BR112021015656A2 - Anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

Anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos Download PDF

Info

Publication number
BR112021015656A2
BR112021015656A2 BR112021015656-9A BR112021015656A BR112021015656A2 BR 112021015656 A2 BR112021015656 A2 BR 112021015656A2 BR 112021015656 A BR112021015656 A BR 112021015656A BR 112021015656 A2 BR112021015656 A2 BR 112021015656A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
sequence
cdr
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
BR112021015656-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark S. Dennis
Riley Walsh
Sherie Duncan
Kathleen Lisaingo
Kathryn M. Monroe
Joshua I. Park
Rachel Prorok
Ju Shi
Ankita SRIVASTAVA
Bettina Van Lengerich
Original Assignee
Denali Therapeutics Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Denali Therapeutics Inc. filed Critical Denali Therapeutics Inc.
Publication of BR112021015656A2 publication Critical patent/BR112021015656A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos. em um aspecto, são fornecidos anticorpos que se ligam especificamente a um receptor desencadeador humano expresso na proteína de células mieloides 2 (trem2). em algumas modalidades, o anticorpo diminui os níveis de trem2 solúvel (strem2). em algumas modalidades, o anticorpo intensifica a atividade de trem2.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTI-TREM2 E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. 62 / 808.141, depositado em 20 de fevereiro de 2019, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins.
FUNDAMENTOS
[002] O receptor desencadeador expresso nas células mieloides- 2 (TREM2) é um receptor transmembranar expresso na microglia e acredita-se que funcione na regulação da fagocitose, sobrevivência celular e produção de citocinas pró-inflamatórias. Mutações em TREM2 foram identificadas em doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer, doença de Nasu-Hakola, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e demência frontotemporal. Além disso, níveis alterados de TREM2 solúvel (sTREM2) foram relatados no líqui- do cefalorraquidiano de pacientes com doença de Alzheimer ou de- mência frontotemporal que apresentam uma mutação em TREM2.
[003] Permanece a necessidade de agentes terapêuticos que modulem a atividade de TREM2 ou os níveis de sTREM2.
BREVE SUMÁRIO
[004] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos isolados ou fra- gmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especifi- camente a um receptor desencadeador humano expresso em células mieloides 2 (TREM2). Em algumas modalidades, o anticorpo ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a TREM2 compreende: (a) uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de GFSIEDFYIH (SEQ ID NO: 29); (b) uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de W-I-D-P-E-β6-G-β8-S-K-Y-A-P-K-F-Q-G (SEQ ID NO:47), em que β6 é N ou Q e β8 é D ou E; (c) uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de HADHGNYGSTMDY (SEQ ID NO: 31); (d) uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de HASQHINVWLS (SEQ ID NO: 32); (e) uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de KASNLHT (SEQ ID NO: 33); e (f) uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de QQGQTYPRT (SEQ ID NO: 34).
[005] Em algumas modalidades, a sequência CDR-H2 é selecio- nada de SEQ ID NOS: 30, 39, 41 e 43.
[006] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende: (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (b) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou
(c) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (d) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[007] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende uma sequência VH que tem pelo me- nos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45 e 46. Em algumas modalidades, a sequência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, a sequência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, a sequência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 42. Em algumas modali- dades, a sequência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, a sequência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 45. Em algumas modalidades, a sequência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 45.
[008] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende uma sequência VL que tem pelo me- nos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, a sequência VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, a sequência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, a se- quência VL compreende a SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, a sequência VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, a sequência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, a sequência VL compreende a SEQ ID NO: 36.
[009] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende: (a) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 27 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 28; ou (b) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 35 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 36; ou (c) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 37 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 36; ou (d) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 38 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 36; ou (e) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 40 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 36; ou (f) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 42 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 36; ou (g) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 44 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 36; ou (h) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 45 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 36; ou (i) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 46 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 36.
[0010] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a TREM2 compreende: (a) uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de G-F-T-F-T-α6-F-Y-M-S (SEQ ID NO:48), em que α6 é D ou N; (b) uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de V-I-R-N-β5-β6-N-β8-Y-T-β11-β12-Y-N-P-S-V-K-G (SEQ ID NO:49), em que β5 é K ou R; β6 é A ou P; β8 é G ou A;β11 é A ou T; e β12 é G ou D; (c) uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de γ1-R-L-γ4-Y-G-F-D-Y (SEQ ID NO:50), em que γ1 é A ou T; e γ4 é T ou S; (d) uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de Q-S-S-K-S-L-L-H-S-δ10-G-K-T-Y-L-N (SEQ ID NO:51), em que δ10 é N ou T; (e) uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de WMSTRAS (SEQ ID NO: 8); e (f) uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de Q-Q-F-L-E-ϕ6-P-F-T (SEQ ID NO:52), em que ϕ6 é Y ou F.
[0011] Em algumas modalidades, a sequência CDR-H1 é selecio- nada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 e 12. Em algumas modalidades, a sequência CDR-H2 é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 13 e 25. Em algumas modalidades, a sequência CDR-H3 é selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6, 14 e 17. Em algumas modalidades, a sequência CDR-L1 é seleciona-
da a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7 e 23. Em algumas modalidades, a sequência CDR-L3 é selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 9 e 18.
[0012] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende: (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, um CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (b) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (c) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (d) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá-
cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (e) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou (f) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 12, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou (g) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
9.
[0013] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende uma sequência VH que tem pelo me- nos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26 e 79. Em algumas modalidades, a se- quência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a sequência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a sequência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24. Em algumas modali- dades, a sequência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO:24. Em algumas modalidades, a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, a sequência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 79. Em algumas modalidades, a sequência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 79. Em algumas modalidades, a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 79.
[0014] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende uma sequência VL que tem pelo me- nos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22 e 68. Em algumas modalidades, a sequência VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
16. Em algumas modalidades, a sequência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16. Em algumas modali- dades, a sequência VL compreende a SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a sequência VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, a se- quência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, a sequência VL compreen-
de a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, a sequência VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, a sequência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 68. Em algumas modali- dades, a sequência VL compreende a SEQ ID NO: 68.
[0015] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende: (a) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 16; ou (b) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 20; ou (c) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 21 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 20; ou (d) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 22; ou (e) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 79 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 22; ou (f) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 20; ou (g) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 20; ou (h) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 22; ou (i) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 22; ou (j) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 3; ou (k) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 10 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 11; ou (l) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 68.
[0016] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a TREM2 compreende: (a) uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4, 12 e 29; (b) uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 13, 25, 30, 39, 41 e 43; (c) uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6, 14, 17 e 31; (d) uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7, 23 e 32; (e) uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8 e 33; e (f) uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 9, 18 e 34.
[0017] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende: (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou (b) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (c) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (d) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (e) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (f) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá-
cidos de SEQ ID NO: 12, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (g) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (h) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (i) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 34; ou (j) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (k) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
9.
[0018] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46 e 79. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia le- ve que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36 e 68.
[0019] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno compreende: (a) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 2 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; ou
(b) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 10 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11; ou (c) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16; ou (d) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (e) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 21 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (f) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (g) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 79 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (h) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (i) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (j) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (k) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (l) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 27 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28; ou (m) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 35 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (n) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 37 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (o) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 38 e uma c VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (p) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 40 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (q) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi-
dade de sequência com a SEQ ID NO: 42 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (r) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (s) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 45 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (t) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (u) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
68.
[0020] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a TREM2 reconhece um epitopo que é o mesmo ou substancialmente o mesmo que o epitopo reconhecido por clone de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: Clone CL0020306, Clone CL0020188, Clo- ne CL0020188-1, Clone CL0020188-2, Clone CL0020188-3, Clone CL0020188-4, Clone CL0020188-5, Clone CL0020188-6, Clone CL0020188-7, Clone CL0020188-8, Clone CL0020307, Clone CL0020123, Clone CL0020123-1, Clone CL0020123-2, Clone CL0020123-3, Clone CL0020123-4, Clone CL0020123-5, Clone CL0020123-6, Clone CL0020123-7, e Clone CL0020123-8.
[0021] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno reconhece um epitopo que é o mesmo ou substan- cialmente o mesmo que o epitopo reconhecido por um clone de anti- corpo selecionado do grupo que consiste em: Clone CL0020123, Clo- ne CL0020123-1, Clone CL0020123-2, Clone CL0020123-3, Clone CL0020123-4, Clone CL0020123-5, Clone CL0020123-6, Clone CL0020123-7, e Clone CL0020123-8. Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno reconhece um ou mais dos seguintes epitopos na SEQ ID NO: 1: (i) resíduos de aminoácidos 55-63 (GEKGPCQRV (SEQ ID NO: 70)), (ii) amino ácidos 96-107 (TLRNLQPHDAGL (SEQ ID NO: 71)), e (iii) resíduos de aminoácidos 126-129 (VEVL (SEQ ID NO: 72)). Em outro aspecto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um TREM2 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo reconhece um epitopo compreendendo ou consistindo em um ou mais dos se- guintes epitopos na SEQ ID NO: 1: (i) resíduos de aminoácidos 55-63 (GEKGPCQRV (SEQ ID NO: 70)), (ii) aminoácidos 96-107 (TLRN- LQPHDAGL (SEQ ID NO: 71)), e (iii) resíduos de aminoácido 126-129 (VEVL (SEQ ID NO: 72)). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno reconhece um epitopo que é o mesmo ou substancialmente o mesmo que o epitopo reconhecido por um clone de anticorpo selecionado do grupo que consiste em: Clone CL0020188, Clone CL0020188 -1, Clone CL0020188-2, Clone CL0020188-3, Clone CL0020188-4, Clone CL0020188-5, Clone CL0020188-6, Clone CL0020188-7, Clone CL0020188-8, Clone CL0020307 e Clone CL0020306. Em modalidades particulares, o anti- corpo ou fragmento de ligação ao antígeno reconhece os resíduos de aminoácidos 143-149 (FPGESES (SEQ ID NO: 69)) na SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especifica- mente a um TREM2 humano, em que o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno do mesmo reconhece um epitopo que compreende ou consiste em resíduos de aminoácidos 143-149 (FPGESES (SEQ ID NO: 69)) em SEQ ID NO: 1.
[0022] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme divulgado neste documento, diminui os níveis de proteína TREM2 solúvel (sTREM2). Em algumas modalida- des, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme di- vulgado neste documento, liga a proteína TREM2 solúvel (sTREM2) em CSF humano saudável ou CSF cynomolgus com melhor potência em comparação com um anticorpo de referência. Em algumas modali- dades, o anticorpo de referência é representado por uma combinação de sequências selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 73 e 74; SEQ ID NOS: 75 e 76; e SEQ ID NOS: 77 e 78. Em algumas modalidades, o ensaio de potência é realizado substancialmente como descrito no Exemplo 11. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme divulgado neste docu- mento, intensifica a atividade de TREM2. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo intensifica a fagocitose ou intensifica a migração, diferenciação, função ou sobrevi- vência de células mieloides, microglia ou macrófagos. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo intensifica a função da microglia sem aumentar a neuroinfla- mação. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo intensifica a fosforilação de Syk. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo intensifica a fosforilação de Syk na presença de um ligando TREM2. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo exibe reatividade cruzada com uma proteí-
na TREM2 de cynomolgus.
[0023] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme divulgado neste documento, é um anti- corpo monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo ou frag- mento de ligação ao antígeno, conforme divulgado neste documento, é um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme divulgado neste docu- mento, é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, um an- ticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme divulgado neste documento, é um anticorpo totalmente humano. Em algumas modali- dades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme divulgado neste documento, é um Fab, um F(ab’)2, um scFv ou um scFv bivalente.
[0024] Em outro aspecto, a divulgação fornece anticorpos ou fra- gmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que competem com um anticorpo anti-TREM2 isolado, conforme divulgado neste documento, pela ligação à proteína TREM2 humana.
[0025] Em outro aspecto, a divulgação fornece composições far- macêuticas que compreendem um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme divulgado neste documento, que se liga especi- ficamente a TREM2 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0026] Em ainda outro aspecto, a divulgação fornece kits que compreendem: um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno con- forme divulgado neste documento que se liga especificamente a TREM2 ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno; e instruções de uso.
[0027] Em ainda outro aspecto, a divulgação fornece métodos de tratamento de uma doença neurodegenerativa em um indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo um anticorpo anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno con-
forme divulgado neste documento ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno conforme divulgado neste documento.
[0028] Em algumas modalidades, a doença neurodegenerativa é selecionada a partir do grupo que consiste em: doença de Alzheimer, tauopatia primária relacionada à idade, paralisia supranuclear progres- siva (PSP), demência frontotemporal, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, demência de grãos argirofíli- cos, esclerose lateral amiotrófica, complexo de esclerose lateral amio- trófica / parkinsonismo-demência de Guam (ALS-PDC), degeneração corticobasal, encefalopatia traumática crônica, doença de Creutzfeldt- Jakob, demência pugilística, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndrome de Down, demência familiar britânica, demência familiar dinamarquesa, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, tauopatia glial globular, parkinsonismo de Guadalupe com demência, PSP de Guadalupe, doença de Hallevorden-Spatz, leucoencefalopatia difusa hereditária com esferoides (HDLS), doença de Huntington, mio- site de corpos de inclusão, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia mio- tônica, doença de Nasu-Hakola, demência com predomínio de emara- nhados neurofibrilares, doença de Niemann-Pick tipo C, degeneração pallido-ponto-nigral, doença de Parkinson, doença de Pick, parkinso- nismo pós-encefalítico, amiloide cerebral de proteína de príon angiopa- tia, gliose subcortical progressiva, panencefalite esclerosante subagu- da e demência apenas emaranhada.
[0029] Em ainda outro aspecto, a divulgação fornece métodos pa- ra diminuir os níveis de sTREM2 em um indivíduo com uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo um anticorpo anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno conforme divulgado neste documento ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno conforme divulgado neste docu- mento.
[0030] Em ainda outro aspecto, a divulgação fornece métodos pa- ra intensificar a atividade de TREM2 em um indivíduo com uma doen- ça neurodegenerativa. Em algumas modalidades, o método compre- ende administrar ao indivíduo um anticorpo anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno conforme divulgado neste documento ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno conforme divulgado neste docu- mento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0031] FIG. 1 inclui histogramas de citometria de fluxo representa- tivos que representam a ligação de um anticorpo anti-TREM2 exempli- ficativo a TREM2 de superfície em células HEK que expressam TREM2.
[0032] FIG. 2 inclui uma curva de dose-resposta representativa da ativação do sinal pSyk por um anticorpo anti-TREM2 exemplificativo em células de macrófagos humanos primários. Os círculos pretos sóli- dos () representam o anticorpo anti-TREM2 e os círculos brancos abertos (º) representam o controle do isótipo.
[0033] FIGS. 3A e 3B incluem curvas de resposta à dose repre- sentativas de ativação de sinal de pSyk em células iPSC da microglia humana após pré-tratamento com anticorpos anti-TREM2 exemplifica- tivos por 5 minutos (FIG. 3A) ou por 24 horas (FIG. 3B), seguido por dosagem com vesículas lipídicas e avaliação da resposta dos liposso- mas nas células.
[0034] FIG. 4 inclui curvas de dose-resposta representativas da atividade repórter NFAT-luciferase em células Jurkat NFAT que ex- pressam TREM2 / DAP12 humano em resposta à estimulação por an- ticorpos anti-TREM2 exemplificativos. Os círculos pretos sólidos ()
representam o anticorpo anti-TREM2 e os círculos brancos abertos (º) representam o controle do isótipo.
[0035] FIG. 5 ilustra curvas de dose-resposta representativas de sobrevivência celular em células de macrófagos humanos em resposta ao tratamento com anticorpos anti-TREM2 exemplificativos.
[0036] FIG. 6 ilustra níveis representativos de TREM2 solúvel (sTREM2) como uma função da concentração de anticorpo anti- TREM2 para anticorpos anti-TREM2 exemplificativos.
[0037] FIG. 7 é um gráfico de barras que indica a intensidade mé- dia de fluorescência de pHrodo por célula em macrófagos humanos tratados com anticorpos anti-TREM2 exemplificativos.
[0038] FIG 8A é uma imagem de microscopia representativa do acúmulo de lipídeos na microglia iPSC tratada com mielina, seguida por incubação com anticorpo anti-TREM2 exemplificativo ou controle de isótipo.
[0039] FIG. 8B é um gráfico de barras representativo da coloração com Vermelho do Nilo (indicando o acúmulo de lipídeos) da microglia iPSC que foi fotografada na FIG. 8A.
[0040] FIGS. 8C-8F incluem gráficos de barras que ilustram os ní- veis quantificados de espécies de éster de colesteril (FIGS. 8C e 8E) e espécies de triacilglicerídeos lipídicos (FIGS. 8D e 8F) em microglia iPSC tratada com mielina, seguida por incubação com anticorpos anti- TREM2 exemplificativos. FIGS. 8E e 8F representam dados para mi- croglia iPSC para a qual uma etapa de lavagem de mielina foi incluída antes da incubação com os anticorpos anti-TREM2 exemplificativos.
[0041] FIG. 9 inclui perfis farmacocinéticos de plasma de camun- dongo representativos de anticorpos anti-TREM2 exemplificativos.
[0042] FIGS. 10A e 10B incluem gráficos de barras que ilustram a mudança em TREM2 solúvel total (sTREM2) (FIG. 10A) e TREM2 li- gado a anticorpo (FIG. 10B) no plasma de camundongo para anticor-
pos anti-TREM2 exemplificativos, que foram injetados em camundon- gos TREM2 cDNA KI (huTrem2KI/KI) .
[0043] FIGS. 11A e 11B incluem curvas de ligação de resposta à dose para TREM2 humano em células HEK para anticorpos anti- TREM2 humanizados e de sequência otimizada exemplificativos.
[0044] FIGS. 12A e 12B incluem curvas de dose-resposta de ati- vação de sinal pSyk por anticorpos anti-TREM2 humanizados e de se- quência otimizada exemplificativos em células HEK293-H6.
[0045] FIG. 13 ilustra curvas de dose-resposta de sobrevivência celular em células de macrófagos humanos em resposta ao tratamento com anticorpos anti-TREM2 humanizados e de sequência otimizada exemplificativos.
[0046] FIGS. 14A e 14B incluem curvas de dose-resposta de de- puração de lipídeos em microglia iPSC em resposta ao tratamento com anticorpos anti-TREM2 humanizados e de sequência otimizada exemplificativos.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. INTRODUÇÃO
[0047] TREM2 é um receptor transmembranar que é expresso na superfície celular da microglia, células dendríticas, macrófagos e oste- oclastos. Sem estar ligado a uma teoria particular, acredita-se que após a ligação do ligando, TREM2 forma um complexo de sinalização com uma proteína adaptadora transmembranar, proteína ativadora de DNAX 12 (DAP12), que por sua vez é tirosina fosforilada pela proteína cinase SRC. Acredita-se que o complexo de sinalização TREM2 / DAP12 ativado medeia a sinalização intracelular por recrutamento e fosforilação de quinases como a Syk cinase. A sinalização TREM2 / DAP12 modula atividades como fagocitose, crescimento e sobrevivên- cia celular, secreção de citocinas pró-inflamatórias e a migração de células como microglia e macrófagos. TREM2 sofre proteólise intra-
membranar regulada, na qual o TREM2 de comprimento total associa- do à membrana é clivado pela metaloprotease ADAM10 em uma por- ção sTREM2 que é eliminada da célula e um fragmento C-terminal re- tido por membrana que é posteriormente degradado por uma gama- secretase. Níveis alterados de sTREM2 foram relatados em pacientes com doença de Alzheimer ou demência frontotemporal e com uma mu- tação em TREM2. Além disso, as mutações em TREM2 estão associ- adas a funções alteradas, como fagocitose prejudicada e função mi- croglial reduzida.
[0048] Conforme detalhado na seção de Exemplos abaixo, foram gerados anticorpos que se ligam especificamente a TREM2 humano e que modulam uma ou mais funções a jusante do complexo de sinali- zação TREM2 / DAP12. Por conseguinte, em um aspecto, a presente divulgação fornece anticorpos anti-TREM2 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Por conseguinte, em um aspecto, a presente divulgação fornece anticorpos anti-TREM2 e porções de ligação ao antígeno dos mesmos.
[0049] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM2 inten- sificam a atividade de TREM2, por exemplo, intensificam a fagocitose ou intensificam a diferenciação, função, migração ou sobrevivência de células mieloides, microglia ou macrófagos. Assim, em outro aspecto, são fornecidos métodos para intensificar a atividade de TREM2, por exemplo, em um indivíduo com uma doença neurodegenerativa.
[0050] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM2 redu- zem a liberação de sTREM2. Assim, em outro aspecto, são fornecidos métodos para diminuir os níveis de sTREM2, por exemplo, em um in- divíduo com uma doença neurodegenerativa. II. DEFINIÇÕES
[0051] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um/uma", "um/uma" e "o/a" incluem as formas do plural referentes, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um anticorpo" inclui opcionalmente uma com- binação de duas ou mais dessas moléculas e semelhantes.
[0052] Conforme usado neste documento, os termos "cerca de" e "aproximadamente", quando usados para modificar uma quantidade especificada em um valor numérico ou faixa indicam que o valor numé- rico, bem como desvios razoáveis do valor conhecido por um versado na técnica, por exemplo ± 20%, ± 10% ou ± 5%, estão dentro do signi- ficado pretendido do valor recitado.
[0053] Como utilizado neste documento, o termo "proteína TREM2" refere-se a um receptor desencadeador expresso na proteína das células mieloides 2 que é codificado pelo gene TREM2. Como uti- lizado neste documento, uma "proteína TREM2" refere-se a uma prote- ína TREM2 nativa (ou seja, tipo selvagem) de qualquer vertebrado, tal como, mas não se limitando a humanos, primatas não humanos (por exemplo, macaco cynomolgus), roedores (por exemplo, camundongos, rato) e outros mamíferos. Em algumas modalidades, uma proteína TREM2 é uma proteína TREM2 humana com a sequência identificada no número de acessão UniprotKB Q9NZC2 (SEQ ID NO: 1).
[0054] Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo anti- TREM2" refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína TREM2 (por exemplo, TREM2 humano).
[0055] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo" se refere a uma proteína com uma dobra de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno por meio de suas regiões variáveis. O termo abrange anticorpos policlonais intactos, anticorpos monoclonais intactos, anticorpos da cadeia única, anticorpos multiespecíficos, tais como anticorpos biespecíficos, anticorpos monoespecíficos, anticorpos monovalentes, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anti- corpos humanos. O termo "anticorpo", como utilizado neste documen-
to, também inclui fragmentos de anticorpo que retêm a especificidade de ligação por meio de suas regiões variáveis, incluindo, mas não se limitando a Fab, F(ab’)2, Fv, scFv, e scFv bivalente. Os anticorpos po- dem conter cadeias leves que são classificadas como kappa ou lamb- da. Os anticorpos podem conter cadeias pesadas que são classifica- das como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectiva- mente.
[0056] Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplificativa compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos da cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kD). O N-terminal de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsável pelo reconhecimento do antígeno. Os termos "cadeia leve variável" (VL) e "cadeia pesada variável" (VH) referem-se a essas cadeias leve e pesa- da, respectivamente.
[0057] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se a um domínio em uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que é deriva- da de um gene de Variável (V) de linhagem germinativa, gene de Di- versidade (D) ou gene de União (J) (e não derivado de um segmento de gene Constante (Cμ e Cδ)), e que dá a um anticorpo sua especifici- dade para a ligação a um antígeno. Normalmente, uma região variável de anticorpo compreende quatro regiões conservadas de "estrutura" intercaladas com três "regiões determinantes de complementaridade" hipervariáveis.
[0058] O termo "região determinante de complementaridade" ou "CDR" refere-se às três regiões hipervariáveis em cada cadeia que interrompem as quatro regiões estruturais estabelecidas pelas regiões variáveis da cadeia leve e pesada. As CDRs são as principais respon-
sáveis pela ligação de anticorpo a um epitopo de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente a partir do terminal N e também são tipicamente identificadas pela cadeia na qual a CDR específica está localizada. Assim, um VH CDR3 ou CDR-H3 está localizado na região variável da cadeia pesada do anticorpo em que é encontrado, enquanto um VL CDR1 ou CDR-L1 é a CDR1 da região variável da ca- deia leve do anticorpo em que se encontra.
[0059] As "regiões estruturais" ou "FRs" de diferentes cadeias le- ves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espé- cie. A região estrutural de um anticorpo, ou seja, as regiões estruturais combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, servem para posicionar e alinhar as CDRs no espaço tridimensional. As sequências estruturais podem ser obtidas de bancos de dados públicos de DNA ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticor- pos da linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA de linhagem germinativa para genes de região variável da cadeia leve e pesada humana podem ser encontradas no banco de dados de se- quência de gene variável de linhagem germinativa "VBASE2" para se- quências de humanos e camundongos.
[0060] As sequências de aminoácidos das CDRs e regiões estrutu- rais podem ser determinadas usando várias definições bem conheci- das na técnica, por exemplo, Kabat, Chothia, banco de dados interna- cional ImMunoGeneTics (IMGT), AbM e contatos de antígenos obser- vados ("Contato"). Em algumas modalidades, as CDRs são determina- das de acordo com a definição de contato. Ver, MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996). Em algumas modalidades, as CDRs são determinadas por uma combinação de definições de Kabat, Chothia e / ou CDR de contato.
[0061] Os termos "porção de ligação ao antígeno" e "fragmento de ligação ao antígeno" são usados indistintamente aqui e se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, uma proteína TREM2) por meio de sua região variável. Exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a, um fragmento Fab (um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1), fragmento F(ab')2 (um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de do- bradiça), Fv da cadeia simples (scFv), Fv ligado por dissulfeto (dsFv), regiões determinantes de complementaridade (CDRs), um VL (região variável da cadeia leve) e um VH (região variável da cadeia pesada).
