KR20210064292A

KR20210064292A - 개질된 홉 생성물의 제조를 위한 효소적 방법

Info

Publication number: KR20210064292A
Application number: KR1020217011788A
Authority: KR
Inventors: 케이티 왈렌; 도날드 리차드 버달; 브라이언 패트릭 버핀; 매튜 블레이크 존스; 카트리나 윌리암스
Original assignee: 칼라마주 홀딩스, 인크.
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2021-06-02
Also published as: WO2020069139A3; MX2021003535A; CO2021005176A2; MA53728A; JP7261873B2; JP2022500063A; CN112930402A; US20210355510A1; US11821020B2; AU2019350847A1; BR112021005879A2; CA3114415A1; KR102584376B1; WO2020069139A2; EP3856917A2; US20200095619A1

Abstract

본 발명은 홉-유래 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 효소 촉매된 생물전환을 통한 맥주 고미제의 제조 방법, 및 그와 같은 방법에 사용될 수 있는 신규한 효소 촉매에 관한 것이다.

Description

개질된 홉 생성물의 제조를 위한 효소적 방법

[서열 목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램 참조사항]

KALSEC_76_PCT_Sequence_Listing_26_Sept_2019.txt라는 파일명으로 EFS-Web을 통하여 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF)로 37 C.F.R. §1.821하에 본원과 함께 동시 제출되는 서열 목록은 본원에 참조로 포함된다. 서열 목록의 전자 사본은 2019년 9월 26일에 생성된 것이다.

[발명의 분야]

본 발명은 홉(hop)-유래 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 효소 촉매된 생물전환을 통한 맥주 고미제(bittering agent)의 제조 방법, 및 그와 같은 방법에 사용될 수 있는 신규한 효소 촉매에 관한 것이다. 디히드로-(로)-이소알파산은 음료 첨가제로서의 효용을 향상시키는 탁월한 특징을 가지고 있다. 소비자는 불쾌한 화학 반응물의 사용을 필요로 하지 않으며 자연적으로 발생될 수 있는 효소를 이용하는 이와 같은 방법을 통하여 제조되는 디히드로-(로)-이소알파산을 선호할 수 있다.

전통적인 맥주의 고미화 방법은 케틀 비등(kettle boil) 동안 첨가되는 완전 신선 홉, 완전 건조 홉 또는 홉 펠렛을 사용한다. 초임계 이산화탄소를 사용하여 홉을 추출하는 것에 의해 제조되는 홉 추출물, 또는 촉매의 존재하에 홉을 가열하는 것에 의해 제조되는 이성질화된 홉 펠렛 또한 양조업자에 의해 채택되고 있는 더 최근의 고미화 신기술이다. 홉 펠렛은 나중에 양조 공정에 첨가될 수도 있으며, 건조 홉핑(hopping)의 경우에는 여과 전에 마감된 맥주에 홉이 첨가된다. 이러한 방법은 홉에 존재하는 고미화 화합물의 저조한 이용률을 감수하고 있는데, 이는 비용면에서 바람직하지 않은 영향을 준다. 이와 같은 방식으로 제조되는 맥주 또는 기타 맥아 음료는 광에 대하여 불안정해서, 짙은 갈색의 병 또는 캔에 포장되어야 하거나, 현저한 광-직격(light-struck) 또는 역겨운 향기를 생성시키는 3-메틸-2-부텐-1-티올 (3-MBT)의 광 유도 형성을 방지하도록 위치되어야 한다. 판지 상자에 병을 위치시키는 것, 또는 광-방지 또는 광-여과 종이, 호일 또는 플라스틱 덮개 중에 그것을 완전히 감싸는 것은 광-직격 향미 또는 향기로부터 이러한 음료를 보호하는 또 다른 비용이 드는 방법이 된다.

전통적인 양조 맥주의 고미는 주로 이소알파산으로부터 유래한다. 이러한 화합물은 양조 공정 동안 홉 식물의 루풀린 선(lupulin gland)에서 자연 발생하는 화합물인 휴물론(humulone)의 이성질화에 의해 형성된다. 맥주에서의 광화학 반응에 대한 이소알파산의 자연적 불안정성을 감안하면, 그 결과는 광-직격 또는 역겨운 향미 및 향기 형성의 경향이 있는 음료이다.

완전히 광 안정성인 맥주 또는 기타 맥아 음료는 소위 개량 또는 개질된 홉 산을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 고미제를 사용하여 제조된 맥주는 역겨운 향기를 형성할 걱정 없이 비-착색 플린트 유리(flint glass) 병에 포장될 수 있다. 디히드로-(로)-이소알파산은 광 안정성인 이소알파산의 환원 생성물이다. 오늘날까지, 이러한 화합물이 자연에서 발견된 바는 없다. 통상적으로, 광화학의 원인이 되는 이소알파산 부분은 소듐 보로히드리드를 사용한 카르보닐 기의 환원에 의해 변형되어 왔다.

소듐 보로히드리드는 케톤의 환원에 활용될 수 있는 무기 화합물이다. 피부 접촉, 눈 접촉, 흡입 또는 섭취의 경우 그것은 극히 위험해서, 경구 LD50이 160 mg/kg (래트)이다. 소듐 보로히드리드는 인화성이며, 부식성이고, 산화제, 산, 알칼리 및 수분과 극히 반응성이기도 하다 (문헌 [Sodium Borohydride; MSDS No. S9125; Sigma-Aldrich Co.: Saint Louis, MO November 01, 2015]).

소비자는 점점 더 합성 또는 반-합성의 것에 비해 자연 물질에 대한 선호도를 표시하고 있다. 따라서, 맥주 및 기타 음료를 위한 고미제로서 자연 물질을 사용하는 조성물을 제공하는 것뿐만 아니라, 해당 물질의 더 자연적인 제조 방법에 대해서도 필요성이 존재한다.

생물촉매 제조는 고가 화합물의 고도로 선택적이며, 안전하고, 깨끗하며, 규모화가능한 제조를 제공하는 신흥 기술이다. 생물촉매 제조는 화학 촉매 대신 자연 발생 효소에 의존한다.

효소는 특정 화학 반응을 촉매할 수 있는 자연 발생 단백질이다. 자연상에는 현재 개질된 홉 고미화 화합물 제조에서의 화학 촉매를 대체할 수 있는 효소가 존재한다 (문헌 [Robinson, P. K., Enzymes: principles and biotechnological applications. Essays Biochem 2015, 59, 1-41.]).

휴물론은 휴물루스 루풀루스 ( Humulus lupulus ) 식물과 공동서식하는 진균 및 세균에 노출되게 되는 자연적인 이차 대사물이다. 토양- 및 식물-서식 진균 및 세균은 해독 또는 제거 목적으로 휴물론을 개질할 수 있는 효소를 보유하는 것이 가능하다. 또한, 생물체가 휴물론-유사 분자를 개질하는 효소를 진화시켰을 수 있으나, 무차별적인 활성(promiscuous activity)으로 인하여 이러한 효소는 중요 화합물인 이소알파산에 대하여 활성을 보유한다 (문헌 [Hult, K.; Berglund, P., Enzyme promiscuity: mechanism and applications. Trends Biotechnol. 2007, 25 (5), 231-238]; [Nobeli, I.; Favia, A. D.; Thornton, J. M., Protein promiscuity and its implications for biotechnology. Nat. Biotechnol. 2009, 27 (2), 157-167.]).

