BR112021005632A2 - mutantes que metabolizam a maltotriose de saccharomyces eubayanus - Google Patents

Abstract

A invenção se refere a um mutante de Saccharomyces eubayanus que é capaz de fermentar maltotriose e ao uso desse mutante para a produção de levedura híbrida e da levedura híbrida resultante. A invenção se refere a métodos de produção de um produto de cerveja fermentado, empregando o referido mutante e / ou a referida levedura híbrida.

Description

MUTANTES QUE METABOLIZAM A MALTOTRIOSE DE SACCHAROMYCES EUBAYANUS CAMPO DE INVENÇÃO

[001] A invenção se refere ao campo da microbiologia, em particular, à produção de novas leveduras e híbridos de leveduras. A invenção também se refere ao uso dessas leveduras e híbridos de leveduras para a produção de um produto fermentado de cerveja, de preferência, cerveja.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Saccharomyces eubayanus foi descoberta na Patagônia e identificado como espécie parental não-S. cerevisiae de híbridos de S. pastorianus de fabricação de cerveja do tipo lager (Libkind et al., 2011. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 14539-44; Sampaio, 2018. Microbiology 164: 1069-71). Embora S. eubayanus tenha sido isolada apenas da natureza (Peris et al., 2014. Mol Ecol 23: 2031-45; Bing et al., 2014. Curr Biol 24: R380-R1; Gayevskiy e Goddard, 2016. Environ Microbiol 18: 1137-47), S. cerevisiae está fortemente associada à biotecnologia humana, nomeadamente para fermentação de massa, fabricação de cerveja e fermentação de vinho (Dequin, 2001. Appl Environ Microbiol 56: 577-88). A fabricação da cerveja é realizada no mosto, um meio complexo contendo uma mistura de açúcar fermentável de 60% de maltose, 25% de maltotriose e 15% de glicose (Zastrow et al., 2001. J Ind Microbiol Biotechnol 27: 34-8). Enquanto a maioria das cepas de S. cerevisiae são capazes de utilizar todos os três açúcares efetivamente, as cepas de S. eubayanus são capazes de utilizar glicose e maltose, mas não maltotriose (Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005;

Brickwedde et al., 2018. Front Microbiol 9: 1786; Gallone et al., 2016. Cell 166: 1397-410 e16). Na S. cerevisiae, a capacidade de utilizar maltose e maltotriose está associada aos loci MAL: agrupamentos de genes que estão presentes em até cinco cromossomos diferentes dentro de cepas de S. cerevisiae (Naumov et al., 1994. Genetics 136: 803-12). Os loci MAL são compostos por três genes: ScMALx1 que codifica um simportador de prótons de maltose, ScMALx2 que codifica uma α-glucosidase que hidrolisa açúcares em glicose e ScMALx3 que codifica um regulador induzindo a expressão de ScMALx1 e ScMALx2 na presença de maltose (Charron et al., 1989. Genetics122: 307-16). Embora ScMALx1 também possa transportar outros dissacarídeos, como turanose e sacarose (Marques et al., 2017. FEMS Yeast Res 17: fox006; Chang et al., 1989. J Bacteriol 171: 6148-54), eles são incapazes de importar o trissacarídeo maltotriose (Alves et al., 2008. Appl Environ Microbiol 74: 1494-501).

[003] No entanto, o locus MAL1 localizado no cromossomo VII contém o gene ScAGT1 que codifica um transportador diferente que tem apenas 57% de identidade com os genes do transportador ScMALx1 (Han et al., 1995. Mol Microbiol 17: 1093-107). ScAgt1 é um amplo simportador de prótons de especificidade de substrato que permite a absorção de maltotriose (Alves et al., 2008. Appl Environ Microbiol 74: 1494-501; Stambuk et al., 1999. FEMS Microbiol Lett 170: 105-10). A capacidade de S. eubayanus para utilizar maltose é consistente com a presença de quatro transportadores com alta homologia com os genes ScMALx1: SeMALT1, SeMAL2, SeMALT3 e SeMALT4 (Baker et al., 2015. Mol Biol Evol 32: 2818-31).

A deleção desses genes na cepa do tipo S. eubayanus CBS 12357 indicou que ela depende da expressão de SeMALT2 e SeMALT4 para o transporte de maltose (Brickwedde et al., 2018. Front Microbiol 9: 1786). SeMALT1 e SeMALT3 foram mal expressos na presença de maltose, supostamente devido à incompletude dos loci MAL que os abrigam. No entanto, nenhum homólogo de ScAGT1 foi encontrado no genoma do tipo cepa CBS 12357, e nem CBS 12357, nem qualquer cepa derivada dele em que os genes SeMALT foram superexpressos, foram capazes de utilizar maltotriose (Brickwedde et al., 2018. Front Microbiol 9 : 1786).

[004] A fim de reconstruir o suposto ancestral híbrido de S. pastorianus, S. cerevisiae e S. Eubayanus, cepas foram cruzadas. Híbridos de S. cerevisiae x eubayanus feitos em laboratório combinaram a capacidade fermentativa e a utilização de açúcar de S. cerevisiae com a capacidade de crescer em baixas temperaturas de S. eubayanus (Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005; Krogerus et al., 2015. J Ind Microbiol Biotechnol 42: 769-78; Mertens et al., 2015. Appl Environ Microbiol 81: 8202-14). Muito provavelmente, a utilização da maltotriose foi devido ao gene ScAGT1 no genoma parental de S. cerevisiae. Paradoxalmente, a capacidade de utilizar maltotriose de isolados de S. pastorianus não se deve ao ScAGT1, pois esse gene está truncado (Vidgren et al., 2009. Appl Environ Microbiol 75: 2333-45). Em vez disso, a utilização da maltotriose foi associada a dois genes específicos para S. pastorianus: SpMTY1 e SeAGT1. O gene SpMTY1 foi encontrado em várias cepas de S. pastorianus, compartilha 90% de identidade de sequência com os genes

ScMALx1 e possibilitou o transporte da maltotriose, mesmo com maior afinidade do que para a maltose (Salema-Oom et a.,

2005. Appl Environ Microbiol 71: 5044-9 ; Dietvorst et al.,

2005. Yeast 22: 775-88). Curiosamente, SpMTY1 mostrou similaridade de sequência com genes SeMALT (Cousseau et al.,

2013. Lett Appl Microbiol 56: 21-9; Nguyen et al., 2011. PLoS One 6: e25821). SeAGT1 compartilha 85% de identidade de sequência com ScAGT1, mas foi encontrada no cromossomo VIII- XV de S. eubayanus (Nakao et al., 2009. DNA Res 16: 115-29). De acordo com sua alta similaridade de sequência, SeAgt1 exibe propriedades de transporte semelhantes a ScAgt1 e também permitiu a importação de maltotriose de alta afinidade (Vidgren e Londesborough, 2012. J Inst Brew 118: 148-51). Apesar de sua presença no genoma de S. pastorianus, os transportadores de maltotriose SpMty1 e SeAgt1 não foram encontrados durante o sequenciamento do genoma da cepa do tipo CBS 12357 de S. eubayanus. Embora esses transportadores de maltotriose possam estar presentes em cepas mais relacionadas ao ancestral de S. eubayanus de S. pastorianus do que CBS 12357 (Bing et al., 2014. Curr Biol 24: R380-1), eles também podem ter evoluído durante a domesticação de S. pastorianus no ambiente de fabricação de cerveja lager.

[005] Independentemente da origem dos transportadores de maltotriose de S. eubayanus em S. pastorianus, a utilização eficiente da maltotriose é crítica para a fabricação de cerveja lager. Atualmente, uma extensa pesquisa é realizada para a formação de novos híbridos de S. cerevisiae x eubayanus para a fabricação de cerveja lager industrial (Krogerus et al., 2017. Appl Environ Microbiol

101: 65-78) e a própria S. eubayanus também é usada para a fabricação de cerveja (Brickwedde et al., 2018. Front Microbiol 9: 1786). Nesse contexto, a incapacidade de utilizar a maltotriose não é benéfica para seu desempenho industrial, uma vez que a maltotriose residual influencia o perfil de sabor e doçura da cerveja, e os rendimentos de etanol concomitantemente mais baixos podem limitar a lucratividade do processo (Zheng et al., 1994. J Am Soc Brew Chem 52: 41-7). No entanto, embora uma cepa de S. eubayanus que utiliza maltotriose seja valiosa para a indústria cervejeira, ela não deve ser construída por edição de genoma direcionada, devido à baixa aceitação de organismos geneticamente modificados pelos clientes (Varzakas et al.,

2007. Crit Rev Food Sci Nutr 47: 335-61). A evolução laboratorial é um método não OGM comumente usado para obter as propriedades desejadas por crescimento prolongado e seleção sob condições que favorecem as células que desenvolvem o fenótipo desejado (Mans et al., 2018. Curr Opin Biotechnol 50: 47-56). Em leveduras Saccharomyces, as propriedades selecionáveis incluem fenótipos complexos e diversos, como tolerância a altas temperaturas, utilização eficiente de nutrientes e tolerância a inibidores (Yona et al., 2012. Proc Natl Acad Sci USA 109: 21010-5; Gresham et al., 2008. PLoS Genet 4: e1000303; González-Ramos et al.,

2016. Biotechnol Biofuels 9: 173; Caspeta et al., 2014. Science 346: 75-8). A evolução do laboratório foi aplicada com sucesso para melhorar a utilização de açúcar para arabinose, galactose, glicose e xilose (Gresham et al., 2008. PLoS Genet 4: e1000303, Papapetridis et al., 2018. FEMS Yeast

Res 18: foy056; Verhoeven et al., 2018. FEMS Yeast Res 18: doi: 10.1093 / femsyr / foy062; Hong et al., 2011. Proc Natl Acad Sci USA 108: 12179-84). Em S. pastorianus, a absorção de maltotriose foi melhorada com sucesso através da realização de cultivos quimiostáticos em meio enriquecido com maltotriose (Brickwedde et al., 2017. Front Microbiol 8: 1690).

[006] Há, portanto, a necessidade de uma cepa de S. eubayanus que utiliza maltotriose que não seja construída por edição de genoma direcionada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Neste estudo, cepa S. eubayanus tipo CBS 12357 foi submetida à mutagênese UV e evolução laboratorial sob condições selecionadas pela capacidade de utilizar maltotriose. Como a CBS 12357 é completamente incapaz de crescer em maltotriose, os mutantes mutagenizados por UV foram introduzidos em frascos de agitação aeróbia com meio sintético com maltotriose como única fonte de carbono. Quando o crescimento foi observado, lotes sequenciais aeróbicos foram realizados nas mesmas condições até que o crescimento fosse rápido e consistente. No entanto, os mutantes resultantes não consumiram nenhuma maltotriose quando cultivados em mosto de cerveja industrial. Portanto, os mutantes resultantes foram posteriormente desenvolvidos durante um quimiostato anaeróbico em mosto de fermentação enriquecido com maltotriose. Os mutantes resultantes foram caracterizados em mosto industrial. Os genomas de mutantes que utilizam maltotriose foram sequenciados usando sequenciamento de leitura curta e longa e mutações incluindo

SNPs, INDELs e recombinações de cromossomos foram identificadas. A introdução de supostas mutações causais restaurou com sucesso a utilização da maltotriose na cepa CBS 12357 não evoluída. Como S. eubayanus é usada na fabricação de cerveja lager industrial, o desempenho industrial do mutante não-OGM evoluído foi avaliado em condições industriais.

[008] A invenção, portanto, fornece uma levedura Saccharomyces mutante que é capaz de fermentar a maltotriose. A referida levedura Saccharomyces mutante, de preferência, é uma levedura S. cerevisiae, S. uvarum, S. bayanus ou S. eubayanus mutante. A referida levedura Saccharomyces mutante compreende preferencialmente um gene transportador quimérico, de preferência, um gene transportador de maltose quimérico, em que parte de uma primeira sequência de gene codificante é translocada adjacente a parte de uma segunda sequência de gene codificante, de modo que a proteína quimérica produzida abriga parte do referido primeiro produto gênico e parte do referido segundo produto gênico. A referida levedura Saccharomyces mutante compreende, preferencialmente, elementos de sequência ou partes de genes de SeMALT1, SeMALT2, SeMALT3 e / ou SeMALT4, preferencialmente, de SeMALT4 / SeMALT1 / SeMALT2 ou SeMALT4 / SeMALT3. Uma levedura Saccharomyces eubayanus mutante que é capaz de fermentar maltotriose compreende, preferencialmente, um gene transportador de maltose quimérico em que parte de uma primeira sequência de gene codificante é translocada adjacente a parte de uma segunda sequência de gene codificante, de modo que a proteína quimérica produzida abriga parte do referido primeiro procuto gênico e parte do referido segundo produto gênico.

[009] Em uma concretização, a referida levedura Saccharomyces é uma levedura S. eubayanus mutante, tendo um gene transportador de maltose quimérico compreendendo os nucleotídeos 1-434 de SeMALT4, nucleotídeos 430-1122 de SeMALT1, nucleotídeos 1113-1145 de SeMALT2 ou SeMALT4 e nucleotídeos 1141-1842 de SeMALT3, conforme ilustrado na Figura 3C. A referida levedura mutante de S. Eubayanus, preferencialmente, tem uma atividade de descarboxilação reduzida de ácidos fenólicos, preferencialmente, não está produzindo 4-vinil guaiacol.

[0010] A invenção fornece ainda um método para a produção de uma levedura híbrida, compreendendo a) fornecer a levedura S. eubayanus mutante da invenção como um primeiro progenitor e uma segunda levedura como um segundo progenitor, em que o referido segundo progenitor difere do primeiro progenitor, b ) hibridizar células do primeiro progenitor com células do segundo progenitor e c) identificar um organismo híbrido resultante. O referido segundo progenitor é uma levedura do complexo Saccharomyces sensu stricto.

[0011] Em um método preferido da invenção, as células do primeiro e / ou segundo progenitor são marcadas com um corante fluorescente, antes de hibridizar as células. Em outro método preferido, a hibridização é realizada a uma temperatura que é pelo menos 5° C abaixo da temperatura de crescimento ideal do primeiro e / ou do segundo progenitor.

[0012] A invenção fornece ainda uma levedura híbrida, produzida por um método para a produção de uma levedura híbrida, de acordo com a invenção. A referida levedura híbrida compreende um gene transportador de maltose quimérico, em que parte de uma primeira sequência de gene codificante é translocada adjacente a parte de uma segunda sequência de gene codificante, de modo que a proteína quimérica produzida abriga parte do referido primeiro produto gênico e parte do referido segundo produto gênico.

[0013] A invenção fornece ainda um método de produção de um produto de cerveja fermentado, compreendendo as etapas de adição de uma levedura fermentativa, de acordo com a invenção em um mosto e, pelo menos, fermentar parcialmente o referido mosto para produzir um produto de cerveja fermentado.

[0014] A referida levedura fermentativa compreende, preferencialmente, uma mutação resultando na inativação de pelo menos um dos genes PAD1 e FDC1 e / ou inativação de um gene que codifica uma proteína envolvida na absorção de um ácido fenólico, preferencialmente, ácido ferúlico, ou envolvida na exportação de um descarboxilado composto fenólico, preferencialmente 4-vinil guaiacol.

[0015] A referida cerveja fermentada produzida preferencialmente é cerveja, preferencialmente, uma cerveja lager.

[0016] Em um método preferido de produção de um produto fermentado de cerveja, o teor de álcool do produto fermentado de cerveja é reduzido após a fermentação, de preferência, por evaporação de retificação.

