KR20220066952A - 케토리덕타아제 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

케토리덕타아제 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 Download PDF

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난드히타 서브라마니안
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데이비드 윌리엄 호만
케이티 웨일런
매튜 블레이크 존스
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코덱시스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 자연적으로 발생된 야생형 케토리덕타아제 효소와 비교하여 개선된 특성을 갖는 조작된 케토리덕타아제 효소 뿐만 아니라, 조작된 케토리덕타아제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 조작된 케토리덕타아제 효소를 발현할 수 있는 숙주 세포, 및 조작된 케토리덕타아제 효소를 사용하여 키랄 알콜을 합성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 조작된 효소를 사용하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

케토리덕타아제 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드
본 출원은 2019년 9월 26일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 제62/906,268호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
서열 목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램에 대한 참조
파일명 CX8-195WO2_ST25.txt로서 EFS-Web을 통해 컴퓨터 판독형 형태(CRF: computer readable form)로 37 C.F.R. §1.821 하에 본원과 함께 동시 제출된 서열 목록이 본원에 참조로 포함된다. 서열 목록의 전자 사본의 파일 크기는 664 킬로바이트로 2020년 9월 23일 작성되었다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 자연적으로 발생된 야생형 케토리덕타아제 효소와 비교하여 특성이 개선된, 조작된 케토리덕타아제 효소 뿐만 아니라, 조작된 케토리덕타아제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 조작된 케토리덕타아제 효소를 발현할 수 있는 숙주 세포, 및 조작된 케토리덕타아제 효소를 사용하는 방법을 제공한다.
배경
케토리덕타아제(KRED) 또는 카보닐 리덕타제 부류(EC1.1.1.184)에 속하는 효소는 상응하는 키랄 전구 케톤 기질로부터 및 상응하는 라세미 알데히드 기질의 입체선택적 환원에 의해 광학 활성 알콜을 합성하는 데 유용하다. KRED는 전형적으로 케톤 및 알데히드 기질을 상응하는 알콜 생성물로 전환시키지만, 이는 또한 역반응인 알콜 기질의 상응하는 케톤/알데히드 생성물로의 산화도 촉매화할 수도 있다. 예컨대, KRED와 같은 효소에 의한 케톤 및 알데히드의 환원 및 알콜의 산화는 산화 반응을 위해 보조인자, 가장 통상적으로는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH: nicotinamide adenine dinucleotide) 또는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+: nicotinamide adenine dinucleotide) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP+: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)을 필요로 한다. NADH 및 NADPH는 전자 공여체로서 작용하는 한편, NAD 및 NADP는 전자 수용체로서 작용한다. 케토리덕타아제 및 알콜 데하이드로게나제가 인산화된 또는 비인산화된 보조인자 중 하나를 (그의 산화 및 환원 상태로) 수용하지만, 대개는 이 둘 모두를 수용하지 않는다는 이 빈번하게 관찰된다.
주요 화합물의 제조를 위한 다수의 화학적 합성 절차를 피하기 위해, 상이한 케토 및 알데히드 기질을 키랄 알콜 생성물로 효소에 의해 전환시키기 위해 케토리덕타아제를 이용하는 것이 점차 증가하고 있다. 이러한 적용은 생체촉매성 케톤 및 알데히드 환원을 위해, 또는 생체촉매성 알콜 산화를 위해 케토리덕타아제를 발현하는 전체 세포를 사용할 수 있거나, 또는 전체 세포 내 다수의 케토리덕타아제의 존재가 원하는 생성물의 입체순도 및 수율에 영향을 미치는 경우에는 정제된 효소의 사용에 의해 사용될 수 있다.
"쓴맛"은 전형적으로 홉 (휴물러스 루풀러스 L.(Humulus lupulus L.) 식물의 꽃)의 첨가로부터 유래하는 맥주의 주요 테이스팅 속성이다. 이소-α-산은 양조 공정에서 홉 식물의 루풀린 선에서 자연적으로 발생된 화합물인 휴물론의 이성질체화에 의해 형성된다. 구체적으로, 6개의 주요 이소-α-산: 시스-이소휴물론, 트랜스-이소휴물론, 시스-이소코휴물론, 트랜스-이소코휴물론, 시스-이소애드휴물론, 및 트랜스-이소애드휴물론이 쓴맛의 원인이 된다.
그러나, 이소-α-산은 광 안정성이 아니며, 3-메틸-2-부텐-1-티올(3-MBT)의 광 유도성 형성은 맥주에 뚜렷한 일광취(light-struck) 또는 스컹키(skunky) 풍미와 향을 제공한다. 이를 위해서는 갈색 병이나 캔에 맥주를 포장해야 한다. 또 다른 해결책은 이소-α-산의 카보닐 기를 환원시켜 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산을 생성함으로써 완전히 광 안정성인 맥주를 제조하는 것이다. 이러한 환원된 디하이드로-(rho)-이소-α-산은 안정적이며, 투명 또는 녹색 병에 담을 수 있다.
그러나, 현재, 이소-α-산은 오직 독성이고, 위험한 비식품 등급의 화학물질 (예컨대, 수소화붕소나트륨)을 사용하여 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로 전환될 수 있다. 따라서, 이소-α-산의 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로의 안전한 식품 등급 전환이 상당한 상업적 가치가 있을 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은 자연적으로 발생된 야생형 케토리덕타아제 효소와 비교하여 특성이 개선된, 조작된 케토리덕타아제 효소 뿐만 아니라, 조작된 케토리덕타아제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 조작된 케토리덕타아제 효소를 발현할 수 있는 숙주 세포, 및 조작된 케토리덕타아제 효소를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir)로부터의 연적으로 발생된 야생형 케토리덕타아제(서열 번호 2)와 비교하여, 또는 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330의 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드를 비롯한, 다른 조작된 케토리덕타아제 효소와 비교하였을 때, 이소-α-산의 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로의 전환에서 개선된 효소 활성을 갖는 조작된 케토리덕타아제("KRED") 효소를 제공한다.
일부 추가 실시양태에서, 조작된 효소는 개선된 효소 활성 이외에도, 하나 이상의 개선된 특성을 갖는다. 개선된 효소 활성으로는 다양한 기질에 걸친 개선된 활성, 높은 기질 농도에서의 개선된 활성 및 낮은 보조인자 농도에서의 개선된 활성을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 4와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 12, 21, 87, 93, 97, 110, 145, 148, 152, 153, 194, 196, 197, 200, 206, 212, 및 226으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 4를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 12I, 21R, 87L, 93D, 93M, 93T, 93V, 97G, 110I, 145C, 145G, 145M, 145S, 148I, 152G, 152S, 153C, 153R, 153V, 194H, 194N, 194R, 196H, 196K, 196R, 197G, 197R, 200L, 200Q, 200R, 206V, 212S, 및 226L로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 4를 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 V12I, L21R, V87L, I93D, I93M, I93T, I93V, K97G, L110I, L145C, L145G, L145M, L145S, V148I, T152G, T152S, L153C, L153R, L153V, P194H, P194N, P194R, L196H, L196K, L196R, D197G, D197R, E200L, E200Q, E200R, M206V, T212S, 및 I226L로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 4를 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 6과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 12/110/145/152, 12/145, 87/110/145, 87/110/145/194, 87/145/194, 110, 110/145/152/197, 110/145/194, 145, 145/152, 145/197/226, 및 152로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 6을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 12I/110I/145M/152G, 12I/145M, 87L/110I/145M, 87L/110I/145M/194H, 87L/110I/145M/194N, 87L/145M/194H, 110I, 110I/145M/152G/197G, 110I/145M/194H, 145M, 145M/152G, 145M/197G/226L, 및 152S로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 6을 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 V12I/L110I/L145M/T152G, V12I/L145M, V87L/L110I/L145M, V87L/L110I/L145M/P194H, V87L/L110I/L145M/P194N, V87L/L145M/P194H, L110I, L110I/L145M/T152G/D197G, L110I/L145M/P194H, L145M, L145M/T152G, L145M/D197G/I226L, 및 T152S로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 6을 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 80과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 17, 21, 46, 56, 72, 79, 95, 101, 110, 152, 162, 190, 198, 210, 211, 및 227로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 80을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 17Q, 17S, 21A, 46V, 56C, 72A, 79L, 95I, 101C, 101L, 101T, 110V, 152K, 152L, 162G, 190A, 198A, 198Q, 210F, 210W, 211R, 및 227V로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 80을 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 L17Q, L17S, L21A, K46V, V56C, K72A, E79L, V95I, D101C, D101L, D101T, I110V, T152K, T152L, A162G, P190A, D198A, D198Q, T210F, T210W, L211R, 및 C227V로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 80을 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 80과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 17, 79, 157, 159, 190/191/194, 190/194, 191/194, 194, 198, 및 211로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 80을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 17M, 17Q, 17S, 79L, 157C, 159T, 190A/191T/194E, 190A/194E, 191T/194E, 194E, 198A, 198Q, 및 211R로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 80을 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 L17M, L17Q, L17S, E79L, N157C, S159T, P190A/I191T/P194E, P190A/P194E, I191T/P194E, P194E, D198A, D198Q, 및 L211R로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 80을 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 104와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 17/46/190, 17/46/198/211, 17/96/194/198, 17/190/198, 46/190/194/198, 및 46/194/198로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 104를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 17M/46V/190A, 17M/46V/198A/211R, 17M/96V/194E/198Q, 17M/190A/198A, 17M/190A/198Q, 46V/190A/194E/198Q, 및 46V/194E/198Q로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 104를 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 Q17M/K46V/P190A, Q17M/K46V/D198A/L211R, Q17M/I96V/P194E/D198Q, Q17M/P190A/D198A, Q17M/P190A/D198Q, K46V/P190A/P194E/D198Q, 및 K46V/P194E/D198Q로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 104를 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 172와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 45, 101, 179, 194, 204, 226, 및 231로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 172를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 45L, 101R, 101Y, 179M, 194E, 204Q, 226V, 및 231G로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 172를 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 E45L, D101R, D101Y, Y179M, P194E, E204Q, I226V, 및 A231G를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 172를 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 186과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 95/96/97/150/153/205, 95/96/150/153/205/206/211/249, 95/97/143/145/150/153/202/205, 95/97/143/145/150/153/249, 95/97/150/153, 95/97/150/153/202/205/206, 95/150/153/205/206/211, 95/150/153/205/211, 95/150/153/206/249, 96/150/153, 96/150/153/206, 97/150/153, 97/150/153/205, 97/150/153/205/211, 97/150/153/206, 143/144/145/150/153/202/205/249, 143/145/150/153, 144/145/150/153/205/206, 144/150/153, 144/150/153/202/205/206, 145/150/153/206/249, 145/153/211, 150/153/202/206/249, 150/153/205/211, 150/153/206/211, 150/153/211, 및 150/153/249로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 186을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 95A/96A/97A/150A/153A/205A, 95A/96A/150A/153A/205A/206A/211A/249A, 95A/97A/143A/145A/150A/153A/202A/205A, 95A/97A/143A/145A/150A/153A/249A, 95A/97A/150A/153A, 95A/97A/150A/153A/202A/205A/206A, 95A/150A/153A/205A/206A/211A, 95A/150A/153A/205A/211A, 95A/150A/153A/206A/249A, 96A/150A/153A, 96A/150A/153A/206A, 97A/150A/153A, 97A/150A/153A/205A, 97A/150A/153A/205A/211A, 97A/150A/153A/206A, 143A/144A/145A/150A/153A/202A/205A/249A, 143A/145A/150A/153A, 144A/145A/150A/153A/205A/206A, 144A/150A/153A, 144A/150A/153A/202A/205A/206A, 145A/150A/153A/206A/249A, 145A/153A/211A, 150A/153A/202A/206A/249A, 150A/153A/205A/211A, 150A/153A/206A/211A, 150A/153A/211A, 및 150A/153A/249A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 186을 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 V95A/I96A/K97A/D150A/L153A/M205A, V95A/I96A/D150A/L153A/M205A/M206A/L211A/W249A, V95A/K97A/S143A/M145A/D150A/L153A/W202A/M205A, V95A/K97A/S143A/M145A/D150A/L153A/W249A, V95A/K97A/D150A/L153A, V95A/K97A/D150A/L153A/W202A/M205A/M206A, V95A/D150A/L153A/M205A/M206A/L211A, V95A/D150A/L153A/M205A/L211A, V95A/D150A/L153A/M206A/W249A, I96A/D150A/L153A, I96A/D150A/L153A/M206A, K97A/D150A/L153A, K97A/D150A/L153A/M205A, K97A/D150A/L153A/M205A/L211A, K97A/D150A/L153A/M206A, S143A/I144A/M145A/D150A/L153A/W202A/M205A/W249A, S143A/M145A/D150A/L153A, I144A/M145A/D150A/L153A/M205A/M206A, I144A/D150A/L153A, I144A/D150A/L153A/W202A/M205A/M206A, M145A/D150A/L153A/M206A/W249A, M145A/L153A/L211A, D150A/L153A/W202A/M206A/W249A, D150A/L153A/M205A/L211A, D150A/L153A/M206A/L211A, D150A/L153A/L211A, 및 D150A/L153A/W249A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 186을 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 186과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 7/147, 103/147, 110, 110/179/194, 147, 및 249로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 186을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 7Q/147I, 103R/147I, 110V, 110V/179M/194E, 147I, 및 249Y로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 186을 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 H7Q/L147I, T103R/L147I, I110V, I110V/Y179M/P194E, L147I, 및 W249Y로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 186을 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 194와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 7/12/54/110/150/153/194/205/211/249, 12/54/72/110/150/152/153/194/205/211/249, 12/72/101/103/110/152/249, 12/72/110/147/152/204, 45/54/72/110/152/194/204, 72/110/147/150/152/153/194/205/211/249, 및 110/150/153/179/194/205/211/249로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 194를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 7Q/12I/54S/110V/150D/153L/194E/205M/211L/249Y, 12I/54S/72T/110V/150D/152M/153L/194E/205M/211L/249Y, 12I/72S/101Y/103Q/110V/152M/249Y, 12I/72S/110V/147I/152M/204Q, 45L/54S/72S/110V/152M/194E/204Q, 72S/110V/147M/150D/152M/153L/194E/205M/211L/249Y, 및 110V/150D/153L/179M/194E/205M/211L/249Y로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 194를 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 H7Q/V12I/T54S/I110V/A150D/A153L/P194E/A205M/A211L/W249Y, V12I/T54S/K72T/I110V/A150D/T152M/A153L/P194E/A205M/A211L/W249Y, V12I/K72S/R101Y/T103Q/I110V/T152M/W249Y, V12I/K72S/I110V/L147I/T152M/E204Q, E45L/T54S/K72S/I110V/T152M/P194E/E204Q, K72S/I110V/L147M/A150D/T152M/A153L/P194E/A205M/A211L/W249Y, 및 I110V/A150D/A153L/Y179M/P194E/A205M/A211L/W249Y로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 194를 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 252와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 7/12/54/179/249, 7/152, 12/54/72/152/179/249, 40, 54/72, 72/147/152/179/249, 및 249로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 252를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 7Q/12I/54S/179Y/249Y, 7Q/152M, 12I/54S/72T/152M/179Y/249Y, 40E, 54S/72S, 72S/147M/152M/179Y/249Y, 및 249Y로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 252를 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 H7Q/V12I/T54S/M179Y/W249Y, H7Q/T152M, V12I/T54S/K72T/T152M/M179Y/W249Y, H40E, T54S/K72S, K72S/L147M/T152M/M179Y/W249Y, 및 W249Y로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 252를 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 270과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 92/93, 150/152, 150/152/153, 및 194/195로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 270을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 92A/93E, 150D/152A/153L, 150Y/152A, 150Y/152S, 및 194S/195A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 270을 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 G92A/I93E, A150D/M152A/A153L, A150Y/M152A, A150Y/M152S, 및 E194S/R195A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 270을 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 272와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 92/93/95, 93, 93/95, 93/95/109, 93/95/109/114, 93/95/114, 93/109/114, 및 114로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 272를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 92A/93D/95R, 93A/95K/109R, 93A/95R/109D/114T, 93D/95R, 93E/109R/114A, 93M, 93R/95A/114T, 및 114A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 272를 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 G92A/I93D/V95R, I93A/V95K/K109R, I93A/V95R/K109D/N114T, I93D/V95R, I93E/K109R/N114A, I93M, I93R/V95A/N114T, 및 N114A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 272를 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 286과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 12/45/72/109/249, 12/45/93/249, 12/45/249, 12/109/249, 45/72/249, 45/109/249, 45/249, 96, 및 145/150으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 286을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 12I/45E/72T/109D/249Y, 12I/45E/93A/249Y, 12I/45E/249Y, 12I/109D/249Y, 45E/72T/249Y, 45E/109D/249Y, 45E/249Y, 96A, 및 145A/150A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 286을 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 V12I/L45E/S72T/K109D/W249Y, V12I/L45E/I93A/W249Y, V12I/L45E/W249Y, V12I/K109D/W249Y, L45E/S72T/W249Y, L45E/K109D/W249Y, L45E/W249Y, I96A, 및 M145A/Y150A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 286을 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 328과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 150, 150/151, 150/195, 및 195로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 328을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 150A, 150A/151A, 150A/195S, 195A, 및 195S로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 328을 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 Y150A, Y150A/P151A, Y150A/R195S, R195A, 및 R195S로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 328을 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 330과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 12/72/109/195, 17/73/200, 17/115, 68/72/101/152/205, 68/72/124, 68/72/124/152, 68/101/124/152/205, 68/124/205, 72/109/152/195, 72/109/195, 72/152, 72/152/195, 72/195, 73, 73/147, 79, 93, 93/95/145/195, 93/109/114/145/195, 93/195, 95/195, 96/108/147/200, 96/194/200, 101/205, 145/195, 147, 147/200, 192, 194, 194/200, 195, 198, 및 200으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 위치는 서열 번호 330을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 12V/72S/109K/195R, 17A/73V/200P, 17A/115Q, 68E/72D/101K/152Q/205L, 68R/72D/101Q/152Q/205L, 68R/72R/124E, 68R/72R/124E/152Q, 68R/101Q/124E/152Q/205L, 68R/124E/205L, 72D/152Q, 72K/152M/195R, 72K/195R, 72S/109K/152M/195R, 72S/109K/195R, 73V, 73V/147I, 79A, 93A, 93A/95R/145A/195R, 93A/109K/114T/145A/195R, 93A/195R, 95R/195R, 96P/108S/147I/200P, 96P/194N/200P, 101M/205L, 145A/195A, 147I, 147I/200P, 192R, 194N, 194N/200P, 195R, 198G, 198R, 및 200P로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 330을 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 I12V/T72S/D109K/S195R, M17A/L73V/E200P, M17A/L115Q, A68E/T72D/R101K/A152Q/A205L, A68R/T72D/R101Q/A152Q/A205L, A68R/T72R/L124E, A68R/T72R/L124E/A152Q, A68R/R101Q/L124E/A152Q/A205L, A68R/L124E/A205L, T72D/A152Q, T72K/A152M/S195R, T72K/S195R, T72S/D109K/A152M/S195R, T72S/D109K/S195R, L73V, L73V/L147I, E79A, I93A, I93A/V95R/M145A/S195R, I93A/D109K/N114T/M145A/S195R, I93A/S195R, V95R/S195R, I96P/R108S/L147I/E200P, I96P/E194N/E200P, R101M/A205L, M145A/S195A, L147I, L147I/E200P, K192R, E194N, E194N/E200P, S195R, Q198G, Q198R, 및 E200P로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 여기서, 위치는 서열 번호 330을 기준으로 넘버링된 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 표 5-1, 6-1, 7-1, 8-1, 17-2, 18-1, 19-1, 19-2, 20-1, 20-2, 21-1, 22-1 및/또는 24-1에 제공된 변이체를 코딩하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체는 서열 번호 6 내지 412에 기재된 짝수 번호의 서열로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 조작된 케토리덕타아제 변이체를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5 내지 411에 기재된 홀수 번호의 서열로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 조작된 케토리덕타아제 변이체를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적어도 하나의 제어 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열 번호 413 및/또는 414를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 조작된 케토리덕타아제 변이체를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 조작된 케토리덕타아제 변이체가 본원에 제공된 숙주 세포에 의해 생산되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 숙주 세포에 의해 생산된 조작된 케토리덕타아제 변이체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제조하는 방법은 서열 번호 413 및/또는 414의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 고정화된 조작된 케토리덕타아제 변이체를 제공한다.
