KR20210071038A

KR20210071038A - 단백질 타이로신-타이로신 유사체 및 그의 사용 방법

Info

Publication number: KR20210071038A
Application number: KR1020217013210A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 앤써니 브리에르; 다니엘 크리스토퍼 로페스; 아비나쉬 뭅피디
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2021-06-15
Also published as: US20200140514A1; JP2022506070A; US20220025009A1; JP2023082013A; US11820803B2; JP7280949B2; AU2022231763B2; CO2021005514A2; PE20211466A1; WO2020092191A1; EP3873924A1; SG11202104161RA; AU2019371232B2; ECSP21030933A; CA3118002A1; TW202208410A; TWI749381B; DOP2021000072A; CR20210192A; PH12021550964A1

Abstract

천연의 인간 PYY에 비교했을 때 반감기를 증가시키는 변형, 뿐만 아니라 NPY2 수용체에 대한 효능 및 선택성을 증가시키는 추가적인 변형을 포함하는 PYY 유사체가 개시된다. 제약상 허용되는 담체 내에 하나 이상의 본원에 기술된 PYY 유사체를 포함하는 제약 조성물이 또한 개시된다. 특히 비만 및 비만-관련 질환 및 장애 예컨대 II형 진성 당뇨병을 치료하기 위한, PYY 유사체의 제조 및 사용 방법이 또한 개시된다.

Description

단백질 타이로신-타이로신 유사체 및 그의 사용 방법

본 개시내용은 일반적으로 생물학 및 의학에 관한 것이고, 더욱 특히 이는 신경펩티드 Y (NPY) 수용체 예컨대 NPY2 수용체에 결합할 수 있는 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체, 뿐만 아니라 그를 포함하는 조성물, 및 비만 및 비만-관련 질환 및 장애 예컨대 II형 당뇨병 (T2DM)을 치료하기 위한 그의 치료적 용도에 관한 것이다.

PYY는 췌장 폴리펩티드 (PP) 패밀리의 구성원이고, 식사 후 음식 섭취 및 에너지 소비를 조정하는 것에서 수반된다 (문헌 [Tatemoto (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:2514-2518]을 참조한다). PYY는 위장관의 L 세포에 의해 분비되고, 2개의 주요 내인성 형태를 갖는다 - PYY_1-36 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1) 및 PYY_3-36 (서열식별번호: 2). 공복 동안에는 PYY_1-36이 PYY_3-36보다 우세한 반면, 급식 후에는 PYY_3-36이 PYY_1-36보다 우세하다. 디펩티딜 펩티다제-IV (DPP-IV)가 Pro²-Ile³ 결합에서 PYY_1-36을 가수분해하여 PYY_3-36이 생산되고, 이는 PYY_1-36보다 NPY2 수용체에 대해 더욱 선택적이다.

혈장 PYY_3-36 농도는 전형적으로 음식 섭취로부터 15분 이내에 증가되고, 60-90분 이내에 피크를 이루며, 최대 6시간까지 상승된 상태로 유지된 후, 기준선으로 돌아간다 (문헌 [Adrian et al. (1985) Gastroenterology 89:1070-1077]; 및 [De Silva & Bloom (2012) Gut Liver 6:10-20]을 참조한다). 이러한 방식으로, PYY_3-36은 그의 직접적인 중추 효과를 통해, 그리고 또한 장 운동성에 대한 그의 효과를 통해 식욕에 영향을 미치는 것으로 여겨진다 (즉, 그의 식욕감퇴 효과). 추가적으로, PYY_3-36은 인슐린 감수성을 매개함으로써 혈당을 낮추는 데 도움이 되는 것으로 여겨진다 (즉, 그의 민감화 효과).

특히 비만, 및 T2DM 및 심혈관 질환을 포함하는 그의 연관된 질환 및 장애를 치료하기 위해, PYY_3-36은 그의 식욕감퇴 효과의 관점에서 체중 조절을 위한 잠재적인 치료제로서 연구되었다 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 2002/47712; 및 문헌 [Schwartz & Morton (2002) Nature 418:595-597]을 참조한다).

불행하게도, 외인성으로 투여된 PYY_3-36은 프로테아제 및 다른 소거 메커니즘으로 인해 반감기가 짧고 (예를 들어, 약 10-15분) (문헌 [Lluis et al. (1989) Rev. Esp. Fisiol. 45:377-384]; 및 [Torang et al. (2016) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 310:R866-R874]을 참조한다), 이는 그를 치료제로서 사용하는 경우에 난제를 제시한다. 이같은 짧은 반감기로, PYY_3-36은 치료 효과를 발휘하기 위해 적어도 1일 1회 투여되어야 하고, 이는 그를 필요로 하는 개체에게 불편하다. 따라서, PYY_3-36의 반감기를 증가시키고/거나 그의 NPY2 수용체 선택성을 증가시키려는 시도가 이루어졌다. 예를 들어, 루빈스타인(Rubinstein) 등은 반감기를 증가시키기 위해 9-플루오레닐메톡시-카르보닐 (Fmoc) 또는 2-술포-9-플루오레닐-메톡시카르보닐 (FMS) 라디칼을 갖는 PYY 유사체를 기술한다 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2004/089279를 참조한다). 또한, 데카르(DeCarr) 등은 반감기를 증가시키기 위해 아미노-말단에 연결된 PEG 모이어티를 갖는 PYY 유사체를 기술한다 (문헌 [DeCarr et al. (2007) Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:1916-1919]을 참조하고; 문헌 [Ortiz et al. (2007) J. Pharmacol. Exp. Ther. 323:692-700]을 또한 참조한다). 또한, 코포드(Kofoed) 등은 반감기를 증가시키기 위해 알부민-결합 측쇄, PYY의 절단 부위에 가까운 적어도 1개의 변형된 잔기 (예를 들어, 관심 아미노산 잔기의 N-메틸 아미노산 유사체), N-글리신, 및/또는 아르기닌 모방체를 갖는 PYY 유사체를 기술한다 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/033068을 참조한다).

물질 대사에서의 PYY_3-36의 역할을 이해하는 것에서의 상당한 증가에도 불구하고, 추가적인 PYY 유사체, 특히 NPY2 수용체에서의 개선된 효능 및 선택성을 갖는 PYY 유사체가 여전히 요구된다.

상기 언급된 바와 같이, 치료 용도를 위한 추가적인 PYY 유사체가 요구된다. 이러한 요구를 다루기 위해, 첫째로, 본 개시내용은 (천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1)의 번호매김과 관련하여) ³PKPEX₇PX₉X₁₀DASPEEX₁₇X₁₈RYYX₂₂X₂₃LRHYLNX₃₀LTRQRY³⁶ (화학식 I) [식 중, X₇은 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 임의의 아미노산이고, 관능기는 C₁₆-C₂₂ 지방산에 접합되고, X₉는 E 또는 G이고, X₁₀은 E 또는 K이고, X₁₇은 L 또는 W이고, X₁₈은 N 또는 Q이고, X₂₂는 A 또는 I이고, X₂₃은 E, D 또는 S이며, X₃₀은 E 또는 W이고 (서열식별번호: 3), 카르복시-말단 (C-말단) 아미노산은 임의적으로 아미드화된다]의 기본 아미노산 서열을 포함하는 PYY 유사체를 기술한다.

특정 경우에, 위치 X₇의 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 아미노산은 C, D, E, K 또는 Q일 수 있다. 특정한 경우에, 위치 X₇의 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 아미노산은 K이고, 아미노산 서열은 하기 중 하나일 수 있다:

.

일부 경우에, C₁₆-C₂₂ 지방산은 링커를 통해 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 아미노산에 접합된다. 특정 경우에, C₁₆-C₂₂ 지방산은 -CO-(CH₂)_a-CO₂H의 구조를 갖고, 여기서 _a는 16 내지 22의 정수이다. 특정한 경우에, 지방산은 C₁₈ 이산 또는 C₂₀ 이산 예컨대 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산 또는 에이코산산, 특히 포화 C₁₈ 이산 또는 C₂₀ 이산이다. 마찬가지로, 일부 경우에, 링커는 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시)]-아세트산 (AEEA), 아미노헥산산 (Ahx), 글루탐산 (E),γ-글루탐산 (γE) 또는 그의 조합물 중 하나 이상의 단위일 수 있다.

특정한 경우에, PYY 유사체는 하기 중 하나일 수 있다:

.

일부 경우에, 본원에서의 PYY 유사체의 기본 구조는 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1)의 2개의 아미노-말단 (N-말단) 아미노산을 추가로 포함할 수 있고, 이는 후속적으로 생체 내에서 PYY_3-36 유사체로 프로세싱될 수 있다 (즉, 서열식별번호: 1의 N-말단 "YP" 잔기가 생체 내에서 PYY 유사체 중 어느 하나로부터 절단될 수 있다).

일부 경우에, PYY 유사체는 -2, 특히 -3 또는 -4 초과의 전하를 갖는다.

일부 경우에, PYY 유사체는 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)의 것보다 더 큰, 예컨대 약 2배 내지 약 10배 더 큰, 특히 약 2배 내지 약 3배 더 큰 인간 NPY2 수용체에서의 결합 친화력을 갖는다.

일부 경우에, PYY 유사체는 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)의 것보다 더 긴, 예컨대 약 5시간 내지 약 24시간 더 긴, 특히 약 12시간인 반감기를 갖는다.

둘째, 적어도 1개의 본원에서의 PYY 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예를 들어, 트리플루오로아세테이트 염, 아세테이트 염 또는 히드로클로라이드 염) 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 기술된다. 일부 경우에, 제약 조성물은 담체, 희석제 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 제약 조성물은 추가적인 치료제, 예를 들어, 다른 항당뇨병제 또는 체중 감소제, 특히 인크레틴을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 인크레틴은 글루카곤 (GCG) 또는 GCG 유사체일 수 있다. 다른 경우에, 인크레틴은 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), GLP-1 (7-36)_아미드 또는GLP-1 유사체일 수 있다. 다른 경우에, 인크레틴은 위 억제 펩티드 (GIP) 또는 GIP 유사체일 수 있다. 다른 경우에, 인크레틴은 이중 수용체 효능제 예컨대 옥신토모둘린 (OXM) 또는 OXM 유사체, GLP-1/GCG 또는 GIP/GLP-1일 수 있다. 다른 경우에, 인크레틴은 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴 유사체 (즉, GIP, GLP-1 및 GCG 수용체 각각의 활성을 갖는 인크레틴 유사체)일 수 있다. 다른 경우에, 추가적인 치료제는 DPP-IV 억제제일 수 있다.

셋째, 본원에서의 PYY 유사체를 사용하는 방법, 특히 비만 및 비만-관련 질환 및 장애 예컨대 T2DM을 치료하기 위해 PYY 유사체를 사용하는 방법이 기술된다. 이러한 방법은 적어도 이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 PYY 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 경우에, PYY 유사체는 개체에게 피하 (SQ) 투여될 수 있다. 마찬가지로, 그리고 일부 경우에, PYY 유사체는 매일, 격일로, 주 3회, 주 2회, 주 1회 (즉, 매주), 2주마다 (즉, 격주로), 또는 매월 투여될 수 있다. 특정 경우에, PYY 유사체는 격일 SQ, 주 3회 SQ, 주 2회 SQ, 주 1회 SQ, 격주 SQ, 또는 월 1회 SQ로 투여될 수 있다. 특정한 경우에, PYY 유사체는 주 1회 (QW) SQ 투여된다.

대안적으로, PYY 유사체는 개체에게 경구 투여될 수 있다. 상기와 같이, PYY 유사체는 매일, 격일로, 주 3회, 주 2회, 주 1회 (즉, 매주), 2주마다 (즉, 격주로), 또는 매월 투여될 수 있다. 특정 경우에, PYY 유사체는 격일 경구, 주 3회 경구, 주 2회 경구, 주 1회 경구, 격주 경구, 또는 월 1회 경구로 투여될 수 있다. 특정한 경우에, PYY 유사체는 주 1회 경구 투여된다.