[0017] A invenção fornece ainda um produto de cerveja fermentado que é produzido pelos métodos da invenção.

[0018] A invenção fornece ainda a utilização de uma levedura Saccharomyces mutante, de acordo com a invenção para a produção de uma levedura híbrida.

[0019] A invenção fornece ainda a utilização de uma levedura Saccharomyces mutante ou de uma levedura híbrida, de acordo com a invenção para a produção de um produto fermentado de cerveja, preferencialmente, uma cerveja, mais preferencialmente, cerveja lager.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0020] A Figura 1 mostra uma visão geral esquemática do processo para desenvolver a utilização industrial relevante da maltotriose em S. eubayanus CBS 12357. As células esporuladas de S. eubayanus foram irradiadas com UV para gerar novos fenótipos. O grupo de mutantes foi enriquecido para células consumidoras de maltotriose por crescimento em SM com maltotriose como única fonte de carbono. A partir da cultura enriquecida, isolados de colônia única foram feitos usando FACS que foram subsequentemente selecionados para alta OD660 em placas de microtitulação. Para melhorar os isolados obtidos para o consumo de maltotriose sob condições industriais relevantes, 7 mutantes foram agrupados e evoluíram em um quimiostato anaeróbio com limitação de carbono em mosto industrial modificado enriquecido com maltotriose adicional. Após a evolução, isolados de colônia única foram gerados usando FACS e caracterizados em condições industriais relevantes. Mutantes evoluídos bem-sucedidos foram sequenciados em todo o genoma e as translocações resultantes foram submetidas a engenharia reversa por superexpressão de SeMALT413 em CBS 12357.

Finalmente, para demonstrar aplicabilidade e relevância industrial, o mutante evoluído foi testado em escala piloto industrial.

[0021] A Figura 2 mostra a mutagênese e evolução para obtenção de maltotriose consumindo S. eubayanus. (A) Caracterização de S. pastorianus CBS 1483 (), S. eubayanus CBS 12357 () e IMS0637 () em SMMt a 20° C. Os dados para IMS0637 são representativos para os outros mutantes IMS0638- IMS0643. A concentração média de maltotriose () e o desvio médio foram determinados a partir de duas repetições. (B) Caracterização de S. pastorianus CBS 1483 (preto), S. eubayanus CBS 12357 (branco) e IMS0637 (cinza) em mosto a 20° C. As concentrações de () glicose, () maltose e () maltotriose foram medidas a partir de medições biológicas únicas. (C) Concentração residual de maltotriose no fluxo durante a evolução laboratorial das cepas IMS0637-IMS0643 em um quimiostato anaeróbico a 20° C em mosto enriquecido com maltotriose. As concentrações de () glicose, () maltose e () maltotriose foram medidas por HPLC. O quimiostato foi reiniciado após uma falha técnica (linha pontilhada). (D) Caracterização de S. pastorianus CBS 1483 (preto), S. eubayanus CBS 12357 (branco), IMS0750 (cinza escuro) e IMS0752 (cinza claro) no mosto a 12° C em garrafas microaeróbicas de 250 mL. A concentração média e o desvio padrão de () glicose, () maltose e () maltotriose foram determinados a partir de três repetições biológicas.

[0022] A Figura 3 mostra a identificação de mutações na cepa mutagenizada IMS0637 e na cepa evoluída IMS0750. (A) Diagrama de Venn das mutações encontradas em IMS0637 mutagenizado por UV e IMS0750 evoluído em relação ao CBS 12357 de tipo selvagem.

Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), pequenas inserções e deleções (INDELs) e variação do número de cópias (CNV) são indicados como detectados por Pilon . (B) Estruturas cromossômicas recombinadas em IMS0637 e IMS0750, conforme detectado por sequenciamento do genoma inteiro usando a tecnologia MinION e montagem do genoma de novo.

Os primeiros 15.000 nucleotídeos do braço esquerdo de CHRII e CHRXVI são representados esquematicamente.

A origem da sequência é indicada em preto para CHRII, marcada para CHRVIII, cinza claro para CHRXIII e cinza escuro para CHRXVI.

Além disso, os genes do transportador SeMALT presentes na sequência são indicados por setas.

Enquanto a recombinação de CHRII e CHRVIII estava presente em IMS0637 e IMS0750, a recombinação de ambas as cópias de CHRXVI foi encontrada apenas em IMS0750, mas não em IMS0637. A recombinação em CHRXVI criou o transportador quimérico SeMALT413. (C) Visão geral da similaridade de sequência dos 1842 nucleotídeos de SeMALT413 em relação a SeMALT1, SeMALT3 e SeMALT4. Os quadros de leitura aberta dos genes foram alinhados e regiões com identidade de sequência de 100% foram identificadas.

Para regiões nas quais a identidade de sequência era inferior a 100%, a identidade de sequência real é indicada para cada gene SeMALT.

A origem da sequência é indicada em preto para CHRII, marcada para CHRVIII, cinza claro para CHRXIII e cinza escuro para CHRXVI. (D) Predição da estrutura da proteína de SeMalt413 com no lado esquerdo uma visão transmembrana e à direita uma visão do canal de transporte.

Domínios originados de transportadores SeMalt de S. eubayanus são indicados pelas cores cinza escuro (SeMalt4 cromossomo XVI), preto (SeMalt1 cromossomo II) e cinza claro (SeMalt3 cromossomo XIII).

[0023] A Figura 4 mostra a engenharia reversa de SeMALT413 em CBS 12357 e caracterização da funcionalidade do transportador em SM. (A) Representação do complexo de gRNA CRISPR-Cas9 (após autoclivagem da ribozima 5' de cabeça de martelo e uma ribozima do vírus da hepatite-δ 3' do gRNA expresso) ligado ao locus SeSGA1 em CBS 12357. Fragmento de reparo com cassete transportador ScTEF1p-SeMALT413-ScCYC1t foi amplificado a partir de pUD814 (SeMALT413) com os iniciadores 13559/13560 e contém saliências com o locus SeSGA1 para recombinação. SeSGA1 foi substituído pelo cassete ScTEF1p-SeMALT413-ScCYC1t. Os transformantes corretos foram verificados usando os iniciadores 12635/12636 a montante e a jusante do locus SeSGA1. As cepas foram validadas usando sequenciamento de Sanger. (B, C, D) ) IMX1941, Caracterização de () CBS 12357, () IMS0750, ( () IMX1942 em glicose SM (B), maltose (C) e maltotriose (D). As cepas foram cultivadas a 20° C e o sobrenadante da cultura foi medido por HPLC. Os dados representam a média e o desvio padrão de três réplicas biológicas.

[0024] A Figura 5 mostra perfis de metabólitos extracelulares das cepas de S. eubayanus CBS 12357 (preto) e IMS0750 (branco) em mosto de alta gravidade (17 ºP) em escala piloto de 7 L. (A) Consumo de açúcares e produção de etanol. Os dados de evolução dos açúcares expressos em % (m / v) são representados como segue: glicose (), maltose (), maltotriose (). Os perfis de produção de etanol expressos em% (v / v) são representados por ().

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0025] O termo "produto fermentado de cerveja", tal como aqui utilizado, se refere a um produto de cerveja que é produzido por fermentação de, por exemplo, safras e produtos derivados, como grãos, arroz, uvas e outras frutas, nozes e / ou exsudações de, por exemplo, agave, iúca e cacto.

[0026] O termo "produto fermentado de cerveja com teor reduzido de álcool", tal como aqui utilizado, se refere a um produto de cerveja fermentado com um nível reduzido de etanol, quando comparado a um produto de cerveja fermentado normal correspondente, por exemplo, uma cerveja com teor reduzido de álcool compreende, preferencialmente, menos de 5% em volume, como 0,5 – 1,2%% em volume de etanol como álcool.

[0027] O termo "produto de cerveja fermentado sem álcool", como é usado neste relatório descritivo, se refere a um produto de cerveja fermentado no qual nenhum etanol está presente, ou no qual menos de 0,03% em volume está presente. Observa-se que a porcentagem máxima de uma cerveja sem álcool pode diferir entre os países. Por exemplo, a cerveja isenta de álcool, também chamada de “cerveja sem álcool”, pode conter menos de 0,5% em volume nos EUA, e, em alguns países europeus, não mais do que 0,05% em volume no Reino Unido. No entanto, tal como aqui utilizado, o termo "produto de cerveja fermentada sem álcool" se refere a um produto de cerveja fermentada em que nenhum etanol está presente, ou no qual menos de 0,03% em volume está presente.

[0028] O termo "maltotriose", tal como aqui utilizado, se refere a um trissacarídeo que consiste em três moléculas de glicose ligadas através de ligações α-1,4 glicosídicas.

[0029] O termo "atividade de descarboxilação de ácidos fenólicos", tal como aqui utilizado, se refere à quantidade de ácidos fenólicos que é convertida em sua forma descarboxilada, de preferência, a quantidade de ácidos fenólicos que é enzimaticamente convertida em sua forma descarboxilada. A conversão enzimática é, preferencialmente, catalisada por pelo menos uma ou ambas as proteínas codificadas pelos genes que codificam a descarboxilase do ácido fenilacrílico (PAD1) e / ou descarboxilase do ácido ferúlico (FDC1). Foi demonstrado que a inativação de um desses dois genes é suficiente para interferir na descarboxilação dos ácidos fenólicos. A atividade de descarboxilação de ácidos fenólicos, isto é, a quantidade de ácidos fenólicos que é convertida na sua forma descarboxilada pode ser determinada por qualquer método conhecido no estado da técnica. Por exemplo, o ácido ferúlico e o 4-VG exibem uma forte diferença em seus espectros de absorção de luz entre 200 e 400 nm. O ácido ferúlico mostra altos valores de absorção acima de 300 nm, enquanto a conversão em 4-VG resulta em uma diminuição dos valores de absorção acima de 300 nm. Essa diferença pode ser usada para estimar a capacidade de conversão do ácido ferúlico em 4-VG, como uma estimativa da atividade de descarboxilação dos ácidos fenólicos. Por exemplo, o sobrenadante de, por exemplo, culturas de placas de microtitulação cultivadas em mosto sintético na presença de ácido ferúlico podem ser recolhidas por centrifugação, por exemplo, por 5 minutos a 2500xg a 4° C, transferido para uma placa de microtitulação e um espectro de absorção de 250 nm a 400 nm da placa de microtitulação de 96 poços pode ser determinado. Como outro exemplo, a atividade de descarboxilação pode ser determinada incubando uma célula de levedura, ou uma cultura de células de levedura, na presença de substrato, ou seja, um ácido fenólico, como ácido ferúlico ou ácido cinâmico, e determinando a conversão do ácido fenólico em seu forma descarboxilada por espectrometria de massa ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

[0030] O termo "atividade de descarboxilação reduzida de ácidos fenólicos", como é usado neste relatório descritivo, se refere à porcentagem de atividade de descarboxilação de uma levedura, que é reduzida quando comparada a um controle, de preferência, um controle não modificado. A conversão de ácidos fenólicos pode, por exemplo, ser determinada durante um período de tempo predeterminado e comparada com a conversão de ácidos fenólicos em uma célula de levedura de controle ou cultura de células de levedura durante o mesmo período de tempo. Como outro exemplo, a atividade de descarboxilação pode ser determinada de uma maneira mais indireta, determinando a proporção de proliferação de células de levedura cultivadas na presença de ácido cinâmico e a proliferação de culturas de células de levedura na ausência de ácido cinâmico. Uma vez que o ácido cinâmico é mais tóxico para as células de levedura do que sua forma descarboxilada estireno, uma proliferação reduzida de células de levedura na presença de ácido cinâmico de uma célula de levedura ou cultura de células de levedura em comparação com uma referência significa que a atividade de descarboxilação é reduzida.

A redução percentual pode, por exemplo, ser determinada determinando a razão de proliferação de células de levedura cultivadas na presença de ácido cinâmico.

Alternativamente, a proliferação de células de levedura na presença ou ausência de ácido cinâmico pode ser determinada e a razão de proliferação de células de levedura cultivadas na presença de ácido cinâmico e a proliferação de culturas de células de levedura na ausência de ácido cinâmico pode ser determinada como um medida da atividade de descarboxilação.

Como referência, uma cepa de levedura normal que é rotineiramente usada em processos de fermentação, por exemplo, uma levedura Heineken-A e / ou a levedura Heineken D- para fermentação de cerveja, pode ser usada como uma referência para determinar uma atividade de descarboxilação reduzida de fenólicos ácidos.

A referida redução é, preferencialmente, de pelo menos 50%, mais preferencialmente, pelo menos 60%, mais preferencialmente, pelo menos 70%, mais preferencialmente, pelo menos 80%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 99%, quando comparado com uma cepa de levedura normal que é rotineiramente utilizada no processo de fermentação indicado.

Isso significa que uma levedura com atividade de descarboxilação reduzida de ácidos fenólicos tem uma atividade de descarboxilação que é no máximo 40% da atividade de descarboxilação de uma referência, mais preferencialmente, no máximo 30%, mais preferencialmente, no máximo 25%, mais preferencialmente,,

no máximo 20 %, mais preferencialmente no máximo 15%, mais preferencialmente, no máximo 10%, mais preferencialmente, no máximo 5%, mais preferencialmente, no máximo 1% da atividade de descarboxilação da referida referência.

[0031] O termo "mutação", tal como aqui utilizado, se refere a uma alteração no DNA genômico de uma levedura, incluindo, mas não se limitando a, uma mutação pontual, uma inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos, uma substituição de um ou mais nucleotídeos, uma mutação de deslocamento de quadro e quebra de DNA de fita simples ou dupla, como quebra de cromossomo ou translocação e qualquer combinação dos mesmos.

[0032] O termo "translocação", tal como aqui utilizado, se refere a um segmento cromossômico que é movido de uma posição para outra, seja dentro do mesmo cromossomo ou para outro cromossomo. Uma translocação pode ser recíproca, o que significa que os fragmentos são trocados mutuamente entre duas localizações cromossômicas, como entre dois cromossomos.

[0033] O termo "gene", tal como aqui utilizado, se refere a todas e quaisquer sequências genômicas de ação cis que garantem que um produto codificado pelo gene seja expresso, incluindo sequências potenciadoras e promotoras, sequências exônicas e intrônicas. O referido produto pode ser uma molécula de RNA, tal como uma molécula de mRNA ou uma molécula de siRNA e / ou uma proteína.

[0034] O termo "um gene envolvido no controle da transcrição" de outro gene, como aqui utilizado, se refere a um gene que codifica um regulador ou fator transcricional que regula a expressão desse outro gene.

[0035] O termo "gene inativado", tal como aqui utilizado, indica um gene que não é capaz de realizar sua função normal. Por exemplo, para um gene que codifica uma proteína, "inativação" significa que o gene não se traduz em uma proteína, codifica uma proteína inativa ou codifica uma proteína com atividade reduzida. A referida inativação, por exemplo, pode ser devido a uma alteração em uma sequência do promotor de modo que o promotor não seja capaz de iniciar a transcrição do gene, a uma alteração de um sítio de splicing de um íntron, alteração essa que interfere no splicing correto do transcrito pré-mRNA, ou uma alteração na região codificadora do gene, tornando a proteína codificada menos ativa ou mesmo inativa. A referida inativação é, preferencialmente, pelo menos 50%, mais preferencialmente, pelo menos 60%, mais preferencialmente, pelo menos 70%, mais preferencialmente, pelo menos 80%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 99%, quando comparado ao gene não inativado.

