CN112888705A

CN112888705A - 蛋白酪氨酸-酪氨酸类似物及其使用方法

Info

Publication number: CN112888705A
Application number: CN201980071360.1A
Authority: CN
Inventors: D·A·贝里尔; D·C·洛佩斯; A·马皮迪
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2021-06-01
Also published as: CL2021001073A1; KR20210071038A; AU2024205661A1; JP2022506070A; JP2023082013A; BR112021006782A2; AU2019371232B2; TW202033544A; MX2021004930A; DOP2021000072A; ECSP21030933A; IL282177A; US20220025009A1; KR20240093737A; EP3873924A1; WO2020092191A1; PH12021550964A1; JP7280949B2; KR102667979B1; US11820803B2

Abstract

公开了PYY类似物，其包含与天然人PYY相比增加半衰期的修饰，以及增加对NPY2受体的功效和选择性的额外修饰。还公开了药物组合物，其在药学上可接受的载体中包含本文所述的一种或多种PYY类似物。还公开了制备和使用所述PYY类似物的方法，尤其用于治疗肥胖和肥胖相关的疾病和病症(诸如II型糖尿病)。

Description

蛋白酪氨酸-酪氨酸类似物及其使用方法

本公开总体涉及生物学和医学，且更具体地，其涉及可以结合神经肽Y(NPY)受体(诸如NPY2受体)的肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物以及包含其的组合物及其在治疗肥胖和肥胖相关的疾病和病症(诸如II型糖尿病(T2DM))中的治疗用途。

PYY是胰腺多肽(PP)家族的成员并参与调节餐后的食物摄入和能量消耗(参见，Tatemoto (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:2514-2518)。PYY由胃肠道的L细胞分泌并具有两种主要内源性形式-PYY_1-36(SEQ ID NO:1)和PYY_3-36(SEQ ID NO:2)。在禁食期间，PYY_1-36相比于PYY_3-36占优势，而在进食后，PYY_3-36相比于PYY_1-36占优势。二肽基肽酶-IV(DPP-IV)水解PYY_1-36的Pro²-Ile³键以产生PYY_3-36，其对NPY2受体比对PYY_1-36更有选择性。

血浆PYY_3-36浓度通常在食物摄入的15分钟内增加，在60-90分钟内达到峰值，并在长达6小时保持升高，然后返回至基线(参见Adrian等人(1985) Gastroenterology 89:1070-1077; 和De Silva & Bloom (2012) Gut Liver 6:10-20)。以该方式，据信PYY_3-36经由其直接中枢作用以及经由其对肠蠕动的效应(即，其厌食效应)影响食欲。另外，据信PYY_3-36介导胰岛素敏感性以由此帮助降低血液葡萄糖(即，其敏化效应)。

鉴于PYY_3-36的厌食效应，PYY_3-36已经作为体重调节的潜在治疗剂进行研究，特别是用于治疗肥胖和其相关疾病和病症，包括T2DM和心血管疾病(参见，例如，国际专利申请公开号2002/47712；和Schwartz & Morton (2002) Nature 418:595-597)。

不幸地，由于蛋白酶和其他清除机制，外源施用的PYY_3-36具有短的半衰期(例如，约10-15分钟)(参见，Lluis等人(1989) Rev. Esp. Fisiol. 45:377-384; 和Torang等人(2016) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 310:R866-R874)，其在将其用作治疗剂时成为挑战。由于这种短的半衰期，PYY_3-36应当每天至少一次施用以发挥治疗作用，其对于有此需要的个体是不方便的。因此，已经做出努力以增加PYY_3-36的半衰期和/或增加其NPY2受体选择性。例如，Rubinstein等人描述了具有9-芴基甲氧基-羰基(Fmoc)或2-磺基-9-芴基-甲氧基羰基(FMS)基团以增加半衰期的PYY类似物(参见，国际专利申请公开号WO 2004/089279)。此外，DeCarr等人描述了具有氨基末端连接的PEG部分以增加半衰期的PYY类似物(参见，DeCarr等人(2007) Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:1916-1919; 也参见, Ortiz等人 (2007) J. Pharmacol. Exp. Ther. 323:692-700)。此外，Kofoed等人描述了具有白蛋白结合侧链、接近PYY的切割位点的至少一个修饰的基团(例如目标氨基酸残基的N-甲基氨基酸类似物)、N-甘氨酸和/或精氨酸模拟物以增加半衰期的PYY类似物(参见，国际专利申请公开号WO 2011/033068)。

尽管对PYY_3-36在代谢中的作用的理解显著增加，但仍需要额外的PYY类似物，尤其是在NPY2受体具有增强的功效和选择性的PYY类似物。

如上所示，需要用于治疗用途的额外PYY类似物。为了解决该需求，本公开首先描述PYY类似物，其包括以下的基础氨基酸序列(相对于天然人PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)的编号)：

(式I)，

其中X₇是具有可用于缀合的官能团的任何氨基酸且所述官能团缀合至C₁₆-C₂₂脂肪酸，X₉是E是G，X₁₀是E是K，X₁₇是L是W，X₁₈是N是Q，X₂₂是A是I，X₂₃是E、D是S，且X₃₀是E是W (SEQID NO:3)，且其中羧基-末端(C-末端)氨基酸任选地被酰胺化。

在某些情况下，具有可用于位置X₇的缀合的官能团的氨基酸可以是C、D、E、K或Q。在具体情况下，具有可用于位置X₇的缀合的官能团的氨基酸是K，且所述氨基酸序列可以是以下之一：

或

。

在一些情况下，C₁₆-C₂₂脂肪酸缀合至具有可用于经由接头缀合的官能团的氨基酸。在某些情况下，C₁₆-C₂₂脂肪酸具有-CO-(CH₂)_a-CO₂H的结构，其中_a是16至22之间的整数。在具体情况下，所述脂肪酸是C₁₈二酸或C₂₀二酸，诸如棕榈酸、硬脂酸、花生酸或二十烷酸，尤其是饱和C₁₈二酸或C₂₀二酸。同样，且在一些情况下，所述接头可以是[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基)]-乙酸(AEEA)、氨基己酸(Ahx)、谷氨酸(E)、γ-谷氨酸(γE)或其组合的一个或多个单元。

在具体情况下，所述PYY类似物可以是以下之一：

在一些情况下，本文的PYY类似物的基础结构可以进一步包含天然人PYY_1-36(SEQID NO:1)的两个氨基末端(N-末端)氨基酸，其随后可以在体内处理为PYY_3-36类似物(即，SEQ ID NO:1的N-末端“YP”残基可以从PYY类似物的任何一者体内切割)。

在一些情况下，所述PYY类似物具有大于-2、尤其是-3或-4的电荷。

在一些情况下，所述PYY类似物在人NPY2受体的结合亲和力比人PYY_3-36 (SEQ IDNO:2)的结合亲和力更大，诸如大约2倍至大约10倍，尤其是大约2倍至大约3倍。

在一些情况下，所述PYY类似物具有的半衰期比人PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)的半衰期更长，诸如长约5小时至约24小时，尤其是约12小时。

第二，描述了药物组合物，其包含至少一种本文的PYY类似物或其药学上可接受的盐(例如，三氟乙酸盐、乙酸盐或盐酸盐)和药学上可接受的载体。在一些情况下，所述药物组合物可以进一步包含载体、稀释剂和/或赋形剂。

此外，所述药物组合物可以包含额外的治疗剂，诸如例如其他抗糖尿病药或减肥药，尤其是肠促胰岛素。在一些情况下，所述肠促胰岛素可以是胰高血糖素(GCG)或GCG类似物。在其他情况下，所述肠促胰岛素可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、GLP-1 (7-36)_酰胺或GLP-1类似物。在其他情况下，所述肠促胰岛素可以是胃抑制肽(GIP)或GIP类似物。在其他情况下，所述肠促胰岛素可以是双重受体激动剂，诸如泌酸调节肽(OXM)或OXM类似物、GLP-1/GCG或GIP/GLP-1。在其他情况下，所述肠促胰岛素可以是具有三重受体活性的肠促胰岛素类似物(即，在GIP、GLP-1和GCG受体各自具有活性的肠促胰岛素类似物)。在其他情况下，所述额外治疗剂可以是DPP-IV抑制剂。

第三，描述了使用本文的PYY类似物、尤其是使用PYY类似物以治疗肥胖和肥胖相关的疾病和病症(诸如T2DM)的方法。所述方法至少包括向有此需要的个体施用有效量的如本文所述的PYY类似物或其药学上可接受的盐的步骤。

在一些情况下，所述PYY类似物可以皮下(SQ)施用于所述个体。同样，且在一些情况下，所述PYY类似物可以每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次(即，每周)、每两周(即，每隔一周)或每月施用。在某些情况下，所述PYY类似物可以每隔一天SQ、每周三次SQ、每周两次SQ、每周一次SQ、每隔一周SQ、或每月一次SQ施用。在具体情况下，所述PYY类似物每周一次(QW) SQ施用。

或者，所述PYY类似物可以经口施用于所述个体。如上，所述PYY类似物可以每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次(即，每周)、每两周(即，每隔一周)或每月施用。在某些情况下，所述PYY类似物可以每隔一天经口、每周三次经口、每周两次经口、每周一次经口、每隔一周经口、或每月一次经口施用。在具体情况下，所述PYY类似物每周一次经口施用。

所述方法还可以包括施用至少一种PYY类似物与有效量的额外治疗剂(诸如DPP-IV抑制剂或肠促胰岛素(例如，GCG或GCG类似物、GLP-1、GLP-1 (7-36)_酰胺或GLP-1类似物、GIP或GIP类似物、OXM或OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG或具有三重受体活性的肠促胰岛素))的组合。所述DPP-IV抑制剂或肠促胰岛素可以与所述PYY类似物同时、分开或依次施用。

