular é descrito nas Figuras 6-9.

[0052] Em algumas modalidades, a ligação cruzada intramolecular é estabelecida pela abordagem RCM (metátese de fechamento de anel) ou de acordo com um reação Click ou Aileron (por exemplo, ci- cloadição catalisada por cobre 3+2) descrito em Patente Estadunidense de Número 5.811.515, que é incorporada por referência na sua totalidade neste documento. Um exemplo de ligação cruzada intramolecular mediada através da abordagem RCM está descrito na Figura 9.

[0053] Em uma outra modalidade, a ligação cruzada intramolecular entre as duas cadeias laterais é estabelecida pela formação de uma ligação química, por exemplo, através de uma reação de condensação, entre os grupos funcionais presentes nas cadeias laterais. A reação de condensação é uma reação química em que duas moléculas ou frações (grupos funcionais) combinam através de uma ligação química e a reação envolve a perda de uma ou mais moléculas pequenas. Exemplos de reação de condensação entre as cadeias laterais que podem ser utilizadas na produção ligação cruzada intramolecular, de acordo com a presente invenção, são bem conhecidos para um versado na técnica atual e essas modalidades estão dentro do âmbito da presente invenção.

[0054] Exemplos adicionais de peptoides interligados com algumas ligações cruzadas intramoleculares são mostrados nas Figuras 4A-4C.

[0055] Exemplos adicionais de ligações cruzadas em peptídeos são revelados nas Patentes dos Estados Unidos de Números 8592377, 8324428, 8198405, 7786072, 7723469, 7192713, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Um versado na técnica atual pode imaginar usando várias ligações cruzadas descritas nestes documentos de patente na preparação de peptoi- des interligados e os híbridos peptoide-peptídeo interligados de acordo com a presente invenção e tais modalidades estão dentro do âmbito da presente invenção.

[0056] Por conseguinte, o presente invento proporciona um pep- toide interligado compreendendo uma pluralidade de glicinas N- substituídas, em que pelo menos duas das glicinas N-substituídas são ligadas uma à outra por ligação cruzada intramolecular, e em que o comprimento e geometria da ligação cruzada intramolecular proporciona estabilidade ao peptoide.

[0057] Em alguns casos, o híbrido peptoide-peptídeo interligado pode compreender uma pluralidade de aminoácidos e a pluralidade de glicinas N-substituídas, em que pelo menos dois resíduos da pluralidade de aminoácidos e a pluralidade de glicinas N-substituídas são ligadas umas às outras por uma ligação cruzada intramolecular, e em que o comprimento e geometria da ligação cruzada intramolecular fornece estabilidade ao híbrido peptoide-peptídeo.

[0058] Em uma modalidade dois resíduos de glicina N-substituídos ou dois resíduos de aminoácidos estão ligados uns aos outros por uma ligação cruzada. Em outra modalidade, um resíduo glicina N- substituído está ligado a um resíduo de aminoácido por uma ligação cruzada.

[0059] Em uma outra modalidade, o híbrido peptoide-peptídeo interligado é um híbrido peptoide-peptídeo cíclico. Um híbrido peptoide- peptídeo cíclico compreende uma pluralidade de sequências alternadas de peptoide-peptídeo, cada um tendo pelo menos um resíduo pep- toide e um resíduo de amino ácido, em que as sequências de peptoi- de-peptídeo formam, pelo menos, duas fitas beta antiparalelas.

[0060] Em algumas modalidades, a ligação cruzada intramolecular é uma ligação cruzada toda de hidrocarboneto.

[0061] Em algumas modalidades, o peptoide ou o híbrido peptoi- de-peptídeo compreende mais do que uma ligação cruzada intramolecular, por exemplo, duas, três, ou quatro ligações cruzadas intramole- culares.

[0062] Em algumas modalidades, as ligações cruzadas estão entre dois ou mais resíduos de aminoácidos ou resíduos de glicina N- substituídos localizados no mesmo lado de uma folha beta, proporcionando deste modo estabilidade ao peptoide ou híbrido peptoide- peptídeo. Em uma modalidade, as ligações cruzadas intramoleculares são entre dois ou mais resíduos de aminoácido, ou de resíduos de gli- cina N-substituídos localizados nos resíduos de uma folha beta, proporcionando deste modo estabilidade ao peptoide ou híbrido peptoide- peptídeo.