[0062] O termo "epitopo" refere-se à área ou região de um antíge- no à qual as CDRs de um anticorpo, se ligam especificamente e po- dem incluir alguns aminoácidos ou porções de alguns aminoácidos, por exemplo 5 ou 6, ou mais, por exemplo, 20 ou mais aminoácidos, ou porções desses aminoácidos. Por exemplo, onde o alvo é uma pro- teína, o epitopo pode ser composto de aminoácidos consecutivos (por exemplo, um epitopo linear), ou aminoácidos de diferentes partes da proteína que são colocados em proximidade pelo dobramento de pro- teína (por exemplo, um epitopo descontínuo ou conformacional). Em algumas modalidades, o epitopo é fosforilado em um aminoácido (por exemplo, em um resíduo de serina ou treonina).
[0063] Como utilizado neste documento, a frase "reconhece um epitopo", conforme usado com referência a um anticorpo anti-TREM2, significa que as CDRs do anticorpo interagem com ou se ligam especi- ficamente ao antígeno (ou seja, a proteína TREM2) naquele epitopo ou uma porção do antígeno contendo esse epitopo.
[0064] Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo multi- específico" refere-se a um anticorpo que compreende duas ou mais porções de ligação ao antígeno diferentes, em que cada porção de li-
gação ao antígeno compreende uma região variável diferente que re- conhece um antígeno diferente, ou um fragmento ou porção do anti- corpo que se liga a dois ou mais antígenos diferentes por meio de su- as regiões variáveis. Como utilizado neste documento, o termo "anti- corpo biespecífico" refere-se a um anticorpo que compreende duas porções de ligação ao antígeno diferentes, em que cada porção de li- gação ao antígeno compreende uma região variável diferente que re- conhece um antígeno diferente, ou um fragmento ou porção do anti- corpo que se liga a dois antígenos diferentes por meio de suas regiões variáveis.
[0065] Um "anticorpo monoclonal" refere-se a anticorpos produzi- dos por um único clone de células ou uma única linhagem celular e consistindo em ou consistindo essencialmente em moléculas de anti- corpo que são idênticas em sua sequência de aminoácidos primária.
[0066] Um "anticorpo policlonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população heterogênea de anticorpos em que diferentes anticorpos na população se ligam a diferentes epitopos de um antíge- no.
[0067] Um "anticorpo quimérico" refere-se a uma molécula de anti- corpo na qual a região constante, ou uma porção da mesma, é altera- da, substituída ou trocada de modo que o sítio de ligação ao antígeno (isto é, região variável, CDR ou porção do mesmo) seja ligado a uma região constante de uma classe diferente ou alterada, função efetora e / ou espécie, ou em que a região variável, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída ou trocada por uma região variável com uma es- pecificidade de antígeno diferente ou alterada (por exemplo, CDR e regiões de estrutura de diferentes espécies). Em algumas modalida- des, um anticorpo quimérico é um anticorpo monoclonal que compre- ende uma região variável de uma fonte ou espécie (por exemplo, ca- mundongo) e uma região constante derivada de uma segunda fonte ou espécie (por exemplo, humano). Os métodos para a produção de anti- corpos quiméricos são descritos na técnica.
[0068] Um "anticorpo humanizado" é uma imunoglobulina quiméri- ca derivada de uma fonte não humana (por exemplo, murina) que con- tém sequências mínimas derivadas da imunoglobulina não humana fora das CDRs. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá pelo menos um (por exemplo, dois) domínio(s) variável(is) de ligação ao antígeno, em que as regiões CDR correspondem substancialmente às da imunoglobulina não humana e as regiões estruturais correspon- dem substancialmente às de uma sequência de imunoglobulina huma- na. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipica- mente aquela de uma sequência de imunoglobulina humana. Os mé- todos de humanização de anticorpos são conhecidos na técnica.
[0069] Um "anticorpo humano" ou um "anticorpo totalmente huma- no" é um anticorpo com sequências da cadeia pesada e da cadeia leve humanas, tipicamente derivadas de genes da linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, o anticorpo é produzido por uma célula humana, por um animal não humano que utiliza repertórios de anticorpos humanos (por exemplo, camundongos transgênicos que são geneticamente modificados para expressar sequências de anticor- pos humanos) ou por plataformas de exibição de fago.
[0070] O termo "liga-se especificamente" refere-se a uma molécula (por exemplo, um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo) que se liga a um epitopo ou alvo com maior afinidade, maior avidez e / ou maior duração para esse epitopo ou alvo em uma amos- tra do que se liga a outro epitopo ou composto não alvo (por exemplo, um antígeno estruturalmente diferente). Em algumas modalidades, um anticorpo (ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo) que se liga especificamente a um epitopo ou alvo é um anticorpo (ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo) que se liga ao epitopo ou alvo com afinidade pelo menos 5 vezes maior do que outros epitopos ou compostos não alvo, por exemplo, pelo menos 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes,
1.000 vezes, 10.000 vezes ou maior. O termo "ligação específica", "li- ga-se especificamente a" ou "é específico para" um determinado epi- topo ou alvo, como utilizado neste documento, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com uma constante de dissociação de equilíbrio KD para o epitopo ou alvo ao qual se liga, por exemplo, 10-4 M ou menor, por exemplo, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, ou 10-12 M. Será reconhecido por um versado que um anti- corpo que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, uma prote- ína TREM2) de uma espécie também pode se ligar especificamente a ortólogos desse alvo (por exemplo, a proteína TREM2).
[0071] O termo "afinidade de ligação" é usado neste documento para se referir à força de uma interação não covalente entre duas mo- léculas, por exemplo, entre um anticorpo (ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo) e um antígeno. Assim, por exemplo, o termo po- de referir-se a interações 1:1 entre um anticorpo (ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo) e um antígeno, a menos que indicado de outra forma ou claro do contexto. A afinidade de ligação pode ser quantificada medindo uma constante de dissociação de equilíbrio (KD), que se refere à constante de taxa de dissociação (kd, tempo-1) dividida pela constante de taxa de associação (ka, tempo-1 M-1). A KD pode ser determinada pela medição da cinética de formação e dissociação do complexo, por exemplo, usando métodos de ressonância de plasma de superfície (SPR), por exemplo, um sistema Biacore™; ensaios de exclusão cinética como KinExA®; e interferometria BioLayer (por exemplo, usando a plataforma ForteBio® Octet). Como utilizado neste documento, "afinidade de ligação" inclui não apenas afinidades de li-
gação formais, como aquelas que refletem interações 1:1 entre um an- ticorpo (ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo) e um antí- geno, mas também afinidades aparentes para as quais os valores de KD são calculados que podem refletir a ligação ávida.
[0072] O termo "reação cruzada", como utilizado neste documento, refere-se à capacidade de um anticorpo se ligar a um antígeno diferen- te do antígeno contra o qual o anticorpo foi criado. Em algumas moda- lidades, a reatividade cruzada se refere à capacidade de um anticorpo se ligar a um antígeno de outra espécie que não o antígeno contra o qual o anticorpo foi criado. Como um exemplo não limitativo, um anti- corpo anti-TREM2 como aqui descrito que é criado contra um peptídeo TREM2 humano pode exibir reatividade cruzada com um peptídeo TREM2 ou proteína de uma espécie diferente (por exemplo, macaco ou camundongo).
[0073] O termo "isolado", conforme usado com referência a um ácido nucleico ou proteína (por exemplo,anticorpo), denota que o ácido nucleico ou proteína é essencialmente livre de outros componentes celulares com os quais está associado no estado natural. Pureza e homogeneidade são normalmente determinadas usando técnicas de química analítica, como eletroforese (por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida) ou cromatografia (por exemplo, cromatografia líqui- da de alto desempenho). Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou proteína isolada (por exemplo, ) é pelo menos 85% puro, pelo me- nos 90% puro, pelo menos 95% puro ou pelo menos 99% puro.
[0074] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos sintéticos e naturais, bem como análogos e miméticos de aminoácidos que funcio- nam de maneira semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são modificados pos- teriormente, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-
fosfoserina. Os α-aminoácidos de ocorrência natural incluem, sem limi- tação, alanina (Ala), cisteína (Cys), ácido aspártico (Asp), ácido glutâ- mico (Glu), fenilalanina (Phe), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), arginina (Arg), lisina (Lys), leucina (Leu), metionina (Met), aspa- ragina (Asn), prolina (Pro), glutamina (Gln), serina (Ser), treonina (Thr), valina (Val), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e combinações dos mesmos. Os estereoisômeros de α-aminoácidos de ocorrência natural incluem, sem limitação, D-alanina (D-Ala), D-cisteína (D-Cys), ácido D-aspártico (D-Asp), ácido D-glutâmico (D-Glu ), D-fenilalanina (D-Phe), D-histidina (D-His), D-isoleucina (D-Ile), D-arginina (D-Arg), D-lisina (D-Lys), D- leucina (D-Leu), D-metionina (D-Met), D-asparagina (D-Asn), D-prolina (D-Pro), D-glutamina (D-Gln), D-serina (D-Ser), D-treonina (D-Thr), D- valina (D-Val), D-triptofano (D-Trp), D-tirosina (D-Tyr) e combinações dos mesmos. "Análogos de aminoácidos" referem-se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica que um aminoácido natu- ral, isto é, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxil, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina e metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou es- truturas peptídicas modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. "Miméticos de ami- noácidos" referem-se a compostos químicos que possuem uma estru- tura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira semelhante a um aminoácido de ocorrência na- tural. Os aminoácidos podem ser aqui referidos pelos seus símbolos de três letras vulgarmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC- IUB.
[0075] Os termos "polipeptídeo" e "peptídeo" são usados indistin- tamente neste documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos em uma única cadeia. Os termos se aplicam a políme- ros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente natural, bem como a polímeros de aminoácidos naturais e a um polí- meros de aminoácidos de ocorrência não natural. Os polímeros de aminoácidos podem compreender inteiramente L-aminoácidos, intei- ramente D-aminoácidos ou uma mistura de L e D aminoácidos.
[0076] O termo "proteína", como utilizado neste documento, refere- se a um polipeptídeo ou dímero (isto é, dois) ou multímero (isto é, três ou mais) de polipeptídeos da cadeia simples. Os polipeptídeos da ca- deia simples de uma proteína podem ser unidos por uma ligação cova- lente, por exemplo, uma ligação dissulfeto ou interações não covalen- tes.
[0077] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" se referem indistintamente a cadeias de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotí- deos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados e / ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em uma cadeia por DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode com- preender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Exemplos de polinucleotídeos aqui contemplados incluem DNA de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla e moléculas híbridas com misturas de DNA e RNA de fita simples e du- pla.
[0078] Os termos "substituição conservativa" e "mutação conser- vadora" referem-se a uma alteração que resulta na substituição de um aminoácido por outro aminoácido que pode ser categorizado como tendo uma característica semelhante. Exemplos de categorias de gru- pos de aminoácidos conservadores definidos desta maneira podem incluir: um "grupo carregado / polar" incluindo Glu (Ácido glutâmico ou
E), Asp (Ácido aspártico ou D), Asn (Asparagina ou N), Gln (Glutamina ou Q), Lys (Lisina ou K), Arg (Arginina ou R) e His (Histidina ou H); um "grupo aromático" incluindo Phe (Fenilalanina ou F), Tyr (Tirosina ou Y), Trp (Triptofano ou W) e (Histidina ou H); e um "grupo alifático" in- cluindo Gly (Glicina ou G), Ala (Alanina ou A), Val (Valina ou V), Leu (Leucina ou L), Ile (Isoleucina ou I), Met (Metionina ou M), Ser (Serina ou S), Thr (Treonina ou T) e Cys (Cisteína ou C). Dentro de cada gru- po, os subgrupos também podem ser identificados. Por exemplo, o grupo de aminoácidos carregados ou polares pode ser subdividido em subgrupos, incluindo: um "subgrupo carregado positivamente" com- preendendo Lys, Arg e His; um "subgrupo carregado negativamente" compreendendo Glu e Asp; e um "subgrupo polar" compreendendo Asn e Gln. Em outro exemplo, o grupo aromático ou cíclico pode ser subdividido em subgrupos, incluindo: um "subgrupo do anel de nitro- gênio" compreendendo Pro, His e Trp; e um "subgrupo fenil" compre- endendo Phe e Tyr. Em outro exemplo adicional, o grupo alifático pode ser subdividido em subgrupos, por exemplo, um "subgrupo alifático não polar" compreendendo Val, Leu, Gly e Ala; e um "subgrupo alifáti- co ligeiramente polar" compreendendo Met, Ser, Thr e Cys. Exemplos de categorias de mutações conservativas incluem substituições de aminoácidos de aminoácidos dentro dos subgrupos acima, tais como, mas não se limitando a: Lys por Arg ou vice-versa, de modo que uma carga positiva possa ser mantida; Glu para Asp ou vice-versa, de mo- do que uma carga negativa possa ser mantida; Ser para Thr ou vice- versa, de modo que um -OH livre possa ser mantido; e Gln para Asn ou vice-versa, de modo que um -NH2 livre possa ser mantido. Em al- gumas modalidades, os aminoácidos hidrofóbicos são substituídos por aminoácidos hidrofóbicos de ocorrência natural, por exemplo, no sítio ativo, para preservar a hidrofobicidade.
[0079] Os termos "idêntico" ou porcentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências polipeptídicas, referem-se a du- as ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou mais, que são idênticos em uma região especificada quando comparados e alinhados para correspondência máxima em uma janela de comparação ou região designada, medida usando um algoritmo de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual.
[0080] Para comparação de sequência de polipeptídeos, normal- mente uma sequência de aminoácidos atua como uma sequência de referência, à qual uma sequência candidata é comparada. O alinha- mento pode ser realizado usando vários métodos disponíveis para um versado na técnica, por exemplo, alinhamento visual ou usando sof- tware disponível publicamente usando algoritmos conhecidos para atingir o alinhamento máximo. Esses programas incluem os programas BLAST, ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Califór- nia) ou Megalign (DNASTAR). Os parâmetros empregados para um alinhamento para atingir o alinhamento máximo podem ser determina- dos por um versado na técnica. Para comparação de sequências de sequências polipeptídicas para fins deste pedido, é usado o algoritmo BLASTP da proteína padrão BLAST para alinhar a sequência de duas proteínas com os parâmetros padrão.
[0081] Os termos "indivíduo", "indivíduo" e "paciente", conforme usados indistintamente aqui, referem-se a um mamífero, incluindo, mas não se limitando a humanos, primatas não humanos, roedores (por exemplo, ratos, camundongos e porquinhos-da-índia), coelhos, vacas, porcos, cavalos e outras espécies de mamíferos. Em uma mo- dalidade, o indivíduo, indivíduo ou paciente é um ser humano.
[0082] Os termos "tratando", "tratamento" e semelhantes são usa- dos neste documento para geralmente significar a obtenção de um efeito farmacológico e / ou fisiológico desejado. "Tratar" ou "tratamen- to" pode referir-se a quaisquer indícios de sucesso no tratamento ou melhoria de uma doença neurodegenerativa (por exemplo, doença de Alzheimer ou outra doença neurodegenerativa aqui descrita), incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo, como redução, remissão, melhora na sobrevida do paciente, aumento no tempo ou taxa de so- brevida, diminuição dos sintomas ou tornando a doença mais tolerável para o paciente, diminuindo a taxa de degeneração ou declínio, ou me- lhorando o bem-estar físico ou mental do paciente. O tratamento ou melhora dos sintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos. O efeito do tratamento pode ser comparado a um indivíduo ou grupo de indivíduos que não estão recebendo o tratamento, ou ao mesmo paciente antes do tratamento ou em um momento diferente durante o tratamento.
[0083] O termo "excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente farmacêutico não ativo que é biologicamente ou far- macologicamente compatível para uso em humanos ou animais, tal como, mas não limitado a um tampão, transportador ou conservante.
[0084] Como utilizado neste documento, uma "quantidade terapêu- tica" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente (por exemplo, um anticorpo como aqui descrito) é uma quantidade do agente que trata, alivia, diminui ou reduz a gravidade dos sintomas de uma doença em um indivíduo. Uma "quantidade terapêutica" de um agente (por exemplo, um anticorpo como aqui descrito) pode melhorar a sobrevivência do paciente, aumentar o tempo ou taxa de sobrevi- vência, diminuir os sintomas, tornar uma lesão, doença ou condição (por exemplo, uma doença neurodegenerativa) mais tolerável, reduzir a taxa de degeneração ou declínio, ou melhorar o bem-estar físico ou mental de um paciente.
[0085] O termo "administrar" refere-se a um método de distribuição de agentes, compostos ou composições ao local desejado de ação biológica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, distribui- ção tópica, distribuição parenteral, distribuição intravenosa, distribui- ção intradérmica, distribuição intramuscular, distribuição intratecal, dis- tribuição colônica, distribuição retal ou distribuição intraperitoneal. Em uma modalidade, um anticorpo como aqui descrito é administrado por via intravenosa.
[0086] O termo "controle" ou "valor de controle" refere-se a um va- lor de referência ou valor de linha de base. Os controles apropriados podem ser determinados por um versado na técnica. Em alguns casos, os valores de controle podem ser determinados em relação a uma li- nha de base dentro do mesmo indivíduo ou experimento, por exemplo, uma medição de sTREM2 feita antes do tratamento com um anticorpo anti-TREM2 pode ser um valor de controle para uma medição pós- tratamento dos níveis de sTREM2 no mesmo indivíduo. Em outros ca- sos, o valor de controle pode ser determinado em relação a um indiví- duo de controle (por exemplo, um controle saudável ou um controle de doença) ou um valor médio em uma população de indivíduos de con- trole (por exemplo, controles saudáveis ou controles de doença, por exemplo, uma população de 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 indivíduos de controle ou mais), por exemplo, uma medição do nível de sTREM2 de um indivíduo na linha de base ou após o tratamento pode ser com- parada a um valor de controle saudável. III. ANTICORPOS ANTI-TREM2
[0087] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a uma proteína TREM2. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga especi- ficamente a uma proteína TREM2 humana. Em algumas modalidades,
um anticorpo anti-TREM2 é seletivo para TREM2 em relação a outros receptores semelhantes a TREM (por exemplo, TREM1).
[0088] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR), região variável da cadeia pesada e / ou sequências da região variável da cadeia leve, conforme divulgado nes- te documento. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma ou mais CDR, região variável da cadeia pesada e / ou sequências de região variável da cadeia leve, conforme divulgado neste documento e compreende ainda uma ou mais características funcionais conforme divulgado neste documento, por exemplo, um an- ticorpo que intensifica a atividade de TREM2 (por exemplo, intensifica a fagocitose ou intensifica a migração, diferenciação, função ou sobre- vivência de uma célula, como uma célula mieloide, microglia ou macró- fago) ou um anticorpo que diminui os níveis de sTREM2. Sequências de anticorpos anti-TREM2
[0089] Em algumas modalidades, um anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência da cadeia pesada, ou uma porção da mesma, e / ou uma sequência da cadeia leve, ou uma porção da mesma, derivada de qualquer um dos seguin- tes anticorpos anti-TREM2 aqui descritos: Clone CL0020306, Clone CL0020188, Clone CL0020307 e Clone CL0020123. A CDR, a região variável da cadeia pesada e as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve destes clones são apresentadas na Listagem de Sequências Informais. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- TREM2 é um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-TREM2 é um anticorpo humanizado e / ou maturado por afinidade.
[0090] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende um ou mais CDRs selecionados do grupo que consiste em:
(a) uma sequência CDR1 (CDR-H1) da cadeia pesada ten- do pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4, 12 e 29 ou tendo até duas substituições de aminoácidos em relação ao sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4, 12 e 29; (b) uma sequência CDR2 (CDR-H2) da cadeia pesada ten- do pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 13, 25, 30, 39, 41 e 43 ou tendo até duas substituições de aminoácidos em relação à se- quência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 13, 25, 30, 39, 41 e 43; (c) uma sequência CDR3 da cadeia pesada (CDR-H3) ten- do pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6, 14, 17 e 31 ou tendo até duas substituições de aminoácidos relativas à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6, 14, 17 e 31; (d) uma sequência CDR1 (CDR-L1) da cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7, 23 e 32 ou tendo até duas substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7, 23 e 32; (e) uma sequência CDR2 (CDR-L2) da cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8 e 33 ou tendo até duas substituições de aminoácidos em relação à sequência de amino- ácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8 e 33; e (f) uma sequência CDR3 da cadeia leve (CDR-L3) tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 9, 18 e 34 ou tendo até duas substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 9, 18 e 34.
[0091] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende dois, três, quatro, cinco ou todos os seis de (a)-(f). Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende a CDR-H1 de (a), a CDR-H2 de (b) e a CDR-H3 de (c). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende a CDR-L1 de (d), a CDR-L2 de (e) e a CDR-L3 de (f). Em algumas modalidades, uma CDR com até duas substituições de aminoácidos tem uma substituição de aminoáci- dos em relação à sequência de referência. Em algumas modalidades, uma CDR com até duas substituições de aminoácidos tem duas subs- tituições de aminoácidos em relação à sequência de referência. Em algumas modalidades, as até duas substituições de aminoácidos são substituições conservativas.
[0092] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende um ou mais CDRs selecionados do grupo que consiste em: (a) uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4, 12 e 29; (b) uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 13, 25, 30, 39, 41 e 43; (c) uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6, 14, 17 e 31; (d) uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7, 23 e 32; (e) uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8 e 33; e (f) uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 9, 18 e 34.
[0093] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende dois, três, quatro, cinco ou todos os seis de (a)-(f). Em algu-
mas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende a CDR-H1 de (a), a CDR-H2 de (b) e a CDR-H3 de (c). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende a CDR-L1 de (d), a CDR-L2 de (e) e a CDR-L3 de (f).
[0094] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende: (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou (b) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (c) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou
(d) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (e) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (f) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 12, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou (g) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (h) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (i) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (j) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[0095] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46 e 79. Em algumas modalidades, um anti- TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesada compre- endendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46 e 79.
[0096] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36 e 68. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de amino- ácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36 e
68.
[0097] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende: uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46, e 79, e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36 e 68. Em algumas modalidades, um anti-TREM2 compreende: uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46 e 79, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36 e 68.
[0098] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com-
preende: (a) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 2 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; ou (b) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 10 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11; ou (c) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16; ou (d) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (e) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 21 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (f) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (g) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 79 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (h) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (i) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (j) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (k) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (l) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 27 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28; ou (m) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 35 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (n) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 37 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (o) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 38 e uma c VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (p) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi-
dade de sequência com a SEQ ID NO: 40 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (q) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 42 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (r) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (s) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 45 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (t) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (u) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
68.
[0099] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma ou mais sequências que são abrangidas por uma se- quência de consenso divulgada neste documento. Como um exemplo não limitativo, as sequências de consenso podem ser identificadas ali- nhando as sequências da cadeia pesada ou da cadeia leve (por exemplo, CDRs) para anticorpos que são das mesmas (ou semelhan- tes) linhagens germinativas. Em algumas modalidades, as sequências de consenso podem ser geradas a partir de anticorpos que contêm sequências que são do mesmo (ou semelhante) comprimento e / ou têm pelo menos uma CDR altamente semelhante (por exemplo, uma CDR3 altamente semelhante). Em algumas modalidades, tais sequên- cias nestes anticorpos podem ser alinhadas e comparadas para identi- ficar aminoácidos conservados ou motivos (isto é, onde a alteração nas sequências pode alterar a função da proteína) e / ou regiões onde ocorre variação nas sequências (isto é, onde a variação de sequência é provavelmente não afetará significativamente a função da proteína). Alternativamente, as sequências de consenso podem ser identificadas alinhando sequências da cadeia pesada ou leve (por exemplo, CDRs) para anticorpos que se ligam aos mesmos ou semelhantes (por exem- plo, sobreposição) epitopos para determinar aminoácidos conservados ou motivos (ou seja, onde a alteração nas sequências pode alterar a função da proteína) e regiões onde a variação ocorre no alinhamento das sequências (isto é, onde a variação de sequência provavelmente não afetará significativamente a função da proteína). Em algumas mo- dalidades, uma ou mais sequências de consenso podem ser identifi- cadas para anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo ou seme- lhante como um anticorpo anti-TREM2, conforme divulgado neste do- cumento.
Sequências de consenso exemplificativas incluem SEQ ID NOS: 47-52. Nas sequências de consenso de SEQ ID NOS: 47-52, a letra maiúscula representa um resíduo de aminoácido que é absoluta- mente conservado entre as sequências alinhadas (por exemplo, se- quências CDR alinhadas), enquanto um "X" ou uma letra grega (por exemplo, "α," "β," "γ," "δ," "ε," ou "φ") representa um resíduo de ami- noácido que não é absolutamente conservado entre as sequências alinhadas.
Será apreciado que, ao selecionar um aminoácido para in- serir em uma posição marcada por um "X" ou por uma letra grega, em algumas modalidades o aminoácido é selecionado a partir daqueles aminoácidos encontrados na posição correspondente nas sequências alinhadas. Clone CL0020123 e variantes de CL0020123
[00100] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de GFSIEDFYIH (SEQ ID NO: 29); (b) uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de W-I-D-P-E-β6-G-β8-S-K-Y-A-P-K-F-Q-G (SEQ ID NO:47), em que β6 é N ou Q e β8 é D ou E; (c) uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de HADHGNYGSTMDY (SEQ ID NO: 31); (d) uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de HASQHINVWLS (SEQ ID NO: 32); (e) uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de KASNLHT (SEQ ID NO: 33); e (f) uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de QQGQTYPRT (SEQ ID NO: 34).
[00101] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência CDR-H2 que é selecionada a partir de SEQ ID NOS: 30, 39, 41 e 43.
[00102] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para qual- quer uma das SEQ ID NOS: 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45 e 46. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 27, 35, 37, 38, 40,
42, 44, 45 e 46.
[00103] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para qual- quer uma das SEQ ID NOS: 28 e 36. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:28 e 36.
[00104] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, uma sequência CDR-H2 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 32, uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[00105] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[00106] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
[00107] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 27 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
[00108] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1-3 da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 29, 30 e 31, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, um anti- corpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 32, 33 e 34, respectiva- mente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 28.
[00109] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo como aqui des- crito (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma CDR1-3 da ca- deia pesada e uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33 e 34, respectivamente, ou um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28).
[00110] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, uma sequência CDR-H2 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 32, uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[00111] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NOS:42. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pe- sada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
42.
[00112] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se-
quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, um an- ticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[00113] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 42 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[00114] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1-3 da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOs: 29, 43 e 31, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1-3 da ca- deia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de se- quência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 36.