[0040] O termo "promotor", tal como aqui utilizado, se refere a uma sequência genômica que é considerada como uma região reguladora de um gene que é necessário para iniciar a sua transcrição. Ele está normalmente localizado na parte 5' do gene, normalmente, mas não exclusivamente, na frente do local de início da transcrição.

[0041] O termo "híbrido" ou "levedura híbrida", tal como aqui utilizado, se refere a uma levedura que é o resultado da combinação de genomas de duas leveduras de diferentes variedades ou espécies. Um híbrido é,

preferencialmente, o resultado de cruzamento sexual, o que significa que a levedura híbrida é o resultado da fusão de duas células de sexos diferentes, como duas células de diferentes tipos de acasalamento, preferencialmente, de dois gametas.

[0042] O termo "híbrido interespécies", tal como aqui utilizado, se refere a uma levedura que é o resultado da combinação de genomas de dois organismos de espécies ou gêneros diferentes.

[0043] Os termos "primeiro progenitor" e "segundo progenitor", tal como aqui utilizados, se referem a duas leveduras de diferentes variedades ou espécies. As referidas duas leveduras são compatíveis com a hibridização.

[0044] O termo "compatível com hibridização", tal como aqui utilizado, se refere a duas leveduras que podem ser cruzadas, de preferência, cruzadas sexualmente. O termo "compatível com acasalamento" pode ser usado, o que equivale ao termo "compatível com hibridização".

[0045] Os termos "corante A" e "corante B" se referem a diferentes corantes fluorescentes que podem ser usados para corar células de levedura.

[0046] O termo "temperatura de crescimento ideal", tal como aqui utilizado, se refere à temperatura na qual as células de levedura de um primeiro organismo progenitor e de um segundo organismo progenitor crescem de forma otimizada, o que significa que as células completam um ciclo celular completo mais rápido. A maioria das leveduras tem uma temperatura ótima de crescimento entre 10 e 40° C, de preferência, entre 15 e 30° C, tal como entre 18° C e 25° C,

mais especificamente, entre 20° C e 22° C.

[0047] O termo "marcador auxotrófico", tal como aqui utilizado, se refere a genes marcadores que codificam enzimas-chave nas vias metabólicas para metabólitos essenciais, especialmente monômeros, usados na biossíntese. Um exemplo é o gene URA3, que codifica a orotidina-5'-fosfato descarboxilase, uma enzima essencial na biossíntese de pirimidina em Saccharomyces cerevisiae. Da mesma forma, os genes marcadores HIS3, LEU2, TRP1 e MET15 codificam enzimas essenciais para a síntese de novo dos aminoácidos histidina, leucina, triptofano e metionina, respectivamente. A presença de um marcador auxotrófico permite o crescimento de células na ausência do metabólito essencial correspondente.

[0052] O termo "diplóide", tal como aqui utilizado, se refere a uma célula ou um organismo que compreende dois conjuntos de cromossomos. Um conjunto de cromossomos é obtido de um dos parentais, enquanto um segundo conjunto de cromossomos normalmente é obtido de um segundo parental. O termo "diplóide" é usado para separar células e organismos com dois conjuntos de cromossomos, de células e organismos com um conjunto de cromossomos, denominado haplóide, e, de células e organismos com múltiplos conjuntos de cromossomos, denominados poliploides. As células e organismos poliplóides incluem células e organismos triplóides, tetraplóides, pentaplóides, hexaplóides e octaplóides.

[0053] O termo "aneuplóide", tal como aqui utilizado, se refere a uma célula ou organismo em que nem todos os cromossomos estão presentes no mesmo número de cópias. Portanto, o complemento cromossômico não pode ser indicado como um número definido de conjuntos cromossômicos completos, como n, 2n, 3n ou 4n, como é conhecido por um técnico versado no assunto. O termo aneuploidia se refere à presença de um número anormal de cromossomos em uma célula ou organismo, em contraste com uma célula euplóide. Uma célula aneuploide pode perder ou ter uma parte extra de um cromossomo, ou pode perder um ou mais cromossomos ou ter um ou mais cromossomos extras.

[0054] O termo "germinação", tal como aqui utilizado, se refere ao processo pelo qual uma semente ou um gameta recupera a capacidade de crescer vegetativamente, resultando em estruturas multicelulares ou na replicação celular por crescimento mitótico. O exemplo mais comum de germinação é o surgimento de uma muda de uma semente. Além disso, o crescimento de um esporelo a partir de um esporo, como os esporos de hifas de esporos de fungos, também é denominado germinação. Além disso, o processo pelo qual um esporo de fungo desprende sua parede de esporo e recupera a atividade metabólica normal, como ocorre em leveduras, também é denominado germinação. A germinação geralmente depende de condições como temperatura, umidade, suprimento de oxigênio e, às vezes, luz ou escuridão.

[0055] Os termos "levedura" e “levedura fermentativa", tal como aqui utilizados, se referem a microrganismos eucarióticos unicelulares que são classificados como membros do reino fungo. Uma levedura preferida é uma levedura do complexo Saccharomyces sensu stricto, incluindo qualquer híbrido desta. O complexo Saccharomyces sensu stricto atualmente abrange nove espécies diferentes: Saccharomyces cerevisiae, S. paradoxus, S. cariocanus, S. uvarum, S. mikatae, S. kudriavzevii, S. arboricola, S. eubayanus e a recém-descoberta S. Jurei [Hittinger , 2013. Trends Genet 29: 309-317; Naseeb et al.,

2017. Int J Syst Evol Microbiol 67: 2046–2052].

[0056] O termo "levedura fermentativa", tal como aqui utilizado, se refere a uma levedura do complexo Saccharomyces sensu stricto, de preferência, uma levedura Saccharomyces cerevisiae ou S. eubayanus, e / ou um híbrido desta, como S. pastorianus, também denominado S. carlsbergensis. Método de seleção de uma maltotriose utilizando mutante de uma não maltotriose utilizando Saccharomyces

[0057] A mutagênese da levedura Saccharomyces pode ser realizada usando qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo métodos convencionais de mutagênese aleatória, como radiação e tratamento químico, e tecnologias de DNA recombinante, como mutagênese direcionada ao local ou mutagênese direcionada. Portanto, a célula de levedura pode ter sido submetida a mutagênese aleatória, incluindo tratamento com irradiação UV, irradiação de raios-X, irradiação de raios gama e um agente mutagênico ou para engenharia genética.

[0058] O termo "mutagênese aleatória" se refere a técnicas de mutagênese em que o local exato da mutação não é previsível e pode ocorrer em qualquer lugar no cromossomo da (s) célula (s) ou esporo (s) de levedura. Em geral, esses métodos envolvem o uso de agentes químicos ou radiação para induzir pelo menos uma mutação. A mutagênese aleatória pode ainda ser alcançada usando PCR propenso a erros, em que a PCR é realizada em condições em que a precisão de cópia da DNA polimerase é baixa, resultando em uma taxa relativamente alta de mutações no produto de PCR.

[0059] "Engenharia genética" é bem conhecida no estado da técnica e se refere à alteração do genoma da levedura usando método biotecnológico, introduzindo, assim, uma alteração do DNA genômico da levedura, de preferência, em um local predefinido e com uma alteração predefinida, denominada mutagênese dirigida ao local.

[0064] A mutagênese direcionada, também denominada mutagênese direcionada ao local, pode ser alcançada usando mutagênese direcionada a oligonucleotídeos para gerar mutações específicas do local em uma sequência de DNA genômico de interesse. Mutagênese direcionada se refere a um método de mutagênese que altera um gene específico in vivo, resultando em uma mudança na estrutura genética direcionada a um local específico, como por nucleases guiadas por RNA programáveis, como TALEN, CRISPR-Cas, nuclease de dedo de zinco ou meganuclease tecnologia.

[0065] A referida mutagênese é, preferencialmente, realizada submetendo uma levedura a tratamento com radiação, tal como irradiação UV, irradiação de raios X, irradiação de raios gama e / ou um agente mutagênico, preferencialmente, um agente químico como NTG (N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina) ou EMS (etilmetanossulfonato). Um procedimento de mutagênese particularmente preferido compreende irradiação UV, por exemplo, por 10 segundos a 3 minutos, de preferência, aproximadamente 1 - 2 minutos. Um método preferido inclui a exposição à luz UV (TUV 30 W T8, Philips, Eindhoven, Holanda) a um pico de radiação de 253,7 nm e por um período de 0,1 a 10 minutos, de preferência 0,5 - 5 minutos, tal como cerca de 90 minutos.

[0066] A referida mutagênese, preferencialmente, mutagênese aleatória, é, preferencialmente, realizada em duas ou mais rodadas. Cada rodada inclui, preferencialmente, uma etapa de mutagênese, preferencialmente, uma etapa de mutagênese leve, preferencialmente, uma etapa de mutagênese mediada por UV, que resulta em uma taxa de sobrevivência moderada de 20-60%, preferencialmente, 40 - 50%.

[0067] Em uma primeira rodada, as leveduras mutadas podem ser inoculadas em um meio sintético contendo maltotriose como única fonte de carbono, que irá enriquecer para mutantes capazes de consumir maltotriose.

[0068] Uma segunda rodada de mutagênese inclui, preferencialmente, o crescimento em mosto de cerveja que é enriquecido com maltotriose. Nessas condições, mutantes com afinidade melhorada ou maior taxa de transporte para crescimento em maltotriose seriam menos limitados por nutrientes, resultando em uma vantagem seletiva quando comparados às leveduras não mutadas. Para isso, o mosto pode ser diluído 2 -10 vezes, por exemplo, seis vezes. O referido mosto diluído pode ser suplementado com maltotriose, por exemplo 1 - 20 g L-1, tal como 10 g L-1 de maltotriose para aumentar a concentração relativa de maltotriose. Ergosterol, por exemplo, 1 - 100 mg L-1, TWEEN® 80, por exemplo, 100 - 1000 mg L-1, e sulfato de amônio, por exemplo, 1 - 20 mg L- 1 podem ser suplementados para prevenir a limitação de oxigênio e nitrogênio.

[0073] O referido crescimento em mosto de cerveja enriquecido com maltotriose é, preferencialmente, realizado por uma cultura contínua. A referida cultura contínua pode ser operada a uma taxa de diluição de 0,001 - 0,2 h-1, de preferência, a 0,01 - 0,1 h-1, tal como 0,03 h-1. Em um ponto de tempo em que a concentração de maltotriose diminui, células individuais da cultura são preferencialmente isoladas, por exemplo, por classificação FACS. A célula isolada pode ser plaqueada em meio sintético contendo maltotriose como a única fonte de carbono e / ou no mosto de cerveja que é enriquecido com maltotriose como descrito acima para selecionar ainda mais mutantes de Saccharomyces, de preferência, mutantes de S. eubayanus que podem utilizar maltotriose.

[0074] Outras leveduras Saccharomyces que não podem utilizar maltotriose incluem algumas cepas de S. cerevisiae, S. uvarum e S. bayanus. Os métodos descritos acima para selecionar uma maltotriose utilizando mutante de uma não maltotriose utilizando Saccharomyces são aplicáveis a S. uvarum e S. bayanus, além de S. eubayanus. Levedura Saccharomyces mutante utilizando maltotriose

[0075] S. eubayanus foi isolado pela primeira vez de árvores Nothofagus e estroma de Cyttaria harioti no noroeste da Patagônia (Libkind et al., 2011. Proc Natl Acad Sci 108: 14539-44). As cepas de S. eubayanus foram subsequentemente também isoladas de locais na América do Norte (Peris et al.,

2014. Mol Ecol 23: 2031-45), Ásia (Bing et al., 2014. Curr Biol 24: R380-1) e Oceania (Gayevskiy e Goddard, 2016.

Environ Microbiol 18: 1137-47). A caracterização fisiológica inicial da cepa patagônica de S. eubayanus CBS12357T revelou que ela cresce mais rápido do que S. cerevisiae em temperaturas abaixo de 10 ºC (Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005), mostra floculação pobre (Krogerus et al.,

2015. J Ind Microbiol Biotechnol 42: 769-78) e consome maltose, mas não maltotriose (Gibson et al., 2013. Yeast 30: 255-266). Gibson et al., 2017. FEMS Yeast Res 17: fox038; Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005).

[0076] A maioria das cepas de S. eubayanus não são capazes de transportar maltotriose e / ou converter maltotriose em etanol.

[0077] O genoma de S. eubayanus abriga nove genes anotados como ortólogos transportadores de facilitador de hexose (HXT) (Baker et al., 2015. Mol Biol Evol 32: 2818– 2831; Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005). Além desses facilitadores de hexose independentes de energia, um simportador de frutose / H+ está presente em S. eubayanus (Pengelly e Wheals, 2013. FEMS Yeast Res 13: 156-161). O genoma da cepa S. eubayanus do tipo CBS 12357 abriga ainda quatro transportadores de maltose SeMalt, denominados SeMALT1; SeMALT2, SeMALT3 e SeMALT4 que, no entanto, ainda não foram analisados funcionalmente (Baker et al., 2015. Mol Biol Evol 32: 2818-2831). Nenhum deles parece transportar maltotriose, uma vez que S. eubayanus CBS12357 é incapaz de crescer neste trissacarídeo (Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005). S. eubayanus não parece codificar qualquer transportador com alta similaridade ao transportador de S. cerevisiae maltotriose ScAgt1, ou aos transportadores de S.

pastorianus maltotriose SpMty1 e SeAgt1 (Baker et al., 2015. Mol Biol Evol 32: 2818–2831; Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005), embora um gene com 81% de homologia com a permease AGT1 de S. cerevisiae tenha sido relatado (Cousseau et al., 2012. Letters in Applied Microbiology 56: 21— 29).

[0078] A referida levedura mutante é, preferencialmente, do complexo Saccharomyces sensu stricto que compreende um gene que codifica um transportador ativado como descrito, e quaisquer genes quiméricos parálogos e homólogos a estes transportadores nos genomas de Saccharomyces.

[0079] Uma levedura de S. eubayanus mutante preferida, de acordo com a invenção, é obtida após mutagênese aleatória, preferencialmente, após mutagênese por UV.

[0080] A mutagênese de S. eubayanus pode resultar na ativação de um ou mais genes transportadores que, após ativação, são capazes de transportar maltotriose e / ou ativação de uma ou mais α-glucosidases intracelulares.

[0081] Os referidos genes transportadores ativados podem incluir genes transportadores de maltose conhecidos em S. cerevisiae, ou seus homólogos em S. eubayanus, tais como genes MPH2, MPH3 e MALx1, incluindo MAL21, MAL31, MAL41, MAL61, AGT1 (também referido como MAL11). A referida ativação pode ainda, ou adicionalmente, incluir a ativação de um homólogo MTY1 (também referido como MTT1) de S. pastorianus em S. eubayanus, e / ou genes AGT1 e MALT de S. eubayanus, incluindo SeMALT1, SeMALT2, SeMALT3, SeMALT4.

[0082] A mutagênese de S. eubayanus pode resultar em uma alteração em um ou mais genes transportadores, incluindo os nove genes HXT, o simportador de frutose / H+ e / ou os quatro transportadores de maltose SeMalt e / ou resultar em uma ou mais alterações resultando em, por exemplo, ativação de um transportador de maltotriose ainda desconhecido, ativação de um ativador transcricional a montante e / ou inativação de um repressor transcricional de um ou mais dos genes transportadores conhecidos ou desconhecidos indicados acima.

