KR102270071B1 - 식물 조절 성분 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물에서 유전자 발현을 조정하는데 유용한, 재조합 DNA 분자 및 작제물을 비롯하여, 그들의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 본 발명은 또한, 그들의 사용 방법에서처럼, 이종성의 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물, 식물 세포, 식물 부분 및 종자를 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본 출원은, 그 전문이 참고로 본 명세서에 편입되는, 2013년 3월 14일자로 출원된 미국 가출원 제61/785,268호의 유익을 주장한다.
서열 목록의 편입
52.7 킬로바이트(마이크로소프트 윈도스(Microsoft Windows)(등록상표)로 측정한 크기)이고, 2014년 3월 11일 생성된 파일명 "MONS332WO.txt"의 파일을 포함하는 서열 목록을 전자 제출에 의해 본 명세서와 함께 제출하고 본 명세서에 참조하여 편입시킨다.
발명의 분야
본 발명은 식물 분자 생물학, 식물 유전자 조작, 및 식물에서 유전자 발현을 조정하는데 유용한 DNA 분자 분야에 관한 것이다.
조절 성분은 작동 가능하게 연결된(operably linked) 전사가능한 DNA 분자의 전사를 조정하여 유전자 활성을 조절하는 유전자 성분이다. 이러한 성분은 프로모터, 리더, 인트론, 및 3' 미번역 영역을 포함할 수 있고, 식물 분자 생물학 및 식물 유전자 조작 분야에서 유용하다.
본 발명은 식물에서 사용하기 위한 신규한 조절 성분, 및 이 조절 성분을 포함하는 작제물을 제공한다. 본 발명은 또한 조절 성분을 포함하는 형질전환 식물 세포(transgenic plant cell), 식물, 및 종자를 제공한다. 본 명세서에 개시된 일 실시형태에서, 조절 성분은 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 일정 실시형태에서, 전사가능한 DNA 분자는 조절 서열에 대해 이종성이다. 본 발명은 또한 조절 성분을 포함하는 작제물, 및 조절 성분에 대해 이종성의 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 조절 성분을 포함하는 형질전환 식물 세포, 식물, 및 종자를 포함한, 본 명세서에 개시된 조절 성분을 제조 및 사용하는 방법을 제공한다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1 내지 37 중 임의의 서열과 서열 동일성이 적어도 약 85%인 DNA 서열; (b) 서열번호 1 내지 37 중 임의의 서열을 포함하는 DNA 서열, 및 (c) 서열번호 1 내지 37 중 임의의 서열의 단편으로서, 단편은 유전자 조절 활성을 갖는 것인 단편으로 이루어진 군에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공하고, 여기서 DNA 서열은 이종성 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. "이종성 전사가능한 DNA 분자"란, 전사가능한 DNA 분자가 작동 가능하게 연결된 DNA 서열에 대해 이종성임을 의미한다. 특정 실시형태에서, 재조합 DNA 분자는 서열번호 1 내지 37 중 임의의 DNA 서열과 서열 동일성이 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 DNA 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 이종성 전사가능한 DNA 분자는 작물학적 관심 유전자, 예컨대 식물에서 제초제 저항성 또는 내충성을 제공할 수 있는 유전자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 재조합 DNA 분자를 포함하는 작제물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1 내지 37 중 임의의 서열과 서열 동일성이 적어도 85%인 DNA 서열; (b) 서열번호 1 내지 37 중 임의의 서열을 포함하는 DNA 서열; 및 (c) 서열번호 1 내지 37 중 임의의 서열의 단편으로서, 여기서 단편은 유전자-조절 활성을 갖는 것인 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 세포를 제공하고, 여기서 DNA 서열은 이종성의 전사가능한 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일정 실시형태에서, 형질전환 식물 세포는 단자엽 식물 세포이다. 다른 실시형태에서, 형질전환 식물 세포는 쌍자엽 식물 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 서열번호 1 내지 37 중 임의의 서열과 서열 동일성이 적어도 85%인 DNA 서열; b) 서열번호 1 내지 37 중 임의의 서열을 포함하는 DNA 서열; 및 c) 서열번호 1 내지 37 중 임의의 서열의 단편으로서, 여기서 단편은 유전자-조절 활성을 갖는 것인 단편으로 이루어진 군에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는, 형질전환 식물, 또는 이의 일부를 더욱 제공하고, 여기서 DNA 서열은 이종성의 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 형질전환 식물은 출발 형질전환 식물에 대해 임의 세대의 자손 식물이고, 재조합 DNA 분자를 포함한다. 성장 시에 이러한 형질전환 식물을 생산하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 종자를 또한 본 명세서에서 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 또는 이의 일부분을 획득하는 단계, 및 그로부터 농작물(commodity product)을 생산하는 단계를 포함하는 농작물을 생산하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 농작물은 가공된 종자, 곡물, 식물 일부분, 및 곡식(meal)이다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 식물을 본 발명의 재조합 DNA 분자로 형질전환시켜(transforming) 형질전환된 식물 세포를 생산하는 단계 및 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재생하는 단계를 포함하는 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
도 1: 본 발명의 발현 카세트 구성을 도시한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1 내지 30, 38 내지 41, 49 및 56은 3'UTR 서열이다.
서열번호 31, 35, 42, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54 및 55는 인트론 서열의 5'에 작동 가능하게 연결된, 리더 서열의 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열, 또는 리더 서열의 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 조절 발현 성분 그룹의 DNA 서열(EXP)이다.
서열번호 32, 36 및 43은 프로모터 서열이다.
서열번호 33 및 37은 리더 서열이다.
서열번호 34는 인트론 서열이다.
서열번호 44는 프로세싱가능한 인트론을 보유한 β-글루쿠로니다제(GUS)에 대한 코딩 서열이다.
서열번호 45 및 46은 루시퍼라제 코딩 서열이다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1 내지 30, 38 내지 41, 49 및 56은 3'UTR 서열이다.
서열번호 31, 35, 42, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54 및 55는 인트론 서열의 5'에 작동 가능하게 연결된, 리더 서열의 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열, 또는 리더 서열의 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 조절 발현 성분 그룹의 DNA 서열(EXP)이다.
서열번호 32, 36 및 43은 프로모터 서열이다.
서열번호 33 및 37은 리더 서열이다.
서열번호 34는 인트론 서열이다.
서열번호 44는 프로세싱가능한 인트론을 보유한 β-글루쿠로니다제(GUS)에 대한 코딩 서열이다.
서열번호 45 및 46은 루시퍼라제 코딩 서열이다.
본 발명은 식물에서 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자를 제공한다. 이들 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 37로 제공된다. 이들 DNA 분자는 식물 조직에서 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 발현을 실시할 수 있고, 따라서 형질전환 식물 내 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 유전자 발현을 조절할 수 있다. 본 발명은 또한 이를 개질, 생산 및 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 세포, 식물, 식물 일부분, 및 종자를 포함하는 조성물, 및 이를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
이하의 정의 및 방법은 본 발명을 보다 잘 정의하고 본 발명의 실시에서 당분야의 숙련가를 안내하기 위해 제공된다. 달리 언급하지 않으면, 용어들은 관련 분야의 숙련가들이 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다.
DNA 분자
본 명세서에서 사용하는 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자"는 게놈 또는 합성 기원의 이중 가닥 DNA 분자, 즉 데옥시리보뉴클레오타이드 염기의 중합체를 의미한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "DNA 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 명명법은 미연방법 규정 §1.822의 37장에 부합하고, WIPO 표준 ST.25(1998), 부록 2, 표 1 및 3의 표에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용하는 "재조합 DNA 분자"는 인간 개입없이는 천연적으로 함께 발생하지 않는 DNA 분자의 조합을 포함하는 DNA 분자이다. 예를 들면, 재조합 DNA 분자는 서로에 대해 이종성인 적어도 2종의 DNA 분자로 구성된 DNA 분자, 자연계에 존재하는 DNA 서열에서 유래된 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 유전자 형질전환에 의해 숙주 세포의 DNA에 도입된 DNA 분자일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "서열 동일성"은 2종의 최적으로 배열된 DNA 서열이 동일한 정도를 의미한다. 최적 서열 배열은 적절한 내부 뉴클레오타이드 삽입, 결실, 또는 갭을 갖는 서열 배열에서 뉴클레오타이드 일치의 수를 최대화하기 위해, 2종의 서열, 예를 들면 기준 서열 및 다른 DNA 서열을 수동으로 배열하여 생성한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "기준 서열"은 서열번호 1 내지 37로 제공되는 DNA 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용하는 용어 "서열 동일성 비율" 또는 "동일성 비율" 또는 동일성%"는 100을 곱한 동일성 분율이다. 기준 서열과 최적으로 배열된 DNA에 대한 "동일성 분율"은 기준 서열의 뉴클레오타이드의 총 개수, 예를 들어 온전한 기준 서열의 전체 길이의 뉴클레오타이드의 총 개수로 나눈, 최적 배열된 뉴클레오타이드 일치 개수이다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태는 서열번호 1 내지 37로서 본 명세서에 제공된, 기준 서열에 대해 최적으로 배열시, 기준 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 86% 동일성, 적어도 약 87% 동일성, 적어도 약 88% 동일성, 적어도 약 89% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 91% 동일성, 적어도 약 92% 동일성, 적어도 약 93% 동일성, 적어도 약 94% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 적어도 약 99% 동일성, 또는 적어도 약 100% 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다.
조절 성분
조절 성분 예컨대 프로모터, 리더, 인핸서, 인트론, 및 전사 종결 영역(또는 3' UTR)은 살아있는 세포에서 유전자의 전체 발현의 필수적인 역할을 한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "조절 성분"은 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자를 의미한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "유전자-조절 활성"은 예를 들면 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA의 전사 및/또는 번역에 영향을 주어서, 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 발현에 영향을 미치는 능력을 의미한다. 따라서, 식물에서 기능하는 조절 성분, 예컨대 프로모터, 리더, 인핸서, 인트론 및 3' UTR은 유전자 조작을 통해 식물 표현형을 개질시키는데 유용하다.
본 명세서에서 사용되는 "조절 발현 성분 그룹" 또는 "EXP" 서열은 작동 가능하게 연결된 조절 성분, 예컨대 인핸서, 프로모터, 리더 및 인트론의 그룹을 의미한다. 따라서, 조절 발현 성분 그룹은 예를 들면, 결과적으로 인트론 서열에 대해 5'에 작동 가능하게 연결되는, 리더 서열에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터로 구성될 수 있다.
조절 성분은 그들의 발현 패턴, 예를 들면 양성 및/또는 음성 효과 예컨대 항상성, 일시적, 공간적, 발생적, 조직, 환경적, 생리학적, 병리학적, 세포 주기, 및/또는 화학적 반응성 발현, 및 이의 임의의 조합을 비롯하여, 정량적 또는 정성적 지표를 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용되는 "유전자 발현 패턴"은 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 전사된 RNA 분자로 전사되는 임의 패턴이다. 전사된 RNA 분자는 단백질 분자를 생산하도록 번역되거나 또는 안티센스 또는 다른 조절 RNA 분자, 예컨대 이중 가닥 RNA(dsRNA), 전이 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 마이크로RNA(miRNA) 등을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질 발현"은 전사된 RNA 분자의 단백질 분자로 번역되는 임의 패턴이다. 단백질 발현은 그의 일시적, 공간적, 발생적, 또는 형태적 질을 비롯하여, 정량적 또는 정성적 지표를 특징으로 한다.
프로모터는 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 조절 성분으로서 유용하다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "프로모터"는 대체로 전사를 개시하기 위해서, RNA 중합효소 II 및 다른 단백질, 예컨대 트랜스 작용성 전사 인자들의 인식 및 결합에 관여하는 DNA 분자를 의미한다. 프로모터는 처음에 유전자의 5' 미번역 영역(5' UTR)으로부터 동정되었다. 대안적으로, 프로모터는 합성적으로 생산되거나 또는 조작되는 DNA 분자일 수 있다. 프로모터는 또는 키메라일 수 있다. 키메라 프로모터는 2 또는 그 이상의 이종성 DNA 분자의 융합을 통해 생성된다. 본 발명을 실시하는데 유용한 프로모터는 그 단편 또는 변이체를 포함하여, 서열번호 32 및 36을 포함한다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 청구된 DNA 분자 및 이의 변이체 또는 유도체는 프로모터 활성을 포함하는 것으로 더욱 정의되며, 다시 말해서 숙주 세포, 예컨대 형질전환 식물에서 프로모터로 작용할 수 있다. 여전히 추가의 특정한 실시형태에서, 단편은 그것이 유래된 출발 프로모터 분자가 보유하는 프로모터 활성을 나타내는 것으로 정의되거나, 또는 단편은 기본 전사 수준을 제공하고, 전사의 개시를 위한 RNA 중합효소 II 복합체의 인식 및 결합을 위한 TATA 박스 또는 균등한 DNA 서열로 구성된 "최소 프로모터"를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 프로모터 서열의 단편이 제공된다. 프로모터 단편은 상기 기술된 바와 같은, 프로모터 활성을 포함할 수 있고, 단독으로 또는 다른 프로모터 및 프로모터 단편과 조합하여, 예컨대 키메라 프로모터를 제작하거나, 또는 다른 EXP 및 EXP 단편과 조합하여 유용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 약 50, 적어도 약 75, 적어도 약 95, 적어도 약 100, 적어도 약 125, 적어도 약 150, 적어도 약 175, 적어도 약 200, 적어도 약 225, 적어도 약 250, 적어도 약 275, 적어도 약 300, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 적어도 약 750, 적어도 약 800, 적어도 약 900, 또는 적어도 약 1000개의 인접한 뉴클레오타이드, 또는 그 보다 긴, 본 명세서에 개시된 바와 같은 프로모터 활성을 갖는 DNA 분자를 포함하는 프로모터의 단편을 제공한다. 출발 프로모터 분자로부터 이러한 단편을 생성시키는 방법은 당분야에서 잘 알려져 있다.
예를 들면, 내부 또는 5'결실과 같은, 서열번호 32 및 36으로 표시되는 임의의 프로모터에서 유래된 조성물은, 발현에 대해 양성 또는 음성 효과를 가지는 성분의 제거; 발현에 대해 양성 또는 음성 효과를 가지는 성분의 복제; 및/또는 발현에 대해 조직 특이적 또는 세포 특이적 효과를 갖는 성분의 복제 또는 제거를 포함하는, 발현을 개선시키거나 또는 변경시키기 위한 당분야에 잘 알려진 방법을 이용해 생성시킬 수 있다. TATA 박스 성분 또는 이의 균등한 서열 및 하류 서열이 제거된 3' 결실을 포함하는 서열번호 32 및 36으로 표시되는 임의의 프로모터에서 유도된 조성물은 예를 들면 인핸서 성분을 만들기 위해 사용될 수 있다. 발현에 대해 양성 또는 음성; 조직 특이적; 세포 특이적; 또는 시기 특이적(예컨대, 제한 없이, 일주기 리듬) 효과를 가지는 임의의 성분을 제거하여 추가 결실을 만들 수 있다. 서열번호 32 및 36으로 표시되는 임의의 프로모터 및 이로부터 유도된 단편 또는 인핸서를 사용해 키메라 전사 조절 성분 조성물을 만들 수 있다.
본 발명에 따라서, 프로모터 또는 프로모터 단편은 기지의 프로모터 성분, 즉 DNA 서열 특질, 예컨대 TATA 박스 및 다른 기지의 전사 인자 결합 부위 모티프의 존재에 대해 분석될 수 있다. 이러한 기지의 프로모터 성분의 동정은 당분야의 숙련가에 의해서 본래 프로모터와 유사한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 변이체를 디자인하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "리더"는 미번역된 5' 영역(5' UTR)으로부터 동정되고 대체로 전사 출발 부위(TSS)와 단백질 코딩 서열 출발 부위 사이의 뉴클레오타이드 절편으로서 정의되는 DNA 분자를 의미한다. 다르게, 리더는 합성적으로 생성되거나 또는 조작된 DNA 성분일 수 있다. 리더는 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 5' 조절 성분으로서 사용될 수 있다. 리더 분자는 이종성 프로모터 또는 그들의 천연 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 리더는 서열번호 33 및 37 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 이러한 DNA 서열은 예를 들면 형질전환 식물 세포를 포함하는, 숙주 세포에서 리더로서 작용할 수 있는 것으로 정의될 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 DNA 서열은 리더 활성을 포함하는 것으로 해독될 수 있다.
서열번호 33 및 37로 표시되는 리더 서열은 조절 성분을 포함하거나, 또는 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 전사 또는 번역에 대해 효과를 갖는 2차 구조를 채택할 수 있다. 서열번호 33 및 37로 표시되는 리더 서열은 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 키메라 조절 성분을 만들도록 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "인트론"은 유전자로부터 동정되고 대체로 번역 전 메신저 RNA(mRNA) 프로세싱 동안 스플라이싱되는 영역으로서 정의되는 DNA 분자를 의미한다. 다르게, 인트론은 합성적으로 생성되거나 또는 조작된 DNA 성분일 수 있다. 인트론은 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사에 영향을 주는 인핸서 성분을 함유할 수 있다. 인트론은 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 조절 성분으로서 사용될 수 있다. 작제물은 인트론을 포함할 수 있고, 인트론은 전사가능한 DNA 분자에 대해 이종성이거나 또는 이종성이 아닐 수 있다. 당분야에서 인트론의 예는 쌀 액틴 인트론 및 옥수수 HSP70 인트론을 포함한다.
식물에서, 유전자 작제물 내 일부 인트론의 포함은 인트론이 결여된 작제물에 비해 높은 mRNA 및 단백질 축적을 유도한다. 이러한 효과는 유전자 발현의 "인트론 매개 상승(IME)"이라고 한다. 식물에서 발현을 자극하는 것으로 알려진 인트론은 옥수수 유전자(예를 들면, tubA1, Adh1, Sh1, 및 Ubi1), 쌀 유전자(예를 들면, tpi) 및 쌍자엽 식물 유전자 예컨대 페튜니아(예를 들면, rbcS), 감자(예를 들면, st-ls1) 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(예를 들면, ubq3 및 pat1) 유래의 것들에서 동정되었다. 인트론의 스플라이싱 부위 내 결실 또는 돌연변이는 유전자 발현을 감소시키며, 이는 스플라이싱이 IME에 필요하다는 것을 시사함을 보여주었다. 그러나, 쌍자엽 식물 내 IME는 에이. 탈리아나(A. thaliana) 유래 pat1 유전자의 스플라이싱 부위 내 점 돌연변이에 의해 확인되었다. 한 식물 내 동일 인트론의 복수의 용도는 일부 상황에서, 단점을 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 경우들에서, 적절한 재조합 DNA 성분의 제작을 위한 기본적인 제어 성분들의 컬렉션을 갖는 것이 필수적이다.
