ES2903527T3

ES2903527T3 - Uso de MCM7 para obtener cepas de levadura resistentes al ácido acético

Info

Publication number: ES2903527T3
Application number: ES17771808T
Authority: ES
Inventors: Georges Pignede; Thomas Desfougeres
Original assignee: Lesaffre et Cie SA
Current assignee: Lesaffre et Cie SA
Priority date: 2016-09-08
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2022-04-04
Anticipated expiration: 2037-08-31
Also published as: WO2018046820A1; EP3510043B1; JP6990697B2; HRP20220006T1; CN110494444A; US20190367951A1; CN110494444B; AU2017322445A1; ZA201901281B; US10738329B2; DK3510043T3; AU2017322445B2; BR112019004497A2; EP3510043A1; FR3055634A1; JP2019530444A; HUE057173T2; FR3055634B1; CA3035619A1

Abstract

Procedimiento de selección de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae resistente a un ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, durante la fermentación de la glucosa, que comprende las siguientes etapas: - detectar, al menos a nivel de un alelo de la cepa, la presencia de un sitio de fijación de Haalp en la secuencia arriba del gen MCM7, favorablemente de la secuencia SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o - detectar, al menos a nivel de un alelo de la cepa, la presencia de una base G en la posición 624794 del cromosoma II.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de MCM7 para obtener cepas de levadura resistentes al ácido acético

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere al uso de la regulación de la expresión del gen MCM7 para conferir una resistencia a un ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, en una cepa de levadura, Saccharomyces cerevisiae, particularmente durante su fermentación de la glucosa. De esta manera, la presencia, al menos a nivel de un alelo, de un sitio de fijación del regulador transcripcional Haalp secuencia arriba del gen MCM7, induciría su expresión, lo que reflejaría una mayor resistencia al ácido orgánico.

De esta manera, la presente invención proporciona un procedimiento que permite la selección genotípica de una cepa de levadura, Saccharomyces cerevisiae, resistente a un ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, durante la fermentación de la glucosa. Del mismo modo, la invención permite optimizar enormemente la obtención de cepas de levadura, Saccharomyces cerevisiae, resistentes a un ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, basándose en la selección genotípica de esporas.

Estado de la técnica

La capacidad de las levaduras modificadas genéticamente para fermentar diversos sustratos las convierte en una herramienta de elección en diversos procesos industriales, en particular, en la producción de etanol a partir de biomasa lignocelulósica. La fermentación alcohólica es el proceso que realizan las levaduras en un medio anaerobio durante el cual los azúcares se transforman en alcohol. La levadura Saccharomyces cerevisiae, también conocida con el nombre de "levadura de panadería", sigue siendo el microorganismo más utilizado para la fermentación alcohólica.

No obstante, algunos inhibidores de la fermentación se encuentran naturalmente en estos sustratos y tienen un impacto negativo en la producción de etanol. Este es particularmente el caso de los ácidos orgánicos débiles, en particular del ácido acético, un producto de la degradación de la hemicelulosa. Cuando las levaduras se enfrentan a la presencia de ácido orgánico en su entorno, bloquean su ciclo celular para poder prepararse para reaccionar frente a este nuevo estrés abiótico. La fermentación comienza solo una vez que la maquinaria celular de resistencia está implementada. De esta manera, la presencia de ácido orgánico débil, tiene como consecuencia retrasar el inicio de la fermentación sobre la glucosa, aumentando así los costes de producción.

El problema relacionado con el ácido acético es crucial especialmente porque es un inhibidor muy potente de la fermentación alcohólica por parte de las levaduras y porque se encuentra a altas concentraciones en determinados medios de fermentación.

Se han descrito diferentes medios para intentar contrarrestar el efecto de los inhibidores de la fermentación, como, por ejemplo, la desintoxicación del medio de fermentación, o la adaptación de las levaduras a inhibidores de la fermentación por aclimatación o por modificación genética. En el caso del ácido acético, la desintoxicación del medio de fermentación es una opción difícil de implementar, en particular a nivel industrial. Por tanto, es necesario intentar modificar las propias levaduras.

En este contexto, la aclimatación de las levaduras puede realizarse introduciendo el inhibidor en el medio de cultivo, preferentemente a dosis crecientes. Sin embargo, se ha observado que, según este método, la adaptación de las levaduras es solo transitoria, y desaparece rápidamente cuando estas últimas se vuelven a cultivar en un medio desprovisto de inhibidor. Por tanto, el método no es muy interesante desde un punto de vista industrial, donde es necesario disponer de cepas fenotípicamente estables.

Por tanto, en el caso de la sensibilidad al ácido acético, solo es posible la modificación genética de las levaduras. Esto puede realizarse o bien mediante modificación por ingeniería genética, dirigiéndose a genes específicos, o bien cruzando cepas de interés de manera convencional. En la actualidad, los mecanismos moleculares relacionados con la sensibilidad o, por el contrario, con la resistencia al ácido acético, no se conocen bien y son insuficientes para los métodos dirigidos de ingeniería genética.

De esta manera, el método de elección para mejorar la resistencia al ácido acético sigue siendo la obtención de levaduras por cruzamiento. Sin embargo, aunque algunos procedimientos han permitido obtener cepas de levadura resistentes al ácido acético, estos son, por definición, aleatorios y sin garantía de éxito.

En el documento WO 2013/178915 se describen procedimientos para cruzar cepas de levadura que permiten la producción de levaduras capaces de metabolizar la xilosa y que son resistentes al ácido acético. Este procedimiento consiste en cruzar la cepa de levadura depositada en la CNCM con el número I-4538 con la cepa de levadura depositada en la CNCM con el número I-4627, y después en seleccionar un híbrido capaz de metabolizar la xilosa y que sea, independientemente, resistente al ácido acético durante la fermentación de la glucosa.

Este método llamado hibridación, se basa en la capacidad de las levaduras para reproducirse asexualmente, o sexualmente, dependiendo en particular de las condiciones de cultivo.

La levadura S. cerevisiae es un organismo con un ciclo reproductivo haplodiplobióntico, es decir, un organismo capaz de multiplicarse activamente tanto en estado haploide como en estado poliploide, por ejemplo, diploide.

Siempre que el medio sea favorable, las levaduras poliploides son capaces de multiplicarse vegetativamente por gemación dando lugar a levaduras poliploides. En el caso de un medio pobre en nutrientes nitrogenados y que contenga únicamente una fuente de carbono no fermentable (por ejemplo, glicerol, acetato...), las células heterocigotas para el locus Mat entran en meiosis y forman levaduras con ploidía reducida (esporas o segregantes) mediante un mecanismo llamado esporulación.

Los segregantes pueden multiplicarse por gemación, dando lugar a levaduras que poseen el mismo genoma. Entre las levaduras haploides, se diferencian dos firmas sexuales opuestas, denominadas MATa y MATa. Dos esporas haploides de sexo opuesto pueden fertilizarse para dar lugar a una levadura diploide.

El ciclo haplodiplobióntico de S. cerevisiae se ha utilizado muchas veces para cruzar segregantes sexualmente compatibles (MATa y MATa), en particular en el método llamado recombinación aleatoria resultante de la esporulación e hibridación masiva. Convencionalmente, se utilizan dos cepas diploides parentales (genómicamente diferentes). La esporulación de cepas diploides parentales se induce normalmente cultivándolas en condiciones en las que el suministro de nitrógeno es limitado y únicamente en presencia de una fuente de carbono no fermentable. La meiosis que tiene lugar durante esta etapa conduce a una mezcla genética, creando esporas de diversos genotipos. Las esporas (haploides) obtenidas para cada una de las cepas parentales se ponen en contacto, para producir cepas diploides (híbridas) por fusión. Esta última etapa se denomina etapa de hibridación.

