BR112021006782A2 - análogos de proteína tirosina-tirosina e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

ANÁLOGOS DE PROTEÍNA TIROSINA-TIROSINA E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a análogos de PYY que incluem modificações que aumentam a meia-vida quando comparados com PYY humano nativo, bem como modificações adicionais que aumentam potência e seletividade ao receptor NPY2. São descritas também composições farmacêuticas que incluem um ou mais dos análogos de PYY descritos aqui, em um veículo farmaceuticamente aceitável. Métodos de produção e uso dos análogos de PYY são também descritos, especialmente para tratamento de obesidade, e doenças e distúrbios relacionados à obesidade tal como diabetes melito tipo II.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁ- LOGOS DE PROTEÍNA TIROSINA-TIROSINA E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS".

[001] A invenção refere-se geralmente à biologia e medicina, e mais particularmente refere-se aos análogos de peptídeo tirosina- tirosina (PYY) que podem ligar um receptor neuropeptídeo Y (NPY) tal como o receptor NPY2, bem como composições, incluindo o mesmo, e seu uso terapêutico no tratamento de obesidade e doenças relaciona- das à obesidade e distúrbios tal como diabetes tipo II (T2DM).

[002] PYY é um membro da família de polipeptídio pancreático (PP) e está envolvido na modulação da ingestão de alimentos e gasto de energia após uma refeição (ver, Tatemoto (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 2514-2518). PYY é secretado por células L da via gastrintesti- nal e apresenta duas formas endógenas principais - PYY1-36 (ID SEQ NO: 1) e PYY3-36 (ID SEQ NO: 2). PYY1-36 predomina sobre PYY3-36 durante o jejum, enquanto PYY3-36 predomina sobre PYY1-36 após a alimentação. Dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV) hidrolisa PYY1-36 em uma ligação de Pro2-Ile3 para produzir PYY3-36, o qual é mais seletivo para o receptor NPY2 do que PYY1-36.

[003] Concentração plasmática de PYY3-36 aumenta tipicamente dentro de 15 minutos de ingestão de alimentos, atinge o pico dentro de 60-90 minutos e permanece elevada por até 6 horas antes de retornar à linha de base (ver, Adrian e outros (1985) Gastroenterology 89: 1070 -1077; e De Silva & Bloom (2012) Gut Liver 6:10-20). Dessa forma, acredita-se que PYY3-36 afeta o apetite por meio de seu efeito central direto e também por meio de seu efeito na motilidade intestinal (ou se- ja, seu efeito anorexígeno). Adicionalmente, acredita-se que PYY3-36 medeia a sensibilidade à insulina para, assim, ajudar a diminuir a gli- cose no sangue (isto é, seu efeito de sensibilização).

[004] PYY3-36 foi investigado como um agente terapêutico poten-

cial para a regulação do peso corporal em vista de seus efeitos anore- xígenos, especialmente, para o tratamento da obesidade e suas doen- ças e distúrbios associados, incluindo DMT2 (diabetes melito tipo 2) e doenças cardiovasculares (ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente Internacional No. 2002/47712; e Schwartz & Morton (2002) Nature 418: 595-597).

[005] Infelizmente, PYY3-36 administrado exogenamente apresen- ta uma meia-vida curta (por exemplo, cerca de 10-15 minutos) devido às proteases e outros mecanismos de depuração (ver, Lluis e outros (1989) Rev. Esp. Fisiol. 45:377-384; e Torang e outros (2016) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 310: R866-R874), o qual apre- senta desafios ao usá-lo como um agente terapêutico. Com uma meia- vida tão curta, PYY3-36 deve ser administrado pelo menos uma vez ao dia para exercer um efeito terapêutico, o que é inconveniente para um indivíduo em necessidade do mesmo. Esforços, portanto, foram feitos para aumentar a meia-vida de PYY3-36 e/ou para aumentar sua seleti- vidade do receptor NPY2. Por exemplo, Rubinstein e outros, descre- vem análogos de PYY apresentando um radical 9-fluorenilmetoxi- carbonila (Fmoc) ou um radical 2-sulfo-9-fluorenil-metoxicarbonila (FMS) para aumentar a meia-vida (ver, Publicação do Pedido de Pa- tente Internacional No. WO 2004/089279). Além disso, DeCarr e ou- tros, descrevem análogos de PYY apresentando porções de PEG liga- das no terminal amino para aumentar a meia-vida (ver, DeCarr e ou- tros (2007) Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:1916-1919; ver também, Ortiz e outros (2007) J. Pharmacol. Exp. Ther. 323: 692-700). Além disso, Kofoed e outros, descrevem análogos de PYY apresentando cadeias laterais de ligação à albumina, pelo menos um resíduo modificado pró- ximo ao sítio de clivagem do PYY (por exemplo, um análogo de N- metil aminoácido de um resíduo de aminoácido de interesse), uma N- glicina e/ou um mimético de arginina para aumentar a meia-vida (ver,

Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2011/033068).

[006] Apesar de aumentos significativos na compreensão do pa- pel de PYY3-36 no metabolismo, permanece uma necessidade de aná- logos de PYY adicionais, especialmente análogos de PYY apresen- tando potência e seletividade aperfeiçoadas no receptor NPY2.

[007] Como observado acima, são necessários análogos de PYY adicionais para usos terapêuticos. Para atender essa necessidade, a invenção descreve primeiro os análogos de PYY que incluem uma se- quência de aminoácidos de base (em relação à numeração de PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1)): 3 PKPEX7PX9X10DASPEEX17X18RYYX22X23LRHYLNX30LTRQRY36 (Fórmula I), em que X7 é qualquer aminoácido com um grupo funcional disponível para conjugação e o grupo funcional é conjugado com um ácido graxo C16-C22, X9 é E ou G, X10 é E ou K, X17 é L ou W, X18 é N ou Q, X22 é A ou I, X23 é E, D ou S, e X30 é E ou W (ID SEQ NO: 3), e em que um aminoácido de término carbóxi (término C) é opcionalmen- te amidado.

[008] Em certos casos, o aminoácido com o grupo funcional dis- ponível para conjugação na posição X7 pode ser C, D, E, K ou Q. Em casos particulares, o aminoácido com o grupo funcional disponível pa- ra conjugação na posição X7 é K, e a sequência de aminoácidos pode ser uma das seguintes: 3 PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNWLTRQRY36 (ID SEQ NO: 4), 3 PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNELTRQRY36 (ID SEQ NO: 5), 3 PKPEKPEEDASPEEWQRYYIELRHYLNWLTRQRY36 (ID SEQ NO: 6), 3 PKPEKPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY36 (ID SEQ NO: 7), ou

PKPEKPGEDASPEELQRYYASLRHYLNWLTRQRY36 (ID SEQ NO: 8).

[009] Em alguns casos, o ácido graxo C16-C22 é conjugado com o aminoácido com o grupo funcional disponível para conjugação por meio de um ligante. Em certos casos, o ácido graxo C16-C22 apresenta uma estrutura de -CO-(CH2)a-CO2H, em que a é um número inteiro en- tre 16 a 22. Em casos particulares, o ácido graxo é um diácido C18 ou um diácido C20 tais como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido ara- quídico ou ácido eicosanoico, especialmente um diácido C18 ou diácido C20 saturado. Da mesma forma, e em alguns casos, o ligante pode ser uma ou mais unidades de ácido [2-(2-amino-etoxi)-etoxi)]-acético (AEEA), ácido aminoexanoico (Ahx), ácido glutâmico (E), ácido - glutâmico (E) ou combinações dos mesmos.

[0010] Em alguns casos particulares, o análogo de PYY pode ser um dos seguintes: 3 36 (ID SEQ NO: 9), 3 36 (ID SEQ NO: 10),

(ID SEQ NO: 11), 3 36 (ID SEQ NO: 12), ou 3 36 (ID SEQ NO: 13).

[0011] Em alguns casos, a estrutura base dos análogos de PYY neste relatório pode incluir adicionalmente os dois aminoácidos de término amino (N-terminal) de PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1), o qual subsequentemente pode ser processado in vivo para um análo- go de PYY3-36 (isto é, os resíduos "YP" do N-terminal de ID SEQ NO: 1 podem ser clivados in vivo a partir de qualquer um dos análogos de PYY).

[0012] Em alguns casos, os análogos de PYY apresentam uma carga maior que -2, especialmente, -3 ou -4.

[0013] Em alguns casos, os análogos de PYY apresentam uma afinidade de ligação no receptor NPY2 humano que é maior que aque- la de PYY3-36 humano (ID SEQ NO: 2), tal como de cerca de 2 vezes maior a cerca de 10 vezes maior, especialmente cerca de 2 vezes maior a cerca de 3 vezes maior.

[0014] Em alguns casos, os análogos de PYY apresentam uma meia-vida que é mais longa do que aquela de PYY3-36 humano (ID SEQ NO: 2), tal como de cerca de 5 horas a cerca de 24 horas mais longa, especialmente cerca de 12 horas.

[0015] Em segundo lugar, são descritas composições farmacêuti- cas que incluem pelo menos um análogo de PYY neste relatório ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (por exemplo, sais trifluo- racetato, sais acetato ou sais cloridrato) e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Em alguns casos, as composições farmacêuticas po- dem incluir adicionalmente veículos, diluentes e/ou excipientes.

[0016] Além disso, as composições farmacêuticas podem incluir um agente terapêutico adicional, tais como, por exemplo, outros agen- tes antidiabéticos ou de perda de peso, especialmente uma incretina. Em alguns casos, a incretina pode ser glucagon (GCG) ou um análogo de GCG. Em outros casos, a incretina pode ser peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), GLP-1 (7-36) amida ou um análogo de GLP-1. Em outros exemplos, a incretina pode ser um peptídeo inibitório gástrico (GIP) ou um análogo de GIP. Em outros casos, a incretina pode ser um agonista de receptor duplo, tal como oxintomodulina (OXM) ou um análogo de OXM, GLP-1/GCG ou GIP/GLP-1. Em outros casos, a in- cretina pode ser um análogo de incretina apresentando atividade de receptor triplo (isto é, análogos de incretina com atividade em cada um dos receptores GIP, GLP-1 e GCG). Em outros casos, o agente tera- pêutico adicional pode ser um inibidor de DPP-IV.

[0017] Em terceiro lugar, são descritos métodos para utilizar os análogos de PYY neste relatório, especialmente para utilizar os análo- gos de PYY para tratar obesidade e doenças e distúrbios relacionados à obesidade, tal como DMT2 (diabetes tipo 2). Os métodos incluem pelo menos uma etapa de administração a um indivíduo com necessi- dade de uma quantidade eficaz de um análogo de PYY, conforme descrito neste relatório, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0018] Em alguns casos, o análogo de PYY pode ser administrado por via subcutânea (SQ) ao indivíduo. Da mesma forma, e em alguns exemplos, o análogo de PYY pode ser administrado diariamente, a ca- da dois dias, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana (ou seja, semanalmente), quinzenalmente (ou seja, a cada duas semanas) ou mensalmente. Em certos casos, o análogo de PYY pode ser administrado SQ dia sim, dia não, SQ três vezes por semana, SQ duas vezes por semana, SQ uma vez por semana, SQ em sema- nas alternadas ou SQ uma vez por mês. Em casos particulares, o aná- logo de PYY é administrado SQ uma vez por semana (QW).

[0019] Alternativamente, o análogo de PYY pode ser administrado oralmente ao indivíduo. Como acima, o análogo de PYY pode ser ad- ministrado diariamente, dia sim, dia não, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana (ou seja, semanalmente), quinzenalmente (ou seja, a cada duas semanas) ou mensalmente. Em certos casos, o análogo de PYY pode ser administrado por via oral em dias alternados, por via oral três vezes por semana, por via oral duas vezes por semana, por via oral uma vez por semana, por via oral em semanas alternadas ou por via oral uma vez por mês. Em casos parti- culares, o análogo de PYY é administrado por via oral uma vez por semana.

[0020] Os métodos também podem incluir a administração de pelo menos um análogo de PYY em combinação com uma quantidade efi-

caz de um agente terapêutico adicional, tal como um inibidor de DPP- IV ou uma incretina (por exemplo, GCG ou um análogo de GCG, GLP- 1, GLP -1 (7-36) amida ou um análogo de GLP-1, GIP ou um análogo de GIP, OXM ou um análogo de OXM, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG ou uma incretina apresentando atividade de receptor triplo). O inibidor DPP-IV ou incretina pode ser administrado simultaneamente, separada ou se- quencialmente com o análogo de PYY.

[0021] Em alguns casos, o inibidor DPP-IV ou incretina pode ser administrado com uma mesma frequência como a do análogo de PYY (isto é, em dias alternados, duas vezes por semana, ou mesmo sema- nalmente). Em outros casos, o inibidor DPP-IV ou incretina é adminis- trado com uma frequência distinta do análogo de PYY. Em outros ca- sos, o inibidor DPP-IV ou incretina é administrado QW. Em ainda ou- tros casos, o análogo de PYY é administrado SQ e o inibidor DPP-IV ou a incretina podem ser administrados oralmente.

[0022] Em alguns casos, o indivíduo é obeso ou com sobrepeso. Em outros casos, o indivíduo é uma pessoa com diabetes (PcD), es- pecialmente DMT2. Em certos casos, o indivíduo é obeso com DMT2 ou tem excesso de peso com DMT2.

[0023] Os métodos podem também incluir etapas tal como medi- ção ou obtenção do peso do indivíduo e/ou glicose no sangue e/ou hemoglobina A1c (HbA1c) e comparação de tais valores obtidos com um ou mais valores de linha de base ou valores obtidos anteriormente para avaliar a eficácia de tratamento.

