BR112021004982A2 - anticorpo, polinucleotídeo, vetor de expressão, célula transformada, métodos para produzir um anticorpo, para prevenir ou inibir o câncer e metástase do câncer, para diagnosticar câncer ou metástase do câncer, para tratar uma doença e para diagnosticar uma doença, composição farmacêutica, composições para diagnóstico e composição para prevenção ou tratamento de uma doença e uso do anticorpo - Google Patents

anticorpo, polinucleotídeo, vetor de expressão, célula transformada, métodos para produzir um anticorpo, para prevenir ou inibir o câncer e metástase do câncer, para diagnosticar câncer ou metástase do câncer, para tratar uma doença e para diagnosticar uma doença, composição farmacêutica, composições para diagnóstico e composição para prevenção ou tratamento de uma doença e uso do anticorpo Download PDF

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Abstract

ANTICORPO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA TRANSFORMADA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, PARA PREVENIR OU INIBIR O CÂNCER E METÁSTASE DO CÂNCER, PARA DIAGNOSTICAR CÂNCER OU METÁSTASE DO CÂNCER, PARA TRATAR UMA DOENÇA E PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICO E COMPOSIÇÃO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE UMA DOENÇA E USO DO ANTICORPO. A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a um domínio N-terminal da lisil-RNAt sintetase (KRS) que é exposto na membrana extracelular e, mais especificamente, a um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a um domínio N-terminal da Lisil-RNAt sintetase (KRS) extracelularmente exposto na membrana com uma sequência específica da região determinante de complementaridade (CDR) definida na presente invenção, e o uso de uma composição que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo como ingrediente ativo para a prevenção, tratamento ou diagnóstico do câncer, metástase do câncer ou doenças associadas à migração de células imunes. O método de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para preparar um anticorpo com maior afinidade ao N-terminal da KRS do que os anticorpos existentes.

Description

“ANTICORPO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA TRANSFORMADA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, PARA PREVENIR OU INIBIR O CÂNCER E METÁSTASE DO CÂNCER, PARA DIAGNOSTICAR CÂNCER OU METÁSTASE DO CÂNCER, PARA TRATAR UMA DOENÇA E PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICO E COMPOSIÇÃO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE UMA DOENÇA E USO DO ANTICORPO” CAMPO DA INVENÇÃO
[001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido de Patente Coreano número 10-2018-0111046, depositado em 17 de setembro de 2018, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado ao presente documento por referência.
[002] A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a um domínio N-terminal da lisil-tRNA sintetase exposto à membrana extracelular e, mais especificamente, ele se liga especificamente a um domínio N-terminal da lisil-tRNA sintetase (KRS, lisil-tRNA sintetase) extracelularmente exposto na membrana com uma sequência da região determinante de complementaridade (CDR) específica descrita na presente invenção; ao tratamento ou diagnóstico do câncer, metástase do câncer ou doenças relacionadas à migração de células imunes por uma composição que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo com alta afinidade e estabilidade ou o anticorpo e fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Estudos recentes estabeleceram que a lisil-tRNA sintetase humana (KRS) geralmente presente no citosol é translocada para a membrana plasmática (membrana celular) para interagir com um receptor de laminina de 67 kDa (67LR) presente na membrana plasmática, promovendo assim a migração de células tumorais (cancerosas) afetando a metástase do câncer (Dae Gyu Kim et al., Chemical inhibition of prometastatic lysyl-tRNA synthetase-laminin receptor interaction, Nat Chem Biol. Jan de 2014; 10(1): 29- 34, Dae Gyu Kim et. al. Interaction of two translational components, lysyl-tRNA synthetase and p40/37LRP, in plasma membrane promotes laminin-dependent cell migration, FASEB J. (2012)26, 4142-4159). A KRS humana (nº de acesso Genbank: NP_005539.1, etc.) compreende uma extensão N-terminal (extensão N-terminal 1-72), um domínio de ligação ao anticódon (73-209) e um domínio catalítico (220-597). A KRS humana é uma enzima essencial para a síntese de proteínas e normalmente reside em um complexo multi-tRNA sintetase (MSC) no citosol. No entanto, após a introdução do sinal de laminina, a MAPK p38 fosforila a KRS no resíduo T52 e a KRS se transloca para a membrana celular, onde a KRS protege a 67LR da degradação mediada por ubiquitina. Também foi relatado que a KRS translocada para a membrana celular acelera a metástase do câncer ao se estabilizar e interagir com o 67LR associado à metástase do câncer.
[004] No entanto, o fato de Myc-KRS41-597 (ΔN) com uma deleção de 40 resíduos terminais na extensão N-terminal (N-ext) não estar localizado na membrana plasmática indica que a região N-ext de KRS é uma região essencial na translocação da KRS para a membrana celular. Quanto à metástase do câncer, especificamente, sabe-se que a região N-ext da KRS está envolvida na interação de ligação de KRS e 67LR. Para usar este fato para fins terapêuticos ou de diagnóstico, é necessário direcionar especificamente um determinado local (especialmente, N-ext da KRS) na proteína KRS de acordo com as características de vários domínios que constituem a proteína KRS. Consequentemente, os presentes inventores produziram um anticorpo que se liga especificamente ao N-terminal de KRS, que não mostra uma reação cruzada de ligação com a ARS (Pedido de Patente
Coreano nº 10-2018-0035446).
[005] No entanto, a afinidade dos anticorpos da técnica anterior que visam o domínio N-terminal de KRS é inferior à de vários anticorpos sob a forma de IgG completa. Portanto, há uma necessidade de construir um anticorpo com uma afinidade mais alta para o domínio N-terminal de KRS.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[006] Portanto, a presente invenção foi concluída pela modificação da região variável de cadeia leve e da região variável de cadeia pesada do anticorpo existente, a fim de produzir um anticorpo com uma melhor afinidade de ligação para o domínio N-terminal de KRS do que o anticorpo existente que se liga especificamente ao domínio N-terminal de KRS exposto à membrana extracelular.
[007] Portanto, o objetivo da presente invenção é fornecer que um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a região N- terminal de uma lisil-tRNA sintetase extracelularmente exposta (KRS, lisil-tRNA sintetase), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo; (i) a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos SYDMS; (ii) a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos X1IX2X3X4X5GX6X7YYADSVKG, e em que X1 é A ou V, X2 é S, D ou G, X3 é Y, P, S ou A, X4 é D, Q, L ou Y, X5 é N, M, S, ou G, X6 é N, R ou P, X7 é T, V, I ou S; e (iii) a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos X 8ALDFDY, em que
X8 é M ou L, e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende; (i) a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos TGSSSNIGSNYVT; (ii) a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos X9NX10X11RPS, em que X9 é D, S ou R, X10 é S ou N, e X11 é N ou Q; e (iii) a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo uma sequência de aminoácidos X 12SFSDELGAYV, e em que X12 é A ou S.
[008] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo, um vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo e uma célula transformada com o vetor.
[009] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma região N-terminal da lisil-tRNA sintetase (KRS) extracelularmente exposta, caracterizado pelo método compreender: (a) a transformação de células hospedeiras com o vetor de expressão recombinante; (b) a incubação das células hospedeiras transformadas para produzir um anticorpo ou fragmento do mesmo; e (c) a coleta do anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras.
[010] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica para a prevenção e inibição do câncer e metástase do câncer compreendendo o anticorpo ou o fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[011] Além disso, outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica para a prevenção ou inibição da metástase do câncer consistindo do anticorpo ou do fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[012] Além disso, outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica para a prevenção ou inibição da metástase do câncer consistindo essencialmente do anticorpo ou do fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[013] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[014] Além disso, outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes que consiste no anticorpo ou fragmento do mesmo como ingrediente ativo.
[015] Além disso, outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes que consiste essencialmente do anticorpo ou fragmento do mesmo como ingrediente ativo.
[016] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição para o diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[017] Além disso, outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição para o diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes que consiste no anticorpo ou fragmento do mesmo como ingrediente ativo.
[018] Além disso, outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição para o diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento do mesmo como ingrediente ativo.
[019] Outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para prevenir ou inibir o câncer e metástases do câncer.
[020] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para prevenir ou inibir o câncer e metástase do câncer compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo a um sujeito com tal necessidade.
[021] Outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para diagnosticar o câncer ou metástases do câncer.
[022] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para diagnosticar o câncer ou metástases do câncer, cujo método compreende: a) a obtenção de uma amostra biológica de um indivíduo (sujeito) com suspeita de metástase de câncer; b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando que o câncer e metástases de câncer ocorreram quando o nível de expressão de KRS está aumentado.
[023] Outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.
[024] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes, administrando uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo a um sujeito com tal necessidade.
[025] Outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, para preparar um agente para o diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes.
[026] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para diagnosticar uma doença relacionada à migração de células imunes, cujo método compreende: a) a obtenção de uma amostra biológica a partir de um sujeito com suspeita de ter uma doença relacionada à migração de células imunes; b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando como uma doença relacionada à migração de células imunes quando o nível de expressão de KRS está aumentado.
SOLUÇÃO TÉCNICA
[027] A fim de alcançar os objetivos acima, a presente invenção fornece que um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente à região N-terminal de uma lisil-tRNA sintetase extracelularmente exposta (KRS, lisil-tRNA sintetase), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo; (i) a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos SYDMS; (ii) a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos X1IX2X3X4X5GX6X7YYADSVKG, e em que X1 é A ou V, X2 é S, D ou G, X3 é Y, P, S ou A, X4 é D, Q, L ou Y, X5 é N, M, S, ou G, X6 é N, R ou P, X7 é T, V, I ou S; e (iii) a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos X 8ALDFDY, em que X8 é M ou L, e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende; (i) a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos TGSSSNIGSNYVT; (ii) a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos X9NX10X11RPS, em que X9 é D, S ou R, X10 é S ou N, e X11 é N ou Q; e (iii) a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo uma sequência de aminoácidos X 12SFSDELGAYV, e em que X12 é A ou S.
[028] A fim de alcançar os objetivos acima, a presente invenção provê um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo, um vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo, e uma célula transformada com o vetor.
