BR122020011542B1 - Cassete de expressão compreendendo elemento regulador de planta e método para produzir uma planta transgênica - Google Patents
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Abstract
a invenção fornece moléculas e constructos de dna recombinante, assim como suas sequências de nucleotídeo, úteis para modular expressão de gene em plantas. a invenção também fornece plantas transgênicas, células de plantas, partes de plantas e sementes compreendendo uma molécula de dna recombinante compreendendo uma molécula de dna operacionalmente ligada a uma molécula de dna capaz de ser transcrita heteróloga, assim como métodos de seu uso.
Description
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido ProvisórioEstados Unidos N.° de Série 61/785.268, depositado em 14 de março de 2013, que é incorporado como referência aqui em sua totalidade.
[002] A listagem de sequência contida no arquivo denominado"MONS332WO.txt", que possui 52,7 kilobytes (tamanho como medido no Microsoft Windows®) e foi criada em 11 de março de 2014, é depositada juntamente por submissão eletrônica e está incorporada como referência aqui.
[003] A invenção refere-se ao campo da biologia molecular deplantas, engenharia genética de plantas, e moléculas de DNA úteis para modular a expressão de gene em plantas.
[004] Elementos reguladores são elementos genéticos que regulam a atividade do gene modulando a transcrição de uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada. Esses elementos incluem promotores, líderes, íntrons e regiões não traduzidas 3', e são úteis no campo da biologia molecular de plantas e engenharia genética de plantas.
[005] A invenção fornece novos elementos reguladores para uso em plantas e constructos compreendendo os elementos reguladores. A invenção fornece também células de plantas transgênicas, plantas e sementes compreendendo os elementos reguladores. Em uma modalidade divulgada aqui, os elementos reguladores são operacionalmente ligados a uma molécula de DNA que pode ser transcrita. Em certas modalidades, a molécula de DNA que pode ser transcrita é heteróloga em relação à sequência reguladora. Também são fornecidos aqui métodos para preparar e usar os elementos reguladores divulgados aqui, incluindo constructos compreendendo os elementos reguladores, e as células de plantas transgênicas, plantas e sementes compreendendo os elementos reguladores operacionalmente ligados a uma molécula de DNA que pode ser transcrita que é heteróloga em relação ao elemento regulador.
[006] Assim, em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: a) uma sequência de DNA com pelo menos 85 por cento de identidade de sequência para qualquer um de SEQ ID NOs: 1-37; (b) uma sequência de DNA compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 1-37; e (c) um fragmento de qualquer um SEQ ID NOs:1-37, em que o fragmento tem atividade reguladora de gene; em que a sequência de DNA está operacionalmente ligada a uma molécula de DNA que pode ser transcrita heteróloga. "Molécula da DNA que pode ser transcrita heteróloga" significa que a molécula de DNA que pode ser transcrita é heteróloga em relação à sequência de DNA à qual ela está operacionalmente ligada. Em modalidades específicas, a molécula de DNA recombinante compreende uma sequência de DNA, tendo pelo 90 por cento, pelo menos 91 por cento, pelo menos 92 por cento, pelo menos 93 por cento, pelo menos 94 por cento, pelo menos 95 por cento, pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, ou pelo menos 99 por cento de identidade de sequência para a sequência de DNA de qualquer um de SEQ ID NOs: 1-37. Em modalidades particulares, a molécula de DNA heteróloga que pode ser transcrita compreende um gene de interesse agronômico, como um gene capaz de fornecer resistência a herbicida ou resistência a pragas nas plantas. Ainda em outras modalidades, a invenção fornece um constructo compreendendo uma molécula de DNA recombinante, conforme fornecida aqui.
[007] Em outro aspecto, são fornecidas aqui células de planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência de DNA com pelo menos cerca de 85 por cento de identidade de sequência para qualquer um de SEQ ID NOs: 1-37; (b) uma sequência de DNA compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 1-37; e (c) um fragmento de qualquer um de SEQ ID NOs:1-37, em que o fragmento tem atividade reguladora de gene; em que a sequência de DNA está operacionalmente ligada a uma molécula de DNA que pode ser transcrita heteróloga. Em certas modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta monocotiledônia. Em outras modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta dicotiledônea.
[008] Ainda em outro aspecto, ainda fornecida aqui é uma planta transgênica, ou parte da mesma, compreendendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência de DNA com pelo menos 85 por cento de identidade de sequência para qualquer um de SEQ ID NOs: 1-37; (b) uma sequência de DNA compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 1-37; e (c) um fragmento de qualquer um de SEQ ID NOs: 1-37, em que o fragmento tem atividade reguladora de gene; em que a sequência de DNA está operacionalmente ligada a uma molécula de DNA que pode ser transcrita heteróloga. Em modalidades específicas, a planta transgênica é uma planta de progênie de qualquer geração em relação a uma planta transgênica inicial e compreende a molécula de DNA recombinante. Uma semente transgênica compreendendo a molécula de DNA recombinante que produz essa planta transgênica quando crescida também é fornecida aqui.
[009] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma commodity compreendendo obter uma planta transgênica ou parte da mesma contendo uma molécula de DNA recombinante da invenção e produzir a commodity da mesma. Em uma modalidade, a commodity é composta de sementes, grãos, partes da planta e farinhas processadas.
[0010] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante da invenção compreendendo transformar uma célula de planta com a molécula de DNA recombinante da invenção para produzir uma célula vegetal transformada e regenerar uma planta transgênica da célula de planta transformada.
[0011] FIG. 1: Mostra configurações de cassete de expressão dainvenção.
[0012] SEQ ID NOs: 1-30, 38-41, 49 e 56 são sequências 3' UTR.
[0013] SEQ ID NOs: 31, 35, 42, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54 e 55
[0014] são sequências de DNA dos grupos de elemento de expressão regulatória (EXPs) compreendendo uma sequência de promotor operacionalmente ligada 5' para uma sequência de líder, que é operacionalmente ligada 5' para uma sequência de íntron; ou uma sequência de promotor operacionalmente ligada 5' para uma sequência de líder.
[0015] SEQ ID NOs: 32, 36 e 43 são sequências de promotor. [15]SEQ ID NOs: 33 e 37 são sequências de líder. [16] SEQ ID NO: 34 é uma sequência de íntron.
[0016] SEQ ID NO: 44 é a sequência de codificação para 15-glucuronidase (GUS) que possui um íntron processável.
[0017] SEQ ID NOs: 45 e 46 são sequências de codificação deluciferase.
[0018] A invenção fornece moléculas de DNA tendo atividade reguladora de gene em plantas. As sequências de nucleotídeos destas moléculas de DNA são fornecidas como SEQ ID NOs: 1-37. Estas moléculas de DNA são capazes de afetar a expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada em tecidos de plantas, e, portanto, regulando a expressão de gene de um transgene operacionalmente ligado em plantas transgênicas. A invenção também fornece métodos para modificar, produzir e usar o mesmo. A invenção também fornece composições que incluem células de planta transgênica, plantas, partes de planta e sementes contendo as moléculas de DNA recombinante da invenção, e métodos para preparar e usar as mesmas.
[0019] As definições e métodos a seguir são fornecidos para definirmelhor a presente invenção e guiar aqueles especialistas na técnica na prática da presente invenção. Salvo se indicado o contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos especialistas na técnica relevante.
[0020] Como usado aqui, o termo "DNA", "molécula de DNA" refere-se a uma molécula de DNA de fita dupla de origem genômica ou sintética, ou seja, um polímero de bases de deoxirribonucleotídeo. Como usado aqui, o termo "sequência de DNA" se refere à sequência de nucleotídeo de uma molécula de DNA. A nomenclatura utilizada aqui corresponde à do Título 37 de United States Code of Federal Regulations § 1.822, e estabelecido nas tabelas na WIPO Standard ST.25 (1998), Apêndice 2, Tabelas 1 e 3.
[0021] Como usado aqui, uma "molécula de DNA recombinante" éuma molécula de DNA compreendendo uma combinação de moléculas de DNA que não ocorreria naturalmente junta sem intervenção humana. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante pode ser uma molécula de DNA que é composta por pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas em relação uma à outra, uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA que se afasta das sequências de DNA que existem na natureza, ou uma molécula de DNA que foi incorporada no DNA de uma célula hospedeira por transformação genética.
[0022] Como usado aqui, o termo "identidade de sequência" refere-se à extensão pela qual duas sequências de DNA idealmente alinhadas são idênticas. Um alinhamento de sequência ideal é criado alinhando manualmente duas sequências, por exemplo, uma sequência de referência e outra sequência de DNA, para maximizar o número de correspondências de nucleotídeos no alinhamento de sequência com inserções, deleções, ou lacunas de nucleotídeo internas apropriadas. Como usado aqui, o termo "sequência de referência" refere-se a uma sequência de DNA fornecida como SEQ ID NOs: 1-37.
[0023] Como usado aqui, o termo "por cento de identidade desequência" ou "por cento de identidade" ou "% de identidade" é a fração de identidade multiplicada por 100.
[0024] A "fração de identidade" para uma sequência de DNAidealmente alinhada com uma sequência de referência é o número de correspondências de nucleotídeos no alinhamento ideal, dividido pelo número total de nucleotídeos na sequência de referência, por exemplo, o número total de nucleotídeos em todo o comprimento de toda a sequência de referência. Assim, uma modalidade da invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de DNA que, quando idealmente alinhada para uma sequência de referência, fornecida aqui como SEQ ID NOs: 1-37, tem pelo menos cerca de 85 por cento de identidade, pelo menos cerca de 86 por cento de identidade, pelo menos cerca de 87 por cento de identidade, pelo menos cerca de 88 por cento de identidade pelo menos cerca de 89 por cento de identidade, pelo menos cerca de 90 por cento de identidade, pelo menos cerca de 91 por cento de identidade, pelo menos cerca de 92 por cento de identidade, pelo menos cerca de 93 por cento de identidade, pelo menos cerca de 94 por cento de identidade, pelo menos cerca de 95 por cento de identidade, pelo menos cerca de 96 por cento de identidade, pelo menos cerca de 97 por cento de identidade, pelo menos cerca de 98 por cento de identidade, pelo menos cerca de 99 por cento de identidade, ou pelo menos cerca de 100 por cento de identidade para a sequência de referência.
[0025] Elementos reguladores como promotores, líderes, potencializadores, íntrons e regiões de terminação da transcrição (ou 3' UTRs) desempenham um papel essencial na expressão geral de genes em células vivas. O termo "elemento regulador", como usado aqui, refere-se a uma molécula de DNA com atividade reguladora de gene. O termo "atividade reguladora de gene", como usado aqui, refere-se à capacidade de afetar a expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada, por exemplo, afetando a transcrição e/ou tradução da molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada. Elementos reguladores, como promotores, líderes, potencializadores, íntrons e 3' UTRs que funcionam em plantas são, portanto, úteis para modificar fenótipos da planta através de engenharia genética.
[0026] Como usado aqui, um "grupo de elemento de expressão reguladora" ou sequência "EXP" pode se referir a um grupo de elementos reguladores operacionalmente ligados, como potencializadores, promotores, líderes, e íntrons. Assim, um grupo de elemento de expressão reguladora pode ser composto, por exemplo, de um promotor operacionalmente ligado 5' para uma sequência líder, que por sua vez se liga operacionalmente 5' para uma sequência de íntron.
[0027] Elementos reguladores podem ser caracterizados pelos seus padrões de expressão de gene, por exemplo, efeitos positivos e/ou negativos como expressão constitutiva ou de resposta temporal, espacial, de desenvolvimento, tecidual, ambiental, fisiológica, patológica, de ciclo celular, e/ou química, e qualquer combinação dos mesmos, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas. Como usado aqui, um "padrão de expressão de gene" é qualquer padrão de transcrição de uma molécula de DNA operacionalmente ligada em uma molécula de RNA transcrita. A molécula de RNA transcrita pode ser traduzida para produzir uma molécula de proteína ou pode fornecer uma molécula de RNA reguladora ou antissenso ou outra, como um RNA de fita dupla (dsRNA), um RNA de transferência (tRNA), um RNA ribossômico (rRNA), um microRNA (miRNA), e afins.
[0028] Como usado aqui, o termo "expressão de proteína" é qualquer padrão de tradução de uma molécula de RNA transcrita em uma molécula de proteína. A expressão da proteína pode ser caracterizada por suas qualidades temporais, espaciais, de desenvolvimento ou morfológicas, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas.
[0029] Um promotor é útil como um elemento regulador para modular a expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada. Como usado aqui, o termo "promotor" refere- se geralmente a uma molécula de DNA que está envolvida no reconhecimento e ligação da RNA polimerase II e outras proteínas, como fatores de transcrição agindo em trans, para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser inicialmente identificado da região não traduzida 5' (5' UTR) de um gene. Alternadamente, os promotores podem ser produzidos sinteticamente ou moléculas de DNA manipuladas. Os promotores também podem ser quiméricos.
[0030] Promotores quiméricos são produzidos através da fusão de duas ou mais moléculas de DNA heterólogas. Promotores úteis na prática da invenção incluem SEQ ID NOs: 32 e 36, incluindo fragmentos ou variantes dos mesmos. Em modalidades específicas da invenção, as moléculas de DNA reivindicadas e quaisquer variantes ou derivadas das mesmas conforme descrito aqui, são também definidas como compreendendo a atividade de promotor, ou seja, são capazes de agir como um promotor em uma célula hospedeira, como em uma planta transgênica. Ainda em outras modalidades específicas, um fragmento pode ser definido como exibindo a atividade de promotor possuída pela molécula do promotor inicial da qual é derivada, ou um fragmento pode compreender um "promotor mínimo", que fornece um nível basal de transcrição e é composto por um TATA box ou sequência de DNA equivalente para reconhecimento e ligação do complexo de RNA polimerase II para iniciação da transcrição.
[0031] Em uma modalidade, fragmentos de uma sequência depromotor divulgados aqui são fornecidos. Fragmentos de promotor podem compreender a atividade do promotor, conforme descrito acima, e podem ser úteis sozinhos ou em combinação com outros promotores e fragmentos de promotor, como na construção de promotores quiméricos, ou na combinação com outros EXPs e fragmentos de EXP. Em modalidades específicas, fragmentos de um promotor são fornecidos compreendendo pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 175, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 225, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 275, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 750, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, ou pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos contíguos, ou mais, de uma molécula de DNA tendo atividade de promotor conforme divulgado aqui. Métodos para produzir esses fragmentos de uma molécula de promotor inicial são bem conhecidos na técnica.