[0063] Em algumas modalidades, a cadeia lateral pode ser selecionada a partir de alquileno cíclico ou acíclico, ramificado ou não ramificado, substituído ou não substituído; alcenileno cíclico ou acíclico, ramificado ou não ramificado, substituído ou não substituído; alquinile- no cíclico ou acíclico, ramificado ou não ramificado, substituído ou não substituído; heteroalquileno cíclico ou acíclico, ramificado ou não ramificado, substituído ou não substituído; heteroalcenileno cíclico ou ací- clico, ramificado ou não ramificado, substituído ou não substituído; he- teroalcinileno cíclico ou acíclico, ramificado ou não ramificado, substituído ou não substituído; arileno substituído ou não substituído; hete- roarileno substituído ou não substituído; ou acileno substituído ou não substituído.

[0064] Exemplos adicionais de cadeias laterais e de ligações cruzadas que podem ser aplicadas na presente invenção são revelados, por exemplo, na Patente Estadunidense de Número 8.592.377 da co-luna 37, linha 26 até à coluna 43, linha 14; Patente Estadunidense de Número 8.198.405, coluna 3, linha 54 até coluna 10, linha 2 e coluna 25, linha 14 até coluna 26, linha 21; Patente Estadunidense de Número 7.786.072, coluna 5, linha 44 a coluna 9, linha 43 e coluna 11, linha 16 até coluna 12, linha 8; Patente Estadunidense de Número 7.723.469, coluna 5, linha 30 até coluna 9, linha 12 e coluna 24, linha 60 até coluna 26, linha 3; e Patente Estadunidense de Número 7.192.713, coluna 4, linha 26 a coluna 9, linha 45 e coluna 11, linha 23 até coluna 12, linha 18.

[0065] Os peptoides interligados, híbridos peptoide-peptídeo, e híbridos de peptoide-peptídeo cíclico interligados da presente invenção também podem conter ainda opcionalmente substituições nas cadeias laterais dos aminoácidos e/ou os resíduos de glicina N-substituídos, em que as substituições nas cadeias laterais adicionalmente estabilizam os peptoides, híbridos peptoide-peptídeo, e híbridos de peptoide-peptídeo cíclicos. Exemplos não limitantes de várias substituições que podem ser utilizados na presente invenção são fornecidos na Tabela 2.

[0066] Produção de Linfócito Infiltrante de Tumor (TIL) é um processo de duas etapas: 1) a fase de pré-REP (Expansão Rápida), onde se cultiva as células em meios de laboratório padrão, tais como RPMI e se trata TILs com reagentes, tais como células de alimentação irradiadas, e anticorpos anti-CD3 para atingir o efeito desejado; e 2) a fase REP onde se expande o TIL em uma quantidade de cultura grande o suficiente para tratar os pacientes. A fase REP requer reagentes de grau cGMP e 30-40L de meio de cultura. No entanto,a fase pré-REP pode utilizar reagentes de grau de laboratório (sob a suposição de que os reagentes de grau de laboratório se diluam para fora durante a fase de REP), tornando mais fácil para incorporar estratégias alternativas para melhorar a produção de TIL. Portanto, em algumas modalidades, o revelado agonista TLR e/ou peptídeo ou peptidomiméticas podem ser incluídos no meio de cultura durante a fase de pré-REP.

[0067] ACT pode ser realizada por (i) obtenção de linfócitos autó- logos de um mamífero, (ii) cultivar os linfócitos autólogos para produzir linfócitos expandidos, e (ii) administrar os linfócitos expandidos ao mamífero. Preferencialmente, os linfócitos são derivados de tumor, isto é, eles são TILs, e são isolados a partir do mamífero a ser tratado, ou seja transferência autóloga.

[0068] ACT autólogas, tal como aqui descrito pode também ser realizado por (i) a cultura de linfócitos autólogos expandidos para produzir linfócitos expandidos; (li) a administração de quimioterapia não- mieloablativa de linfodepleção ao mamífero; e (iii) após a administração de quimioterapia não-mieloablativa de linfodepleção, administrar os linfócitos expandidos ao mamífero. TILs autólogos podem ser obtidos a partir do estroma de tumores ressecados. Amostras do tumor são obtidas a partir de pacientes e uma suspensão de célula é obtida. A suspensão de célula podem ser obtida de qualquer maneira adequada, por exemplo, mecanicamente (desagregação do tumor utilizando, por exemplo, um gentleMACS (TM) Dissociator, MiltenyiBiotec, Auburn, Calif.) Ou enzimaticamente (por exemplo, colagenase ou DNase).

