KR20210135518A

KR20210135518A - 항-trem2 항체 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20210135518A
Application number: KR1020217028927A
Authority: KR
Inventors: 마크 에스. 데니스; 셰리에 던칸; 캐슬린 리사인고; 캐스린 엠. 몬로에; 조슈아 아이. 박; 레이첼 프로록; 주 시; 안키타 스리바스타바; 벳티나 반 렌게리치; 릴리 왈시
Original assignee: 데날리 테라퓨틱스 인크.
Priority date: 2019-02-20
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2021-11-15
Also published as: TW202045543A; PE20211979A1; IL285651A; SG11202108734VA; WO2020172450A1; CN113614110A; MA55025A; WO2020172457A1; AU2020226754A1; ECSP21069105A; JP7543290B2; US20220073609A1; CA3130086A1; BR112021015656A2; CL2021002206A1; EA202192294A1; US20220119522A1; CO2021012230A2; JP2022520868A; AR118144A1

Abstract

일 양태에서, 골수 세포 2 상에 발현된 인간 촉발 수용체 (TREM2) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 가용성 TREM2 (sTREM2)의 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 항체는 TREM2 활성을 향상시킨다.

Description

항-TREM2 항체 및 이의 사용 방법

관련 출원에 대한 교차 참고

본 출원은 2019년 2월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/808,141에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 그 전체로 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.

골수 세포-2 (TREM2) 상에서 발현된 촉발 수용체는 소교세포 상에 발현되는 막횡단 수용체이고 식세포작용, 세포 생존 및 향-염증성 사이토카인의 생성을 조절하는 기능을 하는 것으로 여겨진다. TREM2에서의 돌연변이는 알츠하이머병, 나수-하콜라병, 파킨슨병, 근위축성 측삭경화증, 전두측두엽 치매를 포함한 신경퇴행성 질환에서 확인되었다. 부가적으로, 가용성 TREM2 (sTREM2)의 변화된 수준이 TREM2에 돌연변이가 있는 알츠하이머병 또는 전두측두엽 치매가 있는 환자의 뇌척수액에서 보고되었다.

TREM2 활성 또는 sTREM2의 수준을 조절하는 치료제에 대한 필요성이 남아 있다.

간략한 요약

일 양태에서, 골수 세포 2 상에서 발현된 인간 촉발 수용체 (TREM2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 일부 실시형태에서, TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:

(a) GFSIEDFYIH (서열번호: 29)의 서열을 포함하는 CDR-H1 서열;

(b) W-I-D-P-E-β ₆ -G-β ₈ -S-K-Y-A-P-K-F-Q-G (서열번호: 47)의 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 여기서 β ₆ 은 N 또는 Q이고 β ₈ 은 D 또는 E임;

(c) HADHGNYGSTMDY (서열번호: 31)의 서열을 포함하는 CDR-H3 서열;

(d) HASQHINVWLS (서열번호: 32)의 서열을 포함하는 CDR-L1 서열;

(e) KASNLHT (서열번호: 33)의 서열을 포함하는 CDR-L2 서열; 및

(f) QQGQTYPRT (서열번호: 34)의 서열을 포함하는 CDR-L3 서열.

일부 실시형태에서, CDR-H2 서열은 서열번호: 30, 39, 41, 및 43으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:

(a) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(b) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(c) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(d) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 및 46 중 어느 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 27에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 27에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 27을 포함한다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 42에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 42에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 42를 포함한다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 45에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 45에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 45를 포함한다.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호: 28 또는 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 28에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 28에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 28을 포함한다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 36에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 36에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 36을 포함한다.

(a) 서열번호: 27을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 28을 포함하는 V_L 서열; 또는

(b) 서열번호: 35를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는

(c) 서열번호: 37을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는

(d) 서열번호: 38을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는

(e) 서열번호: 40을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는

(f) 서열번호: 42를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는

(g) 서열번호: 44를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는

(h) 서열번호: 45를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는

(i) 서열번호: 46을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열.

일부 실시형태에서, TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:

(a) G-F-T-F-T-α ₆ -F-Y-M-S (서열번호: 48)의 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 여기서 α ₆ 은 D 또는 N임;

(b) V-I-R-N-β ₅ -β ₆ -N-β ₈ -Y-T-β ₁₁ -β ₁₂ -Y-N-P-S-V-K-G (서열번호: 49)의 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 여기서 β ₅ 는 K 또는 R이고; β ₆ 은 A 또는 P이고; β ₈ 은 G 또는 A이고; β ₁₁ 은 A 또는 T이고; 그리고 β ₁₂ 는 G 또는 D임;

(c) γ ₁ -R-L-γ ₄ -Y-G-F-D-Y (서열번호: 50)의 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 여기서 γ ₁ 은 A 또는 T이고; 그리고 γ ₄ 는 T 또는 S임;

(d) Q-S-S-K-S-L-L-H-S-δ ₁₀ -G-K-T-Y-L-N (서열번호: 51)의 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 여기서 δ ₁₀ 은 N 또는 T임;

(e) WMSTRAS (서열번호: 8)의 서열을 포함하는 CDR-L2 서열; 및

(f) Q-Q-F-L-E-φ ₆ -P-F-T (서열번호: 52)의 서열을 포함하는 CDR-L3 서열, 여기서 φ ₆ 은 Y 또는 F임.

일부 실시형태에서, CDR-H1 서열은 서열번호: 4 및 12 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CDR-H2 서열은 서열번호: 5, 13, 및 25 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CDR-H3 서열은 서열번호: 6, 14, 및 17 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CDR-L1 서열은 서열번호: 7 및 23 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CDR-L3 서열은 서열번호: 9 및 18 중 어느 하나로부터 선택된다.

(a) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(b) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(c) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(d) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(e) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(f) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(g) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 및 79 중 어느 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 15에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 15에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 15를 포함한다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 24에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 24에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 24를 포함한다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 79에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 79에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_H 서열은 서열번호: 79를 포함한다.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 및 68 중 어느 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 16에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 16에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 16을 포함한다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 22에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 22에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 22를 포함한다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 68에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 68에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, V_L 서열은 서열번호: 68을 포함한다.

(a) 서열번호: 15를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 16을 포함하는 V_L 서열; 또는

(b) 서열번호: 19를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 20을 포함하는 V_L 서열; 또는

(c) 서열번호: 21을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 20을 포함하는 V_L 서열; 또는

(d) 서열번호: 19를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 22를 포함하는 V_L 서열; 또는

(e) 서열번호: 79를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 22를 포함하는 V_L 서열; 또는

(f) 서열번호: 24를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 20을 포함하는 V_L 서열; 또는

(g) 서열번호: 26을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 20을 포함하는 V_L 서열; 또는

(h) 서열번호: 24를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 22를 포함하는 V_L 서열; 또는

(i) 서열번호: 26을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 22를 포함하는 V_L 서열; 또는

(j) 서열번호: 2를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 3을 포함하는 V_L 서열; 또는

(k) 서열번호: 10을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 11을 포함하는 V_L 서열; 또는

(l) 서열번호: 24를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 68을 포함하는 V_L 서열.

(a) 서열번호: 4, 12, 및 29 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열;

(b) 서열번호: 5, 13, 25, 30, 39, 41, 및 43 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열;

(c) 서열번호: 6, 14, 17, 및 31 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열;

(d) 서열번호: 7, 23, 및 32 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열;

(e) 서열번호: 8 및 33 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열; 및

(f) 서열번호: 9, 18, 및 34 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열.

(a) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(b) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(c) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(d) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(e) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(f) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3;

(g) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(h) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(i) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(j) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(k) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 및 79 중 어느 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36, 및 68 중 어느 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

(a) 서열번호: 2에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 3에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(b) 서열번호: 10에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 11에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(c) 서열번호: 15에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 16에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(d) 서열번호: 19에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 20에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(e) 서열번호: 21에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 20에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(f) 서열번호: 19에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(g) 서열번호: 79에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(h) 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 20에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(i) 서열번호: 26에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 20에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(j) 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(k) 서열번호: 26에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(l) 서열번호: 27에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 28에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(m) 서열번호: 35에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(n) 서열번호: 37에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(o) 서열번호: 38에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(p) 서열번호: 40에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(q) 서열번호: 42에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(r) 서열번호: 44에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(s) 서열번호: 45에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(t) 서열번호: 46에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는

(u) 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 68에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열.

일부 실시형태에서, TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 클론 CL0020306, 클론 CL0020188, 클론 CL0020188-1, 클론 CL0020188-2, 클론 CL0020188-3, 클론 CL0020188-4, 클론 CL0020188-5, 클론 CL0020188-6, 클론 CL0020188-7, 클론 CL0020188-8, 클론 CL0020307, 클론 CL0020123, 클론 CL0020123-1, 클론 CL0020123-2, 클론 CL0020123-3, 클론 CL0020123-4, 클론 CL0020123-5, 클론 CL0020123-6, 클론 CL0020123-7, 및 클론 CL0020123-8로 구성된 군으로부터 선택된 항체 클론에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프를 인식한다.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 클론 CL0020123, 클론 CL0020123-1, 클론 CL0020123-2, 클론 CL0020123-3, 클론 CL0020123-4, 클론 CL0020123-5, 클론 CL0020123-6, 클론 CL0020123-7 및 클론 CL0020123-8로 구성된 군으로부터 선택된 항체 클론에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프를 인식한다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 1에서 하기 에피토프 중 하나 이상을 인식한다: (i) 아미노산 잔기 55-63 (GEKGPCQRV (서열번호: 70)), (ii) 아미노산 산 96-107 (TLRNLQPHDAGL (서열번호: 71)), 및 (iii) 아미노산 잔기 126-129 (VEVL (서열번호: 72)). 또 다른 양태에서, 개시내용은 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 하고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 1에서 하기 에피토프 중 하나 이상을 포함하거나 이로 구성된 에피토프를 인식한다: (i) 아미노산 잔기 55-63 (GEKGPCQRV (서열번호: 70)), (ii) 아미노산 96-107 (TLRNLQPHDAGL (서열번호: 71)), 및 (iii) 아미노산 잔기 126-129 (VEVL (서열번호 72)). 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 클론 CL0020188, 클론 CL0020188-1, 클론 CL0020188-2, 클론 CL0020188-3, 클론 CL0020188-4, 클론 CL0020188-5, 클론 CL0020188-6, 클론 CL0020188-7, 클론 CL0020188-8, 클론 CL0020307, 및 클론 CL0020306으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 클론에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프를 인식한다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 1에서 아미노산 잔기 143-149 (FPGESES (서열번호: 69))를 인식한다. 또 다른 양태에서, 개시내용은 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 1에 아미노산 잔기 143-149 (FPGESES (서열 ID NO:69))를 포함하거나 이로 구성된 에피토프를 인식한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 가용성 TREM2 단백질 (sTREM2)의 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 참조 항체와 비교하여 더 우수한 효능으로 건강한 인간 CSF 또는 사이노몰구스 CSF에서 가용성 TREM2 단백질 (sTREM2)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 참조 항체는 서열번호: 73 및 74; 서열번호: 75 및 76; 및 서열번호: 77 및 78로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 조합에 의해 표시된다. 일부 실시형태에서, 효능 검정은 실질적으로 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 TREM2 활성을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 식세포작용을 향상시키거나 골수 세포, 소교세포 또는 대식세포의 이동, 분화, 기능 또는 생존을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 신경염증을 증가시키지 않으면서 소교세포 기능을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Syk 인산화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2 리간드의 존재에서 Syk 인산화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 사이노몰구스 TREM2 단백질과 교차-반응성을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 모노클로날 항체이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된 항체이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 완전한 인간 항체이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 Fab, F (ab')₂, scFv, 또는 2가 scFv이다.

또 다른 양태에서, 개시내용은 인간 TREM2 단백질에 대한 결합에 대해 본 명세서에 개시된 바와 같은 단리된 항-TREM2 항체와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 TREM2에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 개시내용은 TREM2에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항-TREM2 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물; 및 그 사용 설명을 포함하는 키트를 제공한다.

여전히 또 다른 양태에서, 개시내용은 대상체에서 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 원발성 연령-관련 타우병증, 진행성 핵상 마비 (PSP), 전두측두엽 치매, 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매, 은친화성 병변 치매, 근위축성 측삭 경화증, 괌의 근위축성 측삭경화증/파킨슨병-치매 복합체 (ALS-PDC), 피질기저변성, 만성 외상성 뇌병증, 크로이츠펠트-야콥병, 푸길리스티카 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경섬유 엉킴, 다운 증후군, 가족성 영국형 치매, 가족성 덴마크형 치매, 거스트만-스트로슬러 샤인커병, 구상교 타우병증, 치매를 동반한 과들로피안 파킨슨병, 과들로피안 PSP, 할레보르덴-스파츠병, 스페로이드를 동반한 유전성 미만성 백질뇌병증 (HDLS), 헌팅턴병, 봉입체 근염, 다계통 위축증, 근긴장성 이영양증, 나수-하콜라병, 신경원섬유 얽힘-우세 치매, 니만-피크병 유형 C, 창백-교-흑질 변성증, 파킨슨병, 픽병, 뇌염후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경교증, 아급성 경화성 범뇌염 및 엉킴 단독 치매로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 개시내용은 신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서 sTREM2의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

여전히 또 다른 양태에서, 개시내용은 신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서 TREM2 활성을 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

도 1은 TREM2를 발현하는 HEK 세포 상의 표면 TREM2에 대한 예시적인 항-TREM2 항체의 결합을 나타내는 대표적인 유세포분석 히스토그램을 포함한다.
도 2는 1차 인간 대식 세포에서 예시적인 항-TREM2 항체에 의한 pSyk 신호 활성화의 대표적인 용량-반응 곡선을 포함한다. 속이 찬 검은색 원 (●)은 항-TREM2 항체를 나타내고 열린 흰색 원 (○)은 이소타입 대조군을 나타낸다.
도 3a 및 3b는 지질 소포를 투여하고 세포에서 리포솜 반응에 이은, 5분 동안 (도 3a) 또는 24시간 동안 (도 3b) 예시적인 항-TREM2 항체로 전-처리 후 인간 iPSC 소교세포의 세포에서 pSyk 신호 활성화의 대표적인 용량-반응 곡선을 포함한다.
도 4는 예시적인 항-TREM2 항체에 의한 자극에 반응하여 인간 TREM2/DAP12를 발현하는 Jurkat NFAT 세포에서 NFAT-루시페라제 리포터 활성의 대표적인 용량-반응 곡선을 포함한다. 속이 찬 검은색 원 (●)은 항-TREM2 항체를 나타내고 열린 흰색 원 (○)은 이소타입 대조군을 나타낸다.
도 5는 예시적인 항-TREM2 항체로의 치료에 대한 반응에서 인간 대식 세포에서 세포 생존의 대표적인 용량-반응 곡선을 예시한다.
도 6은 예시적인 항-TREM2 항체에 대한 항-TREM2 항체 농도의 함수로서 대표적인 가용성 TREM2 수준 (sTREM2)을 예시한다.
도 7은 예시적인 항-TREM2 항체로 처리된 인간 대식세포에서 세포당 평균 pHrodo 형광 강도를 나타내는 막대 차트이다.
도 8a는 예시적인 항-TREM2 항체 또는 이소타입 대조군과 함께 인큐베이션에 이은, 미엘린으로 처리된 iPSC 소교세포에서 지질 축적의 대표적인 현미경 이미지이다.
도 8b는 도 8a에서 이미지화된 iPSC 소교세포의 나일 레드 염색 (지질 축적을 나타냄)의 대표적인 막대 차트이다.
도 8c-8f는 예시적인 항-TREM2 항체와 함께 인큐베이션에 이은, 미엘린으로 처리된 iPSC 소교세포에서 콜레스테릴 에스테르 종 (도 8c 및 8e) 및 트리아실글리세리드 지질 종 (도 8d 및 8f)의 정량화된 수준을 예시하는 막대 차트를 포함한다. 도 8e 및 8f는 예시적인 항-TREM2 항체와 함께 인큐베이션 이전에 미엘린 세정 단계가 포함된 iPSC 소교세포에 대한 데이터를 나타낸다.
도 9는 예시적인 항-TREM2 항체의 대표적인 마우스 혈장 약동학적 프로파일을 포함한다.
도 10a 및 10b는 TREM2 cDNA KI (huTrem2 ^KI ^/ ^KI ) 마우스 안으로 주사된, 예시적인 항-TREM2 항체에 대한 마우스 혈장에서 총 가용성 TREM2 (sTREM2) (도 10a) 및 항체-결합된 TREM2 (도 10b)에서의 변화를 예시하는 막대 차트를 포함한다.
도 11a 및 11b는 예시적인 인간화된 및 서열-최적화된 항-TREM2 항체에 대한 HEK 세포에서 인간 TREM2에 대한 용량-반응 결합 곡선을 포함한다.
도 12a 및 12b는 HEK293-H6 세포에서 예시적인 인간화된 및 서열-최적화된 항-TREM2 항체에 의한 pSyk 신호 활성화의 용량-반응 곡선을 포함한다.
도 13은 예시적인 인간화된 및 서열-최적화된 항-TREM2 항체로의 치료에 대한 반응에서 인간 대식 세포에서의 세포 생존의 용량-반응 곡선을 예시한다.
도 14a 및 14b는 예시적인 인간화된 및 서열-최적화된 항-TREM2 항체로의 치료에 대한 반응에서 iPSC 소교세포에서 지질 제거의 용량-반응 곡선을 포함한다.

I. 도입

TREM2는 소교세포, 수지상 세포, 대식세포 및 파골세포의 세포 표면 상에 발현되는 막횡단 수용체이다. 특정 이론에 구속됨이 없이, 리간드 결합 시 TREM2는 막관통 어댑터 단백질인 DNAX-활성화 단백질 12 (DAP12)와 시그널링 복합체를 형성하고, 이는 차례로 단백질 키나제 SRC에 의해 인산화된 티로신인 것으로 여겨진다. 활성화된 TREM2/DAP12 시그널링 복합체는 Syk 키나제와 같은 키나제를 모집하고 인산화함에 의해 세포내 시그널링을 매개하는 것으로 여겨진다. TREM2/DAP12 시그널링은 식세포작용, 세포 성장 및 생존, 향-염증성 사이토카인 분비, 소교세포 및 대식세포와 같은 세포의 이동과 같은 활성을 조절한다. TREM2는 조절된 막내 단백질분해를 겪으며, 여기에서 막-연관된 전장 TREM2는 메탈로프로테아제 ADAM10에 의해 세포에서 흘러나오는 sTREM2 부분과 감마-분비효소에 의해 추가로 분해되는 막-유지된 C-말단 단편으로 절단된다. sTREM2의 변경된 수준은 알츠하이머병 또는 전두측두엽 치매가 있고 TREM2에 돌연변이가 있는 환자에서 보고되었다. 부가적으로, TREM2에서의 돌연변이는 손상된 식세포작용 및 감소된 소교세포 기능과 같은 변경된 기능과 연관되어 있다.

하기 실시예 섹션에 상세히 설명된 바와 같이, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하고 TREM2/DAP12 시그널링 복합체의 하나 이상의 다운스트림 기능을 조절하는 항체가 생성되었다. 따라서, 일 양태에서, 본 개시내용은 항-TREM2 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 따라서, 일 양태에서, 본 개시내용은 항-TREM2 항체 및 이의 항원-결합 부분을 제공한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 TREM2 활성을 향상시키고, 예를 들어 식세포작용을 향상시키거나 골수 세포, 소교세포 또는 대식세포의 분화, 기능, 이동 또는 생존을 향상시킨다. 따라서, 또 다른 양태에서, 예를 들어 신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서 TREM2 활성을 향상시키는 방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 sTREM2의 발산을 감소시킨다. 따라서, 또 다른 양태에서, 예를 들어 신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서 sTREM2의 수준을 감소시키는 방법이 제공된다.

II. 정의

본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "항체"에 대한 언급은 선택적으로 2개 이상의 이러한 분자의 조합 등을 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "약" 및 "대략"은 숫자 값 또는 범위에 지정된 양을 변형하는 데 사용될 때, 해당 숫자 값뿐만 아니라 당업계의 숙련자에게 알려진 값으로부터의 합리적인 편차를 나타내며, 예를 들어 ± 20%, ± 10% 또는 ± 5%가 인용된 값의 의도된 의미 내에 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "TREM2 단백질"은 유전자 TREM2에 의해 인코딩되는 골수 세포 2 단백질 상에서 발현되는 촉발 수용체를 지칭한다. 본 명세서에 사용된, "TREM2 단백질"은 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 사이노몰구스 원숭이), 설치류 (예를 들어, 마우스, 랫트) 및 기타 포유류와 같은 임의의 척추동물의 천연 (즉, 야생형) TREM2 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, TREM2 단백질은 UniprotKB 수탁 번호 Q9NZC2에서 확인된 서열 (서열번호: 1)을 갖는 인간 TREM2 단백질이다.