[0032] Composições derivadas de qualquer um dos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 32 e 36, como deleções internas ou 5', por exemplo, podem ser produzidas usando métodos bem conhecidos na técnica para melhorar ou alterar a expressão, incluindo a remoção de elementos que têm efeitos positivos ou negativos na expressão, elementos de duplicação que têm efeitos positivos ou negativos na expressão, e/ou elementos de duplicação ou remoção de que têm efeitos específicos no tecido ou célula na expressão. Composições derivadas de qualquer um dos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 32 e 36 compostos de deleções 3' em que o elemento TATA box ou a sequência equivalente da mesma e sequência a jusante é removida podem ser usadas, por exemplo, para preparar elementos potencializadores. Outras deleções podem ser preparadas para remover quaisquer elementos que têm efeitos positivos ou negativos; específicos de tecido; específicos de célula; ou específicos de tempo (como, entre outros, ritmos circadianos) na expressão. Qualquer um dos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 32 e 36 e fragmentos ou potencializadores derivados dos mesmos podem ser usados para preparar composições de elemento regulador transcricional.
[0033] Em conformidade com a invenção, um promotor oufragmento promotor pode ser analisado para a presença de elementos promotores conhecidos, ou seja, características de sequência de DNA, como uma TATA box e outros motivos de sítio de ligação de fator de transcrição conhecidos. A identificação desses elementos de promotor conhecidos pode ser usada por um especialista na técnica para projetar variantes do promotor tendo um padrão de expressão semelhante ao promotor original.
[0034] Como usado aqui, o termo "líder" refere-se a uma molécula de DNA identificada da região 5' não traduzida (5' UTR) de um gene e definido geralmente como um segmento de DNA entre o sítio de início de transcrição (TSS) e o sítio de início da sequência codificadora de proteína. Alternaivamente, os líderes podem ser produzidos sinteticamente ou elementos de DNA manipulados. Um líder pode ser usado como um elemento regulador 5' para modular a expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada. Moléculas líderes podem ser usadas com um promotor heterólogo ou com seu promotor nativo. Líderes úteis na prática da invenção incluem SEQ ID NOs: 33 e 37 ou fragmentos ou variantes dos mesmos. Em modalidades específicas, essas sequências de DNA podem ser definidas como sendo capazes de atuar como um líder em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, uma célula de planta transgênica. Em uma modalidade, essas sequências de DNA podem ser decodificadas como compreendendo a atividade de líder.
[0035] As sequências de líder apresentadas como SEQ ID NOs: 33 e 37 podem ser compostas de elementos reguladores, ou podem adotar estruturas secundárias que podem ter um efeito na transcrição ou tradução de uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada. As sequências de líder apresentadas como SEQ ID NOs: 33 e 37 podem ser usadas em conformidade com a invenção para preparar elementos reguladores quiméricos que afetam a transcrição ou tradução de uma molécula de DNA operacionalmente ligada.
[0036] Como usado aqui, o termo "íntron" refere-se a uma molécula de DNA que pode ser identificada a partir de um gene e pode ser definida geralmente como uma região que sai pela recombinação durante o processamento do RNA mensageiro (mRNA) antes da tradução. Alternadamente, um íntron pode ser produzido sinteticamente ou elemento de DNA manipulado. Um íntron pode conter elementos potencializadores que afetam a transcrição de genes operacionalmente ligados. Um íntron pode ser usado como um elemento regulador para modular a expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada. Um constructo pode compreender um íntron, e o íntron pode ou não ser heterólogo em relação à molécula de DNA que pode ser transcrita. Exemplos de íntrons na técnica incluem o íntron de actina de arroz e o íntron HSP70 de milho.
[0037] Em plantas, a inclusão de alguns íntrons em constructos leva à maior acumulação de mRNA e proteína em relação aos constructos desprovidos do íntron. Este efeito é denominado "potencialização mediada por íntron" (IME) da expressão de gene. Íntrons conhecidos por estimular a expressão em plantas foram identificados em genes de milho (por exemplo, tubA1, Adh1, Sh1 e Ubi1), em genes de arroz (por exemplo, tpi) e nos genes de plantas dicotiledôneas como aqueles de petúnia (por exemplo, rbcS), batata (por exemplo, st-lsl) e de Arabidopsis thaliana (por exemplo, ubq3 e patl). Foi demonstrado que deleções ou mutações dentro dos sítios de recombinação de um íntron reduzem a expressão de gene, indicando que o processamento poderá ser necessário para IME. No entanto, IME em plantas dicotiledôneas demonstrou mutações pontuais dentro dos sítios de recombinação do gene patl de A. thaliana. Vários usos do mesmo íntron em uma planta demonstraram, em certas circunstâncias, apresentar desvantagens. Nesses casos, é necessário ter uma coleção de elementos de controle básicos para a construção de elementos de DNA recombinante apropriados.
[0038] Íntrons úteis na prática da invenção incluem SEQ ID NOs:: 34. Composições derivadas do íntron apresentado com SEQ ID NO: 34 podem ser compostas por deleções ou duplicações internas de elementos reguladores eis; e/ou alterações das sequências de DNA 5' e 3' compreendendo as junções recombinantes de íntron/éxon podem ser usadas para melhorar a expressão ou especificidade de expressão quando operacionalmente ligadas a um promotor + líder ou promotor quimérico + líder e sequência de codificação. Ao modificar sequências de limite de íntron/éxon, pode ser benéfico evitar usar a sequência de nucleotídeo AT ou o nucleotídeo A antes da extremidade 5' do sítio de recombinação (GT) e o nucleotídeo G ou a sequência de nucleotídeo TG, respectivamente, depois da extremidade 3' do sítio de recombinação (AG) para eliminar o potencial de códons de início indesejados de serem formados durante o processamento do RNA mensageiro no transcrito final. A sequência de DNA ao redor dos sítios de junção de recombinação de extremidade 5' ou 3' do íntron, portanto, pode ser modificada dessa maneira. Variantes de íntrons e íntrons alterados conforme descrito aqui e através de métodos conhecidos na técnica, podem ser testadas empiricamente como descrito nos exemplos de trabalho para determinar o efeito de um íntron na expressão de uma molécula de DNA operacionalmente ligada. Alterações das regiões 5' e 3' compreendendo a junção de recombinação íntron/éxon também podem ser preparadas para reduzir o potencial de introdução de inicío falso e códons de parada sendo produzidos no transcrito resultante após o processamento e recombinação do RNA mensageiro. Os íntrons podem ser testados empiricamente como descrito nos exemplos de trabalho para determinar efeito do íntron sobre a expressão de um transgene.
[0039] Como usado aqui, os termos "molécula de terminação de transcrição 3'", "região não traduzida 3'" ou "3' UTR" se referem a uma molécula de DNA que é usada durante a transcrição para a região não traduzida da porção 3' de uma molécula de mRNA. A região não traduzida 3' de uma molécula de mRNA pode ser gerada por clivagem específica e poliadenilação 3', também conhecido como uma cauda polyA. Um 3' UTR pode ser operacionalmente ligado para e localizado a jusante de uma molécula de DNA que pode ser transcrita e pode incluir um sinal de poliadenilação e outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição, processamento de mRNA, ou expressão do gene. Caudas PolyA funcionam na estabilidade do mRNA e na iniciação da tradução. Exemplos de moléculas de terminação de transcrição 3' na técnica são a região 3' de nopalina sintase; região 3' de hsp17 de trigo, região 3' da subunidade pequena de ervilha rubisco, região 3' E6 de algodão e coixina 3' UTR.
[0040] 3' UTRs normalmente encontram uso benéfico para a expressão recombinante de moléculas de DNA específicas. Um 3' UTR fraco tem potencial para gerar a leitura, que pode afetar a expressão da molécula de DNA localizada nos cassetes de expressão vizinhos. O controle apropriado da terminação de transcrição pode impedir a leitura em sequências de DNA (por exemplo, outros cassetes de expressão) localizadas a jusante e ainda pode permitir reciclagem eficiente da RNA polimerase para melhorar a expressão do gene. A terminação da transcrição eficiente (liberação da RNA polimerase II do DNA) é pré- requisito para reinício da transcrição e, assim, afeta diretamente o nível de transcrição geral. Após a terminação da transcrição, o mRNA maduro é liberado do sítio de síntese e o modelo transportado para o citoplasma. mRNAs eucarióticos são acumulados como formas poly(A) in vivo, tornando difícil detectar sítios de terminação de transcrição por métodos convencionais. No entanto, a previsão de 3' UTRs funcional e eficiente pelos métodos de bioinformática pode ser difícil, em que há poucas sequências de DNA conservadas que permitam fácil previsão de uma 3' UTR eficaz.
[0041] Do ponto de vista prático, é geralmente benéfico que um 3' UTR usado em um cassete de expressão possua as seguintes características. O 3' UTR deve ser capaz de terminar a transcrição de forma eficiente e eficaz do transgene que pode ser transcrita e impedir a leitura do transcrito em qualquer sequência de DNA vizinha, que pode ser compreendida de outro cassete de expressão, como no caso de vários cassetes de expressão que residem em um DNA de transferência (T-DNA), ou o DNA cromossômico vizinho, em que o T-DNA foi inserido. Em biotecnologia de planta, o 3' UTR é usado frequentemente para iniciação de reações de amplificação do RNA transcrito reverso extraído da planta transformada e usado para: (1) avaliar a atividade transcricional ou expressão do cassete de expressão uma vez integrado no cromossomo da planta; (2) avaliar o número de cópia das inserções dentro da planta de DNA; e (3) avaliar a zigosidade da semente resultante após reprodução. O 3' UTR também é usado em reações de amplificação do DNA extraído da planta transformada para caracterizar a integridade do cassete inserido.
[0042] Como usado aqui, o termo "potencializador" ou "elemento potencializador" refere-se a um elemento regulador agindo em cis, também conhecido como elemento cis que confere um aspecto do padrão geral de expressão, mas é geralmente insuficiente sozinho para conduzir a transcrição de uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada. Ao contrário dos promotores, os elementos potencializadores geralmente não incluem um sítio de início de transcrição (TSS) ou TATA box ou sequência de DNA equivalente. Um promotor ou fragmento promotor pode naturalmente compreender um ou mais elementos potencializadores que afetam a transcrição de uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada. Um elemento potencializador também pode ser fundido a um promotor para produzir um elemento cis promotor quimérico que confere um aspecto da modulação geral da expressão do gene.
[0043] Acredita-se que muitos elementos potencializadores de promotor se ligam a proteínas de ligação de DNA e/ou afetam a topologia do DNA, produzindo conformações locais que seletivamente permitem ou restringem o acesso da RNA polimerase para o modelo de DNA ou que facilitam a abertura seletiva da dupla hélice no sítio de início da transcrição. Um elemento potencializador pode funcionar para se ligar aos fatores de transcrição que regulam a transcrição. Alguns elementos potencializadores se ligam a mais de um fator de transcrição, e fatores de transcrição podem interagir com diferentes afinidades com mais de um domínio potencializador. Elementos potencializadores podem ser identificados por várias técnicas, incluindo análise de deleção, ou seja, deletando um ou mais nucleotídeos da extremidade 5' ou interno para um promotor; análise de proteínas de ligação de DNA usando footprinting de DNase I, interferência de metilação, ensaios de mobilidade-mudança de eletroforese, footprinting genômico in vivo por reação em cadeia da polimerase (PCR) mediada por ligação e outros ensaios convencionais; ou por análise de similaridade de sequência de DNA usando motivos de elementos eis conhecidos ou elementos potencializadores como uma sequência alvo ou motivo alvo com métodos convencionais de comparação de sequência de DNA, como BLAST. A estrutura fina de um domínio potencializador pode ainda ser estudada por mutagênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou por outros métodos convencionais conhecidos na técnica. Elementos potencializadores podem ser obtidos por síntese química ou por isolamento de elementos reguladores que incluem esses elementos, e podem ser sintetizados com nucleotídeos flanqueando adicionais que contêm sítios de enzima de restrição úteis para facilitar a manipulação de subsequência. Assim, o projeto, construção, e utilização de elementos potencializadores, de acordo com os métodos divulgados aqui para modular da expressão da molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada, são incluídos pela invenção.
[0044] Como usado aqui, o termo "quimérico" refere-se a uma única molécula de DNA produzida pela fusão de uma primeira molécula de DNA para uma segunda molécula de DNA, onde nem a primeira nem a segunda molécula de DNA normalmente poderia ser encontrada nessa configuração, ou seja, fundidida uma com a outra. A molécula de DNA quimérica é, portanto, uma nova molécula de DNA não normalmente encontrada na natureza. Como usado aqui, o termo "promotor quimérico" refere-se a um promotor produzido através dessa manipulação de moléculas de DNA. Um promotor quimérico pode combinar dois ou mais fragmentos de DNA, por exemplo, a fusão de um promotor para um elemento potencializador. Assim, o projeto, construção, e utilização de promotores quiméricos, de acordo com os métodos divulgados aqui para modular a expressão das moléculas de DNA que podem ser transcritas operacionalmente ligadas, são incluídos pela presente invenção.
[0045] Como usado aqui, o termo "variante" refere-se a uma segunda molécula de DNA, como um elemento regulador, que é semelhante na composição, mas não idêntico a, uma primeira molécula de DNA, e em que a segunda molécula de DNA ainda mantém a funcionalidade geral, ou seja, padrão de expressão igual ou semelhante, por exemplo, através de mais ou menos ou atividade transcricional ou traducional equivalente, da primeira molécula de DNA. Uma variante pode ser uma versão encurtada ou truncada da primeira molécula de DNA e/ou uma versão alterada da sequência da primeira molécula de DNA, como uma com sítios de enzimas de restrição diferentes e/ou deleções, substituições e/ou inserções internas. Uma "variante" também pode incluir um elemento regulador tendo uma sequência de nucleotídeo compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleotídeos de uma sequência de referência, em que o elemento regulador derivado tem mais ou menos ou atividade transcricional ou traducional equivalente da molécula reguladora parente correspondente. "Variantes" de elemento regulador também incluem variantes decorrentes de mutações que ocorrem durante ou como resultado de transformação de células bacterianas e de planta. Na invenção, uma sequência de DNA fornecida como SEQ ID NOs: 137 pode ser usada para criar variantes que são semelhantes na composição, mas não idênticas à sequência de DNA do elemento regulador original, mantendo ainda a funcionalidade geral, ou seja, o padrão de expressão igual ou semelhante, de elemento regulador original. A produção dessas variantes da invenção está bem dentro da habilidade da técnica à luz da divulgação e é incluída no escopo da invenção.