Este método es interesante porque permite crear una mezcla genética a partir de la cual pueden surgir rasgos fenotípicos de interés. Sin embargo, requiere una etapa de selección de híbridos en función de los rasgos fenotípicos deseados. Como ejemplo, en el caso de cepas parentales estrictamente diploides, presentando cada una de ellas un rasgo fenotípico portado por 10 genes, la probabilidad de obtener el híbrido de interés se estima en 1 / 2,097.106. No obstante, la etapa de selección final es tediosa, larga y sobre todo costosa.

Por tanto, existe una clara necesidad de procedimientos mejorados para la producción de cepas de levadura resistentes al ácido acético.

Descripción de la invención

Los inventores han identificado que las cepas de levadura S. cerevisiae capaces de expresar MCM7 inducida por un ácido orgánico, en particular ácido acético, poseen un fenotipo de resistencia a este ácido orgánico. Como se muestra en la parte experimental, se mejora el crecimiento de estas cepas y su capacidad para fermentar glucosa en un medio rico en ácido acético.

De una manera particularmente interesante, los inventores han determinado que el ácido acético puede inducir la expresión de MCM7 en estas cepas. También parece que esta expresión de MCM7, inducida por el ácido acético, está mediada por el factor de transcripción Haalp. Esto es particularmente sorprendente, ya que no se sabe que MCM7 que sea un gen regulado por Haalp. De esta manera, las investigaciones de Mira y colaboradores, publicadas en 2010 (Mira et al, 2010, OMICS, 14: 587-601), proporcionan una lista de genes regulados por Haa1p en la cepa BY4741, en la que no figura MCM7. Sin embargo, los inventores han establecido que en las cepas de S. cerevisiae resistentes al ácido acético, la región secuencia arriba del gen que codifica a MCM7, comprende un motivo que se sabe que es un sitio de fijación de Haa1p. Sin estar vinculado a ninguna teoría, la presencia de este sitio de fijación de Haalp sería el resultado de polimorfismos mononucleotídicos (SNP, por las siglas del inglés "Singie-Nucieotide Polymorphism").

Basándose en estos elementos, los inventores han desarrollado procedimientos de selección y obtención de cepas de S. cerevisiae resistente al ácido acético.

Definiciones

La expresión "cepa de levadura" indica, en el sentido de la invención, una población de levaduras rigurosamente idénticas desde un punto de vista genético. Esto incluye tanto las llamadas cepas de laboratorio como las llamadas cepas industriales. Esta expresión debe diferenciarse del término "levadura", obteniéndose una levadura cultivando una cepa como se define anteriormente. Por "levadura" se entiende un producto comercial obtenido gracias a la utilización de un procedimiento de producción de una cepa de levadura. De esta manera, se pueden obtener levaduras con diferentes características a partir de una misma cepa, estando estas diferencias relacionadas con el procedimiento de producción utilizado.

En el sentido de la invención, un "segregante" es el producto de la meiosis de una cepa de levadura, sin importar el nivel de ploidía de dicha levadura. En el resto de la solicitud, los términos "segregante" y "espora" se pueden utilizar indistintamente.

La expresión "cepa de levadura capaz de metabolizar glucosa" indica, en el sentido de la invención, una cepa de levadura capaz de convertir glucosa en etanol, es decir, capaz de fermentar glucosa. Una cepa de levadura capaz de metabolizar glucosa en el sentido de la invención, es una cepa de levadura que, en 60 horas, convierte al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 % de la glucosa en etanol, en un medio de fermentación que comprende 150 g de glucosa por kg de medio de fermentación, en condiciones habituales de fermentación alcohólica.

Preferentemente, el método utilizado para medir el porcentaje de glucosa que se convierte en etanol es el siguiente: La cepa de levadura utilizada se inocula en medio de fermentación sintético a un máximo de 0,25 g de materia seca de levadura/kg de medio de fermentación. La duración de 60 horas se calcula a partir de la inoculación de la cepa de levadura en el medio de fermentación sintético. Un medio de fermentación sintético es un medio cuya composición química exacta se conoce. En el contexto de la invención, un medio de fermentación sintético comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, así como vitaminas y minerales esenciales para el crecimiento de una cepa de levadura. Preferentemente, el medio de fermentación utilizado para medir el porcentaje de glucosa que se convierte en etanol es el medio YF, tal como se define en los ejemplos de realización (denominado YF Ac debido a la presencia de ácido acético).

La fermentación se realiza normalmente a una temperatura comprendida entre 28 y 37 °C, incluso entre 30 y 35 °C, favorablemente igual a 32 °C, con agitación moderada, por ejemplo a 90 o 100 rpm. La agitación es moderada para no oxigenar. El pH del medio se controla, preferentemente, por ejemplo, a través de la capacidad tamponadora de un par ácido/base (tal como el par ácido acético/acetato) y ácido, favorablemente comprendido entre 3,5 y 6, o incluso 4 y 5,5, incluso más favorablemente igual a 4,4 o 5.

La cantidad de etanol presente en el medio de fermentación se mide a través de cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la materia. Puede ser una medida directa del etanol producido o una medida indirecta a través de un parámetro correlacionado con la producción de etanol, tal como la producción de CO²determinada midiendo la pérdida de masa. Por ejemplo, la producción de alcohol puede medirse a través de cromatografía, particularmente a través de HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), de un kit enzimático (por ejemplo, el kit de ensayo de etanol de Boehringer) o un ensayo de dicromato de potasio. La cantidad de glucosa presente en el medio de fermentación se mide a través de cualquier medio adecuado conocido por el experto en la materia, preferentemente a través de cromatografía, particularmente a través de HPLC.

En el contexto de la invención, las expresiones "ácido orgánico" o "ácido orgánico débil" significan un ácido carboxílico susceptible de inhibir la fermentación de un azúcar, favorablemente glucosa. Favorablemente, se trata de ácido acético, ácido levulínico o ácido fórmico, aún más favorablemente, de ácido acético.

Debe tenerse en cuenta que, como se sabe, solo la forma no disociada o no ionizada de dichos ácidos presenta capacidad inhibidora. En el contexto de la invención, la expresión "forma no ionizada o no disociada" de un ácido carboxílico significa su forma protonada. En la práctica, la forma de dichos ácidos orgánicos depende del pH del medio en el que se incorporan. A un pH superior al pKa del ácido, este se encuentra principalmente en forma disociada o de iones COO-. Por el contrario y a un pH inferior, la forma mayoritaria es la forma no disociada o no ionizada (COOH). En el resto de la invención, las cantidades o concentraciones mencionadas se refieren al ácido acético introducido en el medio, englobando formas disociadas y no disociadas en función del pH de dicho medio. Las expresiones "resistente a un ácido orgánico" o "resistente al ácido acético" se refieren a una cepa de levadura que puede fermentar al menos un azúcar, en particular glucosa, con un impacto limitado del ácido orgánico/acético en la curva de fermentación alcohólica. La curva de fermentación alcohólica, que representa la cantidad de alcohol producida en función del tiempo, generalmente comprende tres fases: una fase de latencia durante la cual no se produce etanol, una fase de producción de alcohol y una fase de meseta, que corresponde al final de la fermentación.

Se sabe, que el ácido acético es un inhibidor de la fermentación de la glucosa, reflejando esta inhibición un retraso durante el inicio de la fermentación, permaneciendo invariable la cinética a partir de entonces. Debe tenerse en cuenta que, en presencia de glucosa y xilosa en el medio, las cepas de levadura fermentan prioritariamente la glucosa debido a la represión catabólica.

De esta manera, una "cepa resistente al ácido acético" presenta favorablemente un retraso en el inicio de la fermentación alcohólica inferior a 30 horas, preferentemente inferior a 20 horas, más preferentemente inferior a 15 horas o incluso 10 horas. Preferentemente, se hace referencia a la capacidad de fermentar glucosa con un retraso en el inicio de la fermentación alcohólica como se indicó anteriormente.