在一些情况下，所述DPP-IV抑制剂或肠促胰岛素可以以与所述PYY类似物相同的频率(即，每隔一天、每周两次、或甚至每周)施用。在其他情况下，所述DPP-IV抑制剂或肠促胰岛素以不同于所述PYY类似物的频率施用。在其他情况下，所述DPP-IV抑制剂或肠促胰岛素QW施用。在还有其他情况下，所述PYY类似物SQ施用，且所述DPP-IV抑制剂或肠促胰岛素可以经口施用。

在一些情况下，所述个体是肥胖或过重的。在其他情况下，所述个体是具有糖尿病(PwD)、尤其是T2DM的人。在某些情况下，所述个体是肥胖伴有T2DM或过重伴有T2DM。

所述方法还可以包括步骤，诸如测量或获得个体的重量和/或血液葡萄糖和/或血红蛋白A1c (HbA1c)并将此类获得的值与一个或多个基线值或先前获得的值进行比较以评价治疗的有效性。

所述方法也可以与饮食和运动组合和/或可以与出了上面讨论的那些以外的额外治疗剂组合。

第四，描述了本文的PYY类似物在治疗肥胖和肥胖相关的疾病和病症(诸如T2DM)中的用途，其任选地可以与DPP-IV抑制剂和/或肠促胰岛素(诸如GCG或GCG类似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_酰胺或GLP-1类似物、GIP或GIP类似物、OXM或OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或甚至具有三重受体活性的肠促胰岛素)同时、分开或依次(即，组合)施用。

第五，描述了本文的PYY类似物在制备用于治疗肥胖和肥胖相关的疾病和病症(诸如T2DM)的药物中的用途，其中所述药物任选地进一步包含DPP-IV抑制剂和/或肠促胰岛素(诸如GCG或GCG类似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_酰胺或GLP-1类似物、GIP或GIP类似物、OXM或OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或甚至具有三重受体活性的肠促胰岛素)。

本文的PYY类似物的一个优点是它们不仅可以促进重量减轻而且可以降低葡萄糖。以该方式，个体(特别是易感或患有T2DM的那些)可以延迟进展至外源胰岛素并可以维持靶HbA1c目标。此外，本文的PYY类似物可以通过改善胰岛素敏化来增强血糖控制。组合的GIP/GLP-1和PYY类似物可用于葡萄糖控制(肠促胰岛素+潜在胰岛素敏化剂)和重量减轻(协同)。具体而言，本文的PYY类似物当施用于有此需要的个体时可以仅引起高达约12%的重量减轻并当结合额外治疗剂(诸如肠促胰岛素)施用于有此需要的个体时可以引起高达约25%的重量减轻。

本文的PYY类似物的另一个优点是它们可以具有高达约24小时的半衰期，由此允许每周一次施用。

本文的PYY类似物的另一个优点是它们具有当与天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)相比时增加的物理化学稳定性和相容性、和当与天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)相比时在具有肠促胰岛素的制剂中的增加的相容性。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管类似于或相当于本文所述的方法和材料的任何方法和材料可用于实践或测试PYY类似物、药物组合物和方法，但优选的方法和材料描述于本文中。

此外，通过不定冠词“一个/种(a或an)”对一个/要素的提及并不排除存在多于一个/种要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个/种且仅存在一个/种要素。因此，不定冠词“一个/种(a或an)”通常意指“至少一个/种”。

定义

如本文所用，“约”意指在一个或多个值，诸如例如指定浓度、长度、分子量、pH、序列同一性、时间长度、温度、体积等的统计上有意义的范围内。这种数值或范围可在给定数值或范围的通常20%内、更通常10%内和甚至更通常5%内的量级内。“约”涵盖的容许偏差将取决于受研究的特定系统，并且可以是本领域技术人员容易认识到的。

如本文所用，“氨基酸”意指从化学观点来看特征在于存在一个或多个胺基和一个或多个羧酸基且可以含有其他官能团的分子。如本领域中已知，存在一组二十种氨基酸，其被指定为标准氨基酸并用作由任何生物产生的大多数肽/蛋白的构建嵌段。

如本文所用，“具有可用于缀合的官能团的氨基酸”意指具有可借助例如接头缀合至脂肪酸的官能团的任何天然或非天然氨基酸。此类官能团的实例包括但不限于炔基、烯基、氨基、叠氮基、溴、羧基、氯、碘和硫醇基团。此外，包括此类官能团的天然氨基酸的实例包括C(硫醇)、D(羧基)、E(羧基)、K(氨基)和Q(酰胺)。

如本文所用，“类似物”意指活化靶受体并引发天然激动剂对该受体引发的至少一种体内或体外效应的化合物，诸如合成肽或多肽。

如本文所用，“厌食效应”意指本文的PYY类似物降低食欲、导致较低的食物消耗并最终导致重量减轻的能力。厌食效应也可指本文的PYY类似物增加肠蠕动的能力。

如本文所用，“C₁₆-C₂₂脂肪酸”意指具有16至22个碳原子的羧酸。适于本文使用的C₁₆-C₂₂脂肪酸可以是饱和单酸或饱和二酸(“二酸”在每个末端具有羧基基团)。

如本文所用，“AUC”意指曲线下面积。

如本文所用，“有效量”意指在单剂或多剂施用于有此需要的个体后，在被诊断或治疗的这种个体中提供期望作用(即，可以产生个体的病况的临床上可测量的差异，诸如例如血液葡萄糖的降低、HbA1c的降低和/或重量或体脂肪的降低)的一种或多种本文的PYY类似物或其药学上可接受的盐的量、浓度或剂量。本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果容易确定有效量。在确定对个体而言有效的量时，考虑许多因素，包括但不限于哺乳动物的物种，其体型、年龄和总体健康状况，涉及的特定疾病或病症，疾病或病症的程度或涉及或严重程度，个体的应答，施用的特定PYY类似物，施用模式，施用的制剂的生物利用度特征，所选的剂量方案，伴随药物治疗的使用，和其他相关情况。

如本文所用，“半数最大有效浓度”或“EC₅₀”意指导致测定终点(诸如剂量-响应曲线(例如，cAMP))的50%活化/刺激的化合物浓度。

如本文所用，“与…组合”意指与一种或多种额外治疗剂同时、依次或在单一组合制剂中施用本文的PYY类似物中的至少一种。

如本文所用，“肠促胰岛素类似物”意指与GIP、GLP-1、GCG和OXM、尤其是天然人GIP、GLP-1、GCG和OXM中的每一种具有结构相似性但存在多个差异的肽或多肽。一些肠促胰岛素类似物也具有对GIP、GLP-1和GCG受体中的两者或甚至每一种的亲和力和在GIP、GLP-1和GCG受体中的两者或甚至每一种的活性(即，在诸如OXM、GIP/GLP-1或GLP-1/GCG中的两种受体的激动剂活性、或甚至在所有三种受体的激动剂活性)。

如本文所用，“有此需要的个体”意指具有需要治疗或疗法的病况、疾病、病症或症状，包括例如本文中列举的那些的哺乳动物，诸如人。具体而言，待治疗的优选个体是人。

如本文所用，“长效”意指本文的PYY类似物的结合亲和力和活性比天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)和/或天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)持续更长的时间段，允许至少以每天一次或甚至每周三次、每周两次、每周一次或每月的频率给药。本文的PYY类似物的时间作用概况可以使用已知的药代动力学测试方法(诸如以下实施例中描述的那些)来测量。

如本文所用，“非标准氨基酸”意指可天然存在于细胞中、但不参与肽合成的氨基酸。非标准氨基酸可以是肽的成分并经常通过修饰肽中的标准氨基酸(即，经由翻译后修饰)来生成。非标准氨基酸可以包括D-氨基酸，其具有与上述标准氨基酸相反的绝对手性。

如本文所用，“肥胖的”或“肥胖”意指其中个体的身体质量指数(BMI)为＞30.0kg/m²的状况。总体参见，疾病控制和预防中心的“Overweight & Obesity”，其可在cdc.gov/obesity/adult/defining.html得到；和国立卫生研究院的“Definitions &Facts for Adult Overweight & Obesity”，其可在iddk.nih.gov/health-information/weight-management/adult-overweight-obesity/definition-facts得到。

如本文所用，“肥胖相关的疾病或病症”意指由肥胖引起/加重的任何疾病或病症，包括但不限于心绞痛、心血管疾病、胆囊炎、胆石病、充血性心力衰竭、血脂异常、脂肪肝病、生育并发症、葡萄糖耐受不良、痛风、高血压、甲状腺功能低下、高胰岛素血症、胰岛素抗性、骨关节炎、多囊卵巢综合征(PCOS)、妊娠并发症、心理障碍、睡眠呼吸暂停和其他呼吸道问题、压力性尿失禁中风、T2DM、尿酸肾结石(肾结石)、和乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、肾癌、前列腺癌和直肠癌。

如本文所用，“过重”意指其中个体的BMI为约25.0 kg/m²至＜30 kg/m²的状况。参见，同上。

如本文所用，“PYY”意指获得自或源自任何物种(诸如哺乳动物物种，尤其是人)的肽YY。PYY包括天然PYY(即，全长)和其变体(即，天然PYY的添加、缺失和/或取代)。特定的PYY包括但不限于天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)和天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)。

如本文所用，“一种或多种PYY类似物”意指在一个或多个NPY受体(诸如NPY2受体)引发天然PYY中的一种或多种作用的PYY-样肽或多肽。在一些情况下，当与天然PYY，尤其是人PYY，诸如天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)和天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)相比时，本文的PYY类似物可以更高或更低的亲和力结合NPY受体，尤其是人NPY2受体，但证实有更长的体内或体外半衰期。以该方式，本文的PYY类似物是充当NPY2受体激动剂的合成化合物。