본 발명을 실시하는데서 유용한 인트론은 서열번호 34를 포함한다. 서열번호 34로 표시되는 인트론 유래의 조성물은 시스-조절 성분의 내부 결실 또는 복제를 포함하고/하거나, 인트론/엑손 스플라이싱 접합부를 포함하는 5' 및 3' DNA 서열의 변경은 프로모터 + 리더 또는 키메라 프로모터 + 리더 및 코딩 서열에 작동 가능하게 연결시 발현의 특이성 또는 발현을 개선시키는데 사용될 수 있다. 인트론/엑손 경계 서열을 개질하는 경우, 메신저 RNA가 최종 전사체로 프로세싱되는 동안 원치않는 출발 코돈이 형성될 가능성을 제거하기 위해 스플라이싱 부위의 5'말단(GT) 직전에 뉴클레오타이드 서열 AT 또는 뉴클레오타이드 A, 및 스플라이싱 부위의 3' 말단(AG) 직후에 각각 뉴클레오타이드 G 또는 뉴클레오타이드 서열 TG를 이용하는 것을 피하는 것이 유리하다. 따라서, 인트론의 5' 또는 3' 말단 스플라이싱 접합 부위 주변 DNA 서열은 이러한 방식으로 개질될 수 있다. 인트론 및 본 명세서에 기술된 바와 같이 당분야에 공지된 방법을 통해 변경된 인트론 변이체는 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 발현에 대한 인트론의 효과를 결정하기 위해 실시예에 기술된 바와 같이 경험적으로 시험할 수 있다. 또한 인트론/엑손 스플라이싱 접합부를 포함하는 5' 및 3' 영역을 변경하여 메신저 RNA의 프로세싱 및 스플라이싱 이후 얻어지는 전사체에 생성되는 거짓 출발 및 중지 코돈의 도입 가능성을 감소시킬 수 있다. 인트론은 이식유전자의 발현에 대한 인트론의 효과를 결정하기 위해 실시예에 기술된 바와 같이 경험적으로 시험될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "3' 전사 종결 분자", "3' 미번역 영역" 또는 "3' UTR"은 mRNA의 3' 부분의 미번역 영역으로의 전사 동안 사용되는 DNA 분자를 의미한다. mRNA 분자의 3' 미번역 영역은 특이적 절단 및, 폴리A 꼬리라고도 알려진 3' 폴리아데닐화를 통해 생성될 수 있다. 3' UTR은 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결되고, 이의 하류에 위치하며, 폴리아데닐화 신호 및 전사, mRNA 프로세싱, 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 다른 조절 신호를 포함할 수 있다. 폴리 A 꼬리는 mRNA 안정성 및 번역의 개시에서 기능하는 것으로 여겨진다. 당분야에서 3' 전사 종결 분자의 예에는 노팔리 합성효소 3' 영역; 밀 hsp17 3' 영역, 완두콩 루비스코 소형 서브유닛 3' 영역, 목화 E6 3' 영역, 및 코이신 3' UTR이 있다.
3' UTR은 전형적으로 특이적 DNA 분자의 재조합 발현을 위해 유리한 용도가 밝혀졌다. 약한 3' UTR은 이웃하는 발현 카세트에 위치하는 DNA 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있는, 리드-쓰루(read-through)를 생성하는 가능성을 갖는다. 전사 종결의 적절한 제어는 하류에 위치된 DNA 서열(예를 들면, 다른 발현 카세트)로의 리드-쓰루를 방지할 수 있고, 또한 유전자 발현을 개선하도록 RNA 중합효소의 효율적인 재활용을 가능하게 한다. 전사의 효율적인 종결(DNA로부터 RNA 중합효소 II의 방출)은 전사의 재개시를 위한 전제조건이고, 따라서 전체 전사체 수준에 직접적으로 영향을 미친다. 전사 종결 이후에, 성숙한 mRNA는 합성 부위로부터 방출되고 주형이 세포질로 수송된다. 진핵생물 mRNA는 생체내 폴리(A) 형태로 축적되어, 통상적인 방법에 의해 전사 종결 부위를 검출하는 것을 어렵게 만든다. 그러나, 생물정보학적 방법에 의한 기능적 및 효율적 3' UTR의 예측은 효율적 3' UTR의 용이한 예측을 허용하게 되는 보존 DNA 서열이 많지 않게 존재한다는 점에서 어려울 수 있다.
현실적인 관점에서, 전형적으로, 발현 카세트에서 사용되는 3' UTR은 다음의 특질을 보유한다는 점에서 유리하다. 3' UTR은 이식 유전자의 전사를 효율적이고 효과적으로 종결할 수 있어야 하고, 하나의 전이 DNA(T-DNA)에 존재하는 복수의 발현 카세트의 경우처럼 다른 발현 카세트를 포함할 수 있는, 임의의 이웃 DNA 서열, 또는 T-DNA가 삽입된 이웃의 염색체 DNA로의 전사체의 리드-쓰루를 예방할 수 있어야 한다. 식물 생명공학에서, 3' UTR은 종종 형질전환된 식물로부터 추출된 역전사 RNA의 증폭 반응의 점화를 위해 사용되고, (1) 식물 염색체로 통합되면 발현 카세트의 발현 또는 전사 활성을 평가하고, (2) 식물 DNA 내 삽입부의 복제수를 평가하며, (3) 교배이후 얻어진 종자의 접합성을 평가하는데 사용된다. 3' UTR은 또한 삽입된 카세트의 온전성을 특징규명하기 위한 형질전환된 식물에서 추출된 DNA의 증폭 반응에서 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인핸서" 또는 "인핸서 성분"은 전체 발현 패턴 양상을 부여하지만, 일반적으로 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 전사를 구동시키는데 단독으로는 불충분한, 시스-성분으로도 알려진, 시스-작동성 조절 성분을 의미한다. 프로모터와 달리, 인핸서 성분은 일반적으로, 전사 출발 부위(TSS) 또는 TATA 박스 또는 균등한 DNA 서열을 포함하지 않는다. 프로모터 또는 프로모터 단편은 천연적으로, 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 전사에 영향을 미치는 1 또는 그 이상의 인핸서 성분을 포함할 수 있다. 인핸서 성분은 또한 유전자 발현의 전체 조정 양상을 부여하는, 키메라 프로모터 시스-성분을 생성하도록 프로모터에 융합될 수 있다.
많은 프로모터 인핸서 성분은 DNA-결합 단백질이 결합하고/하거나 DNA 토폴로지에 영향을 주어서, DNA 주형에 RNA 중합효소의 접근을 선택적으로 허용하거나 또는 제한하거나, 또는 전사 개시 부위에서 이중 가닥의 선택적 개방을 용이하게 하는 국소 입체구조를 생성시키는 것으로 여겨진다. 인핸서 성분은 전사를 조절하는 전사 인자를 결합시키도록 기능한다. 일부 인핸서 성분은 1 이상의 전사 인자가 결합하고, 전사 인자들은 1 이상의 인핸서 도메인과 상이한 친화성으로 상호작용한다. 인핸서 성분은 결실 분석법, 즉 프로모터의 5' 말단 또는 내부로부터 1 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 결실시키는 분석법; DNase I 풋프린팅, 메틸화 간섭, 전기영동 이동성-이동 분석법, 결찰-매개 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 생체내 게놈 풋프린팅, 및 다른 통상의 분석법을 이용한 DNA 결합 단백질 분석법을 포함한, 다수의 기법; 또는 통상의 DNA 서열 비교 방법, 예컨대 BLAST를 사용하여 표적 서열 또는 표적 모티프로서 기지의 시스-성분 모티프 또는 인핸서 성분을 이용하는 DNA 서열 유사성 분석을 통해 동정할 수 있다. 인핸서 도메인의 미세한 구조는 1 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 돌연변이유발법(또는 치환) 또는 당분야에 공지된 다른 통상의 방법에 의해 더욱 연구할 수 있다. 인핸서 성분은 화학 합성 또는 이러한 성분을 포함하는 조절 성분에서 단리를 통해 얻을 수 있고, 이들은 하위서열 조작이 용이하도록 유용한 제한효소 부위를 함유하는 추가의 측접한 뉴클레오타이드와 합성될 수 있다. 따라서, 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 본 명세서에 개시된 방법에 따른 인핸서 성분의 디자인, 구성 및 용도는 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "키메라"는 제1 DNA 분자를 제2 DNA 분자에 융합시켜 생성시킨 단일 DNA 분자를 의미하고, 여기서 제1 또는 제2 DNA 분자는 어떠한 것도 정상적으로는 그러한 구조, 즉 다른 것과 융합된 구조로 발현되지 않는다. 따라서, 키메라 DNA 분자는 그렇지 않으면 정상적으로는 자연계에서 발견되지 않는 신규한 DNA 분자이다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "키메라 프로모터"는 DNA 분자의 이러한 조작을 통해 생성된 프로모터를 의미한다. 키메라 프로모터는 2 또는 그 이상의 DNA 단편을 배합할 수 있고, 예를 들면, 인핸서 성분과 프로모터의 융합체일 수 있다. 따라서, 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 본 명세서에 개시된 방법에 따른 키메라 프로모터의 디자인, 구성 및 용도를 본 발명에 포함시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변이체"는 제1 DNA 분자와 조성은 유사하지만, 동일하지 않은 제2 DNA 분자, 예컨대 조절 성분을 의미하고, 여기서 제2 DNA 분자는 여전히 제1 DNA 분자의 일반적인 작용성, 즉 그 이상 또는 그 이하 또는 균등한 전사 또는 번역 활성을 통해, 동일하거나 또는 유사한 발현 패턴을 유지한다. 변이체는 제1 DNA 분자의 보다 짧거나 또는 절단된 형태 및/또는 제1 DNA 분자의 서열이 변경된 형태, 예컨대 상이한 제한효소 부위 및/또는 내부 결실, 치환 및/또는 삽입을 갖는 것일 수 있다. "변이체"는 또한 기준 서열의 1 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 조절 성분을 포함할 수 있고, 여기서 유도성 조절 성분은 상응하는 부모 조절 분자보다 높거나 또는 낮거나 또는 균등한 전사 또는 번역 활성을 갖는다. 조절 성분 "변이체"는 또한 박테리아 및 식물 세포 형질전환 동안 또는 그 결과로서 발생된 돌연변이로부터 생긴 변이체를 포함한다. 본 발명에서 서열번호 1 내지 37로서 제공되는 DNA 서열은 본래 조절 성분의 DNA 서열과 조성이 유사하지만, 동일하지 않은 한편, 여전히 본래 조절 성분의 일반적인 작용성, 즉 동일하거나 또는 유사한 발현 패턴을 유지하는 변이체를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 변이체의 생산은 본 명세서의 견지에서 당분야의 숙련가에게 수월하고 본 발명의 범주에 포함된다.
키메라 조절 성분은 당분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 제한효소 분해 및 결찰, 결찰 비의존적 클로닝, 증폭 동안 PCR 산물의 모듈식 조립, 또는 조절 성분의 직접 화학 합성을 비롯하여, 당분야에 공지된 다른 방법에 의해 작동 가능하게 연결된 다양한 구성 성분을 포함하도록 디자인될 수 있다. 얻어진 다양한 키메라 조절 성분은 동일물, 또는 동일물의 변이체로 구성되지만, 구성 성분은 구성부가 작동 가능하게 연결될 수 있게 하는 연결 DNA 서열 또는 서열들을 포함하는 DNA 서열 또는 DNA 서열들은 상이하다. 본 발명에서, 서열번호 1 내지 30 또는 31 내지 37로 제공되는 DNA 서열은 조절 성분 기준 서열을 제공하고, 여기서 기준 서열을 포함하는 구성 성분은 당분야에서 공지된 방법에 의해 연결되고 박테리아 및 식물 세포 형질전환 시에 천연적으로 발생되는 1 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 및/또는 삽입 또는 돌연변이를 포함할 수 있다.
특정한 전사가능한 DNA 분자의 바람직한 발현 양상에 대한 본 명세서에 기술된 개질, 복제, 또는 결실의 효율은 안정 및 일시적 식물 분석법, 예컨대 본 명세서의 실시예에서 기술된 것으로 경험적으로 시험하여, 출발 DNA 분자에 만들어진 변화 및 변화의 목적에 따라서 다양할 수 있는, 결과들을 검증할 수 있다.
작제물
본 명세서에서 사용되는 용어 "작제물"은 적어도 하나의 DNA 분자가 다른 DNA 분자에 기능적으로 작동적인 방식으로 연결, 즉 작동 가능하게 연결되는, DNA 분자를 포함하는, 게놈 통합 또는 자가 복제할 수 있는, 임의 공급원에서 유래된, 임의의 재조합 DNA 분자 예컨대 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파시, 또는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 형질전환의 목적, 즉 숙주 세포에 이종성 DNA 또는 RNA의 도입을 위해 사용되는 임의의 작제물을 의미한다. 작제물은 전형적으로 1 또는 그 이상의 발현 카세트를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "발현 카세트"는 1 또는 그 이상의 조절 성분, 전형적으로 적어도 프로모터 및 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 전사가능한 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 제2 DNA 분자에 연결된 제1 DNA 분자를 의미하고, 여기서 제1 및 제2 DNA 분자는 제1 DNA 분자가 제2 DNA 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 2종의 DNA 분자는 단일한 인접된 DNA 분자의 일부분이거나 또는 그렇지 않을 수 있고 인접하거나 또는 인접하지 않을 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 이 프로모터가 전사가능한 DNA 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다면 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 작제물은, 일 실시형태에서 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의해 제공된 전이 분자와 함께, 식물 세포의 게놈으로 T-DNA의 통합을 허용하는 T-DNA를 포함하는 아그로박테리움 투머파시엔스에서 단리된 Ti 플라스미드의 우측 경계(RB 또는 AGRtu.RB) 및 좌측 경계(LB 또는 AGRtu.LB) 영역을 갖는 이중 종양-유도성(Ti) 플라스미드 경계 작제물로서 제공된다(예를 들면, 미국 특허 제 6,603,061호를 참조한다). 작제물은 또한 박테리아 세포에서 복제 기능 및 항생제 선별성을 제공하는 플라스미드 골격 DNA 절편, 예를 들면 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 복제 기원 예컨대 ori322, 광범위한 숙주 범위의 복제 기원 예컨대 oriV 또는 oriRi, 및 선별 마커에 대한 코딩 영역 예컨대 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는 Tn7 아미노글리코시드 아데닐트랜스퍼라제(aadA)를 코딩하는 Spec/Strp, 또는 젠타마이신(Gm, Gent) 선별 마커 유전자를 함유한다. 식물 형질전환을 위한, 숙주 박테리아 균주는 종종 에이. 투머파시엔스 ABI, C58, 또는 LBA4404이지만, 식물 형질전환 분야의 숙련가에게 공지된 다른 균주가 본 발명에서 기능할 수 있다.
전사가능한 DNA 분자가 단백질로 번역 및 발현되는 기능성 mRNA 분자로 전사되는 방식으로 작제물을 조립하고 세포에 도입하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 실시를 위해, 작제물 및 숙주 세포를 제조 및 사용하기 위한 통상의 조성물 및 방법은 당분야의 숙련가에게 충분히 공지되어 있다. 예를 들면, 고등 식물에서 핵산의 발현에 유용한 전형적인 벡터는 당분야에서 충분히 공지이고 아그로박테리움 투머파시엔스의 Ti 플라스미드로부터 유도된 벡터 및 pCaMVCN 전이 제어 벡터를 포함한다.
본 명세서에 제공된 임의의 것들을 포함하여, 다양한 조절 성분이 작제물에 포함될 수 있다. 임의의 이러한 조절 성분은 다른 조절 성분과 조합하여 제공될 수 있다. 이러한 조합은 바람직한 조절 특징을 생성하도록 디자인되거나 또는 개질될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 작제물은 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 조절 성분을 포함한다.
본 발명의 작제물은 본 명세서에 제공되거나 또는 당분야에 공지된 임의의 프로모터 또는 리더를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 프로모터는 이종성 비번역 5' 리더 예컨대 열 충격 단백질 유전자에서 유래된 것에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다르게, 본 발명의 리더는 이종성 프로모터 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 전사체 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
발현 카세트는 또한 작동 가능하게 연결된 단백질의, 구체적으로 엽록체, 백색체, 또는 다른 색소체 기관; 미토콘드리아; 퍼옥시좀; 액포; 또는 세포외 위치로의 세포하 표적화에 유용한 펩티드를 코딩하는 수송 펩티드 코딩 서열을 포함한다. 많은 엽록체-국재화 단백질은 전구체로서 핵 유전자로부터 발현되고 엽록체 수송 펩티드(CTP)에 의해 엽록체로 표적화된다. 이러한 단리된 엽록체 단백질의 예에는 제한 없이, 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제의 소형 서브유닛(SSU)과 회합된 것, 페리독신, 페리독신 옥시도리덕타제, 집광성 복합체 단백질 I 및 단백질 II, 티오리독신 F, 및 에놀피루빌 시키메이트 포스페이트 신타제(EPSPS)를 포함한다. 엽록체 수송 펩티드는 예를 들면, 미국 특허 제7,193,133호에 기술되어 있다. 비엽록체 단백질은 비엽록체 단백질을 코딩하는 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 이종성 CTP의 발현에 의해 엽록체로 표적화될 수 있는 것으로 확인되었다.
전사가능한 DNA 분자
본 명세서에서 사용하는 용어 "전사가능한 DNA 분자"는 제한 없이, 단백질 코딩 서열을 포함하는 것 및 유전자 억제에 유용한 서열을 갖는 RNA 분자를 생성하는 것을 포함하여, RNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 DNA 분자를 의미한다. DNA 분자의 유형은 제한 없이, 동일 식물 유래 DNA 분자, 다른 식물 유래 DNA 분자, 다른 유기체 유래 DNA 분자, 합성 DNA 분자, 예커대 유전자의 안티센스 메시지를 포함하는 DNA 분자, 또는 인공, 합성, 또는 아니면 개질된 형태의 이식유전자를 코딩하는 DNA 분자를 포함한다. 본 발명의 작제물에 도입하기 위한 예시적인 전사가능한 DNA 분자는 예를 들면, DNA 분자가 도입되는 종 이외의 종에서 유래된 DNA 분자 또는 유전자, 또는 동일 종에서 유래하거나, 또는 그에 존재하지만, 고전적인 교배 기법보다는 유전자 조작 방법에 의해 수용 세포로 도입되는 유전자를 포함한다.
"이식유전자"는 적어도 숙주 세포 게놈 내에서 그 위치에 대해 숙주 세포에 이종성인 전사가능한 DNA 분자 및/또는 세포의 현재 또는 임의의 이전 세대에서 숙주 세포의 게놈에 인공적으로 도입된 전사가능한 DNA 분자를 의미한다.
조절 성분, 예컨대 본 발명의 프로모터는 조절 성분에 대해 이종성인 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "이종성"은 그러한 조합이 자연계에서 정상적으로 발견되지 않는 경우에 2 또는 그 이상의 DNA의 조합을 의미한다. 예를 들면, 2종의 DNA 분자는 상이한 종에서 유래되고/되거나 2종의 DNA분자는 상이한 유전자, 예를 들면 동일 종 유래의 상이한 유전자 또는 상이한 종 유래의 동일 유전자로부터 유래될 수 있다. 따라서, 조절 성분은 그러한 조합이 자연계에서 정상적으로 발견되지 않으면 작동 가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자에 대해 이종성이며, 다시 말해서, 전사가능한 DNA 분자가 천연적으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결되지 않는다.
전사가능한 DNA 분자는 일반적으로 전사체의 발현이 바람직한 임의의 DNA 분자일 수 있다. 전사체의 이러한 발현은 얻어진 mRNA 분자의 번역을 일으키고, 따라서 단백질 발현이 일어난다. 다르게, 예를 들면, 전사가능한 DNA 분자는 궁극적으로 특이적 유전자 또는 단백질의 감소된 발현이 야기되도록 디자인된다. 일 실시형태에서, 이는 안티센스 방향으로 배향된 전사가능한 DNA 분자를 사용하여 수행될 수 있다. 당분야의 숙련가는 이러한 안티센스 기법에 친숙하다. 임의의 유전자는 이러한 방식으로 음성적으로 조절될 수 있고, 일 실시형태에서, 전사가능한 DNA 분자는 dsRNA, siRNA 또는 miRNA 분자의 발현을 통해 특이적 유전자의 억제를 위해 디자인될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시형태는 작제물이 형질전환 식물 세포의 게놈에 통합될 때 바람직한 수준으로 또는 바람직한 패턴으로 전사가능한 DNA 분자의 전사를 조정하도록 이종성 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 1 내지 37로서 제공된 것과 같은, 본 발명의 조절 성분을 포함하는 재조합 DNA 분자이다. 일 실시형태에서, 전사가능한 DNA 분자는 유전자의 단백질 코딩 영역을 포함하고, 다른 실시형태에서, 전사가능한 DNA 분자는 유전자의 안티센스 영역을 포함한다.