El medio de fermentación utilizado para evaluar la resistencia al ácido acético es preferentemente un medio sintético, más preferentemente, el medio YFAc como se ilustra en los ejemplos de realización. La composición del medio YFAc es la siguiente: 150 g/kg de glucosa, 5 g/kg de extracto de levadura, 4,7 g/kg de DAP (fosfato diamónico), 11,4 g/kg de ácido cítrico, 4 g/kg de ácido acético, 13,5 g/kg de citrato de sodio, 1 ml/kg de Tween 80, 2 ml/kg de ZnSO4 (a 10,6 g/l), 2,5 ml/kg de MgSO47h2O (a 400 g/l), 1 ml/kg de tiamina (a 18,24 g/l), 1 ml/kg de piridoxina (a 5,28 g/l), 1 ml/kg de biotina (a 1,76 g/l), 1 ml/kg de pantotenato (a 3,8 g/l), 2,5 ml/kg de ácido nicotínico (a 8 g/l), 1 ml/kg de mesoinositol (a 50 g/l), 1 ml/kg de riboflavina (a 1 g/l), 1 ml/kg de para-aminobenzoato (a 1,2 g/l), pH ajustado a 4,4 con KOH. La inoculación de la cepa de levadura utilizada para evaluar la resistencia al ácido acético es, preferentemente, de 0,25 g de materia seca/kg de medio de fermentación. El tiempo t=0 de la curva de fermentación alcohólica corresponde al momento de la inoculación de la cepa de levadura en el medio de fermentación. La fermentación alcohólica se realiza en condiciones anaerobias, preferentemente a 32 °C y con agitación moderada, por ejemplo, 90 rpm.

Cabe señalar que a la concentración de 2000 ppm, el ácido acético no tiene ningún efecto inhibidor sobre la fermentación. De manera adecuada, se añade ácido acético a un máximo de 1 a 10 g/kg de medio de fermentación, por ejemplo 4 g/kg de medio de fermentación

En el sentido de la invención, "MCM7" indica el gen que codifica a la proteína Mcm7p, también llamada proteína Cdc47p, así como el producto de la expresión de este gen.

Por "gen que codifica a Mcm7p" o "gen MCM7', en el sentido de la invención, se entiende que es el gen de la levadura Saccharomyces cerevisiae ubicado en el cromosoma II entre las posiciones 625767 y 628304, correspondiente al ORF (por las siglas del inglés Open Reading Frame, marco abierto de lectura) que codifica a Mcm7p. Estas posiciones se indican con referencia al genoma de la cepa de levadura. S. cerevisiae S288c, en particular, su secuencia completa, disponible en bases de datos con la referencia de GenBank GCA_000146045.2. (versión del 18 de abril de 2011), y cuya referencia del NCBI (National Center for Biotechnology Information, Centro Nacional para la Información Biotecnológica) es ID del gen: 852501. La secuencia del cromosoma II, utilizada como secuencia de referencia para la numeración, es accesible con el número del NCBI NC_001134.7 (23/12/2010; SEQ ID NO: 1).

La expresión "secuencia arriba del gen" debe entenderse en el sentido generalmente aceptado en biología molecular, es decir, que significa la región ubicada en dirección 5' (de la cadena codificante) del sitio de inicio de la transcripción del gen. Convencionalmente, esta región (también llamada "región promotora/reguladora") está implicada en la expresión del gen MCM7, que comprende particularmente promotores y secuencias reguladoras, tales como sitios de fijación de reguladores transcripcionales. En el sentido de la invención, esta región consta de 1200 nucleótidos en dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción del gen que codifica a Mcm7p.

Por "inducción de la expresión de MCM7 por o en presencia de un ácido orgánico "o" sobreexpresión de MCM7 por o en presencia de un ácido orgánico', en el sentido de la invención, se entiende que es un aumento del nivel de expresión del gen que codifica a Mcm7p en presencia de ácido orgánico, en comparación con el nivel de expresión de este gen en la misma cepa en ausencia de ácido orgánico. Este aumento de expresión puede reflejarse a nivel de nucleótidos (aumento del ARNm) o también a nivel de proteínas. Por tanto, un experto en la materia podrá elegir el método de medición que le parezca más apropiado y más sencillo de implementar entre los métodos bien conocidos de biología molecular y bioquímica (transferencia Northern (Northern blot en inglés)), PCR (por las siglas del inglés polymerase chain reaction, reacción en cadena de la polimerasa), transferencia Western (Western blot en inglés),

En el sentido de la invención, las expresiones "inducción de la expresión de MCM7 mediada por el factor de transcripción Haalp" o "sobreexpresión de MCM7 mediada por el factor de transcripción Haalp" significan que la inducción de la expresión o la sobreexpresión de MCM7, al que se hace referencia en la presente solicitud, depende del factor de transcripción Haalp. En otras palabras, en ausencia del factor de transcripción Haalp, por ejemplo, en el caso de levaduras en las que este gen está delecionado o lleva una o más mutaciones que lo hacen no funcional, o incluso en condiciones en las que el nivel de Haalp es limitado, las levaduras no pueden inducir la expresión de MCM7, particularmente en presencia de ácido orgánico.

En el contexto de la invención, por "sitio de fijación de Haalp" se entiende, la secuencia de nucleótidos reconocida por el factor de transcripción Haalp, que permite su fijación a nivel del gen diana, cuyo nivel de transcripción es regulado por Haa1p. Según Mira et al. (Nucleic Acid Research, 2011, 39 (16): 6896-6907), el motivo mínimo reconocido por Haa1 presenta la siguiente secuencia:

5'-(G/C)(A/C)GG(G/C)G - 3'

en lugar del motivo -5'-GNN(G/C)(A/C)(A/G)G(A/G/C)G-3', determinado anteriormente por ordenador.

Descripción detallada de la invención

La presente solicitud se refiere al uso del gen MCM7 para conferir resistencia a un ácido orgánico en una cepa de levadura o en la misma.

Favorablemente, la resistencia conferida es una resistencia al ácido acético, cuya presencia en altas concentraciones en los hidrolizados lignocelulósicos está intrínsecamente relacionada con la de grupos acetilo asociados de manera covalente con las moléculas de hemicelulosa.

Favorablemente, la resistencia al ácido orgánico, de la cepa de levadura, se refleja durante la fermentación de la glucosa, para la que disminuye o se reduce el retraso en el inicio de la fermentación.

Favorablemente, el uso del gen MCM7 es de interés cuando éste se induce, favorablemente, en presencia del ácido orgánico en cuestión, particularmente del ácido acético.

De manera incluso más ventajosa, la expresión del gen MCM7 inducida por la presencia del ácido orgánico, está mediada por el factor de transcripción Haa1p. Según la invención, la secuencia arriba del gen MCM7 comprende un sitio de fijación de Haa1p.

Según un modo de realización particular, la secuencia arriba del gen MCM7 comprende la siguiente secuencia: GAGGGG o

GAGGAGGGG o

SEQ ID NO: 2 o

SEQ ID NO: 3 o

SEQ ID NO: 4.

Según otro modo de realización de la invención, la secuencia arriba del gen MCM7 presenta al menos la siguiente característica:

- una G en la posición 624794.

Como ya se ha mencionado y en el contexto de la invención, el número de la posición corresponde al de la cepa de referencia S288c. Por "posición" debe entenderse, por tanto, la posición, en la cepa estudiada, correspondiente a la posición dada.

Según un modo de realización de la invención, la secuencia arriba del gen MCM7 presenta al menos una G en la posición 624794. Según otro modo de realización, dicha secuencia presenta una C en la posición 624758, una G en la posición 624794 y una A en la posición 624801, o incluso todas las siguientes características:

- una T en la posición 624536;

- una T en la posición 624732;

- una G en la posición 624736;

- una C en la posición 624758;

- una G en la posición 624794;

- una A en la posición 624801;

- una A en la posición 624832;

- una C en la posición 625073;

- una G en la posición 625146;

- una A en la posición 625199.