如本文所用，“饱和”意指脂肪酸不含碳-碳双键或三键。

如本文所用，“敏化效应”意指本文的PYY类似物增加胰岛素的作用并由此帮助降低血液葡萄糖的能力。

如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(to treat)”意指减弱、抑制、逆转、减缓或停止现有病况、疾病、病症或症状的进程或严重程度。

某些缩写定义如下：“ACR”是指尿白蛋白/尿肌酸酐比率；“amu”是指原子质量单位；“tBoc”是指叔丁氧基羰基；“cAMP”是指环状单磷酸腺苷；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲基亚砜；“EIA/RIA”是指酶免疫测定/放射免疫测定；“hr”是指小时；“HTRF”是指均匀时间解析荧光；“IV”是指静脉内；“kDa”是指千道尔顿；“LC-MS”是指液相色谱-质谱法；“MS”是指质谱法；“OtBu”是指O-叔丁基；“Pbf”是指NG-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；“RP-HPLC”是指反相高效液相色谱；“SQ”是指皮下；“SEM”是指平均值标准误差；“TFA”是指三氟乙酸；且“Trt”是指三苯甲基(Trityl)。

PYY类似物

本文的PYY类似物与天然PYY肽具有结构相似性，但存在许多结构差异。例如，当与天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)和/或天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)相比时，本文所述的PYY类似物包括在相对于天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)的编号的位置3、7、9、10、17、18、22、23、30和31中的一个或多个处的修饰。在某些情况下，本文的PYY类似物的示例性氨基酸序列包括(相对于天然人PYY (SEQ ID NO:1)的对应的残基的特定变化呈粗体)：

和

。

本文的PYY类似物导致在人NPY2受体的活性足够，但在NPY1、NPY4和NPY5受体的活性不足。同样，本文的PYY类似物具有与它们作为治疗处理的可发展性(developability)相关的有益属性，包括在水溶液中的溶解度提高、化学和物理制剂稳定性提高、药代动力学概况延长和免疫原性潜力最小化。

在一些情况下，本文的PYY类似物在C-末端氨基酸酰胺化以影响稳定性。除了本文所述的变化以外，所述类似物可以包括一种或多种额外氨基酸修饰，然而，条件是所述类似物保持能够结合并活化人NPY2受体。

本文的PYY类似物进一步包括例如借助接头缀合至具有可用于缀合的官能团的天然或非天然氨基酸的脂肪酸(即，“酰化”)。在一些情况下，具有可用于缀合的官能团的氨基酸可以是C、D、E、K和Q。在具体情况下，具有可用于缀合的官能团的氨基酸是K，其中缀合至K侧链的ε-氨基。

此处，当与天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)相比时，PYY类似物的酰化在位置7。以该方式，脂肪酸可以充当白蛋白结合剂以提供更长效的类似物。

关于脂肪酸，其可以通过直接键或通过接头化学缀合至可用于缀合的氨基酸的官能团。脂肪酸的长度和组成影响PYY类似物的半衰期、PYY类似物的体内功效和PYY类似物的溶解度和稳定性。缀合至C₁₆-C₂₂饱和脂肪单酸或二酸由此产生表现出期望的半衰期、期望的体内功效和期望的可溶性和稳定性特征的PYY类似物。

本文所用的示例性饱和C₁₆-C₂₂脂肪酸包括但不限于十六烷酸(即棕榈酸，C₁₆单酸)、十六烷二酸(C₁₆二酸)、十七烷酸(即margaric acid，C₁₇单酸)、十七烷二酸(C₁₇二酸)、硬脂酸(C₁₈单酸)、十八烷二酸(C₁₈二酸)、nonadecylic acid(即十九烷酸，C₁₉单酸)、十九烷二酸(C₁₉二酸)、二十烷酸(即花生酸，C₂₀单酸)、二十烷二酸(C₂₀二酸)、二十一烷酸(即heneicosylic acid，C₂₁单酸)、二十一烷二酸(C₂₁二酸)、二十二烷酸(即山嵛酸，C₂₂单酸)、二十二烷二酸(C₂₂二酸)以及它们的支化和取代衍生物。在某些情况下，C₁₆-C₂₂脂肪酸可以是饱和C₁₈单酸、饱和 C₁₈二酸、饱和C₁₉单酸、饱和C₁₉二酸、饱和C₂₀单酸、饱和C₂₀二酸及其支化和取代衍生物。在具体情况下，C₁₆-C₂₂脂肪酸可以是棕榈酸或十六烷酸、硬脂酸或十八烷二酸、或花生酸或二十烷酸。

为了帮助将脂肪酸缀合至具有可用于缀合的官能团的天然或非天然氨基酸，本文的PYY类似物可以包括接头。在一些情况下，所述接头可以是AEEA、Ahx、E或γE中的至少一种以及其组合。

当所述接头包含氨基酸时，其可以具有一至四个E或γE氨基酸残基。在一些情况下，所述接头可以包含一个或两个E和/或γE氨基酸残基。例如，所述接头可以包含一个或两个E和/或γE氨基酸残基。在其他情况下，所述接头可以包含与AEEA或Ahx组合使用的一至四个氨基酸残基(诸如，例如，E或γE氨基酸)。具体地，所述接头可以是E和γE氨基酸残基与AEEA或Ahx的组合。在还有其他情况下，所述接头可以是一个或两个γE氨基酸残基和一个或两个AEEA或Ahx的组合。在具体情况下，所述接头可以是(AEEA)2•γE部分、Ahx•E•γE部分或AEEA•γE部分。

示例性接头-脂肪酸部分可以包含(AEEA)₂•γE•C₂₀二酸、Ahx•E•γE•C₁₈二酸或AEEA•γE•C₁₈二酸。这些接头-脂肪酸部分的结构特征导致与天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)或天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)相比具有改善的半衰期的类似物。

总之，示例性PYY类似物为：

尽管PYY类似物被描述为具有三十四个氨基酸（如天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)的三十四个氨基酸），但考虑本文的PYY类似物可以具有基于天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。即，所述PYY类似物可以包括天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)的两个N-末端氨基酸(即SEQ ID NO:1的位置1和2的“YP”残基)，其随后可以在施用于个体时在体内切割，如内源释放天然人PYY_1-36(SEQ ID NO:1)时发生。

本文的PYY类似物的半衰期可以使用本领域中已知的技术(包括例如以下实施例中描述的那些)测量。同样，本文的PYY类似物对于各种NPY受体(例如，NPY2R、NPY5R)的各自的亲和力可以使用本领域中已知的测量受体结合水平的技术，包括例如以下实施例中描述的那些，并通常表示为抑制常数(K_i)值。此外，也可使用本领域中已知的技术，包括例如下述体外活性测定法测量本文的PYY类似物在各受体处的活性，并通常表示为EC₅₀值。

由于上述修饰，本文的PYY类似物的半衰期比天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)的半衰期更长。例如，所述PYY类似物的半衰期可以是约5小时至约24小时、约6小时至约23小时、约7小时至约22小时、约8小时至约21小时、约9小时至约20小时、约10小时至约19小时、约11小时至约18小时、约12小时至约17小时、约13小时至约16小时、或甚至约14小时至约15小时。或者，本文的PPY类似物的半衰期可以是约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或甚至约24小时，尤其约12小时。

同样，本文的PYY类似物在NPY2受体的结合亲和力比天然人PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)的结合亲和力更大，诸如约2倍至约10倍。或者，本文的PYY类似物的结合亲和力可以比天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)的结合亲和力大多达约2倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约6倍、大约7倍、大约8倍、大约9倍，或甚至大约10倍，尤其大2倍至大3倍。

药物组合物

本文的PYY类似物可配制为药物组合物，其可通过肠胃外途径(例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或经皮)施用。此类药物组合物及其制备技术是本领域中众所周知的。参见例如Remington, “The Science and Practice of Pharmacy” (D.B. Troy编, 第21版,Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)。在具体情况下，SQ施用所述PYY类似物。然而，或者，所述PYY类似物可以配制成用于其他药学上可接受的途径的形式，诸如，例如，用于经口施用的片剂或其他固体；定时释放胶囊；和目前使用的任何其他形式，包括霜剂、乳剂、吸入剂等。

为了提高其体内相容性和有效性，本文的PYY类似物可与许多无机和有机酸/碱的任一种反应以形成药学上可接受的酸/碱加成盐。药学上可接受的盐及其常用制备技术是本领域中众所周知的(参见例如Stahl等人, “Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties, Selection and Use,” 第2修订版(Wiley-VCH, 2011))。本文所用的药学上可接受的盐包括钠盐、三氟乙酸盐、盐酸盐和乙酸盐。

本文的PYY类似物可以使用注射由医师施用或自己施用。应理解本领域技术人员可以容易地确定计量尺寸和注射体积量。然而，注射体积量可以是≤约2 mL或甚至≤约1mL，并且针式计量器可以是≥约27 G或甚至≥约29 G。

本公开还提供了并因此涵盖可用于合成本文的PYY类似物或其药学上可接受的盐的新型中间体和方法。本文的中间体和PYY类似物可通过本领域中众所周知的各种方法制备。例如，在以下实施例中举例说明使用化学合成的方法。所述各途径的具体合成步骤可以不同方式组合以制备本文所述的PYY类似物。试剂和起始材料是本领域技术人员易得的。

本文的PYY类似物通常在宽剂量范围内是有效的。本文的PYY类似物或包含其的药物组合物的示例性剂量可以是每千克(kg)个体的毫克(mg)、微克(μg)、纳克(ng)或皮克(pg)量。以该方式，每日剂量可以是约1 μg至约100 mg。

此处，药物组合物中PYY类似物的有效量可以是约0.25 mg至约5.0 mg的剂量。然而，本领域技术人员理解，在一些情况下，有效量(即，剂量(dose)/剂量(dosage))可能低于前述范围的下限并绰绰有余，而在其他情况下，有效量可以是更大的剂量并可能在具有可接受的副作用的情况下采用。