작물학적 관심의 유전자
전사가능한 DNA 분자는 작물학적 관심의 유전자일 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "작물학적 관심의 유전자"는 특정한 식물 조직, 세포, 또는 세포 유형에서 발현시, 바람직한 특질을 부여하는 전사가능한 DNA 분자를 의미한다. 작물학적 관심 유전자의 산물은 식물 형태, 생리학, 성장, 발생, 산출량, 곡물 조성, 영양상 프로파일, 질환 또는 해충 저항성, 및/또는 환경 또는 화학 내성에 대한 효과를 일으키기 위해 식물내에서 작용하거나, 또는 식물을 먹는 해충의 식사에서 살충제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 조절 성분은 이 조절 성분이 작물학적 관심의 유전자인 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결되도록 작제물에 도입된다. 이러한 작제물을 함유하는 형질전환 식물에서, 작물학적 관심 유전자의 발현은 유용한 작물학적 특징을 부여할 수 있다. 유용한 작물학적 특징은 예를 들면, 제한 없이, 제초제 내성, 곤충 구제, 변화된 산출량, 질환 저항성, 병원균 저항성, 변화된 식물 성장 및 발육, 변화된 전분 함량, 변화된 오일 함량, 변화된 지방산 함량, 변화된 단백질 함량, 변화된 과육 숙성, 강화된 동물 및 인간 영양분, 생물중합체 생산, 환경 스트레스 저항성, 약학적 펩티드, 개선된 프로세싱 품질, 개선된 풍미, 잡종 종자 생산 유용성, 개선된 섬유질 생산, 및 바람직한 생물연료 생산을 포함한다.
당분야에 공지된 작물학적 관심 유전자의 예에는 제초제 저항성(미국 특허 제6,803,501호; 제6,448,476호; 제6,248,876호; 제6,225,114호; 제6,107,549호; 제5,866,775호; 제5,804,425호; 제5,633,435호; 및 제5,463,175호), 증가된 산출량(미국 특허 제USRE38,446호; 제6,716,474호; 제6,663,906호; 제6,476,295호; 제6,441,277호; 제6,423,828호; 제6,399,330호; 제6,372,211호; 제6,235,971호; 제6,222,098호; 및 제5,716,837호), 곤충 구제(미국 특허 제 6,809,078호; 제6,713,063호; 제6,686,452호; 제6,657,046호; 제6,645,497호; 제6,642,030호; 제6,639,054호; 제6,620,988호; 제6,593,293호; 제6,555,655호; 제6,538,109호; 제6,537,756호; 제6,521,442호; 제6,501,009호; 제6,468,523호; 제6,326,351호; 제6,313,378호; 제6,284,949호; 제6,281,016호; 제6,248,536호; 제6,242,241호; 제6,221,649호; 제6,177,615호; 제6,156,573호; 제6,153,814호; 제6,110,464호; 제6,093,695호; 제6,063,756호; 제6,063,597호; 제6,023,013호; 제5,959,091호; 제5,942,664호; 제5,942,658호, 제5,880,275호; 제5,763,245호; 및 제5,763,241호), 진균성 질환 저항성(미국 특허 제6,653,280호; 제6,573,361호; 제6,506,962호; 제6,316,407호; 제6,215,048호; 제5,516,671호; 제5,773,696호; 제6,121,436호; 제6,316,407호; 및 제6,506,962호), 바이러스 저항성(미국 특허 제6,617,496호; 제6,608,241호; 제6,015,940호; 제6,013,864호; 제5,850,023호; 및 제5,304,730호), 선충 저항성(미국 특허 제6,228,992호), 박테리아 질환 저항성(미국 특허 제 5,516,671호), 식물 성장 및 발육(미국 특허 제 6,723,897호 및 제6,518,488호), 전분 생산(미국 특허 제 6,538,181호; 제6,538,179호; 제6,538,178호; 제5,750,876호; 제6,476,295호), 변화된 오일 생산(미국 특허 제6,444,876호; 제6,426,447호; 및 제6,380,462호), 높은 오일 생산(미국 특허 제6,495,739호; 제5,608,149호; 제6,483,008호; 및 제6,476,295호), 변화된 지방산 함량(미국 특허 제6,828,475호; 제6,822,141호; 제6,770,465호; 제6,706,950호; 제6,660,849호; 제6,596,538호; 제6,589,767호; 제6,537,750호; 제6,489,461호; 및 제6,459,018호), 높은 단백질 생산(미국 특허 제6,380,466호), 과육 숙성(미국 특허 제5,512,466호), 강화된 동물 및 인간 영양분(미국 특허 제6,723,837호; 제6,653,530호; 제6,5412,59호; 제5,985,605호; 및 제6,171,640호), 생물중합체(미국 특허 제USRE37,543호; 제6,228,623호; 및 제5,958,745호, 및 제6,946,588호), 환경 스트레스 저항성(미국 특허 제6,072,103호), 약학적 펩티드 및 분비성 펩티드(미국 특허 제6,812,379호; 제6,774,283호; 제6,140,075호; 및 제6,080,560호), 개선된 프로세싱 특성(미국 특허 제6,476,295호), 개선된 소화성(미국 특허 제6,531,648호) 낮은 라피노스(미국 특허 제6,166,292호), 산업적 효소 생산(미국 특허 제5,543,576호), 개선된 풍미(미국 특허 제6,011,199호), 질소 고정(미국 특허 제5,229,114호), 잡종 종자 생산(미국 특허 제5,689,041호), 섬유질 생산(미국 특허 제6,576,818호; 제6,271,443호; 제5,981,834호; 및 제5,869,720호) 및 생물연료 생산(미국 특허 제5,998,700호)을 위한 것들이 포함된다.
다르게, 작물학적 관심 유전자는 예를 들면, 안티센스(예를 들면, 미국 특허 제5,107,065호); 억제성 RNA("RNAi", 예를 들면, 공개된 U.S. 특허 출원 제2006/0200878호 및 미국 특허 출원 제2008/0066206호, 및 미국 특허 출원 제 11/974,469호에 기술된 바와 같은, miRNA-, siRNa-, 트랜스-작용성 siRNA-, 및 단계적 sRNA-매개 기전에 의한 유전자 발현의 조정을 포함); 또는 공동억제-매개 기전에 의한, 내생성 유전자의 유전자 발현의 표적화 조정을 일으키는 RNA 분자를 코딩하여 상기 언급된 식물 특질 또는 표현형에 영향을 미칠 수 있다. RNA는 또한 바람직한 내생성 mRNA 산물을 절단하도록 조작된 촉매성 RNA 분자(예를 들면, 리보자임 또는 리보스위치: 예를 들면, U.S. 2006/0200878를 참조한다)일 수 있다. 전사가능한 DNA 분자가 유전자 억제를 일으킬 수 있는 분자로 전사되는 방식으로 작제물을 제작하고 세포로 도입시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
선별 마커
선별 마커 이식유전자가 역시 본 발명의 조절 성분과 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "선별 마커 이식유전자"는 형질전환 식물, 조직 또는 세포에서 발현, 또는 그의 결여를 스크리닝하거나 또는 일정 방식으로 채점할 수 있는 임의의 전사가능한 DNA 분자를 의미한다. 본 발명의 실시에서 사용하기 위한, 선별 마커 유전자, 및 그와 연관된 선별 및 스크리닝 기술은 당분야에서 공지되어 있고, 제한 없이, β-글루쿠로니다제(GUS), 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), 항생제 저항성을 부여하는 단백질, 및 제초제 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 전사가능한 DNA 분자를 포함한다.
세포 형질전환
본 발명은 또한 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 1 또는 그 이상의 조절 성분을 포함하는 형질전환된 세포 및 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
용어 "형질전환"은 수용자 숙주에 DNA 분자의 도입을 의미한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "숙주"는 임의의 세포, 조직, 장기, 또는 박테리아, 진균, 또는 식물의 자손을 포함하여, 박테리아, 진균, 또는 식물을 의미한다. 특정 관심의 식물 조직 및 세포는 프로토플라스트, 가피, 뿌리, 덩이줄기, 종자, 줄기, 잎, 묘목, 싹, 및 꽃가루를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "형질전환된"은 외래 DNA 분자, 예컨대 작제물이 도입되는 세포, 조직, 장기, 또는 유기체를 의미한다. 도입된 DNA 분자는 이 도입된 DNA 분자가 후속 자손에 의해 유전되도록 수용자 세포, 조직, 장기, 또는 유기체의 게놈 DNA에 통합된다. "형질전환" 또는 "형질전환"된 세포 또는 유기체는 또한 외래 DNA 분자의 존재로 인해 변경된 표현형을 나타내고 이종교배의 부모로서 이러한 형질전환 유기체를 이용하는 교배 프로그램으로 생산된 자손 및 세포 또는 유기체의 자손을 포함한다. 도입된 DNA 분자는 또한 이 도입된 DNA 분자가 후속 자손에 의해 유전되지 않도록 수용자 세포에 일시적으로 도입될 수 있다. 용어 "형질전환"은 1 이상의 이종성 DNA 분자를 함유하는 박테리아, 진균, 또는 식물을 의미한다.
DNA 분자를 식물 세포에 도입하기 위한 당분야의 숙련가에게 충분히 공지된 많은 방법들이 존재한다. 일반적으로 그 과정은 적합한 숙주 세포를 선택하는 단계, 숙주 세포를 벡터로 형질전환시키는 단계, 및 형질전환된 숙주 세포를 얻는 단계를 포함한다. 본 발명의 실시에서 작제물을 식물 게놈으로 도입시켜서 식물 세포를 형질전환시키는 방법 및 재료는 임의의 충분히 공지되고 입증된 방법을 포함할 수 있다. 적합한 방법은 제한 없이, 다른 것들 중에서도, 박테리아 감염(예를 들면, 아그로박테리움), 이원 BAC 벡터, DNA의 직접 전달(예를 들면, PEG-매개 형질전환, 건조/억제-매개 DNA 흡수, 전기천공, 탄화규소 섬유를 이용한 교반, 및 DNA 코팅 입자의 가속에 의함)을 포함한다.
숙주 세포는 임의의 세포 또는 유기체, 예컨대 식물 세포, 조류 세포, 조류, 진균 세포, 진균, 박테리아 세포, 또는 곤충 세포일 수 있다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포 및 형질전환된 세포는 농작물 유래의 세포를 포함할 수 있다.
이어서 형질전환 식물은 본 발명의 형질전환 식물로부터 재생될 수 있다. 통상의 교배 기법 또는 자가 수분을 이용해, 이러한 형질전환 식물로부터 종자를 생산할 수 있다. 이러한 종자, 및 이러한 종자로부터 성장된 최종 자손 식물은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하게 되고, 따라서 형질전환된다.
본 발명의 형질전환 식물은 자가 수분되어서 본 발명의 동형접합 형질전환 식물(재조합 DNA 분자에 대해 동형접합)에 대한 종자를 제공하거나 또는 비형질전환 식물 또는 상이한 형질전환 식물과 교배되어 본 발명의 이형접합 형질전환 식물(재조합 DNA 분자에 대해 이형접합)에 대한 종자를 제공할 수 있다. 이러한 동형접합 및 이형접합 형질전환 식물을 본 명세서에서 "자손 식물"이라고 한다. 자손 식물은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하고 본래 형질전환 식물에서 내려오는 형질전환 식물이다. 본 발명의 형질전환 식물을 이용해 생산한 종자를 수확하고, 본 발명의 작제물을 포함하고 작물학적 관심의 유전자를 발현하는, 형질전환 식물의 세대들, 즉 본 발명의 자손 식물을 성장시키는데 사용될 수 있다. 상이한 작물에 통용되는 교배 방법에 대한 설명은 몇몇 참조 도서 중 하나에서 확인할 수 있고, 예를 들면, 다음의 도서들을 참조한다: [Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960)]; [Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979)]; [Sneep and Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen(ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979)]; [Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987)]; [Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1)], 및 [Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987)].
형질전환된 식물은 관심 유전자 또는 유전자들의 존재 및 본 발명의 조절 성분이 부여하는 발현도 및/또는 프로파일에 대해 분석될 수 있다. 당분야의 숙련가는 형질전환된 식물의 분석을 위해 이용할 수 있는 수많은 방법을 알고 있다. 예를 들면, 식물 분석을 위한 방법은 제한 없이, 써던 블롯 또는 노던 블롯, PCR-기반 접근법, 생물화학적 분석법, 표현형 스크리닝 방법, 실증 시험, 및 면역진단 분석법을 포함한다. 전사가능한 DNA 분자의 발현은 태크맨(TaqMan)(등록상표)(어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems), 캘리포니아주의 포스터시티에 소재) 시약 및 제조자가 기술한 방법을 이용해 측정할 수 있고 PCR 주기 횟수는 태크맨(TaqMan)(등록상표) 시험 매트릭스를 이용해 결정하였다. 다르게, 인베이더(Invader)(등록상표)(써드 웨이브 테크놀로지즈사(Third Wave Technologies), 위스콘신주의 매디슨시에 소재) 시약 및 제조자가 기술한 방법을 이용해 이식유전자 발현을 평가할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 식물의 일부를 제공한다. 식물 일부는 제한 없이, 앞, 줄기, 뿌리, 덩이줄기, 종자, 내배유, 밑씨, 및 꽃가루를 포함한다. 본 발명의 식물 일부는 생육성, 비생육성, 재생성, 및/또는 비재생성일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 세포를 포함하고 이를 제공한다. 본 발명의 형질전환 또는 형질전환 식물 세포는 재생성 및/또는 비재생성 식물 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 또는 이의 일부로부터 생산된 농작물을 제공한다. 본 발명의 농작물은 서열번호 1 내지 37로 이루어진 군에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 DNA의 검출가능한 양을 함유한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "농작물"은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물, 종자, 식물 세포, 또는 식물 부분에서 유래된 재료로 구성되는 임의의 조성물 또는 생성물을 의미한다. 농작물은 제한 없이, 가공된 종자, 공물, 식물 부분, 및 곡식을 포함한다. 본 발명의 농작물은 본 발명의 재조합 DNA 분자에 상응하는 DNA의 검출가능한 양을 함유하게 된다. 샘플 내 이러한 DNA 중 1 이상의 검출은 농작물의 공급원 또는 함량을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 검출 방법을 포함하여, DNA 분자를 검출하는 임의의 표준 방법을 사용할 수 있다.
본 발명은 예시를 위해 제공되고, 특정하지 않으면, 본 발명을 제한하려는 의도가 아닌, 이하의 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 이하 실시예에 개시된 기술들은 본 발명의 실시에서 충분히 기능하는 것으로서 본 발명자가 발견한 기술을 나타내는 것으로 당분야의 숙련가는 이해해야 한다. 그러나, 당분야의 숙련가는, 본 명세서의 개시 관점에서, 개시된 특정 실시형태에 많은 변화를 가할 수 있고 본 발명의 사조 및 범주를 벗어나지 않고 비슷하거나 또는 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있으며, 따라서 수반된 도면에 기재하거나 또는 도시한 모든 내용은 제한된 의미가 아닌 예시로서 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1
조절 성분의 동정 및 클로닝
조절 발현 성분 그룹(EXP) 및 전사 종결 영역(3' UTR)은 쌍자엽 종 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)의 게놈 DNA로부터 동전하고 클로닝하였다(Barrel Medic). 메디카고 트룬카툴라 3' UTR의 선택은 부분적으로, 상동성 대두 유전자에서 관찰되는 발현 패턴을 기반으로 하였다.
메디카고 트룬카툴라 3' UTR의 동정 및 클로닝은 대두 조직 조사 및 등록 전사체 프로파일링 실험의 대두 유전자 발현 패턴을 기반으로 관심 대두 유전자의 선별로 시작하였다. 선택된 대두 유전자는 이어서 공중이 이용가능한 DNA 서열을 이용해 메디카고 트룬카툴라에서 상동성 유전자를 찾는데 사용하였다. 다음으로, 메디카고 트룬카툴라에서 유래된 조직 샘플은 상이한 환경 조건 하에서 성장된 식물에서 단리하였다. 이어서, 메신저 RNA(mRNA)는 메디카고 조직에서 단리하였고, 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR) 실험에 사용하여 메디카고 유전자의 발현 패턴을 결정하였다. 이러한 실험으로, 메디카고 트룬카툴라 게놈의 서브셋을 클로닝 및 특징규명을 위해 선택하였다.
공중 메디카고 트룬카툴라 서열 데이터를 이용하여, 생물정보학적 분석을 수행해, 선택된 메디카고 유전자 좌위 내에서 조절 성분을 동정하였다. 예를 들면, 생물정보학적 분석을 수행하여 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결 영역을 포함하는 3' UTR 서열 및 동정된 유전자 좌위의 말단으로 더욱 확장된 서열을 동정하였다. 이어서 증폭 프라이머를 디자인하고 동정된 조절 성분 DNA 단편, 예컨대 3' UTR DNA 단편, 프로모터, 리더 및 인트론을 포함하는 DNA 단편, 및 프로모터 및 리더를 포함하는 DNA 단편을 각각 증폭하는데 사용된다. 얻어진 DNA 단편은 베이스 식물 발현 벡터로 결찰시키고 서열분석하였다.
적용가능한 DNA 단편을 위해서, 조절 성분 전사 출발 부위(TSS) 및 인트론/엑손 스플라이싱 접합부의 분석은 이후 형질전환된 식물 프로토플라스트를 이용해 수행하였다. 이 분석에서, 프로토플라스트는 이종성의 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 클로닝된 DNA 단편을 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 다음으로, cDNA 말단의 신속 증폭을 위한 5' RACE 시스템, 버전 2.0(Invitrogen, Carlsbad, California 92008)을 사용해 생산된 mRNA 전사체의 DNA 서열을 분석하여 조절 성분 TSS 및 인트론/엑손 스플라이싱 접합부를 확인하였다.
동정된 3' UTR의 DNA 서열은 서열번호 1 내지 30으로 본 명세서에 제공하였다. 또한, 동정된 프로모터 DNA 서열은 서열번호 32 및 36으로서 본 명세서에 제공하였고, 동정된 리더 DNA 서열은 본 명세서에서 서열번호 33 및 37로서 제공하였으며, 동정된 인트론 DNA 서열은 서열번호 34로서 제공한다. 또한, 동정된 EXP의 DNA 서열은 본 명세서에서 서열번호 31 및 35로서 제공한다. 조절 발현 성분 그룹 EXP-Mt.Ubq2:1:2(서열번호 31)은 프로모터 성분, P-Mt.Ubq2-1:1:1(서열번호 32), 리더 성분 5'에 작동 가능하게 연결된, L-Mt.Ubq2-1:1:1(서열번호 33), 인트론 성분 5'에 작동 가능하게 연결된, I-Mt.Ubq2-1:1:2(서열번호 34)를 포함하고, 조절 발현 성분 그룹 EXP-Mt.AC145767v28:1:1(서열번호 35)은 프로모터 성분, P-Mt.AC145767v28-1:2:1(서열번호 36), 리더 성분 5'에 작동 가능하게 연결된, L-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 37)를 포함한다. 메디카고 트룬카툴라로부터 동정 및 클로닝된 DNA 서열 각각을 하기 표 1에 열거하였다.
실시예 2
대두잎 프로토플라스트에서 항상성 GUS 발현에 대한 3' UTR의 효과 분석
대두잎 프로토플라스트를 벡터, 구체적으로 플라스미드 작제물로 형질전환시키고, 선택된 메디카고 트룬카툴라 3' UTR의 발현에 대한 효과를 평가하였다. 대두잎 프로토플라스트는 메디카고 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 구동시키는 항상성 EXP 서열을 함유하는 DNA 벡터로 형질전환시켰다. 이들 메디카고 3' UTR-형질전환된 대두잎 프로토플라스트는 GUS 이식유전자의 발현이 항상성 프로모터에 의해 구동되고, GUS 이식유전자가 고시피움 힐서툼(Gossypium hirsutum) 또는 고시피움 바바덴스(Gossypium barbadense) 유래의 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 대두잎 프로토플라스트와 비교하였다.
