BR112021005879A2

BR112021005879A2 - processo enzimático para produção de produtos de lúpulo modificados

Info

Publication number: BR112021005879A2
Application number: BR112021005879-6A
Authority: BR
Inventors: Katie WHALEN; Donald Richard Berdahl; Brian Patrick Buffin; Matthew Blake JONES; Katrina WILLIAMS
Original assignee: Kalamazoo Holdings, Inc.
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2021-08-10
Also published as: JP2022500063A; US20210355510A1; MA53728A; AU2019350847A1; EP3856917A2; CA3114415A1; US11821020B2; MX2021003535A; CN112930402A; KR102584376B1; WO2020069139A3; KR20210064292A; CO2021005176A2; US20200095619A1; JP7261873B2; WO2020069139A2

Abstract

PROCESSO ENZIMÁTICO PARA PRODUÇÃO DE PRODUTOS DE LÚPULO MODIFICADOS. A presente invenção refere-se a um processo para produção de um agente de amargor para cerveja via bioconversão catalisada pelas enzimas de ácidos isoalfa derivados de lúpulo em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa e aos novos catalisadores enzimáticos que podem ser empregados em um tal processo.

Description

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PROCESSO ENZIMÁTICO PARA PRODUÇÃO DE PRODUTOS DE LÚPULO MODIFICADOS REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS, TABELA OU PROGRAMA DE COMPUTADOR

[0001] A Listagem de Sequências submetida simultaneamente com o presente sob 37 C.F.R. §1.821 em uma forma legível por computador (CRF) via EFS-Web com o nome de depósito KALSEC_76_PCT_Sequence_Listing_26_Sept_2019.txt é aqui incorporada por referência. A cópia eletrônica da Listagem de Sequências foi criada em 26 de setembro de 2019.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a um processo para produzir um agente de amargor para a cerveja via bioconversão catalisada pelas enzimas de ácidos isoalfa derivados de lúpulo em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa e aos novos catalisadores enzimáticos que podem ser empregados em um tal processo. Ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa têm características superiores que melhoram a atividade como um aditivo de bebida. Consumidores podem preferir ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa produzidos via este processo, que não requer o uso de reagentes químicos agressivos e que utiliza enzimas que podem ocorrer naturalmente.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[0003] Os métodos tradicionais de tornar a cerveja amarga usam lúpulo fresco inteiro, lúpulo desidratado inteiro ou grânulos de lúpulo adicionados durante a fervura na caldeira. Extratos de lúpulo feitos pela extração de lúpulo com dióxido de carbono supercrítico, ou grânulos de lúpulos isomerizados, obtidos por aquecimento de lúpulos na presença de um catalisador, são inovações mais recentes no amargor

2 / 37 que também foram adotadas por cervejeiros. Os grânulos de lúpulo também podem ser adicionados em estágio posterior no processo de fermentação e, no caso de lúpulo desidratado, o lúpulo é adicionado à cerveja acabada antes da filtração. Esses métodos sofrem com a fraca utilização dos compostos de amargor presentes no lúpulo, o que impacta desfavoravelmente o custo. Cerveja ou outras bebidas de malte produzidas deste modo são instáveis à luz e devem ser embaladas em garrafas marrom-escuro ou em latas ou colocadas de modo a evitar a formação induzida por luz de 3-metil-2-buteno-1-tiol (3-MBT) que confere um aroma pronunciado desagradável ou prejudicado por exposição à luz. Colocar as garrafas em caixas de papelão ou envolver as mesmas completamente em papel à prova de luz ou filtro de luz, papel alumínio ou coberturas de plástico é outro método caro de proteger estas bebidas do sabor e do aroma desagradáveis por exposição à luz.

[0004] Amargor na cerveja tradicionalmente fermentada é derivado primariamente de ácidos isoalfa. Esses compostos são formados durante o processo de fermentação pela isomerização das humulonas, que são compostos que ocorrem naturalmente nas glândulas lupulina da planta do lúpulo. Uma consequência disso é, dada a instabilidade natural dos ácidos isoalfa em relação às reações fotoquímicas na cerveja, uma bebida propensa à formação de sabor e aroma desagradáveis ou prejudicados por exposição à luz.

[0005] Cervejas totalmente estáveis à luz ou outras bebidas de malte podem ser preparadas usando os assim chamados ácidos de lúpulo avançados ou modificados. Cervejas feitas com esses agentes de amargor podem ser embaladas em garrafas de vidro sílex não colorido, sem medo de formar

3 / 37 aromas desagradáveis. Ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa são produtos de redução de ácidos isoalfa que são estáveis à luz. Até a presente data, estes compostos não tinham sido encontrados na natureza. Tradicionalmente, a porção dos ácidos isoalfa que é responsável pela fotoquímica foi alterada pela redução de um grupo carbonila usando boroidreto de sódio.

[0006] Boroidreto de sódio é um composto inorgânico que pode ser utilizado para a redução de cetonas. Ele é extremamente perigoso em caso de contato com a pele, contato com os olhos, inalação ou ingestão, com um LD50 oral de 160 mg/kg (rato). Boroidreto de sódio também é inflamável, corrosivo e extremamente reativo com agentes oxidantes, ácidos, álcalis e umidade (Sodium Borohydride; MSDS No. S9125; Sigma-Aldrich Co.: Saint Louis, MO, 1º. de novembro de 2015.

[0007] Consumidores estão cada vez mais expressando uma preferência por materiais naturais em relação aos sintéticos ou semissintéticos. Assim, existe uma necessidade não apenas de fornecer composições empregando materiais naturais como agentes de amargor para cerveja e outras bebidas, mas também processos para uma produção mais natural dos ditos materiais.

[0008] Produção biocatalítica é uma tecnologia emergente que possibilita uma produção altamente seletiva, segura, limpa e escalonável de compostos de alto valor. A produção biocatalítica depende de enzimas que ocorrem naturalmente para substituir os catalisadores químicos.

[0009] Enzimas são proteínas de ocorrência natural, capazes de catalisar reações químicas específicas. Existem enzimas na natureza que são atualmente capazes de substituir

4 / 37 catalisadores químicos na produção de compostos de amargor para lúpulos modificados (Robinson, P. K., Enzymes: principles and biotechnological applications. Essays Biochem 2015, 59, 1-41.).

[0010] Humulona é um metabólito secundário natural que seria exposto a fungos e bactérias que coabitam com a planta, Humulus lupulus. É possível que fungos e bactérias vivendo no solo e em plantas possuam enzimas capazes de modificar a humulona para fins de destoxificação ou sequestro. Adicionalmente, organismos podem ter evoluído enzimas para modificar moléculas semelhantes à humulona, mas, devido à atividade promíscua, essas enzimas possuem atividade contra os compostos de interesse, ácidos isoalfa (Hult, K.; Berglund, P., Enzyme promiscuity: mechanism and applications. Trends Biotechnol. 2007, 25 (5), 231-238; Nobeli, I.; Favia, A. D.; Thornton, J. M., Protein promiscuity and its implications for biotechnology. Nat. Biotechnol. 2009, 27 (2), 157-167.).

[0011] Enzimas que catalisam reações de oxidação/redução, isto é, transferência de átomos de hidrogênio e oxigênio ou elétrons a partir de uma substância para outra, são amplamente classificadas como oxidorredutases. Mais especificamente, enzimas que reduzem grupos cetona em grupos hidroxila são conhecidas como cetorredutases ou carbonil redutases e dependem da suplementação de uma fonte exógena de equivalentes redutores (por exemplo, os cofatores NADH, NADPH). Consistente com a denominação existente das enzimas aqui caracterizadas, as enzimas serão referidas como "cetorredutases".