[029] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma região N-terminal da lisil-tRNA sintetase (KRS)
extracelularmente exposta, caracterizado pelo método compreender: (a) a transformação de células hospedeiras com o vetor de expressão recombinante; (b) a incubação das células hospedeiras transformadas para produzir um anticorpo ou fragmento do mesmo; e (c) a coleta do anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras.
[030] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para a prevenção e inibição do câncer e metástases do câncer compreendendo o anticorpo ou o fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[031] Além disso, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para a prevenção ou inibição da metástase do câncer que consiste no anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[032] Além disso, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para a prevenção ou inibição da metástase do câncer que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[033] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção fornece uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[034] Além disso, a presente invenção fornece uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes que consiste no anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[035] Além disso, a presente invenção fornece uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[036] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção fornece uma composição para o diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[037] Além disso, a presente invenção fornece uma composição para o diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes que consiste no anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[038] Além disso, a presente invenção fornece uma composição para o diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[039] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção provê o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para prevenir ou inibir o câncer e metástases do câncer.
[040] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção provê um método para prevenir ou inibir o câncer e metástase do câncer compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo a um sujeito com tal necessidade.
[041] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção provê um uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para diagnosticar o câncer e metástases do câncer.
[042] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção provê um método para diagnosticar o câncer ou metástases do câncer, cujo método compreende: a) a obtenção de uma amostra biológica de um indivíduo
(sujeito) com suspeita de metástase de câncer; b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando que o câncer e a metástase de câncer ocorreram quando o nível de expressão de KRS está aumentado.
[043] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção provê o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.
[044] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção provê um método para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes, administrando uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo a um sujeito com tal necessidade.
[045] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção provê o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, para preparar um agente para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.
[046] Para alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção provê um método para diagnosticar uma doença relacionada à migração de células imunes, cujo método compreende: a) obtenção de uma amostra biológica a partir de um sujeito com suspeita de ter uma doença relacionada à migração de células imunes; b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando como uma doença relacionada à migração de células imunes quando o nível de expressão de KRS está aumentado.
[047] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em detalhes.
[048] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “região N-terminal da lisil-tRNA sintetase (KRS) extracelularmente exposta” refere-se a uma sequência particular exposta no espaço extracelular ou na superfície da membrana celular quando a KRS produzida nas células é translocada para a membrana celular (ou membrana plasmática), e normalmente pode referir-se a uma sequência de comprimento total ou parcial de uma região de 1 a 72 aminoácidos N-terminais da KRS. Além disso, há similaridade de sequência entre espécies na região N-terminal da KRS e, especialmente, a região N- terminal da KRS pode conter a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 177.
[049] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “KRS” refere-se ao polipeptídeo de comprimento total conhecido como lisil-tRNA sintetase ou qualquer sequência de fragmento KRS compreendendo a região N-terminal. Como descrito acima, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos de acordo com a presente invenção detectam especificamente a região N-terminal da KRS extracelularmente exposta e, portanto, também podem detectar o polipeptídeo KRS de comprimento total (completo) anterior ou qualquer sequência de fragmentos KRS contendo a região N-terminal. A sequência específica da KRS não é particularmente limitada, desde que a sequência contenha o polipeptídeo definido pela SEQ ID NO: 117 e seja conhecida como lisil-tRNA sintetase no estado técnica. Por exemplo, a KRS da presente invenção inclui: uma sequência derivada de um humano (Homo sapiens) e conhecida como Nº. de Acesso NCBI (Genbank) NP_005539.1 ou semelhante; uma sequência derivada de camundongo (Mus musculus) e conhecida como Nº. de Acesso NCBI (Genbank): NP_444322.1 ou semelhante; e uma sequência derivada de um rato (Rattus norvegicus) e conhecida como Nº. de Acesso NCBI (Genbank): XP_006255692.1 ou semelhante, além disso, pode ser feita referência à seguinte informações de sequência, mas não se limitando a elas: XP_005004655.1(porquinho-da-índia: Cavia porcellus), XP_021503253.1(gerbo, Meriones unguiculatus), XP_002711778.1 (coelho, Oryctolagus cuniculus), XP_536777.2(cão, Canis lupus familiaris), XP_003126904.2 (porco, Sus scrofa), XP_011755768.1 (macaco, Macaca nemestrina), XP_008984479.1 (mico, Callithrix jacchus), XP_019834275.1 (vaca, Bos indicus), XP_511115.2 (chimpanzé, Pan troglodytes). Mais preferencialmente, a KRS pode ser conhecida como o nº de acesso NCBI (Genbank): NP_005539.1.
[050] Na presente invenção, o “anticorpo” também é denominado como imunoglobulina (Ig) e é um termo genérico para proteínas que estão envolvidas na imunidade biológica por ação seletiva sobre antígenos. Um anticorpo completo encontrado na natureza geralmente consiste em dois pares de cadeia leve (LC) e cadeia pesada (HC), cada uma das quais sendo um polipeptídeo composto por vários domínios, ou tem dois pares de HC/LC como unidade básica. Existem cinco tipos de cadeias pesadas que constituem anticorpos de mamíferos, que são denotados pelas letras gregas: α, δ, ε, γ e μ, e diferentes tipos de cadeias pesadas constituem diferentes tipos de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Existem dois tipos de cadeias leves que constituem o anticorpo de mamíferos, que são denominados por λ e κ.
[051] As cadeias pesadas e leves de um anticorpo são estruturalmente divididas em regiões variáveis e regiões constantes de acordo com a variabilidade da sequência de aminoácidos. A região constante da cadeia pesada é composta por três ou quatro regiões constantes da cadeia pesada, como CH1, CH2 e CH3 (anticorpos IgA, IgD e IgG) e CH4 (anticorpos IgE e IgM), e de acordo com o tipo de anticorpo, a cadeia leve é composta por uma região constante CL. As regiões variáveis de cadeias pesada e leve são compostas, cada uma, por um domínio de uma região variável da cadeia pesada (VH) ou de uma região variável de cadeia leve (VL). A cadeia leve e a cadeia pesada estão ligadas entre si por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as regiões variáveis e as regiões constantes das mesmas são dispostas em paralelo, e duas moléculas de cadeia pesada, que estão ligadas às cadeias leves, estão ligadas entre si por duas ligações de dissulfeto covalentes, formando assim um anticorpo completo. Todo o anticorpo se liga especificamente a um antígeno através das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves. Todo o anticorpo é composto por dois pares de cadeias pesadas e leves (HC-LC) e, portanto, uma molécula de anticorpo inteira tem monoespecificidade divalente na qual uma molécula de anticorpo inteira se liga a dois mesmos antígenos por meio de duas regiões variáveis.
[052] As regiões variáveis do anticorpo, que compreendem sítios de ligação ao antígeno, são divididas cada uma em regiões estruturais (FRs, do inglês Framework Regions) com baixa variabilidade de sequência e regiões determinantes de complementaridade (CDRs, do inglês complementary determining regions), que são regiões hipervariáveis com alta variabilidade de sequência. Na VH e VL, três CDRs e quatro FRs estão arranjadas na ordem FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 da direção N-terminal para a C- terminal. As CDRs, que têm a maior variabilidade de sequência nas regiões variáveis do anticorpo, são sítios que se ligam diretamente a um antígeno e são muito importantes na especificidade do anticorpo para o antígeno.
[053] A presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma região N-terminal da lisil-tRNA sintetase (KRS, lisil-tRNA sintetase) extracelularmente exposta, em que o anticorpo ou o fragmento do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo; (i) a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos SYDMS; (ii) a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos X1IX2X3X4X5GX6X7YYADSVKG, e em que X1 é A ou V, X2 é S, D ou G, X3 é Y, P, S ou A, X4 é D, Q, L ou Y, X5 é N, M, S, ou G, X6 é N, R ou P, X7 é T, V, I ou S; e (iii) a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos X8ALDFDY, em que X8 é M ou L, e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende; (i) a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos TGSSSNIGSNYVT; (ii) a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos X9NX10X11RPS, em que X9 é D, S ou R, X10 é S ou N, e X11 é N ou Q; e (iii) a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo uma sequência de aminoácidos X12SFSDELGAYV, e em que X12 é A ou S.
[054] Especificamente, em que (a) a região variável da cadeia pesada (VH) compreende uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1; uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 118; e uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 25, e em que (b) a região variável da cadeia leve (VL) compreende uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7; uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29; uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15.
[055] Os anticorpos compostos pelas sequências CDR têm excelente capacidade para se ligarem especificamente à região N-terminal da KRS exposta à membrana celular externa. Isto está bem descrito nos exemplos do relatório descritivo da presente invenção.
[056] Em um exemplo da presente invenção, a fim de produzir um anticorpo que se liga especificamente à região N-terminal da KRS exposta à membrana celular externa e tem alta afinidade, após melhorar a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo N3 existente (número do pedido: 10-2018-0035446), a biblioteca melhorada foi selecionada através da expressão em levedura.
[057] Através da triagem por FACS primária, secundária e terciária, foram selecionados scFvs N3-1, N3-3 e N3-4 com alta afinidade e especificidade para a região N-terminal da KRS, e um novo scFv N3-5 no qual as regiões VH e VL foram combinadas entre si.
[058] Então, a fim de selecionar uma biblioteca melhorada que se liga especificamente ao N-terminal da KRS ligado a GST e tem alta afinidade, foi selecionada uma biblioteca com uma região variável de cadeia pesada melhorada do scFv N3-3. Os scFvs N3-6, N3-7, N3-8 e N3-9 com alta afinidade e especificidade para a região N-terminal de KRS foram selecionados por meio de triagem FACS primária, secundária, terciária e quaternária.
[059] Entre eles, a fim de melhorar a produtividade e estabilidade do anticorpo IgG N3-8 com a maior afinidade, 7 tipos de anticorpos (N3-8-1, N3-8-2, N3-8-3, N3-8- 4, N3-8-5, N3-8-6, N3-8-7) foram obtidos pela introdução de mutações nas regiões da cadeia pesada e leve de N3-8.
[060] Como resultado, os anticorpos IgG N3-1, IgG N3-3, IgG N3- 4, IgG N3-5, IgG N3-6, IgG N3-7, IgG N3-8, IgG N3-9, IgG N3-8-1, IgG N3-8-2, IgG N3-8-3, IgG N3-8-4, IgG N3-8-5, IgG N3-8-6 e IgG N3-8-7 foram preparados e foi confirmado que os anticorpos também mostraram alta afinidade para a região N-terminal de KRS.