La cepa de levadura objeto de la presente invención pertenece, dentro del grupo de los hemiascomicetos, al género Saccharomyces. Se trata de S. cerevisiae.

De esta manera y según un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de selección de una cepa de levadura S. cerevisiae resistente a un ácido orgánico que comprende:

- detectar, al menos a nivel de un alelo de la cepa, la presencia de un sitio de fijación de Haalp en la secuencia arriba del gen MCM7, favorablemente, la secuencia GAGGGG o GAGGAGGGG o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

- detectar, al menos a nivel de un alelo de la cepa, la presencia de una base G en la posición 624794 del cromosoma II.

Como ya se ha mencionado, el ácido orgánico es favorablemente ácido acético.

Según otro modo de realización privilegiado, la resistencia al ácido orgánico de la cepa seleccionada de esta manera, se observa durante su fermentación sobre glucosa.

De esta manera, la presente invención proporciona un procedimiento de cribado genotípico de cepas de interés, en este caso, resistentes a un ácido orgánico. Este planteamiento es mucho más económico, tanto en términos de tiempo como monetarios, que los cribados fenotípicos utilizados habitualmente.

Como se ha indicado, se pueden evaluar los siguientes criterios:

El primer criterio se basa en la presencia, en dirección 5', del gen MCM7, de un sitio de fijación de Haalp. De esta manera y de manera adecuada, la región ubicada secuencia arriba del gen MCM7 comprende la secuencia (G/C)(A/C)GG(G/C)G, o incluso GNN(G/C)(A/C)(A/G)G(A/G/C)G (siendo N un nucleótido elegido entre A, C, G y T). Según un modo de realización particular, esta región contiene al menos una secuencia elegida entre:

- GAGGGG correspondiente a un sitio de fijación mínimo de Haalp;

- GAGGAGGGG correspondiente al motivo reconocido por Haalp, que se determina por ordenador;

- la secuencia SEQ ID N^o: 2;

- la secuencia SEQ ID NO: 3;

- la secuencia SEQ ID NO: 4;

favorablemente, la secuencia SEQ ID NO: 3 o 4.

La detección de estas secuencias puede realizarse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia tal como secuenciación, PCR, hibridación.

Como se muestra en los ejemplos de realización, esto solo puede afectar a un alelo de esta cepa, o incluso a varios, o incluso a todos los alelos (dos en el caso de la levadura diploide).

Según un segundo criterio, la cepa presenta, al menos a nivel de un alelo, una base G en la posición correspondiente a la posición 624794 del cromosoma II, indicado en negrita en la secuencia correspondiente al sitio de fijación mínimo de Haalp (GAGGGG). Debe tenerse en cuenta que, en cepas no resistentes al ácido acético, se observa una A en esta posición. Sin desear quedar vinculado a ninguna categoría, la sustitución de una base de A por una base de G permite crear un sitio de fijación funcional de Haalp, permitiendo la inducción de la expresión de MCM7 en presencia de ácido acético.

Debe tenerse en cuenta que en esta región pueden encontrarse otras mutaciones, favorablemente elegidas entre: - una T en la posición 624536;

- una T en la posición 624732;

- una G en la posición 624736;

- una C en la posición 624758;

- una A en la posición 624801;

- una A en la posición 624832;

- una C en la posición 625073;

- una G en la posición 625146;

- una A en la posición 625199.

Según un modo de realización particular, se selecciona una cepa objeto de la invención debido a la presencia de al menos una base de G en la posición correspondiente a la posición 624794 del cromosoma II, o incluso de al menos una C en la posición 624758, una G en la posición 624794 y una A en la posición 624801, o incluso debido a los 10 nucleótidos mencionados anteriormente en relación con las posiciones particulares mencionadas, al menos a nivel de uno de sus alelos.

La detección o identificación de estas mutaciones la realiza fácilmente un experto en la materia, por ejemplo, secuenciando posiciones de interés.

Por supuesto, el interés de una cepa identificada con la ayuda de este planteamiento puede confirmarse mediante un planteamiento fenotípico, que consiste en evaluar la capacidad de la cepa seleccionada para fermentar glucosa en presencia de ácido acético, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente.

Estos diferentes criterios de cribado genotípico también pueden implementarse para la producción u obtención de cepas de levadura resistentes a un ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, en particular, en el contexto de la fermentación de glucosa.

De esta manera y con la ayuda de herramientas de biología molecular disponibles, es posible realizar mutagénesis (dirigida o aleatoria) en cepas de levadura para obtener el fenotipo deseado. Como ya se ha mencionado, la presencia de las características genotípicas mencionadas anteriormente solo es necesaria a priori a nivel de un alelo. Como alternativa, esta mutagénesis puede realizarse en esporas (o segregantes) que posteriormente se hibridan con otras esporas, eventualmente resultantes de otra cepa que presente otro rasgo fenotípico de interés. Favorablemente, la invención proporciona un procedimiento para obtener una cepa de levadura resistente a un ácido orgánico, basado en un cribado genotípico realizado a nivel de esporas o segregantes, haploides.

De esta manera y según otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de obtención de una cepa de levadura S. cerevisiae resistente a un ácido orgánico, que comprende:

- una etapa de esporulación de dos cepas parentales que poseen genomas diferentes o rasgos fenotípicos divergentes;

- una etapa de hibridación masiva de esporas o segregantes obtenidos,

comprendiendo dicho procedimiento al menos una etapa de selección de esporas o segregantes ante la presencia de un sitio de fijación de Haalp en la secuencia arriba del gen MCM7, favorablemente, la detección de la secuencia SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, y/o la presencia de una base G en la posición 624794 del cromosoma II.

De manera característica, el procedimiento de la invención comprende una etapa de esporulación de cepas parentales. Los expertos en la materia conocen bien esta técnica y, por tanto, no es necesario detallarla posteriormente. Como ejemplo, la etapa de esporulación puede realizarse cultivando las cepas parentales en condiciones de cultivo adecuadas, tales como, por ejemplo, en un medio deficiente.

Entre las cepas parentales, al menos una de ellas, presenta el fenotipo de interés, en este caso una resistencia a un ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, en el sentido de la invención. Favorablemente, esta presenta un retraso de inicio de la fermentación alcohólica inferior a 30 h, preferentemente inferior a 20 horas, más preferentemente inferior a 15 horas o incluso 10 horas, en el medio de fermentación YFAc con un inóculo de 0,25 g de materia seca de levadura/kg de medio. El experto en la materia conoce bien dichas cepas. Si procede, el experto en la materia podrá producir la cepa de levadura parental resistente al ácido orgánico/acético en el sentido de la invención, por ejemplo, mediante técnicas habituales que utilizan presión de selección.

Debe tenerse en cuenta que, con ayuda del procedimiento de selección, también puede identificarse una cepa parental de interés, objeto de la presente invención.

En el caso particular de utilizar S. cerevisiae, esta puede tratarse, en concreto, de la cepa EGAc1 depositada en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) con el número I-4839 de fecha 13 de marzo de 2014.

Como se pone de manifiesto en el contexto de la presente solicitud, eventualmente este rasgo fenotípico lo lleva solo un alelo, dando lugar la esporulación a esporas que no llevan este rasgo genotípico, en este caso llevando la mitad de las esporas, en el caso de una cepa parental diploide, solo un alelo de resistencia al ácido orgánico/acético. En un caso particular, las dos cepas parentales utilizadas en el contexto del procedimiento según la invención, presentan un fenotipo de resistencia a un ácido orgánico en el sentido de la invención.

De manera adecuada, al menos una de las cepas de levadura parentales, en particular la resistente al ácido orgánico/acético, favorablemente, las dos cepas parentales, son capaces de fermentar glucosa en el sentido de la invención.