한 가지 물질로부터 또 다른 것으로의 수소 및 산소 원자 또는 전자의 전달인 산화/환원 반응을 촉매하는 효소는 광범위하게 옥시도리덕타제로 분류된다. 더 구체적으로, 케톤 기를 히드록실 기로 환원시키는 효소는 케토리덕타제 또는 카르보닐 리덕타제로 알려져 있으며, 외인성 환원 당량 공급원 (예컨대 보조인자 NADH, NADPH)의 보충에 의존한다. 본원에서 특성화되는 기존 효소 명명법에 따라, 상기 효소는 "케토리덕타제"로 지칭될 것이다.

고가인 보조인자 (NADH, NADPH)의 비용은 보조인자 재순환을 위한 추가적인 효소 및 기질, 예를 들면 글루코스 데히드로제나제 및 글루코스를 포함시키는 것에 의해, 또는 에탄올과 같이 저-비용이며 자연적인 공급원료를 산화할 수도 있는 케토리덕타제를 활용하는 것에 의해 감소될 수 있다.

양조에서의 효소의 활용 및 맥주의 최종 특징에 대한 그의 바람직한 영향에 대한 많은 선행기술이 존재한다 (문헌 [Pozen, M., Enzymes in Brewing. Ind. Eng. Chem, 1934, 26 (11), 1127-1133.]). 맥주의 자연 발효에서의 효모 효소의 존재는 최종 음료의 향미 및 향기에 영향을 주는 화합물을 생성시키는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Praet, T.; Opstaele, F.; Jaskula-Goiris, B.; Aerts, G.; De Cooman, L., Biotransformations of hop-derived aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae upon fermentation. Cerevisia, 2012, 36, 125-132.]). 외인성으로 첨가되는 효소는 점도의 감소, 발효가능한 당의 증가, 냉장-지속(chill-proofing) 및 정화와 같은 다양한 개선점을 양조 공정에 제공한다 (문헌 [Wallerstein, L. (1947) Bentonite and Proteolytic Enzyme Treatment of Beer, US Patent 2,433,411.]; [Ghionno, L.; Marconi, O.; Sileoni, V.; De Francesco, G.; Perretti, G., Brewing with prolyl endopeptidase from Aspergillus niger: the impact of enzymatic treatment on gluten levels, quality attributes, and sensory profile. Int. J. Food Sci. Technol, 2017, 52 (6), 1367-1374.]). 또한, 홉 추출물은 특히 홉-유래 향기 화합물을 개질하기 위하여 효소로 예비처리되어 왔다 (문헌 [Gros, J.; Tran, T. T. H.; Collin, S., Enzymatic release of odourant polyfunctional thiols from cysteine conjugates in hop. J. Inst. Brew. 2013, 119 (4), 221-227.]).

그러나, 본 발명 이전에, 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 환원을 촉매할 수 있는 효소는 자연상에서 관찰된 바 없으며, 그에 따라 문헌에 기술된 바 없다. 본원에서 개시되는 방법은 신규한 효소 반응을 나타낸다.

홉 식물로부터 유래하는 자연 고미제의 개질된 버전인 디히드로-(로)-이소알파산의 효소적 제조 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명의 방법은 화학 반응물인 소듐 보로히드리드를 활용하는 현재의 제조 방법을 대체하도록 설계된다. 그와 같은 방법에 사용될 수 있는 신규한 효소 촉매를 제공하는 것은 본 발명의 추가적인 목적이 된다.

[발명의 개요]

본 발명은 차후에 음료 중 자연 유래 광 안정성 고미제로 사용될 수 있는 디히드로-(로)-이소알파산으로의 이소-알파산의 생물전환을 위한, 산업 수준으로 규모 증대될 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 측면은 케토리덕타제 효소 또는 상기 케토리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 이용한 이소-알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 고-수율 생물전환 방법이다.

본 발명의 다른 측면은 방법이 환경적으로 양성인 제조 방법이 되도록 하는 온건한 온도 및 pH 조건을 사용하여 수성 시스템 중에서 수행되는, 상기한 바와 같은 디히드로-(로)-이소알파산의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시양태에서, 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 생물전환은 이소알파산 혼합물에의 정제된 케토리덕타제 효소 및 NADPH 또는 NADP의 첨가 이어서 원하는 수율이 수득될 때까지의 인큐베이션을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 생물전환은 보조인자 재순환을 위한 이소프로판올의 존재하에 이소알파산 혼합물에의 정제된 케토리덕타제 효소 및 NADPH 또는 NADP의 첨가 이어서 원하는 수율이 수득될 때까지의 인큐베이션을 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 생물전환의 부피 생산성을 증가시키기 위하여, 이소알파산, 즉 기질의 농도는 최대화된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 생물전환의 경제성을 향상시키기 위하여, 혼합물 중 보조인자 NADPH 또는 NADP의 농도는 최소화된다.

본 발명의 일 실시양태에서, 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 생물전환은 보조인자 재순환을 위한 또 다른 효소 (예컨대 글루코스 데히드로제나제) 존재하에 이소알파산 혼합물에의 정제된 케토리덕타제 효소 및 NADPH 또는 NADP의 첨가 이어서 원하는 수율이 수득될 때까지의 인큐베이션을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 생물전환은 이소알파산 혼합물에의 전세포 생물촉매의 첨가 이어서 원하는 수율이 수득될 때까지의 인큐베이션을 포함하며, 여기서 전세포 생물촉매는 케토리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 고정된 미생물이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 생물전환은 케토리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 성장중인 미생물에의 이소알파산의 공급을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 생물전환은 열이 적용되는 알파산 추출물에의 열안정성 케토리덕타제 효소의 첨가, 그리고 원하는 디히드로-(로)-이소알파산의 수율이 달성될 때까지 혼합물이 인큐베이팅되는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 신규한 효소 촉매에 관한 것이다.

본 발명에 따른 리덕타제는 임의적으로 이소알파산 중 C(4) 측쇄의 카르보닐 기를 환원시켜, 광-민감성인 아실로인 기를 이차 알콜로 전환시킴으로써, 광-안정성 이소알파산 유도체를 생성시키는 것에 대하여 활성을 나타낸다 (도 1).

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 케토리덕타제는 유리하게는 하기 6종의 주요 이소알파산 중 어느 1종 특정 구성원의 환원을 촉매하는 것에 대해서는 최소한의 선호도를 나타내거나 선호도를 나타내지 않는다: 시스-이소휴물론, 트랜스-이소휴물론, 시스-이소코휴물론, 트랜스-이소코휴물론, 시스-이소애드휴물론 및 트랜스-이소애드휴물론.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 케토리덕타제는 시스-이소휴물론, 시스-이소코휴물론 및 시스-이소애드휴물론을 특이적으로 환원시킨다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 케토리덕타제는 트랜스-이소휴물론, 트랜스-이소코휴물론 및 트랜스-이소애드휴물론을 특이적으로 환원시킨다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 시스- 및 트랜스-이소알파산의 혼합물을 그의 각 디히드로이소알파산으로 환원시키기 위하여, 상기 기질 특이성을 나타내는 2종 이상의 케토리덕타제 효소의 혼합물이 본 발명에 따른 방법에 사용된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 소듐 보로히드리드와 같은 화학 환원제에 의해 생성되는 것과 구별되는 특유한 디히드로이소알파산 혼합물을 생성시키기 위하여, 기질 특이성을 나타내는 2종 이상의 케토리덕타제 효소의 혼합물이 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 리덕타제 효소가 케토리덕타제인 상기에서 정의된 바와 같은 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시양태는 케토리덕타제 효소 또는 케토리덕타제 효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물이 서열식별번호(SEQ ID NO): 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는, 상기에서 정의된 바와 같은 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 케토리덕타제 효소 또는 케토리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물이 임의적으로 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 22에서 선택되는 케토리덕타제 효소와 비교하였을 때 아미노산 잔기에 하나 이상의 차이를 가질 수 있는, 상기에서 정의된 바와 같은 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시양태는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 케토리덕타제 효소 또는 케토리덕타제 효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시양태는 케토리덕타제 효소 또는 리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물이 임의적으로 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 리덕타제 효소 서열과 비교하였을 때 아미노산 잔기에 하나 이상의 차이를 가질 수 있는 것에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시양태는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 22에서 선택되는 케토리덕타제 효소와 99, 95, 90, 85, 80, 75 또는 70 % 상동성인 케토리덕타제 효소 또는 케토리덕타제 효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 조절 서열을 추가적으로 포함하는 상기 벡터를 포함한다.