[00115] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo como aqui des- crito (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma CDR1-3 da ca- deia pesada e uma CDR1-3 da cadeia peleve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 29, 43, 31, 32, 33 e 34, respectivamente, ou um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36).
[00116] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, uma sequência CDR-H2 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 32, uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[00117] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, um an- ticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesa- da que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45.
[00118] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, um an- ticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[00119] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 45 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[00120] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1-3 da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOs: 29, 41 e 31, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1-3 da ca- deia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de se- quência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 36.
[00121] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo como aqui des- crito (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma CDR1-3 da ca- deia pesada e uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 29, 41, 31, 32, 33 e 34,
respectivamente, ou um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36). Clones CL0020188, CL0020306, CL0020307 e variantes de CL0020188
[00122] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de G-F-T-F-T-α6-F-Y-M-S (SEQ ID NO:48), em que α6 é D ou N; (b) uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de V-I-R-N-β5-β6-N-β8-Y-T-β11-β12-Y-N-P-S-V-K-G (SEQ ID NO:49), em que β5 é K ou R; β6 é A ou P; β8 é G ou A;β11 é A ou T; e β12 é G ou D; (c) uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de γ1-R-L-γ4-Y-G-F-D-Y (SEQ ID NO:50), em que γ1 é A ou T; e γ4 é T ou S; (d) uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de Q-S-S-K-S-L-L-H-S-δ10-G-K-T-Y-L-N (SEQ ID NO:51), em que δ10 é N ou T; (e) uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de WMSTRAS (SEQ ID NO: 8); e (f) uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de Q-Q-F-L-E-ϕ6-P-F-T (SEQ ID NO:52), em que ϕ6 é Y ou F.
[00123] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência CDR-H1 que é selecionada a partir de SEQ ID NOS: 4 e 12. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma sequência CDR-H2 que é selecionada a partir de SEQ ID NOS: 5, 13, e 25. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma sequência CDR-H3 que é selecionada a partir de SEQ ID NOS: 6, 14 e 17. Em algumas modalidades, um anti- corpo anti-TREM2 compreende uma sequência CDR-L1 que é seleci- onada a partir de SEQ ID NOS: 7 e 23. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma sequência CDR-L3 que é se- lecionada a partir de SEQ ID NOS: 9 e 18.
[00124] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para qual- quer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, e 79. Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoáci- dos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26 e 79.
[00125] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para qual- quer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22, e 68. Em algumas mo- dalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de qual- quer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22, e 68. Clone CL0020188 e variantes de CL0020188
[00126] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma sequência CDR-H2 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoá-
cidos de SEQ ID NO: 7, uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[00127] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
[00128] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
[00129] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 15 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a se-
quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
[00130] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1-3 da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 4, 5 e 17, respectivamente, e que tem pelo me- nos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, um anti- corpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 7, 8 e 18, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pe- lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 16.
[00131] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo como aqui des- crito (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma CDR1-3 da ca- deia pesada e uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 5, 17, 7, 8 e 18, respecti- vamente, ou um anticorpo compreendendo uma região variável da ca- deia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16).
[00132] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma sequência CDR-H2 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
17, uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 23, uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[00133] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 79. Em algumas modalidades, um an- ticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesa- da que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.
[00134] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, um an- ticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
[00135] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 79 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
[00136] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1-3 da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOs: 4, 5 e 17, respectivamente, e que tem pelo me- nos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 79. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1-3 da ca- deia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 23, 8 e 18, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de se- quência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 22.
[00137] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo como aqui des- crito (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma CDR1-3 da ca- deia pesada e uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 5, 17, 23, 8 e 18, respec- tivamente, ou um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22).
[00138] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência de CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma sequência de CDR-H2 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma se- quência de CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma sequência de CDR-L1 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma sequência de CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma sequência de CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoáci-
dos de SEQ ID NO: 18.
[00139] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, um an- ticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesa- da que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
[00140] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, um an- ticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
[00141] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 24 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
[00142] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1-3 da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoá-
cidos de SEQ ID NOs: 4, 25 e 17, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1-3 da ca- deia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 23, 8 e 18, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de se- quência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 22.
[00143] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo como aqui des- crito (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma de CDR1-3 ca- deia pesada e uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 25, 17, 23, 8 e 18, res- pectivamente, ou um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22).
[00144] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência de CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma sequência de CDR-H2 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma se- quência de CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma sequência de CDR-L1 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma sequência de CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma sequência de CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[00145] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, um an- ticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesa- da que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
[00146] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, um an- ticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.
[00147] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 24 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.
[00148] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1-3 da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOs: 4, 25 e 17, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1-3 da ca- deia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de se- quência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 68.
[00149] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo como aqui des- crito (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma CDR1-3 da ca- deia pesada e uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 25, 17, 7, 8 e 9, respec- tivamente, ou um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68). Clone CL0020306
[00150] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma sequência CDR-H2 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 7, uma sequência CDR-L2 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[00151] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ
ID NO: 2. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
[00152] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NOS: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[00153] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 2 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[00154] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1-3 da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 4, 5 e 6, respectivamente, e que tem pelo me- nos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 7, 8 e 9, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo me- nos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 3.
[00155] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo como aqui des- crito (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma CDR1-3 da ca- deia pesada e uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 7, 8 e 9, respecti- vamente, ou um anticorpo compreendendo uma região variável da ca- deia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3). Clone CL0020307
[00156] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma sequência de CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma sequência de CDR-H2 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma se- quência de CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR-L1 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma sequência de CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma sequência de CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[00157] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
[00158] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
[00159] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 10 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
[00160] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 com- preende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma
CDR1-3 da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOS: 12, 13 e 14, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um anti- corpo anti-TREM2 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 7, 8 e 9, respectivamente, e que tem pelo menos 85% de sequência identidade (por exemplo, pe- lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 11.
[00161] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo como aqui des- crito (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma CDR1-3 da ca- deia pesada e uma CDR1-3 da cadeia leve compreendendo as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 12, 13, 14, 7, 8 e 9, respec- tivamente, ou um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11). Características de ligação de anticorpos anti-TREM2
[00162] Em algumas modalidades, um anticorpo como aqui descrito que se liga especificamente a uma proteína TREM2 se liga a TREM2 que é expresso em uma célula (por exemplo, uma célula ou linhagem celular primária que expressa TREM2 endogenamente, como macró- fagos humanos, ou uma célula ou linhagem celular primária que foi engenheirada para expressar TREM2, por exemplo, conforme descrito na seção de Exemplos abaixo). Em algumas modalidades, um anticor- po que se liga especificamente a uma proteína TREM2, conforme des- crito neste documento, liga-se à proteína TREM2 purificada ou recom-
binante de uma porção da mesma, ou a uma proteína quimérica com- preendendo TREM2 ou uma porção da mesma (por exemplo, uma pro- teína de fusão Fc compreendendo TREM2 ou uma proteína de fusão Fc compreendendo o domínio ecto de TREM2).
[00163] Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga especi- ficamente à proteína TREM2 humana exibe reatividade cruzada com uma ou mais outras proteínas TREM2 de outra espécie. Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga especificamente à proteína TREM2 humana exibe reatividade cruzada com uma proteína TREM2 de macaco cynomolgus ("cyno"). Em algumas modalidades, um anti- corpo que se liga especificamente à proteína TREM2 humana exibe reatividade cruzada com uma proteína TREM2 de camundongo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 exibe reatividade cruzada com TREM2 humano, TREM2 cyno e TREM2 de camundon- go.
[00164] Métodos para analisar a afinidade de ligação, cinética de ligação e reatividade cruzada são conhecidos na técnica. Esses méto- dos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação em fase sólida (por exemplo, ensaio ELISA), imunoprecipitação, ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, Biacore™ (GE Healthcare, Pis- cataway, NJ)), ensaios de exclusão cinética (por exemplo, KinExA®), citometria de fluxo, classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), interferometria BioLayer (por exemplo, Octet® (FortéBio, Inc., Menlo Park, CA)) e análise de western blot. Em algumas modalidades, o ELISA é usado para determinar a afinidade de ligação e / ou reativi- dade cruzada. Os métodos para a realização de ensaios ELISA são conhecidos na técnica, e também são descritos na seção Exemplos abaixo. Em algumas modalidades, a ressonância de plasma de super- fície (SPR) é usada para determinar a afinidade de ligação, cinética de ligação e / ou reatividade cruzada. Em algumas modalidades, os en-
saios de exclusão cinética são usados para determinar a afinidade de ligação, cinética de ligação e / ou reatividade cruzada. Em algumas modalidades, os ensaios de interferometria BioLayer são usados para determinar a afinidade de ligação, cinética de ligação e / ou reatividade cruzada. Epitopos reconhecidos por anticorpos anti-TREM2
[00165] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 reco- nhece um epitopo de TREM2 humano que é o mesmo ou substancial- mente o mesmo que o epitopo reconhecido por um clone de anticorpo como aqui descrito. Como utilizado neste documento, o termo "subs- tancialmente o mesmo", conforme usado com referência a um epitopo reconhecido por um clone de anticorpo como aqui descrito, significa que o anticorpo anti-TREM2 reconhece um epitopo que é idêntico, dentro ou quase idêntico a (por exemplo,, tem pelo menos 90% de identidade de sequência com, ou tem uma, duas ou três substituições de aminoácidos, por exemplo, substituições conservativas, em relação a), ou tem sobreposição substancial com (por exemplo, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de sobreposição com) o epitopo reconhecido pelo clone de anticorpo como aqui descrito.
[00166] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 reco- nhece um epitopo de TREM2 humano que é o mesmo ou substancial- mente o mesmo que o epitopo reconhecido por um clone de anticorpo selecionado do grupo que consiste no Clone CL0020306, Clone CL0020188, Clone CL0020307 e Clone CL0020123.
[00167] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 se liga a TREM2 humano em um epitopo dentro da região de haste de TREM2. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 reco- nhece um epitopo de TREM2 humano compreendendo, dentro ou con- sistindo nos resíduos 129-172 ou resíduos 131-169 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 reconhece um epitopo de TREM2 humano compreendendo, dentro ou consistindo nos resíduos 129-148 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM2 reconhece um epitopo de TREM2 humano com- preendendo, dentro ou consistindo nos resíduos de aminoácidos 143- 149 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- TREM2 é um agonista que ativa a sinalização de TREM2 / DAP12 (por exemplo, induzindo a fosforilação de uma cinase como Syk) e se liga a TREM2 humano em um epitopo dentro da região de haste de TREM2. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 se liga a TREM2 humano em um epitopo dentro da região de haste de TREM2 e inibe a clivagem de TREM2 por uma protease (por exemplo, ADAM17).
[00168] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 se liga a TREM2 humano em um epitopo dentro do domínio variável de Ig (IgV) de TREM2. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um agonista que ativa a sinalização de TREM2 / DAP12 (por exem- plo, induzindo a fosforilação de uma cinase como Syk) e se liga a TREM2 humano em um epitopo dentro do domínio IgV de TREM2. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 se liga a TREM2 hu- mano em um epitopo compreendendo ou consistindo em um ou mais dos seguintes: (i) resíduos de aminoácidos 55-63 (GEKGPCQRV (SEQ ID NO: 70)) de SEQ ID NO:1, (ii) aminoácidos 96-107 (TLRN- LQPHDAGL (SEQ ID NO: 71)) de SEQ ID NO: 1, e (iii) resíduos de aminoácidos 126-129 (VEVL (SEQ ID NO: 72)) de SEQ ID NO: 1. Características funcionais de anticorpos anti-TREM2
[00169] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 (por exemplo, um anticorpo com uma ou mais CDR, sequências da região variável da cadeia pesada e / ou da região variável da cadeia leve, conforme divulgado) funciona em uma ou mais atividades TREM2, conforme divulgado neste documento. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, um anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo que modula os níveis da proteína sTREM2 (por exemplo, os níveis de sTREM2 que são eliminados da superfície celular em uma amostra extracelular), modula o recrutamento ou fosforilação de uma cinase que interage com um complexo de sinalização TREM2 / DAP12 (por exemplo, Syk cinase) e / ou modula uma ou mais atividades a jusante do complexo de sinalização, como fagocitose, crescimento celular, sobrevivência celular, diferenciação celular, secreção de citocinas ou migração celu- lar. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2, conforme divulgado neste documento, liga a proteína TREM2 solúvel (sTREM2) em CSF humano saudável ou CSF cynomolgus com melhor potência em comparação com um anticorpo de referência. Em algumas modali- dades, o anticorpo de referência é representado por uma combinação de sequências selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 73 e 74; SEQ ID NOS: 75 e 76; e SEQ ID NOS: 77 e 78. Em algumas modalidades, o ensaio de potência é realizado substancialmente como descrito no Exemplo 11.
[00170] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 inten- sifica uma ou mais atividades TREM2 (por exemplo, aquelas aqui des- critas) que são induzidas por um ligando. Em algumas modalidades, o ligando é um ligando lipídico. Exemplos de ligantes lipídicos TREM2 incluem, mas não estão limitados a, 1-palmitoil-2-(5'-oxo-valeroil)-sn- glicero-3-fosfocolina (POVPC), 2-araquidonoilglicerol (2-AG), 7- cetocolesterol (7-KC), 24(S)hidroxicolesterol (24OHC), 25 (S) hidroxi- colesterol (25OHC), 27-hidroxicolesterol (27OHC), Acil Carnitina (AC), alquilacilglicerofosfocolina (PAF), α-galactosilceramida (KRN7000), Bis(monoacilglicero)fosfato (BMP), Cardiolipina (CL), Ceramida, Ce- ramida-1-fosfato (C1P), Colesteril éster (CE), Colesterol fosfato (CP), Diacilglicerol 34:1 (DG 34:1), Diacilglicerol 38:4 (DG 38:4), Pirofosfato de diacilglicerol (DGPP), Di-hidroceramida (DhCer), Di- hidroesfingomielina (DhSM), Éter fosfatidilcolina (PCe), Colesterol livre
(FC), Galactosilceramida (GalCer), Galactosilsfingosina (GalSo), Gan- gliosídeo GM1, Gangliosídeo GM3, Glucosilsfingosina (GlcSo), solu- ção salina equilibrada de Hank (HBSS), Kdo2-lipídeo A (KLA), Lacto- silceramida (LacCer), lisoalquilacilglicerofosfocolina (LPAF), Ácido liso- fosfatídico (LPA), Lisofosfatidilcolina (LPC), Lisofosfatidiletanolamina (LPE), Lisofosfatidilglicerol (LPG), Lisofosfatidilinositol (LPI), Lisosfin- gomielina (LSM), Lisofosfatidilserina (LPS), N-Acil-fosfatidiletanolamina (NAPE), N-Acil-Serina (NSer), Fosfatidilcolina oxidada (oxPC), ácido palmítico-9-hidroxi-esteárico (PAHSA), Fosfatidiletanolamina (PE), Fosfatidiletanol (PEtOH), Ácido fosfatídico (PA), Fosfatidilcolina (PC), Fosfatidilglicerol (PG), Fosfatidilinositol (PI), Fosfatidilserina (PS), Es- finganina, Esfinganina-1-fosfato (Sa1P), Esfingomielina (SM), Esfingo- sina, Esfingosina-1-fosfato (So1P) e Sulfatida. Modulação de derramamento de sTREM2
[00171] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 altera os níveis da proteína sTREM2 em uma amostra, por exemplo, os ní- veis de sTREM2 que são eliminados da superfície celular em uma amostra extracelular. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- TREM2 diminui os níveis de sTREM2.
[00172] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 dimi- nui os níveis de sTREM2 se a quantidade de sTREM2 em uma amos- tra tratada for diminuída em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pe- lo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou mais em compa- ração com um valor de controle. Em algumas modalidades, um anti- corpo anti-TREM2 diminui os níveis de sTREM2 se a quantidade de sTREM2 em uma amostra tratada for diminuída em pelo menos 2 ve- zes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais em comparação com um valor de controle. Em algumas modalidades, o valor de controle é a quantidade de sTREM2 em uma amostra não tratada (por exemplo, um sobrenadante de uma célula que expressa TREM2 que não foi tratada com um anticorpo anti- TREM2, ou uma amostra de um indivíduo que não foi tratado com um anticorpo anti-TREM2) ou uma amostra tratada com um anticorpo de ligação não TREM2 apropriado.
[00173] Em algumas modalidades, a liberação de sTREM2 é medi- da usando uma amostra que compreende um fluido, por exemplo, sangue, plasma, soro, urina ou líquido cefalorraquidiano. Em algumas modalidades, a amostra compreende líquido cefalorraquidiano. Em algumas modalidades, a amostra compreende sobrenadante de cultu- ras de células (por exemplo, sobrenadante de uma célula ou linhagem celular primária que expressa TREM2 endogenamente, como macró- fagos humanos, ou uma célula ou linhagem celular primária que foi engenheirada para expressar TREM2, por exemplo, como descrito na seção de Exemplos abaixo).
[00174] Em algumas modalidades, o nível de sTREM2 em uma amostra é medido usando um imunoensaio. Os imunoensaios são co- nhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, imunoen- saios enzimáticos (EIA), como imunoensaio enzimático multiplicado (EMIA), ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunoensaio enzimático de micropartículas (MEIA), imuno-histoquímica (IHC), imu- nocitoquímica, imunoensaios de eletroforese capilar (CEIA), radioimu- noensaios (RIA), imunofluorescência, imunoensaios de quimiolumi- nescência (CL) e imunoensaios de eletroquimioluminescência (ECL). Em algumas modalidades, os níveis de sTREM2 são medidos usando um ensaio ELISA. Em algumas modalidades, os níveis de sTREM2 são medidos usando um ensaio ELISA conforme descrito na seção de Exemplos abaixo. Modulação de Recrutamento de Cinase ou Fosforilação
[00175] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 induz a fosforilação de uma cinase que interage com o complexo de sinali- zação TREM2 / DAP12 (tal como, mas não limitado a, Syk, ZAP70, PI3K, Erk, AKT ou GSK3b). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 induz a fosforilação de uma cinase que interage com o complexo de sinalização TREM2 / DAP12 sem bloquear a ligação de um ligando TREM2 nativo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a fosforilação de uma cinase que interage com o complexo de sinalização TREM2 / DAP12 que é induzido por um li- gando TREM2 (por exemplo, um ligando lipídico). Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-TREM2 induz ou intensifica a fosforilação de Syk. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 induz ou intensifica a fosforilação de Syk se o nível de fosforilação de Syk em uma amostra tratada com o anticorpo anti-TREM2 é aumentado em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, em pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo me- nos 80%, pelo menos 90% ou mais em comparação com um valor de controle. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 induz a fosforilação de Syk se o nível de fosforilação de Syk em uma amostra tratada com o anticorpo anti-TREM2 for aumentado em pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais em comparação com um valor de controle. Em al- gumas modalidades, o valor de controle é o nível de fosforilação de Syk em uma amostra não tratada (por exemplo, uma amostra compre- endendo uma célula que expressa TREM2 que não foi tratada com um anticorpo anti-TREM2, ou uma amostra de um indivíduo que não foi tratada com um anticorpo anti-TREM2), ou uma amostra que foi trata- da com um ligando de TREM2, mas não um anticorpo anti-TREM2, ou uma amostra tratada com um anticorpo de não ligação a TREM2 apro- priado.
[00176] Para detectar e / ou quantificar a fosforilação (por exemplo,
fosforilação Syk) em uma amostra, em algumas modalidades, um imu- noensaio é usado. Em algumas modalidades, o imunoensaio é um imunoensaio enzimático (EIA), imunoensaio multiplicado por enzima (EMIA), ensaio imunoenzimático (ELISA), imunoensaio enzimático de micropartículas (MEIA), imuno-histoquímica (IHC), imunocitoquímica, imunoensaio por eletroforese capilar (CEIA), radioimunoensaio (RIA), imunofluorescência, imunoensaio de quimioluminescência (CL) ou imunoensaio de eletroquimioluminescência (ECL). Em algumas moda- lidades, a fosforilação é detectada e / ou quantificada usando um imu- noensaio que utiliza um ensaio homogêneo de proximidade lumines- cente amplificado (AlphaLISA®, PerkinElmer Inc.).
[00177] Em algumas modalidades, a fosforilação é medida usando uma amostra que compreende uma ou mais células, por exemplo, uma ou mais células que expressam TREM2 (por exemplo, uma célula ou linhagem celular primária que expressa TREM2 endogenamente, co- mo macrófagos humanos ou microglia derivada de iPSC, ou uma célu- la ou linhagem celular primária que foi engenheirada para expressar TREM2, por exemplo, conforme descrito na seção de Exemplos abai- xo). Em algumas modalidades, a amostra compreende um fluido, por exemplo, sangue, plasma, soro, urina ou líquido cefalorraquidiano. Em algumas modalidades, a amostra compreende tecido (por exemplo, pulmão, cérebro, rim, baço, tecido nervoso ou músculo esquelético) ou células desse tecido. Em algumas modalidades, a amostra compreen- de fluido endógeno, tecido ou células (por exemplo, de um indivíduo humano ou não humano). Modulação da fagocitose
[00178] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 inten- sifica a fagocitose de fragmentos de células mortas, fragmentos de te- cidos, partículas de beta amiloide ou material estranho. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a fagocitose sem bloquear a ligação de um ligando de TREM2 nativo. Em algumas mo- dalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a fagocitose que é in- duzida por um ligando TREM2 (por exemplo, um ligando lipídico). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a fagocito- se se o nível de fagocitose em uma amostra tratada com o anticorpo anti-TREM2 é aumentado em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou mais em comparação com um valor de controle. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a fagocitose se o nível de fagocitose em uma amostra tratada com o anticorpo anti-TREM2 é aumentado em pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais em comparação com um valor de controle. Em algumas modalidades, o valor de controle é o nível de fagocitose em uma amostra não tratada, uma amostra que foi tratada com um ligando de TREM2, mas não um anticorpo anti-TREM2, ou uma amostra tratada com um anticorpo de não ligação a TREM2 apro- priado.
[00179] Em algumas modalidades, a fagocitose é medida usando um ensaio de fagocitose com um substrato marcado. Os ensaios de fagocitose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o ensaio de fagocitose é realizado em uma amostra que compreende células que expressam TREM2 endogenamente, como macrófagos humanos ou microglia. Em algumas modalidades, o ensaio de fagoci- tose é realizado em uma amostra que compreende células que foram engenheiradas para expressar TREM2. Em algumas modalidades, a fagocitose é medida usando um ensaio de fagocitose de macrófago humano, conforme descrito na seção de Exemplos abaixo. Modulação da diferenciação celular, função, migração e sobrevivência
[00180] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 inten-
sifica a migração celular, sobrevivência celular, função celular ou dife- renciação celular (por exemplo, para células mieloides, macrófagos e microglia, incluindo microglia derivada de iPSC e microglia associada à doença). A microglia associada à doença e os métodos de detecção da microglia associada à doença são descritos em Keren-Shaul et al., Cell, 2017, 169:1276-1290. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a migração celular de um ou mais tipos de célu- las (por exemplo, células mieloides, macrófagos ou microglia). Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a sobrevi- vência celular de um ou mais tipos de células (por exemplo, células mieloides, macrófagos ou microglia). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a função celular de um ou mais tipos de células (por exemplo, células mieloides, macrófagos ou microglia). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a dife- renciação celular de um ou mais tipos de células (por exemplo, células mieloides, macrófagos ou microglia). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a migração, sobrevivência, função e / ou diferenciação de células mieloides.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a migração, sobrevivência, função e / ou diferenciação de macrófagos.
Em algumas modalidades, um anti- corpo anti-TREM2 intensifica a migração, sobrevivência, função e / ou diferenciação de microglia.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a ativação da microglia.
Em algumas modalida- des, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a migração, sobrevivência, função e / ou diferenciação de microglia associada à doença.
Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a migração celular, a sobrevivência celular, a função celular ou a diferenciação celular sem bloquear a ligação de um ligando TREM2 nativo.
Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a migração celular, a sobrevivência celular, a função celular ou a diferenciação celular que é induzida por um ligando TREM2 (por exemplo, um ligan- do lipídico).
[00181] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 inten- sifica a migração celular, sobrevivência celular, função celular ou dife- renciação celular se o nível de atividade (por exemplo, migração, so- brevivência, função ou diferenciação) em uma amostra tratada com o anticorpo anti-TREM2 for aumentado em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo me- nos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou mais em comparação a um valor de controle. Em algumas modalida- des, um anticorpo anti-TREM2 intensifica a migração celular, sobrevi- vência celular, função celular ou diferenciação celular se o nível de ati- vidade (por exemplo, migração, sobrevivência, função ou diferencia- ção) em uma amostra tratada com o anticorpo anti-TREM2 é aumen- tado em pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais em comparação com um valor de controle. Em algumas modalidades, o valor de controle é o nível de atividade (por exemplo, migração, sobrevivência, função ou diferenciação) em uma amostra não tratada (por exemplo, uma amos- tra que não foi tratada com um anticorpo anti-TREM2), uma amostra que foi tratada com um ligando de TREM2, mas não um anticorpo anti- TREM2, ou uma amostra tratada com um anticorpo de não ligação a TREM2 apropriado.
[00182] Em algumas modalidades, a migração celular é medida usando um ensaio de quimiotaxia. Os ensaios de quimiotaxia são co- nhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o ensaio de migração celular (por exemplo, ensaio de quimiotaxia) é realizado em uma amostra compreendendo células que expressam TREM2 endogena- mente, como macrófagos humanos. Em algumas modalidades, o en- saio de migração celular (por exemplo, ensaio de quimiotaxia) é reali-
zado em uma amostra que compreende células que foram engenhei- radas para expressar TREM2. Em algumas modalidades, a migração celular é medida usando um ensaio de quimiotaxia de macrófagos humanos, conforme descrito na seção de Exemplos abaixo.
[00183] Em algumas modalidades, a sobrevivência celular é medida usando um ensaio de viabilidade celular. Os ensaios de viabilidade celular são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o ensaio de sobrevivência celular (por exemplo, ensaio de viabilidade celular) é realizado em uma amostra que compreende células que expressam TREM2 endogenamente, como macrófagos humanos. Em algumas modalidades, o ensaio de sobrevivência celular (por exemplo, ensaio de viabilidade celular) é realizado em uma amostra que compreende células que foram engenheiradas para expressar TREM2. Em algumas modalidades, a sobrevivência celular é medida usando um ensaio de viabilidade de macrófago humano, conforme descrito na seção de Exemplos abaixo.