본 발명은 추가로 본원에 제공된 적어도 하나의 조작된 케토리덕타아제 변이체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 제공된 적어도 하나의 고정화된 조작된 케토리덕타아제 변이체를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 높은 기질 농도에서 서열 번호 6 및 서열 번호 80의 폴리펩티드의 KRED 활성을 비교하는 전형적인 HPLC 반응 프로파일을 제공한다.
도 2는 실시예 11에 기술된 실험 결과인 높은 기질 농도 및 낮은 NADP 농도에서의 선택된 변이체의 KRED 활성(전환율(%))을 제공한다.
도 3은 서열 번호 194의 폴리펩티드에 의해 제조된 Rho 종을 나타낸 전형적인 HPLC 반응 프로파일을 제공한다.
도 4는 높은 기질 농도 및 낮은 NADP 농도에서 서열 번호 328 및 서열 번호 330의 폴리펩티드의 KRED 활성을 비교하는 전형적인 HPLC 반응 프로파일을 제공한다. 도 4의 경우, 실선 = 4 g/L 효소; 점선 = 1 g/L 효소; 다이아몬드 = 서열 번호 328; 오픈형 정사각형 = 서열 번호 330.
도 5는 높은 기질 농도 및 낮은 NADP 농도에서 서열 번호270, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호 348, 서열 번호 346, 및 서열 번호 356의 폴리펩티드의 KRED 활성을 비교하는 전형적인 HPLC 반응 프로파일을 제공한다. 도 5의 경우, 오픈형 삼각형 = 서열 번호270; 필드형 삼각형 = 서열 번호 328; 오픈형 원= 서열 번호 348; 필드형 원 = 서열 번호 356; 오픈형 정사각형 = 서열 번호 330; 필드형 정사각형 = 서열 번호 346.
본 발명의 설명
본 발명은 자연적으로 발생된 야생형 케토리덕타아제와 비교하여 개선된 특성을 갖는 조작된 케토리덕타아제 효소 뿐만 아니라, 조작된 케토리덕타아제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 조작된 케토리덕타아제 효소를 발현할 수 있는 숙주 세포, 및 조작된 케토리덕타아제 효소를 사용하는 방법을 제공한다.
정의
본 발명과 관련하여, 본원의 설명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 구체적으로 달리 정의되지 않는 한, 당업계의 숙련가가 보편적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 따라서, 하기 용어들은 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다. 본원에서 참조된 모든 특허 및 공개문헌(상기 특허 및 공개문헌에 개시된 모든 서열 포함)은 명시적으로 참조로 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업자에게 공지된 분자 생물학, 발효, 미생물학 및 관련 분야에서 일반적으로 사용되는 통상적인 기술을 포함한다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기술된다. 실제로, 사용되는 맥락에 따라 달라질 수 있는 바, 본 발명은 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는 것으로 의도된다. 본원에 제공된 표제는 본 발명의 다양한 측면 또는 실시양태의 제한이 아니다.
그럼에도 불구하고, 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 하기에서 정의된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 모든 수치 범위는 마치 더 좁은 수치 범위가 모두 본원에 명시적으로 기술된 것처럼 더 넓은 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포괄하도록 의도된다. 또한 본원에 개시된 모든 최대(또는 최소) 수치 제한은 마치 상기의 더 낮은(또는 더 높은) 수치 제한이 본원에 명시적으로 기술된 것처럼 모든 더 낮은(또는 더 높은) 수치 제한을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하는(comprising)" 및 그 동족어는 그의 포괄적인 의미로 사용된다(즉, 용어 "포함하는(including)" 및 그의 상응하는 동족어와 등가).
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, 단수 "하나"("a," "an") 및 "그"는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 한 "숙주 세포"에 대한 언급은 복수의 상기 숙주 세포들을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 핵산은 각각 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로, 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 작성된다.
본 명세서에 제공된 표제는 전체로서 명세서를 참조하여 가질 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 실시양태의 제한이 아니다. 따라서, 하기에서 정의되는 용어들은 명세서 전체를 참조하여 보다 완전히 정의된다.
"케토리덕타아제" 및 "KRED"는 카보닐 기를 그의 상응하는 알콜로 환원시키는 효소 능력을 갖는 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 케토리덕타아제 폴리펩티드는 반응식 1에 제시된 바와 같이 이소-α-산의 혼합물을 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로 환원시킬 수 있다. 본 발명의 케토리덕타아제 효소는 L. 케피르(L. kefir)의 자연적으로 발생된 KRED(서열 번호: 2)로부터 유래된 것이다. 그러나, KRED 및 케토리덕타아제라는 용어는 이에 제한되지 않으며, 다양한 종의 박테리아, 식물, 조류 및/또는 동물 종에서 유래하는 자연적으로 발생된 효소 또는 효소들을 지칭할 수 있다. 효소는 합성이거나, 인공이거나, 또는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다.
"이소-α-산" 또는 "이소"는 홉, 홉 식물의 꽃, 휴물러스 루풀러스 L로부터 유래된 화합물인 이소휴물론의 이성질체, 에피머, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 거울상이성질체를 지칭하하는 것으로 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. "이소-α-산" 또는 "이소"는 시스-이소휴물론, 트랜스-이소휴물론, 시스-이소코휴물론, 트랜스-이소코휴물론, 시스-이소애드휴물론, 및 트랜스-이소애드휴물론를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "이소-α-산" 또는 "이소"는 또한 구체적으로 쓴맛(bitter taste 또는 bitterness)을 맥주 또는 다른 알콜 음료 또는 유사 음료에 부여하는, 임의의 자연적으로 발생된 또는 합성 이성질체, 에피머, 부분입체이성질체, 호변이성질체 거울상이성질체 또는 유사한 화학적 특성을 갖는 다른 유도체 또는 유사한 화합물을 포함한다. 이는 이소휴물론 테트론산 코어의 임의의 이성질체, 에피머, 부분입체이성질체, 거울상이성질체 또는 호변이성질체를 포함한다.
"디하이드로-(rho)-이소-α-산" 또는 "rho"는 본원에 정의된 바와 같이, "이소-α-산" 또는 "이소"의 카보닐 기의 환원에 의해 생성된 화합물을 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "디하이드로-(rho)-이소-α-산" 또는 "rho"는 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 KRED 폴리펩티드에 의한 전환을 통해 "이소-α-산" 또는 "이소"로부터 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "단백질," "폴리펩티드," 및 "펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 길이 또는 번역 후 변형(예컨대, 글리코실화, 인산화, 지질화, 미리스틸화, 유비퀴틴화 등)과 상관없이, 아미드 결합에 의해 공유적으로 연결된 적어도 2개의 아미노산으로 이루어진 중합체를 의미한다. D-아미노산 및 L-아미노산, 및 D-아미노산과 L-아미노산의 혼합물이 본 정의에 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산'은 함께 공유적으로 연결된 2개 이상의 뉴클레오시드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 전체로 리보뉴클레오시드(즉, RNA)로 구성되거나, 전체로 2' 데옥시리보뉴클레오티드(즉, DNA) 또는 리보뉴클레오시드 및 2' 데옥시리보뉴클레오시드의 혼합물로 구성될 수 있다. 뉴클레오시드는 전형적으로 표준 포스포디에스테르 연결을 통해 함께 연결되지만, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 비표준 연결을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥, 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 단일 가닥 영역 및 이중 가닥 영역, 둘 모두를 포함할 수 있다. 더욱이, 폴리뉴클레오티드가 전형적으로 자연적으로 발생된 코딩 핵염기(즉, 아데닌, 구아닌, 우라실, 티민, 및 시토신)로 구성되는 반면, 하나 이상의 변형된 핵염기 및/또는 합성 핵염기(예컨대, 예를 들어, 이노신, 크산틴, 히포크산틴 등)를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 변형된 핵염기 또는 합성 핵염기는 아미노산 서열을 코딩하는 핵염기가 될 것이다.
본원에서 사용되는 바, "코딩 서열"은 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(예컨대, 유전자)의 일부를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "자연적으로 발생된" 또는 "야생형"은 자연상에서 발견되는 형태를을 지칭한다. 예를 들어, 자연적으로 발생된 또는 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연에서의 공급원으로부터 단리될 수 있는 유기체에 존재하며, 인간 조작에 의해 의도적으로 변형되지 않은 서열이다.
본원에서 사용되는 바, 본 발명에서 (예컨대, 세포, 핵산, 또는 폴리펩티드)와 관련하여 사용될 때, "비자연적으로 발생된" 또는 "조작된" 또는 "재조합"이란, 달리 자연상에 존재하지 않는 방식으로 변형된 물질, 또는 상기 물질의 자연 또는 천연 형태에 상응하는 물질, 또는 그와 동일하지만, 합성 물질로부터 및/또는 재조합 기술을 사용하는 조작에 의해 제조 또는 유도된 것을 지칭한다. 비제한적인 예로는 다른 것들 중에서도 특히 세포의 천연(비재조합) 형태에서는 발견되지 않거나, 또는 그렇지 않으면 다른 수준으로 발현되는 천연 유전자를 발현하는 유전자를 발현하는 재조합 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "서열 동일성(%)," "동일성(%)," 및 "% 동일한"은 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 폴리펩티드 서열 사이의 비교를 지칭하고, 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 측정되고, 여기서, 상기 비교창의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 두 서열의 최적의 정렬을 위해, 기준 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율(%)은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치, 또는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 갭과 함께 정렬된 위치의 개수를 측정하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창 중 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성(%)을 산출함으로써 계산된다. 최적 정렬 및 서열 동일성(%) 측정은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘 예컨대, 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 [1990]]; 및 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 3389-3402 [1977]])을 사용하여 수행된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트를 통해 공개적으로 이용가능하다.
간략하면, BLAST 분석은 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드와 정렬될 때, 일부 양의 값의 임계 스코어 T와 매칭되거나, 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어링 서열 쌍(HSP: high scoring sequence pair)을 먼저 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 임계치로서 지칭된다(문헌 [Altschul et al, 상기 문헌 동일]). 이러한 초기 이웃 워드 히트는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾는 초기 검색을 위한 시드로서의 역할을 한다. 이어서, 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한, 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열인 경우, 파라미터 "M"(매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 "N"(미스매칭 잔기에 대한 패널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열인 경우, 스코어링 행렬이 누적 스코어를 계산하는 데 사용된다. 각 방향으로 워드 히트의 연장은 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값으로부터 X 양만큼 감소하거나; 누적 스코어가 하나 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하가 되거나; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달한 경우, 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열인 경우)은 디폴트로서 워드길이(W) 11, 기대값(E) 10, M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열인 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다(예컨대, 문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915 [1989]] 참조).
두 서열에 대한 동일성(%)을 제공하는 데 있어서 BLAST와 유사하게 작용하는 다수의 다른 알고리즘이 이용가능하고 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여(예컨대, 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 [1981]]의 국소 상동성 알고리즘에 의해; 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 [1970]]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해; 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 [1988]]의 유사성 검색 방법에 의해; 및/또는 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현에 의해 [GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA]), 또는 당업계에 통상적으로 공지된 방법을 사용하여 육안 검사에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 서열 정렬 및 서열 동일성(%) 측정은 제공된 디폴트 파라미터를 이용하여 GCG 위스콘신 소프트웨어 팩키지(GCG Wisconsin Software)(Accelrys: 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 BESTFIT 또는 GAP 프로그램을 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "기준 서열"은 또 다른 서열의 비교 대상이 되는 정의된 서열을 지칭한다. 기준 서열은 더 큰 서열의 서브세트, 예를 들어, 전장 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 세그먼트일 수 있다. 일반적으로, 기준 서열의 길이는 적어도 20개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 길이, 적어도 25개의 잔기 길이, 적어도 50개의 잔기 길이, 또는 전장의 핵산 또는 폴리펩티드이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각각 (1) 2개의 서열 간에 유사한 서열(즉, 완전한 서열의 일부)을 포함할 수 있고, (2) 2개의 서열 간에 상이한 서열을 추가로 포함할 수 있으므로, 2개(또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 서열 비교는 전형적으로 비교창에 걸쳐 두 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하여 서열 유사성의 국부적 영역을 확인하고, 비교함으로써 수행된다. 용어 "기준 서열"은 야생형 서열로 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 조작되거나, 변경된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "기준 서열"은 이전에 조작되거나, 변경된 아미노산 서열일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "비교창"은 적어도 약 20개의 인접한 뉴클레오티드 위치 또는 아미노산 잔기의 개념적 절편을 지칭하고, 여기서, 서열은 적어도 20개의 인접한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 기준 서열과 비교될 수 있고, 비교창 내 서열의 일부분은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열과 비교하였을 때, 20% 이하의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교창은 20개보다 긴 인접한 잔기일 수 있고, 임의적으로, 30, 40, 50, 100개, 또는 그보다 긴 창을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 넘버링과 관련하여 사용할 때, "∼에 상응하는," "∼와 관련하여", 및 "∼ 대비"는 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 기준 서열과 비교하는 경우의 언급된 기준 서열의 잔기의 넘버링을 지칭한다. 다시 말해, 주어진 중합체의 잔기 번호 또는 잔기 위치는 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내 잔기의 실제 번호 위치보다는 기준 서열에 대해 지정된다. 예를 들어, 주어진 아미노산 서열, 예컨대, 조작된 케토리덕타아제의 아미노산 서열은 두 서열 사이의 잔기 매치를 최적화하기 위해 갭을 도입시킴으로써 기준 서열에 대해 정렬시킬 수 있다. 이러한 경우, 비록 갭이 존재하여도, 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내 잔기의 넘버링은 정렬시킨 기준 서열에 대해 이루어진다. 본원에서 사용되는 바, 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 잔기 위치, 예컨대, "Xn"에 대한 언급은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, "~에 상응하는 잔기"를 언급하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "X94"는 폴리펩티드 서열에서 94번 위치에 있는 임의의 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "입체선택성"은 화학 또는 효소 반응에서 또 다른 입체이성질체 또는 또 다른 입체이성질체 세트에 비하여 한 입체이성질체가 우선적으로 형성되는 것을 지칭한다. 한 입체이성질체의 형성이 또 다른 것보다 선호되는 경우, 입체선택성은 부분적일 수 있거나, 또는 오직 한 입체이성질체만이 형성된다면, 이는 완전한 것일 수 있다. 입체이성질체가 거울상이성질체일 때, 입체선택성은 둘 모두의 합산에서 거울상이성질체의 분율(전형적으로 비율(%)로 기록)인 한 거울상선택성으로 지칭된다. 대안적으로, 이는 당업계에서 보편적으로는 공식 [메이저 거울상이성질체 - 마이너 거울상이성질체]/[메이저 거울상이성질체 + 마이너 거울상이성질체]에 따라 그로부터 계산된 거울상이성질체 과량("ee": enantiomeric excess)으로 (전형적으로는 비율(%)로) 기록된다. 입체이성질체가 부분입체이성질체일 때, 입체선택성은 두 부분입체이성질체의 혼합물 중 한 부분입체이성질체의 분율(전형적으로 비율(%)로 기록)인 부분입체선택성으로 지칭되며, 이는 보편적으로 대안적으로는 부분입체이성질체 과량("de": diastereomeric excess)으로 기록된다. 거울상이성질체 과량 및 부분입체이성질체 과량은 입체이성질체 과량 유형이다. 또한, 입체선택성은 단일 입체이성질체로 제한되지 않으며, 입체이성질체 세트에 대해서도 기술될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
본원에서 사용되는 바, "고도로 입체선택적"이라는 것은 적어도 약 75% 입체이성질체 과량으로 기질을 그의 상응하는 키랄 칼로 생성물로 전환시킬 수 있는 화학적 또는 효소적 반응을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "증가된 효소 활성" 및 "증가된 활성"은 기준 효소와 비교하여 특이적 활성(예컨대, 생산된 생성물/시간/단백질 중량)의 증가 또는 기질에서 생성물로의 전환율(%)(예컨대, 특정 양의 케토리덕타아제를 사용하여 특정 시간 내에 출발량의 기질의 생성물로의 전환율(%))의 증가로 표시될 수 있는, 조작된 효소의 개선된 특성을 지칭한다. 효소 활성을 측정하기 위한 예시적인 방법이 실시예에 제공되어 있다. Km, Vmax 또는 kcat의 고전적인 효소 특성, 효소 활성을 증가시킬 수 있는 변화를 비롯한, 효소 활성과 관련된 임의의 특성이 영향을 받을 수 있다. 케토리덕타아제 활성은 예컨대, 기질 또는 생성물 농도의 변화, 또는 보조인자 농도의 변화(보조인자 재생 시스템이 없는 경우)와 같은 케토리덕타아제 측정에 사용되는 표준 검정법 중 하나에 의해 측정될 수 있다. 효소 활성의 비교는 본원에서 추가로 상세하게 기술되는 바와 같이, 정의된 효소 제제, 설정된 조건하의 정의된 검정법 및 하나 이상의 정의된 기질을 사용하여 이루어진다. 일반적으로, 세포 용해물에 있는 효소를 비교할 때, 세포의 수와 검정되는 단백질의 양을 측정할 뿐만 아니라, 동일한 발현 시스템과 동일한 숙주 세포를 사용하여 숙주 세포에 의해 생성되고, 용해물에 존재하는 효소 양의 변동을 최소화한다.
본원에서 사용되는 바, "전환"은 기질의 상응하는 생성물로의 효소적 변환을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "전환율(%)"은 특정 조건하에서 일정 기간 이내에 생성물로 전환되는 기질의 비율(%)을 지칭한다. 따라서, 케토리덕타아제 폴리펩티드의 "효소 활성" 또는 "활성"은 기질의 생성물로의 "전환율(%)"로서 표현될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "열안정성" 또는 "열적 안정성"은 상호교환적으로 사용되며, 일정 기간 동안 온도 조건 세트(예컨대, 40-80℃)에 노출되었을 때, 비처리 효소와 비교하여 불활성화에 대해 내성을 띠며, 이로써, 승온에 노출된 후에도 특정 수준의 잔류 활성(예컨대, 예를 들어, 60% 초과 내지 80%)을 유지하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "용매 안정성"은 다양한 농도(예컨대, 5-99%)의 용매에 노출된 후, 비처리 효소와 비교하였을 때, 유사한 활성(예컨대, 예로서, 60% 초과 내지 80% )을 유지할 수 있는 폴리펩티드의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "아미노산 차이" 및 "잔기 차이"는 기준 서열 중의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기 대비 폴리펩티드 서열의 위치에 있는 아미노산 잔기의 차이를 지칭한다. 아미노산 차이의 위치는 일반적으로 본원에서 "Xn"으로 지칭되며, 여기서, n은 잔기 차이의 기초가 되는 기준 서열 중의 상응하는 위치를 지칭한다. 예를 들어, "서열 번호 2와 비교하여 위치 X40에서의 잔기 차이"는 서열 번호 2의 40번 위치에 상응하는 폴리펩티드 위치에 있는 아미노산 잔기의 차이를 지칭한다. 따라서, 서열 번호 2의 기준 폴리펩티드가 40번 위치에 히스티딘을 가지면, 이때 "서열 번호 2와 비교하여 위치 X40에서의 잔기 차이"란, 서열 번호 2의 40번 위치에 상응하는 폴리펩티드의 위치에 히스티딘 이외의 다른 임의의 잔기의 아미노산 치환을 지칭한다. 본원의 대부분의 경우에서, 위치에서의 특정 아미노산 잔기 차이는 "XnY"로 표시되고, 여기서, "Xn"은 상기 기술된 바와 같이 상응하는 위치를 명시하고, "Y"는 조작된 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산의 단일 문자 식별자이다(즉, 기준 폴리펩티드 중의 것과 다른 잔기). 일부 경우에서, 본 발명은 또한 통상의 표기법 "AnB"로 표시된 특정 아미노산 차이를 제공하고, 여기서, A는 기준 서열 중의 잔기의 단일 문자 식별자이고, "n"은 기준 서열 중의 잔기 위치의 번호이고, B는 조작된 폴리펩티드의 서열 중의 잔기 치환의 단일 문자 식별자이다. 일부 경우에서, 본 발명의 폴리펩티드는 잔기 차이가 기준 서열 대비로 존재하는 명시된 위치의 목록으로 표시되는, 기준 서열 대비의 하나 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 초과의 아미노산이 폴리펩티드의 특정 잔기 위치에 사용될 수 있는 경우, 사용될 수 있는 다양한 아미노산 잔기는 "/"로 분리되어 표시된다(예컨대, X192A/G). 본 발명은 보존적 및 비보존적 아미노산 치환 중 하나, 또는 그 둘 모두를 포함하는 하나 이상의 아미노산 차이를 포함하는 조작된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 본 발명의 서열 목록에 포함된 특정 재조합 케토리덕타아제 폴리펩티드의 아미노산 서열은 개시 메티오닌(M) 잔기(즉, M은 잔기 1번 위치를 나타냄)를 포함한다. 그러나, 당업자는 이 개시 메티오닌 잔기가 예컨대, 숙주 세포에서 또는 시험관내 번역 시스템과 같은 생물학적 프로세싱 기구에 의해 제거되어 개시 메티오닌 잔기가 결여되어 있지만, 그 외에는 효소의 특성을 유지하는 성숙한 단백질을 생성할 수 있다는 것을 이해하고 있다. 결과적으로, 본원에 사용된 용어 "위치 Xn에서 서열 번호 2 대비 아미노산 잔기 차이"는 출발 메티오닌이 결여되도록 프로세싱된 기준 서열 중의 위치 "Xn" 또는 상응하는 위치(예컨대, 위치 (X-1)n)를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "보존적 아미노산 치환"이라는 어구는 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 지칭하며, 따라서, 전형적으로 폴리펩티드 내 아미노산의 동일 또는 유사한 소정의 부류의 아미노산 내 아미노산으로의 치환을 포함한다. 예로서 및 제한 없이, 일부 실시양태에서, 각각 지방족 측쇄를 갖는 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신)으로 치환되고/거나; 하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산은 하이드록실 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예컨대, 세린 및 트레오닌)으로 치환되고/거나; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산은 방향족 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예컨대, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 및 히스티딘)으로 치환되고/거나; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 염기성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예컨대, 리신 및 아르기닌)으로 치환되고/거나; 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 산성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산)으로 치환되고/거나; 소수성 또는 친수성 아미노산은 또 다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 대체된다. 예시적인 보존적 치환은 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00001
본원에서 사용되는 바, 본원에서 사용되는 바, "비보존적 치환"이라는 어구는 폴리펩티드 중의 아미노산을, 유의적으로 상이한 다른 측쇄 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 비보존적 치환은 정의된 군 안에서 보다는, 그 사이의 아미노산을 사용할 수 있고, (a) 치환 영역 내 펩티드 백본의 구조(예컨대, 글리신 대신 프롤린), (b) 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피에 영향을 준다. 예로서 및 제한 없이, 예시적인 비보존적 치환은 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환된 산성 아미노산; 소형 아미노산으로 치환된 방향족 아미노산; 및 소수성 아미노산으로 치환된 친수성 아미노산일 수 있다.