[0024] Os métodos podem também ser combinados com dieta e exercício e/ou podem ser combinados com agentes terapêuticos adici- onais diferentes daqueles discutidos acima.

[0025] Em quarto lugar, são descritos utilizações para os análogos de PYY neste relatório no tratamento de obesidade e doenças relacio- nadas à obesidade e distúrbios, tal como DMT2, os quais opcional-

mente podem ser administrados simultânea, separadamente ou se- quencialmente (isto é, em combinação) com um inibidor DPP-IV e/ou uma incretina tal como GCG ou um análogo de GCG, GLP-1, GLP-1 (7-36) amida ou um análogo de GLP-1, GIP ou um análogo de GIP, OXM ou um análogo de OXM, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, ou mesmo uma in- cretina apresentando atividade de receptor triplo.

[0026] Em quinto lugar, são descritos usos para os análogos de PYY neste relatório na produção de um medicamento para tratamento de obesidade e doenças relacionadas à obesidade e distúrbios, tal como DMT2, em que o medicamento opcionalmente pode incluir ainda um inibidor DPP-IV e/ou uma incretina, tal como GCG ou um análogo de GCG, GLP-1, GLP-1 (7-36) amida ou um análogo de GLP-1, GIP ou um análogo de GIP, OXM ou um análogo de OXM, GIP/GLP-1, GLP- 1/GCG, ou mesmo uma incretina apresentando atividade de receptor triplo.

[0027] Uma vantagem dos análogos de PYY neste relatório é que não apenas podem facilitar a perda de peso, mas também podem re- duzir a glicose. Desse modo, os indivíduos, especialmente aqueles suscetíveis a, ou apresentando DMT2, podem retardar a progressão para insulina exógena e manter as metas-alvo de HbA1c. Além disso, os análogos de PYY aqui, podem acentuar o controle glicêmico, me- lhorando a sensibilização à insulina. Combinados, GIP/GLP-1 e análo- go de PYY podem ser usados tanto para controle de glicose (incretina + potencial sensibilizador de insulina) quanto perda de peso (sinérgi- co). Em particular, os análogos de PYY neste relatório podem causar uma perda de peso de até cerca de 12% quando administrados a um indivíduo em necessidade deste e podem causar uma perda de peso de até cerca de 25% em ligação com um agente terapêutico adicional, tal como uma incretina quando administrada a um indivíduo com ne- cessidade deste.

[0028] Outra vantagem dos análogos de PYY descritos neste rela- tório é que podem apresentar uma meia-vida de até cerca de 24 horas, permitindo assim administração uma vez por semana.

[0029] Outra vantagem dos análogos de PYY neste relatório é que estes apresentam estabilidade físico-química e compatibilidade eleva- das em comparação com o PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2) e maior compatibilidade em uma formulação com incretinas quando comparados com o PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2).

[0030] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste relatório apresentam o mesmo signifi- cado como comumente entendido por aquele versado no estado da técnica à qual a invenção se refere. Embora quaisquer métodos e ma- teriais similares ou equivalentes àqueles descritos neste relatório pos- sam ser usados na prática ou teste dos análogos de PYY, composi- ções farmacêuticas e métodos, os métodos e materiais preferidos são descritos neste relatório.

[0031] Além disso, referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais de um elemento esteja presente, a menos que o contexto exija claramente que haja um e apenas um elemento. O artigo indefinido "um" ou "uma", desse mo- do, geralmente significa "pelo menos um". Definições

[0032] Conforme utilizado neste relatório, "cerca de" significa den- tro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor ou valores, tais como, por exemplo, uma concentração estabelecida, comprimen- to, peso molecular, pH, identidade de sequência, período de tempo, temperatura, volume, etc. Tal valor ou faixa pode estar dentro de uma ordem de magnitude tipicamente dentro de 20%, mais tipicamente, dentro de 10% e ainda mais tipicamente dentro de 5% de um determi- nado valor ou faixa. A variação permitida abrangida por "cerca de" de-

penderá do sistema particular sob estudo e pode ser prontamente ava- liada por aquele versado no estado da técnica.

[0033] Conforme utilizado neste relatório, "aminoácido" significa uma molécula que, do ponto de vista químico, caracteriza-se pela pre- sença de um ou mais grupos amina e um ou mais grupos de ácido carboxílico e pode conter outros grupos funcionais. Como é conhecido no estado da técnica, existe um conjunto de vinte aminoácidos que são designados como aminoácidos padrão e que são usados como blocos de construção para a maioria dos peptídeos/proteínas produzi- dos por qualquer ser vivo.

[0034] Conforme utilizado neste relatório, "aminoácido com um grupo funcional disponível para conjugação" significa qualquer amino- ácido natural ou não natural com um grupo funcional que pode ser conjugado com um ácido graxo por meio de, por exemplo, um ligante. Exemplos de tais grupos funcionais incluem, mas não se limitam aos mesmos, grupos alquinila, alquenila, amino, azido, bromo, carboxila, cloro, iodo e tiol. Adicionalmente, exemplos de aminoácidos naturais, incluindo tais grupos funcionais incluem C (tiol), D (carboxila), E (car- boxila), K (amino) e Q (amida).

[0035] Conforme utilizado neste relatório, "análogo" significa um composto, tal como um peptídeo ou polipeptídio sintético, que ativa um receptor alvo e que provoca pelo menos um efeito in vivo ou in vitro provocado por um agonista nativo para esse receptor.

[0036] Conforme utilizado neste relatório, "efeito anorexígeno" sig- nifica uma capacidade dos análogos de PYY neste relatório de reduzir o apetite, resultando em menor consumo de alimentos e, finalmente, levando à perda de peso O efeito anorexígeno também pode referir-se a uma capacidade dos análogos de PYY neste relatório de aumentar a motilidade intestinal.

[0037] Como utilizado neste relatório, "ácido graxo C16-C22" signifi-

ca um ácido carboxílico apresentando entre 16 e 22 átomos de carbo- no. O ácido graxo C16-C22 adequado para uso neste relatório pode ser um monoácido saturado ou um diácido saturado ("diácidos" apresen- tam um grupo carboxila em cada extremidade).

[0038] Conforme utilizado neste relatório, "AUC" significa área sob a curva.

[0039] Conforme utilizado neste relatório, "quantidade eficaz" sig- nifica uma quantidade, concentração ou dose de um ou mais análogos de PYY neste relatório, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo que, após administração de dose única ou múltipla a um indi- víduo com necessidade do mesmo, proporciona um efeito desejado em tal indivíduo sob diagnóstico ou tratamento (isto é, pode produzir uma diferença clinicamente mensurável em uma condição do indiví- duo, tal como, por exemplo, uma redução em glicose no sangue, uma redução em HbA1c e/ou uma redução no peso ou gordura corporal). Uma quantidade eficaz pode ser prontamente determinada por aquele versado no estado da técnica, usando técnicas conhecidas e obser- vando os resultados obtidos em circunstâncias análogas. Na determi- nação da quantidade eficaz para um indivíduo, vários fatores são con- siderados, incluindo, mas não se limitam aos mesmos, a espécie de mamífero, seu tamanho, idade e saúde geral, a doença ou distúrbio específico envolvido, o grau de, ou envolvimento ou a gravidade da doença ou distúrbio, a resposta do indivíduo, o análogo de PYY parti- cular administrado, o modo de administração, as características de bi- odisponibilidade da preparação administrada, o regime de dosagem selecionado, o uso de medicação concomitante e outras circunstâncias relevantes.

[0040] Conforme utilizado neste relatório, "metade da concentra- ção efetiva máxima" ou "CE50" significa uma concentração de compos- to que resulta em 50% de ativação/estimulação de um ponto final de ensaio, tal como uma curva de dose-resposta (por exemplo, cAMP).

[0041] Conforme utilizado neste relatório, "em combinação com" significa administrar pelo menos um dos análogos de PYY neste rela- tório simultânea, sequencialmente ou em uma única formulação com- binada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

[0042] Conforme utilizado neste relatório "análogo de incretina" significa um peptídeo ou polipeptídio apresentando semelhanças es- truturais com, mas múltiplas diferenças de, cada um de GIP, GLP-1, GCG e OXM, especialmente GIP humano nativo, GLP-1, GCG e OXM. Alguns análogos de incretina também apresentam afinidade e ativida- de em dois ou mesmo em cada um dos receptores GIP, GLP-1 e GCG (isto é, atividade agonista em dois receptores, tais como em OXM, GIP/GLP-1 ou GLP-1/GCG, ou mesmo atividade agonista em todos os três receptores).

[0043] Conforme utilizado neste relatório, "indivíduo com necessi- dade deste" significa um mamífero, tal como um humano, com uma condição, doença, distúrbio ou sintoma que requer tratamento ou tera- pia, incluindo, por exemplo, aqueles listados neste relatório. Em parti- cular, o indivíduo preferido que deve ser tratado é um ser humano.

[0044] Conforme utilizado neste relatório, "ação prolongada" signi- fica que a afinidade de ligação e a atividade de um análogo de PYY neste relatório continua por um período de tempo maior que o PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1) e/ou PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2), permitindo a dosagem pelo menos tão raramente quanto uma vez ao dia ou mesmo três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana ou mensalmente. O perfil de ação no tempo dos análogos de PYY neste relatório pode ser medido usando métodos de testes farmacocinéticos conhecidos, tais como aqueles descritos nos Exemplos abaixo.

[0045] Conforme utilizado neste relatório, "aminoácido não padrão"

significa um aminoácido que pode ocorrer naturalmente nas células, mas não participa da síntese de peptídeos. Os aminoácidos não pa- drão podem ser constituintes de um peptídeo e muitas vezes são ge- rados por modificação de aminoácidos padrão no peptídeo (isto é, via modificação pós-translacional). Os aminoácidos não padrão podem incluir D-aminoácidos, os quais apresentam uma quiralidade absoluta oposta aos aminoácidos padrão acima.

[0046] Conforme utilizado neste relatório, "obeso" ou "obesidade" significa uma condição em que um indivíduo apresenta um índice de massa corporal (IMC) que é >30,0 kg/m2. Ver geralmente, "Overweight & Obesity" pelo Center for Disease Control and Prevention (Centro de Controle e Prevenção de Doenças) disponível em cdc.gov/obesity/adult/defining.html; e "Definitions & Facts for Adult Overweight & Obesity" "Definições e fatos para sobrepeso e obesidade em adultos" pelos Institutos Nacionais de Saúde em iddk.nih.gov/health-information/weight-management/adult-overweight- obesity/definition-facts.

[0047] Conforme utilizado neste relatório, "doença ou distúrbio re- lacionado à obesidade" significa quaisquer doenças ou distúrbios que são induzidos/exacerbados por obesidade, incluindo, mas não se limi- tam aos mesmos, angina de peito, doença cardiovascular, colecistite, colelitíase, insuficiência cardíaca congestiva, dislipidemia, doença he- pática gordurosa, complicações de fertilidade, intolerância à glicose, gota, hipertensão, hipotireoidismo, hiperinsulinemia, resistência à insu- lina, osteoartrite, síndrome dos ovários policísticos (SOP), complica- ções na gravidez, distúrbios psicológicos, apneia do sono e outros problemas respiratórios, acidente vascular cerebral com incontinência urinária de esforço, DMT2, nefrolitíase de ácido úrico (pedras nos rins) e câncer de mama, cólon, endométrio, esôfago, vesícula biliar, rim, próstata e reto.

[0048] Conforme utilizado neste relatório, "sobrepeso" significa uma condição em que um indivíduo apresenta um IMC que é de cerca de 25,0 kg/m2 a <30 kg/m2. Ver, id.

[0049] Conforme utilizado neste relatório, "PYY" significa Peptídeo YY obtido ou derivado de qualquer espécie, tal como uma espécie de mamífero, especialmente um humano. PYY inclui tanto o PYY nativo (isto é, comprimento total) e suas variações (isto é, adições, deleções e/ou substituições de PYY nativo). PYYs específicos incluem, mas não se limitam aos mesmos, PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1) e PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2).

[0050] Conforme utilizado neste relatório, "análogo de PYY" ou "análogos de PYY" significa um peptídeo ou polipeptídio semelhante a PYY que induz um ou mais efeitos de PYY nativo em um ou mais re- ceptores NPY, tal como o receptor NPY2. Em alguns casos, os análo- gos de PYY neste relatório podem se ligar a um receptor NPY, especi- almente, o receptor NPY2 humano, com maior ou menor afinidade, mas demonstram uma meia-vida mais longa in vivo ou in vitro em comparação com PYY nativo, especialmente PYY humano, tal como PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1) e PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2). Dessa forma, os análogos de PYY descritos neste relató- rio são compostos sintéticos que atuam como agonistas do receptor NPY2.

[0051] Conforme utilizado neste relatório, "saturado" significa que o ácido graxo não contém ligações duplas ou triplas de carbono- carbono.

[0052] Conforme utilizado neste relatório, "efeito sensibilizante" significa uma capacidade dos análogos de PYY neste relatório de au- mentar o efeito da insulina e, assim, ajudar a reduzir a glicose no san- gue.

[0053] Conforme utilizado neste relatório, "tratamento" ou "tratar"

significa atenuar, restringir, reverter, retardar ou interromper a progres- são ou gravidade de uma condição, doença, distúrbio ou sintoma exis- tente.