방법은 적어도 1개의 PYY 유사체를 유효량의 추가적인 치료제 예컨대 DPP-IV 억제제 또는 인크레틴 (예를 들어, GCG 또는 GCG 유사체, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드 또는GLP-1 유사체, GIP 또는 GIP 유사체, OXM 또는 OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴)과 조합하여 투여하는 것을 또한 포함할 수 있다. DPP-IV 억제제 또는 인크레틴은 PYY 유사체와 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

일부 경우에, DPP-IV 억제제 또는 인크레틴은 PYY 유사체와 동일한 빈도 (즉, 격일, 주 2회, 또는 매주)로 투여될 수 있다. 다른 경우에, DPP-IV 억제제 또는 인크레틴은 PYY 유사체와 다른 빈도로 투여된다. 다른 경우에, DPP-IV 억제제 또는 인크레틴은 QW로 투여된다. 또 다른 경우에, PYY 유사체는 SQ 투여되고, DPP-IV 억제제 또는 인크레틴은 경구 투여될 수 있다.

일부 경우에, 개체는 비만이거나 또는 과체중이다. 다른 경우에, 개체는 당뇨병에 걸린 사람 (PwD), 특히 T2DM이다. 특정 경우에, 개체는 T2DM이면서 비만이거나 또는 T2DM이면서 과체중이다.

방법은 개체의 체중 및/또는 혈당 및/또는 헤모글로빈 A1c (HbA1c)을 측정하거나 수득하고, 이같은 수득된 값을 하나 이상의 기준선 값 또는 기존에 수득된 값에 비교하여 치료 실효성을 평가하는 것과 같은 단계를 또한 포함할 수 있다.

방법은 또한 식이 및 운동과 조합될 수 있고/거나 상기 논의된 것들 이외의 추가적인 치료제와 조합될 수 있다.

넷째, 비만 및 비만-관련 질환 및 장애 예컨대 T2DM을 치료하는 것에서의 본원에서의 PYY 유사체의 용도가 기술되고, 이는 임의적으로 DPP-IV 억제제 및/또는 인크레틴 예컨대 GCG 또는 GCG 유사체, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드 또는GLP-1 유사체, GIP 또는 GIP 유사체, OXM 또는 OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 심지어 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴과 동시에, 별개로 또는 순차적으로 (즉, 조합되어) 투여될 수 있다.

다섯째, 비만 및 비만-관련 질환 및 장애 예컨대 T2DM을 치료하기 위한 약제를 제조하는 것에서의 본원에서의 PYY 유사체의 용도가 기술되고, 여기서 약제는 임의적으로 DPP-IV 억제제 및/또는 인크레틴 예컨대 GCG 또는 GCG 유사체, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드 또는GLP-1 유사체, GIP 또는 GIP 유사체, OXM 또는 OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 심지어 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴을 추가로 포함할 수 있다.

본원에서의 PYY 유사체의 한가지 장점은 체중 감소를 용이하게 할 수 있을 뿐만 아니라, 글루코스를 낮출 수도 있다는 것이다. 이러한 방식으로, 개체, 특히 T2DM에 걸리기 쉽거나 또는 T2DM에 걸린 개체가 외인성 인슐린으로 진행되는 것을 지연시킬 수 있고, 표적 HbA1c 목표를 유지할 수 있다. 또한, 본원에서의 PYY 유사체는 인슐린 민감화를 개선하는 것에 의해 혈당 제어를 강화할 수 있다. 조합된 GIP/GLP-1 및 PYY 유사체는 글루코스 제어 (인크레틴 + 잠재적인 인슐린 민감화제) 및 체중 감소 둘 다에 사용될 수 있다 (상승작용적). 특히, 본원에서의 PYY 유사체는 이를 필요로 하는 개체에게 투여되었을 때 단독으로 최대 약 12%의 체중 감소를 야기할 수 있고, 이를 필요로 하는 개체에게 투여되었을 때 추가적인 치료제 예컨대 인크레틴과 조합되어 최대 약 25%의 체중 감소를 야기할 수 있다.

본원에서의 PYY 유사체의 또 다른 장점은 반감기가 최대 약 24시간임에 의해 주 1회 투여를 허용할 수 있다는 것이다.

본원에서의 PYY 유사체의 또 다른 장점은 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)에 비교했을 때 물리화학적 안정성 및 상용성이 증가된다는 것과 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)에 비교했을 때 인크레틴이 있는 제형과의 상용성이 증가된다는 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 PYY 유사체, 제약 조성물 및 방법의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에서 기술된다.

또한, 문맥적으로 1개의 유일한 요소가 존재하는 것이 명확하게 요구되지 않는 한, 단수 형태 "하나"에 의해 요소를 언급하는 것은 1개를 초과하는 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 단수 형태 "하나"는 일반적으로 "적어도 1개"를 의미한다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, "약"은 값 또는 값들, 예를 들어, 언급된 농도, 길이, 분자량, pH, 서열 동일성, 시간 프레임, 온도, 부피 등의 통계적으로 의미가 있는 범위 이내를 의미한다. 이같은 값 또는 범위는 소정의 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 전형적으로 20% 이내, 더욱 전형적으로 10% 이내, 더욱 더 전형적으로 5% 이내일 수 있다. "약"에 의해 포함되는 허용가능한 변동은 연구 중인 특정한 시스템에 좌우될 것이고, 관련 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 이해될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산"은 화학적 관점에서, 하나 이상의 아민 기 및 하나 이상의 카르복실산 기의 존재를 특징으로 하고 다른 관능기를 함유할 수 있는 분자를 의미한다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 표준 아미노산으로 지정되고, 임의의 생명체에 의해 생산되는 대부분의 펩티드/단백질에 대한 빌딩 블럭으로서 사용되는 아미노산 20개의 세트가 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "접합에 이용가능한 관능기를 갖는 아미노산"은, 예를 들어 링커에 의해, 지방산에 접합될 수 있는 관능기를 갖는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산을 의미한다. 이같은 관능기의 예는 알키닐, 알케닐, 아미노, 아지도, 브로모, 카르복실, 클로로, 아이오도 및 티올 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가적으로, 이같은 관능기를 포함하는 천연 아미노산의 예는 C (티올), D (카르복실), E (카르복실), K (아미노) 및 Q (아미드)를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "유사체"는 표적 수용체를 활성화하고, 이러한 수용체에 대해 천연 효능제에 의해 유발되는 적어도 1개의 생체 내 또는 시험관 내 효과를 유발하는 화합물, 예컨대 합성 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "식욕감퇴 효과"는 식욕을 감소시켜, 더 낮은 음식 소비를 초래하고, 궁극적으로는 체중 감소에 이르는 본원에서의 PYY 유사체의 능력을 의미한다. 식욕감퇴 효과는 장 운동을 증가시키는 본원에서의 PYY 유사체의 능력을 지칭할 수도 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "C₁₆-C₂₂ 지방산"은 16 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 카르복실산을 의미한다. 본원에서 사용하기에 적절한 C₁₆-C₂₂ 지방산은 포화 일산 또는 포화 이산 ("이산"은 각각의 단부에 카르복실 기를 갖는다)일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "AUC"는 곡선하 면적을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "유효량"은 이를 필요로 하는 개체에게 단일 또는 다중 용량 투여 시, 진단 또는 치료 하의 이같은 개체에서 원하는 효과를 제공하는 (즉, 개체의 상태에서 임상적으로 측정가능한 차이, 예를 들어, 혈당 감소, HbA1c 감소, 및/또는 체중 또는 체지방 감소를 일으킬 수 있는) 하나 이상의 본원에서의 PYY 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양, 농도 또는 용량을 의미한다. 유효량은 공지된 기술을 사용하고 유사 상황에서 수득된 결과를 관찰하는 것에 의해 관련 기술의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 개체에 대한 유효량을 결정하는 것에서, 포유동물의 종, 그의 체격, 연령 및 일반 건강, 수반된 특정 질환 또는 장애, 질환 또는 장애의 정도 또는 수반 또는 중증도, 개체의 반응, 투여된 특정한 PYY 유사체, 투여 방식, 투여된 제제의 생체이용률 특성, 선택된 용량 체계, 동반 의약의 사용, 및 기타 관련 상황을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 요인이 고려된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "최대-절반 유효 농도" 또는 "EC₅₀"은 검정법 종점, 예컨대 용량-반응 곡선 (예를 들어, cAMP)의 50% 활성화/자극을 초래하는 화합물의 농도를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "~와 조합된"은 적어도 1개의 본원에서의 PYY 유사체를 하나 이상의 추가적인 치료제와 동시에, 순차적으로 또는 단일 조합 제형으로 투여하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "인크레틴 유사체"는 각각의 GIP, GLP-1, GCG 및 OXM, 특히 천연의 인간 GIP, GLP-1, GCG 및 OXM과 구조적 유사성을 갖지만 다수의 차이를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 인크레틴 유사체는 2개 또는 심지어 각각의 GIP, GLP-1 및 GCG 수용체에 대한 친화력 및 활성 (즉, 2개의 수용체 예컨대 OXM, GIP/GLP-1 또는 GLP-1/GCG에서의 효능제 활성, 또는 심지어 3개 모두의 수용체에서의 효능제 활성)을 또한 갖는다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이를 필요로 하는 개체"는 본원에 열거된 것들을 예를 들어 포함하는, 치료 또는 요법을 필요로 하는 병태, 질환, 장애 또는 증상을 갖는 포유동물, 예컨대 인간을 의미한다. 특히, 치료될 바람직한 개체는 인간이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "장기-작용"은 본원에서의 PYY 유사체의 결합 친화력 및 활성이 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1) 및/또는 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)보다 더 큰 기간 동안 계속되어, 적어도 1일 1회 또는 심지어 주 3회, 주 2회, 주 1회, 또는 매월만큼 덜 빈번하게 투약하도록 허용한다는 것을 의미한다. 본원에서의 PYY 유사체의 시간 작용 프로파일을 공지된 약동학 테스트 방법 예컨대 하기 실시예에 기술된 것을 사용하여 측정할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "비-표준 아미노산"은 세포에서 천연으로 발생할 수 있지만 펩티드 합성에 참여하지 않는 아미노산을 의미한다. 비-표준 아미노산은 펩티드의 구성성분일 수 있고, 종종 펩티드 내의 표준 아미노산의 변형에 의해 (즉, 번역후 변형을 통해) 생성된다. 비-표준 아미노산은 D-아미노산을 포함할 수 있고, 이는 상기 표준 아미노산과 반대되는 절대 키랄성을 갖는다.

본원에서 사용된 바와 같이, "비만인" 또는 "비만"은 개체가 >30.0 kg/m²인 체질량 지수 (BMI)를 갖는 상태를 의미한다. 일반적으로, 문헌 ["Overweight & Obesity", Center for Disease Control and Prevention] (cdc.gov/obesity/adult/defining.html에서 입수가능함); 및 ["Definitions & Facts for Adult Overweight & Obesity", National Institutes of Health] (iddk.nih.gov/health-information/weight-management/adult-overweight-obesity/definition-facts)을 참조한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "비만-관련 질환 또는 장애"는 협심증, 심혈관 질환, 담낭염, 담석증, 울혈성 심부전, 이상지질혈증, 지방간 질환, 생식능력 합병증, 글루코스 불내성, 통풍, 고혈압, 갑상선 저하증, 고인슐린혈증, 인슐린 저항성, 골관절염, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 임신 합병증, 심리적 장애, 수면 무호흡증 및 기타 호흡 문제, 스트레스성 요실금, 뇌졸중, T2DM, 요산 신장결석증 (신장 결석), 및 유방암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 담낭암, 신장암, 전립선암 및 직장암을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 비만에 의해 유도/악화되는 임의의 질환 또는 장애를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "과체중"은 개체가 약 25.0 kg/m² 내지 <30 kg/m²인 BMI를 갖는 상태를 의미한다. 상기 문헌을 참조한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "PYY"는 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 펩티드 YY를 의미한다. PYY는 천연 PYY (즉, 전장) 및 이의 변형 (즉, 천연 PYY의 부가, 결실 및/또는 치환) 둘 다를 포함한다. 구체적인 PYY는 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1) 및 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, "PYY 유사체" 또는 "PYY 유사체들"은 하나 이상의 NPY 수용체 예컨대 NPY2 수용체에서 천연 PYY의 하나 이상의 효과를 유발하는 PYY-유사 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 경우에, 본원에서의 PYY 유사체는 천연 PYY, 특히 인간 PYY 예컨대 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1) 및 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)에 비교했을 때 NPY 수용체, 특히 인간 NPY2 수용체에 더 높은 또는 더 낮은 친화력으로 결합할 수 있지만, 생체 내에서 또는 시험관 내에서 더 긴 반감기를 입증한다. 이러한 방식으로, 본원에서의 PYY 유사체는 NPY2 수용체 효능제로서 작용하는 합성 화합물이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "포화"는 지방산이 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 함유하지 않는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "민감화 효과"는 인슐린의 효과를 증가시키고 이에 의해 혈당을 낮추는 것을 돕는 본원에서의 PYY 유사체의 능력을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료함" 또는 "치료하다"는 기존의 병태, 질환, 장애 또는 증상의 진행 또는 중증도를 약화시키거나, 제한하거나, 역전시키거나, 늦추거나, 또는 정지시키는 것을 의미한다.