당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 상기에서 정의된 카테고리 중 일부는 달리 명시되지 않는 한, 상호 배타적이지 않다. 따라서, 2개 이상의 물리화학적 특성을 나타내는 측쇄를 갖는 아미노산은 여러 카테고리에 포함될 수 있다. 임의의 아미노산 또는 잔기의 적절한 분류는 특히 본원에 제공된 상세한 발명에 비추어 당업자에게 자명할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "결실"은 기준 폴리펩티드로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거에 의한 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. 결실은 효소 활성은 유지하고/거나, 조작된 효소의 개선된 특성은 유지하면서, 폴리펩티드를 구성하는 아미노산의 총 개수의 10% 이하로, 또는 아미노산의 총 개수의 20% 이하로, 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산의 제거를 포함할 수 있다. 결실은 폴리펩티드의 내부 부분 및/또는 말단 부분으로 지정될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 결실은 연속되는 세그먼트를 포함할 수 있거나, 또는 비연속적일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "삽입"은 기준 폴리펩티드에의 하나 이상의 아미노산의 부가에 의한 폴리펩티드에 대한 변형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 개선된 조작된 케토리덕타아제 효소는 하나 이상의 아미노산의 자연적으로 발생된 케토리덕타아제 폴리펩티드에의 삽입 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산의 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드에의 삽입을 포함한다. 삽입은 폴리펩티드의 내부 부분에, 또는 카복시 또는 아미노 말단에 있을 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 삽입은 당업계에 공지된 바와 같은 융합 단백질을 포함한다. 삽입은 아미노산의 인접한 세그먼트일 수 있거나, 자연적으로 발생된 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산에 의해 분리될 수 있다.
용어 "아미노산 치환 세트" 및 "치환 세트"는 기준 서열과 비교하여 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 치환으로 이루어진 그룹을 지칭한다. 치환 세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환 세트는 실시예에 제공된 표에 열거된 변이체 KRED 중 임의의 것에 존재하는 아미노산 치환의 세트를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "단편"은 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실을 갖지만, 남은 아미노산 서열은 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 지칭한다. 단편은 전형적으로 전장 케토리덕타아제 폴리펩티드, 예를 들어, 서열 번호 4의 폴리펩티드의 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99%를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편은 "생물학적으로 활성"이다(즉, 이는 전장 서열과 동일한 효소 활성을 나타낸다).
본원에서 사용되는 바, "단리된 폴리펩티드"는 자연적으로 수반하는 다른 오염물질, 예컨대, 단백질, 지질, 및 폴리뉴클레오티드로부터 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 용어는 그의 자연적으로 발생된 환경 또는 발현 시스템(예컨대, 숙주 세포 또는 시험관내 합성)으로부터 제거되거나, 정제된 폴리펩티드를 포괄한다. 개선된 케토리덕타아제 효소는 세포 내에 존재하거나, 세포 배지에 존재하거나, 또는 예컨대, 용해물 또는 단리된 제제와 같은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 폴리펩티드 종이 존재하는 우세한 종(즉, 몰 농도 또는 중량 기준으로, 조성물 내의 임의의 다른 개별 거대분자 종보다 더 풍부함)인 조성물을 지칭하며, 일반적으로 대상 종이 존재하는 거대분자 종의 적어도 약 50%(몰 또는% 중량 기준)를 포함할 때 실질적으로 정제된 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드 조성물은 조성물 중에 존재하는 모든 거대분자 종 중의 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99%(몰 또는 % 중량 기준)을 차지할 것이다. 용매 종, 소형 분자(<500 달톤), 및 원소 이온 종은 거대분자 종으로 간주되지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 개선된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물이다.
본원에서 사용되는 바, 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 용어 "이종성"은 유기체(예컨대, 야생형 유기체)에 의해 정상적으로 발현 및 분비되지 않는 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 자연에서 정상적으로 발견되는 것과 같이 서로 동일한 관계에서 발견되지 않거나, 또는 세포에서의 그의 발현 수준 또는 다른 핵산 또는 다른 분자와의 물리적 관계, 또는 구조가 일반적으로 자연에서 발견되지 않도록 재조합적으로 조작된 2개 이상의 하위서열을 포함하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 이종성 핵산은 전형적으로 자연에서 발견되지 않는 방식으로 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 2개 이상의 서열을 갖는 것으로 재조합으로 생산된다(예컨대, 발현 카세트, 예컨대, 벡터 내로 삽입된 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 핵산 오픈 리딩 프레임(ORF: pen reading frame)). 일부 실시양태에서, "이종성 폴리뉴클레오티드"는 실험실 기술에 의해 숙주 세포 내로 도입되는 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭하고, 숙주 세포로부터 제거되고, 실험실 조작을 거친 후, 이어서, 숙주 세포 내로 재도입되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "코돈 최적화된"은 코딩된 단백질이 관심 유기체에서 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈의 변화를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 케토리덕타아제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현을 위해 선택된 숙주 유기체로부터 최적의 생산을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "제어 서열"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현에 필요하거나, 또는 이로운, 모든 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 각각의 제어 서열은 관심 폴리뉴클레오티드에 천연적이거나, 또는 외래의 것일 수 있다. 그러한 제어 서열로는 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터 서열, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결인자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "~에 작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 관심 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 지시하거나, 조절하도록 제어 서열이 관심 폴리뉴클레오티드에 대한 위치에 적절히 배치되는(즉, 기능적 관계로) 구성으로서 본원에서 정의된다.
본원에서 사용되는 바, "보조인자 재생 시스템" 및 "보조인자 리사이클링 시스템"이라는 어구는 보조인자의 산화 형태를 환원시키는 반응(예컨대, NADP+에서 NADPH로의 반응)에 참여하는 반응물 세트를 지칭한다. 케토 기질의 케토리덕타아제 촉매화된 환원에 의해 산화되는 보조인자는 보조인자 재생 시스템에 의해 환원 형태로 재생된다. 보조인자 재생 시스템은 수소 등가물을 환원시키는 공급원이며, 보조인자의 산화 형태를 환원시킬 수 있는 화학량론적 환원제를 포함한다. 보조인자 재생 시스템은 환원제에 의해 보조인자의 산화 형태의 환원을 촉매화하는 촉매, 예컨대, 효소 촉매를 추가로 포함할 수 있다. 각각 NAD+ 또는 NADP+로부터 NADH 또는 NADPH를 재생하기 위한 보조인자 재생 시스템이 당업계에 공지되어 있으며, 본원에 기술된 방법에 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "적합한 반응 조건"은 본 발명의 케토리덕타아제 폴리펩티드가 기질 화합물을 생성물 화합물로 입체선택적으로 환원시킬 수 있는 생체촉매성 반응 용액에서의 조건(예컨대, 효소 로딩, 기질 로딩, 보조인자 로딩, 온도, pH, 완충제, 공용매 등의 범위)을 지칭한다. 예시적인 "적합한 반응 조건"은 본 발명에서 제공되고, 실시예에 의해 예시된다.
본원에서 사용되는 바, 예컨대, "화합물 로딩," "효소 로딩," 또는 "보조인자 로딩"에서 "로딩"은 반응 시작시 반응 혼합물 내 성분의 농도 또는 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 생체촉매 매개 프로세스와 관련하여 "기질은 생체촉매에 의해 작용하는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 개시된 프로세스에서 케토리덕타아제 촉매에 대한 예시적인 기질은 이소-α-산이다.
본원에서 사용되는 바, 생체촉매 매개 프로세스와 관련하여 "생성물"은 생체촉매의 작용으로부터 생성되는 화합물 또는 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 본원에서 사용되는 것과 같은 "평형"이란, 화학 또는 효소 반응의 정반응 속도 상수 및 역반응 속도 상수로 측정되는 바와 같은, 입체이성질체의 상호전환을 포함하는, 화학 또는 효소 반응(예컨대, 2개 종 A 및 B의 상호전환)의 화학 종의 정상 상태 농도를 야기시키는 프로세스를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "옥소"는 =O를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "옥시"는 2가 기 -O-를 지칭하며, 이는 에테르 및 에스테르를 비롯한, 상이한 옥기 시를 형성하는 다양한 치환기를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "카복시"는 -COOH를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "카보닐"은 -C(O)-를 지칭하며, 이는 산, 산 할라이드, 알데히드, 아미드, 에스테르, 및 케톤을 비롯한, 상이한 카보닐 기를 형성하는 다양한 치환기를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "하이드록시"는 -OH를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "임의적" 및 "임의적으로"라는 것은 후속하여 기술되는 이벤트 또는 상황이 발생할 수도, 또는 발생하지 않을 수도 있고, 기술내용이 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우, 및 그가 발생하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 당업계의 숙련가라면, 하나 이상의 임의적 치환기를 함유하는 것으로 기술된 임의의 분자와 관련하여, 오직 입체구조상 실현가능하고/거나, 합성에 의해 실행가능한 화합물만을 포함한다는 것을 의미함을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "임의적으로 치환된"은 한 용어 또는 시리즈의 화학 기에서 모든 후속 수식어를 지칭한다. 예를 들어, "임의적으로 치환된 아릴알킬이라는 용어에서, 상기 분자의 "알킬" 부분 및 "아릴" 부분은 치환될 수 있거나, 또는 치환되지 않을 수 있고, 시리즈 "임의적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴"의 경우, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴 기는 다른 나머지와는 독립적으로 치환될 수 있거나, 또는 치환되지 않을 수 있다.
조작된 효소 폴리펩티드
케토리덕타아제(KRED) 또는 카보닐 리덕타제 생체촉매 (EC 1.1.1.184)는 알데히드 및 케톤으로부터 알콜을, 및 상응하는 전입체이성질체 케톤 기질로부터 광학 활성 2차 알콜을 합성하는 데 유용하다. KRED는 또한 역반응(즉, 알콜 기질을 상응하는 알데히드/케톤 생성물로 산화)을 촉매화할 수도 있다. KRED에 의한 알데히드 및 케톤의 환원 및 알콜의 산화는 산화 반응을 위해 보조인자, 가장 일반적으로 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH) 또는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH), 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP+)를 사용한다. NADH와 NADPH는 전자 공여자 역할을 하고, NAD+와 NADP+는 전자 수용체 역할을 한다.
KRED는 당업계에 공지된 바와 같이, 광범위한 박테리아 및 효모에서 발견될 수 있다(예컨대, 문헌 [Hummel and Kula Eur. J. Biochem., 184:1-13 [1989]] 참조). 칸디다 마그놀리아에(Candida magnoliae)의 것(진뱅크 수탁 번호(Genbank Acc. No.) JC7338; GI: 11360538); 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis)의 것(진뱅크 수탁 번호 BAA24528.1; GI: 2815409), 스포로볼로마이세스 살모니콜로르(Sporobolomyces salmonicolor)의 것(진뱅크 수탁 번호 AF160799; GI: 6539734), 락토바실러스 케피르의 것(진뱅크 수탁 번호 AAP94029.1; GI: 33112056), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 것(진뱅크 수탁 번호 1NXQ_A; GI: 30749782), 및 써모아나에로비움 브로키(Thermoanaerobium brockii)의 것(진뱅크 수탁 번호 P14941; GI: 1771790)을 비롯한, 다수의 KRED 유전자 및 효소 서열이 보고되었다.
케토리덕타아제의 입체선택성은 중요한 약학적 빌딩 블록의 제조에 적용되었다(예컨대, 문헌 [Broussy et al., Org. Lett., 11:305-308 [2009]] 참조). 유용한 화학 화합물을 생성하기 위한 생체촉매성 프로세스에서의 자연적으로 발생된 또는 조작된 KRED의 특정 적용은 4-클로로아세토아세테이트 에스테르의 환원(예컨대, 문헌 [Zhou, J. Am. Chem. Soc.,105:5925-5926 [1983]]; [Santaniello, J. Chem. Res., (S)132-133 [1984]]; 미국 특허 제5,559,030호; 미국 특허 제5,700,670호; 및 미국 특허 제5,891,685호 참조), 디옥소카복실산의 환원(예컨대, 미국 특허 제6,399,339호 참조), tert-부틸 (S)-클로로-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 환원(예컨대, 미국 특허 제6,645,746호; 및 WO 01/40450 참조), 피롤로트리아진계 화합물의 환원(예컨대, 미국 출원 공개 제2006/0286646호); 치환된 아세토페논의 환원(예컨대, 미국 특허 제6,800,477호 및 제8,748,143호 참조); 및 케토티올란의 환원(WO 2005/054491)에 대해 입증되었다.
이소-α-산("이소")은 시스 및 트랜스 에피머의 복합 혼합물로 존재한다. 일반적으로 n-, ad- 및 코-(각각 iBu, sBu 및 iPr)로 지칭되는 세 가지 다른 측쇄(이소 상의 "R")가 있다. 추가로, ad-이소(R=s-Bu)는 한 쌍의 거울상이성질체로 존재할 것으로 예상된다. 각각의 n-, ad- 및 코-이소는 또한 상응하는 시스 -/트랜스-이성질체 쌍으로 존재할 뿐만 아니라, 잠재적으로는 환원되는 케톤에 인접한 C4 3차 알콜로부터 유도된 거울상이성질체 쌍으로 존재한다. 전체적으로 테트론산 코어의 호변이성질체를 고려하지 않고, 최대 16개의 이소-α-산 이성질체(4R, 시스 /트랜스 및 거울상이성질체)가 있다.
효소는 전형적으로 그들이 작용하는 기질에 대해 매우 선택적이다. 따라서, 단일 효소 또는 심지어는 두 효소의 단순 혼합물이 이소-α-산의 16개 이성질체 모두를 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로 완전히 전환할 수 있다는 것은 예상하지 못한 것이다. 놀랍게도, 본 발명은 효소(들) 및 보조인자의 단순 혼합물을 사용하여 이소-α-산을 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로 전환시키는 프로세스를 포함한다. 추가로, 효소(KRED)를 사용한 생체변환을 통해 "천연"인 것으로 표시/인증되는 이소-α-산으로부터 디하이드로-(rho)-이소-α-산을 제조하여 "천연"인 것으로 표시/인증할 수 있다.
본 발명은 반응식 1에 도시된 바와 같이, 3차 알콜에 인접해 있는 이소프레닐 측쇄 상의 케톤만을 위치선택적으로 환원시켜 이소-α-산의 16개 주요 이성질체를 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로 무차별적으로 환원시킬 수 있는 조작된 케토리덕타아제를 제공한다.
반응식 1
Figure pct00002
서열 번호 4의 케토리덕타아제 폴리펩티드를 본 발명에 의해 제공되는 개선된 효소의 개발을 위한 초기 백본으로 선택하였다. 서열 번호 4의 효소는 락토바실러스 케피르의 야생형 케토리덕타아제(서열 번호 2)로부터 유래된 것이다. 서열 번호 4의 폴리펩티드는 이소-α-산을 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로 전환시키는 그의 높은 활성 뿐만 아니라, 그의 상대적 기질 무차별성 및 다양한 이소휴물론 이성질체 및 에피머를 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 능력에 기인하여 출발 백본으로서 선택되었다. 추가로, 서열 번호 4의 폴리펩티드는 다양한 반응 조건하에서 활성을 나타냈다. 서열 번호 2의 야생형 서열은 이소-α-산을 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로 전환시키는 데 있어 검출가능한 활성을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 서열 번호 4의 조작된 케토리덕타아제와 비교하여 개선된 특성을 갖는 것으로 조작된 케토리덕타아제이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 서열 번호 4의 조작된 폴리펩티드와 비교하여 이소-α-산을 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로 전환시키는 데 개선된 활성을 갖는다. 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 서열 번호 4의 조작된 폴리펩티드와 비교하여 다양한 이소-α-산 기질에 대하여 개선된 활성을 갖는다. 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 서열 번호 4의 조작된 폴리펩티드와 비교하여 다양한 기질 및 보조인자 농도에 대하여 개선된 활성을 갖는다. 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 서열 번호 4의 조작된 폴리펩티드와 비교하여 높은 기질 농도에서 개선된 활성을 갖는다. 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 서열 번호 4의 조작된 폴리펩티드와 비교하여 낮은 보조인자 농도에서 개선된 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 하나 이상의 기질에 대해 개선된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 기질은 이소-α-산의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 시스-이소휴물론을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 트랜스-이소휴물론을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 시스-이소코휴물론을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 트랜스-이소코휴물론을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 시스-이소애드휴물론을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 트랜스-이소애드휴물론을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 하나 이상의 기질에 대해 개선된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 이소-α-산의 혼합물에 대해 개선된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 시스-이소휴물론에 대해 개선된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 트랜스-이소휴물론에 대해 개선된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 시스-이소코휴물론에 대해 개선된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 트랜스-이소코휴물론에 대해 개선된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 시스-이소애드휴물론에 대해 개선된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 트랜스-이소애드휴물론에 대해 개선된 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 보조인자 리사이클링 시스템의 존재하에서 기질 화합물을 생성물 화합물로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 보조인자 리사이클링 시스템은 2차 효소, 예컨대, 글루코스 데하이드로게나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보조인자 리사이클링 시스템은 이소프로판올을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 적합한 반응 조건하에서 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330의 기준 폴리펩티드의 활성 대비 적어도 약 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 또는 100배 증가된 활성으로 기질 화합물을 생성물 화합물로 전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드는 적합한 반응 조건하에 약 48 h, 약 36 h, 약 24 h, 또는 심지어는 더 짧은 기간의 반응 시간 동안 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 전환율(%)로 기질 화합물을 생성물 화합물로 전환시킬 수 있다.
적합한 반응 조건은 기질 화합물을 상응하는 생성물 화합물로 생체촉매적으로 전환시키는 반응 파라미터의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 본 프로세스의 일부 실시양태에서, 반응 파라미터의 조합은 (a) 약 0.1 내지 220 g/L의 기질 화합물(들); (b) 약 0.5 내지 50 g/L 조작된 폴리펩티드; (c) 약 10-60% 이소프로판올 중 약 0.01 내지 10 g/L NADP+ (d) 약 5 내지 200 mM 트리에탄올아민*H2SO4; (e) 약 0 내지 5 mM MgSO4 또는 MgCl2; (f) 온도 약 25℃ 내지 60℃; 및 (g) pH 6 내지 10을 포함한다. 따라서, 본 프로세스의 일부 실시양태에서, 반응 파라미터의 조합은 (a) 약 10 내지 220 g/L의 기질 화합물(들); (b) 약 0.5 내지 50 g/L 조작된 폴리펩티드; (c) 약 10-60% 이소프로판올 중 약 0.01 내지 10 g/L NADP+ (d) 약 5 내지 200 mM 인산칼륨 또는 인산나트륨; (e) 약 0 내지 5 mM MgSO4 또는 MgCl2; (f) 온도 약 25℃ 내지 60℃; 및 (g) pH 약 6 내지 10을 포함한다.