[061] O “anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente à região N-terminal de KRS exposta à membrana extracelular” de acordo com a presente invenção é preferencialmente um anticorpo compreendendo as seguintes composições de CDR da região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve; i, ii, iii, iv, v, vi, vii, vii i, ix, x, xi, xii e xiii que representam, respectivamente, as combinações de CDR dos anticorpos N3-1, N3-3, N3-4, N3-5, N3-6, N3-7, N3-8, N3-9, N3-8-1, N3-8-2, N3-8-3, N3-8-4, N3- 8-5, N3-8-6 e N3-8-7 dos exemplos, mas não está limitado a estes.
[062] O anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento do mesmo compreender:
i) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 3, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 13;
ii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 3, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
iii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 118, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 13;
iv) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 118, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
v) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 17, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
vi) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 19, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
vii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
viii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 23, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
ix) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 27, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15; x) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 29, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
xi) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 25, e uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
xii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 25, e uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 27, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15; ou xiii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 25, e uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 29, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15.
[063] Mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), como segue.
[064] No anticorpo ou fragmento do mesmo, a região variável de cadeia pesada inclui uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47, e a região variável de cadeia leve inclui uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 55.
[065] Preferencialmente, é um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 49; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 51; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 49; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 51; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 37 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 51;
uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 51;
uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 51;
uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID
NO: 51; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 45 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela
SEQ ID NO: 51; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 45 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 53; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 45 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 55; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID
NO: 47 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 51; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID
NO: 47 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 53; uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID
NO: 47 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 55.
[066] O anticorpo do tipo IgG compreendendo a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) pode ser especificamente um anticorpo caracterizado por consistir em uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 105, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 115.
[067] De modo mais preferido, ele é um anticorpo contendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 89 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 107; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 89 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 93 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 107; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 93 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 95 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 97 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 99 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 101 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 103 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 111; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 103 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 113; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 103 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 115; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 105 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 111; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 105 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 113; uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 105 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 115; É um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 99 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 111.
[068] O “anticorpo que se liga especificamente à região N- terminal da KRS extracelularmente exposta” de acordo com a presente invenção não está limitado ao seu tipo, desde que o anticorpo tenha as combinações de CDR acima ou combinações de VH e VL. Como um exemplo específico, o anticorpo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos IgG, IgA, IgM, IgE e IgD e pode ser preferencialmente um anticorpo IgG.
[069] Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais, desde que os anticorpos tenham as combinações CDR acima ou combinações VH e VL que se ligam especificamente à região N-terminal de KRS, mas são preferencialmente anticorpos monoclonais, que são um grupo de anticorpos com sequências de aminoácidos substancialmente idênticas nas cadeias pesadas e leves.
[070] O anticorpo da presente invenção pode ser derivado de qualquer animal, incluindo mamíferos, incluindo humanos, e também de pássaros, e pode ser preferencialmente derivado de humanos. No entanto, o anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo quimérico incluindo uma porção do anticorpo derivado de humanos e uma porção do anticorpo derivado de uma espécie animal diferente. Ou seja, a presente invenção inclui todos os anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos, e podem ser preferencialmente anticorpos humanos.
[071] Além disso, o fragmento do anticorpo da presente invenção refere-se a um fragmento de anticorpo que retém a capacidade de ligação específica ao antígeno de um anticorpo inteiro. De preferência, o fragmento retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% da afinidade de ligação do N-terminal de KRS do anticorpo parental. Especificamente, o fragmento pode estar na forma de Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, diacorpo (diabody), scFv ou semelhantes.
[072] O Fab (fragmento de ligação ao antígeno) é um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, e é composto por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada uma composta de um domínio variável e um domínio constante. O F(ab')2 é um fragmento produzido pela hidrólise de pepsina de um anticorpo, o F(ab')2 tem uma forma na qual duas moléculas Fab são ligadas através de ligações de bissulfeto na cadeia pesada da região de dobradiça (hinge). O F(ab') é um fragmento de anticorpo monomérico no qual uma cadeia pesada da região de dobradiça é adicionada a um Fab separado a partir do fragmento F(ab')2 pela redução das ligações de dissulfeto deste fragmento. Fv (fragmento variável) é um fragmento de anticorpo composto apenas das respectivas regiões variáveis de cadeias pesada e leve. scFv (fragmento variável de cadeia única) é um fragmento de anticorpo recombinante no qual uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL) estão ligadas entre si através de um peptídeo ligante flexível. O termo “diacorpo” (diabody) refere-se a um fragmento no qual a VH e VL do scFv são ligadas por um ligante muito curto e por isso não podem se ligar entre si, e se ligam à VL e VH de outro scFv na mesma forma, respectivamente, para formar um dímero.
[073] Para os propósitos da presente invenção, o fragmento de anticorpo não está limitado à estrutura ou forma do mesmo, desde que o fragmento de anticorpo retenha a especificidade de ligação à região N-terminal de KRS, mas pode ser preferencialmente scFv. O scFv de acordo com a presente invenção tem uma conformação CDR ou conformação VH e VL específica para a região do N-terminal de KRS, e a sequência deste não é particularmente limitada, desde que o terminal C de VH e o N-terminal de VL sejam vinculado por meio de um ligante. O ligante não é particularmente limitado ao seu tipo, desde que seja conhecido como um ligante aplicado a scFv na técnica, mas pode ser um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 57. Especificamente, o scFv da presente invenção pode conter a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID
NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 87.
[074] O anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção pode compreender uma substituição de aminoácidos conservadora (também chamada de variante conservadora do anticorpo) que não altera substancialmente a atividade biológica do mesmo.
[075] Além disso, o anticorpo exposto acima ou fragmento do mesmo da presente invenção pode ser conjugado a uma enzima, uma substância fluorescente, uma substância radioativa e uma proteína, mas não está limitado a elas. Além disso, os métodos de conjugar os materiais acima com o anticorpo são bem conhecidos no estado da técnica.
[076] Além disso, a presente invenção provê um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo.
[077] No presente relatório descritivo, o polinucleotídeo pode ser descrito como um oligonucleotídeo ou ácido nucleico e inclui: análogos de DNA ou RNA (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos e análogos de nucleotídeos de ocorrência não natural) gerados usando moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico), Moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) ou análogos de nucleotídeos; e seus híbridos. O polinucleotídeo pode ser de fita simples ou dupla.
[078] O polinucleotídeo refere-se a uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo composto de cadeias pesadas e leves, cada uma tendo uma conformação CDR ou conformação VH e VL específica para a região N-terminal de KRS. O polinucleotídeo da presente invenção não está particularmente limitado à sua sequência, desde que a sequência codifique o anticorpo ou seu fragmento da presente invenção. Os polinucleotídeos que codificam as sequências CDRs anteriores nos anticorpos descritos acima de acordo com a presente invenção não estão particularmente limitados às sequências dos mesmos, mas podem conter preferencialmente a sequência de nucleotídeos definida pela SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 119.
[079] Além disso, os polinucleotídeos que codificam a VH e VL no anticorpo de acordo com a presente invenção não são particularmente limitados às suas sequências, mas podem conter preferencialmente a sequência de nucleotídeos definida pela SEQ ID NO: 32 (VH), SEQ ID NO: 34 (VL), SEQ ID NO: 36 (VH), SEQ ID NO: 38 (VH), SEQ ID NO: 40 (VH), SEQ ID NO: 42 (VH), SEQ ID NO: 44 (VH), SEQ ID NO: 46 (VH), SEQ ID NO: 48 (VH), SEQ ID NO: 50 (VL), SEQ ID NO: 52 (VL), SEQ ID NO: 54 (VL) ou SEQ ID NO: 56 (VL).
[080] Além disso, o polinucleotídeo que codifica o fragmento do anticorpo pode conter preferencialmente a sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 88, que codificam fragmentos scFv de acordo com a presente invenção.
[081] Os polinucleotídeos que codificam o anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção podem ser obtidos por um método conhecido no estado da técnica. Por exemplo, com base nas sequências de DNA que codificam uma parte ou a totalidade das cadeias pesadas e leves do anticorpo ou sequências de aminoácidos correspondentes, os polinucleotídeos podem ser sintetizados pelos métodos de síntese de oligonucleotídeos que são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, um método da reação em cadeia da polimerase (PCR).
[082] A presente invenção provê um vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou seu fragmento de acordo com a presente invenção.
[083] Conforme usado no presente documento, o termo “recombinante”, usado alternadamente com “manipulação genética”, refere-se à construção de um gene na forma que não existe na natureza, usando técnicas de clonagem molecular, como transformação, clivagem ou ligação de genes.
[084] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “expressão” refere-se à produção de proteínas ou ácidos nucleicos em células.
[085] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “vetor de expressão recombinante” é um vetor que pode expressar uma proteína ou ácido nucleico (RNA) alvo em uma célula hospedeira adequada e o termo refere-se a uma construção gênica que compreende elementos de controle essenciais que estão operacionalmente ligados para serem capazes de expressar uma inserção de polinucleotídeo (gene). O termo “operacionalmente ligado” refere-se à ligação funcional de uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico e uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína alvo ou RNA de modo a realizar funções gerais, o que significa a ligação entre as mesmas de modo a permitir que um gene seja expresso pela sequência de controle de expressão. A sequência de controle de expressão refere-se a uma sequência de DNA que controla a expressão de uma sequência polinucleotídica operacionalmente ligada em uma célula hospedeira particular. Tal sequência de controle de expressão inclui um promotor para a transcrição, qualquer sequência operadora para controlar a transcrição, uma sequência para codificar um sítio de ligação ribossomal de mRNA adequado, uma sequência para controlar a terminação da transcrição e tradução, um códon de iniciação, um códon de terminação, um sinal de poliadenilação, um intensificador/facilitador (enhancer) e semelhantes.