[0012] O custo de cofatores caros (NADH, NADPH) pode ser

5 / 37 reduzido por inclusão de enzimas e substratos adicionais para reciclagem de cofator, por exemplo, glicose desidrogenase e glicose, ou por utilização de uma cetorredutase que é também capaz de oxidar uma carga de alimentação de baixo custo e natural, tal como etanol.

[0013] Existe precedência abundante para a utilidade de enzimas na fermentação de cerveja e sua influência favorável no caráter final da cerveja (Pozen, M., Enzymes in Brewing. Ind. Eng. Chem, 1934, 26 (11), 1127-1133.). A presença de enzimas de levedura na fermentação natural de cerveja é conhecida como produzindo compostos que afetam o aroma e o sabor da bebida final (Praet, T.; Opstaele, F.; Jaskula- Goiris, B.; Aerts, G.; De Cooman, L., Biotransformations of hop-derived aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae upon fermentation. Cerevisia, 2012, 36, 125-132.). Enzimas adicionadas exogenamente proporcionam uma variedade de aperfeiçoamentos para o processo de fermentação, como viscosidade reduzida, açúcares fermentáveis aumentados, resistência ao resfriamento e clarificação (Wallerstein, L. (1947) Bentonite and Proteolytic Enzyme Treatment of Beer, Patente US 2.433.411.; Ghionno, L.; Marconi, O.; Sileoni, V.; De Francesco, G.; Perretti, G., Brewing with prolyl endopeptidase from Aspergillus niger: the impact of enzymatic treatment on gluten levels, quality attributes, and sensory profile. Int. J. Food Sci. Technol, 2017, 52 (6), 1367-1374.). Adicionalmente, extratos de lúpulo foram especificamente pré-tratados com enzimas para modificar os compostos de aroma derivados de lúpulo (Gros, J.; Tran, T. T. H.; Collin, S., Enzymatic release of odourant polyfunctional thiols from cysteine conjugates in hop. J.

6 / 37 Inst. Brew. 2013, 119 (4), 221-227.).

[0014] Antes da presente invenção, no entanto, enzimas capazes de catalisar a redução de ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa não tinham sido observadas na natureza e, assim, não tinham sido descritas na literatura. O processo divulgado aqui representa uma nova reação enzimática.

OBJETO DA INVENÇÃO

[0015] É um objeto da presente invenção prover um processo para produção enzimática de ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa, uma versão modificada de agentes de amargor naturais derivados da planta de lúpulo. O presente processo é projetado para substituir os atuais processos de produção que utilizam o reagente químico, boroidreto de sódio. É um objeto adicional da invenção prover novos catalisadores enzimáticos que podem ser empregados em um tal processo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] A presente invenção refere-se a um processo que pode ser ampliado para níveis industriais para a bioconversão de ácidos iso-alfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa, que podem ser então usados como um agente de amargor derivado naturalmente e estável à luz em bebidas

[0017] Um aspecto da presente invenção é um processo para a bioconversão de elevado rendimento de ácidos iso-alfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa utilizando uma enzima cetorredutase ou um microrganismo expressando um gene que codifica dita cetorredutase.

[0018] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal processo para a produção de ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa, em que o processo é realizado em um sistema aquoso

7 / 37 com condições suaves de temperatura e pH, tornando-o um processo de fabricação ambientalmente favorável.

[0019] Em uma modalidade da invenção, bioconversão de ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa compreende a adição de enzima cetorredutase purificada e NADPH ou NADP a uma mistura de ácidos isoalfa seguido por incubação até o rendimento desejado ser obtido.

[0020] Em outra modalidade da invenção, bioconversão de ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa compreende a adição de enzima cetorredutase purificada e NADPH ou NADP a uma mistura de ácidos isoalfa na presença de isopropanol para reciclagem de cofator, seguido por incubação até o rendimento desejado ser obtido.

[0021] Em uma modalidade adicional da invenção, a concentração de ácidos isoalfa, isto é, o substrato, é maximizada para aumentar a produtividade volumétrica da bioconversão.

[0022] Em uma modalidade adicional da invenção, a concentração do cofator NADPH ou NADP na mistura é minimizada para melhorar a economia da bioconversão.

[0023] Em uma modalidade da invenção, bioconversão de ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa compreende a adição da enzima cetorredutase purificada e NADPH ou NADP a uma mistura de ácidos isoalfa na presença de outra enzima (tal como glicose desidrogenase) para reciclagem de cofator, seguido por incubação até o rendimento desejado ser obtido.

[0024] Em outra modalidade da invenção, bioconversão de ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa compreende a adição de um biocatalisador de célula completa a uma mistura de ácidos isoalfa seguido por incubação até o

8 / 37 rendimento desejado ser obtido, em que o biocatalisador de célula completa é um microrganismo imobilizado expressando o gene que codifica uma cetorredutase.

[0025] Em outra modalidade da invenção, bioconversão de ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa compreende a alimentação de ácidos isoalfa para um microrganismo em crescimento expressando o gene que codifica uma cetorredutase.

[0026] Em outra modalidade da invenção, bioconversão de ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa compreende a adição de enzima cetorredutase termoestável a um extrato de ácidos alfa em que calor é aplicado e a mistura é incubada até o rendimento desejado de ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa ser alcançado.

[0027] A presente invenção refere-se também a novos catalisadores enzimáticos que podem ser utilizados no processo da invenção, como definido acima.

[0028] Uma redutase de acordo com a presente invenção opcionalmente exibe atividade para reduzir o grupo carbonila na cadeia lateral a C(4) dos ácidos isoalfa, convertendo o grupo aciloina sensível à luz em um álcool secundário, e produzindo um derivado de ácido isoalfa estável na luz (Figura 1).

[0029] Em outra modalidade da invenção, a cetorredutase empregada no processo de acordo com a presente invenção exibe, de modo vantajoso, preferência mínima ou nenhuma para catalisar a redução de qualquer um membro particular dos seis principais ácidos isoalfa: cis-iso-humulona, trans-iso- humulona, cis-isoco-humulona, trans-isoco-humulona, cis- isoad-humulona, e trans-isoad-humulona.

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[0030] Em outra modalidade da invenção, a cetorredutase empregada no processo de acordo com a presente invenção especificamente reduz cis-iso-humulona, cis-isoco-humulona e cis-isoad-humulona.

[0031] Em outra modalidade da invenção, a cetorredutase empregada no processo de acordo com a presente invenção especificamente reduz trans-iso-humulona, trans-isoco- humulona e trans-isoad-humulona.

[0032] Em outra modalidade da invenção, uma mistura de 2 ou mais enzimas cetorredutase exibindo a especificidade de substrato acima é empregada no processo, de acordo com a presente invenção, para reduzir uma mistura de ácidos cis- e trans- isoalfa em seus respectivos ácidos di-hidroisoalfa.

[0033] Em outra modalidade da invenção, uma mistura de 2 ou mais enzimas cetorredutase exibindo especificidade de substrato pode ser adicionada a uma mistura de reação para produzir uma mistura singular de ácidos di-hidroisoalfa que é distinta da produzida por agentes redutores químicos, como boroidreto de sódio.

[0034] Em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se a um processo, como definido acima, em que a enzima redutase é uma cetorredutase.

[0035] Uma modalidade adicional da invenção refere-se a um processo, como definido acima, em que a enzima cetorredutase ou microrganismo expressando um gene que codifica a enzima cetorredutase compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

[0036] Em uma modalidade adicional, a presente invenção

10 / 37 refere-se a um processo, como definido acima, em que a enzima cetorredutase ou microrganismo expressando um gene que codifica a cetorredutase pode ter opcionalmente uma ou mais diferenças em resíduos de aminoácido como comparado com a enzima cetorredutase selecionada dentre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, e SEQ ID NO:22..