일부 실시양태에서, 반응 파라미터의 조합은 (a) 약 80 g/L의 기질 화합물; (b) 약 20 g/L 조작된 폴리펩티드; (c) 40% 이소프로판올 중 약 0.01 g/L NADP+; (d) 약 100 mM 트리에탄올아민*H2SO4; (e) 약 2 mM MgSO4; (f) 약 40℃; 및 (g) pH 약 8을 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 파라미터의 조합은 (a) 약 160 g/L의 기질 화합물; (b) 약 20 g/L 조작된 폴리펩티드; (c) 40% 이소프로판올 중 약 0.01 g/L NADP+; (d) 약 100 mM 인산칼륨; (e) 약 2 mM MgSO4; (f) 약 40℃; 및 (g) pH 약 8을 포함한다.
추가의 예시적인 반응 조건은 실시예에 제공된 검정 조건을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개선된 조작된 케토리덕타아제 효소는 자연적으로 발생된 케토리덕타아제 폴리펩티드에 아미노산 잔기 결실, 또는 다른 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드에 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 결실은 케토리덕타아제 활성의 기능성 활성을 유지되는 한, 케토리덕타아제 폴리펩티드의 아미노산의 총 개수의 10% 이하, 아미노산의 총 개수의 10% 이하, 아미노산의 총 개수의 20% 이하 또는 아미노산의 총 개수의 30% 이하로, 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산, 8개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결실은 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-14, 1-15, 1-16, 1-18, 1-20, 1-22, 1-24, 1-25, 1-30, 1-35 또는 약 1-40개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결실 개수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 35 또는 약 40개의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결실은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 또는 20개의 아미노산 잔기의 결실을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 케토리덕타아제 폴리펩티드는 케토리덕타아제가 다른 폴리펩티드, 예컨대, 항체 태그(예를 들어, myc 에피토프) 또는 정제 서열(예컨대, His 태그)에 융합된 융합 펩티드의 형태일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 케토리덕타아제 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드와 함께 또는 그것에 융합되지 않고 사용될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본원에 기술된 폴리펩티드는 유전적으로 코딩된 아미노산에 국한되지 않는다. 유전적으로 코딩된 아미노산 이외에도, 본원에 기술된 폴리펩티드는 자연적으로 발생 및/또는 합성 비코딩된 아미노산의 전체 또는 부분 내에 포함될 수 있다. 본원에 기술된 폴리펩티드가 포함될 수 있는 일부 통상적으로 발견되는 비코딩된 아미노산은 하기의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 유전적으로 코딩된 아미노산의 D-입체이성질체; 2,3-디아미노프로피온산(Dpr); α-아미노이소부티르산(Aib); ε-아미노헥산산(Aha); δ-아미노발레르산(Ava); N-메틸글리신 또는 사르코신(MeGly 또는 Sar); 오르니틴(Orn); 시트룰린(Cit); t-부틸알라닌(Bua); t-부틸글리신(Bug); N-메틸이소류신(MeIle); 페닐글리신(Phg); 사이클로헥실알라닌(Cha); 노르류신(Nle); 나프틸알라닌(Nal); 2-클로로페닐알라닌(Ocf); 3-클로로페닐알라닌(Mcf); 4-클로로페닐알라닌(Pcf); 2-플루오로페닐알라닌(Off); 3-플루오로페닐알라닌(Mff); 4-플루오로페닐알라닌(Pff); 2-브로모페닐알라닌(Obf); 3-브로모페닐알라닌(Mbf); 4-브로모페닐알라닌(Pbf); 2-메틸페닐알라닌(Omf); 3-메틸페닐알라닌(Mmf); 4-메틸페닐알라닌(Pmf); 2-니트로페닐알라닌(Onf); 3-니트로페닐알라닌(Mnf); 4-니트로페닐알라닌(Pnf); 2-시아노페닐알라닌(Ocf); 3-시아노페닐알라닌(Mcf); 4-시아노페닐알라닌(Pcf); 2-트리플루오로메틸페닐알라닌(Otf); 3-트리플루오로메틸페닐알라닌(Mtf); 4-트리플루오로메틸페닐알라닌(Ptf); 4-아미노페닐알라닌(Paf); 4-아이오도페닐알라닌(Pif); 4-아미노메틸페닐알라닌(Pamf); 2,4-디클로로페닐알라닌(Opef); 3,4-디클로로페닐알라닌(Mpcf); 2,4-디플루오로페닐알라닌(Opff); 3,4-디플루오로페닐알라닌(Mpff); 피리드-2-일알라닌(2pAla); 피리드-3-일알라닌(3pAla); 피리드-4-일알라닌(4pAla); 나프트-1-일알라닌(1nAla); 나프트-2-일알라닌(2nAla); 티아졸릴알라닌(taAla); 벤조티에닐알라닌(bAla); 티에닐알라닌(tAla); 푸릴알라닌(fAla); 호모페닐알라닌(hPhe); 호모티로신(hTyr); 호모트립토판(hTrp); 펜타플루오로페닐알라닌(5ff); 스티릴알라닌(sAla); 안트릴알라닌(aAla); 3,3-디페닐알라닌(Dfa); 3-아미노-5-페니펜탄산(Afp); 페니실라민(Pen); 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산(Tic); β-2-티에닐알라닌(Thi); 메티오닌 술폭시드(Mso); N(w)-니트로아르기닌(nArg); 호모리신(hLys); 포스포노메틸페닐알라닌(pmPhe); 포스포세린(pSer); 포스포트레오닌(pThr); 호모아스파르트산(hAsp); 호모글루탐산(hGlu); 1-아미노사이클로펜트-(2 또는 3)-엔-4 카복실산; 피페콜산(PA), 아제티딘-3-카복실산(ACA); 1-아미노사이클로펜탄-3-카복실산; 알릴글리신(aOly); 프로파르길글리신(pgGly); 호모알라닌(hAla); 노르발린 (nVal); 호모류신(hLeu), 호모발린(hVal); 호모이소류신(hIle); 호모아르기닌(hArg); N-아세틸 리신(AcLys); 2,4-디아미노부티르산(Dbu); 2,3-디아미노부티르산(Dab); N-메틸발린(MeVal); 호모시스테인(hCys); 호모세린(hSer); 하이드록시프롤린(Hyp) 및 호모프롤린(hPro). 본원에 기술된 폴리펩티드가 포함될 수 있는 추가의 비코딩된 아미노산은 당업자에게 자명하다. 상기 아미노산은 L- 또는 D-구성일 수 있다.
당업자는 측쇄 보호기를 갖는 아미노산 또는 잔기가 본원에 기술된 폴리펩티드도 또한 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 이 경우에 방향족 카테고리에 속하는 상기 보호된 아미노산의 비제한적 예로는 하기의 것들(괄호 안에 열거된 보호기들)을 포함되나, 이에 제한되지 않는다: Arg(tos), Cys(메틸벤질), Cys(니트로피리딘술페닐), Glu(δ-벤질에스테르), Gln(크산틸), Asn(N-δ-크산틸), His(bom), His(벤질), His(tos), Lys(fmoc), Lys(tos), Ser(O-벤질), Thr (O-벤질) 및 Tyr(O-벤질).
본원에 기술된 폴리펩티드가 포함될 수 있는 구속형 형태의 비코딩 아미노산은 N-메틸 아미노산 (L-구성); 1-아미노사이클로펜트-(2 또는 3)-엔-4-카복실산; 피페콜산; 아제티딘-3-카복실산; 호모프롤린(hPro); 및 1-아미노사이클로펜탄-3-카복실산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 기술된 바와 같이, 조작된 케토리덕타아제 효소를 생성시키기 위해 자연적으로 발생된 폴리펩티드에 도입된 각종 변형들은 효소의 특정 성질에 표적화될 수 있다.
조작된 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
또 다른 측면에서, 본 발명은 조작된 케토리덕타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 생성시키기 위해 유전자 발현을 제어하는 하나 이상의 이종 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 조작된 케토리덕타아제를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구성물을 적절한 숙주 세포에 도입하여 상응하는 상응하는 케토리덕타아제 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
각종 아미노산에 상응하는 코돈을 알고 있으면, 단백질 서열을 이용하여 대상을 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드의 설명을 얻을 수 있다. 동일한 아미노산이 대안 또는 동의 코돈에 의해 코딩되는 유전자 코드의 변성으로 인해 상당히 많은 수의 핵산이 제조될 수 있고, 이들 모두는 본원에 개시된 개선된 케토리덕타아제 효소를 코딩한다. 따라서, 특정 아미노산 서열이 확인되면, 당업자는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 방식으로 하나 이상의 코돈의 서열을 간단히 변형시켜 임의의 수의 상이한 핵산을 제조할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 가능한 코돈 선택을 기초로 하여 조합을 선택하여 제조될 수 있는 각각의 모든 가능한 폴리뉴클레오티드의 변이를 구체적으로 고려하며, 그러한 모든 변이는 실시예의 표에 제시된 아미노산 서열을 비롯하여 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드에 대해 구체적으로 개시된 것으로 간주되어야 한다. 다양한 실시양태에서, 코돈은 바람직하게 단백질이 생성되고 있는 숙주 세포에 맞도록 선택된다. 예를 들어, 박테리아에 사용되는 바람직한 코돈은 박테리아에서의 유전자의 발현에 사용되고; 효모에 사용되는 바람직한 코돈은 효모에서의 발현에 사용되며; 포유동물에 사용되는 바람직한 코돈은 포유동물 세포에서의 발현에 사용된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1에 의해 제시된 자연적으로 발생된 케토리덕타아제 폴리펩티드 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 각각의 것이 각각 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330의 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 것인 서열 번호 3, 5, 79, 103, 171, 185, 193, 251, 269, 271, 285, 327 및/또는 329의 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 포함하는 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 효소 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 특성을 포함하는 효소 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 폴리펩티드는 본원에 제공된 서열 번호로부터 선택되는 기준 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 기준 폴리뉴클레오티드(들)와 비교하여 임의의 변이체(예컨대, 실시예에 제공된 것), 및 하나 이상의 잔기 차이의 아미노산 서열, 또는 실시예에 개시된 바와 같은 임의의 변이체(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 잔기 위치)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기준 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3, 5, 79, 103, 171, 185, 193, 251, 269, 271, 285, 327 및/또는 329로부터 선택되는 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5, 79, 103, 171, 185, 193, 251, 269, 271, 285, 327 및/또는 329를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5 내지 411로부터 선택되는 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5 내지 411로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제 서열은 실시예에 기술된 바와 같이, 유익한 것으로 확인된 위치를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개선된 케토리덕타아제를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 개선된 발현 및/또는 생산을 제공하기 위해 각종 방식으로 조작된다. 단리된 폴리펩티드를 벡터에 삽입하기 전에 그를 조작하는 것이 사용되는 발현 벡터에 따라 바람직하거나, 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 변형시키는 기술이 당업계에 널리 공지되어 있다.
박테리아 숙주 세포의 경우, 본 발명의 핵산 구성물의 전사를 유도하는 데 적합한 프로모터는 E. 콜라이(E. coli) lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor) 아가라제 유전자(dagA), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라세 유전자(sacB), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라제 유전자(amyL), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 말토제닉 아밀라제 유전자(amyM), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자(amyQ), 바실러스 리체니포르미스 페니실리나제 유전자(penP), 바실러스 섭틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 및 원핵성 베타-락타마제 유전자로부터 수득되는 프로모터(예컨대, 문헌 [Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 [1978] 참조) 뿐만 아니라, tac 프로모터(예컨대, 문헌 [DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]] 참조)를 포함한다. 추가의 적합한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다.
사상성 진균 숙주 세포의 경우, 본 발명의 핵산 구성물의 전사를 유도하기 위한 적합한 프로모터는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르트산 프로테이나제, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 니거 산 안정성 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 니거 또는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제(glaA), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파제, 아스퍼질러스 오리자에 알칼리성 프로테아제, 아스퍼질러스 오리자에 트리오스 포스페이트 이소머라제, 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아세트아미다제 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제(WO 96/00787)로부터 수득된 프로모터 뿐만 아니라, NA2-tpi 프로모터(아스퍼질러스 니거 중성 알파-아밀라제 및 아스퍼질러스 오리자에 트리오스 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자로부터의 프로모터의 하이브리드), 및 그의 돌연변이체, 말단절단형 및 하이브리드 프로모터에 대한 유전자로부터 얻은 프로모터를 포함한다.
효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 갈락토키나제(GAL1), 사카로마이세스 세레비지아에 알콜 데하이드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(ADH2/GAP) 및 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 유전자로부터의 것 뿐만 아니라, 효모 숙주 세포에 대한 다른 유용한 프로모터(예컨대, 문헌 [Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]] 참조)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
제어 서열은 또한 전사를 종료시키기 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 서열인 적합한 전사 종결인자 서열일 수도 있다. 종결인자 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 작용하는 임의의 종결인자를 본 발명에서 사용할 수 있다.
예를 들어, 사상성 진균 숙주 세포에 대한 예시적 전사 종결인자는 아스퍼질러스 오리자에 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 아스퍼질러스 니거 알파-글루코시다제 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다.
효모 숙주 세포에 대한 예시적 종결인자는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀라제, 사카로마이세스 세레비지아에 사이토크롬 C(CYC1) 및 사카로마이세스 세레비지아에 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있을 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 효모 숙주 세포에 대한 다른 유용한 종결인자(예컨대, 문헌 [Romanos et al., 상기 문헌 동일] 참조)로부터 수득될 수 있다.
제어 서열은 또한 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역인 적합한 리더 서열일 수 있다. 리더 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 작용하는 임의의 리더 서열을 사용할 수 있다. 사상성 진균 숙주 세포에 대한 예시적 리더는 아스퍼질러스 오리자에 TAKA 아밀라제 및 아스퍼질러스 니둘란스 트리오스 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다. 효모 숙주 세포에 대한 적합한 리더는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로마이세스 세레비지아에 알파 인자 및 사카로마이세스 세레비지아에 알콜 데하이드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 수득된다.
제어 서열은 또한 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결되며, 전사시, 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 부가하기 위한 신호로서 숙주 세포에 의해 인식되는 서열인 폴리아데닐화 서열일 수 있다. 선택된 숙주 세포에서 작용하는 임의의 폴리아데닐화 서열을 본 발명에서 사용할 수 있다. 사상성 진균 숙주 세포에 대한 예시적 폴리아데닐화 서열은 아스퍼질러스 오리자에 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 푸사리움 옥시스포룸 트립신 유사 프로테아제 및 아스퍼질러스 니거 알파-글루코시다제에 대한 유전자로부터의 것 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 효모 숙주 세포에 대한 유용한 추가의 폴리아데닐화 서열(예컨대, 문헌 [Guo et al., Mol. Cell. Biol., 15:5983-5990 [1995]] 참조)일 수 있다.
제어 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하며, 코딩된 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 유도하는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다. 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 말단은 본질적으로, 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 세그먼트를 갖는 번역 리딩 프레임에 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 원래 포함할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열의 5' 말단은 코딩 서열에 외래적인 신호 펩티드 코딩 영역을 포함할 수 있다. 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 코딩 서열이 신호 펩티드 코딩 영역을 본래 포함하지 않는 경우 필요할 수 있다.
대안적으로, 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 폴리펩티드의 분비를 증강시키기 위해 자연 신호 펩티드 코딩 영역을 간단히 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 선택된 숙주 세포의 분비 경로로 유도하는 임의의 신호 펩티드 코딩 영역이 본 발명에서 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 바실러스 NClB 11837 말토제닉 아밀라제, 바실러스 스테아로써모필러스 알파-아밀라제, 바실러스 리체니포르미스 섭틸리신, 바실러스 리체니포르미스 베타-락타마제, 바실러스 스테아로써모필러스 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM) 및 바실러스 섭틸리스 prsA에 대한 유전자로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 영역 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 추가의 신호 펩티드(예컨대, [Simonen et al., Microbiol. Rev., 57: 109-137 [1993]] 참조)이다.
사상성 진균 숙주 세포에 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 아스퍼질러스 오리자에 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 중성 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나제, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 셀룰라제 및 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파제에 대한 유전자로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 영역을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비지아에 알파 인자 및 사카로마이세스 세레비지아에 이버타제에 대한 유전자로부터 것 뿐만 아니라, 추가의 유용한 신호 펩티드 코딩 영역(예컨대, 문헌 [Romanos et al., 1992, 상기 문헌 동일] 참조)일 수 있다.
제어 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열을 코딩하는 프로펩티드 코딩 영역일 수 있다. 생성된 폴리펩티드는 효소 전구체 또는 프로폴리펩티드(또는 일부 경우, 자이모겐)로 공지되어 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성이며, 프로폴리펩티드로부터의 프로펩티드의 촉매성 또는 자가촉매성 절단에 의해 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 바실러스 섭틸리스 알칼리성 프로테아제(aprE), 바실러스 섭틸리스 중성 프로테아제(nprT), 사카로마이세스 세레비지아에 알파 인자, 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나제 및 마이셀리오프소라 써모필라(Myceliophthora thermophila) 락타제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다(WO 95/33836)
신호 펩티드 및 프로펩티드 영역 둘 모두가 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단 옆에 위치하며, 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단 옆에 위치한다.
숙주 세포의 성장에 대해 폴리펩티드의 발현의 조절을 가능하게 하는 조절 서열을 부가하는 것도 또한 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예는 조절 화합물의 존재를 비롯한 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자의 발현을 개시 및 정지시키는 것들이다. 원핵 숙주 세포에서, 적합한 조절 서열은 lac, tac 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모 숙주 세포에서, 적합한 조절 시스템은 예로서, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템을 포함한다. 사상성 진균에서, 적합한 조절 서열은 TAKA 알파-아밀라제 프로모터, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제 프로모터 및 아스퍼질러스 오리자에 글루코아밀라제 프로모터를 포함한다.
조절 서열의 다른 예는 유전자 증폭을 가능하게 하는 것이다. 진핵 시스템에서는 메톡트렉세이트의 존재하에서 증폭되는 것인 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자, 및 중금속으로 증폭되는 메탈로티오네인 유전자를 포함한다. 이 경우, 본 발명의 KRED 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 조절 서열과 작동가능하게 연결될 것이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 도입 대상이 되는 숙주의 유형에 따라, 하나 이상의 발현 조절 영역, 예컨대, 프로모터 및 종결인자복제 기점 등을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 기술된 각종 핵산 및 제어 서열을 함께 연결하여 하나 이상의 편리한 제한 부위에서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 삽입 또는 치환을 가능하게 하는 상기 제한 부위를 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터를 생성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 핵산 서열은 발현에 적합한 벡터에 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 핵산 구성물을 삽입하여 발현될 수 있다. 발현 벡터를 생성할 때, 코딩 서열은 그 코딩 서열이 발현에 적합한 제어 서열과 작동가능하게 연결되도록 벡터 내에 위치한다.
재조합 발현 벡터는 편리하게는 재조합 DNA 절차를 거칠 수 있고, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 초래할 수 있는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터의 도입 대상이 되는 숙주 세포와 벡터의 적합성에 따라 달라질 수 있다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 고리형 플라스미드일 수 있다.
발현 벡터는 자가 복제 벡터(즉, 염색체외 엔티티로서 존재하고, 그 복제가 염색체 복제와는 독립적인 벡터, 예컨대, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체 또는 인공 염색체)이다. 벡터는 자가 복제를 보장하는 임의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포 내로의 도입시, 벡터는 게놈 내로 통합되고, 그가 내부에 통합되어 염색체(들)와 함께 복제되는 것이다. 추가로, 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 숙주 세포의 게놈에 도입되는 전체 DNA를 함께 함유하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 및/또는 트랜스포존이 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 바람직하게 형질전환된 세포의 용이한 선별을 가능하게 하는, 하나 이상의 선별가능한 마커를 함유한다. 선별가능한 마커는 그의 생성물이 살생물성 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구성에 대해 자가영양성 등을 제공하는 유전자일 수 있다. 박테리아 선별가능한 마커의 예로는 바실러스 섭틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 항생제 내성, 예컨대, 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포에 적합한 마커로는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이 있다.