본 발명은 또한 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 숙주 세포에 의해 케토리덕타제가 생성되는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22 케토리덕타제의 제조 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 상기 숙주 세포에 의해 생성된 케토리덕타제를 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22 케토리덕타제의 제조 방법을 포함한다.

도 1은 대표적인 이소알파산 에피머(epimer)의 효소 촉매된 환원을 나타낸다.
도 2는 정제된 리덕타제의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 3은 30 ℃에서 24시간 동안 리덕타제 R20과 함께 (상부 2개 패널), 그리고 그것 없이 (저부 2개 패널) 인큐베이팅된 이소알파산의 UPLC 크로마토그램을 나타낸다. 생성물인 디히드로-(로)-이소알파산에 상응하는 피크를 표시하였다.
도 4는 활성 부위 공강에 결합된 대표적인 기질 (트랜스-이소휴물론, 흑색) 및 보조인자 (NADPH, 옅은 회색)을 포함한 리덕타제 R17 (짙은 회색, 표면 렌더링(rendering))의 구조 모델을 나타낸다.
도 5는 (A) 디히드로-(로)-이소알파산의 1종의 부분입체이성질체만을 생성시키는 케토리덕타제 및 (B) 디히드로-(로)-이소알파산의 두 부분입체이성질체를 생성시키는 케토리덕타제의 UPLC 크로마토그램을 나타낸다. 생성물인 디히드로-(로)-이소알파산에 상응하는 피크를 표시하였다.
도 6은 하기 활성 케토리덕타제 상동체의 클러스탈 오메가(Clustal Omega) (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 생성되는 아미노산 서열 정렬을 나타낸다: R4, R17, R20, R21 및 R23.

본 발명에서는, 케토리덕타제 효소가 소듐 보로히드리드의 기능을 대체하여, 음료 첨가제인 디히드로-(로)-이소알파산의 더 자연적인 제조 방법을 가능하게 한다. 상기 효소는 이소알파산의 임의의 또는 모든 이성질체 (코-, n-, 애드- 및 시스/트랜스-) 중 케톤 기를 히드록시 기로 특이적으로 환원시키는 임의의 케토리덕타제일 수 있다. 상기 효소는 세균, 진균 또는 식물로부터 유래할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 효소는 보조인자 의존성 (NADH 또는 NADPH) 또는 비의존성일 수 있다.

본원에서, "이소알파산", "홉 이소알파산" 및 "홉-유래 이소알파산"은 호환가능하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따라, 이소알파산 용액은 1종 이상의 정제된 효소, 또는 효소(들) 및 임의적으로 보조인자 재순환을 위한 추가적인 효소를 함유하는 혼합물을 사용한 효소적 처리에 적용된다. 효소의 양은 기간, 온도, 기질의 양 및 농도를 포함한 인큐베이션 파라미터에 따라 달라진다.

대안적으로, 이소알파산 용액은 상기 효소(들)를 발현하는 미생물을 함유하는 혼합물을 사용한 효소적 처리에 적용된다. 본 발명은 또한 케토리덕타제-생성 미생물을 배양하고, 경우에 따라 케토리덕타제의 발현을 유도하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 이소알파산의 환원 방법을 제공한다. 무손상 세포가 수확되어, 상기한 바와 같은 이소알파산의 환원을 위하여 단리된 효소 대신 바로 반응에 첨가될 수 있다. 또한, 수확된 세포는 환원 반응에의 첨가 전에 고정될 수 있다. 미생물은 공지의 방법에 의해 배양 및 발효될 수 있다. 상기 미생물은 세균 또는 진균일 수 있다.

시스- 및 트랜스-이소알파산의 혼합물이 두 이성질체를 환원시키는 능력을 나타내는 단일 케토리덕타제와 함께 인큐베이팅될 수 있다. 대안적으로는, 가변적인 특이성을 나타내는 2종 이상의 케토리덕타제와 함께 시스- 및 트랜스-이소알파산의 혼합물이 인큐베이팅될 수 있으며, 이 경우 생성되는 생성물은 시스- 및 트랜스-디히드로이소알파산의 혼합물이다.

대안적으로, 시스-이소알파산만을 함유하는 용액이 시스-이성질체에 대하여 특이적인 케토리덕타제(들)와 함께 인큐베이팅될 수 있으며, 생성되는 생성물은 시스-디히드로이소알파산의 용액이다. 시스-디히드로이소알파산만의 용액은 유리한 고미 및/또는 열적 안정성 특성을 나타낼 수 있다.

대안적으로, 트랜스-이소알파산만을 함유하는 용액이 트랜스-이성질체에 대하여 특이적인 케토리덕타제(들)와 함께 인큐베이팅될 수 있으며, 생성되는 생성물은 트랜스-디히드로이소알파산의 용액이다. 트랜스-디히드로이소알파산만의 용액은 유리한 고미 특성을 나타낼 수 있다.

트랜스- 및 시스-이소알파산의 맞춤형 블렌드는 달리는 달성될 수 없는 디히드로이소알파산의 특유한 블렌드를 제조하기 위하여 가변적인 기질 특이성을 나타내는 1종 이상의 케토리덕타제와 함께 인큐베이팅될 수도 있다.

이소알파산 혼합물은 비제한적으로 데히드로제나제, 이소머라제, 히드라타제 및 리아제와 같은 추가적인 원하는 개질을 촉매하기 위한 효소에 더하여 케토리덕타제 효소(들)를 사용한 효소 반응에 적용될 수 있다. 가변적인 활성을 가지는 효소가 1 포트 반응(one pot reaction)에서 조합될 수 있거나, 순차적으로 첨가될 수 있다.

효소 인큐베이션에서 사용하기에 적합한 용매에는 물, 및 효소와 상용성인 또 다른 용매, 예컨대 에탄올 또는 이소프로판올과의 물의 혼합물이 포함된다. 효소 활성은 수성 용액의 완충으로부터 도움을 받는다. 완충제에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (별칭 트리스(Tris)), 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산 (별칭 헤페스(HEPES)), 소듐 포스페이트 및 칼륨 포스페이트.

효소(들) 및 이소알파산은 적합한 pH 범위 예를 들면 pH 6 내지 10, 및 온도 범위 예를 들면 10 내지 90 ℃ 내에서 인큐베이팅되며, 원하는 디히드로-(로)-이소알파산 수율까지 이소알파산을 전환하기에 충분한 시간 동안 이와 같은 온도에서 유지된다. 일정한 온도 및 효소에의 기질의 노출은 연속적인 교반이 보장하게 된다. 통상적으로 24 내지 48시간인 반응 기간은 효소 및 기질의 양 및 농도, 존재하는 용매 및 선택되는 온도에 따라 달라지게 된다.