[0037] Uma modalidade adicional da invenção refere-se a uma enzima cetorredutase ou microrganismo expressando um gene que codifica a enzima cetorredutase que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

[0038] Uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a uma enzima cetorredutase ou microrganismo expressando um gene que codifica a redutase pode ter opcionalmente uma ou mais diferenças em resíduos de aminoácido, como comparado com a sequência de enzima redutase de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

[0039] Uma modalidade adicional da invenção refere-se a uma enzima cetorredutase ou microrganismo expressando um gene que codifica a enzima cetorredutase que é homóloga a 99, 95, 90, 85, 80, 75 ou 70 por cento para a enzima cetorredutase selecionada dentre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:22.

[0040] Outro aspecto da invenção compreende um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando a sequência de

11 / 37 aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

[0041] A invenção compreende adicionalmente um tal vetor, compreendendo adicionalmente pelo menos uma sequência de controle.

[0042] A invenção compreende adicionalmente uma célula hospedeira compreendendo um tal vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

[0043] A invenção compreende adicionalmente um método para produzir uma cetorredutase de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22, compreendendo cultivar dita célula hospedeira sob condições em que a cetorredutase é produzida pela dita célula hospedeira.

[0044] A invenção compreende adicionalmente um método para produzir uma cetorredutase de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22, compreendendo adicionalmente a etapa de recuperar a cetorredutase produzida pela dita célula hospedeira.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0045] Figura 1 mostra a redução catalisada por enzima do epímero representativo de ácidos isoalfa.

[0046] Figura 2 mostra uma análise SDS-PAGE de redutases purificadas.

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[0047] Figura 3 mostra cromatogramas UPLC para ácidos isoalfa incubados com (dois painéis de topo) e sem (dois painéis de fundo) redutase R20 durante 24 h a 30°C. Picos correspondendo ao produto, ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa, são indicados.

[0048] Figura 4 mostra um modelo estrutural de redutase R17 (cinza escuro, renderização de superfície) com um substrato representativo (trans-iso-humulona, preto) e cofator (NADPH, cinza claro) ligado à cavidade de sítio ativo.

[0049] Figura 5 mostra cromatogramas UPLC para (A) uma cetorredutase que produz somente um diastereômero de ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa e (B) uma cetorredutase que produz ambos os diastereômeros de ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa. Picos correspondendo ao produto, ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa, são indicados.

[0050] Figura 6 mostra um alinhamento de sequência de aminoácidos, gerado com Clustal Omega (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) de homólogos de cetorredutase ativos: R4, R17, R20, R21, e R23.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0051] Nesta invenção, uma enzima cetorredutase substitui a função de boroidreto de sódio e permite um método de produção mais natural para o aditivo de bebida, ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa. A enzima pode ser qualquer cetorredutase especificamente reduzindo um grupo cetona em um grupo hidróxi de qualquer um ou de todos os isômeros de ácido isoalfa (co-, n- ad-, e cis/trans-). A enzima pode ser derivada de, mas não limitada a, bactérias, fungos ou plantas. A enzima pode ser dependente de cofator (NADH ou

13 / 37 NADPH) ou independente.

[0052] Aqui, "ácidos isoalfa", " ácidos isoalfa de lúpulo", e "derivados de lúpulo ácidos isoalfa" podem ser usados de modo interpermutável.

[0053] De acordo com a presente invenção, uma solução de ácido isoalfa é submetida a tratamento enzimático usando uma ou mais enzimas purificadas ou uma mistura contendo a(s) enzima(s) e, opcionalmente, enzimas adicionais para reciclagem de cofator. A quantidade de enzima depende dos parâmetros de incubação incluindo duração, temperatura, quantidade e concentração de substrato.

[0054] Alternativamente, uma solução de ácido isoalfa é submetida a tratamento enzimático usando uma mistura contendo um microrganismo expressando dita(s) enzima(s). A invenção provê, ainda mais, um processo para reduzir ácidos isoalfa, de acordo com a invenção, que compreende cultivar um microrganismo produzindo cetorredutase, se apropriado, induzindo a expressão da cetorredutase. Células intactas podem ser coletadas e adicionadas diretamente à reação, em vez de enzima isolada, para a redução de ácidos isoalfa, como descrito acima. Além disso, as células coletadas podem ser imobilizadas antes da adição a uma reação de redução. O microrganismo pode ser cultivado e fermentado por métodos conhecidos. O microrganismo pode ser bactéria ou fungo.

[0055] Uma mistura de ácidos cis- e trans-isoalfa pode ser incubada com uma única cetorredutase exibindo a capacidade para reduzir ambos os isômeros. Alternativamente, uma mistura de ácidos cis- e trans-isoalfa pode ser incubada com 2 ou mais cetorredutases mostrando variada especificidade onde o produto resultante é uma mistura de

14 / 37 ácidos cis- e trans-di-hidroisoalfa.

[0056] Alternativamente, uma solução contendo somente ácidos cis- isoalfa pode ser incubada com cetorredutase(s) específica(s) para o cis- isômero, e o produto resultante é uma solução de ácidos cis-di-hidroisoalfa. Uma solução de somente ácidos cis-di-hidroisoalfa pode exibir propriedades de amargor e/ou estabilidade térmica vantajosas.

[0057] Alternativamente, uma solução contendo somente ácidos trans- isoalfa pode ser incubada com cetorredutase(s) específica(s) para o trans- isômero, e o produto resultante é uma solução dos ácidos trans-di-hidroisoalfa. Uma solução de somente ácidos trans-di-hidroisoalfa pode exibir propriedades de amargor vantajosas.

[0058] Misturas personalizadas de ácidos trans- e cis- isoalfa podem ser incubadas com 1 ou mais cetorredutases exibindo especificidade variável de substrato, para produzir misturas únicas de ácidos di-hidroisoalfa de outra forma inatingíveis.

[0059] Uma mistura de ácido isoalfa pode ser submetida a uma reação enzimática usando enzima(s) cetorredutase em adição a enzimas para catalisar modificações desejadas adicionais, tais como, mas não limitadas a, desidrogenases, isomerases, hidratases e liases. Enzimas de atividade variada podem ser combinadas em uma reação de etapa única e adicionadas sequencialmente.

[0060] Um solvente apropriado para usar na incubação da enzima inclui água e misturas de água com outro solvente compatível com a enzima, como etanol ou isopropanol. A atividade enzimática se beneficia do tamponamento de soluções aquosas. Os agentes tampão incluem, mas não são

15 / 37 limitados a: tris(hidroximetil)aminometano (também conhecido como Tris), ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1- etanossulfônico (também conhecido como HEPES), fosfato de sódio e fosfato de potássio.

[0061] A(s) enzima(s) e ácidos isoalfa são incubados em uma faixa de pH, por exemplo pH 6 a 10, e faixa de temperatura, por exemplo 10 a 90°C, apropriadas e mantida(s) na temperatura durante um tempo suficiente para converter os ácidos isoalfa no desejado rendimento de ácidos di-hidro- (rho)-isoalfa. A agitação contínua irá assegurar uma temperatura constante e exposição de substrato em enzima. A duração de reação, tipicamente 24 a 48 horas, irá depender da quantidade e concentração da enzima e substrato, solvente presente e temperatura escolhida.

[0062] A(s) enzima(s) pode(m) estar livre(s) em solução, imobilizada(s) em contas ou andaimes misturáveis similares, ou imobilizada(s) em uma película ou resina sobre a qual uma solução de ácidos isoalfa é passada. O nível de pureza da enzima pode variar de 30 a 90 +% dependendo do método de purificação.

[0063] A(s) enzima(s) pode(m) ser removida(s) do produto final via filtragem física ou centrifugação. A(s) enzima(s) também pode ser tornada inativa por temperatura ou pH extremos e permanecer no produto final.