사상성 진균 숙주 세포에서 사용하기 위한 선별가능한 마커로는 amdS(아세트아미다제), argB(오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제), bar(포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제), hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제), niaD(니트레이트 리덕타제), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 데카복실라제), sC(술페이트 아데닐트랜스퍼라제) 및 trpC(안트라닐레이트 신타제) 뿐만 아니라, 그의 등가물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아스퍼질러스 세포에 사용하기 위한 실시양태는 아스퍼질러스 니둘란스 또는 아스퍼질러스 오리자에의 amdS 및 pyrG 유전자, 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)의 bar 유전자를 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 벡터가 숙주 세포의 게놈에 통합 가능하게 하거나, 또는 게놈과 독립적으로 세포 내에서 벡터가 자가 복제 가능하게 하는 요소(들)를 포함한다. 숙주 세포 게놈에 통합시키는 데에 있어서, 벡터는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 상동성 또는 비상동성 재조합에 의해 벡터를 게놈에 통합시키기 위한 벡터의 임의의 다른 요소에 의존할 수 있다.
대안적으로, 발현 벡터는 상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈에 통합되는 것을 유도하기 위한 추가의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 추가의 핵산 서열로 인해 벡터가 염색체(들) 내 정확한 위치(들)에서 숙주 세포 게놈에 통합 가능해진다. 정확한 위치에서의 통합 가능성을 증가시키기 위해, 통합 요소는 바람직하게는 상동성 재조합의 가능성을 증강시키도록 상응하는 표적 서열과 고도로 상동성인 예컨대, 100 내지 10,000개의 염기쌍, 바람직하게는, 400 내지 10,000개의 염기쌍, 가장 바람직하게는, 800 내지 10,000개의 염기 쌍과 같은 충분한 개수의 핵산을 포함하여야 한다. 통합 요소는 숙주 세포의 게놈 내 표적 서열과 상동성인 임의의 서열일 수 있다. 추가로, 통합 요소는 비코딩 또는 코딩 핵산 서열일 수 있다. 다른 한편, 벡터는 비상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
자가 복제를 위해, 벡터는 벡터가 해당 숙주 세포에서 자가 복제 가능하게 하는 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 박테리아의 복제 기점의 예로는 P15A ori 또는 E. 콜라이에서의 복제를 가능하게 하는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177(플라스미드는 P15A ori를 가짐) 또는 pACYC184의 복제 기점, 및 바실러스에서의 복제를 가능하게 하는 pUB110, pE194, pTA1060 또는 pAMβ1이 있다. 효모 숙주 세포에 사용하기 위한 복제 기점의 예로는 2 마이크론의 복제 기점, ARS1, ARS4, ARS1과 CEN3의 조합, 및 ARS4와 CEN6의 조합이 있다. 복제 기점은 숙주 세포에서 그의 기능성을 온도 감수성으로 만드는 돌연변이를 갖는 것일 수 있다(예컨대, 문헌 [Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1433 [1978]] 참조).
본 발명의 핵산 서열의 1 초과의 카피를 숙주 세포에 삽입하여 유전자 생성물의 생성을 증가시킬 수 있다. 서열의 적어도 하나의 추가 카피를 숙주 세포 게놈에 통합하거나, 또는 증폭가능한 선별가능한 마커 유전자를 핵산 서열과 함께 포함시켜 핵산 서열의 카피수를 증가시킬 수 있고, 여기서, 적합한 선별가능한 제제의 존재하에 세포를 배양하여 선별가능한 마커 유전자의 증폭 카피 및 이에 따른 핵산 서열의 추가 사본을 포함하는 세포를 선택할 수 있다.
본 발명으 본원에 개시된 발현 벡터로 제한되지 않는 것으로 의도된다. 임의의 적합한 발현 벡터가 본 발명에서 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 발명에 사용하기 위한 다수의 발현 벡터들은 상업적으로 입수가능하다. 적합한 상업적인 발현 벡터는 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 위한 CMV 프로모터 및 hGH 폴리아데닐화 부위, 및 pBR322의 복제 기점 및 E. 콜라이에서의 증폭을 위한 암피실린 내성 마커를 포함하는 p3xFLAGTM™ 발현 벡터(Sigma-Aldrich)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 상업적으로 이용가능한 적합한 발현 벡터로는 pBluescriptII SK(-) 및 pBK-CMV 벡터(Stratagene), 및 pBR322(Gibco BRL), pUC(Gibco BRL), pREP4, pCEP4(Invitrogen) 또는 pPolypPoly(문헌 [Lathe et al., Gene 57:193-201 [1987]] 참조)로부터 유래된 플라스미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
조작된 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명 개선된 케토리덕타아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로서, 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에서 케토리덕타아제 효소의 발현을 위해 하나 이상의 제어 서열에 작동적으로 연결되어 있는 것인 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터에 의해 코딩되는 KRED 폴리펩티드를 발현하는 데 사용하기 위한 숙주 세포는 당업계에 널리 공지되어 있고, 박테리아 세포, 예컨대, E. 콜라이, 락토바실러스 케피르, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 마이너(Lactobacillus minor), 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예컨대, 효모 세포(예컨대, 사카로마이세스 세레비지아에 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris )(ATCC 수탁 번호 201178)); 곤충 세포, 예컨대, 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포, 예컨대, CHO, COS, BHK, 293, 및 보우스(Bowes) 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기술된 숙주 세포에 적합한 배양 배지 및 성장 조건은 당업계에 널리 공지되어 있다.
케토리덕타아제의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 기술로는 특히 전기천공, 바이오리스틱스 입자 충격, 리포솜 매개 형질감염, 염화칼슘 형질감염, 및 원형질체 융합을 포함한다. 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입시키기 위한 다양한 방법이 당업자에게 자명할 것이다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) W3110은 본 발명에서 사용되는 숙주 균주이지만, 본 발명이 상기 특정 숙주 균주로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. lacI 리프레서의 제어하에 개선된 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 lac 프로모터에 작동적으로 연결된 플라스미드 pCK110900에 작동적으로 연결시킴으로써 발현 벡터를 생성하였다. 발현 벡터는 또한 P15a의 복제 기점 및 클로람페니콜 내성 유전자도 포함하였다. 에스케리키아 콜라이 W3110 내에 대상 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포는, 그 세포를 클로람페니콜 선택 처리함으로써 단리될 수 있다.
조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드 생성 방법
일부 실시양태에서, 본 발명의 개선된 KRED 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제조하기 위해, 환원 반응을 촉매화하는 자연적으로 발생된 케토리덕타아제 효소는 락토바실러스 케피르로부터 수득(또는 유래)된다. 일부 실시양태에서, 모체 폴리뉴클레오티드 서열은 특정 숙주 세포에서 케토리덕타아제의 발현을 증강시키도록 코돈 최적화된다. 한 예시로서, 락토바실러스 케피르의 야생형 KRED 폴리펩티드를 코딩하는 모체 폴리뉴클레오티드 서열은 진뱅크 데이터베이스로부터 이용가능한 락토바실러스 케피르 KRED 서열의 공지된 폴리펩티드 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 구성되었다. 모체 폴리뉴클레오티드 서열은 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었고, 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드는 lac 프로모터 및 lacI 리프레서 유전자의 제어하에 케토리덕타아제 유전자의 발현을 배치함으로써 발현 벡터 내로 클로닝하였다. E. 콜라이에서 활성 케토리덕타아제를 발현하는 클론을 확인하고, 유전자를 시퀀싱하여 그의 아이덴티티를 확인하였다.
일부 실시양태에서, 조작된 케토리덕타아제는 상기 논의된 바와 같이, 자연적으로 발생된 케토리덕타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이유발 및/또는 유도 진화 방법에 적용함으로써 수득된다. 돌연변이유발은 무작위 및 부위 특이적 돌연변이유발을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 기술에 따라 수행될 수 있다. 유도 진화는 셔플링을 포함하는 개선된 프로모터 변이체를 스크리닝하는 당업계에 공지된 임의의 기술로 수행될 수 있다. 돌연변이 유발 및 유도 진화 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호, 제5,837,458호, 제5,928,905호, 제6,096,548호, 제6,117,679호, 제6,132,970호, 제6,165,793호, 제6,180,406호, 제6,251,674호, 제6,265,201호, 제6,277,638호, 제6,287,861호, 제6,287,862호, 제6,291,242호, 제6,297,053호, 제6,303,344호, 제6,309,883호, 제6,319,713호, 제6,319,714호, 제6,323,030호, 제6,326,204호, 제6,335,160호, 제6,335,198호, 제6,344,356호, 제6,352,859호, 제6,355,484호, 제6,358,740호, 제6,358,742호, 제6,365,377호, 제6,365,408호, 제6,368,861호, 제6,372,497호, 제6,337,186호, 제6,376,246호, 제6,379,964호, 제6,387,702호, 제6,391,552호, 제6,391,640호, 제6,395,547호, 제6,406,855호, 제6,406,910호, 제6,413,745호, 제6,413,774호, 제6,420,175호, 제6,423,542호, 제6,426,224호, 제6,436,675호, 제6,444,468호, 제6,455,253호, 제6,479,652호, 제6,482,647호, 제6,483,011호, 제6,484,105호, 제6,489,146호, 제6,500,617호, 제6,500,639호, 제6,506,602호, 제6,506,603호, 제6,518,065호, 제6,519,065호, 제6,521,453호, 제6,528,311호, 제6,537,746호, 제6,573,098호, 제6,576,467호, 제6,579,678호, 제6,586,182호, 제6,602,986호, 제6,605,430호, 제6,613,514호, 제6,653,072호, 제6,686,515호, 제6,703,240호, 제6,716,631호, 제6,825,001호, 제6,902,922호, 제6,917,882호, 제6,946,296호, 제6,961,664호, 제6,995,017호, 제7,024,312호, 제7,058,515호, 제7,105,297호, 제7,148,054호, 제7,220,566호, 제7,288,375호, 제7,384,387호, 제7,421,347호, 제7,430,477호, 제7,462,469호, 제7,534,564호, 제7,620,500호, 제7,620,502호, 제7,629,170호, 제7,702,464호, 제7,747,391호, 제7,747,393호, 제7,751,986호, 제7,776,598호, 제7,783,428호, 제7,795,030호, 제7,853,410호, 제7,868,138호, 제7,783,428호, 제7,873,477호, 제7,873,499호, 제7,904,249호, 제7,957,912호, 제7,981,614호, 제8,014,961호, 제8,029,988호, 제8,048,674호, 제8,058,001호, 제8,076,138호, 제8,108,150호, 제8,170,806호, 제8,224,580호, 제8,377,681호, 제8,383,346호, 제8,457,903호, 제8,504,498호, 제8,589,085호, 제8,762,066호, 제8,768,871호, 제9,593,326호, 및 모든 관련된 US 이외의 대응 특허; 문헌 [Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]]; [Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]]; [Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]]; [Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]]; [Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]]; [Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]]; [Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]]; [Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3: 284-290 [1999]]; [Christians et al., Nat. Biotechnol., 17: 259-264 [1999]]; [Crameri et al., Nature, 391: 288-291 [1998]]; [Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]]; [Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]]; [Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]]; [Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]]; [Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; 및 WO 2009/152336(상기 문헌들은 모두 본원에서 참조로 포함된다) 참조).
돌연변이유발 처리 후 수득된 클론을 원하는 개선된 효소 특성을 갖는 조작된 케토리덕타아제에 대해 스크리닝한다. (흡광도 또는 형광성 감소를 통해) NADH 또는 NADPH가 NAD+ 또는 NADP+로 전환되면서 일어나는 NADH 또는 NADPH 농도의 감소율을 모니터링하는 표준 생화학 기술을 이용하여 발현 라이브러리로부터 효소 활성을 측정할 수 있다. 상기 반응에서, 케토리덕타아제가 케톤 기질을 상응하는 하이드록실 기로 환원시키면서 NADH 또는 NADPH는 케토리덕타아제에 의해 소비(산화)된다. 단위 시간당 흡광도 또는 형광성의 감소에 의해 측정된 바의 NADH 또는 NADPH 농도의 감소율은 고정량의 용해물(또는 그로부터 제조된 동결건조된 분말) 중 KRED 폴리펩티드의 상대 (효소) 활성을 가리킨다. 생성물의 입체화학은 공지된 각종 방법에 의해, 및 또한 실시예에 제공된 바와 같이 확인될 수 있다. 원하는 개선된 효소 특성이 열 안정성인 경우, 효소 제제를 정의된 온도에 가하고, 열 처리 후 남은 효소 활성의 양을 측정한 후 효소 활성을 측정할 수 있다. 이어서, 케토리덕타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 클론을 단리시키고, 시퀀싱하여 (존재하는 경우) 뉴클레오티드 서열 변이를 동정하고, 숙주 세포 내에서 효소를 발현시키는 데에 사용한다.
조작된 폴리펩티드의 서열이 공지되어 있는 경우, 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 합성 방법에 따라 표준 고체상 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 최대 약 100개의 염기로 이루어진 단편을 개별적으로 합성한 후, 이어서, (예컨대, 효소 또는 화학적 라이게이션 방법 또는 중합효소 매개 방법에 의해) 연결시켜, 임의의 원하는 연속 서열을 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 (예컨대, 문헌 [Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981]]에 기술된 고전적 포스포르아미다이트 방법, 또는 전형적인 자동화 합성 방법으로 실시되는, 문헌 [Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984]]에 기술된 방법을 이용하여) 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 포스포르아미다이트 방법에 따라, 올리고뉴클레오티드는 (예컨대, 자동 DNA 합성기에서) 합성되고, 정제, 어닐링, 라이게이션되고, 적절한 벡터에서 클로닝된다. 추가로, 본질적으로 임의의 핵산은 (예컨대, 미국 텍사스주 미들랜드 소재의 The Midland Certified Reagent Company, 미국 캘리포니아주 라모나 소재의 The Great American Gene Company, 미국 일리노이스주 시카고 소재의 ExpressGen Inc., 미국 캘리포니아주 알라메다 소재의 및 다수의 다른 공급원) 다양한 상업적 공급원들 중 임의의 곳으로부터 입수할 수 있다.
숙주 세포에서 발현된 조작된 케토리덕타아제 효소는 다른 것들 중에서도 특히 리소자임 처리, 초음파 처리, 여과, 염석, 초원심분리 및 크로마토그래피를 비롯한 단백질 정제에 대해 널리 공지된 기술 중 임의의 하나 이상의 것을 이용하여 세포 및 또는 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 예컨대, E. 콜라이와 같은 박테리아로부터 단백질을 용해시키고, 고효율로 추출하는 데 적합한 용액은 셀라이틱 B(CelLytic B)™(Sigma-Aldrich)이라는 상표명으로 상업적으로 이용가능하다.
케토리덕타아제 폴리펩티드를 단리시키기 위한 크로마토그래피 기술에는 다른 것들 중에서도 특히 역상 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 특정 효소를 정제하기 위한 조건은 부분적으로는 예컨대, 순전하, 소수성, 친수성, 분자량, 분자 형상 등과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에게는 자명할 것이다.
일부 실시양태에서, 친화성 기술을 이용하여 개선된 케토리덕타아제 효소를 단리시킬 수 있다. 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 케토리덕타아제 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 임의의 항체를 사용할 수 있다. 항체의 제조를 위해, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 숙주 동물에 케토리덕타아제를 주사하여 그를 면역화시킬 수 있다. 케토리덕타아제 폴리펩티드를 측쇄 작용기 또는 측쇄 작용기에 부착된 링커에 의해 예컨대, BSA와 같은 적합한 캐리어에 부착시킬 수 있다. 프로인트(완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄, 계면 활성 물질, 예컨대, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 예컨대, BCG(바실러스 칼메-구에린(bacilli Calmette Guerin)) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간용 애주번트를 포함하나, 이에 제한되지 않는 각종 애주번트를 사용하여, 숙주 종에 따라 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
케토리덕타아제는 효소를 발현하는 세포의 형태로, 조 추출물로서, 또는 단리된 또는 정제된 제제로서 제조되고, 사용될 수 있다. 케토리덕타아제는 분말 형태(예컨대, 아세톤 분말)인, 동결건조물로서 제조되거나, 또는 효소 용액으로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케토리덕타아제는 실질적으로 순수한 제제 형태일 수 있다.
일부 실시양태에서, 케토리덕타아제 폴리펩티드는 임의의 적합한 고체 기판에 부착될 수 있다. 기판은 고체상, 표면, 및/또는 막일 수 있다. 고체 지지체는 유기 중합체, 예컨대, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플루오로에틸렌, 폴리에틸렌옥시, 및 폴리아크릴아미드 뿐만 아니라, 그의 공중합체 및 그래프트로 구성될 수 있다. 고체 지지체는 또한 무기물, 예컨대, 유리, 실리카, 공극 조절형 유리(CPG: controlled pore glass), 역상 실리카 또는 금속, 예컨대, 금 또는 백금일 수 있다. 기판의 입체형태는 비드, 구체, 입자, 과립, 겔, 막 또는 표면의 형태일 수 있다. 표면은 평면, 실질적으로 평면 또는 비평면일 수 있다. 고체 지지체는 다공성이거나, 또는 비다공성일 수 있고, 팽윤성 또는 비팽윤성 특징을 가질 수 있다. 고체 지지체는 웰, 함몰형, 또는 다른 용기, 베쓸, 피처, 또는 위치 형태로 구성될 수 있다. 복수의 지지체가 시약의 로봇식 전달을 다룰 수 있거나, 또는 검출 방법 및/또는 장비에 의해 다룰 수 있는, 다양한 위치의 어레이 상에 배치될 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 케토리덕타아제 촉매화된 환원 반응은 전형적으로 보조인자를 필요로 한다. 본원에 기술된 조작된 케토리덕타아제 효소에 의해 촉매화된 환원 반응은 또한 전형적으로 보조인자를 필요로 하지만, 조작된 케토리덕타아제의 다수의 실시양태는 야생형 케토리덕타아제 효소로 촉매화된 반응보다 보조인자를 훨씬 적게 필요로 한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "보조인자"는 케토리덕타아제 효소와 함께 조합되어 작동하는 비단백질 화합물을 지칭한다. 본원에 기술된 조작된 케토리덕타아제 효소와 함께 사용하기에 적합한 보조인자로는 NADP+(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트), NADPH(NADP+의 환원된 형태), NAD+(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드) 및 NADH(NAD+의 환원된 형태)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 보조인자의 환원 형태를 반응 혼합물에 첨가한다. 환원된 NAD(P)H 형태는 보조인자 재생 시스템을 사용하여 산화된 NAD(P)+ 형태로부터 임의적으로 재생될 수 있다. 용어 "보조인자 재생 시스템"은 보조인자의 산화 형태를 환원시키는 반응(예컨대, NADP+에서 NADPH로의 반응)에 참여하는 반응물 세트를 지칭한다. 케토 기질의 케토리덕타아제 촉매화된 환원에 의해 산화되는 보조인자는 보조인자 재생 시스템에 의해 환원 형태로 재생된다. 보조인자 재생 시스템은 수소 등가물을 환원시키는 공급원이며, 보조인자의 산화 형태를 환원시킬 수 있는 화학량론적 환원제를 포함한다. 보조인자 재생 시스템은 환원제에 의해 보조인자의 산화 형태의 환원을 촉매화하는 효소 촉매와 같은 촉매를 추가로 포함할 수 있다. 보조인자 재생 시스템은 또한 예컨대, 이소프로판올과 같은 보조기질을 포함할 수 있다. 각각 NAD+ 또는 NADP+로부터 NADH 또는 NADPH를 재생하기 위한 보조인자 재생 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다.
실험부
본 발명의 다양한 특징 및 실시양태가 하기의 대표적인 실시예에서 예시되지만, 이는 제한하는 것이 아니라, 예시를 위한 것으로 의도된다.
하기 실험 개시내용에서, 하기 약어가 적용된다: ppm(백만분율: parts per million); M(몰 농도); mM(밀리몰 농도), uM 및 μM(마이크로몰 농도); nM(나노몰 농도); mol(몰); gm 및 g(그램); mg(밀리그램); ug 및 ㎍(마이크로그램); L 및 ℓ(리터); ml 및 mL(밀리리터); cm(센티미터); mm(밀리미터); um 및 ㎛(마이크로미터); sec(초); min(s)(분); h 및 hr(시간); U(단위); MW(분자량: molecular weight); rpm(분당 회전수: rotations per minute); ℃(섭씨 온도); RT(실온: room temperature); CDS(코딩 서열: coding sequence); DNA(데옥시리보핵산: deoxyribonucleic acid); RNA(리보핵산: ribonucleic acid); HPLC(고성능 액체 크로마토그래피: high performance liquid chromatography); FIOPC (양성 대조군 대비 개선 배수: fold improvement over positive control); HTP(고처리량: high throughput); LB(루리아 브로쓰: Luria broth); KPO4(인산칼륨); KPO3(포타슘 포스파이트); TEoA(트리에탄올아민); PMBS(폴리믹신 B 술페이트: polymyxin B sulfate); 시그마-알츠리치(Sigma-Aldrich)(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재); 밀리포어(Millipore)(Millipore, Corp.: 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재); 디프코(Difco)(Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems: 미국 미시간주 디트로이트 소재); 다이셀(Daicel)(Daicel: 미국 펜실베이니아주 웨스트체스터 소재); 게네틱스(Genetix)(Genetix USA, Inc.: 미국 오리건주 비버턴 소재); 몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices)(Molecular Devices, LLC: 미국 캘리포니아주 서니베일 소재); 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(Applied Biosystems, Life Technologies, Corp.의 지사: 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재), 애질런트(Agilent)(Agilent Technologies, Inc: 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재); 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)(Thermo Fisher Scientific의 지사: 미국 매사추세츠주 Waltham 소재); 코닝(Corning)(Corning, Inc.: 미국 캘리포니아주 팔로알토 소재); 및 바이오-래드(Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories: 미국 캘리포니아주 허큘리스 소재).