[0054] Certas abreviações são definidas como seguem: "ACR" re- fere-se à razão albumina/creatinina urinária; "amu" refere-se a unidade de massa atômica; "tBoc" refere-se a terc-butoxicarbonila; "cAMP" re- fere-se a monofosfato de adenosina cíclica; "DMF" refere-se a dimetil- formamida; "DMSO" refere-se a sulfóxido de dimetila; "EIA/RIA" refere- se a imunoensaio/radioimunoensaio enzimático; "h" refere-se a hora; "HTRF" refere-se a fluorescente homogênea resolvida no tempo; "IV" refere-se a intravenoso; "KDa" refere-se a quilodaltons; "LC-MS" refe- re-se a espectrometria de massa de cromatografia líquida; "MS" refere- se a espectrometria de massa; "OtBu" refere-se à O-terc-butila; "Pbf" refere-se a NG-2,2,4,6,7-pentametildiidrobenzofuran-5-sulfonila; "RP- HPLC" refere-se a cromatografia líquida de alta eficiência de fase re- versa; "SQ" refere-se a subcutâneo; "SEM" refere-se ao erro padrão da média; "TFA" refere-se a ácido trifluoracético; e "Trt" refere-se a Tritila. Análogos de PYY

[0055] Os análogos de PYY neste relatório apresentam semelhan- ças estruturais com, mas muitas diferenças estruturais, de peptídeos PYY nativos. Por exemplo, quando comparado com PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1) e/ou PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2), os análogos de PYY aqui descritos incluem modificações em uma ou mais das posições 3, 7, 9, 10, 17, 18, 22, 23, 30 e 31 em relação à numeração de PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1). Em certos ca- sos, as sequências de aminoácidos exemplares dos análogos de PYY neste relatório incluem (alterações específicas em relação ao resíduo correspondente de PYY humano nativo (ID SEQ NO: 1) estão em ne- grito):

PKPEX7PX9X10DASPEEX17X18RYYX22X23LRHYLNX30LTRQRY36 (ID SEQ NO:3), 3 PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNWLTRQRY36 (ID SEQ NO:4), 3 PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNELTRQRY36 (ID SEQ NO:5), 3 PKPEKPEEDASPEEWQRYYIELRHYLNWLTRQRY36 (ID SEQ NO:6), 3 PKPEKPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY36 (ID SEQ NO:7), e 3 PKPEKPGEDASPEELQRYYASLRHYLNWLTRQRY36 (ID SEQ NO:8).

[0056] Os análogos de PYY neste relatório resultam em atividade suficiente no receptor NPY2 humano, mas atividade insuficiente nos receptores NPY1, NPY4 e NPY5. Da mesma forma, os análogos de PYY neste relatório apresentam atributos benéficos relevantes para sua capacidade de desenvolvimento como tratamentos terapêuticos, incluindo melhor solubilidade em soluções aquosas, melhor estabilida- de de formulação química e física, perfil farmacocinético estendido e potencial minimizado para imunogenicidade.

[0057] Em alguns casos, os análogos de PYY neste relatório são amidados em um aminoácido de término C para afetar a estabilidade. Além das alterações aqui descritas, os análogos podem incluir uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais, desde que, no entanto, os análogos permaneçam capazes de se ligar e ativar o receptor NPY2 humano.

[0058] Os análogos de PYY neste relatório incluem adicionalmente um ácido graxo conjugado, por exemplo, por meio de um ligante a um aminoácido natural ou não natural com um grupo funcional disponível para conjugação (isto é, "acilação"). Em alguns casos, o aminoácido com um grupo funcional disponível para conjugação pode ser C, D, E, K e Q. Em casos particulares, o aminoácido com o grupo funcional disponível para conjugação é K, em que a conjugação é para um gru- po ε-amino de uma cadeia lateral K.

[0059] Aqui, a acilação dos análogos de PYY está na posição 7 quando comparada com PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1). Des- sa forma, o ácido graxo pode atuar como um ligante de albumina para proporcionar análogos de ação mais longa.

[0060] Com relação ao ácido graxo, este pode ser quimicamente conjugado ao grupo funcional do aminoácido disponível para conjuga- ção por uma ligação direta ou por um ligante. O comprimento e a com- posição do ácido graxo afetam a meia-vida dos análogos de PYY, a potência in vivo dos análogos de PYY, e a solubilidade e estabilidade dos análogos de PYY. A conjugação com um monoácido ou diácido graxo saturado C16-C22 resulta, desse modo, em análogos de PYY que exibem meia-vida desejável, potência in vivo desejável e característi- cas desejáveis de solubilidade e estabilidade.

[0061] Exemplos de ácidos graxos saturados C16-C22 para uso neste relatório incluem, mas não se limitam aos mesmos, ácido hexa- decanoico (isto é, ácido palmítico, monoácido C16), ácido hexadecano- dioico (diácido C16), ácido heptadecanoico (isto é, ácido margárico, monoácido C17), ácido heptadecanodioico (diácido C17), ácido esteári- co (monoácido C18), ácido octadecanodioico (diácido C18), ácido nona- decílico (isto é, ácido nonadecanoico, monoácido C19), ácido nonade- canodioico (diácido C19), ácido eicosanoico (isto é, ácido aracádico, monácido C20), ácido eicosanodioico (diácido C20), ácido heneicosa- noico (isto é, ácido heneicosílico, monácido C21), ácido heneicosanodi- oico (diácido C21), ácido docosanoico (isto é, ácido beênico, monácido C22), ácido docosanodioico (diácido C22), e seus derivados ramificados e substituídos. Em certos casos, o ácido graxo C16-C22 pode ser um monoácido C18 saturado, um diácido C18 saturado, um monoácido C19 saturado, um diácido C19 saturado, um monoácido C20 saturado, um diácido C20 saturado e seus derivados ramificados e substituídos. Em casos particulares, o ácido graxo C16-C22 pode ser ácido palmítico ou ácido hexadecônico, ácido esteárico ou ácido octadecônico, ou ácido araquídico ou ácido eicosanoico.

[0062] Para auxiliar na conjugação de um ácido graxo a um ami- noácido natural ou não natural com o grupo funcional disponível para conjugação, os análogos de PYY neste relatório podem incluir um li- gante. Em alguns casos, o ligante pode ser pelo menos um de AEEA, Ahx, E ou E, bem como combinações dos mesmos.

[0063] Quando o ligante inclui os aminoácidos, o ligante pode apresentar de um a quatro resíduos de aminoácidos E ou E. Em al- guns casos, o ligante pode incluir um ou dois resíduos de aminoácidos E e/ou E. Por exemplo, o ligante pode incluir um ou dois resíduos de aminoácidos E e/ou E. Em outros casos, o ligante pode incluir um a quatro resíduos de aminoácidos (tais como, por exemplo, aminoácidos E ou E) usados em combinação com AEEA ou Ahx. Especificamente, o ligante pode ser combinações de resíduos de aminoácidos E e E com AEEA ou Ahx. Em ainda outros casos, o ligante pode ser combi- nações de um ou dois resíduos de aminoácidos E e um ou dois AEEA ou Ahx. Em casos particulares, o ligante pode ser uma porção (AEEA)2•E, uma porção Ahx•E•E ou uma porção AEEA•E.

[0064] Porções de ácido graxo ligante exemplares podem incluir diácido (AEEA)2•E•C20, diácido Ahx•E•E•C18 ou diácido AEEA•E•C18. As características estruturais dessas porções de ácido graxo ligante resultam em análogos apresentando meia-vida aperfei- çoada quando comparados com PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1) ou PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2).

[0065] Tomados juntamente, análogos de PYY exemplares são:

(ID SEQ NO:9),

3 36

(ID SEQ NO:10),

3 36

(ID SEQ NO:11),

3 36

(ID SEQ NO:12), ou

(ID SEQ NO:13).

[0066] Embora os análogos de PYY sejam descritos como apre- sentando trinta e quatro aminoácidos como aquele de PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2), considera-se que os análogos de PYY neste relatório podem apresentar uma sequência de aminoácidos com base no PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1). Isto é, os análogos de PYY podem incluir os dois aminoácidos de término N (isto é, os resíduos "YP" das posições 1 e 2 de ID SEQ NO: 1) de PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1), o qual subsequentemente pode ser clivado in vivo quando administrado a um indivíduo como ocorreria quando PYY1-36 humano nativo (ID SEQ NO: 1) é liberado endogenamente.

[0067] A meia-vida dos análogos de PYY neste relatório pode ser medida usando técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo, por exemplo, aquelas descritas nos Exemplos abaixo. Da mesma for- ma, a afinidade dos análogos de PYY neste relatório para cada um dos vários receptores NPY humanos (por exemplo, NPY2R, NPY5R) pode ser medida usando técnicas conhecidas no estado da técnica para medir os níveis de ligação do receptor, incluindo, por exemplo, aqueles descritos nos Exemplos abaixo, e é comumente expresso co- mo um valor de constante inibitória (Ki). Além disso, a atividade dos análogos de PYY neste relatório em cada um dos receptores também pode ser medida usando técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo, por exemplo, os ensaios de atividade in vitro descritos abai- xo, e é comumente expressa como um valor CE50.

[0068] Como resultado das modificações descritas acima, os aná- logos de PYY neste relatório apresentam uma meia-vida que é mais longa do que aquela de PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2). Por exemplo, os análogos de PYY podem apresentar uma meia-vida de cerca de 5 horas a cerca de 24 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 23 horas, de cerca de 7 horas a cerca de 22 horas, de cerca de 8 ho- ras a cerca de 21 horas, de cerca de 9 horas a cerca de 20 horas, de cerca de 10 horas a cerca de 19 horas, de cerca de 11 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 12 horas a cerca de 17 horas, de cerca de 13 horas a cerca de 16 horas, ou mesmo de cerca de 14 horas a cerca de 15 horas. Alternativamente, os análogos de PPY neste relatório podem apresentar uma meia-vida que é cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 ho- ras, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, ou mesmo cerca de 24 horas, especialmente cerca de 12 horas.

[0069] Da mesma forma, os análogos de PYY neste relatório apre- sentam uma afinidade de ligação no receptor NPY2 que é maior que a de PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2), tal como de cerca de 2 ve- zes a cerca de 10 vezes. Alternativamente, os análogos de PYY aqui podem apresentar uma afinidade de ligação até cerca de 2 vezes mai- or, cerca de 3 vezes maior, cerca de 4 vezes maior, cerca de 5 vezes maior, cerca de 6 vezes maior, cerca de 7 vezes maior, cerca de 8 ve- zes maior, cerca de 9 vezes maior, ou mesmo cerca de 10 vezes mai- or, especialmente 2 vezes maior a 3 vezes maior, do que aquela de PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2). Composições Farmacêuticas

[0070] Os análogos de PYY neste relatório podem ser formulados como composições farmacêuticas, que podem ser administradas por vias parenterais (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscu- lar, subcutânea ou transdérmica). Tais composições farmacêuticas e técnicas para a sua preparação são bem conhecidas no estado da técnica. Ver, por exemplo, Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" (D.B. Troy ed., 21ª. Edição, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006). Em casos particulares, os análogos de PYY são administrados SQ. Alternativamente, no entanto, os análogos de PYY podem ser formulados em formas para outras vias farmaceuticamente aceitáveis, tais como, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para adminis- tração oral; cápsulas de liberação temporizada; e qualquer outra forma atualmente usada, incluindo cremes, loções, inalantes e similares.

[0071] Para melhorar sua compatibilidade e eficácia in vivo, os análogos de PYY neste relatório podem ser reagidos com qualquer um de vários ácidos/bases inorgânicos e orgânicos para formar sais de adição de ácido/base farmaceuticamente aceitáveis. Sais farmaceuti- camente aceitáveis e metodologias comuns para prepará-los são bem conhecidos no estado da técnica (ver, por exemplo, Stahl e outros, "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use", 2ª edição revisada (Wiley-VCH, 2011)). Os sais farmaceuticamente acei- táveis para uso neste relatório incluem sais de sódio, trifluoracetato, cloridrato e acetato.

[0072] Os análogos de PYY neste relatório podem ser administra- dos por um médico ou autoadministrados utilizando uma injeção. En- tende-se que o tamanho do calibre e a quantidade de volume de inje- ção podem ser prontamente determinados por aquele versado no es- tado da técnica. Entretanto, a quantidade de volume de injeção pode ser ≤ cerca de 2 mL ou mesmo ≤ cerca de 1 mL, e o calibre da agulha pode ser ≥ cerca de 27 G ou mesmo ≥ cerca de 29 G.

[0073] A invenção também proporciona e, portanto, abrange novos intermediários e métodos úteis para sintetizar os análogos de PYY neste relatório, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Os intermediários e análogos de PYY neste relatório podem ser prepara- dos por uma variedade de metodologias que são bem conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, um método usando síntese química é ilustrado nos Exemplos abaixo. As etapas de síntese específicas para cada uma das vias descritas podem ser combinadas de diferentes mo- dos para preparar os análogos de PYY aqui descritos. Os reagentes e materiais de partida são prontamente disponíveis por aquele versado no estado da técnica.

[0074] Os análogos de PYY neste relatório são geralmente efica- zes em uma ampla faixa de dosagem. Doses exemplares dos análo- gos de PYY neste relatório ou de composições farmacêuticas, incluin- do os mesmos, podem ser quantidades de miligramas (mg), micro- gramas (µg), nanogramas (ng) ou picrograma (pg) por quilograma (kg) de um indivíduo. Desse modo, uma dose diária pode ser cerca de 1 μg a cerca de 100 mg.

[0075] Aqui, a quantidade eficaz do análogo de PYY em uma composição farmacêutica pode ser uma dose de cerca de 0,25 mg a cerca de 5,0 mg. Aquele versado no estado da técnica, contudo, en- tende que em alguns casos a quantidade eficaz (isto é, do- se/dosagem) pode estar abaixo do limite inferior da faixa acima menci- onada e ser mais do que adequada, enquanto em outros casos a quantidade eficaz pode ser doses maiores e pode ser empregada com efeitos colaterais aceitáveis.