[0064] Enzimas redutase englobadas pela presente invenção incluem enzimas cetorredutase.

[0065] Detalhes para 23 enzimas purificadas com sucesso são listados em Tabela 1, incluindo: etiqueta abreviada, número de ID de sequência, e sequência de aminoácido. Tabela 1. Redutases purificadas.

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SEQ Marcador ID Sequência de aminoácido NO.

MSSGIHVALVTGGNKGIGLAIVRDLCRLFSGDVVLTARDVTRGQAAVQQLQAEGLSPRF H QLDIDDLQSIRALRDFLRKEYGGLDVLVNNAGIAFKVADPTPFHIQAEVTMKTNFFGTR

D R1 1

VCTELLPLIKPQGRVVNVSSIMSVRALKSCSPELQQKFRSETITEEELVGLMNKFVEDT K KGVHQKEGWPSSAYGVTKIGVTVLSRIHARKLSEQRKGDKILLNACCPGWVRTDMAGPK ATKSPEEGAETPVYLALLPPDAEGPHGQFVSEKRVEQW MRLEGKVCLITGAASGIGKATTLLFAQEGATVIAGDISKENLDSLVKEAEGLPGKVDPY

VLNVTDRDQIKEVVEKVVQKYGRIDVLVNNAGITRDALLVRMKEEDWDAVINVNLKGVF R2/3 2 NVTQMVVPYMIKQRNGSIVNVSSVVGIYGNPGQTNYAASKAGVIGMTKTWAKELAGRNI

RVNAVAPGFIETPMTEKLPEKARETALSRIPLGRFGKPEEVAQVILFLASDESSYVTGQ VIGIDGGLVI MSVFVSGANGFIAQHIVDLLLKEDYKVIGSARSQEKAENLTEAFGNNPKFSMEVVPDIS KLDAFDHVFQKHGKDIKIVLHTASPFCFDITDSERDLLIPAVNGVKGILHSIKKYAADS

VERVVLTSSYAAVFDMAKENDKSLTFNEESWNPATWESCQSDPVNAYCGSKKFAEKAAW R4 3

EFLEENRDSVKFELTAVNPVYVFGPQMFDKDVKKHLNTSCELVNSLMHLSPEDKIPELF GGYIDVRDVAKAHLVAFQKRETIGQRLIVSEARFTMQDVLDILNEDFPVLKGNIPVGKP GSGATHNTLGATLDNKKSKKLLGFKFRNLKETIDDTASQILKFEGRI MNQVVLVTGGSSGIGKSICLYLHEKGYIVYGTSRNPARYAHEVPFKLIALDVLDDTTIT

PALKTIIDAEGKLDVLVNNAGIGMLGSIEDSTAEEVKEVFETNVYGILRTCQAVLPHMR R5 4 ERKMGLIINVSSIAGYMGLPYRGIYSATKASVHMITEAMRMELKPYGVHACVVDPGDFA

TNISDNRKVAHAGRSGSVYMEEINRIEAMINAEVAHSSDPLLMGKAIEKIIRSSNPDIN YLVGKPMQKLSILVRRLVPKKWFEKIIASHYNMPVK MANSGEGKVVCVTGASGYIASWLVKFLLSRGYTVKASVRDPSDPKKTQHLVSLEGAKER LHLFKADLLEQGSFDSAIDGCHGVFHTASPFFNDAKDPQAELIDPAVKGTLNVLNSCAK

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17 / 37

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18 / 37

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REKPNFTLTVLNPPVSHFLFSRHKDVAVTFFSDSFQHCRWSTARSCTPWHHWTISTPRA SES

[0066] Quase todas as candidatas eram suficientemente puras (>80% de teor de proteína é a proteína de interesse) após purificada em uma etapa (Ver Figura 2).

[0067] Enzimas redutase englobadas pela presente invenção incluem as compreendendo as seguintes sequências de aminoácido: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, e SEQ ID NO:22.

[0068] Enzimas redutase englobadas pela presente invenção também incluem as tendo uma ou mais diferenças em resíduos de aminoácido como comparadas com as seguintes sequências de aminoácido: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, e SEQ ID NO:22.

[0069] Enzimas redutase englobadas pela presente invenção também incluem as compreendendo uma sequência de aminoácido que é idêntica por pelo menos 40% (incluindo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, e pelo menos 95%) com as seguintes sequências de aminoácido: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, e SEQ ID NO:22.

19 / 37

[0070] Como aqui usado, "porcentagem de homologia de sequência", "homologia percentual" e "idêntica percentual" referem-se a comparações entre sequências de polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeos e são determinadas por comparação de duas sequências alinhadas de modo ótimo ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeo ou de polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas), em comparação com a sequência de referência para o alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições em que ou a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências ou uma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido está alinhada com uma lacuna para dar o número de posições correspondidas, dividindo o número de posições correspondidas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a porcentagem de identidade de sequência. A determinação do alinhamento ótimo e homologia de sequência percentual é realizada usando os algoritmos BLAST e BLAST 2.0. (ver, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 [1990]; e Altschul et al., Nucleic Acids Res. 3389-3402 [1977]). Software para realizar as análises BLAST está disponível ao público pelo website National Center for Biotechnology Information.

[0071] As enzimas promíscuas podem catalisar a mesma reação química, apesar de possuírem baixa identidade de aminoácidos compartilhados. Cetorredutase R4 (SEQ ID NO:3) foi inicialmente selecionada para triagem devido à sua natureza promíscua [Guo et al. Biochim. Biophys. Acta 2014,

20 / 37 1844]. Cinco cetorredutases adicionais (R17 (SEQ ID NO:16), R20 (SEQ ID NO:19), R21 (SEQ ID NO:20), R22 (SEQ ID NO:21) e R23 (SEQ ID NO:22)) que contêm o mesmo domínio de enzima (IPR001509: epimerase/desidratase NAD-dependente) e compartilham a identidade de aminoácido para R4 (SEQ ID NO:3) foram adquiridas como genes sintéticos, purificadas e caracterizadas. As redutases foram selecionadas propositalmente com identidade de sequência cada vez mais baixa, a fim de estabelecer um corte de identidade de sequência.

[0072] Apesar de compartilhar um percentual de identidade relativamente baixo (34-39% sobre o comprimento completo da enzima) para R4 (SEQ ID NO:3), enzimas R17 (SEQ ID NO:16), R20 (SEQ ID NO:19), R21 (SEQ ID NO:20) e R23 (SEQ ID NO:22) catalisam a transformação de ácidos isoalfa em ácidos di- hidro-(rho)-isoalfa. R22 (SEQ ID NO:21), que compartilha 33% de identidade para R4 (SEQ ID NO:3), não catalisa a transformação de ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa, mas é, de outra forma, uma enzima ativa como purificada (estabelecido pela medição da atividade de oxidação catalisada por enzima de isopropanol).

[0073] Uma característica que separa redutases funcionais de não funcionais para obter ácidos di-hidro- (rho)-isoalfa é ilustrada por um alinhamento de sequência múltiplo (Figura 6). Cetorredutase R4 (SEQ ID NO:3), e todos os homólogos de R4 (SEQ ID NO:3) caracterizados como capazes de converter os ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa aqui, possuem um domínio ocorrendo entre resíduos 100 e 200, composto de 13 aminoácidos de boa homologia (> 53% identidade) e 9 aminoácidos de alta homologia (> 55%)

21 / 37 separados por 36-39 aminoácidos de baixa homologia (38-46%). Este domínio está faltando no polipeptídeo R22 não funcional (SEQ ID NO:21). O domínio é, assim, considerado uma marca característica da atividade da cetorredutase para a obtenção de ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa.