본 명세서에 사용된, 용어 "항-TREM2 항체"는 TREM2 단백질 (예를 들어, 인간 TREM2)에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "항체"는 그 가변 영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 접힘을 갖는 단백질을 지칭한다. 용어는 온전한 폴리클로날 항체, 온전한 모노클로날 항체, 단일 사슬 항체, 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체를 포괄한다. 본 명세서에 사용된, 용어 "항체"는 또한 Fab, F (ab')₂, Fv, scFv 및 2가 scFv를 포함하나 이에 제한되지 않는, 그 가변 영역을 통해 결합 특이성을 유지하는 항체 단편을 포함한다. 항체는 카파 또는 람다로 분류되는 경쇄를 함유할 수 있다. 항체는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되는 중쇄를 함유할 수 있으며, 이는 차례로 면역글로불린 클래스인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다.

예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 2개 동일한 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경"쇄 (약 25kD) 및 하나의 "중"쇄 (약 50-70kD)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 "가변 경쇄" (VL) 및 "가변 중쇄" (V_H)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 생식계열 가변 (V) 유전자, 다양성 (D) 유전자, 또는 결합 (J) 유전자로부터 유래되고 (그리고 불변 (Cμ 및 Cδ) 유전자 세그먼트에서 유래되지 않고), 항체에 항원에 대한 결합에 대해 그 특이성을 제공하는 항체 중쇄 또는 경쇄에서의 도메인을 지칭한다. 전형적으로, 항체 가변 영역은 3개의 초가변 "상보성 결정 영역"이 산재된 4개의 보존된 "프레임워크" 영역을 포함한다.

용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 의해 확립된 4개의 프레임워크 영역을 방해하는 각 사슬에서 3개의 초가변 영역을 지칭한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 항체 결합을 담당한다. 각 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 번호가 매겨진 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭되고, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치한 사슬에 의해 동정된다. 따라서, V_H CDR3 또는 CDR-H3은 그것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변 영역에 위치하는 반면, V_L CDR1 또는 CDR-L1은 그것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변 영역으로부터의 CDR1이다.

상이한 경쇄 또는 중쇄의 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성 경쇄 및 중쇄의 결합된 프레임워크 영역은 3-차원 공간에서 CDR을 위치시키고 정렬시키는 역할을 한다. 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 인간 및 마우스 서열에 대한 "VBASE2" 생식계열 가변 유전자 서열 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.

CDR 및 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지된 다양한 정의, 예를 들어 Kabat, Chothia, 국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스 (IMGT), AbM 및 관찰된 항원 접촉 ("Contact")을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 접촉 정의에 따라 결정된다. MacCallum 등, J. Mol . Biol., 262:732-745 (1996) 참고. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat, Chothia 및/또는 접촉 CDR 정의의 조합에 의해 결정된다.

용어 "항원-결합 부분" 및 "항원-결합 단편"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되고 그 가변 영역을 통해 항원 (예를 들어, TREM2 단백질)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예는 Fab 단편 (VL, V_H, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편), F(ab')₂ 단편 (힌지 영역에서 디설파이드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), 단일 사슬 Fv (scFv), 디설파이드-연결된 Fv (dsFv), 상보성 결정 영역 (CDR), V_L (경쇄 가변 영역) 및 V_H (중쇄 가변 영역)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

용어 "에피토프"는 항체의 CDR이 특이적으로 결합하는 항원의 구역 또는 영역을 지칭하고, 소수의 아미노산 또는 소수의 아미노산의 일부, 예를 들어 5 또는 6 또는 그 초과, 예를 들어, 20개 이상의 아미노산, 또는 이들 아미노산의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적이 단백질인 경우, 에피토프는 연속적인 아미노산 (예를 들어, 선형 에피토프), 또는 단백질 폴딩에 의해 근접하게 되는 단백질의 다른 부분으로부터의 아미노산 (예를 들어, 불연속 또는 구조적 에피토프)으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 하나의 아미노산에서 (예를 들어, 세린 또는 트레오닌 잔기에서) 인산화된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 항-TREM2 항체와 관련하여 사용된 어구 "에피토프를 인식한다"는 항체 CDR이 그 에피토프 또는 그 에피토프를 함유하는 항원의 일부에서 항원 (즉, TREM2 단백질)과 상호작용하거나 이에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "다중특이적 항체"는 2개 이상의 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 항체를 지칭하며, 여기서 각각의 항원-결합 부분은 상이한 항원을 인식하는 상이한 가변 영역, 또는 그 가변 영역을 통해 2개 이상의 상이한 항원에 결합하는 항체의 단편 또는 부분을 포함한다. 본 명세서에 사용된, 용어 "이중특이적 항체"는 2개의 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 항체를 지칭하며, 여기서 각각의 항원-결합 부분은 상이한 항원을 인식하는 상이한 가변 영역, 또는 그 가변 영역을 통해 2개의 상이한 항원에 결합하는 항체의 단편 또는 부분을 포함한다.

"모노클로날 항체"는 세포의 단일 클론 또는 단일 세포주에 의해 생성되고 그의 1차 아미노산 서열이 동일한 항체 분자로 구성되거나 본질적으로 구성된 항체를 지칭한다.

"폴리클로날 항체"는 모집단 내의 상이한 항체가 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 이종 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다.

"키메라 항체"는 항원-결합 부위 (즉, 가변 영역, CDR, 또는 이의 일부)가 상이하거나 변경된 부류, 효과기 기능 및/또는 종의 불변 영역에 연결되어서 불변 영역 또는 이의 일부가 변경, 대체 또는 교환되거나, 또는 가변 영역 또는 이의 일부가 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역 (예를 들어, 상이한 종으로부터 CDR 및 프레임워크 영역)으로 변경, 대체 또는 교환되는 항체 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 키메라 항체는 하나의 공급원 또는 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 가변 영역 및 제2 공급원 또는 종 (예를 들어, 인간)으로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 모노클로날 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 기술되어 있다.

"인간화된 항체"는 CDR 외부의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 비-인간 공급원 (예를 들어, 뮤어라인)으로부터 유래된 키메라 면역글로불린이다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나 (예를 들어, 2개)의 항원 결합 가변 도메인(들)을 포함할 것이며, 여기서 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 실질적으로 상응하고 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것에 실질적으로 상응한다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린 서열의 것을 포함할 수 있다. 항체 인간화의 방법은 당업계에 공지되어 있다.

"인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"는 전형적으로 인간 생식계열 유전자로부터 유래된 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 세포, 인간 항체 레퍼토리를 이용하는 비-인간 동물 (예를 들어, 인간 항체 서열을 발현하도록 유전적으로 조작된 이식유전자 마우스), 또는 파지 디스플레이 플랫폼에 의해 생산된다.

용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플에서 에피토프 또는 표적에 대해 다른 에피토프 또는 비-표적 화합물 (예를 들어, 구조적으로 다른 항원)에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 더 큰 결합력 및/또는 더 큰 지속기간으로 그 에피토프 또는 표적에 결합하는 분자 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 부분)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 에피토프 또는 표적에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 항원-결합 부분)는 다른 에피토프 또는 비-표적 화합물보다 적어도 5-배 더 큰 친화력으로, 예를 들어, 적어도 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 20-배, 25-배, 50-배, 100-배, 1,000-배, 10,000-배 또는 초과의 친화력으로 에피토프 또는 표적에 결합하는 항체 (또는 이의 항원-결합 부분)이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 특정 에피토프 또는 표적에 대해, 용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합한다", 또는 "특이적이다"는, 예를 들어, 그것이 예를 들어 10^-4 M 이하, 예를 들어 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M, 또는 10^-12 M로 결합하는 에피토프 또는 표적에 대한 평형 해리 상수 K_D를 갖는 분자에 의해 나타날 수 있다. 한 종으로부터의 표적 (예를 들어, TREM2 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 그 표적 (예를 들어, TREM2 단백질)의 이종상동체에 특이적으로 결합할 것이라는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.

용어 "결합 친화도"는 두 분자 사이, 예를 들어 항체 (또는 이의 항원-결합 부분)와 항원 사이의 비-공유 상호작용의 강도를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 따라서, 예를 들어, 용어는 문맥에서 달리 나타내거나 명확하지 않는 한 항체 (또는 이의 항원-결합 부분)와 항원 사이의 1:1 상호작용을 지칭할 수 있다. 결합 친화도는 해리 속도 상수 (k_d, 시간^-1)를 결합 속도 상수 (k_a, 시간^-1 M^- ¹)로 나눈 것을 나타내는 평형 해리 상수 (K_D)를 측정함에 의해 정량화될 수 있다. K_D는 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR) 방법, 예를 들어 Biacore™ 시스템; KinExA^®와 같은 동역학 배제 검정; 및 BioLayer 간섭계 (예를 들어, ForteBio^® Octet 플랫폼 사용)을 사용하여 복합체 형성 및 해리의 동역학 측정에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 사용된, "결합 친화도"는 항체 (또는 이의 항원-결합 부분)와 항원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 것과 같은 형식적 결합 친화도뿐만 아니라 강렬한 결합을 반영할 수 있는 K_D 값이 계산되는 겉보기 친화도를 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "교차-반응"은 항체가 그에 대해 생성되는 항원 이외의 항원에 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 교차-반응성은 항체가 그에 대해 생성되는 항원이 아닌 다른 종의 항원에 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 비-제한적인 예로서, 인간 TREM2 펩티드에 대해 생성된 본 명세서에 기재된 항-TREM2 항체는 상이한 종 (예를 들어, 원숭이 또는 마우스)으로부터의 TREM2 펩티드 또는 단백질과 교차-반응성을 나타낼 수 있다.

핵산 또는 단백질 (예를 들어, 항체)과 관련하여 사용된, 용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질에 천연 상태에서 결합되는 다른 세포의 구성성분이 본질적으로 없음을 나타낸다. 순도 및 균질성은 전형적으로 전기영동 (예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피)와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 단리된 핵산 또는 단백질 (예를 들어, 항체)은 적어도 85% 순수, 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 또는 적어도 99% 순수하다.

용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전적 코드에 의해 인코딩된 아미노산뿐만 아니라 나중에 변형되는 그 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 자연 발생 α-아미노산은 비제한적으로 알라닌 (Ala), 시스테인 (Cys), 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu), 페닐알라닌 (Phe), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 아르기닌 (Arg), 라이신 (Lys), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 아스파라긴 (Asn), 프롤린 (Pro), 글루타민 (Gln), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 발린 (Val), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr), 및 이들의 조합을 포함한다. 자연 발생 α-아미노산의 입체 이성질체는 비제한적으로 D-알라닌 (D-Ala), D-시스테인 (D-Cys), D-아스파르트산 (D-Asp), D-글루탐산 (D-Glu), D-페닐알라닌 (D-Phe), D-히스티딘 (D-His), D-이소류신 (D-Ile), D-아르기닌 (D-Arg), D-라이신 (D-Lys), D-류신 (D-Leu), D-메티오닌 (D-Met), D-아스파라긴 (D-Asn), D-프롤린 (D-Pro), D-글루타민 (D-Gln), D-세린 (D-Ser) , D-트레오닌 (D-Thr), D-발린 (D-Val), D-트립토판 (D-Trp), D-티로신 (D-Tyr), 및 이들의 조합을 포함한다. "아미노산 유사체"는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 다른 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 지칭한다. 아미노산은 일반적으로 알려진 세 글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 한-글자 기호에 의해 본 명세서에서 지칭될 수 있다.

용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 단일 사슬 내의 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 아미노산 중합체는 전적으로 L-아미노산, 전적으로 D-아미노산, 또는 L 및 D 아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "단백질"은 폴리펩티드 또는 단일 사슬 폴리펩티드의 이량체 (즉, 2개) 또는 다량체 (즉, 3개 이상)를 지칭한다. 단백질의 단일 사슬 폴리펩티드는 공유 결합, 예를 들어 디설파이드 결합, 또는 비-공유 상호작용에 의해 연결될 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 상호교환가능하게 임의의 길이의 뉴클레오티드의 사슬을 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 사슬 내로 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 이의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 폴리뉴클레오티드의 예는 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 DNA와 RNA의 혼합물을 갖는 하이브리드 분자를 포함한다.

용어 "보존적 치환" 및 "보존적 돌연변이"는 유사한 특징을 갖는 것으로 분류될 수 있는 다른 아미노산으로 아미노산의 치환을 초래하는 변경을 지칭한다. 이 방식에서 정의된 보존적 아미노산 기의 범주의 예는 Glu (글루탐산 또는 E), Asp (아스파르트산 또는 D), Asn (아스파라긴 또는 N), Gln (글루타민 또는 Q), Lys (라이신 또는 K), Arg (아르기닌 또는 R) 및 His (히스티딘 또는 H)을 포함하는 "하전된/극성 기"; Phe (페닐알라닌 또는 F), Tyr (티로신 또는 Y), Trp (트립토판 또는 W) 및 (히스티딘 또는 H)를 포함하는 "방향족 기"; 및 Gly (글리신 또는 G), Ala (알라닌 또는 A), Val (발린 또는 V), Leu (류신 또는 L), Ile (이소류신 또는 I), Met (메티오닌 또는 M), Ser (세린 또는 S), Thr (트레오닌 또는 T) 및 Cys (시스테인 또는 C)을 포함하는 "지방족 기"를 포함할 수 있다. 각 그룹 내에서 하위 그룹도 동정될 수 있다. 예를 들어, 하전된 또는 극성 아미노산의 그룹은 Lys, Arg 및 His를 포함하는 "양으로-하전된 하위-그룹"; Glu 및 Asp를 포함하는 "음으로-하전된 하위-그룹"; 및 Asn 및 Gln을 포함하는 "극성 하위-그룹"을 포함하는 하위-그룹으로 하위-분할될 수 있다. 또 다른 예에서, 방향족 또는 환형 기는 Pro, His 및 Trp를 포함하는 "질소 고리 하위-그룹"; 및 Phe 및 Tyr을 포함하는 "페닐 하위-그룹"을 포함하는 하위-그룹으로 하위-분할될 수 있다. 또 다른 추가 예에서, 지방족 기는 하위-그룹, 예를 들어 Val, Leu, Gly 및 Ala를 포함하는 "지방족 비-극성 하위-그룹"; 및 Met, Ser, Thr 및 Cys를 포함하는 "지방족 약간-극성 하위-그룹"으로 하위-분할될 수 있다. 보존적 돌연변이의 카테고리의 예는, 비제한적으로: 양전하가 유지될 수 있도록 Arg를 Lys로 또는 그 반대로 하는 것; 음전하가 유지될 수 있도록 Asp를 Glu로 또는 그 반대로 하는 것; 유리 -OH가 유지될 수 있도록 Thr을 Ser로 또는 그 반대로 하는 것; 유리 -NH₂가 유지될 수 있도록 Asn을 Gln으로 또는 그 반대로 하는 것과 같은 위의 하위-그룹 내 아미노산의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 소수성 아미노산은 소수성을 보존하기 위해, 예를 들어 활성 부위에서 자연 발생 소수성 아미노산으로 치환된다.

2개 이상의 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일하거나, 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 비교 윈도우, 또는 지정된 영역에 대해 최대 일치를 위해 비교되어 정렬될 때 특정 영역에 걸쳐 동일한, 예를 들어 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 또는 초과인, 특정된 백분율의 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.

폴리펩티드의 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 아미노산 서열이 후보 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 정렬은 당업자가 이용할 수 있는 다양한 방법, 예를 들어 시각적 정렬을 사용하거나 알려진 알고리즘을 사용하여 최대 정렬을 달성하는 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 프로그램에는 BLAST 프로그램, ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재) 또는 Megalign (DNASTAR)이 포함된다. 최대 정렬을 달성하기 위한 정렬에 이용되는 매개변수는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이 출원의 목적을 위한 폴리펩티드 서열의 서열 비교를 위해, 2개의 단백질 서열을 디폴트 매개변수와 정렬하기 위한 BLASTP 알고리즘 표준 단백질 BLAST가 사용된다.

본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된, 용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 (예를 들어, 랫트, 마우스 및 기니피그), 토끼, 소, 돼지, 말 및 기타 포유류 종을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물을 지칭한다. 일 실시형태에서, 대상체, 개체 또는 환자는 인간이다.

용어 "치료하는", "치료" 등은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 본 명세서에 사용된다. "치료하는" 또는 "치료"는 신경퇴행성 질환 (예를 들어, 알츠하이머병 또는 본 명세서에 기재된 다른 신경퇴행성 질환)의 치료 또는 개선에서 성공의 임의의 지표를 지칭할 수 있으며, 여기에는 경감, 관해, 환자 생존의 개선, 생존 시간 또는 비율의 증가, 증상의 감소 또는 환자가 질병을 더 견딜 수 있게 하는 것, 퇴행 또는 쇠퇴의 속도를 늦추는 것, 또는 환자의 신체적 또는 정신적 웰빙을 개선하는 것과 같은 임의의 객관적 또는 주관적 매개변수가 포함된다. 증상의 치료 또는 개선은 객관적이거나 주관적인 매개변수를 기반으로 할 수 있다. 치료의 효과는 치료를 받지 않은 개체 또는 개체의 집단, 또는 치료 이전 또는 치료 도중 다른 시간에 동일한 환자에 비교될 수 있다.

용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는, 이에 제한되지 않지만, 완충제, 담체 또는 보존제와 같은 인간 또는 동물에서 사용하기 위해 생물학적으로 또는 약리학적으로 양립가능한 비-활성 약학적 성분을 지칭한다.

본 명세서에 사용된, 제제 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체)의 "치료량" 또는 "치료적으로 유효한 양"은 대상체에서 질환의 증상의 중증도를 치료, 경감, 완화 또는 감소시키는 제제의 양이다. 제제 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체)의 "치료량"은 환자 생존을 개선하고, 생존 시간 또는 비율을 증가시키고, 증상을 감소시키고, 손상, 질환 또는 병태 (예를 들어, 신경퇴행성 질환)를 더 견딜 수 있게 하고, 퇴행 또는 쇠퇴의 속도를 늦추고, 또는 환자의 신체적 또는 정신적 웰빙을 향상시킬 수 있다.

용어 "투여하다"는 원하는 생물학적 작용부위에 제제, 화합물 또는 조성물을 전달하는 방법을 지칭한다. 이들 방법은 국소 전달, 비경구 전달, 정맥내 전달, 피내 전달, 근육내 전달, 척추강내 전달, 결장 전달, 직장 전달 또는 복강내 전달을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체는 정맥내로 투여된다.

용어 "대조군" 또는 "대조군 값"은 참조 값 또는 기준 값을 지칭한다. 적절한 대조군은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에, 대조군 값은 동일한 대상체 또는 실험 내의 기준선에 비해 결정될 수 있으며, 예를 들어 항-TREM2 항체로 치료하기 이전에 취한 sTREM2의 측정은 동일한 대상체에서 sTREM2 수준의 치료-후 측정을 위한 대조군 값일 수 있다. 다른 예에서, 대조군 값은 대조군 대상체 (예를 들어, 건강한 대조군 또는 질환 대조군) 또는 대조군 대상체의 모집단 (예를 들어, 건강한 대조군 또는 질환 대조군, 예를 들어 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 대조군 대상체 또는 그 초과의 모집단)에서 평균 값에 비해 결정될 수 있으며, 예를 들어 기준선에서 또는 치료 후 대상체의 sTREM2 수준의 측정은 건강한 대조군 값에 비교될 수 있다.

III. 항-TREM2 항체

일 양태에서, TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 다른 TREM-유사 수용체 (예를 들어, TREM1)보다 TREM2에 대해 선택적이다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR), 중쇄 가변 영역, 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 CDR, 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 기능적 특징, 예를 들어 TREM2 활성을 향상시키는 (예를 들어, 식세포작용을 향상시키거나 골수 세포, 소교세포 또는 대식세포와 같은 세포의 이동, 분화, 기능 또는 생존을 향상시키는) 항체 또는 sTREM2의 수준을 감소시키는 항체를 추가로 포함한다.