除了PYY类似物以外，所述药物组合物也可以包含额外的治疗剂，尤其是其他抗糖尿病药或减肥药。在一些情况下，所述额外的治疗剂可以是肠促胰岛素或DPP-IV抑制剂中的至少一种。示例性肠促胰岛素包括但不限于GCG、GLP-1、GLP-1 (7-36)_酰胺、GIP、OXM、GCG类似物、GLP-1类似物、GIP类似物、OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或甚至具有三重受体活性的肠促胰岛素类似物。

以该方式，所述药物组合物可以包含有效量的SEQ ID NO:9的PYY类似物和肠促胰岛素或DPP-IV抑制剂、有效量的SEQ ID NO:10的PYY类似物和肠促胰岛素或DPP-IV抑制剂、有效量的SEQ ID NO:11的PYY类似物和肠促胰岛素或DPP-IV抑制剂、有效量的SEQ ID NO:12的PYY类似物和肠促胰岛素或DPP-IV抑制剂、或有效量的SEQ ID NO:13的PYY类似物和肠促胰岛素或DPP-IV抑制剂。

在肠促胰岛素是GLP-1或GLP-1类似物的那些情况下，其可以是GLP-1或GLP-1类似物，诸如阿必鲁肽(albiglutide)、度拉鲁肽(dulaglutide)、利拉鲁肽(liraglutide)、司马鲁肽(semaglutide)或其组合，尤其是度拉鲁肽。

制备和使用PYY类似物的方法

本文的PYY类似物可以使用标准手动或自动化固相合成程序，经由本领域中已知的任何数目的肽合成方法来合成。自动化肽合成仪从例如Applied Biosystems (FosterCity, CA)和Protein Technologies Inc. (Tucson, AZ)商业得到。用于固相合成的试剂容易地从商业来源获得。固相合成仪可以根据制造商的说明书用于阻断干扰基团，在反应期间保护氨基酸，偶联，脱保护和封端未反应的氨基酸。

通常，在室温下，在惰性溶剂(诸如DMF、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷)中，在偶联剂(诸如二异丙基-碳二亚胺和1-羟基苯并三唑)存在的情况下，将N-α-氨基甲酰基保护的氨基酸和附接至树脂的生长肽链上的N-末端氨基酸偶联。使用诸如TFA或哌啶的试剂从所得的肽树脂除去N-α-氨基甲酰基保护基，并用下一个期望的N-α-保护的氨基酸重复偶联反应以添加至肽链。合适的胺保护基是本领域中众所周知并描述于例如Green & Wuts,“Protecting Groups in Organic Synthesis,” (John Wiley and Sons, 1991)中。最常用的实例包括tBoc和Fmoc。合成完成后，在酸性条件下使用标准处理方法，从固相支持物切下肽，同时使侧链脱保护。

本领域技术人员将理解用C-末端羧酰胺来合成本文所述的肽链。为了合成C-末端酰胺肽，并入Rink酰胺MBHA或Rink酰胺AM接头的树脂通常用于Fmoc合成，而MBHA树脂通常用于tBoc合成。

粗肽通常在C8或C18柱上使用RP-HPLC使用0.05%至0.1% TFA中的水-乙腈梯度纯化。纯度可以通过分析型RP-HPLC验证。肽的身份可以通过MS验证。肽可以在宽pH范围内溶解于水性缓冲液中。

本文的PYY类似物的一种用途是用于降低个体(特别是超重或肥胖并具有T2DM的个体)中的血液葡萄糖和/或体重。施用如本文所述的PYY类似物可以通过改善胰岛素敏化和重量减轻而导致血糖控制。因此，本文的PYY类似物显示葡萄糖降低效力与重量减轻的额外益处，使得个体可以延迟进展至胰岛素并维持靶HbA1c目标。

所述方法可以包括本文所述的步骤，且这些可能(但不是必需)以所述的顺序进行。然而，也可以想到其他顺序。此外，单个或多个步骤可以并行和/或在时间上重叠和/或单独地或在多个重复的步骤中实施。此外，所述方法可以包括额外未指定的步骤。

因此，此类方法可以包括选择过重且具有T2DM或易患该疾病的个体。或者，所述方法可以包括选择肥胖且具有T2DM或易患该疾病的个体。

所述方法也可以包括向个体施用有效量的至少一种如本文所述的PYY类似物，其可以呈也如本文所述的药物组合物的形式。在一些情况下，所述至少一种PYY类似物/药物组合物可以包括额外的治疗剂，诸如肠促胰岛素或DPP-IV抑制剂。

所述至少一种PYY类似物和任选的肠促胰岛素或DPP-IV抑制剂的浓度/剂量(dose)/剂量(dosage)讨论于本文其他地方。

关于施用途径，所述至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物可以根据已知方法(诸如，例如，经口；通过注射(即，动脉内、静脉内、腹膜内、脑内、脑室内、肌肉内、眼内、门静脉内或病灶内)；通过持续释放系统、或通过植入装置)施用。在某些情况下，所述至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物可以通过推注或连续地SQ施用。

关于给药频率，所述至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物可以每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次(即，每周)、每两周(即，每隔一周)或每月施用。在某些情况下，所述至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物每隔一天SQ、每周三次SQ、每周两次SQ、每周一次SQ、每隔一周SQ或每月SQ施用。在具体情况下，所述至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物每周一次(QW) SQ施用。

或者，所述至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物可以经口施用。如上所述，且关于给药频率，所述至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物可以每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次(即，每周)、每两周(即，每隔一周)或每月施用。在某些情况下，所述至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物每隔一天经口、每周三次经口、每周两次经口、每周一次经口或每隔一周经口施用。在具体情况下，所述PYY类似物每周一次经口施用。

关于其中将至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物与有效量的肠促胰岛素组合施用的那些情况，所述肠促胰岛素可以是GCG或GCG类似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_酰胺或GLP-1类似物、GIP或GIP类似物、OXM或OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或甚至具有三重受体活性的肠促胰岛素。所述GCG、GCG类似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_酰胺、GLP-1类似物、GIP、GIP类似物、OXM、OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受体活性的肠促胰岛素可以与至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物同时、分开或依次施用。

此外，所述GCG、GCG类似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_酰胺、GLP-1类似物、GIP、GIP类似物、OXM、OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受体活性的肠促胰岛素可以与至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物相同的频率(即，每隔一天、每周两次、或甚至每周)施用。或者，所述GCG、GCG类似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_酰胺、GLP-1类似物、GIP、GIP类似物、OXM、OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受体活性的肠促胰岛素可以与至少一种PYY类似物或包含其的药物组合物不同的频率施用。在其他情况下，所述GCG、GCG类似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_酰胺、GLP-1类似物、GIP、GIP类似物、OXM、OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受体活性的肠促胰岛素QW施用。在还有其他情况下，所述PYY类似物是SQ施用的，且所述GCG、GCG类似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_酰胺、GLP-1类似物、GIP、GIP类似物、OXM、OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受体活性的肠促胰岛素可以是经口施用的。

进一步考虑所述方法可以与饮食和运动组合和/或可以与除了上面讨论的那些以为的额外治疗剂组合。

实施例

出于举例说明而非限制的目的，提供以下非限制性实施例。

实施例1：PYY类似物1。

并入该发明构思的一种PYY类似物可以具有以下结构：

此处，N-末端是游离的，且C-末端氨基酸被酰胺化为C-末端伯酰胺。位置7的K通过用(Ahx-E-(γE)-CO-(CH₂)₁₆-COOH缀合至位置7的K侧链的ε-氨基进行化学修饰。

根据SEQ ID NO:9的PYY类似物通过固相肽合成使用Fmoc/t-Bu策略在SymphonyX自动化肽合成仪(PTI Protein Technologies Inc.)上从RAPP AM-Rink酰胺树脂(H40023聚苯乙烯AM RAM, Rapp polymere GmbH)开始来生成。在25℃下，使用10当量的氨基酸、0.9M二异丙基碳二亚胺(DIC)和0.9 M Oxyma (1:1:1摩尔比)于DMF中进行氨基酸偶联3 h。使用DMF中的25%哌啶溶液实施脱保护。

如上所述伸长肽-树脂后，使用二氯甲烷(DCM)中的30%六氟异丙醇(HFIP)除去位置7的K中存在的MTT保护基。使用Fmoc/t-Bu策略来延长位置7侧链的K的额外偶联/脱保护循环涉及Fmoc-6-氨基己酸(Chem-Impex国际目录号02490)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu (ChemPep目录号100703)和HOOC-(CH₂)₁₆-COOtBu。在所有偶联中，在25℃下在DMF中使用3当量的构建嵌段与PyBOP(3当量)和DIEA(6当量)，持续3h。

在25℃下，在含有TFA：三异丙基硅烷：1,2-乙二硫醇：甲醇：苯甲硫醚80:5:5:5:5(v/v)的溶液中同时实施从树脂裂解和侧链保护基除去2 h，随后用冷乙醚沉淀。通过RP-HPLC在苯基己基柱(Phenomenex, Luna; 5 μm, 100A)上将粗肽纯化至＞99%纯度(15-20%纯化产率)，其中将合适的级分合并并冻干。

通过分析型RP-HPLC检查PYY类似物的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 = 1659.2 (+/-0.2)；计算值：M+3H⁺/3 = 1659.2；观察值：M+4H⁺/4 = 1244.6 (+/-0.2)；计算值：M+4H⁺/4 = 1244.6；观察值：M+5H⁺/5 = 995.9 (+/-0.2)；计算值：M+5H⁺/5 =995.9)。

实施例2：PYY类似物2。

并入该发明构思的一种PPY类似物可以具有以下结构：

如实施例1中，N-末端是游离的，且C-末端氨基酸被酰胺化为C-末端伯酰胺。然而，与之相比，位置7的K通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γE)-CO-(CH₂)₁₈-COOH缀合至K侧链的ε-氨基进行化学修饰。