[0074] As modalidades específicas divulgadas aqui podem ser adicionalmente limitadas nas reivindicações usando as expressões consistindo em ou e consistindo essencialmente em. Quando usado nas reivindicações, seja como depositado ou acrescentado por emendas, o termo de transição "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado nas reivindicações. O termo de transição "consistindo essencialmente em" limita o escopo de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificados e aqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s). As modalidades da invenção, assim reivindicadas, são inerentemente ou expressamente descritas e habilitadas aqui.

[0075] Como usado aqui, o termo "compreendendo" ou "compreende" se destina a significar que as composições e métodos incluem os elementos recitados, mas não excluindo outros.

[0076] O termo “quantidade eficaz” refere-se à quantidade de uma redutase que é suficiente para transformar ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa. Determinação da quantidade eficaz para uma dada administração está bem em conformidade com a habilidade comum nas artes farmacêuticas.

[0077] Em um método para preparar ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa, uma solução de ácido isoalfa é submetida a tratamento enzimático usando uma ou mais enzimas redutase

22 / 37 purificadas ou uma mistura contendo uma enzima(s) redutase e opcionalmente enzimas adicionais para a reciclagem de cofator, em uma quantidade eficaz para transformar os ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa. A quantidade de enzima depende dos parâmetros de incubação incluindo duração, temperatura, quantidade e concentração de substrato.

[0078] Alternativamente, uma solução de ácido isoalfa é submetida a tratamento enzimático usando uma mistura contendo um microrganismo expressando dita enzima.

[0079] Uma mistura de ácidos cis- e trans-isoalfa pode ser incubada com uma única redutase/cetorredutase exibindo a capacidade de reduzir ambos os isômeros. Alternativamente, uma mistura de ácidos cis- e trans-isoalfa pode ser incubada com 2 ou mais cetorredutases mostrando variada especificidade onde o produto resultante é uma mistura de ácidos cis- e trans-di-hidroisoalfa.

[0080] Misturas personalizadas de ácidos trans- e cis- isoalfa podem ser incubadas com 1 ou mais redutases/ cetorredutases exibindo especificidade variável de substrato, para produzir misturas únicas de ácidos di- hidroisoalfa de outra forma inatingíveis.

[0081] Uma mistura de ácidos isoalfa pode ser submetida a uma reação enzimática usando uma enzima redutase em adição a enzimas para catalisar modificações desejadas adicionais, tais como, mas não limitadas a, desidrogenases, isomerases, hidratases e liases. Enzimas de atividade variada podem ser combinadas em uma reação de etapa única ou adicionadas sequencialmente.

[0082] Um solvente apropriado para uso em incubação de

23 / 37 enzimas inclui água e misturas de água com outro solvente compatível com a enzima, tal como etanol ou isopropanol. Atividade enzimática se beneficia do tamponamento de soluções aquosas. Agentes tampão incluem, mas não limitados a: tris(hidroximetil)aminometano (também conhecido como. Tris), ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico (também conhecido como. HEPES), fosfato de sódio e fosfato de potássio.

[0083] A enzima e os ácidos isoalfa são incubados dentro de uma faixa de pH apropriada, por exemplo, pH 6 a 10, e faixa de temperatura, por exemplo, 10 a 90°C, e mantidos a esta temperatura durante um tempo suficiente para converter os ácidos isoalfa no rendimento desejado de ácidos di-hidro- (rho)-isoalfa. A agitação contínua irá garantir uma temperatura constante e a exposição do substrato à enzima. A duração da reação, tipicamente 24 a 48 horas, dependerá da quantidade e da concentração da enzima e substrato, solvente presente e temperatura escolhida.

[0084] A enzima redutase pode estar livre em solução, imobilizada em contas ou estruturas misturáveis similares, ou imobilizada em uma película ou resina sobre a qual uma solução de ácidos isoalfa é passada. O nível de pureza da enzima pode variar de 30 a 90 +%, dependendo do método de purificação.

[0085] A redutase pode ser removida do produto final via filtragem física ou centrifugação. A enzima também pode ser tornada inativa por temperatura ou pH extremos e permanecer no produto final.

[0086] A presente invenção é um método novo de utilizar redutases para transformar ácidos isoalfa em ácidos di-

24 / 37 hidro-(rho)-isoalfa. Os genes redutase otimizados no códon alcançaram rendimentos de mais de 100 mg de enzima purificada por L de cultura celular em E. coli BL21(DE3). Todas as enzimas foram caracterizadas com NADPH como o cofator. As redutases caracterizadas neste estudo possuem uma atividade enzimática que não foi descrita anteriormente. Estas enzimas formam uma base para os novos biocatalisadores que podem ser utilizados em uma nova biotransformação para substituir os processos atuais utilizando boroidreto de sódio.

EXEMPLOS

[0087] Os seguintes exemplos ilustram a invenção sem limitar seu escopo. EXEMPLO 1 – PREPARAÇÃO E TRIAGEM DE REDUTASE

MÉTODOS IDENTIFICAÇÃO DA CANDIDATA

[0088] Candidatas a redutase foram selecionadas após uma busca extensiva da literatura para reações enzimáticas caracterizadas de uma natureza similar à reação desejada, seguida por ‘mineração’ bioinformática de três bases de dados públicas de sequências de proteínas: UniProt (www.uniprot.org/), Pfam (//pfam.xfam.org/), e InterPro (www.ebi.ac.uk/interpro/E. coli). Bioinformática baseada em alinhamentos de sequências BLASTP (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) entre enzimas caracterizadas e candidatas a redutase.

EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS

[0089] DNA plasmídeo foi adquirido de várias maneiras: 1) em um vetor de expressão do Repositório de Plasmídeo DNASU (www.dnasu.org), 2) em um vetor de clonagem do Repositório de Plasmídeo DNASU e, subsequentemente, clonado em um vetor

25 / 37 de expressão obtido internamente, 3) como um gene sintético em um vetor de expressão de Atum (www.atum.bio), ou 4) como um gene sintético em um vetor de expressão da General Biosystems (www.generalbiosystems.com). Genes sintéticos foram otimizados por códons para expressão em E. coli.

[0090] 5 mL de caldo Luria com antibióticos apropriados foram inoculados a partir de uma placa de ágar de E. coli BL21 (DE3) contendo o vetor de expressão de interesse e incubados a 30°C com agitação durante a noite. No dia seguinte, a cultura durante a noite foi retro-diluída 1:100 em caldo Luria fresco de 0,5 L com antibióticos e incubada a 37°C por 2-3 horas com agitação de 220 rpm até que uma densidade óptica de 0,5 ser alcançada. Culturas foram induzidas com concentração final de 0,2 mM de β-D-1- tiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG) e incubadas a 25°C com agitação de 180 rpm por 16 h. Células foram coletadas por centrifugação a 4800 rpm durante 15 min. O grânulo de células foi recolocado em suspensão em 12 mL de tampão de ligação (HEPES 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e as células foram lisadas via sonicação durante 15 min (5 s ligado, 5 s desligado). O lisado celular foi clarificado por centrifugação a 10.000 rpm durante 20 min. A proteína marcada foi purificada a partir de lisado celular clarificado via cromatografia de afinidade de cobalto, afinidade de maltose ou afinidade de glutationa. Soluções de proteína foram trocadas em tampão de armazenamento de proteína (Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM pH 7,0) por meio de filtração centrífuga. Concentração de proteína foi medida através da absorbância a 280 nm usando coeficientes de extinção calculados usando a sequência de aminoácidos apropriada. Glicerol foi

26 / 37 adicionado a uma concentração final de 20% e soluções enzimáticas congeladas a -20 ou -80°C. Ensaio de redução de ácidos isoalfa