본 발명의 개발에서 하기 서열이 사용되었다.
서열 번호 413:
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
서열 번호 414:
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 1
재조합 KRED 유전자를 함유하는 E. 콜라이 발현 숙주
본 발명의 변이체를 생성하는 데 사용된 초기 KRED 효소는 코덱시스(Codexis)의 상업적으로 입수가능한 KRED 효소 패널의 수집물로부터 수득하였다. 초기 스크린 동안, 서열 번호 4의 변이체는 LC/MS에 의해 측정된 바와 같이 가장 많은 생성물을 생성하였다. KRED 코딩 유전자를 lacl 리프레서의 제어하에 lac 프로모터에 작동적으로 연결된 pCK110900(미국 특허 출원 공개 제2006/0195947호의 도 3 참조), 서열 번호 413, 또는 서열 번호 414를 포함하는 발현 벡터 시스템으로 클로닝하였다. 발현 벡터 시스템은 또한 P15a 복제 기점 및 클로람페니콜 내성 유전자를 함유한다. 본 발명이 본원에 개시된 발현 벡터로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 당업자는 p3xFLAGTM™ 발현 벡터(Sigma-Aldrich), pBluescriptII SK(-) 및 pBK-CMV 벡터(Stratagene), 및 pBR322(Gibco BRL), pUC(Gibco BRL), pREP4, pCEP4(Invitrogen) 또는 pPoly(문헌 [Lathe et al., Gene 57:193-201 [1987]] 참조)로부터 유래된 플라스미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 발현 벡터가 본 발명에서 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
생성된 플라스미드를 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 E. 콜라이 W3110으로 형질전환시켰다. 당업계에 공지된 바와 같이 세포에 대해 클로람페니콜 선택을 수행하여 형질전환체를 단리시켰다(예컨대, 미국 특허 제8,383,346호 및 WO2010/144103 참조).
실시예 2
HTP KRED 함유 습윤 세포 펠릿의 제조
단일클론 콜로니로부터의 재조합 KRED 코딩 유전자를 함유하는 E. 콜라이 세포를 96 웰 얕은 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 1% 글루코스 및 30 ㎍/mL 클로람페니콜을 함유하는 190 ㎕ LB에 접종하였다. 플레이트를 O2 투과성 씰로 밀봉하고, 배양물을 20℃에서, 200 rpm, 및 85% 습도에서 밤새도록 성장시켰다. 이어서, 20 ㎕의 각 세포 배양물을 380 ㎕ TB 및 30 ㎍/mL CAM을 함유하는 96 웰 딥 웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 딥 웰 플레이트를 O2 투과성 씰로 밀봉하고, OD600이 0.6-0.8에 도달할 때까지 30℃, 250 rpm, 및 85% 습도에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포 배양물을 IPTG에 의해 1 mM의 최종 농도로 유도하고, 원래 사용된 것과 동일한 조건하에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 4℃에서 4000 rpm으로 10 min 동안 원심분리를 사용하여 펠릿화하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 용해 전에 -80℃에서 냉동시켰다.
실시예 3
HTP KRED 함유 세포 용해물 제조
먼저, 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 세포 펠릿을, 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM pH 8 트리에탄올아민*H2SO4를 함유하거나, 또는 2 mM MgSO4, 1 g/L 리소자임, 및 0.5 g/L PMBS를 포함하는 100 mM pH 8 인산칼륨을 함유하는 150 ㎕ 용해 완충제를 첨가함으로써 용해시켰다. 이어서, 세포 펠릿을 벤치 탑 진탕기에서 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 플레이트를 4℃에서 15분 동안 4000 rpm으로 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 이어서, 상청액을 생체촉매성 반응에 사용하여 그의 활성 수준을 측정하였다.
실시예 4
진탕 플라스크( SF : Shake Flask) 배양물로부터 동결건조된 용해물 제조
진탕 플라스크 방법을 사용하여 2차 스크리닝 검정법 및/또는 본원에 기술된 생체촉매성 프로세스에서 사용하는 데 유용한 조작된 KRED 폴리펩티드 진탕 플라스크 분말(SFP: shake-flask powder)을 생성할 수 있다. 진탕 플라스크 분말(SFP) 효소 제제는 HTP 검정법에 사용되는 세포 용해물과 비교하여 더욱 정제된(예컨대, 총 단백질의 최대 30%) 조작된 효소 제제를 제공하고, 이는 또한 더욱 농축된 효소 용액을 사용할 수 있게 한다. 이를 시작하기 위해, 상기 기술된 바와 같이 성장시킨 선택된 HTP 배양물을 1% 글루코스 및 30 ㎍/ml 클로람페니콜(CAM)을 포함하는 LB 아가 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새도록 성장시켰다. 각 배양물로부터의 단일 콜로니를 1% 글루코스 및 30㎍/ml CAM을 포함하는 6 ml의 LB로 옮겼다. 배양물을 250 rpm으로 30℃에서 18 h 동안 성장시키고, 최종 OD600이 0.05가 되도록 30 ㎍/ml CAM을 함유하는 250 ml의 TB에 대략 1:50으로 계대배양하였다. 배양물을 250 rpm으로 30℃에서 대략 3시간 동안 OD600이 0.8-1.0이 될 때까지 성장시키고, 1 mM IPTG로 유도하였다. 이어서, 배양물을 250 rpm으로 30℃에서 20 h 동안 성장시켰다. 배양물을 원심분리하였다(4000 rpm으로 4℃에서 20 min 동안). 상청액을 폐기하고, 펠릿을 2 mM MgSO4를 포함하는 50 mM pH 8 인산칼륨 35 ml 중에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 원심분리하였다(4000 rpm으로 4℃에서 20 min 동안). 상청액을 폐기하고, 펠릿을 2 mM MgSO4를 포함하는 50 mM pH 8 인산칼륨 6 ml 중에 재현탁시키고, 콘스탄트 시스템즈(Constant Systems)로부터의 세포 파괴기(One Shot)를 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해물을 펠릿화하고(10,000 rpm으로 4℃에서 60 min 동안), 상청액을 냉동시키고, 동결건조시켜 진탕 플라스크(SF) 효소를 생성하였다.
실시예 5
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 4로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
이소-α-산 기질의 환원에 대한 변이체 스크리닝의 결과에 기초하여 모체 효소로서 서열 번호 4를 선택하였다. 잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 4의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드(즉, 서열 번호 3)를 사용하여 표 5-1의 추가의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 이들 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 이소-α-산으로부터의 디하이드로-(rho)-이소-α-산 형성에서 개선을 보였다. 조작된 폴리펩티드는 HTP 검정법 및 하기 표 5-2에 기술된 분석 방법과 함께 상기 기술된 바와 같은 유도 진화 방법을 사용하여 서열 번호 4의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성하였다.
유도 진화는 서열 번호 3에 기재된 폴리뉴클레오티드에서부터 시작하였다. 이어서, 조작된 폴리펩티드를 출발 "백본" 유전자 서열로서 선택하였다. 각종의 널리 공지된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 이용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 이소-α-산 기질을 원하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정한 분석 방법 및 HTP 검정법을 이용하여 스크리닝하였다.
효소 검정법은 96 웰 포맷으로 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM pH 8 트리에탄올아민*H2SO4 중 50% v/v HTP 효소 용해물, 8 g/L 이소-α-산 기질(Isolone® Isomerized Hop Extract Solution, Kalsec), 및 40 vol% 이소프로판올(IPA) 중의 0.1 g/L NADP를 포함한 200 ㎕의 총 부피/웰로 수행하였다. 플레이트를 밀봉하고, 20-24시간 동안 600 rpm으로 진탕시키면서 40℃에서 인큐베이션시켰다.
20-24시간 후, 0.1% 아세트산을 포함하는 1000 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4000 rpm으로 4℃에서 10 min 동안 원심분리하였다. 켄칭된 샘플을 HPLC 분석 전 50:50 아세토니트릴:물 혼합물 중에서 4-5x로 추가로 희석하였다. HPLC 전개 파라미터는 하기 표 5-2에 기술되어 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 6
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 6으로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 6의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드(즉, 서열 번호 5)를 사용하여 표 6-1의 추가의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 이들 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 이소-α-산으로부터의 디하이드로-(rho)-이소-α-산 형성에서 개선을 보였다. 조작된 폴리펩티드는 HTP 검정법 및 하기 표 5-2에 기술된 분석 방법과 함께 상기 기술된 바와 같은 유도 진화 방법을 사용하여 서열 번호 6의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성하였다.
유도 진화는 서열 번호 5에 기재된 폴리뉴클레오티드에서부터 시작하였다. 이어서, 조작된 폴리펩티드를 출발 "백본" 유전자 서열로서 선택하였다. 각종의 널리 공지된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 이용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 이소-α-산 기질을 원하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정한 분석 방법 및 HTP 검정법을 이용하여 스크리닝하였다.
효소 검정법은 96 웰 포맷으로 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM pH 8 트리에탄올아민*H2SO4 중 50% v/v HTP 효소 용해물, 16 또는 40 g/L의 이소-α-산 기질(Isolone® Isomerized Hop Extract Solution, Kalsec), 및 40 vol% 이소프로판올(IPA) 중의 0.1 g/L NADP를 포함한 200 ㎕의 총 부피/웰로 수행하였다. 플레이트를 밀봉하고, 20-24시간 동안 600 rpm으로 진탕시키면서 40℃에서 인큐베이션시켰다.
20-24시간 후, 0.1% 아세트산을 포함하는 1000 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4000 rpm으로 4℃에서 10 min 동안 원심분리하였다. 켄칭된 샘플을 HPLC 분석 전 50:50 아세토니트릴:물 혼합물 중에서 10-20x로 추가로 희석하였다. HPLC 전개 파라미터는 표 5-2에 기술되어 있다.
Figure pct00011
실시예 7
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 80으로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 80의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드(즉, 서열 번호 79)를 사용하여 표 7-1의 추가의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 이들 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 이소-α-산으로부터의 디하이드로-(rho)-이소-α-산 형성에서 개선을 보였다. 조작된 폴리펩티드는 HTP 검정법 및 하기 표 5-2에 기술된 분석 방법과 함께 상기 기술된 바와 같은 유도 진화 방법을 사용하여 서열 번호 80의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성하였다.
유도 진화는 서열 번호 79에 기재된 폴리뉴클레오티드에서부터 시작하였다. 이어서, 조작된 폴리펩티드를 출발 "백본" 유전자 서열로서 선택하였다. 각종의 널리 공지된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 이용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 이소-α-산 기질을 원하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정한 분석 방법 및 HTP 검정법을 이용하여 스크리닝하였다.
효소 검정법은 96 웰 포맷으로 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM pH 8 인산칼륨 중 25% v/v HTP 효소 용해물, 60 또는 80 g/L의 이소-α-산 기질(Isolone® Isomerized Hop Extract Solution, Kalsec), 및 40 vol% 이소프로판올(IPA) 중의 0.02 g/L NADP를 포함한 200 ㎕의 총 부피/웰로 수행하였다. 플레이트를 밀봉하고, 20-24시간 동안 600 rpm으로 진탕시키면서 45℃에서 인큐베이션시켰다.
20-24시간 후, 0.1% 아세트산을 포함하는 1000 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4000 rpm으로 4℃에서 10 min 동안 원심분리하였다. 켄칭된 샘플을 HPLC 분석 전 50:50 아세토니트릴:물 혼합물 중에서 20-40x로 추가로 희석하였다. HPLC 전개 파라미터는 표 5-2에 기술되어 있다.
Figure pct00012
실시예 8
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 80으로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 80의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드(즉, 서열 번호 79)를 사용하여 표 8-1의 추가의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 이들 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 이소-α-산으로부터의 디하이드로-(rho)-이소-α-산 형성에서 개선을 보였다. 조작된 폴리펩티드는 HTP 검정법 및 하기 표 5-2에 기술된 분석 방법과 함께 상기 기술된 바와 같은 유도 진화 방법을 사용하여 서열 번호 80의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성하였다.
유도 진화는 서열 번호 79에 기재된 폴리뉴클레오티드에서부터 시작하였다. 이어서, 조작된 폴리펩티드를 출발 "백본" 유전자 서열로서 선택하였다. 각종의 널리 공지된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 이용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 이소-α-산 기질을 원하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정한 분석 방법 및 HTP 검정법을 이용하여 스크리닝하였다.
효소 검정법은 96 웰 포맷으로 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM pH 8 인산칼륨 중 10-20% v/v HTP 효소 용해물, 80 또는 160 g/L의 이소-α-산 기질(Isolone® Isomerized Hop Extract Solution, Kalsec), 및 40 vol% 이소프로판올(IPA) 중의 0.02 g/L NADP를 포함한 200 ㎕의 총 부피/웰로 수행하였다. 플레이트를 밀봉하고, 20-24시간 동안 600 rpm으로 진탕시키면서 45℃에서 인큐베이션시켰다.
20-24시간 후, 0.1% 아세트산을 포함하는 1000 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4000 rpm으로 4℃에서 10 min 동안 원심분리하였다. 켄칭된 샘플을 HPLC 분석 전 50:50 아세토니트릴:물 혼합물 중에서 20-40x로 추가로 희석하였다. HPLC 전개 파라미터는 표 5-2에 기술되어 있다.
Figure pct00013
실시예 9
높은 기질 농도에서의 개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 6 및 서열 번호 80으로부터 유래된 조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
2 mM MgSO4를 포함하는 5 mL의 100 mM pH 8 트리에탄올아민*H2SO4 중에 200 mg의 효소 분말을 용해시켜 40 g/L 효소 스톡 용액을 제조하였다. 2 mL 분취량을 취하고, 각각 20 및 10 g/L로 2회 연속 1:1 v/v 희석을 수행하였다. 500 ㎕의 효소 스톡 용액(10, 20 또는 40 g/L)을 교반 막대를 이용하여 대기하에서 바이알을 첨가하였다. 교반된 효소 스톡 용액에 완충제 중 1 g/L NADP의 100 ㎕ 분취량 및 이소프로판올(IPA) 중 25 g/L 이소-α-산 400 ㎕를 첨가하였다. 최종 반응 조성물은 5, 10, 또는 20 g/L 효소, 10 g/L 이소-α-산, 및 40% IPA 중 0.1 g/L NADP였다. 바이알을 25℃ 또는 40℃에 가열 블록에 놓고, 1, 2, 4, 8, 및 24 h 후에 샘플링하고, HPLC-UV에 의해 분석하였다. 서열 번호 6 및 서열 번호 80을 비교하는 전형적인 반응 프로파일은 도 1에 제시되어 있다.
실시예 10
높은 기질 농도 및 낮은 NADP 농도에서 개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 80, 104, 100, 136, 116, 132, 162, 150, 152, 144 및 146으로부터 유래된 조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
2 mM MgSO4를 포함하는 500 ㎕의 pH 8 인산칼륨 완충제 중에 100 mg의 효소 분말을 용해시킴으로써 200 g/L 효소 스톡 용액을 제조하였다. 96 딥 웰 플레이트 중 웰에 40 ㎕의 효소/NADP 스톡 용액, 80 ㎕의 이소프로판올, 및 80 ㎕의 40 wt% 이소-α-산 수용액을 첨가하였다. 최종 반응 조성물은 40 g/L의 효소, 160 g/L 이소-α-산, 및 40% IPA 중 0.02 g/L NADP였다. 플레이트를 밀봉하고, 40℃에서 24 h 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 켄칭하고, HPLC-UV에 의해 분석하였다. 데이터는 표 11-1에 제시되어 있고, 도 2에 도시되어 있다.
Figure pct00014
실시예 11
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 104로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
실시예 8에 기술된 바와 같이, 잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 104의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드(즉, 서열 번호 103)를 사용하여 표 11-1의 추가의 개선된, 조작된 폴리펩티드를 생성하였다.
Figure pct00015
실시예 12
재조합 KRED 유전자를 함유하는 E. 콜라이 발현 숙주
본 발명의 변이체를 생성하는 데 사용된 초기 KRED 효소는 코덱시스의 상업적으로 입수가능한 KRED 효소 패널의 수집물로부터 수득하였다. 초기 스크린 동안, 서열 번호 172의 폴리펩티드 또는 서열 번호 270의 폴리펩티드는 LC/MS에 의해 측정된 바와 같이 가장 많은 생성물을 생성하였다. KRED 코딩 유전자를 lacl 리프레서의 제어하에 lac 프로모터에 작동적으로 연결된, 서열 번호 413, 또는 서열 번호 414의 발현 벡터로 클로닝하였다. 발현 벡터는 또한 P15a 복제 기점 및 클로람페니콜 내성 유전자를 함유한다. 생성된 플라스미드를 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 E. 콜라이 W3110으로 형질전환시켰다. 당업계에 공지된 바와 같이 세포에 대해 트리클로산 선택을 수행하여 형질전환체를 단리시켰다(예컨대, 미국 특허 제8,383,346 및 WO2010/144103 참조).
실시예 13
HTP KRED 함유 습윤 세포 펠릿의 제조
단일클론 콜로니로부터의 재조합 KRED 코딩 유전자를 함유하는 E. 콜라이 세포를 96 웰 얕은 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 1% 글루코스 및 0.12 ㎍/mL 트리클로산을 함유하는 190 ㎕ LB에 접종하였다. 플레이트를 O2 투과성 씰로 밀봉하고, 배양물을 20℃에서, 200 rpm, 및 85% 습도에서 밤새도록 성장시켰다. 이어서, 20 ㎕의 각 세포 배양물을 380 ㎕ TB 및 30 ㎍/mL CAM을 함유하는 96 웰 딥 웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 딥 웰 플레이트를 O2 투과성 씰로 밀봉하고, OD600이 0.6-0.8에 도달할 때까지 30℃, 250 rpm, 및 85% 습도에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포 배양물을 IPTG에 의해 1 mM의 최종 농도로 유도하고, 원래 사용된 것과 동일한 조건하에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 4℃에서 4000 rpm으로 10 min 동안 원심분리를 사용하여 펠릿화하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 용해 전에 -80℃에서 냉동시켰다.
실시예 14
HTP KRED 함유 세포 용해물 제조
먼저, 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 세포 펠릿을, 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM, pH 8 인산칼륨을 함유하거나, 또는 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM, pH 8 인산칼륨을 함유하는 150 ㎕ 용해 완충제를 첨가함으로써 용해시켰다. 이어서, 세포 펠릿을 벤치 탑 진탕기에서 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 플레이트를 4℃에서 15분 동안 4,000 rpm으로 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 이어서, 상청액을 생체촉매성 반응에 사용하여 그의 활성 수준을 측정하였다.