[0069] Expansão de linfócitos, incluindo os linfócitos infiltrantes de tumor, tais como as células T pode ser conseguida por qualquer de um número de métodos como são conhecidos na técnica. Por exemplo, as células T podem ser rapidamente expandida através de estimulação não específica do receptor de células T na presença de linfócitos de alimentação e interleucina-2 (IL-2), IL-7, IL-15, IL-21, ou suas combinações. O estimulo do receptor de células T não específico pode por exemplo, incluir cerca de 30 ng/ml de OKT3, um anti-CD3 anticorpo monoclonal de camundongo (disponível a partir de Ortho-McNeil (R), Raritan, NJ ou MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). Alternativamente, as células T podem ser rapidamente expandida por estimulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) in vitro com um ou mais antigenos (incluindo porções antigênicas das mesmas, tais como o epítopo (s), ou uma célula do câncer, que podem ser opcionalmente expressos a partir de um vetor, tal como um antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), peptídeo de ligação, por exemplo,, aproximadamente0,3 μM MART-1: 26-35 (27 L) ou gp100: 209-217 (210M)), na presença de um fator de crescimento de células T, tal co mo cerca de 200-400 Ill/ml, tal como 300 IU/mL de IL-2 ou IL-15, IL-2 sendo preferencial. As células T in vitro induzidas são rapidamente expandidas por re-estimulação com o mesmo antígeno (s) do câncer pulsados para HLA-A2 que expressam as células apresentadoras de an- tígeno. Alternativamente, as células T podem ser re-estimuladas com linfócitos autólogos irradiados, ou com linfócitos alogeneicos irradiados HLA-A2+ e IL-2, por exemplo.

[0070] Em algumas modalidades, a quimioterapia não- mieloablativa de linfodepleção é administrada ao mamífero antes da administração ao mamífero de linfócitos expandidos infiltrantes de tumor. O objetivo da linfodepleção é criar espaço para os linfócitos de infusão, em particular por eliminação de células T reguladoras e outras células T não específicas que competem para citocinas homeostáticas. Quimioterapia não-mieloablativa de linfodepleção pode ser qualquer tipo de terapia adequada, a qual pode ser administrada por qualquer via adequada conhecida para uma pessoa versada. A quimioterapia não-mieloablativa de linfodepleção pode compreender, por exemplo, a administração de ciclofosfamida e fludarabina, particularmente se o câncer é melanoma, que pode ser metastático. Uma via preferida de administração de ciclofosfamida e fludarabina é por via intravenosa. Da mesma forma, qualquer dose adequada de ciclofosfamida e fluda- rabina pode ser administrada. De um modo preferencial, cerca de 4080 mg/Kg, tal como de cerca de 60 mg/Kg de ciclofosfamida é administrado durante cerca de dois dias após o qual cerca de 15-35 mg/m2, tal como cerca de 25 mg/m2fludarabina é administrada durante cerca de cinco dias, particularmente se o câncer é melanoma.

[0071] Reatividade específica de tumor dos TILs expandidos pode ser testada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por meio de medição da liberação de citocina (por exemplo, interferon- gama) após a co-cultura com células tumorais. Em uma modalidade, o método de ACT autólogo compreende enriquecer TIL de cultura para células T CD8+ antes da expansão rápida das células. Após a cultura dos TILs em IL-2, as células T são depletadas de células CD4+ e enriquecidas em células CD8+, utilizando, por exemplo, uma separação microgrânulo CD8 (por exemplo, usando um sistema de microesferas CliniMACS<plus>CDs (Miltenyi Biotec)). Em uma modalidade do método, um fator de crescimento de células T que promove o crescimento e a ativação das células T autólogas é administrada ao mamífero, quer concomitantemente com as células T autólogas ou, subsequentemente às células T autólogas. O fator de crescimento de células T pode ser qualquer fator de crescimento apropriado que promove o crescimento e a ativação das células T autólogas. Exemplos de fatores de crescimento de células T adequadas incluem a interleucina (IL) -2, IL-7, IL- 15, IL-12 e IL-21, que podem ser utilizadas isoladamente ou em várias combinações, tais como IL-2 e IL-7, IL-2 e IL-15, IL-7 e IL-15, IL-2, IL-7 e IL-15, IL-12 e IL-7, IL- 12 eIL-15, ou IL-12 e IL2. IL-12 é um fator de crescimento de células T preferencial.