[0091] As candidatas a enzima purificadas foram testadas por sua capacidade para reduzir ácidos isoalfa. A reação específica envolve a redução de um grupo cetona específico a um grupo hidroxi de qualquer um ou todos os isômeros e congêneres de ácido isoalfa (co-, n- ad-, e cis/trans-). Em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, 100 µL de solução de enzima (concentração final de 0,15 – 1,8 mg/mL enzima) foram adicionados a 900 µL de solução aquosa tamponada com reciclagem de cofator por glicose desidrogenase (263 mM fosfato de sódio, 1,7 mM sulfato de magnésio, 1,1 mM NADP+, 1,1 mM NAD+, 80 mM D-glicose, 4,3 U/mL glicose desidrogenase, pH 7,0). 5 µL de solução alcalina de ácido isoalfa (ISOLONE®, ácidos isoalfa a 29%) foram adicionados para uma concentração final de ácidos isoalfa a 0,29%. A reação foi incubada a 30°C com agitação orbital a 180 rpm durante 24 horas. A mistura de reação obtida foi filtrada para remover enzima. Ácidos isoalfa e ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa foram detectados por UPLC-MS/MS. Uma amostra de controle negativo contém todos os componentes de reação acima onde a solução de enzima foi substituído com tampão de armazenamento de proteína.

RESULTADOS Seleção de candidatas

[0092] Com base em anotações funcionais públicas e similaridade de sequência de aminoácidos, 60 sequências de enzimas únicas foram identificadas como sendo candidatas à redutase.

27 / 37 Expressão e purificação de enzimas

[0093] 30 candidatas foram selecionadas para expressão e purificação com base na disponibilidade de DNA e amostragem suficiente da diversidade de sequências de aminoácidos representadas no grupo inicial de 60 candidatas. A maioria das candidatas exibiu boa expressão e níveis de solubilidade em E. coli BL21(DE3) com rendimentos variando de 5 a 100 mg de proteína purificada por litro de cultura. Várias candidatas foram abandonadas devido à baixa solubilidade no organismo hospedeiro. Caracterização de redutase

[0094] Enzimas foram determinadas para reduzir ácidos isoalfa se picos correspondentes a ácido cis/trans-co/ad/n- di-hidro-(rho)-isoalfa forem detectados via UPLC em uma intensidade maior do que uma amostra de controle sem enzima. Dez enzimas únicas foram determinadas como ácido isoalfa redutases (ver Figura 3). Detalhes dessas enzimas são resumidos na Tabela 2. Devido à solubilidade e ao rendimento de enzima, a concentração final das enzimas no ensaio e obtidas internamente variou de 0,15 - 1,8 mg/mL. Concentração menor de enzima contribui para o rendimento de ácidos di- hidro-(rho)-isoalfa.

[0095] Enzimas foram inicialmente testadas quanto à atividade de redutase na presença de glicose, glicose desidrogenase e NAD, a fim de reciclar o NADP requerido para redução de ácido isoalfa. Após determinação da atividade da redutase, enzimas foram caracterizadas quanto à sua capacidade de oxidar isopropanol, uma alternativa mais econômica para a reciclagem do cofator. Capacidade de oxidar de modo eficaz o isopropanol é indicada na Tabela 2.

28 / 37 Tabela 2. Novas ácido isoalfa redutases caracterizadas Marcador Redução de ácido isoalfa Oxidação de isopropanol R2 Sim Não R4 Sim Sim R7 Sim Não R9 Sim Sim R13 Sim Não R14 Sim Sim R17 Sim Sim R20 Sim Sim R21 Sim Não testado R23 Sim Não testado Especificidade de substrato

[0096] A cetorredutase ideal para fins de biotransformação não mostra especificidade de substrato para os congêneres de iso-humulona que variam com base na composição de cadeia lateral (conferindo n-, ad-, e co-iso- humulona). Adicionalmente, a cetorredutase não mostra especificidade para os isômeros cis e trans de iso-humulona que variam espacialmente no grupo de álcool terciário C4 proximal ao sítio da redução enzimática. A especificidade do substrato é ditada pela sequência de aminoácidos e, portanto, pela geometria do bolso de ligação ao substrato de uma enzima. Bolsos de ligação maiores acomodam substratos maiores, bem como uma maior variedade de substratos, em comparação com os bolsos de ligação mais restritos. (Ver Figura 4).

[0097] Duas variedades de estereoespecificidades de redução foram observadas entre as redutases caracterizadas (ver Figura 5).

[0098] Apesar da presença de dois grupos cetona adicionais na molécula de ácido isoalfa, apenas a redução desejada na cadeia lateral C4 foi observada para todas as

29 / 37 cetorredutases caracterizadas. Exemplo 2 – tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com reciclagem de cofator por oxidação de isopropanol

[0099] Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, 10 mg de redutase são recolocados em suspensão em 700 µL de solução aquosa tamponada (por exemplo, fosfato de sódio pH 7,5). 290 µL de isopropanol são adicionados. 10 µL de solução alcalina de ácido isoalfa (ácidos isoalfa a 29%) são adicionados para uma concentração final de 0,29% ácidos isoalfa a 29%. A reação é incubada a 30°C com agitação orbital a 180 rpm durante 48 horas. A mistura de reação obtida é filtrada para remover enzima. Ácidos isoalfa e ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa são quantificados por HPLC. Exemplo 3 – tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo acidificados com reciclagem de cofator por oxidação de isopropanol

[00100] Ácidos isoalfa são tratados em um modo descrito em Exemplo 2, onde a fonte de ácidos isoalfa é um material altamente concentrado (ácidos isoalfa a 68,9%) tendo um pH <7. EXEMPLO 4 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com reciclagem de cofator por glicose desidrogenase

[00101] Ácidos isoalfa são tratados em um modo descrito em Exemplo 2, com a exceção que isopropanol é substituído com 4,3 U/mL de glicose desidrogenase, 0,7 g/L mM NAD, e 14,4 g/L de D-glicose. EXEMPLO 5 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo sem reciclagem de cofator

30 / 37

[00102] Ácidos isoalfa são tratados em um modo descrito em Exemplo 2, com a exceção que isopropanol é substituído com uma equimolar quantidade de NADPH como substrato. EXEMPLO 6 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com redutase termoestável

[00103] Redutases naturalmente termoestáveis são obtidas a partir de organismos termofílicos bacterianos e arqueanos, tais como Thermotoga maritima. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, 100 µL de solução de enzima (1,5 – 15,0 mg/mL de enzima) são adicionados a 900 µL de solução aquosa tamponada (263 mM Fosfato de sódio pH 7,0, 1,7 mM sulfato de magnésio, 4,3 U/mL glicose desidrogenase, 1,1 mM NADP+, 1,1 mM NAD+, 80 mM D-glicose). Solução de extrato de lúpulo isomerizado ISOLONE® (ácidos isoalfa a 29%) é adicionada para uma concentração final de ácidos isoalfa a 0,145-16%. A reação é incubada a 60-80°C com agitação orbital a 180 rpm durante 24 horas. A mistura de reação obtida é filtrada para remover enzima. EXEMPLO 7 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com reciclagem de cofator por oxidação de etanol

[00104] Ácidos isoalfa são tratados em um modo descrito em Exemplo 2, com a exceção que isopropanol é substituído com etanol. EXEMPLO 8 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com cetorredutase imobilizada via SiO2

[00105] Uma cetorredutase é adsorvida em SiO2 e reticulada com glutaraldeído para dar um material de cetorredutase imobilizada. Ácidos isoalfa são tratados com a cetorredutase imobilizada em um modo descrito em Exemplo

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2. A mistura de reação obtida é centrifugada a 10.000g para remover a enzima imobilizada. EXEMPLO 9 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com cetorredutase imobilizada via DEAE- Celulose