[0083] Da mesma forma, a mutagênese de S. eubayanus pode resultar em uma alteração de um ou mais genes cujos produtos codificados estão envolvidos na quebra da maltotriose em glicose. A hidrólise da maltotriose em glicose é facilitada por α-glicosidases intracelulares, também denominadas maltases, que hidrolisam resíduos de α-D-glicose terminais 1,4-ligados, liberando, assim, α-D-glicose. Três α-glucosidases diferentes foram isoladas da levedura de cerveja, das quais duas proteínas são capazes de hidrolisar a maltotriose (Matsusaka et al., 1977. Agric Biol Chem 41: 1917-1923). A priori, a alteração de genes que resultam na ativação de uma ou mais α-glucosidases intracelulares pode resultar em uma levedura S. eubayanus mutante que é capaz de fermentar a maltotriose. A referida mutação que resulta na ativação de uma ou mais α-glucosidases intracelulares pode ser separada ou adicionalmente a uma ou mais mutações que resultam na ativação de pelo menos um transportador de maltotriose em uma levedura S. eubayanus.

[0084] Além disso, a alteração de um sensor de glicose de superfície celular Rgt2 e / ou Snf3, e ou do fator de transcrição nuclear a jusante Rgt1 pode ser empregada para reprimir genes que codificam transportadores de glicose (Roy et al., 2016. Mol Biol Cell 27: 862- 871). Um técnico versado no assunto entenderá que a alteração, de preferência, por mutagênese aleatória, de um ou mais genes que codificam enzimas-chave na absorção, fermentação e / ou degradação aeróbia da maltotriose em S. eubayanus pode resultar em uma levedura fermentativa de S. eubayanus que seja capaz de converter a maltotriose em etanol, preferencialmente, de converter completamente a maltotriose que está presente, por exemplo, no mosto, em etanol.

[0085] A invenção, portanto, fornece uma levedura Saccharomyces eubayanus mutante que é capaz de fermentar maltotriose.

[0090] A referida levedura mutante de S. eubayanus compreende, preferencialmente, um gene quimérico em que parte de uma primeira sequência de gene codificante é translocada adjacente a parte de uma segunda sequência de gene codificante de modo que a proteína produzida abriga parte do referido primeiro produto gênico e parte do referido segundo produto gênico. Por exemplo, o referido gene quimérico pode codificar uma primeira parte de SeMalt4 e uma segunda parte de SeMalt1. A referida proteína quimérica compreende, preferencialmente, uma combinação de sequências de aminoácidos SeMalt 1 e SeMalt 4, denotadas como proteína SeMalt 1 / SeMalt 4, em que a parte N-terminal é fornecida por SeMalt1 e uma parte C-terminal é fornecida por SeMalt4, ou SeMalt1 / Proteína SeMalt2, uma proteína SeMalt1 / SeMalt3, uma proteína SeMalt2 / SeMalt1, uma proteína SeMalt2 / SeMalt3, uma proteína SeMalt2 / SeMalt4, uma proteína

SeMalt3 / SeMalt1, uma proteína SeMalt3 / SeMalt2, uma proteína SeMalt3 / SeMalt4 / SeMalt4, uma SeMalt4 / SeMalt4 proteína, uma proteína SeMalt4 / SeMalt2 ou uma proteína SeMalt4 / SeMalt3.

[0091] A referida proteína quimérica pode compreender uma combinação de três sequências de aminoácidos SeMalt incluindo, por exemplo, SeMalt1/SeMalt2/SeMalt3, SeMalt1/SeMalt3/SeMalt3, SeMalt1/SeMalt2/SeMalt4, SeMalt1/SeMalt3/SeMalt4, SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3, SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4, SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1, SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4, SeMalt2/SeMalt4/SeMalt1, SeMalt2/SeMalt4/SeMalt3, SeMalt3/SeMalt1/SeMalt2, SeMalt3/SeMalt1/SeMalt4, SeMalt3/SeMalt2/SeMalt1, SeMalt3/SeMalt2/SeMalt4, SeMalt3/SeMalt1/SeMalt2, SeMalt3/SeMalt1/SeMalt4, SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2, SeMalt4/SeMalt1/SeMalt3, SeMalt4/SeMalt2/SeMalt1, SeMalt4/SeMalt2/SeMalt3, SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1, ou SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2.

[0092] Porque SeMALT2 e SeMALT4 são conhecidos por serem expressos em levedura S. eubayanus, a parte N-terminal da proteína quimérica é, preferencialmente, de SeMALT2 ou de SeMALT4. Consequentemente, uma outra proteína quimérica preferida compreende, por exemplo, SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3, SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4, SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1, SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4, SeMalt2/SeMalt4/SeMalt1, SeMalt2/SeMalt4/SeMalt3, SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2, SeMalt4/SeMalt1/SeMalt3, SeMalt4/SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3, SeMalt4/SeMalt2/SeMalt3, SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt3, SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeMalt3,SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4/SeM alt3, SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt3, SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4/SeMalt3,SeMalt2/SeMalt4/SeMalt1/SeM alt3, SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2/SeMalt3, SeMalt4/SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3,SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeM alt3, SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeMalt3, SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt3,SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeM alt3,SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3/SeMalt1,SeMalt2/SeMalt1/SeMalt 4/SeMalt1, SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4/SeMalt1, SeMalt2/SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1,SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2/SeM alt1, SeMalt4/SeMalt1/SeMalt3/SeMalt1, SeMalt4/SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1,SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeM alt1, SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeMalt1, SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3/ SeMalt2, SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4/SeMalt2,SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1/SeM alt2, SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4/SeMalt2, SeMalt2/SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2,SeMalt2/SeMalt4/SeMalt3/SeM alt2, SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2/SeMalt4, SeMalt4/SeMalt1/SeMalt3/SeMalt4,SeMalt4/SeMalt2/SeMalt1/SeM alt4, SeMalt4/SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4, SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt4,SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeM alt4, ou outras combinações desses transportadores.

[0093] Uma outra levedura de S. eubayanus mutante preferida, de acordo com a invenção, tem um gene transportador de maltose quimérico compreendendo uma parte N-terminal e uma parte C-terminal de SeMalt2 e / ou SeMalt4.

[0094] Uma levedura de S. eubayanus mutante mais preferida de acordo com a invenção tem um gene transportador de maltose quimérico compreendendo SeMalt4 / SeMalt1 / SeMalt2 ou SeMalt4 / SeMalt3. O referido gene quimérico mais preferido compreende preferencialmente os nucleotídeos 1-434 da SeMALT4, os nucleotídeos 430-1122 da SeMALT1, os nucleotídeos 1113-1145 da SeMALT2 ou SeMALT4 e os nucleotídeos 1141-1842 da SeMALT3, conforme representado na Figura 3.

[0095] Outros genes que são preferencialmente alterados, preferencialmente, por mutagênese aleatória, são genes envolvidos na atividade de descarboxilação de ácidos fenólicos, preferencialmente na produção de 4-vinil guaiacol, mais preferencialmente na descarboxilação de ácido ferúlico em 4-vinil guaiacol. As bebidas fermentadas em que os compostos fenólicos são geralmente considerados como sabores estranhos incluem cerveja, mais preferencialmente, uma cerveja selecionada do grupo que consiste em lager, wild lager, pilsner, pale ale e saison.

[0096] Uma levedura fermentativa preferida compreende uma mutação em pelo menos um dos genes PAD1 e FDC1 e / ou um gene envolvido no controle da transcrição de pelo menos um dos referidos genes e / ou um gene que codifica uma proteína envolvida na absorção de um ácido fenólico, preferencialmente, ácido ferúlico, ou envolvido na exportação de um composto fenólico descarboxilado, preferencialmente 4-vinil guaiacol e / ou um gene envolvido no controle da transcrição do referido gene.

[0097] O referido ácido fenólico é preferencialmente um ácido fenólico que pode ser convertido por uma proteína codificada por PAD1 e / ou uma proteína codificada por FDC1, mais preferencialmente selecionada a partir de ácido ferúlico, 4 hidroxibenzoato, ácido sinápico, ácido caféico,

ácido cinâmico, 3,4 ácido -di-hidroxibenzóico, ácido ferúlico, ácido gálico, ácido p-cumárico, ácido 4- metoxicinâmico, ácido p-hidroxibenzóico, 4- hidroxibenzaldeído, ácido protocatecuico, ácido salicílico, ácido síngico, ácido tânico e / ou ácido vanílico. Um substrato particularmente preferido é o ácido ferúlico, cuja absorção é, preferencialmente, reduzida ou mesmo inibida numa levedura fermentativa preferida que é usada nos métodos da invenção.

[0098] Exemplos de proteínas envolvidas na exportação de um produto de uma proteína codificada por PAD1 e / ou uma proteína codificada por FDC1 é Pdr16 / YNL231C, Pdr8 / YLR266C, Pdr12 / YPL058C, Pdr10 / YOR328W, Pdr5 / YOR153W, Pdr18 / YNR070W, Pdr3 / YBL005W, Pdr15 / YDR406W, Pdr17 / YNL264C e Pdr11 / YIL013C. O referido produto é, preferencialmente, um composto fenólico descarboxilado, mais preferencialmente 4-VG, 4-vinilfenol, 4 etilfenol, guaiacol e eugenol. Um produto particularmente preferido é 4-VG.

[0099] A invenção, portanto, fornece uma levedura de S. eubayanus mutante, de acordo com a invenção, que tem uma atividade de descarboxilação reduzida de ácidos fenólicos, de preferência, não está produzindo 4-vinil guaiacol.

[0097] Uma levedura de S. eubayanus mutante preferida, de acordo com a invenção, pode, além disso, compreender uma ou mais alterações genômicas selecionadas a partir de uma duplicação do braço direito do cromossomo VIII, uma alteração no gene do fator de transcrição SEF1, uma alteração no gene da palmitoil transferase AKR1, que está envolvida na endocitose e no controle da forma celular, uma alteração no repressor da via de sinalização de detecção de glicose Mth1, uma alteração no gene que codifica o Bypass da proteína Códon de Parada 1 (Bsc1), que é uma proteína de função não confirmada; semelhante à floculina Flo11p da superfície celular, uma alteração no gene regulador da permease de amônio PAR32, uma alteração no regulador negativo da esporulação Mds3, uma alteração no gene de biossíntese de ergosterol Erg25, uma alteração no gene que codifica um fator de transcrição envolvido na resposta de fome ZPR1, uma alteração no gene que codifica um fator de transcrição envolvido na resposta à fome STP2, uma alteração no gene que codifica uma proteína necessária para a fermentação em baixa temperatura CSF1, uma alteração no gene que codifica uma proteína envolvida na regulação da biossíntese de esterol NSG1.

[0098] As referidas uma ou mais alterações genômicas adicionais incluem, preferencialmente, uma alteração L895P no gene do fator de transcrição SEF1; uma alteração S50P no gene da palmitoil transferase AKR1; uma alteração na região promotora de DNA de MTH1, preferencialmente uma alteração G (-753) A; uma alteração L469S em BSC1; uma alteração na região promotora de DNA de PAR32, preferencialmente, G (- 1266) A, G (-1265) A, G (-1237) A e / ou G (-1236A); uma alteração P727H em MDS3; uma alteração na região Terminator de ácido nucleico de ERG25, preferencialmente uma alteração G (+165) A; uma alteração em um ou ambos os domínios de dedo de zinco (AA 52-210 e 293-486) de ZPR1, de preferência uma alteração S327P; uma alteração S181L no fator de transcrição STP2; uma alteração S2708P em CSF1; e / ou uma alteração

G163A em NSG1.

[0099] Salvo indicação em contrário, as alterações se referem a uma alteração de aminoácido do primeiro resíduo de aminoácido de letra única nomeado para o segundo resíduo de aminoácido de letra única nomeado na posição indicada. Por exemplo, uma alteração S50P, em AKR1 se refere à troca de uma serina na posição 50 por uma prolina em AKR1. As posições nas regiões do promotor do ácido nucleico e do terminador referem-se à posição do nucleotídeo em relação ao início da transcrição ou em relação ao códon de parada, respectivamente. Levedura híbrida gerada a partir da levedura S. eubayanus mutante

[00100] A invenção fornece, além disso, um método para produzir uma levedura híbrida, compreendendo a) fornecer a levedura S. eubayanus mutante, de acordo com a invenção, como um primeiro progenitor, e uma segunda levedura como um segundo progenitor, em que o referido segundo progenitor difere do primeiro progenitor, b) hibridizar células do primeiro progenitor com células do segundo progenitor e c) identificar um organismo híbrido resultante.

[00101] Os híbridos de Saccharomyces são mais comumente encontrados em ambientes domesticados e são usados em vários processos de fermentação industrial [Boynton e Greig, 2014. Yeast, 31: 449-462; Gorter de Vries et al.,

2017. Applied Environm Microbiol 83: e03206-16]. Por exemplo, a cerveja lager é realizada com S. pastorianus, um híbrido entre S. cerevisiae e S. eubayanus [Libkind et al.,

2011. PNAS 108: 14539-14544], que combina a capacidade fermentativa e a utilização de açúcar de S. cerevisiae com a criotolerância de S. eubayanus [Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005]. Vários híbridos duplos e triplos entre S. cerevisiae, S. kudriavzevii e S. uvarum foram isolados de fermentações de vinho e parecem desempenhar um papel importante na produção de aroma [González et al., 2006. FEMS Yeast Res 6: 1221-1234].

[00102] O referido segundo progenitor é, de preferência, uma levedura do complexo Saccharomyces sensu stricto. Uma levedura mais preferida é uma levedura Saccharomyces cerevisiae, uma levedura S. carlsbergensis, uma levedura S. pastorianus, uma levedura S. eubayanus e / ou um híbrido destas, de preferência, uma levedura S. cerevisiae.

[00103] A combinação de dois ou mais genomas de Saccharomyces em um híbrido geralmente resulta em efeitos sinérgicos, um fenômeno chamado 'heterose' ou 'vigor híbrido', que permite que o híbrido tenha um desempenho melhor do que qualquer um de seus pais em ambientes específicos [Shapira et al., 2014. Heredity 113: 316]. Portanto, a hibridização direcionada de leveduras Saccharomyces é comumente usada para gerar cepas com fenótipos novos ou aprimorados para aplicações industriais. Por exemplo, híbridos de S. cerevisiae × S. eubayanus feitos em laboratório mostraram maior tolerância ao frio e consumo de oligossacarídeos [Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005], diferentes perfis de sabor [Steensels et al., 2014. Applied Environment Microbiol 80: 6965-6975], maiores taxas de fermentação e maiores títulos de etanol [Krogerus et al.,

2015. J Industrial Microbiol & Biotechnol 42: 769-778] do que suas cepas parentais.

[00104] A heterose é um fenômeno complexo que ainda não é totalmente compreendido; é mais provavelmente causado por uma combinação de múltiplos fatores, incluindo a quantidade de números de cópias cromossômicas [Gorter de Vries et al., 2017. Applied Environm Microbiol 83: e03206- 16; Krogerus et al., 2016. Appl Microbiol Biotechnol 100: 7203-7222], interações entre diferentes alelos dominantes e recessivos e interações epistáticas [Shapira et al., 2014. Heredity 113: 316]. O fenótipo resultante nem sempre é ambíguo: fenótipos dominantes e geralmente mais complexos, como criotolerância ou floculação, são geralmente completamente herdados de uma das cepas parentais [Hebly et al., 2015. FEMS Yeast Res 15: fov005; Coloretti et al., 2006. Food Microbiol 23: 672-676], enquanto para compostos de sabor e outros metabólitos secundários os híbridos geralmente produzem concentrações em torno da média das concentrações produzidas por suas cepas parentais [Krogerus et al., 2015. J Industrial Microbiol & Biotechnol 42: 769-778; Bellon et al., 2011. Appl Microbiol and Biotechnol 91: 603-612]. A heterose não depende apenas da espécie parental usada para a hibridização interespécie, mas também das cepas específicas usadas, tornando ainda mais difícil prever o fenótipo de um outcross.