[00184] Em algumas modalidades, a função celular é medida usan- do um ensaio funcional que é apropriado para essa célula. Por exem- plo, em algumas modalidades, a função da célula de macrófago é ava- liada usando um ensaio de fagocitose, por exemplo, conforme descrito na seção de Exemplos abaixo.
[00185] Em algumas modalidades, a diferenciação celular é medida avaliando a capacidade de diferenciação das células que expressam TREM2 endogenamente. Por exemplo, em algumas modalidades, a diferenciação celular é medida avaliando a capacidade dos macrófa- gos de se diferenciarem dos monócitos, por exemplo, conforme des- crito na seção de Exemplos abaixo.
[00186] Em algumas modalidades, a ativação da microglia é medida in vivo. Em algumas modalidades, a ativação da microglia é medida usando imageamento de TSPO-PET. Os métodos de imageamento de
TSPO-PET são conhecidos na técnica.
[00187] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 inten- sifica a função da microglia sem aumentar a neuroinflamação. Os ní- veis de neuroinflamação podem ser determinados medindo os níveis de citocinas (por exemplo, citocinas inflamatórias), tais como, mas não se limitando a TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-1ra, TGFβ, IL-15 ou IFN-γ . Em algumas modalidades, os níveis de citocinas são medidos usando imunoensaios, por exemplo, um imunoensaio enzimático (EIA), imuno- ensaio multiplicado por enzima (EMIA), ensaio imunoenzimático (ELI- SA), imunoensaio enzimático de micropartículas (MEIA), imuno- histoquímica (IHC), imunocitoquímica, imunoensaio de eletroforese capilar (CEIA), radioimunoensaio (RIA), imunofluorescência, imunoen- saio de quimioluminescência (CL) ou imunoensaio de eletroquimiolu- minescência (ECL). IV. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS
[00188] Em algumas modalidades, os anticorpos são preparados pela imunização de um animal ou animais (por exemplo, camundon- gos, coelhos ou ratos) com um antígeno ou uma mistura de antígenos para a indução de uma resposta de anticorpo. Em algumas modalida- des, o antígeno ou mistura de antígenos é administrado em conjuga- ção com um adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund). Após uma imunização inicial, uma ou mais injeções de reforço subsequentes do antígeno ou antígenos podem ser administradas para melhorar a pro- dução de anticorpos. Após a imunização, as células B específicas do antígeno são colhidas, por exemplo, do baço e / ou tecido linfoide. Pa- ra gerar anticorpos monoclonais, as células B são fundidas com célu- las de mieloma, que são subsequentemente pesquisadas quanto à es- pecificidade do antígeno. Os métodos de preparação de anticorpos também são descritos na seção de Exemplos abaixo.
[00189] Os genes que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpo de interesse podem ser clonados a partir de uma célula, por exemplo, os genes que codificam um anticorpo monoclonal podem ser clonados a partir de um hibridoma e usados para produzir um anticor- po monoclonal recombinante. Bibliotecas de genes que codificam ca- deias pesadas e leves de anticorpos monoclonais também podem ser feitas a partir de hibridoma ou células plasmáticas. Alternativamente, a tecnologia de exibição de fago ou levedura pode ser usada para identi- ficar anticorpos e fragmentos Fab que se ligam especificamente a an- tígenos selecionados. Os anticorpos também podem ser tornados bi- específicos, ou seja, capazes de reconhecer dois antígenos diferentes. Os anticorpos também podem ser heteroconjugados, por exemplo, dois anticorpos unidos covalentemente ou imunotoxinas.
[00190] Os anticorpos podem ser produzidos usando qualquer nú- mero de sistemas de expressão, incluindo sistemas de expressão pro- carióticos e eucarióticos. Em algumas modalidades, o sistema de ex- pressão é uma expressão de células de mamífero, como um hibridoma ou um sistema de expressão de células CHO. Muitos desses sistemas estão amplamente disponíveis em fornecedores comerciais. Em moda- lidades nas quais um anticorpo compreende uma região VH e VL, as regiões VH e VL podem ser expressas usando um único vetor, por exemplo, em uma unidade de expressão discistrônica ou sob o contro- le de diferentes promotores. Em outras modalidades, a região VH e VL pode ser expressa usando vetores separados. Uma região VH ou VL conforme descrito neste documento, pode opcionalmente compreen- der uma metionina no terminal N.
[00191] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo qui- mérico. Os métodos para preparar anticorpos quiméricos são conheci- dos na técnica. Por exemplo, anticorpos quiméricos podem ser feitos em que a região de ligação ao antígeno (região variável da cadeia pe- sada e região variável da cadeia leve) de uma espécie, como um ca-
mundongo, é fundida à região efetora (domínio constante) de outra espécie, como um humano. Como outro exemplo, anticorpos quiméri- cos "comutados por classe" podem ser feitos nos quais a região efeto- ra de um anticorpo é substituída por uma região efetora de uma classe ou subclasse de imunoglobulina diferente.
[00192] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo hu- manizado. Geralmente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir sua imunogenicidade. Os anticorpos humanizados tipicamente compreendem uma ou mais regiões variáveis (por exemplo, CDRs) ou porções das mesmas que são não humanas (por exemplo, derivadas de uma sequência de região variável de camundongo) e, possivelmen- te, algumas regiões estruturais ou porções das mesmas que são não humanas, e ainda compreendem uma ou mais regiões constantes que são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Os métodos pa- ra humanizar anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Camundongos transgênicos, ou outros organismos, como outros ma- míferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados ou humanos. Outros métodos de humanização de anticorpos incluem, por exemplo, ressuperfície de domínio variável, enxerto de CDR, enxerto de resíduos determinantes de especificidade (SDR), seleção guiada e embaralhamento de estrutura.
[00193] Como alternativa à humanização, anticorpos humanos po- dem ser gerados. Como um exemplo não limitativo, animais transgêni- cos (por exemplo, camundongos) podem ser produzidos que são ca- pazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anti- corpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endóge- na. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção da cadeia pesada do anticorpo (JH) em camundon- gos mutantes quiméricos e da linha germinativa resulta em inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do arranjo de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos por desafio com antígeno. Como ou- tro exemplo, os anticorpos humanos podem ser produzidos por méto- dos baseados em hibridoma, tais como usando células B humanas primárias para gerar linhagens de células que produzem anticorpos monoclonais humanos.
[00194] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos usando a tecnologia de exibição de fago ou de exibição de levedura. Na exibição de fago, repertórios de genes da cadeia pesada variável e cadeia leve variável são amplificados e expressos em vetores de exi- bição de fago. Em algumas modalidades, a biblioteca de anticorpos é um repertório natural amplificado de uma fonte humana. Em algumas modalidades, a biblioteca de anticorpos é uma biblioteca sintética feita por clonagem de sequências da cadeia pesada e da cadeia leve e re- combinação para gerar um grande pool de anticorpos com especifici- dade antigênica diferente. O fago tipicamente exibe fragmentos de an- ticorpo (por exemplo, fragmentos Fab ou fragmentos scFv), que são então selecionados para ligação a um antígeno de interesse.
[00195] Em algumas modalidades, fragmentos de anticorpo (como um Fab, um Fab', um F(ab’)2, um scFv, um VH, ou um VHH) são gera- dos. Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de frag- mentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos eram deri- vados por digestão proteolítica de anticorpos intactos. No entanto, es- ses fragmentos podem agora ser produzidos diretamente usando célu- las hospedeiras recombinantes. Por exemplo, fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo. Alternativa- mente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de células de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 . De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 po-
dem ser isolados diretamente da cultura de células hospedeiras re- combinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anti- corpo serão evidentes para os versados na técnica.
[00196] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de anticorpo é conjugado a outra molécula, por exemplo, polietileno glicol (PEGuilação) ou albumina sérica, para fornecer uma meia-vida prolon- gada in vivo.
[00197] Em algumas modalidades, anticorpos multiespecíficos compreendendo um anticorpo anti-TREM2 (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), conforme descrito neste documento, são for- necidos, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multi- específicos são anticorpos que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes. Em algumas modalidades, um anti- corpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico) tem uma especificidade de ligação para TREM2 e tem uma especificidade de ligação para pelo menos um outro antígeno. Em algumas modali- dades, um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo bies- pecífico) se liga a dois epitopos TREM2 diferentes. Em algumas moda- lidades, um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo bies- pecífico) é capaz de induzir o agrupamento de TREM2 na superfície celular. Um método ilustrativo para medir o agrupamento de recepto- res usando microscopia confocal FRET é descrito em Wallrabe et al., Biophys. J., 2003, 85:559-571. Métodos de produção de anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) incluem, mas não estão limitados a, coexpressão recombinante de dois pares da ca- deia pesada e cadeia leve em uma célula hospedeira, engenharia de "botões em buracos", trimerização intramolecular e fusão de um frag- mento de anticorpo ao terminal N ou terminal C de outro anticorpo, por exemplo, domínios variáveis em tandem. V. ÁCIDOS NUCLEICOS, VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[00198] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM2 con- forme divulgados neste documento são preparados usando métodos recombinantes. Por conseguinte, em alguns aspectos, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-TREM2 como aqui descrito (por exemplo, qualquer uma ou mais das CDRs, regiões variáveis da cadeia pesada e regiões variáveis da cadeia leve descritas aqui); vetores compreendendo tais ácidos nucleicos; e célu- las hospedeiras nas quais os ácidos nucleicos são introduzidos que são usados para replicar os ácidos nucleicos que codificam o anticorpo e / ou para expressar os anticorpos.
[00199] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo (por exem- plo, um polinucleotídeo isolado) compreende uma sequência de nucle- otídeos que codifica um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito neste documento (por exemplo, conforme descrito na Seção acima intitulada "Sequências de anticorpo anti- TREM2"). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais sequências de aminoácidos (por exemplo, CDR, sequências da cadeia pesada ou da cadeia leve) divulgadas na Listagem de Sequências Informais abai- xo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma se- quência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pe- lo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência) para uma sequência (por exemplo, uma sequência de CDR, cadeia pesada ou cadeia leve) divulgada na Listagem de Se- quência Informal abaixo. Em algumas modalidades, um polinucleotí- deo como aqui descrito está operacionalmente ligado a um ácido nu-
cleico heterólogo, por exemplo, um promotor heterólogo.
[00200] Os vetores adequados contendo polinucleotídeos que codi- ficam anticorpos da presente divulgação, ou fragmentos dos mesmos, incluem vetores de clonagem e vetores de expressão. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospe- deira que se pretende usar, os vetores de clonagem úteis geralmente têm a capacidade de se autorreplicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular e / ou podem transpor- tar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Os exemplos incluem plasmídeos e vírus bacteria- nos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores de transporte, como pSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis em fornecedores comerciais, como BioRad, Strategene e Invitrogen.
[00201] Os vetores de expressão geralmente são construtos polinu- cleotídicos replicáveis que contêm um ácido nucleico da presente di- vulgação. O vetor de expressão pode se replicar nas células hospedei- ras como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico. Os vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adeno- associados, retrovírus e qualquer outro vetor.
[00202] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou ex- pressão de um polinucleotídeo ou vetor, conforme descrito neste do- cumento, incluem células procarióticas ou eucarióticas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é procariótica. Em algumas modali- dades, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, células de ová- rio de hamster chinês (CHO) ou células linfoides. Em algumas modali- dades, a célula hospedeira é uma célula humana, por exemplo, uma célula de rim embrionário humano (HEK).
[00203] Em outro aspecto, são fornecidos métodos de produção de um anticorpo anti-TREM2, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o método inclui cultivar uma célula hospedeira como aqui descrito (por exemplo, uma célula hospedeira que expressa um polinucleotídeo ou vetor como aqui descrito) sob condições ade- quadas para a expressão do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é subsequentemente recuperado da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira). VI. MÉTODOS TERAPÊUTICOS USANDO ANTICORPOS ANTI- TREM2
[00204] Em outro aspecto, métodos terapêuticos usando um anti- corpo anti-TREM2 conforme divulgado neste documento (por exemplo, um anticorpo anti-TREM2 conforme descrito na Seção III acima) são fornecidos. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tra- tamento de uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalida- des, métodos de modulação de uma ou mais atividades TREM2 (por exemplo, em um indivíduo com uma doença neurodegenerativa) são fornecidos.
[00205] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tra- tamento de uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalida- des, a doença neurodegenerativa é selecionada a partir do grupo que consiste em: doença de Alzheimer, tauopatia primária relacionada à idade, paralisia supranuclear progressiva (PSP), demência frontotem- poral, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromos- somo 17, demência de grãos argirofílicos, esclerose lateral amiotrófica, complexo de esclerose lateral amiotrófica / parkinsonismo-demência de Guam (ALS-PDC), degeneração corticobasal, encefalopatia trau- mática crônica, doença de Creutzfeldt-Jakob, demência pugilística, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndrome de Down, demência familiar britânica, demência familiar dinamarquesa,
doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, tauopatia glial globular, parkinsonismo de Guadalupe com demência, PSP de Guadalupe, do- ença de Hallevorden-Spatz, leucoencefalopatia difusa hereditária com esferoides (HDLS), doença de Huntington, miosite de corpos de inclu- são, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia miotônica, doença de Nasu- Hakola, demência com predomínio de emaranhados neurofibrilares, doença de Niemann-Pick tipo C, degeneração pallido-ponto-nigral, do- ença de Parkinson, doença de Pick, parkinsonismo pós-encefalítico, amiloide cerebral de proteína de príon angiopatia, gliose subcortical progressiva, panencefalite esclerosante subaguda e demência apenas emaranhada. Em algumas modalidades, a doença neurodegenerativa é a doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, a doença neuro- degenerativa é a doença de Nasu-Hakola. Em algumas modalidades, a doença neurodegenerativa é demência frontotemporal. Em algumas modalidades, a doença neurodegenerativa é a doença de Parkinson. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao indi- víduo um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma proteína TREM2 humana, por exemplo, um anticorpo anti-TREM2 como aqui descrito, ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-TREM2 como aqui descrito.
[00206] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 (ou porção de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica do mes- mo), conforme descrito neste documento, é usado no tratamento de uma doença neurodegenerativa que é caracterizada por uma mutação em TREM2. Em algumas modalidades, a doença neurodegenerativa que é caracterizada por uma mutação em TREM2 é a doença de Al- zheimer, por exemplo, doença de Alzheimer que é caracterizada por uma mutação R47H em TREM2.
[00207] Em algumas modalidades, métodos de modulação de uma ou mais atividades TREM2 (por exemplo, em um indivíduo com uma doença neurodegenerativa) são fornecidos. Em algumas modalidades, o método compreende níveis de modulação de sTREM2; modulação do recrutamento ou fosforilação de uma cinase que interage com um complexo de sinalização TREM2 / DAP12 (por exemplo, Syk cinase); modulação da fagocitose (por exemplo, fagocitose de detritos celula- res, partículas de beta amiloide, etc.); modulação da migração celular (por exemplo, migração de células mieloides, macrófagos, microglia e microglia associada à doença); e / ou modulação da diferenciação ce- lular (por exemplo, para células mieloides, macrófagos, microglia e mi- croglia associada à doença). Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para intensificar uma ou mais atividades TREM2 em um indi- víduo com uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para diminuir os níveis de sTREM2 em um indivíduo com uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalida- des, o método de modulação de uma ou mais atividades TREM2 em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo um anticorpo isola- do ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo que se liga espe- cificamente a uma proteína TREM2 humana, por exemplo, um anticor- po anti-TREM2 como aqui descrito, ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-TREM2 como aqui descrito.
[00208] Em algumas modalidades, o indivíduo a ser tratado é um humano, por exemplo, um adulto humano ou uma criança humana.
[00209] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de re- dução do acúmulo de placa em um indivíduo com uma doença neuro- degenerativa. Em algumas modalidades, o método compreende admi- nistrar ao indivíduo um anticorpo ou composição farmacêutica como aqui descrito. Em algumas modalidades, o indivíduo tem doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, o indivíduo é um modelo animal de uma doença neurodegenerativa (por exemplo, um modelo de ca-
mundongo 5XFAD ou APP / PS1). Em algumas modalidades, o acú- mulo de placa é medido por imageamento de placa amiloide e / ou imageamento Tau, por exemplo, usando varredura de tomografia por emissão de pósitrons (PET). Em algumas modalidades, a administra- ção de um anticorpo anti-TREM2 reduz o acúmulo de placa em pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pe- lo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% em comparação com um valor de linha de base (por exemplo, o nível de acúmulo de placa no indivíduo após a administração do anti- corpo anti-TREM2).
[00210] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é ad- ministrado a um indivíduo em uma quantidade ou dose terapeutica- mente eficaz. Uma faixa de dose diária de cerca de 0,01 mg / kg a cer- ca de 500 mg / kg, ou cerca de 0,1 mg / kg a cerca de 200 mg / kg, ou cerca de 1 mg / kg a cerca de 100 mg / kg, ou cerca de 10 mg / kg a cerca de 50 mg / kg. As dosagens, no entanto, podem ser variadas de acordo com vários fatores, incluindo a via de administração escolhida, a formulação da composição, a resposta do paciente, a gravidade da condição, o peso do indivíduo e o julgamento do médico prescritor. A dosagem pode ser aumentada ou diminuída ao longo do tempo, con- forme necessário para cada paciente. Em certos casos, um paciente recebe inicialmente uma dose baixa, que é então aumentada para uma dosagem eficaz tolerável para o paciente. A determinação de uma quantidade eficaz está bem dentro da capacidade dos versados na técnica.
[00211] A via de administração de um anticorpo anti-TREM2 como aqui descrito pode ser oral, intraperitoneal, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intratecal, inalatória, tópica, intralesional, retal, intrabrônquica, nasal, transmucosa, distribuição intestinal, ocular ou ótica, ou quaisquer outros métodos conhecidos na técnica. Em al-
gumas modalidades, o anticorpo é administrado por via oral, intrave- nosa ou intraperitoneal.
[00212] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM2 (e opci- onalmente outro agente terapêutico) é administrado ao indivíduo ao longo de um período de tempo prolongado, por exemplo, por pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 dias ou mais. VII. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E KITS
[00213] Em outro aspecto, são fornecidas composições farmacêuti- cas e kits que compreendem um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína TREM2 humana. Em algumas modalidades, as com- posições farmacêuticas e kits são para uso no tratamento de uma do- ença neurodegenerativa. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas e kits são para uso na modulação (por exemplo, intensi- ficando ou inibindo) uma ou mais atividades TREM2, por exemplo, fos- forilação Syk. Em algumas modalidades, as composições farmacêuti- cas e kits são para uso na modulação (por exemplo, diminuição) dos níveis de sTREM2. Composições Farmacêuticas
[00214] Em algumas modalidades, são fornecidas composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-TREM2 ou um fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo conforme descrito na Seção III acima ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00215] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo anti-TREM2 como aqui descrito e compre- ende ainda um ou mais transportadores e / ou excipientes farmaceuti- camente aceitáveis. Um transportador farmaceuticamente aceitável inclui quaisquer solventes, meios de dispersão ou revestimentos que sejam fisiologicamente compatíveis e que, não interfiram ou inibam a atividade do agente ativo. Vários excipientes farmaceuticamente acei- táveis são bem conhecidos na técnica.
[00216] Em algumas modalidades, o transportador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, oral, intraperitoneal, intrate- cal, transdérmica, tópica ou subcutânea. Os transportadores farmaceu- ticamente aceitáveis podem conter um ou mais compostos fisiologica- mente aceitáveis que atuam, por exemplo, para estabilizar a composi- ção ou para aumentar ou diminuir a absorção do(s) agente(s) ativo(s). Os compostos fisiologicamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, carboidratos, como glicose, sacarose ou dextranos, antioxidantes, co- mo ácido ascórbico ou glutationa, agentes quelantes, proteínas de bai- xo peso molecular, composições que reduzem a depuração ou hidróli- se dos agentes ativos, ou excipientes ou outros estabilizadores e / ou tampões. Outros transportadores farmaceuticamente aceitáveis e suas formulações são bem conhecidos na técnica.
[00217] As composições farmacêuticas descritas aqui podem ser fabricadas de uma maneira que seja conhecida pelos versados na téc- nica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, emulsificação, encap- sulação, aprisionamento ou liofilização. Os seguintes métodos e exci- pientes são meramente exemplificativos e não são de forma alguma limitativos.
[00218] Para administração oral, um anticorpo anti-TREM2 pode ser formulado combinando-o com transportadores farmaceuticamente aceitáveis que são bem conhecidos na técnica. Esses transportadores permitem que os compostos sejam formulados como comprimidos, pí- lulas, drágeas, cápsulas, emulsões, suspensões lipofílicas e hidrofíli- cas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um paciente a ser tratado. As preparações farmacêu- ticas para uso oral podem ser obtidas misturando os compostos com um excipiente sólido, opcionalmente triturando uma mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após adição de auxiliares ade- quados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Os excipientes adequados incluem, por exemplo, enchimentos, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; prepa- rações de celulose, tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, me- til celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetilcelulose de sódio e / ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrantes, tais como uma polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginato de só- dio.
[00219] Um anticorpo anti-TREM2 pode ser formulado para admi- nistração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua. Para injeção, o composto ou compostos podem ser formulados em preparações por dissolução, suspensão ou emulsifica- ção em um solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleos vegetais ou outros semelhantes, glicerídeos de ácido alifático sintético, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propileno glicol; e se desejado, com aditivos convencionais, tais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizantes e con- servantes. Em algumas modalidades, os compostos podem ser formu- lados em soluções aquosas, por exemplo, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. As formulações para injeção po- dem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose, com um conservante adiciona- do. As composições podem tomar formas, tais como suspensões, so- luções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores, tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes.
[00220] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM2 é pre- parado para distribuição em uma formulação de liberação sustentada, liberação controlada, liberação prolongada, liberação cronometrada ou liberação retardada, por exemplo, em matrizes semipermeáveis de po- límeros hidrofóbicos sólidos contendo o agente ativo. Vários tipos de materiais de liberação sustentada foram estabelecidos e são bem co- nhecidos pelos versados na técnica. As formulações de liberação es- tendida atuais incluem comprimidos revestidos por filme, sistemas mul- tiparticulados ou de peletes, tecnologias de matriz usando materiais hidrofílicos ou lipofílicos e comprimidos à base de cera com excipien- tes formadores de poros. Os sistemas de distribuição de liberação sus- tentada podem, dependendo de seu projeto, liberar os compostos ao longo de horas ou dias, por exemplo, ao longo de 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24 horas ou mais. Normalmente, as formulações de liberação sus- tentada podem ser preparadas usando polímeros de ocorrência natural ou sintéticos, por exemplo, vinil pirrolidonas poliméricas, tais como po- livinil pirrolidona (PVP); polímeros hidrofílicos de carboxivinil; hidroco- loides hidrofóbicos e / ou hidrofílicos, tais como metilcelulose, etilcelu- lose, hidroxipropilcelulose e hidroxipropilmetilcelulose; e carboxipoli- metileno.
[00221] Normalmente, uma composição farmacêutica para uso na administração in vivo é estéril. A esterilização pode ser realizada de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, esteriliza- ção por calor, esterilização por vapor, filtração estéril ou irradiação.
[00222] As dosagens e a concentração de droga desejada de com- posições farmacêuticas da divulgação podem variar dependendo do uso particular previsto. A determinação da dosagem ou via de adminis- tração apropriada está bem ao alcance de um versado na técnica. As dosagens adequadas também são descritas na Seção VI acima.
Kits
[00223] Em algumas modalidades, são fornecidos kits que compre- endem um anticorpo anti-TREM2 ou um fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM2 é um anticorpo conforme descrito na Seção III acima ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00224] Em algumas modalidades, o kit compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, o kit compreende um anticorpo anti-TREM2 como aqui des- crito e compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais para uso no tratamento de uma doença neurodegenerativa, por exem- plo, doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, o agente tera- pêutico é um agente para uso no tratamento de um sintoma cognitivo ou comportamental de uma doença neurodegenerativa (por exemplo, um antidepressivo, um agonista da dopamina ou um antipsicótico). Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um agente neuroprotetor (por exemplo, carbidopa / levodopa, um agente anticolinérgico, um agente dopaminérgico, um inibidor da monoamina oxidase B (MAO-B), um inibidor da catecol-O-metil transferase (COMT), um agente gluta- matérgico, um inibidor de histona desacetilase (HDAC), um canabinoi- de, um inibidor de caspase, melatonina, um agente anti-inflamatório, um hormônio (por exemplo, estrogênio ou progesterona) ou uma vita- mina).
[00225] Em algumas modalidades, o kit compreende um anticorpo anti-TREM como aqui descrito e compreende ainda um ou mais rea- gentes para medir os níveis de sTREM2. Em algumas modalidades, o kit compreende um anticorpo anti-TREM como aqui descrito e com- preende ainda um ou mais reagentes para medir a atividade de TREM2 (por exemplo, para medir a fosforilação de Syk).
[00226] Em algumas modalidades, o kit compreende ainda materi-
ais de instrução contendo instruções (ou seja, protocolos) para a práti- ca dos métodos descritos neste documento (por exemplo, instruções para usar o kit para um método terapêutico conforme descrito na Se- ção VI acima). Embora os materiais de instrução normalmente com- preendam materiais escritos ou impressos, eles não se limitam a isso. Qualquer meio capaz de armazenar tais instruções e comunicá-las a um usuário final é contemplado por esta divulgação. Essas mídias in- cluem, mas não estão limitadas a, mídia de armazenamento eletrônico (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), mídia ótica (por exemplo, CD-ROM) e semelhantes. Essas mídias podem incluir endereços para sites da Internet que fornecem esses materiais de ins- trução. VIII. EXEMPLOS
[00227] A presente invenção será descrita com mais detalhes a títu- lo de exemplos específicos. Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitos de ilustração somente e não se destinam a limitar a invenção de maneira alguma. Exemplo 1. Geração e caracterização inicial de anticorpos anti- TREM2 Expressão recombinante e purificação de ECD de TREM2 humano fundido com Fc de camundongo
[00228] O domínio ecto (resíduos 19-172) de TREM2 humano (Uni- ProtKB ID - Q9NZC2) foi subclonado no vetor pRK com o sinal de se- creção da cadeia IgG kappa V-III de camundongo, aminoácidos 1-20 (UniProtKB ID - P01661) na região N-terminal e um marcador Fc de camundongo na região C-terminal com um GGGGS (SEQ ID NO: 64) entre TREM2 ECD e Fc.