[0046] Elementos reguladores quiméricos podem ser projetados para compreender vários elementos constitutivos que podem ser operacionalmente ligados por vários métodos conhecidos na técnica, como digestão e ligação por enzima de restrição, clonagem independente de ligação, montagem modular de produtos de PCR durante a amplificação, ou síntese química direta do elemento regulador, bem como outros métodos conhecidos na técnica. Os vários elementos reguladores quiméricos resultantes podem ser compreendidos do mesmo, ou variantes dos mesmos elementos constituintes, mas diferem na sequência de DNA ou sequências de DNA que compreendem a sequência ou sequências de DNA ligante que permitem que os elementos constitutivos sejam operacionalmente ligados. Na invenção, uma sequência de DNA fornecida como SEQ ID NOs: 1-30 ou 31-37 podem fornecer uma sequência de referência de elemento regulador, em que os elementos constituintes que compreendem a sequência de referência podem ser unidos por métodos conhecidos na técnica e podem compreender substituições, deleções e/ou inserções de um ou mais nucleotídeos ou mutações que ocorrem naturalmente na transformação de células bacterianas e de planta.
[0047] A eficácia das modificações, duplicações ou deleções aqui descritas nos aspectos de expressão desejados de uma molécula de DNA que pode ser transcrita particular pode ser testada empiricamente em ensaios de planta estáveis e transitórios, como os descritos nos exemplos de trabalho aqui, a fim de validar os resultados, que podem variar dependendo das mudanças feitas e o objetivo da mudança na molécula de DNA inicial.
[0048] Como usado aqui, o termo "constructo" significa qualquer molécula de DNA recombinante como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, fagos ou molécula de DNA ou RNA linear ou circular, derivada de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, compreendendo uma molécula de DNA onde pelo menos uma molécula de DNA foi ligada à outra molécula de DNA de uma forma funcionalmente operativa, ou seja, operacionalmente ligada. Como usado aqui, o termo "vetor" significa qualquer constructo que pode ser utilizado para fins de transformação, ou seja, a introdução de DNA ou RNA heterólogo em uma célula hospedeira. Um constructo normalmente inclui um ou mais cassetes de expressão. Como usado aqui, um "cassete de expressão" refere-se a uma molécula de DNA compreendendo pelo menos uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada a um ou mais elementos reguladores, geralmente pelo menos um promotor e um 3' UTR.
[0049] Como usado aqui, o termo "operacionalmente ligado" refere- se a uma primeira molécula de DNA unida para uma segunda molécula de DNA, em que a primeira e segunda molécula de DNA são então organizadas em que a primeira molécula de DNA afeta a função da segunda molécula de DNA. As duas moléculas de DNA podem ou não ser parte de uma única molécula de DNA contígua e podem ou não ser adjacentes. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma molécula de DNA que pode ser transcrita se o promotor for capaz de afetar a transcrição ou a tradução da molécula de DNA que pode ser transcrita.
[0050] Os constructos da invenção podem ser fornecidos, em uma modalidade, como constructos de borda de plasmídeo indutor de duplo tumor (Ti) que têm as regiões de borda direita (RB ou AGRtu.RB) e borda esquerda (LB ou AGRtu.LB) do plasmídeo Ti isolado de Agrobacterium tumefaciens, compreendendo um T-DNA, que, junto com moléculas de transferência fornecidas por células de A. tumefaciens, permitem a integração do T-DNA no genoma em uma célula de planta (ver, por exemplo, Patente US 6.603.061). Os constructos também podem conter os segmentos de DNA de estrutura do plasmídeo que fornecem a função de replicação e seleção antibiótica em células bacterianas, por exemplo, uma origem de replicação de Escherichia coli como ori322, uma origem de replicação de faixa de hospedeiro ampla como oriV ou oriRi, e uma região codificadora para um marcador selecionável como Spec/Strp que codifica para aminoglicosídeo adeniltransferase Tn7 ( aadA) conferindo resistência à espectinomicina ou estreptomicina, ou um gene marcador selecionável de gentamicina (Gm, Gent). Para a transformação da planta, a cepa bacteriana hospedeira é frequentemente A. tumefaciens ABI, C58 ou LBA4404; no entanto, outras cepas conhecidas pelos especialistas na técnica de transformação de plantas podem funcionar na invenção.
[0051] Métodos são conhecidos na técnica de montagem e introdução de constructos em uma célula de forma que a molécula de DNA que pode ser transcrita é transcrita em uma molécula de mRNA funcional que é traduzida e expressa como uma proteína. Para a prática da invenção, composições convencionais e métodos para preparar e usar constructos e células hospedeiras são bem conhecidos por um especialista na técnica. Por exemplo, vetores típicos úteis para expressão de ácidos nucleicos em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vetores derivados do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens e o vetor de controle de transferência pCaMVCN.
[0052] Vários elementos reguladores podem ser incluídos em um constructo, incluindo qualquer um dos fornecidos aqui. Qualquer um desses elementos reguladores pode ser fornecido em combinação com outros elementos reguladores. Essas combinações podem ser projetadas ou modificadas para produzir características reguladoras desejáveis. Em uma modalidade, constructos da invenção compreendem pelo menos um elemento regulador operacionalmente ligado a uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada a um 3' UTR.
[0053] Constructos da invenção podem incluir qualquer promotor ou líder fornecido aqui ou conhecido na técnica. Por exemplo, um promotor da invenção pode ser operacionalmente ligado a um líder 5' não traduzido heterólogo como um derivado de um gene de proteína de choque térmico. Alternativamente, um líder da invenção pode ser operacionalmente ligado a um promotor heterólogo como promotor de transcrição do Vírus do Mosaico da Couve-flor 35S.
[0054] Cassetes de expressão também podem incluir uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito que codifica um peptídeo que é útil para o direcionamento subcelular de uma proteína operacionalmente ligada, particularmente para um cloroplasto, leucoplasto ou outra organela do plastídeo; mitocôndrias; peroxissoma; vacúolo; ou uma localização extracelular. Muitas proteínas localizadas no cloroplasto são expressas de genes nucleares como precursores e são direcionadas para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP). Exemplos dessas proteínas de cloroplasto isoladas incluem, entre outras, aquelas associados com a subunidade pequena (SSU) da ribulose-1,5,-bisfosfato carboxilase, ferredoxina, ferredoxina oxidorredutase, a proteína complexa de colheita de luz I e II, tioredoxina F e enolpiruvil xiquimato fosfato sintase (EPSPS). Peptídeos de trânsito de cloroplasto são descritos, por exemplo, em Patente US 7.193.133. Foi demonstrado que as proteínas não cloroplasto podem ser direcionadas para o cloroplasto pela expressão de um CTP heterólogo operacionalmente ligado à molécula de DNA que pode ser transcrita que codifica uma proteína não cloroplasto.
[0055] Como usado aqui, o termo "molécula de DNA que pode ser transcrita" refere-se a qualquer molécula de DNA capaz de ser transcrita em uma molécula de RNA, incluindo, entre outras, aquelas que têm sequências de codificação de proteína e aquelas produzindo moléculas de RNA tendo sequências úteis para a supressão do gene. O tipo de molécula de DNA pode incluir, entre outros, uma molécula de DNA da mesma planta, uma molécula de DNA de outra planta, uma molécula de DNA de um organismo diferente, ou uma molécula de DNA sintética, como uma molécula de DNA contendo uma mensagem antissenso de um gene, ou uma molécula de DNA que codifica uma versão artificial, sintética ou modificada de outra forma de um transgene. Molécula de DNA que pode ser transcrita exemplar para a incorporação em constructos da invenção incluem, por exemplo, moléculas de DNA ou genes de uma espécie diferente da espécie em que a molécula de DNA é incorporada ou genes que se originam de, ou estão presentes em, a mesma espécie, mas são incorporados em células destinatárias por métodos de engenharia genética em vez de técnicas de reprodução clássica.
[0056] Um "transgene" refere-se a uma molécula de DNA que pode ser transcrita heteróloga para uma célula hospedeira pelo menos no que diz respeito a sua localização no genoma da célula hospedeira e/ou uma molécula de DNA que pode ser transcrita artificialmente incorporada no genoma de uma célula hospedeira na geração atual ou qualquer geração anterior da célula.
[0057] Um elemento regulador, como um promotor da invenção, pode ser operacionalmente ligado a uma molécula de DNA que pode ser transcrita que é heteróloga em relação ao elemento regulador. Como usado aqui, o termo "heterólogo" refere-se à combinação de duas ou mais moléculas de DNA quando essa combinação é não normalmente encontrada na natureza. Por exemplo, as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de diferentes espécies e/ou as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de genes diferentes, por exemplo, genes diferentes da mesma espécie ou os mesmos genes de espécies diferentes. Um elemento regulador é assim heterólogo em relação a uma molécula de DNA que pode ser transcrita operacionalmente ligada se essa combinação não é normalmente encontrada na natureza, ou seja, a molécula de DNA que pode ser transcrita não ocorre naturalmente operacionalmente ligada ao elemento regulador.
[0058] A molécula de DNA que pode ser transcrita em geral pode ser qualquer molécula de DNA para que a expressão de um transcrito seja desejada. Essa expressão de um transcrito pode resultar na tradução da molécula de mRNA resultante e, portanto, expressão da proteína. Como alternativa, por exemplo, uma molécula de DNA que pode ser transcrita pode ser projetada para, finalmente, causar diminuição da expressão de um gene ou proteína específica. Em uma modalidade, isto pode ser feito usando uma molécula de DNA que pode ser transcrita que é orientada na direção antissenso. Um especialista na técnica é familiarizado com o uso dessa tecnologia antissenso. Qualquer gene pode ser regulado negativamente dessa maneira, e, em uma modalidade, uma molécula de DNA que pode ser transcrita pode ser projetada para a supressão de um gene específico através da expressão de uma molécula de dsRNA, siRNA ou miRNA.
[0059] Assim, uma modalidade da invenção é uma molécula de DNA recombinante compreendendo um elemento regulador da invenção, como aqueles fornecidos como SEQ ID NOs: 1-37, operacionalmente ligado a uma molécula de DNA que pode ser transcrita heteróloga a fim de modular a transcrição da molécula de DNA que pode ser transcrita em um nível desejado ou em um padrão desejado quando o constructo é integrado no genoma de uma célula de planta transgênica. Em uma modalidade, a molécula de DNA que pode ser transcrita compreende uma região de codificação de proteína de um gene e, em outra modalidade, a molécula de DNA que pode ser transcrita compreende uma região antissenso de um gene.
[0060] Uma molécula de DNA que pode ser transcrita pode ser um gene de interesse agronômico. Como usado aqui, o termo "gene de interesse agronômico" refere-se a uma molécula de DNA que pode ser transcrita que, quando expressa em um tecido, célula, ou tipo de célula de planta particular, confere uma característica desejável. O produto de um gene de interesse agronômico pode agir dentro da planta a fim de causar um efeito sobre a morfologia, fisiologia, crescimento, desenvolvimento, rendimento, composição do grão, perfil nutricional, resistência à doença ou pragas e/ou tolerância ambiental ou química da planta ou pode agir como um agente pesticida na dieta de uma praga que se alimenta da planta. Em uma modalidade da invenção, um elemento regulador da invenção é incorporado em um constructo de forma que o elemento regulador é operacionalmente ligado a uma molécula de DNA que pode ser transcrita que é um gene de interesse agronômico. Em uma planta transgênica contendo esse constructo, a expressão do gene de interesse agronômico pode conferir uma característica agronômica benéfica. Uma característica agronômica benéfica pode incluir, por exemplo, entre outros, tolerância a herbicida, controle de insetos, rendimento modificado, resistência a doenças, resistência a patógeno, modificado crescimento e desenvolvimento de planta, modificado teor de amido, modificado teor de óleo, modificado teor de ácidos graxos, modificado teor de proteínas, modificado amadurecimento de frutas, reforçada nutrição humana e animal, produções de biopolímero, resistência a estresse ambiental, peptídeos farmacêuticos, melhoradas qualidades de processamento, sabor melhorado, utilidade de produção de semente híbrida, melhorada produção de fibra, e produção de biocombustível desejável.
[0061] Exemplos de genes de interesse agronômico conhecidos na técnica incluem aqueles para resistência a herbicida (Patentes US 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; e 5.463.175), rendimento aumentado (Patentes US USRE38, 446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; e 5.716.837), controle de insetos (Patentes US 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658, 5.880.275; 5.763.245; e 5.763.241), resistência a doenças fúngicas (Patentes US 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; e 6.506.962), resistência a vírus (Patentes US 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; e 5.304.730), resistência a nematoide (Patente US 6.228.992), resistência a doenças bacterianas (Patente US 5.516.671), crescimento e desenvolvimento de planta (Patentes US 6.723.897 e 6.518.488), produção de amido (Patentes US 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), produção de óleos modificada (Patentes US 6.444.876; 6.426.447; e 6.380.462), alta produção de óleo (Patentes US 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; e 6.476.295), teor modificado de ácidos graxos (Patentes US 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; e 6.459.018), alta produção de proteína (Patente US 6.380.466), amadurecimento de fruta (Patente US 5.512.466), reforçada nutrição animal e humana (Patentes US 6.723.837; 6.653.530; 6.541.259; 5.985.605; e 6.171.640), biopolímeros (Patentes US USRE37.543; 6.228.623; e 5.958.745, e 6.946.588), resistência a estresse ambiental (Patente US 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (Patentes US 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; e 6.080.560), características de processamento melhoradas (Patente US 6.476.295), digestibilidade melhorada (Patente US 6.531.648) baixa rafinose (Patente US 6.166.292), produção de enzimas industriais (Patente US 5.543.576), sabor melhorado (Patente US 6.011.199), fixação do nitrogênio (Patente US 5.229.114), produção de sementes híbridas (Patente US 5.689.041), produção de fibra (Patentes US 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; e 5.869.720) e produção de biocombustíveis (Patente US 5.998.700).
[0062] Alternativamente, um gene de interesse agronômico pode afetar as características ou fenótipos da planta acima mencionada pela codificação de uma molécula de RNA que causa a modulação da expressão gênica de um gene endógeno, por exemplo, por antissenso (ver, por exemplo, Patente US 5.107.065); RNA inibitório ("RNAi," incluindo a modulação da expressão gênica por mecanismos mediados por miRNA, siRNA, siRNA de atuação trans e sRNA em fases, por exemplo, conforme descrito nos pedidos publicados US 2006/0200878 e US 2008/0066206 e no pedido de patente US 11/974.469); ou mecanismos mediados por cossupressão. O RNA também poderia ser uma molécula de RNA catalítica (por exemplo, uma ribozima ou um riboswitch; ver, por exemplo, US 2006/0200878) projetado para clivar um produto de mRNA endógeno desejado. Métodos são conhecidos na técnica para construir e introduzir constructos em uma célula de forma que a molécula de DNA que pode ser transcrita é transcrita em uma molécula que é capaz de causar a supressão do gene.