항- TREM2 항체 서열

일부 실시형태에서, 항-TREM2 또는 이의 항원-결합 단편은 본 명세서에 기재된 다음 항-TREM2 항체 중 임의의 것으로부터 유래된 중쇄 서열, 또는 이의 일부, 및/또는 경쇄 서열, 또는 이의 일부를 포함한다: 클론 CL0020306, 클론 CL0020188, 클론 CL0020307, 및 클론 CL0020123. 이들 클론의 CDR, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 비공식 서열 목록에 제시되어 있다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 인간화된 및/또는 친화도 성숙된 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함한다:

(a) 서열번호: 4, 12, 및 29 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나 서열번호: 4, 12, 및 29 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1 (CDR-H1) 서열;

(b) 서열번호: 5, 13, 25, 30, 39, 41, 및 43 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나 서열번호: 5, 13, 25, 30, 39, 41, 및 43 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR2 (CDR-H2) 서열;

(c) 서열번호: 6, 14, 17, 및 31 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나 서열번호: 6, 14, 17, 및 31 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR3 (CDR-H3) 서열;

(d) 서열번호: 7, 23, 및 32 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나 서열번호: 7, 23, 및 32 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1 (CDR-L1) 서열;

(e) 서열번호: 8 및 33 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나 서열번호: 8 및 33 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR2 (CDR-L2) 서열; 및

(f) 서열번호: 9, 18, 및 34 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나 서열번호: 9, 18, 및 34 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR3 (CDR-L3) 서열.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 (a)-(f) 중 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 (a)의 CDR-H1, (b)의 CDR-H2, 및 (c)의 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 (d)의 CDR-L1, (e)의 CDR-L2, 및 (f)의 CDR-L3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 최대 2개 아미노산 치환을 갖는 CDR은 참조 서열에 대해 1개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 최대 2개 아미노산 치환을 갖는 CDR은 참조 서열에 대해 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 최대 2개 아미노산 치환은 보존적 치환이다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 (a)-(f) 중 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 (a)의 CDR-H1, (b)의 CDR-H2, 및 (c)의 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 (d)의 CDR-L1, (e)의 CDR-L2, 및 (f)의 CDR-L3을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 하기를 포함한다:

(j) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 및 79 중 임의의 하나에 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2는 서열번호: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 및 79 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36, 및 68 중 임의의 하나에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36 및 68 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46 및 79 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36, 및 68 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2는 서열 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 및 79 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 28, 36, 및 68 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 하기를 포함한다:

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 개시된 공통 서열에 의해 포괄되는 하나 이상의 서열을 포함한다. 비-제한적 예로서, 공통 서열은 동일한 (또는 유사한) 생식계열로부터 유래된 항체에 대한 중쇄 또는 경쇄 서열 (예를 들어, CDR)을 정렬함에 의해 동정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공통 서열은 동일한 (또는 유사한) 길이의 서열을 함유하고/하거나 적어도 하나의 고도로 유사한 CDR (예를 들어, 고도로 유사한 CDR3)을 갖는 항체로부터 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 항체에서 이러한 서열은 정렬되고 비교되어 보존된 아미노산 또는 모티프 (즉, 서열에서 변경이 단백질 기능을 변경할 수 있는 경우) 및/또는 변이가 서열에 발생하는 영역 (즉, 서열의 변이가 단백질 기능에 유의하게 영향을 미치지 않을 가능성이 있는 경우)을 동정할 수 있다. 대안적으로, 공통 서열은 보존된 아미노산 또는 모티프 (즉, 서열에서 변경이 단백질 기능 변경할 수 있는 경우) 및 변이가 서열의 정렬에서 발생하는 영역 (즉, 서열의 변이가 단백질 기능에 유의하게 영향을 미치지 않을 가능성이 있는 경우)을 결정하기 위해 동일하거나 유사한 (예를 들어, 중복되는) 에피토프에 결합하는 항체에 대한 중쇄 또는 경쇄 서열 (예를 들어, CDR)을 정렬함에 의해 동정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체와 동일하거나 유사한 에피토프를 인식하는 항체에 대해 하나 이상의 공통 서열이 동정될 수 있다. 예시적인 공통 서열은 서열번호: 47-52를 포함한다. 서열번호: 47-52의 공통 서열에서, 대문자는 정렬된 서열 (예를 들어, 정렬된 CDR 서열) 중에서 절대적으로 보존되는 아미노산 잔기를 나타내고, 반면에 "X" 또는 그리스 문자 (예를 들어, "α", "β", "γ", "δ", "ε" 또는 "φ")는 정렬된 서열 중에서 절대적으로 보존되지 않는 아미노산 잔기를 나타낸다. "X" 또는 그리스 문자로 표시된 위치에 삽입할 아미노산을 선택할 때, 일부 실시형태에서 아미노산은 정렬된 서열에서 상응하는 위치에서 발견되는 이들 아미노산으로부터 선택된다는 것이 이해될 것이다.

클론 CL0020123 및 CL0020123의 변이체

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:

(a) GFSIEDFYIH (서열번호: 29)의 서열을 포함하는 CDR-H1 서열;

(c) HADHGNYGSTMDY (서열번호: 31)의 서열을 포함하는 CDR-H3 서열;

(d) HASQHINVWLS (서열번호: 32)의 서열을 포함하는 CDR-L1 서열;

(e) KASNLHT (서열번호: 33)의 서열을 포함하는 CDR-L2 서열; 및

(f) QQGQTYPRT (서열번호: 34)의 서열을 포함하는 CDR-L3 서열.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 30, 39, 41 및 43으로부터 선택되는 CDR-H2 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 및 46 중 임의의 하나에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 및 46 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 28 및 36 중 임의의 하나에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 28 및 36 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 27에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 28에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 27에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 28에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 29, 30, 및 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 27에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 32, 33, 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 28에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, 각각 서열번호: 29, 30, 31, 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 42에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 42에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95% 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 29, 43, 및 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 42에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, 각각 서열번호: 29, 43, 31, 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 45에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95% 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95% 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 45에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95% 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 29, 41 및 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3을 포함하고, 서열번호: 45에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 32, 33, 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, 각각 서열번호: 29, 41, 31, 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.

클론 CL0020188, CL0020306, CL0020307, 및 CL0020188의 변이체

(e) WMSTRAS (서열번호: 8)의 서열을 포함하는 CDR-L2 서열; 및

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 4 및 12로부터 선택된 CDR-H1 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 5, 13 및 25로부터 선택된 CDR-H2 서열을 포함한다: 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 6, 14, 및 17로부터 선택되는 CDR-H3 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 7 및 23으로부터 선택되는 CDR-L1 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 9 및 18로부터 선택되는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 및 79 중 임의의 하나에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 및 79 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 및 68 중 임의의 하나에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 및 68 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

클론 CL0020188 및 CL0020188의 변이체

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 15에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 16에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 15에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 16에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 4, 5 및 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3을 포함하고, 서열번호: 15에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 7, 8, 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 16에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, 각각 서열번호: 5, 17, 7, 8, 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 79에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 79에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 4, 5 및 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 79에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 23, 8, 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, 각각 서열번호: 4, 5, 17, 23, 8 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 4, 25 및 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3을 포함하고, 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 23, 8, 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, 각각 서열번호: 4, 25, 17, 23, 8 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 68에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 68에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 4, 25 및 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3을 포함하고, 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 7, 8 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 68에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, 각각 서열번호: 4, 25, 17, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.

클론 CL0020306

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 2에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 3에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 2에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 3에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3을 포함하고, 서열번호: 2에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 7, 8 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 3에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, 각각 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.

클론 CL0020307

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 10에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 11에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 10에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 12, 13 및 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3을 포함하고, 서열번호: 10에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 각각 서열번호: 7, 8 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1-3을 포함하고 서열번호: 11에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, 각각 서열번호: 12, 13, 14, 7, 8 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.

항- TREM2 항체의 결합 특성

일부 실시형태에서, TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체는 세포 (예를 들어, TREM2를 내인성으로 발현하는 1차 세포 또는 세포주, 예컨대, 예를 들어, 아래의 실시예 섹션에 기술된 바와 같이 TREM2를 발현하도록 조작된 인간 대식세포, 또는 1차 세포 또는 세포주) 상에서 발현되는 TREM2에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 그의 일부의 정제된 또는 재조합 TREM2 단백질, 또는 TREM2 또는 그의 일부를 포함하는 키메라 단백질 (예를 들어, TREM2를 포함하는 Fc-융합 단백질 또는 TREM2의 엑토-도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질)에 결합한다.

일부 실시형태에서, 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 종의 하나 이상의 다른 TREM2 단백질과 교차-반응성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 사이노몰구스 원숭이 ("사이노") TREM2 단백질과 교차-반응성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 마우스 TREM2 단백질과 교차-반응성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 인간 TREM2, 사이노 TREM2, 및 마우스 TREM2와 교차-반응성을 나타낸다.

결합 친화도, 결합 동역학 및 교차-반응성을 분석하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법은 고상 결합 검정 (예를 들어, ELISA 검정), 면역침강, 표면 플라스몬 공명 (예를 들어, Biacore™ (GE Healthcare, 뉴저지주 피스캐타웨이 소재)), 동역학 배제 검정 (예를 들어, KinExA^®), 유세포분석, 형광-활성화 세포 분류 (FACS), BioLayer 간섭계 (예를 들어, Octet™ (Fort

Bio, Inc., 캘리포니아주 멘로 파크 소재)) 및 웨스턴 블롯 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, ELISA를 사용하여 결합 친화도 및/또는 교차-반응성을 결정한다. ELISA 검정을 수행하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 또한 하기 실시예 섹션에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 결합 친화도, 결합 동역학 및/또는 교차-반응성을 결정한다. 일부 실시형태에서, 동역학 배제 검정을 사용하여 결합 친화도, 결합 동역학 및/또는 교차-반응성을 결정한다. 일부 실시형태에서, BioLayer 간섭계 검정을 사용하여 결합 친화도, 결합 동역학 및/또는 교차-반응성을 결정한다.

항- TREM2 항체에 의해 인식되는 에피토프

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 본 명세서에 기재된 항체 클론에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 동일한 인간 TREM2의 에피토프를 인식한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 클론에 의해 인식되는 에피토프와 관련하여 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 항-TREM2 항체가 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 클론에 의해 인식된 에피토프에, 동등하거나, 그 안에 있거나, 이에 거의 동등한 (예를 들어, 이에 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 치환을 갖거나), 또는 이와 실질적 중첩 (예를 들어, 이와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중첩)을 갖는 에피토프를 인식한다는 것을 의미한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 클론 CL0020306, 클론 CL0020188, 클론 CL0020307 및 클론 CL0020123으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 클론에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 동일한 인간 TREM2의 에피토프를 인식한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 TREM2의 줄기 영역 내의 에피토프에서 인간 TREM2에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 1의 잔기 129-172 또는 잔기 131-169를 포함하거나, 그 내부에 있거나, 이로 구성된 인간 TREM2의 에피토프를 인식한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 1의 잔기 129-148을 포함하거나, 그 내부에 있거나, 이로 구성된 인간 TREM2의 에피토프를 인식한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 서열번호: 1의 아미노산 잔기 143-149를 포함하거나, 그 내부에 있거나, 이로 구성된 인간 TREM2의 에피토프를 인식한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 (예를 들어, Syk와 같은 키나제의 인산화를 유도함에 의해) TREM2/DAP12 시그널링을 활성화하고 TREM2의 줄기 영역 내의 에피토프에서 인간 TREM2에 결합하는 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 TREM2의 줄기 영역 내의 에피토프에서 인간 TREM2에 결합하고 프로테아제 (예를 들어, ADAM17)에 의한 TREM2의 절단을 억제한다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 TREM2의 Ig 가변 (IgV) 도메인 내의 에피토프에서 인간 TREM2에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 (예를 들어, Syk와 같은 키나제의 인산화를 유도함에 의해) TREM2/DAP12 시그널링을 활성화하고 TREM2의 IgV 도메인 내의 에피토프에서 인간 TREM2에 결합하는 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 하기 중 하나 이상을 포함하거나 이로 구성된 에피토프에서 인간 TREM2에 결합한다: (i) 서열번호: 1의 아미노산 잔기 55-63 (GEKGPCQRV (서열번호: 70)), (ii) 서열번호: 1의 아미노산 96-107 (TLRNLQPHDAGL (서열번호: 71)), 및 (iii) 서열번호: 1의 아미노산 잔기 126-129 (VEVL (서열번호: 72)).

항- TREM2 항체의 기능적 특징

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체 (예를 들어, 개시된 바와 같은 하나 이상의 CDR, 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체)는 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 TREM2 활성에서 기능한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 항-TREM2 항체는 sTREM2 단백질의 수준 (예를 들어, 세포 표면에서 세포외 샘플로 발산되는 sTREM2의 수준)을 조절하고, TREM2/DAP12 시그널링 복합체 (예를 들어, Syk 키나제)와 상호작용하는 키나제의 모집 또는 인산화를 조절하고, 및/또는 식세포작용, 세포 성장, 세포 생존, 세포 분화, 사이토카인 분비 또는 세포 이동과 같은, 시그널링 복합체의 하나 이상의 활성 다운스트림을 조절하는 항체이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체는 참조 항체와 비교하여 더 양호한 효능으로 건강한 인간 CSF 또는 사이노몰구스 CSF에서 가용성 TREM2 단백질 (sTREM2)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 참조 항체는 서열번호: 73 및 74; 서열번호: 75 및 76; 및 서열번호: 77 및 78로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 조합에 의해 표시된다. 일부 실시형태에서, 효능 검정은 실질적으로 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행된다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 리간드에 의해 유도되는 하나 이상의 TREM2 활성 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 리간드는 지질 리간드이다. TREM2 지질 리간드의 예는 1-팔미토일-2-(5'-옥소-발레로일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POVPC), 2-아라키도노일글리세롤 (2-AG), 7-케토콜레스테롤 (7-KC), 24(S)하이드록시콜레스테롤 (24OHC), 25(S)하이드록시콜레스테롤 (25OHC), 27-하이드록시콜레스테롤 (27OHC), 아실 카르니틴 (AC), 알킬아실글리세로포스포콜린 (PAF), α-갈락토실세라마이드 (KRN7000), 비스(모노아실글리세로)포스페이트 (BMP), 카디오리핀 (CL), 세라마이드, 세라마이드-1-포스페이트 (C1P), 콜레스테롤 에스테르 (CE), 콜레스테롤 포스페이트 (CP), 디아실글리세롤 34:1 (DG 34:1), 디아실글리세롤 38:4 (DG 38:4), 디아실글리세롤 피로포스페이트 (DGPP), 디히르도세라마이드 (DhCer), 디하이드로스핑고미엘린 (DhSM), 에테르 포스파티딜콜린 (PCe), 유리 콜레스테롤 (FC), 갈락토실세라마이드 (GalCer), 갈락토실스핑고신 (GalSo), 강글리오사이드 GM1, 강글리오사이드 GM3, 글루코실스핑고신 (GlcSo), 행크 균형염 용액 (HBSS), Kdo2-지질 A (KLA), 락토실세라마이드 (LacCer), 리소알킬아실글리세로포스포콜린 (LPAF), 리소포스파티딕 산 (LPA), 리소포스파티딜콜린 (LPC), 리소포스파티딜에탄올아민 (LPE), 리소포스파티딜글리세롤 (LPG), 리소포스파티딜이노시톨 (LPI), 리소스핑고미엘린 (LSM), 리소포스파티딜세린 (LPS), N-아실-포스파티딜에탄올아민 (NAPE), N-아실-세린 (NSer), 산화 포스파티딜콜린 (oxPC), 팔미트-산-9-하이드록시-스테아르-산 (PAHSA), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티딜에탄올 (PEtOH), 포스파티드산 (PA), 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜글리세롤 (PG), 포스파티딜이노시톨 (PI), 포스파티딜세린 (PS), 스핑가닌, 스핑가닌-1-포스페이트 (Sa1P), 스핑고미엘린 (SM), 스핑고신, 스핑고신-1-포스페이트 (So1P) 및 설파티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

sTREM2 발산의 조절

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 샘플에서 sTREM2 단백질의 수준, 예를 들어, 세포 표면에서 세포외 샘플 안으로 발산되는 sTREM2의 수준을 변경한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 sTREM2의 수준을 감소시킨다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 처리된 샘플에서 sTREM2의 양이 대조군 값과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과로 감소되는 경우 sTREM2의 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 처리된 샘플에서 sTREM2의 양이 대조군 값과 비교하여 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배 또는 그 초과로 감소되는 경우 sTREM2의 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 대조군 값은 미처리된 샘플 (예를 들어, 항-TREM2 항체로 처리되지 않은 TREM2-발현 세포로부터의 상등액, 또는 항-TREM2 항체로 처리되지 않은 대상체로부터의 샘플) 또는 적절한 비-TREM2-결합 항체로 처리된 샘플에서 sTREM2의 양이다.

일부 실시형태에서, sTREM2 발산은 유체, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변 또는 뇌척수액을 포함하는 샘플을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 뇌척수액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 세포 배양물로부터의 상등액 (예를 들어, 인간 대식세포와 같은 TREM2를 내인성으로 발현하는 1차 세포 또는 세포주, 또는 예를 들어, 아래의 실시예 섹션에 기술된 바와 같은 TREM2를 발현하도록 조작된 1차 세포 또는 세포주로부터의 상등액)을 포함한다.

일부 실시형태에서, 샘플에서 sTREM2의 수준은 면역검정을 사용하여 측정된다. 면역검정은 당업계에 공지되어 있고, 효소 면역검정 (EIA) 예컨대 효소 증식 면역검정 (EMIA), 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 미세입자 효소 면역검정 (MEIA), 면역조직화학 (IHC), 면역세포화학, 모세관 전기영동 면역검정 (CEIA), 방사선면역검정 (RIA), 면역형광, 화학발광 면역검정 (CL) 및 전기화학발광 면역검정 (ECL)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, sTREM2 수준은 ELISA 검정을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, sTREM2 수준은 하기 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 ELISA 검정을 사용하여 측정된다.

키나제 모집 또는 인산화의 조절

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 TREM2/DAP12 시그널링 복합체 (예컨대, 비제한적으로 Syk, ZAP70, PI3K, Erk, AKT, 또는 GSK3b)와 상호작용하는 키나제의 인산화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 천연 TREM2 리간드의 결합을 차단하지 않으면서 TREM2/DAP12 시그널링 복합체와 상호작용하는 키나제의 인산화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 TREM2 리간드 (예를 들어, 지질 리간드)에 의해 유도되는 TREM2/DAP12 시그널링 복합체와 상호작용하는 키나제의 인산화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 항-TREM2 항체로 처리된 샘플에서 Syk 인산화의 수준이 대조군 값과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과로 증가되면 Syk의 인산화를 유도하거나 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 항-TREM2 항체로 처리된 샘플에서 Syk 인산화의 수준이 대조군 값과 비교하여 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배 또는 그 초과로 증가되면 Syk의 인산화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 값은 비처리된 샘플 (예를 들어, 항-TREM2 항체로 처리되지 않은 TREM2-발현 세포를 포함하는 샘플, 또는 항-TREM2 항체로 처리되지 않은 대상체로부터의 샘플), 또는 TREM2 리간드로 처리되었지만 항-TREM2 항체로 처리되지 않은 샘플, 또는 적절한 비-TREM2-결합 항체로 처리된 샘플에서 Syk 인산화의 수준이다.

샘플에서 인산화 (예를 들어, Syk 인산화)를 검출 및/또는 정량화하기 위해, 일부 실시형태에서 면역검정이 사용된다. 일부 실시형태에서, 면역검정은 효소 면역검정 (EIA), 효소 증식 면역검정 (EMIA), 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 미세입자 효소 면역검정 (MEIA), 면역조직화학 (IHC), 면역세포화학, 모세관 전기영동 면역검정 (CEIA), 방사선면역검정 (RIA), 면역형광, 화학발광 면역검정 (CL) 및 전기화학발광 면역검정 (ECL)이다. 일부 실시형태에서, 인산화는 증폭된 발광 근접 균질 검정 (AlphaLISA®, PerkinElmer Inc.)을 이용하는 면역검정을 사용하여 검출 및/또는 정량화된다.

일부 실시형태에서, 인산화는 하나 이상의 세포, 예를 들어, 하나 이상의 TREM2-발현 세포 (예를 들어, TREM2를 내인성으로 발현하는 1차 세포 또는 세포주, 예컨대 인간 대식세포 또는 iPSC-유도된 소교세포, 또는 예를 들어 하기 실시예 섹션에 기재된 바와 같은, TREM2를 발현하도록 조작된 1차 세포 또는 세포주)를 포함하는 샘플을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 유체, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변 또는 뇌척수액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 조직 (예를 들어, 폐, 뇌, 신장, 비장, 신경 조직, 또는 골격근) 또는 이러한 조직으로부터의 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 대상체로부터) 내인성 유체, 조직 또는 세포를 포함한다.

식세포작용의 조절

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 죽은 세포 파편, 조직 파편, 아밀로이드 베타 입자 또는 이물질의 식세포작용을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 천연 TREM2 리간드의 결합을 차단하지 않으면서 식세포작용을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 TREM2 리간드 (예를 들어, 지질 리간드)에 의해 유도되는 식세포작용을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 항-TREM2 항체로 처리된 샘플에서 식세포작용의 수준이 대조군 값과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과로 증가되면 식세포작용을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 항-TREM2 항체로 처리된 샘플에서 식세포작용의 수준이 대조군 값과 비교하여 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배 또는 그 초과로 증가되면 식세포작용을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 대조군 값은 처리되지 않은 샘플, TREM2 리간드로 처리되었지만 항-TREM2 항체로 처리되지 않은 샘플, 또는 적절한 비-TREM2-결합 항체로 처리된 샘플에서 식세포작용의 수준이다.

일부 실시형태에서, 식세포작용은 표지된 기질을 사용한 식세포작용 검정을 사용하여 측정된다. 식세포작용 검정은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 식세포작용 검정은 인간 대식세포 또는 소교세포와 같이 TREM2를 내인성으로 발현하는 세포를 포함하는 샘플에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 식세포작용 검정은 TREM2를 발현하도록 조작된 세포를 포함하는 샘플에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 식세포작용은 하기 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 인간 대식세포 식세포작용 검정을 사용하여 측정된다.