[0072] Preferencialmente, linfócitos expandidos produzidos por estes métodos são administrados como uma infusão intra-arterial ou intravenosa, que de preferência tem a duração de cerca de 30 a cerca de 60 minutos. Outros exemplos de vias de administração incluem a via intraperitoneal, intratecal e intralinfática. Da mesma forma, qualquer dose adequada de linfócitos podem ser administrados. Em uma modalidade, cerca de 1 x 1010 linfócitos até cerca de 15 x 1010 linfóci- tos são administrados.

[0073] O câncer tratado por composições e métodos revelado podem ser qualquer tipo de câncer, incluindo qualquer um dentre câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiossarcoma alveolar, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, câncer do ânus, canal anal ou ano-retal, câncer de olho, câncer da colestase biliar, câncer das articulações, câncer do pescoço, da vesícula biliar ou pleura, câncer do nariz, câncer nasal de cavidade, ou orelha média, da vulva, leucemia linfocítica crônica, câncer mieloide crônica, câncer do colo do útero, glioma, Hodgkin Linfoma, câncer de hipofaringe, câncer de rim, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, meso- telioma maligno, melanoma, mieloma múltiplo, câncer de nasofaringe, linfoma não-Hodgkin, câncer de ovário, peritônio, omento e câncer do mesentério, faringe câncer, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer, câncer de tecidos moles, câncer testicular de pele, câncer de tireoide, câncer de uretra, câncer de bexiga e câncer do aparelho digestivo, tais como, por exemplo, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de estômago, câncer de intestino, tumor carcinoide gastrointestinal, câncer da cavidade oral, câncer co- lorretal e câncer de vesícula.

[0074] O câncer pode ser um câncer recorrente. Preferencialmente, o câncer é um câncer sólido. Preferencialmente, o câncer é melanoma, do ovário, da mama e câncer colo-rectal, ainda mais preferencial é melanoma, em particular melanoma metastático.

Definições

[0075] O termo "indivíduo" refere-se a qualquer indivíduo que é alvo de administração ou tratamento. O indivíduo pode ser um vertebrado, por exemplo, um mamífero. Assim, o indivíduo pode ser um pa-ciente humano ou veterinário. O termo "paciente" refere-se a um indivíduo sob tratamento de um clínico, por exemplo, um médico.

[0076] O termo "terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade da composição utilizada é uma quantidade suficiente para melhorar um ou mais sintomas ou causas de uma doença ou distúrbio. Tal melhoria só exige uma redução ou alteração, não necessariamente a eliminação.

[0077] O termo "tratamento" refere-se à gestão médica de um pa ciente com a intenção de curar, melhorar, estabilizar ou prevenir uma doença, condição patológica ou transtorno. Este termo inclui tratamento ativo, ou seja, o tratamento direcionado especificamente para a melhora de uma doença, condição patológica ou transtorno e inclui também o tratamento causal, ou seja, o tratamento direcionado para a remoção da causa da doença, condição patológica ou transtorno associado. Além disso, este termo inclui tratamento paliativo, ou seja, tratamento designado para o alívio dos sintomas ao invés da cura da doença, condição patológica ou transtorno; tratamento preventivo, ou seja, o tratamento direcionado a minimizar ou parcial ou completamente inibir o desenvolvimento da doença, condição patológica ou transtorno associado; e tratamento de suporte, ou seja, o tratamento empregado para complementar outra terapia específica direcionada à melhora da doença, condição patológica ou transtorno associado.

[0078] Os termos "peptídeo", "proteína" e "polipeptídeo" são utilizados indiferentemente para se referir a uma molécula natural ou sintética que compreende dois ou mais aminoácidos ligados pelo grupo carboxil de um aminoácido com o grupo alfa-amino de outro.