실시예 15
진탕 플라스크( SF ) 배양물로부터 동결건조된 용해물 제조
진탕 플라스크 방법을 사용하여 2차 스크리닝 검정법 및/또는 본원에 기술된 생체촉매성 프로세스에서 사용하는 데 유용한 조작된 KRED 폴리펩티드 진탕 플라스크 분말(SFP)을 생성할 수 있다. 진탕 플라스크 분말(SFP) 효소 제제는 HTP 검정법에 사용되는 세포 용해물과 비교하여 더욱 정제된(예컨대, 총 단백질의 최대 30%) 조작된 효소 제제를 제공하고, 이는 또한 더욱 농축된 효소 용액을 사용할 수 있게 한다. 이를 시작하기 위해, 상기 기술된 바와 같이 성장시킨 선택된 HTP 배양물을 1% 글루코스 및 0.12 ㎍/mL의 트리클로산을 포함하는 LB 아가 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새도록 성장시켰다. 각 배양물로부터의 단일 콜로니를 1% 글루코스 및 30 ㎍/ml CAM을 포함하는 6 ml의 LB로 옮겼다. 배양물을 250 rpm으로 30℃에서 18 h 동안 성장시키고, 최종 OD600이 0.05가 되도록 0.12 ㎍/mL의 트리클로산을 함유하는 250 ml의 TB에 대략 1:50으로 계대배양하였다. 배양물을 250 rpm으로 30℃에서 대략 3시간 동안 OD600이 0.8-1.0이 될 때까지 성장시키고, 1 mM IPTG로 유도하였다. 이어서, 배양물을 250 rpm으로 30℃에서 20 h 동안 성장시켰다. 배양물을 원심분리하였다(4000 rpm으로 4℃에서 20 min 동안). 상청액을 폐기하고, 펠릿을 2 mM MgSO4를 포함하는 50 mM, pH 8 인산칼륨 35 ml 중에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 원심분리하였다(4000 rpm으로 4℃에서 20 min 동안). 상청액을 폐기하고, 펠릿을 2 mM MgSO4를 포함하는 50 mM, pH 8 인산칼륨 6 ml 중에 재현탁시키고, 콘스탄트 시스템즈로부터의 세포 파괴기(One Shot)를 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해물을 펠릿화하고(10,000 rpm으로 4℃에서 60 min 동안), 상청액을 냉동시키고, 동결건조시켜 진탕 플라스크(SF) 효소를 생성하였다.
실시예 16
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 172로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
이소-α-산 기질의 환원에 대한 변이체 스크리닝의 결과에 기초하여 모체 효소로서 서열 번호 172를 선택하였다. 잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 172의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표 16-1의 추가의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 이들 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 이소-α-산으로부터의 디하이드로-(rho)-이소-α-산 형성에서 개선을 보였다. 조작된 폴리펩티드는 HTP 검정법 및 하기 표 16-1에 기술된 분석 방법과 함께 상기 기술된 바와 같은 유도 진화 방법을 사용하여 서열 번호 172의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성하였다.
유도 진화는 서열 번호 171에 기재된 폴리뉴클레오티드에서부터 시작하였다. 이어서, 조작된 폴리펩티드를 출발 "백본" 유전자 서열로서 선택하였다. 각종의 널리 공지된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 이용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 이소-α-산 기질을 원하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정한 분석 방법 및 HTP 검정법을 이용하여 스크리닝하였다.
효소 검정법은 96 딥 웰 포맷으로 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM, pH 8 인산칼륨 중 20% v/v HTP 효소 용해물, 40% v/v의 40wt% 이소-α-산 기질 수용액(Isolone® Isomerized Hop Extract Solution, Kalsec), 및 40 vol% 이소프로판올(IPA) 중 0.02 g/L NADP를 포함한 100 ㎕의 총 부피/웰로 수행하였다. 플레이트를 밀봉하고, 20-24시간 동안 600 rpm으로 진탕시키면서 45℃에서 인큐베이션시켰다.
20-24시간 후, 0.1% 아세트산을 포함하는 1000 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4000 rpm으로 4℃에서 10 min 동안 원심분리하였다. 켄칭된 샘플을 HPLC 분석 전 50:50 아세토니트릴:물 혼합물 중에서 4-5x로 추가로 희석하였다. HPLC 전개 파라미터는 하기 표 5-2에 기술되어 있다.
Figure pct00016
실시예 17
트랜스-ISO에 대한 개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 186으로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
이소-α-산 기질의 환원에 대한 변이체 스크리닝의 결과에 기초하여 모체 효소로서 서열 번호 186을 선택하였다. 잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 185의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표 17-2의 추가의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 이들 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 이소-α-산으로부터의 디하이드로-(rho)-이소-α-산 형성에서 개선을 보였다. 조작된 폴리펩티드는 HTP 검정법 및 하기 표 5-2에 기술된 분석 방법과 함께 상기 기술된 바와 같은 유도 진화 방법을 사용하여 서열 번호 186의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성하였다.
유도 진화는 서열 번호 185에 기재된 폴리뉴클레오티드에서부터 시작하였다. 이어서, 조작된 폴리펩티드를 출발 "백본" 유전자 서열로서 선택하였다. 각종의 널리 공지된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 이용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 이소-α-산 기질을 원하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정한 분석 방법 및 HTP 검정법을 이용하여 스크리닝하였다.
효소 검정법은 96 딥 웰 플레이트 포맷으로 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM, pH 8 인산칼륨 중 50% v/v HTP 효소 용해물, 10% v/v의 10 g/L의 서열 번호 186, 1 g/L 이소-α-산 기질(Isolone® Isomerized Hop Extract Solution, Kalsec), 및 40 vol% 이소프로판올(IPA) 중 0.1 g/L NADP를 포함한 100 ㎕의 총 부피/웰로 수행하였다. 플레이트를 밀봉하고, 44-48시간 동안 600 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 인큐베이션시켰다.
20-24시간 후, 0.1% 아세트산을 포함하는 1000 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4000 rpm으로 4℃에서 10 min 동안 원심분리하였다. 켄칭된 샘플을 HPLC 분석 전 50:50 아세토니트릴:물 혼합물 중에서 4-5x로 추가로 희석하였다. HPLC 전개 파라미터는 하기 표 17-1에 기술되어 있다. 도 3을 참조한다. 트랜스-ISO에 대하여 개선된 활성을 보인 변이체는 표 17-2에 제시되어 있다.
Figure pct00017
Figure pct00018
실시예 18
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 186으로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
실시예 16에 기술된 바와 같이, 잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 186의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드(즉, 서열 번호 185)를 사용하여 표 18-1의 추가의 개선된 조작된 폴리펩티드를 생성하였다.
Figure pct00019
실시예 19
높은 기질 농도 및 낮은 NADP 농도에서
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 194, 서열 번호 252로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
2 mM MgSO4 및 0.1 g/L의 NADP를 포함하는 500 ㎕의 100 mM, pH 8 인산칼륨 완충제 중에 100 mg의 효소 분말을 용해시킴으로써 200 g/L 효소 스톡 용액을 제조하였다. 96 딥 웰 플레이트 중 웰에 40 ㎕ 분취량의 효소/NADP 스톡 용액, 80 ㎕의 이소프로판올, 및 80 ㎕의 40 wt% 이소-α-산 수용액을 첨가하였다. 최종 반응 조성물은 40 g/L의 효소, 160 g/L 이소-α-산, 및 40% IPA 중 0.02 g/L NADP였다. 플레이트를 밀봉하고, 40℃에서 24 h 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 켄칭하고, HPLC-UV에 의해 분석하였다. 데이터는 표 19-1, 19-2 및 19-3에 제시되어 있다.
Figure pct00020
실시예 20
높은 기질 농도 및 낮은 NADP 농도에서 개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 270 및 서열 번호 272로부터 유래된 조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
실시예 18에 기술된 바와 같이, 잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 270 및 서열 번호 272의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드(즉, 서열 번호 269 및 서열 번호 271)를 사용하여 표 20-1 및 20-2의 추가의 개선된 조작된 폴리펩티드를 생성하였다.
Figure pct00021
실시예 21
높은 기질 농도 및 낮은 NADP 농도에서 개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 286으로부터 유래된 조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
실시예 18에 기술된 바와 같이, 잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 286의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드(즉, 서열 번호 285)를 사용하여 표 21-1의 추가의 개선된 조작된 폴리펩티드를 생성하였다.
Figure pct00022
실시예 22
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 328로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
이소-α-산 기질의 환원에 대한 변이체 스크리닝의 결과에 기초하여 모체 효소로서 서열 번호 328을 선택하였다. 잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 327의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표 22-1의 추가의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 이들 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 이소-α-산으로부터의 디하이드로-(rho)-이소-α-산 형성에서 개선을 보였다. 조작된 폴리펩티드는 HTP 검정법 및 하기 표 5-2에 기술된 분석 방법과 함께 상기 기술된 바와 같은 유도 진화 방법을 사용하여 서열 번호 328의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성하였다.
유도 진화는 서열 번호 327에 기재된 폴리뉴클레오티드에서부터 시작하였다. 이어서, 조작된 폴리펩티드를 출발 "백본" 유전자 서열로서 선택하였다. 각종의 널리 공지된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 이용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 이소-α-산 기질을 원하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정한 분석 방법 및 HTP 검정법을 이용하여 스크리닝하였다.
효소 검정법은 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM, pH 8 인산칼륨 중 20% v/v HTP 효소 용해물, 40% v/v의 40wt% 이소-α-산 기질 수용액(Isolone® Isomerized Hop Extract Solution, Kalsec), 및 40 vol% 이소프로판올(IPA) 중 0.02 g/L NADP를 포함한 200 ㎕의 총 부피/웰로 수행하였다. 플레이트를 밀봉하고, 20-24시간 동안 600 rpm으로 진탕시키면서 45℃에서 인큐베이션시켰다.
20-24시간 후, 0.1% 아세트산을 포함하는 1000 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4,000 rpm으로 4℃에서 10 min 동안 원심분리하였다. 켄칭된 샘플을 HPLC 분석 전 50:50 아세토니트릴:물 혼합물 중에서 4-5x로 추가로 희석하였다. HPLC 전개 파라미터는 표 5-2 및 표 17-1에 기술되어 있다. 도 3을 참조한다. 개선된 변이체는 표 22-1에 제시되어 있다.
Figure pct00023
실시예 23
높은 기질 로딩 및 낮은 NADP 로딩에서
서열 번호 328 및 서열 번호 330의 성능
8 g의 40wt% ISO 수용액 샘플을 8 mL의 이소프로판올(IPA) 및 2 mL의 100 mM, pH 8 인산칼륨 완충제 중에 용해시켰다. 4 N NaOH 및/또는 10% H3PO4를 이용하여 pH를 8로 조정하였다. 4.5 mL의 pH 조정된 ISO/IPA/완충제 용액을 교반 막대가 있는 격막 캡이 있는 바이알에 첨가하고, 40℃ 가열 블록에서 블랭킹된 질소하에 첨가하였다. 10 mM의 MgSO4 및 0.2 g/L의 NADP를 포함하는 100 mM, pH 8 인산칼륨 완충제 중 0.5 mL의 10 또는 40 g/L의 KRED를 용액에 첨가하였다(최종 KRED 및 NADP 로딩은 각각 1 또는 4 g/L KRED 및 0.02 g/L NADP이다). 다양한 시간 간격으로, 20 ㎕ 분취량을 주사기를 통해 반응으로부터 회수하고, 0.1% 아세트산을 포함하는 1000 ㎕의 1:1 아세토니트릴/물로 켄칭하였다. 4,000 rpm으로 20℃에서 5 min 동안 원심분리한 후, 20 ㎕의 상청액을 HPLC 분석을 위해 0.1% 아세트산을 포함하는 180 ㎕의 1:1 아세토니트릴/물로 희석하였다(표 5-2 및 표 17-1). 도 4를 참조한다.
실시예 24
개선된 KRED 활성을 위한 서열 번호 330으로부터 유래된
조작된 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝
이소-α-산 기질의 환원에 대한 변이체 스크리닝의 결과에 기초하여 모체 효소로서 서열 번호 330을 선택하였다. 잘 확립된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 및 앞서 확인된 유익한 돌연변이의 재조합)을 사용하여 조작된 유전자의 라이브러리를 생성하였다. 각 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 HTP로 생성하였고, 가용성 용해물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하였다.
서열 번호 329의 KRED 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표 24-1의 추가의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 이들 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 이소-α-산으로부터의 디하이드로-(rho)-이소-α-산 형성에서 개선을 보였다. 조작된 폴리펩티드는 HTP 검정법 및 하기 표 24-1에 기술된 분석 방법과 함께 상기 기술된 바와 같은 유도 진화 방법을 사용하여 서열 번호 330의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성하였다.
유도 진화는 서열 번호 329에 기재된 폴리뉴클레오티드에서부터 시작하였다. 이어서, 조작된 폴리펩티드를 출발 "백본" 유전자 서열로서 선택하였다. 각종의 널리 공지된 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 이용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 이소-α-산 기질을 원하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정한 분석 방법 및 HTP 검정법을 이용하여 스크리닝하였다.
효소 검정법은 96 둥근 바닥 플레이트 포맷으로 2 mM MgSO4를 포함하는 100 mM, pH 8 인산칼륨 중 50% v/v HTP 효소 용해물, 10% v/v의 40wt% 이소-α-산 기질 수용액(Isolone® Isomerized Hop Extract Solution, Kalsec), 및 40 vol% 이소프로판올(IPA) 중 0.02 g/L NADP를 포함한 200 ㎕의 총 부피/웰로 수행하였다. 플레이트를 밀봉하고, 20-24시간 동안 600 rpm으로 진탕시키면서 45℃에서 인큐베이션시켰다.
Figure pct00024
Figure pct00025
실시예 25
높은 기질 로딩 및 낮은 NADP 로딩에서 서열 번호 270, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호 348, 서열 번호 346 및 서열 번호 356의 성능
100 mL의 100 mM, pH 9 인산칼륨 및 10 mM의 MgSO4 중 10 mg의 NADP로 구성된 1 mL의 NADP 스톡 용액에 80 mg의 각 변이체 샘플을 용해시켰다. 스톡 용액을 5회 연속 1:1로 희석하여 NADP 스톡 용액 중 80, 40, 20, 10 및 5 g/L 효소 스톡 용액을 수득하였다. 20 uL 분취량의 스톡 용액을 둥근 바닥 플레이트 중 40 uL의 40wt% ISO 용액 및 40 uL의 IPA에 첨가하여 0.02 g/L의 NADP를 포함하는 20 mM, pH 8 인산칼륨 및 2 mM MgSO4 중 40 vol%의 IPA 중의 160 g/L의 ISO 최종 조성물을 수득하였다. 최종 효소 농도는 각각 16, 8, 4, 2 및 1 g/L였다. 플레이트를 밀봉하고, 600 rpm으로 40℃에서 24시간 동안 진탕기에 놓았다. 24시간 후, 플레이트를 4,000 rpm으로 20℃에서 10분 동안 원심분리하고, 100 ul의 상청액을 딥 웰 플레이트 중 0.1% 아세트산을 포함하는 1 mL의 :1 아세토니트릴/물로 옮겼다. 켄칭된 반응 혼합물을 포함하는 딥 웰 플레이트를 4,000 rpm으로 20℃에서 10분 동안 원심분리하고, 5 uL의 상청액을 표 5-2 및 17-1에 따른 HPLC 분석을 위해 0.1% 아세트산을 포함하는 200 uL의 1:1 아세토니트릴/물로 옮겼다. 도 5를 참조한다.
본 출원에서 인용된 모든 공개문헌, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌들은 각각의 개별 공개문헌, 특허, 특허 출원 또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참조로 포함되는 것으로 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
다양한 구체적인 실시양태가 예시되고 기술되었지만, 본 발명(들)의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이, 다양하게 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CODEXIS, INC. <120> KETOREDUCTASE POLYPEPTIDES AND POLYNUCLEOTIDES <130> CX8-195WO1 <140> <141> 2020-09-24 <150> US 62/906,268 <151> 2019-09-26 <160> 414 <210> 1 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild-Type Kred from Lactobacillus kefir <400> 1 atgaccgatc gtctgaaggg caaagtagcc atcgtaaccg gcgggactct gggtatcggt 60 ttggcaatcg ccgataaatt tgtagaggag ggtgcgaaag tagttattac tggtcgtcac 120 gcggatgtag gtgaaaaggc cgccaaatca atcggcggca ctgatgttat tcgctttgtc 180 cagcacgatg catccgatga agcaggctgg acgaaactgt tcgacaccac cgaggaggca 240 ttcggcccgg ttacgaccgt cgtgaacaat gcagggattg cagtttccaa aagcgttgaa 300 gacactacca cggaggaatg gcgtaaactg ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360 ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420 atgagcagta ttgaggggtt cgtaggcgat ccgacgctgg gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggctat atcaagaccc cgctggtcga tgatctggaa 600 ggtgctgagg aaatgatgtc acagcgtacg aaaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtatacc gcacagtga 759 <210> 2 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild Type Kred from Lactobacillus kefir <400> 2 Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser 85 90 95 Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly 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atctggatgg tgtttttttc 360 ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420 atgagcagta ttctggggct cgtaggcgat ccgacgctgg gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcccc atcaagaccc cgcggctcga tgatctggaa 600 ggttgggagg aaatgatgtc acagcgtacg ttaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtggacc gcacagtga 759 <210> 4 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 4 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Leu Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu 165 170 175 Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys 180 185 190 Thr Pro Arg Leu Asp Asp Leu Glu Gly Trp Glu Glu Met Met Ser Gln 195 200 205 Arg Thr Leu Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala 210 215 220 Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly 225 230 235 240 Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Trp Thr Ala Gln 245 250 <210> 5 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 5 atgaccgatc gtctgaagca taaagtagcc atcgtaaccg gcgggacact gggtatcggt 60 ttggcaatcg ccgataaatt tgtagaggag ggtgcgaaag tagttattac tggtcgtcac 120 gcggatgtag gtgaaaaggc cgccaaatca atcggcggca ctgatgttat tcgctttgtc 180 cagcacgatg cgtccgaaga agcaggctgg acgaaactgt tcgacaccac cgaggaggca 240 ttcggcccgg ttacgaccgt cgtgaacaat gcagggattg gggttattaa aagcgttgaa 300 gacactacca cggaggaatg gcgtaaactg ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360 ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420 atgagcagta ttctggggct cgtaggcgat ccgacgctgg gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcccc atcaagaccc cgcggaagga tgatctggaa 600 ggttgggagg aaatgatgtc acagcgtacg ttaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtggacc gcacag 756 <210> 6 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 6 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly 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ttaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtggacc gcacag 756 <210> 8 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 8 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Leu Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn 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tgtttttttc 360 ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420 atgagcagta ttctggggct cgtaggcgat ccgacgaggg gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcccc atcaagaccc cgcggctcga tgatctggaa 600 ggttgggagg aaatgatgtc acagcgtacg ttaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtggacc gcacag 756 <210> 10 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 10 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr 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kefir <400> 132 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Val Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Ile Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Met Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu 165 170 175 Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys 180 185 190 Thr Pro Arg Lys Asp Asp Leu Glu Gly Trp Glu Glu Met Met Ser Gln 195 200 205 Arg 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Lactobacillus kefir <400> 138 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Ile Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Met Gly Leu Val Gly Asp Pro Leu Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu 165 170 175 Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys 180 185 190 Thr Pro Arg Lys Asp Asp Leu Glu Gly Trp Glu Glu Met Met Ser Gln 195 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Lactobacillus kefir <400> 143 atgaccgatc gtctgaagca taaagtagcc atcgttaccg gcgggacact gggtatcggt 60 ttggcaatcg ccgataaatt tgtagaggag ggtgcgaaag tagttattac tggtcgtcac 120 gcggatgtag gtgaaaaggc cgccaaatca atcggcggca ctgatgttat tcgctttgtc 180 cagcacgatg cgtccgaaga agcaggctgg acgaaactgt tcgacaccac cgaggaggca 240 ttcggcccgg ttacgaccct ggtgaacaat gcagggattg gggttattaa aagcgttgaa 300 gacactacca cggaggaatg gcgtaaaatc ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360 ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420 atgagcagta ttatggggct cgtaggcgat ccgactctgg gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcgct atcaagaccg agcgcaagga tgatctggaa 600 ggttgggagg aaatgatgtc acagcgtacg ttaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtggacc gcacag 756 <210> 144 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 144 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Ile Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Met Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu 165 170 175 Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Ala Ile Lys 180 185 190 Thr Glu Arg Lys Asp Asp Leu Glu Gly Trp Glu Glu Met Met 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of Kred from Lactobacillus kefir <400> 149 atgaccgatc gtctgaagca taaagtagcc atcgttaccg gcgggacaat gggtatcggt 60 ttggcaatcg ccgataaatt tgtagaggag ggtgcgaaag tagttattac tggtcgtcac 120 gcggatgtag gtgaaaaggc cgccaaatca atcggcggca ctgatgttat tcgctttgtc 180 cagcacgatg cgtccgaaga agcaggctgg acgaaactgt tcgacaccac cgaggaggca 240 ttcggcccgg ttacgaccct ggtgaacaat gcagggattg gggttattaa aagcgttgaa 300 gacactacca cggaggaatg gcgtaaaatc ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360 ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420 atgagcagta ttatggggct cgtaggcgat ccgactctgg gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcccc atcaagaccc cgcggaagga tgatctggaa 600 ggttgggagg aaatgatgtc acagcgtacg ttaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtggacc gcacag 756 <210> 150 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 162 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Ile Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Met Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu 165 170 175 Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys 180 185 190 Thr Pro Arg Lys 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catcatcaat 420 atgagctcga tcatggggct cgtaggcgct ccgactgcag gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcgcg atcaagaccc cacggaagga tcagctggaa 600 ggttgggagg aagcaatgtc acagcgtacg ctgaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtggacc gcacag 756 <210> 212 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 212 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Met Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Ala Ser Val Glu Arg 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gggttattaa aagcgttgaa 300 cggactacca cggaggaatg gcgtaaagtt ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360 ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420 atgagcagta ttatggggat ggtaggcgat ccgatgctgg gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcgcg atcaagaccg aacggaagga tcagctggaa 600 ggttgggagg agatgatgtc acagcgtacg ctgaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcgtctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtacacc gcacag 756 <210> 278 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 278 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Met Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala 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of Kred from Lactobacillus kefir <400> 291 atgaccgatc gtctgaagca caaagtagcc atcgtcaccg gcgggacaat gggtatcggt 60 ttggcaatcg ccgataaatt tgtagaggag ggtgcgaaag tagttattac tggtcgtcac 120 gcggatgtag gtctgaaagc cgccaaatca atcggtggca gtgatgttat tcgctttgtc 180 cagcacgatg cgtccgaaga agcaggctgg acgagtctgt tcgacaccac cgaggaggca 240 ttcggcccgg ttacgaccct ggtgaacaat gcagccgagg gcgtcattaa gagcgttgaa 300 cggactacca cggaggaatg gcgtaaagtt ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360 ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420 atgagcagta ttatggggct ggtaggcgct ccgatggcag gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcgcg atcaagaccg agcggaagga tcagctggaa 600 ggttgggagc aggcaatgtc acagcgtacg gcgaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtggacc gcacag 756 <210> 292 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 292 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Met Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Leu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Ser Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Ser Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Leu Val Asn Asn Ala Ala Glu Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Arg Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Val Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Met Gly Leu Val Gly Ala Pro Met Ala Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu 165 170 175 Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Ala Ile Lys 180 185 190 Thr Glu Arg Lys Asp Gln Leu Glu Gly 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Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Arg Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Asp Val Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Met Gly Leu Val Gly Ala Pro