이들 실험에서 이용된 식물 벡터는 당분야에 공지된 클로닝 방법을 이용해 구축하였다. 최종적인 벡터는 에이. 투머파시언스 유래의 잎 경계 영역; 제초제 글리포세이트 또는 항생제 스펙티노마이신(둘 모두 아라비돕시스 액틴 7 프로모터에 의해 구동됨)에 대한 저항성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선별을 위한 제1 이식유전자 발현 카세트; 메디카고 트룬카툴라, 고시피움 힐서툼, 또는 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR의 5'에 작동 가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 GUS에 대한 DNA 서열(GUS-2, 서열번호 44)의 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열 또는 EXP를 포함하는, 3' UTR의 활성을 평가하는데 사용되는 제2 이식유전자 발현 카세트; 및 에이. 투머파시엔스 유래의 우측 경계 영역을 포함한다. 메디카고에서 유래된 3' UTR을 포함하는 벡터(즉, pMON109593, pMON116803, pMON116812, pMON116813, pMON116815, pMON116826, pMON116827, pMON116830, pMON122852, pMON122853, pMON122854, pMON122855, pMON122856, pMON122857, pMON122858, pMON122859, pMON122862, pMON122864, pMON122865, pMON122866, pMON122867, 및 pMON122868)는 GUS를 구동하기 위해서 항상성 조절 발현 성분 그룹 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42)을 이용하였다. 고시피움 힐서툼 또는 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR을 포함하는 벡터(즉, pMON81345, pMON81347 및 pMON83002)는 GUS를 구동하기 위해 항상성 프로모터 P-CaMV.35S-enh-1:1:11(서열번호 43)를 사용하였다.
표 2는 본 실시예에서 제시된 실험에서 대두를 형질전환하는데 사용된 상응하는 3' UTR 및 서열번호와 플라스미드 작제물을 제공한다.
공형질전환 및 데이터의 정규화에 사용되는, 2종의 식물 벡터, 구체적으로 플라스미드 작제물을 또한 당분야에 공지된 클로닝 방법을 이용해 구축하였다. 이들 각 플라스미드 작제물은 항상성 EXP에 의해 구동된 특이적 루시퍼라제 코딩 서열을 함유하였다. 식물 벡터 pMON19437은 인트론(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, 서열번호 47)의 5'에 작동 가능하게 연결되고, 반딧불이(포티너스 피랄리스) 루시퍼라제 코딩 서열(LUCIFERASE:1:3, 서열번호 45)의 5'에 작동 가능하게 연결되고, 아그로박테리움 투머파시엔서 노팔린 신타제 유전자(T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열번호 49)로부터의 5'에서 3' UTR로 작동 가능하게 연결된 리더 서열의 5' 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 항상성 EXP를 갖는 발현 카세트를 포함한다. 식물 벡터 pMON63934는 리더 서열(EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1, 서열번호 48)의 5'에 작동 가능하게 연결되고, 바다 팬지(레닐라 레니포르미스) 루시퍼라제 코딩 서열(CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, 서열번호 46)의 5'에 작동 가능하게 연결되고, 아그로박테리움 투머파시엔스 노팔린 신타제 유전자(T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열번호 49) 유래의 3' UTR의 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 항상성 EXP 서열을 갖는 발현 카세트를 포함한다.
대두잎 프로토플라스트는 당분야에 잘 알려진 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-기반 형질전환 방법을 이용해 형질전환시킨다. 각 프로토플라스트 세포는 pMON19437 플라스미드 작제물, pMON63934 플라스미드 작제물, 표 2에 제시된 플라스미드 작제물 중 하나로 형질전환된다. 형질전환 후, 형질전환된 대두잎 프로토플라스트는 밤새 암흑에서 항온반응시켰다. 다음으로, GUS 및 루시퍼라제의 측정은 형질전환된 세포의 용해된 조제물의 분취액을 2가지 상이한 소형-웰 트레이에 위치시켜 수행하였다. 한 트레이는 GUS 측정에 사용하였고, 제2 트레이는 이중 루시퍼라제 리포터 검정 시스템을 이용하여 이중 루시퍼라제 검정을 수행하는데 사용하였다(프로메가사(Promega Corp.), 위스콘신주의 매디슨시에 소재; 예컨대, 문헌[Promega Notes Magazine, NO: 57, 1996, p.02] 참조).
1 또는 2 형질전환을 표 2에 나타낸 각 플라스미드 작제물에 대해 수행하였다. 각 3' UTR에 대한 평균 발현값은 각 형질전환 유래의 몇몇 샘플로부터 결정하였다. 샘플 측정은 각 플라스미드 작제물 형질전환의 4 복제물, 또는 다르게는 2 형질전환 실험 중 하나 당 각 플라스미드 작제물의 3 복제물을 이용해 실시하였다. 평균 GUS 및 루시퍼라제 발현도는 표 3에 제공하였다. 이 표에서, 반딧불이 루시퍼라제 값(예를 들면, pMON19437의 발현 유래)은 "Fluc"로 표지된 컬럼에 제공하였고, 바다 팬지 루시퍼라제 값(예를 들면, pMON63934의 발현 유래)은 "RLuc"로 표지된 컬럼에 제공하였다.
또한, 각 3' UTR의 상대적인 활성을 비교하기 위해서, GUS 값은 GUS 대 루시퍼라제 활성의 비율로서 표시하였고 최고 발현되는 메디카고 이외의 3'UTR, 즉 T-Gb.FbL2-1:1:1(서열번호 41)에 대해 정규화하였다. 표 4는 GUS/루시퍼라제 비율 및 정규화된 비율을 나타낸다. 다시, 이 표에서, 반딧불이 루시퍼라제 값은 "FLuc"로 표지하였고 바다 팬지 루시퍼라제 값은 "Luc"로 표지하였다.
표 4에서 입증한 바와 같이, GUS 발현은 고시피움 힐서툼 또는 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR과 비교하여 모든 선택된 메디카고 3' UTR을 사용해 상승되었다. 예를 들면, GUS의 발현은 고시피움 힐서툼 또는 고시피움 바바덴스에서 유래된 것의 최고 발현 3'UTR인, T-Gb.FbL2-1:1:1에 대해 정규화된 GUS/FLuc 비율을 기반으로 메디카고-유래된 3' UTR을 이용해 2.1배 내지 18.3배 높았다. 유사하게, GUS의 발현은 T-Gb.FbL2-1:1:1에 대해 정규화된 GUS/RLuc 비율을 기반으로 메디카고-유래된 3' UTR을 이용해 1.61배 내지 10.48배 높았다.
실시예 3
안정하게 형질전환된 대두 식물에서 항상성 GUS 발현에 대한 3' UTR의 효과 분석
대두 식물은 벡터, 구체적으로 플라스미드 작제물로 형질전환시켜서, 발현에 대한 선택된 메디카고 트룬카툴라 3' UTR의 효과를 평가하였다. 구체적으로, 대두 식물은 메디카고 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 구동하는 항상성 EXP 서열을 함유하는 벡터로 형질전환시켰다. 이들 메디카고 3' UTR-형질전환된 대두 식물은 GUS 이식유전자의 발현이 항상성 프로모터에 의해 구동되고, GUS 이식유전자가 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR에 작동 가능하게 연결된, 형질전환된 대두 식물과 비교하였다.
이들 실험에서 사용되는 식물 벡터는 당분야에 공지된 클로닝 방법을 이용해 구축하였다. 최종 벡터는 에이. 투머파시엔스 유래 좌측 경계 영역; 항생제 스펙티노마이신(아라비돕시스 액틴 7 프로모터)에 대한 저항성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선별을 위한 제1 이식유전자 발현 카세트; 메디카고 트룬카툴라 또는 고시피움 바바덴스에서 유래된 3'UTR의 5'에 작동 가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 GUS에 대한 코딩 서열(GUS-2, 서열번호 44)의 5'에 작동 가능하게 연결된 조절 발현 성분 그룹 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42)을 포함하는, 3' UTR의 활성을 평가하는데 사용되는 제2 이식유전자 발현 카세트; 및 에이. 투머파시엔스 유래 우측 경계 영역을 포함한다. 메디카고에서 유래된 3' UTR을 포함하는 벡터는 pMON109593, pMON116803, pMON116812, pMON116813, pMON116815, pMON116826, pMON116827, pMON116830, pMON122850, pMON122851, pMON122852, pMON122853, pMON122854, pMON122855, pMON122856, pMON122857, pMON122858, pMON122859, pMON122861, pMON122862, pMON122863, pMON122864, pMON122865, pMON122866, pMON122867, 및 pMON122868이었다. 고시피움 바바덴스 유래의 3' UTR을 포함하는 벡터는 pMON102167이었다.
표 5는 이 실시예에서 제시한 실험에서 대두 식물을 형질전환시키는데 사용되는 상응하는 3' UTR 및 서열번호를 갖는 플라스미드 작제물을 제공한다.
대두 식물은 당분야에 공지된 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용해 형질전환시켰다. GUS의 발현은 선택된 조직의 조직학적 섹션법을 이용해 정성적으로 분석하였다. 조직화학 GUS 분석을 위해서, 전체 조직 섹션을 적절한 시간 기간 동안 GUS 염색 용액 X-Gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-글루쿠로니드)(1 mg/mL)과 함께 항온반응시키고, 세정하고, 시각적으로 파란색 착색에 대해 검사하였다. GUS 활성은 선택된 식물 장기 및 조직을 이용해 현미경 하 검사 및 직접 육안 검사를 통해 정성적으로 결정하였다. R0 세대 식물은 Vn5 뿌리, Vn5 침하 잎, Vn5 근원 잎, R1 근원 잎, R1 잎자루, R1 꽃, 노란색 꼬투리 배아(대략 R8 발육기), 노란색 꼬투리 자엽(대략 R8 발육기), R3 미성숙 종자, R3 꼬투리, 및 R5 자엽에서의 발현에 대해 검사하였다.
표 6-13에서 입증된 대로, 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR을 포함하는, pMON102167에 의해 부여된 발현에 대한 GUS 발현의 양적 변화를 또한 분석하였다. 이러한 양적 분석을 위해서, 전체 단백질을 형질전환된 식물의 선택 조직에서 추출하였다. 총 단백질의 1 마이크로그램은 50 ㎕의 전체 반응 부피로 형광원 기질 4-메틸레움벨리펄리-β-D-글루쿠로니드(MUG)와 함께 사용하였다. 반응 산물, 4-메틸움벨리페론(4-MU)은 히드록실 기가 이온화되는, 높은 pH에서 최대로 형광발광한다. 탄산나트륨의 염기 용액의 부가는 동시에 검정을 중지시켰고 형광발광 산물을 정량하기 위한 pH로 조정하였다. 형광발광은 슬릿 너비가 여기 2 nm, 발광 3 nm로 설정된, Micromax 리더가 구비된 Fluoromax-3(Horiba; Kyoto, Japan)를 이용해 365 nm에서 여기, 445 nm에서 발광으로 측정하였다.
표 6 및 7은 R0 세대 식물 조직에서 측정된 평균 정량 발현도를 보여준다. 분석하지 않은 조직은 양쪽 표에서 빈 칸으로 보여진다.
표 6 및 표 7에서 입증한 바와 같이, 동일한 EXP에 의해 구동된 발현은 고시피움 바바덴스-구동된 3' UTR과 비교 시 상이한 메디카고 3' UTR을 포함하는 안정하게 형질전환된 대두 식물의 조직에서 뚜렷히 구별되었다.
표 8 및 표 9는 고시피움 바바덴스-구동된 3' UTR과 비교 시 상이한 메디카고 3' UTR을 포함하는 안정하게 형질전환된 대두 식물의 조직에서 발현 배수 차이를 보여준다.
표 8 및 9에서 입증한 바와 같이, 상이한 메디카고 3' UTR을 포함하는 형질전환된 대두 식물의 조직에서 발현은 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR을 포함하는, pMON102167로 형질전환된 대두 식물의 것과 비교 시 뚜렷이 구별되었다. 예를 들면, 2종의 메디카고 3' UTR, T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1) 및 T-Mt.Lox-1-1:2:1(서열번호 14)은 전체 조직에 걸쳐서, 항상성 EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42)의 발현 상승을 야기하였다. 다른 메디카고 3' UTR은 일부 조직에서 항상성 EXP의 상승된 발현을 제공하는 한편, 다른 것들에서는 발현이 감소되었다. 예를 들면, 3'UTR T-Mt.Sali3-2-1:2:1(서열번호 26)은 Vn5 뿌리, Vn5 침하 잎, Vn5 근원 잎, R1 근원 잎, 노란색 꼬투리 배아 및 노란색 꼬투리 자엽에서 2.19배 내지 8.05배 증가된 발현을 제공하는 한편, R1 꽃 및 R5 자엽에서는 발현이 감소되었다. 또한, 3' UTR T-Mt.AC140914v20-1:2:1(서열번호 2)은 Vn5 뿌리, Vn5 침하 잎, Vn5 근원 잎, 노란색 꼬투리 배아, 노란색 꼬투리 자엽, R3 미성숙 종자, 및 R5 자엽에서 발현의 1.88배 내지 4.12배 증가를 제공하는 반면, R1 근원 잎, R1 꽃에서 발현이 감소되었고, R3 꼬투리에서는 발현이 비교적 동일하게 유지되었다. 또한, 3'UTR T-Mt.Oxr-1:2:1(서열번호 17)은 Vn5 뿌리, Vn5 침하 잎, Vn5 근원 잎, R1 근원 잎, 노란색 꼬투리 배아, 노란색 꼬투리 자엽, 및 R3 꼬투리에서 발현의 2.19배 내지 10.90배 증가를 제공하는 한편, R1 꽃 및 R5 자엽에서 발현이 감소하였고, R3 미성숙 종자에서는 발현이 비교적 동일하게 유지되었다.
상이한 메디카고 3' UTR을 포함하는 형질전환된 대두 식물의 일부를 R1 세대로 취하였다. 표 10 및 11은 검정한 조식의 평균 GUS 발현값을 보여준다. 표 12 및 13은 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR에 대한 발현에서의 배수 차이를 보여준다.
표 10 및 표 11에서 입증된 바와 같이, 동일한 EXP에 의해 구동된 발현은 고시피움 바바덴스-구동된 3' UTR과 비교 시 상이한 메디카고 3' UTR을 포함하는 안정하게 형질전환된 대두 식물의 조직에서 뚜렷이 구분되었다. 표 12 및 표 13은 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR을 포함하는, pMON102167로 형질전환된 조직에 비해 상이한 메디카고 3' UTR을 포함하는 안정하게 형질전환된 대두 식물의 조직에서 발현 배수 차이를 보여준다.
표 12 및 표 13에서 입증한 바와 같이, 몇몇 메디카고 3' UTR은 R1 세대에서 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR을 포함하는, pMON102167로 형질전환된 식물에 비해서, 항상성 EXP 성분, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42)의 발현을 상승시켰다. 예를 들면, 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1)은 검정한 모든 조직에서 GUS 발현의 3.10배 내지 21.65배 상승을 제공하였다. 3'UTR T-Mt.Sali3-2-1:2:1(서열번호 26)은 검정한 모든 조직에서 GUS 발현의 1.52배 내지 8.90배 상승을 제공하였다. 3' UTR T-Mt.Oxr-1:2:1(서열번호 17)은 대부분의 조직에서 상승을 제공하였지만, T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40)로 형질전환된 식물에 비해 R3 미성숙 종자에서 발현은 감소되었다.
전술한 실험은 메디카고 트룬카툴라 유래된 3'UTR 성분이 선택된 특이적 3' UTR에 의존적으로 상이한 방식으로 항상성 EXP 성분 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42)의 발현에 영향을 미침을 입증하였다. 많은 경우에서, 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR을 포함하는, pMON102167로 형질전환된 식물에 비해 메디카고 3' UTR을 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물의 일정 조직에서 발현의 상승이 존재하였다. 그러나, 상승 효과는 모든 식물 조직에서 보이지 않았고, 많은 경우에서, 발현은 일부 조직에서 약화되었고, 메디카고 3' UTR을 사용한 다른 것들에서 상승되었다. 따라서, 선택된 메디카고 3' UTR의 사용은 특정한 이식유전자의 발현 프로파일을 "미세 조율"하는 것을 가능하게 하고, 특별한 조직에서 최적 발현을 제공하는 한편, 특별한 전사가능한 DNA 분자에 대해 덜 바람직한 조직에서는 발현을 감소시키도록, 전사가능한 DNA 분자와 작동 가능하게 연결된, 다른 발현 성분, 예컨대 프로모터, 리더 및 인트론과 조합하여 사용될 수 있다.
실시예 4
안정하게 형질전환된 대두 식물에서 종자 선호된 GUS 발현에 대한 3' UTR의 효과의 분석
대두 식물은 발현에 대한 선택된 메디카고 3' UTR의 효과를 평가하기 위해, 벡터, 구체적으로 플라스미드 작제물로 형질전환시켰다. 구체적으로, 대두 식물은 메디카고 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 구동하는 EXP 서열을 발현하는 종자를 함유하는 DNA 벡터로 형질전환시켰다. 이들 메디카고 3'UTR-형질전환된 대두 식물은 GUS 이식유전자의 발현이 EXP 서열을 발현하는 종자에 의해 구동되고 GUS 이식유전자가 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 형질전환된 대두 식물과 비교하였다.
이들 실험에서 이용되는 식물 벡터는 당분야에 공지된 클로닝 방법을 이용해 구축하였다. 최종 벡터는 에이.투머파시엔스 유래 좌측 경계 영역; 항생제 스펙티노마이신(아라비돕시스 액틴 7 프로모터에 의해 구동됨)에 대한 저항성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선별을 위한 제1 이식유전자 발현 카세트; 메디카고 트룬카툴라 또는 고시피움 바바덴스에서 유래된 3'UTR의 5'에 작동 가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 GUS에 대한 코딩 서열(GUS-2, 서열번호 44)의 5'에 작동 가능하게 연결된, 종자 선호 발현을 제공하는, EXP 성분, EXP-Gm.Sphas1:1:1(서열번호 50)을 포함하는, 3' UTR의 활성을 평가하는데 사용되는 제2 이식유전자 발현 카세트; 및 에이. 투머파시엔스 유래 우측 경계 영역을 포함한다. 메디카고에서 유래된 3' UTR을 포함하는 식물 발현 벡터는 pMON116832, pMON116834, pMON116835, pMON116841, pMON122869, pMON122870, pMON122871, pMON122872, pMON122873, pMON122874, pMON122875, pMON122876, pMON122878, pMON122879, pMON122880, pMON122881, pMON122882, pMON122883, pMON122885, pMON122887, pMON122888, 및 pMON126122였다. 고시피움 바바덴스 유래 3' UTR을 포함하는 벡터는 pMON83028였다.
표 14는 플라스미드 작제물과 상응하는 3' UTR, 서열번호, 및 정량 검정 데이터를 제공하는 세대를 제공한다.
대두 식물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 형질전환되어 GUS 검정되었다. 표 15 및 16은 안정하게 형질전환된 대두 식물의 R0 세대에 대한 정량적인 평균 GUS 값을 제공한다.
표 15 및 표 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대부분의 메디카고 3' UTR은 R1 근원 잎, R1 잎자루, 및 R1 꽃에서 GUS 발현을 상승시키는, T-Mt.Apx-1:1:2(서열번호 5)를 제외하고, 오직 종자-유래된 조직에서, 종자 선호 EXP 성분, EXP-Gm.Sphas1:1:1(서열번호 50)의 발현에 영향을 미친다. 몇몇 메디카고 3'UTR, 예컨대 T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1), T-Mt.RD22-1:2:1(서열번호 24), 및 T-Mt.AC153125V10-1:2:1(서열번호 4)은 노란색 꼬투리 배아 및 노란색 꼬투리 자엽에서 높은 발현을 제공하였다. 따라서, 이들 3' UTR은 종자 발육 후기 동안 종자 프로모터의 발현을 상승시키는데 이상적일 수 있다. 3' UTR T-Mt.Expr1-1:2:1(서열번호 7)은 많은 다른 3' UTR에 비하여 R5 자엽 및 노란색 꼬투리 자엽 둘 모두에서 높은 발현을 제공하고, 따라서 종자 발육의 보다 넓은 창을 위해 높은 자엽 발현을 제공하는데 유용할 수 있다. 일부 경우에서, 3' UTR은, 예컨대 T-Mt.FBA-1:2:1(서열번호 9), T-Mt.Zfp-1:2:1(서열번호 30), T-Mt.Pip1-1:2:1(서열번호 18), 및 T-Mt.Pt2-1:2:2 (서열번호 23)를 사용하는 경우, 노란색 꼬투리 배아 및 노란색 꼬투리 자엽 둘 모두에서 보다 균일한 종자 발현도를 제공하였다.