[0063] Transgenes de marcador selecionável podem também ser utilizados com os elementos reguladores da invenção. Como usado aqui, o termo "transgene de marcador selecionável" refere-se a qualquer molécula de DNA que pode ser transcrita cuja expressão em uma planta, tecido ou célula transgênica, ou falta dos mesmos, pode ser triada para ou pontuada de alguma forma. Genes de marcador selecionável, e suas técnicas de seleção e triagem associadas, para uso na prática da invenção são conhecidas e incluem, entre outras, moléculas de DNA que podem ser transcritas codificando p- glucuronidase (GUS), proteína verde fluorescente de luciferase (GFP), proteínas que conferem resistência aos antibióticos e proteínas que conferem tolerância de herbicida.
[0064] A invenção também é direcionada para um método para produzir células e plantas transformadas que compreendem um ou mais elementos reguladores operacionalmente ligados a uma molécula de DNA que pode ser transcrita.
[0065] O termo "transformação" refere-se à introdução de uma molécula de DNA em um hospedeiro destinatário. Como usado aqui, o termo "hospedeiro" refere-se a bactérias, fungos ou plantas, incluindo quaisquer células, tecidos, órgãos ou progênies de bactérias, fungos ou plantas. Tecidos e células de planta de interesse particular incluem protoplastos, calo, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, mudas, embriões e pólen.
[0066] Como usado aqui, o termo "transformado" refere-se a uma célula, tecido, órgão ou organismo em que foi introduzida uma molécula de DNA estranha, como um constructo. A molécula de DNA introduzida está integrada no DNA genômico da célula, tecido, órgão ou organismo destinatário de forma que a molécula de DNA introduzida é herdada por progênies subsequentes. Uma célula ou organismo "transgênico" ou "transformado" também pode incluir progênie da célula ou organismo e progênie produzida a partir de um programa de reprodução empregando um organismo transgênico como um parental em uma cruz e apresentando um fenótipo alterado resultando da presença de uma molécula de DNA estranha. A molécula de DNA introduzida também pode ser introduzida na célula destinatária de forma que a molécula de DNA introduzida não é herdada por progênies subsequentes. O termo "transgênico" refere-se a uma bactéria, fungo ou planta que contém uma ou mais moléculas de DNA heterólogas.
[0067] Existem vários métodos conhecidos pelos especialistas na técnica para introduzir moléculas de DNA em células de planta. O processo compreende geralmente as etapas de selecionar uma célula hospedeira adequada, transformar a célula hospedeira com um vetor, e obter a célula hospedeira transformada. Métodos e materiais para transformar células de planta através da introdução de um constructo em um genoma da planta na prática desta invenção podem incluem qualquer um dos métodos conhecidos e demonstrados. Métodos adequados incluem, entre outros, infecção bacteriana (por exemplo, Agrobacteríum), vetores BAC binários, liberação direta de DNA (por exemplo, pela transformação mediada por PEG, absorção de DNA mediada por dessecação/inibição, eletroporação, agitação com fibras de carboneto de silício, e aceleração de partículas de DNA revestido), entre outros.
[0068] As células hospedeiras podem ser quaisquer células ou organismos, como uma célula de planta, célula de alga, alga, célula fúngica, fungos, célula bacteriana ou célula de inseto. Em modalidades específicas, as células hospedeiras e células transformadas podem incluir células de plantas de cultura.
[0069] Uma planta transgênica posteriormente pode ser regenerada de uma célula de planta transgênica da invenção. Usando técnicas de reprodução convencionais ou autopolinização, sementes podem ser produzidas a partir desta planta transgênica. Essas sementes, e a planta de progênie resultante dessa semente, conterão a molécula de DNA recombinante da invenção e, portanto, serão transgênicas.
[0070] Plantas transgênicas da invenção podem ser autogâmicas para fornecer sementes para plantas transgênicas homozigotas da invenção (homozigota para a molécula de DNA recombinante) ou cruzadas com plantas não transgênicas ou plantas transgênicas diferentes para fornecer sementes para plantas transgênicas heterozigotas da invenção (heterozigota para a molécula de DNA recombinante). Ambas as plantas transgênicas homozigotas e heterozigotas são referidas aqui como "plantas de progênie". As plantas de progênie são plantas transgênicas de progênie da planta transgênica original e contendo a molécula de DNA recombinante da invenção. As sementes produzidas usando uma planta transgênica da invenção podem ser colhidas e usadas para crescer gerações de plantas transgênicas, ou seja, plantas de progênie da invenção, compreendendo o constructo desta invenção e expressando um gene de interesse agronômico. Descrições de métodos de cruzamento que são comumente usados para culturas diferentes podem ser encontradas em um dos vários livros de referência, ver, por exemplo, Allard, Principles of Plant Breedíng, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement , Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) e Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).
[0071] As plantas transformadas podem ser analisadas para a presença do gene ou genes de interesse e o nível de expressão e/ou perfil conferidos pelos elementos reguladores da invenção. Os especialistas na técnica estão cientes dos inúmeros métodos disponíveis para a análise de plantas transformadas. Por exemplo, métodos para análise de planta incluem, entre outros, Southern blots ou northern blots, abordagens baseadas em PCR, análises bioquímicas, métodos de triagem fenotípica, avaliações de campo, e ensaios imunodiagnósticos. A expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita pode ser medida usando reagentes e métodos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA), conforme descrito pelo fabricante e número de ciclo de PCR determinado usando TaqMan® Testing Matrix. Alternativamente, reagentes e métodos Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) conforme descrito pelo fabricante podem ser usados para avaliar a expressão do transgene.
[0072] A invenção também fornece partes de uma planta da invenção. Partes de planta incluem, entre outras, folhas, caules, raízes, tubérculos, sementes, endosperma, óvulo e pólen. As partes da planta da invenção podem ser viáveis, não viáveis, regeneráveis, e/ou não regeneráveis. A invenção também inclui e fornece células de plantas transformadas compreendendo uma molécula de DNA da invenção. As células de plantas transformadas ou transgênicas da invenção incluem células de planta regeneráveis e/ou não regeneráveis.
[0073] A invenção também fornece uma commodity que é produzida a partir de uma planta transgênica ou parte da mesma contendo a molécula de DNA recombinante da invenção. Commodities da invenção contêm uma quantidade detectável de DNA compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1-37. Como usado aqui, uma "commodity" refere-se a qualquer composição ou produto que é composto de material derivado de uma planta transgênica, semente, célula da planta, parte da planta contendo a molécula de DNA recombinante da invenção. Commodities incluem, entre outros, sementes processadas, grãos, partes da planta, e refeições. Uma commodity da invenção conterá uma quantidade detectável de DNA correspondente à molécula de DNA recombinante da invenção. A detecção de um ou mais deste DNA em uma amostra pode ser utilizada para determinar o conteúdo ou a fonte da commodity. Qualquer método padrão de detecção para moléculas de DNA pode ser usado, incluindo métodos para detecção divulgados aqui.
[0074] A invenção pode ser entendida mais facilmente através da referência aos exemplos a seguir, que são fornecidos a título de ilustração, e não se destinam a ser limitante da invenção, salvo se especificado. Deve ser apreciado pelos especialistas na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que seguem representam técnicas que os inventores descobriram que funcionam bem na prática da invenção. No entanto, os especialistas na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nestas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado semelhante sem se afastar do espírito e o escopo da invenção, portanto, toda a matéria estabelecida ou mostrada nos desenhos anexos deve ser interpretada como ilustrativa e não em sentido limitante.
[0075] Grupos de elemento de expressão reguladora (EXPs) e regiões de terminação de transcrição (3' UTRs) foram identificados e clonadas a partir do DNA genômico da espécie dicotiledônea Medicago truncatula (Barrel Medic). A seleção de Medicago truncatula 3' UTRs foi, em parte, baseada em padrões de expressão observados nos genes de soja homólogos.
[0076] A identificação e clonagem de 3' UTRs de Medicago truncatula começou com a seleção de genes de soja de interesse com base no padrão de expressão dos genes de soja em pesquisas de tecido de soja e experimentos de criação de perfil de transcrição proprietária. Os genes de soja selecionados foram então usados para encontrar genes homólogos em Medicago truncatula usando sequências de DNA publicamente disponíveis. Em seguida, amostras de tecido derivadas de Medicago truncatula foram isoladas de plantas crescidas sob diferentes condições ambientais. Em seguida, RNA mensageiro (mRNA) foi isolado dos tecidos de Medicago e usado em experimentos de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real para determinar o padrão de expressão dos genes de Medicago. A partir destes experimentos, um subconjunto do genoma de Medicago truncatula foi selecionado para clonagem e caracterização.
[0077] Usando dados de sequência de Medicago truncatula públicos, uma análise de bioinformática foi realizada para identificar elementos reguladores dentro dos loci de gene de Medicago selecionados. Por exemplo, a análise de bioinformática foi realizada para identificar sequências 3' UTR que compreendem as regiões de poliadenilação e terminação do mRNA e sequências se estendendo além da extremidade do lócus do gene identificado. Iniciadores de amplificação foram projetados e usados para amplificar cada um dos fragmentos de DNA de elemento regulador identificados, como fragmentos de DNA 3' UTR, fragmentos de DNA compreendendo um promotor, líder e íntron, e fragmentos de DNA compreendendo um promotor e líder. Os fragmentos de DNA resultantes foram ligados em vetores de expressão de base de planta e sequenciados.
[0078] Para fragmentos de DNA aplicáveis, uma análise do sítio de início de transcrição de elemento regulador (TSS) e junções de recombinação íntron/éxon foi, então, feita usando protoplastos de planta transformada. Nesta análise, os protoplastos foram transformados com os vetores de expressão de planta compreendendo os fragmentos de DNA clonados operacionalmente ligados a uma molécula heteróloga de DNA que pode ser transcrita. Em seguida, 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, California 92008) foi usado para confirmar o elemento regulador TSS e junções de recombinação íntron/éxon analisando a sequência de DNA dos transcritos do mRNA produzido.
[0079] As sequências de DNA dos 3' UTRs identificados são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 1-30. Além disso, sequências de DNA de promotor identificadas são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 32 e 36; sequências de DNA líder identificadas são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 33 e 37; e uma sequência de DNA de íntron identificada é fornecida como SEQ ID NO: 34. Além disso, as sequências de DNA dos EXPs identificados são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 31 e 35. O grupo de elemento regulador de expressão EXP-Mt.Ubq2:1:2 (SEQ ID NO: 31) compreende um elemento promotor, P-Mt.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 32), operacionalmente ligado 5' para um elemento líder, L-Mt.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 33), operacionalmente ligado 5' a um elemento íntron, I-Mt.Ubq2-1:1:2 (SEQ ID NO: 34) e o grupo de elemento de expressão reguladora EXP-Mt.AC145767v28:1:1 (SEQ ID NO: 35) compreende um elemento promotor, P- Mt.AC145767v28-1:2:1 (SEQ ID NO: 36), operacionalmente ligado 5' para um elemento líder, L-Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 37). Cada uma das sequências de DNA identificadas e clonados de Medicago truncatula estão listados na Tabela 1.Tabela 1. 3' UTRs, Grupos de elemento de expressão reguladora, promotores, líderes e íntrons clonados de Medicago truncatula.
[0080] Protoplastos de folha de soja foram transformados com vetores, especificamente constructos de plasmídeo, para avaliar o efeito de 3' UTRs de Medicago truncatula selecionado na expressão. Protoplastos de folha de soja foram transformados com vetores de DNA contendo uma sequência EXP constitutiva conduzindo a expressão do transgene B-glucuronidase (GUS) operacionalmente ligado a um 3' UTR de Medicago. Estes protoplastos de folha de soja de 3' UTR transformado de Medicago foram comparados com protoplastos de folha de soja em que a expressão do transgene GUS foi conduzida por um promotor constitutivo, e o transgene GUS foi operacionalmente ligado a um 3' UTR derivado de Gossypium hirsutum ou Gossypium barbadense.
[0081] Os vetores de planta utilizados nesses experimentos foram construídos usando métodos de clonagem conhecidos na técnica. Os vetores resultantes compostos por uma região da borda esquerda de A. tumefaciens; um primeiro cassete de expressão de transgene para seleção de células de planta transformadas que conferem resistência ao herbicida glifosato ou ao antibiótico espectinomicina (ambos conduzidos pelo promotor Arabidopsis Actina 7); um segundo cassete de expressão de transgene usado para avaliar a atividade de 3' UTR, que compreendia uma EXP ou sequência de promotor operacionalmente ligada 5' para uma sequência de DNA para GUS que possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), que é operacionalmente ligado 5' a 3' UTR derivado de Medicago truncatula Gossypium hirsutum e Gossypium barbadense; e uma região da borda direita de A. tumefaciens. Os vetores que compreendem um 3' UTR derivado de Medicago (ou seja, pMON109593, pMON116803, pMON116812, pMON116813, pMON116815, pMON116826, pMON116827, pMON116830, pMON122852, pMON122853, pMON122854, pMON122855, pMON122856, pMON122857, pMON122858, pMON122859, pMON122862, pMON122864, pMON122865, pMON122866, pMON122867, e pMON122868) usaram o grupo de elemento de expressão reguladora constitutivo EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42) para conduzir GUS. Os vetores que compreendem um 3' UTR derivado de Gossypium hirsutum ou Gossypium barbadense (ou seja, pMON81345, pMON81347 e pMON83002) usaram o promotor constitutivo P-CaMV.35S-enh-1:1:11 (SEQ ID NO: 43) para conduzir GUS.
[0082] A Tabela 2 fornece os constructos de plasmídeo com o 3'UTR correspondente e SEQ ID NO usado para transformar os protoplastos de soja em experimentos apresentados neste Exemplo.Tabela 2. Constructos de plasmídeo usados para transformar os protoplastos de folha de soja e descrições 3' UTR.