Según un modo de realización privilegiado, la segunda cepa de levadura parental, favorablemente la que no presenta resistencia al ácido orgánico/acético, muestra un segundo rasgo fenotípico de interés. Esto incluye, por ejemplo, la capacidad de metabolizar pentosas, en particular, xilosa que está presente en grandes cantidades en los hidrolizados lignocelulósicos.

De esta manera, se encuentran disponibles cepas de levadura capaces de fermentar glucosa y también capaces de metabolizar pentosas:

Como ejemplo, en el documento WO 2010/000464 se informa sobre la obtención de cepas de levadura capaces de fermentar pentosas gracias a un gen bacteriano que codifica una xilosa isomerasa (XI) que convierte la xilosa en xilulosa metabolizable por la levadura. Debe tenerse en cuenta que, de manera alternativa, una vía eucariota, que comprende una xilosa reductasa (XR o XYL1) que genera xilitol y una xilitol deshidrogenasa (XDH o XYL2) también permite dar lugar a xilulosa.

De esta manera, en el documento WO 2012/072793 se describen cepas de levadura mejoradas, asociando genes exógenos que codifican una xilosa isomerasa y una xilitol deshidrogenasa para eliminar el xilitol, que es un inhibidor de la xilosa isomerasa. Dichas cepas, en particular, la cepa depositada en la CNCM el 5.10.2011 con el número I-4538, presentan rendimientos mejorados y, por tanto, una utilidad industrial comprobada para la producción de etanol.

De esta manera y según un modo de realización particular, la segunda cepa parental utilizada en el contexto del procedimiento según la invención es la cepa depositada en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) con el número I-4538 de fecha 5 de octubre de 2011.

El procedimiento de la invención comprende además una etapa de hibridación masiva de esporas o segregantes obtenidos.

Esta etapa se realiza fácilmente según los métodos convencionales utilizados en el campo y descritos con detalle en el capítulo 7 "Sporulation and Hydridization of Yeast" por R.R. Fowell, del libro de referencia "The Yeasts", Volumen 1, editado por A.H. Rose y J. S. Harrison, 1969-Academic Press. Brevemente, la hibridación se realiza, introduciendo las esporas en cuestión, en un medio de cultivo adecuado para la etapa de hibridación. Normalmente, el experto en la materia podrá utilizar, en esta etapa, medio de cultivo completo de tipo YPG (que contiene 10 g/l de extracto de levadura, bactopeptona 20 g/l, glucosa 20 g/l y agua desionizada csp 1 l).

La etapa de selección de esporas o segregantes de interés, se realiza como se ha descrito anteriormente, basándose al menos en uno de los dos criterios siguientes:

El primer criterio se basa en la presencia, en dirección 5' del gen MCM7 de la espora, de un sitio de fijación de Haalp. De esta manera y de manera adecuada, la región ubicada secuencia arriba del gen MCM7 comprende la secuencia (G/C)(A/C)GG(G/C)G, incluso GNN(G/C)(A/C)(A/G)G(A/G/C)G (siendo N un nucleótido elegido entre A, C, G y T).

Según un modo de realización particular, esta región contiene al menos una secuencia elegida entre:

- GAGGGG correspondiente al sitio de fijación mínimo de Haalp;

- la secuencia SEQ ID N^o: 2 o

- la secuencia SEQ ID NO: 3 o

- la secuencia SEQ ID NO: 4,

favorablemente, la secuencia SEQ ID NO: 3 o 4.

Según otro criterio, la espora presenta una base de G (guanina) en la posición correspondiente a la posición 624794 del cromosoma II, indicado en negrita en la secuencia correspondiente al sitio de fijación mínimo de Haalp GAGGGG. Debe tenerse en cuenta que, en las esporas que no son resistentes al ácido acético, en esta posición se observa una base de A (adenosina). Sin desear quedar vinculado a ninguna categoría, la sustitución de una base de A por una base de G permite crear un sitio de fijación funcional de Haalp, permitiendo la expresión o la sobreexpresión de MCM7 en respuesta al ácido acético.

Debe tenerse en cuenta que, en esta región, pueden encontrarse otras mutaciones, favorablemente elegidas entre: - una T en la posición 624536;

- una T en la posición 624732;

- una G en la posición 624736;

- una C en la posición 624758;

- una A en la posición 624801;

- una A en la posición 624832;

- una C en la posición 625073;

- una G en la posición 625146;

- una A en la posición 625199.

Según un modo de realización particular, se selecciona un segregante objeto de la invención ante la presencia de al menos una base de G en la posición 624794 del cromosoma II, o incluso de al menos una C en la posición 624758, una G en la posición 624794 y una A en la posición 624801, o incluso debido a los 10 nucleótidos mencionados anteriormente en relación con las posiciones particulares mencionadas.

Una selección de este tipo puede realizarse, por ejemplo, basándose en secuenciación total o parcial según técnicas de biología molecular bien conocidas por el experto en la materia, o también mediante técnicas de PCR. De esta manera, la secuenciación también puede realizarse mediante secuenciación por hibridación o mediante técnicas de secuenciación de alto rendimiento tales como pirosecuenciación, secuenciación sintética o secuenciación por ligamiento. Como alternativa, la selección puede realizarse basándose en técnicas de PCR buscando los polimorfismos en cuestión. En este contexto, pueden citarse, por ejemplo, las técnicas de PCR múltiple, que permitirán buscar varios polimorfismos en una sola prueba, la PCR anidada, lo que permite una alta sensibilidad del resultado, o incluso PCR en una colonia que no requiere extracción de ADN.

Para realizar la secuenciación o la PCR, puede requerirse una etapa de multiplicación del ADN, para tener suficiente material biológico. Entonces será posible realizar una amplificación cultivando cada cepa o espora en un medio de cultivo adecuado para su reproducción. Además, puede requerirse una etapa de extracción del ADN de las levaduras, que podrá realizarse según los métodos de biología molecular bien conocidos en el campo de la invención.

El procedimiento de la invención puede implementarse de diversas maneras, pudiendo realizarse la etapa de selección de levaduras a partir de cepas parentales y/o de esporas resultantes de las mismas y/o de cepas obtenidas después de la hibridación. Sin embargo, como ya se ha mencionado, es particularmente ventajoso realizar la etapa de selección a partir de esporas resultantes de cepas parentales.

De esta manera, y según un modo de realización privilegiado, un procedimiento según la invención, comprende las siguientes etapas:

a) preparar segregantes resultantes de una primera cepa parental y segregantes resultantes de una segunda cepa parental;

b) seleccionar, entre los segregantes resultantes de la etapa a), los que presenten un sitio de fijación de Haalp en la secuencia arriba del gen MCM7, favorablemente, la secuencia SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, y/o los que presenten una base de G en la posición 624794 del cromosoma II;

c) hibridar los segregantes resultantes de la primera cepa parental y seleccionados en la etapa b), con los segregantes resultantes de la segunda cepa parental, eventualmente seleccionados en la etapa b);

d) seleccionar, entre los híbridos resultantes de la etapa c), los que sean resistentes al ácido orgánico.

La etapa a) del procedimiento corresponde a una etapa de preparación de segregantes a partir de dos cepas de levadura parentales, favorablemente S. cerevisiae, diferentes, es decir una etapa de esporulación. El experto en la materia podrá obtener fácilmente segregantes a partir de cepas parentales definidas anteriormente, según métodos bien conocidos en el campo de la invención.

En un modo de realización ventajoso, esta etapa comprende el cultivo de la primera cepa de levadura parental por un lado y de la segunda cepa de levadura parental por otro lado, en un medio deficiente en nitrógeno o azúcar. Según la invención, las cepas parentales utilizadas son cepas de levadura pertenecientes a la especie Saccharomyces cerevisiae.