根据SEQ ID NO:10的PYY类似物由固相肽生成，类似于以上在实施例1中所述者。因此，在25℃下在DMF中使用3当量的构建嵌段与PyBOP(3当量)和DIEA(6当量)进行MTT裂解3 h后，将FMOC-NHPEG₂-CH₂COOH和HOOC-(CH₂)₁₈-COOtBu附接至侧链。

通过分析型RP-HPLC检查PYY类似物的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 = 1665.4 (+/-0.2)；计算值：M+3H⁺/3 = 1665.5；观察值：M+4H⁺/4 = 1249.3 (+/-0.2)；计算值：M+4H⁺/4 = 1249.4；观察值：M+5H⁺/5 = 999.7 (+/-0.2)；计算值：M+5H⁺/5 =999.7)。

实施例3：PYY类似物3。

并入该发明构思的一种PYY类似物可以具有以下结构：

如实施例1中，N-末端是游离的，且C-末端氨基酸被酰胺化为C-末端伯酰胺。然而，与之相比，位置7的K通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γE)-CO-(CH₂)₁₆-COOH缀合至K侧链的ε-氨基进行化学修饰。

根据SEQ ID NO:11的PYY类似物由固相肽生成，类似于以上在实施例1中所述者。因此，在25℃下在DMF中使用3当量的构建嵌段与PyBOP(3当量)和DIEA(6当量)进行MTT裂解3 h后，将FMOC-NHPEG₂-CH₂COOH和HOOC-(CH₂)₁₆-COOtBu附接至侧链。

通过分析型RP-HPLC检查PYY类似物的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 = 1664.7 (+/-0.2)；计算值：M+3H⁺/3 = 1664.9；观察值：M+4H⁺/4 = 1248.9 (+/-0.2)；计算值：M+4H⁺/4 = 1248.9；观察值：M+5H⁺/5 = 999.3 (+/-0.2)；计算值：M+5H⁺/5 =999.3)。

实施例4：PYY类似物4。

并入该发明构思的一种PYY类似物可以具有以下结构：

根据SEQ ID NO:12的PYY类似物由固相肽生成，类似于以上在实施例1中所述者。因此，在25℃下在DMF中使用3当量的构建嵌段与PyBOP(3当量)和DIEA(6当量)进行MTT裂解3 h后，将FMOC-NHPEG₂-CH₂COOH和HOOC-(CH₂)₁₆-COOtBu附接至侧链。

通过分析型RP-HPLC检查PYY类似物的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 = 1664.8 (+/-0.2)；计算值：M+3H⁺/3 = 1665.5；观察值：M+4H⁺/4 = 1248.9 (+/-0.2)；计算值：M+4H⁺/4 = 1249.4；观察值：M+5H⁺/5 = 998.9 (+/-0.2)；计算值：M+5H⁺/5 =995.7)。

实施例5：PYY类似物5。

并入该发明构思的一种PYY类似物可以具有以下结构：

如实施例1中，N-末端是游离的，且C-末端氨基酸被酰胺化为C-末端伯酰胺。然而，与之相比，位置7的K通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γE)₃-CO-(CH₂)₁₈-COOH缀合至K侧链的ε-氨基进行化学修饰。

根据SEQ ID NO:13的PYY类似物由固相肽生成，类似于以上在实施例1中所述者。因此，在25℃下在DMF中使用3当量的构建嵌段与PyBOP(3当量)和DIEA(6当量)进行MTT裂解3 h后，将FMOC-NHPEG₂-CH₂COOH和HOOC-(CH₂)₁₈-COOtBu附接至侧链。

通过分析型RP-HPLC检查PYY类似物的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 = 1732.2 (+/-0.2)；计算值：M+3H⁺/3 = 1732.3；观察值：M+4H⁺/4 = 1299.4 (+/-0.2)；计算值：M+4H⁺/4 = 1299.5；观察值：M+5H⁺/5 = 1039.7 (+/-0.2)；计算值：M+5H⁺/5 =1039.8)。

实施例6：PYY类似物的体外活性。

(1) 与hNPY1、hNPY2、hNPY4和hNPY5受体的体外结合

目的：

评价实施例1至5的PYY类似物在牛血清白蛋白(BSA)不存在的情况下与以下人(h)受体的体外结合亲和力(Ki)：hNPY1R、hNPY2R、hNPY4R和hNPY5R。在闪烁邻近测定(SPA)方法中使用竞争性放射性配体结合测定，所述竞争性放射性配体结合测定使用由过表达各种重组受体和相关[¹²⁵I]标记肽的细胞系制备的膜。在每种测定中确定对相关天然肽PYY_1-36(SEQ ID NO:1)、PYY_3-36(SEQ ID NO:2)和胰腺多肽_1-36(PP_1-36；SEQ ID NO:14)的结合亲和力作为对照。

方法：

PYY类似物、天然人PYY_1-36和对照PYY_3-36在Lilly Research Laboratories(Indianapolis, IN, USA)合成并通过LC/MS、NMR和LC/UV分析进行表征(99.5%纯度)。肽含量被估计为80%粉末量。所述肽被制备为100% DMSO中的10 mM储备溶液并保持冷冻在-20℃下，直至在测定中临测试前。

对于hNPY1R，使用CHO细胞进行瞬时过表达。通过将受体cDNA亚克隆至pcDNA3.1表达质粒中并转染至人胚胎肾脏(HEK) 293细胞中、随后用遗传霉素进行选择来制备用于hNPY2R和hNPY4R的稳定转染的细胞系。在Multispan, Inc. (Hayward, CA)进行hNPY5R克隆。

为了制备hNPY1R、hNPY2R、mNPY2R和hNPY4R粗细胞膜，利用两种不同方法(如下所述)。hNPY5R膜购自Multipan, Inc. (#MCG1275)。

方法1 – 对于hNPY2R和hNPY4R膜，将冷冻的细胞沉淀在冰上在10 mL低渗均质缓冲液中裂解，所述低渗均质缓冲液含有50 mM Tris HCl(pH 7.5)和具有EDTA (#1169749001)的Roche Complete™蛋白酶抑制剂的每克湿细胞糊剂。使用安装有Teflon®杵的玻璃Potter-Elvehjem均质仪破坏细胞悬浮液25次。在4℃下以1100 x g离心均质物10分钟。收集上清液并储存在冰上，同时将沉淀重悬浮于均质化缓冲液中并如上所述再次均质化。以1100 x g离心均质物10分钟。将第二上清液与第一上清液组合并在4℃下以35000x g离心1小时。将所得的膜沉淀以近似1至3 mg/mL重悬浮于含有蛋白酶抑制剂的均质化缓冲液中，在液氮中快速冷冻，并作为等分试样储存在-80℃冰箱中直至使用。使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，#23225)以BSA作为标准品测定蛋白浓度。

方法2 – 对于hNPY1R膜，将冷冻的细胞沉淀在冰上在5 mL低渗均质缓冲液中裂解，所述低渗均质缓冲液含有25 mM Tris HCl(pH 7.5)、1 mM MgCl₂、25单位/mL DNA酶I(Invitrogen，#18047-019)和没有EDTA (#11836170001)的Roche Complete™蛋白酶抑制剂的每克湿细胞糊剂。使用安装有Teflon®杵的玻璃Potter-Elvehjem均质仪破坏细胞悬浮液25次。在4℃下在50 mL锥形管中以1800 x g离心均质物15分钟。收集上清液并储存在冰上，同时将沉淀重悬浮于均质化缓冲液中并如上所述再次均质化，除了在均质化缓冲液中不使用DNA酶I。以1800 x g离心均质物15分钟。将第二上清液与第一上清液组合并在4℃下以25000 x g离心30分钟。将所得的膜沉淀以近似2 mg/mL重悬浮于含有蛋白酶抑制剂的均质化缓冲液中，等分，并储存在-80℃冰箱中直至使用。使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，#23225)以BSA作为标准品测定蛋白浓度。

一般结合测定方法–使用与以下对于化合物测试所述相同的试剂和缓冲液，从饱和结合分析测定各种受体/放射性配体相互作用的平衡解离常数(K_d)。对于该研究中使用的受体制剂测定的K_d值如下：hNPY2R，0.0047 nM；hNPY1R，0.07 nM；hNPY4R，0.084 nM；和hNPY5R，0.896 nM。

hNPY1R受体结合方案 – 用从Perkin Elmer (Waltham，MA)获得的人重组[¹²⁵I]-PYY_1-36(#NEX341，2200 Ci/mmol)从竞争性放射性配体结合测定确定PYY类似物肽和PYY_1-36对hNPY1R的受体结合亲和力(Ki)。用使用聚乙烯基甲苯(PVT)小麦胚芽凝集素偶联的SPA珠粒 (#RPNQ0001，Perkin Elmer)的SPA方法进行该测定。使用测定缓冲液(25 mM HEPES (pH7.5)、1 mM MgCl₂、2.5 mM CaCl₂和0.2% w/v杆菌肽(RPI，#32000))用于制备试剂。将PYY类似物和PYY_1-36解冻并使用Tecan Evo液体处理器3倍连续稀释于100% DMSO(10点浓度响应曲线)中。将肽20倍逐步下降稀释至测定缓冲液中以降低DMSO的水平和肽浓度，然后添加至测定板中。接下来，将5 µL连续稀释的肽或DMSO转移至含有45 µL测定缓冲液或未标记的PYY_1-36对照(非特异性结合或NSB，10 nM最终浓度)的Corning® 3632透明底测定板中。然后，添加50 µL [¹²⁵I]-PYY_1-36(0.05 nM最终浓度)和50 µL hNPY1R膜(1.0 µg/孔)。最后添加50 µL WGA SPA珠粒(50 µg/孔)。最终DMSO浓度为0.125%。将板密封并在板振荡器(设置6)上混合1分钟并在室温下在10小时的孵育/珠粒沉降时间后用PerkinElmer TriluxMicroBeta®闪烁计数器读取。在响应曲线中测试的肽的最终测定浓度范围为：PYY类似物(2.5 µM至0.13 nM)和PYY_1-36(10 nM至0.5 pM)。

hNPY2受体结合方案 – 从如以上对于hNPY1R所述的竞争性放射性配体结合测定确定PYY类似物肽和PP_1-36对hNPY2R的受体结合亲和力(K_i)。在响应曲线中测试的肽的最终测定浓度范围为：PYY类似物(0.1 µM至5 pM)和PYY_3-36(10 nM至0.5 pM)。

hNPY4R受体结合方案 – 从如以上对于hNPY1R所述的竞争性放射性配体结合测定确定PYY类似物肽和PP_1-36对hNPY4R的受体结合亲和力(K_i)。在响应曲线中测试的肽的最终测定浓度范围为：PYY类似物(1 µM至10 pM)和PYY_1-36(1 µM至10 pM)。

hNPY5R受体结合方案 – 从如以上对于hNPY1R所述的竞争性放射性配体结合测定确定PYY类似物肽和PYY_1-36对hNPY5R的受体结合亲和力(K_i)。在响应曲线中测试的肽的最终测定浓度范围为：PYY类似物(1 µM至10 pM)和PYY_1-36(1 µM至10 pM)。