[0083] Dois vetores de planta, especificamente constructos de plasmídeo, para uso em cotransformação e normalização de dados foram também construídos usando métodos de clonagem conhecidos na técnica. Cada um desses constructos de plasmídeo continha uma sequência de codificação de luciferase específica que foi conduzida por uma EXP constitutiva. O vetor de planta pMON19437 compreendeu uma cassete de expressão com um EXP constitutivo compreendendo um promotor operacionalmente ligado 5' para uma sequência de lider que é operacionalmente ligada 5' para um intron (EXP-CaMV.35S- enh+Zm.DnaK:1:1, SEQ ID NO: 47), operacionalmente ligada 5' para uma sequência de codificação de luciferase de vaga-lume (Photinus pyralis) (LUCIFERASE: 1:3, SEQ ID NO: 45), operacionalmente ligada 5' para um 3' UTR de gene sintase de nopalina de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 49). O vetor de planta pMON63934 compreendeu um cassete de expressão com uma sequência EXP constitutiva compreendendo um promotor operacionalmente ligado 5' para uma sequência de lider (EXP- CaMV.35S-enh-Lhcb1, SEQ ID NO: 48), operacionalmente ligada 5' para uma sequência de codificação de luciferase de Renilla reniformis (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, SEQ ID NO: 46), operacionalmente ligada 5' para um 3' UTR de gene sintase de nopalina de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 49).
[0084] Os protoplastos de folha de soja foram transformadosusando um método de transformação baseado em polietileno glicol (PEG), que é bem conhecido na técnica. Cada célula de protoplasto foi transformada com o constructo de plasmideo de pMON19437, o constructo de plasmideo de pMON63934, e um dos constructos de plasmídeo apresentados na Tabela 2. Após a transformação, os protoplastos de folha de soja transformados foram incubados durante a noite na escuridão total. Em seguida, as medições de GUS e luciferase foram realizadas colocando alíquotas de uma preparação lisada de células transformadas em duas bandejas de poços pequenos diferentes. Uma bandeja foi usada para medições de GUS, e uma segunda bandeja foi usada para realizar um ensaio de luciferase duplo usando o sistema de ensaio de repórter de luciferase duplo (Promega Corp., Madison, WI; ver, por exemplo, Promega Notes Magazine, NO: 57, 1996, p.02).
[0085] Uma ou duas transformações foram realizadas para cada constructo de plasmídeo apresentado na Tabela 2. Os valores de expressão média para cada 3' UTR foram determinados de várias amostras de cada transformação. As medições de amostra foram feitas utilizando quatro replicatas de cada transformação de constructo de plasmídeo, ou alternativamente, três replicatas de cada constructo de plasmídeo por um dos dois experimentos de transformação. Os níveis de expressão de GUS e luciferase médios são fornecidos na Tabela 3. Nesta Tabela, os valores de luciferase de vaga-lume (por exemplo, da expressão de pMON19437) são fornecidos na coluna rotulada "FLuc" e os valores de luciferase de Renilla reniformis (por exemplo, da expressão de pMON63934) são fornecidos como na coluna rotulada "RLuc".Tabela 3. Valores de ensaio de GUS e Luciferase médios em protoplastos de folha de soja transformados.
[0086] Além disso, para comparar a atividade relativa de cada 3'UTR, valores de GUS foram expressos como uma razão de atividade de GUS para luciferase e normalizados para o melhor 3' UTR expressando não Medicago, ou seja, T-Gb.FbL2-1:1:1 (SEQ ID NO: 41). A Tabela 4 mostra as razões de GUS/Luciferase e as razões normalizadas. Novamente, nesta Tabela, os valores de luciferase de vaga-lume são rotulados "FLuc" e os valores de luciferase de Renilla reniformis são rotulados "RLuc".Tabela 4. Razões de GUS/FLuc e GUS/RLuc de expressão normalizada em relação a T-Gb.FbL2-1:1:1 (SEQ ID NO: 41 em protoplastos de folha de soja transformados.
[0087] Conforme demonstrado na Tabela 4, a expressão de GUS foi potencializada usando todos os 3' UTRs de Medicago selecionados comparados com os 3' UTRs derivados de Gossypium hirsutum ou Gossypium barbadense. Por exemplo, a expressão de GUS foi 2,1 a 18,3 vezes mais alta usando um 3' UTR derivado de Medicago baseado nas razões de GUS/FLuc normalizadas em relação a T-Gb.FbL2-1:1:1, o melhor expressando 3' UTR daqueles derivados de Gossypium hirsutum ou Gossypium barbadense. Da mesma forma, a expressão de GUS foi 1,61 a 10,48 vezes mais alta, usando um 3' UTR derivado de Medicago baseado nas razões de GUS/RLuc normalizadas em relação a T-Gb.FbL2-1:1:1.
[0088] Plantas de soja foram transformadas com vetores,especificamente constructos de plasmídeo, para avaliar o efeito de 3' UTRs de Medicago truncatula selecionado na expressão.
[0089] Especificamente, plantas de soja foram transformadas com vetores contendo uma sequência EXP constitutiva conduzindo a expressão do transgene B-glucuronidase (GUS) operacionalmente ligado a um 3' UTR de Medicago. Estas plantas de soja de 3' UTR transformado de Medicago foram comparadas com plantas de soja em que a expressão do transgene GUS foi conduzida por um promotor constitutivo, e o transgene GUS foi operacionalmente ligado a um 3' UTR derivado de Gossypium barbadense.
[0090] Os vetores de planta utilizados nesses experimentos foram construídos usando métodos de clonagem conhecidos na técnica. Os vetores resultantes compreenderam uma região de borda esquerda de A. tumefaciens; um primeiro cassete de expressão de transgene para a seleção de células de plantas transformadas que conferem resistência aos antibióticos espectinomicina (conduzido pelo promotor Arabidopsis Actina 7); um segundo cassete de expressão de transgene usado para avaliar a atividade de 3' UTR, que compreendeu o grupo de elemento de expressão regulador EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42) operacionalmente ligado 5' a uma sequência de codificação para GUS que possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), que é operacionalmente ligado 5' a um 3' UTR derivado de Medicago truncatula ou Gossypium barbadense; e uma região da borda direita de A. tumefaciens. Os vetores que compreenderam um 3' UTR derivado de Medicago foram pMON109593, pMON116803, pMON116813, pMON116815, pMON116826, pMON116830, pMON122850, pMON122851, pMON122853, pMON122854, pMON122855, pMON122857, pMON122858, pMON122859, pMON122862, pMON122863, pMON122864, pMON122866, pMON122867, e pMON122868. pMON116812, pMON116827, pMON122852, pMON122856, pMON122861, pMON122865,O vetor quecompreendeu um 3' UTR de Gossypium barbadense foi pMON102167.
[0091] A Tabela 5 fornece os constructos de plasmídeo com o 3'UTR correspondente e SEQ ID NO usado para transformar as plantas de soja em experimentos apresentados neste Exemplo.Tabela 5. Constructos de plasmídeo usados para transformar as plantas de soja e descrições 3' UTR.
[0092] As plantas de soja foram transformadas usando métodos de transformação mediada por Agrobacterium conhecidos na técnica. A expressão de GUS foi analisada qualitativamente usando seções histológicos de tecidos selecionados. Para a análise de GUS histoquímica, seções de tecido inteiro foram incubadas com solução de coloração de GUS X-Glic (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucuronida) (1 mg/ml) por um período de tempo adequado, lavadas, e inspecionadas visualmente para a coloração azul. A atividade de GUS foi determinada qualitativamente por inspeção visual direta ou inspeção sob um microscópio usando tecidos e órgãos de planta selecionados. As plantas de geração R0 foram inspecionadas para expressão na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1, Flor R1, Embrião de Vagem Amarela (fase de desenvolvimento aproximadamente R8), Cotilédone de Vagem Amarela (fase de desenvolvimento aproximadamente R8), Semente Imatura R3, Vagem R3 e Cotilédone R5.
[0093] As alterações quantitativas da expressão de GUS em relação à expressão transmitida por pMON102167, que compreendeu o 3' UTR derivado de Gossypium barbadense, também foram analisadas, como demonstrado nas Tabelas 6-13. Para essa análise quantitativa, a proteína total foi extraída de tecidos selecionados de plantas transformadas. Um micrograma de proteína total foi usado com o substrato fluorogênico 4-metileumbeliferil-p-D-glucuronídeo (MUG) em um volume total de reação de 50 ul. O produto de reação, 4- metilumbeliferona (4-MU), é maximamente fluorescente em pH elevado, onde o grupo hidroxila é ionizado. A adição de uma solução básica de carbonato de sódio, simultaneamente, interrompe o ensaio e ajusta o pH para quantificar o produto fluorescente. A fluorescência foi medida com excitação a 365 nm, emissão a 445 nm, utilizando um Fluoromax- 3 (Horiba; Kyoto, Japan) com Leitor Micromax, com largura de fenda definida na excitação 2 nm e emissão 3.
[0094] As Tabelas 6 e 7 mostram os níveis de expressão quantitativa média medidos nos tecidos de planta de geração R0. Esses tecidos não analisados são mostrados como células em branco em ambas as tabelas. Tabela 6. Expressão de GUS média em plantas de geração Ro na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1 e Flor R1.
Tabela 7. Expressão de GUS médias em plantas de geração Ro em Embrião de Vagem Amare a, Cotilédone de Vagem Amarela, Semente Imatura R3, Vagem R3 e Cotilédone R5.
[0095] Como demonstrado nas Tabelas 6 e 7, a expressãoconduzida pelo mesmo EXP foi distinta nos tecidos das plantas de soja transformadas de forma estável compreendendo diferentes 3' UTRs de Medicago quando comparada com o 3' UTR derivado de Gossypium barbadense.
[0096] As Tabelas 8 e 9 mostram o número de vezes de diferençasnos tecidos das plantas de soja transformadas de forma estável compreendendo diferentes 3' UTRs de Medicago quando comparadas com o 3' UTR derivado de Gossypium barbadense. Tabela 8. Número de vezes de expressão de plantas de soja transformadas na geração R0R0 na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1 e Flor R1.
Tabela 9. Número de vezes de expressão de plantas de soja transformadas na geração Ro no Embrião de Vagem
[0097] Como demonstrado nas Tabelas 8 e 9, a expressão nos tecidos das plantas de soja transformadas compreendendo diferentes 3' UTRs de Medicago foi distinta quando comparada com a de plantas de soja transformadas com pMON102167, que compreendia um 3' UTR derivado de Gossypium barbadense. Por exemplo, dois 3' UTRs de Medicago, T- Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1) e T-Mt.Lox-1-1:2:1 (SEQ ID NO: 14) causaram expressão potencializada do EXP constitutivo, EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42), em todos os tecidos. Outros 3' UTRs de Medicago forneceram expressão potencializada do EXP constitutivo em alguns tecidos, enquanto reduzindo a expressão em outros. Por exemplo, o 3' UTR T-Mt.Sali3-2-1:2:1 (SEQ ID NO: 26) forneceu um aumento de 2,19 a 8,05 vezes na expressão na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Embrião de Vagem Amarela, e Cotilédone de Vagem Amarela, reduzindo a expressão na Flor R1 e Cotilédone R5. Além disso, o 3' UTR T-Mt.AC140914v20-1:2:1 (SEQ ID NO: 2) forneceu um aumento de 1,88 a 4,12 vezes em expressão na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, Semente Imatura R3, e Cotilédone R5, enquanto reduz a expressão na Folha Source R1, Flor R1, e mantendo a expressão relativamente igual na Vagem R3. Além disso, o 3' UTR T-Mt.Oxr-1:2:1 (SEQ ID NO: 17) forneceu um aumento de 2,19 a 10,90 vezes em expressão na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, e Vagem R3 , enquanto reduz a expressão na Flor R1 e Cotilédone R5, e mantendo a expressão relativamente igual na Semente Imatura R3.
[0098] Algumas das plantas de soja transformadas compreendendo diferentes 3' UTRs de Medicago foram levadas para a geração RL As
[0099] Tabelas 10 e 11 mostram os valores de expressão de GUS médios dos tecidos analisados. As Tabelas 12 e 13 mostram o número de vezes de diferença na expressão em relação ao 3' UTR derivado de Gossypium barbadense. Tabela 10. Expressão de GUS média em plantas de soja transformadas de geração Ri na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1, e Flor R1.
Tabela 11. Expressão de GUS média nas plantas de soja transformadas de geração R1 em Embrião de Vagem
[00100] Como demonstrado nas Tabelas 10 e 11, a expressão conduzida pelo mesmo EXP foi distinta nos tecidos das plantas de soja transformadas de forma estável compreendendo diferentes 3' UTRs de Medicago quando comparada com o 3' UTR derivado de Gossypium barbadense. As Tabelas 12 e 13 mostram as diferenças de números de vezes de expressão nos tecidos das plantas de soja transformadas compreendendo diferentes 3' UTRs de Medicago em relação aos tecidos transformadas com pMON102167, que compreendia um 3' UTR derivado de Gossypium barbadense. Tabela 12. Diferenças no número de vezes de expressão nas plantas de soja transformadas de geração R1 na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1, e R1.
Tabela 13. Diferenças no número de vezes de expressão nas plantas de soja transformadas de geração R1 noEmbrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, Semente Imatura R3, Vagem R3 e Cotilédone R5.
[00101] Como demonstrado nas Tabelas 12 e 13, vários dos 3' UTRs de Medicago potencializaram a expressão do elemento EXP constitutivo, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42), em relação às plantas transformadas com pMON102167, que compreendia um 3' UTR derivado de Gossypium barbadense na geração RL Por exemplo, o 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1) forneceu uma potencialização de 3,10 a 21,65 vezes da expressão de GUS em todos os tecidos analisados. O 3' UTR T-Mt.Sali3-2-1:2:1 (SEQ ID NO: 26) forneceu uma potencialização de 1,52 a 8,90 vezes da expressão de GUS em todos os tecidos analisados. O 3' UTR T-Mt.Oxr-1:2:1 (SEQ ID NO: 17) forneceu potencialização na maioria dos tecidos, mas reduziu a expressão na Semente Imatura R3 em relação às plantas transformadas com T-Gb.E6-3b:1:1 (SEQ ID NO: 40).
[00102] Os experimentos anteriores demonstram que elementos 3' UTR derivados de Medicago truncatula afetaram a expressão do elemento EXP constitutivo EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42) de maneiras diferentes, dependendo do 3' UTR especifico selecionado. Em muitos casos, houve uma potencialização da expressão em certos tecidos de plantas transformadas com vetores de expressão de planta compreendendo 3' UTRs de Medicago em relação às plantas transformadas com pMON102167, que compreendia um 3' UTR derivado de Gossypium barbadense. No entanto, o efeito de potencialização não foi visto em todos os tecidos da planta e, em muitos casos, a expressão foi atenuada em alguns tecidos e potencializada em outros usando um 3' UTR de Medicago. Assim, o uso de 3' UTRs de Medicago selecionados permite que se faça o "ajuste fino" do perfil de expressão de um transgene particular e pode ser usado em combinação com elementos de expressão diferentes, como promotores, lideres e introns, em ligação operável com uma molécula de DNA que pode ser transcrita para fornecer uma expressão ideal em tecidos especificos, reduzindo a expressão nos tecidos que são menos desejáveis para uma molécula especifica de DNA que pode ser transcrita.