[00106] Uma cetorredutase é reticulada com glutaraldeído e adsorvida sobre DEAE-celulose para dar um material de cetorredutase imobilizada. Ácidos isoalfa são tratados com a cetorredutase imobilizada em um modo descrito em Exemplo

2. A mistura de reação obtida é centrifugada a 10.000g para remover a enzima imobilizada. EXEMPLO 10 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com cetorredutase imobilizada via alumina tratada com PEI

[00107] Uma cetorredutase é reticulada com glutaraldeído e adsorvida sobre alumina tratada com polietilimina (PEI) para dar um material de cetorredutase imobilizada. Ácidos isoalfa são tratados com a cetorredutase imobilizada em um modo descrito em Exemplo 2. A mistura de reação obtida é centrifugada a 10.000g para remover a enzima imobilizada. EXEMPLO 11 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com enzimas co-imobilizadas

[00108] Uma redutase e enzima de reciclagem de cofator, tal como glicose desidrogenase, são imobilizadas sequencialmente ou juntas em uma composição única utilizando qualquer um dos métodos acima mencionados para dar um material co-imobilizado. O material co-imobilizado é adicionado a uma concentração de 0,1-10 mg/mL em solução aquosa tamponada (50-250 mM fosfato de sódio, 0,1-1,0 mM NADPH, 10-40% isopropanol, pH 7-9). Solução de extrato de

32 / 37 lúpulo isomerizado ISOLONE® (ácidos isoalfa a 29%) é adicionada para uma concentração final de 0,145-16% ácidos isoalfa. A reação é incubada a 30-40°C com agitação orbital a 180 rpm durante 24 horas. A mistura de reação obtida é centrifugada a 10.000g para remover a enzima imobilizada. EXEMPLO 12 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com células reticuladas/esferonizadas

[00109] Uma célula (bacteriana, fúngica, de planta) expressando a redutase é reticulada com poliamina/glutaraldeído, extrudada e esferonizada para dar um material de redutase imobilizada. Redutase imobilizada é adicionada a uma concentração de 0,1-10 mg/mL em solução aquosa tamponada (50-250 mM fosfato de sódio, 0,1-1,0 mM NADPH, 10-40% isopropanol, pH 7-9). Solução de extrato de lúpulo isomerizado ISOLONE ® (ácidos isoalfa a 29%) é adicionada para uma concentração final de 0,145-16% ácidos isoalfa. A reação é incubada a 30-40°C com agitação orbital a 180 rpm durante 24 horas. A mistura de reação obtida é centrifugada a 10.000g para remover a enzima imobilizada. EXEMPLO 13 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com células reticuladas/aprisionadas

[00110] Uma célula (bacteriana, fúngica, de planta) expressando a redutase é reticulada com glutaraldeído e aprisionada dentro de gelatina ou contas de polímero para dar um material de redutase imobilizada. Redutase imobilizada é adicionada a uma concentração de 0,1-10 mg/mL em solução aquosa tamponada (50-250 mM fosfato de sódio, 0,1-1,0 mM NADPH, 10-40% isopropanol, pH 7-9). Solução de extrato de lúpulo isomerizado ISOLONE® (ácidos isoalfa a 29%) é adicionada para uma concentração final de 0,145-16% de

33 / 37 ácidos isoalfa. A reação é incubada a 30-40°C com agitação orbital a 180 rpm durante 24 horas. A mistura de reação obtida é centrifugada a 10.000g para remover a enzima imobilizada. EXEMPLO 14 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com células vivas

[00111] Um microrganismo (bactéria, fungo) expressando a redutase é cultivado via fermentação até alta densidade, colhido, lavado e pelotizado para formar uma pasta de células. A pasta de células é recolocada em suspensão em meio de crescimento fresco contendo 0,145-16% ácidos isoalfa. A cultura de células é incubada a 25-37°C com mistura durante 24-72 horas. A cultura de células é centrifugada a 10.000g para remove células do meio de crescimento gasto. Ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa são extraídos do meio de crescimento gasto com etanol. EXEMPLO 15 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com lisado de células

[00112] Um microrganismo (bactéria, fungo) expressando a redutase é cultivado via fermentação até alta densidade, colhido, lavado e lisado para dar um lisado bruto de células. Ácidos isoalfa são adicionados ao lisado bruto de células a uma concentração final de ácidos isoalfa a 0,145-16%. A cultura celular é incubada a 25-40°C com mistura durante 24 horas. a mistura de reação é centrifugada a 10.000g ou filtrada para remover material celular do lisado. Ácidos di- hidro-(rho)-isoalfa são extraídos do lisado clarificado com etanol. EXEMPLO 16 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com redutase psicrofílica

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[00113] Tratamento enzimático onde a redutase é um homólogo de um microrganismo psicrofílico (tolerante ao frio). Redutase é adicionada a uma concentração de 0,1-10 mg/mL em solução aquosa tamponada (50-250 mM fosfato de sódio, 0,1-1,0 mM NADPH, 10-40% isopropanol, pH 7-9). Solução de extrato de lúpulo isomerizado ISOLONE ® (ácidos isoalfa a 29%) é adicionada para uma concentração final de ácidos isoalfa a 0,145-16%. A reação é incubada a 0-20°C com agitação orbital a 180 rpm durante 24 horas. A mistura de reação obtida é filtrada para remover enzima. EXEMPLO 17 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com reciclagem de cofator NADH

[00114] Tratamento enzimático onde o cofator NADPH é substituído com NADH. Ácidos isoalfa são tratados em um modo descrito em Exemplo 2, mas o NADP é substituído com NAD. EXEMPLO 18 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com reciclagem de cofator via oxidação de etanol

[00115] Tratamento enzimático onde o material de partida de isopropanol é substituído com etanol, em que a redutase é adicionada a uma concentração de 0,1-10 mg/mL em solução aquosa tamponada (50-250 mM fosfato de sódio, 0,1-1,0 mM NADH, 10-40% etanol, pH 7-9). Solução de extrato de lúpulo isomerizado ISOLONE® (ácidos isoalfa a 29%) é adicionada para uma concentração final de ácidos isoalfa a 0,145-16%. A reação é incubada a 30-40°C com agitação orbital a 180 rpm durante 24 horas. A mistura de reação obtida é filtrada para remover enzima. EXEMPLO 19 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo seguido por extração

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[00116] Tratamento enzimático seguido por extração para aumentar a concentração final de ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa. Ácidos isoalfa são tratados em um modo descrito em Exemplo 2. A mistura de reação obtida é filtrada para remover enzima e extraída com solvente tipo alimentício para obter uma concentração desejada de ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa. EXEMPLO 20 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo seguido por inativação térmica

[00117] Ácidos isoalfa são tratados em um modo descrito em Exemplo 2. A reação é incubada a 30-40°C com agitação orbital a 180 rpm durante 24 horas. A mistura de reação obtida é aquecida a 80-100°C por 10-30 minutos para inativar enzima. EXEMPLO 21 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo seguido por inativação química

[00118] Ácidos isoalfa são tratados em um modo descrito em Exemplo 2. A reação é incubada a 30-40°C com agitação orbital a 180 rpm durante 24 horas. Etanol de tipo alimentício é adicionado a uma concentração final de >50% para inativar enzima. EXEMPLO 22 – Tratamento enzimático de ácidos isoalfa derivados de lúpulo com reciclagem de cetorredutase imobilizada

[00119] Uma cetorredutase é reticulada com glutaraldeído e absorvida sobre DEAE-celulose para dar um material de cetorredutase imobilizada. Ácidos isoalfa são então tratados com a cetorredutase imobilizada em um modo descrito em Exemplo 2. A mistura de reação obtida é centrifugada a

10.000g para separar a cetorredutase imobilizada da solução de reação. Cetorredutase imobilizada é recuperada, lavada

36 / 37 com água ou tampão aquoso, e usada novamente em uma nova mistura de reação. Conclusões

[00120] 23 cetorredutases foram caracterizadas como ácidos isoalfa transformantes em ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa. As cetorredutases caracterizadas nesse estudo possuem uma atividade enzimática que não foi descrita previamente. As cetorredutases caracterizadas nesse estudo reduzem, todas, um grupo cetona em um álcool e são, assim, cetorredutases. Estes resultados demonstram que um biocatalisador de cetorredutase pode ser empregado para converter ácidos isoalfa em ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa em um novo processo de biotransformação. A presente invenção substitui os processos químicos atuais utilizando boroidreto de sódio.