[0076] Além do análogo de PYY, a composição farmacêutica tam- bém pode incluir um agente terapêutico adicional, especialmente ou- tros agentes antidiabéticos ou de perda de peso. Em alguns casos, o agente terapêutico adicional pode ser pelo menos um dentre uma in- cretina ou um inibidor de DPP-IV. Incretinas exemplares incluem, mas não se limitam as mesmas, GCG, GLP-1, GLP-1 (7-36) amida, GIP, OXM, um análogo de GCG, um análogo de GLP-1, um análogo de GIP, um análogo de OXM, um GIP/GLP-1, um GLP-1/GCG, ou mesmo um análogo de incretina apresentando atividade de receptor triplo.

[0077] Desse modo, a composição farmacêutica pode incluir uma quantidade eficaz de um análogo de PYY de ID SEQ NO: 9 e uma in- cretina ou um inibidor de DPP-IV, uma quantidade eficaz de um análo- go de PYY de ID SEQ NO: 10 e uma incretina ou um inibidor DPP-IV, uma quantidade eficaz de um análogo de PYY de ID SEQ NO: 11 e uma incretina ou um inibidor DPP-IV, uma quantidade eficaz de um análogo de PYY de ID SEQ NO: 12 e uma incretina ou um inibidor DPP-IV, ou uma quantidade eficaz de um análogo de PYY de ID SEQ NO: 13 e uma incretina ou um inibidor DPP-IV.

[0078] Nesses casos em que a incretina é GLP-1 ou um análogo de GLP-1, pode ser GLP-1 ou um análogo de GLP-1, tais como albi- glutide, dulaglutide, liraglutide, semaglutide ou combinações dos mes- mos, especialmente dulaglutide. Métodos de Produção e Uso dos Análogos de PYY

[0079] Os análogos de PYY neste relatório podem ser sintetizados por meio de qualquer número de métodos de síntese de peptídeos co- nhecidos no estado da técnica usando procedimentos de síntese em fase sólida manuais ou automatizados padrão. Os sintetizadores de peptídeos automatizados são comercialmente disponíveis, por exem- plo, de Applied Biosystems (Foster City, CA) e Protein Technologies Inc. (Tucson, AZ). Os reagentes para a síntese em fase sólida são prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais. Sintetizadores de fase sólida podem ser usados de acordo com as instruções do fa- bricante para o bloqueio de grupos interferentes, proteção de aminoá- cidos durante a reação, acoplamento, desproteção e proteção de ami- noácidos que não reagiram.

[0080] Tipicamente, um aminoácido protegido por N--carbamoíla e o aminoácido de término N na cadeia de peptídeo em crescimento ligado a uma resina são acoplados sob temperatura ambiente em um solvente inerte, tal como DMF, N-metilpirrolidona ou cloreto de metile- no na presença de agentes de acoplamento, tais como diisopropil-1- carbodiimida e 1-hidroxibenzotriazol. O grupo de proteção N-- carbamoíla é removido a partir da resina de peptídeo resultante usan- do um reagente tal como TFA ou piperidina, e a reação de acoplamen- to é repetida com o próximo aminoácido N--protegido desejado que deve ser adicionado à cadeia de peptídeo. Os grupos de proteção de amina adequados são bem conhecidos no estado da técnica e são descritos, por exemplo, em Green & Wuts, "Protecting Groups in Or- ganic Synthesis" (Grupos Protetores em Síntese Orgânica) (John Wil- ey and Sons, 1991). Os exemplos mais comumente usados incluem tBoc e Fmoc. Após a conclusão da síntese, os peptídeos são clivados a partir do suporte de fase sólida com desproteção simultânea da ca- deia lateral usando métodos de tratamento padrão em condições áci- das.

[0081] Aquele versado no estado da técnica avaliará que as ca- deias de peptídeos aqui descritas são sintetizadas com uma carboxa- mida de término C. Para a síntese de peptídeos de amida de término C, resinas incorporando ligantes MBHA de amida Rink ou ligantes AM de amida Rink são tipicamente utilizadas com síntese de Fmoc, en- quanto a resina de MBHA é geralmente usada com síntese de tBoc.

[0082] Peptídeos brutos são tipicamente purificados usando RP- HPLC em colunas C8 ou C18 utilizando gradientes de água- acetonitrila em TFA a 0,05% a 0,1%. A pureza pode ser verificada por RP-HPLC analítica. A identidade dos peptídeos pode ser verificada por meio de EM. Os peptídeos podem ser solubilizados em tampões aquosos em uma ampla faixa de pH.

[0083] Um uso dos análogos de PYY neste relatório é para reduzir a glicose no sangue e/ou peso corporal em indivíduos, especialmente indivíduos que estão com sobrepeso ou obesos e apresentam DMT2. A administração de um análogo de PYY, conforme descrito neste rela- tório, pode resultar no controle glicêmico, melhorando a sensibilização à insulina e a perda de peso. Como tal, os análogos de PYY neste re- latório mostram eficácia na redução da glicose com o benefício adicio- nal de redução de peso, de modo que os indivíduos possam retardar a progressão para insulina e manter as metas de HbA1c alvo.

[0084] Os métodos podem incluir as etapas descritas neste relató- rio, e essas podem ser, mas não necessariamente, realizadas na se- quência conforme descrita. Outras sequências, entretanto, também são concebíveis. Além disso, as etapas individuais ou múltiplas podem ser realizadas em paralelo e/ou sobrepostas no tempo e/ou individu- almente ou em etapas múltiplas repetidas. Além disso, os métodos podem incluir etapas adicionais não especificadas.

[0085] Tais métodos, portanto, podem incluir a seleção de um indi- víduo que está acima do peso e apresentam DMT2 ou está predispos- to ao mesmo. Alternativamente, os métodos podem incluir a seleção de um indivíduo que é obeso e apresenta DMT2 ou está predisposto ao mesmo.

[0086] Os métodos também podem incluir a administração ao indi- víduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um análogo de PYY, conforme descrito neste relatório, o qual pode estar na forma de uma composição farmacêutica, conforme também descrita neste relatório. Em alguns casos, pelo menos um análogo de PYY/composição farma- cêutica pode incluir agentes terapêuticos adicionais, tal como uma in- cretina ou um inibidor de DPP-IV.

[0087] A concentração/dose/dosagem de pelo menos um análogo de PYY e incretina opcional ou inibidor de DPP-IV são discutidos em outro lugar neste relatório.

[0088] Com relação à uma via de administração, pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo pode ser administrado de acordo com métodos conhecidos, tais como, por exemplo, oralmente; por meio de injeção (isto é, intra-arterial, in- travenosa, intraperitoneal, intracerebral, intracerebroventricular, intra- muscular, intraocular, intraportal ou intralesionalmente); por meio de sistemas de liberação sustentada ou por meio de dispositivos de im- plantação. Em certos casos, pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo, pode ser administrado por via subcutânea (SQ) por meio de injeção em bolus ou continua- mente.

[0089] Com relação à uma frequência de dosagem, pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo, pode ser administrado diariamente, dia sim, dia não, três ve- zes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana (isto é, semanalmente), quinzenalmente (ou seja, a cada duas semanas) ou mensalmente. Em certos casos, pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo é administrado por via subcutânea (SQ) dia sim, dia não, SQ três vezes por semana, SQ duas vezes por semana, SQ uma vez por semana, SQ em semanas alternadas ou SQ mensalmente. Em casos particulares, pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo é administrado SQ uma vez por semana (QW).

[0090] Alternativamente, pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo pode ser administrado por via oral. Como acima, e no que diz respeito à frequência de dosa- gem, pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêuti- ca, incluindo o mesmo pode ser administrado diariamente, em dias al- ternados, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana (isto é, semanalmente), quinzenalmente (ou seja, a cada duas semanas) ou mensalmente. Em certos casos, pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo é administrado por via oral em dias alternados, por via oral três vezes por semana, por via oral duas vezes por semana, por via oral uma vez por semana ou por via oral a cada duas semanas. Em casos particula- res, o análogo de PYY é administrado por via oral uma vez por sema- na.

[0091] Em relação a esses casos em que pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo é admi- nistrado em combinação com uma quantidade eficaz de uma incretina, a incretina pode ser GCG ou um análogo de GCG, GLP-1, GLP-1 (7- 36) amida ou um análogo de GLP-1, GIP ou um análogo de GIP, OXM ou um análogo de OXM, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, ou mesmo uma in- cretina apresentando atividade de receptor triplo. O GCG, análogo de GCG, GLP-1, GLP-1 (7-36) amida, análogo de GLP-1, GIP, análogo de GIP, OXM, análogo de OXM, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG ou incretina apresentando atividade do receptor triplo pode ser administrada simul- taneamente, separada ou sequencialmente com pelo menos um aná- logo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo.

[0092] Além disso, o GCG, análogo de GCG, GLP-1, GLP-1 (7-36) amida, análogo de GLP-1, GIP, análogo de GIP, OXM, análogo de OXM, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, ou incretina apresentando atividade de re- ceptor triplo pode ser administrado com uma mesma frequência como pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo (isto é, dia sim, dia não, duas vezes por semana, ou mesmo semanalmente). Alternativamente, o GCG, análogo de GCG, GLP-1, GLP-1 (7-36) amida, análogo de GLP-1, GIP, análogo de GIP, OXM, análogo de OXM, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG ou incretina apresentando atividade de receptor triplo pode ser administrada com uma frequência distinta de pelo menos um análogo de PYY ou uma composição farmacêutica, incluindo o mesmo. Em outros casos, o GCG, análogo de GCG, GLP-1, GLP-1 (7-36) amida, análogo de GLP-1, GIP, análogo de GIP, OXM, análogo de OXM, GIP/GLP-1, GLP- 1/GCG, ou incretina apresentando atividade de receptor triplo é admi- nistrada QW. Em ainda outros casos, o análogo de PYY é administra- do subcutâneo (SQ), e o GCG, análogo de GCG, GLP-1, GLP-1 (7- 36)amida, análogo de GLP-1, GIP, análogo de GIP, OXM, análogo de OXM, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG ou incretina apresentando atividade de receptor triplo podem ser administrados por via oral.

[0093] Considera-se ainda que os métodos podem ser combina- dos com dieta e exercício e/ou podem ser combinados com agentes terapêuticos adicionais além desses discutidos acima.

EXEMPLOS

[0094] Os exemplos seguintes não limitativos são oferecidos para fins de ilustração, não limitação. Exemplo 1: Análogo de PYY 1.

[0095] Um análogo de PYY incorporando o conceito inventivo po- de apresentar uma estrutura de: 3 36 (ID SEQ NO:9).

[0096] Aqui, o término N é livre e o aminoácido de término C é amidado como uma amida primária de término C. O K na posição 7 é quimicamente modificado através da conjugação com o grupo ε-amino da cadeia lateral K na posição 7 com (Ahx-E-(E)-CO-(CH2)16-COOH).

[0097] O análogo de PYY de acordo com ID SEQ NO: 9 é gerado por síntese de peptídeo em fase sólida usando estratégia de Fmoc/t- Bu em um Sintetizador Automatizado de Peptídeo SymphonyX (PTI Protein Technologies Inc.) partindo de resina RAPP Amida AM-Rink (H40023 Poliestireno AM RAM, Rapp polymere GmbH). Acoplamentos de aminoácidos são realizados usando 10 equivalentes de aminoáci- dos, diisopropilcarbodiimida 0,9 M (DIC) e Oxima 0,9 M (razão molar de 1:1:1) em DMF por 3 horas a 25°C. Desproteções são realizadas usando soluções de piperidina a 25% em DMF.

[0098] Após alongamento da resina de peptídeo conforme descrita acima, o grupo protetor MTT presente em K na posição 7 é removido usando hexafluorisopropanol a 30% (HFIP) em diclorometano (DCM). Ciclos adicionais de acoplamento/desproteção usando uma estratégia de Fmoc/t-Bu para estender o K na posição 7 da cadeia lateral envol- vem ácido Fmoc-6-aminoexanoico (Chem-Impex International Catálo- go no. 02490), Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OH)-OtBu (Catálogo ChemPep no. 100703) e HOOC-(CH2)16-COOtBu. Em todos os aco- plamentos, 3 equivalentes do bloco de construção são usados com PyBOP (3 equivalentes) e DIEA (6 equivalentes) em DMF por 3 horas a 25oC.

[0099] Clivagem concomitante a partir da resina e remoção do grupo protetor da cadeia lateral são realizadas em uma solução con- tendo TFA: triisopropilsilano: 1,2-etanoditiol: metanol: tioanisol 80:5:5:5:5 (v/v) por 2 horas a 25°C seguido por precipitação com éter frio. O peptídeo bruto é purificado a >99% de pureza (15-20% de ren- dimento purificado) por meio de RP-HPLC em uma coluna de fenilexila (Phenomenex, Luna; 5 μm, 100A), em que as frações adequadas são reunidas e liofilizadas.

[00100] A pureza do análogo de PYY é examinada por RP-HPLC analítica e identidade é confirmada usando CL/EM (observado: M + 3H+/3 = 1659,2 (+/- 0,2); calculado: M + 3H+/3 = 1659,2; observado: M

+ 4H+/4 = 1244,6 (+/- 0,2); calculado: M + 4H+/4 = 1244,6; observado: M + 5H+/5 = 995,9 (+/- 0,2); calculado: M + 5H+/5 = 995,9). Exemplo 2: Análogo de PYY 2.

[00101] Um análogo de PYY incorporando o conceito inventivo po- de apresentar uma estrutura de: 3 36 (ID SEQ NO:10).