[00103] Plantas de soja foram transformadas com vetores, especificamente constructos de plasmideo, para avaliar o efeito de 3' UTRs de Medicago selecionado na expressão. Especificamente, plantas de soja foram transformadas com vetores de DNA contendo uma sequência EXP constitutiva conduzindo a expressão do transgene 15-glucuronidase (GUS) operacionalmente ligado a um 3' UTR de Medicago. Estas plantas de soja de 3' UTR transformado de Medicago foram comparadas com plantas de soja transformadas em que a expressão do transgene GUS foi conduzida por uma sequência EXP expressando na semente, e o transgene GUS foi operacionalmente ligado a um 3' UTR derivado de Gossypium barbadense.
[00104] Os vetores de planta utilizados nesses experimentos foram construídos usando métodos de clonagem conhecidos na técnica. Os vetores resultantes compreenderam uma região de borda esquerda de A. tumefaciens; um primeiro cassete de expressão de transgene para a seleção de células de plantas transformadas que conferem resistência aos antibióticos espectinomicina (conduzido pelo promotor Arabidopsis Actina 7); um segundo cassete de expressão de transgene usado para avaliar a atividade de 3' UTR, que compreendeu o elemento EXP EXP- Gm.Sphas1:1:1 (SEQ ID NO: 50), que fornece expressão preferencial na semente, operacionalmente ligado 5' a uma sequência de codificação para GUS que possui um intron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), que é operacionalmente ligado 5' a um 3' UTR derivado de Medicago truncatula ou Gossypium barbadense; e uma região da borda direita de A. tumefaciens. Os vetores de expressão de planta que compreendem um 3' UTR derivado de Medicago foram pMON116832, pMON116834, pMON116835, pMON116841, pMON122869, pMON122870, pMON122871, pMON122872, pMON122873, pMON122874, pMON122875, pMON122876, pMON122878, pMON122879, pMON122880, pMON122881, pMON122882, pMON122883, pMON122885, pMON122887, pMON122888, e pMON12 6122. O vetor que compreendeu um 3' UTR de Gossypium barbadense foi pMON83028.
[00105] A Tabela 14 fornece constructos de plasmídeo com o 3' UTR correspondente, SEQ ID NO, e geração para a qual os dados de ensaio quantitativo são fornecidos.Tabela 14. Constructos de plasmídeo usados para transformar as plantas de soja e 3' UTR correspondentes.
[00106] As plantas de soja foram transformadas e GUS analisado conforme descrito no Exemplo 3. As Tabelas 15 e 16 fornecem os valores de GUS médio quantitativos para a geração R0 de plantas de soja transformadas de forma estável.Tabela 15. Expressão de GUS média na geração Ro de plantas de soja transformadas no Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, Semente Imatura R3, Vagem R3, e Cotilédone R5.
Tabela 16. Expressão de GUS média em plantas de soja transformadas de geração Ro na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1, e Flor R1.
[00107] Como pode ser visto nas Tabelas 15 e 16, a maioria dos 3' UTRs de Medicago afetou a expressão do elemento EXP preferencial de semente, EXP-Gm.Sphas1:1:1 (SEQ ID NO: 50), em apenas tecidos derivados de semente, com exceção de T-Mt.Apx-1:1:2 (SEQ ID NO: 5), que potencializou a expressão de GUS na Folha Source R1, Peciolo R1, e Flor R1. Vários 3' UTRs de Medicago forneceram alta expressão no Embrião de Vagem Amarela e Cotilédone de Vagem Amarela, como T- Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1), T-Mt.RD22-1:2:1 (SEQ ID NO: 24), e T-Mt.AC153125V10-1:2:1 (SEQ ID NO: 4). Assim, estes 3' UTRs podem ser ideais para potencializar a expressão de um promotor de semente durante as fases tardias do desenvolvimento da semente. O 3' UTR T-Mt.Expr1-1:2:1 (SEQ ID NO: 7) forneceu alta expressão em Cotilédone R5 e Cotilédone de Vagem Amarela em relação a muitos dos outros 3' UTRs, e assim pode ser útil no fornecimento de alta expressão de cotilédone para uma janela mais ampla de desenvolvimento de sementes. Em alguns casos, o 3' UTR forneceu um nivel mais uniforme de expressão na semente no Embrião de Vagem Amarela e Cotilédone de Vagem Amarela, como quando T-Mt.FBA-1:2:1 (SEQ ID NO: 9), T- Mt.Zfp-1:2:1 (SEQ ID NO: 30), T-Mt.Pip1-1:2:1 (SEQ ID NO: 18) e T- Mt.Pt2-1:2:2 (SEQ ID NO: 23) foram utilizados.
[00108] As plantas de geração R0 compreendendo T-Mt.Zfp-1:2:1 (SEQ ID NO: 30), T-Mt.Apx-1:1:2 (SEQ ID NO: 5), T-Mt.Sui1-1:1:2 (SEQ ID NO: 29) e T-Mt.EF1a-1:1:2 (SEQ ID NO: 6) foram autorizados a definir sementes e foram plantadas para estudos de geração de R1. A Tabela 17 mostra uma comparação entre os dados de ensaio quantitativo médio para eventos compreendendo estas plantas de geração R1 plantas compreendendo 3' UTR de Medicago e plantas transformadas com pMON83028, que compreendeu o 3' UTR T-Gb.E6- 3b:1:1 (SEQ ID NO: 40) derivado de Gossypium barbadense.Tabela 17. Expressão de GUS média na geração R1 de plantas de soja transformadas no Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, e Cotilédone R5.
[00109] Como pode ser visto na Tabela 17, os 3' UTRs de Medicago afetaram expressão de forma diferente ao T-Gb.E6-3b:1:1 no embrião e tecidos de cotilédone. Por exemplo, T-Mt.Apx-1:1:2 (SEQ ID NO: 5) e T- Mt.Sui1-1:1:2 (SEQ ID NO: 29) potencializou a expressão do elemento EXP preferencial de semente no Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, e Cotilédone R5 em relação ao T- Gb.E6-3b:1:1. T-Mt.EF1a-1:1:2 (SEQ ID NO: 6) potencializou aexpressão no Embrião de Vagem Amarela e Cotilédone de Vagem Amarela, mas não no Cotilédone R5. T-Mt.Zfp-1:2:1 (SEQ ID NO: 30) reduziu a expressão no Embrião de Vagem Amarela dedesenvolvimento tardio e Cotilédone de Vagem Amarela, maspotencializou a expressão no Cotilédone R5.
[00110] Assim, cada um dos 3' UTRs de Medicago diferentes afeta expressão diferencialmente na semente em desenvolvimento quando em ligação operável com um promotor preferencial de semente. Estas diferenças no efeito sobre a expressão podem ser utilizadas para fornecer uma abordagem mais refinada e adaptada à expressão de semente e pode ser idealmente adequado para "ajuste fino" do perfil de expressão de moléculas de DNA que podem ser transcritas especificas onde a expressão na semente é desejada.
[00111] Plantas de soja foram transformadas com vetores, especificamente constructos de plasmideo, para avaliar o efeito de 3' UTRs de Medicago truncatula selecionado na expressão. Especificamente, plantas de soja foram transformadas com vetores contendo dois elementos EXP diferentes que apresentam um perfil de expressão constitutiva do transgene B-glucuronidase (GUS) operacionalmente ligado a um 3' UTR de Medicago. Estas plantas de 3' UTR transformado de Medicago foram comparadas com plantas de soja transformadas em que a expressão do transgene GUS foi operacionalmente ligada para um 3' UTR derivado de Gossypium barbadense.
[00112] Os vetores de planta utilizados nesses experimentos foram construidos usando métodos de clonagem conhecidos na técnica. Os vetores resultantes compreenderam uma região de borda esquerda de A. tumefaciens; um primeiro cassete de expressão de transgene para a seleção de células de plantas transformadas que conferem resistência aos antibióticos espectinomicina (conduzido pelo promotor Arabidopsis Actina 7); um segundo cassete de expressão de transgene usado para avaliar a atividade de 3' UTR, que compreendeu os elementos EXP EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42) ou EXP- DaMV.FLT:1:2 (SEQ ID NO: 51) operacionalmente ligado 5' a uma sequência de codificação para GUS que possui um intron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), que é operacionalmente ligado 5' a um 3' UTR derivado de Medicago truncatula ou Gossypium barbadense; e uma região da borda direita de A. tumefaciens. Os vetores que compreenderam um 3' UTR derivado de Medicago foram pMON118768, pMON153701 e pMON116803. Os vetores que compreenderam um 3' UTR de Gossypium barbadense foram pMON121042 e pMON102167.
[00113] A Tabela 18 fornece os constructos de plasmideo com o elemento EXP correspondente, 3' UTR e SEQ ID NO usado para transformar as plantas de soja apresentadas neste Exemplo.Tabela 18. Constructos de plasmídeo usados para transformar as plantas de soja e o elemento EXP e 3' UTR correspondentes.
[00114] As plantas foram transformadas e GUS analisado conforme descrito no Exemplo 3. As Tabelas 19 e 20 fornecem os valores de GUS médio quantitativos para a geração R0 de plantas de soja transformadas de forma estável. Tabela 19. Expressão de GUS média em plantas de soja transformadas de geração Ro na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1, e Flor R1.
Tabela 20. Expressão de GUS média na geração R0 de plantas de soja transformadas no Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, Semente Imatura R3, Vagem R3 e Cotilédone R5.
[00115] Como demonstrado nas Tabelas 19 e 20, os 3' UTRs de Medicago T-Mt.Sali3-2-1:2:1 (SEQ ID NO: 26) e T-Mt.AC140914v20- 1:2:1 (SEQ ID NO: 2) afetaram a expressão do elemento EXP constitutivo EXP-DaMV.FLT:1:2 (SEQ ID NO: 51) diferentemente do que o 3' UTR derivado de Gossypium barbadense T-Gb.E6-3b:1:1 (SEQ ID NO: 40). Em muitos dos tecidos amostrados, houve uma potencialização da expressão usando os 3' UTRs de Medicago. Em relação ao 3' UTR T-Mt.AC140914v20-1:2:1, a potencialização foi vista na maioria dos tecidos em plantas também compreendendo o elemento EXP EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42). Tabelas 21 e 22 mostram as diferenças de número de vezes da expressão de GUS quantitativa em relação à expressão transmitida por pMON121042 (T- Gb.E6-3b:1:1 (SEQ ID NO: 40)), que compreendeu um 3' UTR derivado de Gossypium barbadense. Tabela 21. Diferenças no número de vezes de expressão nas plantas de soja transformadas de geração R1 na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1 e Flor R1.
Tabela 22. Diferenças no número de vezes de expressão nas plantas de soja transformadas de geração R1 no
[00116] Os experimentos anteriores demonstram que cada um dos 3' UTRs de Medicago tem efeitos diferentes sobre o nivel de expressão de cada um dos elementos EXP constitutivos em relação ao pMON121042 (T-Gb.E6-3b:1:1 (SEQ ID NO: 40)), que compreende o 3' UTR derivado de Gossypium barbadense. Por exemplo, a expressão de EXP-DaMV.FLT:1:2 foi potencializada de 1,14 a 15,13 vezes na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Peciolo R1, Flor R1, Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, Vagem R3, e Cotilédone R5, mas reduzida na Semente Imatura R3 usando T-Mt.Sali3-2-1:2:1. Este mesmo elemento EXP, quando combinado com T-Mt.AC140914v20-1:2:1, resultou em uma potencialização de 1,34 a 13,42 vezes na Raiz Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Peciolo R1, Flor R1, Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, Semente Imatura R3, Vagem R3, e Cotilédone R5, mas permaneceu o mesmo do T-Gb.E6-3b:1:1 (SEQ ID NO: 40) na Folha Sink V5. A expressão no Embrião de Vagem Amarela foi cerca de duas vezes a do Cotilédone de Vagem Amarela usando T- Mt.Sali3-2-1:2:1 (potencialização de 15,13 vs 7,23 vezes), enquanto a expressão nestes dois tecidos foi relativamente igual quando usando T- Mt.AC140914v20-1:2:1 (potencialização de 9,19 vs 9,13 vezes). No que diz respeito ao elemento EXP EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3, a combinação com T-Mt.AC140914v20-1:2:1 produziu menos potencialização em mais tecidos amostrados do que quando este mesmo 3' UTR foi combinado com EXP-DaMV.FLT:1:2. Na Flor R1, houve uma redução da expressão em relação ao T-Gb.E6-3b:1:1 quando EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 foi combinado com T- Mt.AC140914v20-1:2:1. A combinação de EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 com T-Mt.Sali3-2-1:2:1 forneceu potencialização na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Embrião de Vagem Amarela, e Cotilédone de Vagem Amarela, mas expressão reduzida na Flor R1 e Cotilédone R5 em relação ao T-Gb.E6-3b:1:1 (SEQ ID NO: 40).
[00117] Cada um dos dois 3' UTRs de Medicago, T-Mt.Sali3-2-1:2:1 e T-Mt.AC140914v20-1:2:1, afetou a expressão dos dois elementos EXP constitutivos diferentes, EXP-DaMV.FLT:1:2 e EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3, de forma diferente. Em muitos tecidos, houve uma potencialização da expressão em relação ao T-Gb.E6-3b:1:1 (SEQ ID NO: 40), mas em alguns tecidos, uma redução da expressão ocorreu. Assim, usando diferentes 3' UTRs de Medicago, é possível ser capaz de controlar mais precisamente a expressão na planta e melhor "ajuste fino" da expressão das moléculas especificas de DNA que podem ser transcritas para fornecer expressão ideal onde a expressão da molécula de DNA que pode ser transcrita é necessária, reduzindo a expressão nos tecidos que podem afetar negativamente a planta.
[00118] Plantas de soja foram transformadas com vetores, especificamente constructos de plasmideo, para avaliar o efeito de 3' UTR de Medicago T-Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1) na expressão. Especificamente, as plantas de soja foram transformadas com vetores contendo vários EXP diferentes com um perfil de expressão constitutiva conduzindo a expressão do transgene B glucuronidase (GUS) operacionalmente ligado ao 3' UTR de Medicago T- Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1). Estas plantas de soja 3' UTR transformadas de Medicago foram comparadas com plantas de soja transformadas em que o transgene GUS foi operacionalmente ligado para um 3' UTR derivado de Gossypium barbadense.