T-Mt.Zfp-1:2:1(서열번호 30), T-Mt.Apx-1:1:2(서열번호 5), T-Mt.Sui1-1:1:2(서열번호 29), 및 T-Mt.EF1a-1:1:2(서열번호 6)를 포함하는 R0 세대는 종자를 설정하는 것을 가능하게 하였고 R1 세대 실험을 위해서 심었다. 표 17은 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40)을 포함하는, pMON83028로 형질전환된 식물 및 메디카고 3' UTR을 포함하는 이들 R1 세대 식물을 포함하는 사건에 대한 평균 정량 검정 데이터의 비교를 보여준다.
표 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 메디카고 3' UTR은 배아 및 자엽 조직에서 T-Gb.E6-3b:1:1와는 상이하게 발현에 영향을 미쳤다. 예를 들면, T-Mt.Apx-1:1:2(서열번호 5) 및 T-Mt.Sui1-1:1:2(서열번호 29)는 T-Gb.E6-3b:1:1에 비하여 노란색 꼬투리 배아, 노란색 꼬투리 자엽, 및 R5 자엽에서 종자 선호 EXP 성분의 발현을 상승시켰다. T-Mt.EF1a-1:1:2(서열번호 6)는 노란색 꼬투리 배아 및 노란색 꼬투리 자엽에서 발현을 상승시켰지만, R5 자엽에서는 그렇지 않았다. T-Mt.Zfp-1:2:1(서열번호 30)은 후기 발육되는 노란색 꼬투리 배아 및 노란색 꼬투리 자엽에서 발현을 감소시켰지만, R5 자엽에서 발현을 상승시켰다.
따라서, 각각의 상이한 메디카고 3' UTR은 종자 선호 프로모터와 작동 가능하게 연결시 발육되는 종자에서 차별적으로 발현에 영향을 미쳤다. 이러한 발현에 대한 효과 차이는 종자 발현에 대해 보다 정제되고 재단된 접근법을 제공하고, 종자 발현이 바람직한 특별한 전사가능한 DNA의 발현 프로파일을 "미세 조율"하는데 이상적으로 적합할 수 있다.
실시예 5
안정하게 형질전환된 대두 식물에서 항상성 GUS 발현에 대한 3' UTR의 효과의 분석
대두 식물은 선택된 메디카고 트룬카툴라 3' UTR의 발현에 대한 효과를 평가하기 위해, 벡터, 구체적으로 플라스미드 작제물로 형질전환시켰다. 구체적으로, 대두 식물은 메디카고 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 구동하는 항상성 발현 프로파일을 나타내는 2종의 상이한 EXP 성분을 함유하는 벡터로 형질전환시켰다. 이들 메디카고 3' UTR-형질전환된 식물은 GUS 이식유전자의 발현이 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 형질전환된 대두 식물과 비교하였다.
이들 실험에서 이용된 식물 벡터는 당분야의 공지된 클로닝 방법을 이용해 구축하였다. 이들 최종적인 벡터는 에이. 투머파시엔스 유래 좌측 경계 영역; 항생제 스펙티노마이신(아라비돕시스 액틴 7 프로모터에 의해 구동)에 대한 저항성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선별을 위한 제1 이식유전자 발현 카세트; 메디카고 트룬카툴라 또는 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR의 5'에 작동 가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 GUS에 대한 코딩 서열(GUS-2, 서열번호 44)의 5'에 작동 가능하게 연결된, EXP 성분 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42) 또는 EXP-DaMV.FLT:1:2(서열번호 51)를 포함하는, 3' UTR의 활성을 평가하는데 사용되는 제2 이식유전자 발현 카세트; 및 에이.투머파시엔서 유래 우측 경계 영역을 포함한다. 메디카고로부터 유래된 3' UTR을 포함하는 벡터는 pMON118768, pMON153701 및 pMON116803이었다. 고시피움 바바덴스 유래 3' UTR을 포함하는 벡터는 pMON121042 및 pMON102167이었다.
표 18은 이 실시예에서 제시한 대두 식물을 형질전환시키는데 사용된 플라스미드 작제물과 상응하는 EXP 성분, 3' UTR 및 서열번호를 제공한다.
식물은 실시예 3에서 기술한 대로 형질전환시키고 GUS 검정하였다. 표 19 및 20은 안정하게 형질전환된 대두 식물의 R0 세대에 대한 정량적인 평균 GUS 값을 제공한다.
표 19 및 표 20에서 입증한 바와 같이, 메디카고 3' UTR T-Mt.Sali3-2-1:2:1(서열번호 26) 및 T-Mt.AC140914v20-1:2:1(서열번호 2)은 고시피움 바바덴스-유래된 3' UTR T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40)과는 다르게 항상성 EXP 성분 EXP-DaMV.FLT:1:2(서열번호 51)의 발현에 영향을 미쳤다. 많은 채취된 조직에서, 메디카고 3' UTR을 이용하여 발현의 상승이 존재하였다. 3' UTR T-Mt.AC140914v20-1:2:1에 대해서, 상승은 역시 EXP 성분 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42)을 포함하는 식물의 대부분의 조직에서 확인되었다. 표 21 및 22는 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR을 포함하는, pMON121042 (T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40))에 의해 부여된 발현에 대한 정량적 GUS 발현의 배수 차이를 보여준다.
전술한 실험은 각각의 메디카고 3' UTR이 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR을 포함하는, pMON121042 (T-Gb.E6-3b:1:1 (서열번호 40))에 비해서 각각의 항상성 EXP 성분의 발현도에 대해 상이한 효과를 가짐을 입증하였다. 예를 들면, EXP-DaMV.FLT:1:2의 발현은 Vn5 뿌리, Vn5 침하 잎, Vn5 근원 잎, R1 근원 잎, R1 잎자루, R1 꽃, 노란색 꼬투리 배아, 노란색 꼬투리 자엽, R3 꼬투리, 및 R5 자엽에서 1.14배 내지 15.13배 상승하였지만, T-Mt.Sali3-2-1:2:1을 이용한 R3 미성숙 종자에서는 감소하였다. T-Mt.AC140914v20-1:2:1와 조합시, 동일한 EXP 성분은 Vn5 뿌리, Vn5 근원 잎, R1 근원 잎, R1 잎자루, R1 꽃, 노란색 꼬투리 배아, 노란색 꼬투리 자엽, R3 미성숙 종자, R3 꼬투리, 및 R5 자엽에서 1.34배 내지 13.42배 상승을 야기하였지만, V5 침하 잎에서는 T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40)과 동일하게 남았다. 노란색 꼬투리 배아에서의 발현은, T-Mt.Sali3-2-1:2:1를 사용시 노란색 꼬투리 자엽의 약 2배(15.13배 대 7.23배 상승)였는데 반해, 이들 2 조직에서의 발현은 T-Mt.AC140914v20-1:2:1를 사용시 비교적 동일하였다(9.19배 대 9.13배 상승). EXP 성분 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3에 대해, T-Mt.AC140914v20-1:2:1과의 이 동일한 3' UTR을 EXP-DaMV.FLT:1:2와 조합한 경우에 비해 많은 샘플 조직에서 상승이 덜 야기되었다. R1 꽃에서, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3을 T-Mt.AC140914v20-1:2:1과 조합한 경우 T-Gb.E6-3b:1:1에 비해 발현이 감소되었다. EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3과 T-Mt.Sali3-2-1:2:1의 조합은 Vn5 뿌리, Vn5 침하 잎, Vn5 근원 잎, R1 근원 잎, 노란색 꼬투리 배아, 및 노란색 꼬투리 자엽에서 상승을 제공하였지만, T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40)에 비해 R1 꽃 및 R5 자엽에서 발현은 감소하였다.
각각의 2종의 메디카고 3' UTR, T-Mt.Sali3-2-1:2:1 및 T-Mt.AC140914v20-1:2:1은 2종의 상이한 항상성 EXP 성분, EXP-DaMV.FLT:1:2 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3의 발현에 차등적으로 영향을 미쳤다. 많은 조직에서, T-Gb.E6-3b:1:1 (서열번호 40)에 비해 발현이 상승되었지만, 일부 조직에서, 발현의 감소가 일어났다. 따라서, 상이한 메디카고 3' UTR을 이용하여, 식물에서 발현을 보다 정밀하게 제어할 수 있고 전사가능한 DNa 분자의 발현이 요구되는 경우 최적의 발현을 제공하는 한편, 음성적으로 식물에 영향을 줄 수 있는 조직에서 발현을 감소시키도록 특별한 전사가능한 DNA 분자의 발현을 보다 양호하게 "미세 조율"할 수 있다.
실시예 6
메디카고 트룬카툴라 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2는 안정하게 형질전환된 대두 식물에서 많은 상이한 ExP 성분과 조합시 GUS 발현의 상승을 야기한다.
대두 식물은 벡터, 구체적으로 플라스미드 작제물로 형질전환시키고, 발현에 대한 메디카고 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1)의 효과를 평가하였다. 구체적으로, 대두 식물은 메디카고 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1)에 작동 가능하게 연결된 β-글루쿠로니다제(GUS)의 발현을 구동하는 항상성 발현 프로파일로 몇몇 상이한 EXP를 함유하는 벡터로 형질전환시켰다. 이들 메디카고 3' UTR-형질전환된 대두 식물은 GUS 이식유전자가 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 형질전환된 대두 식물과 비교하였다.
이들 실험에서 이용된 벡터는 당분야에 공지된 클로닝 방법을 이용해 구축하였다. 최종적인 벡터는 에이.투머파시엔스 유래 좌측 경계 영역; 항생제 스펙티노마이신(아라비돕시스 액틴 7 프로모터에 의해 구동)에 대한 저항성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선별을 위한 제1 이식유전자 발현 카세트; 메디카고 트룬카툴라에서 유래된 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1), 또는 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40) 또는 T-Gb.FbL2-1:1:1(서열번호 41)의 5'에 작동 가능하게 연결된 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 GUS에 대한 코딩 서열(GUS-2, 서열번호 44)의 5'에 작동 가능하게 연결된, EXP 성분, EXP-Mt.AC145767v28:1:1(서열번호 35), EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42), EXP-BSAcVNV.FLT:1:2(서열번호 52), EXP-CERV.FLT:1:2(서열번호 53), EXP-DaMV.FLT:1:2(서열번호 51), EXP-CUCme.eEF1a:1:1(서열번호 54), 또는 EXP-Mt.Ubq2:1:2(서열번호 31)을 포함하는, 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1)의 활성을 평가하기 위해 사용되는 제2 이식유전자 발현 카세트; 및 에이.누커파시엔스 유래 우측 경계 영역을 포함한다. T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1)를 포함하는 벡터는 pMON118798, pMON116815, pMON118769, pMON153709, pMON118771, pMON153707, 및 pMON155502였다. 특히, 벡터 pMON118798은 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1)와 동일한 유전자 좌위로부터 클로닝된 리더 성분에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 천연 EXP-Mt.AC145767v28:1:1을 포함한다. 고시피움 바바덴스 유래 3' UTR을 포함하는 벡터는 pMON102167, pMON113874, pMON121030, pMON121042, pMON140827, 및 pMON125841이었다.
표 23은 이 실시예에서 제시된 대두 식물을 형질전환시키는데 사용된 플라스미드 작제물과 상응하는 EXP 성분, 3'UTR, 및 서열번호를 제공한다.
대두 식물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 형질전환시키고 GUS 검정하였다. 표 24 및 25는 안정하게 형질전환된 대두 식물의 R0 세대에 대한 정량적 평균 GUS 값을 제공한다. "bdl"로 표시된 표의 칸은 정량적으로 분석하였지만, 발현이 검출 수준 이하인 조직을 의미한다. 표 26 및 27은 T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40)에 대해 T-Mt.AC145767v28-1:1:2에 작동 가능하게 연결된 각 EXP 성분의 발현에서 배수 변화를 제공한다.
표 24 및 표 25에서 입증된 바와 같이, 메디카고 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1)는 T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40)에 비해 6종의 항상성 EXP 성분의 발현을 증가시켰지만, 특별한 EXP 및 조직에 의존적인 상이한 방식이었다. EXP 성분, EXP-Mt.AC145767v28:1:1은 GUS를 구동시키는데 사용되고 그의 천연 3'UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2에 작동 가능하게 연결시 검정한 모든 조직에서 매우 낮게 발현되었고, R3 미성숙 종자, R3 꼬투리, 및 R1 꽃에서 미검출되었다. EXP 성분 EXP-Mt.Ubq2:1:2 및 3'UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2을 포함하는 식물의 일부 조직은 EXP-Mt.Ubq2:1:2 및 T-Gb.FbL2-1:1:1의 조합에 비해서 감소된 발현을 보였다. 이러한 감소된 발현은 R3 미성숙 종자, R1 꽃, 및 R1 잎자루에서 확인되었고, 반면 대조적으로, Vn5 침하 잎 및 R5 자엽에서 발현은 4배보다 높게 상승되었다. EXP-Mt.Ubq2:1:2 및 3'UTR로는 뿌리 발현(Vn5 뿌리)의 변화가 없었다.
조절 발현 성분 그룹 EXP-CERV.FLT:1:2 및 EXP-DaMV.FLT:1:2는 최고 발현도를 제공하였다. 표 26 및 표 ㅠ27에서 입증된 바와 같이, 이들 2종의 EXP는 T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40)와 조합된 동일한 EXP에 비해서 T-Mt.AC145767v28-1:1:2를 갖는 모든 조직에서 상승되었다. 조절 발현 성분 그룹 EXP-CERV.FLT:1:2은 노란색 꼬투리 자엽을 발육시키는데서 60.50배 상승되었고 노란색 꼬투리 배아에서는 덜 상승(21.50배)된 반면, 조절 발현 성분 그룹 EXP-DaMV.FLT:1:2은 노란색 꼬투리 자엽에서 보다 노란색 꼬투리 배아에서 보다 높은 정도로 상승되었다(각각, 26.80배 대 15.76배 상승). 이들 발현 및 상승 차이는 후기 발육 종자에서 이식유전자의 재단된 발현을 제공하는 기회를 부여한다. 조절 발현 성분 그룹 EXP-BSAcVNV.FLT:1:2은 T-Gb.E6-3b:1:1와 조합시 R3 꼬투리 및 Vn5 뿌리에서 최고로 발현하였다(표 25 및 26 참조). 이들 2 조직에서 EXP-BSAcVNV.FLT:1:2의 발현은 T-Mt.AC145767v28-1:1:2와 조합시, 특히 Vn5 뿌리에서 극적으로 상승하였다. 또한, EXP-BSAcVNV.FLT:1:2의 발현은 T-Gb.E6-3b:1:19(서열번호 40)와 조합된 동일한 EXP에 비하여 T-Mt.AC145767v28-1:1:2와 조합시 58.63배 상승되었다.
요컨대, 메디카고 트룬카툴라 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1)는 식물 및 식물 바이러스 게놈 DNA 둘 모두로부터 유래된 6종의 다른 항상성 EXP 성분의 발현을 상승시켰다. 또한, 이 3' UTR은 종자-선호 EXP 성분 EXP-Gm.Sphas1:1:1(서열번호 54)의 발현을 대부분의 다른 메디카고 유래 3' UTR에 비해 상승시켰다. 따라서, 이러한 3' UTR은 작제물내 작동 가능하게 연결된 발현 성분의 조합 또는 프로모터의 상승된 발현을 제공하는데 적합하다.
실시예 7
안정하게 형질전환된 대두 식물에서 EXP-Mt.Ubq2:1:2(서열번호 31)의 분석
대두 식물은 GUS 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 항상성 조절 발현 성분 그룹 EXP-Mt.Ubq2:1:2(서열번호 31)을 포함하는 벡터, 구체적으로 플라스미드 작제물로 형질전환되었다. 이들 형질전환된 식물을 이어 안정하게 형질전환된 대두 식물에서의 GUS 발현에 대해 검정하였다.
이들 실험에서 이용한 식물 벡터는 당분야에 공지된 클로닝 방법을 이용해 구축하였다. 최종 벡터는 에이.투머파시엔스 유래의 좌측 경계 영역; 항생제 스펙티노마이신에 대한 저항성(아라비돕시스 액틴 7 프로모터에 의해 구동됨)을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선별을 위한 제1 이식유전자 발현 카세트; 메디카고 트룬카툴라에서 유래된 3' UTR T-Mt.AC145767v28-1:1:2(서열번호 1), 또는 고시피움 바바덴스에서 유래된 3' UTR T-Gb.E6-3b:1:1(서열번호 40) 또는 T-Gb.FbL2-1:1:1(서열번호 41)의 5'에 작동 가능하게 연결된 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 β-글루쿠로니다제(GUS)의 코딩 서열(GUS-2, 서열번호 44)의 5'에 작동 가능하게 연결된 EXP-Mt.Ubq2:1:2를 포함하는 EXP-Mt.Ubq2:1:2(서열번호 31)의 활성을 평가하는데 사용되는 제2 이식유전자 발현 카세트; 및 에이. 투머파시엔스 유래 우측 경계 영역을 포함한다.
최종적인 벡터는 실시예 3에 기술된 대로 대두 식물을 형질전환시키는데 사용하였다. 표 28 및 29는 안정하게 형질전환된 대두 식물에서 다양한 조직 및 발육 시점에서 검정된 평균 정량적 GUS 발현값을 나타낸다.
표 28 및 표 29에 입증된 바와 같이, EXP-Mt.Ubq2:1:2(서열번호 31)는 안정하게 형질전환된 대두 식물에서 전사가능한 DNA 분자의 항상성 발현을 구동할 수 있다. 또한, 상이한 3' UTR은 각 조직에서의 발현도에 영향을 미친다. 예를 들면, EXP-Mt.Ubq2:1:2와 T-Gb.E6-3b:1:1의 조합은 2종의 다른 3' UTR, T-Gb.FbL2-1:1:1 및 T-Mt.AC145767v28-1:1:2 보다 검정된 모든 조직에서 보다 낮은 발현을 야기하였다. 그러나, 3' UTR을 도입한 것과 무관하게, EXP-Mt.Ubq2:1:2는 중간 내지 높은 항상성 발현을 제공하고, 이러한 발현도는 EXP에 작동 가능하게 연결되는 3' UTR의 선택에 의해 조정될 수 있다.
실시예 8
조절 성분에서 유래된 인핸서
인핸서는 본 명세서에서 제공된 프로모터 성분, 예컨대 서열번호 32 및 36으로부터 유도될 수 있다. 인핸서 성분은 프로모터의 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 추가의 인핸서 성분의 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결 시, 전사가능한 DNA 분자의 발현을 상승 또는 조정할 수 있거나, 또는 특정한 세포 유형 또는 식물 장기 또는 발육 또는 일주기 리듬의 특정 시점에 전사가능한 DNA 분자의 발현을 제공할 수 있는 1 이상의 시스-조절 성분으로 구성될 수 있다. 인핸서는 TATA 박스 또는 기능적으로 유사한 성분, 및 프로모터 또는 프로모터 단편으로부터 전사가 개시될 수 있게 하는 임의의 하류 서열을 제거하여 만든다.