효소(들)는 용액 중에서 자유롭거나, 비드 또는 유사한 혼합가능 스캐폴드상에 고정되거나, 또는 이소알파산의 용액이 그 위로 통과되는 필름 또는 수지상에 고정될 수 있다. 효소의 순도 수준은 정제 방법에 따라 30 내지 90+ %로 가변적일 수 있다.

효소(들)는 물리적 여과 또는 원심분리를 통하여 최종 생성물로부터 제거될 수 있다. 효소(들)는 극한 온도 또는 pH에 의해 불활성이 되거나 최종 생성물에 잔존할 수도 있다.

본 발명에 의해 포괄되는 리덕타제 효소에는 케토리덕타제 효소가 포함된다.

23종의 성공적으로 정제된 효소에 대한 세부사항을 하기 표 1에 열거한 바, 하기를 포함한다: 약기 표지, 서열 ID 번호 및 아미노산 서열.

<표 1> 정제된 리덕타제

1-단계 정제 후, 거의 모든 후보가 충분하게 순수하였다 (>80 %의 단백질 내용물이 해당 단백질임) (도 2 참조).

본 발명에 의해 포괄되는 리덕타제 효소에는 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것이 포함된다: 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 22.

본 발명에 의해 포괄되는 리덕타제 효소에는 또한 하기의 아미노산 서열과 비교하였을 때 아미노산 잔기에 하나 이상의 차이를 가지는 것이 포함된다: 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 22.

본 발명에 의해 포괄되는 리덕타제 효소에는 또한 하기의 아미노산 서열에 대하여 적어도 40 % (적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 % 및 적어도 95 % 포함)까지 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 포함된다: 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 22.

본원에서 사용될 때, "서열 상동성의 백분율", "% 상동성" 및 "% 동일성"은 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열 사이의 비교를 지칭하는 것으로서, 2개의 비교 영역에 걸쳐 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 것에 의해 측정되는데, 여기서 비교 영역 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 중 일부는 2개 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열과 비교하였을 때 첨가 또는 결실 (즉 갭(gap))을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기 중 어느 하나가 출현하거나, 또는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 갭을 동반하여 정렬되는 위치의 수를 측정함으로써 일치되는 위치의 수를 산출하고, 일치되는 위치의 수를 비교 영역 내의 총 위치 수로 나눈 후, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출하는 것에 의해 계산된다. 최적 정렬 및 % 서열 상동성의 측정은 블라스트(BLAST) 및 블라스트 2.0 알고리즘을 사용하여 수행된다 (예컨대 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 [1990]]; 및 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 3389-3402 [1977]] 참조). 블라스트 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트에서 공적으로 가용하다.

무차별적인 효소는 낮게 공유되는 아미노산 동일성을 보유함에도 불구하고 동일한 화학 반응을 촉매할 수 있다. 케토리덕타제 R4 (서열식별번호: 3)가 그의 무차별적인 특성으로 인하여 최초 스크리닝용으로 선택되었다 (문헌 [Guo et al. Biochim . Biophys . Acta 2014, 1844]). 동일한 효소 도메인 (IPR001509: NAD-의존성 에피머라제/데히드라타제)을 함유하며 R4 (서열식별번호: 3)에 대하여 아미노산 동일성을 공유하는 5종의 추가적인 케토리덕타제 (R17 (서열식별번호: 16), R20 (서열식별번호: 19), R21 (서열식별번호: 20), R22 (서열식별번호: 21) 및 R23 (서열식별번호: 22))가 정제 및 특성화된 합성 유전자로서 수득되었다. 서열 동일성 컷오프(cutoff)를 확립하기 위하여, 점점 더 낮은 서열 동일성으로 특수하게 리덕타제가 선택되었다.

R4 (서열식별번호: 3)에 대하여 상대적으로 낮은 % 동일성 (효소 전체 길이에 걸쳐 34-39 %)을 공유함에도 불구하고, 효소 R17 (서열식별번호: 16), R20 (서열식별번호: 19), R21 (서열식별번호: 20) 및 R23 (서열식별번호: 22)은 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 전환을 촉매한다. R4 (서열식별번호: 3)에 대하여 33 %의 동일성을 공유하는 R22 (서열식별번호: 21)는 이소알파산의 디히드로-(로)-이소알파산으로의 전환을 촉매하지는 않으나, 정제되었을 때 다른 것은 활성인 효소이다 (이소프로판올의 효소-촉매된 산화 활성을 측정하는 것에 의해 확립되었음).

디히드로-(로)-이소알파산을 수득하는 데에 있어서 비기능성인 리덕타제로부터 기능성인 것을 분리하는 특징은 다중 서열 정렬 (도 6)로 예시된다. 본원에서 이소알파산을 디히드로-(로)-이소알파산으로 전환할 수 있는 것으로 특성화되는 케토리덕타제 R4 (서열식별번호: 3) 및 모든 R4 (서열식별번호: 3) 상동체는 낮은 상동성 (38-46 %)을 가지는 36-39개 아미노산에 의해 분리되어 있는 우수한 상동성 (> 53 %의 동일성)을 가지는 13개 아미노산 및 높은 상동성 (> 55 %)을 가지는 9개 아미노산으로 이루어진, 잔기 100 내지 200 사이에서 출현하는 도메인을 보유한다. 이와 같은 도메인은 비기능성인 R22 폴리펩티드 (서열식별번호: 21)에는 빠져있다. 이에 따라, 상기 도메인은 디히드로-(로)-이소알파산을 수득하기 위한 케토리덕타제 활성의 인증마크인 것으로 여겨진다.

본원에서 개시되는 구체적인 실시양태는 청구범위에서 ~로 이루어진 또는 본질적으로 ~로 이루어진 이라는 언어를 사용하여 추가적으로 제한될 수도 있다. 청구범위에서 사용될 때, 출원된 것인지 또는 보정시 첨가된 것인지에 관계없이, 연결 어구인 "~로 이루어진"은 청구범위에서 열거되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 연결 어구 "본질적으로 ~로 이루어진"은 열거된 물질 또는 단계, 그리고 기본적인 신규 특징(들)에는 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계로 청구범위의 영역을 제한한다. 그와 같이 청구되는 본 발명의 실시양태는 본원에서 본질적으로 또는 명시적으로 기술되어 수권된다.

본원에서 사용될 때, "포함하는" 또는 "포함하다"라는 용어는 조성물 또는 방법이 언급된 요소를 포함하나 다른 것을 배제하지는 않는다는 것을 의미하고자 하는 것이다.

"유효량"이라는 용어는 이소알파산을 디히드로-(로)-이소알파산으로 전환하기에 충분한 리덕타제의 양을 지칭한다. 해당 투여의 유효량 측정은 전적으로 제약 기술분야 통상의 기술에 속한다.

디히드로-(로)-이소알파산의 제조 방법에서, 이소알파산 용액은 이소알파산을 디히드로-(로)-이소알파산으로 전환하기에 효과적인 양인 1종 이상의 정제된 리덕타제 효소, 또는 리덕타제 효소(들) 및 임의적으로 보조인자 재순환을 위한 추가적인 효소를 함유하는 혼합물을 사용한 효소적 처리에 적용된다. 효소의 양은 기간, 온도, 기질의 양 및 농도를 포함한 인큐베이션 파라미터에 따라 달라진다.

대안적으로, 이소알파산 용액은 상기 효소를 발현하는 미생물을 함유하는 혼합물을 사용한 효소적 처리에 적용된다.