[086] O vetor de expressão recombinante da presente invenção não é particularmente limitado ao seu tipo, desde que o vetor seja normalmente usado em um campo de clonagem e exemplos de vetores de expressão recombinantes incluem um vetor plasmidial, um vetor de cosmídeo, um vetor bacteriófago, e um vetor viral, mas não estão limitados aos mesmos. Exemplos de plasmídeos podem incluir plasmídeos derivados de Escherichia coli (pBR322, pBR325, pUC118, pUC119 e pET-22b(+)), plasmídeos derivados de Bacillus subtilis (pUB110 e pTP5) e plasmídeos derivados de levedura (YEp13, YEp24, e YCp50), e exemplos de vírus podem incluir: vírus animais, tais como retrovírus, adenovírus ou vírus vaccinia; e vírus de insetos, como baculovírus.
[087] O vetor de expressão recombinante de acordo com a presente invenção significa uma construção de gene que está operacionalmente ligada de modo a ser capaz de expressar, em uma célula hospedeira adequada, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo composto de cadeias pesadas e leves com a CDR referida acima ou conformações VH e VL capazes de se ligar especificamente à região N-terminal de KRS.
[088] Os polinucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo de acordo com a presente invenção podem estar contidos em vetores de expressão recombinantes separados, respectivamente, ou podem estar contidos em um vetor de expressão recombinante.
[089] A presente invenção fornece células transformadas com o vetor de expressão recombinante descrito acima.
[090] As células da presente invenção não estão particularmente limitadas ao seu tipo, desde que as células possam ser usadas para expressar um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou um fragmento do mesmo contido no vetor de expressão recombinante da presente invenção. As células
(células hospedeiras) transformadas com o vetor de expressão recombinante de acordo com a presente invenção podem ser células procarióticas (por exemplo, E. coli), células eucarióticas (por exemplo, de levedura ou outros fungos), células vegetais (por exemplo, células de plantas de tabaco ou tomate), células animais (por exemplo, células humanas, células de macaco, células de hamster, células de rato, células de camundongo ou células de insetos) ou hibridomas derivados das mesmas. De preferência, as células podem ser derivadas de mamíferos, incluindo humanos.
[091] Procariontes exemplares adequados para o presente propósito incluem organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como a Escherichia ou, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescens, e Shigella, bem como Bacilli, por exemplo, B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas, por exemplo, P.
aeruginosa, e Streptomyces. As células da presente invenção não são particularmente limitadas desde que as células possam expressar o vetor da presente invenção, mas podem ser preferencialmente E. coli.
[092] O Saccharomyces cerevisiae é mais frequentemente usado como um eucariota para as células da presente invenção. Entretanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e cepas pode ser utilizada, mas não se limita a, por exemplo, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces; hospediros como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K.
bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC
56.500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K . thermotolerans, e K. marxianus; Yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como, por exemplo, Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tal como A. nidulans e A.
niger.
[093] O termo “transformação” refere-se a uma modificação do genótipo de uma célula hospedeira devido à introdução de polinucleotídeos exógenos e refere-se a introdução de um polinucleotídeo exótico em uma célula hospedeira, independentemente do método usado para a transformação.
O polinucleotídeo exótico introduzido na célula hospedeira é incorporado e mantido no genoma da célula hospedeira, ou é mantido sem a incorporação no mesmo, e a presente invenção inclui ambos.
[094] O vetor de expressão recombinante capaz de expressar o anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente à região do N- terminal de KRS de acordo com a presente invenção pode ser introduzido nas células para a produção do anticorpo ou fragmento do mesmo, por um método conhecido no estado da técnica, por exemplo, mas não está limitado a, transfecção transitória, microinjeção, transdução, fusão celular, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por lipossomas, transfecção mediada por DEAE dextrano, transfecção mediada por polibreno, eletroporação, biobalística (gene gun) e métodos conhecidos para a introdução de ácidos nucleicos nas células, e então pode transformar as células.
[095] A presente invenção fornece um método para preparar um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma região N- terminal da lisil-tRNA sintetase (KRS) extracelularmente exposta, caracterizado por compreender: (a) a transformação de células hospedeiras com o vetor de expressão recombinante; (b) a incubação das células hospedeiras transformadas para produzir um anticorpo ou fragmento do mesmo; e (c) a coleta do anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras.
[096] Na etapa (a), a fim de produzir o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção, as células hospedeiras são transformadas com o vetor de expressão recombinante, no qual o polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo está operacionalmente ligado.
[097] Um versado na técnica pode realizar a presente etapa selecionando um método de transformação adequado de acordo com as células hospedeiras selecionadas e o vetor de expressão recombinante como descrito acima. Os vetores de expressão recombinantes compreendendo sequências nucleotídicas de cadeias pesadas e leves podem ser cotransformados na mesma célula hospedeira para permitir que as cadeias pesadas e leves sejam expressas em uma célula, ou os vetores de expressão recombinantes compreendendo sequências nucleotídicas de cadeias pesadas e leves podem ser transformados em células hospedeiras separadas para permitir que as cadeias pesadas e leves sejam expressas separadamente.
[100] Na etapa (b), as células hospedeiras transformadas são incubadas para produzir polipeptídeos de cadeias pesadas e leves do anticorpo ou fragmento do anticorpo de acordo com a presente invenção a partir do vetor de expressão recombinante introduzido nas células hospedeiras.
[101] A composição do meio, as condições de incubação e o tempo de incubação para incubar as células hospedeiras podem ser apropriadamente selecionados de acordo com um método normalmente usado no estado da técnica. As moléculas de anticorpo produzidas na célula hospedeira podem ser acumuladas no citoplasma celular, podem ser secretadas para fora da célula ou no meio de cultura por uma sequência sinal adequada ou podem ser direcionadas usando um periplasma ou semelhante. É também preferível que o anticorpo de acordo com a presente invenção tenha uma conformação funcional através de reenovelamento de proteína usando um método conhecido no estado da técnica de modo a manter a especificidade de ligação para a região N-terminal da KRS. Quanto à produção de anticorpo do tipo IgG, as cadeias pesadas e leves podem ser expressas em células separadas e, em seguida, colocadas em contato umas com as outras em uma etapa separada para constituir o anticorpo inteiro, ou cadeias pesadas e leves podem ser expressas na mesma célula para formar a totalidade do anticorpo dentro da célula.
[102] Na etapa (c) é obtido o anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras.
[103] Um profissional versado na técnica pode selecionar e controlar adequadamente o método de coleta considerando as características dos polipeptídeos do anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras, características das células hospedeiras, o modo de expressão ou o direcionamento ou não do polipeptídeo. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento do mesmo secretado no meio de cultura pode ser coletado obtendo o meio de cultura, no qual as células hospedeiras são cultivadas, removendo as impurezas por centrifugação e etc. A fim de excretar o anticorpo presente em organelas específicas ou citoplasma das células para o exterior das células e coletar o anticorpo, conforme necessário, as células podem ser lisadas em uma extensão que não afeta a estrutura funcional do anticorpo ou fragmento do mesmo. O anticorpo obtido pode ser adicionalmente submetido a um processo de remoção adicional de impurezas e realização de concentração, por meio de cromatografia, filtração usando um filtro, diálise ou semelhantes.
[104] O polipeptídeo no método de fabricação (produção) da presente invenção pode ser o próprio anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção, e um polipeptídeo ao qual outra sequência de aminoácidos diferente do anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção está adicionalmente ligada. Neste caso, a sequência de aminoácidos pode ser removida do anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção usando um método bem conhecido por um profissional versado técnica.
[105] O anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção liga-se especificamente à região do N-terminal de KRS e, portanto, é útil na análise diagnóstica para detectar e quantificar proteínas KRS, por exemplo, células, tecidos ou soro particulares. Especialmente, a região N-terminal de KRS extracelularmente exposta pode ser detectada especificamente sem a lise celular.
[106] O método de detecção da presente invenção pode compreender uma etapa de preparação de uma amostra, que deve ser medida quanto à presença ou ausência de KRS (ou peptídeo N-terminal da KRS extracelularmente exposto) e a concentração do mesmo usando o anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com para a presente invenção (etapa (1)), antes de contatar o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção com a amostra.
[107] Um versado na técnica pode selecionar adequadamente um método de detecção de proteína conhecido usando um anticorpo e preparar uma amostra adequada para o método selecionado. Além disso, a amostra pode ser células ou tecidos obtidos por biópsia, sangue, sangue total, soro, plasma, saliva, líquido cefalorraquidiano ou semelhantes, que é coletado de um sujeito para ser examinado quanto à presença ou ausência de câncer (especialmente câncer de mama ou câncer de pulmão) ou metástase de câncer. Exemplos do método de detecção de proteína usando o anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Western blotting, imunotransferência, dot blotting, imuno-histoquímica, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio, ensaio de ligação competitiva, imunoprecipitação e semelhantes. Por exemplo, para Western blotting, uma preparação pode ser feita adicionando um tampão adequado para eletroforese a uma amostra ou lisado celular, seguido por fervura, e para imuno-histoquímica, um tratamento pode ser realizado imobilizando e bloqueando células ou fatias de tecido, seguido por bloqueio.
[108] Em seguida, é realizada uma etapa de contato do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção com a amostra preparada na etapa descrita acima (etapa (2)).
[109] O anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo ou fragmento do mesmo que tem as conformações CDR ou VH e VL descritas acima e liga-se especificamente à região N-terminal de KRS, e os tipos específicos e organização de sequência dos mesmos são conforme descrito acima.
[110] O anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser marcado com uma fração detectável geral, para “detecção” do mesmo. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser marcado com um radioisótopo ou marcador fluorescente conhecido no estado da técnica. Além disso, vários marcadores enzimáticos são utilizáveis, e exemplos de marcadores enzimáticos incluem: luciferase, como a luciferase de Drosophila e a luciferase bacteriana (Patente Norte-Americana US 4.737.456), Luciferina, 2,3- dihidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidases como, por exemplo, peroxidase do rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β- galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarina oxidases (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato-desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares. As técnicas para conjugar enzimas com anticorpos são conhecidas no estado da técnica. Os marcadores podem ser conjugados direta ou indiretamente com anticorpos usando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, um anticorpo pode ser conjugado à biotina, e quaisquer rótulos pertencentes a três classes de categorias generalizadas citadas acima podem ser conjugados à avidina ou vice-versa. A biotina pode se ligar seletivamente à avidina e, portanto, este rótulo pode ser conjugado a um anticorpo de forma indireta. Alternativamente, a fim de alcançar a conjugação indireta de um rótulo a um anticorpo, o anticorpo pode ser conjugado a um pequeno hapteno (por exemplo, dioxina), e um dos diferentes tipos de rótulos acima pode ser conjugado a um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, um anticorpo antidioxina). Portanto, a conjugação indireta de rótulos a um anticorpo pode ser alcançada.