Según un modo de realización privilegiado, la primera cepa se elige por su capacidad de resistencia al ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, en particular, durante la fermentación sobre glucosa. Particularmente, puede tratarse de la cepa EGAcl depositada en la CNCM con el número I-4839 el 13 de marzo de 2014. Los segregantes de esta cepa serán el objeto prioritario de la etapa de selección b) del procedimiento.

Según otro modo de realización privilegiado, la segunda cepa de levadura parental se elige por otro rasgo fenotípico de interés, por ejemplo, por su capacidad para metabolizar la xilosa. Puede tratarse, por ejemplo, de la cepa depositada en la CNCM con el número I-4538 de fecha 5 de octubre de 2011.

En un caso particular, la segunda cepa de levadura parental también puede presentar una capacidad de resistencia al ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, en particular, durante la fermentación sobre glucosa. En este caso, las esporas de esta cepa también serán objeto de la etapa de selección b) del procedimiento.

La etapa b) del procedimiento de la invención se implementa como se ha descrito anteriormente y permite eliminar las esporas que no presenten el rasgo fenotípico deseado, en este caso, una resistencia a un ácido orgánico en el sentido de la invención. De esta manera y gracias a esta etapa, la probabilidad de obtener al final de la hibridación una cepa que presente este rasgo fenotípico aumenta considerablemente.

La etapa c) del procedimiento de la invención es una etapa de hibridación de segregantes resultantes de una primera cepa de levadura parental con segregantes resultantes de una segunda cepa parental, habiéndose seleccionado previamente en la etapa b), al menos una de las poblaciones de segregantes, favorablemente la obtenida de la primera cepa de levadura parental.

Preferentemente, la hibridación masiva se realiza en la etapa c). En otras palabras, la etapa c) corresponde, preferentemente, a una etapa de hibridación de todas las esporas resultantes de la etapa b).

La etapa d) del procedimiento, opcional, consiste en seleccionar, entre los híbridos resultantes de la etapa c), los que puedan realizar fermentación alcohólica y los que posean un fenotipo de resistencia al ácido orgánico, favorablemente al ácido acético. Como ya se ha mencionado, esta etapa se realiza fácilmente mediante métodos de selección tradicionales, utilizando técnicas de cultivo habituales. Esta etapa se lleva a cabo favorablemente en un medio que comprende glucosa.

Basándose en las figuras adjuntas, la presente invención se ilustrará más detalladamente con la ayuda de los siguientes ejemplos de realización. Sin embargo, estos no son de ninguna manera limitativos.

Leyendas de las figuras:

En la figura 1 se representa el flujograma utilizado para determinar la proporción de alelos resultantes de EGAc1 (I-4839) en poblaciones de levaduras que han fermentado en presencia de ácido acético (popB) o en poblaciones de levaduras que han fermentado sin ácido acético (popC) y esto a lo largo del cromosoma II.

S288c: cepa de S. cerevisiae cuyo genoma sirve como referencia de GenBank GCA_000146045.2., versión del 18 de abril de 2011; ID del gen del NCBI: 852501; cromosoma II: NCBI NC_001134.7)

EGAc1: cepa depositada en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15) de fecha 13 de marzo de 2014 con el número I-4839 I- 4538: cepa depositada en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15) de fecha 5 de octubre de 2011

EGAc2: cepa depositada en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15) de fecha 13 de marzo de 2014 con el número I-4840 En la figura 2 se representan las frecuencias medias de los alelos de la cepa EGAc1 (I-4839) en las dos poblaciones: PopC = sin estrés, línea discontinua; PopB = con estrés, línea continua

En la figura 3 se representa

(A) las frecuencias medias de los alelos de la cepa EGAc1 (I-4839) en las poblaciones de levaduras que han fermentado en presencia de ácido acético (popB: con estrés, línea continua) o en las poblaciones de levaduras que han fermentado sin ácido acético (popC: sin estrés, línea discontinua) y esto a lo largo del cromosoma II.

(B) el valor de la puntuación LOD (índice de verosimilitud) en función de la posición a lo largo del cromosoma II para las 3 series de experimentos realizados.

La figura 4 corresponde a

(A) una representación gráfica del ensamblaje de lecturas del genoma de la cepa EGAc2 (I-4840) en la zona de 624000 a 626000 pb del cromosoma II de la cepa de referencia. Se destaca la zona donde se detectan las puntuaciones LOD más relevantes (de 624500 a 625200 pb; SEQ ID NO: 3).

(B) un enfoque sobre el impacto del SNP (A > G) que afecta al 50 % de los alelos de esta cepa en la posición 624794. Las flechas representan la presencia de un sitio reconocido por el factor de transcripción Haalp en la secuencia SEQ ID NO: 2.

En la figura 5 se proporciona la evolución promedio de la pérdida de masa durante una fermentación en medio YFAc a 32 °C con un inóculo de 0,25 g/kg (eq de materia seca). Las cepas utilizadas son:

cepa I-4538, sensible al ácido acético (S);

cepa EGAc1 (I-4839), resistente al ácido acético (R);

cepa EGAc2 (I-4840) heterocigota, indicada como "EGAc2-AleloR/AleloS";

la cepa EGAc2 (I-4840) se volvió homocigota para el alelo resultante de EGAc1 (alelo resistente) en el locus II- 624794, indicada como "EGAc2-AleloR/AleloR";

la cepa EGAc2 (I-4840) se volvió homocigota para el alelo resultante de I-4538 (alelo sensible) en el locus II-624794, indicada como "EGAc2-AleloS/AleloS".

Las barras de error corresponden a las desviaciones estándar calculadas en base a las medidas realizadas con las 7 cepas homocigotas para el alelo resistente y las 5 cepas homocigotas para el alelo sensible.

Ejemplos de realización

Ejemplo 1: Identificación de rasgos genéticos y mutaciones ligados al fenotipo de resistencia a los ácidos orgánicos débiles tales como el ácido acético

En estos primeros experimentos, el objetivo es producir una población de levaduras genéticamente diversas (a), para no solo seleccionar cepas resistentes a los ácidos orgánicos débiles sino también para poder analizar los rasgos genéticos implicados en este fenotipo (b).

a. Producción de una población de levaduras que comprende cepas resistentes a ácidos orgánicos débiles:

La población de levaduras se obtuvo mediante recombinación aleatoria resultante de la esporulación e hibridación masiva. Esta estrategia está inspirada en las investigaciones de Leo Parts et al. (2011, Genoma Res, 21(7):1131-8). Brevemente, un segregante (también llamado espora) de una cepa resistente al ácido acético (cepa EGAc1/I-4839) se cruza con otro segregante, de la cepa I-4538, creando así un primer híbrido (cepa EGAc2/I-4840), como se describe en el documento WO2013/178915.

En un segundo momento, el genoma de la cepa EGAc2 (I-4840) se recombinó al azar para obtener una población de levaduras genéticamente muy diversas. En la práctica, el híbrido EGAc2 (I-4840) esporuló y después se permitió que las esporas obtenidas rehibridasen entre sí, como se describe en el documento WO2013/178915. El ciclo se reprodujo 4 veces, generando así una reducción de 24 en la distancia genética en centiMorgan (cM).

b. Selección de cepas resistentes a ácidos orgánicos débiles:

Las cepas resistentes a ácidos orgánicos débiles se seleccionaron siguiendo los principios de la genética de poblaciones, en particular el principio de Hardy y Weinberg que establece que en una población aislada de tamaño ilimitado, no sometida a selección, y en la que no hay mutaciones, las frecuencias alélicas y genotípicas permanecen estables de generación en generación.

De esta manera, en ausencia de selección, en el caso de 2 alelos "A" y "B", de los cuales es probable que solo "A" desempeñe un papel en la adaptación de la población a una presión de selección determinada (por ejemplo, resistencia a los ácidos orgánicos débiles), las frecuencias del alelo "A" y del alelo "B" en la población, se mantienen estables. En cambio, si el entorno cambia y el medio es rico en ácido orgánico débil, entonces las cepas menos adaptadas desaparecerán (B) en favor de las cepas más adaptadas (A). Según este principio, en caso de que exista una presión de selección, se observa una desviación de este equilibrio durante algunas generaciones. De esta manera, comparando las variaciones de frecuencia alélica entre una población no sujeta a selección y una población sujeta a una presión de selección, se pueden determinar los alelos susceptibles de estar implicados en la resistencia o adaptación a la selección aplicada.