세포 분화, 기능, 이동 및 생존의 조절

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 세포 이동, 세포 생존, 세포 기능 또는 세포 분화 (예를 들어, iPSC-유래 소교세포 및 질환-연관된 소교세포를 포함하는, 골수 세포, 대식세포, 및 소교세포의 경우)를 향상시킨다. 질환-연관된 소교세포 및 질환-연관된 소교세포를 검출하는 방법은 Keren-Shaul 등, Cell, 2017, 169:1276-1290에 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 하나 이상의 세포 유형 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포 또는 소교세포)의 세포 이동을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 하나 이상의 세포 유형 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포 또는 소교세포)의 세포 생존을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 하나 이상의 세포 유형 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포 또는 소교세포)의 세포 기능을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 하나 이상의 세포 유형 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포 또는 소교세포)의 세포 분화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 골수 세포의 이동, 생존, 기능 및/또는 분화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 대식세포의 이동, 생존, 기능 및/또는 분화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 소교세포의 이동, 생존, 기능 및/또는 분화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 소교세포 활성화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 질환-연관된 소교세포의 이동, 생존, 기능 및/또는 분화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 천연 TREM2 리간드의 결합을 차단하지 않으면서 세포 이동, 세포 생존, 세포 기능 또는 세포 분화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 TREM2 리간드 (예를 들어, 지질 리간드)에 의해 유도되는 세포 이동, 세포 생존, 세포 기능, 또는 세포 분화를 향상시킨다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 항-TREM2 항체로 처리된 샘플에서의 활성 (예를 들어, 이동, 생존, 기능 또는 분화)의 수준이 대조군 값과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과로 증가되면 세포 이동, 세포 생존, 세포 기능 또는 세포 분화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 항-TREM2 항체로 처리된 샘플에서 활성 (예를 들어, 이동, 생존, 기능 또는 분화)의 수준이 대조군 값과 비교하여 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배 또는 그 초과로 증가되면 세포 이동, 세포 생존, 세포 기능 또는 세포 분화를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 대조군 값은 미처리 샘플 (예를 들어, 항-TREM2 항체로 처리되지 않은 샘플), TREM2 리간드로 처리되었지만 항-TREM2 항체로 처리되지 않은 샘플, 또는 적절한 비-TREM2-결합 항체로 처리된 샘플에서 활성 (예를 들어, 이동, 생존, 기능 또는 분화)의 수준이다.

일부 실시형태에서, 세포 이동은 화학주성 검정을 사용하여 측정된다. 화학주성 검정은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 세포 이동 검정 (예를 들어, 화학주성 검정)은 인간 대식세포와 같이 TREM2를 내인성으로 발현하는 세포를 포함하는 샘플에 대해 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포 이동 검정 (예를 들어, 화학주성 검정)은 TREM2를 발현하도록 조작된 세포를 포함하는 샘플에 대해 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포 이동은 하기 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 인간 대식세포 화학주성 검정을 사용하여 측정된다.

일부 실시형태에서, 세포 생존은 세포 생존력 검정을 사용하여 측정된다. 세포 생존력 검정은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 세포 생존 검정 (예를 들어, 세포 생존력 검정)은 인간 대식세포와 같이 TREM2를 내인성으로 발현하는 세포를 포함하는 샘플에 대해 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포 생존 검정 (예를 들어, 세포 생존력 검정)은 TREM2를 발현하도록 조작된 세포를 포함하는 샘플에 대해 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포 생존은 하기 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 인간 대식세포 생존력 검정을 사용하여 측정된다.

일부 실시형태에서, 세포 기능은 그 세포에 적합한 기능의 검정을 사용하여 측정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대식세포 세포 기능은, 예를 들어, 하기 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 식세포작용 검정을 사용하여 평가된다.

일부 실시형태에서, 세포 분화는 분화하는 TREM2를 내인성으로 발현하는 세포의 능력을 평가함에 의해 측정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포 분화는, 예를 들어, 하기 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 단핵구로부터 분화하는 대식세포의 능력을 평가함에 의해 측정된다.

일부 실시형태에서, 소교세포의 활성화는 생체내에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 소교세포 활성화는 TSPO-PET 영상화를 사용하여 측정된다. TSPO-PET 영상화 방법은 당업계에 공지되어 있다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 신경염증을 증가시키지 않으면서 소교세포 기능을 향상시킨다. 신경염증의 수준은 사이토카인 (예를 들어, 염증성 사이토카인), 예컨대 비제한적으로, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-1ra, TGFβ, IL-15 또는 IFN-γ의 수준을 측정함에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 수준은 면역검정, 예를 들어 효소 면역검정 (EIA), 효소 증식 면역검정 (EMIA), 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 미세입자 효소 면역검정 (MEIA), 면역조직화학 (IHC), 면역세포화학, 모세관 전기영동 면역검정 (CEIA), 방사선면역검정 (RIA), 면역형광, 화학발광 면역검정 (CL) 또는 전기화학발광 면역검정 (ECL)을 사용하여 측정된다.

IV. 항체의 제조

일부 실시형태에서, 항체는 항체 반응의 유도를 위한 항원 또는 항원의 혼합물로 동물 또는 동물들 (예를 들어, 마우스, 토끼 또는 랫트)을 면역화함에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 항원 또는 항원의 혼합물은 아쥬반트 (예를 들어, 프로인트 아쥬반트)와 접합되어 투여된다. 초기 면역화 후, 항체 생산을 개선하기 위해 항원 또는 항원들의 1회 이상의 후속 부스터 주입이 투여될 수 있다. 면역화에 이어서, 항원-특이적 B 세포는 예를 들어, 비장 및/또는 림프 조직으로부터 수확된다. 모노클로날 항체를 생성하기 위해, B 세포는 골수종 세포와 융합되고, 이는 후속적으로 항원 특이성에 대해 스크리닝된다. 항체를 제조하는 방법은 또한 하기 실시예 섹션에 기재되어 있다.

관심 있는 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자는 세포로부터 클로닝될 수 있고, 예를 들어 모노클로날 항체를 인코딩하는 유전자는 하이브리도마로부터 클로닝되어 재조합 모노클로날 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자 라이브러리는 또한 하이브리도마 또는 혈장 세포로부터 제조될 수 있다. 대안적으로, 파지 또는 효모 디스플레이 기술을 사용하여 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 Fab 단편을 동정할 수 있다. 항체는 또한 이중특이성으로 만들어질 수 있고, 즉 2개의 상이한 항원을 인식할 수 있다. 항체는 또한 이종접합체, 예를 들어 2개의 공유적으로 결합된 항체 또는 면역독소일 수 있다.

항체는 원핵생물 및 진핵생물 발현 시스템을 포함하는 임의의 수의 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 발현 시스템은 하이브리도마와 같은 포유동물 세포 발현, 또는 CHO 세포 발현 시스템이다. 그러한 많은 시스템은 상업적 공급업체로부터 널리 이용 가능하다. 항체가 V_H 및 V_L 영역을 둘 모두 포함하는 실시형태에서, V_H 및 V_L 영역은 단일 벡터를 사용하여, 예를 들어, 디-시스트론 발현 단위에서, 또는 상이한 프로모터의 제어하에서 발현될 수 있다. 다른 실시형태에서, V_H 및 V_L 영역은 별도의 벡터를 사용하여 발현될 수 있다. 본 명세서에 기재된 V_H 또는 V_L영역은 N-말단에 메티오닌을 선택적으로 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 항체는 키메라 항체이다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 마우스와 같은 한 종으로부터 항원 결합 영역 (중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역)이 인간과 같은 다른 종의 효과기 영역 (불변 도메인)에 융합되어 만들어질 수 있다. 다른 예로서, 항체의 효과기 영역이 상이한 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스의 효과기 영역으로 치환된 "클래스 스윗칭된" 키메라 항체가 만들어질 수 있다.

일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 일반적으로 비-인간 항체는 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 인간화된 항체는 전형적으로 비-인간인 (예를 들어, 마우스 가변 영역 서열로부터 유래된) 하나 이상의 가변 영역 (예를 들어, CDR) 또는 이의 부분, 및 가능하게는 비-인간인 일부 프레임워크 영역 또는 이의 부분을 포함하고, 추가로 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이식유전자 마우스, 또는 다른 유기체 예컨대 다른 포유동물을 사용하여 인간화된 또는 인간 항체를 발현할 수 있다. 항체를 인간화하는 다른 방법은, 예를 들어, 가변 도메인 재표면화, CDR 이식, 이식 특이성-결정 잔기 (SDR), 유도된 선택 및 프레임워크 셔플링을 포함한다.

인간화에 대한 대안으로서, 완전한 인간 항체가 생성될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 면역화시 내인성 면역글로불린 생성의 부재에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 이식유전자 동물 (예를 들어, 마우스)이 생성될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식-계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래한다는 것이 기술되어 있다. 이러한 생식-계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 공격시 인간 항체의 생산을 초래할 것이다. 다른 예로서, 인간 항체는 인간 모노클로날 항체를 생성하는 세포주를 생성하기 위해 1차 인간 B 세포를 사용하는 것과 같은 하이브리도마-기반 방법에 의해 생성될 수 있다.

인간 항체는 또한 파지 디스플레이 또는 효모 디스플레이 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이에서 가변 중쇄 및 가변 경쇄 유전자의 레퍼토리가 증폭되고 파지 디스플레이 벡터에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리는 인간 공급원으로부터 증폭된 천연 레퍼토리이다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리는 중쇄 및 경쇄 서열을 클로닝하고 재조합하여 상이한 항원 특이성을 갖는 큰 집단의 항체를 생성함에 의해 제조된 합성 라이브러리이다. 파지는 전형적으로 항체 단편 (예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 단편)을 디스플레이한 다음 관심 있는 항원에 대한 결합에 대해 스크리닝된다.

일부 실시형태에서, 항체 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, V_H, 또는 V_HH)이 생성된다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화를 통해 유래되었다. 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포를 사용하여 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. 콜리 세포로부터 직접적으로 회수되고 화학적으로 결합되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다. 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양에서 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 생체내 연장된 반감기를 제공하기 위해 다른 분자, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG화) 또는 혈청 알부민에 접합된다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체가 제공된다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 일부 실시형태에서, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)는 TREM2에 대한 결합 특이성을 갖고 적어도 하나의 다른 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)는 2개의 상이한 TREM2 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)는 세포 표면에서 TREM2 클러스터링을 유도할 수 있다. 공초점 FRET 현미경을 사용하여 수용체 클러스터링을 측정하는 예시적인 방법은 Wallrabe 등, Biophys . J., 2003, 85:559-571에 기재되어 있다. 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)를 만드는 방법은 숙주 세포에서 두 쌍의 중쇄 및 경쇄의 재조합 공-발현, "노브-인투-홀 (knobs-into-holes)" 조작, 분자내 삼량체화, 및 다른 항체의 N-말단 또는 C-말단, 예를 들어, 탠덤 가변 도메인에 대한 항체 단편의 융합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

V. 핵산, 벡터 및 숙주 세포

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체는 재조합 방법을 사용하여 제조된다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 항-TREM2 항체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 CDR, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역); 이러한 핵산을 포함하는 벡터; 및 항체-인코딩 핵산을 복제하고/하거나 항체를 발현하는 데 사용되는 핵산이 그 안으로 도입된 숙주 세포를 제공한다.

일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드)는 (예를 들어, "항-TREM2 항체 서열"이라는 제목의 상기 섹션에 기재된 바와 같은) 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기 비공식 서열 목록에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열 (예를 들어, CDR, 중쇄 또는 경쇄 서열)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기 비공식 서열 목록에 개시된 서열 (예를 들어, CDR, 중쇄 또는 경쇄 서열)에 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 이종 핵산, 예를 들어, 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

본 개시내용의 항체 또는 그의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 다양할 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제 능력이 있고, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는 데 사용될 수 있다. 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, Bluescript (예를 들어, pBS SK+) 및 이의 유도체, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA 및 셔틀 벡터 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 기타 많은 클로닝 벡터는 BioRad, Strategene 및 Invitrogen과 같은 상용 공급업체로부터 이용가능하다.

발현 벡터는 일반적으로 본 개시내용의 핵산을 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 작제물이다. 발현 벡터는 에피솜 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 세포에서 복제할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스를 포함하는 바이러스 벡터, 및 임의의 다른 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 원핵세포이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 인간 세포, 예를 들어 인간 배아 신장 (HEK) 세포이다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 숙주 세포 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 발현하는 숙주 세포)를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 후속적으로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수된다.

VI. 항-TREM2 항체를 사용한 치료 방법

또 다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TREM2 항체 (예를 들어, 상기 섹션 III에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체)를 사용하는 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서) 하나 이상의 TREM2 활성을 조절하는 방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 원발성 연령-관련 타우병증, 진행성 핵상 마비 (PSP), 전두측두엽 치매, 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매, 은친화성 병변 치매, 근위축성 측삭 경화증, 괌의 근위축성 측삭경화증/파킨슨병-치매 복합체 (ALS-PDC), 피질기저변성, 만성 외상성 뇌병증, 크로이츠펠트-야콥병, 푸길리스티카 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경섬유 엉킴, 다운 증후군, 가족성 영국형 치매, 가족성 덴마크형 치매, 거스트만-스트로슬러 샤인커병, 구상교 타우병증, 치매를 동반한 과들로피안 파킨슨병, 과들로피안 PSP, 할레보르덴-스파츠병, 스페로이드를 동반한 유전성 미만성 백질뇌병증 (HDLS), 헌팅턴병, 봉입체 근염, 다계통 위축증, 근긴장성 이영양증, 나수-하콜라병, 신경원섬유 얽힘-우세 치매, 니만-피크병 유형 C, 창백-교-흑질 변성증, 파킨슨병, 픽병, 뇌염후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경교증, 아급성 경화성 범뇌염 및 엉킴 단독 치매로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병이다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 나수-하콜라병이다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 전측두엽 치매이다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 파킨슨병이다. 일부 실시형태에서, 방법은 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체 (또는 이의 항원-결합 부분 또는 약학적 조성물)는 TREM2의 돌연변이를 특징으로 하는 신경퇴행성 질환을 치료하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, TREM2의 돌연변이를 특징으로 하는 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 예를 들어, TREM2에서 R47H 돌연변이를 특징으로 하는 알츠하이머병이다.

일부 실시형태에서, 대상체 (예를 들어, 신경퇴행성 질환이 있는 대상체)에서 하나 이상의 TREM2 활성을 조절하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 sTREM2의 수준을 조절하는 단계; TREM2/DAP12 시그널링 복합체와 상호작용하는 키나제 (예를 들어, Syk 키나제)의 동원 또는 인산화를 조절하는 단계; 식세포작용 (예를 들어, 세포 파편, 아밀로이드 베타 입자 등의 식세포작용)을 조절하는 단계; 세포 이동 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포, 소교세포, 및 질병 연관 소교세포의 이동)을 조절하는 단계; 및/또는 세포 분화 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포, 소교세포, 및 질환 연관 소교세포의 경우)를 조절하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서 하나 이상의 TREM2 활성을 향상시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서 sTREM2의 수준을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 하나 이상의 TREM2 활성을 조절하는 방법은 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체, 또는 본 명세서에 기재된 항-TREM2 항체를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 치료되는 대상체는 인간, 예를 들어, 인간 성인 또는 인간 어린이이다.

일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서 플라크 축적을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 알츠하이머병을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 신경퇴행성 질환의 동물 모델 (예를 들어, 5XFAD 또는 APP/PS1 마우스 모델)이다. 일부 실시형태에서, 플라크 축적은, 예를 들어, 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캐닝을 사용하여 아밀로이드 플라크 영상화 및/또는 타우 영상화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체의 투여는 기준선 값 (예를 들어, 항-TREM2 항체의 투여 이전에 대상체에서 플라크 축적의 수준)과 비교하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%까지 플라크 축적을 감소시킨다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 치료 유효량 또는 용량으로 대상체에게 투여된다. 약 0.01mg/kg 내지 약 500mg/kg, 또는 약 0.1mg/kg 내지 약 200mg/kg, 또는 약 1mg/kg 내지 약 100mg/kg, 또는 약 10mg/kg 내지 약 50mg/kg의 1일 용량 범위가 사용될 수 있다. 그러나, 복용량은 선택된 투여의 경로, 조성물의 제형, 환자 반응, 병태의 중증도, 대상체의 체중 및 처방 의사의 판단을 포함하는 여러 요인에 따라 달라질 수 있다. 복용량은 개별 환자의 요구에 따라 시간이 지남에 따라 증가하거나 감소할 수 있다. 특정 경우에, 환자에게 초기에 낮은 용량이 제공되고, 그 다음 환자가 견딜 수 있는 효과적인 용량으로 증가된다. 유효량의 결정은 당업자의 능력 이내에 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체의 투여 경로는 경구, 복강내, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 척수강내, 흡입, 국소, 병변내, 직장, 기관지내, 비강, 경점막, 장, 안구 또는 귀 전달, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 경구로, 정맥내로 또는 복강내로 투여된다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체 (및 선택적으로 또 다른 치료제)는 연장된 기간, 예를 들어, 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350일 또는 그 초과에 걸쳐 대상체에게 투여된다.

VII. 약학적 조성물 및 키트

또 다른 양태에서, 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약학적 조성물 및 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물 및 키트는 신경퇴행성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물 및 키트는 하나 이상의 TREM2 활성, 예를 들어, Syk 인산화를 조절 (예를 들어, 향상 또는 억제)하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물 및 키트는 sTREM2 수준을 조절 (예를 들어, 감소)하는데 사용하기 위한 것이다.

약학적 조성물

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 상기 섹션 III에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체를 포함하고, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 생리학적으로 양립가능하고 활성제의 활성을 방해하지 않거나 달리 억제하지 않는 임의의 용매, 분산 매질 또는 코팅을 포함한다. 다양한 약학적으로 허용 가능한 부형제가 당업계에 잘 알려져 있다.

일부 실시형태에서, 담체는 정맥내, 근육내, 경구, 복강내, 경막내, 경피, 국소 또는 피하 투여에 적합하다. 약학적으로 허용 가능한 담체는, 예를 들어, 조성물을 안정화시키거나 활성제(들)의 흡수를 증가 또는 감소시키는 작용을 하는 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 화합물(들)을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용 가능한 화합물은, 예를 들어, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산 또는 글루타티온과 같은 항산화제, 킬레이트제, 저분자량 단백질, 활성제의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제 또는 기타 안정제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 기타 약학적으로 허용 가능한 담체 및 이의 제형은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 명세서에 기재된 약학적 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 당업자에게 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 하기 방법 및 부형제는 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 제한되지 않는다.

경구 투여를 위해, 항-TREM2 항체는 당업계에 널리 공지된 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합함에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 화합물이 치료되는 환자에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 에멀젼, 친유성 및 친수성 현탁액, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다. 경구용 약학적 제제는 화합물을 고체 부형제와 혼합하고, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함에 의해 수득될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당류와 같은 충전제; 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 셀룰로오스 제제를 포함한다. 원한다면, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 이들의 염과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.

항-TREM2 항체는 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사를 위해, 화합물 또는 화합물들은 이를 식물성 또는 기타 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세리드, 고급 지방족 산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜과 같은 수성 또는 비수성 용매에 용해, 현탁 또는 유화함에 의해; 그리고 원하는 경우, 가용화제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 통상적인 첨가제와 함께 제제로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화합물은 수용액, 예를 들어 행크스 용액, 링거 용액, 또는 생리 식염수 완충액과 같은 생리학적으로 양립가능한 완충액에서 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 방부제와 함께 단위 복용량 형태, 예를 들어 앰플 또는 다중-용량 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는, 예를 들어, 활성제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스에서 지속-방출, 제어 방출, 연장-방출, 제시간-방출 또는 지연-방출 제형으로 전달을 위해 제조된다. 다양한 유형의 지속-방출 물질이 확립되어 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다. 현행 연장-방출 제형은 필름-코팅된 정제, 다중미립자 또는 펠렛 시스템, 친수성 또는 친유성 물질을 사용하는 매트릭스 기술 및 기공-형성 부형제가 있는 왁스-기반 정제를 포함한다. 지속-방출 전달 시스템은 그 설계에 따라 몇 시간 또는 며칠의 경과에 걸쳐, 예를 들어 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24시간 또는 그 초과에 걸쳐 화합물을 방출할 수 있다. 일반적으로 지속 방출 제형은 자연적으로-발생하는 또는 합성 중합체, 예를 들어 폴리비닐 피롤리돈 (PVP)과 같은 중합체성 비닐 피롤리돈; 카르복시비닐 친수성 중합체; 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스와 같은 소수성 및/또는 친수성 하이드로콜로이드; 및 카르복시폴리메틸렌을 사용하여 제조될 수 있다.

전형적으로, 생체내 투여에 사용하기 위한 약학적 조성물은 멸균상태이다. 멸균은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 가열 멸균, 증기 멸균, 멸균 여과 또는 조사에 따라 달성될 수 있다.