[00121] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas aqui descritas. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas descritas aqui, se tornarão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição acima. Tais modificações são destinadas a estar dentro do escopo das reivindicações em anexo.

[00122] Todas as patentes, pedidos, publicações, métodos de teste, literatura e outros materiais citados são incorporados aqui por referência. Referências citadas

[00123] 1. “Sodium Borohydride”; MSDS No. S9125; Sigma- Aldrich Co.: Saint Louis, MO 01 de novembro, 2015. (acessado em 08/06/17).

[00124] 2. Robinson, P. K., “Enzymes: principles and

37 / 37 biotechnological applications”. Essays Biochem 2015, 59, 1-

41.

[00125] 3. Hult, K.; Berglund, P., “Enzyme promiscuity: mechanism and applications”. Trends Biotechnol. 2007, 25 (5), 231-238.

[00126] 4. Nobeli, I.; Favia, A. D.; Thornton, J. M., “Protein promiscuity and its implications for biotechnology”. Nat. Biotechnol. 2009, 27 (2), 157-167.

[00127] 5. Pozen, M., “Enzymes in Brewing. Ind. Eng. Chem”, 1934, 26 (11), 1127-1133.

[00128] 6. Praet, T.; Opstaele, F.; Jaskula-Goiris, B.; Aerts, G.; De Cooman, L., “Biotransformations of hop-derived aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae upon fermentation”. Cerevisia, 2012, 36, 125-132.

[00129] 7. Wallerstein, L. (1947) “Bentonite and Proteolytic Enzyme Treatment of Beer”, US 2.433.411.

[00130] 8. Ghionno, L.; Marconi, O.; Sileoni, V.; De Francesco, G.; Perretti, G., “Brewing with prolyl endopeptidase from Aspergillus niger: the impact of enzymatic treatment on gluten levels, quality attributes, and sensory profile”. Int. J. Food Sci. Technol, 2017, 52 (6), 1367-1374.

[00131] 9. Gros, J.; Tran, T. T. H.; Collin, S., “Enzymatic release of odourant polyfunctional thiols from cysteine conjugates in hop”. J. Inst. Brew. 2013, 119 (4), 221-227.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para preparação de ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa, caracterizado pelo fato de que compreende tratar ácidos isoalfa com uma enzima cetorredutase ou um microrganismo expressando um gene que codifica a cetorredutase.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo é realizado em um sistema aquoso.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o processo é realizado sob condições suaves de temperatura e pH.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar a enzima cetorredutase e NADPH ou NADP a uma mistura de ácidos isoalfa seguido por incubação.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar a enzima cetorredutase e NADPH ou NADP a uma mistura de ácidos isoalfa na presença de isopropanol para reciclagem de cofator, seguido por incubação.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a concentração de ácidos isoalfa, isto é, do substrato, é maximizada para aumentar a produtividade volumétrica da bioconversão.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a concentração do cofator NADPH ou NADP na mistura é minimizada para melhorar a economia da bioconversão.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizado pelo fato de que compreende adicionar a enzima cetorredutase e NADPH ou NADP a uma mistura de ácidos isoalfa na presença de outra enzima para reciclagem de cofator, seguido por incubação.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar um biocatalisador de célula completa, em que o biocatalisador de célula completa é um microrganismo imobilizado expressando o gene que codifica uma cetorredutase, a uma mistura de ácidos isoalfa seguido por incubação.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microrganismo expressando o gene que codifica a cetorredutase e adicionar ácidos isoalfa à cultura.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar uma enzima cetorredutase, em que a cetorredutase é termoestável, a um extrato de ácidos isoalfa em que calor é aplicado, e a mistura é incubada.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cetorredutase especificamente reduz cis-iso-humulona, cis-isoco-humulona e cis-isoad-humulona.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cetorredutase especificamente reduz trans-iso-humulona, trans-isoco- humulona e trans-isoad-humulona.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar uma mistura de 2 ou mais enzimas cetorredutase em uma quantidade eficaz para reduzir uma mistura de ácidos cis- e trans- isoalfa, em seus respectivos ácidos di-hidroisoalfa.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a mistura de 2 ou mais enzimas cetorredutase produz uma mistura singular de ácidos di- hidroisoalfa que é distinta da produzida por agentes redutores químicos, como boroidreto de sódio.

16. Processo, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a enzima cetorredutase compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a enzima cetorredutase ou microrganismo expressando um gene que codifica a cetorredutase pode ter opcionalmente uma ou mais diferenças em resíduos de aminoácido, como comparada com uma cetorredutase de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a cetorredutase é homóloga em 99, 95, 90, 85, 80, 75 ou 70 por cento à cetorredutase de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

19. Enzima cetorredutase, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13,

SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

20. Enzima cetorredutase, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a enzima redutase ou microrganismo expressando um gene que codifica a redutase pode ter opcionalmente uma ou mais diferenças em resíduos de aminoácido como comparada com uma cetorredutase de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

21. Enzima cetorredutase, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a cetorredutase é homóloga em 99, 95, 90, 85, 80, 75 ou 70 por cento à cetorredutase de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:22.

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Redutase

FIGURA 1. Redução catalisada porenzima de um epímero representativo de ácidos isoalfa.

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Figura 2. Análise SDS-PAGE de todas as redutases purificadas.

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Amostra R20

Isotipo de

Amostra R20

Isotipo de

Amostra Nctrl_

Isotipo de

Amostra Nctrl_

Isotipo de

Figura 3. Cromatograma UPLC para ácidos isoalfa incubados com (dois painéis de topo) e sem (dois paíneis de fundo) cetorredutase R20 durante 24 h a 30 °C.

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Figura 4. Um modelo estrutural de redutase R17 (cinza escuro, renderização de superfície) com um substrato representativo (trans-iso-humulona, preto) e cofator (NADPH, cinza claro) ligado à cavidade de sítio ativo.

5 / 6 isotipo de isotipo de isotipo de isotipo de

Figura 5. Cromatogramas UPLC para (A) uma cetorredutase que produz somente diastereômero de ácidos di-hidro-(rho)- isoalfa e (B) uma cetorreductase que produz ambos os diastereômeros de ácidos di-hidro-(rho)-isoalfa.

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Boa Homologia Baixa Homologia

Boa Homologia

Figura 6. Alinhamento da sequência de aminoácidos Clustal Omega de homólogos de cetorredutase ativos: R4, R17, R20, R21 e R23. Um domínio compartilhado, contendo 3 regiões de boa (linha sólida) ou baixa homologia (linha tracejada), é destacado em caixas.

LEGENDA: Um * (asterisco) indica posições que têm um único resíduo completamente conservado.

A : (dois pontos) indica conservação entre grupos de propriedades fortemente similares – pontuação > 0,5 na matriz Gonnet PAM 250. A . (ponto final) indica conservação entre grupos de propriedades fracamente similares - pontuação = < 0,5 na matriz Gonnet PAM 250. Portanto, a hierarquia de conservação usando esses símbolos é * (idêntica) > : (dois pontos)>. (ponto final).