[00102] Como no Exemplo 1, o término N é livre, e o aminoácido de término C é amidado como uma amida primária de término C. Em con- traste, entretanto, o K na posição 7 é quimicamente modificado através da conjugação com o grupo ε-amino da cadeia lateral K com ([2-(2- amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(E)-CO-(CH2)18-COOH.

[00103] O análogo de PYY de acordo com ID SEQ NO: 10 é gerado por peptídeo em fase sólida, semelhante ao descrito acima no Exem- plo 1. Desse modo, FMOC-NHPEG2-CH2COOH e HOOC-(CH2)18- COOtBu é ligado com a cadeia lateral após clivagem de MTT usando 3 equivalentes do bloco de construção com PyBOP (3 equivalentes) e DIEA (6 equivalentes) em DMF por 3 horas a 25oC.

[00104] A pureza do análogo de PYY é examinada por RP-HPLC analítica e identidade é confirmada usando CL/EM (observado: M + 3H+/3 = 1665,4 (+/- 0,2); calculado: M + 3H+/3 = 1665,5; observado: M + 4H+/4 = 1249,3 (+/- 0,2); calculado M + 4H+/4 = 1249,4; observado: M + 5H+/5 = 999,7 (+/- 0,2); calculado: M + 5H+/5 = 999,7). Exemplo 3: Análogo de PYY 3.

[00105] Um análogo de PYY incorporando o conceito inventivo po-

de apresentar uma estrutura de: 3 36 (ID SEQ NO:11).

[00106] Como no Exemplo 1, o término N é livre e o aminoácido de término C é amidado como uma amida primária de término C. Em con- traste, entretanto, o K na posição 7 é quimicamente modificado através da conjugação com o grupo ε-amino da cadeia lateral K com ([2-(2- amino-etoxi)-etoxi]-acetil)-(E)-CO-(CH2)16-COOH.

[00107] O análogo de PYY de acordo com ID SEQ NO: 11 é gerado por peptídeo em fase sólida, semelhante ao descrito acima no Exem- plo 1. Desse modo, FMOC-NHPEG2-CH2COOH e HOOC-(CH2)16- COOtBu são ligados com a cadeia lateral após clivagem de MTT usando 3 equivalentes do bloco de construção com PyBOP (3 equiva- lentes) e DIEA (6 equivalentes) em DMF por 3 horas a 25oC.

[00108] A pureza do análogo de PYY é examinada por RP-HPLC analítica e identidade é confirmada usando CL/EM (observado: M + 3H+/3 = 1664,7 (+/- 0,2); calculado: M + 3H+/3 = 1664,9; observado: M + 4H+/4 = 1248,9 (+/- 0,2); calculado: M + 4H+/4 = 1248,9; observado: M + 5H+/5 = 999,3 (+/- 0,2); calculado: M + 5H+/5 = 999,3). Exemplo 4: Análogo de PYY 4.

[00109] Um análogo de PYY incorporando o conceito inventivo po- de apresentar uma estrutura de:

(ID SEQ NO:12).

[00110] Como no Exemplo 1, o término N é livre e o aminoácido de término C é amidado como uma amida primária de término C. Em con- traste, entretanto, o K na posição 7 é quimicamente modificado através da conjugação com o grupo ε-amino da cadeia lateral K com ([2-(2- amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(E)-CO-(CH2)16-COOH.

[00111] O análogo de PYY de acordo com ID SEQ NO: 12 é gerado por peptídeo em fase sólida, semelhante ao descrito acima no Exem- plo 1. Desse modo, FMOC-NHPEG2-CH2COOH e HOOC-(CH2)16- COOtBu são ligados com a cadeia lateral após clivagem de MTT usando 3 equivalentes do bloco de construção com PyBOP (3 equiva- lentes) e DIEA (6 equivalentes) em DMF por 3 horas a 25oC.

[00112] A pureza do análogo de PYY é examinada por RP-HPLC analítica e identidade é confirmada usando CL/EM (observado: M + 3H+/3 = 1664,8 (+/- 0,2); calculado: M + 3H+/3 = 1665,5; observado: M + 4H+/4 = 1248,9 (+/- 0,2); calculado: M + 4H+/4 = 1249,4; observado: M + 5H+/5 = 998,9 (+/- 0,2); calculado: M + 5H+/5 = 995,7). Exemplo 5: Análogo de PYY 5.

[00113] Um análogo de PYY incorporando o conceito inventivo po- de apresentar uma estrutura de:

(ID SEQ NO:13).

[00114] Como no Exemplo 1, o término N é livre e o aminoácido de término C é amidado como uma amida primária de término C. Em con- traste, entretanto, o K na posição 7 é quimicamente modificado através da conjugação com o grupo ε-amino da cadeia lateral K com ([2-(2- amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(E)3-CO-(CH2)18-COOH.

[00115] O análogo de PYY de acordo com ID SEQ NO: 13 é gerado por peptídeo em fase sólida, semelhante ao descrito acima no Exem- plo 1. Desse modo, FMOC-NHPEG2-CH2COOH e HOOC-(CH2)18- COOtBu são ligados com a cadeia lateral após clivagem de MTT usando 3 equivalentes do bloco de construção com PyBOP (3 equiva- lentes) e DIEA (6 equivalentes) em DMF por 3 horas a 25oC.

[00116] A pureza do análogo de PYY é examinada por RP-HPLC analítica e identidade é confirmada usando CL/EM (observado: M + 3H+/3 = 1732,2 (+/- 0,2); calculado: M + 3H+/3 = 1732,3; observado: M + 4H+/4 = 1299,4 (+/- 0,2); calculado: M + 4H+/4 = 1299,5; observado: M + 5H+/5 = 1039,7 (+/- 0,2); calculado: M + 5H+/5 = 1039,8). Exemplo 6: Atividade in vitro de análogos de PYY (1) Ligação in vitro com receptores hNPY1, hNPY2, hNPY4 e hNPY5 Propósito:

[00117] Avaliar a afinidade de ligação in vitro (Ki) dos análogos de PYY dos Exemplos 1 a 5 na ausência de albumina sérica bovina (BSA)

para os seguintes receptores humanos (h): hNPY1R, hNPY2R, hNPY4R e hNPY5R. Ensaios de ligação de radioligante competitivos com membranas preparadas a partir de linhagens celulares que supe- rexpressam cada um dos receptores recombinantes e os peptídeos marcados com [125I] relevantes são usados em um método de ensaio de proximidade de cintilação (EPC). A afinidade de ligação para os peptídeos nativos associados, PYY1-36 (ID SEQ NO: 1), PYY3-36 (ID SEQ NO: 2) e polipeptídio pancreático1-36 (PP1-36; ID SEQ NO: 14), é determinada em cada ensaio como um controle. Métodos:

[00118] Análogos de PYY, PYY1-36 humano nativo e PYY3-36 de con- trole são sintetizados em Lilly Research Laboratories (Indianapolis, IN, EUA) e são caracterizados por CL/EM, RMN e análise de CL/UV (pu- reza de 99,5%). Os teores de peptídeo estimam-se em 80% da massa do pó. Os peptídeos são preparados como solução de estoque 10 mM em DMSO a 100% e mantidos congelados a -20°C até justamente an- tes do teste nos ensaios.

[00119] Para hNPY1R, a superexpressão transitória é realizada usando células CHO. As linhagens celulares transfectadas de forma estável são preparadas de hNPY2R e hNPY4R por meio de subclona- gem do ADNc do receptor no plasmídeo de expressão ADNpc3.1 e transfecção em células renais embrionárias humanas (HEK) 293 se- guido por seleção com Geneticina. A clonagem de hNPY5R é realiza- da em Multispan, Inc. (Hayward, CA).

[00120] Para a preparação de membranas celulares brutas de hNPY1R, hNPY2R, mNPY2R e hNPY4R, são utilizados dois métodos diferentes (descritos abaixo). As membranas de hNPY5R são adquiri- das de Multipan, Inc. (no. MCG1275).

[00121] Método 1 – Para as membranas de hNPY2R e hNPY4R, os péletes de células congelados são lisados em gelo em 10 mL de tam-

pão de homogeneização hipotônico contendo Tris HCl 50 mM, pH 7,5 e Inibidores de Protease Roche Complete™ com EDTA (no. 1169749001) por grama de pasta úmida de células. A suspensão de células é interrompida usando um homogeneizador de vidro Potter- Elvehjem equipado com um pilão de Teflon® de 25 batidas. O homo- genato é centrifugado a 4°C em 1.100 x g durante 10 minutos. O so- brenadante é coletado e armazenado em gelo enquanto os péletes são ressuspensos em tampão de homogeneização e re- homogeneizados como descrito acima. O homogenato é centrifugado em 1.100 x g durante 10 minutos. O segundo sobrenadante é combi- nado com o primeiro sobrenadante e centrifugado em 35.000 x g du- rante 1 hora a 4°C. O sedimento (pélete) da membrana resultante é ressuspenso em tampão de homogeneização contendo inibidores de protease em aproximadamente 1 a 3 mg/mL, rapidamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado como alíquotas em um freezer a - 80°C até uso. A concentração de proteína é determinada usando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, no. 23225) com BSA como pa- drão.

[00122] Método 2 – Para membranas de hNPY1R, péletes de célu- las congeladas são lisados em gelo em 5 mL de tampão de homoge- neização hipotônica contendo Tris HCl 25 mM, pH 7,5, MgCl2 1 mM, 25 unidades/mL de DNase I (Invitrogen, no. 18047-019) e inibidores de Protease Roche Complete™ sem EDTA (no. 11836170001) por grama de pasta úmida de células. A suspensão de células é interrompida usando um homogeneizador de vidro Potter-Elvehjem equipado com um pilão de Teflon® de 25 batidas. O homogenato é centrifugado a 4°C em 1.800 x g por 15 minutos em um tubo cônico de 50 mL. O so- brenadante é coletado e armazenado em gelo enquanto os péletes são ressuspensos em tampão de homogeneização e re- homogeneizados como descrito acima, exceto que DNase I não é utili-

zada no tampão de homogeneização. O homogenato é centrifugado em 1.800 x g durante 15 minutos. O segundo sobrenadante é combi- nado com o primeiro sobrenadante e centrifugado em 25.000 x g du- rante 30 minutos a 4°C. O sedimento (pélete) de membrana resultante é ressuspenso em tampão de homogeneização contendo inibidores de protease em aproximadamente 2 mg/mL, dividido em alíquotas e ar- mazenado em um freezer a -80°C até uso. A concentração de proteína é determinada usando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, no. 23225) com BSA como padrão.

[00123] Métodos de ensaio de ligação geral - As constantes de dis- sociação de equilíbrio (Kd) para as várias interações de recep- tor/radioligante são determinadas a partir da análise de ligação de sa- turação usando os mesmos reagentes e tampões conforme descritos abaixo para teste do composto. Os valores de Kd determinados para as preparações do receptor utilizado nesse estudo são os seguintes: hNPY2R, 0,0047 nM; hNPY1R, 0,07 nM; hNPY4R, 0,084 nM; e hNPY5R, 0,896 nM.

[00124] Protocolo de ligação ao receptor hNPY1R - A afinidade de ligação ao receptor (Ki) de peptídeos de análogos de PYY e PYY1-36 para hNPY1R é determinada a partir de um ensaio de ligação de radio- ligante competitivo com recombinante humano [125I]-PYY1-36 (no. NEX341, 2200 Ci/mmoles) obtido de Perkin Elmer (Waltham, MA). O ensaio é realizado com um método de SPA usando contas de SPA acopladas a aglutinina de gérmen de trigo de poliviniltolueno (PVT) (no. RPNQ0001, Perkin Elmer). Tampão de ensaio (HEPES 25 mM, pH 7,5, MgCl2 1 mM, CaCl2 2,5 mM e Bacitracina 0,2% p/v (RPI, no. 32000)) é usado para a preparação de reagentes. Análogos de PYY e PYY1-36 são descongelados e 3 vezes diluídos em série em DMSO a 100% (curvas de resposta de concentração de 10 pontos) usando um manipulador de líquidos Tecan Evo. Uma diluição em etapa decres-

cente de 20 vezes do peptídeo em tampão de ensaio é realizada para reduzir o nível de DMSO e a concentração de peptídeo antes de adi- ção na placa de ensaio. Em seguida, 5 µL de peptídeo diluído em série ou DMSO são transferidos para uma placa de ensaio de fundo trans- parente Corning® 3632 contendo 45 µL de tampão de ensaio ou con- trole de PYY1-36 não marcado (ligação não específica ou NSB, em con- centração final de 10 nM). Em seguida, são adicionados 50 µL [125I]- PYY1-36 (concentração final de 0,05 nM) e 50 µL de membranas hNPY1R (1,0 µg/poço). A adição final é de 50 µL de contas WGA de SPA (50 µg/poço). A concentração final de DMSO é de 0,125%. As placas são seladas e misturadas em um agitador de placas (configura- ção 6) por 1 minuto e lidas com um contador de cintilação PerkinElmer Trilux MicroBeta® após 10 horas de incubação/tempo de sedimenta- ção das contas sob temperatura ambiente. As faixas de concentração do ensaio final para os peptídeos testados nas curvas de resposta são: análogos de PYY (2,5 µM a 0,13 nM) e PYY1-36 (10 nM a 0,5 pM).

[00125] Protocolo de ligação ao receptor hNPY2 - A afinidade de ligação ao receptor (Ki) de peptídeos de análogos de PYY e PP1-36 pa- ra hNPY2R é determinada a partir de um ensaio de ligação de radioli- gante competitivo conforme descrito acima para hNPY1R. As faixas de concentração do ensaio final para os peptídeos testados em curvas de resposta são: análogos de PYY (0,1 µM a 5 pM) e PYY3-36 (10 nM a 0,5 pM).