Gln Ala Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu 165 170 175 Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Ala Ile Lys 180 185 190 Thr Glu Ser Lys Asp Gln Leu Glu Gly Trp Glu Gln Ala Met Ser Gln 195 200 205 Arg Thr Ala Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala 210 215 220 Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly 225 230 235 240 Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln 245 250 <210> 409 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 409 atgaccgatc gtctgaagca caaagtagcc atcatcaccg gcgggacaat gggtatcggt 60 ttggcaatcg ccgataaatt tgtagaggag ggtgcgaaag tagttattac tggtcgtcac 120 gcggatgtag gtgagaaagc cgccaaatca atcggtggca gtgatgttat tcgctttgtc 180 cagcacgatg cgtccgaaga acgtggctgg acgacgctgt tcgacaccac cgaggaggca 240 ttcggcccgg ttacgaccct ggtgaacaat gcagggattg gggtaattaa gagcgttgaa 300 cggactacca cggaggaatg gcgtgatgtt ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360 ggcacccgtg agggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420 atgagcagta ttatggggct ggtaggcgct ccggccgccg gggcatacaa cgcttccaag 480 ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540 gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcgcg atcaagaccg agtcgaagga tcagctggaa 600 ggttgggagc agctgatgtc acagcgtacg gcgaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtacacc gcacag 756 <210> 410 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 410 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Met Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Ser Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Arg Gly Trp Thr Thr Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Arg Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Asp Val Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Glu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Met Gly Leu Val Gly Ala Pro Ala Ala Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu 165 170 175 Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Ala Ile Lys 180 185 190 Thr Glu Ser Lys Asp Gln Leu Glu Gly Trp Glu Gln Leu Met Ser Gln 195 200 205 Arg Thr Ala Thr 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agtcgaagga tcagctggaa 600 ggttgggagc agctgatgtc acagcgtacg gcgaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660 aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720 gcagaatttg tggtcgacgg cgggtacacc gcacag 756 <210> 412 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Variant of Kred from Lactobacillus kefir <400> 412 Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Met Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Gly Ser Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Glu Arg Gly Trp Thr Thr Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala 65 70 75 80 Phe Gly Pro Val Thr Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile 85 90 95 Lys Ser Val Glu Gln Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Asp Val Leu Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Glu Gly Ile Gln Arg 115 120 125 Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile 130 135 140 Met Gly Leu Val Gly Ala Pro Gln Ala Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu 165 170 175 Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Ala Ile Lys 180 185 190 Thr Glu Ser Lys Asp Gln Leu Glu Gly Trp Glu Gln Leu Met Ser Gln 195 200 205 Arg Thr Ala Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala 210 215 220 Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly 225 230 235 240 Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln 245 250 <210> 413 <211> 4205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJVFabI#2-Bla plasmid sequence <400> 413 aacggctttg ccgcggccct ctcacttccc tgttaagtat cttcctggca tcttccagga 60 aatctccgcc ccgttcgtaa gccatttccg ctcgccgcag tcgaacgacc gagcgtagcg 120 agtcagtgag cgaggaagcg gaatatatcc tgtatcacat attctgctga cgcaccggtg 180 cagccttttt tctcctgcca catgaagcac ttcactgaca ccctcatcag tgaaccaccg 240 ctggtagcgg tggttttttt aggcctatgg cctttttttt ttgtgggaaa cctttcgcgg 300 tatggtatta aagcgcccgg aagagagtca attcagggtg gtgaatgtga aaccagtaac 360 gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa 420 ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct 480 gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc aaacagtcgt tgctgattgg 540 cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc 600 tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcgtcga 660 agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc gtcagtgggc tgatcattaa 720 ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc 780 gttatttctt gatgtctctg accagacacc catcaacagt attattttct cccatgaaga 840 cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt 900 agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct 960 cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg 1020 ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt tccactgcga tgctggttgc 1080 caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg 1140 tgcggacatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac agctcatgtt atatcccgcc 1200 gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct 1260 gcaactctct cagggccagg cggttaaggg caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa 1320 aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 1380 attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cggtacccga 1440 taaaagcggc ttcctgacag gaggccgttt tgtttctcga gttaattaag gcagtgagcg 1500 caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 1560 tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacggcta 1620 tgaccatgat tacggattca ctggccgtcg ttttacaatc tagaggccag cctggccata 1680 aggagatata catatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttctgcggc 1740 attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 1800 tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 1860 gagttttcgc cccgaagagc gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 1920 cgcggtatta tcccgtgttg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 1980 tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 2040 agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 2100 tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgttttt ttgcacacca tgggggatca 2160 tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 2220 tgacaccacg atgcctacag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 2280 acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 2340 accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 2400 tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 2460 cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgtaata gacagatcgc 2520 tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gggccaaact ggccaccatc accatcacca 2580 ttagggaaga gcagatgggc aagcttgacc tgtgaagtga aaaatggcgc acattgtgcg 2640 acattttttt ttgaattcta cgtaaaaagc agccgataca tcggctgctt tttttttctg 2700 cagggtgaaa caaaacggtt gaccacatga agtaaacacg gtacggtgcg gtagtttatc 2760 acagttaaat tgctaacgca gtcaggcaaa gtccatgggt tttctttccg gtaagcgcat 2820 tctggtaacc ggtgttgcca gcaaactatc catcgcctac ggtatcgctc aggcgatgca 2880 ccgcgaagga gctgaactgg cattcaccta ccagaacgac aaactgaaag gccgcgtaga 2940 agaatttgcc gctcaattgg gttctgacat cgttctgcag tgcgatgttg cagaagatgc 3000 cagcatcgac accatgttcg ctgaactggg gaaagtttgg ccgaaatttg acggttttgt 3060 acactctatt gtttttgcac ctggcgatca gctggatggt gactatgtta acgccgttac 3120 ccgtgaaggc ttcaaaattg cccacgacat cagctcctac agcttcgttg caatggcaaa 3180 agcttgccgc tccatgctga atccgggttc tgccctgctg accctttcct accttggcgc 3240 tgagcgcgct atcccgaact acaacgttat gggtctggca aaagcgtctc tggaagcgaa 3300 cgtgcgctat atggcgaacg cgatgggtcc ggaaggtgtg cgtgttaacg ccatctctgc 3360 tggtccgatc cgtactctgg cggcctccgg tatcaaagac ttccgcaaaa tgctggctca 3420 ttgcgaagcc gttaccccga ttcgccgtac cgttactatt gaagatgtgg gtaactctgc 3480 ggcattcctg tgctccgatc tctctgccgg tatctccggt gaagtggtcc acgttgacgg 3540 cggtttcagc attgctgcaa tgaacgaact cgaactgaaa taactgcagg agctcaaaca 3600 gcagcctgta ttcaggctgc tttttagaaa tattttatct gattaataag atgatcttct 3660 tgagatcgtt ttggtctgcg cgtattctct tgctctgaaa acgaaaaaac cgccttgcag 3720 ggcggttttt cgaaggttct ctgagctacc aactctttga accgaggtaa ctggcttgga 3780 ggagcgcagt caccaaaact tgtcctttca gtttagcctt aaccggcgca tgacttcaag 3840 actaactcct ctaaatcaat taccagtggc tgctgccagt ggtgcttttg catgtctttc 3900 cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcggact gaacgggggg 3960 ttcgtgcata cagtccagct tggagcgaac tgcctacccg gaactgagtg tcaggcgtgg 4020 aatgagacaa acgcggccat aacagcggaa tgacaccggt aaaccgaaag gcaggaacag 4080 gagagcgcac gagggagccg ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 4140 ttcgccacca ctgatttgag cgtcagattt cgtgatgctt gtcagggggg cggagcctat 4200 ggaaa 4205 <210> 414 <211> 4205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJVFabI#5-Bla plasmid sequence <400> 414 aacggctttg ccgcggccct ctcacttccc tgttaagtat cttcctggca tcttccagga 60 aatctccgcc ccgttcgtaa gccatttccg ctcgccgcag tcgaacgacc gagcgtagcg 120 agtcagtgag cgaggaagcg gaatatatcc tgtatcacat attctgctga cgcaccggtg 180 cagccttttt tctcctgcca catgaagcac ttcactgaca ccctcatcag tgaaccaccg 240 ctggtagcgg tggttttttt aggcctatgg cctttttttt ttgtgggaaa cctttcgcgg 300 tatggtatta aagcgcccgg aagagagtca attcagggtg gtgaatgtga aaccagtaac 360 gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa 420 ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct 480 gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc aaacagtcgt tgctgattgg 540 cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc 600 tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcgtcga 660 agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc gtcagtgggc tgatcattaa 720 ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc 780 gttatttctt gatgtctctg accagacacc catcaacagt attattttct cccatgaaga 840 cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt 900 agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct 960 cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg 1020 ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt tccactgcga tgctggttgc 1080 caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg 1140 tgcggacatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac agctcatgtt atatcccgcc 1200 gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct 1260 gcaactctct cagggccagg cggttaaggg caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa 1320 aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 1380 attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cggtacccga 1440 taaaagcggc ttcctgacag gaggccgttt tgtttctcga gttaattaag gcagtgagcg 1500 caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 1560 tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacggcta 1620 tgaccatgat tacggattca ctggccgtcg ttttacaatc tagaggccag cctggccata 1680 aggagatata catatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttctgcggc 1740 attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 1800 tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 1860 gagttttcgc cccgaagagc gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 1920 cgcggtatta tcccgtgttg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 1980 tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 2040 agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 2100 tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgttttt ttgcacacca tgggggatca 2160 tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 2220 tgacaccacg atgcctacag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 2280 acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 2340 accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 2400 tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 2460 cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgtaata gacagatcgc 2520 tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gggccaaact ggccaccatc accatcacca 2580 ttagggaaga gcagatgggc aagcttgacc tgtgaagtga aaaatggcgc acattgtgcg 2640 acattttttt ttgaattcta cgtaaaaagc agccgataca tcggctgctt tttttttctg 2700 cagggtgaaa caaaacggtt gactacatga agtaaacacg gtacggtgcg gtagtttatc 2760 acagttaaat tgctaacgca gtcaggcaaa gtccatgggt tttctttccg gtaagcgcat 2820 tctggtaacc ggtgttgcca gcaaactatc catcgcctac ggtatcgctc aggcgatgca 2880 ccgcgaagga gctgaactgg cattcaccta ccagaacgac aaactgaaag gccgcgtaga 2940 agaatttgcc gctcaattgg gttctgacat cgttctgcag tgcgatgttg cagaagatgc 3000 cagcatcgac accatgttcg ctgaactggg gaaagtttgg ccgaaatttg acggttttgt 3060 acactctatt gtttttgcac ctggcgatca gctggatggt gactatgtta acgccgttac 3120 ccgtgaaggc ttcaaaattg cccacgacat cagctcctac agcttcgttg caatggcaaa 3180 agcttgccgc tccatgctga atccgggttc tgccctgctg accctttcct accttggcgc 3240 tgagcgcgct atcccgaact acaacgttat gggtctggca aaagcgtctc tggaagcgaa 3300 cgtgcgctat atggcgaacg cgatgggtcc ggaaggtgtg cgtgttaacg ccatctctgc 3360 tggtccgatc cgtactctgg cggcctccgg tatcaaagac ttccgcaaaa tgctggctca 3420 ttgcgaagcc gttaccccga ttcgccgtac cgttactatt gaagatgtgg gtaactctgc 3480 ggcattcctg tgctccgatc tctctgccgg tatctccggt gaagtggtcc acgttgacgg 3540 cggtttcagc attgctgcaa tgaacgaact cgaactgaaa taactgcagg agctcaaaca 3600 gcagcctgta ttcaggctgc tttttagaaa tattttatct gattaataag atgatcttct 3660 tgagatcgtt ttggtctgcg cgtaatctct tgctctgaaa acgaaaaaac cgccttgcag 3720 ggcggttttt cgaaggttct ctgagctacc aactctttga accgaggtaa ctggcttgga 3780 ggagcgcagt caccaaaact tgtcctttca gtttagcctt aaccggcgca tgacttcaag 3840 actaactcct ctaaatcaat taccagtggc tgctgccagt ggtgcttttg catgtctttc 3900 cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcggact gaacgggggg 3960 ttcgtgcata cagtccagct tggagcgaac tgcctacccg gaactgagtg tcaggcgtgg 4020 aatgagacaa acgcggccat aacagcggaa tgacaccggt aaaccgaaag gcaggaacag 4080 gagagcgcac gagggagccg ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 4140 ttcgccacca ctgatttgag cgtcagattt cgtgatgctt gtcagggggg cggagcctat 4200 ggaaa 4205

Claims (37)

  1. 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  2. 서열 번호 4와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 위치 12, 21, 87, 93, 97, 110, 145, 148, 152, 153, 194, 196, 197, 200, 206, 212, 및 226으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 4를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  3. 서열 번호 6과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 12/110/145/152, 12/145, 87/110/145, 87/110/145/194, 87/145/194, 110, 110/145/152/197, 110/145/194, 145, 145/152, 145/197/226, 및 152로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 6을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  4. 서열 번호 80과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 17, 21, 46, 56, 72, 79, 95, 101, 110, 152, 162, 190, 198, 210, 211, 및 227로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 80을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  5. 서열 번호 80과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 17, 79, 157, 159, 190/191/194, 190/194, 191/194, 194, 198, 및 211로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 80을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  6. 서열 번호 104와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 17/46/190, 17/46/198/211, 17/96/194/198, 17/190/198, 46/190/194/198, 및 46/194/198로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 104를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  7. 서열 번호 172와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 45, 101, 179, 194, 204, 226, 및 231로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 172를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  8. 서열 번호 186과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 95/96/97/150/153/205, 95/96/150/153/205/206/211/249, 95/97/143/145/150/153/202/205, 95/97/143/145/150/153/249, 95/97/150/153, 95/97/150/153/202/205/206, 95/150/153/205/206/211, 95/150/153/205/211, 95/150/153/206/249, 96/150/153, 96/150/153/206, 97/150/153, 97/150/153/205, 97/150/153/205/211, 97/150/153/206, 143/144/145/150/153/202/205/249, 143/145/150/153, 144/145/150/153/205/206, 144/150/153, 144/150/153/202/205/206, 145/150/153/206/249, 145/153/211, 150/153/202/206/249, 150/153/205/211, 150/153/206/211, 150/153/211, 및 150/153/249로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 186을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  9. 서열 번호 186과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 7/147, 103/147, 110, 110/179/194, 147, 및 249로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 186을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  10. 서열 번호 194와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 7/12/54/110/150/153/194/205/211/249, 12/54/72/110/150/152/153/194/205/211/249, 12/72/101/103/110/152/249, 12/72/110/147/152/204, 45/54/72/110/152/194/204, 72/110/147/150/152/153/194/205/211/249, 및 110/150/153/179/194/205/211/249로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 194를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  11. 서열 번호 252와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 7/12/54/179/249, 7/152, 12/54/72/152/179/249, 40, 54/72, 72/147/152/179/249, 및 249로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 252를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  12. 서열 번호 270과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 92/93, 150/152, 150/152/153, 및 194/195로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 270을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  13. 서열 번호 272와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 92/93/95, 93, 93/95, 93/95/109, 93/95/109/114, 93/95/114, 93/109/114, 및 114로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 272를 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  14. 서열 번호 286과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 12/45/72/109/249, 12/45/93/249, 12/45/249, 12/109/249, 45/72/249, 45/109/249, 45/249, 96, 및 145/150으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 286을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  15. 서열 번호 328과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 150, 150/151, 150/195, 및 195로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 328을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  16. 서열 번호 330과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 12/72/109/195, 17/73/200, 17/115, 68/72/101/152/205, 68/72/124, 68/72/124/152, 68/101/124/152/205, 68/124/205, 72/109/152/195, 72/109/195, 72/152, 72/152/195, 72/195, 73, 73/147, 79, 93, 93/95/145/195, 93/109/114/145/195, 93/195, 95/195, 96/108/147/200, 96/194/200, 101/205, 145/195, 147, 147/200, 192, 194, 194/200, 195, 198, 및 200으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 갖는 조작된 케토리덕타아제 변이체로서, 여기서, 상기 위치는 서열 번호 330을 기준으로 넘버링된 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 4, 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 6, 80, 104, 172, 186, 194, 252, 270, 272, 286, 328, 및/또는 330에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 케토리덕타아제가 표 5-1, 6-1, 7-1, 8-1, 10-1, 11-1, 16-1, 17-2, 18-1, 19-1, 19-2, 20-1, 20-2, 21-1, 22-1 및/또는 24-1에 제공된 변이체를 코딩하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 케토리덕타아제가 서열 번호 6 내지 412에 기재된 짝수 번호의 서열로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  22. 제1항에 있어서, 조작된 케토리덕타아제 폴리펩티드가 하나 이상의 이소-α-산 기질을 하나 이상의 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  23. 제1항에 있어서, 서열 번호 4의 기준 폴리펩티드의 활성의 적어도 10배로 하나 이상의 이소-α-산 기질을 하나 이상의 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산 생성물로 전환시킬 수 있는 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 케토리덕타아제가 서열 번호 4의 케토리덕타아제와 비교하여 개선된 특성을 포함하는 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  25. 제24항에 있어서, 개선된 특성이 서열 번호 4의 케토리덕타아제와 비교하여 이소-α-산을 상응하는 디하이드로-(rho)-이소-α-산으로 전환시키는 개선된 활성을 포함하는 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  26. 제24항에 있어서, 개선된 특성이 서열 번호 4의 케토리덕타아제와 비교하여 높은 기질 농도에서의 개선된 활성을 포함하는 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  27. 제24항에 있어서, 개선된 특성이 서열 번호 4의 케토리덕타아제와 비교하여 낮은 보조인자 농도에서의 개선된 활성을 포함하는 것인 조작된 케토리덕타아제 변이체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 조작된 케토리덕타아제 변이체를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드 서열.
  29. 제28항에 있어서, 상기 서열이 서열 번호 5 내지 411에 기재된 홀수 번호의 서열로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조작된 폴리뉴클레오티드 서열.
  30. 제28항 및/또는 제29항의 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 적어도 하나의 제어 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  32. 제30항 및/또는 제31항에 있어서, 상기 벡터가 서열 번호 413 또는 414를 포함하는 것인 벡터.
  33. 제30항, 제31항, 및/또는 제32항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  34. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 조작된 케토리덕타아제 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 조적된 케토리덕타아제 변이체가 제33항의 상기 숙주 세포에 의해 생산되는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 숙주 세포에 의해 생산된 상기 조작된 케토리덕타아제 변이체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제34항 및/또는 제35항에 있어서, 조작된 케토리덕타아제 변이체가 서열 번호 413 및/또는 414의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 의해 생산되는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에서 제공된 적어도 하나의 조작된 케토리덕타아제 변이체를 포함하는 조성물.
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