NPY受体结合测定的数据分析 – 将PYY类似物、PYY_1-36、PYY_3-36或PP_1-36的浓度曲线的每分钟原始计数(CPM)数据通过如下转换为特异性抑制百分比：从各个CPM值减去非特异性结合(NSB，分别在过量的未标记的PYY_1-36、PYY_3-36或PP_1-36存在的情况下进行结合)并除以总结合信号，还通过减去非特异性结合来校正，如以下方程中所示：

。

使用四参数(曲线最大值、曲线最小值、IC₅₀、希尔斜率)非线性回归惯例(GenedataScreener，版本13.0.5, Genedata AG, Basal, Switzerland)分析数据。基于方程K_i=IC₅₀/(1 + D/K_d)从相对IC₅₀值计算亲和力(K_i)，其中D=实验中放射性配体的浓度，IC₅₀是引起结合的50%抑制的浓度，且K_d是从饱和结合分析(上面列出)确定的放射性配体的平衡结合亲和力常数。限定符(＞)指示与竞争剂不存在的情况下的最大结合相比，数据未达到50%抑制，因此，使用测定中测试的化合物的最高浓度计算K_i。

报告的K_i值被计算为几何平均值，如下所示：

。

使用Δ方法计算平均值的标准误差(SEM)，如下所示：

其中SD是标准偏差，n是独立运行的次数，且ln(10)是10的自然对数。

通过除以hNPY2R结果(以nM计)来计算肽对hNPY2R (Y2)(相比于hNPY5R (Y5)、hNPY4R (Y4)和/或hNPY1R (Y1))的选择性。

结果：

表1：与hNPY1R、hNPY2R、hNPY4R和hNPY5R的体外结合(K_i)。

*用于比较的已知PYY类似物；参见国际专利申请公开号WO 2016/198682，其中参考例1对应于其中的化合物4，参考例2对应于其中的化合物21，且参考例3对应于其中的化合物32。

ND – 未检测到

NA – 不适用。

如上所示，实施例1至5的PYY类似物对hNPY2受体有高度选择性，甚至证实与天然人PYY_3-36(SEQ ID NO:2)相比，与hNPY5、hNPY4和hNPY1受体的结合亲和力降低。

(2) 对人NPY2受体的体外cAMP活性

目的：

通过测量过表达重组人NPY2受体的HEK 293细胞中的毛喉素诱导的细胞内cAMP产生的抑制，来测定实施例1至5的PYY类似物与天然人PYY_3-36相比的体外功能活性。

方法：

如以上在受体结合测定中所述，合成、表征和储存PYY类似物和人PYY_3-36(SEQ IDNO:2)。

受体克隆 – 通过将受体cDNA亚克隆至pcDNA3.1表达质粒中并将其转染至HEK293细胞中、随后用遗传霉素进行选择，制备hNPY2受体的稳定转染的细胞。制备第9代的细胞的等分试样(1 x 10⁷个细胞/mL)并在液氮罐的气相中保持冷冻。在测定时使用这些冷冻的等分试样。细胞经几个月维持大于95%存活率。

hNPY2R cAMP测定 – 使用过表达重组hNPY2R的HEK 293细胞，测量PYY类似物或PYY_3-36对毛喉素诱导的cAMP产生的抑制。将冷冻的细胞等分试样在37℃水浴中解冻。将细胞转移至具有10 mL培养基(MEM细胞培养基(来自Life Tech 11090-081)，具有10% FBS(来自Life Tech 10082-147)、1 mM L-谷氨酰胺(来自Life Tech 25030-081)、1xNEAA(来自Life Tech 11140-050)、1 mM丙酮酸钠(来自Life Tech 11360-070)、1x抗生素-抗霉剂(来自Life Tech 15240-062))的50 mL管中，并在Beckman台式离心机中以1500 rpm离心5分钟。除去上清液，并将细胞沉淀重悬浮于10 mL细胞培养基中，随后通过40 µm过滤器。使用来自Beckman-Coulter的Vi-Cell分析仪(Vi-Cell XR 2.03)测定细胞数和细胞活力的准确计数。使用Combi-Tip分配器(Thermo Scientific)将每孔8000个细胞接种至白色384孔测定板(Corning，聚-D-赖氨酸包被，白色/不透光，目录号356661)中。将板以1000 rpm离心1秒，并在37℃在5% CO₂-控制孵育箱中孵育18至20小时。通过在纸巾上轻拍，从测定板除去培养基。使用Combi-Tip分配器将10 µL测定缓冲液[1X HBSS (Hyclone, #SH3026801)、20mM HEPES (pH 7.5) (Hyclone #SH 30237.01)、0.1% w/v酪蛋白(CTL Scientific SupplyCorp., #440203H)、500 µM IBMX (Sigma-Aldrich #I5876)]添加至孔中，随后以1500 rpm离心10秒。使用声音分配技术(Labcyte Echo 550)在100% DMSO中制备2倍稀释的浓度响应曲线(20点)。细胞在37℃用PYY类似物或人PYY_3-36处理45分钟(最终DMSO浓度=1%)，然后在37℃用1µM毛喉素(Sigma-Aldrich，#F6886)刺激45分钟。使用CisBio cAMP-G_i动态试剂盒(#62AM9PEB)定量细胞内cAMP。简而言之，使用HTRF试剂盒试剂通过添加细胞裂解缓冲液(10 μL)中的cAMP-d2缀合物，随后添加也在细胞裂解缓冲液(10 μL)中的抗体抗cAMP-Eu³⁺-穴状化合物(Cryptate)，来检测细胞内的cAMP水平。所得的竞争性测定在室温下孵育至少60分钟，然后在PerkinElmer Envision™仪器上用在320 nm处激发和在665 nm和620 nm处发射来读取。在响应曲线中测试的肽的最终测定浓度范围为：PYY类似物(0.1 µM至0.2 pM)和人PYY_3-36(10 nM至0.02 pM)。在测定缓冲液中制备已知cAMP浓度(0.5 µM至1 pM)的标准曲线。在各板上包括没有添加竞争剂的孔或具有过量添加人PYY_3-36的孔分别作为最大响应和抑制剂对照。

hNPY2受体cAMP测定的数据分析 – 使用时间解析的荧光发射来计算荧光比率(665 nM/620 nm)，其与存在的cAMP的量成反比。使用绘制为相对响应单位(在665 nm/620nm处的发射*10,000，y-轴)与cAMP浓度(x-轴)的cAMP标准曲线将PYY类似物和人PYY_3-36的信号转换为每孔的nM cAMP。

将每孔中的生成的cAMP的量(nM)转换为用单独毛喉素观察到的最大响应的百分比，如以下方程中所示：

，

其中抑制剂对照是在添加的过量人PYY_3-36存在的情况下产生的cAMP，最大响应是在仅存在毛喉素的情况下产生的cAMP，且肽是在测试肽存在的情况下产生的cAMP。

将特异性抑制百分比(y-轴)针对竞争剂的浓度(x-轴)作图并使用如下所定义的四参数(曲线顶部、曲线底部、IC₅₀、希尔斜率)非线性回归惯例(Genedata Screener，版本13.0.5, Genedata AG, Basal, Switzerland)进行分析：

。

相对IC₅₀值代表引起毛喉素诱导的cAMP产生的50%抑制的浓度。

报告的IC₅₀值被计算为几何平均值，如下所示：

。

使用Δ方法计算平均值标准误差(SEM)，如下所示：

结果：

表2：对hNPY2受体的体外cAMP活性

*用于比较的已知PYY类似物；参见，国际专利申请公开号WO 2016/198682，其中参考例1对应于其中的化合物4，参考例2对应于其中的化合物21，且参考例3对应于其中的化合物32。

如上所示，来自cAMP测定的结果证实实施例1至5的PYY类似物对hNPY2受体的功能活性，其中实施例2显示最弱的效力，其效力比人PYY_3-36低12倍。

(3) 对hNPR2受体的体外GTPγS活性

目的：

通过实施例1至5的PYY类似物评价G-蛋白的受体介导的活化。使用不可水解的GTP类似物GTPγ[³⁵S]测量受体介导的活化。G-蛋白偶联受体的激动剂介导的刺激导致膜相关的Gαβγ-蛋白异三聚复合物的活化。这代表转导细胞外信号以修饰细胞内途径中的第一步骤。本文中，使用GTPγ[³⁵S]功能测定评价各种PYY类似物在hNPY2受体的效力。