[111] Conforme utilizado na presente invenção, “contato” é usado em um sentido geral do mesmo e refere-se à mistura, ligação ou toque de duas ou mais substâncias. O contato pode ser realizado in vitro ou em outro recipiente, ou pode ser realizado in situ, in vivo, no sujeito, tecido ou célula.
[112] Em seguida, é realizada uma etapa de detecção do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção a partir da amostra após a execução da etapa (2) (etapa (3)).
[113] A “detecção” é realizada em um complexo do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção e um antígeno, o complexo sendo formado na amostra, e refere-se à detecção da presença ou ausência do peptídeo N-terminal de KRS (ou uma proteína incluindo o peptídeo, por exemplo, KRS) ou a medição (incluindo medição qualitativa, medição quantitativa ou ambas) do nível do peptídeo. Portanto, o método de detecção da presente invenção pode compreender ainda uma etapa de remoção de anticorpos extras ou fragmentos dos mesmos, que não formaram o complexo junto com a região N-terminal de KRS, após a execução da etapa (2) antes da etapa (3) a ser descrito mais tarde.
[114] Quando o anticorpo ou fragmento do mesmo utilizado na etapa (2) descrito acima contém uma porção detectável, como fluorescência, isótopo radioativo ou enzima, que marca diretamente o anticorpo ou fragmento do mesmo, a detecção pode ser realizada por um método de detecção para a porção correspondente conhecido no estado técnico. Por exemplo, a radioatividade pode ser medida por, por exemplo, pela contagem de cintilação e a fluorescência pode ser quantificada usando um fluorômetro.
[115] Quando o anticorpo ou seu fragmento, per se, utilizado na etapa (2) descrita acima não contém a fração detectável anterior, a detecção indireta usando um anticorpo secundário marcado com fluorescência, radioatividade, enzima ou semelhantes pode ser realizada. O anticorpo secundário liga-se ao anticorpo ou fragmento deste (anticorpo primário) de acordo com a presente invenção.
[116] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou inibir a metástase do câncer e uma composição para diagnosticar o câncer compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção como um ingrediente ativo.
[117] O câncer não é particularmente limitado ao seu tipo, desde que o câncer seja conhecido no estado da técnica como um tumor maligno, e exemplos do mesmo podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de intestino grosso, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer gástrico, câncer de fígado, câncer sanguíneo, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer anal, câncer de cólon, carcinoma de trompa de Falópio, carcinoma endometrial, câncer cervical, câncer vaginal, carcinoma vulvar, doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer endócrino, câncer de tireoide, carcinoma de paratireoide, câncer adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer uretral, câncer de pênis, câncer de próstata, leucemia crônica ou aguda, linfoma de linfócitos, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma pélvico renal,
tumor do SNC, linfoma primário do SNC, tumor da medula espinhal, glioma de tronco cerebral e adenoma hipofisário. De preferência, o câncer pode ser câncer de mama ou câncer pulmonar.
[118] A presente invenção pode compreender o anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção sozinho ou pode ainda compreender pelo menos um transportador farmaceuticamente aceitável.
Conforme utilizado na presente invenção, o termo “farmaceuticamente aceitável” refere-se a uma composição não tóxica que é fisiologicamente aceitável, não inibe a ação de um ingrediente ativo quando administrado a humanos e normalmente não causa efeitos colaterais graves.
[119] Na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser administrado em várias formas de dosagem orais e parentais durante a administração clínica. O anticorpo ou fragmento do mesmo, quando formulado, pode ser preparado usando um diluente ou um excipiente, como um enchimento, um extensor, um aglutinante, um agente umectante, um desintegrante ou um tensoativo, que é normalmente usado. As formulações sólidas para administração oral incluem um comprimido, uma pílula, um pó, grânulos, uma cápsula, uma pastilha e similares. Estas formulações sólidas podem ser preparadas misturando um derivado de arila de fórmula química 1 da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo com pelo menos um excipiente, por exemplo, amido, carbonato de cálcio, sacarose ou lactose ou gelatina. Além disso, lubrificantes, como estearato de magnésio e talco, podem ser usados além dos excipientes simples. As formulações líquidas para administração oral incluem uma suspensão, uma solução para uso interno, uma emulsão, xarope e similares. Além de diluentes simples que são frequentemente usados, como água e parafina líquida, vários excipientes, por exemplo, um agente umectante, um adoçante, um aromatizante e um conservante e similares podem estar contidos nas formulações líquidas.
[120] Formulações exemplares para administração parenteral incluem uma solução aquosa estéril, um solvente não aquoso, um solvente de suspensão, uma emulsão, um agente de liofilização e um supositório. A composição para o tratamento da presente invenção pode ser preparada na forma de um bolo seco por congelamento ou uma solução aquosa para misturar e armazenar qualquer transportador, excipiente ou estabilizante fisiologicamente aceitável e um anticorpo com pureza preferível. O transportador, excipiente ou estabilizante aceitável é atóxico para um usuário na dose e concentração usadas e exemplos dos mesmos incluem: tampões, por exemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, por exemplo, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulina; polímeros hidrofílicos, por exemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos, por exemplo, glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrina; agentes quelantes, por exemplo, EDT; alcoóis de açúcar, por exemplo, manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, por exemplo, sódio; e (ou) tensoativos não iônicos, por exemplo, Tween, pluronics ou polietilenoglicol (PEG).
[121] O anticorpo da presente invenção pode ser administrado em uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um sujeito que luta contra o câncer ou uma doença relacionada à migração de células imunes. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “quantidade farmaceuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade que mostra uma resposta mais elevada em comparação com o controle negativo e, preferencialmente, refere-se a uma quantidade suficiente para tratar o câncer, uma quantidade suficiente para prevenir ou inibir a metástase do câncer e uma quantidade suficiente para tratar uma doença relacionada à migração de células imunes. A quantidade eficaz total do anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção pode ser administrada a um paciente como uma dose única, ou pode ser administrada por um protocolo de tratamento fracionado, no qual doses múltiplas são administradas por um longo período de tempo. A dose do anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção para o corpo humano pode ser normalmente de 0,01-100 mg/kg/semana, preferencialmente 0,1-20 mg/kg/semana, e mais preferencialmente 5-10 mg/kg/semana. No entanto, quanto à dose do anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção, uma dose eficaz do mesmo em relação a um paciente é determinada em consideração a vários fatores, por exemplo, a via de administração da composição farmacêutica, o número de vezes de tratamento, a idade, peso corporal, condição de saúde e sexo do paciente, a gravidade da doença, a dieta e a taxa de excreção e, portanto, considerando este fato, um versado na técnica poderia determinar uma quantidade eficaz adequada do anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção de acordo com o uso particular como um inibidor do câncer ou inibidor de metástase do câncer. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção não está particularmente limitada à forma de dosagem, via de administração e método de administração da mesma, desde que a composição apresente efeitos da presente invenção.
[122] A via de administração da composição da presente invenção pode ser um método de administração de anticorpo conhecido, por exemplo, a injeção ou infusão por via intravenosa, intraperitoneal, intracraniana, subcutânea, intramuscular, intraocular, intra-arterial, cerebrospinal ou intralesional, ou a injeção ou infusão pelo sistema de liberação sustentada descrito abaixo. Por exemplo, o anticorpo da presente invenção pode ser administrado sistemicamente ou localmente.
[123] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com cirurgia, terapia hormonal, quimioterapia e métodos usando controlador de resposta biológica, para câncer ou metástase do câncer.
[124] O diagnóstico e o prognóstico do câncer (ou metástase de câncer) de acordo com a presente invenção podem ser avaliados pela detecção de proteínas KRS (especialmente, região N-terminal de KRS exposta extracelularmente) na amostra biológica.
[125] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “diagnóstico” refere-se à identificação da presença ou características de uma condição patológica. Na presente invenção, o diagnóstico é para identificar a ocorrência ou a probabilidade (risco) de câncer e/ou metástase do câncer ou doença relacionada à migração de células imunes.
[126] O termo “detecção” é conforme descrito acima, e a amostra biológica inclui sangue e outras amostras líquidas com origens biológicas, espécimes de biópsia, amostras de tecido sólido, como cultura de tecido ou células derivadas delas. Mais especificamente, os exemplos da amostra biológica podem incluir, mas não estão limitados a, tecidos, extratos, lisados celulares, sangue total, plasma, soro, saliva, líquido ocular, líquido cefalorraquidiano, suor, urina, leite, líquido ascítico, líquido sinovial, fluido peritoneal e semelhantes. A amostra pode ser obtida de animais, preferencialmente mamíferos, e mais preferencialmente humanos. A amostra pode ser pré-tratada antes do uso para a detecção. Exemplos de pré- tratamento podem incluir filtração, destilação, extração, concentração, desativação de ingredientes de interferência, adição de reagentes e semelhantes. Além disso, os ácidos nucleicos e proteínas isoladas da amostra podem ser usados para a detecção.
[127] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser fornecido como um kit de diagnóstico. O kit não é particularmente limitado ao seu tipo, desde que o kit seja conhecido na técnica como um kit de ensaio que fornece um peptídeo com um anticorpo ou um domínio de ligação particular como um componente e exemplos dos mesmos incluem um kit para western blotting, ELISA, radioimunoensaio, radioimunodifusão, imunodifusão de Ouchterlony, imunoeletroforese do tipo rocket, imuno-histoquímica, ensaio de imunoprecipitação, ensaio de fixação do complemento, FACS, chip de proteína ou semelhantes.