[00229] O plasmídeo purificado foi transfectado em células Ex- pi293F™ (Thermo Fisher) usando o Kit de Sistema de Expressão Ex- pi293F™ de acordo com as instruções do fabricante. Para inibir a ma-
turação de glicanos ligados a N e reduzir a heterogeneidade de glicosi- lação, kifunensina (Sigma), um inibidor de alta manosidase I, foi adici- onado à cultura na concentração de 1 μg / mL imediatamente após a transfecção. As células transfectadas foram incubadas num agitador orbital (Infors HT Multitron) a 125 rpm e 37°C numa atmosfera umidifi- cada de 6% de CO2. O intensificador de transfecção ExpiFectamine™ 293 1 e 2 foram adicionados às células 16 horas após a transfecção e o sobrenadante do meio foi colhido 96 horas após a transfecção. O sobrenadante clarificado foi suplementado com inibidor de protease sem EDTA (Roche) e armazenado a -80°C.
[00230] Para o isolamento de rhTREM2-Fc, o sobrenadante do meio clarificado foi carregado em coluna de afinidade HiTrap MabSe- lect SuRe Protein A (GE Healthcare Life Sciences) e lavado com argi- nina 200 mM e tampão succinato 137 mM pH 5,0. A proteína de fusão foi eluída em tampão citrato QB 100 mM, pH 3,0 e NaCl 50 mM. Ime- diatamente após a eluição, tampão Tris-HCl 1M pH 8,0 foi adicionado à solução de proteína para neutralizar o pH. Os agregados de proteína foram separados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em coluna de aumento Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare Life Sci- ences). O tampão de fase móvel SEC foi mantido em Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 100 mM e arginina 50 mM, que também era o tampão de armazenamento de proteína. Todas as etapas de cromatografia foram realizadas em sistemas AKTA puro ou AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences). Expressão recombinante e purificação de ECD TREM2 marcado com His
[00231] O domínio ecto (resíduos 19-172) de TREM2 (UniProtKB - Q9NZC2) foi subclonado no vetor pRK com o sinal de secreção da ca- deia V-III de Ig de camundongo, aminoácidos 1-20 (UniProtKB ID - P01661) na região N-terminal e uma etiqueta 6X-His (SEQ ID NO: 65)
na região C-terminal. A inserção foi verificada por sequenciamento e a purificação do plasmídeo maxi prep foi realizada.
[00232] O plasmídeo purificado foi transfectado em células Ex- pi293F™ (Thermo Fisher) usando o Kit de Sistema de Expressão Ex- pi293F™ de acordo com as instruções do fabricante. As células trans- fectadas foram incubadas num agitador orbital (Infors HT Multitron) a 125 rpm e 37°C numa atmosfera umidificada de 6% de CO2. O intensi- ficador de transfecção ExpiFectamine™ 293 1 e 2 foram adicionados às células 16 horas após a transfecção e o sobrenadante do meio foi colhido 96 horas após a transfecção.
[00233] O meio colhido foi suplementado com imidazol 1M pH 8,0 a uma concentração final de 10 mM e filtrado usando as unidades de filtro descartáveis Nalgene™ Rapid-Flow™ (Thermo Fisher) com um tamanho de poro de 0,4 mícron. A resina HisPur™ Ni-NTA (Thermo Fisher) foi lavada com água MQ e equilibrada com tampão de carga (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM e imidazol 10 mM). A purificação por afinidade foi realizada usando o método de fluxo por gravidade. O meio colhido foi carregado na resina e as proteínas ligadas de forma não específica foram lavadas com tampão de carga suplementado com imidazol 50 mM e 100 mM. O domínio eco TREM2 marcado com His ligado foi eluído com Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM e imidazol 200 mM. A proteína eluída foi concentrada usando concentradores Amicon 10 kDa e a proteína concentrada foi posteriormente purificada por cromatografia de filtração em gel usando o sistema AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences). A proteína foi carregada em uma colu- na HiLoad Superdex 200 16/600 (GE Healthcare Life Sciences) equili- brada com 1x PBS e eluída e fracionada usando 1x PBS como tampão de execução. As frações eluídas foram analisadas por eletroforese em géis de poliacrilamida (PAGE) em condições desnaturantes e nativas. As frações eluídas foram ainda caracterizadas por cromatografia analí-
tica de exclusão de tamanho e a determinação da massa de proteína intacta. Os resultados do PAGE e da caracterização analítica foram usados para reunir as frações de proteína fortemente glicosiladas e estas foram divididas em alíquotas e armazenadas a -80°C. Geração de Anticorpos
[00234] Roedores (camundongos e ratos) foram imunizados usando protocolos padrão com imunógeno rhTREM2-Fc ou células BWZ que expressam o receptor Trem2 de comprimento total. Os títulos foram medidos durante a imunização usando soros coletados em diferentes pontos de tempo. A detecção de uma resposta imune específica do antígeno foi realizada usando citometria de fluxo com o imunógeno rhTREM2-Fc e células BWZ vivas que expressam TREM2 de compri- mento total. Os critérios de seleção de anticorpos candidatos incluíram a produção de anticorpos de roedores e a especificidade de ligação a TREM2, conforme detectado por citometria de fluxo. As células secre- toras de anticorpos foram isoladas de tecidos imunes animais, incluin- do baço, nódulos linfáticos e medula óssea.
[00235] As suspensões de células únicas foram analisadas para determinar as propriedades de ligação dos anticorpos segregados. As células secretoras de anticorpos foram carregadas em dispositivos mi- crofluídicos e isoladas em câmaras de reação de volume de nanolitro para permitir a detecção de anticorpos secretados usando ensaios de microscopia baseados em imagens fluorescentes e de campo claro (ver, por exemplo, Patente U.S. 9.188.593). Foram realizados ensaios de ligação envolvendo a detecção de ligação de anticorpos a microes- feras revestidas com antígeno, detecção de ligação de antígeno mar- cado com fluorescência solúvel a anticorpos imobilizados em esferas e detecção de ligação de anticorpos a antígenos expressos na superfície celular. Os antígenos expressos na superfície celular incluem a forma recombinante e as formas nativas dos antígenos apresentados na su-
perfície das células.
[00236] A análise de imagem foi usada para identificar câmaras que exibem sinais fluorescentes positivos, indicando a presença de uma única célula produzindo anticorpos com as propriedades desejadas, e o conteúdo das câmaras foi recuperado e lisado em placas de 384 po- ços (ver, por exemplo, Patente U.S. 10.087.408). Os lisados de células individuais foram então submetidos a RT-PCR para amplificar as se- quências da região variável da cadeia pesada e leve. Os amplicons resultantes foram então sequenciados para determinar a sequência de cDNA das regiões variáveis da cadeia pesada e leve emparelhadas das células individuais selecionadas. As sequências resultantes foram inspecionadas e analisadas manualmente para determinar a diversi- dade de sequência e a hipermutação somática. As sequências foram selecionadas para expressão com base em dados de triagem e diver- sidade de sequência. Os anticorpos expressos foram testados para confirmar a especificidade de ligação ao antígeno. Triagem primária de anticorpos anti-TREM2
[00237] A triagem primária de anticorpos foi realizada em células HEK 293 que expressam TREM2, iPSC de tipo selvagem e iPSC no- caute de TREM2 como segue.
1. Triagem de ligação de TREM2 em células HEK que expressam TREM2
[00238] Uma linhagem de células HEK 293 expressando de forma estável TREM2 / DAP12 humano foi gerada por transfecção das célu- las com um vetor que expressa TREM2 e DAP12 humanos de tipo sel- vagem, e DAP12 sozinho, respectivamente. Clones de expressão es- tável foram selecionados e a expressão de TREM2 na superfície celu- lar foi avaliada por citometria de fluxo. Anticorpo monoclonal de rato anti-TREM2 humano / camundongo conjugado com APC (R&D, No. de Catálogo MAB17291) foi usado para detectar a expressão de TREM2 de superfície. O clone que mostra o nível de expressão de TREM2 de tipo selvagem mais alto foi selecionado e denominado "HEK293-H6." Os clones que expressam estavelmente DAP12 foram analisados por Western blot, e o clone selecionado foi denominado "HEK293-DAP12 #1".
[00239] HEK 293 superexpressando TREM2 humano (HEK293-H6) e HEK 293 superexpressando GFP (B5) foram colhidos por 0,05% de tripsina e incubados a 37°C por 2 horas. Após a incubação, as células foram centrifugadas e lavadas em tampão FACS (PBS + 0,5% BSA) duas vezes. As células misturadas foram ressuspensas em tampão FACS com solução de Trustain FcX humana (Biolegend, No. de Catá- logo 422302) a uma densidade de 106/mL por linhagem celular. As li- nhagens celulares misturadas foram semeadas a 200.000 células por poço em uma placa de fundo redondo de 96 poços e incubadas por 20 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, as células foram centrifugadas e incubadas com anticorpos anti-TREM2 de titulação de dose de cerca de 0 - 200 nM por 45 minutos em gelo. Após a incuba- ção, as células foram centrifugadas e lavadas com tampão FACS três vezes. As células foram então incubadas com anticorpo secundário (Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab’)2 Fragment Goat Anti-human IgG(H+L), Jackson ImmunoResearch Laboratories, No. de Catálogo 109-606-088, diluição 1:800) por 30 minutos no gelo. Após a incuba- ção, as células foram lavadas com tampão FACS três vezes, ressus- pensas em 100 μL de tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo (BD FACSCanto II, San Jose, CA), para o qual foram obtidos
30.000 eventos para cada amostra. A intensidade média de fluores- cência por células foi calculada pelo software FlowJo e usada para ge- rar a curva de ligação de resposta à dose.
[00240] FIG. 1 ilustra um resultado representativo para um anticor- po exemplificativo que se liga ao receptor da superfície celular TREM2 em células HEK293-H6. Avaliação da ativação da sinalização pSyk dependente de TREM2
[00241] A ativação da sinalização de pSyk dependente de TREM2 foi medida em células de macrófagos humanos ou em células HEK293-H6 usando um ensaio AlphaLisa comercial de Perkin-Elmer.
[00242] Para todos os experimentos envolvendo o uso de vesículas lipídicas contendo 70% DOPC e 30% POPS, as vesículas lipídicas fo- ram preparadas dentro de duas semanas de experimentos como se segue: 7 mg de DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) e 3 mg POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina) foram combina- dos em clorofórmio em um frasco de vidro e secos sob uma corrente de gás de N2 por 1-2 horas, ou até a completa secura. A mistura de lipídeos foi ressuspensa em 1 mL de HBSS (para uma concentração final de lipídeos de cerca de 10 mg / mL) e agitada em vórtice por 2-3 minutos. Posteriormente, a suspensão lipídica foi extrudada usando uma mini-extrusora Avanti construída com uma membrana de tamanho de poro de 100 nm para formar pequenas vesículas unilamelares a 10 mg / mL.
1. Dosagem de anticorpos em células
[00243] No dia anterior ao ensaio, células de macrófagos humanos ou células HEK293-H6 foram plaqueadas a 100.000 células / poço ou
40.000 células / poço, respectivamente, em uma placa de 96 poços revestida com poli-D-lisina. Os anticorpos foram diluídos em PBS co- meçando em 300 nM e prosseguindo em uma titulação de diluição em série de 10 pontos com diluições de 3 vezes entre os pontos. Para as curvas de dose-resposta do antagonista, vesículas lipídicas contendo DOPC 70% e POPS 30% na concentração final de 1 mg / mL também foram incluídas na mistura de anticorpo / PBS. As células foram lava- das 3 vezes com HBSS usando um lavador de placas Biotek 405/406, após o que 50 μL por poço da solução de anticorpo / PBS (com ou sem vesículas) foram adicionados usando um manipulador de líquidos Hamilton Nimbus. A placa de células foi então transferida para uma incubadora a 37°C durante 5 minutos. A solução de lipossoma / anti- corpo foi removida sacudindo a placa e 40 μL de tampão de lise (Cell Signaling Technologies, CST) contendo 1 μM de PMSF foram adicio- nados usando o manipulador de líquidos. O lisado foi então congelado a -80°C ou imediatamente testado no ensaio AlphaLisa.
[00244] As células de macrófagos humanos foram preparadas para o ensaio como se segue. Monócitos humanos foram isolados seguindo o protocolo de coquetel de enriquecimento de monócitos humanos Ro- setteSep (Stemcell Technologies, REF #15068) de sangue fresco. Mo- nócitos isolados foram lavados em tampão de lavagem (PBS + 2% FBS) e ressuspensos em 10 mL de tampão de lise ACK (ThermoFis- her Scientific, No. de Catálogo A10492) para lisar glóbulos vermelhos. Vinte (20) mL de tampão de lavagem foram adicionados para parar a lise celular, e a amostra foi centrifugada e lavada mais uma vez com meio de cultura (RPMI, 10% Hyclone FBS, 1% Piruvato de Sódio, 1% Glutamax, 1% aminoácidos não essenciais e 1% Penicilina- estreptomicina). Monócitos humanos foram então diferenciados em células de macrófagos em meio de cultura na presença de 50 ng / mL de M-CSF humano recombinante (Gibco, No. de Catálogo PHC9501) em um frasco de 250 mL. M-CSF humano fresco foi adicionado no dia 3 e macrófagos humanos foram subsequentemente colhidos no dia 5 e usados para o ensaio.
2. Ensaio AlphaLisa
[00245] Os lisados celulares foram testados para pSyk usando o protocolo padrão para o kit Perkin Elmer pSyk AlphaLisa. Em resumo, 10 μL de lisado / poço foram transferidos para um Optiplate de 384 poços branco opaco (Perkin Elmer). Em seguida, 5 μL de Mistura de Aceitador (contendo a solução de trabalho de grânulos de aceitador)
foram adicionados por poço, seguido pela selagem das placas com selos de alumínio e incubação por 1 hora em temperatura ambiente. Posteriormente, 5 μL de Mistura de Doador (contendo a solução de trabalho de grânulos de doador) foram adicionados a cada poço sob condições de luz reduzida. As placas foram novamente vedadas e in- cubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as pla- cas foram lidas usando as configurações AlphaLisa em um leitor de placas Perkin Elmer EnVision.
[00246] FIG. 2 ilustra curvas de resposta à dose de anticorpo anti- TREM2 representativas para ativação de sinal pSyk em células de macrófagos humanos primários. Os círculos pretos sólidos () repre- sentam o anticorpo anti-TREM2 e os círculos brancos abertos (º) re- presentam o controle do isótipo. Cada curva representa a média de três experimentos independentes, e os valores de EC50 são fornecidos na Tabela 1 abaixo. Os resultados indicam que os anticorpos anti- TREM2 são capazes de ativar a sinalização TREM2-DAP12 ITAM em macrófagos humanos primários. Ensaio de resposta de lipossomas em iPSC Microglia
[00247] Anticorpos agonistas de TREM2 e lipossomas contendo fosfotidilserina ativam pSyk via TREM2. A fim de compreender o efeito dos anticorpos anti-TREM2 na sinalização Syk na presença de lipos- somas, microglia iPSC foram pré-tratadas com anticorpo anti-TREM2, seguido pela avaliação da resposta do lipossoma nas células.
[00248] Antes do ensaio, as iPSCs foram diferenciadas em células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) usando um kit comercialmente disponível (STEMdiff Hematopoietic Kit da StemCell Technologies). HPCs foram transferidos para uma placa contendo astrócitos humanos primários e cocultivados por 14-21 dias. Uma vez que as células flutu- antes em cocultura foram predominantemente identificadas como mi- croglia madura (> 80%), a microglia foi usada para o ensaio.
[00249] Dois dias antes do ensaio, microglia iPSC humana foi se- meada a 30.000 células / poço em uma placa de 96 poços revestida com poli-D-lisina. Os anticorpos foram diluídos a 100 nM em meio con- tendo IMDM, Hyclone FBS a 10% e Pen-strep a 1%, e as células fo- ram doseadas com a solução de anticorpo durante 24 horas ou 5 mi- nutos a 37°C. Subsequentemente, as células foram lavadas uma vez com HBSS e depois doseadas com vesículas lipídicas contendo DOPC 70% e POPS 30% a 1 mg / mL durante 5 minutos a 37°C. A solução de lipossoma foi removida sacudindo a placa e 30 μL de tam- pão de lise (Cell Signaling Technologies, CST) contendo 1 μM de PMSF foram adicionados. O lisado foi então congelado a -80°C ou imediatamente testado no ensaio AlphaLisa. Os lisados celulares fo- ram testados para pSyk usando o protocolo padrão para o kit Perkin Elmer pSyk AlphaLisa como descrito acima.
[00250] FIGS. 3A e 3B ilustram a ativação do sinal pSyk na micro- glia iPSC humana incubada com anticorpos anti-TREM2, seguido por dosagem com vesículas lipídicas e avaliação da resposta do liposso- ma nas células. Barras brancas indicam incubação com PBS em vez de vesículas lipídicas como controle. Os dados representam a média e o erro padrão de 2-7 experimentos independentes. FIG. 3A ilustra da- dos para microglia iPSC pré-tratada com anticorpo por 5 minutos, e a FIG. 3B ilustra dados para microglia iPSC pré-tratada com anticorpo por 24 horas. Os resultados mostram que o pré-tratamento da micro- glia iPSC humana com anticorpos anti-TREM2 produz um aumento no sinal de fosfo-Syk eliciado por lipossomas em comparação com o con- trole de isótipo, indicando que os anticorpos anti-TREM2 não interfe- rem, mas, em vez disso, aumentam os lipídeos ativação da sinalização pSyk nas células. Ensaio de repórter TREM2 NFAT humano
[00251] Linhagens celulares Jurkat NFAT expressando TREM2 /
DAP12 humana foram geradas como se segue. As células repórter Jurkat NFAT foram infectadas com a expressão do vetor lentiviral de TREM2 e DAP12 humanos e cultivadas em RPMI contendo Hyclone FBS a 10% e penicilina / estreptomicina a 1%. Os clones de expressão estável foram selecionados na presença de puromicina e zeocina. A expressão de TREM2 na superfície celular foi avaliada por citômetro de fluxo usando um anticorpo anti-TREM2 biotinilado (SEQ ID NOS: 66 e 67). O clone que ilustrou o nível de expressão de TREM2 de tipo selvagem mais alto foi selecionado e denominado como células repór- ter hTrem2 / NFAT Jurkat para o ensaio descrito abaixo.
[00252] No dia anterior ao ensaio, as placas de 96 poços foram pré- revestidas com anticorpo anti-TREM2 ou controle de isótipo a uma titu- lação de dose de 0-500 nM (45 L / poço, total de 12 pontos) e incu- badas durante a noite a 4 C. Após a incubação durante a noite, a placa pré-revestida foi lavada duas vezes com PBS e, em seguida, carrega- da com células repórter hTrem2 / NFAT Jurkat (106 células / poço) em 200 μL de meio de cultura fresco (RPMI com 10% de Hyclone FBS e 1% de penicilina / estreptomicina). A placa foi incubada a 37ºC por 24 horas, após o que 50 L / poço de solução de quantlucia foram adicio- nados a cada poço e bem misturados. Para análise, 20 L de solução foram removidos de cada poço e transferidos para uma placa branca de 384 poços para medição do sinal por luminômetro (Perkin Elmer Envision).
[00253] FIG. 4 inclui curvas de resposta à dose de anticorpo anti- TREM2 representativas para ativação de NFAT, conforme medido pela detecção do gene repórter luciferase, e os valores de EC50 para ativa- ção são fornecidos na Tabela 1 abaixo. Os resultados na FIG. 4 ilus- tram que, em relação ao controle de isótipo, os anticorpos anti-TREM2 candidatos foram capazes de induzir a ativação de NFAT e sinalização a jusante suficiente para ativar uma resposta transcricional.
Ensaio de sobrevivência em células de macrófagos humanos
[00254] Monócitos humanos foram isolados seguindo o protocolo de coquetel de enriquecimento de monócitos humanos RosetteSep (Stemcell Technologies, Catalog No. 15068). Monócitos isolados foram lavados em tampão de lavagem (PBS + 2% FBS) e ressuspensos em 10 mL de solução de lise ACK (ThermoFisher Scientific, No. de Catá- logo A10492) para lisar glóbulos vermelhos. Vinte (20) mL de tampão de lavagem foram adicionados para parar a lise. A suspensão de célu- las foi centrifugada e lavada uma vez com meio de cultura (RPMI 1640 + FBS 10% + penicilina / estreptomicina). As células foram ressuspen- sas em meio de cultura a uma densidade de 106 cells L/mL e utiliza- das no ensaio de sobrevivência descrito abaixo.
[00255] No dia anterior ao ensaio, as placas de 96 poços foram pré- revestidas com anticorpo anti-TREM2 ou controle de isótipo em uma titulação de dose de 0-200 nM (45 L / poço, total de 12 pontos) e in- cubadas durante a noite a 4° C. Após incubação durante a noite, a placa pré-revestida foi lavada duas vezes com PBS e, em seguida, carregada com monócito humano (105 células/poço) na presença de M-CSF humano de baixa concentração (5 ng / mL, Gibco, No. de Catá- logo PHC9501). Após 5 dias a 37ºC, o meio foi aspirado e 100 L de PBS + 100 L de meio Celltiter-glo (Promega, No. de Catálogo G7571) foi adicionado a cada poço. Após 10 minutos de incubação, o meio ce- lular foi transferido para placas de múltiplos poços compatíveis para o uso do luminômetro, e a luminescência para a viabilidade celular foi registrada.
[00256] FIG. 5 ilustra curvas de resposta à dose de anticorpo anti- TREM2 representativas de sobrevivência celular em células de macró- fagos humanos em condições de M-CSF baixo, e os valores de EC50 para sobrevivência são fornecidos na Tabela 1 abaixo. Os resultados indicam que os anticorpos agonistas de TREM2 têm capacidade de ativação do receptor suficiente para induzir uma resposta transcricional para modular a função celular e promover a sobrevivência de células de macrófagos humanos em condições de baixo M-CSF. Medição Cinética Biacore de Anticorpos
[00257] A ressonância de plasmon de superfície (instrumento Bia- core™ 8K) foi usada para medir as afinidades do anticorpo anti- TREM2 para ECD de TREM2 humano e cynomolgus. Anticorpos anti- TREM2 foram capturados usando Human Fab Capture Kit (GE Heal- thcare Life Sciences, No. de Catálogo 28958325) em um chip sensor Biacore Series S CM5 (GE Healthcare Life Sciences, No. de Catálogo 29149604). Diluições em série de 3 vezes de TREM2 humano ou cynomolgus recombinante foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 µL / min. A ligação do anticorpo foi monitorada por 300 segundos, se- guido pelo monitoramento da dissociação do anticorpo por mais de 600 segundos em tampão de execução HBS-EP+ (GE Healthcare Life Sciences, No. de Catálogo BR100669). A resposta de ligação foi corri- gida subtraindo o valor de RU de uma célula de fluxo em branco. Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e koff foi usado para a análise cinética. Os valores de ligação KD são fornecidos na Tabela 1 abaixo. Tabela 1. Características In Vitro de Anticorpos Anticorpo Biacore Biacore Ativação ativa- Ligação NFAT Sobrevi- hTREM TREM2 de pSyk ção celular EC50 vência 2 cyno (macrófa- pSyk (macrófa- (nM)* EC50 KD(nM) KD(nM) gos hu- (HEK2 gos hu- *mAb (nM)* manos) 93-H6) manos) revesti- *mAb re- EC50 (nM) EC50 EC50 (nM) do de vestido de (nM) placa placa CL0020123 0,068 5,7 7 ± 2,7 0,3 Não Cal- 44,7 ± 30,3 culável CL0020188 5,2 2,0 7,7 ± 1,5 0,5 91,2 ± 2,4 ± 1,3 47,0 NB: nenhuma ligação detectada
ND: não determinado Exemplo 2. Modulação de níveis de TREM2 solúvel e comporta- mento de fagocitose em células de macrófagos humanos Ensaio de resposta à dose de TREM2 solúvel em macrófagos huma- nos
[00258] As células de macrófagos humanos foram geradas como descrito acima. Um dia antes do ensaio, as células de macrófagos humanos foram semeadas a 100.000 células / poço em uma placa de 96 poços revestida com poli-D-lisina. Os anticorpos foram diluídos em meio de macrófagos humanos (RPMI, 10% Hyclone FBS, 1% de pi- ruvato de sódio, 1% de Glutamax, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de penicilina-estreptomicina) a partir de 300 nM e prosseguindo em uma titulação de diluição em série de 10 pontos com diluições de 3 vezes entre os pontos. As células foram dosadas com os anticorpos e incubadas durante 24 horas. Após a incubação com os anticorpos, a placa foi girada para remover os resíduos e os sobrenadantes coleta- dos para medição de TREM2 solúvel.
[00259] O TREM2 solúvel foi medido como segue. Resumidamente, placas de estreptavidina de pequenas manchas MSD (Meso Scale Discovery) foram revestidas com anticorpo policlonal anti-hTREM2 bio- tinilado (R&D Systems) durante a noite a 4°C. As placas foram então bloqueadas com BSA / TBST a 3% durante 1 hora à temperatura am- biente. As amostras e padrões foram preparados por aquecimento a 95°C durante 5 minutos em tampão contendo SDS. As amostras e pa- drões preparados foram diluídos 1:10 em 3% BSA / TBST na placa de ensaio após o bloqueio. Uma proteína TREM2-His diluída em 3% BSA / TBST foi usada como um padrão para quantificação absoluta. Após uma incubação de duas horas à temperatura ambiente, as placas fo- ram lavadas com TBST. O anticorpo de detecção primário, anti- TREM2 humano de cabra marcado com sulfo (R&D Systems), foi dilu-
ído em BSA / TBST a 3%, adicionado às placas e incubado durante uma hora à temperatura ambiente. Após a lavagem com TBST, as pla- cas MSD foram desenvolvidas usando 2x MSD de tampão de leitura T, seguido por detecção usando um leitor de placas MSD Sector. Os va- lores de MSD foram convertidos em quantidades absolutas de sTREM2 ajustando uma curva padrão usando o software Prism 7.0 (Graphpad). A modulação da liberação de TREM2 foi representada como uma razão de TREM2 solúvel de células incubadas com anticor- pos anti-TREM2 de teste normalizados para TREM2 solúvel de células cultivadas sem anticorpo anti-TREM2 específico no meio.