方法：

如以上在受体结合测定中所述，合成、表征并储存PYY类似物、人PYY_1-36(SEQ IDNO:1)和对照肽PYY_3-36(SEQ ID NO:2)。

对于每种测试肽，用Hamilton NIMBUS液体处理器在补充有0.2%杆菌肽(U.S.Biologicals #11805)和0.5% DMSO的测定缓冲液(20mM HEPES (pH 7.4)、100mM NaCl、6mMMgCl₂、1 mM EDTA)中完成1/3 log稀释(对数浓度为-6.52至-12.52)的浓度响应曲线(CRC)。杆菌肽和DMSO的最终测定浓度分别为0.05%和0.125%。在补充有20 uM GDP (Sigma#G-7127)和6 ug/mL皂苷(Sigma #S-4521)的测定缓冲液中将hNPY2R膜(Multispan #HTS066M)制备成7.5 ug/mL的浓度并将hNPY2R膜在添加至测定之前在室温下培养20分钟。在测定缓冲液中将GTPγS[³⁵S](PerkinElmer #NEG030H)制备成0.6 nM的浓度。在测定缓冲液中将WGA SPA珠粒(PerkinElmer #RPNQ0001)制备为12 mg/mL的浓度。通过首先添加100uL至hNPY2R膜，然后添加50 uL CRC溶液，然后添加50 uL GTPγS[³⁵S]溶液，最终体积为200uL，在96-孔板(Costar #3604)中进行该测定。将板覆盖并在室温下置于定轨振荡器(175rpm，45分钟)上。然后，添加25 uL SPA珠粒且再密封板并涡转以混合，然后在室温下放回定轨振荡器上3小时。然后将板以500 rpm离心5分钟并在PerkinElmer 2450微板计数器上每孔计数1分钟。在PYY类似物或人PYY_3-36不存在的情况下确定基础结合(CPM)并用于用以下方程计算每种浓度的肽的高于基础值的百分比：(PYY类似物或人PYY_3-36，CPM – 基础CPM)/(基础CPM)*100。EC₅₀ (nM)值通过在GraphPad Prism 7.0中使用以下方程对浓度的对数和基础值的百分比进行非线性回归分析(对数(激动剂) vs. 响应--可变斜率(四个参数))确定：Y=底部+(顶部-底部)/(1+10^((LogEC₅₀-X)*希尔斜率))。使用GraphPad Prism 7.0中的列统计功能，从EC₅₀(nM)值计算几何平均值和平均值的标准误差。

结果：

表3：对hNPY2受体的体外GTPγS活性。

如上所示，来自GTPγ[³⁵S]功能测定的结果证实PYY类似物对hNPY2受体的功能活性，其中实施例2显示最弱的效力，其中效力比人PYY_3-36低4倍。

(4) 药代动力学

目的：

研究PYY类似物的药代动力学特性。

方法：

LC/MS – 各种PYY类似物的血浆浓度通过LC/MS方法来确定。所述方法测量整体化合物；肽加连接的时间延长。对于测定，使用具有0.1%甲酸的甲醇从小鼠、大鼠或猴血浆(50µL)提取PYY类似物和内部标准品。离心所述样品并将上清液转移至热蛋白沉淀板(ThermoProtein Precipitation Plate)。将所述样品装载于用水中的甲醇和0.1%甲酸调节的Sep-Pak tC18 SPE µ洗脱板上。SPE柱用水中的0.1%甲酸洗两次。然后使用甲酸/水/乙腈(0.1:15:85)洗脱所述化合物，然后将其干燥并重构，然后将等分试样(10 µL)注射至ThermoAcclaim PepMap100 C18，300 µm x 5 mm trap柱和Thermo Easy Spray PepMap C18，75 µm x 15 cm柱上用于LC/MS分析。将柱流出物导入Thermo Q-Exactive加质谱仪中用于检测和定量。

PYY类似物在CD-1小鼠中的药代动力学 – 单次皮下给药200 nmol/kg后，在雄性CD-1小鼠中评估PYY类似物的血浆药代动力学。经168小时，每个时间点从2只动物收集血液样品。由于使用非连续采样来评估小鼠中PYY类似物的动力学，因此使用平均浓度相比于时间数据以列出PYY类似物在单次皮下给药200 nmol/kg后的药代动力学参数。单次皮下施用200 nmol/kg后持续120小时检测PYY类似物的血浆浓度。

PYY类似物在SD大鼠中的药代动力学 – 单次皮下给药50 nmol/kg后，在雄性Sprague Dawley大鼠中评估PYY类似物的血浆药代动力学。经168小时，每个时间点从2只动物收集血液样品。由于使用连续采样来评估大鼠中PYY类似物的动力学，因此使用单个动物浓度相比于时间数据以列出PYY类似物在单次皮下给药50 nmol/kg后的药代动力学参数。单次皮下施用50 nmol/kg后持续120小时检测PYY类似物的血浆浓度。

PYY类似物在食蟹猴中的药代动力学 – 单次皮下给药50 nmol/kg后，在雄性和雌性食蟹猴中评估PYY类似物的血浆药代动力学。经504小时，收集血液样品。由于使用连续采样来评估猴中PYY类似物的动力学，因此使用单独动物浓度相比于时间数据以列出PYY类似物在单次皮下给药50 nmol/kg后的药代动力学参数。单次皮下施用50 nmol/kg后持续504小时检测PYY类似物的血浆浓度。

结果：

表4：向雄性CD-1小鼠单次皮下给药后的平均药代动力学参数。

缩写：AUC_inf=从0至无穷大的曲线下面积；CL/F=清除率除以生物利用度(F)；Cmax=最大浓度；Tmax=最大浓度下的时间；T1/2=半衰期。

表5：向雄性SD大鼠单次皮下给药后的平均药代动力学参数。

缩写：AUC_inf=从0至无穷大的曲线下面积；CL/F=清除率除以生物利用度(F)；C_max=最大浓度；T_max=最大浓度下的时间；T1/2=半衰期。

表6：向食蟹猕猴单次皮下给药后的平均药代动力学参数。

结果：

这些数据证实上述化合物具有适于每周一次施用的药代动力学概况。

(5) 溶解度和稳定性

目的：

确定PYY类似物的可溶性pH范围和稳定性

方法：

目测溶解度范围评价 – 将冻干的PYY类似物粉末以4 mg/mL浓度重构于水中，并用柠檬酸/磷酸盐缓冲液将pH调整至pH 4。将系统的pH用0.5 N NaCl向上滴定至pH 8且然后用0.5 N HCl向下滴定至pH 4。

热稳定性评估 – 制备1 mg/mL或2 mg/mL浓度的10 mM或20 mM磷酸钠(pH 7.0)中的PYY类似物溶液并在4℃和40℃下孵育4周。通过大小排除色谱(SEC)和RP-HPLC分析在4周时间点的样品。

SEC方法 – 使用TOSOH TSKgelG2000SWxl，7.8 mm ID x 30 cm，5 um柱进行，其中流动相组成为50 mM磷酸钠、具有20%乙腈的300 mM NaCl(pH 7.0)，经30分钟，流速为0.5mL/min，λ–214 nm。

RP方法 – 使用Cortecs C18，2.7 um，4.6 x 50 mm柱，具有0.085% TFA的20%-45%乙腈/水进行，经10分钟，流速为1 mL/min，λ-214 nm。

结果：

表7：PYY类似物的溶解度和热稳定性。

如上所示，所有肽在pH＞7.0下均可溶。如通过RP和SEC所评价的稳定性表明这些肽在剧烈热应力下相对稳定。

实施例7：PYY的体内效应。

(1)对正常小鼠中的食物摄取和体重的体内效应

目的：

比较实施例1至5的PYY类似物在单次注射后在正常小鼠中减轻体重和抑制食物摄取的效应。

方法：

将来自Envigo RMS (Indianapolis, IN)的雄性C57Bl/6小鼠维持饲料饮食(chowdiet)(5008; LabDiet, St. Louis, MO)并单独圈养在具有正常12:12小时照明循环并自由获得食物和水的温度受控的设施(74.0°F；23.3℃)中。在9至10周龄时，记录未禁食的体重和初始食物重量，并向动物施用媒介物或肽的单次皮下注射，随后在给药后3天每天测量体重和食物摄取。计算体重和食物摄取相比于媒介物的曲线分析下面积(AUC)。在每次测定运行中，将30 nmol/kg的实施例4用作体重和食物摄取的100%效力的基准。

结果：

表8：单次给药PYY类似物后，C57/Bl6小鼠3天的体重和食物摄取的变化。

**30 nmol/kg(AUC)的实施例4设置为100%效力

如上所示，体重和食物摄取两者的减少证实PYY类似物的体内效力，其中对完全效力所需剂量的比较证实效力的提高。

(2) 对饮食诱导的肥胖小鼠的食物摄取和体重的体内效应

目的：

研究在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中经两周时段每天给药实施例1-5的PYY类似物(单独地或与GLP-1受体激动剂组合)以减轻体重的作用。

方法：

20周龄的DIO雄性C57Bl/6小鼠(Taconic)在到达后维持60%脂肪饮食(D12492;Research Diets, New Brunswick, NJ)。将动物单独地圈养在具有12小时照明/黑暗循环(在22:00照明)并自由获得食物和水的温度受控的设施(74.0°F；23.3℃)中。在每天媒介物给药的一周适应期后，测量非禁食体重，并根据体重将动物随机分为实验组(n=6)并每天施用媒介物、GLP-1受体激动剂(GLP-1 RA；SEQ ID NO:15)、PYY类似物、或PYY类似物加GLP-1RA的组合的皮下注射。给药2周后，记录非禁食体重并计算平均体重相比于媒介物的变化。为了确定PYY类似物与GLP-1 RA的组合的累加或协同效应，计算高于单独的GLP-1 RA的效力(净效应)。