인핸서 성분은 본 명세서에서 제공되는 프로모터 성분으로부터 유도되고, 당분야에 공지된 방법을 이용해 프로모터 성분의 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 추가 인핸서 성분의 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되도록 클로닝될 수 있다. 다르게, 인핸서 성분은 당분야에 공지된 방법을 이용해, 프로모터 성분의 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결된 인핸서 성분의 1 이상의 복제부에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 추가 인핸서 성분의 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되도록 클로닝될 수 있다. 또한, 인핸서 성분은 상이한 속의 유기체로부터 유래된 프로모터 성분의 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 동일하거나 또는 상이한 속의 유기체로부터 유래된 프로모터에 작동 가능하게 연결된 다른 속의 유기체 또는 동일한 속의 유기체에서 유래된 추가 인핸서 성분의 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되도록 클로닝하여, 키메라 조절 성분을 만들 수 있다. GUS 발현 식물 형질전환 벡터는 최종 식물 발현 벡터가 에이.투머파시엔스 유래 좌측 경계 영역: 항생제 또는 제초제에 대한 저항성을 부여하고 형질전환된 식물 세포의 선별에 이용되는 제1 이식유전자 선별 카세트; 3' UTR 예컨대 T-Gb.E6-3b:1:1 또는 메디카고 트룬카툴라 유래의 상기 기술된 임의의 것에 작동 가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 GUS에 대한 코딩 서열(GUS-2, 서열번호 44)의 5'에 작동 가능하게 연결된, 리더 성분의 5'에 작동 가능하게 연결된, 키메라 프로모터를 형성하게 인핸서 성분이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 이식유전자 카세트; 및 에이.투머파시엔스 유래 우측 경계 영역을 포함하는 이전 실시예에서 기술된 작제물과 유사하게 당분야에 공지된 방법을 이용해 제작할 수 있다.
1종 이상의 인핸서를 포함하는 조절 성분에 의해 구동되는 GUS 발현은 전사가능한 DNA 분자의 발현에 대한 인핸서 성분의 효과를 결정하기 위해서 본 명세서에 기술된 대로 안정한 또는 일시적 식물 검정으로 평가하였다. 1 이상의 인핸서 성분에 대한 개질 또는 1 이상의 인핸서 성분의 복제는 각각의 조절 성분 조성물을 이용해 관찰된 최종적인 유전자 발현 조절, 및 경험적 실험을 기반으로 수행하였다. 최종적인 조절 또는 키메라 조절 성분에서 1 이상의 인핸서의 상대적 위치 변경은 조절 또는 키메라 조절 성분의 전사 활성 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있고, 식물 내 바람직한 이식유전자 발현 프로파일에 대한 최고 인핸서를 경험적으로 동정하기 위해 결정된다.
실시예 9
안정하게 형질전환된 옥수수 식물에서 항상성 GUS 발현에 대한 3' UTR의 효과의 분석
옥수수 식물은 이원 플라스미드 작제물로 형질전환시켜서 옥수수 식물에서 빈번하게 사용되는 2종 3' UTR에 대해 발현에 대한 메디카고 3' UTR T-Mt.Oxr-1:2:1(서열번호 17)의 효과를 평가하였다. 구체적으로, 옥수수 식물을 메디카고 3' UTR T-Mt.Oxr-1:2:1(서열번호 17)에 작동 가능하게 연결된, β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 구동하는 항상성 발현 프로파일을 나타내는 EXP를 함유하는 벡터로 형질전환시켰다. 이들 형질전환된 옥수수 식물은 GUS가 3' UTR T-AGRtu.nos-1:1:13 (서열번호 49) 또는 3' UTR T-Os.LTP:1(서열번호 56)에 작동 가능하게 연결된 형질전환된 옥수수 식물과 비교하였다.
이들 실험에서 이용된 이원 플라스미드 작제물은 당분에서 공지된 클로닝 방법을 이용해 구축하였다. 최종적인 벡터는 에이. 투머파시엔스 유래 우측 경계 영역; 3' UTR 서열을 평가하기 위한 제1 발현 카세트로서, 여기서 항상성 조절 발현 그룹 EXP-FMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Zm.DnaK:1:2(서열번호 56)은 다음의 3종 3' UTR: T-Mt.Oxr-1:2:1(서열번호 17), T-AGRtu.nos-1:1:13(서열번호 49) 또는 T-Os.LTP:1(서열번호 56) 중 하나의 5'에 작동 가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 GUS에 대한 코딩 서열(GUS-2, 서열번호 44)의 5'에 작동 가능하게 연결된 것인 제1 발현 카세트; 제초제 글리포세이트에 대한 저항성(쌀 액틴 1 프로모터에 의해 구동됨)을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선별을 위해 사용되는 제2 이식유전자 발현 카세트; 및 에이. 투머파시엔스 유래 좌측 경계 영역을 포함한다. 최종적인 플라스미드는 옥수수 식물을 형질전환시키는데 사용되었다.
조직화학 GUS 분석은 형질전환된 식물의 정성적 발현 분석을 위해 이용하였다. 전체 조직 섹션은 적절한 시간 기간 동안 GUS 염색 용액 X-Gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-글루쿠로니드)(1 mg/mL)와 항온반응시키고, 세정하고, 파란색 착색을 육안으로 검사하였다. GUS 활성은 선택된 장기 및 조직을 이용해 직접 육안 검사 또는 현미경 하 검사를 통해 질적으로 결정하였다. R0 식물은 수분 후 21일(21 DAP)에, 뿌리 및 잎을 비롯하여, 꽃밥, 수염, 및 발육 종자 및 배아에서의 발현에 대해 검사하였다.
형질전환된 옥수수 식물에 대한 정량 분석을 또한 수행하였다. 정량 분석을 위해서, 총 단백질은 형질전환된 옥수수 식물의 선택 조직으로부터 추출하였다. 총 단백질의 1 마이크로그램을 50 ㎕의 총 반응 부피로 형광원 기질 4-메틸레움벨리퍼릴-β-D-글루쿠로니드(MUG)와 함께 사용하였다. 반응 산물, 4-메틸움벨리페론(4-MU)은 하이드록시 기가 이온화되는, 높은 pH에서 최대로 형광발광하였다. 탄산나트륨의 염기성 용액의 부가는 동시에 검정을 중지시키고 형광발광 산물을 정량하기 위한 pH로 조정하였다. 형광발광은 슬릿 너비를 2 nm 여기 및 3 nm 발광으로 설정된, Micromax 판독기가 구비된 Fluoromax-3(Horiba; Kyoto, Japan)을 이용해 365 nm에서 여기, 445 nm에서 발광으로 측정하였다.
표 30은 동일한 항상성 발현 EXP에 대한 각 3' UTR의 상이한 효과를 입증하는 측정된 평균 양적 GUS 발현을 보여준다.
표 30에서 알 수 있는 바와 같이, 각 3' UTR은 EXP-FMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Zm.DnaK:1:2(서열번호 56)에 의해 구동되는 항상성 발현에 대해 상이한 효과를 가졌다. 예를 들면, 3' UTR T-Os.LTP:1(서열번호 56)은 다른 2종 3'UTR에 비해 VT 뿌리 및 R1 속대/수염에서 발현이 상승되는 것으로 나타났다. 3'UTR T-Mt.Oxr-1:2:1(서열번호 17)은 T-AGRtu.nos-1:1:13(서열번호 49) 및 T-Os.LTP:1(서열번호 56)에 비해서, R3 종자, 21DAP 내배유 및 21DAP 배아 둘 모두에서 발현이 상승한 것으로 나타났다. 꽃/꽃밥에서의 발현은 또한 다른 2종의 3'UTR에 대해 T-Mt.Oxr-1:2:1(서열번호 17)을 사용하여 보다 높았다. 각각의 3' UTR에 대해 관찰된 발현의 차이는 발현을 조절하는데서 각 3' UTR의 유용성을 입증하였다. 따라서, 이들 실험은 3' UTR의 선택을 특정한 전사가능한 DNA 분자의 발현을 미세 조율하기 위한 이식유전자 카세트에서 사용할 수 있음을 입증하였다. 이는 또한 단자엽 종 예컨대 옥수수에서의 전사에 영향을 미치는, 쌍자엽 유래된 3' UTR, 예컨대 T-Mt.Oxr-1:2:1의 능력을 입증하였다.
실시예 10
식물 유래된 프로토플라스트를 이용한 GUS 활성의 인트론 상승의 분석
대체로, 인트론은 이식유전자의 최적 발현을 위해 벡터 전이 DNA(T-DNA) 성분 배열 내 구성 및 인트론을 경험적으로 선택하기 위해 인트론 무함유 벡터 대조군과의 비교 및 실험을 기반으로 선택하였다. 예를 들면, 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는, 제초제 저항성 유전자, 예컨대 CP4(US RE39247)의 발현에서, 제초제를 적용시 산출량의 손실을 방지하기 위해서 영양 조직뿐만 아니라 생식 조직 내에서 이식유전자를 발현하는 것이 바람직하다. 이러한 예에서 인트론은, 항상성 프로모터에 작동 가능하게 연결 시, 구체적으로 형질전환된 식물의 생식 세포 및 조직 내에서, 제초제 저항성 부여 이식유전자의 발현을 상승시키고, 따라서 제초제를 분무시 형질전환 식물에 영양 및 생식 내성 둘 모두를 제공하는 능력에 대해 선택하게 된다. 대부분의 유비퀴틴 유전자에서, 5' UTR은 그 안에 삽입된 인트론 서열을 갖는, 리더를 포함한다. 이러한 유전자에서 유래된 조절 성분은 따라서 프로모터, 리더, 및 인트론을 포함하는 전체 5' UTR을 이용해 검정된다. 상이한 발현 프로파일을 획득하거나 또는 이식유전자 발현도를 조정하기 위해서, 이러한 조절 성분 유래 인트론은 제거되거나 또는 이종성 인트론으로 치환될 수 있다.
서열번호 34로서 본 명세서에 제시된 인트론은 게놈 DNA 내 엑손 및 인트론 서열을 동정하기 위해, 발현된 서열 태그 무리, 또는 cDNA 콘티그와 비교하여 게놈 DNA 콘디그를 이용해 동정하였다. 또한, 5' UTR 또는 리더 서열을 또한 이용하여 유전자 서열이 1 이상의 인트론이 개재된 리더 서열을 코딩할 경우의 조건 하에서 1 이상의 인트론의 인트론/엑손 스플라이싱 접합부를 정의하였다. 인트론은 당분야에 공지된 방법을 이용해 도 1에 제시된 발현 카세트처럼, 조절 성분 및 리더 단편의 3'에 작동 가능하게 연결되고 제2 리더 단편 또는 코딩 서열의 5'에 작동 가능하게 연결되도록 식물 형질전환 벡터에 클로닝시켰다.
따라서, 예를 들면, 제1의 가능한 발현 카세트, 예컨대 도 1의 발현 카세트 구성 1은 3'UTR 성분[E]에 작동 가능하게 연결된, 코딩 영역[D]에 작동 가능하게 연결된, 시험 인트론 성분[C]의 5'에 작동 가능하게 연결된, 리더 성분[B]의 5'에 작동 가능하게 연결된, 프로모터 또는 키메라 프로모터 성분[A]을 포함한다. 다르게, 제2의 가능한 발현 카세트, 예컨대 도 1의 발현 카세트 구성 2는 3' UTR 성분[K]에 작동 가능하게 연결된, 코딩 영역[J]에 작동 가능하게 연결된, 제2 리더 성분 또는 제1 리더 성분 제2 단편[I]의 5'에 작동 가능하게 연결된, 시험 인트론 성분[H]의 5'에 작동 가능하게 연결된, 제1 리더 성분 또는 제1 리더 성분 단편[G]의 5'에 작동 가능하게 연결된, 프로모터 또는 키메라 프로모터 성분[F]을 포함한다. 또한, 제3의 가능한 발현 카세트, 예컨대 도 1의 발현 카세트 구성 3은 3' UTR 성분[Q]에 작동 가능하게 연결된, 코딩 서열 성분의 제2 단편[P]의 5'에 작동 가능하게 연결된, 인트론 성분[O] 성분의 5'에 작동 가능하게 연결된, 코딩 서열 성분의 제1 단편[N]의 5'에 작동 가능하게 연결된, 리더 성분[M]의 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터 또는 키메라 프로모터 성분[L]을 포함한다. 특히, 발현 카세트 구성 3은 코딩 서열의 제1 및 제2 단편 사이의 프레임 쉬프트없이 완벽한 오픈 리딩 프레임을 생성하는 방식으로 인트론의 스플라이싱을 가능하게 디자인되었다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 메신저 RNA가 최종 전사체로 프로세싱되는 동안 원치않는 출발 코돈이 형성될 가능성을 제거하기 위해서, 스플라이싱 부위의 5' 말단(GT) 직전에 뉴클레오타이드 서열 AT 또는 뉴클레오타이드 A를 사용하고, 스플라이싱 부위의 3' 말단(AG) 직후에 각각 뉴클레오타이드 G 또는 뉴클레오타이드 서열 TG를 이용하는 것을 피하는 것이 바람직할 수 있다. 인트론의 5' 또는 3' 말단 스플라이싱 접합무 주변 DNA 서열을 따라서 변경될 수 있다.
인트론은 일시적 검정 또는 안정한 식물 검정에서 발현을 상승시키는 능력을 통한 상승 효과에 대해 검정할 수 있다. 인트론 상승의 일시적 검정을 위해서, 베이스 식물 벡터는 당분야에 공지된 방법을 이용해 제작된다. 인트론은 3' UTR(T-Gb.E6-3b:1:1, 서열번호 40)에 작동 가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 GUS에 대한 코딩 서열(GUS-2, 서열번호 44)에 작동 가능하게 연결된, 시험 인트론 성분(예를 들면, 서열번호 34)의 5'에 작동 가능하게 연결된, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42)와 같은 리더 및 프로모터로 구성된 항성성 EXP를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 베이스 식물 벡터로 클로닝된다. 대두 또는 다른 속의 식물 조직에서 유래된 프로토플라스트 세포는 상기 실시예 2에 이전에 기술된 대로 베이스 식물 벡터 및 루시퍼라제 대조군 벡터로 형질전환시키고, 활성에 대해 검정하였다. 발현을 상승시키는 인트론의 상대적 능력을 비교하기 위해서, GUS 값은 GUS 대 루시퍼라제 활성의 비율로 표현하였고 공지된 인트론 표준물 예컨대 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum) 연장 인자 4A10 유전자로부터 유래된 인트론, I-Nt.eIF4A10-1:1:1(서열번호 57)에 작동 가능하게 연결된 항상성 프로모터를 포함하는 작제물을 비롯하여, 항상성 프로모터를 포함하지만, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 인트론이 없는 작제물에 의해 부여된 수준과 비교하였다.
서열번호 34로 제시된 인트론의 안정한 식물 검정을 위해서, GUS 발현 식물 형질전환 벡터는 에이. 투머파시엔서 유래 우측 경계 영역; 고시피움 바바덴스 유래 3' UTR(T-Gb.E6-3b:1:1, 서열번호 40)에 작동 가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론을 보유하는 GUS에 대한 코딩 서열(GUS-2, 서열번호 44)에 작동 가능하게 연결된, 시험 인트론 성분(예를 들면, 서열번호 34)의 5'에 작동 가능하게 연결된 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 42)과 같은, 리더 및 프로모터로 구성된 항상성 EXP를 포함하는 제1 발현 카세트를 함유하는 이전 실시예에 기술된 작제물과 유사하게 제작하였다. 옥수수 또는 다른 속 식물 조직에서 유래된 프로토플라스트 세포는 상기 실시예 2에 앞서 기술한 바대로, 베이스 식물 벡터 및 루시퍼라제 대조군 벡터로 형질전환시키고, 활성을 검정하였다. 발현을 상승시키는 인트론의 상대적 능력을 비교하기 위해서, GUS 값은 GUS 대 루시퍼라제 활성의 비율로 표시하였고 공지의 인트론 표준물 예컨대 니코티아나 타바컴 연장 인자4A10 유전자에서 유래된 인트론, I-Nt.eIF4A10-1:1:1(서열번호 57)에 작동 가능하게 연결된 항상성 프로모터를 포함하는 작제물을 비롯하여, 항상성 프로모터를 포함하지만, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 인트론은 없는 작제물에 의해 부여된 수준과 비교하였다.
서열번호 34로 제시된 인트론은 다수의 방식, 예컨대 발현을 감소시킬 수 있는, 인트론 서열 내 단편의 결실 또는 발현을 상승시킬 수 있는 인트론을 갖는 단편의 복제에 의해 변경될 수 있음을 주목한다. 또한, 특정 세포 유형 또는 조직 및 장기에 대한 발현의 특이성에 영향을 미칠 수 있는 인트론 내 DNA 서열은 이식유전자의 발현 및 발현 패턴에 영향을 미치도록 복사되거나 또는 변경되거나 또는 결실될 수 있다. 또한, 본 명세서에 제공된 인트론은 다르거나, 보다 길거나 또는 절단된 단백질로서 부적절하게 스플라이싱된 인트론으로부터 의도치 않은 전사체가 발현되게 할 수 있는 임의의 가능한 출발 코돈(ATG)을 제거하도록 변경될 수 있다. 인트론이 경험적으로 시험되거나, 또는 실험을 기초로 변경되면, 인트론이 이식유전자의 상승을 제공하는 한, 그 인트론은 임의의 단자엽 또는 쌍자엽 속 식물일 수 있는 안정하게 형질전환된 식물의 발현을 상승시키는데 사용될 수 있다. 인트론은 또한 그 인트론이 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 발현의 상승 또는 약화 또는 특이성을 제공하는한, 다른 유기체, 예컨대 조류, 진균, 또는 동물 세포에서 발현을 상승시키는데 사용될 수 있다.
* * * * * * *
본 발명의 원리를 예시하고 기술하였지만, 본 발명을 이러한 원리를 벗어나지 않고 방식 및 세부 사항을 변경할 수 있음은 당분야의 숙련가에게 자명하다. 본 발명자는 청구항의 정신 및 범주 내에 속하는 모든 변경을 청구한다. 본 명세서에서 인용한 모든 출판물 및 공개된 특허 문허는 각 개별 출판물 또는 특허 출원을 참조하여 편입시킨다고 구체적이고 개별적으로 언급한 바와 동일한 정도로 참조하여 본 명세서에 편입시킨다.