En la práctica, para disponer de una población controlada, se cultivó una muestra de la población obtenida en el punto a) en un medio desprovisto de ácido acético (sin presión de selección). La población obtenida de esta manera se denominó "población C".

En paralelo, una muestra de la población obtenida en el punto a) se sometió a una fuerte presión de selección mediante la adición de ácido acético al inicio de la fermentación alcohólica en presencia de glucosa. La población obtenida de esta manera se denominó "población B". En la práctica, para obtener una concentración de 4 g/l, se añadió ácido acético al medio de cultivo.

c. Determinación de rasgos genéticos implicados en el fenotipo de resistencia a ácidos orgánicos débiles:

Al ser la cepa EGAc1 (I-4839) resistente al ácido acético, se espera que los rasgos genéticos asociados a esta resistencia estén presentes en esta cepa. Por consiguiente, para limitar el número de alelos a analizar, en primer lugar se identifican los alelos específicos de la cepa EGAc1 (I-4839) que están presentes en la cepa EGAc2 (I-4840), así como en las poblaciones C y B. En un segundo momento, es posible determinar la frecuencia de aparición de cada uno de estos alelos en las poblaciones con estrés (B) o sin estrés (C).

El estudio de las variaciones de la frecuencia alélica a lo largo del genoma se realizó de la siguiente manera:

Al final de las fermentaciones, los ADN genómicos provenientes de la cepa EGAc1 (I-4839), de la cepa EGAc2 (I-4840) y de las poblaciones B y C, se extrajeron, y después, con un instrumento HiSeq 2000 de Illumina, se secuenciaron mediante el método de "Paired End' (secuenciación desde ambos extremos).

A continuación, los resultados se trataron según el planteamiento ilustrado en la figura 1. Debe tenerse en cuenta que el genoma de referencia es el de la cepa S288c (GenBank GCA_000146045.2., versión del 18 de abril de 2011; ID del gen del NCBI: 852501; NCBI NC_001134.7).

En el caso de un estudio llevado a cabo en poblaciones complejas, la frecuencia alélica refleja la cantidad de individuos que llevan del alelo en cuestión. De esta manera, como ejemplo, y aplicando directamente la ley de Hard y Weinberg, si un alelo está presente con una frecuencia del 70 %, es posible deducir que el 91 % de los individuos de la población lleven al menos una copia de este alelo.

En la figura 2 se representa la evolución de la frecuencia de los alelos resultantes de la cepa EGAc1 (I-4839) a lo largo del Cromosoma II y que están presentes en las poblaciones B y C.

Los resultados presentados en la figura 2 muestran que en la primera parte del cromosoma II, las frecuencias de los alelos resultantes de EGAcl (I-4839) son muy parecidas en los dos tipos de poblaciones y esto hasta aproximadamente 530 kb. Esta conclusión sugiere que los genes presentes en esta parte del cromosoma II (de 0 a 530 kb) no estarían implicados en el proceso de resistencia al ácido acético transmitido por el segregante resultante de la cepa EGAc1 (I-4839) hacia la cepa EGAc2 (I-4840).

La segunda parte del cromosoma II (de 530 kb a 660 kb), muestra una disociación de las curvas correspondiente a las frecuencias de los alelos resultantes de EGAcl (I-4839) en los dos tipos de poblaciones. Este resultado muestra que hay un alelo que está más representado en las poblaciones sometidas a presión de selección que en las que fermentaron sin esta presión. Esta sobrerrepresentación sugiere que este alelo resultante de EGAcl (I-4839) favorecería la multiplicación de las células en presencia de ácido acético. En otras palabras, la segunda parte del cromosoma II (de 530 kb a 660 kb) se identifica como un rasgo genético cuantificable (también llamado QTL, por sus siglas en inglés Quantitative Trait Locus, locus de rasgo cuantitativo), es decir, una región genética implicada en la resistencia al ácido acético.

Los QTL son generalmente secuencias de gran tamaño. Parece diferenciarse una subregión: se trata de la región que abarca las bases 624000 a 626000 del cromosoma II. Esta región parece comprender las variaciones de frecuencia alélicas más significativas. En consecuencia, es esta subregión la que se analizó.

d. Análisis de rasgos genéticos implicados en el fenotipo de resistencia a ácidos orgánicos débiles:

Dentro de los QTL, más concretamente, las variaciones de frecuencia de los polimorfismos puntuales (SNP por las siglas del inglés "Single-Nucleotide Polymorphism", polimorfismo mononucleotídico), en comparación con las cepas que no presentan el rasgo fenotípico estudiado, las que pueden resultar ser las más relevantes.

Por tanto, se analizó con más detalle la región de los pares de bases 624000 a 626000 del cromosoma II. Los valores de los índices de verosimilitud de los SNP que comprende, se analizaron para localizar la región que comprende los SNP más relevantes en el fenotipo de resistencia a los ácidos orgánicos débiles (i). Una vez identificada esta región, los SNP que comprende, se analizaron más exhaustivamente (ii).

i. Determinación de la región más relevante:

El planteamiento elegido es el de las puntuaciones LOD, tal como describen Lander y Botstein (1989, Genetics, 121:185-99).

La primera etapa consiste en determinar la inferencia:

En la primera ecuación, "n1" es el número de lecturas que lleva el SNP resultante de la cepa EGAcl (I-4839) en la población B y "n2" el número de lecturas que lleva el otro SNP. La siguiente ecuación se refiere al mismo cálculo, pero se aplica a los resultados de las poblaciones sin estrés.

La segunda etapa consiste en calcular la verosimilitud:

La verosimilitud (L) se define como una función de probabilidad condicional. De esta manera, se trata de la probabilidad de tener el alelo de la cepa EGAc1 (I-4839), bien en la población que ha fermentado en presencia de ácido acético, o en la población que no ha fermentado en presencia de ácido acético, calculada según las siguientes ecuaciones:

£(B |/B ) = n?=i(B,:|/B )

£{c\fc) = nf=1(c;|/c)

La tercera etapa consiste en calcular la puntuación LOD:

A partir de estas determinaciones de verosimilitud de cada alelo, ahora es posible calcular la LOD de cada SNP y asociarla al alelo resultante de la cepa EGAc1. La ecuación utilizada es la publicada por Lander y Botstein en 1989:

El análisis de la puntuación LOD en la zona de interés del cromosoma II se realizó 3 veces (3 experimentos independientes). Los resultados se presentan en la figura 3. Estos resultados muestran que, cuando la diferencia de frecuencia alélica es significativa, la dispersión de las puntuaciones LOD también lo es (principalmente debido a sus relaciones con las matemáticas y la biología).

De la figura 3B se desprende que una zona comprendida entre 624500 pb y 625200 pb presenta fuertes puntuaciones LOD que parecen ser reproducibles. Por tanto, la región más relevante identificada es la zona comprendida entre 624500 pb y 625200 pb del cromosoma II (SEQ ID NO: 3).

ii. Análisis de los SNP en la región más relevante (entre 624500 pb y 625200 pb del cromosoma II):

Se analizaron las estructuras genéticas presentes, así como los SNP más frecuentemente encontrados en la zona en cuestión (entre 624500 pb y 625200 pb del cromosoma II) de la cepa EGAc2 (I-4840).

Los resultados se ilustran en la figura 4.

Se identificaron 10 SNP en la zona ubicada entre 624500 pb y 625200 pb(SEQ ID NO: 3) del cromosoma II:

El impacto de estos SNP sobre la secuencia de las zonas codificantes (marcos de lectura abiertos) no permitió detectar mutaciones que condujeran a una modificación de la secuencia de las proteínas.