개시내용의 약학적 조성물의 복용량 및 원하는 약물 농도는 구상되는 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 복용량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 적절한 복용량은 또한 상기 섹션 VI에 기술되어 있다.

키트

일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 상기 섹션 III에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 추가 치료제를 더 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM2 항체를 포함하고 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 알츠하이머병의 치료에 사용하기 위한 하나 이상의 추가 치료제를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 신경퇴행성 질환의 인지 또는 행동 증상을 치료하는데 사용하기 위한 제제 (예를 들어, 항우울제, 도파민 작용제, 또는 항정신병제)이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 신경보호제 (예를 들어, 카르비도파/레보도파, 항콜린제, 도파민제, 모노아민 옥시다제 B (MAO-B) 억제제, 카테콜-O-메틸 트랜스퍼라제 (COMT) 억제제, 글루탐산성 작용제, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제, 칸나비노이드, 카스파제 억제제, 멜라토닌, 항-염증제, 호르몬 (예를 들어, 에스트로겐 또는 프로게스테론), 또는 비타민)이다.

일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM 항체를 포함하고 sTREM2 수준을 측정하기 위한 하나 이상의 시약을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-TREM 항체를 포함하고 TREM2 활성을 측정하기 위한 (예를 들어, Syk 인산화를 측정하기 위한) 하나 이상의 시약을 더 포함한다.

일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 방법의 실시에 대한 설명 (즉, 프로토콜)을 함유하는 설명 자료 (예를 들어, 상기 섹션 VI에 기재된 바와 같은 치료 방법을 위한 키트를 사용하기 위한 설명)를 더 포함한다. 설명 자료는 전형적으로 서면 또는 인쇄된 자료를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 설명을 저장하고 이를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 개시내용에 의해 고려된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체 (예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예를 들어, CD-ROM) 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 그러한 매체는 그러한 설명 자료를 제공하는 인터넷 사이트에 대한 주소를 포함할 수 있다.

VIII. 실시예

본 발명은 구체적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 기술될 것이다. 하기 실시예는 단지 예시적 목적으로 제공되고 어떠한 방식으로도 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1. 항- TREM2 항체의 생성 및 초기 특성화

마우스 Fc 융합된 인간 TREM2 ECD의 재조합 발현 및 정제

인간 TREM2 (UniProtKB ID - Q9NZC2)의 엑토 도메인 (잔기 19-172)을 마우스 IgG 카파 사슬 V-III로부터의 분비 신호, N-말단 영역에서 아미노산 1-20 (UniProtKB ID - P01661), 및 TREM2 ECD와 Fc 사이에 GGGGS (서열번호: 64)가 있는 C-말단 영역에서 마우스 Fc 태그와 함께 pRK 벡터 안으로 서브클로닝했다.

정제된 플라스미드를 제조사의 설명에 따라 Expi293F™ 발현 시스템 키트를 사용하여 Expi293F™ 세포 (Thermo Fisher) 안으로 형질감염시켰다. N-연결된 글리칸의 성숙을 억제하고 글리코실화 이질성을 감소시키기 위해, 높은 만노시다제 I의 억제제인 키푸넨신 (Sigma)을 형질감염 직후 1μg/mL 농도로 배양액에 첨가하였다. 형질감염된 세포를 6% CO₂의 가습된 분위기에서 125rpm 및 37℃에서 궤도 진탕기 (Infors HT Multitron)에서 인큐베이션하였다. ExpiFectamine™ 293 Transfection Enhancer 1 및 2를 형질감염 16시간 후에 세포에 첨가하고 배지 상등액을 형질감염 96시간 후에 수확하였다. 정화된 상등액에 EDTA가 없는 프로테아제 억제제 (Roche)를 보충하고 -80℃에서 보관했다.

rhTREM2-Fc 분리를 위해, 정화된 배지 상등액을 HiTrap MabSelect SuRe Protein A 친화성 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences) 상에 장입하고 200mM 아르기닌 및 137mM 석시네이트 완충액 pH 5.0으로 세정했다. 융합 단백질을 100mM QB 시트레이트 완충액 pH 3.0 및 50mM NaCl에서 용리시켰다. 용리 직후, 1M Tris-HCl 완충액 pH 8.0을 단백질 용액에 첨가하여 pH를 중화시켰다. 단백질 응집체는 Superdex 200 증가 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences) 상에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분리되었다. SEC 이동상 완충액은 20mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM NaCl 및 50mM 아르기닌으로 유지되었으며, 이는 또한 단백질 저장 완충액이었다. 모든 크로마토그래피 단계는 AKTA 퓨어 또는 AKTA Avant 시스템 (GE Healthcare Life Sciences) 상에서 수행되었다.

His- 태그된 TREM2 ECD의 재조합 발현 및 정제

TREM2 (UniProtKB - Q9NZC2)의 엑토 도메인 (잔기 19-172)을 마우스 Ig 카파 사슬 V-III로부터의 분비 신호, N-말단 영역에서 아미노산 1-20 (UniProtKB ID - P01661), 및 C-말단 영역에서 6X-His 태그 (서열번호: 65)와 함께 pRK 벡터 안으로 서브클로닝했다. 인서트를 시퀀싱에 의해 확인하고 maxi prep 플라스미드 정제를 수행했다.

정제된 플라스미드를 제조사의 설명에 따라 Expi293F™ 발현 시스템 키트를 사용하여 Expi293F™ 세포 (Thermo Fisher) 안으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 6% CO₂의 가습된 분위기에서 125rpm 및 37℃에서 궤도 진탕기 (Infors HT Multitron)에서 인큐베이션하였다. ExpiFectamine™ 293 Transfection Enhancer 1 및 2를 형질감염 16시간 후에 세포에 첨가하고 배지 상등액을 형질감염 96시간 후에 수확하였다.

수확된 배지에 10mM의 최종 농도까지 1M 이미다졸 pH 8.0을 보충하고 0.4 마이크론의 기공 크기를 갖는 Nalgene™ Rapid-Flow™ 일회용 필터 단위 (Thermo Fisher)을 사용하여 여과했다. HisPur™ Ni-NTA 수지 (Thermo Fisher)를 MQ 물로 세정하고 장입 완충액 (20mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl 및 10mM 이미다졸)으로 평형화했다. 중력 흐름 방법을 사용하여 친화도 정제를 수행했다. 수확된 배지를 수지 상으로 장입하고 비특이적으로 결합된 단백질을 50mM 및 100mM 이미다졸이 보충된 장입 완충액으로 세정하였다. 결합된 His-태그된 TREM2 에코 도메인은 20mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl 및 200mM 이미다졸로 용리되었다. 용리된 단백질을 Amicon 10kDa 농축기를 사용하여 농축하고 농축된 단백질을 AKTA Avant 시스템 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용하는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 단백질을 1x PBS로 평형화된 HiLoad Superdex 200 16/600 (GE Healthcare Life Sciences) 컬럼 상에 장입하고 러닝 완충액으로서 1x PBS를 사용하여 용리하고 분획화했다. 용리된 분획은 변성 및 자연 조건하에서 폴리아크릴아미드 (PAGE) 겔 상에서 전기영동에 의해 분석되었다. 용리된 분획은 분석적 크기 배제 크로마토그래피 및 온전한 단백질 질량 측정에 의해 추가로 특성화되었다. PAGE로부터의 결과 및 분석적 특성화를 사용하여 심하게 글리코실화된 단백질 분획을 수집하고 이들을 분취하여 -80℃에서 보관했다.

항체의 생성

설치류 (마우스 및 랫트)를 표준 프로토콜을 사용하여 전장 Trem2 수용체를 발현하는 rhTREM2-Fc 면역원 또는 BWZ 세포로 면역화시켰다. 상이한 시점에서 수집된 혈청을 사용하여 면역화 전반에 걸쳐 역가를 측정하였다. 항원 특이적 면역 반응의 검출은 rhTREM2-Fc 면역원 및 전장 TREM2를 발현하는 살아있는 BWZ 세포로 유세포분석을 사용하여 수행하였다. 후보 항체의 선택 기준은 유세포분석에 의해 검출된 설치류 항체 생산 및 TREM2에 대한 결합 특이성을 포함했다. 항체-분비 세포는 비장, 림프절 및 골수를 포함한 동물 면역 조직으로부터 단리되었다.

분비된 항체의 결합 특성을 결정하기 위해 단일 세포 현탁액을 분석하였다. 항체-분비 세포를 미세유체 장치 안으로 장입하고 나노리터 부피 반응 챔버에서 단리하여 형광 및 명시야 이미지-기반 현미경 검정을 사용하여 분비된 항체의 검출을 가능하게 하였다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,188,593 참조). 항원-코팅된 마이크로비드에 결합하는 항체의 검출, 비드 상에 고정된 항체에 결합하는 가용성 형광-표지된 항원의 검출 및 세포 표면-발현된 항원에 결합하는 항체의 검출을 포함하는 결합 검정을 수행하였다. 세포 표면-발현된 항원은 재조합 형태와 세포의 표면 상에 존재하는 천연 형태의 항원 둘 모두를 포함했다.

이미지 분석을 사용하여 원하는 특성을 가진 항체를 생성하는 단일 세포의 존재를 표시하는 양성 형광 신호를 나타내는 챔버를 동정하고 챔버의 내용물을 회수하고 384 웰 플레이트에서 용해했다 (예를 들어, 미국 특허 번호 10,087,408 참조). 단일 세포 용해물을 그 다음 RT-PCR에 적용하여 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 증폭시켰다. 그 다음, 생성된 앰플리콘을 서열분석하여 선택된 단일 세포로부터 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 cDNA 서열을 결정하였다. 얻어진 서열을 수동으로 검사하고 분석하여 서열 다양성과 체세포 과돌연변이를 결정했다. 스크리닝 데이터 및 서열 다양성에 기초하여 발현을 위해 서열을 선택하였다. 발현된 항체를 시험하여 항원 결합 특이성을 확인하였다.

항- TREM2 항체의 1차 스크리닝

항체의 1차 스크리닝은 TREM2를 발현하는 HEK 293 세포, 야생형 iPSC 및 TREM2 녹아웃 iPSC에서 다음과 같이 수행하였다.

1. TREM2 -발현 HEK 세포에서 TREM2 결합에 대한 스크리닝

인간 TREM2/DAP12를 안정적으로 발현하는 HEK 293 세포주는 야생형 인간 TREM2와 DAP12, 및 DAP12 단독을 각각 발현하는 벡터로 세포를 형질감염시켜 생성하였다. 안정한 발현 클론을 선택하고, 세포 표면 TREM2 발현을 유세포분석에 의해 평가하였다. APC-접합된 랫트 항-인간/마우스-TREM2 모노클로날 항체 (R&D, 카탈로그 번호 MAB17291)를 사용하여 표면 TREM2 발현을 검출하였다. 가장 높은 야생형 TREM2 발현 수준을 나타내는 클론을 선택하여 "HEK293-H6"으로 명명했다. DAP12를 안정적으로 발현하는 클론을 웨스턴 블랏으로 분석하였고, 선택된 클론을 "HEK293-DAP12#1"로 명명하였다.

HEK 293 과발현 인간 TREM2 (HEK293-H6) 및 HEK 293 과발현 GFP (B5)를 0.05% 트립신에 의해 수확하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고 FACS 완충액 (PBS + 0.5% BSA)에서 2회 세정하였다. 혼합된 세포를 세포주당 10⁶/mL의 밀도로 인간 트러스테인 FcX 용액 (Biolegend, 카탈로그 번호 422302)과 함께 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 혼합된 세포주를 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 웰당 200,000개 세포로 시딩하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 세포를 원심분리하고 얼음 위에서 45분 동안 약 0 - 200nM 용량 적정의 항-TREM2 항체와 함께 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고 FACS 완충액으로 3회 세정하였다. 그런 다음 세포를 이차 항체 (Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-human IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch Laboratories, 카탈로그 번호 109-606-088, 1:800 희석)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 FACS 완충액으로 3회 세정하고, 100μL의 FACS 완충액에 재현탁하고, 유세포분석법 (BD FACSCanto II, 캘리포니아주 산호세 소재)으로 분석하여, 각 샘플에 대해 30,000개 이벤트를 얻었다. 세포당 평균 형광 강도를 FlowJo 소프트웨어로 계산하고 용량 반응 결합 곡선을 생성하는 데 사용했다.

도 1은 HEK293-H6 세포에서 세포 표면 수용체 TREM2에 결합하는 예시적인 항체에 대한 대표적인 결과를 예시한다.

TREM2 -의존성 pSyk 시그널링의 활성화의 평가

TREM2-의존성 pSyk 시그널링의 활성화는 Perkin-Elmer로부터의 상업용 AlphaLisa 검정을 사용하여 인간 대식세포 또는 HEK293-H6 세포에서 측정되었다.

70% DOPC 및 30% POPS를 함유하는 지질 소포의 사용을 포함하는 모든 실험에 대해, 지질 소포는 실험의 2주 이내에 다음과 같이 준비되었다: 7mg DOPC (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린) 및 3mg POPS (1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린)를 유리 바이알에서 클로로포름에서 조합하고 N₂ 가스의 흐름 하에서 1-2시간 동안 또는 완전히 건조될 때까지 건조시켰다. 지질 혼합물을 (약 10mg/mL의 최종 지질 농도를 위해) 1mL HBSS에 재현탁하고 2-3분 동안 와류시켰다. 이어서, 지질 현탁액을 하나의 100-nm 기공 크기 멤브레인으로 구성된 Avanti 미니-압출기를 사용하여 압출하여 10mg/mL에서 작은 단일막 소포를 형성하였다.

1. 세포 내 항체 투여

검정 전날, 인간 대식세포 또는 HEK293-H6 세포를 폴리-D-라이신이 코팅된 96-웰 플레이트 상에 각각 100,000개 세포/웰 또는 40,000개 세포/웰로 도말하였다. 항체를 300nM에서 시작하고 포인트 사이에 3-배 희석으로 10-포인트 일련의 희석 적정을 진행하여 PBS 안으로 희석했다. 길항제 용량-반응 곡선을 위해, 1mg/mL 최종 농도에서 70% DOPC 및 30% POPS를 함유하는 지질 소포가 또한 항체/PBS 혼합물에 포함되었다. 세포를 Biotek 405/406 플레이트 세정기를 사용하여 HBSS로 3회 세정한 후, 웰당 50μL의 항체/PBS (소포가 있거나 없음) 용액을 Hamilton Nimbus 액체 취급기를 사용하여 첨가했다. 세포 플레이트를 그 다음 5분 동안 37℃ 인큐베이터로 옮겼다. 리포솜/항체 용액을 플레이트를 가볍게 치면서 제거하고, 1μM PMSF를 함유하는 40μL 용해 완충액 (Cell Signaling Technologies, CST)을 액체 취급기를 사용하여 첨가했다. 그런 다음 용해물을 -80℃에서 동결하거나 AlphaLisa 검정에서 즉시 분석했다.

인간 대식세포를 다음과 같이 검정을 위해 준비하였다. 인간 단핵구는 신선한 혈액으로부터 RosetteSep 인간 단핵구 농후 칵테일 프로토콜 (Stemcell Technologies, REF#15068)에 따라 단리되었다. 단리된 단핵구를 세정 완충액 (PBS+2% FBS)에서 세정하고 10mL ACK 용해 완충액 (ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 A10492)에 재현탁하여 적혈구를 용해시켰다. 이십 (20) mL의 세정 완충액을 첨가하여 세포 용해를 중지하고 샘플을 원심분리하고 배양 배지 (RPMI, 10% 하이클론 FBS, 1% 나트륨 피루베이트, 1% 글루타맥스, 1% 비-필수 아미노산, 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)로 한번 더 세정했다. 그런 다음 인간 단핵구를 250-mL 플라스크에서 50ng/mL 인간 재조합 M-CSF (Gibco, 카탈로그 번호 PHC9501)의 존재에서 배양 배지에서 대식세포 안으로 분화시켰다. 신선한 인간 M-CSF를 3일차에 스파이킹하고 인간 대식세포를 이어서 5일차에 수확하여 검정에 사용했다.

2. AlphaLisa 검정

세포 용해물을 Perkin Elmer pSyk AlphaLisa 키트에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 pSyk에 대해 검정하였다. 간단히 말해서, 10μL의 용해물/웰을 흰색 불투명 384 웰 Optiplate (Perkin Elmer)로 옮겼다. 다음으로, 5μL의 억셉터 믹스 (억셉터 비드의 작업 용액을 함유함)를 웰당 첨가한 다음, 호일 씰로 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 5μL의 도너 믹스 (도너 비드의 작업 용액을 함유함)를 감소된 조명 조건에서 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 다시 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 마지막으로 Perkin Elmer EnVision 플레이트 판독기 상에서 AlphaLisa 설정을 사용하여 플레이트를 판독했다.

도 2는 1차 인간 대식세포에서 pSyk 신호 활성화에 대한 대표적인 항-TREM2 항체 용량 반응 곡선을 예시한다. 속이 찬 검은색 원 (●)은 항-TREM2 항체를 나타내고 열린 흰색 원 (○)은 이소타입 대조군을 나타낸다. 각 곡선은 3회 독립적인 실험의 평균을 나타내고 EC₅₀ 값은 아래 표 1에 제공된다. 결과는 항-TREM2 항체가 1차 인간 대식세포에서 TREM2-DAP12 ITAM 시그널링을 활성화할 수 있다는 것을 나타낸다.

iPSC 소교세포에서 리포솜 반응 검정

TREM2 작용제 항체 및 포스포티딜세린-함유 리포솜은 TREM2를 통해 pSyk를 활성화한다. 리포솜의 존재에서 Syk 시그널링에 대한 항-TREM2 항체의 효과를 이해하기 위해, iPSC 소교세포를 항-TREM2 항체로 사전-처리한 후, 세포에서 리포솜 반응을 평가하였다.

검정 이전에, iPSC는 먼저 상업적으로 이용 가능한 키트 (StemCell Technologies로부터의 STEMdiff Hematopoietic Kit)를 사용하여 조혈 전구 세포 (HPC)로 분화되었다. HPC를 1차 인간 성상세포를 함유하는 플레이트로 옮기고 14-21일 동안 공-배양했다. 공-배양에서 부유 세포가 성숙한 소교세포로 우세하게 동정되면 (>80%), 소교세포를 검정에 사용했다.

검정 2일 전에, 인간 iPSC 소교세포를 폴리-D-라이신으로 코팅된 96-웰 플레이트 상에 30,000개 세포/웰로 도말하였다. 항체를 IMDM, 10% 하이클론 FBS 및 1% Pen-strep을 함유하는 배지에 100nM로 희석하고, 세포에 24시간 또는 5분 동안 37℃에서 항체 용액을 투여하였다. 이어서, 세포를 HBSS로 1회 세정한 다음, 37℃에서 5분 동안 1mg/mL에서 70% DOPC 및 30% POPS를 함유하는 지질 소포를 투여하였다. 플레이트를 가볍게 치면서 리포좀 용액을 제거하고, 1μM PMSF를 함유하는 30μL 용해 완충액 (Cell Signaling Technologies, CST)을 첨가하였다. 그런 다음 용해물을 -80℃에서 동결하거나 AlphaLisa 검정에서 즉시 검정했다. 세포 용해물은 상기에 기술된 Perkin Elmer pSyk AlphaLisa 키트에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 pSyk에 대해 검정되었다.

도 3a 및 3b는 항-TREM2 항체와 함께 인큐베이션된 인간 iPSC 소교세포에서 pSyk 신호의 활성화에 이어 지질 소포를 투여하고 세포에서 리포솜 반응의 평가를 예시한다. 흰색 막대는 대조군으로 지질 소포 대신 PBS로의 인큐베이션을 나타낸다. 데이터는 2-7개의 독립적인 실험의 평균 및 표준 오차를 나타낸다. 도 3a는 5분 동안 항체로 사전-처리된 iPSC 소교세포에 대한 데이터를 예시하고, 도 3b는 24시간 동안 항체로 사전-처리된 iPSC 소교세포에 대한 데이터를 예시한다. 결과는 항-TREM2 항체로 인간 iPSC 소교세포의 사전-처리가 이소타입 대조군과 비교하여 리포솜에 의해 유발된 포스포-Syk 신호의 증가를 생성한다는 것을 나타내며, 이는 항-TREM2 항체가 세포에서 pSyk 시그널링의 지질 활성화를 방해하지 않고 대신 향상시킨다는 것을 나타낸다.

인간 TREM2 NFAT 리포터 검정

인간 TREM2/DAP12-발현 Jurkat NFAT 세포주를 다음과 같이 생성하였다. Jurkat NFAT 리포터 세포를 인간 TREM2 및 DAP12의 렌티바이러스 벡터 발현으로 감염시키고 10% 하이클론 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI에서 배양했다. 퓨로마이신 및 제오신의 존재에서 안정한 발현 클론을 선택하였다. 세포 표면 TREM2 발현은 바이오틴화된 항-TREM2 항체 (서열번호: 66 및 67)를 사용하여 유세포분석기에 의해 평가되었다. 가장 높은 야생형 TREM2 발현 수준을 예시한 클론을 선택하고 아래에 기술된 검정을 위해 hTrem2/NFAT Jurkat 리포터 세포로 명명했다.