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<130> MONS:332WO
<150> 61/785,268
<151> 2014-03-14
<160> 57
<210> 1
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 1
ttaatcatct gaaactgttc accatgcatg caatcttgtg aaatatatgg ttttaattag 60
acttcaatct tatgttggct attgtactaa taaaagcatg tcatgttatt ttcatttgat 120
tttatctgta ctttggtttg tttgaagaat aaagatgagc ttgctatgca tgcatgcatg 180
ccatcgatta tcagggtttc cttttttctt ttctggcttc ccatcaattt ggtgtgaatt 240
agtgtgtgtg atatattata ttatgctatt tatgaaataa attgttggtt atatttgatc 300
tacaatctac atacatgtga tttttatcaa caaaatatct cgggaaacaa tacctttttg 360
gtagcaaaat tcaaataata ctattttaaa taaatcaaag ttaaccaata ccttattcaa 420
gttggagggg tctcaaacaa gcaaaagaat tcaagttgtt aatgaacttc ggttaatgat 480
aaaagaattc gcatttaaaa 500
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
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aagggctctc tgtcatgatt tcatactttc attattgagc tctgtaatta caattatgac 60
catgagaaca tctcttattg tgtggccttt taattgctga tgttagtact gaaccaaagc 120
ttatcgtgat gatgtaaaag caataagtac ttgtttgtag cttctttgtg tctccctttg 180
ggcttaatac atctgtttag tgttgtggct ttggcataga cttctcttgg taataatgcc 240
ttgcaatgca aaatttcaat tatcaaattc tattatgttc tcaccttatg gtaacagctt 300
accctgtgga agatgagatt cttgagttga gtcattgcca atttttggca ttagcttttg 360
aattagtgaa ttttgacaaa aattaccgtg acactgattt tgttgaagct cttaagtgta 420
gtttttacaa aatttcagtg gctcgttgtg attatgtcaa actcacggcg aatgtagttc 480
ttacagaatt tcagtggctc 500
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
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gcatgaataa tcaagctcat aaatttcatg gctttgaatt tgtactattt tggttactag 60
aaagtgtatt tgtgtgttta tgcagtaata aatctctaag agatatatgt ttgttatttt 120
ttataattat ccaaaaaatc gttaatgttg aaaattgatt caaaattgat attgaagttc 180
tgaaaaaatc gtggcgtgat taaaaatcca aactttttta taaaataata ttgtgtctat 240
atcttttata aatgacgata aatgggataa agtaaatgaa acaaaaccgt taatgcaatg 300
ttcatctgca caatatatat aattaaaaaa cattataaaa ccttgtttct tcactcattt 360
acaatcttga aattttagtc tttaccattt gaaagtacaa tcttttcatg aaagtttata 420
gtacaaatca agagtttgga taagctgctc tgctttttat aatcactggg aaatgattta 480
tgacttggaa aaacaacttg 500
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
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aaaattgttg ttgaattcca aaagggtcct gtagtagaaa tttacgtaca agcaaaatcg 60
atttcttgat atacaagtta aagggtatat gagaaaatac atacatgtaa atgagtaccg 120
agttttctat agtttgagca tttgtgtcaa ataagcaagt gattgtgatg attccaagct 180
tttaaattga aaaaagatta gcaaccaaga atcaaacatc cacacaccat atacatgctc 240
taggcttcaa ataccattga gcaacattat actctatatt gtttgatttc aaccaattcc 300
aagagcttga taattcgcat gagaattata ttatatcaaa aactttagtg aaagatgctc 360
caataatttc taaacttgtg atcatttttt ggcattagga ataaggcaaa aatctgcaaa 420
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caaaattcaa caataatctt 500
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
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ggagcagtgt gtggtgtttg agaggaatgg tgcatcttac ataaatttca cagacattgc 60
tcttattttg aatgcgggtt catcgacatt gggtagtttt tggatgtatt ttgctagaca 120
cgatgaacgt ggagtttgat tgttttctct attgttgatc ctctgttaaa taacattgtt 180
aagtgataat tcccagctat ttcggtttta ttattcccca atgttgctct tccgcatgtc 240
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<213> Medicago truncatula
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tcttagtttt ttgttattcc agttttattt ttccagtttt agaaacttac agaactgggt 120
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ttttgaattt ttgttcgtaa tatttgtcct tgattgtgtg tttgtggttc cgtgcttgca 360
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aaataaaatt acttatagat agatttggaa ctagatgact agtgttttat tgtttctggt 60
ttgtgtaatt ctataaatta atgttatctc tatgtccaag aatgttatct ctagtgctct 120
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tgagtcaaag ttggtgtctc ttttgaagac tagaaaaagg gtttattttg ttgttatttt 60
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tctattgtct actaatttta tttttttttt acttttctat tctttatttg tattaaatca 300
taagttctaa ttatttaatc aaaacttcaa atggtggcgg ttatacgcta ttccgaatcg 360
tcttttgttg tccgagtcta taggctacac tcatatcctg gttgaaacag actctatagc 420
tgtcctgatc aggtcaatca gattagaaga ttcttttctc aaaattggag tcttttcttt 480
caacgctgtg cagattgact 500
<210> 15
<211> 500
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 15
aaaggttgaa ggaaagagaa tctcagcagt catattgaat ctgtttgatt tactacacaa 60
aaggataatt ttctattttg gatgtttcaa taactgtgtg caatatttag gtatttagta 120
tgctctgtga gcaaattaat cccccctccc aaaatttcat ttcaccccac ttttctgttt 180
ttccaaatgt ctctgtatcc gtggctctgc cacaatcttt attgatattg caattttcca 240
gttttgtgca aataatcatg agcatttcaa ttcactattt tcaaatgcgg ctttatacct 300
taaacacgag ggcatagctt cacactatgg tttccatgaa tattgtcaca ccgtggtttg 360
caaggatatt gtttaaaggt taaatgtgac tgtgaatgat caatattttg cagaaaagaa 420
ataaacttaa acaaaaggtg atctaaattt tcaatgacca gtaatcaata tcttacaatc 480
tctcaactgt gaaattccga 500
<210> 16
<211> 500
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 16
tttgctttat atatgataag aaattgtttt tttagttttg ctttccattt gtaaaattat 60
cttttgagag tttttagatt attgcacttt ctaaattttc attttgcttc tttgttggat 120
ctgggatttc tgaaatgaac attagagtaa taaatcgaat ctgagtatta caagcaagtt 180
tgttgaaata atgatctcta attttgtcaa gttaaagaaa tcaaaatatc ttgtaccaaa 240
aaaaaaaaaa aatcaaaaca tcatgtttga ttaacaaaac tccaatttga aatcaattta 300
aatttaaatt tcatttttag aaagaaaaaa aaaatattat tccatccatt attagttctc 360
gatttcacac aactagtttt tcgatttact cacgtaccta catatgagta tgtaagggtt 420
gattacgtat tcattattgc tctttgtttc acataattct tttttttcaa tcaaaatgaa 480
aattatataa aggagtacaa 500
<210> 17
<211> 500
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 17
aaatgaatga atcagctttc tcttgttcat aaagaattgt gtggaaatga attgtgtgtt 60
gctatataca tgagtgtgtt ggttgctgcc ttatgtgttc ttctagggtt attttttctt 120
ttgctttgta ataatttgtg cgttactatt gtaaacaatg tatttaatga ataatgaaag 180
tctaaagttt gtaatggagg gaagtaaatg taaatccttt cgcaagtgtt tttttagctt 240
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gattttaggg acaagagaag ttcaaattac actccaatta tgtgctcggg gaaatttaat 360
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gtgcatatgt tcatatcatt tcacattttt ataatccagc atattataaa ttcaaaccta 480
attttggtac ataatagtat 500
<210> 18
<211> 500
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 18
ttaatccatc atcatcggca tgtgtgtttg ttttttttgt gtctattttg accaaatcat 60
atattcatat gtatgtgtaa attattatga actactgtat gttagtgctt catgttcgtg 120
aactgaacac attgaatggt ctgtggagtg tggagattct ttcatgttgt tatttattat 180
gagtttttct tttttatttc ttcaaaagca gactactgaa atattgattt gataccacca 240
aaaagaaaaa gtaatatatc ttactattaa tatttatagt tgatataaac atcatcaaaa 300
tttaaaatca gtttctaatc ttggtttgtt cggggtggcc cttggattcc attttgcata 360
tgctgttgcc caggaactaa gctctttcat aagataatgt tcggggtagc tctgttacta 420
ggtcataaaa aagaccgatt gttgtcatcg ttcgaaaaag cgaaaaaaca aacacaagca 480
ttctcgtcat aacaaagacc 500
<210> 19
<211> 500
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 19
tgaagaagga taatgattga ttaattgttt aatataaagt tgagggaatt tttttatatt 60
ttctataaat tatcaaaata tgttgattgt tgagaataag aattctaggt tcaaaacaga 120
atcttgaatt gtcaaggagt ctgttaaatg tgagatttat tattatgttt catttcaaaa 180
gtattaagtt ttatttgtgt gactatttgg attgtgatta ttgctaaatg tttatacgta 240
ttaaaatttg catgcttttt gtcccactca aataaaaatt aattagtatt gcttgcttcc 300
aagttttaga tttactataa tatgtatttt ttttttttag agatacatgt aatatgtata 360
aatattttgt aacgagcaaa aaaaatacac tctaattatc tcataataga gaaaagacac 420
tctttatgtg agtgtaaatt cctataaaga aaagagatgt gaaaactacc ctcagtatac 480
ggataattgc actcacaata 500
<210> 20
<211> 289
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 20
gggtcttagt ttacttttct tgatttgtaa tgtacaatgg ggctgtggtg tttatatttc 60
atttaatcgt taatgtacta ctttatacta gttgtttata tttaaaaaag cataaacttt 120
gcctcatcta aatgtacttg aattgagttt acttagaagt gcttgaattg agtttgtgta 180
aatgaacata attttagtag tgcttagatt aagttcacat atcactactt tataccaggg 240
gattactatt ctttttagct tttgttttta ctgttggttt tttgccaaa 289
<210> 21
<211> 382
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 21
gaagggtctt gatctatgaa gcacggaaac gcctccgatt aggcgtgtcc aggtgtccga 60
cacgtatcat ctctgatacc gacacgacac cgacacttac aattacacgg aattatgtaa 120
ttttctcaaa ttattagagg tgtcggcgtg tcagtgtacg tgtcgtgtcc tttgtatccg 180
tgtttcatag gtcttggttc atttttcttg atttgtaatg tacaatgggg ttgttgtgtt 240
taaatttcat ctaatcttta ctgtactatt ataaatatat atactagttt gttcataaaa 300
gcataaagtt ttgcttatct ctttggtgtt accggttcaa tgctcgacct aggaaaaaat 360
taataaaatt tcattcataa aa 382
<210> 22
<211> 400
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 22
gcaaggagga tcatgaacat cacaaagtga atttatttta tgtttgcacc atatattatt 60
atttgtgaca cattttagaa ctcttaaacc atttttctgt ttgcatttta gctactggtt 120
gttgtattca caataatgat gcagtcctat gcttcttggt gtaagattca atactatgta 180
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 23
actgcagtca cagtcataaa taccggtgca taacatgaat taattttata tttgcaacat 60
gtttttaaaa tcttaaacct tctatttttc cactccatag gttatcaatt aagtattatt 120
attttgtgtg attctactac tttggaatat aagaagattg aaaaggaatt tctgtgagcc 180
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cacaataatg atgtagttct atgcttcttg gtgcatgaac aaatactaca taaagtgtaa 420
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<210> 24
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 24
aaacaccaat tccatcttct tcaataataa ccactatata tatatagaag caacttcaaa 60
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<213> Medicago truncatula
<400> 25
ttatggtagt agttttgaaa tgttgggaac ttgtttttca tgttttgtta ccatctgttt 60
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tccaattttg gtgttttatt cctttttctt aaaattttga tttatttata cttccgcata 240
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<210> 26
<211> 500
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 26
gagtactctc caacatggac acaccatggg attgtgtaac ataaataatg tgtcgtttgt 60
aatgaatgct cgcaactttt ctagctaatt aagctagagt tgaacttgag ctacttttat 120
gtaccctaaa gaggcacaat ctttgctgtt gatgtactat gatcatgtta taatatgatg 180
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gcagtacaaa ttgagagtta 500
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 27
caaattgtta gtgtttttct gatttagttc agagattgta agtaagatac cccaaaagtt 60
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 29
gcagctggaa acttactagt gttaaagttg tatctggctc atttcgagct gggtatatat 60
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taatatgtat caaaggagtt ttataagact tcatttaaca tttcagatgc ttggatgtgt 240
tactttatgt ttaccgtgct atgtttttat accagattca agattttaga tgccttaggc 300
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a 481
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<211> 600
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 30
tcattcaatt tgaccctttt gctacattct tgctgtcata gttatttaat ttaatttctt 60
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gttgtctact agaaaaaaaa atcctgtaag aggtaaggta ttcttccaaa acaggattct 300
ttttcttatc attttacttc attagtttct aagttccttt tcctacattg tataagattc 360
tgtcagtaca tttatgttgc ttatgtagga agtgggactg agtttcttat gaaggaattt 420
atgagttatt gaatatttat tgcaagctat attttagaat acagtatact ttcttcttat 480
gttattattt ttttaagtgt attgtgttgt gttattatta taagctttgt taaactctga 540
tcattttcaa attcaaaaca atgtttagtt caaaggcaaa gctgagttgt gctgattatt 600
<210> 31
<211> 1594
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 31
actgttaata atttttaaac gtcagcgcac taaaaaaacg aaaagacgga cacgtgaaaa 60
taaaaaacac acactagttt atgacgcaat actattttac ttatgatttg ggtacattag 120
acaaaaccgt gaaagagatg tatcagctat gaaacctgta tacttcaata cagagacgta 180
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tttatcggat acttatgtga tactctacat atacacaagg atatttctaa gatactttat 300
agatacgtat cctagaaaaa catgaagagt aaaaaagtga gacaatgttg taaaaattca 360
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attttttaaa aattgtatct tttataataa tacaataata aagagtaatc agtgttaatt 660
tttcttcaaa tataagtttt attataaatc attgttaacg tatcataagt cattaccgta 720
tcgtatctta attttttttt aaaaaccgct aattcacgta cccgtattgt attgtacccg 780
cacctgtatc acaatcgatc ttagttagaa gaattgtctc gaggcggtgc aagacagcat 840
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agccaatcga tttttgctat aaaagcaaat caggtaaact aaacttcttc attcttttct 1020
tccccatcgc tacaaaaccg gttcctttgg aaaagagatt cattcaaacc tagcacccaa 1080
ttccgtttca aggtataatc tactttctat tcttcgatta ttttattatt attagctact 1140
atcgtttaat cgatcttttc ttttgatccg tcaaatttaa attcaattag ggttttgttc 1200
ttttctttca tctgattgaa atccttctga attgaaccgt ttacttgatt ttactgttta 1260
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ataaattttt agatttggat ttttgtattg tatgattcaa aaaatacgtc ctttaattag 1380
attagtacat ggatattttt tacccgattt attgattgtc agggagaatt tgatgagcaa 1440
gtttttttga tgtctgttgt aaattgaatt gattataatt gctgatctgc tgcttccagt 1500
tttcataacc catattcttt taaccttgtt gtacacacaa tgaaaaattg gtgattgatt 1560
catttgtttt tctttgtttt ggattataca gggt 1594
<210> 32
<211> 1000
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 32
actgttaata atttttaaac gtcagcgcac taaaaaaacg aaaagacgga cacgtgaaaa 60
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aaatgtaata tgatttataa gaaaattttt aaaaaattta ttttaataat cacatgtact 600
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<213> Medicago truncatula
<400> 33
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<212> DNA
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<400> 34
gtataatcta ctttctattc ttcgattatt ttattattat tagctactat cgtttaatcg 60
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atcctttgtt tttcaaagac agtctttaga ttgtgattag gggttcatat aaatttttag 240
atttggattt ttgtattgta tgattcaaaa aatacgtcct ttaattagat tagtacatgg 300
atatttttta cccgatttat tgattgtcag ggagaatttg atgagcaagt ttttttgatg 360
tctgttgtaa attgaattga ttataattgc tgatctgctg cttccagttt tcataaccca 420
tattctttta accttgttgt acacacaatg aaaaattggt gattgattca tttgtttttc 480
tttgttttgg attatacagg gt 502
<210> 35
<211> 1141
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 35
tggattaatt tatttggact ggtttcgtaa tgagttgtat tcaatcattc tcttctttac 60
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taatcaaacg ttataaaata ataaagatag taagtcttgc aaataaaata aaaaatgaga 240
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cataatcata cttacactca atattctcca ccaatgataa aatttgagga gttacttcaa 360
ctttagaaat taattttttt ttttgacaag actttagaaa ttaattatta tatattgagt 420
gtaatatgga ttaatcatat actaattcat tatatgcgtg actagtcaaa caagataaac 480
ctggatggta attgattgta atgcaccacc aacattgaat taaaaattag caagtttttt 540
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aaagggagaa aagcaatttt ccttttcttg aactcattaa ggttccaaat tcttttataa 1080
aagggccact acactgcttt catatataca ccattcatac atagaaacca atagccaaaa 1140
a 1141
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<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 36
tggattaatt tatttggact ggtttcgtaa tgagttgtat tcaatcattc tcttctttac 60
aattttgggt gaaagtggtc attgtatttt cttaaataac ttttttgctt atataaaaag 120
agagagaaaa aaagatcgtt tattgtctct actttgatta tagaatagaa gtttaagact 180
taatcaaacg ttataaaata ataaagatag taagtcttgc aaataaaata aaaaatgaga 240
gtgctgataa agccaaaacc ttacacaaat tgagggatta aaaagttact cacgtctatg 300
cataatcata cttacactca atattctcca ccaatgataa aatttgagga gttacttcaa 360
ctttagaaat taattttttt ttttgacaag actttagaaa ttaattatta tatattgagt 420
gtaatatgga ttaatcatat actaattcat tatatgcgtg actagtcaaa caagataaac 480
ctggatggta attgattgta atgcaccacc aacattgaat taaaaattag caagtttttt 540
tttgttggaa aaaattaaca agttaaatac caaaatgtga tttaattttt ttaatacgca 600
aattttaatg gttaatctgt taggaggaaa aattgtgaat tttttagtgc ataaatcaaa 660
ccgttgacct ttttattgaa ctcgtttagt ctcaactcat atcattggac tctaccttcg 720
agaatgtacc aaaatgtgtt tagttagacc tagcagggcc acataaatga actcgaacat 780
acttttcttg aaaaattgtt cttctcccat ttaaaattgc tcactccttt gatctatcgg 840
gagttaactc atactcggca ttattcaacg gtagctaacc cacattgtca ctgttagatt 900
agttcaatca ttttttaaat cgagtcaacc aatcttaaaa gtctcagcat gagttaacta 960
ccgctgaaaa atgtcgagcc cgagttaact tcatctgaat caagggaatg aacaatttta 1020
aaagggagaa aagcaatttt ccttttcttg aactcattaa ggttccaaat tcttttataa 1080
aagggccact acactgcttt catatat 1107
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 37
acaccattca tacatagaaa ccaatagcca aaaa 34
<210> 38
<211> 298
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 38
tgtcgtacag tatttctaca tttgatgtgt gatttgtgaa gaacatcaaa caaaacaagc 60
actggcttta atatgatgat aagtattatg gtaattaatt aattggcaaa aacaacaatg 120
aagctaaaat tttatttatt gagccttgcg gttactttct tgtgatgatc ttttttattt 180
tctaattata tatagtttcc ttcgctttga aatgctaaag gtttgagaga gttatgttct 240
ttttctcttc ctctttcttt tttaacttta tcaaacaatt tttgaataaa aatgtgag 298
<210> 39
<211> 436
<212> DNA
<213> Gossypium barbadense
<400> 39
aacaaaagag tgcctcacat ttgatgcaat agctctgtaa tgtttcattc atttgcttat 60
ttcggccttg tttttctcgt attctatggg ctgatgtctc atatgggact tttctactag 120
agagcctacg ttactttacc attatattgt attctttgag acattattat tattttttta 180
ccttttgagg acactctttt tttgtatttg aaggaattta ttgtttattt tgtttggaat 240
atgtttggtt ggatttattc gattcatata tattatataa aagtaattat gttattaaga 300
aacgtagtaa gaacttacaa atataaggat cgaatcccga acttcatgca aatcaattta 360
caacccacac aagtttaaca ttaaattaac gtgattggtt agtaaattca tgtttctctg 420
tttaatttgt tgaatt 436
<210> 40
<211> 315
<212> DNA
<213> Gossypium barbadense
<400> 40
tgatcacctg tcgtacagta tttctacatt tgatgtgtga tttgtgaaga acatcaaaca 60
aaacaagcac tggctttaat atgatgataa gtattatggt aattaattaa ttggcaaaaa 120
caacaatgaa gctaaaattt tatttattga gccttgcggt taatttcttg tgatgatctt 180
tttttttatt ttctaattat atatagtttc ctttgctttg aaatgctaaa ggtttgagag 240
agttatgctc tttttttctt cctctttctt ttttaacttt atcatacaaa ttttgaataa 300
aaatgtgagt acatt 315
<210> 41
<211> 315
<212> DNA
<213> Gossypium barbadense
<400> 41
accatatgac actggtgcat gtgccatcat catgcagtaa tttcatggta tatcttaatt 60
atatggttaa taaaaaaaag atggtgagtg aataatgtgc gtgcattcct ccatgcacca 120
atggtgaatc tctttgcata catagagatt ctgaatgatt atagtttatg ttgtagtgaa 180
attaattttg aatgttgttt ttaaatttta atgtcacttg gcttgattta tgttttaacg 240
aagcttatgt tatgtatttt actttaatga tattgcatgt attgttaatt taacattgct 300
tgatcagtat actct 315
<210> 42
<211> 712
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(712)
<223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group or
EXP.