시스- 및 트랜스-이소알파산의 혼합물이 두 이성질체를 환원시키는 능력을 나타내는 단일 리덕타제/케토리덕타제와 함께 인큐베이팅될 수 있다. 대안적으로는, 가변적인 특이성을 나타내는 2종 이상의 케토리덕타제와 함께 시스- 및 트랜스-이소알파산의 혼합물이 인큐베이팅될 수 있으며, 이 경우 생성되는 생성물은 시스- 및 트랜스-디히드로이소알파산의 혼합물이다.

달리는 달성될 수 없는 디히드로이소알파산의 특유한 블렌드를 제조하기 위하여, 트랜스- 및 시스-이소알파산의 맞춤형 블렌드가 가변적인 기질 특이성을 나타내는 1종 이상의 리덕타제/케토리덕타제와 함께 인큐베이팅될 수도 있다.

이소알파산 혼합물은 비제한적으로 데히드로제나제, 이소머라제, 히드라타제 및 리아제와 같은 추가적인 원하는 개질을 촉매하기 위한 효소에 더하여 리덕타제 효소를 사용한 효소적 반응에 적용될 수 있다. 가변적인 활성을 가지는 효소가 1 포트 반응(one pot reaction)에서 조합될 수 있거나, 순차적으로 첨가될 수 있다.

효소 인큐베이션에서 사용하기에 적합한 용매에는 물, 및 효소와 상용성인 또 다른 용매, 예컨대 에탄올 또는 이소프로판올과의 물의 혼합물이 포함된다. 효소 활성은 수성 용액의 완충으로부터 도움을 받는다. 완충제에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (별칭 트리스), 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산 (별칭 헤페스), 소듐 포스페이트 및 칼륨 포스페이트.

효소 및 이소알파산은 적합한 pH 범위 예를 들면 pH 6 내지 10, 및 온도 범위 예를 들면 10 내지 90 ℃ 내에서 인큐베이팅되며, 원하는 디히드로-(로)-이소알파산 수율까지 이소알파산을 전환하기에 충분한 시간 동안 이와 같은 온도에서 유지된다. 일정한 온도 및 효소에의 기질의 노출은 연속적인 교반이 보장하게 된다. 통상적으로 24 내지 48시간인 반응 기간은 효소 및 기질의 양 및 농도, 존재하는 용매 및 선택되는 온도에 따라 달라지게 된다.

리덕타제 효소는 용액 중에서 자유롭거나, 비드 또는 유사한 혼합가능 스캐폴드상에 고정되거나, 또는 이소알파산의 용액이 그 위로 통과되는 필름 또는 수지상에 고정될 수 있다. 효소의 순도 수준은 정제 방법에 따라 30 내지 90+ %로 가변적일 수 있다.

리덕타제는 물리적 여과 또는 원심분리를 통하여 최종 생성물로부터 제거될 수 있다. 효소는 극한 온도 또는 pH에 의해 불활성이 될 수 있으며, 최종 생성물에 잔존할 수도 있다.

본 발명은 이소알파산을 디히드로-(로)-이소알파산으로 전환하기 위한 신규한 리덕타제 이용 방법이다. 코돈 최적화된 리덕타제 유전자로서, 이. 콜리 (E coli) BL21(DE3)에서 위로는 세포 배양물 L 당 정제된 효소 100 mg까지의 수율을 달성하였다. 모든 효소는 보조인자로서 NADPH를 사용하여 특성화되었다. 이와 같은 연구에서 특성화된 리덕타제는 지금까지 기술된 바 없는 효소 활성을 보유한다. 이러한 효소는 소듐 보로히드리드를 활용하는 현재의 방법을 대체하기 위하여 신규한 생물전환에 활용될 수 있는 신규한 생물촉매의 바탕을 형성한다.

[ 실시예 ]

하기의 실시예로서 본 발명을 예시하는 바, 그의 영역을 제한하는 것은 아니다.

실시예 1 - 리덕타제 제조 및 스크리닝

방법

후보 확인

원하는 반응과 유사한 특성을 가지는 특성화되어 있는 효소 반응에 대한 집중적인 문헌 검색 후, 리덕타제 후보를 선택하고, 이어서 하기의 3개 공공 단백질 서열 데이터베이스의 생물정보공학 발굴을 수행하였다: UniProt (www.uniprot.org/), Pfam (//pfam.xfam.org/) 및 InterPro (www.ebi.ac.uk/interpro/E coli). 생물정보공학은 특성화되어 있는 효소와 리덕타제 후보 사이의 블라스트피(BLASTP) 서열 정렬 (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 기반으로 하였다.

효소 발현 및 정제

하기의 몇 가지 방식으로 플라스미드 DNA를 수득하였다: 1) DNASU 플라스미드 레포지토리(Plasmid Repository) (www.dnasu.org)로부터의 발현 벡터 중으로, 2) DNASU 플라스미드 레포지토리로부터의 클로닝 벡터 중으로, 그리고 이후 사내 발현 벡터로 클로닝하여, 3) 아툼(Atum) (www.atum.bio)으로부터의 발현 벡터 중 합성 유전자로서, 또는 4) 제너럴 바이오시스템스(General Biosystems) (www.generalbiosystems.com)로부터의 발현 벡터 중 합성 유전자로서. 합성 유전자는 이. 콜리에서의 발현용으로 코돈-최적화하였다.

적절한 항생제를 포함하는 5 mL의 루리아 브로스(Luria Broth)에 해당 발현 벡터를 함유하는 이. 콜리 BL21(DE3)의 아가 플레이트를 접종하고, 밤새 진탕하면서 30 ℃로 인큐베이팅하였다. 다음날, 항생제를 포함하는 새로운 0.5 L의 루리아 브로스에 밤샘 배양물을 1:100 역-희석하고, 0.5의 광학 밀도에 도달할 때까지 220 rpm 진탕하면서 2-3시간 동안 37 ℃로 인큐베이팅하였다. 0.2 mM 최종 농도의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 사용하여 배양물을 유도하고, 180 rpm 진탕하면서 25 ℃로 16시간 동안 인큐베이팅하였다. 4800 rpm에서의 15분 동안의 원심분리에 의해 세포를 수확하였다. 12 mL의 결합 완충제 (10 mM 헤페스, 50 mM NaCl, pH 7.5)에 세포 펠렛을 재현탁하고, 15분 동안의 초음파처리 (5초 작동, 5초 작동중지)를 통하여 세포를 용해시켰다. 10,000 rpm에서의 20분 동안의 원심분리를 통하여 세포 용해물을 정화하였다. 코발트 친화성, 말토스 친화성 또는 글루타치온 친화성 크로마토그래피를 통하여 정화된 세포 용해물로부터 태그부착된 단백질을 정제하였다. 단백질 용액을 원심분리 여과를 통하여 단백질 저장 완충제 (20 mM 트리스-HCl, 50 mM NaCl pH 7.0)로 교환하였다. 적절한 아미노산 서열을 사용하여 계산된 흡광 계수를 사용하는 280 nm에서의 흡광도를 통하여 단백질 농도를 측정하였다. 20 %의 최종 농도까지 글리세롤을 첨가하고, -20 또는 -80 ℃로 효소 용액을 냉동하였다.