검정 전날, 96-웰 플레이트를 0-500nM 용량 적정 (45μL/웰, 총 12 포인트)에서 항-TREM2 항체 또는 이소타입 대조군으로 사전-코팅하고 4C에서 밤새 인큐베이션했다. 밤새 인큐베이션 후, 사전-코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세정한 다음 200μL의 신선한 배양 배지 (10% 하이클론 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 RPMI)에 hTrem2/NFAT Jurkat 리포터 세포 (10⁶ 세포/웰)를 장입했다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 50μL/웰의 퀀트루시아 용액을 각 웰에 첨가하고 잘 혼합하였다. 분석을 위해, 각 웰에서 20μL의 용액을 제거하고 광도계 (Perkin Elmer Envision)에 의한 신호의 측정을 위해 384-웰 흰색 플레이트로 옮겼다.

도 4는 리포터 유전자 루시페라아제의 검출에 의해 측정된 NFAT의 활성화에 대한 대표적인 항-TREM2 항체 용량-반응 곡선을 포함하고, 활성화에 대한 EC₅₀ 값은 하기 표 1에 제공된다. 도 4에서 결과는 이소타입 대조군에 비해 후보 항-TREM2 항체가 NFAT 활성화 및 전사 반응을 활성화하기에 충분한 다운스트림 시그널링을 유도할 수 있었음을 예시한다.

인간 대식세포에서 생존 검정

인간 단핵구는 RosetteSep 인간 단핵구 농후 칵테일 프로토콜 (Stemcell Technologies, 카탈로그 번호 15068)에 따라 단리되었다. 단리된 단핵구를 세정 완충액 (PBS+2% FBS)에서 세정하고 10mL ACK 용해 용액 (ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 A10492)에 재현탁하여 적혈구를 용해시켰다. 이십 (20) mL의 세정 완충액을 첨가하여 용해를 중지시켰다. 세포 현탁액을 원심분리하고 배양 배지 (RPMI 1640 + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신)로 1회 세정하였다. 세포는 10⁶ 세포 μL/mL의 밀도로 배양 배지에 재현탁되었고 아래에 기술된 생존 검정에 사용되었다.

검정 전날, 96-웰 플레이트를 0-200nM 용량 적정 (45μL/웰, 총 12 포인트)에서 항-TREM2 항체 또는 이소타입 대조군으로 사전-코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 밤새 인큐베이션 후, 사전-코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세정한 다음 저농도 인간 M-CSF (5ng/mL, Gibco, 카탈로그 번호 PHC9501)의 존재에서 인간 단핵구 (10⁵ 세포/웰)를 장입했다. 37℃에서 5일 후, 배지를 흡인하고 100μL PBS + 100μL Celltiter-glo 배지 (Promega, 카탈로그 번호 G7571)를 각 웰에 첨가했다. 10분의 인큐베이션 후, 세포 배지를 발광계 사용에 적합한 멀티웰 플레이트로 옮기고, 세포 생존력에 대한 발광을 기록하였다.

도 5는 낮은 M-CSF 조건하에서 인간 대식세포에서 세포 생존의 대표적인 항-TREM2 항체 용량-반응 곡선을 예시하고, 생존에 대한 EC₅₀ 값은 하기 표 1에 제공된다. 결과는 TREM2 작용제 항체가 낮은 M-CSF 조건하에서 세포의 기능을 조절하고 인간 대식세포의 생존을 촉진하기 위한 전사 반응을 유도하기에 충분한 수용체 활성화 능력을 갖는다는 것을 나타낸다.

항체의 Biacore 동역학 측정

표면 플라즈몬 공명 (Biacore™ 8K 기기)을 사용하여 인간 및 사이노몰구스 TREM2 ECD에 대한 항-TREM2 항체 친화성을 측정하였다. 항-TREM2 항체는 Biacore 시리즈 S CM5 센서 칩 (GE Healthcare Life Sciences, 카탈로그 번호 29149604)에서 Human Fab 캡처 키트 (GE Healthcare Life Sciences, 카탈로그 번호 28958325)를 사용하여 캡처되었다. 재조합 인간 또는 사이노몰구스 TREM2의 일련의 3-배 희석을 30μL/분의 유속으로 주입했다. 항체 결합을 300초 동안 모니터링한 다음 HBS-EP+ 러닝 완충액 (GE Healthcare Life Sciences, 카탈로그 번호 BR100669)에서 600+ 초 동안 항체 해리를 모니터링했다. 결합 반응은 블랭크 플로우 셀에서 RU 값을 차감함에 의해 수정했다. k_on과 k_off의 동시 피팅의 1:1 Languir 모델이 동역학 분석에 사용되었다. K_D 결합 값은 하기 표 1에 제공된다.

표 1. 항체의 시험관내 특성

NB: 감지된 결합 없음

ND: 결정되지 않음

실시예 2. 인간 대식세포에서 가용성 TREM2 수준 및 식세포작용 거동의 조절

인간 대식세포에서 가용성 TREM2 용량 반응 검정

인간 대식세포를 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 검정 하루 전에 인간 대식세포를 폴리-D-라이신으로 코팅된 96 웰 플레이트 상에 100,000개 세포/웰로 도말하였다. 항체는 300nM에서 시작하고 포인트 사이에 3-배 희석으로 10-포인트 일련의 희석 적정을 진행하여 인간 대식세포 배지 (RPMI, 10% 하이클론 FBS, 1% 나트륨 피루베이트, 1% 글루타맥스, 1% 비-필수 아미노산 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)에서 희석되었다. 세포에 항체를 투여하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 항체와 함께 인큐베이션 후, 플레이트를 회전시켜 파편을 제거하고, 가용성 TREM2 측정을 위해 상등액을 수집했다.

가용성 TREM2는 다음과 같이 측정하였다. 간단히 말해서, MSD 작은 반점 스트렙타비딘 플레이트 (Meso Scale Discovery)를 4℃에서 밤새 비오틴화된 항-hTREM2 폴리클로날 항체 (R&D Systems)로 코팅했다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 1시간 동안 3% BSA/TBST로 차단하였다. 샘플 및 표준은 SDS-함유 완충액에서 5분 동안 95℃로 가열하여 제조했다. 준비된 샘플 및 표준은 블로킹 후 검정 플레이트에서 3% BSA/TBST에 1:10 희석했다. 3% BSA/TBST에 희석된 TREM2-His 단백질은 절대 정량화를 위한 표준으로 사용되었다. 실온에서 2시간 인큐베이션에 이어서, 플레이트를 TBST로 세정하였다. 1차 검출 항체인 설포-태그된 염소 항-인간 TREM2 (R&D Systems)를 3% BSA/TBST에 희석하고, 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. TBST로 세정한 후, 2x MSD 판독 완충액 T를 사용하여 MSD 플레이트를 전개한 후 MSD 섹터 플레이트 판독기를 사용하여 검출했다. MSD 값은 Prism 7.0 소프트웨어 (Graphpad)를 사용하여 표준 곡선을 피팅함에 의해 sTREM2의 절대량으로 변환되었다. TREM2 발산의 조절은 배지에 특이적인 항-TREM2 항체 없이 배양된 세포로부터 가용성 TREM2로 정규화된 시험 항-TREM2 항체와 함께 인큐베이션된 세포로부터의 가용성 TREM2의 비율로 제시되었다.

도 6은 항-TREM2 항체 농도의 함수로서 대표적인 가용성 TREM2 수준 (sTREM2)을 예시한다. 결과는 항-TREM2 항체가 밤새 처리 후 용량-의존적 방식으로 인간 대식세포에서 sTREM2 수준을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

인간 대식세포에서 식세포작용 검정

인간 대식세포를 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 검정 2일 전에, 인간 대식세포를 폴리-D-라이신으로 코팅된 96 웰 플레이트에 80,000개 세포/웰로 도말하였다. 항체를 RPMI, 10% 하이클론 FBS, 1% 나트륨 피루베이트, 1% 글루타맥스, 1% 비-필수 아미노산, 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 배지로 100nM에서 희석하였다. 그럼 다음 세포에 37℃에서 24시간 동안 항체 용액을 투여하였다. 세포핵과 세포막을 그 다음 10분간 염색한 후 pHrodo-미엘린을 5μg/mL로 첨가하였다. 그런 다음 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. pHrodo 형광은 하이 콘텐츠 공초점 현미경 (Opera Phoenix) 상에서 세포당 측정되었고 형광 강도는 기기 소프트웨어 상에서 정량화되었다.

pHrodo-미엘린은 Safaiyan 등 (2016, Nature Neuroscience 19 (8):995-998)에 기술된 방법을 사용하여 야생형 C57Bl/6 마우스 뇌로부터 미엘린을 정제함에 의해 제조되었다 (Jackson Laboratories). 정제에 이어서, 미엘린을 PBS에 재현탁하고 DC 단백질 검정 키트 2 (BioRad, 카탈로그 번호 5000112)를 사용하여 1mg/mL 단백질 농도로 조정했다. 미엘린은 제조업체 설명에 따라 마이크로스케일 라벨링 키트 (ThermoFisher, 카탈로그 번호 P35363)를 사용하여 pHrodo-red로 태그되었다. 10,000g에서 5분 동안 미엘린을 펠렛화하고 상등액을 제거하고 이들 단계를 3-5회 반복하여 과잉 라벨을 제거하였다.

도 7은 인간 대식세포에서 식세포작용 검정의 대표적인 결과를 예시한다. 미엘린 식세포작용은 TREM2-처리된 대식세포의 현미경 이미지에서 pHrodo 형광을 검출 및 정량화하고 측정된 값을 이소타입 대조군의 값과 비교함에 의해 측정되었다. 결과는 예시적인 TREM2 작용제 항체로 처리된 인간 대식세포가 이소타입 대조군에 비해 pHrodo-미엘린 식세포작용을 증가시킴을 보여주며, 이는 항-TREM2 항체가 세포에서 미엘린 파편의 유익한 소거를 가능하게 할 수 있음을 나타낸다.

실시예 3. iPSC 소교세포에서 지질 축적의 조절

지질 저장 검정

검정에 앞서, iPSC는 먼저 상업적으로 이용 가능한 키트 (StemCell Technologies로부터의 STEMdiff 조혈 키트)를 사용하여 조혈 전구 세포 (HPC)로 분화되었다. HPC를 1차 인간 성상세포를 함유하는 플레이트로 옮기고 14-21일 동안 공-배양했다. 공-배양에서 부유 세포가 성숙한 소교세포로 우세하게 동정되면 (>80%), 소교세포를 검정에 사용했다.

세포 (iPSC 소교세포, 30,000개 세포/웰)를 전체 혈청 배지에서 PDL-코팅된 96-웰 플레이트 상에 도말하였다. 37℃에서 24시간 후, Safaiyan 등 (2016, Nature Neuroscience 19(8):995-998)에 기술된 방법을 사용하여 야생형 C57Bl/6 마우스 뇌로부터 정제된, 정제된 미표지 미엘린 (최종 농도 50μg/mL (Jackson Laboratories)을 웰에 스파이킹했다. 37℃의 지질 처리에서 24시간 후, 항-TREM2 항체 또는 RSV 대조군을 100nM의 최종 농도로 웰에 스파이킹했다. 세포를 수집하거나 영상화하기 전에 세포를 37℃에서 48-72시간 더 인큐베이션했다. 미엘린 세정 실험을 위해, 미엘린은 24-시간 인큐베이션 기간 후에 제거되었고 후속 24-48시간의 인큐베이션 동안 항체-함유 배지로 대체되었다.

Nile Red 영상화를 위해, 상등액을 제거하고 세포를 1μM Nile Red (ThermoFisher, 카탈로그 번호 N1142) 및 1 방울/mL의 Nucblue (ThermoFisher, 카탈로그 번호 R37605)를 함유한 살아있는 세포 영상화 완충액 (Life Technologies, 카탈로그 번호 A14291DJ)에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 기간 후, 염색 용액을 제거하고 세포를 4% 파라포름알데히드에 고정하였다. 그런 다음 Opera Phoenix 하이 콘텐츠 공초점 이미저에서 Alexa 568 및 DAPI 조명 셋팅을 사용하여 세포를 이미지화했다. 기기와 함께 제공된 Harmony 소프트웨어의 스팟-찾기 알고리즘을 사용하여 지질 스팟을 분석했다. 도 8a는 24시간 동안 비히클 또는 미엘린 (최종 농도 50μg/mL)으로 처리된 후 72시간 동안 이소타입 대조군 또는 예시적인 항-TREM2 항체 (CL0020123)와 함께 인큐베이션된 iPSC 소교세포의 대표적인 현미경 이미지를 포함한다. 도 8b는 도 8a의 현미경 이미지에 사용된 동일한 항-TREM2 항체에 대한 대표적인 막대 차트이다. Nile Red 염색의 정량화는 세포당 총 스팟 강도에 의해 수행되었고, 데이터는 동일한 현미경 샘플의 상이한 필드에서 3가지 기술적 복제의 평균 및 표준 편차로 표시된다.

지질의 분석을 위해 세포를 얼음 위에 유지하면서 PBS로 한 번 세정했다. 1:100 내부 표준을 함유하는 9:1 메탄올:물 용액 70μL의 부피를 96-웰 플레이트에서의 세포에 첨가했다. 플레이트를 4℃ 및 1200rpm에서 20분 동안 진탕기에서 교반한 다음, 300 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 50μL의 상등액 샘플을 LCMS 바이알로 옮기고 기기에서 분석할 때까지 -80℃에서 유지했다.

지질 수준은 전자분무 질량 분석기 (QTRAP 6500+, Sciex, 미국 매사추세츠주 프레이밍햄 소재)와 결합된 액체 크로마토그래피 (Shimadzu Nexera X2 시스템, Shimadzu Scientific Instrument, 미국 미주리주 콜럼비아 소재)에 의해 분석되었다. 각 분석을 위해 55℃에서 0.25mL/분의 유속을 사용하여 5μL의 샘플을 BEH C18 1.7μm, 2.1×100mm 컬럼 (Waters Corporation, 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)에 주입했다. 양성 이온화 모드를 위해, 이동상 A는 10mM 포름산암모늄 + 0.1% 포름산을 갖는 60:40 아세토니트릴/물 (v/v)로 구성되었고; 이동상 B는 10mM 포름산암모늄 + 0.1% 포름산을 갖는 90:10 이소프로필 알코올/아세토니트릴 (v/v)로 구성되었다. 음성 이온화 모드를 위해, 이동상 A는 10mM 아세트산암모늄을 갖는 60:40 아세토니트릴/물 (v/v)로 구성되었고; 이동상 B는 10mM 아세트산암모늄을 갖는 90:10 이소프로필 알코올/아세토니트릴 (v/v)로 구성되었다. 기울기는 다음과 같이 프로그래밍되었다: 45% B에서 99% B로 0.0-8.0분, 99% B에서 8.0-9.0분, 45% B로 9.0-9.1분, 45% B에서 9.1-10.0분. 전자분무 이온화는 다음 설정을 적용하여 양성 또는 음성 이온 모드에서 수행되었다: 30에서 커튼 가스; 중앙으로 설정된 충돌 가스; 5500 (양성 모드) 또는 4500 (음성 모드)에서 이온 분무 전압; 250℃ (양성 모드) 또는 600℃ (음성 모드)에서의 온도; 50에서의 이온 소스 가스 1; 60에서의 이온 소스 가스 2. 데이터 수집은 다중 반응 모니터링 모드 (MRM)에서 Analyst 1.6.3 (Sciex)을 사용하여 다음 매개변수로 수행되었다: 체류 시간 (msec) 및 충돌 에너지 (CE); 80에서 디클러스터링 전위 (DP); 10 (양성 모드) 또는 -10 (음성 모드)에서의 진입 전위 (EP), 및 12.5 (양성 모드) 또는 -12.5 (음성 모드)에서의 충돌 세포 배출 전위 (CXP). 지질은 비-내인성 내부 표준의 혼합물을 사용하여 정량화했다. 지질은 상업적으로 이용 가능한 참조 표준 (Avanti Polar Lipids, 미국 앨라배마주 버밍햄 소재)의 체류 시간 및 MRM 특성을 기반으로 동정되었다.

도 8c 및 8d는 24-시간 미엘린 처리 후 72시간 동안 예시적인 항-TREM2 항체로 처리된 iPSC 소교세포의 세포 용해물에서 질량 분석에 의해 검출된 콜레스테롤 에스테르 (CE) (도 8c) 및 트리아실글리세리드 (TAG) 지질 종 (도 8d)의 수준을 예시한다. 도 8e 및 8f는 예시적인 항-TREM2 항체로 미엘린 세정 실험을 거친 iPSC 소교세포의 세포 용해물에서 질량 분석에 의해 검출된 콜레스테롤 에스테르 (CE) (도 8e) 및 트리아실글리세리드 (TAG) 지질 종 (도 8f)의 수준을 예시한다. 도 8c-8f에서 생성된 LC/MS 데이터는 CE 데이터에 대한 내부 표준으로 정규화되었고 TAG 데이터에 대한 각 개별 지질 종에 대한 미엘린 + 이소타입 대조군으로 정규화되었다.

iPSC 소교세포에서 지질 축적은 미엘린 처리에 의해 유도되며, 이는 중성 지질 염색 (Nile Red)에서의 증가 및 세포의 용해물에서 특정 지질 종의 검출을 위한 LC/MS에 의해 반영된다. 도 8a-8f에 예시된 데이터는 세포에서 중성 지질 염색에서의 감소 및 LC/MS에 의해 측정된 CE 및 TAG 지질 종 수준의 감소에 의해 나타난 바와 같이, 예시적인 항-TREM2 항체로 iPSC 소교세포 포스트-미엘린 챌린지의 처리가 지질 종의 축적을 감소시켰음을 집합적으로 나타낸다. 항체 처리의 결과로 지질 수준의 감소는 24시간 내지 72시간 범위의 상이한 시점에서 관찰되었다. 지질 수준에서의 감소가 지질 흡수의 차단에 의해 야기될 가능성을 제거하기 위해, 미엘린이 항-TREM2 항체 첨가 이전에 제거되는 미엘린 세정 실험이 수행되었다. 도 8f는 항-TREM2 항체가 또한 이소타입 대조군에 비해 항체 처리 이전에 미엘린 세정을 갖는 iPSC 소교세포에서 지질 수준을 감소시켰다는 것을 예시한다.

실시예 4. 항체의 기능적 에피토프 비닝 (Binning)

TREM2 항체 에피토프 빈은 TREM2 단백질에 대한 경쟁 결합에 의해 결정되었다. 에피토프 비닝 실험은 25℃에서 전통적인 샌드위치 에피토프 비닝 구성 방법을 사용하여 Carterra LSA 기기 상에서 수행되었다. 모든 시험 항체는 아민 커플링에 의해 HC30M 칩 상으로 고정되었다. 샌드위치 경쟁 결합의 다중 주기가 그 다음 시험 항체에 대해 수행되었다. 각 주기는 항원 (His-태그된 TREM2 ECD) 주입에 이어 고정된 항체에 대한 분석물 항체 주입으로 구성되었다. 각 주기가 말단에서, 고정된 항체의 표면은 1.25M NaCl을 함유하는 낮은 pH 버퍼 (pH = 3)를 주입함에 의해 재생되었다. 에피토프 결합 데이터는 경쟁 매트릭스 및 에피토프 빈을 생성하기 위해 Carterra 소프트웨어에 의해 평가되었다. 결과는 표 2에 제공된다.

2개의 작용제 빈이 항-TREM2 항체의 에피토프 비닝에 의해 동정되었다: (1) 줄기 결합 작용제, 및 (2) IgV 도메인 결합 작용제. 동일한 빈 내의 항체는 동일한 기능, 예를 들어, 지질 리간드에 의한 TREM2-DAP12 pSyk 활성화의 억제 (길항제 항체), 항체 단독으로 pSyk의 활성화 (줄기 결합 작용제, IgV 도메인 결합 작용제)를 입증했다.

표 2. 기능의 클래스에 의해 주석이 달린, 항- TREM2 항체 빈

실시예 5. TREM2 줄기 펩티드에 대한 항체 결합

TREM2 항체는 인간 및 마우스 TREM2 줄기 영역 펩티드에 대한 결합에 대해 평가되었다. 시험된 펩티드는: (1) 전장 줄기 영역 (인간 TREM2의 아미노산 129-172, UniProtKB Q9NZC2; 마우스 TREM2의 아미노산 131-169, UniProtKB Q99NH8) 및 (2) ADAM10/17 절단 부위를 함유하는 절단된 줄기 펩티드 (인간/마우스 TREM2의 아미노산 149-163)를 포함했다. TREM2 줄기 펩티드에 대한 항체 결합은 표준 샌드위치 ELISA를 사용하여 검출되었다. 간단히 말해서, 96-웰 절반-면적 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 스트렙타비딘으로 코팅했다. 다음날, 1% BSA/PBS에 희석된 비오틴화된 TREM2 줄기 펩티드를 플레이트에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1% BSA/PBS에 희석된 항체를 그 다음 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 펩티드에 결합된 항체는 1% BSA/PBS에 희석된 항-인간 카파-HRP 2차 항체 (Bethyl Laboratories, Inc.)로 검출되었다. 플레이트는 검출 시약 (One-step TMB Ultra, Thermo)과의 반응 및 표준 분광광도계 기기 (BioTek®)에 의한 450nm (A450)에서 흡광도의 측정에 의해 검정되었다. 결과는 하기 표 3에 제공된다. 데이터는 정규화된 값으로 표시된다 (배경 = 이소타입 대조군인 배경에 대한 배수).