<400> 42
ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60
cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120
ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240
aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg 300
aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa 360
ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc 420
ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 480
agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag 540
ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt 600
tcatttggag aggacactct agacagaaaa atttgctaca ttgtttcaca aacttcaaat 660
attattcatt tatttgtcag ctttcaaact ctttgtttct tgtttgttga tt 712
<210> 43
<211> 613
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(613)
<223> Enhanced Cauliflower mosaic virus 35S promoter.
<400> 43
ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60
cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120
ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240
aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg 300
aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa 360
ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc 420
ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 480
agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag 540
ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt 600
tcatttggag agg 613
<210> 44
<211> 2001
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2001)
<223> Native E. coli GUS coding sequence with processable intron.
<400> 44
atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60
ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120
gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180
cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240
ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300
aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360
tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa 420
taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat 480
gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt 540
ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa 600
ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag 660
cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac 720
accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt 780
aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt 840
gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg 900
aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa 960
agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020
ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080
gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140
atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200
ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260
aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320
gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380
cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440
ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500
acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc 1560
gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620
ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680
cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac 1740
accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800
gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860
caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg 1920
aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980
cagcagggag gcaaacaatg a 2001
<210> 45
<211> 1653
<212> DNA
<213> Photinus pyralis
<400> 45
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360
tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga 600
tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840
aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960
aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320
ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620
aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa 1653
<210> 46
<211> 936
<212> DNA
<213> Renilla reniformis
<400> 46
atggcttcca aggtgtacga ccccgagcaa cgcaaacgca tgatcactgg gcctcagtgg 60
tgggctcgct gcaagcaaat gaacgtgctg gactccttca tcaactacta tgattccgag 120
aagcacgccg agaacgccgt gatttttctg catggtaacg ctgcctccag ctacctgtgg 180
aggcacgtcg tgcctcacat cgagcccgtg gctagatgca tcatccctga tctgatcgga 240
atgggtaagt ccggcaagag cgggaatggc tcatatcgcc tcctggatca ctacaagtac 300
ctcaccgctt ggttcgagct gctgaacctt ccaaagaaaa tcatctttgt gggccacgac 360
tggggggctt gtctggcctt tcactactcc tacgagcacc aagacaagat caaggccatc 420
gtccatgctg agagtgtcgt ggacgtgatc gagtcctggg acgagtggcc tgacatcgag 480
gaggatatcg ccctgatcaa gagcgaagag ggcgagaaaa tggtgcttga gaataacttc 540
ttcgtcgaga ccatgctccc aagcaagatc atgcggaaac tggagcctga ggagttcgct 600
gcctacctgg agccattcaa ggagaagggc gaggttagac ggcctaccct ctcctggcct 660
cgcgagatcc ctctcgttaa gggaggcaag cccgacgtcg tccagattgt ccgcaactac 720
aacgcctacc ttcgggccag cgacgatctg cctaagatgt tcatcgagtc cgaccctggg 780
ttcttttcca acgctattgt cgagggagct aagaagttcc ctaacaccga gttcgtgaag 840
gtgaagggcc tccacttcag ccaggaggac gctccagatg aaatgggtaa gtacatcaag 900
agcttcgtgg agcgcgtgct gaagaacgag cagtaa 936
<210> 47
<211> 1446
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1446)
<223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group or
EXP.
<400> 47
ggtccgattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 60
ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 120
catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 180
gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 240
aagcaagtgg attgatgtga tggtccgatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 300
aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 360
gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 420
tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 480
gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg 540
gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt 600
catttggaga ggacacgctg acaagctgac tctagcagat ctaccgtctt cggtacgcgc 660
tcactccgcc ctctgccttt gttactgcca cgtttctctg aatgctctct tgtgtggtga 720
ttgctgagag tggtttagct ggatctagaa ttacactctg aaatcgtgtt ctgcctgtgc 780
tgattacttg ccgtcctttg tagcagcaaa atatagggac atggtagtac gaaacgaaga 840
tagaacctac acagcaatac gagaaatgtg taatttggtg cttagcggta tttatttaag 900
cacatgttgg tgttataggg cacttggatt cagaagtttg ctgttaattt aggcacaggc 960
ttcatactac atgggtcaat agtataggga ttcatattat aggcgatact ataataattt 1020
gttcgtctgc agagcttatt atttgccaaa attagatatt cctattctgt ttttgtttgt 1080
gtgctgttaa attgttaacg cctgaaggaa taaatataaa tgacgaaatt ttgatgttta 1140
tctctgctcc tttattgtga ccataagtca agatcagatg cacttgtttt aaatattgtt 1200
gtctgaagaa ataagtactg acagtatttt gatgcattga tctgcttgtt tgttgtaaca 1260
aaatttaaaa ataaagagtt tcctttttgt tgctctcctt acctcctgat ggtatctagt 1320
atctaccaac tgacactata ttgcttctct ttacatacgt atcttgctcg atgccttctc 1380
cctagtgttg accagtgtta ctcacatagt ctttgctcat ttcattgtaa tgcagatacc 1440
aagcgg 1446
<210> 48
<211> 675
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(675)
<223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group or
EXP.
<400> 48
ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60
cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120
ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240
aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300
gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360
aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420
cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480
aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540
gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600
ttcatttgga gaggaaccat cttccacaca ctcaagccac actattggag aacacacagg 660
gacaacacac cataa 675
<210> 49
<211> 253
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 49
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253
<210> 50
<211> 841
<212> DNA
<213> Glycine max
<400> 50
ggcaaaaaca tttaatacgt attatttaag aaaaaaatat gtaataatat atttatattt 60
taatatctat tcttatgtat tttttaaaaa tctattatat attgatcaac taaaatattt 120
ttatatctac acttattttg catttttatc aattttcttg cgttttttgg catatttaat 180
aatgactatt ctttaataat caatcattat tcttacatgg tacatattgt tggaaccata 240
tgaagtgtcc attgcatttg actatgtgga tagtgttttg atccaggcct ccatttgccg 300
cttattaatt aatttggtaa cagtccgtac taatcagtta cttatccttc ctccatcata 360
attaatcttg gtagtctcga atgccacaac actgactagt ctcttggatc ataagaaaaa 420
gccaaggaac aaaagaagac aaaacacaat gagagtatcc tttgcatagc aatgtctaag 480
ttcataaaat tcaaacaaaa acgcaatcac acacagtgga catcacttat ccactagctg 540
atcaggatcg ccgcgtcaag aaaaaaaaac tggaccccaa aagccatgca caacaacacg 600
tactcacaaa ggtgtcaatc gagcagccca aaacattcac caactcaacc catcatgagc 660
ccacacattt gttgtttcta acccaacctc aaactcgtat tctcttccgc cacctcattt 720
ttgtttattt caacacccgt caaactgcat gccaccccgt ggccaaatgt ccatgcatgt 780
taacaagacc tatgactata aatatctgca atctcggccc aggttttcat catcaagaac 840
c 841
<210> 51
<211> 422
<212> DNA
<213> Dahlia mosaic virus
<400> 51
atcaacggag aaacaaagat aaaaatcaat tactcacatg aaagagtatt gatcacgagt 60
cactatggag cgacaatctc cagacaggat gtcagcatct tatcttcctt tgaagaaagc 120
atcatcaata acgatgtaat ggtggggaca tccactaagt tattgctctg caaacagctc 180
aaaaagctac tggccgacaa tcataattgc tcggcatgtg caggtggggc ctccactagc 240
aataatacaa gctttacagc ttgcagtgac tcatcctcca ataatggaga aaaagacgtc 300
agcagtgacg aacaagggtc gaaagacttg cctatataag ggcattctcc cctcagttga 360
agatcatcga aagttggagc aataaactct ctcttcaaca aatctatctt ttatctttta 420
tc 422
<210> 52
<211> 595
<212> DNA
<213> Banana streak virus strain Acuminata Vietnam
<400> 52
agacatcctg gaccaatatg ctgaagatta tgctacctac accaggatag gacttgaagc 60
acttaacctt gaagattggt tcgaagaacc agaacccgat ccacctaacc ctgtggaccg 120
ccagaggata gaggacatcc tggacctact gaacgtcagc aatgacgact gaaagattcc 180
caggacaccg gcggaagtgg tggacccagt ctaggtgcga tgcttagtcg cgcacgatga 240
ctatgtcgga aggcatcttt gctttcggca aactttagta atactttaag gaaagtattg 300
tacaagttag gtgcagagac aataatgcac ccagctttag ctttgtttat ggaattattg 360
tgtcggttgc attattggat gcctgcgtgc accctaagca atccccggcc ctcttctcta 420
taagaggagc ccttgcaatc agttgcaagc attcaagttt cccactgcaa gcttacttct 480
gagtttgagt tcaagttcaa taaaattcaa gctttcctct tacattctgt tcttgaaagg 540
ttcgatctaa tcgagcgagt agagaacaag atcttttggg atttccgccg ttcca 595
<210> 53
<211> 382
<212> DNA
<213> Carnation etched ring virus
<400> 53
atcctcaact tccaatcaga agttagcagc tgcaagcttt taggattcca tagtgataag 60
atatgttctt atctaaacaa aaaagcaagc gtcggcaaac catacagctg tccacaaaaa 120
ggaaaggctg taataacaag cggacccagc ttctcagtgg aagatacttt atcagacact 180
gaataatgga tggaccctac cacgattaaa gaggagcgtc tgtctaaagt aaagtagatg 240
cgtctttaat aattcatcta ctttagacgt catgcatgac gtttaacatg cattgtatcc 300
agatcctccc tggctatata aagggagtta aatttcattg ttaaggcatc gaaaaaaaaa 360
tttcaagtct atctctcaag aa 382
<210> 54
<211> 1235
<212> DNA
<213> Cucumis melo
<400> 54
aaattttaat aattaaaatg aacaattttt caagagtaat agagtttgag agatgtcaga 60
gaagtttgag gaagaagata acaagtggga gaagagaata agtttgttgt gtgaaagaga 120
aggggaaatt tcattcaagg gtatattgaa ctttttactc aaattttgta agtctatttt 180
ttccgatcaa tcctaaaatc acacacaccc ttaaaaaatg gattatattt ggcaattttc 240
catgataaac tcatttttaa tttagagtta ttttttcaac gagatattaa cagttttagt 300
tcatatacta attgtaagaa tagtttcttt taagttgaat agaatttttg aaacttttaa 360
tagttcaaaa ggtatttttg aaacaaaata agaatgtttt tgaacttttt ataaaaagaa 420
ttgagatttt tttgaaattt ttgataaaga gaaaagaaaa gaagaaagaa aaaagaaaaa 480
caagtttgta gaactccgtg ggaaaatcgt cgagggccct gtgaaggaat tttgaaatta 540
taatgagggt attttcgtca acaagggaat ttagacatcg tatataagca tcctcaaacc 600
ctataattaa gcccttcaat ccaattgcca ttctccatct ctcgccgcaa gggtttaaga 660
gcagcttctc tcctcaggtt ggggtttccc cctatcttct tcattcttcc tcttctcgat 720
ttctttcttc tatttgctcg atagtctctt atttcttgag cttttgctgt ttttctcctg 780
tacatcctaa catgaattat aacttggttt tgattttgtc ttttacttct gtattaaaca 840
acttttctta cccttttatt cttctcttct tcttcgtgtc cctgcccttt tgtttttatg 900
ctaattttat gtttctgttt atcaatctat cgaggcgtga cctgtcgttc ttccaatagc 960
gtagatctgc acttaatcta ttctagctga ttggattggt cgtttttcgt ttttttaatt 1020
tattttctct gttctagttc cgataaattt ttttatatat aattaacaag ttctccagcc 1080
aaaagggtta atattgcgtt ggatatttta atttttacgt tatttagatg tgtgaatcta 1140
ataaaattag ggttattcat aaatttcagt aatgatattt tggttatctg ttcttgctgt 1200
tcctgtttcg cagttctttt acctaatatt caagc 1235
<210> 55
<211> 1865
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1865)
<223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group or
EXP.
<400> 55
aattctcagt ccaaagcctc aacaaggtca gggtacagag tctccaaacc attagccaaa 60
agctacagga gatcaatgaa gaatcttcaa tcaaagtaaa ctactgttcc agcacatgca 120
tcatggtcag taagtttcag aaaaagacat ccaccgaaga cttaaagtta gtgggcatct 180
ttgaaagtaa tcttgtcaac atcgagcagc tggcttgtgg ggaccagaca aaaaaggaat 240
ggtgcagaat tgttaggcgc acctaccaaa agcatctttg cctttattgc aaagataaag 300
cagattcctc tagtacaagt ggggaacaaa ataacgtgga aaagagctgt cctgacagcc 360
cactcactaa tgcgtatgac gaacgcagtg acgaccacaa aagaattagc ttgagctcag 420
gatttagcag cattccagat tgggttcaat caacaaggta cgagccatat cactttattc 480
aaattggtat cgccaaaacc aagaaggaac tcccatcctc aaaggtttgt aaggaagaat 540
tctcagtcca aagcctcaac aaggtcaggg tacagagtct ccaaaccatt agccaaaagc 600
tacaggagat caatgaagaa tcttcaatca aagtaaacta ctgttccagc acatgcatca 660
tggtcagtaa gtttcagaaa aagacatcca ccgaagactt aaagttagtg ggcatctttg 720
aaagtaatct tgtcaacatc gagcagctgg cttgtgggga ccagacaaaa aaggaatggt 780
gcagaattgt taggcgcacc taccaaaagc atctttgcct ttattgcaaa gataaagcag 840
attcctctag tacaagtggg gaacaaaata acgtggaaaa gagctgtcct gacagcccac 900
tcactaatgc gtatgacgaa cgcagtgacg accacaaaag aattccctct atataagaag 960
gcattcattc ccatttgaag gatcatcaga tacaaccatc ttccacacac tcaagccaca 1020
ctattggaga acacacaggg acaacacacc ataacggacc gaccgtcttc ggtacgcgct 1080
cactccgccc tctgcctttg ttactgccac gtttctctga atgctctctt gtgtggtgat 1140
tgctgagagt ggtttagctg gatctagaat tacactctga aatcgtgttc tgcctgtgct 1200
gattacttgc cgtcctttgt agcagcaaaa tatagggaca tggtagtacg aaacgaagat 1260
agaacctaca cagcaatacg agaaatgtgt aatttggtgc ttagcggtat ttatttaagc 1320
acatgttggt gttatagggc acttggattc agaagtttgc tgttaattta ggcacaggct 1380
tcatactaca tgggtcaata gtatagggat tcatattata ggcgatacta taataatttg 1440
ttcgtctgca gagcttatta tttgccaaaa ttagatattc ctattctgtt tttgtttgtg 1500
tgctgttaaa ttgttaacgc ctgaaggaat aaatataaat gacgaaattt tgatgtttat 1560
ctctgctcct ttattgtgac cataagtcaa gatcagatgc acttgtttta aatattgttg 1620
tctgaagaaa taagtactga cagtattttg atgcattgat ctgcttgttt gttgtaacaa 1680
aatttaaaaa taaagagttt cctttttgtt gctctcctta cctcctgatg gtatctagta 1740
tctaccaact gacactatat tgcttctctt tacatacgta tcttgctcga tgccttctcc 1800
ctagtgttga ccagtgttac tcacatagtc tttgctcatt tcattgtaat gcagatacca 1860
agcgg 1865
<210> 56
<211> 300
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 56
attaatcgat cctccgatcc cttaattacc ataccattac accatgcatc aatatccata 60
tatatataaa ccctttcgca cgtacttata ctatgttttg tcatacatat atatgtgtcg 120
aacgatcgat ctatcactga tatgatatga ttgatccatc agcctgatct ctgtatcttg 180
ttatttgtat accgtcaaat aaaagtttct tccacttgtg ttaataatta gctactctca 240
tctcatgaac cctatatata actagtttaa tttgctgtca attgaacatg atgatcgatg 300
<210> 57
<211> 892
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 57
gttagctatg ttttttttcc ctttaatatt ttaatgtatt tcttgtaata tttgtttgtg 60
tattgaagat tgaatcttga tgattgattg ttggtctgac tacagctggg ttttgtgtta 120
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tagttcttga attaaaaacc tgaaagtatt gtgcaaaaag atgctaggaa tgagactatc 300
attgttttga tgcaatatgt tcttttaagt aataggtgtt ttgtaagaag tctacgcagt 360
tctggatgta ttttactact cgggaaaact ggatagttgg atacttatta tgtataggaa 420
gtaaatgtgg ggattataat gcctttctct gccatctgct ctttgtattt tgtgtaaagc 480
ttggcatgcc tctcgtcaga tagccatcgc taccgtacat tcttttaaga atgaagcact 540
tagacacttg ctcgtttctg cctttgtcac attgacccag catcatataa tctgaaagat 600
tggttagcag ttggctgcta tttaacttgt atgttaaaac aattgatttt catgtgtatc 660
tcctcctttt gtgctttgtg cttcttcata aaagaaagaa aacatacatt cggttgtgct 720
ctcctccttt ttcaatggta gagaggaaga acagataatt ttattgctgc tgtaggtatt 780
tgacatctgt gatattttca tagtaaggtt ttgttttttc ctttttattt agttcaagat 840
tgtttcatga atttccataa gcgtaatacc atagttcttt tatttgctac ag 892
Claims (17)
- a) 서열번호 3에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 DNA 서열,
b) 서열번호 3을 포함하는 DNA 서열, 및
c) 유전자-조절 활성을 갖는, 적어도 200개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 서열번호 3의 단편
으로 이루어진 군에서 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자이며,
상기 DNA 서열은 이종성의 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 것인 재조합 DNA 분자. - 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열이 서열번호 3의 DNA 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열이 서열번호 3의 DNA 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 이종성의 전사가능한 DNA 분자가 작물학적 관심 유전자를 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
- 제4항에 있어서, 작물학적 관심 유전자가 식물에서 제초제 내성을 부여하는 것인 재조합 DNA 분자.
- 제4항에 있어서, 작물학적 관심 유전자가 식물에서 해충 저항성을 부여하는 것인 재조합 DNA 분자.
- a) 서열번호 3에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 DNA 서열,
b) 서열번호 3을 포함하는 DNA 서열, 및
c) 유전자-조절 활성을 갖는, 적어도 200개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 서열번호 3의 단편
으로 이루어진 군에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 세포(transgenic plant cell)이며,
상기 DNA 서열은 이종성의 전사가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 것인 형질전환 식물 세포. - 제7항에 있어서, 단자엽 식물 세포인 형질전환 식물 세포.
- 제7항에 있어서, 쌍자엽 식물 세포인 형질전환 식물 세포.
- 제1항에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물.
- 제1항에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물의 일부.
- 제10항의 형질전환 식물의 자손 식물이며, 상기 재조합 DNA 분자를 포함하는 자손 식물.
- 제10항의 형질전환 식물의 자손 식물의 일부이며, 상기 재조합 DNA 분자를 포함하는 자손 식물의 일부.
- 제10항의 형질전환 식물의 형질전환 종자이며, 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 종자.
- 제10항에 따른 형질전환 식물 또는 이의 일부를 획득하는 단계, 및
이로부터 농작물을 생산하는 단계
를 포함하는, 농작물의 생산 방법. - 제15항에 있어서, 농작물이 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡물, 전분, 종자, 곡식(meal), 곡분, 생물량(biomass), 또는 종자유인, 농작물의 생산 방법.
- a) 제1항의 재조합 DNA 분자로 식물 세포를 형질전환시켜(transforming) 형질전환된 식물 세포를 생성시키는 단계, 및
b) 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재생시키는 단계
를 포함하는, 형질전환 식물의 생산 방법.
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