En cambio, el polimorfismo (A ->G) en la posición 624794, que afecta al 50 % de los alelos de la cepa EGAc2 (I-4840), reconstituye un sitio reconocido por el factor de transcripción Haalp ubicado secuencia arriba del gen MCM7, codificando este el último una ADN helicasa ("DNA helicase"). Las ADN helicasas permiten la replicación del ADN y, por tanto, regulan el progreso del ciclo celular y, por consiguiente, la producción de la biomasa. En otras palabras, las levaduras que poseen este SNP tienen un sitio de fijación del factor de transcripción Haalp que otras levaduras no tienen, secuencia arriba de un gen que se sabe que desempeña un papel significativo en la división celular. De esta manera, el hecho de que la presencia de un sitio reconocido por Haalp secuencia arriba del gen MCM7 haga que las cepas sean más resistentes, podría deberse a que, en presencia de ácido acético, las levaduras que llevan este sitio se multiplicarían más rápidamente.

Ejemplo 2: Validación del interés del alelo denominado "EGAclII-624794"

Para abordar, a través de otra estrategia, el análisis de la zona de interés identificada (en particular, que lleva las mutaciones T-> C en la posición 624758, A -> G en la posición 624794 y G -> A en la posición 624801; SEQ ID NO: 4), se eligió realizar la pérdida de heterocigosidad en la cepa EGAc2 (I-4840). En un segundo momento, se comparó el rendimiento de las cepas que se volvieron homocigotas para uno cualquiera de los dos alelos.

a) Construcción de cepas EGAc2 homocigotas para el alelo de tipo silvestre o para el alelo que comprende el SNP identificado como de interés:

La cepa EGAc2 (I-4840) es heterocigota para el QTL identificado como de interés, es decir, que lleva el SNP (A ->G) en la posición 624794. En efecto, dicha cepa, posee un alelo denominado "II-624794" de la cepa EGAc1/I-4839 (es decir, presenta una G en la posición 624794) y un alelo "I4538-II-624794" de la cepa I-4538 (es decir, presenta una A en la posición 624794). Como recordatorio, la cepa EGAcl (I-4839) es resistente al ácido acético, mientras que la cepa I-4538 no lo es.

Para estudiar mejor el papel de esta mutación, se prepararon cepas homocigotas para el alelo II-624794 de la cepa EGAcl (denominado "EGAc1-II-624794") o para el alelo II-624794 de la cepa I-4538 (denominado "14538-11 624794"). Para ello, se utilizó un casete llamado LOH. En principio, el casete LOH, consiste en un gen (KanMX4) que confiere resistencia a la geneticina a las levaduras que lo expresan. Otra parte del casete lleva la secuencia GIN11m86. Esta última es tóxica para las células que la expresan (Akada et al., 1997, Mol Gen Genet 254, 267-74; Kawahata et al., 1999, Yeast, 15, 1-10 et Akada et al., 2002, Yeast, 19, 393-402). Este sistema se califica como dominante negativo porque solo se requiere una copia de esta secuencia para conferir el fenotipo letal a las células. En la medida en que la secuencia GIN11m86 se coloque bajo el control del promotor GAL2, las células que han perdido el casete pueden seleccionarse en YNB Galactosa.

La estrategia utilizada para construir cepas EGAc2 homocigotas para el alelo II-624794 es la siguiente: El casete LOH se flanqueó con secuencias recombinogénicas adecuadas para delecionar uno de los dos alelos. La selección de transformantes se realizó en un medio YNB-G418 (que contenía geneticina). Para determinar cuál de los dos alelos se conservaba, el locus se amplificó mediante PCR con la ayuda de cebadores, denominados de validación, fuera del casete LOH. El fragmento más pequeño de la PCR, obtenido de esta manera (650 pb), se clonó en un plásmido pTOPO y después se secuenció, lo que permitió determinar cuál de los dos alelos se conservaba. Las cepas se volvieron a transformar con una secuencia idéntica a la del alelo conservado. Los nuevos transformantes se seleccionaron en un medio YNB que, como única fuente de carbono, contenía galactosa, que permite seleccionar los que han perdido el casete LOH. Finalmente, con la ayuda de cebadores de validación, se volvió a realizar una PCR. El producto de esta reacción es único y se ha secuenciado directamente.

Con la ayuda de esta estrategia, se construyeron y se validaron 7 cepas EGAc2 homocigotas para el alelo "EGAcl-N-624794" (que confiere resistencia al ácido acético), denominadas "EGAc2-AleloR/AleloR", y 5 cepas EGAc2 homocigotas para el alelo denominado "I4538-II-624794" (que confiere sensibilidad al ácido acético), denominadas "EGAc2-AleloS/AleloS".

b) Análisis del impacto de la homocigosidad sobre la resistencia al ácido acético:

Después de haber obtenido las 12 cepas homocigotas mencionadas anteriormente, se probó su capacidad para fermentar glucosa en presencia de ácido acético. Estos rendimientos se midieron en un medio YFAc (4000 ppm; pH 4,4), definido de la siguiente manera:

En la figura 5 se representan los resultados de pérdida de masa observada durante la fermentación en este medio. Las curvas presentadas son las medias de los valores obtenidos para todas las cepas del mismo genotipo.

Los resultados presentados en la figura 5 muestran que las cepas EGAc2 que se han vuelto homocigotas para el alelo sensible (S) en el locus II-624794 tienen un mayor retraso en el inicio de la fermentación que en el de la cepa EGAc2 (I-4840) en YFAc. Esto demuestra que la pérdida del alelo "EGAc1-II-624794" en una cepa EGAc2 en beneficio de una homocigosidad del alelo "14538-11-624794" hace que las cepas obtenidas sean más sensibles al ácido acético durante la fermentación de la glucosa.

En cambio, las cepas EGAc2 que se han vuelto homocigotas para el alelo "EGAc1-II-624794" en el locus II-624794, tienen una cinética de fermentación en este medio que no es diferente de la de la cepa EGAc2 (I-4840). Este resultado sugiere que, en este medio, la homocigosidad no aporta nada a las cepas.

En conclusión, estas investigaciones revelan que el alelo "EGAcl-11-624794" contribuye eficazmente a la resistencia de la cepa EGAc2 (I-4840) frente al ácido acético. En cambio, una sola copia parece ser suficiente para conferir un fenotipo de resistencia al ácido acético.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de selección de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae resistente a un ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, durante la fermentación de la glucosa, que comprende las siguientes etapas: - detectar, al menos a nivel de un alelo de la cepa, la presencia de un sitio de fijación de Haalp en la secuencia arriba del gen MCM7, favorablemente de la secuencia SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

2. Procedimiento de obtención de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae resistente a un ácido orgánico, favorablemente, al ácido acético, durante la fermentación de la glucosa, que comprende las siguientes etapas: - una etapa de esporulación de dos cepas parentales que poseen genomas diferentes;

- una etapa de hibridación masiva de los segregantes obtenidos;

- al menos una etapa de selección de segregantes ante la presencia de un sitio de fijación de Haalp en la secuencia arriba del gen MCM7, favorablemente, la detección de la secuencia SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, y/o la presencia de una base G en la posición 624794 del cromosoma II.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado por que la primera cepa se elige por su capacidad de resistencia al ácido orgánico y la segunda cepa por otra característica de interés, por ejemplo, por su capacidad para metabolizar la xilosa.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado por que la primera cepa es la cepa EGAc1 depositada en la CNCM con el número I-4839 de fecha 13 de marzo de 2014 y la segunda cepa es la cepa depositada en la CNCM con el número I-4538 de fecha 5 de octubre de 2011.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por que la capacidad de resistencia al ácido orgánico se prueba en un medio que comprende glucosa.