[0079] Tal como aqui utilizado, "peptidomimética" significa um cadeia mimética de um peptídeo que inclui alguma alteração da química peptídica normal. As peptidomiméticas tipicamente melhoram algumas propriedades do peptídeo original, tal como aumento da estabilidade, o aumento da eficácia, a administração melhorada, aumento da meia- vida, etc. Os métodos de produção de peptidomiméticas com base em uma sequência de polipeptídeo conhecida é descrita, por exemplo, no documento Patente Estadunidense de Número 5.631.280; 5.612.895; e 5.579.250. Uso de peptidomiméticas podem envolver a incorporação de um resíduo de ácido não-amino com ligações não-amida em uma dada posição. Uma modalidade da presente invenção é uma peptido- mimética, em que o composto tem uma ligação, um esqueleto peptídi- co ou um componente amino ácido substituído por uma mímica adequada. Alguns exemplos não limitantes de aminoácidos não naturais que podem ser mímicas de amino ácidos adequadas incluem β- alanina, ácido butírico-L-a amino, ácido butírico-L-y amino, ácido isobutírico-L-a amino, L-ε-amino ácido caproico, ácido 7-amino hepta- noico, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, N-ε-Boc-N-α-CBZ-L-lisina, N-ε-Boc-N-α-Fmoc-L-lisina, L-metionina sulfona, L-norleucina, L- norvalina, N-α-Boc-N-δCBZ-L-ornitina, N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-ornitina, Boc-p-nitro- L-fenilalanina, Boc-hidroxiprolina, e Boc-L-tioprolina.

[0080] O termo "peptoide" refere-se a uma classe de peptidomimé- ticas, cujas cadeias laterais são acrescentadas ao átomo de nitrogênio da espinha dorsal do peptídeo, em vez de aos a-carbonos (como o são em aminoácidos).

[0081] O termo "infiltração tumoral de linfócitos" ou "TIL" refere-se a células brancas do sangue, que deixaram a corrente sanguínea e migraram para um tumor.

[0082] O termo "regressão" não implica necessariamente 100% ou regressão completa. Em vez disso, existem vários graus de regressão, dos quais um versado na técnica reconhece como tendo um potencial benefício ou efeito terapêutico. O termo abrange também atrasar a aparição da doença, ou um sintoma ou condição da mesma.

[0083] O termo "interligação" ou "interligação de hidrocarboneto" tal como aqui utilizado refere-se ao uso de um hidrocarboneto para estabilizar a estrutura secundária de um peptídeo sintético ou pepti- domimética.

[0084] Um número de modalidades da invenção foi descrito. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Nesse sentido, outras modalidades estão no escopo das reivindicações a seguir.

EXEMPLOS Exemplo 1: Objetivando TLRs para melhorar a expansão e atividade TIL

[0085] Receptores do tipo toll (TLRs, do inglês Toll-like-receptors) são receptores de reconhecimento de padrões que reconhecem uma grande variedade de moléculas microbianas. Ligação de ligantes de TLR a TLRs expressos em macrófagos e células dendríticas (DCs) leva à apresentação de antígeno eficaz para a ativação de células T e imunidade do hospedeiro. No ambiente do tumor, a função de macró- fagos e DCs é inibida. Tal como aqui descrito, este estado reprimido pode ser revertido pela administração de ligantes de TLR (Tabela 1). Ligantes de TLR exógenos adicionados a culturas de TIL podem melhorar a função de DCs e macrófagos, resultando em aumento da expansão TIL e respostas imunitárias específicas ao tumor melhoradas. Tabela 1. Receptores TLR e Ligantes

[0086] Para determinar se os ligantes de TLR exógenos adicionados a culturas de TIL são capazes de aumentar a expansão de TIL e melhorar a especificidade ao tumor, tumores de melanoma frescos são cortados em fragmentos de 1-2 mm2 fragmentos em meios com suplemento de 6000 UI/ml de IL-2. Doze fragmentos são cultivados apenas em IL-2. Grupos adicionais de 12 fragmentos são tratados com os seguintes ligantes de TLR: Ligante TLR1/2 Pam3CSK4 (1 μg/ml), li- gante TLR3 poli (I: C) (12,5 μg/ml), ligante TLR4 Ribomunyl, um extrato de bactéria de grau clínico (1 μg/ml), ligante TLR9 CpG ODN2006 (10 μg/ml). O meio de cultura é substituído por meio fresco a cada 2-3 dias. TILs são divididos em novos poços quando eles atingem a confluência. Depois de 10, 20, e 30 dias de cultura, o número total de fragmentos de tumor resultando em crescimento TIL são registados. Além disso, as células são recolhidas a partir de cada fragmento e contadas. Os números de células são comparados entre o grupo de controle IL-2 e grupo tratado de ligante TLR. Pools Individuais de TIL de cada fragmento são co-cultivadas com células de melanoma combinadas e não-combinadas com HLA autólogos por 24 horas. Os so- brenadantes da cultura são coletados e IFN-gama é medido por ELISA convencional. O objetivo destes experimentos é determinar se a adição de ligantes TLR resulta no aumento do crescimento de TIL de fragmentos, aumento da proliferação de TILA, e/ou aumento da ativação de TIL específica a tumores.