표 3. TREM2 줄기 펩티드에 대한 항- TREM2 항체 결합

표 3은 표 2에서 에피토프 비닝 데이터를 뒷받침하는 인간 및 마우스 줄기 영역 펩티드-항체 결합 상호작용을 묘사한다. 표 3의 데이터에 기초하여, 특정 항-TREM2 항체가 결합하는 것으로 보이는 부위는 TREM2 세포외 줄기 영역에서 아미노산 129-148에 해당한다.

ADAM17에 의한 TREM2 줄기 펩티드 절단을 억제하는 항-TREM2 항체의 능력을 또한 형광 편광 검정을 사용하여 분석하였다. TREM2 줄기 펩티드를 먼저 스트렙타비딘과 함께 검정 완충액 (25mM Tris pH 7.5, 2.5μM ZnCl₂, 0.005% Brij-35)에 준비하였다. 그 다음 항-TREM2 항체를 실온에서 30분 동안 TREM2 줄기 펩티드와 함께 사전-인큐베이션하였다. 사전-인큐베이션 기간 후, ADAM17 (R&D 시스템, 카탈로그 번호 930-ADB)을 추가하고 펩티드와 함께 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다. 다음 날, 샘플을 검정 완충액에서 추가로 희석하고 흑색 불투명 384-웰 플레이트로 옮겼다. 형광 편광은 Perkin Elmer EnVision 플레이트 판독기에서 후속적으로 측정되었다. 항-TREM2 항체와 함께 사전-인큐베이션된 TREM2 줄기 펩티드의 형광 편광을 전장 TREM2 줄기 펩티드 및 효소 대조군 (ADAM17을 갖는 전장 TREM2 줄기 펩티드)의 형광 편광과 비교하였다.

TREM2 줄기-결합 항체는 형광 편광을 유의하게 증가시켜 ADAM17 (클론 CL0020141, CL0020188, CL0020313, CL0020308)에 의한 줄기 펩티드 절단의 부분적 억제를 입증하였다. IgV 결합 항체 CL0020107은 TREM2 줄기 영역 펩티드에 결합하지 않았고 따라서 형광 편광 검정에서 펩티드 절단에 대한 효과를 나타내지 않았다.

실시예 6. 항- TREM2 항체의 약동학적 분석

항-TREM2 항체의 약동학적 프로파일을 마우스에서 평가하였다. C57BL/6J 마우스는 7-일 약동학적 (PK) 연구 및 표적 계합 연구에 사용된 2개월령으로 Jackson Laboratory (재고 번호 000664)에서 구입했다. 인간 Trem2 cDNA KI 동형접합 마우스 (huTrem2 ^KI ^/ ^KI )를 3개월령에서 24-시간 표적 계합 연구에 사용했다. 인간 Trem2 cDNA KI 마우스의 생성 및 번식은 아래에 기술되어 있다.

인간 Trem2 cDNA KI 마우스 모델의 생성

인간 TREM2 cDNA KI 마우스 (huTrem2 ^KI ^/ ^KI )를 다음과 같이 생성하였다. 인간 Trem2 cDNA-pA 서열을 마우스 Trem2 내인성 ATG 시작 부위에 삽입하였다. 인간 Trem2 cDNA-pA의 삽입은 내인성 마우스 프로모터에 의해 구동되는 인간 Trem2 cDNA의 발현 및 내인성 마우스 Trem2의 발현의 중단을 허용하는 마우스 Trem2의 엑손1 서열의 대체를 초래하였다. huTrem2 ^KI ^/ ^KI 마우스는 상동 재조합을 사용하여 C57BL/6 유전적 배경에서 생성되었다.

huTrem2 ^KI ^/ ^KI 표적화 벡터의 경우, 긴 상동성 아암 (LA)은 인간 Trem2 cDNA-pA 서열의 5' 말단의 약 3.6kb 업스트림으로 확장하고 짧은 상동성 아암 (SA)은 FRT-측접된 네오 카세트로 3'의 약 2.3kb 다운스트림으로 확장한다. 긴 및 짧은 상동성 아암 둘 모두는 C57BL/6 BAC 클론 (RP23: 358G22)으로부터 증폭된 다음 암피실린 선택 카세트를 함유하는 ~2.4kb pSP72 (Promega) 골격 벡터 안으로 서브-클로닝되었다. hUBS-gb2 FRT-측접된 네오마이신 카세트를 즉시 hTrem2-pA 카세트의 다운스트림에 삽입하여, 약 13.6kb 크기의 표적화 벡터를 생성했다. 십 (10) μg의 표적화 벡터를 제한 효소 Not I (New England Biolabs)로 선형화한 다음 전기천공에 의해 FLP C57Bl/6 (B6) 배아 줄기 (ES) 세포 안으로 형질감염시켰다. G418 항생제로 선정 후, 생존 클론을 PCR 분석을 위해 확장하여 양성 재조합 ES 클론을 동정했다. PCR 스크리닝을 위한 프라이머 서열 (서열번호: 53 = 5'-AGG AAT GTG GGG AGC ACG GAG-3' 및 서열번호: 54 = 5'- TGC ATC GCA TTG TCT GAG TAG GTG-3')은 bghpA 요소로부터 3' 영역 외부의 짧은 상동성 아암 (SA)의 다운스트림까지 영역을 함유하는 2.81-kb 단편으로 증폭되었다. 5개의 클론이 양성으로 동정되었고 추가 확장을 위해 선정되었다. 네오 카세트는 ES 클론 확장 동안 Flp 이식유전자에 의해 제거되었다.

5개의 양성 클론으로부터 추출된 게놈 DNA를 먼저 서열화 분석에 의해 특성화하였다. 1.19-kb 산물을 증폭하고 프라이머 (서열번호 55 = 5'- ACC CTA GTC CTG ACT GTT GCT C-3'; 서열번호: 56 = 5'- TAT AGG AAC TTC GCG ACA CGG ACA C-3')에 의해 서열화하여 5' 게놈/네오 카세트 접합 및 3' KI 카세트 접합을 확인했다. 서열화 결과는 5개 클론 모두에 인간 Trem2 cDNA-pA 서열의 도입을 확인했다.

5개의 양성 클론은 짧은 아암 및 긴 아암에 대해 표적화된 프로브를 사용한 서던 블랏팅 분석에 의해 추가로 특성화되었다. Ssp I 및 Bam HI로 절단된 ES 세포 게놈 DNA를 각각 짧은 아암 및 긴 아암 프로브와 혼성화하였다. 5개의 모든 ES 클론은 긴 아암 및 짧은 아암 둘 모두에서 교정 상동성 재조합 이벤트를 수행하는 것으로 확인되었다. 짧은 아암 프로브 (658 bp)를 증폭하기 위한 프라이머 서열은 (서열번호: 57 = 5'- ACA GGA GGG ACC TAC CTT CAG 3'; 서열번호: 58 = 5'- GCC TGC CTT TCA GAG ACC TCA GTC -3)이다. 긴 아암 프로브 (681 bp)를 증폭하기 위한 프라이머 서열은 (서열번호: 59 = 5'- CCT CTC CGG CTG CTC ATC TTA CTC -3'; 서열번호: 60 = 5'- GTC TCT CAG CCC TGG CAG AGT TTG -3')이다.

그런 다음 5개의 모든 ES 세포 클론을 C57BL/6 배반포 안으로 주입했다. 일 클론으로부터의 새끼는 PCR 유전자형에 의한 생식선 전달로 확인되었다. 유전자형에 대한 프라이머는 (서열번호: 61 = pr1: 5'- CGC CTA CCC TAG TCC TGA CTG TTG -3', 서열번호: 62 = pr2: 5'- AAA GCC TAC AGC ATC CTC ACC TC -3'; 및 서열번호: 63 = pr3: 5'- GCA TCA TGG GGT TGT AGA TTC CG -3')이다. 야생형 상의 pr1/pr2에 대한 PCR 산물은 658bp이다. KI 대립유전자 상의 pr1/pr3에 대한 PCR 산물은 469bp이다.

항체 투여 및 혈장/ CSF 수집

PK 분석을 위해, C57BL/6J 마우스에 정맥내 (IV) 꼬리 정맥 주사를 통해 항-TREM2 항체 또는 대조군 IgG를 10mg/kg으로 투여하였다 (약 200μL/마우스의 투여 부피, 각 그룹에 대해 n = 3). 혈액 샘플은 투여 후 1시간, 24시간, 4일 및 7일에 수집되었다. 처음 세 시점에서 혈액 샘플은 3-mm 란셋 (GoldenRod 동물 란셋)을 사용하여 턱밑 출혈을 통해 수집했다. 7일차에서 마지막 혈액 샘플과 말기 혈액 샘플을 심장 천자를 통해 수집했다. 혈액을 EDTA 튜브 (Sarstedt Microvette 500 K3E, 카탈로그 번호 201341102)에 수집하고, 천천히 뒤집어 혼합하고, 4℃에서 원심분리했다. 플라즈마 (상부) 층을 1.5-mL Eppendorf 튜브로 옮기고 분석할 때까지 -80℃에서 보관했다.

24-시간 표적 계합 연구를 위해, C57BL/6J 마우스를 사용하여 마우스 대리 항-TREM2 항체를 시험하고, huTrem2 ^KI ^/ ^KI 마우스를 사용하여 인간 항-TREM2 항체를 시험하였다. 마우스에 정맥내 (IV) 꼬리 정맥 주사를 통해 100mg/kg에서 항-TREM2 항체 또는 대조군 IgG를 투여했다 (약 200μL/마우스의 투여 부피, 각 그룹에 대해 n = 5). TREM2의 기준선 수준을 결정하기 위해 혈액 샘플을 투여 24시간 전에 수집하였다. 말단 혈액 및 CSF 샘플을 투여 24시간 후에 수집하였다. 혈장 제제는 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. CSF 샘플의 수집을 위해, 두개골의 뒤쪽에 시상 절개를 하고 피하 조직과 근육을 분리하여 대수조를 노출시켰다. 미리 당겨진 유리 모세관을 사용하여 대수조에 구멍을 뚫고 CSF 샘플을 수집했다. 그런 다음 CSF를 4℃에서 원심분리하여 혈액 잔류물을 제거하고 CSF 상등액을 0.5-mL 저단백질 LoBind Eppendorf 튜브 (Eppendorf, 카탈로그 번호 022431064)로 옮겨 분석할 때까지 -80℃에서 보관했다.

생체내 항- TREM2 항체 혈장 수준의 분석

항-TREM2 항체 PK 분석을 위해, 마우스 혈장에서 총 항체 농도를 일반적인 인간 항-Fc 샌드위치 ELISA를 사용하여 정량화하였다. 384-웰 MaxiSorp 플레이트를 1μg/mL 항-huFc 당나귀 폴리클로날 (Jackson Immunoresearch)로 밤새 코팅했다. 검정 완충액 (PBST, 1% BSA)에서 1:2,000 또는 1:20,000으로 희석된 혈장과 함께 인큐베이션 후, HRP (Jackson Immunoresearch)에 접합된 항-huFc 당나귀 항체를 검출 시약으로 첨가하였다. 5-매개변수 로지스틱 회귀를 사용하여, 3-배 희석을 사용하여 2nM 내지 2.7pM의 각각의 개별 항체에 대한 표준 곡선을 생성했다.

도 9는 특정 항-TREM2 항체에 대한 대표적인 마우스 PK 프로파일을 예시한다. 항체 제거율 (CL [mL/day/kg])은 7-일 기간에 걸쳐 각각의 제시된 항체에 대해 제공되고 정상적인 이펙터가 없는 이소타입 대조군과 비교된다. 도 9에 예시된 각 항체는 이소타입 대조군과 비교하여 유사한 제거율을 나타내었다.

생체 내 표적 계합 : sTREM2 혈장 수준

가용성 TREM2 (sTREM2) 혈장 수준의 측정을 위해, 인간 TREM2 cDNA KI 마우스 (huTrem2 ^KI ^/ ^KI )를 채혈한 다음 100mg/kg의 시험 항-TREM2 항체 또는 이소타입 대조군으로 정맥내로 처리하였다. 마우스를 투여-후 24시간에 채혈하였다. 혈액 샘플에서 혈장을 얻고 다음과 같이 수행된 MSD 검정에서 평가했다. MSD SECTOR 플레이트를 PBS에 희석된 1μg/mL 포획 항체 (R+D 항-TREM2 항체, 카탈로그 번호 MAB17291-100)로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양했다. 샘플 웰을 희석되지 않은 MSD 차단제 A로 1시간 동안 차단했다. 혈장 샘플을 0.05% 트윈-20을 함유하는 트리스-완충 식염수 (TBST)에서 25% MSD 차단제 A에 1:20으로 희석하고 플레이트 상의 각 샘플 웰에 첨가했으며, 그 다음 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 검출 항체 (MSD 설포-태그된 염소 항-인간, 카탈로그 번호 R32AJ-1, 1:1000)를 후속적으로 각 샘플 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Biotek 플레이트 와셔를 갖는 각 샘플 웰에 대해 TBST 세정을 수행했다. 검출 시약 (MSD 판독 완충액)을 첨가하고 MSD Meso Sector S600 판독기를 사용하여 측정하여 항체에 대한 sTREM2 결합의 결과를 얻었다.

도 10a 및 10b는 예시적인 항-TREM2 항체에 대한 huTrem2 ^KI/KI 혈장 내 총 sTREM2 수준 (도 10a) 및 항체-결합 sTREM2 수준 (도 10b)을 예시한다. 데이터는 총 및 결합 sTREM2 검정에 대한 sTREM2의 투여-이전 기준선 수준으로 정규화되었다. 결과는 총 순환 sTREM2 수준이 항체로 24-시간 처리 후 이소타입 대조군과 비교하여 항-TREM2 항체로 처리된 마우스 간에 유의하게 변화하지 않았음을 나타내며, 이는 총 순환 sTREM2 수준이 초기 시점에서 사후-항체 용량에 영향을 받지 않음을 시사한다. 대조적으로, 항체-결합 sTREM2 수준은 아이소타입 대조군에 비해 항-TREM2 항체가 주입된 마우스에서 더 높았다.

실시예 7. 항- TREM2 항체의 서열 최적화 및 인간화

예시적인 항-TREM2 항체를 서열 최적화하고 인간화한 다음 결합 동역학 및 결합 특이성에 대한 특성화를 수행하였다.

서열 최적화는 화학적 변형에 민감한 잔기 (예를 들어, 아스파라긴 탈아미드화 모티프 (NG), 아스파르트산 이성질체화 모티프 (DS), 및 잠재적 산화 잔기 (트립토판 (W) 및 메티오닌 (M))에 대한 CDR 서열 내에서 검색 및 보존적 및 생식계열 잔기로 아미노산 치환을 하여 이러한 서열 경향성을 제거함에 의해 수행하였다. 항-TREM2 항체의 인간화된 및 서열-최적화된 변이체를 그 다음 Biacore를 사용하여 결합 동력학에 대해 분석하고 HEK293-H6 세포에 대한 세포 결합을 용량-적정하였다 (대표적인 프로토콜에 대해서는 실시예 1 참조).

항체 CL0020188의 인간화된 및 서열-최적화된 변이체의 결합 특성의 분석에 대한 결과는 표 4에 제공되어 있다. CL0020188 CDR-H2 서열 (서열번호: 5) 및 CDR-L1 서열 (서열번호: 7)에서 NG 모티프는 변형되고, 인간 프레임워크 영역 상으로 그라프팅되고 분석되었다. 표 4는 Biacore에 의해 측정된 K_D 값 및 HEK293-H6 세포에서 용량-적정된 결합 검정에 의해 측정된 EC₅₀ 값을 제공한다.

표 4. CL0020188의 서열-최적화 및 인간화된 변이체의 결합 특성

3m = V_H 내 A24G/L45P/V48L

표 4에 예시된 바와 같이, CL00201088의 인간화된 및 서열-최적화된 클론은 Biacore에 의해 측정된 바와 같이 모 항체 (K_D = 9.5 nM)와 비교하여 hTREM2에 대해 유사한 친화도 값을 나타냈다. 이것은 표 4에 예시된 HEK293-H6 세포의 세포-결합 결과와 일치했다. 모 항체 (EC₅₀ = 0.44 nM)와 비교하여, 인간화된 및 서열-최적화된 클론은 HEK293-H6 세포에서 발현된 TREM2에 대한 필적할만한 서브-나노몰의 친화도를 나타냈다. 종합하면, 결과는 모 항체와 인간화된 및 서열-최적화된 변이체 사이에 필적할만한 결합 동역학을 나타낸다.

항체 CL0020123의 인간화된 및 서열-최적화된 변이체의 결합 특성의 분석에 대한 결과가 표 5에 제공되어 있다. CL0020123 CDR-H2 서열 (서열번호: 30)에서 NG 및 DS 모티프는 변형되고, 인간 프레임워크 영역 상으로 그라프팅되고 분석되었다. 표 5는 Biacore에 의해 측정된 K_D 값 및 HEK293-H6 세포에서 용량-적정된 결합 검정에 의해 측정된 EC₅₀ 값을 제공한다.

표 5. CL0020123의 서열-최적화된 및 인간화된 변이체의 결합 특성

1m = V_H에서 R71A

2m = V_H에서 V67A/R71A

모 항체 (K_D = 0.10 nM)와 비교하여, 인간화된 및 서열-최적화된 클론은 Biacore에 의해 측정된 바와 같이 hTREM2에 대한 결합에 대해 약 4-배 더 높은 K_D 값을 나타내었다. 한편, HEK293-H6 세포에서 용량-적정된 세포-결합 검정에서 인간화된 및 서열-최적화된 클론은 TREM2에 대해 필적할만한 서브-나노몰의 친화도를 나타냈다.

실시예 8. 서열-최적화된, 인간화된 항- TREM2 항체의 시험관내 특성화

예시적인 서열-최적화된 및 인간화된 항-TREM2 항체 (실시예 7)를 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같은 시험관내 방법에 의해 평가하였다. 항체를 TREM2-발현 HEK 세포에서의 TREM2 결합, HEK-H6 세포에서 TREM2-의존성 pSyk 시그널링, 인간 대식세포의 생존을 촉진하는 능력, 및 iPSC 소교세포에서 지질 축적을 조절하는 능력에 대해 평가하였다. 도 11 내지 14는 대표적인 항-TREM2 항체에 대한 결과를 예시한다. 항-TREM2 항체는 TREM2-발현 HEK293-H6 세포를 사용한 검정에서 우수한 세포 결합을 나타냈다 (0.34 nM (도 11a) 및 0.08 nM (도 11b)의 EC50 값). 항-TREM2 항체는 또한 TREM2-발현 HEK293-H6 세포에서 pSyk 시그널링을 활성화시켰다 (도 12a 및 12b). 부가하여, 항-TREM2 항체는 CL0020188 변이체 항체에 대해 관찰된 더 양호한 생존 활성과 함께 대식세포 생존을 유도하였다 (도 13). 최종적으로 항-TREM2 항체는 미엘린-처리된 iPSC 소교세포에서 지질 축적을 감소시키는 능력을 입증하였다 (도 14a 및 14b).

실시예 9. 서열-최적화된, 인간화된 항- TREM2 항체의 마우스 PK

특정 서열-최적화된, 인간화된 항-TREM2 항체의 약동학적 프로파일 (실시예 7)을 실시예 6에 기재된 것과 유사한 7-일 약동학 (PK) 연구를 위해 야생형 마우스에서 평가하였다. 각 용량 그룹은 n=3 마우스를 함유했다. 표 6은 예시적인 서열-최적화된 및 인간화된 항-TREM2 항체의 PK 특성 (실시예 7)을 제공한다.

표 6. 항- TREM2 항체의 마우스 PK 특성

실시예 10. 서열-최적화된, 인간화된 항- TREM2 항체의 사이노 PK

항-TREM2 항체의 약동학적 프로파일을 나이브 사이노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 2-4연령의 나이브 사이노몰구스 원숭이 (체중 대략 2-3kg)에 정맥내 볼러스 주사를 통해 항-TREM2 항체를 주사했다. 투여된 용량은 용량 그룹당 n=3 원숭이로 3mg/kg 및 25mg/kg을 포함했다. 혈액 샘플 (약 1mL)은 투여-이전 및 투여-이후 10분, 30분, 1, 6, 12, 24시간 및 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24 및 28일에 수집되었다. 샘플을 원심분리 이전에 약 5℃에서 냉각시켜 혈장을 수득하고, 수득된 혈장을 분석까지 -70℃에서 저장하기 전에 드라이아이스 상에서 유지하였다. 혈장 샘플을 다음과 같이 항-TREM2 항체 수준에 대해 분석하였다.