[128] O anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção pode ser usado em um kit, isto é, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para realizar o ensaio de diagnóstico. Quando o anticorpo é marcado com uma enzima, o kit pode incluir substratos e cofatores exigidos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que fornece o cromóforo ou fluoróforo). Além disso, podem ser incluídos outros aditivos, tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, tampão de bloqueio ou tampão de lise) e similares. As quantidades relativas de vários reagentes podem ser amplamente variadas para fornecer concentrações em solução dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Os reagentes podem ser fornecidos como pó-seco, geralmente liofilizados, incluindo excipientes que na dissolução irão fornecer uma solução reagente com uma concentração apropriada.
[129] Na presente invenção, o anticorpo é um polipeptídeo contendo uma Fc variante de uma região Fc de IgG humana tipo selvagem e a Fc variante compreende pelo menos uma substituição de aminoácido adicional como L117A, L118A, T182A, T182A, P212G da região Fc de IgG 1 humana tipo selvagem definida na SEQ ID NO: 126; ou a T179A da região Fc de IgG4 humana definida na SEQ ID NO: 138, o polipeptídeo é caracterizado por compreender um polipeptídeo com uma função ADCC/CDC reduzida em comparação com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc de IgG tipo selvagem.
[130] Na presente invenção, a região Fc refere-se à região C- terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina contendo pelo menos uma parte da região constante, e inclui uma região Fc de sequência tipo selvagem e uma região Fc variante. Na presente invenção, “Fc variante” refere-se a um polipeptídeo que contém uma modificação no domínio Fc. A Fc variante da presente invenção é definida de acordo com a modificação dos aminoácidos que a constituem. Especificamente, a L118A é uma Fc variante na qual a leucina é substituída por alanina na posição 118, T182A é uma Fc variante na qual a treonina é substituída por alanina na posição 182, e P212G é uma Fc variante na qual a prolina é substituída por glicina na posição 212 quando comparada com o polipeptídeo Fc parental. As modificações de aminoácidos podem ser adições de aminoácidos, deleções de aminoácidos ou substituições de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem incluir aminoácidos que ocorrem naturalmente e aminoácidos que não ocorrem naturalmente. As variantes podem incluir aminoácidos não naturais.
[131] A “substituição de aminoácidos” refere-se à substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos existentes por outro resíduo de aminoácidos “substituto” diferente dentro de uma determinada sequência de aminoácidos.
[132] Os resíduos de substituição ou resíduos podem ser “resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente” (ou seja, codificados pelo código genético), e podem ser selecionados do grupo composto por alanina (Ala); Arginina (Arg); Asparagina (Asn); Ácido Aspártico (Asp); Cisteína (Cys ou Cis); Glutamina (Gln); Ácido Glutâmico (Glu); Glicina (Gly ou Gli); Histidina (His); Isoleucina (Ile): leucina (Leu); Lisina (Lys ou Lis); Metionina (Met); Fenilalanina (Phe ou Fen); Prolina (Pro); Serina (Ser); Treonina (Thr ou Tre); Triptofano (Trp); Tirosina (Tyr ou Tir); e Valina (Val).
[133] A “função ADCC/CDC” significa uma função de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC, do inglês Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity), e citotoxicidade dependente do complemento (CDC, do inglês complement-dependent cytotoxicity). A “citotoxicidade dependente do complemento” (CDC) refere-se à lise de células de expressão de antígenos pelo anticorpo da presente invenção na presença do complemento. A “citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo” (ADCC) refere-se à citotoxicidade celular não específica (por exemplo, células natural killer (NK), neutrófilos e macrófagos) que expressam receptores Fc (FcRs) que reconhecem anticorpos ligados em células-alvo e, portanto, refere-se a uma reação mediada por células que destrói a célula alvo.
A CDC e ADCC podem ser medidas usando ensaios bem conhecidos e disponíveis no estado da técnica. (Exemplos de referência: patentes US
5.500.362 e US 5.821.337, e Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). A região constante do anticorpo é importante para a capacidade do anticorpo de fixar o complemento e mediar a citotoxicidade dependente de célula. Assim, o isotipo do anticorpo pode ser selecionado com base em se é desejável que o anticorpo medeie a citotoxicidade.
[134] De modo específico, o anticorpo da presente invenção é especificamente um anticorpo que contém uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir de sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 91.
[135] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir de sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela
SEQ ID NO: 107.
[136] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir de sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109.
[137] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir de sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 107.
[138] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir de sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109.
[139] Uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada entre as sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NO: 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO:
109.
[140] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 182, 184, 186, 188, 190, 192, e 194 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109.
[141] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109.
[142] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109.
[143] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 111.
[144] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 113.
[145] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 115.
[146] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 111.
[147] Uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 113.
[148] Uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 115; ou.
[149] Uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs: 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO:
111.
[150] A presente invenção provê uma composição para prevenir ou tratar doenças relacionadas à migração de células imunes e uma composição para diagnosticar doenças relacionadas à migração de células imunes, compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo como ingrediente ativo.
[151] Na presente invenção, o termo doença relacionada à migração de células imunes, por exemplo, pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em doença cardiovascular, doença fibrótica, doença inflamatória e síndrome de Alport, mas se a migração excessiva de células imunes (e/ou invasão) for conhecida na técnica como a patogênese principal, então o tipo específico de doença não é particularmente limitado.
[152] A doença cardiovascular pode ser, por exemplo, selecionada a partir do grupo que consiste em hipertensão (incluindo complicações inflamatórias causadas pela hipertensão), hipertensão arterial pulmonar, aterosclerose, angina pectoris, infarto do miocárdio, doença cerebrovascular isquêmica, arteriosclerose e esclerose mesentérica, mas o tipo da doença específica não é particularmente limitado.
[153] A doença fibrótica pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em, por exemplo, esclerodermia, artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerativa, mielofibrose, fibrose pulmonar, fibrose hepática, cirrose hepática, fibrose renal, glomeruloesclerose, miofibrose, mielofibrose, miofibrose cordis, fibrose intersticial, fibrose pancreática, fibrose esplênica, fibrose mediastinal, fibrose vascular, fibrose cutânea, fibrose ocular, degeneração macular, fibrose articular, fibrose tireoidiana, fibrose endomiocárdica, fibrose peritoneal, fibrose retroperitoneal, fibrose maciça progressiva, fibrose sistêmica nefrogênica, fibrose ereditária, lúpus eritematoso sistêmico, fibrose hereditária, fibrose infecciosa, fibrose irritante, fibrose devido a autoimunidade crônica, fibrose devido à incompatibilidade de antígeno durante o transplante de órgão, complicações fibróticas após a cirurgia, fibrose devido a hiperlipidemia, fibrose devido à obesidade, fibrose diabética, fibrose devido à hipertensão, e oclusão devido a fibrose relacionado à inserção de stent, mas o tipo específico de doença não é particularmente limitado.
[154] Na presente invenção, a doença inflamatória pode ser selecionada preferencialmente a partir do grupo que consiste em uma doença autoimune, doença inflamatória intestinal, dermatite (por exemplo, dermatite atópica, eczema, psoríase, etc.), doença diabética ocular (retinopatia diabética, etc.), peritonite, osteomielite, celulite, meningite, encefalite, pancreatite, choque induzido por trauma, asma brônquica, rinite, sinusite, timpanite, pneumonia, gastrite, enterite, fibrose cística, apoplexia (apoplexia, derrame cerebral, etc.), bronquite, bronquiolite, hepatite (cirrose, não alcoólica, esteato-hepatite, etc.), nefrite (insuficiência renal diabética, etc.), proteinúria, artrite (como artrite psoriática, osteoartrite), neurite (neuropatia diabética, esclerose múltipla, etc.), gota, espondilite, síndrome de Reiter, poliarterite nodosa, vasculite, esclerose lateral amiotrófica, granulomatose de Wegener, hipercitoquinemia, polimialgia reumática, arterite das células articulares, artrite por cristais de cálcio, pseudogota, artrite reumatoide não articular, bursite, tendinovite, epicondilite (cotovelo de tenista), articulação de Charcot, hemartrose, púrpura de Henoch- Schonlein, osteoartrite hipertrófica, reticulocitoma multicêntrico, sarcoidose, hemocromatose, drepanocitose, hiperlipoproteinemia, hipogamaglobulinemia, hiperparatiroidismo, acromegalia, febre mediterrânea familiar, doença de Behcet, lúpus eritematoso sistêmico, febre recorrente, psoríase, esclerose múltipla, sepse, choque séptico, síndrome do desconforto respiratório agudo, disfunção de múltiplos órgãos, doença pulmonar obstrutiva crônica, lesão pulmonar aguda e displasia bronco-pulmonar, e também inclui doenças inflamatórias crônicas, mas o tipo de doença não é particularmente limitado.
[155] Na presente invenção, as doenças autoimunes podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, esclerodermia sistêmica, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, asma, colite ulcerativa, doença de Behcet, doença de Crohn, esclerose múltipla, dermatite, doença do colágeno, vasculite, artrite, granulomatose, doenças autoimunes com especificidade de órgão, colite ulcerativa e GvHD (doença do enxerto contra o hospedeiro).
[156] A doença inflamatória crônica refere-se a uma condição que é cronicizada com referência aos tipos de doenças inflamatórias descritas acima, e exemplos preferidos das mesmas incluem asma, dermatite atópica, eczema, psoríase, osteoartrite, gota, artrite psoriática, cirrose, esteato-hepatite não alcoólica, doença pulmonar obstrutiva crônica, rinite, retinopatia diabética, insuficiência renal diabética, neuropatia diabética e esclerose múltipla, mas os exemplos não se limitam apenas a estes.
[157] Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ser administrado em uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um indivíduo que sofre de uma doença relacionada à migração de células imunes. Acima, o termo “quantidade farmaceuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade que exibe uma resposta mais elevada em comparação com o grupo de controle negativo e, de preferência, refere-se a uma quantidade suficiente para tratar doenças relacionadas à migração de células imunes. A quantidade eficaz total do anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção, a formulação da composição, o método de administração e a via de administração estão descritos acima.
[158] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com cirurgia, terapia hormonal, quimioterapia e métodos que usam modificadores da resposta biológica para a prevenção ou tratamento de doenças relacionadas à migração de células imunes.