[00105] Híbridos interespécies de espécies sem uma barreira pré-zigótica podem ser obtidos de forma análoga ao acasalamento intraespecífico: os híbridos são formados por acasalamento de cepas haplóides de tipo de acasalamento oposto ou por acasalamento raro entre linhagens que não têm tipos de acasalamento opostos que sofreram perda espontânea de heterozigosidade o locus de tipo de acasalamento [Steensels et al., 2014. FEMS Microbiol Reviews 38: 947- 995]. A hibridização entre espécies tem uma taxa de ocorrência relativamente baixa; as frequências de hibridização variam de 1,5 a 3,6% para o acasalamento de esporo com esporo [Krogerus et al., 2016. Appl Microbiol Biotechnol 100: 7203-7222; Mertens et al., 2015. Appl Environment Microbiol 81: 8202-8214] para frequências tão baixas quanto 1 × 10-6 a 1 × 10-7 para acasalamento raro [Krogerus et al., 2017. Microbial Cell Factories 16: 66; Gunge e Nakatomi, 1972. Genetics 70: 41-58].

[00106] A fim de aumentar a identificação dos produtos híbridos, especialmente de eventos de acasalamento raros, um método preferido para a produção de uma levedura híbrida compreende a marcação de células do primeiro e / ou segundo progenitor com um corante fluorescente, antes da hibridização das células.

[00107] As células de uma primeira levedura parental podem ser marcadas com um primeiro corante, aqui após denominado corante A, enquanto as células de uma segunda levedura parental podem ser marcadas com um segundo corante, aqui após denominado corante B. O corante A e o corante B são corantes fluorescentes, em que o corante A difere do corante B. Além disso, as células marcadas com o corante A, preferencialmente, podem ser distinguidas das células marcadas com o corante B; por exemplo, empregando corantes com diferentes espectros de excitação e / ou emissão.

Corantes adequados que podem ser usados nos métodos da invenção podem ser excitados por uma fonte de luz monocromática, de preferência um laser, mais preferencialmente por um laser ultravioleta (cerca de 355 nm), um laser violeta (cerca de 405 nm), um laser azul (cerca de 488 nm) ou um laser vermelho (cerca de 640 nm). Por exemplo, o corante A pode ser um corante que é excitado com um laser vermelho a cerca de 630 nm e que emite a cerca de 661 nm, enquanto o corante B é um corante que é excitado com um laser azul a cerca de 492 nm e que emite a cerca de 517 nm.

[00108] A marcação é, preferencialmente, direta. A marcação é, preferencialmente, realizada marcando aminas primárias (R-NH2) de proteínas, oligonucleotídeos modificados com amina e outras moléculas contendo amina.

[00109] Para isso, um corante compreende, preferencialmente, um grupo succinimidil, preferencialmente, um éster succinimidil para acoplar o corante a resíduos de lisina intracelular e outras fontes de amina.

[00110] Outros corantes preferidos incluem corantes reativos com tiol, em que um marcador fluorescente é acoplado a, por exemplo, iodoacetamida, maleimida, haleto benzílico ou uma bromometilcetona. Além disso, corantes microinjetáveis compreendendo um corante polar, tal como amarelo lúcifer CH, hidrazida azul em cascata, Alexa Fluor hidrazidas e biocitina que podem ser introduzidas em uma célula por patch clamping de células inteiras, iontoforese, lise osmótica de vesículas pinocíticas; e / ou conjugados de dextrano fluorescentes ou microesferas fluorescentes que podem ser carregados nas células por técnicas invasivas, tais como microinjeção, fixação de emplastro de células inteiras, carregamento de raspagem, bombardeamento de microprojéteis, eletroporação ou choque osmótico, podem ser usados para corar células em métodos da invenção.

[00111] O referido marcador fluorescente é, preferencialmente, selecionado a partir de Abz (Antranilil, 2-Aminobenzoil), N-Me-Abz (N-Metil-antranilil, N-Metil-2- Aminobenzoil), FITC (Isotiocianato de Fluoresceína), 5-FAM (5-carboxifluoresceína ), 6-FAM (6-carboxifluoresceína), TAMRA (carboxitetrametil rodamina), Mca (7-metoxicumarinil- 4-acetil), AMCA ou Amc (acetato de aminometilcumarina), Dansil (5- (dimetilamino) naftaleno-1-sulfonil), EDANS (ácido 5 - [(2-aminoetil) amino] naftaleno-1-sulfônico), Atto (por exemplo, Atto465, Atto488, Atto495, Atto550, Atto647), corantes cianina (Cy), incluindo Cy3 (1- (5- carboxipentil) Cloreto de -3,3-dimetil-2 - ((1E, 3E) -3- (1,3,3-trimetilindolin-2-ilideno) prop-1-en-1-il) -3H- indol-1-io ), Cy5 (1- (5-carboxipentil) -3,3-dimetil-2 - ((1E, 3E, 5E) -5- (1,3,3-trimetilindolin-2-ilideno) penta- 1,3- cloreto de dienil) -3H-indolium), incluindo Cy5 trissulfonado, e Cy7 (1- (5-carboxipentil) -2- [7- (1-etil- 5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2- ilideno) hepta-1,3,5-trien- 1-il] -3H-indolium-5-sulfonato), Alexa Fluor (por exemplo, Alexa Fluor 647, Alexa488, Alexa532, Alexa546, Alexa594, Alexa633, Alexa647), Bodipy (por exemplo Bodipy® FL), Dylight (por exemplo, DyLight 488, DyLight 550), Lucifer Yellow (etilenodiamina ou 6-amino-2- (2-amino-etil) -1,3- dioxo-2,3-dihidro-1H-benzo ácido [de] isoquinolina-5,8-

dissulfônico) e seus derivados.

[00112] Será claro para um técnico versado no assunto que as combinações de corantes preferidas incluem corantes que podem ser medidos distintamente, de preferência por dois filtros de emissão sem sobreposição espectral, de preferência sem a necessidade de compensação de fluorescência, mais preferencialmente corantes que podem ser excitados por dois diferentes por dois lasers diferentes para minimizar a sobreposição espectral, como com um laser violeta (cerca de 405 nm), um laser azul (cerca de 488 nm) ou um laser vermelho (cerca de 640 nm). As combinações preferidas, que permitem às células que são coradas com o corante A identificar e isolar das células coradas com o corante B, são corantes fluorescentes que podem ser excitados com um laser violeta e um laser azul; com um laser violeta e um laser vermelho ou com um laser azul e um laser vermelho.

[00113] O corante A e o corante B são, preferencialmente, corantes que também permitem a identificação e o isolamento de células que abrigam tanto o corante A quanto o corante B, a partir de células que abrigam apenas o corante A e apenas o corante B. Para isso, os corantes preferidos incluem um corante que é excitado com um laser vermelho a cerca de 630 nm, e que emite a cerca de 661 nm, e um corante que é excitado com um laser azul a cerca de 492 nm e que emite a cerca de 517 nm.

[00114] A hibridização de células marcadas é, preferencialmente, realizada no escuro para evitar o branqueamento dos corantes fluorescentes, como será claro para um especialista na técnica. A fim de aumentar a identificação de produtos híbridos, especialmente de eventos de acasalamento raros, a hibridização de células de levedura parentais marcadas ou não marcadas, preferencialmente, é realizada a uma temperatura que é pelo menos 5° C abaixo da temperatura de crescimento ideal da primeira e / ou da segunda levedura parental.

[00115] A hibridização é, preferencialmente, realizada a uma temperatura que está abaixo da temperatura ótima de crescimento de ambas as leveduras parentais, a fim de prevenir a proliferação celular excessiva. Ao reduzir a temperatura, a divisão celular leva mais tempo, enquanto a hibridização é menos afetada. Assim, uma proporção maior das células resultantes são células híbridas, quando comparadas à hibridização em uma temperatura mais alta. Verificou-se que uma temperatura de hibridização que é pelo menos 5° C abaixo da temperatura ideal de crescimento das leveduras parentais limita a perda de coloração pelos corantes e resulta na identificação de híbridos interespécies raros resultantes da hibridização entre a primeira levedura parental e a segunda levedura parental.

[00116] Uma temperatura que é pelo menos 5° C abaixo da temperatura ótima de crescimento do primeiro e / ou do segundo organismo parental é, preferencialmente, abaixo de 18° C, preferencialmente, entre 5° C e 15° C, mais preferencialmente, entre 10° C e 13° C, mais preferencialmente, cerca de 12° C. Um técnico versado no assunto é inquestionavelmente capaz de determinar uma temperatura ótima de crescimento de uma levedura com uma temperatura ótima de crescimento incomum, por exemplo,

cultivando células da levedura em diferentes temperaturas.

[00117] A invenção é ainda dirigida a uma levedura híbrida que compreende uma cópia do genoma de uma levedura Saccharomyces eubayanus mutante que é capaz de fermentar maltotriose. A referida levedura híbrida é, preferencialmente, produzida por um método para a produção de uma levedura híbrida de acordo com a invenção. Métodos de produção de um produto fermentado de cerveja

[00118] As leveduras são usadas desde há muito na panificação, cerveja e destilação, como na produção de pão e na fermentação de cerveja e vinho.

[00119] O mosto do cervejeiro compreende açúcares fermentáveis, incluindo maltose (50–60%), maltotriose (15– 20%) e glicose (10–15%). Os métodos da invenção empregam preferencialmente uma levedura S. eubayanus mutante e / ou um híbrido desta, que é capaz de fermentar a maltotriose. A utilização de uma levedura Saccharomyces eubayanus mutante que é capaz de fermentar a maltotriose, de acordo com a invenção, e / ou uma levedura híbrida, de acordo com a invenção, irá influenciar as características organolépticas do produto fermentado de cerveja resultante.

[00120] A referida levedura pode compreender ainda uma ou mais mutações de ocorrência natural e / ou mutações resultantes de mutagênese, em pelo menos um dos genes PAD1 e FDC1, um gene envolvido no controle da transcrição de pelo menos um dos referidos genes e / ou um gene que codifica uma proteína envolvida na absorção de um ácido fenólico, preferencialmente ácido ferúlico, ou envolvida na exportação de um composto fenólico descarboxilado, preferencialmente,

4-vinil guaiacol, e / ou um gene envolvido no controle da transcrição do referido gene.

[00121] O referido método para a produção de um produto fermentado de cerveja compreende o fornecimento de grãos de cereais amassados, preferencialmente cevada, em uma solução aquosa, preferencialmente em água, para liberar os açúcares do malte. Esta etapa de maltagem é seguida pela fervura do mosto resultante na presença de lúpulo e pela fermentação do mosto fervido resultante após o resfriamento. Terminada a fermentação, a cerveja pode ser filtrada e engarrafada.

[00122] Durante o processo de fermentação, os açúcares fermentáveis são convertidos em álcoois, como etanol, CO2 e compostos aromatizantes, como ésteres, por exemplo, acetato de isoamila. Como é conhecido por um técnico versado no assunto, os fatores que influenciarão a aparência e o sabor do produto resultante incluem, mas não estão limitados a, temperatura de torrefação e tempo de torrefação dos grãos, temperatura e tempo de maceração, germinação e queima dos grãos, temperatura e tempo de moagem e maceração dos grãos, lautering do macerado resultante para gerar o mosto, temperatura e tempo de ebulição do mosto, tempo e quantidades de lúpulo adicionado, o lúpulo específico que é usado, temperatura e tempo de fermentação, tipo de levedura, filtragem mecânica da levedura ou adição de agentes filtrantes para remoção da levedura e por fim, carbonatação e embalagem da cerveja. Durante uma etapa de condicionamento, que pode começar após a fermentação, mas antes da filtragem, a levedura tem tempo, de dias a semanas, para absorver sabores estranhos comuns associados à cerveja "verde" ou sub-condicionada, incluindo enxofre, manteiga e maçãs verdes.

[00123] Nos métodos da invenção, o processo de fermentação é realizado a temperaturas normais, de preferência, 6 - 25º C, preferencialmente, 7 - 20º C, mais preferencialmente, 8 - 13º C, incluindo. A fermentação da cerveja lager é geralmente realizada a temperaturas entre 7 e 13° C.

[00124] Em uma concretização, a quantidade de álcool é reduzida após a fermentação. Para reduzir a quantidade de álcool no produto final de cerveja, o produto de cerveja resultante com uma concentração de álcool acima de 4 vol% é submetido a um processo físico envolvendo, por exemplo, retificação e / ou diálise, incluindo osmose reversa.

[00125] A retificação é geralmente realizada sob pressão reduzida para atingir a ebulição do etanol volátil a uma temperatura que não resulte na quebra de outros ingredientes, como proteínas e açúcares. A referida retificação é, preferencialmente, realizada após a fermentação a uma temperatura elevada a 20 - 50° C sob pressão reduzida. Métodos para retificação a vácuo para reduzir os níveis de álcool foram descritos, por exempo, por Narziss et al., 1993. Brauwelt 133: 1806–1820 e Kern 1994. Alimentacion Equipos y Tecnologia 13: 37–41. Outros métodos adequados incluem retificação de queda de filme (Zufall e Wackerbauer, 2000. Monatsschrift fuer Brauwissenschaft 53: 124–137). Os sistemas de retificação em grande escala adequados estão disponíveis em, por exemplo, KmX Chemical

Corporation, New Church, Virginia, Pope Scientific, Inc., Saukville, Wisconsin, M&L Engineering GmbH, Hofheim am Taunus, Germany, Centec, Maintal, Germany, e API Schmidt Bretten GmbH & Co. KG, Bretten, Alemanha.

[00126] A diálise para reduzir o teor de álcool de uma bebida fermentada inclui a passagem da bebida através de uma membrana semipermeável (Patentes Alemãs Nos. 2 145 298 e 2 413 236). Um processo de diálise preferido é um único processo de osmose reversa para separar uma bebida em um concentrado e um filtrado (Patente Belga No. 717 847, Patente Alemã No. 2 323 094, Patente Alemã No. 2 339 206). Outras variantes compreendem osmose reversa (Pat. U.S. No.

4.317.217) e pervaporação (Pedido de Patente Europeia

332.738). As características de limiar da membrana usada determinam quais moléculas de baixo peso molecular, como os sais, ésteres e aldeídos, são removidas junto com o álcool da bebida fermentada. Além disso, a alta pressão que é exercida durante o processo pode causar desnaturação das moléculas, resultando em alterações nas propriedades físico- químicas, como aumento da turbidez, floculação, etc., e nas propriedades organolépticas, como sabor e sabor modificado. Sistemas de diálise em grande escala adequados estão disponíveis em, por exemplo, Alfa Laval, Lund, Suécia e Osmonics Inc., Minnetonka, Minnesota.