[00119] Os vetores utilizados nesses experimentos foram construídos usando métodos de clonagem conhecidos na técnica. Os vetores resultantes compreenderam uma região de borda esquerda de A. tumefaciens; um primeiro cassete de expressão de transgene para a seleção de células de planta transformadas que conferem resistência ao antibiótico espectinomicina (conduzido pelo promotor Arabidopsis Actina 7); um segundo cassete de expressão de transgene usado para avaliar a atividade do 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1), que compreende os elementos EXP, EXP-Mt.AC145767v28:1:1 (SEQ ID NO: 35), EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42), EXP- BSAcVNV.FLT:1:2 (SEQ ID NO: 52), EXP-CERV.FLT:1:2 (SEQ ID NO: 53), EXP-DaMV.FLT:1:2 (SEQ ID NO: 51), EXP-CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 54), ou EXP-Mt.Ubq2:1:2 (SEQ ID NO: 31) operacionalmente ligados 5' para uma sequência de codificação para GUS que possui um intron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), que é operacionalmente ligado 5' para o 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1) derivado de Medicago truncatula, ou para os 3' UTRs T-Gb.E6-3b:1:1 (SEQ ID NO: 40) ou T-Gb.FbL2-1:1:1 (SEQ ID NO: 41) derivado de Gossypium barbadense; e uma região da borda direita de A. tumefaciens. Os vetores que compreendem T-Mt.AC145767v28- 1:1:2 (SEQ ID NO: 1) foram pMON118798, pMON116815, pMON118769, pMON153709, pMON118771, pMON153707 e pMON155502. Notavelmente, o vetor pMON118798 compreendeu o EXP-Mt.AC145767v28:1:1 nativo, que é compreendido por um elemento promotor operacionalmente ligado a um elemento líder clonado do mesmo lócus do gene como o 3' UTR T-Mt.AC145767v28- 1:1:2 (SEQ ID NO: 1). Os vetores que compreendem o 3' UTR de Gossypium barbadense foram pMON102167, pMON113874, pMON121030, pMON121042, pMON140827 e pMON125841.
[00120] A Tabela 23 fornece os constructos de plasmídeo com o elemento EXP correspondente, 3' UTR e SEQ ID NO usado para transformar as plantas de soja apresentadas neste Exemplo.Tabela 23. Constructos de plasmídeo usados para transformar as plantas de soja e o elemento EXP e 3' UTR correspondentes.
[00121] As plantas de soja foram transformadas e GUS analisado conforme descrito no Exemplo 3. As Tabelas 24 e 25 fornecem os valores de GUS médio quantitativos para a geração R0 de plantas de soja transformadas de forma estável. As células da tabela marcadas como "bdl" indicam os tecidos que foram analisados quantitativamente, mas em que a expressão estava abaixo do nível de detecção. As Tabelas 26 e 27 fornecem o número de vezes de alterações na expressão de cada elemento EXP operacionalmente ligado a T- Mt.AC145767v28-1:1:2 em relação a T-Gb.E6-3b:1:1(SEQ ID NO: 40). Tabela 24. Expressão de GUS média em plantas de soja transformadas de geração R0 na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1 e Flor R1.
Tabela 25. Expressão de GUS média na geração R0 de plantas de soja transformadas no Embrião de VagemAmarela, Cotilédone de Vagem Amarela, Semente Imatura R3, Vagem R3 e Cotilédone R5.
Tabela 26. Diferenças no número de vezes de expressão nas plantas de soja transformadas de geração R1 na Raiz Vn5, Folha Sink Vn5, Folha Source Vn5, Folha Source R1, Pecíolo R1 e Flor R1.
Tabela 27. Diferenças no número de vezes de expressão nas plantas de soja transformadas de geração R1 no Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, Semente Imatura R3, Vagem R3 e Cotilédone R5.
[00122] Como demonstrado nas Tabelas 24 e 25, o 3' UTR de Medicago T-Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1) reforçou a expressão dos seis elementos EXP constitutivos em relação a T-Gb.E6- 3b:1:1(SEQ ID NO: 40), mas de maneiras diferentes dependendo do elemento EXP específico e tecido. O elemento EXP, EXP- Mt.AC145767v28:1:1, quando usado para conduzir GUS e operacionalmente ligado ao seu 3' UTR nativo T-Mt.AC145767v28-1:1:2 expressa muito baixo em todos os tecidos analisados e foi indetectável na Semente Imatura R3, Vagem R3, e Flor R1. Alguns tecidos de plantas compreendendo o elemento EXP EXP-Mt.Ubq2:1:2 e o 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2 demonstrou expressão reduzida em relação à combinação de EXP-Mt.Ubq2:1:2 e T-Gb.FbL2-1:1:1. Esta expressão reduzida foi vista na Semente Imatura R3, Flor R1, e Pecíolo R1 ao mesmo tempo, em contraste, a expressão na Folha Sink Vn5 e Cotilédone R5 foi potencializada em mais de quatro vezes. Não houve alteração na expressão na raiz (Raiz Vn5) com EXP-Mt.Ubq2:1:2 e 3' UTR.
[00123] Os grupos de elemento de expressão reguladora EXP- CERV.FLT:1:2 e EXP-DaMV.FLT:1:2 forneceram os mais altos níveis de expressão. Como demonstrado nas Tabelas 26 e 27, estes dois EXPs foram potencializados em todos os tecidos com T- Mt.AC145767v28-1:1:2 em relação aos mesmos EXPs combinados com T-Gb.E6-3b:1:1(SEQ ID NO: 40). O grupo de elemento de expressão reguladora EXP-CERV.FLT:1:2 foi potencializado em 60,50 vezes na Cotilédone de Vagem Amarela em desenvolvimento e menos no Embrião de Vagem Amarela (21,50 vezes), enquanto o grupo de elemento regulador de expressão EXP-DaMV.FLT:1:2 foi potencializado para um grau maior no Embrião de Vagem Amarela do que no Cotilédone de Vagem Amarela (potencialização de 26,80 vs 15,76 vezes, respectivamente). Estas diferenças de expressão e potencialização oferecem uma oportunidade para fornecer uma expressão adaptada de um transgene na semente em desenvolvimento em fase tardia. O grupo do elemento regulador de expressão EXP- BSAcVNV.FLT:1:2 expressou no nível mais alto na Vagem R3 e Raiz Vn5 quando combinado com T-Gb.E6-3b:1:1 (ver Tabelas 25 e 26). A expressão de EXP-BSAcVNV.FLT:1:2 nestes dois tecidos foi potencializada dramaticamente quando combinada com T- Mt.AC145767v28-1:1:2, particularmente na Raiz Vn5. Além disso, a expressão de EXP-BSAcVNV.FLT:1:2 foi reforçada 58,63 vezes quando combinada com T-Mt.AC145767v28-1:1:2 em relação a esta mesma EXP combinada com T-Gb.E6-3b:1:19 (SEQ ID NO: 40)
[00124] Em suma, o 3' UTR de Medicago truncatula T- Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1) potencializou a expressão de seis elementos EXP constitutivos diferentes que foram derivados da planta e DNA genômico viral de planta. Além disso, este 3' UTR potencializou a expressão do elemento EXP preferencial de semente EXP-Gm.Sphas1:1:1 (SEQ ID NO: 54) em relação à maioria dos outros 3' UTRs derivados de Medicago. Nesse sentido, este 3' UTR é adequado para fornecer expressão potencializada de um promotor ou combinação de elementos de expressão operacionalmente ligados em um constructo.
[00125] Plantas de soja foram transformadas com vetores, especificamente constructo de plasmídeo, compreendendo o grupo de elemento de expressão reguladora constitutiva EXP-Mt.Ubq2:1:2 (SEQ ID NO: 31) operacionalmente ligado a um sequência de codificação de GUS. Estas plantas transformadas foram então analisadas para expressão de GUS em plantas de soja transformadas de forma estável.
[00126] Os vetores de planta utilizados nesses experimentos foram construídos usando métodos de clonagem conhecidos na técnica. Os vetores resultantes compreenderam uma região de borda esquerda de A. tumefaciens; um primeiro cassete de expressão de transgene para a seleção de células de planta transformadas que conferem resistência ao antibiótico espectinomicina (conduzido pelo promotor Arabidopsis Actina 7); um segundo cassete de expressão de transgene usado para avaliar a atividade do EXP-Mt.Ubq2:1:2 (SEQ ID NO: 31), que compreendeu EXP-Mt.Ubq2:1:2 operacionalmente ligado 5' para uma sequência de codificação para B-glucuronidase (GUS) que possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), que é operacionalmente ligado 5' para o 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2 (SEQ ID NO: 1) derivado de Medicago truncatula, ou para os 3' UTRs T-Gb.E6-3b:1:1 (SEQ ID NO: 40) ou T-Gb.FbL2-1:1:1 (SEQ ID NO: 41) derivado de Gossypium barbadense; e uma região da borda direita de A. tumefaciens.
[00127] Os vetores resultantes foram usados para transformar plantas de soja conforme descrito no Exemplo 3. As Tabelas 28 e 29 mostram os valores de expressão de GUS quantitativos média avaliados em diversos tecidos e pontos de tempo de desenvolvimento para as plantas de soja transformadas de forma estável. Tabela 28. Expressão de GUS média em folha, raiz e flor para plantas de soja transformadas de forma estável compreendendo EXP-Mt.Ubq2:1:2 (SEQ ID NO: 31).
Tabela 29. Expressão de GUS média em tecidos de vagem e semente para plantas de soja transformadas de forma estável compreendendo EXP-Mt.Ubq2:1:2 (SEQ ID NO: 31).
[00128] Como demonstrado nas Tabelas 28 e 29, EXP-Mt.Ubq2:1:2 (SEQ ID NO: 31) é capaz de conduzir a expressão constitutiva de uma molécula de DNA que pode ser transcrita em plantas de soja transformadas de forma estável. Além disso, diferentes 3' UTRs afetam o grau de expressão em cada tecido. Por exemplo, a combinação de EXP-Mt.Ubq2:1:2 com T-Gb.E6-3b:1:1 resultou em menor expressão em todos os tecidos avaliados do que os outros dois 3' UTRs, T- Gb.FbL2-1:1:1 e T-Mt.AC145767v28-1:1:2. No entanto,independentemente de qual 3' UTR foi aplicado, EXP-Mt.Ubq2:1:2 fornece a expressão constitutiva de média a alta, o grau do qual pode ser modulado por uma seleção de qual 3' UTR é operacionalmente ligado para EXP.
[00129] Os potencializadores podem ser derivados dos elementos de promotor aqui fornecidos, como SEQ ID NOs: 32 e 36. Um elemento potencializador pode ser composto de um ou mais elementos reguladores cis que, quando operacionalmente ligado 5' ou 3' para um elemento promotor, ou operacionalmente ligado 5' ou 3' para elementos potencializadores adicionais que são operacionalmente ligados a um promotor, podem potencializar ou modular a expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita, ou fornecer a expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita em um tipo de célula ou órgão de planta específico, ou em um ponto particular do tempo no desenvolvimento ou ritmo circadiano. Potencializadores são preparados através da remoção de TATA box ou elementos funcionalmente semelhantes e qualquer sequência a jusante que permite que a transcrição seja iniciada a partir dos promotores ou fragmentos de promotor.
[00130] Elementos potencializadores podem ser derivados dos elementos de promotor aqui fornecidos e clonados usando métodos conhecidos na técnica para serem operacionalmente ligados 5' ou 3' para um elemento promotor, ou operacionalmente ligados 5' ou 3' para elementos potencializadores adicionais que são operacionalmente ligados a um promotor. Alternativamente, elementos potencializadores podem ser clonados, usando métodos conhecidos na técnica, para serem operacionalmente ligados a uma ou mais cópias do elemento potencializador que são operacionalmente ligados 5' ou 3' para um elemento promotor, ou operacionalmente ligados 5' ou 3' para elementos potencializadores adicionais que são operacionalmente ligados a um promotor. Além disso, elementos potencializadores também podem ser clonados para serem operacionalmente ligados 5' ou 3' para um elemento promotor derivado de um organismo de gênero diferente, ou operacionalmente ligados 5' ou 3' para elementos potencializadores adicionais derivados de organismos de outros gêneros ou organismo do mesmo gênero que são operacionalmente ligados a um promotor derivado de organismos de gêneros iguais ou diferentes, resultando em um elemento regulador quimérico. Um vetor de transformação de planta de expressão de GUS pode ser construído usando métodos conhecidos na técnica semelhantes para os constructos descritos nos Exemplos anteriores em que os vetores de expressão de planta resultantes contêm uma região de borda esquerda de A. tumefaciens; um primeiro cassete de seleção de transgene que confere resistência a um antibiótico ou herbicida e é utilizado para a seleção de células de plantas; e um segundo cassete de transgene em que um elemento potencializador é operacionalmente ligado a um promotor formando um elemento promotor quimérico, que é operacionalmente ligado 5' a um elemento de líder, que é operacionalmente ligado 5' a uma sequência de codificação para GUS que possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), operacionalmente ligado a um 3' UTR como T-Gb.E6-3b:1:1 ou qualquer um desses acima descrito de Medicago truncatula; e uma região da borda direita de A. tumefaciens.
[00131] A expressão de GUS conduzida pelo elemento regulador compreendendo um ou mais potencializadores pode ser avaliada em ensaios de planta estável ou transitória como determinado aqui para determinar os efeitos do elemento potencializador na expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita. Modificações para um ou mais elementos potencializadores ou duplicação de um ou mais elementos potencializadores pode ser realizada com base na experimentação empírica, e a regulação da expressão do gene resultante que é observada usando cada composição de elemento regulador. A alteração da posição relativa de um ou mais potencializadores no elemento regulador ou regulador quimérico resultante pode afetar a atividade transcricional ou especificidade do elemento regulador ou regulador quimérico e é determinada empiricamente para identificar os melhores potencializadores para o perfil de expressão de transgene desejado dentro de uma planta.