[00126] Protocolo de ligação ao receptor hNPY4R - A afinidade de ligação ao receptor (Ki) de peptídeos de análogos de PYY e PP1-36 pa- ra hNPY4R é determinada a partir de um ensaio de ligação de radioli- gante competitivo conforme descrito acima para hNPY1R. As faixas de concentração do ensaio final para os peptídeos testados em curvas de resposta são: análogos de PYY (2,5 µM a 0,13 nM) e PYY1-36 (10 nM a 0,5 pM).

[00127] Protocolo de ligação ao receptor hNPY5R - A afinidade de ligação ao receptor (Ki) de peptídeos de análogos de PYY e PYY1-36 para hNPY5R é determinada a partir de um ensaio de ligação de radio- ligante competitivo conforme descrito acima para hNPY1R. As faixas de concentração do ensaio final para os peptídeos testados em curvas de resposta são: análogos de PYY (1 µM a 10 pM) e PYY1-36 (1 µM a 10 pM).

[00128] Análise de dados para ensaios de ligação ao receptor NPY - Dados de contagem bruta por minuto (CPM) para curvas de concen- tração de análogos PYY, PYY1-36, PYY3-36 ou PP1-36 são convertidos em porcentagem de inibição específica subtraindo ligação não especí- fica (NSB , ligação na presença de excesso de PYY1-36, PYY3-36 ou PP1-36, respectivamente) a partir dos valores individuais de CPM e di- vidindo pelo sinal de ligação total, também corrigido pela subtração de ligação não específica, conforme mostrado na equação abaixo: .

[00129] Dados são analisados utilizando rotinas de regressão não linear de quatro parâmetros (curva máxima, curva mínima, CI50, incli- nação de Hill) (Genedata Screener, versão 13.0.5, Genedata AG, Ba- sal, Suíça). A afinidade de (Ki) é calculada a partir do valor de CI50 re- lativo com base na equação Ki = CI50/(1 + D/Kd) em que D = a concen- tração de radioligante no experimento, CI50 é a concentração que cau- sa 50% de inibição de ligação, e Kd é a constante de afinidade de liga- ção de equilíbrio do radioligante determinada a partir da análise de li- gação de saturação (listada acima). Um qualificador (>) indica que os dados não atingiram 50% de inibição, em comparação com a ligação máxima na ausência de competidor, por meio do qual Ki é calculado usando a concentração mais alta do composto testado no ensaio.

[00130] Os valores relatados para Ki são calculados como a média geométrica, conforme mostrada abaixo:

[00131] Erro padrão da média (SEM) é calculado utilizando o méto- do delta conforme mostrado abaixo: , em que DP é o desvio padrão, n é o número de séries independentes e ln(10) é o logaritmo natural de 10.

[00132] Seletividade de peptídeos para hNPY2R (Y2) versus hNPY5R (Y5), hNPY4R (Y4) e/ou hNPY1R (Y1) são calculados divi- dindo pelos resultados de hNPY2R em nM. Resultados: Tabela 1: Ligação in vitro (Ki) a hNPY1R, hNPY2R, hNPY4R e hNPY5R. Peptídeo hNPY2 hNPY5 hNPY4 hNPY1 Dobra Dobra Dobra R (nM) R (nM) R (nM) R (nM) (Y5/Y2) (Y4/Y2) (Y1/Y2) PP1-36 -- -- 0,07 -- -- -- -- PYY1-36 0,007 0,37 5 0,06 52 714 8,6 PYY3-36 0,008 3,6 27 7 450 3375 875 Exemplo 1 0,011 59 626 256 5363 56909 23272 Exemplo 2 0,070 >1000 >1840 >1460 >14285 >26286 >20857 Exemplo 3 0,009 36,4 112 >1550 4044 12444 >19375 0 Exemplo 4 0,005 ND 280 >148 NA 56000 >29600 Exemplo 5 0,030 ND 560 >1530 NA 18666 >51000 Ref. 1* 0,016 189 -- -- 11812 -- -- Ref. 2* 0,021 112 -- -- 5333 -- -- Ref. 3* 0,013 469 -- -- 36076 -- -- * Análogo de PYY conhecido para comparação; ver, Publicação do pedido de patente internacional nº WO 2016/198682, em que Ref. 1 corresponde ao Composto 4 nesta, Ref. 2 corresponde ao Composto 21 nesta, e a Ref. 3 corresponde ao Composto 32 nesta. ND - não detectado

NA - não aplicável

[00133] Conforme mostrado acima, os análogos de PYY dos Exem- plos 1-5 são altamente seletivos para o receptor hNPY2, mesmo de- monstrando afinidade de ligação reduzida aos receptores hNPY5, hNPY4 e hNPY1 versus PYY3-36 humano nativo (ID SEQ NO: 2). (2) Atividade in vitro de cAMP no receptor NPY2 humano Propósito:

[00134] Determinar a atividade funcional in vitro dos análogos de PYY dos Exemplos 1 a 5 em comparação com PYY3-36 humano nativo medindo a inibição de produção intracelular de cAMP induzida por forscolina em células HEK 293 que superexpressam o receptor NPY2 humano recombinante. Métodos:

[00135] Análogos de PYY e PYY3-36 humano (ID SEQ NO: 2) são sintetizados, caracterizados e armazenados conforme descritos acima nos ensaios de ligação a receptores.

[00136] Clonagem do receptor - Uma linhagem celular transfectada de forma estável é preparada para o receptor hNPY2 subclonando o ADNc do receptor no plasmídeo de expressão pcADN3.1 e transfec- tando-o em células HEK 293 seguido por seleção com Geneticina. Alí- quotas de células (1 x 107 células/mL) em passagem 9 são feitas e mantidas congeladas na fase de vapor de um tanque de nitrogênio lí- quido. Essas alíquotas congeladas são usadas no momento do ensaio. As células mantêm uma viabilidade superior a 95% ao longo de vários meses.

[00137] Ensaio de cAMP de hNPY2R - A inibição de produção da cAMP induzida por forscolina por meio de análogos de PYY ou PYY3-36 é medida usando células HEK 293 que superexpressam hNPY2R re- combinante. Alíquotas congeladas de células são descongeladas em banho-maria a 37°C. As células são transferidas para um tubo de 50 mL com 10 mL de meio de cultura (meio de cultura de células MEM de Life Tech 11090-081 com FBS a 10% de Life Tech 10082-147, 1 mM de L-Glutamina de Life Tech 25030-081, 1 x NEAA de Life Tech 11140-050, piruvato de sódio 1 mM de Life Tech 11360-070, 1x anti- bióticos antimicóticos de Life Tech 15240-062) e são centrifugadas 5 minutos em 1.500 rpm em uma centrífuga de mesa Beckman.

O so- brenadante é removido e o pélete de células é ressuspenso em 10 mL de meio de cultura de células seguido por passagem através de um filtro de 40 µm.

Uma contagem precisa do número de células e da via- bilidade celular é determinada usando um Analisador Vi-Cell de Beck- man Coulter (Vi-Cell XR 2.03). 8.000 células por poço são semeadas em uma placa de ensaio de 384 poços (Corning, revestido com Poli-D- Lisina, branco/opaco, catálogo no. 356661) usando um Dispensador Combi-Tip (Thermo Scientific). As placas são centrifugadas 1 segundo em 1.000 rpm e incubadas 18 a 20 horas a 37°C em uma incubadora controlada com CO2 a 5%. O meio de cultura é removido das placas de ensaio batendo suavemente em toalhas de papel. 10 µL de tampão de ensaio [1X HBSS (Hyclone, no.

SH3026801), HEPES 20 mM, pH 7,5 (Hyclone no.

SH30237.01), caseína a 0,1% p/v (CTL Scientific Su- pply Corp., no. 440203H), IBMX 500 µM (Sigma-Aldrich no.

I5876)] é adicionado aos poços usando o Dispensador Combi-Tip seguido por centrifugação por 10 segundos a 1.500 rpm.

Uma curva de resposta à concentração (20 pontos) em diluições de 2 vezes é preparada em DMSO a 100% usando tecnologia de distribuição acústica (Labcyte Echo 550). As células são tratadas com análogos de PYY ou PYY3-36 humano durante 45 minutos a 37°C (concentração final de DMSO = 1%), em seguida estimuladas com forscolina 1 µM (Sigma-Aldrich, no.

F6886) durante 45 minutos a 37°C.

O cAMP intracelular é quantificado usando um Kit dinâmico CisBio cAMP-Gi (no. 62AM9PEB). Resumi- damente, os níveis de cAMP dentro da célula são detectados usando os reagentes do kit HTRF adicionando conjugado de cAMP-d2 em tampão de lise celular (10 μL) seguido por adição do anticorpo anti- cAMP-Eu3+-Criptato, também em tampão de lise celular (10 μL). O en- saio competitivo resultante é incubado por pelo menos 60 minutos sob temperatura ambiente, em seguida lido em um instrumento PerkinEl- mer Envision™ com excitação a 320 nm e emissão a 665 nm e 620 nm. As faixas de concentração do ensaio final para os peptídeos tes- tados nas curvas de resposta são: análogos de PYY (0,1 µM a 0,2 pM) e PYY3-36 humano (10 nM a 0,02 pM). Uma curva padrão de concen- trações conhecidas de cAMP (0,5 µM a 1 pM) é preparada em tampão de ensaio. Os poços na ausência de competidor adicionado ou com um excesso de PYY3-36 humano adicionado são incluídos em cada placa como Resposta Máxima e Controles de Inibidores, respectiva- mente.

[00138] Análise de dados para o ensaio de cAMP do receptor hNPY2 - Emissão de fluorescência resolvida no tempo é usada para calcular uma razão de fluorescência (665 nM/620 nm), que é inversa- mente proporcional à quantidade de cAMP presente. Sinais de análo- gos de PYY e PYY3-36 humano são convertidos em cAMP de nM por poço usando uma curva padrão de cAMP plotada como unidades rela- tivas de resposta (emissão a 665 nm/620 nm*10.000, eixo y) versus concentração de cAMP (eixo x).

[00139] A quantidade de cAMP gerada (nM) em cada poço é con- vertida em uma porcentagem da resposta máxima observada com forscolina apenas como mostrado na equação abaixo: , em que o controle do inibidor é o cAMP produzido na presença de PYY3-36 humano de excesso adicionado, a Resposta Máxima é o cAMP produzido na presença de apenas forscolina e Peptídeo é o cAMP produzido na presença do peptídeo de teste.

[00140] A inibição específica percentual (eixo y) é representada gra- ficamente contra a concentração do competidor (eixo x) e analisada usando uma rotina de regressão não linear de quatro parâmetros (topo da curva, fundo da curva, CI50, inclinação de Hill) (Genedata Screener, versão 13.0.5, Genedata AG, Basal, Suíça) conforme definida abaixo: .

[00141] O valor de CI50 relativo representa a concentração que cau- sa 50% de inibição de produção de cAMP induzida por forscolina.

[00142] Valores relatados para CI50 são calculados como a média geométrica conforme mostrada abaixo: .

[00143] Erro padrão da média (SEM) é calculado usando o método delta conforme mostrado abaixo: , em que DP é o desvio padrão, n é o número de séries independentes, e ln(10) é o logaritmo natural de 10. Resultados: Tabela 2: Atividade in vitro de cAMP no receptor hNPY2. Peptídeo hNPY2R CE50 (nM) PYY1-36 0,12 PYY3-36 0,15 Exemplo 1 0,07 Exemplo 2 1,23 Exemplo 3 0,15 Exemplo 4 0,06 Exemplo 5 0,55 Ref. 1* 0,30 Ref. 2* 0,23 Ref. 3* 0,32

* Análogo de PYY conhecido para comparação; ver, Publicação do pedido de patente internacional nº. WO 2016/198682, em que Ref. 1 corresponde ao Composto 4 nesta, Ref. 2 corresponde ao Composto 21 nesta, e a Ref. 3 corresponde ao Composto 32.

[00144] Conforme mostrado acima, os resultados a partir do ensaio de cAMP demonstram a atividade funcional dos análogos de PYY dos Exemplos 1-5 no receptor hNPY2, com o Exemplo 2 mostrando a po- tência mais fraca em potência 12 vezes inferior versus PYY3-36 huma- no. (3) Atividade in vitro de GTPS no receptor hNPR2 Propósito:

[00145] Avaliar a ativação mediada por receptor de proteínas G pe- los análogos de PYY dos Exemplos 1 a 5. A ativação mediada por re- ceptor pode ser medida usando o análogo de GTP não hidrolisável, GTP[35S]. A estimulação mediada por agonista de receptores acopla- dos à proteína G resulta na ativação de complexos heterotriméricos de proteína G associados à membrana. Isso representa uma primeira etapa na transdução de sinais extracelulares para modificar as vias intracelulares. Aqui, um ensaio funcional de GTP[35S] é usado para avaliar a potência de vários análogos de PYY no receptor hNPY2. Métodos:

[00146] Análogos de PYY, PYY1-36 humano (ID SEQ NO: 1) e PYY3- 36 peptídeo de controle (ID SEQ NO: 2) são sintetizados, caracteriza- dos e armazenados conforme descritos acima no ensaio de ligação ao receptor.

[00147] Para cada peptídeo de teste, as curvas de resposta à con- centração (CRC) com diluições logarítmicas de 1/3 (concentrações lo- garítmicas de -6,52 a -12,52) são concluídas com um manipulador de líquido Hamilton NIMBUS em tampão de ensaio (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, MgCl2 6 mM, EDTA 1 mM) suplementado com baci-

tracina a 0,2% (U.S.