Exemplo 2: Identificação de Peptoides para a proliferação de TIL e ativação

[0087] Além de agonistas TLR, outras moléculas co-estimuladoras podem ser expressas por TIL. Uma biblioteca peptoide pode passar por varredura para identificar os compostos que levam a uma melhor proliferação e ativação de TIL. Uma biblioteca peptoide contendo aproximadamente 200.000 compostos passa por varredura em um formato similar a 384 poços. Linhas de células TIL são marcadas com pontos quânticos vermelhos e passam por varredura para identificar acertos da biblioteca que se ligam seletivamente às células vermelhas. Uma vez que vários peptoides de ligação são identificados, a proliferação de TIL é examinada na presença dos peptoides. Peptoides que levam à proliferação de TIL (peptoides estimuladores) são ainda examinados em um ensaio funcional.

[0088] Usando uma linha de células T humanas (AS1), os efeitos estimuladores de peptoides são medidos em função das células T. Células AS1 são ativadas células T humanas CD8 + que demonstram especificidade contra a linha celular 624 de melanoma, mas não a linha celular de melanoma HLA 888 não-combinada. Células AS1 são cultivadas em 6000 Ul/ml de IL-2 na presença de doses crescentes de peptoides estimuladores. As células são contadas nos dias 3, 7, 10, 14, e 21 para determinar a dose de peptoides estimulantes que leva a um aumento da proliferação de células AS1. Para determinar se a cultura com peptoides estimuladores leva a função de células T aumentada, IFN-gama, uma citocina secretada por células T ativadas, é medida. Células AS1 são tratadas com a dose ótima de corpos peptoides estimuladores, tal como determinado acima. Os controles incluem células AS1 apenas e células AS1 tratadas com anticorpo anti-41BB. Após 7 dias, as células AS1 são recolhidas eco-cultivadas com 624 células de melanoma. Como controle negativo, as células AS1 são co- cultivadas com 888 células de melanoma. Após 24 horas, os sobrena- dantes são recolhidos e a produção de IFN-gama é medido por ELISA. As comparações são feitas entre AS1 sozinho e AS1 tratado com peptoides estimulantes. Para explorar ainda mais a eficácia da peptoides estimulantes, as células T são recolhidas a partir dos tumores de 10 pacientes com melanoma metastático inscritos em testes clínicos aprovados IRB. Os fragmentos de tumor são cultivados em meios contendo 6000 UI/ml de IL-2 para gerar pools de células T tal como previamente descrito (Pilon-Thomas S, et al. J Immunother. 2012 35 (8): 615-20). Peptoides irrelevantes ou estimulantes são adicionados a 12 fragmentos por condição.Os fragmentos tratados com isotipoIgG ou anticorpo anti-41BB (10 μg/ml) são utilizados como controles. Após 21 dias, as células T são recolhidas e contadas. Para medir a ativação, as células T são co-cultivadas com células tumorais autólogas ou HLA- combinadas. As células T apenas e as células T em co-cultura com células tumorais HLA-combinadas estão incluídas como controles negativos. As células T cultivadas na presença de células CD3/CD28 são incluídas como um controle positivo. Após 24 horas, os sobrenadantes são recolhidos e a produção de IFN-gama é medido por ELISA. Além disso, a proliferação de células T é medida nos dias 7, 14 e 21 para determinar se a co-cultura com peptoides estimuladores leva ao aumento da proliferação de células T que se infiltram no tumor. Estes estudos determinar se o tratamento das células T com corpos de peptoi- de anti-PD1 melhora a proliferação e ativação de células T antimelanoma.

Exemplo 3: Avaliação da atividade TIL em um modelo murino

[0089] Uma grande desvantagem de estudos de TIL é a incapacidade de testar TIL em um modelo in vivo. Um modelo murino é desenvolvido para medir a eficácia de TIL. Usando camundongos NSG (ca-mundongos sem células B e T, adquiridos da Jackson Laboratories), os tumores de melanoma de pacientes primários são implantados no flanco. Quando o tumor atinge 5 mm de diâmetro, 1x107 TIL expandidos são transferidos a partir de amostras de pacientes combinadas. O crescimento do tumor e sobrevivência são medidos. Usando esse modelo, é examinado se TIL cresceu em padrão de meio IL-2, com ligantes TLR, ou com peptoides estimuladores levar a melhor rejeição de tumor in vivo.