특정 약어가 하기와 같이 정의된다: "ACR"은 소변 알부민/소변 크레아틴 비를 지칭하고; "amu"는 원자 질량 단위를 지칭하고; "tBoc"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "cAMP"는 고리형 아데노신 모노포스페이트를 지칭하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "EIA/RIA"는 효소 면역검정법/방사성 면역검정법을 지칭하고; "hr"은 시간을 지칭하고; "HTRF"는 균질 시간-분해 형광을 지칭하고; "IV"는 정맥내를 지칭하고; "kDa"는 킬로돌턴을 지칭하고; "LC-MS"는 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 지칭하고; "MS"는 질량 분광법을 지칭하고; "OtBu"는 O-tert-부틸을 지칭하고; "Pbf"는 NG-2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐을 지칭하고; "RP-HPLC"는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭하고; "SQ"는 피하를 지칭하고; "SEM"은 평균의 표준 오차를 지칭하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하며; "Trt"는 트리틸을 지칭한다.

PYY 유사체

본원에서의 PYY 유사체는 천연 PYY 펩티드와 구조적 유사성을 갖지만, 다수의 구조적 차이를 갖는다. 예를 들어, 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1) 및/또는 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)에 비교했을 때, 본원에 기술된 PYY 유사체는 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1)의 번호매김과 관련하여 위치 3, 7, 9, 10, 17, 18, 22, 23, 30 및 31 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 특정 경우에, 본원에서의 PYY 유사체의 예시적 아미노산 서열은 하기를 포함한다 (천연의 인간 PYY (서열식별번호: 1)의 상응하는 잔기에 관련된 특정 변화는 볼드체이다):

.

본원에서의 PYY 유사체는 인간 NPY2 수용체에서의 충분한 활성을 초래하지만, NPY1, NPY4 및 NPY5 수용체에서는 불충분한 활성을 초래한다. 마찬가지로, 본원에서의 PYY 유사체는 수성 용액에서의 개선된 용해도, 개선된 화학적 및 물리적 제형 안정성, 연장된 약동학 프로파일, 및 면역원성에 대한 최소화된 잠재력을 포함하여, 치료적 치료로서의 그의 개발가능성과 관련된 이로운 속성을 갖는다.

일부 경우에, 본원에서의 PYY 유사체는 안정성에 영향을 미치도록 C-말단 아미노산에서 아미드화된다. 본원에 기술된 변화에 더하여, 유사체는 하나 이상의 추가적인 아미노산 변형을 포함할 수 있지만, 단, 유사체는 여전히 인간 NPY2 수용체에 결합하여 그를 활성화시킬 수 있다.

본원에서의 PYY 유사체는, 예를 들어 링커에 의해, 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 천연 또는 비천연 아미노산에 접합된 지방산을 추가로 포함한다 (즉, "아실화"). 일부 경우에, 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 아미노산은 C, D, E, K 및 Q일 수 있다. 특정한 경우에, 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 아미노산은 K이고, 여기서 접합은 K 측쇄의 ε-아미노 기에 대한 것이다.

여기서, PYY 유사체의 아실화는 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1)에 비교했을 때 위치 7에 있다. 이러한 방식으로, 지방산은 더 길게 작용하는 유사체를 제공하도록 알부민 결합제로서 작용할 수 있다.

지방산과 관련하여, 이는 접합에 이용가능한 아미노산의 관능기에 직접 결합에 의해 또는 링커에 의해 화학적으로 접합될 수 있다. 지방산의 길이 및 조성은 PYY 유사체의 반감기, PYY 유사체의 생체 내 효능, 및 PYY 유사체의 용해도 및 안정성에 영향을 미친다. C₁₆-C₂₂ 포화 지방 일산 또는 이산에 대한 접합은 이에 의해 바람직한 반감기, 바람직한 생체 내 효능, 및 바람직한 용해도 및 안정성 특성을 나타내는 PYY 유사체를 초래한다.

본원에서 사용하기 위한 예시적인 포화 C₁₆-C₂₂ 지방산은 헥사데칸산 (즉, 팔미트산, C₁₆ 일산), 헥사데칸디오산 (C₁₆ 이산), 헵타데칸산 (즉, 마르가르산, C₁₇ 일산), 헵타데칸디오산 (C₁₇ 이산), 스테아르산 (C₁₈ 일산), 옥타데칸디오산 (C₁₈ 이산), 노나데실산 (즉, 노나데칸산, C₁₉ 일산), 노나데칸디오산 (C₁₉ 이산), 에이코산산 (즉, 아라키드산, C₂₀ 일산), 에이코산디오산 (C₂₀ 이산), 헤네이코산산 (즉, 헤테이코실산, C₂₁ 일산), 헤네이코산디오산 (C₂₁ 이산), 도코산산 (즉, 베헨산, C₂₂ 일산), 도코산디오산 (C₂₂ 이산), 및 그의 분지형 및 치환된 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 경우에, C₁₆-C₂₂ 지방산은 포화 C₁₈ 일산, 포화 C₁₈ 이산, 포화 C₁₉ 일산, 포화 C₁₉ 이산, 포화 C₂₀ 일산, 포화 C₂₀ 이산, 및 그의 분지형 및 치환된 유도체일 수 있다. 특정한 경우에, C₁₆-C₂₂ 지방산은 팔미트산 또는 헥사데칸산, 스테아르산 또는 옥타데칸산, 또는 아라키드산 또는 에이코산산일 수 있다.

지방산을 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 천연 또는 비천연 아미노산에 접합시키는 것을 보조하기 위해, 본원에서의 PYY 유사체는 링커를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 링커는 AEEA, Ahx, E 또는 γE, 뿐만 아니라 그의 조합물 중 적어도 1개일 수 있다.

링커가 아미노산을 포함하는 경우, 이는 1 내지 4개의 E 또는 γE 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 경우에, 링커는 1 또는 2개의 E 및/또는 γE 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 1 또는 2개의 E 및/또는 γE 아미노산 잔기 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 링커는 AEEA 또는 Ahx와 조합되어 사용되는 1 내지 4개의 아미노산 잔기 (예를 들어, E 또는 γE 아미노산)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 링커는 E 및 γE 아미노산 잔기와 AEEA 또는 Ahx의 조합물일 수 있다. 또 다른 경우에, 링커는 1 또는 2개의 γE 아미노산 잔기 및 1 또는 2개의 AEEA 또는 Ahx의 조합물일 수 있다. 특정한 경우에, 링커는 (AEEA)₂

γE 모이어티, Ahx

E

γE 모이어티, 또는 AEEA

γE 모이어티일 수 있다.

예시적인 링커-지방산 모이어티는 (AEEA)₂

γE

C₂₀ 이산, Ahx

E

γE

C₁₈ 이산, 또는 AEEA

γE

C₁₈ 이산을 포함할 수 있다. 이러한 링커-지방산 모이어티의 구조적 특색은 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1) 또는 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)에 비교했을 때 개선된 반감기를 갖는 유사체를 초래한다.

총괄적으로, 예시적인 PYY 유사체는 하기의 것이다:

.

PYY 유사체가 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)의 것과 같이 34개의 아미노산을 갖는 것으로 기술되지만, 본원에서의 PYY 유사체는 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1)을 기초로 하는 아미노산 서열을 가질 수 있는 것으로 구상된다. 즉, PYY 유사체는 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1)의 2개의 N-말단 아미노산 (즉, 서열식별번호: 1의 위치 1 및 2의 "YP" 잔기)을 포함할 수 있고, 이는 천연의 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1)이 내인성으로 방출되는 경우에 발생할 것과 같이 후속적으로 개체에 투여되었을 때 생체 내에서 절단될 수 있다.

본원에서의 PYY 유사체의 반감기를 하기 실시예에 기술된 것을 예를 들어 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 마찬가지로, 다양한 인간 NPY 수용체 (예를 들어, NPY2R, NPY5R) 각각에 대한 본원에서의 PYY 유사체의 친화력을 하기 실시예에 기술된 것을 예를 들어 포함하는, 수용체 결합 수준을 측정하기 위한 관련 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 측정할 수 있고, 이는 통상적으로 억제 상수 (K_i) 값으로 표현된다. 또한, 각각의 수용체에서의 본원에서의 PYY 유사체의 활성도 하기 기술된 시험관 내 활성 검정법을 예를 들어 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 측정할 수 있고, 이는 통상적으로 EC₅₀ 값으로 표현된다.

상기 기술된 변형의 결과로, 본원에서의 PYY 유사체는 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)의 것보다 더 긴 반감기를 갖는다. 예를 들어, PYY 유사체는 약 5시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 23시간, 약 7시간 내지 약 22시간, 약 8시간 내지 약 21시간, 약 9시간 내지 약 20시간, 약 10시간 내지 약 19시간, 약 11시간 내지 약 18시간, 약 12시간 내지 약 17시간, 약 13시간 내지 약 16시간, 또는 심지어 약 14시간 내지 약 15시간의 반감기를 가질 수 있다. 대안적으로, 본원에서의 PPY 유사체는 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 또는 심지어 약 24시간, 특히 약 12시간인 반감기를 가질 수 있다.

마찬가지로, 본원에서의 PYY 유사체는 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)의 것보다 더 큰, 예컨대 약 2배 내지 약 10배인 NPY2 수용체에서의 결합 친화력을 갖는다. 대안적으로, 본원에서의 PYY 유사체는 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)의 것보다 최대 약 2배 더 큰, 약 3배 더 큰, 약 4배 더 큰, 약 5배 더 큰, 약 6배 더 큰, 약 7배 더큰, 약 8배 더 큰, 약 9배 더 큰, 또는 심지어 약 10배 더 큰, 특히 2배 내지 3배 더 큰 결합 친화력을 가질 수 있다.

제약 조성물

본원에서의 PYY 유사체는 제약 조성물로서 제형될 수 있고, 이는 비경구 경로 (예를 들어, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하 또는 경피)에 의해 투여될 수 있다. 이같은 제약 조성물 및 이를 제조하는 기술이 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" (D.B. Troy ed., 21^st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)]을 참조한다. 특정한 경우에, PYY 유사체는 SQ 투여된다. 그러나, 대안적으로, PYY 유사체는 다른 제약상 허용되는 경로를 위한 형태, 예를 들어, 경구 투여를 위한 정제 또는 기타 고체; 시간 방출 캡슐; 및 크림, 로션, 흡입제 등을 포함하는, 현재 사용되는 임의의 다른 형태로 제형될 수 있다.

생체 내 상용성 및 유효성을 개선하기 위해, 본원에서의 PYY 유사체는 제약상 허용되는 산/염기 부가염을 형성하도록 다수의 무기 및 유기 산/염기와 반응될 수 있다. 제약상 허용되는 염 및 이를 제조하기 위한 통상적인 방법이 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Stahl et al., "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, "2^nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011)]을 참조한다). 본원에서 사용하기 위한 제약상 허용되는 염은 나트륨, 트리플루오로아세테이트 히드로클로라이드 및 아세테이트 염을 포함한다.

본원에서의 PYY 유사체는 주사를 사용하여 자가-투여될 수 있거나 또는 의사에 의해 투여될 수 있다. 게이지 크기 및 주사 부피의 양은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 그러나, 주사 부피의 양은 ≤ 약 2 mL 또는 심지어 ≤ 약 1 mL일 수 있고, 바늘 게이지는 ≥ 약 27 G 또는 심지어 ≥ 약 29 G일 수 있다.

본 개시내용은 본원에서의 PYY 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 합성하는 데 유용한 신규 중간체 및 방법을 또한 제공하고, 따라서 포함한다. 본원에서의 중간체 및 PYY 유사체는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 화학 합성을 이용하는 방법이 하기 실시예에서 예시된다. 기술된 경로 각각에 대한 특정한 합성 단계들이 본원에 기술된 PYY 유사체를 제조하기 위해 상이한 방식으로 조합될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 쉽게 이용가능하다.