结果：

表9：在饮食诱导的肥胖小鼠中用单独的PYY类似物或与GLP-1受体激动剂的组合的2周研究中的体重变化。

*高于GLP-1受体激动剂(GLP-1 RA)的效力。

如上所示，用单独和与GLP-1 RA组合的PYY类似物的体重的减轻证实PYY类似物的体内效力，其中对体重减轻的量级进行比较。

(3)对糖尿病和肥胖(db/db)小鼠中的体重和葡萄糖的体内效应

目的：

研究在肥胖和糖尿病小鼠(db/db)中经十天时段每天给药实施例1至5的PYY类似物以减轻体重和血液葡萄糖水平的作用。

方法：

将来自Envigo RMS (Indianapolis, IN)的Lepr^db/db(db/db)雄性小鼠维持饲料型饮食(chow-style diet)(5008; LabDiet, St. Louis, MO)并每个笼子5只动物圈养在具有正常12:12小时照明循环并自由获得食物和水的温度受控的设施(74.0°F；23.3℃)中。在8至9周龄时，使用Accu-Check®血糖仪(Roche Diabetes Care, Inc., Indianapolis,IN)测量体重和血液葡萄糖水平，随后每天皮下注射媒介物或肽。给药10天后，测量体重和血液葡萄糖水平并计算相比于媒介物处理的变化。

结果：

表10：对处理10天的db/db小鼠中的体重和血液葡萄糖的作用。

如上所示，用PYY类似物降低体重和血液葡萄糖水平证实PYY类似物的体内效力，其中对体重减轻和葡萄糖降低的量级进行了比较。

总之，本文的PYY类似物显示对NPY2R的选择性。它们也显示体重的剂量依赖性降低，如在正常小鼠、饮食诱导的肥胖小鼠和db/db小鼠中所反映，以及db/db小鼠中的血液葡萄糖的剂量依赖性改善，其中实施例1、3和4的PYY类似物是最有效的，与体外概况一致。

序列表

<110> Eli Lilly and Company

<120> 蛋白酪氨酸-酪氨酸类似物及其使用方法

<130> X21917

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu

1 5 10 15

Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr

20 25 30

Arg Gln Arg Tyr

35

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 3

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> 位置5的Xaa是具有可用于缀合的官能团的任何氨基酸且所述官能团缀合至C16-C22脂肪酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> 位置7的Xaa是E或G

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> 位置8的Xaa是E或K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> 位置15的Xaa是L或W

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是N或Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

<223> 位置20的Xaa是A或I

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> 位置21的Xaa是E, D,或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)..(28)

<223> 位置28的Xaa是E或W

<400> 3

Pro Lys Pro Glu Xaa Pro Xaa Xaa Asp Ala Ser Pro Glu Glu Xaa Xaa

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Xaa Xaa Leu Arg His Tyr Leu Asn Xaa Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 5

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Glu Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ile Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 7

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 8

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Gln

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 9

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 位置5的Lys通过Lys侧链的ε-氨基与Ahx-谷氨酸-γ谷氨酸-CO-(CH2)16-CO2H的缀合进行化学修饰

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> 酰胺化

<400> 9

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 10

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 位置5的Lys通过Lys侧链的ε-氨基与(AEEA)2-γ谷氨酸-CO-(CH2)18-CO2H的缀合进行化学修饰

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> 酰胺化

<400> 10

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 11

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 位置5的Lys通过Lys侧链的ε-氨基与AEEA-γ谷氨酸-CO-(CH2)16-CO2H的缀合进行化学修饰

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> 酰胺化

<400> 11

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Glu Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ile Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 12

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 位置5的Lys通过Lys侧链的ε-氨基与(AEEA)2-γ谷氨酸-CO-(CH2)16-CO2H的缀合进行化学修饰

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> 酰胺化

<400> 12

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 13

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 位置5的Lys通过Lys侧链的ε-氨基与(AEEA)2-(γ谷氨酸)3-CO-C18-CO2H的缀合进行化学修饰

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> 酰胺化

<400> 13

Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Gln

1 5 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Arg Tyr

<210> 14

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln

1 5 10 15

Met Ala Gln Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr

20 25 30

Arg Pro Arg Tyr

35

<210> 15

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser

35 40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

50 55 60

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

65 70 75 80

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

85 90 95

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

100 105 110

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

115 120 125

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

130 135 140

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

145 150 155 160

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

165 170 175

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

180 185 190

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

195 200 205

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

210 215 220

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

225 230 235 240

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

245 250 255

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

260 265 270

Leu Gly

Claims

1.肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物，其包含以下的氨基酸序列：

PKPEX₇PX₉X₁₀DASPEEX₁₇X₁₈RYYX₂₂X₂₃LRHYLNX₃₀LTRQRY (式I)，

其中X₇是具有可用于缀合的官能团的任何氨基酸且所述官能团缀合至C₁₆-C₂₂脂肪酸，

其中X₉是E或G，

其中X₁₀是E或K，

其中X₁₇是L或W，

其中X₁₈是N或Q，

其中X₂₂是A或I，

其中X₂₃是E, D或S，

其中X₃₀是E或W (SEQ ID NO:3)，且

其中C-末端氨基酸任选地被酰胺化。

2.权利要求1的PYY类似物，其中X₇选自C、D、E、K和Q。

3.权利要求1的PYY类似物，其中X₇是K，且通过K侧链的ε-氨基缀合至C₁₆-C₂₂脂肪酸。

4.权利要求1的PYY类似物，其中所述氨基酸序列选自：

和

。

5.权利要求1至4中任一项的PYY类似物，其中所述C₁₆-C₂₂脂肪酸选自十六烷酸、十六烷二酸、十七烷酸、十七烷二酸、硬脂酸、十八烷二酸、十九烷酸、十九烷二酸、二十烷酸、二十烷二酸、二十一烷酸、二十一烷二酸、二十二烷酸、二十二烷二酸及其支化和取代的衍生物。

6.权利要求5的PYY类似物，其中所述C₁₆-C₂₂脂肪酸是C₁₈-C₂₀脂肪酸。

7.权利要求6的PYY类似物，其中所述C₁₈-C₂₀脂肪酸是具有式CO-(CH₂)_x-CO₂H的直链脂肪酸，且其中_x是18或20。

8.权利要求7的PYY类似物，其中所述C₁₈-C₂₀脂肪酸选自棕榈酸、硬脂酸、花生酸和二十烷酸。

9.权利要求1至8中任一项的PYY类似物，其中所述C₁₆-C₂₂脂肪酸缀合至具有可用于经由接头缀合的官能团的氨基酸。

10.权利要求9的PYY类似物，其中所述接头可以是选自[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基)]-乙酸(AEEA)、氨基己酸(Ahx)、谷氨酸(E)、γ谷氨酸(γE)或其组合的一个或多个单元。

11.肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物，其包含：

(SEQ ID NO:9)。

12.肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物，其包含：

(SEQ ID NO:10)。

13.肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物，其包含：

(SEQ ID NO:11)。

14.肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物，其包含：

(SEQ ID NO:12)。

15.肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物，其包含：

(SEQ ID NO:13)。

16.权利要求1至15中任一项的PYY类似物，其中所述PYY类似物具有大于-2的电荷。

17.权利要求1至16中任一项的PYY类似物，其中所述PYY类似物在NPY2受体的结合亲和力大于PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)的结合亲和力。

18.权利要求1至17中任一项的PYY类似物，

其中所述PYY类似物的半衰期大于人PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)的半衰期。

19.药物组合物，其包含：

至少一种权利要求1至18中任一项的肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物或其盐；和

一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。

20.权利要求19的药物组合物，其进一步包含额外治疗剂。

21.权利要求20的药物组合物，其中所述额外治疗剂是选自胰高血糖素(GCG)、GCG类似物、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)、GLP-1_7-36-酰胺、GLP-1类似物、胃抑制肽(GIP)、GIP类似物、泌酸调节肽(OXM)、OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG的肠促胰岛素，或具有三重受体活性的肠促胰岛素类似物。

22.权利要求20的药物组合物，其中所述额外治疗剂是二肽基肽酶-IV (DPP-IV)抑制剂。

23.治疗肥胖或肥胖相关的疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：

向有此需要的个体施用有效量的权利要求1至18中任一项的肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物或其药学上可接受的盐。

24.权利要求23的方法，其中所述PYY类似物或其药学上可接受的盐皮下(SQ)施用于所述个体。

25.权利要求23的方法，其中所述PYY类似物或其药学上可接受的盐经口施用于所述个体。

26.权利要求24或25的方法，其中所述PYY类似物或其药学上可接受的盐每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次或每两周施用。

27.权利要求23的方法，其中所述PYY类似物或其药学上可接受的盐每周一次(QW) SQ施用。

28.权利要求23的方法，其中所述PYY类似物或其药学上可接受的盐每周一次经口施用。

29.权利要求23至28中任一项的方法，其进一步包括施用额外治疗剂。

30.权利要求29的方法，其中所述额外治疗剂是选自胰高血糖素(GCG)、GCG类似物、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)、GLP-1_7-36-酰胺、GLP-1类似物、胃抑制肽(GIP)、GIP类似物、泌酸调节肽(OXM)、OXM类似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG的肠促胰岛素，或具有三重受体活性的肠促胰岛素类似物。

31.权利要求29的方法，其中所述额外治疗剂是二肽基肽酶-IV (DPP-IV)抑制剂。

32.权利要求1至18中任一项的肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物或其药学上可接受的盐用于治疗肥胖的用途。

33.权利要求1至18中任一项的肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物或其药学上可接受的盐用于治疗肥胖相关的疾病或病症的用途。

34.权利要求1至18中任一项的肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物或其药学上可接受的盐用于治疗II型糖尿病的用途。

35.权利要求1至18中任一项的肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗肥胖的药物的用途。

36.权利要求1至18中任一项的肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗肥胖相关的疾病或病症的药物的用途。

37.权利要求1至18中任一项的肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)类似物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗II型糖尿病的药物的用途。