이소알파산 환원 검정

정제된 효소 후보를 이소알파산을 환원시키는 그의 능력에 대하여 시험하였다. 특이적 반응은 이소알파산의 임의의 또는 모든 이성질체 및 유사물 (코-, n-, 애드- 및 시스/트랜스-) 중 특정 케톤 기를 히드록시 기로 환원시키는 것을 수반한다. 2 mL 미세원심분리 튜브에서, 100 uL의 효소 용액 (0.15-1.8 mg/mL 효소의 최종 농도)을 글루코스 데히드로제나제에 의한 보조인자 재순환을 포함하는 900 uL의 완충된 수성 용액 (263 mM의 소듐 포스페이트, 1.7 mM의 마그네슘 술페이트, 1.1 mM의 NADP+, 1.1 mM의 NAD+, 80 mM의 D-글루코스, 4.3 U/mL의 글루코스 데히드로제나제, pH 7.0)에 첨가하였다. 5 uL의 알칼리성 이소알파산 용액 (이솔론(ISOLONE)^®, 29 % 이소알파산)을 이소알파산 0.29 %의 최종 농도로 첨가하였다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 24시간 동안 30 ℃로 반응물을 인큐베이팅하였다. 수득되는 반응 혼합물을 여과하여 효소를 제거하였다. UPLC-MS/MS에 의해 이소알파산 및 디히드로-(로)-이소알파산을 검출하였다. 음성 대조 샘플은 모든 상기 반응 성분을 함유하였으며, 효소 용액이 단백질 저장 완충제로 대체되었다.

결과

후보 선택

공적인 기능 주해(functional annotation) 및 아미노산 서열 유사성을 바탕으로, 60종의 특유한 효소 서열을 리덕타제 후보인 것으로 확인하였다.

효소 발현 및 정제

최초의 60종 후보 군에서 제시된 다양한 아미노산 서열의 DNA의 가용성 및 충분한 샘플링을 바탕으로, 30종의 후보를 발현 및 정제용으로 선택하였다. 대부분의 후보가 이. 콜리 BL21(DE3)에서 우수한 발현 및 용해도 수준을 나타내었으며, 배양물 리터 당 정제된 단백질 5 내지 100 mg으로 가변적인 수율을 가졌다. 몇 가지 후보는 숙주 생물체에서의 저조한 용해도로 인하여 폐기되었다.

리덕타제 특성화

효소가 결핍되어 있는 대조 샘플에 비해 더 큰 강도로 UPLC를 통하여 시스 /트랜스- 코/애드/n-디히드로-(로)-이소알파산에 상응하는 피크가 검출되는 경우, 효소를 이소알파산을 환원시키는 것으로 결정하였다. 10종의 특유한 효소가 이소알파산 리덕타제인 것으로 결정되었다 (도 3 참조). 이들 효소의 세부사항을 하기 표 2에 요약하였다. 용해도 및 효소 수율로 인하여, 검정에서의 사내 효소의 최종 농도는 0.15-1.8 mg/mL로 가변적이었다. 더 낮은 효소 농도는 디히드로-(로)-이소알파산 수율에 기여한다.

이소알파산 환원에 필요한 NADP를 재순환하기 위하여, 효소를 먼저 글루코스, 글루코스 데히드로제나제 및 NAD의 존재하에 리덕타제 활성에 대하여 시험하였다. 리덕타제 활성의 측정 후, 보조인자 재순환을 위한 더 경제적인 대안인 이소프로판올을 산화하는 그의 능력에 대하여 효소를 특성화하였다. 이소프로판올을 효율적으로 산화하는 능력을 하기 표 2에 표시하였다.

<표 2>

기질 특이성

생물전환 목적으로 이상적인 케토리덕타제는 측쇄 조성을 기준으로 가변적인 이소휴물론 유사물 (n-, 애드- 및 코-이소휴물론으로 지칭)에 대하여 기질 특이성을 나타내지 않는다. 또한, 상기 케토리덕타제는 효소 환원 부위에 근접한 C4 삼차 알콜 기에서 공간적으로 가변적인 이소휴물론 시스 및 트랜스 이성질체에 대하여 특이성을 나타내지 않는다. 기질 특이성은 아미노산 서열 및 그에 따른 효소의 기질 결합 포켓 형상구조에 의해 좌우된다. 더 큰 결합 포켓은 더 제한된 결합 포켓에 비해 더 큰 기질은 물론 더 다양한 기질을 수용한다 (도 4 참조).

특성화된 리덕타제 중에서 환원 입체특이성을 가지는 2종의 변종이 관찰되었다 (도 5 참조).

이소알파산 분자상의 2개의 추가적인 케톤 기의 존재에도 불구하고, 특성화된 모든 케토리덕타제에서 원하는 C4 측쇄에서의 환원만이 관찰되었다.

실시예 2 - 이소프로판올 산화에 의한 보조인자 재순환을 동반하는 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

1.5 mL 미세원심분리 튜브에서, 10 mg의 리덕타제를 700 uL의 완충된 수성 용액 (예컨대 소듐 포스페이트 pH 7.5)에 재현탁한다. 290 uL의 이소프로판올을 첨가한다. 10 uL의 알칼리성 이소알파산 용액 (29 % 이소알파산)을 이소알파산 0.29 %의 최종 농도로 첨가한다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 48시간 동안 30 ℃로 반응물을 인큐베이팅한다. 수득되는 반응 혼합물을 여과하여 효소를 제거한다. HPLC에 의해 이소알파산 및 디히드로-(로)-이소알파산을 정량한다.

실시예 3 - 이소프로판올 산화에 의한 보조인자 재순환을 동반하는 산성화된 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

실시예 2에서 기술된 방식으로 이소알파산을 처리하되, 이소알파산의 공급원이 <7의 pH를 가지는 고도로 농축된 재료 (68.9 %의 이소알파산)이다.

실시예 4 - 글루코스 데히드로제나제에 의한 보조인자 재순환을 동반하는 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

이소프로판올이 4.3 U/mL의 글루코스 데히드로제나제, 0.7 g/L mM의 NAD 및 14.4 g/L의 D-글루코스로 대체되는 것 이외에는 실시예 2에서 기술된 방식으로, 이소알파산을 처리한다.

실시예 5 - 보조인자 재순환이 없는 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

이소프로판올이 기질로서의 등몰량의 NADPH로 대체되는 것 이외에는 실시예 2에서 기술된 방식으로, 이소알파산을 처리한다.

실시예 6 - 열안정성 리덕타제를 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

호열성 세균 및 고세균 생물체, 예컨대 서모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 자연적으로 열안정성인 리덕타제를 수득한다. 1.5 mL 미세원심분리 튜브에서, 100 uL의 효소 용액 (1.5-15.0 mg/mL 효소)을 900 uL의 완충된 수성 용액 (263 mM의 소듐 포스페이트 pH 7.0, 1.7 mM의 마그네슘 술페이트, 4.3 U/mL의 글루코스 데히드로제나제, 1.1 mM의 NADP+, 1.1 mM의 NAD+, 80 mM의 D-글루코스)에 첨가한다. 이솔론^® 이성질화된 홉 추출물 용액 (29 % 이소알파산)을 이소알파산 0.145-16 %의 최종 농도로 첨가한다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 24시간 동안 60-80 ℃로 반응물을 인큐베이팅한다. 수득되는 반응 혼합물을 여과하여 효소를 제거한다.

실시예 7 - 에탄올 산화에 의한 보조인자 재순환을 동반하는 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

이소프로판올이 에탄올로 대체되는 것 이외에는 실시예 2에서 기술된 방식으로, 이소알파산을 처리한다.

실시예 8 - SiO ₂ 를 매개로 고정된 케토리덕타제를 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

케토리덕타제를 SiO₂상에 흡착시키고, 글루타르알데히드와 가교결합시킴으로써, 고정된 케토리덕타제 재료를 산출한다. 실시예 2에서 기술된 방식으로 고정된 케토리덕타제를 사용하여 이소알파산을 처리한다. 수득되는 반응 혼합물을 10,000 g로 원심분리함으로써, 고정된 효소를 제거한다.