Exemplo 4: Varredura de posição com 69 diferentes substituintes

[0090] Em algumas modalidades, uma biblioteca molecular exibindo uma mistura de 69 compostos definidos pela estrutura geral na Fi-gura 4A tendo vários substituintes (listados na Tabela 2) em qualquer das posições R1, ou R2, R3 é preparada onde todos as restantes posições R1 e R2, Ou R1 e R3 ou R2 e R3 exibem cada uma das possíveis 69 x 69 combinações. Isto é igual a 69 x 69 x 3, ou seja. 14,283 pontos diferentes. Este número é muito menor do que ter que fazer todas as combinações possíveis de 69 x 69 x 69, ou seja. 328,509 pontos que tornem necessárias 952,2 placas com 345 pontos por placa. A abor-dagem de varredura posicionai requer apenas 41,4 placas.

[0091] Nesta modalidade do método de varredura posicionai, apenas cerca de 1/69° de uma substância pura é apresentado por ponto. Quando uma varredura encontra um acerto, o acerto é preparado no-vamente para verificar a sua atividade. Esta abordagem dá ~ 1,4% de uma sequência particular representado por poço e comparando com acertos de outras placas que discretamente mostram as cadeias laterais em cada uma das três cadeias laterais, as cadeias laterais preferenciais podem ser determinadas. Tabela 2. Exemplos de substituintes em posições R1, R2, Ou R3 :

[0092] A Figura 5 é um exemplo de uma placa usada para varredura posicionai. Ospontos 1-69 teriam Ri idêntica em todos os pontos e cada uma das 69 cadeias laterais individuais e diferentes na R2 e uma mistura de todos os 69 compostos exibidos na posição R3. Pontos 70138 teriam analogamente todas as posições Ri exibindo cadeia lateral 2 e, em seguida, cada uma das 69 cadeias laterais diferentes na posição R2 e uma mistura de 69 cadeias laterais diferentes exibidas na posição R3 e assim por diante para cobrir todas as combinações possíveis. As placas R2 específicas teriam uma mistura de 69 compostos apresentados na posição Ri e, em seguida, todos os 69 pontos com a R2 tendo a mesma cadeia lateral igual ao composto 1, e em seguida, cada um dos 69 compostos individuais para a R3 análogo às placas específicas Ri acima descritas, em seguida, a combinação restante onde a posição Ri irá exibir cada um dos 69, a R2 exibirá a mistura dos 69 compostos, e pontos 1-69, todos eles terão a mesma cadeia lateral na posição R3.

[0093] Um exemplo dos resultados da varredura posicionai também é mostrado na Figura 5. O primeiro ponto sombreado tem as melhores cadeias laterais de Ri com a cadeia lateral igual ao composto 2 e R2 é igual ao composto 26, e pelo menos um dos 69 possíveis compostos na posição R3. O próximo ponto mostra que o composto 3 é ativo em Ri e R2 tem composto 10 e, pelo menos, um dos 69 compostos na posição R3. O último ponto na placa mostra que Ri é igual ao composto 5 e o composto 55 para R2 e, pelo menos, um dos 69 compostos em posição R3. Ao analisar os resultados da varredura análogos a partir da R 2 definido e placas de posição R3 a seqüência exata pode ser determinada.

[0094] Os 69 compostos com reatividade semelhante na reação SN2 para fazer as aminas secundárias são necessários. Variabilidade estruturalmente enorme é possível, mas algumas cadeias laterais pos-síveis são mostrados na Tabela 2.

Exemplo 5: Métodos de Interligação para Estabilizar a Esqueleto Híbrido Peptoide-Peptídeo Similar a Grampo Beta Cíclico

[0095] Existem vários métodos de interligar viáveis que podem ser usados para estabilizar o esqueleto híbrido peptoide-peptídeo similar a grampo beta cíclico. A interligação de duas cadeias laterais de peptoi- des é a mais fácil de realizar a partir de um ponto de vista sintético e irá pré-organizar aquelas duas cadeias laterais de peptoides para estarem próximas entre si, e aquela proximidade força conformações com o esqueleto geral que são compatíveis com a estrutura secundária similar a grampo beta cíclica desejada. Os pares mais fáceis de interligar são aminas de propargil em cadeias laterais de peptoides para ser interligado e reagir com estes dois terminais alcinos com uma diazida bifuncional com um ligante orgânico estável que atravessa a distância entre estas cadeias laterais de peptoides. O ligante orgânico precisa de mais 3 átomos para abranger essa distância. O grupo meta-xilenilo é mostrado na Figura 6; no entanto, pode ser utilizada qualquer combinação estável de átomos. Além disso, a corrente não precisa ser apenas um ligante, tal como o grupo também pode ser utilizado para otimizar as propriedades farmacocinéticas, por exemplo.