Biologicals no. 11805) e DMSO a 0,5%. As con- centrações do ensaio final de Bacitracina e DMSO são de 0,05% e 0,125%, respectivamente.

Membranas de hNPY2R (Multispan no.

HTS066M) são preparadas a uma concentração de 7,5 ug/mL em tampão de ensaio suplementado com GDP 20 uM (Sigma no.

G-7127) e 6 ug/mL de saponina (Sigma no.

S-4521) e membranas de hNPY2R são incubadas sob temperatura ambiente durante 20 minutos antes de adição ao ensaio.

GTPS[35S] (PerkinElmer no.

NEG030H) é prepara- do em tampão de ensaio a uma concentração de 0,6 nM.

Contas de WGA SPA (PerkinElmer no.

RPNQ0001) são preparadas sob concen- tração de 12 mg/mL em tampão de ensaio.

O ensaio é realizado em uma placa de 96 poços (Costar no. 3604) adicionando primeiro 100 uL às membranas de hNPY2R, em seguida 50 uL de solução de CRC, em seguida 50 uL de solução de GTPS[35S] para um volume final de 200 uL.

A placa é coberta e colocada em um agitador orbital (175 rpm por 45 minutos) sob temperatura ambiente.

Em seguida, 25 uL de contas de SPA são adicionados e a placa é selada novamente e agitada em vórtice para misturar, em seguida, colocada de volta no agitador orbital por 3 horas em temperatura ambiente.

A placa é então centrifugada por 5 minutos a 500 rpm e contada em um contador de microplacas PerkinElmer 2450 durante 1 minuto por poço.

A ligação basal (CPM) é determinada na ausência de análogo de PYY ou PYY3-36 humano e é usada para calcular uma porcentagem acima do valor basal para cada concentração de peptídeo com a seguinte equação: (análogo de PYY ou PYY3-36 humano, CPM - CPM basal) /(CPM basal)*100. Os valores de CE50 (nM) são determinados submetendo o logaritmo das concen- trações e a porcentagem dos valores basais à análise de regressão não linear (log (agonista) versus resposta - inclinação variável (quatro parâmetros)) em GraphPad Prism 7.0 usando a equação: Y = Fundo + (Topo - Fundo) /(1 + 10^((LogCE50-X)*Inclinação de Hill)). A média ge-

ométrica e o erro padrão da média são calculados a partir dos valores de CE50 (nM) usando a função estatística da coluna em GraphPad Prism 7.0. Resultados: Tabela 3: Atividade in vitro de GTPS no receptor hNPY2. Peptídeo hNPY2R CE50 (nM) PYY1-36 0,42 PYY3-36 0,43 Exemplo 1 0,08 Exemplo 2 1,83 Exemplo 3 0,06 Exemplo 4 0,04 Exemplo 5 0,16 Ref. 1* 0,22 Ref. 2* 0,13 Ref. 3* 0,11 * Análogo de PYY conhecido para comparação; ver, Publicação do pedido de patente internacional nº WO 2016/198682, em que Ref. 1 corresponde ao Composto 4 nesta, Ref. 2 corresponde ao Composto 21 nesta, e a Ref. 3 corresponde ao Composto 32 nesta.

[00148] Conforme mostrado acima, resultados do ensaio funcional GTP[35S] demonstram a atividade dos análogos de PYY no receptor hNPY2, com o Exemplo 2 mostrando a potência mais fraca em potên- cia 4 vezes inferior versus PYY3-36 humano. (4) Farmacocinética Propósito:

[00149] Investigar as propriedades farmacocinéticas dos análogos de PYY. Métodos:

[00150] CL/EM - As concentrações plasmáticas de vários análogos de PYY são determinadas por métodos de CL/EM. Os métodos me- dem todo o composto; peptídeo mais extensão de tempo de ligação. Para o ensaio, os análogos de PYY e um padrão interno são extraídos a partir de plasma de camundongo, rato ou macaco (50 µL) usando metanol com ácido fórmico a 0,1%. As amostras são centrifugadas e o sobrenadante é transferido para uma Placa de Precipitação de Proteí- na Thermo. As amostras são carregadas em uma Placa µEluição Sep- Pak tC18 SPE que é condicionada com metanol e ácido fórmico a 0,1% em água. As colunas SPE são lavadas duas vezes com ácido fórmico a 0,1% em água. Os compostos são em seguida eluídos usando ácido fórmico/água/acetonitila (0,1:15:85), os quais são então secos e reconstituídos antes de injetar uma alíquota (10 µL) em uma coluna de armadilha Thermo Acclaim PepMap100 C18, 300 µm x 5 mm e Thermo Easy Spray PepMap C18, coluna de 75 µm x 15 cm pa- ra análise de CL/EM. O efluente da coluna é direcionado para um es- pectrômetro de massa Thermo Q-Exactive Plus para detecção e quan- tificação.

[00151] Farmacocinética de análogos de PYY em camundongos CD-1 - A farmacocinética plasmática dos análogos de PYY é avaliada em camundongos CD-1 machos após uma dose subcutânea única de 200 nmol/kg. Amostras de sangue são coletadas de 2 animais por pon- to de tempo ao longo de 168 horas. Uma vez que a amostragem não serial é usada para avaliar a cinética dos análogos de PYY em ca- mundongos, os dados de concentração média versus tempo são usa- dos para tabular os parâmetros farmacocinéticos para os análogos de PYY após uma dose única subcutânea de 200 nmol/kg. As concentra- ções plasmáticas de análogos de PYY são detectadas ao longo de 120 horas após uma única administração subcutânea de 200 nmol/kg.

[00152] Farmacocinética de análogos de PYY em ratos SD - A far- macocinética plasmática dos análogos de PYY é avaliada em ratos

Sprague Dawley machos após uma dose única subcutânea de 50 nmol/kg. Amostras de sangue são coletadas de 2 animais por ponto de tempo ao longo de 168 horas. Uma vez que a amostragem em série foi usada para avaliar a cinética dos análogos de PYY em ratos, dados de concentração animal individual versus tempo foram usados para tabu- lar os parâmetros farmacocinéticos para os análogos de PYY após uma dose única subcutânea de 50 nmol/kg. As concentrações plasmá- ticas de análogos de PYY são detectadas ao longo de 120 horas após uma única administração subcutânea de 50 nmol/kg.

[00153] Farmacocinética de análogos de PYY em macacos cinomo- lgos - A farmacocinética plasmática dos análogos de PYY é avaliada em macacos cinomolgos machos e fêmeas após uma dose única sub- cutânea de 50 nmol/kg. Amostras de sangue são coletadas ao longo de 504 horas. Uma vez que a amostragem em série é usada para ava- liar a cinética dos análogos de PYY em macacos, os dados de concen- tração animal individual versus tempo são usados para tabular os pa- râmetros farmacocinéticos para os análogos de PYY após uma dose única subcutânea de 50 nmol/kg. As concentrações plasmáticas de análogos de PYY são detectadas ao longo de 504 horas após uma única administração subcutânea de 50 nmol/kg. Resultados: Tabela 4: Parâmetros Farmacocinéticos Médios após uma dose única subcutânea a Camundongos CD-1 machos. Peptídeo Dose T1/2 (h) Tmáx. Cmáx. AUCinf CL/F (nmol/kg) (h) (nmol/L) (h*nmol/L) (mL/h/kg) Exemplo 1 200 15 6 1140 29795 6,71 Exemplo 2 200 27 12 1014 56198 3,56 Exemplo 3 200 26 12 1360 52751 3,79 Exemplo 4 200 15 12 916 31257 6,40 Abreviações: AUCinf = área sob a curva de 0 a infinito; CL/F = depura- ção dividida pela biodisponibilidade (F); Cmáx. = concentração máxima;

Tmáx. = tempo em concentração máxima; T1/2 = meia-vida. Tabela 5: Parâmetros Farmacocinéticos Médios após uma dose única subcutânea a Ratos SD machos. Peptídeo Dose T1/2 Tmáx. Cmáx. AUCinf CL/F (nmol/kg) (h) (h) (nmol/L) (h*nmol/L) (mL/h/kg) Exemplo 1 50 22 12 221 8621 5,83 Exemplo 3 50 38 12 399 21094 2,39 Exemplo 4 50 19 8 219 8289 6,41 Abreviações: AUCinf = área sob a curva de 0 a infinito; CL/F = depura- ção dividida pela biodisponibilidade (F); Cmáx. = concentração máxima; Tmáx. = tempo em concentração máxima; T1/2 = meia-vida. Tabela 6: Parâmetros Farmacocinéticos Médios após uma dose única subcutânea a Macacos Cinomolgos Peptídeo Dose T1/2 Tmáx. Cmáx. AUCinf CL/F (nmol/kg) (h) (h) (nmol/L) (h*nmol/L) (mL/h/kg) Exemplo 1 50 101 9 500 64552 0,775 Exemplo 2 50 131 18 583 123173 0,408 Exemplo 3 50 148 9 599 105839 0,509 Abreviações: AUCinf = área sob a curva de 0 a infinito; CL/F = depura- ção dividida pela biodisponibilidade (F); Cmáx. = concentração máxima; Tmáx. = tempo em concentração máxima; T1/2 = meia-vida. Resultados:

[00154] Esses dados demonstram que os compostos acima apre- sentam um perfil farmacocinético adequado para administração uma vez por semana. (5) Solubilidade e Estabilidade Propósito:

[00155] Determinar as faixas de pH solúvel e estabilidade dos aná- logos de PYY. Métodos:

[00156] Avaliação da faixa de solubilidade visual - Pós de análogos de PYY liofilizados são reconstituídos em água sob concentrações de 4 mg/mL, e o pH é ajustado com ácido cítrico/tampão fosfato em pH 4. O pH do sistema é titulado acima com NaCl 0,5 N a pH 8 e em seguida titulado abaixo com HCl 0,5 N a pH 4.

[00157] Avaliação da estabilidade térmica - soluções de análogos de PYY em fosfato de sódio 10 mM ou 20 mM, pH 7,0 sob concentra- ção de 1 mg/mL ou de 2 mg/mL são preparadas e incubadas a 4˚C e 40˚C por 4 semanas. As amostras no ponto de tempo de 4 semanas são analisadas por meio de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e RP-HPLC.

[00158] Método SEC - realizado usando um TOSOH TSKgelG2000SWxl, 7,8 mm ID x 30 cm, coluna de 5 µm, com compo- sição de fase móvel de fosfato de sódio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,0 com acetonitrila a 20% durante 30 minutos com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/minuto,  - 214 nm.

[00159] Método RP - realizado usando uma coluna Cortecs C18, 2,7 µm, 4,6 x 50 mm, acetonitrila a 20% - 45%/água com TFA a 0,085% durante 10 minutos com uma taxa de fluxo de 1 mL/minuto,  - 214 nm. Resultados: Tabela 7: Solubilidade e Estabilidade Térmica dos Análogos de PYY. Peptídeo Solubilidade Estabilidade Térmica (Fosfato 10 ou 20 mM, (faixa de pH 7,0) pH) RP % de Pico Princi- SEC % de Pico Princi- pal pal 4°C 40°C 4°C 40°C Exemplo 1 > 5,7 95,8 92,9 98,9 95,7 Exemplo 2 > 5,5 99,7 99,3 99,9 99,6 Exemplo 3 > 6,1 99,5 97,1 95,2 92,4 Exemplo 4 > 6,8 96,8 97,5 99,6 98,7 Exemplo 5 > 5,8 96,8 95,2 99,7 97,5

[00160] Conforme mostrado acima, todos os peptídeos são solúveis em pH > 7,0. A estabilidade, conforme avaliada por RP e SEC, sugere que esses peptídeos sejam relativamente estáveis sob o estresse tér- mico agressivo. Exemplo 7: Efeitos in vivo de PYY. (1) Efeitos in vivo em ingestão de alimentos e pesos corporais em camundongos normais. Propósito:

[00161] Comparar o efeito dos análogos de PYY dos Exemplos 1 a 5 para reduzir peso corporal e suprimir ingestão de alimentos em ca- mundongos normais após uma única injeção. Métodos:

[00162] Camundongos C57B1/6 machos de Envigo RMS (Indiana- polis, IN) são mantidos em uma dieta alimentar (5008; LabDiet, St. Louis, MO) e alojados individualmente em uma instalação de tempera- tura controlada (74,0°F; 23,3°C) com um ciclo de luz normal de 12:12 horas e livre acesso a alimentos e água. Em 9-10 semanas de idade, os pesos corporais sem jejum e os pesos iniciais dos alimentos são registrados, e os animais são administrados com uma única injeção subcutânea de veículo ou peptídeo, seguida por medições diárias de peso corporal e ingestão de alimentos por 3 dias após a dose. A análi- se da área sob a curva (AUC) é calculada tanto para o peso corporal quanto para a ingestão de alimentos em relação ao veículo. O Exem- plo 4 a 30 nmol/kg é usado como referência de eficácia de 100% para o peso corporal e ingestão de alimentos em cada execução do ensaio. Resultados:

Tabela 8: Alterações em Peso Corporal e Ingestão de alimentos duran- te 3 dias em camundongos C57/B16 após uma dose única de análogo de PYY. Peptídeo Dose (nmol/kg, Δ Peso Corporal Δ Ingestão de SC) (%)** Alimento (%)** Exemplo 1 30 89 103 100 108 105 Exemplo 2 100 71 71 300 117 78 Exemplo 3 30 98 93 100 111 100 Exemplo 4 3 22 12 10 41 48 30 100 100 Exemplo 5 100 70 99 300 129 118 Ref. 1* 100 87 79 300 127 104 Ref. 2* 100 62 67 300 110 85 Ref. 3* 100 50 78 300 104 99 * Análogo de PYY conhecido para comparação; ver, Publicação do pedido de patente internacional nº WO 2016/198682, em que Ref. 1 corresponde ao Composto 4 nesta, Ref. 2 corresponde ao Composto 21 nesta, e a Ref. 3 corresponde ao Composto 32. ** Exemplo 4 a 30 nmol/kg (AUCs) definido como 100% de eficácia