실시예 9 - DEAE - 셀룰로스를 매개로 고정된 케토리덕타제를 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

케토리덕타제를 글루타르알데히드와 가교결합시키고, DEAE-셀룰로스상에 흡착시킴으로써, 고정된 케토리덕타제 재료를 산출한다. 실시예 2에서 기술된 방식으로 고정된 케토리덕타제를 사용하여 이소알파산을 처리한다. 수득되는 반응 혼합물을 10,000 g로 원심분리함으로써, 고정된 효소를 제거한다.

실시예 10 - PEI -처리된 알루미나를 매개로 고정된 케토리덕타제를 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

케토리덕타제를 글루타르알데히드와 가교결합시키고, 폴리에틸이민 (PEI)-처리된 알루미나상에 흡착시킴으로써, 고정된 케토리덕타제 재료를 산출한다. 실시예 2에서 기술된 방식으로 고정된 케토리덕타제를 사용하여 이소알파산을 처리한다. 수득되는 반응 혼합물을 10,000 g로 원심분리함으로써, 고정된 효소를 제거한다.

실시예 11 - 공동-고정된 효소를 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

상기-언급된 방법 중 어느 것을 이용하여 리덕타제 및 보조인자 재순환 효소, 예컨대 글루코스 데히드로제나제를 순차적으로, 또는 단일 조성물로서 함께 고정함으로써, 공동고정된 재료를 산출한다. 공동고정된 재료를 완충된 수성 용액 (50-250 mM의 소듐 포스페이트, 0.1-1.0 mM의 NADPH, 10-40 %의 이소프로판올, pH 7-9)에 0.1-10 mg/mL의 농도로 첨가한다. 이솔론^® 이성질화된 홉 추출물 용액 (29 % 이소알파산)을 이소알파산 0.145-16 %의 최종 농도로 첨가한다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 24시간 동안 30-40 ℃로 반응물을 인큐베이팅한다. 수득되는 반응 혼합물을 10,000 g로 원심분리함으로써, 고정된 효소를 제거한다.

실시예 12 - 가교결합 /구체화된 세포를 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

리덕타제를 발현하는 세포 (세균, 진균, 식물)를 폴리아민/글루타르알데히드와 가교결합시키고, 압출한 후, 구체화함으로써, 고정된 리덕타제 재료를 산출한다. 고정된 리덕타제를 완충된 수성 용액 (50-250 mM의 소듐 포스페이트, 0.1-1.0 mM의 NADPH, 10-40 %의 이소프로판올, pH 7-9)에 0.1-10 mg/mL의 농도로 첨가한다. 이솔론^® 이성질화된 홉 추출물 용액 (29 % 이소알파산)을 이소알파산 0.145-16 %의 최종 농도로 첨가한다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 24시간 동안 30-40 ℃로 반응물을 인큐베이팅한다. 수득되는 반응 혼합물을 10,000g로 원심분리함으로써, 고정된 효소를 제거한다.

실시예 13 - 가교결합 /포획된 세포를 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

리덕타제를 발현하는 세포 (세균, 진균, 식물)를 글루타르알데히드와 가교결합시키고, 젤라틴 또는 중합체 비드 내에 포획함으로써, 고정된 리덕타제 재료를 산출한다. 고정된 리덕타제를 완충된 수성 용액 (50-250 mM의 소듐 포스페이트, 0.1-1.0 mM의 NADPH, 10-40 %의 이소프로판올, pH 7-9)에 0.1-10 mg/mL의 농도로 첨가한다. 이솔론^® 이성질화된 홉 추출물 용액 (29 % 이소알파산)을 이소알파산 0.145-16 %의 최종 농도로 첨가한다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 24시간 동안 30-40 ℃로 반응물을 인큐베이팅한다. 수득되는 반응 혼합물을 10,000g로 원심분리함으로써, 고정된 효소를 제거한다.

실시예 14 - 살아있는 세포를 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

리덕타제를 발현하는 미생물 (세균, 진균)을 발효를 통하여 고밀도로 성장시키고, 수확하여, 세척한 후, 펠렛화함으로써, 세포 페이스트를 형성시킨다. 세포 페이스트를 0.145-16 %의 이소알파산을 함유하는 새로운 성장 배지에 재현탁한다. 세포 배양물을 혼합하면서 24-72시간 동안 25-37 ℃로 인큐베이팅한다. 세포 배양물을 10,000g로 원심분리함으로써, 폐 성장 배지로부터 세포를 제거한다. 에탄올을 사용하여 폐 성장 배지로부터 디히드로-(로)-이소알파산을 추출한다.

실시예 15 - 세포 용해물을 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

리덕타제를 발현하는 미생물 (세균, 진균)을 발효를 통하여 고밀도로 성장시키고, 수확하여, 세척한 후, 용해시킴으로써, 조 세포 용해물을 산출한다. 이소알파산을 이소알파산 0.145-16 %의 최종 농도로 조 세포 용해물에 첨가한다. 세포 배양물을 혼합하면서 24시간 동안 25-40 ℃로 인큐베이팅한다. 반응 혼합물을 10,000g로 원심분리하거나 여과함으로써, 용해물로부터 세포성 물질을 제거한다. 에탄올을 사용하여 정화된 용해물로부터 디히드로-(로)-이소알파산을 추출한다.

실시예 16 - 호냉성 리덕타제를 사용한 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

리덕타제가 호냉성 (저온 내성) 미생물 유래의 상동체인 효소 처리. 리덕타제를 완충된 수성 용액 (50-250 mM의 소듐 포스페이트, 0.1-1.0 mM의 NADPH, 10-40 %의 이소프로판올, pH 7-9)에 0.1-10 mg/mL의 농도로 첨가한다. 이솔론^® 이성질화된 홉 추출물 용액 (29 % 이소알파산)을 이소알파산 0.145-16 %의 최종 농도로 첨가한다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 24시간 동안 0-20 ℃로 반응물을 인큐베이팅한다. 수득되는 반응 혼합물을 여과함으로써, 효소를 제거한다.

실시예 17 - NADH 보조인자 재순환을 동반하는 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

NADPH 보조인자가 NADH로 대체되는 효소 처리. 실시예 2에서 기술된 방식으로 이소알파산을 처리하나, NADP가 NAD로 대체된다.

실시예 18 - 에탄올 산화를 통한 보조인자 재순환을 동반하는 홉 유래 이소알파산 의 효소 처리

이소프로판올 개시 재료가 에탄올로 대체되는 효소 처리로서, 리덕타제를 완충된 수성 용액 (50-250 mM의 소듐 포스페이트, 0.1-1.0 mM의 NADH, 10-40 %의 에탄올, pH 7-9)에 0.1-10 mg/mL의 농도로 첨가한다. 이솔론^® 이성질화된 홉 추출물 용액 (29 % 이소알파산)을 이소알파산 0.145-16 %의 최종 농도로 첨가한다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 24시간 동안 30-40 ℃로 반응물을 인큐베이팅한다. 수득되는 반응 혼합물을 여과함으로써, 효소를 제거한다.

실시예 19 - 홉 유래 이소알파산의 효소 처리 이어서 추출

디히드로-(로)-이소알파산의 최종 농도를 증가시키기 위한 효소 처리 이어서 추출. 실시예 2에서 기술된 방식으로 이소알파산을 처리한다. 수득된 반응 혼합물을 여과하여 효소를 제거하고, 식품-등급 용매를 사용하여 추출함으로써, 원하는 디히드로-(로)-이소알파산의 농도를 달성한다.