EXEMPLOS Exemplo 1 Materiais e Métodos Cepas e Manutenção

[00127] A cepa de S. eubayanus do tipo CBS 12357

(Libkind et al., 2011. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 14539- 44), foi obtida do Westerdijk Fungal Biodiversity Institute (Utrecht, Holanda). Todas as cepas usadas neste estudo estão listadas nas Tabelas 1 e 3. Culturas estoque de cepas de S. eubayanus foram cultivadas em YPD (10 g L-1 de extrato de levedura, 20 g L-1 de peptona e 20 g L-1 de glicose) até tarde fase exponencial, complementada com glicerol estéril até uma concentração final de 30% (v / v) e armazenada a - 80 ˚C até uso posterior. Meio e Cultivo

[00128] Os plasmídeos foram propagados durante a noite em células Escherichia coli XL1-Blue em 10 mL de meio LB contendo 10 g L-1 de peptona, 5 g L-1 de extrato de levedura Bacto, 5 g L-1 de NaCl e 100 mg L-1 de ampicilina a 37° C. O meio sintético (SM) continha 3,0 g L-1 KH2PO4, 5,0 g L-1 (NH4)2SO4, 0,5 g L-1 MgSO4, 7 H2O, 1 mL L-1 de solução de oligoelementos e 1 mL L-1 de solução de vitamina (Verduyn et al., 1992. Yeast 8:501-17), e foi suplementado com 20 g L-1 de glicose (SMG), maltose (SMM) ou maltotriose (SMMt) por adição de uma solução autoclavada a 50%. Foi utilizada maltotriose com pureza de 95,8% (Glentham Life Sciences, Corsham, Reino Unido). O mosto industrial foi fornecido pela HEINEKEN Supply Chain B.V., Zoeterwoude, Holanda. O mosto foi suplementado com 1,5 g L-1 de Zn2 + pela adição de sulfato hepta-hidratado de zinco, autoclavado por 30 minutos a 121ᵒC e filtrado usando filtros Nalgene 0,2 µm SFCA (Thermo Scientific) antes do uso. Para experimentos realizados com mosto diluído, água desmineralizada estéril foi adicionada ao mosto filtrado no volume apropriado. As culturas aeróbias foram cultivadas em frascos de agitação de 500 mL com 100 mL de meio. Para o cultivo em meio sólido, os meios foram suplementados com 20 g L-1 de ágar. Frasco de agitação e culturas de garrafa foram incubados a 200 RPM em um agitador New Brunswick Innova43 / 43R (Eppendorf Nederland B.V., Nijmegen, Holanda). A seleção das cepas de S. eubayanus transformadas com os plasmídeos pUDP052 (gRNASeSGA1) foi realizada em um meio SMAceG:SMG no qual (NH4)2SO4 foi substituído por 5 g L-1 K2SO4 e 10 mM de acetamida conforme descrito anteriormente (Solis-Escalante et al., 2013. FEMS Yeast Res 13: 126-39). Culturas de frasco de agitação aeróbica

[00129] Culturas em frasco de agitação aeróbia foram inoculadas a partir de pré-culturas aeróbicas em fase estacionária. Os estudos de crescimento em SMMt e SMM foram pré-cultivados em SMM, os estudos de crescimento em SMG foram pré-cultivados em SMG e os estudos de crescimento em mosto diluído três vezes foram pré-cultivados em mosto diluído três vezes. As experiências de crescimento foram realizadas em frascos de agitação de 500 ml contendo 100 ml de meio e foram inoculados a uma DO660 de 0,1. Os frascos de agitação foram incubados a 20˚ C e 200 RPM e as amostras foram retiradas em intervalos regulares para determinar as concentrações de metabólitos extracelulares. Caracterização de garrafa microaeróbica

[00130] Os cultivos em garrafa foram realizados em garrafas de 250 mL com tampa airlock, com volume de trabalho de 200 mL em mosto diluído três vezes e suplementado com 0,4 mL L-1 de pluronic para evitar a formação de espuma (Sigma-

Aldrich). A membrana da tampa foi equipada com uma agulha curta tampada com um filtro de 0,2 µm para evitar o aumento da pressão e a amostragem foi realizada assepticamente através de uma agulha com uma seringa de 3 mL. Os frascos foram inoculados com uma DO660 de 0,1 de pré-culturas de fase estacionária em tubos de reator aeróbio Greiner de 50 ml contendo 30 ml do mesmo meio após 4 dias de incubação a 12° C. Os frascos foram incubados a 12° C e 200 RPM, e amostras de 3,5 mL foram coletadas em uma placa de 24 poços profundos usando um manipulador de líquidos LiHa (Tecan, Männedorf, Suíça) em intervalos regulares para medir OD660 e metabólitos externos. Para cada amostra, 30 µL foram diluídos 5 vezes para 150 µL em uma placa de 96 poços e o OD660 foi medido usando um espectrofotômetro Magellan Infinite 200 PRO (Tecan, Männedorf, Suíça), e a amostra restante foi esterilizada por filtração para medições de HPLC.

[00131] Tabela 1: Cepas de Saccharomyces usadas durante este estudo. Nome Espécies Genótipo relevante Origem CBS S. Diploide tipo selvagem Libkind et 12357 eubayanus al., 2011. PNAS 108: 14539-44 IMS0637 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo IMS0638 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo IMS0639 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo IMS0640 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo

IMS0641 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo IMS0642 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo IMS0643 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo IMS0750 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo IMS0751 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo IMS0752 S. Cepa evoluída derivada Desse eubayanus de CBS 12357 estudo IMX1941 S. ΔSesga1::ScTEF1p- Desse eubayanus SeMALT2-ScCYC1t estudo IMX1942 S. ΔSesga1::ScTEF1p- Desse eubayanus SeMALT413-ScCYC1t estudo CBS S. Group II brewer’s Van den 1483 pastorianus yeast, Heineken’s Broek et bottom yeast, July 1927 al., 2015. Appl Environ Microbiol 81: 6253-67 Mutagênese UV e seleção

[00132] CBS 12357 foi cultivado aerobicamente em SMG a 20˚ C até a fase estacionária e diluído para um OD660 de 1,0 com milliQ. 50 mL desta solução foram centrifugados a 4816 g durante 5 minutos e ressuspensos em água milliQ duas vezes. Verteram-se 25 ml de células lavadas para uma placa de petri de 100 mm x 15 mm sem tampa e irradiou-se com uma lâmpada UV (TUV 30 W T8, Philips, Eindhoven, Holanda) a um pico de radiação de 253,7 nm. 25 mL de células não mutagenizadas e 5 mL de células mutagenizadas foram mantidos para determinar a taxa de sobrevivência. A partir de ambas as amostras foi feita uma diluição de 100 vezes, a partir da qual diluições sucessivas de 10 vezes foram feitas até uma diluição de 100.000 vezes.

Em seguida, 100 µL de cada diluição foram semeados em ágar YPD e o número de colônias foi contado após incubação durante 48h em temperatura ambiente.

Após diluição de 10.000 vezes, 182 colônias se formaram a partir das células não mutagenizadas contra 84 colônias das células mutagenizadas, indicando uma taxa de sobrevivência de 46%. Os 20 ml restantes de células mutagenizadas foram centrifugados a 4816 g durante 5 minutos e ressuspensos em 1 ml de água milliQ.

As células mutagenizadas foram adicionadas a um frasco de agitação de 50 mL contendo 9 mL de SMMt e incubadas por 21 dias a 20° C e 200 RPM.

A concentração de maltotriose foi registrada nos dias 0, 19 e 21. No dia 21, 100 µL da cultura cultivada foram transferidos duas vezes para um frasco de agitação fresco com SMMt e incubados até a fase estacionária.

No final da segunda transferência, isolados de células individuais foram obtidos usando o BD FACSAria™ II SORP Cell Sorter (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) equipado com lasers de 355 nm, 445 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm e um Bico de 70 µm e operado com FACSFlow™ filtrado (BD Biosciences). O desempenho do citômetro foi avaliado antes de cada experimento executando um ciclo CST com CS&T Beads (BD Biosciences). O retardo de queda para classificação foi determinado executando um ciclo de Atraso de queda automática com Accudrop Beads (BD Biosciences). A morfologia celular foi analisada plotando a dispersão direta (FSC) contra a dispersão lateral (SSC). Células individuais bloqueadas foram classificadas em placas de microtitulação de 96 poços contendo SMMt usando uma máscara de classificação de "célula única", correspondendo a uma máscara de rendimento de 0, uma máscara de pureza de 32 e uma máscara de fase de 16. A placa de 96 poços foi incubada durante 96h à temperatura ambiente em um espectrofotômetro de microplaca GENIos Pro (Tecan, Männedorf, Suíça) e o crescimento foi monitorado por OD660. Finalmente, a biomassa foi ressuspensa e o OD660 final foi medido. Os 7 isolados com a maior OD660 final foram colhidos, riscados novamente e estocados como IMS0637-643. Cultivo de quimiostato limitado por maltotriose

[00133] Os cultivos de quimostato foram realizados em Mini Fermentadores Multifors 2 (INFORS HT, Velp, Holanda) equipados com um sensor de nível para manter um volume de trabalho constante de 100 mL. A temperatura da cultura foi controlada em 20° C e a taxa de diluição foi fixada em 0,03 h−1 controlando a taxa de influxo do meio. As culturas foram cultivadas em mosto diluído seis vezes suplementado com 10 g L-1 de maltotriose adicional (Glentham Life Sciences), 0,2 mL L-1 de emulsão anti-espuma C (Sigma ‐ Aldrich, Zwijndrecht, Holanda), 10 mg L-1 ergosterol, 420 mg L-1 TWEEN® 80 e 5 g L-1 de sulfato de amônio. O TWEEN® e o ergosterol foram adicionados como uma solução conforme descrito anteriormente (Verduyn et al., 1992. Yeast 8: 501-17). IMS0637-IMS0643 foram cultivados durante a noite a 20˚ C e 200 RPM em frascos de agitação separados em mosto diluído três vezes. A DO660 de cada cepa foi medida e o equivalente a 7 mL a uma DO660 de 20 de cada cepa foi reunido em um volume total de 50 mL. Para inocular o reator, foram usados 20 mL das culturas reunidas. Após o crescimento durante a noite, as bombas de entrada de meio foram ligadas e o fermentador foi aspergido com 20 mL min-1 de gás nitrogênio e agitado a 500 RPM. O pH não foi ajustado. As amostras foram coletadas semanalmente. Por falha técnica no 63º dia, o quimiostato foi autoclavado, limpo e reiniciado com amostra colhida no mesmo dia. Após um total de 122 dias, o quimiostato foi interrompido e isolados de colônia única foram classificados em ágar SMMt usando o FACS, como para IMS0637-IMS0643. Três colônias foram escolhidas aleatoriamente, riscadas novamente e armazenadas como IMS0750-752. Isolamento genômico e sequenciamento do genoma completo

[00134] As culturas de levedura foram incubadas em tubos Greiner de 50 ml contendo meio YPD líquido a 20° C em um agitador orbital ajustado a 200 RPM até que as cepas atingissem a fase estacionária com um OD660 entre 12 e 20. O DNA genômico para o sequenciamento do genoma inteiro foi isolado usando o Kit Qiagen 100 / G (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante e quantificado usando um Qubit® Fluorometer 2.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).

[00135] O DNA genômico das cepas CBS 12357, IMS0637- IMS0643 e IMS0750-IMS0752 foi sequenciado por Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd (Yuen Long, Hong Kong) em um sequenciador HiSeq2500 (Illumina, San Diego, CA) com 150 bp de leitura de extremidade emparelhada usando preparação de biblioteca livre de PCR. Todas as leituras estão disponíveis no NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) sob o número de acesso de bioprojeto PRJNA492251.

[00136] O DNA genômico das cepas IMS0637 e IMS0750 foi sequenciado em um Nanopore MinION (Oxford Nanopore

Technologies, Oxford, Reino Unido). As bibliotecas foram preparadas usando 1D-ligation (SQK-LSK108) conforme descrito anteriormente (Salazar et al., 2017. FEMS Yeast Res 17: doi:

10.1093 / femsyr / fox074) e analisadas em célula de fluxo FLO-MIN106 (R9.4) conectada para uma unidade MinION Mk1B (Oxford Nanopore Technology). O software MinKNOW (versão

1.5.12; Oxford Nanopore Technology) foi usado para o controle de qualidade dos poros ativos e para o sequenciamento. Os arquivos brutos gerados pelo MinKNOW foram chamados de base usando o Albacore (versão 1.1.0; Oxford Nanopore Technology). As leituras com comprimento mínimo de 1000 bp foram extraídas no formato fastq. Todas as leituras estão disponíveis no NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) sob o número de acesso de bioprojeto PRJNA492251. Análise Genômica

[00137] Para as cepas CBS 12357, IMS0637-IMS0643, IMS0750-IMS0752 e IMS0760-IMS0762, as leituras Illumina brutas foram alinhadas contra um genoma de referência de nível de cromossomo da cepa do tipo S. eubayanus CBS 12357 (Brickwedde et al., 2018. Front Microbiol 9 : 1786) usando a ferramenta Burrows – Wheeler Alignment (BWA), e posteriormente processado usando SAMtools e Pilon para chamada de variantes (Li e Durbin, 2010. Bioinformatics 26: 589-95; Li et al., 2009. Bioinformatics 25: 2078- 9; Walker et al., 2014. PloS One 9: e112963). SNPs heterozigotos e INDELs que eram heterozigotos em CBS 12357 foram desconsiderados. As translocações cromossômicas foram detectadas usando Breakdancer (Chen et al., 2009. Nat Methods 6: 677). Apenas translocações que foram suportadas por pelo menos 10% das leituras alinhadas naquele locus foram consideradas.

[00138] A variação do número de cópias cromossômicas foi estimada usando Magnolya (Nijkamp et al., 2012. Bioinformática 28: 3195-202) com a configuração de gama definida como "nenhum" e usando o montador ABySS (v 1.3.7) com um tamanho de k-mer de 29 (Simpson et al., 2009. Genome Res 19: 1117-23). Todos os SNPs, INDELs, recombinações e alterações no número de cópias foram confirmados manualmente, visualizando os arquivos .bam gerados no software Integrative Genomics Viewer (IGV) (Robinson et al.,

2011. Nat Biotechnol 29:24).

[00139] Para as cepas IMS0637 e IMS0750, as leituras de sequenciamento de nanopore foram montadas de novo usando Canu (versão 1.3) (Koren et al., 2017. Genome Res 27: 722- 736) com tamanho do genoma definido para 12 Mbp. A exatidão da montagem foi avaliada usando Pilon (Walker et al., 2014. PloS One 9: e112963) e a correção adicional de "polimento" de erros de sequenciamento / montagem foi realizada alinhando as leituras Illumina com BWA (Li e Durbin, 2010. Bioinformática 26: 589 -95) usando correção de apenas SNPs e indels curtos (parâmetro –fix bases). Longas leituras de sequenciamento de IMS0637 e IMS0750 foram alinhadas aos genomas de referência obtidos e ao genoma de referência de CBS 12357 usando minimap2 (Li, 2018. Bioinformática 34: 3094- 3100). Todas as leituras estão disponíveis no NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) sob o número de acesso de bioprojeto PRJNA492251.