본원에서의 PYY 유사체는 일반적으로 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 본원에서의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물의 예시적인 용량은 개체 킬로그램 (kg) 당 밀리그램 (mg), 마이크로그램 (㎍), 나노그램 (ng) 또는 피코그램 (pg)의 양일 수 있다. 이러한 방식으로, 일일 용량은 약 1 ㎍ 내지 약 100 mg일 수 있다.

본원에서, 제약 조성물 내의 PYY 유사체의 유효량은 약 0.25 mg 내지 약 5.0 mg의 용량일 수 있다. 그러나, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일부 경우에는 유효량 (즉, 용량/투여량)이 전술한 범위의 하한 미만일 수 있고, 충분하고도 남을 수 있는 한편, 다른 경우에는 유효량이 더 큰 용량일 수 있고, 허용가능한 부작용과 함께 사용될 수 있다는 것을 이해한다.

PYY 유사체에 더하여, 제약 조성물은 추가적인 치료제, 특히 다른 항당뇨병제 또는 체중 감소제를 또한 포함할 수 있다. 일부 경우에, 추가적인 치료제는 인크레틴 또는 DPP-IV 억제제 중 적어도 1개일 수 있다. 예시적인 인크레틴은 GCG, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드, GIP, OXM, GCG 유사체, GLP-1 유사체, GIP 유사체, OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 심지어 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴 유사체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 방식으로, 제약 조성물은 유효량의 서열식별번호: 9의 PYY 유사체 및 인크레틴 또는 DPP-IV 억제제, 유효량의 서열식별번호: 10의 PYY 유사체 및 인크레틴 또는 DPP-IV 억제제, 유효량의 서열식별번호: 11의 PYY 유사체 및 인크레틴 또는 DPP-IV 억제제, 유효량의 서열식별번호: 12의 PYY 유사체 및 인크레틴 또는 DPP-IV 억제제, 또는 유효량의 서열식별번호: 13의 PYY 유사체 및 인크레틴 또는 DPP-IV 억제제를 포함할 수 있다.

인크레틴이 GLP-1 또는 GLP-1 유사체인 경우, 이는 알비글루타이드, 둘라글루타이드, 리라글루타이드, 세마글루타이드, 또는 그의 조합물, 특히 둘라글루타이드와 같은 GLP-1 또는 GLP-1 유사체일 수 있다.

PYY 유사체의 제조 및 사용 방법

본원에서의 PYY 유사체는 표준 수동 또는 자동 고체-상 합성 절차를 사용하여 관련 기술 분야에 공지된 다수의 펩티드 합성 방법을 통해 합성될 수 있다. 자동 펩티드 합성기가, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (캘리포니아주 포스터 시티) 및 프로틴 테크놀러지즈 인크(Protein Technologies Inc.) (애리조나주 투손)로부터 상업적으로 입수가능하다. 고체-상 합성을 위한 시약이 상업적 공급원으로부터 쉽게 입수가능하다. 간섭 기 차단, 반응 동안의 아미노산 보호, 커플링, 탈보호 및 미반응 아미노산의 캡핑을 위해 고체-상 합성기를 제조사의 설명서에 따라 사용할 수 있다.

전형적으로, N-α-카르바모일-보호 아미노산 및 수지에 부착된 성장 중인 펩티드 쇄 상의 N-말단 아미노산이 실온에서 커플링제 예컨대 디이소프로필-카르보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸의 존재 하에 불활성 용매 예컨대 DMF, N-메틸피롤리돈 또는 메틸렌 클로라이드에서 커플링된다. 생성된 펩티드 수지로부터 N-α-카르바모일 보호 기가 TFA 또는 피페리딘과 같은 시약을 사용하여 제거되고, 펩티드 쇄에 부가될 원하는 다음 N-α-보호 아미노산으로 커플링 반응이 반복된다. 적절한 아민 보호 기가 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Green & Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis," (John Wiley and Sons, 1991)]에 기술되어 있다. 가장 통상적으로 사용되는 예는 tBoc 및 Fmoc이다. 합성 완료 후, 산성 조건 하에 표준 처리 방법을 사용하여 동시적인 측쇄 탈보호로 펩티드가 고체-상 지지체로부터 절단된다.

관련 기술 분야의 기술자는 본원에 기술된 펩티드 쇄가 C-말단 카르복사미드로 합성된다는 것을 이해할 것이다. C-말단 아미드 펩티드의 합성을 위해, 링크(Rink) 아미드 MBHA 또는 링크 아미드 AM 링커가 혼입된 수지가 전형적으로 Fmoc 합성과 함께 사용되는 한편, MBHA 수지가 일반적으로 tBoc 합성과 함께 사용된다.

전형적으로 미정제 펩티드는 0.05% 내지 0.1% TFA의 물-아세토니트릴 구배를 사용하여 C8 또는 C18 칼럼 상에서 RP-HPLC를 사용하여 정제된다. 분석용 RP-HPLC에 의해 순도를 확인할 수 있다. MS에 의해 펩티드의 신원을 확인할 수 있다. 광범위한 pH 범위에 걸쳐 수성 완충제에서 펩티드가 가용화될 수 있다.

본원에서의 PYY 유사체의 한 가지 용도는 개체, 특히 과체중이거나 비만이고 T2DM에 걸린 개체에서 혈당 및/또는 체중을 감소시키기 위한 것이다. 본원에 기술된 바와 같은 PYY 유사체를 투여하는 것은 인슐린 민감화를 개선하는 것에 의한 혈당 제어 및 체중 감소를 초래할 수 있다. 이와 같이, 본원에서의 PYY 유사체는 체중 감소의 이점이 추가되면서 글루코스 저하 효능을 나타내어, 개체가 인슐린으로의 진행을 지연시킬 수 있고, 표적 HbA1c 목표를 유지할 수 있다.

방법은 본원에 기술된 단계들을 포함할 수 있고, 이들은 필수적이지는 않지만 기술된 바와 같은 순서로 수행될 수 있다. 그러나, 다른 순서 또한 생각될 수 있다. 또한, 개별적인 단계 또는 다중 단계가 병행으로 및/또는 시간 면에서 중첩되면서 및/또는 개별적으로 또는 여러 번 반복되는 단계로 수행될 수 있다. 또한, 방법은 추가적인 미특정 단계를 포함할 수 있다.

따라서 이같은 방법은 과체중이고 T2DM에 걸렸거나 또는 이에 걸리기 쉬운 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 비만이고 T2DM에 걸렸거나 또는 이에 걸리기 쉬운 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다.

방법은 개체에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 적어도 1개의 PYY 유사체를 투여하는 것을 또한 포함할 수 있고, 이는 또한 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물의 형태일 수 있다. 일부 경우에, 적어도 1개의 PYY 유사체/제약 조성물은 추가적인 치료제 예컨대 인크레틴 또는 DPP-IV 억제제를 포함할 수 있다.

적어도 1개의 PYY 유사체 및 임의적인 인크레틴 또는 DPP-IV 억제제의 농도/용량/투여량이 본원의 다른 곳에서 논의된다.

투여 경로와 관련하여, 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 경구로; 주사에 의해 (즉, 동맥내, 정맥내, 복막내, 뇌내, 뇌실내, 근육내, 안구내, 문맥내 또는 병변내); 지속 방출 시스템에 의해 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다. 특정 경우에, 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 볼루스 주사에 의해 또는 연속적으로 SQ 투여될 수 있다.

투약 빈도와 관련하여, 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 매일, 격일로, 주 3회, 주 2회, 주 1회 (즉, 매주), 2주마다 (즉, 격주로), 또는 매월 투여될 수 있다. 특정 경우에, 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 격일 SQ, 주 3회 SQ, 주 2회 SQ, 주 1회 SQ, 격주 SQ, 또는 매월 SQ로 투여된다. 특정한 경우에, 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 주 1회 (QW) SQ 투여된다.

대안적으로, 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 경구 투여될 수 있다. 상기와 같이, 그리고 투약 빈도와 관련하여, 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 매일, 격일로, 주 3회, 주 2회, 주 1회 (즉, 매주), 2주마다 (즉, 격주로), 또는 매월 투여될 수 있다. 특정 경우에, 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 격일 경구, 주 3회 경구, 주 2회 경구, 주 1회 경구, 또는 격주 경구로 투여될 수 있다. 특정한 경우에, PYY 유사체는 주 1회 경구 투여된다.

적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물이 유효량의 인크레틴과 조합되어 투여되는 경우와 관련하여, 인크레틴은 GCG 또는 GCG 유사체, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드 또는 GLP-1 유사체, GIP 또는 GIP 유사체, OXM 또는 OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 심지어 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴일 수 있다. GCG, GCG 유사체, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드, GLP-1 유사체, GIP, GIP 유사체, OXM, OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴은 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물과 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

또한, GCG, GCG 유사체, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드, GLP-1 유사체, GIP, GIP 유사체, OXM, OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴은 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물과 동일한 빈도 (즉, 격일, 주 2회, 또는 심지어 매주)로 투여될 수 있다. 대안적으로, GCG, GCG 유사체, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드, GLP-1 유사체, GIP, GIP 유사체, OXM, OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴은 적어도 1개의 PYY 유사체 또는 그를 포함하는 제약 조성물과 다른 빈도로 투여될 수 있다. 다른 경우에, GCG, GCG 유사체, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드, GLP-1 유사체, GIP, GIP 유사체, OXM, OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴은 QW로 투여된다. 또 다른 경우에, PYY 유사체는 SQ 투여되고, GCG, GCG 유사체, GLP-1, GLP-1 (7-36)_아미드, GLP-1 유사체, GIP, GIP 유사체, OXM, OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴은 경구 투여될 수 있다.

이러한 방법이 식이 및 운동과 조합될 수 있고/거나 상기 논의된 것들 이외의 추가적인 치료제와 조합될 수 있는 것이 추가로 구상된다.

실시예

하기의 비제한적인 실시예는 제한이 아니라 예시를 목적으로 제공된다.

실시예 1: PYY 유사체 1.

본 발명의 개념을 포함하는 한 PYY 유사체는 하기의 구조를 가질 수 있다:

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여기서, N-말단은 유리이고, C-말단 아미노산은 C-말단 1차 아미드로서 아미드화된다. 위치 7의 K는 (Ahx-E-(γE)-CO-(CH₂)₁₆-COOH로의 위치 7의 K 측쇄의 ε-아미노 기에 대한 접합을 통해 화학적으로 변형된다.

RAPP AM-링크 아미드 수지 (H40023 폴리스티렌 AM RAM, 랩 폴리메레 게엠베하(Rapp polymere GmbH))로부터 출발하여 심포니X(SymphonyX) 자동 펩티드 합성기 (PTI 프로틴 테크놀러리즈 인크(PTI Protein Technologies Inc.)) 상에서 Fmoc/t-Bu 전략을 사용하여 고체-상 펩티드 합성에 의해 서열식별번호: 9에 따른 PYY 유사체가 생성된다. 3시간 동안 25℃에서 DMF 내의 10 당량의 아미노산, 0.9 M 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 0.9 M 옥시마(Oxyma) (1:1:1 몰비)를 사용하여 아미노산 커플링을 수행한다. DMF 내의 25% 피페리딘 용액을 사용하여 탈보호를 수행한다.

상기 기술된 바와 같이 펩티드-수지를 신장시킨 후, 디클로로메탄 (DCM) 내의 30% 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP)을 사용하여 위치 7의 K에 존재하는 MTT 보호 기를 제거한다. 위치 7의 K의 측쇄를 연장시키기 위한 Fmoc/t-Bu 전략을 사용하는 추가적인 커플링/탈보호 사이클은 Fmoc-6-아미노헥산산 (켐-임펙스 인터내셔널(Chem-Impex International) 카탈로그# 02490), Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OH)-OtBu (켐펩(ChemPep) 카탈로그# 100703) 및 HOOC-(CH₂)₁₆-COOtBu를 수반한다. 모든 커플링에서, 3 당량의 빌딩 블럭이 3시간 동안 25℃에서 DMF 내의 PyBOP (3 당량) 및 DIEA (6 당량)와 함께 사용된다.

동반적인 수지로부터의 절단 및 측쇄 보호 기 제거를 2시간 동안 25℃에서 TFA:트리이소프로필실란:1,2-에탄디티올:메탄올:티오아니솔 80:5:5:5:5 (v/v)를 함유하는 용액에서 수행한 후, 저온 에테르로 침전시킨다. 미정제 펩티드를 페닐 헥실 칼럼 (페노메넥스(Phenomenex), 루나(Luna); 5 ㎛, 100A) 상에서 RP-HPLC에 의해 >99% 순도 (15-20% 정제 수율)로 정제하고, 여기서 적절한 분획을 풀링하고, 동결건조시킨다.