[0096] Alternativamente, o mesmo ou um ligante diferente pode ser usado para interligar cadeias laterais de propargil que estão em cadeias laterais de peptoides mais próximas, como mostrado na Figu-ra 7. Tal como aqui descrito, uma cadeia lateral de uma lateral de amino ácido e uma cadeia lateral próxima de peptoide são também possíveis, mas não mostradas. Um esquema mais genérico que utiliza uma azida e um alcino é mostrado na Figura 8. A reação RCM (do inglês, ring closing metathesis, a metátese de fechamento do anel) também pode ser usada, como mostrado pelo exemplo genérico na Figura 9.

[0097] A não ser que definido de outra forma a seguir, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que normalmente é entendido por uma pessoa versada na técnica para o qual esta invenção pertence. Publicações citadas neste documento e os materiais citados são especificamente incorporados por referência.

[0098] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar o uso de não mais do que a experimentação de rotina, e de muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descritos neste documento. Pretende-se abranger tais equivalentes pelas seguintes reivindicações.

Claims (20)

1. Método para expansão ex vivo de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) para uso em terapia celular adotiva (ACT), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter TILs autólogos de um indivíduo; (b) cultivar os TILs em um processo de duas etapas compreendendo: (i) um estágio de pré-expansão rápida (pré-REP) em um primeiro meio de cultura na presença de IL-2; e (ii) cultivar os TILs da etapa (i) em um estágio de expansão rápida (REP) em um segundo meio de cultura, compreendendo reagentes diferentes dos reagentes do primeiro meio de cultura, na presença de IL-2 para produzir TILs expandidos; e (c) adicionar (i) linfócitos irradiados e (ii) um agonista do receptor do tipo toll (TLR) a um ou mais do primeiro meio de cultura e do segundo meio de cultura em uma quantidade eficaz para melhorar a especificidade do tumor dos TILs expandidos.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agonista do TLR é um ligante para um TLR selecionado dentre o grupo que consiste em TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, e TLR9.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agonista de TLR compreende um ligante selecionado dentre o grupo que consiste em poli I:C e CpG ODN, Pam3CSK4 e Ribomunil.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os linfócitos irradiados são linfóci- tos autólogos.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os linfócitos irradiados são linfócitos alogênicos irradiados.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os linfócitos alogênicos irradiados são positivos para o antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2).

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o primeiro meio de cultura compreende (i) linfócitos irradiados e (ii) um agonista do receptor do tipo toll (TLR).

9. Uso de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), caracterizada pelo fato de que é na fabricação de uma composição para terapia de câncer, compreendendo: (a) obter TILs autólogos de um indivíduo; (b) cultivar os TILs em um processo de duas etapas compreendendo: (i) um estágio de pré-expansão rápida (pré-REP) em um primeiro meio de cultura na presença de IL-2; e (ii) cultivar os TILs da etapa (i) em um estágio de expansão rápida (REP) em um segundo meio de cultura, compreendendo reagentes diferentes dos reagentes do primeiro meio de cultura, na presença de IL-2 para produzir TILs expandidos; e (c) adicionar (i) linfócitos irradiados e (ii) um agonista do receptor do tipo toll (TLR) a um ou mais do primeiro meio de cultura e do segundo meio de cultura em uma quantidade eficaz para melhorar a especificidade do tumor dos TILs expandidos.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agonista de TLR é um ligante selecionado dentre o grupo que consiste em TLR1, TLR2, TLR3, TLR4 e TLR9.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agonista de TLR compreende um ligante selecionado do grupo que consiste em poli l:C e CpG ODN, Pam3CSK4 e Ri- bomunil.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que os linfócitos irradiados são linfócitos autólogos.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que os linfócitos irradiados são linfócitos alogênicos irradiados.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que os linfócitos alogênicos irradiados são positivos para o antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2).

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado pelo fato de que o primeiro meio de cultura compreende (i) linfócitos irradiados e (ii) um agonista do receptor do tipo toll (TLR).

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 16, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor sólido.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em melanoma, câncer de ovário, câncer de mama e câncer colorretal.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18, caracterizado pelo fato de que o câncer é metastático.

20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 19, caracterizado pelo fato de que o câncer é recorrente.