[159] O diagnóstico e o prognóstico de doenças relacionadas com a migração de células imunes de acordo com a presente invenção podem ser realizados pela detecção de uma proteína KRS (especialmente, uma região N-terminal de KRS exposta sobre a membrana extracelular) em uma amostra biológica.
[160] Adicionalmente, a presente invenção provê o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para prevenir ou inibir o câncer e metástases do câncer.
[161] Além disso, a presente invenção provê um método para prevenir ou inibir o câncer e metástase do câncer compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo para um indivíduo com tal necessidade.
[162] Além disso, a presente invenção provê o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para diagnosticar o câncer e metástases do câncer.
[163] Além disso, a presente invenção provê um método para diagnosticar o câncer ou metástases do câncer, compreendendo: a) a obtenção de uma amostra biológica de um indivíduo (sujeito) com suspeita de metástase de câncer; b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando que o câncer e a metástase de câncer ocorreram quando o nível de expressão de KRS está aumentado.
[164] A presente invenção provê o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.
[165] A presente invenção provê o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo para preparar um agente para o diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes.
[166] A presente invenção provê um método para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes, administrando uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo a um sujeito com tal necessidade.
[167] A presente invenção provê um método para diagnosticar uma doença relacionada à migração de células imunes, compreendendo: a) obtenção de uma amostra biológica a partir de um sujeito com suspeita de ter uma doença relacionada à migração de células imunes;
b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando como uma doença relacionada à migração de células imunes quando o nível de expressão de KRS está aumentado.
[168] Em um exemplo de realização, a presente invenção provê um método de diagnóstico e de tratamento do câncer e metástases de câncer que compreende as etapas de: a) a obtenção de uma amostra biológica de um indivíduo (sujeito) com suspeita de metástase de câncer; b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando que o câncer e a metástase de câncer ocorreram quando o nível de expressão de KRS está aumentado; e e) a administração de um medicamento terapêutico para tratar o câncer e as metástases do câncer ao indivíduo diagnosticado; ou o tratamento da doença por meio de cirurgia.
[169] Em um exemplo de realização, a presente invenção provê um método para diagnosticar e tratar doenças relacionadas à migração de células imunes, compreendendo as etapas de: a) obtenção de uma amostra biológica a partir de um sujeito com suspeita de ter uma doença relacionada à migração de células imunes; b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando como uma doença relacionada à migração de células imunes quando o nível de expressão de KRS está aumentado; e e) a administração de um medicamento terapêutico para tratar uma doença relacionada à migração de células imunes para o indivíduo diagnosticado; ou o tratamento da doença por meio de cirurgia.
[170] A etapa e) é uma etapa da realização do tratamento da doença ao indivíduo cuja doença é diagnosticada na etapa d) por meios como a administração de medicamentos terapêuticos ou cirurgia.
[171] O “tratamento” da presente invenção refere-se, em geral, a melhorar os sintomas de câncer e metástase de câncer ou doença relacionada à migração de células imunes, isso pode incluir a cura, prevenção substancial ou melhora da condição do câncer e metástases do câncer ou doenças relacionadas à migração de células imunes, e inclui, mas não está limitado a, aliviar, curar ou prevenir um sintoma ou a maioria dos sintomas resultantes da doença.
[172] O medicamento terapêutico não é particularmente limitado, desde que seja um tipo de medicamento comumente usado para o tratamento do câncer, metástases do câncer ou doenças relacionadas à migração de células imunes e, em um exemplo de realização, ele pode ser um ou mais medicamentos selecionados a partir do grupo que consiste em um agente anticâncer, um agente anti-inflamatório (tal como um agente esteroide como um exemplo representativo) e um agente terapêutico para hipertensão arterial pulmonar, mas não está limitado aos mesmos.
[173] O medicamento terapêutico é administrado a um indivíduo em uma “quantidade terapeuticamente eficaz”, e a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada por aqueles versados na técnica, a dose eficaz para um paciente pode ser determinada considerando vários fatores, como a gravidade do paciente, dieta e taxa de excreção, bem como idade, peso, condição de saúde, sexo e doença do paciente. A via de administração do fármaco terapêutico não é particularmente limitada e pode ser administrada por via oral ou parenteral, e inclui tanto a administração local como a administração sistêmica. A administração parenteral pode ser, mas não está limitada a, aplicação de fármaco intranasal, injeção subcutânea e semelhantes, e como outro exemplo, pode ser utilizada uma injeção intramuscular, injeção intravenosa ou semelhantes.
[174] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “compreendendo” é usado como sinônimo de “contendo” ou “sendo caracterizado” e não exclui ingredientes ou etapas adicionais não mencionados na composição ou método. Os termos “consistindo em” e “constituído por” significa excluir elementos, etapas ou ingredientes adicionais que não estejam descritos separadamente. O termo “consistindo essencialmente em” significa incluir os elementos ou etapas mencionados, bem como qualquer elemento ou etapa que não afete substancialmente as características básicas dos elementos ou etapas mencionados no escopo das composições ou métodos.
EFEITO VANTAJOSO
[175] Consequentemente, a presente invenção provê um anticorpo que tem uma sequência CDR (região determinante de complementaridade) específica aqui descrita e se liga especificamente à região
N-terminal da KRS exposta à membrana extracelular. O método da presente invenção pode ser usado para preparar um anticorpo possuindo uma afinidade mais elevada para o N-terminal de KRS do que um anticorpo convencional.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[176] A Fig. 1 mostra em um diagrama esquemático de seleção e estratégia de construção de duas bibliotecas construídas com base em cada região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) de N3, a fim de melhorar a afinidade anticorpo N3 que visa a porção N-terminal de KRS para a porção N-terminal de KRS.
[177] A Fig. 2a mostra os resultados da análise do peptídeo KRS (1-72) ligado a 10 nM, 1 nM ou 0,1 nM de GST e a capacidade de ligação analisada por citometria de fluxo (FACS) para cada etapa de levedura que expressa a biblioteca selecionada usando FACS (separação de células ativadas por fluorescência).
[178] A Fig. 2b mostra os resultados da análise do peptídeo KRS (1-72) ligado a GST 0,1 nM e a capacidade de ligação com um citômetro de fluxo para leveduras que expressam 47 clones individuais na biblioteca final selecionada.
[179] As Figs. 3a e 3b mostram resultados de ELISA para medir a afinidade ao N-terminal de KRS dos anticorpos N3-1, N3-3, N3-4 e N3-5 selecionados como tendo alta afinidade e especificidade para o peptídeo N- terminal de KRS (resíduos 1-72).
[180] A Fig. 4 mostra os resultados da confirmação do efeito inibidor da migração celular do anticorpo N3 e anticorpo N3-1.
[181] A Fig. 5 mostra o resultado da comparação da afinidade para KRS do anticorpo N3 e do anticorpo N3-1 pelo método SPR (ressonância plasmônica de superfície).
[182] A Fig. 6 mostra os resultados da análise do peptídeo KRS
(1-72) ligado a 10 nM, 1 nM ou 0,1 nM de GST e a capacidade de ligação analisada por citômetro de fluxo para cada levedura que expressa a biblioteca de etapas selecionada usando MACS e FACS (separação de células ativadas por fluorescência).
[183] A Fig. 7 mostra os resultados de ELISA para medir a afinidade do anticorpo N3-1, anticorpo N3-6, anticorpo N3-7, anticorpo N3-8 e anticorpo N3-9 para o N-terminal de KRS.
[184] A Fig. 8 mostra os resultados da comparação da afinidade do anticorpo N3-6, anticorpo N3-7, anticorpo N3-8 e anticorpo N3-9 para KRS pelo método de ressonância plasmônica de superfície (SPR).
[185] A Fig. 9 mostra os resultados da confirmação do efeito inibidor da migração celular pelo anticorpo N3, anticorpo N3-1, anticorpo N3-6, anticorpo N3-7, anticorpo N3-8 e anticorpo N3-9.
[186] A Fig. 10 mostra os resultados da confirmação da endocitose do anticorpo N3 e do anticorpo N3-8 em células de câncer de mama pelo método de IHQ (imuno-histoquímica).
[187] Fig. 11 mostra a mudança da pressão sistólica final do ventrículo direito (RVESP) nos modelos de hipertensão arterial pulmonar (HAP) por administração do anticorpo N3 da presente invenção (IgG simulado (mock): controle negativo, Ab 1mpk: anticorpo N3 1mpk, Ab 10 mpk: Anticorpo N3 10 mpk, sildenafil: controle positivo).
[188] A Fig. 12 é o resultado da confirmação por coloração de IHQ de que a migração e invasão de células imunes são reduzidas pela administração do anticorpo N3 da presente invenção nos modelos de hipertensão arterial pulmonar (HAP).
[189] A Fig. 13 mostra o resultado da confirmação de que o número total de células imunes aumentou no BALF (fluido de lavagem broncoalveolar) em modelos de camundongo de lesão pulmonar aguda foi reduzido dependendo da concentração de tratamento de anticorpo N3 (anticorpo que se liga ao N-terminal de KRS).
[190] A Fig. 14 mostra o resultado da confirmação de que os neutrófilos que estão particularmente aumentados no fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) dos modelos de camundongo de lesão pulmonar aguda foram reduzidos dependendo da concentração de tratamento do anticorpo N3 (anticorpo que se liga ao N-terminal de KRS).
[191] Fig. 15 mostra os resultados da confirmação por FACS de que o aumento da migração e invasão de macrófagos (IM, CD11b +/F4/80+) no tecido pulmonar dos modelos de camundongo de lesão pulmonar aguda foi reduzido de maneira dependente da concentração de tratamento de anticorpo N3 (anticorpo de ligação ao N-terminal de KRS).
[192] A Fig. 16 é um gráfico que quantifica os resultados da Fig.
15.
[193] A Fig. 17 é uma imagem de tecido que mostra que a fibrose tecidual avançada no tecido pulmonar dos modelos de camundongo em modelos de camundongo com lesão pulmonar aguda é inibida pelo tratamento com um anticorpo N3 (anticorpo de ligação ao N-terminal de KRS). Tecidos de cada grupo experimental e grupo controle foram observados ao microscópio após a coloração com tricrômio de Masson.
[194] A Fig. 18 mostra os resultados que confirmam que a migração celular foi inibida por tratamento com anticorpos N3-8, N3-8-1, e anticorpos derivados de N3-8-1 nos quais as funções ADCC/CDC foram removidas.