Métodos de biologia molecular

[00140] Para PCR de colônia e sequenciamento Sanger, o DNA genômico foi preparado fervendo em 10 μL de NaOH 0,02 M por cinco minutos. Para verificar se os isolados pertenciam à espécie S. eubayanus, a presença do gene específico de S. eubayanus SeFSY1 foi testada por amplificação por PCR usando os iniciadores 8572 e 8573 (Pengelly and Wheals, 2013. FEMS Yeast Res 13: 156-61), e a ausência do gene específico de S. cerevisiae ScMEX67 foi testada por amplificação por PCR usando os iniciadores 8570 e 8571 (Muir et al., 2011. FEMS Yeast Res 11: 552-63). Para confirmação adicional da natureza de S. eubayanus, as regiões ITS foram amplificadas usando os iniciadores 10199 e 10202 e os fragmentos amplificados foram sequenciados Sanger (Schoch et al., 2012. Proc Natl Acad Sci USA 109: 6241-6). As sequências resultantes foram comparadas com as sequências ITS disponíveis e classificadas como as espécies para as quais a região amplificada tinha a identidade de sequência mais elevada. A presença dos genes SeMALT foi verificada por PCR usando iniciadores específicos do gene: 10491 e 10492 para SeMALT1, 10632 e 10633 para SeMALT2 e SeMALT4 / 2, 10671 e 10672 para SeMALT3, 10491 e 10671 para SeMALT13, e 10633 e 10671 para SeMALT413. Os fragmentos amplificados foram purificados em gel e Sanger sequenciados usando os primers usados para amplificá-los. Construção de plasmídeo

[00141] Todos os plasmídeos e primers usados neste estudo estão listados na Tabela 2 e Tabela 3. A amplificação de DNA para a construção de plasmídeo e cepa foi realizada usando polimerase de DNA de alta fidelidade Phusion

(ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fornecedor. A região codificadora de SeMALT413 foi amplificada a partir do DNA genômico de IMS0750 com o par de iniciador 10633/10671. Cada iniciador carregava uma extensão de 40 bp complementar ao esqueleto do plasmídeo de p426-TEF- amds (Marques et al., 2017. FEMS Yeast Res 17: fox006), que foi amplificado por PCR usando os iniciadores 7812 e 5921. O fragmento era “Gibson” montado (Gibson et al., 2009. Nat Methods 6: 343) com o fragmento de estrutura principal p426- TEF-amdS usando NEBuilder HiFi DNA Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA), resultando no plasmídeo pUD814. Construção da Cepa

[00142] Para integrar e superexpressar as ORFs SeMALT2 e SeMALT413 em S. eubayanus CBS 12357, SeMALT2 e SeMALT413 foram amplificados a partir de pUD480 e pUD814, respectivamente, com os iniciadores 13559/13560 que carregavam uma região de 40 bp homóloga a cada flanco do gene SeSGA1 localizado no cromossomo IX de S. eubayanus. Para facilitar a integração, os fragmentos de PCR foram cotransformados com o plasmídeo pUDP052 que expressou Spcas9D147Y P411T (Bao et al., 2014. ACS Synth Biol 4: 585- 94; Gorter de Vries et al., 2017. Microb Cell Fact 16: 222) e um gRNA direcionado a SeSGA1 (Brickwedde et al., 2018. Front Microbiol 9: 1786). A cepa IMX1941 foi construída transformando CBS 12357 com 1 µg do cassete de expressão SeMALT2 amplificado e 500 ng do plasmídeo pUDP052 por eletroporação, conforme descrito anteriormente (Gorter de Vries et al., 2017. Microb Cell Fact 16: 222). Os transformantes foram selecionados em placas SMAceG. Da mesma forma, IMX1942 foi construído transformando CBS 12357 com 1 µg da cassete de expressão SeMALT413 amplificada para SeMALT413 em vez de SeMALT2. A integração correta foi verificada por PCR de diagnóstico com o par de primer 12635/12636. Todas as sequências de genes amplificadas por PCR foram sequenciadas por Sanger (Baseclear, Leiden, Holanda). Previsão da estrutura da proteína

[00143] A modelagem de homologia do transportador SeMalt413 foi realizada usando o servidor SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014. Nucleic Acids Res 42 (W1): W252-W8). SeMALT413 foi traduzido e usado como entrada. O modelo do simportador de prótons de xilose XylE (PDB: 4GBY) foi escolhido como molde (Lam et al., 1980. J Bacteriol 143: 396-402). Os modelos foram construídos com base no alinhamento do modelo de destino usando ProMod3. As coordenadas que são conservadas entre o alvo e o modelo são copiadas do modelo para o modelo. As inserções e exclusões são remodeladas usando uma biblioteca de fragmentos. As cadeias laterais são reconstruídas. Finalmente, a geometria do modelo resultante é regularizada usando um campo de força. Caso a modelagem de loop com ProMod3 falhe, um modelo alternativo é construído com PROMOD- II (Guex et al., 2009. Eletroforese 30: S162-S73). O modelo 3D foi avaliado e colorido usando Pymol (The PyMOL Molecular Graphics System, Versão 2.1.1 Schrödinger, LLC.). Tabela 2: Plasmídeos usados durante este estudo. Nome Genótipo relevante Fonte pUDP052 ori (ColE1) bla panARSopt amdSYM Brickwedde ScTDH3pr‐gRNASeSGA1‐ScCYC1ter AaTEF1pr‐ et al., Spcas9D147Y P411T‐ScPHO5ter 2018. Front Microbiol 9: 1786 pUDE044 ori (ColE1) bla 2μ ScTDH3pr‐ de Kok et ScMAL12‐ScADH1ter URA3 al., 2011. Metab Eng 13: 518-26 p426- ori (ColE1) bla 2μ amdSYM ScTEF1pr- Marques et TEF- ScCYC1ter al., 2017. amdS FEMS Yeast Res 17:fox00613 pUD479 ori (ColE1) bla 2μ amdSYM ScTEF1pr‐ Brickwedde SeMALT1‐ScCYC1ter et al.,

2018. Front Microbiol 9: 1786 pUD480 ori (ColE1) bla 2μ amdSYM ScTEF1pr‐ Brickwedde SeMALT2‐ScCYC1ter et al.,

2018. Front Microbiol 9: 1786 pUD814 ori (ColE1) bla 2μ amdSYM ScTEF1pr‐ This study SeMALT413‐ScCYC1ter Analítica

[00144] As concentrações de etanol e dos açúcares glicose, maltose e maltotriose foram medidas usando uma cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) Agilent Infinity 1260 series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)

usando uma coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H a 65 ° C e uma fase móvel de ácido sulfúrico 5mM com uma taxa de fluxo de 0,8 mL por minuto. Os compostos foram medidos usando um RID a 35° C. As amostras foram centrifugadas (13.000xg por 5 minutos) para coletar o sobrenadante ou esterilizar em filtro de 0,2 µm antes da análise. Resultados Mutagênese e evolução permitem que S. eubayanus utilize a maltotriose

[00145] A cepa do tipo Saccharomyces eubayanus CBS 12357 consome maltose, mas não maltotriose, um dos principais açúcares fermentáveis no mosto de cerveja (Hebly et al.,

2015. FEMS Yeast Res 15: fov005). Na tentativa de obter mutantes capazes de utilizar a maltotriose, a evolução laboratorial foi aplicada (ver Figura 1). Para aumentar a diversidade genética inicial, a cepa CBS 12357 foi submetida a uma leve mutagênese no UV, que resultou em uma taxa de sobrevivência de 46%. O pool de mutantes foi inoculado em meio SM contendo 20 g L-1 de maltotriose (SMMt) como única fonte de carbono e incubado a 20˚C para enriquecimento para mutantes consumidores de maltotriose. Após uma fase lag de duas semanas, o crescimento foi observado e a concentração de maltotriose diminuiu para 10,48 g L-1 após 21 dias. Após duas transferências subsequentes em meio SMMt, 96 células individuais foram classificadas em uma placa de microtitulação YPD usando FACS. Após a incubação, as culturas de células únicas resultantes foram plaqueadas em réplicas em uma placa de microtitulação SMMt e o crescimento foi monitorado com base em OD660. Os sete isolados com o OD660 final mais alto foram selecionados e nomeados IMS0637- IMS0643.

[00146] A amplificação por PCR do gene SeFSY1 específico de S. eubayanus e o sequenciamento da região ITS confirmaram que todos os 7 isolados pertenciam à espécie S. eubayanus (dados não mostrados). Para caracterizar o seu crescimento em maltotriose, o CBS 12357 de tipo selvagem, os mutantes IMS0637-IMS0643 e a cepa de S. pastorianus consumidor de maltotriose CBS 1483 foram caracterizados em frascos de agitação contendo SMMt a 20 ° C (Figura 2A). Enquanto CBS 12357 não mostrou qualquer consumo de maltotriose após 187 h, a quantidade residual de maltotriose caiu abaixo de 50% após 91 h para IMS0637-IMS0643 e após 43 h para CBS 1483. Apesar da utilização mais lenta da maltotriose, a atenuação final da maltotriose atingiu 92,7 ± 1,6% para mutantes IMS0637-IMS0643, comparativamente à atenuação final de 92,1% alcançada pela referência de consumo de maltotriose CBS 1483.

[00147] Embora esses resultados indiquem que a maltotriose foi utilizada em meio sintético, a utilização da maltotriose no mosto de cerveja foi necessária para aplicabilidade industrial. As cepas foram caracterizadas em frascos de agitação contendo mosto diluído três vezes. Enquanto S. pastorianus CBS 1483 consumiu 50% da maltotriose após 145 h, os mutantes IMS0637-IMS0643 não consumiram nenhuma maltotriose após 361 h, assim como S. eubayanus CBS 12357 tipo selvagem (Figura 2B). Portanto, para melhorar a capacidade de utilizar a maltotriose sob condições de fermentação, os mutantes IMS0637-IMS0643 foram submetidos à evolução em laboratório em um quimiostato de carbono limitado em mosto de cerveja enriquecido com maltotriose. Nessas condições, os mutantes com uma afinidade melhorada ou uma taxa de transporte mais alta para o crescimento na maltotriose seriam menos limitados por nutrientes, resultando em uma forte vantagem seletiva. Para tanto, as células foram cultivadas em mosto diluído seis vezes suplementado com 10 g L-1 de maltotriose, resultando em uma concentração final de 2 g L-1 de glicose, 15 g L-1 de maltose e 15 g L-1 de maltotriose.

[00148] Para prevenir a limitação de oxigênio e nitrogênio, foram suplementados 10 mg L-1 de ergosterol, 420 mg L-1 TWEEN® 80 e 5 g L-1 de sulfato de amônio. Os mutantes UV IMS0637-IMS0643 foram reunidos e usados para inocular o reator. No lote inicial, toda a glicose e maltose foram consumidas, deixando a maltotriose como a única fonte de carbono restante. A cultura contínua foi operada a uma taxa de diluição de 0,03 h-1, e a vazão inicialmente continha 13,2 g L-1 de maltotriose. Ao longo de um período de 121 dias, a concentração de maltotriose diminuiu progressivamente para 7,0 g L -1 (Figura 2C). Nesse ponto, 10 células individuais da cultura foram classificadas por FACS em placas de ágar SMMt e incubadas a 20° C. A amplificação por PCR do gene SeFSY1 específico de S. eubayanus e o sequenciamento da região ITS confirmaram que todos os isolados testados pertenciam à espécie S. eubayanus (dados não mostrados). Três linhas de células únicas foram isoladas, denominadas IMS0750, IMS0751 e IMS0752, e caracterizadas a 12° C em culturas microaeróbicas contendo mosto diluído três vezes, juntamente com o tipo selvagem CBS 12357 e o S. pastorianus CBS 1483 (Figura 2D). Enquanto CBS 12357 e IMS0751 só foram capazes de consumir glicose e maltose, os isolados evoluídos IMS0750, IMS0752 e CBS 1483 consumiram maltotriose. Após 263 h, a concentração de maltotriose diminuiu de 20 para 4,3 g L-1 de maltotriose para IMS0750 e IMS0752 e para 2,0 g L-1 para CBS 1483. Devido à sua incapacidade de utilizar maltotriose no mosto, IMS0751 não foi estudado mais.

[00149] Estes resultados confirmaram que as cepas evoluídas IMS0750 e IMS0752 foram capazes de consumir maltotriose em mosto quase tão bem quanto a referência de S. pastorianus CBS 1483, enquanto as cepas mutagenizadas IMS0637-IMS0643 só foram capazes de utilizar maltotriose quando fornecida como única fonte de carbono em médio (SMMt). Tabela 3. Primers usados nesse trabalho

Sequenciamento do genoma completo revela um novo gene SeMALT quimérico recombinado

[00150] Os genomas do CBS 12357 de tipo selvagem,

dos mutantes UV IMS0637-IMS0643 e das cepas evoluídas IMS0750 e IMS0752 foram sequenciados usando leituras Illumina de extremidade emparelhada de 150 bp. Os dados de sequenciamento foram mapeados para uma montagem em nível de cromossomo do genoma do CBS 12357 de tipo selvagem (Brickwedde et al.,

2018. Front Microbiol 9: 1786) para identificar SNPs, INDELs e mutações CNV em relação ao CBS 12357. Os genomas do Mutantes UV IMS0637, IMS0640, IMS0641 e IMS0642 compartilharam um conjunto de 116 SNPs, 5 INDELs e 1 variação do número de cópias (Figura 3A). Além dessas mutações, IMS0638, IMS0639 e IMS0643 tinham três SNPs adicionais. Todas as mutações em IMS0637-IMS0643 eram heterozigotas, com exceção de apenas 3 SNPs. A prevalência de SNPs heterozigotos foi provavelmente causada pelo acasalamento dos esporos mutagenizados de CBS 12357, que resultou em um tipo selvagem e um alelo mutado em cada posição mutada. Das mutações em IMS0637, 34 SNPs e todos os 5 INDELs afetaram as regiões intergênicas, 30 SNPs eram sinônimos, 48 SNPs resultaram em substituições de aminoácidos e 4 SNPs resultaram em códon de parada prematura (dados não mostrados). Até onde sabemos, nenhum dos 52 SNPs não sinônimos afetou genes previamente ligados à utilização da maltotriose. A única variação do número de cópias dizia respeito a uma duplicação da região subtelomérica direita de CHRVIII. O emparelhamento read-mate indicou que a região duplicada estava ligada ao braço esquerdo de CHRII, causando a substituição da região subtelomérica esquerda de CHRII por uma translocação não recíproca. Embora não seja considerada significativa por Pilon, a região subtelomérica esquerda de CHRII de fato apresentou uma cobertura de sequenciamento inferior. Curiosamente, a região afetada de CHRII abrigou o gene SeMALT1 não expresso (Brickwedde et al., 2018. Front Microbiol 9: 1786), embora sua perda tenha sido estimada como improvável para melhorar a utilização da maltotriose.

[00151] Uma vez que a capacidade de utilizar maltotriose no mosto surgiu apenas após a evolução laboratorial, as mutações presentes no IMS0750 e IMS0752 foram estudadas com mais detalhes. IMS0750 e IMS0752 compartilharam 95 SNPs, 3 INDELs e 1 variação do número de cópias com mutantes UV IMS0637-643 (Figura 3A). IMS0750 e IMS0752 eram quase idênticos: IMS0752 tinha um SNP silencioso que estava ausente em IMS0750. Em relação a IMS0637-IMS0643, 16 SNPs e 1 INDEL que eram heterozigotos tornaram-se homozigotos, e 21 SNPs e 2 INDELs que eram heterozigotos em IMS0637 não foram mais mutados em IMS0750 e 752. Além disso, surgiram 5 SNPs e 4 variações de número de cópias que foram ausente em IMS0637-643 (Figura 3A). Os 5 SNPs consistiam em dois SNPs heterozigotos intergênicos, um SNP heterozigoto não sinônimo no gene de função desconhecida SeBSC1, um SNP homozigoto não sinônimo no componente putativo da via regulatória TOR SeMDS3 e um SNP heterozigoto não sinônimo no gene de direcionamento vacuolar SePEP1. Mudanças no número de cópias afetaram várias regiões que abrigam genes SeMALT: uma duplicação de 550 bp de CHRII incluindo SeMALT1 (coordenadas 8950 a 9500), uma duplicação do braço esquerdo de CHRXIII incluindo SeMALT3 (coordenadas 1-10275), perda do braço esquerdo de CHRXVI (coordenadas 1-15350) e perda de 5,5 kb de CHRXVI incluindo SeMALT4 (coordenadas 16850-

22300).