[00132] Plantas de milho foram transformadas com os constructos de plasmídeo binário para avaliar o efeito de 3' UTR de Medicago T-Mt.Oxr- 1:2:1 (SEQ ID NO: 17) na expressão em relação a dois 3' UTRs usados com frequência em plantas de milho. Especificamente, as plantas de milho foram transformadas com vetores contendo um EXP que apresentou um perfil de expressão constitutivo conduzindo a expressão do transgene B-glucuronidase (GUS) que foi operacionalmente ligado ao 3' UTR de Medicago T-Mt.Oxr-1:2:1 (SEQ ID NO: 17). Estas plantas de milho transformadas foram comparadas a plantas de milho transformadas em que GUS era operacionalmente ligado a 3' UTR T- AGRtu.nos-1:1:13 (SEQ ID NO: 49) ou o 3' UTR T-Os.LTP:1 (SEQ ID NO: 56).
[00133] Os constructos de plasmídeo binário utilizados nesses experimentos foram construídos usando métodos de clonagem conhecidos na técnica. Os vetores resultantes continham uma região da borda direita de A. tumefaciens; um primeiro cassete de expressão para avaliar a sequência 3' UTR em que um grupo de elemento de expressão reguladora constitutiva EXP-FMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Zm.DnaK:1:2 (SEQ ID NO: 56) é operacionalmente ligado 5' para uma sequência de codificação para GUS que possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), que é operacionalmente ligado 5' para um dos seguintes três 3' UTRs: T-Mt.Oxr-1:2:1 (SEQ ID NO: 17), T-AGRtu.nos-1:1:13 (SEQ ID NO: 49) ou T-Os.LTP:1 (SEQ ID NO: 56); um segundo cassete de seleção de transgene usado para a seleção de células de planta transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo promotor Actina 1 de arroz), e uma região da borda esquerda de A. tumefaciens. Os plasmídeos resultantes foram usados para transformar plantas de milho.
[00134] Análises de GUS histoquímica foram usadas para análise de expressão qualitativa de plantas transformadas. Seções de tecido inteiro foram incubadas com solução de coloração de GUS X-Glic (5- bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucuronida) (1 mg/ml) por um período de tempo adequado, lavadas, e inspecionadas visualmente para a coloração azul. A atividade de GUS foi determinada qualitativamente por inspeção visual direta ou inspeção sob um microscópio usando tecidos e órgãos de planta selecionados. As plantas R0 são inspecionadas para expressão nas raízes e folhas, bem como antera, seda, e semente e embrião em desenvolvimento, 21 dias após a polinização (21 DAP).
[00135] Análise quantitativa para as plantas de milho transformadas também foi realizada. Para a análise quantitativa, a proteína total foi extraída de tecidos selecionados de plantas de milho transformadas. Um micrograma de proteína total foi usado com o substrato fluorogênico 4-metileumbeliferil-p-D-glucuronídeo (MUG) em um volume total de reação de 50 ul. O produto de reação, 4-metilumbeliferona (4-MU), é maximamente fluorescente em pH elevado, onde o grupo hidroxila é ionizado. A adição de uma solução básica de carbonato de sódio, simultaneamente, interrompe o ensaio e ajusta o pH para quantificar o produto fluorescente. A fluorescência é medida com excitação a 365 nm, emissão a 445 nm, utilizando um Fluoromax-3 (Horiba; Kyoto, Japan) com Leitor Micromax, com largura de fenda definida na excitação 2 nm e emissão 3 nm.
[00136] A Tabela 30 mostra que a expressão de GUS quantitativa média medida demonstrando efeitos diferentes de cada 3' UTR sobre a mesma EXP expressando constitutiva.Tabela 30. Expressão de GUS média em plantas de milhotransformadas com 3' UTRs diferentes.
[00137] Como pode ser visto na Tabela 30, cada 3' UTR teve um efeito diferente na expressão constitutiva conduzida por EXP-FMV.35S- enh+Ta.Lhcb1+Zm.DnaK:1:2 (SEQ ID NO: 56). Por exemplo, o 3' UTR T-Os.LTP: 1 (SEQ ID NO: 56) apareceu para potencializar a expressão na Raiz VT e Vagem/Seda R1 em relação aos outros dois 3' UTRs. O 3' UTR T-Mt.Oxr-1:2:1 (SEQ ID NO: 17) pareceu potencializar a expressão na semente R3, no endosperma 21DAP e Embrião 21DAP em relação ao T-AGRtu.nos-1:1:13 (SEQ ID NO: 49) e T-Os.LTP:1 (SEQ ID NO: 56). A expressão na Flor/Antera também foi maior usando T-Mt.Oxr-1:2:1 (SEQ ID NO: 17) em relação aos outros dois 3' UTRs. As diferenças na expressão observadas para cada um 3' UTRs demonstra a utilidade de cada 3' UTR na modulação da expressão. Assim, estes experimentos demonstram que a seleção de um 3' UTR pode ser usada em cassetes de transgene para ajuste fino da expressão de uma molécula de DNA que pode ser transcrita particular. Este experimento demonstra também a capacidade de um 3' UTR derivado de dicotiledônea, como T-Mt.Oxr-1:2:1, para afetar a transcrição em uma espécie monocotiledôneas como o milho.
[00138] Geralmente, um íntron é selecionado com base na experimentação e comparação com um controle de vetor de expressão sem íntron para selecionar empiricamente um íntron e configuração dentro do arranjo de elemento de DNA de transferência (T-DNA) para expressão ideal de um transgene. Por exemplo, na expressão de um gene de resistência de herbicida, como CP4 (US RE39247), que confere tolerância ao glifosato, é desejável ter expressão do transgene dentro dos tecidos reprodutivos, bem como nos tecidos vegetativos, para evitar a perda de rendimento ao aplicar o herbicida. Um íntron neste caso deve ser selecionado pela sua capacidade, quando operacionalmente ligado a um promotor constitutivo, para potencializar a expressão de resistência a herbicida, conferindo o transgene, particularmente nas células e tecidos reprodutivos da planta transgênica, e fornecendo tolerância vegetativa e reprodutiva para as plantas transgênicas quando pulverizado com o herbicida. Na maioria dos genes de ubiquitina, o 5' UTR é composto de um líder, que tem uma sequência de íntron incorporada dentro do mesmo. Os elementos reguladores derivados desses genes são, portanto, avaliados usando o 5' UTR inteiro compreendendo o promotor, líder e íntron. Para alcançar diferentes perfis de expressão ou para modular o nível de expressão do transgene, o íntron desse elemento regulador pode ser removido ou substituído com um íntron heterólogo.
[00139] O íntron apresentado aqui como SEQ ID NO: 34 foi identificados usando contíguos de DNA genômico em comparação com clusters de tag de sequência expressa, ou contíguos de cDNA para identificar sequências de éxon e íntron dentro do DNA genômico. Além disso, 5' UTR ou sequências de líder também são usadas para definir a junção de recombinação íntron/éxon de um ou mais íntrons sob condições quando a sequência do gene codifica uma sequência de líder que é interrompida por um ou mais íntrons. Íntrons foram clonados usando métodos conhecidos na técnica em um vetor de transformação de planta para ser operacionalmente ligado 3' para um elemento regulador e fragmento de líder e operacionalmente ligado 5' para um segundo fragmento de líder ou para sequências de codificação, como os cassetes de expressão apresentados na FIG. 1.
[00140] Assim, por exemplo, um primeiro cassete de expressão possível, como Configuração de Cassete de Expressão 1 na FIG. 1, é composto de um promotor ou elemento promotor quimérico [A], operacionalmente ligado 5' para um elemento líder [B], operacionalmente ligado 5' para um elemento de íntron de teste [C], operacionalmente ligado a uma região da codificação [D], que é operacionalmente ligada a um elemento 3' UTR [E]. Alternativamente, um segundo cassete de expressão possível, como Configuração de Cassete de Expressão 2 na FIG. 1, é composto de um promotor ou elemento promotor quimérico [F], operacionalmente ligado 5' para um primeiro elemento de líder ou primeiro fragmento de elemento de líder [G], operacionalmente ligado 5' para um elemento de íntron de teste [H], operacionalmente ligado 5' para um segundo elemento de líder ou segundo fragmento de primeiro elemento de líder [I], operacionalmente ligado a uma região da codificação [J], que é operacionalmente ligada a um elemento 3' UTR [K]. Além disso, um terceiro cassete de expressão possível, como Configuração de Cassete de Expressão 3 na FIG. 1, é composto de um promotor ou elemento promotor quimérico [L], operacionalmente ligado 5' para um elemento líder [M], operacionalmente ligado 5' para um primeiro fragmento do elemento de sequência de codificação [N], operacionalmente ligado 5' para um elemento de íntron [O], operacionalmente ligado 5' para um segundo fragmento do elemento de sequência de codificação [P], que é operacionalmente ligado a um elemento 3' UTR [Q]. Notavelmente, a Configuração de Cassete de Expressão 3 é projetada para permitir o processamento do íntron de forma a produzir um quadro de leitura aberto completo sem uma mudança de quadro entre o primeiro e o segundo fragmento da sequência de codificação.
[00141] Como discutido aqui, pode ser preferencial evitar usar a sequência de nucleotídeo AT ou o nucleotídeo A antes da extremidade 5' do sítio de recombinação (GT) e o nucleotídeo G ou a sequência de nucleotídeo TG, respectivamente, depois da extremidade 3' do sítio de recombinação (AG) para eliminar o potencial de códons de início indesejados de serem formados durante o processamento do RNA mensageiro no transcrito final. A sequência de DNA ao redor dos sítios de junção de recombinação de extremidade 5' ou 3' do íntron, portanto, pode ser modificada.
[00142] Os íntrons podem ser avaliados para um efeito de potencialização através da capacidade de potencializar a expressão em ensaio transitório ou ensaio de planta estável. Para ensaio transitório de potencialização de íntron, um vetor de planta de base é construído usando métodos conhecidos na técnica. O íntron é clonado em um vetor de base de planta que compreende uma cassete de expressão composto de um EXP constitutivo composto por um promotor e um líder como EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42), operacionalmente ligado 5' para um elemento de íntron de teste (por exemplo, um SEQ ID NO: 34), operacionalmente ligado a uma sequência de codificação para GUS que possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), operacionalmente ligado ao 3' UTR de (T- Gb.E6-3b:1:1 SEQ ID NO: 40). Células de protoplastos derivadas de soja ou tecidos de planta de outro gênero são transformadas com o vetor de base de planta e vetores de controle de Luciferase, conforme descrito anteriormente no Exemplo 2 acima, e avaliadas para a atividade. Para comparar a capacidade relativa do íntron em potencializar a expressão, valores de GUS são expressos como uma razão de GUS para atividade de Luciferase e comparados com esses níveis transmitidos por um constructo compreendendo o promotor constitutivo operacionalmente ligado a um íntron conhecido padrão como aquele do íntron derivado do gene 4A10 de fator de alongamento de Nicotiana tabacum, I-Nt.eIF4A10-1:1:1 (SEQ ID NO: 57), bem como um constructo compreendendo o promotor constitutivo, mas sem um íntron operacionalmente ligado ao promotor.
[00143] Para ensaio de planta estável do íntron apresentado como SEQ ID NO: 34, um vetor de transformação de planta de expressão de GUS pode ser construído de forma semelhante aos constructos descritos nos exemplos anteriores em que os vetores de expressão de planta resultantes contêm uma região da borda direita de A. tumefaciens; um primeiro cassete de expressão composto de um EXP constitutiva composto de um promotor e um líder como EXP-CaMV.35S enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO: 42), operacionalmente ligado 5' para um elemento de íntron de teste (por exemplo, SEQ ID NO: 34), operacionalmente ligado para uma sequência de codificação para GUS que possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 44), operacionalmente ligado para o 3' UTR de Gossypium barbadense (T- Gb.E6-3b:1:1, SEQ ID NO: 40). Células de protoplastos derivadas de milho ou tecidos de planta de outro gênero são transformadas com o vetor de base de planta e vetores de controle de luciferase, conforme descrito anteriormente no Exemplo 2 acima, e avaliadas para a atividade. Para comparar a capacidade relativa do íntron em potencializar a expressão, valores de GUS são expressos como uma razão de GUS para atividade de luciferase e comparados com esses níveis transmitidos por um constructo compreendendo o promotor constitutivo operacionalmente ligado a um íntron conhecido padrão como aquele do íntron derivado do gene 4A10 de fator de alongamento de Nicotiana tabacum, I-Nt.eIF4A10-1:1:1 (SEQ ID NO: 57), bem como um constructo compreendendo o promotor constitutivo, mas sem um íntron operacionalmente ligado ao promotor.
[00144] Deve ser notado que o íntron apresentado como SEQ ID NO: 34 pode ser modificado em várias maneiras, como deletando fragmentos dentro da sequência de íntron, que poderia reduzir a expressão ou a duplicação de fragmentos com o íntron que pode potencializar a expressão. Além disso, sequências de DNA dentro do íntron que pode afetar a especificidade de expressão para qualquer tipo de célula ou tecido particular e órgão podem ser duplicadas ou alteradas ou deletadas para afetar a expressão e os padrões de expressão do transgene. Além disso, os íntrons aqui fornecidos podem ser modificados para remover quaisquer códons de início potenciais (ATG) que podem causar transcrições não intencionais de serem expressas de íntrons impropriamente recombinados como proteínas diferentes, maiores ou truncadas. Uma vez que o íntron foi empiricamente testado, ou foi alterado com base na experimentação, o íntron pode ser usado para potencializar a expressão de um transgene em plantas transformadas de forma estável que podem ser de qualquer planta de gênero monocotiledônea ou dicotiledônea, contanto que o íntron forneça potencialização do transgene. O íntron também pode ser usado para potencializar a expressão em outros organismos, como algas, fungos ou células animais, contando que o íntron forneça potencialização ou atenuação ou especificidade da expressão do transgene ao qual está operacionalmente ligado.
[00145] Tendo ilustrado e descrito os princípios da invenção, deve ser evidente para especialistas na técnica que a invenção pode ser modificada no arranjo e nos detalhes sem se afastar desses princípios. Reivindicamos todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações. Todas as publicações e documentos de patente publicados citados aqui são aqui incorporados como referência na mesma medida como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse individual e especificamente indicado para estar aqui incorporado como referência.
Claims (5)
1. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de DNA compreendendo SEQ ID NO: 7, em que a referida sequência de DNA é operacionalmente ligada a uma molécula de DNA heteróloga capaz de ser transcrita.
2. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA heteróloga capaz de ser transcrita compreende um gene de interesse agronômico.
3. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene de interesse agronômico confere tolerância a herbicida em plantas.
4. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene de interesse agronômico confere tolerância a praga em plantas.
5. Método para produzir uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: a) transformar uma célula de planta com o cassete de expressão como definido na reivindicação 1 para produzir uma célula de planta transformada; e b) regenerar uma planta transgênica da célula de planta transformada.
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