항-TREM2 항체 PK 분석을 위해, 원숭이 혈장 내 총 항체 농도를 Meso Scale Discovery (MSD) 플랫폼에서 일반적인 항-인간_IgG 샌드위치 전기화학발광 면역검정 (ECLIA)을 사용하여 정량화하였다. 간단히 말해서, 1% 카제인-기반 PBS 차단 완충액 (Thermo Scientific, MA)을 MSD GOLD 96-웰 스몰-스팟 스트렙타비딘-코팅 미세역가 플레이트 (Meso Scale Discovery, MD)에 첨가하고 대략 1시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트 차단 및 세정 단계에 이어서, 0.5μg/mL의 작업 용액에서 비오틴화된 항-인간_IgG 염소 항체 (SouthernBiotech, AL)를 검정 플레이트에 첨가하고 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 및 세정 단계에 이어서, 혈장 시험 샘플 (즉, 항-TREM2 인간화된 항체를 갖는 샘플)을 검정 플레이트에 첨가하고 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 시험 샘플은 0.5% 카제인-기반 PBS 검정 완충액 (Thermo Scientific, MA)에서 1:100의 검정 최소-요구-희석액 (MRD)으로 희석되어, 그 결과 검정 플레이트에 추가 이전에 최종 1% 혈장 매트릭스가 생성되어야 한다는 점에 주목한다. 항-TREM2 항체 분석물의 포획 및 세정 단계에 이어서, 0.4μg/mL의 작업 용액에서 2차 루테닐화 (SULFO-TAG) 항-인간 IgG 염소 항체 (Meso Scale Discovery, MD)를 검정 플레이트에 첨가하고 대략 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 인큐베이션 및 세정 단계에 이어서, 검정 판독 완충액 (1X MSD 판독 완충액 T)을 검정 플레이트에 첨가하여 검정 샘플 신호를 생성했다. MSD 플레이트 판독기로부터의 샘플 신호 판독치는 전기화학발광 (ECL) 신호의 형태였으며 ECL 단위 (ECLU)로 표현되었다. 이전에 기술된 모든 검정 반응 단계는 주변 온도에서 플레이트 진탕기 (적절한 경우)에서 진탕하면서 수행되었다. 검정은 1:2로 일련으로-희석된 8개 표준 포인트 플러스 블랭크 혈장 샘플로 19.5 - 2500ng/mL (또는 1:100의 사후-MRD에서 0.195 - 25ng/mL)의 동적 보정 표준 범위를 가졌다. 혈장 샘플 농도는 가중된 4-매개변수 비-선형 로지스틱 회귀에 맞춰진 검정 보정 표준 곡선에서 역-계산되었다. 표 7은 예시적인 서열-최적화된 및 인간화된 항-TREM2 항체의 약동학적 (PK) 특성 (실시예 7)을 제공한다.

표 7. 항- TREM2 항체의 사이노몰구스 PK 특성

CL0020188 변이체는 사이노몰구스 원숭이에서 상이한 용량 수준과 선형 약동학적 프로파일 사이에서 유사한 낮은 제거 수준을 나타냈다. 추가하여, 사이노몰구스 원숭이에서 변이체의 투여와 관련된 임상 병리학적 소견은 없었다 (데이터 도시되지 않음).

실시예 11. 항- TREM2 항체의 비교

인간 TREM2 및 사이노몰구스 TREM2에 대한 항-TREM2 항체의 친화도를 (실시예 1에 기재된) Biacore에 의해 측정하였다. 항-TREM2 항체의 역가는 MSD 검정에 의해 건강한 인간 지원자 CSF 샘플 (Innovative Research) 및 건강한 사이노몰구스 원숭이 CSF 샘플 (Worldwide Primates)에서 측정되었다. 각 항체의 역가는 EC50에 의해 결정되었다. 간단히 말해서, 포획 항체 (비오틴화된 염소 항-인간 TREM2, R&D Systems, 카탈로그 번호 BAF1828)로 코팅된 MSD GOLD 96-웰 소형 스팟 스트렙타비딘 플레이트 (MSD, 카탈로그 번호 L45SA)를 실온에서 1시간 동안 검정 완충액 (25% (v/v) MSD 차단제 A (MSD, 카탈로그 번호 R93BA-A), 75% (v/v) TBST)에서 1:3으로 희석된 생체유체 샘플과 함께 인큐베이션했다. TBST로 웰을 린스한 후, 설포-태그된 항-TREM2 항체를 플레이트의 웰에 일련의 희석액 (11 포인트에 걸쳐 4x 희석)으로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 TBST로 세정하고, MSD 판독 완충액 (MSD, 카탈로그 번호 R92TC-3)을 웰에 첨가하였다. 샘플로부터의 신호는 MSD Meso Sector S600 장치를 사용하여 측정되었다. 각 항체에 대한 EC50 값은 4-매개변수 가변성 기울기 비-선형 회귀에 의해 결정되었다. 참조 항체 #1 및 #2는 WO 2018/195506에 기재된 4C5 및 6E7에 상응한다. 참조 항체 #3은 WO 2019/028292에 기술된 AL2p-58에 상응한다. 참조 항체 #1의 가변성 영역은 서열번호: 73 및 74로 표시된다. 참조 항체 #2의 가변성 영역은 서열번호: 75 및 76으로 표시된다. 참조 항체 #3의 가변성 영역은 서열번호: 77 및 78로 표시된다. 결과는 표 8에 제공된다.

표 8에 예시된 바와 같이, 참조 항체에 비해 본 명세서에 개시된 CL0020188 및 CL0020123 변이체는 인간 TREM2에 대해 더 강한 친화도를 갖고 건강한 인간 자원자 대상체로부터 단리된 CSF 샘플에서 sTREM2에 결합하는 데 더 강력하다. 부가하여, CL0020188 변이체는 참조 항체에 비해 사이노몰구스 TREM2에 대해 더 강한 친화도를 가지고 건강한 사이노몰구스 원숭이 대상체로부터 단리된 CSF 샘플에서 sTREM2에 결합하는 데 더 강력하다. 이는 동일한 조건하에서 주어진 양의 sTREM2에 결합하기 위한 절반 최대 유효 농도 (EC50)에 도달하는 데 필요한 항체의 상대적인 양으로 입증된다. 표 8에 예시된 바와 같이, CL0020188 및 CL0020123 항체와 비교하여 EC50을 달성하기 위해 참조 항체 #1, #2 및 #3의 더 높은 상대적인 양이 요구된다.

표 8. 항-TREM2 항체의 특성의 비교

실시예 12. 항- TREM2 항체의 에피토프 매핑

펩티드 수준에서 항-TREM2 항체의 에피토프를 동정하기 위해, 수소 중수소 교환 (HDX) 질량 분석을 사용하였다. 재조합 인간 TREM2를 단독으로 또는 항-TREM2 항체와 혼합하여 중수소 산화물 표지 완충액 (50mM 인산나트륨, 100mM 염화나트륨, pH 7.0)과 함께 20℃에서 0, 60, 600 및 3600초 동안 인큐베이션했다. 동등한 부피의 4M 구아니딘 염산염, 0.85M TCEP 완충액 (최종 pH 2.5)을 첨가하여 수소/중수소 교환을 켄칭하였다. 켄칭된 샘플은 펩신/프로테아제 XIII 단리 및 LC-MS 분석을 거쳤다. 간단히 말해서, 켄칭된 샘플을 20℃로 유지된 패킹된 펩신/프로테아제 XIII 컬럼 (2.1 x 30mm)에 주입하고 생성된 펩티드를 Q Exactive™ HF-하이브리드 사중극자-궤도 질량 분석기 (Thermo Fisher)에 결합된 Waters Acquity UPLC (Waters Corporation)로 구성된 UPLC-MS 시스템을 사용하여 분석했다. 펩티드는 2%에서 31% 용매 B (용매 B: 아세토니트릴 내 0.2% 포름산; 용매 A: 물 내 0.2% 포름산)로부터 16.5-분 구배를 사용하여 -6℃로 유지된 50mm x 1mm C8 컬럼 상에서 분리되었다. 질량 스펙트럼은 MS 전용 모드에서 기록되었다. 원 MS 데이터는 HDX 워크벤치를 사용하여 처리되었다 (Pascal 등 2012. Journal of American Society for Mass Spectrometry 23:1512-1521). 중수소 수준은 t0에서 중수소화 펩티드와 이의 천연 형태 사이의 평균 질량 차이를 사용하여 계산되었다. 마스코트 소프트위드 (Matrix Science)를 사용하여 인간 TREM2 서열에 대한 MS/MS 데이터 검색을 통해 펩티드 동정을 수행했다. 전구체 및 생성 이온에 대한 질량 허용오차는 각각 10ppm 및 0.02Da였다.

HDX 질량 분석 결과에 기반하여, CL0020188 및 CL0020188의 변이체는 아미노산 잔기 143-149 (FPGESES (서열번호: 69))에서 인간 TREM2 (서열번호: 1)에 결합하는 반면, CL0020123 및 CL0020123의 변이체는 (i) 아미노산 잔기 55-63 (GEKGPCQRV (서열번호: 70)), (ii) 아미노산 96-107 (TLRNLQPHDAGL (서열번호: 71)), 및 (iii) 아미노산 잔기 126-129 (VEVL (서열번호: 72))에서 인간 TREM2에 결합한다.

IX. 비공식 서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> DENALI THERAPEUTICS INC. <120> ANTI-TREM2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 102342-003310PC-1173316 <140> <141> <150> 62/808,141 <151> 2019-02-20 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 230 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu 20 25 30 Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys 35 40 45 Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val 50 55 60 Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly 65 70 75 80 Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr 85 90 95 Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser 100 105 110 Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val 115 120 125 Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro 130 135 140 Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser 145 150 155 160 Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu 165 170 175 Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala 180 185 190 Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro 195 200 205 Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu 210 215 220 Pro Gly Leu Arg Asp Thr 225 230 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Glu Val Lys Leu Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp 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Claims

인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(a) G-F-T-F-T-α ₆ -F-Y-M-S (서열번호: 48)의 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, 여기서 α ₆ 은 D 또는 N임;
(b) V-I-R-N-β ₅ -β ₆ -N-β ₈ -Y-T-β ₁₁ -β ₁₂ -Y-N-P-S-V-K-G (서열번호: 49)의 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 여기서 β ₅ 는 K 또는 R이고; β ₆ 은 A 또는 P이고; β ₈ 은 G 또는 A이고; β ₁₁ 은 A 또는 T이고; 그리고 β ₁₂ 는 G 또는 D임;
(c) γ ₁ -R-L-γ ₄ -Y-G-F-D-Y (서열번호: 50)의 서열을 포함하는 CDR-H3 서열, 여기서 γ ₁ 은 A 또는 T이고; 그리고 γ ₄ 는 T 또는 S임;
(d) Q-S-S-K-S-L-L-H-S-δ ₁₀ -G-K-T-Y-L-N (서열번호: 51)의 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, 여기서 δ ₁₀ 은 N 또는 T임;
(e) WMSTRAS (서열번호: 8)의 서열을 포함하는 CDR-L2 서열; 및
(f) Q-Q-F-L-E-φ ₆ -P-F-T (서열번호: 52)의 서열을 포함하는 CDR-L3 서열, 여기서 φ ₆ 은 Y 또는 F임.
제1항에 있어서, 상기 CDR-H1 서열은 서열번호: 4 및 12 중 임의의 하나로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CDR-H2 서열은 서열번호: 5, 13, 및 25 중 임의의 하나로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H3 서열은 서열번호: 6, 14, 및 17 중 임의의 하나로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L1 서열은 서열번호: 7 및 23 중 임의의 하나로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L3 서열은 서열번호: 9 및 18 중 임의의 하나로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편:
(a) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(b) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(c) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(d) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(e) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(f) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(g) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26 및 79 중 임의의 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제8항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 15에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제9항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 15에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제10항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 15를 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제8항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 24에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제12항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 24에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제13항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 24를 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제8항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 79에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제15항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 79에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제16항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 79를 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 및 68 중 임의의 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제18항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 16에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제19항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 16에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제20항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 16을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
제18항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 22에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제22항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 22에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제23항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 22를 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제18항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 68에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제25항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 68에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제26항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 68을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편:
(a) 서열번호: 15를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 16을 포함하는 V_L 서열; 또는
(b) 서열번호: 19를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 20을 포함하는 V_L 서열; 또는
(c) 서열번호: 21을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 20을 포함하는 V_L 서열; 또는
(d) 서열번호: 19를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 22를 포함하는 V_L 서열; 또는
(e) 서열번호: 79를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 22를 포함하는 V_L 서열; 또는
(f) 서열번호: 24를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 20을 포함하는 V_L 서열; 또는
(g) 서열번호: 26을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 20을 포함하는 V_L 서열; 또는
(h) 서열번호: 24를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 22를 포함하는 V_L 서열; 또는
(i) 서열번호: 26을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 22를 포함하는 V_L 서열; 또는
(j) 서열번호: 2를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 3을 포함하는 V_L 서열; 또는
(k) 서열번호: 10을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 11을 포함하는 V_L 서열; 또는
(l) 서열번호: 24를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 68을 포함하는 V_L 서열.
인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(a) GFSIEDFYIH (서열번호: 29)의 서열을 포함하는 CDR-H1 서열;
(b) W-I-D-P-E-β ₆ -G-β ₈ -S-K-Y-A-P-K-F-Q-G (서열번호: 47)의 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 여기서 β ₆ 은 N 또는 Q이고 β ₈ 은 D 또는 E임;
(c) HADHGNYGSTMDY (서열번호: 31)의 서열을 포함하는 CDR-H3 서열;
(d) HASQHINVWLS (서열번호: 32)의 서열을 포함하는 CDR-L1 서열;
(e) KASNLHT (서열번호: 33)의 서열을 포함하는 CDR-L2 서열; 및
(f) QQGQTYPRT (서열번호: 34)의 서열을 포함하는 CDR-L3 서열.
제29항에 있어서, 상기 CDR-H2 서열은 서열번호: 30, 39, 41, 및 43으로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편:
(a) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(b) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(c) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(d) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45 및 46 중 임의의 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제32항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 27에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제33항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 27에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제34항에 있어서, 상기 V_H 서열은 서열번호: 27을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 28 또는 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제36항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 28에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제37항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 28에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제38항에 있어서, 상기 V_L 서열은 서열번호: 28을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편:
(a) 서열번호: 27을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 28을 포함하는 V_L 서열; 또는
(b) 서열번호: 35를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는
(c) 서열번호: 37을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는
(d) 서열번호: 38을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는
(e) 서열번호: 40을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는
(f) 서열번호: 42를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는
(g) 서열번호: 44를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는
(h) 서열번호: 45를 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열; 또는
(i) 서열번호: 46을 포함하는 V_H 서열 및 서열번호: 36을 포함하는 V_L 서열.
인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(a) 서열번호: 4, 12, 및 29 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열;
(b) 서열번호: 5, 13, 25, 30, 39, 41, 및 43 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열;
(c) 서열번호: 6, 14, 17, 및 31 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열;
(d) 서열번호: 7, 23, 및 32 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열;
(e) 서열번호: 8 및 33 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열; 및
(f) 서열번호: 9, 18, 및 34 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열.
제41항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편:
(a) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(b) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(c) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(d) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(e) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(f) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3;
(g) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(h) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(i) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(j) 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(k) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
제41항 또는 제42항에 있어서, 서열번호: 2, 10, 15, 19, 21, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 및 79 중 임의의 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 3, 11, 16, 20, 22, 28 및 36 중 임의의 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편:
(a) 서열번호: 2에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 3에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(b) 서열번호: 10에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 11에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(c) 서열번호: 15에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 16에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(d) 서열번호: 19에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 20에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(e) 서열번호: 21에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 20에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(f) 서열번호: 19에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(g) 서열번호: 79에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(h) 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 20에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(i) 서열번호: 26에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 20에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(j) 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(k) 서열번호: 26에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 22에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(l) 서열번호: 27에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 28에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(m) 서열번호: 35에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(n) 서열번호: 37에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(o) 서열번호: 38에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(p) 서열번호: 40에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(q) 서열번호: 42에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(r) 서열번호: 44에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(s) 서열번호: 45에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(t) 서열번호: 46에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 36에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열; 또는
(u) 서열번호: 24에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_H 서열 및 서열번호: 68에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 V_L 서열.
골수 세포 2 상에 발현된 인간 촉발 수용체 (TREM2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 클론 CL0020306, 클론 CL0020188, 클론 CL0020188-1, 클론 CL0020188-2, 클론 CL0020188-3, 클론 CL0020188-4, 클론 CL0020188-5, 클론 CL0020188-6, 클론 CL0020188-7, 클론 CL0020188-8, 클론 CL0020307, 클론 CL0020123, 클론 CL0020123-1, 클론 CL0020123-2, 클론 CL0020123-3, 클론 CL0020123-4, 클론 CL0020123-5, 클론 CL0020123-6, 클론 CL0020123-7, 및 클론 CL0020123-8로 구성된 군으로부터 선택된 항체 클론에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제46항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 클론 CL0020123, 클론 CL0020123-1, 클론 CL0020123-2, 클론 CL0020123-3, 클론 CL0020123-4, 클론 CL0020123-5, 클론 CL0020123-6, 클론 CL0020123-6, 클론 CL0020123-7, 및 클론 CL0020123-8로 구성된 군으로부터 선택된 항체 클론에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 1에서 하기: (i) 아미노산 잔기 55-63 (GEKGPCQRV (서열번호: 70)), (ii) 아미노산 96-107 (TLRNLQPHDAGL (서열번호: 71)), 및 (iii) 아미노산 잔기 126-129 (VEVL (서열번호 72)) 중 하나 이상을 인식하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제46항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 클론 CL0020188, 클론 CL0020188-1, 클론 CL0020188-2, 클론 CL0020188-3, 클론 CL0020188-4, 클론 CL0020188-5, 클론 CL0020188-6, 클론 CL0020188-7, 클론 CL0020188-8, 클론 CL0020307, 및 클론 CL0020306으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 클론에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
제49항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열단편:1에서 아미노산 잔기 143-149 (FPGESES (서열번호: 69))를 인식하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 1에서 하기: (i) 아미노산 잔기 55-63 (GEKGPCQRV (서열번호: 70)), (ii) 아미노산 96-107 (TLRNLQPHDAGL (서열번호: 71)), 및 (iii) 아미노산 잔기 126-129 (VEVL (서열번호: 72)) 중 하나 이상을 포함하거나 이로 구성된 에피토프를 인식하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 1에서 아미노산 잔기 143-149 (FPGESES (서열번호: 69))를 포함하거나 이로 구성된 에피토프를 인식하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 가용성 TREM2 단백질 (sTREM2)의 수준을 감소시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2 활성을 향상시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제54항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 식세포작용을 향상시키거나 골수 세포, 소교세포 또는 대식세포의 이동, 분화, 기능 또는 생존을 향상시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제55항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 신경염증을 증가시키지 않으면서 소교세포 기능을 향상시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제54항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Syk 인산화를 향상시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제57항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2 리간드의 존재에서 Syk 인산화를 향상시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 사이노몰구스 TREM2 단백질과 교차-반응성을 나타내는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 완전한 인간 항체인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')₂, scFv, 또는 2가 scFv인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
인간 TREM2 단백질에 대한 결합에 대해 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 단리된 항체와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제65항의 약학적 조성물; 및
사용 설명을 포함하는 키트.
대상체에서 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제65항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제68항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 원발성 연령-관련 타우병증, 진행성 핵상 마비 (PSP), 전두측두엽 치매, 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매, 은친화성 병변 치매, 근위축성 측삭 경화증, 괌의 근위축성 측삭경화증/파킨슨병-치매 복합체 (ALS-PDC), 피질기저변성, 만성 외상성 뇌병증, 크로이츠펠트-야콥병, 푸길리스티카 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경섬유 엉킴, 다운 증후군, 가족성 영국형 치매, 가족성 덴마크형 치매, 거스트만-스트로슬러 샤인커병, 구상교 타우병증, 치매를 동반한 과들로피안 파킨슨병, 과들로피안 PSP, 할레보르덴-스파츠병, 스페로이드를 동반한 유전성 미만성 백질뇌병증 (HDLS), 헌팅턴병, 봉입체 근염, 다계통 위축증, 근긴장성 이영양증, 나수-하콜라병, 신경원섬유 얽힘-우세 치매, 니만-피크병 유형 C, 창백-교-흑질 변성증, 파킨슨병, 픽병, 뇌염후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경교증, 아급성 경화성 범뇌염 및 엉킴 단독 치매로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서 sTREM2의 수준을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제65항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
신경퇴행성 질환이 있는 대상체에서 TREM2 활성을 향상시키는 방법으로서, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제65항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.