실시예 20 - 홉 유래 이소알파산의 효소 처리 이어서 열적 불활성화

실시예 2에서 기술된 방식으로 이소알파산을 처리한다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 24시간 동안 30-40 ℃로 반응물을 인큐베이팅한다. 수득되는 반응 혼합물을 80-100 ℃로 10-30분 동안 가열함으로써, 효소를 불활성화한다.

실시예 21 - 홉 유래 이소알파산의 효소 처리 이어서 화학적 불활성화

실시예 2에서 기술된 방식으로 이소알파산을 처리한다. 궤도 진탕을 사용하여 180 rpm에서 24시간 동안 30-40 ℃로 반응물을 인큐베이팅한다. >50 %의 최종 농도로 식품-등급 에탄올을 첨가함으로써, 효소를 불활성화한다.

실시예 22 - 고정된 케토리덕타제 재순환을 동반하는 홉 유래 이소알파산의 효소 처리

케토리덕타제를 글루타르알데히드와 가교결합시키고, DEAE-셀룰로스상에 흡수시킴으로써, 고정된 케토리덕타제 재료를 산출한다. 다음에, 실시예 2에서 기술된 방식으로 고정된 케토리덕타제를 사용하여 이소알파산을 처리한다. 수득되는 반응 혼합물을 10,000 g로 원심분리함으로써, 반응 용액으로부터 고정된 케토리덕타제를 분리한다. 고정된 케토리덕타제를 회수하여, 물 또는 수성 완충제로 세척한 후, 새로운 반응 혼합물에 재-사용한다.

결론

23종의 케토리덕타제가 이소알파산을 디히드로-(로)-이소알파산으로 전환시키는 것으로 특성화되었다. 이와 같은 연구에서 특성화된 케토리덕타제는 이전에는 기술된 바 없는 효소 활성을 보유한다. 이와 같은 연구에서 특성화된 케토리덕타제는 모두 케톤 기를 알콜로 환원시키며, 그에 따라 케토리덕타제이다. 이러한 결과는 케토리덕타제 생물촉매가 신규한 생물전환 과정으로 이소알파산을 디히드로-(로)-이소알파산으로 전환시키는 데에 사용될 수 있다는 것을 입증하고 있다. 본 발명은 소듐 보로히드리드를 이용하는 현재의 화학적 방법을 대체한다.

본 발명이 본원에서 기술된 구체적인 실시양태에 의해 영역상 제한되어서는 안 된다. 사실상, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 전기한 상세한 설명으로부터 본원에서 기술된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형이 떠오르게 될 것이다. 그와 같은 변형은 첨부된 청구범위의 영역에 속하는 것으로 하고자 한다.

본원에서 인용된 모든 특허, 출원, 공개, 시험 방법, 문헌 및 기타 자료는 본원에 참조로 포함된다.

[인용 참고문헌]

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270 Ser Lys Ala Thr Arg Ile Leu Gly Ile Thr Tyr Arg Ser Lys Glu Asp 275 280 285 Thr Met Lys Asp Leu Leu Glu Asp Phe Glu Arg Arg Gly Trp 290 295 300 <210> 22 <211> 239 <212> PRT <213> Exophiala <400> 22 Met Lys Val Leu Leu Thr Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ala Thr His Cys 1 5 10 15 Leu Asp Ala Leu Leu Lys His Gly His Glu Val Val Ile Thr Val Arg 20 25 30 Ser Ala Glu Lys Gly Gln Ala Leu Val Asp Leu Phe Lys Gly Gln Lys 35 40 45 Val Ser Tyr Thr Ile Val Lys Asp Ile Ser Val Pro Gly Ala Phe Asp 50 55 60 Gln Ala Val Ile Ser Asp Pro Pro Phe Asp Ala Val Val His Thr Ala 65 70 75 80 Ser Pro Phe His Tyr Asp Val Gln Asp Asn Lys Arg Asp Leu Leu Asp 85 90 95 Pro Ala Ile Ile Gly Thr Thr Gly Ile Leu Glu Ser Ile Gln Lys Gly 100 105 110 Ala Pro Ser Val Lys Lys Val Val Val Thr Ser Ser Phe Ala Ala Ile 115 120 125 Ser Asn Pro Thr Ala Pro Pro Lys Val Tyr Asp Glu Thr Val Trp Asn 130 135 140 Gln Met Thr Met Glu Glu Ala Leu Thr Thr Lys Asp Pro Gln Ala Val 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Ser Lys Thr Phe Ala Glu Lys Ala Ala 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Claims

케토리덕타제 효소 또는 케토리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 사용하여 이소알파산을 처리하는 것을 포함하는, 디히드로-(로)-이소알파산의 제조 방법.
제1항에 있어서, 수성 시스템 중에서 수행되는 방법.
제2항에 있어서, 온건한 온도 및 pH 조건하에서 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 이소알파산 혼합물에의 케토리덕타제 효소 및 NADPH 또는 NADP의 첨가 이어서 인큐베이션을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 보조인자 재순환을 위한 이소프로판올의 존재하에 이소알파산 혼합물에의 케토리덕타제 효소 및 NADPH 또는 NADP의 첨가 이어서 인큐베이션을 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 생물전환의 부피 생산성을 증가시키기 위하여, 이소알파산, 즉 기질의 농도가 최대화되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 생물전환의 경제성을 향상시키기 위하여, 혼합물 중 보조인자 NADPH 또는 NADP의 농도가 최소화되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 보조인자 재순환을 위한 또 다른 효소의 존재하에 이소알파산 혼합물에의 케토리덕타제 효소 및 NADPH 또는 NADP의 첨가 이어서 인큐베이션을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 이소알파산 혼합물에의 케토리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 고정된 미생물인 전세포 생물촉매의 첨가 이어서 인큐베이션을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 케토리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 배양하는 것, 및 배양물에 이소알파산을 첨가하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 열이 적용되는 이소알파산 추출물에 열안정성인 케토리덕타제 효소를 첨가하는 것, 및 혼합물을 인큐베이팅하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 케토리덕타제가 시스-이소휴물론, 시스-이소코휴물론 및 시 스-이소애드휴물론을 특이적으로 환원시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 케토리덕타제가 트랜스-이소휴물론, 트랜스-이소코휴물론 및 트랜스-이소애드휴물론을 특이적으로 환원시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 시스- 및 트랜스-이소알파산의 혼합물을 그의 각 디히드로이소알파산으로 환원시키는 데에 효과적인 양으로 2종 이상의 케토리덕타제 효소의 혼합물을 첨가하는 것을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 2종 이상의 케토리덕타제 효소의 혼합물이 소듐 보로히드리드와 같은 화학 환원제에 의해 생성되는 것과 구별되는 특유한 디히드로이소알파산 혼합물을 생성시키는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 케토리덕타제 효소가 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 케토리덕타제 효소 또는 케토리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물이 임의적으로 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 케토리덕타제와 비교하였을 때 아미노산 잔기에 하나 이상의 차이를 가질 수 있는 것인 방법.
제17항에 있어서, 케토리덕타제가 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 케토리덕타제와 99, 95, 90, 85, 80, 75 또는 70 % 상동성인 방법.
서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 케토리덕타제 효소.
제19항에 있어서, 리덕타제 효소 또는 리덕타제를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물이 임의적으로 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 케토리덕타제와 비교하였을 때 아미노산 잔기에 하나 이상의 차이를 가질 수 있는 것인 케토리덕타제 효소.
제20항에 있어서, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22의 케토리덕타제와 99, 95, 90, 85, 80, 75 또는 70 % 상동성인 케토리덕타제 효소.