[00152] A análise do emparelhamento de pares lidos indicou que a variação do número de cópias resultou de um conjunto complexo de recombinações entre os cromossomos II, XIII e XVI. O alto grau de similaridade dos loci MAL afetados e sua localização nas regiões subteloméricas dificultaram a reconstrução exata das mutações. Portanto, IMS0637 e IMS0750 foram sequenciados usando sequenciamento de leitura longa na plataforma MinION da ONT e um conjunto de genoma de novo foi feito para cada cepa. A comparação das montagens resultantes com a montagem ao nível do cromossomo de CBS 12357 indicou que ocorreram duas recombinações. Tanto no IMS0637 quanto no IMS0750, uma cópia adicional dos últimos 11500 nucleotídeos do braço direito do cromossomo VIII substituiu os primeiros 11400 nucleotídeos de uma das duas cópias do braço esquerdo do cromossomo II (Figura 3B). Esta recombinação foi consistente com as alterações do número de cópias das regiões afetadas em IMS0637-IMS0643, IMS0750 e IMS0752 e resultou na perda de uma cópia do locus MAL abrigando SeMALT1. Além disso, a montagem do genoma de IMS0750 indicou a substituição de ambas as cópias dos primeiros 22,3 kbp de CHRXVI por sequências complexamente reorganizadas de CHRII, CHRXVIII e CHRXVI. A região recombinada consistia precisamente nos primeiros 10.273 nucleotídeos do braço esquerdo de CHRIII, seguidos por 693 nucleotídeos de CHRII, 1.468 nucleotídeos de CHRXVI e 237 nucleotídeos de CHRXIII (Figura 3B).

[00153] As recombinações não foram recíprocas, uma vez que as regiões presentes no cromossomo recombinado mostraram maior cobertura de sequenciamento, enquanto as regiões circundantes permaneceram inalteradas. Essa recombinação resultou na perda do locus MAL canônico que abrigava SeMALT4 no cromossomo XVI.

[00154] No entanto, a sequência recombinada continha uma estrutura de leitura aberta quimérica consistindo no início de SeMALT4 de CHRXVI, no meio de SeMALT1 de CHRII e no final de SeMALT3 de CHRXIII (Figura 3C).

[00155] Para verificar esta recombinação, o ORF foi amplificado por PCR usando iniciadores de ligação ao promotor de SeMALT4 e ao terminador de SeMALT3. Como esperado, uma banda foi obtida para IMS0750, mas não para CBS 12357. O sequenciamento Sanger do fragmento amplificado confirmou a organização quimérica da nova estrutura de leitura aberta do alelo, que denominamos SeMALT413. A sequência de SeMALT413 codifica uma proteína de comprimento total com 100% de identidade com SeMALT4 para os nucleotídeos 1-434 e 1113- 1145, 100% de similaridade com SeMALT1 para os nucleotídeos 430-1122 e 100% de similaridade com SeMALT3 para os nucleotídeos 1141-1842 (Figura 3C).

[00156] Uma vez que os nucleotídeos 1123-1140 mostraram apenas 72% de similaridade com SeMALT1 e 61% de similaridade com SeMALT3, esses nucleotídeos representam uma introgressão adicional de CHRXVI que não foi detectada anteriormente (Figura 3B). Enquanto os primeiros 434 nucleotídeos podem ser claramente atribuídos a SeMALT4 devido a uma diferença de nucleotídeos com SeMALT2, os nucleotídeos 1123-1140 são idênticos em SeMALT2 e SeMALT4, portanto, a sequência também pode ter vindo de SeMALT2 em CHRV. Notavelmente, SeMALT413 tinha uma identidade de sequência de apenas 85 a 87% com os genes SeMALT originais, e a sequência de proteína correspondente exibia entre 52-88% de similaridade. Portanto, postulamos que o transportador SeMalt413 recombinado pode ter uma especificidade de substrato alterada e pode ser responsável pela utilização de maltotriose observada.

[00157] A fim de investigar a estrutura terciária do gene SeMALT413 quimérico, uma previsão foi feita usando SWISS-MODEL com base na homologia estrutural com o simportador de prótons de xilose bacteriana XylE de Escherichia coli (Lam et al., 1980. J Bacteriol 143: 396- 402), uma referência anteriormente usada para modelar a estrutura de ScAgt1 (Henderson e Poolman, 2017. Sci Rep 7: 14375). Como transportadores de maltose em Saccharomyces, XylE é um simportador de prótons com um domínio transmembranar composto por 12 hélices α pertencentes à superfamília de facilitadores principais, de forma semelhante a SeMalt413 (dados não mostrados). A estrutura prevista de SeMalt413 revelou que 1 α-hélice foi formada exclusivamente por resíduos de SeMalt4, 4 α-hélices foram formadas exclusivamente por resíduos de SeMalt1 e 5 α-hélices foram formadas exclusivamente por resíduos de SeMalt3 (Figura 3D). Além disso, 2 α-hélices eram compostas por resíduos de mais de um transportador. Uma vez que os primeiros 100 aminoácidos foram excluídos do modelo devido à ausência de resíduos semelhantes no modelo de referência do simportador de xilose, a contribuição da sequência SeMalt4 foi subestimada. A estrutura prevista de SeMalt413 foi altamente semelhante às estruturas previstas de SeMalt1,

SeMalt3 e SeMalt4, indicando que reteve a estrutura geral de um transportador funcional de maltose (dados não mostrados).

[00158] Embora diferenças estruturais marginais tenham sido identificadas, não ficou claro se elas poderiam resultar na capacidade de transportar maltotriose, uma vez que não se sabe quais resíduos determinam a especificidade do substrato de tais transportadores (Henderson e Poolman,

2017. Sci Rep 7: 14375). Além disso, a capacidade de utilizar a maltotriose provavelmente depende das propriedades químicas dos resíduos que determinam a especificidade do substrato. Introdução do gene SeMALT413 no tipo selvagem CBS 12357 permite a utilização da maltotriose

[00159] Para testar a sua funcionalidade e especificidade de substrato, SeMALT413 foi superexpresso no S. eubayanus CBS 12357 de tipo selvagem. O transportador de maltotriose SeMALT413 putativo foi amplificado de IMS0750 por PCR (dados não mostrados) e integrado na estrutura do plasmídeo de p426-TEF-amdS entre um promotor ScTEF1 expresso constitutivamente e o terminador ScCYC1, por montagem “Gibson” (Gibson et al., 2009. Nat Methods 6: 343).

[00160] O plasmídeo pUD814 resultante foi verificado por sequenciamento Sanger, que confirmou que o seu SeMALT413 ORF era idêntico ao ORF recombinado encontrado na montagem nanopore de IMS0750 (Figura 3C). O plasmídeo pUDP052 expressando cas9 e um gRNA direcionado a SeSGA1 foi previamente usado com sucesso para integração de genes no locus SeSGA1 em CBS 12357 (Brickwedde et al., 2018. Front Microbiol 9: 1786). Portanto, um fragmento de reparo foi amplificado de pUD814 que continha a cassete de expressão ScTEF1pr-SeMALT413-ScCYC1ter flanqueada por braços de homologia de 40 pb para integração no locus SeSGA1 (Figura 4). O S. eubayanus CBS 12357 de tipo selvagem foi transformado com pUDP052 e o fragmento de reparação, resultando na substituição do locus SeSGA1 pelo gene SeMALT413 (Figura 4A). Como controle, um fragmento de reparo contendo o SeMALT2 ORF de tipo selvagem entre o promotor ScTEF1 e o terminador ScCYC1 foi amplificado a partir de pUD480 e integrado de maneira semelhante.

[00161] As cepas resultantes IMX1941 (ScTEF1pr- SeMALT2-ScCYC1ter) e IMX1942 (ScTEF1pr-SeMALT413-ScCYC1ter) foram caracterizadas e comparadas com CBS 12357 de tipo selvagem e o mutante evoluído IMS0750 em SM com diferentes fontes de carbono. As taxas de crescimento foram determinadas com base em medições de OD660 em intervalos regulares. Na glicose, IMX1941 e IMX1942 cresceram com uma taxa de crescimento específica de 0,25 ± 0,01 h-1, enquanto IMS0750 cresceu mais rápido com uma taxa de crescimento específica de 0,28 ± 0,01 h-1. A glicose foi completamente consumida após 33 horas (Figura 4B). Na maltose, CBS 12357 e IMX1941 cresceram com uma taxa de crescimento específica de 0,19 ± 0,01 h-1, IMX1942 cresceu com uma taxa de crescimento específica de 0,18 ± 001 h-1 e IMS0750 cresceu mais devagar com uma taxa de crescimento específica de 0,17 ± 0,01 h-1. A maltose foi completamente consumida após 43 horas (Figura 4C). Na maltotriose, apenas o mutante evoluído IMS0750 e a cepa de engenharia reversa IMX1942 (ScTEF1pr-SeMALT413- ScCYC1ter) foram capazes de crescer e consumir maltotriose.

[00162] Enquanto, IMS0750 cresceu exponencialmente com uma taxa de crescimento de 0,19 ± 0,01 h-1 e consumiu ± 55% da maltotriose, IMX1942 cresceu com uma taxa de crescimento de apenas 0,03 ± 0,00 h-1 e consumiu 45% da maltotriose após 172 horas, demonstrando funcionalidade do transportador quimérico SeMalt413 (Figura 4D).

[00163] No entanto, o crescimento da maltotriose após a superexpressão de SeMALT413 não correspondeu ao da cepa evoluída IMS0750. Além disso, IMS0750 exibiu aumento da captação de glicose, mas diminuiu a captação de maltose, sugerindo que pode haver uma troca evolutiva favorecendo a glicose e a maltotriose em detrimento da maltose. Aplicabilidade de uma cepa de S. eubayanus consumidora de maltotriose para a fabricação de cerveja lager.

[00155] Como as cepas de S. eubayanus são usadas atualmente para a fabricação de cerveja lager industrial (Brickwedde et al., 2018. Front Microbiol 9: 1786), a cepa evoluída IMS0750 e sua cepa parental CBS 12357 foram testadas em fermentadores de 7 L em alta gravidade 17° Mosto de Platô em duplicado (Figura 5). A cepa de engenharia reversa IMX1942 não foi testada, uma vez que sua natureza geneticamente modificada impede o uso industrial devido a problemas de aceitação do cliente (Varzakas et al., 2007. Crit Rev Food Sci Nutr 47: 335-61). Após 333 h, IMS0750 consumiu completamente toda a glicose e maltose, e a concentração de maltotriose caiu de 1,93% m / v) para 0,47% (m / v) (Figura 5). Essa redução de 75% na maltotriose superou a redução de 60% alcançada anteriormente em garrafas (de 10,5 g L-1 para 4,3 g L-1, Figura 2D).

[00156] Em contraste, CBS 12357 não utilizou nenhuma maltotriose. Além da utilização melhorada da maltotriose, o IMS0750 expressou um consumo melhorado de maltose: toda a maltose foi esgotada em menos de 200 h, enquanto o CBS 12357 havia esgotado a maltose somente após 333 h (Figura 5). De acordo com a melhor utilização do açúcar, a concentração final de etanol foi 18,5% maior para IMS0750 do que para CBS 12357 (Figura 5).

[00157] Para explorar ainda mais as características relacionadas à fabricação de cerveja de IMS0750, a concentração de vários ésteres definidores de aroma, álcoois superiores e dicetonas vicinais foram monitorados. As concentrações finais de ésteres e álcoois superiores foram predominantemente maiores no sobrenadante da cultura IMS750, embora apenas o aumento da concentração de acetato de isoamila fosse estatisticamente significativo (dados não mostrados). Além disso, ésteres e álcoois se acumularam mais rápido no IMS0750 do que no CBS 12357, provavelmente devido ao consumo mais rápido de açúcar.

[00158] Em conjunto, esses resultados indicam que a IMS0750 é capaz de utilizar a maltotriose em condições industriais e sugere que ela pode expressar uma gama mais ampla de características aprimoradas para a fabricação de cerveja.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Levedura Saccharomyces eubayanus mutante caracterizada pelo fato de que é capaz de fermentar maltotriose, compreendendo um gene transportador de maltose quimérico no qual parte de uma primeira sequência de gene codificante é translocada adjacente a parte de uma segunda sequência de gene codificante, de modo que a proteína quimérica produzida abriga parte do referido primeiro produto gênico e parte do referido segundo produto gênico.

2. Levedura de S. eubayanus mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende partes do gene de SeMALT1, SeMALT2, SeMALT3 e / ou SeMALT4, de preferência, SeMALT4 / SeMALT1 / SeMALT2 ou SeMALT4 / SeMALT3.

3. Levedura mutante de S. eubayanus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de ter um gene transportador de maltose quimérico compreendendo os nucleotídeos 1-434 de SeMALT4, nucleotídeos 430-1122 de SeMALT1, nucleotídeos 1113-1145 de SeMALT2 ou SeMALT4 e nucleotídeos 1141 -1842 de SeMALT3, conforme representado na Figura 3C.

4. Levedura mutante de S. eubayanus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que tem uma atividade de descarboxilação reduzida de ácidos fenólicos, de preferência, isenta de produzir 4-vinil guaiacol.

5. Método para a produção de uma levedura híbrida, caracterizado pelo fato de que compreende a) fornecer a levedura de S. eubayanus mutante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 4, como um primeiro progenitor e uma segunda levedura como um segundo progenitor, em que o referido segundo progenitor difere do primeiro progenitor, b) hibridizar células do primeiro progenitor com células do segundo progenitor c) identificar um organismo híbrido resultante.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o segundo progenitor é uma levedura do complexo Saccharomyces sensu stricto.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que as células do primeiro e / ou segundo progenitor são marcadas com um corante fluorescente, antes de hibridizar as células.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a hibridização é realizada a uma temperatura que é pelo menos 5° C abaixo da temperatura de crescimento ideal do primeiro e / ou do segundo progenitor.

9. Levedura híbrida produzida pelo método conforme definido por qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizada pelo fato de que a referida levedura híbrida compreende um gene transportador de maltose quimérico, em que parte de uma primeira sequência de gene codificante é translocada adjacente a parte de uma segunda sequência de gene codificante, de modo a proteína quimérica produzida contém parte do referido primeiro produto gênico e parte do referido segundo produto gênico.

10. Método de produção de um produto de cerveja fermentado caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: adicionar uma levedura fermentativa, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 9, a um mosto, e fermentar pelo menos parcialmente o referido mosto para produzir um produto de cerveja fermentado.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a levedura fermentativa compreende uma mutação resultando na inativação de pelo menos um dos genes PAD1 e FDC1 e / ou inativação de um gene que codifica uma proteína envolvida na absorção de um ácido fenólico, de preferência, ácido ferúlico ou envolvida na exportação de um composto fenólico descarboxilado, de preferência, 4-vinil guaiacol.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o produto de cerveja fermentado produzido é cerveja, de preferência, uma cerveja lager.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o teor de álcool da cerveja fermentada é reduzido após a fermentação, de preferência, por evaporação de retificação.

14. Uso da levedura Saccharomyces eubayanus mutante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma levedura híbrida.

15. Uso da levedura Saccharomyces eubayanus mutante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 4,

ou levedura híbrida, conforme definido pela reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é para produzir um produto de cerveja fermentado, de preferência, uma cerveja, mais preferencialmente, cerveja lager.