PYY 유사체의 순도를 분석용 RP-HPLC로 검사하고, LC/MS를 사용하여 신원을 확인한다 (관측치: M+3H⁺/3 = 1659.2 (+/-0.2); 계산치: M+3H⁺/3 = 1659.2; 관측치: M+4H⁺/4 = 1244.6 (+/-0.2); 계산치: M+4H⁺/4 = 1244.6; 관측치: M+5H⁺/5 = 995.9 (+/-0.2); 계산치: M+5H⁺/5 = 995.9).

실시예 2: PYY 유사체 2.

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실시예 1에서와 같이, N-말단은 유리이고, C-말단 아미노산은 C-말단 1차 아미드로서 아미드화된다. 그러나, 대조적으로, 위치 7의 K가 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)₂-(γE)-CO-(CH₂)₁₈-COOH로의 K 측쇄의 ε-아미노 기에 대한 접합을 통해 화학적으로 변형된다.

상기 실시예 1에서 기술된 것과 유사하게, 고체-상 펩티드에 의해 서열식별번호: 10에 따른 PYY 유사체가 생성된다. 따라서, FMOC-NHPEG₂-CH₂COOH 및 HOOC-(CH₂)₁₈-COOtBu가 3시간 동안 25℃에서 3 당량의 빌딩 블럭을 DMF 내의 PyBOP (3 당량) 및 DIEA (6 당량)와 함께 사용하여 MTT 절단 후에 측쇄에 부착된다.

PYY 유사체의 순도를 분석용 RP-HPLC로 검사하고, LC/MS를 사용하여 신원을 확인한다 (관측치: M+3H⁺/3 = 1665.4 (+/-0.2); 계산치: M+3H⁺/3 = 1665.5; 관측치: M+4H⁺/4 = 1249.3 (+/-0.2); 계산치: M+4H⁺/4 = 1249.4; 관측치: M+5H⁺/5 = 999.7 (+/-0.2); 계산치: M+5H⁺/5 = 999.7).

실시예 3: PYY 유사체 3.

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실시예 1에서와 같이, N-말단은 유리이고, C-말단 아미노산은 C-말단 1차 아미드로서 아미드화된다. 그러나, 대조적으로, 위치 7의 K가 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)-(γE)-CO-(CH₂)₁₆-COOH로의 K 측쇄의 ε-아미노 기에 대한 접합을 통해 화학적으로 변형된다.

상기 실시예 1에서 기술된 것과 유사하게, 고체-상 펩티드에 의해 서열식별번호: 11에 따른 PYY 유사체가 생성된다. 따라서, FMOC-NHPEG₂-CH₂COOH 및 HOOC-(CH₂)₁₆-COOtBu가 3시간 동안 25℃에서 3 당량의 빌딩 블럭을 DMF 내의 PyBOP (3 당량) 및 DIEA (6 당량)와 함께 사용하여 MTT 절단 후에 측쇄에 부착된다.

PYY 유사체의 순도를 분석용 RP-HPLC로 검사하고, LC/MS를 사용하여 신원을 확인한다 (관측치: M+3H⁺/3 = 1664.7 (+/-0.2); 계산치: M+3H⁺/3 = 1664.9; 관측치: M+4H⁺/4 = 1248.9 (+/-0.2); 계산치: M+4H⁺/4 = 1248.9; 관측치: M+5H⁺/5 =999.3 (+/-0.2); 계산치: M+5H⁺/5 =999.3).

실시예 4: PYY 유사체 4.

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실시예 1에서와 같이, N-말단은 유리이고, C-말단 아미노산은 C-말단 1차 아미드로서 아미드화된다. 그러나, 대조적으로, 위치 7의 K가 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)₂-(γE)-CO-(CH₂)₁₆-COOH로의 K 측쇄의 ε-아미노 기에 대한 접합을 통해 화학적으로 변형된다.

상기 실시예 1에서 기술된 것과 유사하게, 고체-상 펩티드에 의해 서열식별번호: 12에 따른 PYY 유사체가 생성된다. 따라서, FMOC-NHPEG₂-CH₂COOH 및 HOOC-(CH₂)₁₆-COOtBu가 3시간 동안 25℃에서 3 당량의 빌딩 블럭을 DMF 내의 PyBOP (3 당량) 및 DIEA (6 당량)와 함께 사용하여 MTT 절단 후에 측쇄에 부착된다.

PYY 유사체의 순도를 분석용 RP-HPLC로 검사하고, LC/MS를 사용하여 신원을 확인한다 (관측치: M+3H⁺/3 = 1664.8 (+/-0.2); 계산치: M+3H⁺/3 = 1665.5; 관측치: M+4H⁺/4 = 1248.9 (+/-0.2); 계산치: M+4H⁺/4 = 1249.4; 관측치: M+5H⁺/5 =998.9 (+/-0.2); 계산치: M+5H⁺/5 =995.7).

실시예 5: PYY 유사체 5.

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실시예 1에서와 같이, N-말단은 유리이고, C-말단 아미노산은 C-말단 1차 아미드로서 아미드화된다. 그러나, 대조적으로, 위치 7의 K가 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)₂-(γE)₃-CO-(CH₂)₁₈-COOH로의 K 측쇄의 ε-아미노 기에 대한 접합을 통해 화학적으로 변형된다.

상기 실시예 1에서 기술된 것과 유사하게, 고체-상 펩티드에 의해 서열식별번호: 13에 따른 PYY 유사체가 생성된다. 따라서, FMOC-NHPEG₂-CH₂COOH 및 HOOC-(CH₂)₁₈-COOtBu가 3시간 동안 25℃에서 3 당량의 빌딩 블럭을 DMF 내의 PyBOP (3 당량) 및 DIEA (6 당량)와 함께 사용하여 MTT 절단 후에 측쇄에 부착된다.

PYY 유사체의 순도를 분석용 RP-HPLC로 검사하고, LC/MS를 사용하여 신원을 확인한다 (관측치: M+3H⁺/3 = 1732.2 (+/-0.2); 계산치: M+3H⁺/3 = 1732.3; 관측치: M+4H⁺/4 = 1299.4 (+/-0.2); 계산치: M+4H⁺/4 = 1299.5; 관측치: M+5H⁺/5 = 1039.7(+/-0.2); 계산치: M+5H⁺/5 = 1039.8).

실시예 6: PYY 유사체의 시험관 내 활성.

(1) hNPY1, hNPY2, hNPY4, 및 hNPY5 수용체에 대한 시험관 내 결합

목적:

하기의 인간 (h) 수용체에 대한 소 혈청 알부민 (BSA)의 부재 하의 실시예 1 내지 5의 PYY 유사체의 시험관 내 결합 친화력 (K_i)을 평가하기 위한 것이다: hNPY1R, hNPY2R, hNPY4R 및 hNPY5R. 각각의 재조합 수용체를 과발현하는 세포주로부터 제조된 막 및 관련된 [¹²⁵I]-표지 펩티드로의 경쟁적 방사성 리간드 결합 검정법이 섬광 근접 검정법 (SPA) 방법에서 사용된다. 연관된 천연 펩티드인 PYY_1-36 (서열식별번호: 1), PYY_3-36 (서열식별번호: 2) 및 췌장 폴리펩티드_1-36 (PP_1-36; 서열식별번호: 14)에 대한 결합 친화력이 각각의 검정법에서 대조군으로서 결정된다.

방법:

PYY 유사체, 천연의 인간 PYY_1-36 및 대조군 PYY_3-36이 릴리 리서치 래버러토리즈(Lilly Research Laboratories) (미국 인디애나주 인디애나폴리스)에서 합성되고, LC/MS, NMR, 및 LC/UV 분석에 의해 특성화된다 (99.5% 순도). 펩티드 함량은 80% 분말 질량으로 추정된다. 펩티드는 100% DMSO 내의 10 mM 모액으로 제조되고, 검정법에서 테스트하기 직전까지 -20℃에서 냉동으로 유지된다.

hNPY1R의 경우, CHO 세포를 사용하여 일시적인 과발현이 수행된다. hNPY2R 및 hNPY4R의 경우는 수용체 cDNA를 pcDNA3.1 발현 플라스미드 내로 서브클로닝하고, 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포 내로 형질감염시킨 후, 제네티신(Geneticin)으로 선별하는 것에 의해 안정적으로 형질감염된 세포주가 제조된다. hNPY5R 클로닝은 멀티스팬 인크(Multispan, Inc.) (캘리포니아주 헤이워드)에서 수행된다.

hNPY1R, hNPY2R, mNPY2R 및 hNPY4R 미정제 세포 막의 제조를 위해, 2가지 상이한 방법 (하기 기술됨)이 이용된다. hNPY5R 막은 멀티스팬 인크 (#MCG1275)로부터 구입한다.

방법 1- hNPY2R 및 hNPY4R 막의 경우, 냉동된 세포 펠릿을 50 mM 트리스 HCl, pH 7.5, 및 EDTA가 있는 로슈 컴플리트(Roche Complete)™ 프로테아제 억제제 (#1169749001)를 함유하는, 습식 세포 페이스트 1 그램 당 10 mL의 저장성 균질화 완충제에서 얼음 상에서 용해시킨다. 25회 스트로크에 대해 테프론(Teflon)® 막자가 장착된 유리 포터-엘베헴(Potter-Elvehjem) 균질화기를 사용하여 세포 현탁액을 파괴한다. 균질화물을 4℃에서 10분 동안 1100×g에서 원심분리한다. 상청액을 수집하고 얼음 상에서 보관하는 한편, 펠릿을 상기 기술된 바와 같이 균질화 완충제에 재현탁시키고 다시 균질화시킨다. 균질화물을 1100×g에서 10분 동안 원심분리한다. 제2 상청액을 제1 상청액과 조합하고, 4℃에서 1시간 동안 35000×g에서 원심분리한다. 생성된 막 펠릿을 약 1 내지 3 mg/mL로 프로테아제 억제제를 함유하는 균질화 완충제에 재현탁시키고, 액체 질소에서 급속 냉동시키고, 사용할 때까지 분취량으로서 -80℃ 냉동고에서 보관한다. BSA를 표준물로 하여 BCA 단백질 검정법 키트 (피어스(Pierce), #23225)를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.

방법 2- hNPY1R 막의 경우, 냉동된 세포 펠릿을 25 mM 트리스 HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl₂, 25 유닛/mL DNase I (인비트로젠(Invitrogen), #18047-019) 및 EDTA가 없는 로슈 컴플리트™ 프로테아제 억제제 (#11836170001)를 함유하는, 습식 세포 페이스트 1 그램 당 5 mL의 저장성 균질화 완충제에서 얼음 상에서 용해시킨다. 25회 스트로크에 대해 테프론® 막자가 장착된 유리 포터-엘베헴 균질화기를 사용하여 세포 현탁액을 파괴한다. 균질화물을 50 mL 원뿔형 튜브에서 4℃에서 15분 동안 1800×g에서 원심분리한다. 상청액을 수집하고 얼음 상에서 보관하는 한편, 펠릿을 DNase I이 균질화 완충제에서 사용되지 않는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 균질화 완충제에 재현탁시키고 다시 균질화시킨다. 균질화물을 1800×g에서 15분 동안 원심분리한다. 제2 상청액을 제1 상청액과 조합하고, 4℃에서 30분 동안 25000×g에서 원심분리한다. 생성된 막 펠릿을 약 2 mg/mL로 프로테아제 억제제를 함유하는 균질화 완충제에 재현탁시키고, 분취하고, 사용할 때까지 -80℃ 냉동고에서 보관한다. BSA를 표준물로 하여 BCA 단백질 검정법 키트 (피어스(Pierce), #23225)를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.