[00163] Conforme mostrado acima, as reduções no peso corporal e na ingestão de alimentos demonstram a eficácia dos análogos de PYY in vivo, em que as comparações em doses necessárias para a eficácia total demonstram melhorias na eficácia. (2) Efeitos in vivo em ingestão de alimentos e pesos cor-

porais em camundongos obesos induzidos por dieta. Propósito:

[00164] Investigar o efeito da dosagem diária dos análogos de PYY dos Exemplos 1-5 para reduzir o peso corporal, isolado ou em combi- nação com um agonista do receptor de GLP-1, ao longo de um perío- do de duas semanas em camundongos obesos induzidos por dieta (DIO). Métodos:

[00165] Camundongos C57Bl/6 machos DIO (Taconic) com 20 se- manas de idade são mantidos em uma dieta de 60% de gordura na chegada (D12492; Research Diets, New Brunswick, NJ). Os animais são alojados individualmente em instalações com temperatura contro- lada (74,0°F; 23,3°C) com um ciclo claro/escuro de 12 horas (luzes às 22:00) e livre acesso a alimento e água. Após um período de aclimata- ção de uma semana de dosagem diária de veículo, os pesos corporais sem jejum são medidos e os animais são randomizados pelo peso corporal em grupos experimentais (n = 6) e administradas injeções subcutâneas diárias de veículo, um agonista do receptor de GLP-1 (GLP-1 RA; ID SEQ NO: 15), análogos de PYY ou combinações de análogos de PYY mais o GLP-1 RA. Após 2 semanas de dosagem, os pesos corporais sem jejum são registrados e as alterações no peso corporal médio em relação ao veículo são calculadas. Para determinar os efeitos aditivos ou sinérgicos de análogos de PYY em combinação com um GLP-1 RA, é calculada a eficácia acima daquela do GLP-1 RA isolado (efeito líquido). Resultados:

Tabela 9: Alterações em peso corporal em um estudo de 2 semanas em camundongos obesos induzidos por dieta com análogos de PYY isolados ou em combinação com um agonista do receptor GLP-1. Peptídeo Dose Δ Peso Corporal (%) (nmol/kg, SC) PYY Isolado PYY + GLP-1RA* Exemplo 1 1 -4 -18 3 -6 -26 10 -15 -31 Exemplo 2 3 ND -1 10 ND -6 30 2 -11 Exemplo 3 1 -3 -16 3 -6 -28 10 -23 -30 Exemplo 4 0,3 0 -3 1 -1 -12 3 -4 -17 10 -12 -21 Exemplo 5 1 -2 -2 3 0 -11 10 -2 -18 30 -3 ND *Eficácia acima daquela de um agonista do receptor GLP-1 (GLP-1 RA)

[00166] Conforme mostrado acima, reduções no peso corporal com os análogos de PYY, tanto isolados quanto em combinação com o GLP-1 RA, demonstram a eficácia dos análogos de PYY in vivo, em que as comparações são feitas na magnitude de perda de peso. (3) Efeitos in vivo em peso corporal e glicose em camun- dongos diabéticos e obesos (db/db). Propósito:

[00167] Investigar o efeito de dosagem diária dos análogos de PYY dos Exemplos 1 a 5 para reduzir o peso corporal e os níveis de glicose no sangue ao longo de um período de 10 (dez) dias em camundongos obesos e diabéticos (db/db). Métodos:

[00168] Camundongos machos Leprdb/db (db/db) de Envigo RMS (Indianapolis, IN) são mantidos em uma dieta estilo ração (5008; Lab- Diet, St. Louis, MO) e alojados 5 animais por gaiola em uma instalação de temperatura controlada (74,0°F; 23,3°C) com um ciclo de luz nor- mal de 12:12 horas e livre acesso a alimentos e água. Em 8-9 sema- nas de idade, os pesos corporais e os níveis de glicose no sangue usando glucômetros Accu-Check® (Roche Diabetes Care, Inc., India- napolis, IN) são medidos, seguidos por injeções subcutâneas diárias de veículo ou peptídeo. Após 10 dias de dosagem, os pesos corporais e os níveis de glicose no sangue são medidos e as alterações em re- lação ao tratamento com veículo são calculadas. Resultados: Tabela 10: Efeitos em peso corporal e glicose no sangue em camun- dongos db/db tratados durante 10 dias. Peptídeo Dose Δ Peso corporal Δ Glicose (nmol/kg, SC) (%) (%) Exemplo 1 1 -1 7 3 -1 -10 10 -10 -56 30 -14 -59 Exemplo 2 30 -5 -40 100 -9 -60 300 -17 -67 Exemplo 3 1 0 0 3 -5 -7 10 -9 -50 30 -15 -53

Peptídeo Dose Δ Peso corporal Δ Glicose (nmol/kg, SC) (%) (%) Exemplo 4 3 -2 -23 10 -12 -61 30 -17 -62 Exemplo 5 10 -4 -24 30 -11 -59 100 -17 -66

[00169] Conforme mostrado acima, reduções no peso corporal e nos níveis de glicose no sangue com os análogos de PYY demonstram a eficácia dos análogos de PYY in vivo, em que as comparações são feitas na magnitude de perda de peso e redução da glicose.

[00170] Em conclusão, os análogos de PYY neste relatório mostram seletividade para NPY2R. Os análogos também mostram reduções dependentes da dose no peso corporal, conforme refletido em camun- dongos normais, camundongos obesos induzidos por dieta e camun- dongos db/db, bem como melhora dependente da dose em glicose no sangue em camundongos db/db, com os análogos de PYY dos Exem- plos 1, 3 e 4 são os mais eficazes, de acordo com o perfil in vitro.

SEQUÊNCIAS ID SEQ NO: 1 – PYY1-36 humano

YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY ID SEQ NO: 2 – PYY3-36 humano

IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY ID SEQ NO: 3 – Análogo de PYY PKPEX7PX9X10DASPEEX17X18RYYX22X23LRHYLNX30LTRQRY ID SEQ NO: 4 – Análogo de PYY

PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNWLTRQRY ID SEQ NO: 5 – Análogo de PYY

PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNELTRQRY ID SEQ NO: 6 – Análogo de PYY

PKPEKPEEDASPEEWQRYYIELRHYLNWLTRQRY ID SEQ NO: 7 – Análogo de PYY

PKPEKPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY ID SEQ NO: 8 – Análogo de PYY

PKPEKPGEDASPEELQRYYASLRHYLNWLTRQRY ID SEQ NO: 9 – Análogo de PYY 3 36 ID SEQ NO: 10 – Análogo de PYY 3 36 ID SEQ NO: 11 – Análogo de PYY 3 36 ID SEQ NO: 12 – Análogo de PYY

ID SEQ NO: 13 – Análogo de PYY 3 36 ID SEQ NO: 14 – PP1-36

APLEPVYPGDNATPEQMAQYAADLRRYINMLTRPRY ID SEQ NO: 15 – GLP-1 RA

HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGGGGGSGGGGS GGGGSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

Claims (37)

REIVINDICAÇÕES

1. Análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), caracte- rizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de: PKPEX7PX9X10DASPEEX17X18RYYX22X23LRHYLNX30LTRQ RY (Fórmula I), em que X7 é qualquer aminoácido com um grupo fun- cional disponível para conjugação e o grupo funcional é conjugado com um ácido graxo C16-C22, em que X9 é E ou G, em que X10 é E ou K, em que X17 é L ou W, em que X18 é N ou Q, em que X22 é A ou I, em que X23 é E, D ou S, em que X30 é E ou W (ID SEQ NO: 3), e em que um aminoácido de término C é opcionalmente ami- dado.

2. Análogo de PYY, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que X7 é selecionado do grupo que consiste em C, D, E, K e Q.

3. Análogo de PYY, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que X7 é K e conjugação com o ácido graxo C16-C22 é por meio de um grupo épsilon-amino de uma cadeia lateral K.

4. Análogo de PYY, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos é seleciona- da do grupo que consiste em: PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNWLTRQRY (ID SEQ NO: 4); PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNELTRQRY (ID SEQ NO: 5); PKPEKPEEDASPEEWQRYYIELRHYLNWLTRQRY (ID SEQ NO: 6);

PKPEKPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY (ID SEQ NO: 7); e PKPEKPGEDASPEELQRYYASLRHYLNWLTRQRY (ID SEQ NO: 8).

5. Análogo de PYY, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo C16- C22 é selecionado do grupo que consiste em ácido hexadecanoico, ácido hexadecanodioico, ácido heptadecanoico, ácido heptadecanodi- oico, ácido esteárico, ácido octadecanodioico, ácido nonadecílico, áci- do nonadecanodioico, ácido eicosanoico, ácido eicosanodioico, ácido heneicosanoico, ácido heneicosanodioico, ácido docosanoico, ácido docosanodioico e derivados ramificados e substituídos dos mesmos.

6. Análogo de PYY, de acordo com a reivindicação 5, ca- racterizado pelo fato de que o ácido graxo C16-C22 é um ácido graxo C18-C20.

7. Análogo de PYY, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que o ácido graxo C18-C20 é um ácido graxo de cadeia normal apresentando uma fórmula de CO-(CH2)x-CO2H, e em que x é 18 ou 20.

8. Análogo de PYY, de acordo com a reivindicação 7, ca- racterizado pelo fato de que o ácido graxo C18-C20 é selecionado do grupo que consiste em ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquí- dico e ácido eicosanoico.

9. Análogo de PYY, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo C16- C22 é conjugado com o aminoácido com o grupo funcional disponível de conjugação via um ligante.

10. Análogo de PYY, de acordo com a reivindicação 9, ca- racterizado pelo fato de que o ligante pode ser uma ou mais unidades selecionadas do grupo que consiste em ácido [2-(2-amino-etoxi)- etoxi)]-acético (AEEA), ácido aminoexanoico (Ahx), ácido glutâmico

(E), ácido gama-glutâmico (E) e combinações destes.

11. Análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), caracte- rizado pelo fato de que compreende: 3 36 (ID SEQ NO:9).

12. Análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), caracte- rizado pelo fato de que compreende: 3 36 (ID SEQ NO:10).

13. Análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), caracte- rizado pelo fato de que compreende: 3 36 (ID SEQ NO:11).

14. Análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), caracte- rizado pelo fato de que compreende:

(ID SEQ NO:12).

15. Análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), caracte- rizado pelo fato de que compreende: 3 36 (ID SEQ NO:13).

16. Análogo de PYY, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que apresenta uma carga maior que -2.

17. Análogo de PYY, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que apresenta uma afinidade de ligação em um receptor NPY2 que é maior que aquela de PYY3-36 (ID SEQ NO: 2).

18. Análogo de PYY, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que apresenta uma meia-vida que é maior que aquela de PYY3-36 humano (ID SEQ NO: 2).

19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: pelo menos um análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina

(PYY), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou um sal do mesmo; e um ou mais veículos, diluentes e excipientes farmaceutica- mente aceitáveis.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 19, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agen- te terapêutico adicional.

21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 20, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicio- nal é uma incretina selecionada do grupo que consiste em glucagon (GCG), um análogo de GCG, peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), GLP-17-36-amida, um análogo de GLP-1, peptídeo inibitório gás- trico (GIP), um análogo de GIP, oxintomodulina (OXM), um análogo de OXM, um GIP/GLP-1, um GLP-1/GCG, ou um análogo de incretina apresentando atividade de receptor triplo.

22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 20, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicio- nal é um inibidor de dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV).

23. Método de tratamento de obesidade ou uma doença ou distúrbio relacionado à obesidade, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de: administrar a um indivíduo com necessidade deste, uma quantidade eficaz de um análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que o análogo de PYY ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via subcutânea (SQ) ao indiví- duo.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteri-

zado pelo fato de que o análogo de PYY ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado oralmente ao indivíduo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, ca- racterizado pelo fato de que o análogo de PYY ou sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo é administrado diariamente, a cada dois dias, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana ou quinzenalmente.

27. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que o análogo de PYY ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via subcutânea (SQ) uma vez por semana (QW).

28. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que o análogo de PYY ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado oralmente uma vez por semana.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 23 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende ainda admi- nistrar um agente terapêutico adicional.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteri- zado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é uma incretina selecionada do grupo que consiste em glucagon (GCG), um análogo de GCG, peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), GLP-17-36-amida, um análogo de GLP-1, peptídeo inibitório gástrico (GIP), um análogo de GIP, oxintomodulina (OXM), um análogo de OXM, um GIP/GLP-1, um GLP-1/GCG, ou um análogo de incretina apresentando atividade de receptor triplo.

31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteri- zado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um inibidor de dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV).

32. Uso de um análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o uso é para tratamento de obesidade.

33. Uso de um análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o uso é para tratamento de uma doença ou distúrbio relaciona- do à obesidade.

34. Uso de um análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o uso é para tratamento de diabetes melito tipo II.

35. Uso de um análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o uso é para produção de um medicamento para tratamento de obesidade.

36. Uso de um análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o uso é para produção de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado à obesidade.

37. Uso de um análogo de Peptídeo Tirosina-Tirosina (PYY), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o uso é para produção de um medicamento para tratamento de diabetes melito tipo II.