[00260] FIG. 6 ilustra níveis representativos de TREM2 solúvel (sTREM2) como uma função da concentração de anticorpo anti- TREM2. Os resultados indicam que os anticorpos anti-TREM2 são ca- pazes de diminuir os níveis de sTREM2 em células de macrófagos humanos de uma maneira dependente da dose após o tratamento du- rante a noite. Ensaio de fagocitose em macrófagos humanos
[00261] As células de macrófagos humanos foram geradas como descrito acima. Dois dias antes do ensaio, as células de macrófagos humanos foram semeadas a 80.000 células / poço em uma placa de 96 poços revestida com poli-D-lisina. Os anticorpos foram diluídos a 100 nM em meio contendo RPMI, 10% de Hyclone FBS, 1% de piruva- to de sódio, 1% de Glutamax, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram então dosadas com so- lução de anticorpo durante 24 horas a 37°C. Os núcleos celulares e a membrana celular foram então corados durante 10 minutos, após o que pHrodo-mielina foi adicionado a 5 µg / mL. As células foram então incubadas durante 4 horas a 37°C. A fluorescência de pHrodo foi me- dida por célula em um microscópio confocal de alto conteúdo (Opera Phoenix), e a intensidade de fluorescência quantificada no software do instrumento.
[00262] A pHrodo-mielina foi preparada purificando a mielina de cé- rebro de camundongo C57Bl / 6 de tipo selvagem (Jackson Laborato- ries) usando métodos descritos em Safaiyan et al. (2016, Nature Neu- roscience 19(8):995-998). Após a purificação, a mielina foi ressuspen- sa em PBS e ajustada para a concentração de proteína de 1 mg / mL usando o DC Protein Assay Kit 2 (BioRad, No. de Catálogo 5000112). A mielina foi marcada com pHrodo-vermelho usando um kit de marca- ção em microescala (ThermoFisher, No. de Catálogo P35363) de acordo com as instruções do fabricante. O excesso de etiqueta foi re- movido peletizando a mielina a 10.000 g por 5 min, removendo o so- brenadante e repetindo essas etapas 3-5 vezes.
[00263] FIG. 7 ilustra resultados representativos do ensaio de fago- citose em células de macrófagos humanos. A fagocitose da mielina foi medida detectando e quantificando a fluorescência de pHrodo em imagens microscópicas de células macrófagos tratadas com TREM2 e comparando os valores medidos aos de um controle de isótipo. Os re- sultados mostram que macrófagos humanos tratados com anticorpos agonistas de TREM2 exemplificativos aumentam a fagocitose de pHrodo-mielina em relação ao controle de isótipo, indicando que os anticorpos anti-TREM2 podem permitir a eliminação benéfica de resí- duos de mielina nas células. Exemplo 3. Modulação da acumulação de lipídeos em iPSC Mi- croglia Ensaio de armazenamento de lipídeos
[00264] Antes do ensaio, as iPSCs foram diferenciadas em células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) usando um kit comercialmente disponível (STEMdiff Hematopoietic Kit da StemCell Technologies). HPCs foram transferidos para uma placa contendo astrócitos humanos primários e cocultivados por 14-21 dias. Uma vez que as células flutu-
antes em cocultura foram predominantemente identificadas como mi- croglia madura (> 80%), a microglia foi usada para o ensaio.
[00265] As células (microglia iPSC, 30.000 células / poço) foram semeadas em placas de 96 poços revestidas com PDL em meio de soro completo. Após 24 horas a 37ºC, mielina não marcada purificada (concentração final de 50 g / mL, purificada de cérebro de camun- dongo C57Bl / 6 do tipo selvagem (Jackson Laboratories) usando mé- todos descritos em Safaiyan et al. (2016, Nature Neuroscience 19 (8): 995-998)) foi adicionada aos poços. Após 24 horas a 37ºC de trata- mento lipídico, o anticorpo anti-TREM2 ou controle de RSV foi adicio- nado aos poços para uma concentração final de 100 nM. As células foram incubadas por mais 48-72 horas a 37ºC antes de coletar ou ob- ter imagens das células. Para experimentos de eliminação de mielina, a mielina foi removida após o período de incubação de 24 horas e substituída por meio contendo anticorpos por 24-48 horas subsequen- tes de incubação.
[00266] Para imageamento de vermelho do Nilo, o sobrenadante foi removido e as células foram incubadas a 37 ºC por 30 minutos em tampão de imageamento de células vivas (Life Technologies, No. de Catálogo A14291DJ) contendo 1 µM de Vermelho do Nilo (ThermoFis- her, No. de Catálogo N1142) e 1 gota / mL de Nucblue (ThermoFisher, No. de Catálogo R37605). Após o período de incubação, a solução de coloração foi removida e as células fixadas em paraformaldeído 4%. As células foram então fotografadas usando configurações de ilumina- ção Alexa 568 e DAPI em um gerador de imagens confocal de alto conteúdo do Opera Phoenix. As manchas lipídicas foram analisadas usando um algoritmo de localização de manchas no software Harmony fornecido com o instrumento. FIG. 8A inclui uma imagem de microsco- pia representativa de microglia iPSC tratada com veículo ou mielina (concentração final de 50 g / mL) por 24 horas, seguida por incuba-
ção com um controle de isótipo ou um anticorpo anti-TREM2 exempli- ficativo (CL0020123) por 72 horas. FIG. 8B é um gráfico de barras representativo para o mesmo anticorpo anti-TREM2 usado na imagem microscópica da FIG. 8A. A quantificação da coloração com Vermelho do Nilo foi realizada pela intensidade total do ponto por célula, e os dados são mostrados como a média e o desvio padrão de três repeti- ções técnicas em diferentes campos da mesma amostra de microsco- pia.
[00267] Para análise lipidômica, as células foram lavadas uma vez com PBS enquanto mantidas em gelo. Um volume de 70 µL de uma solução de metanol:água 9:1 contendo padrões internos 1:100 foi adi- cionado às células na placa de 96 poços. A placa foi agitada em agita- dor a 4ºC e 1200 rpm por 20 minutos e depois centrifugada por 5 minu- tos a 300 x g. Uma amostra de 50 µL de sobrenadante foi transferida para frascos de LCMS e mantida a -80ºC até ser analisada no instru- mento.
[00268] Os níveis lipídicos foram analisados por cromatografia lí- quida (sistema Shimadzu Nexera X2, Shimadzu Scientific Instrument, Columbia, MD, EUA) acoplada à espectrometria de massa por eletro- pulverização (QTRAP 6500+, Sciex, Framingham, MA, EUA). Para ca- da análise, 5 µL de amostra foram injetados em uma coluna BEH C18 1,7 µm, 2,1 × 100 mm (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, EUA) usando uma taxa de fluxo de 0,25 mL / min a 55°C. Para o modo de ionização positiva, a fase móvel A consistia em 60:40 acetonitrila / água (v / v) com formato de amônio 10 mM + ácido fórmico 0,1%; a fase móvel B consistia em 90:10 de álcool isopropílico / acetonitrila (v / v) com 10 mM de formato de amônio + 0,1% de ácido fórmico. Para o modo de ionização negativa, a fase móvel A consistia em 60:40 aceto- nitrila / água (v / v) com acetato de amônio 10 mM; a fase móvel B consistia em 90:10 de álcool isopropílico / acetonitrila (v / v) com ace-
tato de amônio 10 mM. O gradiente foi programado da seguinte forma: 0,0-8,0 min de 45% B a 99% B, 8,0-9,0 min a 99% B, 9,0-9,1 min a 45% B e 9,1-10,0 min a 45% B. Ionização por eletropulverização foi realizada no modo de íon positivo ou negativo aplicando as seguintes configurações: gás de cortina a 30; gás de colisão ajustado para mé- dio; voltagem de spray de íons em 5500 (modo positivo) ou 4500 (mo- do negativo); temperatura de 250°C (modo positivo) ou 600°C (modo negativo); fonte de íons Gás 1 em 50; fonte de íons Gás 2 em 60. A aquisição de dados foi realizada utilizando Analyst 1.6.3 (Sciex) em modo de monitoramento de reação múltipla (MRM), com os seguintes parâmetros: tempo de permanência (mseg) e energia de colisão (CE); potencial de desagrupamento (DP) em 80; potencial de entrada (EP) em 10 (modo positivo) ou -10 (modo negativo), e potencial de saída da célula de colisão (CXP) em 12,5 (modo positivo) ou -12,5 (modo nega- tivo). Os lipídeos foram quantificados por meio de uma mistura de pa- drões internos não endógenos. Os lipídeos foram identificados com base em seus tempos de retenção e propriedades MRM de padrões de referência comercialmente disponíveis (Avanti Polar Lipids, Birmin- gham, AL, EUA).
[00269] FIGS. 8C e 8D ilustram os níveis de éster de colesterol (CE) (FIG. 8C) e espécies de lipídeos triacilglicerídeos (TAG) (FIG. 8D) conforme detectado por espectrometria de massa em lisados celulares de células iPSC da microglia tratadas com anticorpos anti-TREM2 exemplificativos por 72 horas após um tratamento de mielina de 24 horas. FIGS. 8E e 8F ilustram os níveis de éster de colesterol (CE) (FIG. 8E) e espécies de lipídeos triacilglicerídeos (TAG) (FIG. 8F) con- forme detectado por espectrometria de massa em lisados celulares de células iPSC da microglia que foram submetidos a experimentos de lavagem de mielina com exemplos de anticorpos anti-TREM2. Dados LC / MS gerados nas FIGS. 8C-8F foram normalizados para os pa-
drões internos para dados CE e normalizados para controle de mielina + isótipo para cada espécie de lipídeo individual para dados de TAG.
[00270] O acúmulo de lipídeos na microglia iPSC é induzido pelo tratamento com mielina, que é refletido por um aumento na coloração de lipídeos neutros (Nile Red) e por LC / MS para detecção de espé- cies específicas de lipídeos em lisados celulares. Os dados ilustrados nas FIGS. 8A-8F indicam coletivamente que o tratamento de células da microglia iPSC pós-desafio de mielina com os anticorpos anti- TREM2 exemplificativos reduziu o acúmulo de espécies de lipídeos, conforme indicado pela diminuição na coloração de lipídeos neutros em células e pela diminuição dos níveis de espécies de lipídeos CE e TAG medido por LC / MS. A redução dos níveis de lipídeos como re- sultado do tratamento com anticorpos foi observada em diferentes pontos de tempo variando de 24 horas a 72 horas. Para eliminar a possibilidade de que a redução nos níveis de lipídeos seja causada pelo bloqueio da captação de lipídeos, foram realizadas experiências de lavagem de mielina em que a mielina foi removida antes da adição do anticorpo anti-TREM2. FIG. 8F ilustra que os anticorpos anti- TREM2 também reduziram os níveis de lipídeos na microglia iPSC com lavagem de mielina antes do tratamento com anticorpo em rela- ção ao controle de isótipo. Exemplo 4. Classificação funcional de epitopos de anticorpos
[00271] As caixas do epitopo do anticorpo TREM2 foram determi- nadas por ligação de competição na proteína TREM2. O experimento de armazenamento de epitopo foi realizado em um instrumento Carter- ra LSA usando um método de configuração de armazenamento de epi- topo sanduíche clássico a 25°C. Todos os anticorpos de teste foram imobilizados em um chip HC30M por acoplamento de amina. Múltiplos ciclos de ligação de competição em sanduíche foram então realizados para os anticorpos de teste. Cada ciclo consistia em injeção de antíge-
no (ECD TREM2 marcado com His) seguida de injeção de anticorpo analito nos anticorpos imobilizados. Ao final de cada ciclo, a superfície dos anticorpos imobilizados foi regenerada pela injeção de um tampão de baixo pH (pH = 3) contendo 1,25 M de NaCl. Os dados de ligação do epitopo foram avaliados pelo software Carterra para criar matriz de competição e caixas de epitopos. Os resultados são fornecidos na Ta- bela 2.
[00272] Duas caixas agonistas foram identificadas por armazena- mento de epitopos dos anticorpos anti-TREM2: (1) agonistas de liga- ção de haste e (2) agonistas de ligação de domínio IgV. Os anticorpos dentro das mesmas caixas demonstraram a mesma função, por exem- plo, inibição da ativação de TREM2-DAP12 pSyk por ligando lipídico (anticorpos antagonistas), ativação de pSyk com anticorpo sozinho (agonistas de ligação de haste, agonistas de ligação de domínio IgV). Tabela 2. Caixas de anticorpo anti-TREM2, anotadas por classe funci- onal Caixa 1 Caixa 2 Agonista de haste Agonista IgV CL0020188 CL0020123 Exemplo 5. Ligação de anticorpo ao peptídeo de haste TREM2
[00273] Os anticorpos TREM2 foram avaliados quanto à ligação a peptídeos da região de haste TREM2 humano e de camundongo. Os peptídeos testados incluíram: (1) região de haste de comprimento total (aminoácidos 129-172 de TREM2 humano, UniProtKB Q9NZC2; ami- noácidos 131-169 de TREM2 de camundongo, UniProtKB Q99NH8) e (2) um peptídeo de haste truncado contendo o sítio de clivagem ADAM10 / 17 (aminoácidos 149-163 de TREM2 humano / camundon- go). A ligação do anticorpo aos peptídeos de haste TREM2 foi detec- tada usando ELISA sanduíche padrão. Resumidamente, uma placa de ELISA de meia área de 96 poços foi revestida com estreptavidina du- rante a noite a 4ºC. No dia seguinte, peptídeos de haste TREM2 bioti-
nilados diluídos em 1% BSA / PBS foram adicionados à placa e incu- bados por 1 hora. Os anticorpos diluídos em 1% BSA / PBS foram en- tão adicionados e incubados durante 1 hora. Os anticorpos ligados ao peptídeo foram detectados com anticorpo secundário anti-kappa-HRP humano (Bethyl Laboratories, Inc.) diluído em 1% BSA / PBS. As pla- cas foram testadas por reação com um reagente de detecção (One- step TMB Ultra, Thermo) e medição da absorbância a 450 nm (A450) por instrumentação espectrofotométrica padrão (BioTek®). Os resulta- dos são fornecidos na Tabela 3, abaixo. Os dados são mostrados co- mo valores normalizados (vezes sobre o fundo onde fundo = controle de isótipo). Tabela 3. Ligação de anticorpo anti-TREM2 a peptídeos de haste TREM2 CL0020188 CL0020123 Isótipo Ligação de peptídeo humano TREM2 1,0 3,0 1,2 (aa 149-163) Ligação de peptídeo humano TREM2 1,0 51 1,2 (aa 129-172) Ligação de peptídeo TREM2 de camundongo 1,0 0,9 0,9 (aa 149-163) Ligação de peptídeo TREM2 de camundongo 1,0 33 1,0 (aa 131-169)
[00274] A Tabela 3 representa as interações de ligação de peptí- deo-anticorpo da região de haste humano e de camundongo que su- portam os dados de armazenamento de epitopo na Tabela 2. Com ba- se nos dados da Tabela 3, o local em que certos anticorpos anti- TREM2 parecem se ligar corresponde aos aminoácidos 129-148 na região da haste extracelular de TREM2.
[00275] A capacidade dos anticorpos anti-TREM2 de inibir a cliva- gem do peptídeo de haste TREM2 por ADAM17 também foi analisada usando um ensaio de polarização de fluorescência. Os peptídeos de haste TREM2 foram primeiro preparados em tampão de ensaio (25 mM Tris pH 7,5, 2,5 µM ZnCl2, 0,005% Brij-35) com estreptavidina. Os anticorpos anti-TREM2 foram então pré-incubados com peptídeos de caule TREM2 durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após o pe- ríodo de pré-incubação, ADAM17 (R&D systems, No. de Catálogo 930- ADB) foi adicionado e incubado com os peptídeos por 20 horas a 37 ºC. No dia seguinte, as amostras foram ainda diluídas em tampão de ensaio e transferidas para uma placa de 384 poços opaca preta. A po- larização da fluorescência foi subsequentemente medida no leitor de placas Perkin Elmer EnVision. A polarização de fluorescência de pep- tídeos de haste TREM2 pré-incubados com anticorpo anti-TREM2 foi comparada à polarização de fluorescência de peptídeo de haste TREM2 de comprimento total e controle de enzima (peptídeo de haste TREM2 de comprimento total com ADAM17).
[00276] Os anticorpos TREM2 de ligação à haste aumentaram sig- nificativamente a polarização de fluorescência, demonstrando a inibi- ção parcial da clivagem do peptídeo de haste por ADAM17 (clones CL0020141, CL0020188, CL0020313, CL0020308). O anticorpo CL0020107 de ligação a IgV não se ligou ao peptídeo da região de haste TREM2 e, portanto, não mostrou um efeito na clivagem do pep- tídeo no ensaio de polarização de fluorescência. Exemplo 6. Análise Farmacocinética de Anticorpos Anti-TREM2
[00277] Os perfis farmacocinéticos dos anticorpos anti-TREM2 fo- ram avaliados em camundongos. Os camundongos C57BL / 6J foram adquiridos no Laboratório Jackson (Stock No. 000664) aos 2 meses de idade, usados para um estudo de farmacocinética (PK) de 7 dias e es- tudo de engajamento do alvo. Camundongos homozigotos cDNA KI de
Trem2 humano (huTrem2KI/KI) foram usados para um estudo de enga- jamento de alvo de 24 horas aos 3 meses de idade. A geração e re- produção dos camundongos cDNA KI de Trem2 humano são descritas abaixo. Geração de modelo de camundongo cDNA KI de Trem2 humano
[00278] Um camundongo humano TREM2 cDNA KI (huTrem2KI/KI) foi gerado como segue. A sequência de cDNA-pA de Trem2 humano foi inserida no sítio de início ATG endógeno de Trem2 de camundon- go. A inserção de cDNA-pA de Trem2 humano resultou na substituição da sequência de éxon 1 de Trem2 de camundongo, que permite a ex- pressão de cDNA de Trem2 humano conduzida pelo promotor endó- geno de camundongo e na interrupção da expressão de Trem2 de ca- mundongo endógeno. O camundongo huTrem2KI/KI foi gerado no fundo genético C57BL / 6 usando recombinação homóloga.
[00279] Para o vetor de direcionamento huTrem2KI/KI, o braço de homologia longo (LA) se estende cerca de 3,6 kb a montante da ex- tremidade 5' da sequência de cDNA-pA de Trem2 humano e o braço de homologia curto (SA) se estende cerca de 2,3 kb a jusante da 3' para a fita Neo flanqueada por FRT. Ambos os braços de homologia longo e curto foram amplificados a partir de um clone C57BL / 6 BAC (RP23: 358G22) e, em seguida, subclonados em um vetor de espinha dorsal de ~ 2,4 kb pSP72 (Promega) contendo um cassete de seleção de ampicilina. Um cassete de Neomicina flanqueado por hUBS-gb2 FRT foi inserido imediatamente a jusante do cassete hTrem2-pA, re- sultando em um vetor de direcionamento de cerca de 13,6 kb de ta- manho. Dez (10) g do vetor de direcionamento foram linearizados com a enzima de restrição Not I (New England Biolabs) e, em seguida, transfectados em células-tronco embrionárias (ES) FLP C57Bl / 6 (B6) por eletroporação. Após a seleção com o antibiótico G418, os clones sobreviventes foram expandidos para análise de PCR para identificar clones ES recombinantes positivos. As sequências de iniciador para a triagem de PCR (SEQ ID NO:53 = 5’-AGG AAT GTG GGG AGC ACG GAG–3’ and SEQ ID NO:54 = 5’- TGC ATC GCA TTG TCT GAG TAG GTG-3’) amplificaram um fragmento de 2,81 kb contendo a região do elemento bghpA para a jusante do braço de homologia curto (SA) fora da região 3'. Cinco clones foram identificados como positivos e seleci- onados para expansão posterior. O cassete Neo foi removido pelo transgene Flp durante a expansão do clone ES.
[00280] O DNA genômico extraído dos cinco clones positivos foi primeiro caracterizado por análise de sequenciamento. Um produto de 1,19 kb foi amplificado e sequenciado por iniciadores (SEQ ID NO:55 = 5’- ACC CTA GTC CTG ACT GTT GCT C-3’; SEQ ID NO:56 = 5’- TAT AGG AAC TTC GCG ACA CGG ACA C-3’) para confirmar a junção do genoma 5' / cassete neo e as junções do cassete 3'KI. Os resultados de sequenciamento confirmaram a introdução da sequência de cDNA- pA de Trem2 humano em todos os cinco clones.
[00281] Os cinco clones positivos foram ainda caracterizados por análise de Southern Blotting usando sondas direcionadas contra o braço curto e o braço longo. DNA genômico de células ES digerido com Ssp I e Bam HI foram hibridados com braço curto e sonda de bra- ço longo, respectivamente. Todos os cinco clones ES foram confirma- dos para transportar os eventos de recombinação homóloga corretos em ambos os braços longos e curtos. As sequências de iniciador para amplificar a sonda de braço curto (658 pb) são (SEQ ID NO:57 = 5’- ACA GGA GGG ACC TAC CTT CAG 3’; SEQ ID NO:58 = 5’- GCC TGC CTT TCA GAG ACC TCA GTC -3). As sequências de iniciador para amplificar a sonda de braço longo (681 pb) são (SEQ ID NO:59 = 5’- CCT CTC CGG CTG CTC ATC TTA CTC -3’; SEQ ID NO:60 = 5’- GTC TCT CAG CCC TGG CAG AGT TTG -3’).
[00282] Todos os cinco clones de células ES foram então injetados em blastocistos C57BL / 6. Os filhotes de um clone foram confirmados com transmissão da linhagem germinativa por genotipagem por PCR. Os iniciadores para genotipagem são (SEQ ID NO:61 = pr1: 5’- CGC CTA CCC TAG TCC TGA CTG TTG -3’, SEQ ID NO:62 = pr2: 5’- AAA GCC TAC AGC ATC CTC ACC TC -3’; e SEQ ID NO:63 = pr3: 5’- GCA TCA TGG GGT TGT AGA TTC CG -3’). O produto de PCR para o pr1 / pr2 no tipo selvagem é de 658 pb. O produto de PCR para pr1 / pr3 no alelo KI é 469 bp. Dosagem de anticorpos e coleta de plasma / CSF
[00283] Para a análise de PK, os camundongos C57BL/6J foram dosados com anticorpos anti-TREM2 ou IgG de controle a 10 mg / kg por meio de injeção intravenosa (IV) na veia da cauda (volume de do- sagem de cerca de 200 L / camundongo, n = 3 para cada grupo). Amostras de sangue foram coletadas em 1 hora, 24 horas, 4 dias e 7 dias após a dosagem. As amostras de sangue nos três primeiros pon- tos temporais foram coletadas por meio de sangramento submandibu- lar usando lancetas de 3 mm (lancetas de animais GoldenRod). A últi- ma e terminal amostra de sangue no dia 7 foi coletada por punção cardíaca. O sangue foi coletado em tubos de EDTA (Sarstedt Microvet- te 500 K3E, No. de Catálogo 201341102), invertido lentamente para misturar e centrifugado a 4°C. A camada de plasma (topo) foi transfe- rida para tubos Eppendorf de 1,5 mL e armazenada a -80°C até a aná- lise.
[00284] Para o estudo de engajamento de alvo de 24 horas, ca- mundongos C57BL / 6J foram usados para testar anticorpos anti- TREM2 substitutos de camundongo, e camundongos huTrem2KI/KI fo- ram usados para testar anticorpos anti-TREM2 humanos. Os camun- dongos foram dosados com anticorpos anti-TREM2 ou IgG de controle a 100 mg / kg por meio de injeção intravenosa (IV) na veia da cauda (volume de dosagem de cerca de 200 L / camundongo, n = 5 para cada grupo). Amostras de sangue foram coletadas 24 horas antes da dosagem para determinar os níveis basais de TREM2. Amostras ter- minais de sangue e CSF foram coletadas 24 horas após a dosagem. A preparação de plasma foi preparada como descrito acima. Para a cole- ta da amostra de CSF, foi feita uma incisão sagital na parte posterior do crânio, e o tecido subcutâneo e os músculos foram separados para expor a cisterna magna. Um tubo capilar de vidro pré-puxado foi usado para puncionar a cisterna magna e coletar a amostra de CSF. O CSF foi então centrifugado a 4°C para remover os resíduos de sangue e o sobrenadante do CSF foi transferido para um tubo LoBind Eppendorf de 0,5 mL de baixa proteína (Eppendorf, No. de Catálogo 022431064) para armazenamento a -80°C até a análise. Análise de níveis de plasma de anticorpo anti-TREM2 in vivo
[00285] Para a análise de PK de anticorpo anti-TREM2, as concen- trações de anticorpos totais no plasma de camundongo foram quantifi- cadas usando um ELISA sanduíche anti-Fc humano genérico. Uma placa MaxiSorp de 384 poços foi revestida durante a noite com poli- clonal de burro anti-huFc 1 g / mL (Jackson Immunoresearch). Após a incubação com plasma diluído 1:2.000 ou 1:20.000 em tampão de en- saio (PBST, 1% BSA), um anticorpo de burro anti-huFc conjugado com HRP (Jackson Immunoresearch) foi adicionado como o reagente de detecção. As curvas padrão foram geradas para cada anticorpo indivi- dual, de 2 nM a 2,7 pM usando diluições de 3 vezes, usando uma re- gressão logística de cinco parâmetros.
[00286] FIG. 9 ilustra perfis representativos de PK de camundongo para certos anticorpos anti-TREM2. As taxas de eliminação de anticor- pos (CL [mL / dia / kg]) são fornecidas para cada anticorpo represen- tado ao longo de um período de 7 dias e são comparadas ao controle de isótipo sem efetor normal. Cada anticorpo ilustrado na FIG. 9 exibiu taxas de depuração comparáveis em relação ao controle de isótipo.