일반적인 결합 검정법 방법 - 다양한 수용체/방사성 리간드 상호작용에 대한 평형 해리 상수 (K_d)를 화합물 테스트에 대해 하기 기술된 것과 동일한 시약 및 완충제를 사용하여 포화 결합 분석으로부터 결정한다. 이러한 연구에서 사용된 수용체 제제에 대해 결정된 K_d 값은 하기와 같다: hNPY2R, 0.0047 nM; hNPY1R, 0.07 nM; hNPY4R, 0.084 nM; 및 hNPY5R, 0.896 nM.

hNPY1R 수용체 결합 프로토콜 - hNPY1R에 대한 PYY 유사체 펩티드 및 PYY_1-36의 수용체 결합 친화력 (K_i)을 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) (매사추세츠주 월섬)로부터 수득된 인간 재조합 [¹²⁵I]-PYY_1-36 (#NEX341, 2200 Ci/mmol)으로 경쟁적 방사성 리간드 결합 검정법으로부터 결정한다. 폴리비닐톨루엔 (PVT) 밀 배아 응집소-커플링 SPA 비드 (#RPNQ0001, 퍼킨 엘머)를 사용하여 SPA 방법으로 검정법을 수행한다. 검정법 완충제 (25 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM MgCl₂, 2.5 mM CaCl₂, 및 0.2% w/v 바시트라신(Bacitracin) (RPI, #32000))가 시약 제조에 사용된다. PYY 유사체 및 PYY_1-36을 해동하고, 테칸 에보(Tecan Evo) 액체 취급기를 사용하여 100% DMSO에서 3배 연속 희석한다 (10 포인트 농도 반응 곡선). DMSO 및 펩티드 농도의 수준을 감소시키도록 검정법 완충제 내로의 펩티드의 20배 단계적 감소 희석이 이루어진 후, 검정법 플레이트로 첨가한다. 다음으로, 5 ㎕의 연속 희석 펩티드 또는 DMSO를 45 ㎕ 검정법 완충제 또는 미표지 PYY_1-36 대조군 (비-특이적 결합 또는 NSB, 10 nM 최종 농도)을 함유하는 코닝(Corning)®3632 투명 바닥 검정법 플레이트 내로 옮긴다. 그 후, 50 ㎕ [¹²⁵I]-PYY_1-36 (0.05 nM 최종 농도) 및 50 ㎕ hNPY1R 막 (1.0 ㎍/웰)을 첨가한다. 최종 첨가는 50 ㎕의 WGA SPA 비드 (50 ㎍/웰)이다. 최종 DMSO 농도는 0.125%이다. 플레이트를 밀봉하고, 플레이트 진탕기 (설정 6)에서 1분 동안 혼합하고, 실온에서의 10시간의 인큐베이션/비드 침강 시간 후 퍼킨엘머의 트릴룩스 마이크로베타(Trilux MicroBeta)® 섬광 카운터로 판독한다. 반응 곡선에서 테스트된 펩티드에 대한 최종 검정법 농도 범위는 하기와 같다: PYY 유사체 (2.5 μM 내지 0.13 nM) 및 PYY_1-36 (10 nM 내지 0.5 pM).

hNPY2 수용체 결합 프로토콜 - hNPY2R에 대한 PYY 유사체 펩티드 및 PP_1-36의 수용체 결합 친화력 (K_i)을 hNPY1R에 대해 상기 기술된 바와 같이 경쟁적 방사성 리간드 결합 검정법으로부터 결정한다. 반응 곡선에서 테스트된 펩티드에 대한 최종 검정법 농도 범위는 하기와 같다: PYY 유사체 (0.1 μM 내지 5 pM) 및 PYY_3-36 (10 nM 내지 0.5 pM).

hNPY4R 수용체 결합 프로토콜 - hNPY4R에 대한 PYY 유사체 펩티드 및 PP_1-36의 수용체 결합 친화력 (K_i)을 hNPY1R에 대해 상기 기술된 바와 같이 경쟁적 방사성 리간드 결합 검정법으로부터 결정한다. 반응 곡선에서 테스트된 펩티드에 대한 최종 검정법 농도 범위는 하기와 같다: PYY 유사체 (2.5 μM 내지 0.13 nM) 및 PYY_1-36 (10 nM 내지 0.5 pM).

hNPY5R 수용체 결합 프로토콜 - hNPY5R에 대한 PYY 유사체 펩티드 및 PYY_1-36의 수용체 결합 친화력 (K_i)을 hNPY1R에 대해 상기 기술된 바와 같이 경쟁적 방사성 리간드 결합 검정법으로부터 결정한다. 반응 곡선에서 테스트된 펩티드에 대한 최종 검정법 농도 범위는 하기와 같다: PYY 유사체 (1 μM 내지 10 pM) 및 PYY_1-36 (1 μM 내지 10 pM).

NPY 수용체 결합 검정법에 대한 데이터 분석 - 하기 공식에 제시된 바와 같이, 개별적인 분 당 카운트 (CPM) 값으로부터 비-특이적 결합 (NSB, 과량의 미표지 PYY_1-36, PYY_3-36, 또는 PP_1-36 각각의 존재 하에서의 결합)을 차감하고, 또한 비-특이적 결합을 차감하는 것에 의해 수정된 전체 결합 신호 (됨)로 나누는 것에 의해, PYY 유사체, PYY_1-36, PYY_3-36, 또는 PP_1-36의 농도 곡선에 대한 원시 CPM 데이터가 퍼센트 특이적 억제로 변환된다:

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4-파라미터 (곡선 최대값, 곡선 최소값, IC₅₀, 힐 슬로프(Hill slope)) 비-선형 회귀 루틴 (진데이터 스크리너(Genedata Screener), 버전 13.0.5, 진데이터 아게(Genedata AG), 스위스 바젤)을 사용하여 데이터를 분석한다. 공식 K_i= IC₅₀/(1 + D/K_d) [식 중, D = 실험에서의 방사성 리간드의 농도이고, IC₅₀은 결합의 50% 억제를 야기하는 농도이고, K_d는 포화 결합 분석으로부터 결정된 방사성 리간드의 평형 결합 친화력 상수이다 (상기 열거됨)]을 기초로 상대적 IC₅₀ 값으로부터 친화력 (K_i)이 계산된다. 한정어 (>)는 경쟁자의 부재 하의 최대 결합에 비교하여 데이터가 50% 억제에 도달하지 않았고, 이에 의해 K_i가 검정법에서 테스트된 화합물의 최고 농도를 사용하여 계산된다는 것을 가리킨다.

K_i에 대한 보고된 값은 하기에 제시된 바와 같이 기하 평균으로서 계산된다:

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평균의 표준 오차 (SEM)는 하기에 제시된 바와 같이 델타 방법을 사용하여 계산된다:

[식 중, SD는 표준 편차이고, n은 독립적인 실행의 수이며, ln(10)은 10의 자연 로그이다].

hNPY2R (Y2) 대 hNPY5R (Y5), hNPY4R (Y4), 및/또는 hNPY1R (Y1)에 대한 펩티드의 선택성은 nM 단위의 hNPY2R 결과로 나누는 것에 의해 계산된다.

결과:

표 1: hNPY1R, hNPY2R, hNPY4R 및 hNPY5R에 대한 시험관 내 결합 (K_i).

상기에 제시된 바와 같이, 실시예 1-5의 PYY 유사체는 hNPY2 수용체에 대해 고도로 선택적이고, 심지어 천연의 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)에 대비하여 hNPY5, hNPY4 및 hNPY1 수용체에 대한 감소된 결합 친화력을 입증한다.

(2) 인간 NPY2 수용체 상에서의 시험관 내 cAMP 활성

목적:

재조합 인간 NPY2 수용체를 과발현하는 HEK 293 세포에서의 포스콜린-유도 세포내 cAMP 생산의 억제를 측정하는 것에 의해 천연의 인간 PYY_3-36에 비교하여 실시예 1 내지 5의 PYY 유사체의 시험관 내 기능적 활성을 결정하기 위한 것이다.

방법:

상기에서 수용체 결합 검정법에서 기술된 바와 같이 PYY 유사체 및 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)를 합성하고, 특성화하고, 보관한다.

수용체 클로닝 - 수용체 cDNA를 pcDNA3.1 발현 플라스미드 내로 서브클로닝하고, 이를 HEK 293 세포 내로 형질감염시킨 후, 제네티신으로 선별하는 것에 의해 hNPY2 수용체에 대해 안정적으로 형질감염된 세포주가 제조된다. 계대 9의 분취량의 세포 (1×10⁷개의 세포/mL)를 제조하고, 액체 질소 탱크의 증기 상에서 냉동으로 유지시킨다. 이러한 냉동된 분취량이 검정법 시점에 사용된다. 세포는 수 개월에 걸쳐 95%를 초과하는 생존력을 유지한다.

hNPY2R cAMP 검정법 - 재조합 hNPY2R을 과발현하는 HEK 293 세포를 사용하여 PYY 유사체 또는 PYY_3-36에 의한 포스콜린-유도 cAMP 생산의 억제를 측정한다. 냉동된 분취량의 세포를 37℃ 수조에서 해동시킨다. 세포를 10 mL의 배양 배지 (라이프 테크(Life Tech) 11090-081로부터의 MEM 세포 배양 배지 + 라이프 테크 10082-147로부터의 10% FBS, 라이프 테크 25030-081로부터의 1 mM L-글루타민, 라이프 테크 11140-050으로부터의 1×NEAA, 라이프 테크 11360-070으로부터의 피루브산나트륨, 라이프 테크 15240-062로부터의 1× 항생제-항진균제)가 있는 50 mL 튜브로 옮기고, 벡맨(Beckman) 탁상용 원심분리기에서 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 10 mL의 세포 배양 배지에 재현탁시킨 후, 40 ㎛ 여과기에 통과시킨다. 벡맨-쿨터(Beckman-Coulter)로부터의 바이-셀 애널라이저(Vi-Cell Analyzer) (바이-셀 XR 2.03)를 사용하여 세포 수 및 세포 생존율의 정확한 카운트를 결정한다. 웰 당 8000개의 세포를 콤비-팁 디스펜서(Combi-Tip Dispenser) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 백색 384웰 검정법 플레이트 (코닝(Corning), 폴리-D-라이신 코팅, 백색/불투명, 카탈로그# 356661) 내로 플레이팅한다. 플레이트를 1초 동안 1000 rpm에서 원심분리하고, 18 내지 20시간 동안 37℃에서 5% CO₂-제어 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 종이 타월에 부드럽게 털어서 배양 배지를 검정법 플레이트로부터 제거한다. 10 ㎕의 검정법 완충제 [1× HBSS (하이클론(Hyclone), #SH3026801), 20 mM HEPES, pH 7.5 (하이클론 #SH30237.01), 0.1% w/v 카세인 (CTL 사이언티픽 서플라이 코포레이션(CTL Scientific Supply Corp.), #440203H), 500 μM IBMX (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) #I5876)]를 콤비-팁 디스펜서를 사용하여 웰에 첨가한 후, 10초 동안 1500 rpm에서 원심분리한다. 음파 분배 기술 (랩사이트 에코(Labcyte Echo) 550)을 사용하여 100% DMSO에서 2배 희석의 농도 반응 곡선 (20 포인트)을 제조한다. 세포를 45분 동안 37℃에서 PYY 유사체 또는 인간 PYY_3-36으로 처리한 후 (최종 DMSO 농도 = 1%), 45분 동안 37℃에서 1 μM 포스콜린 (시그마-알드리치, #F6886)으로 자극한다. 시스바이오 cAMP-G_i 다이나믹 키트(CisBio cAMP-G_i Dynamic Kit) (#62AM9PEB)를 사용하여 세포내 cAMP를 정량한다. 간략하게, 세포 용해 완충제 (10 ㎕) 내의 cAMP-d2 접합체를 첨가한 후, 또한 세포 용해 완충제 (10 ㎕) 내에 있는 항체 항-cAMP-Eu³⁺-크립테이트를 첨가하는 것에 의해 HTRF 키트 시약을 사용하여 세포 내의 cAMP 수준을 검출한다. 생성된 경쟁적 검정법을 적어도 60분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 320 nm에서의 여기 및 665 nm 및 620 nm에서의 방출로 퍼킨엘머의 인비전(Envision)™ 기구 상에서 판독한다. 반응 곡선에서 테스트된 펩티드에 대한 최종 검정법 농도 범위는 하기와 같다: PYY 유사체 (0.1 μM 내지 0.2 pM) 및 인간 PYY_3-36 (10 nM 내지 0.02 pM). 공지된 cAMP 농도 (0.5 μM 내지 1 pM)의 표준 곡선을 검정법 완충제에서 제조한다. 첨가된 경쟁자가 부재하거나 또는 과량의 인간 PYY_3-36이 첨가된 웰이 각각 최대 반응 및 억제제 대조군으로서 각각의 플레이트 상에 포함된다.

hNPY2 수용체 cAMP 검정법에 대한 데이터 분석 - 시간-분해 형광 방출을 사용하여 형광 비 (665 nM/620 nm)를 계산하고, 이는 존재하는 cAMP의 양에 반비례한다. PYY 유사체 및 인간 PYY_3-36에 대한 신호가 상대적 반응 단위 (665 nm/620 nm에서의 방출 * 10,000, y축) 대 cAMP의 농도 (x축)으로 플롯팅된 cAMP 표준 곡선을 사용하여 웰 당 nM cAMP로 변환된다.

각각의 웰에서의 생성된 cAMP의 양 (nM)은 하기 공식에 제시된 바와 같이 포스콜린만으로 관찰된 최대 반응의 퍼센트로 변환된다:

[식 중, 억제제 대조군은 첨가된 과량의 인간 PYY_3-36의 존재 하에 생산된 cAMP이고, 최대 반응은 포스콜린만 존재하는 경우에 생산된 cAMP이며, 펩티드는 테스트 펩티드의 존재 하에 생산된 cAMP이다].

퍼센트 특이적 억제 (y축)를 경쟁자의 농도 (x축)에 대해 플롯팅하고, 하기 정의된 바와 같이 4-파라미터 (곡선 상단, 곡선 하단, IC₅₀, 힐 슬로프) 비-선형 회귀 루틴 (진데이터 스크리너, 버전 13.0.5, 진데이터 아게, 스위스 바젤)을 사용하여 분석한다:

상대적 IC₅₀ 값은 포스콜린-유도 cAMP 생산의 50% 억제를 야기하는 농도를 나타낸다.

IC₅₀에 대한 보고된 값은 하기에 제시된 바와 같이 기하 평균으로서 계산된다:

.

결과:

표 2: hNPY2 수용체 상에서의 시험관 내 cAMP 활성.

상기에 제시된 바와 같이, 실시예 2가 인간 PYY_3-36에 대비하여 12배 더 낮은 효능에서 가장 약한 효능을 나타내면서, cAMP 검정법으로부터의 결과는 hNPY2 수용체 상에서의 실시예 1-5의 PYY 유사체의 기능적 활성을 입증한다.

(3) hNPR2 수용체 상에서의 시험관 내 GTPγS 활성

목적:

실시예 1 내지 5의 PYY 유사체에 의한 G-단백질의 수용체-매개 활성화를 평가하기 위한 것이다. 비-가수분해성 GTP 유사체인 GTPγ[³⁵S]를 사용하여 수용체-매개 활성화를 측정할 수 있다. G-단백질-커플링 수용체의 효능제-매개 자극은 막-회합 Gαβγ-단백질 이종삼량체 복합체의 활성화를 초래한다. 이는 세포외 신호를 전달하여 세포내 경로를 변형시키는 것에서의 제1 단계를 나타낸다. 본원에서, GTPγ[³⁵S] 기능적 검정법을 사용하여 hNPY2 수용체에서의 다양한 PYY 유사체의 효능을 평가한다.

방법:

상기에서 수용체 결합 검정법에서 기술된 바와 같이 PYY 유사체, 인간 PYY_1-36 (서열식별번호: 1) 및 대조군 펩티드 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)를 합성하고, 특성화하고, 보관한다.

각각의 테스트 펩티드에 대해, 1/3 log 희석으로의 농도 반응 곡선 (CRC) (로그 농도 -6.52 내지 -12.52)을 0.2% 바시트라신 (U.S. 바이올로지컬스(U.S. Biologicals) #11805) 및 0.5% DMSO가 보충된 검정법 완충제 (20 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl₂, 1 mM EDTA)에서 해밀튼 님부스(Hamilton NIMBUS) 액체 취급기로 완성한다. 바시트라신 및 DMSO의 최종 검정법 농도는 각각 0.05% 및 0.125%이다. hNPY2R 막 (멀티스팬 #HTS066M)을 20 uM GDP (시그마(Sigma) #G-7127) 및 6 ug/mL 사포닌(Saponin) (시그마 #S-4521)이 보충된 검정법 완충제에서 7.5 ug/mL의 농도로 제조하고, hNPY2R 막을 20분 동안 실온에서 인큐베이션 한 후, 검정법에 첨가한다. GTPγS[³⁵S] (퍼킨엘머 #NEG030H)를 0.6 nM의 농도로 검정법 완충제에서 제조한다. WGA SPA 비드 (퍼킨엘머 #RPNQ0001)를 검정법 완충제에서 12 mg/mL의 농도로 제조한다. 200 uL의 최종 부피에 대해 먼저 100 uL를 hNPY2R 막에, 그 후 50 uL의 CRC 용액을, 그 후 50 uL의 GTPγS[³⁵S] 용액을 첨가하는 것에 의해 96웰 플레이트 (코스타(Costar) #3604)에서 검정법을 수행한다. 플레이트를 덮고, 실온에서 궤도형 진탕기 (45분 동안 175 rpm)에 놓는다. 그 후, 25 uL의 SPA 비드를 첨가하고, 플레이트를 다시 밀봉하고, 혼합되도록 와동시킨 후, 다시 3시간 동안 실온에서 궤도형 진탕기 상에 놓는다. 그 후, 플레이트를 5분 동안 500 rpm에서 원심분리하고, 퍼킨엘머 2450 마이크로플레이트 카운터에서 웰 당 1분 동안 카운팅한다. PYY 유사체 또는 인간 PYY_3-36의 부재 하에 기본 결합 (CPM)을 결정하고, 하기의 공식으로 각각의 펩티드 농도에 대한 기본값을 초과하는 퍼센트를 계산하는 데 사용한다: (PYY 유사체, 또는 인간 PYY_3-36, CPM - 기본 CPM)/(기본 CPM)*100. EC₅₀ (nM) 값은 하기 공식을 사용하여 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 7.0에서 농도 및 기본 값의 퍼센트의 로그를 비-선형 회귀 분석 (log(효능제) 대 반응 - 가변 슬로프 (4 파라미터))에 적용함으로써 결정된다: Y = 하단 + (상단-하단)/(1+10^((LogEC₅₀-X)*힐슬로프)). 기하 평균 및 평균의 표준 오차는 그래프패드 프리즘 7.0의 칼럼 통계 기능을 사용하여 EC₅₀ (nM) 값으로부터 계산된다.

결과:

표 3: hNPY2 수용체 상에서의 시험관 내 GTPγS 활성.

상기에 제시된 바와 같이, 실시예 2가 인간 PYY_3-36에 대비하여 4배 더 낮은 효능에서 가장 낮은 효능을 나타내면서, GTPγ[³⁵S] 기능적 검정법으로부터의 결과 는 hNPY2 수용체 상에서의 PYY 유사체의 활성을 입증한다.

(4) 약동학

목적:

PYY 유사체의 약동학 성질을 조사하기 위한 것이다.

방법:

LC/MS - 다양한 PYY 유사체의 혈장 농도를 LC/MS 방법에 의해 결정한다. 이러한 방법은 전체 화합물을 측정한다; 펩티드 플러스 연결 시간 연장. 검정법을 위해, PYY 유사체 및 내부 표준물질을 마우스, 래트 또는 원숭이 혈장 (50 ㎕)으로부터 0.1% 포름산이 있는 메탄올을 사용하여 추출한다. 샘플을 원심분리하고, 상청액을 써모(Thermo) 단백질 침전 플레이트로 옮긴다. 샘플을 물 내의 0.1% 포름산 및 메탄올로 컨디셔닝된 셉-팩 tC18 SPE μ일루션 플레이트(Sep-Pak tC18 SPE μElution Plate) 상에 로딩한다. SPE 칼럼을 물 내의 0.1% 포름산으로 2회 세정한다. 그 후, 포름산/물/아세토니트릴 (0.1:15:85)을 사용하여 화합물을 용출시키고, 건조시키고, 재구성시킨 뒤, 분취량 (10 ㎕)을 써모 액클레임 펩맵100(Thermo Acclaim PepMap100) C18, 300 ㎛ × 5 mm 트랩 칼럼 및 써모 이지 스프레이 펩맵(Thermo Easy Spray PepMap) C18, 75 ㎛ × 15 cm LC/MS 분석용 칼럼에 주입한다. 검출 및 정량을 위해 칼럼 용출물을 써모 Q-엑스액티브 플러스(Thermo Q-Exactive Plus) 질량 분광계로 보낸다.

CD-1 마우스에서의 PYY 유사체의 약동학 - PYY 유사체의 혈장 약동학을 200 nmol/kg의 단일 피하 용량 후에 수컷 CD-1 마우스에서 평가한다. 168시간에 걸쳐 시점 당 2마리의 동물로부터 혈액 샘플을 수집한다. 비-연속 샘플링이 마우스에서의 PYY 유사체의 동역학을 평가하는데 사용되기 때문에, 평균 농도 대 시간 데이터가 200 nmol/kg의 단일 피하 용량 후에 PYY 유사체의 약동학 파라미터를 표로 만드는 데 사용된다. 200 nmol/kg의 단일 피하 투여 후에 120시간 동안 PYY 유사체의 혈장 농도를 검출한다.

SD 래트에서의 PYY 유사체의 약동학 - PYY 유사체의 혈장 약동학을 50 nmol/kg의 단일 피하 용량 후에 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트에서 평가한다. 168시간에 걸쳐 시점 당 2마리의 동물로부터 혈액 샘플을 수집한다. 연속 샘플링이 래트에서의 PYY 유사체의 동역학을 평가하는데 사용되기 때문에, 개별적인 동물 농도 대 시간 데이터가 50 nmol/kg의 단일 피하 용량 후에 PYY 유사체의 약동학 파라미터를 표로 만드는 데 사용된다. 50 nmol/kg의 단일 피하 투여 후에 120시간 동안 PYY 유사체의 혈장 농도를 검출한다.

시노몰구스 원숭이에서의 PYY 유사체의 약동학 - PYY 유사체의 혈장 약동학을 50 nmol/kg의 단일 피하 용량 후에 수컷 및 암컷 시노물구스 원숭이에서 평가한다. 504시간에 걸쳐 혈액 샘플을 수집한다. 연속 샘플링이 원숭이에서의 PYY 유사체의 동역학을 평가하는데 사용되기 때문에, 개별적인 동물 농도 대 시간 데이터가 50 nmol/kg의 단일 피하 용량 후에 PYY 유사체의 약동학 파라미터를 표로 만드는 데 사용된다. 50 nmol/kg의 단일 피하 투여 후에 504시간 동안 PYY 유사체의 혈장 농도를 검출한다.

결과:

표 4: 수컷 CD-1 마우스로의 단일 피하 용량 후의 평균 약동학 파라미터.

표 5: 수컷 SD 래트로의 단일 피하 용량 후의 평균 약동학 파라미터.

표 6: 시노몰구스 원숭이로의 단일 피하 용량 후의 평균 약동학 파라미터.

결과:

이러한 데이터는 상기 화합물들이 주 1회 투여에 적절한 약동학 프로파일을 갖는다는 것을 입증한다.

(5) 용해도 & 안정성

목적:

PYY 유사체의 가용성 pH 범위 및 안정성을 결정하기 위한 것이다.

방법:

시각적 용해도 범위 평가 - 동결건조된 PYY 유사체 분말을 물에서 4 mg/mL 농도로 재구성시키고, pH를 시트르산/포스페이트 완충제로 pH 4로 조정한다. 시스템의 pH를 0.5 N NaCl로 pH 8로 상향 적정한 후, 0.5 N HCl로 pH 4로 하향 적정한다.

열 안정성 평가 - 1 mg/mL 또는 2 mg/mL 농도의 10 mM 또는 20 mM 인산나트륨, pH 7.0 내의 PYY 유사체 용액을 제조하고, 4℃ 및 40℃에서 4주 동안 인큐베이션한다. 4주 시점의 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 RP-HPLC에 의해 분석한다.

SEC 방법 - TOSOH TSKgelG2000SWxl, 7.8 mm ID × 30 cm, 5 um 칼럼, 0.5 mL/분의 유속으로의 30분에 걸친 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 7.0 + 20% 아세토니트릴 이동상 조성, λ -214 nm를 사용하여 수행됨.

RP 방법 - 코텍스(Cortecs) C18, 2.7 um, 4.6 × 50 mm 칼럼, 1 mL/분의 유속으로의 10분에 걸친 20% -45% 아세토니트릴/물 + 0.085% TFA, λ -214 nm를 사용하여 수행됨.

결과:

표 7: PYY 유사체의 용해도 및 열 안정성.