Engajamento de destino in vivo: níveis de plasma sTREM2
[00287] Para a medição dos níveis plasmáticos de TREM2 solúvel (sTREM2), camundongos humanos TREM2 cDNA KI (huTrem2KI/KI) foram sangrados e, em seguida, tratados por via intravenosa com 100 mg / kg de teste de anticorpo anti-TREM2 ou controle de isótipo.Os camundongos foram sangrados 24 horas após a dosagem. O plasma foi obtido a partir de amostras de sangue e avaliado em um ensaio MSD conduzido como segue. As placas MSD SECTOR foram revesti- das com 1 g / mL de anticorpo de captura (anticorpo R+D anti- TREM2, No. de Catálogo MAB17291-100) diluído em PBS e incubado durante a noite a 4ºC. Os poços de amostra foram bloqueados por 1 hora com MSD Blocker A. não diluído. As amostras de plasma foram diluídas 1:20 em 25% de MSD Blocker A em solução salina tampona- da com Tris contendo 0,05% de Tween-20 (TBST) e adicionadas a ca- da poço de amostra na placa, que foi então incubado por 2 horas em temperatura ambiente. Anticorpo de detecção (anti-humano de cabra marcado com sulfo MSD, No. de Catálogo R32AJ-1, 1: 1000) foi sub- sequentemente adicionado a cada poço de amostra e a placa foi incu- bada durante 1 hora à temperatura ambiente. As lavagens de TBST foram realizadas para cada poço de amostra com um lavador de pla- cas Biotek. O reagente de detecção (MSD Read buffer) foi adicionado e medido usando um leitor MSD Meso Sector S600 para obter os re- sultados da ligação de sTREM2 aos anticorpos.
[00288] FIGS. 10A e 10B ilustram os níveis totais de sTREM2 (FIG. 10A) e os níveis de sTREM2 ligado ao anticorpo (FIG. 10B) no plasma huhuTrem2KI/KI para um anticorpo anti-TREM2 exemplificativo. Os da- dos foram normalizados para os níveis basais de pré-dose de sTREM2 para os ensaios de sTREM2 total e ligado. Os resultados indicam que os níveis de sTREM2 circulante total não mudaram significativamente entre os camundongos tratados com anticorpos anti-TREM2 em com-
paração com o controle de isótipo após tratamento de 24 horas com os anticorpos, o que sugere que os níveis de sTREM2 circulante total não são afetados em pontos de tempo iniciais após a dose do anticorpo. Em contraste, os níveis de sTREM2 ligado ao anticorpo foram maiores em camundongos injetados com anticorpos anti-TREM2 em relação ao controle de isótipo. Exemplo 7. Otimização de sequência e humanização de anticor- pos anti-TREM2
[00289] Anticorpos anti-TREM2 exemplificativos foram otimizados em sequência e humanizados, seguidos pela caracterização quanto à cinética de ligação e especificidade de ligação.
[00290] A otimização da sequência foi conduzida pesquisando nas sequências CDR por resíduos que são suscetíveis à modificação quí- mica (por exemplo, motivos de desamidação de asparagina (NG), mo- tivos de isomerização de ácido aspártico (DS) e resíduos de oxidação em potencial (triptofano (W) e metionina (M)) e fazer substituições de aminoácidos com resíduos conservativos e da linhagem germinativa para remover tais responsabilidades de sequência. Variantes humani- zadas e otimizadas de sequência de anticorpos anti-TREM2 foram en- tão analisadas quanto à cinética de ligação usando Biacore e ligação de células tituladas por dose a células HEK293-H6 (ver, Exemplo 1 para protocolos representativos).
[00291] Os resultados para uma análise das características de liga- ção de variantes humanizadas e otimizadas para sequência do anti- corpo CL0020188 são fornecidos na Tabela 4. Motivos NG na sequên- cia CL0020188 CDR-H2 (SEQ ID NO: 5) e sequência CDR-L1 (SEQ ID NO: 7) foram modificados, enxertados em regiões estruturais humanas e analisados. A Tabela 4 fornece os valores de s KD medidos por Bia- core e valores de EC50 medidos por ensaio de ligação titulada por do- se em células HEK293-H6.
Tabela 4. Características de ligação de variantes humanizadas e oti- mizadas de sequência de CL0020188 Clone hVH hVL KD EC50 CL0020188-1 NG/ enxerto NG/ enxerto 2,3 nM 0,42 nM CL0020188-2 NG/3m NG/ enxerto 3,4 nM 0,26 nM CL0020188-3 NG/ enxerto TG/ enxerto 6,8 nM 0,64 nM CL0020188-4 NG/3m TG/ enxerto 4,8 nM 0,44 nM CL0020188-5 NA/ enxerto NG/ enxerto 5,1 nM 0,45 nM CL0020188-6 NA/3m NG/ enxerto 4,0 nM 0,31 nM CL0020188-7 NA/ enxerto TG/ enxerto 10 nM 0,68 nM CL0020188-8 NA/3m TG/ enxerto 7,3 nM 0,51 nM Parental 9,5 nM 0,44 nM 3m = A24G/L45P/V48L em VH
[00292] Conforme ilustrado na Tabela 4, os clones humanizados e com sequência otimizada de CL00201088 exibiram valores de afinida- de semelhantes para hTREM2 em comparação com o anticorpo paren- tal (KD = 9,5 nM), conforme medido por Biacore. Isso foi consistente com os resultados de ligação celular em células HEK293-H6, que são ilustrados na Tabela 4. Em comparação com o anticorpo parental (EC50 = 0,44 nM), os clones humanizados e otimizados para sequência exibiram afinidade comparável e sub-nanomolar para TREM2 expres- so em células HEK293-H6. Tomados em conjunto, os resultados indi- cam cinética de ligação comparável entre o anticorpo parental e as va- riantes humanizadas e de sequência otimizada.
[00293] Os resultados para uma análise das características de liga- ção de variantes humanizadas e otimizadas para sequência do anti- corpo CL0020123 são fornecidos na Tabela 5. Motivos NG e DS na sequência CL0020123 CDR-H2 (SEQ ID NO: 30) foram modificados, enxertados em regiões estruturais humanas e analisados. A Tabela 5 fornece os valores de s KD medidos por Biacore e valores de EC50 medidos por ensaio de ligação titulada por dose em células HEK293-
H6. Tabela 5. Características de ligação de variantes humanizadas e oti- mizadas de sequência de CL0020123 Clone hVH hVL KD EC50 CL0020123-1 NGDS (SEQ ID Enxerto Vκ 0,14 nM 0,25 nM NO:80)/2m CL0020123-2 NGDS (SEQ ID Enxerto Vκ 0,18 nM 0,23 nM NO:80)/1m CL0020123-3 QGDS (SEQ ID Enxerto Vκ 0,40 nM 0,24 nM NO:81)/2m CL0020123-4 NGES (SEQ ID Enxerto Vκ 0,17 nM 0,17 nM NO:82)/2m CL0020123-5 QGES (SEQ ID Enxerto Vκ 0,44 nM 0,37 nM NO:83)/2m CL0020123-6 QGDS (SEQ ID Enxerto Vκ 0,32 nM 0,29 nM NO:81)/1m CL0020123-7 NGES (SEQ ID Enxerto Vκ 0,15 nM 0,19 nM NO:82)/1m CL0020123-8 QGES (SEQ ID Enxerto Vκ 0,39 nM 0,38 nM NO:83)/1m Parental 0,10 nM 0,26 nM 1m = R71A em VH 2m = V67A/R71A em VH
[00294] Em comparação com o anticorpo parental (KD = 0,10 nM), os clones humanizados e com sequência otimizada exibiram valores de KD cerca de 4 vezes maiores para a ligação a hTREM2 conforme medido por Biacore. Por outro lado, em ensaios de ligação de células tituladas por dose em células HEK293-H6, os clones humanizados e com sequência otimizada exibiram afinidade subnanomolar compará- vel a TREM2. Exemplo 8. Caracterização in vitro de anticorpos anti-TREM2 hu- manizados otimizados para sequência
[00295] Anticorpos anti-TREM2 otimizados de sequência exemplifi-
cativos e humanizados (Exemplo 7) foram avaliados por métodos in vitro, conforme descrito nos Exemplos 1 e 3. Os anticorpos foram ava- liados quanto à ligação de TREM2 em células HEK que expressam TREM2, sinalização de pSyk dependente de TREM2 em células HEK- H6, capacidade de promover a sobrevivência de células de macrófa- gos humanos e capacidade de modular o acúmulo de lipídeos na mi- croglia iPSC. As FIGS. 11 a 14 ilustram os resultados para anticorpos anti-TREM2 representativos. Os anticorpos anti-TREM2 exibiram boa ligação celular em ensaios com células HEK293-H6 que expressam TREM2 (valores de EC50 de 0,34 nM (FIG. 11A) e 0,08 nM (FIG. 11B). Os anticorpos anti-TREM2 também ativaram a sinalização de pSyk em células HEK293-H6 que expressam TREM2 (FIGS. 12A e 12B). Além disso, os anticorpos anti-TREM2 induziram a sobrevivência de macrófagos, com melhor atividade de sobrevivência observada pa- ra um anticorpo variante CL0020188 (FIG. 13). Finalmente, os anticor- pos anti-TREM2 demonstraram capacidade de reduzir o acúmulo de lipídeos na microglia iPSC tratada com mielina (FIGS. 14A e 14B). Exemplo 9. PK de camundongo de anticorpos anti-TREM2 huma- nizados otimizados para sequência
[00296] Os perfis farmacocinéticos de certos anticorpos anti-TREM2 humanizados com sequência otimizada (Exemplo 7) foram avaliados em camundongos de tipo selvagem para um estudo farmacocinético (PK) de 7 dias semelhante ao descrito no Exemplo 6. Cada grupo de dose continha n = 3 camundongos. A Tabela 6 fornece as proprieda- des PK de anticorpos anti-TREM2 otimizados para sequência e huma- nizados exemplificativos (Exemplo 7).
Tabela 6. Propriedades de PK de camundongo de anticorpos anti- TREM2 Clone Dose (mg/kg) C0 (M) AUC0-inf CL (M*h) (mL/dia/kg) Variante 10 1,14 ± 0,05 207,78 ± 8,14 ± 1,80 CL0020188 43,30 Variante 50 6,48 ± 0,61 236,49 ± 2,67 34,58 ± 0,39 CL0020188 Variante 10 1,4999 223,1 13,2 CL0020123 Referência 10 1,017 60,19 33,3 anti-BACE Exemplo 10. PK de cyno de anticorpos anti-TREM2 humanizados otimizados para sequência
[00297] Os perfis farmacocinéticos dos anticorpos anti-TREM2 fo- ram avaliados em macacos cynomolgus naïve. Macacos cynomolgus naïve de 2-4 anos de idade (aproximadamente 2-3 kg de peso) foram injetados com anticorpo anti-TREM2 por meio de injeção intravenosa em bolus. As doses administradas incluíram 3 mg / kg e 25 mg / kg, com n = 3 macacos por grupo de dose. Amostras de sangue (cerca de 1 mL) foram coletadas pré-dose e em 10 minutos, 30 minutos, em 1, 6, 12 e 24 horas, e em 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24 e 28 dias pós-dose. As amostras foram resfriadas a cerca de 5°C antes da centrifugação para obter plasma, e o plasma obtido foi mantido em gelo seco antes do armazenamento a -70°C até a análise. As amostras de plasma foram analisadas quanto aos níveis de anticorpos anti-TREM2 como segue.
[00298] Para a análise de PK do anticorpo anti-TREM2, as concen- trações de anticorpos totais no plasma do macaco foram quantificadas usando um imunoensaio de eletroquimioluminescência em sanduíche anti-IgG_humana genérico (ECLIA) em uma plataforma Meso Scale Discovery (MSD). Resumidamente, tampão de bloqueio de PBS base- ado em caseína a 1% (Thermo Scientific, MA) foi adicionado a uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina de 96 poços MSD GOLD (Meso Scale Discovery, MD) e incubada por aproximadamente 1 hora.
Seguindo as etapas de bloqueio e lavagem da placa, um anti- corpo de cabra anti-IgG_humana biotinilado (SouthernBiotech, AL) em uma solução de trabalho de 0,5 µg / mL foi adicionado à placa de en- saio e deixado a incubar por 1-2 horas.
Após as etapas de incubação e lavagem, as amostras de teste de plasma (isto é, amostras com anti- corpos humanizados anti-TREM2) foram adicionadas à placa de en- saio e incubadas por 1-2 horas.
Observe que as amostras de teste de- vem ser diluídas na diluição mínima exigida do ensaio (MRD) de 1:100 em tampão de ensaio PBS baseado em caseína a 0,5% (Thermo Sci- entific, MA), resultando na matriz de plasma final de 1%, antes de adi- cionar à placa de ensaio.
Após a captura do analito de anticorpo anti- TREM2 e etapas de lavagem, um anticorpo de cabra anti-IgG humana rutenilado (SULFO-TAG) (Meso Scale Discovery, MD) em uma solu- ção de trabalho de 0,4 µg / mL foi adicionado à placa de ensaio e in- cubado por aproximadamente 1 hora.
Por último, após as etapas de incubação e lavagem, um tampão de leitura de ensaio (1X MSD Read Buffer T) foi adicionado à placa de ensaio para gerar sinais de amostra de ensaio.
A amostra de leituras de sinal de um leitor de placa MSD estava na forma de sinais de eletroquimioluminescência (ECL) e ex- pressa em unidades ECL (ECLU). Todas as etapas de reação do en- saio descritas anteriormente foram realizadas à temperatura ambiente e com agitação em um agitador de placa (quando apropriado). O en- saio teve um intervalo padrão de calibração dinâmica de 19,5 – 2.500 ng / mL (ou 0,195 - 25 ng / mL em pós-MRD de 1:100) com 8 pontos padrão diluídos em série a 1:2 mais uma amostra de plasma em bran- co.
A concentração da amostra de plasma foi calculada novamente a partir da curva padrão de calibração do ensaio que foi ajustada com uma regressão logística não linear ponderada de quatro parâmetros.
A Tabela 7 fornece as propriedades farmacocinéticas (PK) de um anti- corpo anti-TREM2 otimizado para sequência e humanizado exemplifi- cativo (Exemplo 7). Tabela 7. Propriedades PK de Cynomolgus de anticorpos anti-TREM2 Clone Dose (mg/kg) AUC0-inf (M*h) CL (mL/dia/kg) Variante CL0020188 25 899,0 ± 53 4,46 ± 0,26 Variante CL0020188 3 61,2 ± 6,3 7,90 ± 0,77
[00299] A variante CL0020188 exibiu níveis baixos de depuração semelhantes entre os diferentes níveis de dose e um perfil farmacoci- nético linear em macacos cynomolgus. Além disso, não houve acha- dos de patologia clínica relacionados à administração da variante em macacos cynomolgus (dados não mostrados). Exemplo 11. Comparação de anticorpos anti-TREM2
[00300] A afinidade de anticorpos anti-TREM2 para TREM2 huma- no e TREM2 de cynomolgus foi medida por Biacore (descrito no Exemplo 1). A potência dos anticorpos anti-TREM2 foi medida em amostras de CSF de voluntários humanos saudáveis (Innovative Re- search) e em amostras de CSF de macaco cynomolgus saudáveis (Worldwide Primates), por ensaio MSD. A potência de cada anticorpo foi determinada por seu EC50. Resumidamente, placas de estreptavi- dina de pequena mancha MSD GOLD de 96 poços (MSD, Cat. No. L45SA) revestido com anticorpo de captura (anti-TREM 2 humano de cabra biotinilado, R&D Systems, Cat. No. BAF1828) foi incubado com amostras de biofluido diluídas 1:3 em Tampão de Ensaio (25% (v / v) MSD Blocker A (MSD, Cat. No. R93BA-A), 75% (v / v) TBST) durante uma hora à temperatura ambiente. Depois de enxaguar os poços com TBST, o anticorpo anti-TREM2 marcado com sulfo foi adicionado em uma diluição em série (diluição 4x em 11 pontos) aos poços da placa e incubado por uma hora em temperatura ambiente. Os poços foram la- vados com TBST e MSD Read Buffer (MSD, Cat. No. R92TC-3) foi adicionado aos poços. O sinal das amostras foi medido usando um dispositivo MSD Meso Sector S600. Os valores de EC50 para cada anticorpo foram determinados por regressão não linear de inclinação variável de quatro parâmetros. Os anticorpos de referência #1 e #2 correspondem a 4C5 e 6E7 descritos em WO 2018/195506. O anticor- po de referência #3 corresponde a AL2p-58 descrito em WO 2019/028292. As regiões variáveis do anticorpo de referência #1 são representadas por SEQ ID NOS: 73 e 74. As regiões variáveis do anti- corpo de referência #2 são representadas por SEQ ID NOS: 75 e 76. As regiões variáveis do anticorpo de referência #3 são representadas por SEQ ID NOS: 77 e 78. Os resultados são fornecidos na Tabela 8.
[00301] Conforme ilustrado na Tabela 8, as variantes CL0020188 e CL0020123 aqui divulgadas, em relação aos anticorpos de referência, têm afinidade mais forte para TREM2 humano e são mais potentes na ligação de sTREM2 em amostras de CSF isoladas de indivíduos volun- tários humanos saudáveis. Além disso, as variantes CL0020188, em relação aos anticorpos de referência, têm afinidade mais forte para TREM2 cynomolgus e são mais potentes na ligação de sTREM2 em amostras de CSF isoladas de indivíduos saudáveis de macacos cyno- molgus. Isto é demonstrado pela quantidade relativa de anticorpo ne- cessária para atingir a metade da concentração efetiva máxima para a ligação de uma determinada quantidade de sTREM2 nas mesmas condições (EC50). Conforme ilustrado na Tabela 8, maiores quantida- des relativas de anticorpos de referência #1, #2 e #3 são necessárias para atingir EC50 em comparação com os anticorpos CL0020188 e CL0020123.
Tabela 8. Comparação de propriedades de anticorpos anti-TREM2 Anticorpo KD (nM) KD (nM) EC50, EC50, TREM2 hu- TREM2 sTREM2 liga- sTREM2 liga- mano cyno do em CSF do em CSF humano [nM] Cyno [nM] CL0020188-4 1,4 1,5 0,29 0,28 CL0020188-7 3,3 2,8 0,75 0,72 CL0020123-5 0,63 9,3 1,00 49,41 CL0020123-7 0,08 9,4 0,54 16,88 Anticorpo de re- 5,9 14 32,6 81,6 ferência #1 Anticorpo de re- 4,3 9,2 7,4 6,5 ferência #2 Anticorpo de re- 8,7 9,2 7,25 33,72 ferência #3 Exemplo 12. Mapeamento de epitopos de anticorpos anti-TREM2
[00302] Para identificar os epitopos dos anticorpos anti-TREM2 no nível do peptídeo, foi usada a espectrometria de massa de troca de hidrogênio deutério (HDX). TREM2 humano recombinante sozinho ou misturado com anticorpo anti-TREM2 foi incubado com tampão de marcação de óxido de deutério (fosfato de sódio 50 mM, cloreto de só- dio 100 mM, pH 7,0) por 0, 60, 600 e 3600 segundos a 20°C. A troca de hidrogênio / deutério foi extinta pela adição de um volume igual de cloridrato de guanidina 4 M, tampão TCEP 0,85 M (pH final 2,5). As amostras extintas foram então submetidas à digestão com pepsina / protease XIII e análise LC-MS. Resumidamente, as amostras extintas foram injetadas em uma coluna empacotada de pepsina / protease XIII (2,1 x 30 mm) mantida a 20 ºC, e os peptídeos resultantes foram anali- sados usando um sistema UPLC-MS composto por um UPLC Waters Acquity (Waters Corporation) acoplado a um espectrômetro de massa Q Exactive™ HF-Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Fisher). Os peptídeos foram separados em uma coluna C8 de 50 mm x 1 mm mantida a -6 ºC usando um gradiente de 16,5 minutos de 2% a 31% do solvente B (solvente B: 0,2% de ácido fórmico em acetonitrila; solvente A: 0,2% de ácido fórmico na água). Os espectros de massa foram re- gistrados no modo somente MS. Os dados brutos de MS foram pro- cessados usando HDX Workbench (Pascal et al. 2012. Journal of The American Society for Mass Spectrometry 23:1512-1521). Os níveis de deutério foram calculados usando a diferença de massa média entre o peptídeo deuterado e sua forma nativa em t0. A identificação do peptí- deo foi realizada através da pesquisa de dados MS / MS contra a se- quência TREM2 humana com Mascot softward (Matrix Science). A to- lerância de massa para íons precursores e produtos foi de 10 ppm e 0,02 Da, respectivamente.
[00303] Com base nos resultados da espectrometria de massa HDX, CL0020188 e variantes de CL0020188 ligam-se a TREM2 hu- mano (SEQ ID NO: 1) nos resíduos de aminoácidos 143-149 (FPGE- SES (SEQ ID NO: 69)), enquanto CL0020123 e variantes de CL0020123 se ligam a TREM2 humano em (i) resíduos de aminoáci- dos 55-63 (GEKGPCQRV (SEQ ID NO: 70)), (ii) aminoácidos 96-107 (TLRNLQPHDAGL (SEQ ID NO: 71)), e (iii) resíduos de aminoácidos 126 -129 (VEVL (SEQ ID NO: 72)). IX. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA INFORMAL
SEQ Sequência Descrição
ID NO MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGV AGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWC RQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRR
WNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHD Proteína TREM2 hu- 1 AGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLA mana
DPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVE HSISRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKI LAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELD CGHDPGYQLQTLPGLRDT
SEQ Sequência Descrição
ID NO EVKLLDSGGGLVQAGGSLRLSCAGSG
FTFTDFYMSWIRQPPGKAPEWLGVIR 2 NKANGYTAGYNPSVKGRFTISRDNTQ CL0020306 VH
NILYLQMNTLRAEDTAIYYCARLSYGF DYWGQGVMVTVSS DIVMTQGALPNPVPSGESASITCQSSK
SLLHSNGKTYLNWYLQRPGQSPQLLIY 3 WMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLKI CL0020306 VL
SSVEAEDVGVYYCQQFLEFPFTFGSG
TKLEIK CL0020306 CDR-H1; CDR-H1 para CL0020188 e varian- tes CL0020188-1, CL0020188-2, 4 GFTFTDFYMS CL0020188-3, CL0020188-4, CL0020188-5, CL0020188-6, CL0020188-7 e CL0020188-8 CL0020306 CDR-H2; CDR-H2 para CL0020188 e varian- 5 VIRNKANGYTAGYNPSVKG tes CL0020188-1, CL0020188-2, CL0020188-3 e CL0020188-4 6 ARLSYGFDY CL0020306 CDR-H3 CL0020306 CDR-L1; CL0020307 CDR-L1; CL0020307-1 CDR-L1; 7 QSSKSLLHSNGKTYLN CDR-L1 para CL0020188 e varian- tes CL0020188-1,
SEQ Sequência Descrição
ID NO CL0020188-2, CL0020188-5 e CL0020188-6 CL0020306 CDR-L2; CL0020307 CDR-L2; CL0020307-1 CDR-L2; CDR-L2 para CL0020188 e varian- tes CL0020188-1, 8 WMSTRAS CL0020188-2, CL0020188-3, CL0020188-4, CL0020188-5, CL0020188-6, CL0020188-7 e CL0020188-8 CL0020306 CDR-L3; 9 QQFLEFPFT CL0020307 CDR-L3; CL0020307-1 CDR-L3
EVKLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFTNFYMSWIRQPPGRAPEWLGVIR 10 NRPNGYTTDYNPSVKGRFTISRDNTQ CL0020307 VH
NILYLQMSTLRADDTAFYYCTRLTYGF DYWGQGVMVTVSS DIVMTQGALPNPVPSGESASITCQSSK
SLLHSNGKTYLNWYLQRPGQSPQLLIY 11 WMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLKI CL0020307 VL
SSVEAEVVGVYYCQQFLEFPFTFGSG
TKLEIK 12 GFTFTNFYMS CL0020307 CDR-H1 13 VIRNRPNGYTTDYNPSVKG CL0020307 CDR-H2 14 TRLTYGFDY CL0020307 CDR-H3
EVKLLDSGGGLVQAGGSLRLSCAGSG 15 CL0020188 VH
FTFTDFYMSWIRQPPGKAPEWLGVIR
SEQ Sequência Descrição
ID NO NKANGYTAGYNPSVKGRFTISRDNTQ NILYLQMNTLRAEDTAIYYCARLTYGF DYWGQGVMVTVSS DIVMTQGALPNPVPSGESASITCQSSK
SLLHSNGKTYLNWYLQRPGQSPQLLIY 16 WMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLKI CL0020188 VL
SSVEAEDVGVYYCQQFLEYPFTFGSG
TKLEIK CDR-H3 para CL0020188 e varian- tes CL0020188-1, CL0020188-2, CL0020188-3, 17 ARLTYGFDY CL0020188-4, CL0020188-5, CL0020188-6, CL0020188-7 e CL0020188-8 CDR-L3 para CL0020188 e varian- tes CL0020188-1, CL0020188-2, CL0020188-3, 18 QQFLEYPFT CL0020188-4, CL0020188-5, CL0020188-6, CL0020188-7 e CL0020188-8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFTDFYMSWVRQAPGKGLEWVSVIR CL0020188-1 VH; 19 NKANGYTAGYNPSVKGRFTISRDNSK CL0020188-3 VH
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTYG
FDYWGQGTLVTVSS DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCQSSK CL0020188-1 VL; 20 SLLHSNGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIY CL0020188-2 VL;
SEQ Sequência Descrição
ID NO WMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKI CL0020188-5 VL; SRVEAEDVGVYYCQQFLEYPFTFGQG CL0020188-6 VL
TKVEIK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGS
GFTFTDFYMSWVRQAPGKGLEWVSVI 21 RNKANGYTAGYNPSVKGRFTISRDNS CL0020188-2 VH
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTY
GFDYWGQGTLVTVSS DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCQSSK CL0020188-3 VL;
SLLHSTGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIY CL0020188-4 VL; 22 WMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKI CL0020188-7 VL;
SRVEAEDVGVYYCQQFLEYPFTFGQG TKVEIK CL0020188-8 VL CDR-L1 para as vari- antes CL0020188-3, 23 QSSKSLLHSTGKTYLN CL0020188-4, CL0020188-7 e CL0020188-8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFTDFYMSWVRQAPGKGLEWVSVIR CL0020188-5 VH; 24 NKANAYTAGYNPSVKGRFTISRDNSK CL0020188-7 VH
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTYG
FDYWGQGTLVTVSS CDR-H2 para as vari- antes CL0020188-5, 25 VIRNKANAYTAGYNPSVKG CL0020188-6, CL0020188-7 e CL0020188-8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGS
GFTFTDFYMSWVRQAPGKGPEWLSVI CL0020188-6 VH; 26 RNKANAYTAGYNPSVKGRFTISRDNS CL0020188-8 VH
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTY GFDYWGQGTLVTVSS
EVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASG 27 CL0020123 VH
FSIEDFYIHWVKQRPEQGLEWIGWIDP
SEQ Sequência Descrição
ID NO ENGDSKYAPKFQGKATMTADTSSNTA YLHLSSLTSEDTAVYYCHADHGNYGS TMDYWGQGTSVTVSS DIQMNQSPSSLSASLGDTVTITCHASQ
HINVWLSWYQQKPGDHPKLLIYKASNL 28 CL0020123 VL
HTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPE
DIATYYCQQGQTYPRTFGGGTKLEIK CDR-H1 para CL0020123 e varian- tes CL0020123-1, CL0020123-2, CL0020123-3, 29 GFSIEDFYIH CL0020123-4, CL0020123-5, CL0020123-6, CL0020123-7 e CL0020123-8 CDR-H2 para CL0020123 e varian- 30 WIDPENGDSKYAPKFQG tes CL0020123-1 e CL0020123-2 CDR-H3 para CL0020123 e varian- tes CL0020123-1, CL0020123-2, CL0020123-3, 31 HADHGNYGSTMDY CL0020123-4, CL0020123-5, CL0020123-6, CL0020123-7 e CL0020123-8 CDR-L1 para CL0020123 e varian- 32 HASQHINVWLS tes CL0020123-1, CL0020123-2,
SEQ Sequência Descrição
ID NO CL0020123-3, CL0020123-4, CL0020123-5, CL0020123-6, CL0020123-7 e CL0020123-8 CDR-L2 para CL0020123 e varian- tes CL0020123-1, CL0020123-2, CL0020123-3, 33 KASNLHT CL0020123-4, CL0020123-5, CL0020123-6, CL0020123-7 e CL0020123-8 CDR-L3 para CL0020123 e varian- tes CL0020123-1, CL0020123-2, CL0020123-3, 34 QQGQTYPRT CL0020123-4, CL0020123-5, CL0020123-6, CL0020123-7 e CL0020123-8
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG
FSIEDFYIHWVRQAPGQGLEWMGWID 35 PENGDSKYAPKFQGRATITADTSTSTA CL0020123-1 VH
YMELSSLRSEDTAVYYCHADHGNYGS
TMDYWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQ CL0020123-1 VL; HINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNL CL0020123-2 VL; 36 HTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE CL0020123-3 VL; DFATYYCQQGQTYPRTFGQGTKVEIK CL0020123-4 VL
SEQ Sequência Descrição
ID NO CL0020123-5 VL; CL0020123-6 VL; CL0020123-7 VL; CL0020123-8 VL
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG
FSIEDFYIHWVRQAPGQGLEWMGWID 37 PENGDSKYAPKFQGRVTITADTSTSTA CL0020123-2 VH
YMELSSLRSEDTAVYYCHADHGNYGS TMDYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG
FSIEDFYIHWVRQAPGQGLEWMGWID 38 PEQGDSKYAPKFQGRATITADTSTSTA CL0020123-3 VH
YMELSSLRSEDTAVYYCHADHGNYGS
TMDYWGQGTLVTVSS CDR-H2 para as vari- 39 WIDPEQGDSKYAPKFQG antes CL0020123-3 e CL0020123-6
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG
FSIEDFYIHWVRQAPGQGLEWMGWID 40 PENGESKYAPKFQGRATITADTSTSTA CL0020123-4 VH
YMELSSLRSEDTAVYYCHADHGNYGS
TMDYWGQGTLVTVSS CDR-H2 para as vari- 41 WIDPENGESKYAPKFQG antes CL0020123-4 e CL0020123-7
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG
FSIEDFYIHWVRQAPGQGLEWMGWID 42 PEQGESKYAPKFQGRATITADTSTSTA CL0020123-5 VH
YMELSSLRSEDTAVYYCHADHGNYGS
TMDYWGQGTLVTVSS CDR-H2 para as vari- 43 WIDPEQGESKYAPKFQG antes CL0020123-5 e CL0020123-8 44 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG CL0020123-6 VH
SEQ Sequência Descrição
ID NO FSIEDFYIHWVRQAPGQGLEWMGWID PEQGDSKYAPKFQGRVTITADTSTSTA YMELSSLRSEDTAVYYCHADHGNYGS TMDYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG
FSIEDFYIHWVRQAPGQGLEWMGWID 45 PENGESKYAPKFQGRVTITADTSTSTA CL0020123-7 VH
YMELSSLRSEDTAVYYCHADHGNYGS TMDYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG
FSIEDFYIHWVRQAPGQGLEWMGWID 46 PEQGESKYAPKFQGRVTITADTSTSTA CL0020123-8 VH
YMELSSLRSEDTAVYYCHADHGNYGS
TMDYWGQGTLVTVSS W-I-D-P-E-β6-G-β8-S-K-Y-A-P-K-F-Q-G, Sequência consenso 47 em que β6 é N ou Q e β8 é D ou E CDR-H2 G-F-T-F-T-α6-F-Y-M-S, em que α6 é D Sequência de consen- 48 ou N so CDR-H1 V-I-R-N-β5-β6-N-β8-Y-T-β11-β12-Y-N-P- S-V-K-G, em que β5 é K ou R; β6 é A ou Sequência consenso 49 P; β8 é G ou A;β11 é ou T; e β12 é G ou CDR-H2
D γ1-R-L-γ4-Y-G-F-D-Y, em que γ1 é A ou Sequência consenso 50 T; e γ4 é T ou S CDR-H3 Q-S-S-K-S-L-L-H-S-δ10-G-K-T-Y-L-N, Sequência de consen- 51 em que δ10 é N ou T so CDR-L1 Q-Q-F-L-E-ϕ6-P-F-T, em que ϕ6 é Y ou Sequência consenso 52 F CDR-L3 53 AGGAATGTGGGGAGCACGGAG Sequência de iniciador 54 TGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG Sequência de iniciador 55 ACCCTAGTCCTGACTGTTGCTC Sequência de iniciador 56 TATAGGAACTTCGCGACACGGACAC Sequência de iniciador 57 ACAGGAGGGACCTACCTTCAG Sequência de iniciador 58 GCCTGCCTTTCAGAGACCTCAGTC Sequência de iniciador
SEQ Sequência Descrição
ID NO 59 CCTCTCCGGCTGCTCATC TTACTC Sequência de iniciador 60 GTCTCTCAGCCCTGGCAGAGTTTG Sequência de iniciador 61 CGCCTACCCTAGTCCTGACTGTTG Sequência de iniciador 62 AAAGCCTACAGCATCCTCACCTC Sequência de iniciador 63 GCATCATGGGGTTGTAGATTCCG Sequência de iniciador 64 GGGGS Sequência de Ligante 65 HHHHHH Etiqueta 6X-His
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASG
YTFTSYWMHWVKQSPGRGLEWIGRS DPTTGGTNYNEKFKTKATLTVDKPSST VH para anticorpo anti- 66 AYMQLSSLTSDDSAVYYCVRTSGTGD TREM2 RS9.F6
YWGQGTSLTVSSAKTTAPSVYPLAPV CGGTTGSSVT DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS
QSLVHNNGNTFLHWYLQKPGQSPKLLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI VL para anticorpo anti- 67 SRVEAEDLGVYFCSQTTHVPPTFGGG TREM2 RS9.F6
TKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGG ASVVCF DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQSSK
SLLHSNGKTYLNWYQQKPGQPPKLLI 68 YWMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTL CL0020307-1 VL
TISSLQAEDVAVYYCQQFLEFPFTFGQ
GTKVEIK 69 FPGESES Epitopo TREM2 70 GEKGPCQRV Epitopo TREM2 71 TLRNLQPHDAGL Epitopo TREM2 72 VEVL Epitopo TREM2
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ GISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSL Anticorpo de referên- 73 QVGVPLRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE cia #1 VL
DFATYYCQQADSFPRNFGQGTKLEIK 74 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG Anticorpo de referên-
SEQ Sequência Descrição
ID NO HSFTNYWIAWVRQMPGKGLEWMGIIY cia #1 VH
PGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTA YLQWSSLKASDTAVYFCARQRTFYYD SSGYFDYWGQGTLVTVSS
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ GISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSL Anticorpo de referên- 75 QNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE cia #2 VL
DFATYFCQQADSFPRTFGQGTKLEIK EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG
YSFTSYWIAWVRQMPGKGLEWMGIIY Anticorpo de referên- 76 PGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTA cia #2 VH
YLQWSSLKASDTAMYFCARQRTFYYD SSDYFDYWGQGTLVTVSS DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSS
QSLVHSNRYTYLHWYQQKPGQSPKLLI Anticorpo de referên- 77 YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI cia #3 VL
SRVEAEDVGVYYCSQSTRVPYTFGQG TKLEIK QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG
YAFSSQWMNWVRQAPGQRLEWIGRI Anticorpo de referên- 78 YPGGGDTNYAGKFQGRVTITADTSAS cia #3 VH
TAYMELSSLRSEDTAVYYCARLLRNQ PGESYAMDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGS
GFTFTDFYMSWVRQAPGKGPEWLSVI 79 RNKANGYTAGYNPSVKGRFTISRDNS CL0020188-4 VH
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTY
GFDYWGQGTLVTVSS 80 NGDS Tabela 5 hVH 81 QGDS Tabela 5 hVH 82 NGES Tabela 5 hVH 83 QGES Tabela 5 hVH

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um TREM2 humano, caracte- rizado pelo fato de que compreende: (a) uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de G-F-T-F-T-α6-F-Y-M-S (SEQ ID NO:48), em que α6 é D ou N; (b) uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de V-I-R-N-β5-β6-N-β8-Y-T-β11-β12-Y-N-P-S-V-K-G (SEQ ID NO:49), em que β5 é K ou R; β6 é A ou P; β8 é G ou A; β11 é A ou T; e β12 é G ou D; (c) uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de γ1-R-L-γ4-Y-G-F-D-Y (SEQ ID NO:50), em que γ1 é A ou T; e γ4 é T ou S; (d) uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de Q-S-S-K-S-L-L-H-S-δ10-G-K-T-Y-L-N (SEQ ID NO:51), em que δ10 é N ou T; (e) uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de WMSTRAS (SEQ ID NO: 8); e (f) uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de Q-Q-F-L-E-Φ6-P-F-T (SEQ ID NO:52), em que Φ6 é Y ou F.
    2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a se- quência CDR-H1 é selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 e 12.
    3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência CDR-H2 é selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 13 e 25.
    4. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequência CDR-H3 é selecionada a partir de qual- quer uma das SEQ ID NOS: 6, 14 e 17.
    5. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequência CDR-L1 é selecionada a partir de qual- quer uma das SEQ ID NOS: 7 e 23.
    6. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sequência CDR-L3 é selecionada a partir de qual- quer uma das SEQ ID NOS: 9 e 18.
    7. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 , uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (b) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou
    (c) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (d) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (e) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou (f) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 12, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 , uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma
    CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou (g) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
    9.
    8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26 e 79.
    9. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a se- quência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15.
    10. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a se- quência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15.
    11. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 15.
    12. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a se- quência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24.
    13. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sequência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24.
    14. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 24.
    15. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a se- quência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 79.
    16. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a sequência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 79.
    17. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 79.
    18. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22 e 68.
    19. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a sequência VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16.
    20. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sequência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a
    SEQ ID NO: 16.
    21. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sequência VL compreende a SEQ ID NO: 16.
    22. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a sequência VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22.
    23. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a sequência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22.
    24. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a sequência VL compreende a SEQ ID NO: 22.
    25. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a sequência VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 68.
    26. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a sequência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 68.
    27. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a sequência VL compreende a SEQ ID NO: 68.
    28. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende:
    (a) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 16; ou (b) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 20; ou (c) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 21 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 20; ou (d) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 22; ou (e) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 79 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 22; ou (f) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 20; ou (g) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 20; ou (h) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 22; ou (i) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 22; ou (j) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 3; ou (k) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 10 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 11; ou (l) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 68.
    29. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um TREM2 humano, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo compreende: (a) uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de GFSIEDFYIH (SEQ ID NO: 29);
    (b) uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de W-I-D-P-E-β6-G-β8-S-K-Y-A-P-K-F-Q-G (SEQ ID NO:47), em que β6 é N ou Q e β8 é D ou E; (c) uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de HADHGNYGSTMDY (SEQ ID NO: 31); (d) uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de HASQHINVWLS (SEQ ID NO: 32); (e) uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de KASNLHT (SEQ ID NO: 33); e (f) uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de QQGQTYPRT (SEQ ID NO: 34).
    30. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a sequência CDR-H2 é selecionada a partir de SEQ ID NOS: 30, 39, 41 e 43.
    31. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (b) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre-
    endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (c) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (d) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
    32. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma sequência VH que tem pelo me- nos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45 e 46.
    33. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a sequência VH tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27.
    34. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno,
    de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a sequência VH tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27.
    35. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a sequência VH compreende a SEQ ID NO: 27.
    36. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 35, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma sequência VL que tem pelo me- nos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 36.
    37. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a sequência VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28.
    38. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a sequência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28.
    39. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a sequência VL compreende a SEQ ID NO: 28.
    40. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 27 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 28; ou (b) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 35 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 36; ou (c) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 37 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 36; ou (d) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 38 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 36; ou (e) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 40 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 36; ou (f) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 42 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 36; ou (g) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 44 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 36; ou (h) uma sequência VH compreendendo SEQ ID NO: 45 e uma sequência VL compreendendo SEQ ID NO: 36; ou (i) uma sequência VH compreendendo a SEQ ID NO: 46 e uma sequência VL compreendendo a SEQ ID NO: 36.
    41. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um TREM2 humano, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo compreende: (a) uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4, 12 e 29; (b) uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 13, 25, 30, 39, 41 e 43; (c) uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6, 14, 17 e 31; (d) uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7, 23 e 32; (e) uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8 e 33; e (f) uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 9, 18 e 34.
    42. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou (b) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (c) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (d) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se-
    quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (e) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou (f) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 12, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou (g) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (h) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá-
    cidos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (i) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (j) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 29, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (k) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR-H3 compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma CDR-L1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
    9.
    43. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46 e
    79.
    44. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia leve que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 11, 16, 20, 22, 28 e 36.
    45. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 2 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; ou (b) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 10 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11; ou (c) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16; ou (d) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
    20; ou (e) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 21 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (f) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 19 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (g) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 79 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (h) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (i) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; ou (j) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (k) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 26 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22; ou (l) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi-
    dade de sequência com a SEQ ID NO: 27 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28; ou (m) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 35 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (n) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 37 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (o) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 38 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (p) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 40 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (q) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 42 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (r) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (s) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 45 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
    36; ou (t) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36; ou (u) uma sequência VH que tem pelo menos 85% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e uma sequência VL que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
    68.
    46. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um receptor desencadeador humano expresso nas células mieloides 2 (TREM2), caracterizado pe- lo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo reconhece um epítopo que é o mesmo ou substancialmente o mesmo que o epítopo reconhecido por clone de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: Clone CL0020306, Clone CL0020188, Clone CL0020188-1, Clone CL0020188-2, Clone CL0020188-3, Clone CL0020188-4, Clone CL0020188-5, Clone CL0020188-6, Clone CL0020188-7, Clone CL0020188-8, Clone CL0020307, Clone CL0020123, Clone CL0020123-1, Clone CL0020123-2, Clone CL0020123-3, Clone CL0020123-4, Clone CL0020123-5, Clone CL0020123-6, Clone CL0020123-7, e Clone CL0020123-8.
    47. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno reconhece um epítopo que é o mesmo ou substancialmente o mesmo que o epítopo reconhe- cido por um clone de anticorpo selecionado do grupo que consiste em: Clone CL0020123, Clone CL0020123-1, Clone CL0020123-2, Clone CL0020123-3, Clone CL0020123-4, Clone CL0020123-5, Clone
    CL0020123-6, Clone CL0020123-7, e Clone CL0020123-8.
    48. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno reconhece um ou mais dos seguintes na SEQ ID NO: 1: (i) resíduos de aminoácidos 55-63 (GEKGPCQRV (SEQ ID NO:70)), (ii) aminoácidos 96-107 (TLRN- LQPHDAGL (SEQ ID NO:71)), e (iii) resíduos de aminoácidos 126-129 (VEVL (SEQ ID NO:72)).
    49. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno reconhece um epítopo que é o mesmo ou substancialmente o mesmo que o epítopo reconhe- cido por um clone de anticorpo selecionado do grupo que consiste em: Clone CL0020188, Clone CL0020188 -1, Clone CL0020188-2, Clone CL0020188-3, Clone CL0020188-4, Clone CL0020188-5, Clone CL0020188-6, Clone CL0020188-7, Clone CL0020188-8, Clone CL0020307 e Clone CL0020306.
    50. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno reconhece os resíduos de aminoácidos 143-149 (FPGESES (SEQ ID NO: 69)) em SEQ ID NO: 1.
    51. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um TREM2 humano, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo reconhece um epítopo compreendendo ou consistindo em um ou mais dos seguintes na SEQ ID NO: 1: (i) resíduos de ami- noácidos 55-63 (GEKGPCQRV (SEQ ID NO: 70)), (ii) aminoácidos 96- 107 (TLRNLQPHDAGL (SEQ ID NO: 71)), e (iii) resíduos de aminoáci- do 126-129 (VEVL (SEQ ID NO: 72)).
    52. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um TREM2 humano, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo reconhece um epítopo que compreende ou consiste em resíduos de aminoácidos 143-149 (FPGESES (SEQ ID NO: 69)) em SEQ ID NO: 1.
    53. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo diminui os níveis de proteína TREM2 solúvel (sTREM2).
    54. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo intensifica a atividade de TREM2.
    55. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo intensifica a fagocitose ou aumenta a migração, diferenciação, função ou sobrevivência de células mieloides, microglia ou macrófagos.
    56. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo intensifica a função da microglia sem aumentar a neuroinflamação.
    57. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo intensifica a fosforilação de Syk.
    58. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo intensifica a fosforilação de Syk na presença de um ligando TREM2.
    59. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo exibe reatividade cruzada com uma proteína TREM2 de cynomolgus.
    60. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
    61. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico.
    62. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.
    63. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo totalmente humano.
    64. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab’)2, um scFv, ou um scFv bivalente.
    65. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64 , e um transportador farmaceuticamente aceitável.
    66. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compete com o anticorpo isola-
    do como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 64 para li- gação à proteína TREM2 humana.
    67. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 64 , ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 65; e instruções de uso dos mesmos.
    68. Método de tratamento de uma doença neurodegenerati- va em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar ao indivíduo o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 64 , ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação
    65.
    69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracteriza- do pelo fato de que a doença neurodegenerativa é selecionada a partir do grupo que consiste em: doença de Alzheimer, tauopatia primária relacionada à idade, paralisia supranuclear progressiva (PSP), demên- cia frontotemporal, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, demência de grãos argirofílicos, esclerose lateral amiotrófica, complexo de esclerose lateral amiotrófica / parkinsonismo- demência de Guam (ALS-PDC), degeneração corticobasal, encefalo- patia traumática crônica, doença de Creutzfeldt-Jakob, demência pugi- lística, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndro- me de Down, demência familiar britânica, demência familiar dinamar- quesa, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, tauopatia glial globular, parkinsonismo de Guadalupe com demência, PSP de Guada- lupe, doença de Hallevorden-Spatz, leucoencefalopatia difusa heredi- tária com esferoides (HDLS), doença de Huntington, miosite de corpos de inclusão, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia miotônica, doença de Nasu-Hakola, demência com predomínio de emaranhados neurofi-
    brilares, doença de Niemann-Pick tipo C, degeneração pallido-ponto- nigral, doença de Parkinson, doença de Pick, parkinsonismo pós- encefalítico, amiloide cerebral de proteína de príon angiopatia, gliose subcortical progressiva, panencefalite esclerosante subaguda e de- mência apenas emaranhada.
    70. Método para diminuir os níveis de sTREM2 em um indi- víduo com uma doença neurodegenerativa, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo o anticorpo isolado ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 64 ou a composição farmacêutica como definido na reivindicação 65.
    71. Método para intensificar a atividade de TREM2 em um indivíduo com uma doença neurodegenerativa, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 64 , ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 65.
BR112021015656-9A 2019-02-20 2020-02-20 Anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos BR112021015656A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962808141P 2019-02-20 2019-02-20
US62/808,141 2019-02-20
PCT/US2020/019093 WO2020172450A1 (en) 2019-02-20 2020-02-20 Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112021015656A2 true BR112021015656A2 (pt) 2021-10-05

Family

ID=69844940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112021015656-9A BR112021015656A2 (pt) 2019-02-20 2020-02-20 Anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos

Country Status (20)

Country Link
US (2) US20220119522A1 (pt)
EP (1) EP3927743A1 (pt)
JP (1) JP7543290B2 (pt)
KR (1) KR20210135518A (pt)
CN (1) CN113614110A (pt)
AR (1) AR118144A1 (pt)
AU (1) AU2020226754A1 (pt)
BR (1) BR112021015656A2 (pt)
CA (1) CA3130086A1 (pt)
CL (1) CL2021002206A1 (pt)
CO (1) CO2021012230A2 (pt)
EA (1) EA202192294A1 (pt)
EC (1) ECSP21069105A (pt)
IL (1) IL285651A (pt)
MA (1) MA55025A (pt)
MX (1) MX2021009722A (pt)
PE (1) PE20211979A1 (pt)
SG (1) SG11202108734VA (pt)
TW (1) TW202045543A (pt)
WO (2) WO2020172457A1 (pt)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
PE20221465A1 (es) 2020-01-13 2022-09-21 Denali Therapeutics Inc Anticuerpos anti-trem2 y metodos para utilizarlos
AU2022273303A1 (en) * 2021-05-14 2023-11-02 Genentech, Inc. Agonists of trem2
AU2023225020A1 (en) 2022-02-23 2024-09-12 Alector Llc Methods of use of anti-trem2 antibodies
WO2023192282A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 Denali Therapeutics Inc. Methods for treating brain glucose hypometabolism
WO2023192288A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 Denali Therapeutics Inc. Monovalent anti-trem2 binding molecules and methods of use thereof
WO2024160736A1 (en) 2023-01-30 2024-08-08 Isar Bioscience Gmbh Human anti-trem2 antibody for treating neurodegenerative disorders

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10087408B2 (en) 2010-07-07 2018-10-02 The University Of British Columbia System and method for microfluidic cell culture
US9188593B2 (en) 2010-07-16 2015-11-17 The University Of British Columbia Methods for assaying cellular binding interactions
MX2017001531A (es) 2014-08-08 2017-05-15 Alector Llc Anticuerpos anti-trem2 y metodos de uso de los mismos.
JP6996979B2 (ja) * 2015-03-31 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三量体ｔｎｆファミリーリガンドを含む抗原結合分子
WO2017058866A1 (en) * 2015-09-28 2017-04-06 Precision Immune, Inc. Anti-trem2 antibodies and uses thereof
CN108738323B (zh) * 2015-10-06 2023-05-26 艾利妥 抗trem2抗体及其使用方法
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
BR112019022752A2 (pt) 2017-08-03 2020-05-19 Alector Llc anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos

Also Published As

Publication number Publication date
TW202045543A (zh) 2020-12-16
PE20211979A1 (es) 2021-10-05
IL285651A (en) 2021-09-30
SG11202108734VA (en) 2021-09-29
WO2020172450A1 (en) 2020-08-27
CN113614110A (zh) 2021-11-05
MA55025A (fr) 2021-12-29
KR20210135518A (ko) 2021-11-15
WO2020172457A1 (en) 2020-08-27
AU2020226754A1 (en) 2021-09-16
ECSP21069105A (es) 2021-11-18
JP7543290B2 (ja) 2024-09-02
US20220073609A1 (en) 2022-03-10
CA3130086A1 (en) 2020-08-27
CL2021002206A1 (es) 2022-04-22
EA202192294A1 (ru) 2021-12-24
US20220119522A1 (en) 2022-04-21
CO2021012230A2 (es) 2021-09-30
JP2022520868A (ja) 2022-04-01
AR118144A1 (es) 2021-09-22
MX2021009722A (es) 2021-09-14
EP3927743A1 (en) 2021-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7543290B2 (ja) 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
US11124567B2 (en) Anti-TREM2 antibodies and methods of use thereof
JP7403441B2 (ja) 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
JP6494565B2 (ja) オリゴマー特異アミロイドベータエピトープおよび抗体
ES2865112T3 (es) Anticuerpos de unión a protofibrillas A-beta mejorados
TW201827466A (zh) 抗-ｔａｕ抗體及使用方法
WO2021146256A1 (en) Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof
ES2693165T3 (es) Formas monoméricas y diméricas de fragmentos de receptores de adiponectina y métodos de uso
BR112020010508A2 (pt) anticorpos anti-alfa-sinucleína
BR112020017956A2 (pt) Anticorpos anti-spla2-gib terapêuticos e os usos dos mesmos
CA2851987A1 (en) Anti-spla2-v antibodies and uses thereof
CN115916234A (zh) 靶向ras蛋白的分子
KR20220092859A (ko) 항-cxcr2 항체 및 이의 용도
TW202337906A (zh) 抗ｐｉｌｒａ抗體、其用途以及相關方法及試劑
WO2023192288A1 (en) Monovalent anti-trem2 binding molecules and methods of use thereof
KR20220143730A (ko) 단백질을 표적화하는 분자
WO2015021291A2 (en) Antibodies to acetylated cyclophilin and use thereof