상기에 제시된 바와 같이, 모든 펩티드가 pH >7.0에서 가용성이다. RP 및 SEC에 의해 평가된 바와 같은 안정성은 이러한 펩티드들이 공격적인 열 스트레스 하에 비교적 안정적임을 시사한다.

실시예 7: PYY의 생체 내 효과.

(1) 정상 마우스에서의 음식 섭취 및 체중에 대한 생체 내 효과

목적:

단일 주사 후 정상 마우스의 체중을 감소시키고 음식 섭취를 억제하기 위한 실시예 1 내지 5의 PYY 유사체의 효과를 비교하기 위한 것이다.

방법:

엔비고 RMS(Envigo RMS) (인디애나주 인디애나폴리스)로부터의 수컷 C57Bl/6 마우스를 차우(chow) 식이 (5008; 랩다이어트(LabDiet), 미주리주 세인트 루이스)에서 유지시키고, 정상적인 12:12시간 광 주기의 온도-제어 시설 (74.0℉; 23.3℃)에서 단일 거주시키며, 음식 및 물에 자유롭게 접근시킨다. 9-10주령에, 비-공복 체중 및 초기 음식 중량을 기록하고, 동물에 비히클 또는 펩티드의 단일 피하 주사를 투여한 후, 투약 후 3일 동안 체중 및 음식 섭취를 매일 측정한다. 비히클에 대비하여 체중 및 음식 섭취 둘 다에 대해 곡선하 면적 분석 (AUC)을 계산한다. 30 nmol/kg의 실시예 4가 검정법의 각각의 실행에서 체중 및 음식 섭취에 대한 100% 효능의 벤치마크로서 사용된다.

결과:

표 8: PYY 유사체의 단일 용량 후의 C57/Bl6 마우스에서의 3일 동안의 체중 및 음식 섭취의 변화

상기에 제시된 바와 같이, 체중 및 음식 섭취 둘 다의 감소가 생체 내에서의 PYY 유사체의 효능을 입증하고, 여기서 완전한 효능에 요구되는 용량에 대한 비교가 효능 개선을 입증한다.

(2) 식이-유도 비만 마우스에서의 음식 섭취 및 체중에 대한 생체 내 효과

목적:

식이-유도 비만 (DIO) 마우스에서 2주 기간에 걸쳐, 단독으로 또는 GLP-1 수용체 효능제와 조합하여, 체중을 감소시키기 위해 실시예 1-5의 PYY 유사체를 매일 투약하는 것의 효과를 조사하기 위한 것이다.

방법:

20주령의 DIO 수컷 C57Bl/6 마우스 (타코닉(Taconic))가 도착 시 60% 지방 식이에서 유지된다 (D12492; 리서치 다이어트(Research Diets), 뉴저지주 뉴브런즈윅). 동물을 12시간 명/암 주기 (22:00에 점등)의 온도-제어 시설 (74.0℉; 23.3℃)에 개별적으로 거주시키고, 음식 및 물에 자유롭게 접근시킨다. 매일 비히클을 투약하는 1주 순응 기간 후, 비-공복 체중을 측정하고, 동물을 체중에 의해 실험군 (n=6)으로 무작위화하고, 비히클, GLP-1 수용체 효능제 (GLP-1 RA; 서열식별번호: 15), PYY 유사체, 또는 PYY 유사체 + GLP-1 RA의 조합물의 피하 주사를 매일 투여한다. 2주 투약 후, 비-공복 체중을 기록하고, 비히클 대비 평균 체중의 변화를 계산한다. GLP-1 RA와 조합된 PYY 유사체의 부가적 또는 상승작용적 효과를 결정하기 위해, GLP-1 RA 단독의 것을 초과하는 효능 (순 효과)를 계산한다.

결과:

표 9: 단독이거나 GLP-1 수용체 효능제와 조합된 PYY 유사체로의 식이-유도 비만 마우스에서의 2주 연구에서의 체중 변화

상기에 제시된 바와 같이, 단독 및 GLP-1 RA와의 조합 둘 다의 PYY 유사체로의 체중 감소가 생체 내에서의 PYY 유사체의 효능을 입증하고, 여기서 비교는 체중 감소의 규모에 대해 이루어진다.

(3) 당뇨병 및 비만 (db/db) 마우스에서의 체중 및 글루코스에 대한 생체 내 효과

목적:

비만 및 당뇨병 마우스 (db/db)에서 10일 기간에 걸쳐 체중 및 혈당 수준을 감소시키기 위해 실시예 1 내지 5의 PYY 유사체를 매일 투약하는 것의 효과를 조사하기 위한 것이다.

방법:

엔비고 RMS (인디애나주 인디애나폴리스)로부터의 Lepr^db/db(db/db) 수컷 마우스를 차우-스타일 식이 (5008; 랩다이어트, 미주리주 세인트 루이스)에서 유지시키고, 우리 당 5마리의 동물을 정상적인 12:12시간 광 주기의 온도-제어 시설 (74.0℉; 23.3℃)에서 거주시키며, 음식 및 물에 자유롭게 접근시킨다. 8-9주령에, 애큐-체크® 글루코미터(Accu-Check® Glucometers) (로슈 다이어비티스 케어 인크(Roche Diabetes Care, Inc.), 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 체중 및 혈당 수준을 측정한 후, 비히클 또는 펩티드를 매일 피하 주사한다. 10일 투약 후, 체중 및 혈당 수준을 측정하고, 비히클 처리 대비 변화를 계산한다.

결과:

표 10: 10일 동안 처리된 db/db 마우스에서의 체중 및 혈당에 대한 효과.

상기에 제시된 바와 같이, PYY 유사체로의 체중 및 혈당 수준의 감소가 생체 내에서의 PYY 유사체의 효능을 입증하고, 여기서 비교는 체중 감소 및 글루코스 저하의 규모에 대해 이루어진다.

결론적으로, 본원에서의 PYY 유사체는 NPY2R에 대한 선택성을 나타낸다. 시험관 내 프로파일과 일치하게 실시예 1, 3 및 4의 PYY 유사체가 가장 효과적이면서, 이들은 정상 마우스, 식이-유도 비만 마우스 및 db/db 마우스에서 반영된 바와 같은 체중의 용량-의존적 감소, 뿐만 아니라 db/db 마우스에서의 혈당의 용량-의존적 개선을 또한 나타낸다.

서열

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> PYY agonist <130> X21917 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is any amino acid with a functional group available for conjugation and the functional group is conjugated to a C16-C22 fatty acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is E or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is E or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is L or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is N or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is A or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is E, D, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is E or W <400> 3 Pro Lys Pro Glu Xaa Pro Xaa Xaa Asp Ala Ser Pro Glu Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Xaa Xaa Leu Arg His Tyr Leu Asn Xaa Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Glu Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ile Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 8 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys at position 5 is chemically modified by conjugation of the epsilon-amino group of the Lys side chain with Ahx-glutamic acid-gamma glutamic acid-CO-(CH2)16-CO2H <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 9 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys at position 5 is chemically modified by conjugation of the epsilon-amino group of the Lys side chain with (AEEA)2-gamma glutamic acid-CO-(CH2)18-CO2H <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 10 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 11 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys at position 5 is chemically modified by conjugation of the epsilon-amino group of the Lys side chain with AEEA-gamma glutamic acid-CO-(CH2)16-CO2H <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 11 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Glu Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ile Glu Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 12 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys at position 5 is chemically modified by conjugation of the epsilon-amino group of the Lys side chain with (AEEA)2-gamma glutamic acid-CO-(CH2)16-CO2H <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 12 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys at position 5 is chemically modified by conjugation of the epsilon-amino group of the Lys side chain with (AEEA)2-(gamma glutamic acid)3-CO-C18-CO2H <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 13 Pro Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 14 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln 1 5 10 15 Met Ala Gln Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr 20 25 30 Arg Pro Arg Tyr 35 <210> 15 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 50 55 60 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 100 105 110 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 115 120 125 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 225 230 235 240 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270 Leu Gly

Claims

하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체:
PKPEX₇PX₉X₁₀DASPEEX₁₇X₁₈RYYX₂₂X₂₃LRHYLNX₃₀LTRQRY (화학식 I)
식 중
X₇은 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 임의의 아미노산이고, 상기 관능기는 C₁₆-C₂₂ 지방산에 접합되고,
X₉는 E 또는 G이고,
X₁₀은 E 또는 K이고,
X₁₇은 L 또는 W이고,
X₁₈은 N 또는 Q이고,
X₂₂는 A 또는 I이고,
X₂₃은 E, D 또는 S이고,
X₃₀은 E 또는 W이고 (서열식별번호: 3),
C-말단 아미노산은 임의적으로 아미드화된다.
제1항에 있어서, X₇이 C, D, E, K 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 PYY 유사체.
제1항에 있어서, X₇이 K이고, C₁₆-C₂₂ 지방산에 대한 접합이 K 측쇄의 엡실론-아미노 기를 통한 것인 PYY 유사체.
제1항에 있어서, 아미노산 서열이

로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 PYY 유사체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, C₁₆-C₂₂ 지방산이 헥사데칸산, 헥사데칸디오산, 헵타데칸산, 헵타데칸디오산, 스테아르산, 옥타데칸디오산, 노나데실산, 노나데칸디오산, 에이코산산, 에이코산디오산, 헤네이코산산, 헤네이코산디오산, 도코산산, 도코산디오산, 및 그의 분지형 및 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 PYY 유사체.
제5항에 있어서, C₁₆-C₂₂ 지방산이 C₁₈-C₂₀ 지방산인 PYY 유사체.
제6항에 있어서, C₁₈-C₂₀ 지방산이 화학식 CO-(CH₂)_x-CO₂H를 갖는 직쇄 지방산이고, 여기서 _x는 18 또는 20인 PYY 유사체.
제7항에 있어서, C₁₈-C₂₀ 지방산이 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산 및 에이코산산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 PYY 유사체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C₁₆-C₂₂ 지방산이 링커를 통해 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 아미노산에 접합되는 것인 PYY 유사체.
제9항에 있어서, 링커가 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시)]-아세트산 (AEEA), 아미노헥산산 (Ahx), 글루탐산 (E), 감마 글루탐산 (γE) 및 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단위일 수 있는 것인 PYY 유사체.
를 포함하는 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체.
를 포함하는 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체.
를 포함하는 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체.
를 포함하는 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체.
를 포함하는 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, -2 초과의 전하를 갖는 PYY 유사체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, NPY2 수용체에서의 결합 친화력이 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)보다 더 큰 PYY 유사체.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 반감기가 인간 PYY_3-36 (서열식별번호: 2)보다 더 큰 PYY 유사체.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 하나 이상의 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체 또는 그의 염, 및
하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 및 부형제
를 포함하는 제약 조성물.
제19항에 있어서,
추가적인 치료제
를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제20항에 있어서, 추가적인 치료제가 글루카곤 (GCG), GCG 유사체, 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), GLP-1_{7-36-아미드}, GLP-1 유사체, 위 억제 펩티드 (GIP), GIP 유사체, 옥신토모둘린 (OXM), OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 인크레틴인 제약 조성물.
제20항에 있어서, 추가적인 치료제가 디펩티딜 펩티다제-IV (DPP-IV) 억제제인 제약 조성물.
비만 또는 비만-관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에게 유효량의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계
를 포함하는, 비만 또는 비만-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
제23항에 있어서, PYY 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염이 개체에게 피하 (SQ) 투여되는 것인 방법.
제23항에 있어서, PYY 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염이 개체에게 경구 투여되는 것인 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, PYY 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염이 매일, 격일로, 주 3회, 주 2회, 주 1회, 또는 격주로 투여되는 것인 방법.
제23항에 있어서, PYY 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염이 주 1회 (QW) SQ 투여되는 것인 방법.
제23항에 있어서, PYY 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염이 주 1회 경구 투여되는 것인 방법.
제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 추가적인 치료제가 글루카곤 (GCG), GCG 유사체, 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), GLP-1_{7-36-아미드}, GLP-1 유사체, 위 억제 펩티드 (GIP), GIP 유사체, 옥신토모둘린 (OXM), OXM 유사체, GIP/GLP-1, GLP-1/GCG, 또는 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 인크레틴인 방법.
제29항에 있어서, 추가적인 치료제가 디펩티딜 펩티다제-IV (DPP-IV) 억제제인 방법.
비만을 치료하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
비만-관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
II형 진성 당뇨병을 치료하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
비만을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
비만-관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
II형 진성 당뇨병을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 펩티드 타이로신-타이로신 (PYY) 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.