[195] A Fig. 19 mostra os resultados que confirmam que a migração celular de células de câncer foi inibida pelo tratamento com anticorpos N3-8, N3-8-1, e anticorpos derivados de N3-8-1 nos quais as funções ADCC/CDC foram removidas.
MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
[196] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em detalhes.
[197] No entanto, os exemplos a seguir servem apenas para ilustrar a presente invenção, e não pretendem limitar o escopo da presente invenção.
EXEMPLO 1
CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE EXPRESSÃO DE SUPERFÍCIE CELULAR DE LEVEDURA PARA AUMENTAR A AFINIDADE
[198] A afinidade para o anticorpo N3 N-terminal (número do pedido: 10-2018-0035446) direcionado ao N-terminal do KRS existente é de cerca de 150 nM, que é menor do que a de vários anticorpos na forma IgG completa. Consequentemente, a fim de aumentar a afinidade para preparar um anticorpo com um efeito melhor, a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada do anticorpo N3 foram melhoradas.
[199] O modelo de homologia foi usado para prever a estrutura aproximada de N3, através da qual foram introduzidas mutações aleatórias nas regiões CDR previstas para desempenhar um papel importante na ligação ao antígeno. Especificamente, na biblioteca com base na região variável de cadeia pesada, NNK, foi usado um códon degenerado que pode conter todas as 20 sequências de aminoácidos para resíduos de CDR3. Na biblioteca baseada na região variável de cadeia leve, NNK, foi usado um códon degenerado que pode conter todas as 20 sequências de aminoácidos para resíduos CDR3.
[200] Especificamente, o DNA que codifica a biblioteca projetada foi amplificado usando uma técnica de PCR e, em seguida, concentrado usando um método de precipitação com etanol.
[201] O vetor de expressão de superfície de levedura (C-aga2), que expressa a proteína aga2 no C-terminal para recombinação homóloga, é tratado com as enzimas de restrição NheI e MluI e purificado usando o método de extração em gel de agarose e o método de precipitação com etanol concentrado.
[202] 4 µg de vetores tratados com enzima de restrição para 12 µg de cada DNA que codifica a biblioteca foram transformados em levedura EBY100 para expressão na superfície da levedura por eletroporação, e o tamanho da biblioteca foi confirmado medindo o número de colônias cultivadas no meio seletivo SD-CAA (20 g/L de glicose, 6,7 g/L de base nitrogenada de leveduras sem aminoácidos, 5,4 g/L de Na2HPO4, 8,6 g/L NaH2PO4, 5 g/L de casaminoácidos) por diluição em série.
[203] Este processo é mostrado na Fig. 1.
EXEMPLO 2 SELEÇÃO DA REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE (VL) E REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA (VH) COM AFINIDADE MELHORADA PARA O PEPTÍDEO KRS (1-72)
CONJUGADO COM GST
[204] Dois tipos de bibliotecas de melhora da afinidade baseadas em N3 construídas no Exemplo 1 foram selecionados usando o peptídeo KRS (1- 72) conjugado com GST como antígeno.
[205] Especificamente, um nível de 10 nM de peptídeo KRS (1-72) conjugado com GST purificado foi incubado com leveduras expressando uma única biblioteca da região variável de cadeia leve cadeia tipo Fab de cadeia única (scFab) na superfície da célula, utilizando meio SG-AAG (20 g/L de Galactose, 6,7 g/L de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 5,4 g/L de Na2HPO4, 8,6 g/L de NaH2PO4, 5 g/L de casaminoácidos) por 1 hora em temperatura ambiente para a triagem primária por FACS.
[206] Em seguida, os peptídeos KRS (resíduos 1-72) conjugados com GST e leveduras expressando a biblioteca foram reagidos com conjugado Estreptavidina-R-ficoeritrina conjugado com PE (SA-PE) a 4ºC durante 20 minutos, e foram analisados por FACS (separação de células ativadas por fluorescência, FACS Caliber; BD Bioscience). Em seguida, uma segunda triagem FACS foi realizada com 1 nM de peptídeo KRS (resíduos 1-72) conjugado com GST, e uma terceira triagem FACS foi realizada com 0,5 nM de peptídeo KRS (resíduos 1-72) conjugado com GST.
[207] Como resultado, conforme mostrado nas Figs. 2a e 2b, através do processo de seleção utilizando FACS, em comparação com o anticorpo N3, confirmou-se que os clones que possuem uma elevada afinidade para peptídeos KRS (1-72) conjugados com GST foram selecionados e a afinidade foi dependente de uma região variável de cadeia pesada (VH) ou região variável de cadeia leve (VL). Três clones únicos (N3-1, N3-3, e N3-4) que tem alta afinidade e especificidade para peptídeo KRS (1-72) conjugados com GST foram selecionados por meio de análise de capacidade de ligação clone individual. Além disso, outro clone único (N3-5) foi construído combinando a região da variável cadeia leve e a região da variável cadeia pesada entre si. Ou seja, um total de quatro clones únicos (N3-1, N3-3, N3-4, N3-5) foi selecionado.
[208] A Tabela 1 mostra as sequências de CDR da região variável de cadeia leve e da região variável de cadeia pesada de quatro clones individuais mostrando alta capacidade de ligação ao peptídeo KRS (1-72) conjugado com GST. A Tabela 2 mostra a sequência da região variável de cadeia pesada e a sequência da região variável de cadeia leve.
TABELA 1 Pesada Leve
CDR CDR H2 CDR H3 CDR L1 CDR L2 CDR L3 H1
SYDM MALDFD DNSNRP S AISYDNGNTYYADSVK TGSSSNIGSNYV ASWDDSLSAY
Y S N3 (SEQ G T V (SEQ ID (SEQ ID ID (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:11) NO:5) NO:9) NO:1)
Pesada Leve
CDR CDR H2 CDR H3 CDR L1 CDR L2 CDR L3 H1
SYDM MALDFD DNSNRP
S AISYDNGNTYYADSVK TGSSSNIGSNYV N3 Y S ASFSDELGAYV (SEQ G T -1 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:13) ID (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:7) NO:5) NO:9) NO:1)
SYDM MALDFD DNSNRP
S AISYDNGNTYYADSVK TGSSSNIGSNYV N3 Y S SSFSDELGAYV (SEQ G T -3 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:15) ID (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:7) NO:5) NO:9) NO:1)
SYDM MALDFD DNSNRP
S VISSDGGNTYYADSVK TGSSSNIGSNYV N3 Y S ASFSDELGAYV (SEQ G T -4 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:13) ID (SEQ ID NO:118) (SEQ ID NO:7) NO:5) NO:9) NO:1)
SYDM MALDFD DNSNRP
S VISSDGGNTYYADSVK TGSSSNIGSNYV N3 Y S SSFSDELGAYV (SEQ G T -5 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:15) ID (SEQ ID NO:118) (SEQ ID NO:7) NO:5) NO:9) NO:1)
TABELA 2 SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAISY SEQ ID NO: 31
VH DNGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH)
LQMNSLRAEDTAVYYSARMALDFDYW
GQGTLVTVSS N3
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 33
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRS (N3 VL)
EDEADYYCASWDDSLSAYVFGGGTKL TVL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAISY SEQ ID NO: 31
VH DNGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH)
LQMNSLRAEDTAVYYSARMALDFDYW
GQGTLVTVSS N3-1
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 49
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 1) EDEADYYCASFSDELgAYVFGGGTKLT
VL
SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAISY SEQ ID NO: 31
VH DNGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH)
LQMNSLRAEDTAVYYSARMALDFDYW
GQGTLVTVSS N3-3
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 51
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 2) EDEADYYCSSFSDELgAYVFGGGTKLT
VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSVISS SEQ ID NO: 35
VH DGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 1)
LQMNSLRAEDTAVYYSARMALDFDYW
GQGTLVTVSS N3-4
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 49
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 1) EDEADYYCASFSDELgAYVFGGGTKLT
VL
SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSVISS SEQ ID NO: 35
VH DGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 1)
LQMNSLRAEDTAVYYSARMALDFDYW
GQGTLVTVSS N3-5
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 51
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 2) EDEADYYCSSFSDELgAYVFGGGTKLT
VL
[209] Além disso, foi realizado um ensaio ELISA para medir a afinidade ao N-terminal de KRS e confirmar se a afinidade ao N-terminal de KRS aumentou.
[210] Especificamente, o peptídeo da região N-terminal (resíduos 1-72) de KRS foi revestido em uma placa de 96 poços de EIA/RIA (Costar Corning) a 25ºC durante 1 hora, e a placa foi lavada 3 vezes com PBS (pH 7,4, NaCl 137 mM, fosfato 12 mM, KCl 2,7 mM) (SIGMA) durante 10 minutos.
Depois disso, 4% de BSA PBS (4% de albumina de soro bovino, pH 7,4, NaCl 137 mM, fosfato 12 mM, KCl 2,7 mM) (SIGMA) foi tratado durante 1 hora e depois lavado 3 vezes com PBS durante 10 minutos. Em seguida, o anticorpo N3, o anticorpo N3-1, o anticorpo N3-3, o anticorpo N3-4 e o anticorpo N3-5 do tipo IgG foram tratados e incubados, respectivamente, e a placa foi lavada três vezes com PBST a 0,1% durante 10 minutos. Como anticorpo marcado, foi utilizado mAb anti-humano conjugado com peroxidase de rábano (Sigma). Em seguida, ele foi reagido com TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina) (Sigma) e a absorbância foi medida a 450 nm para quantificar a ligação de anticorpo.
[211] Como resultado, como mostrado nas Figs. 3a e 3b, confirmou-se que a afinidade dos anticorpos mutantes N3-1, N3-3, N3-4, e anticorpos N3-5 aumentou em comparação com o anticorpo N3 tipo selvagem.
Verificou-se que todos os clones não se ligaram a GST ou NRP1-b1b2 usado como controle negativo. Não houve diferença significativa na capacidade de ligação ao KRS entre os anticorpos mutantes N3-1, N3-3, N3-4 e N3-5.
EXEMPLO 3 COMPARAÇÃO DE AFINIDADE ENTRE O ANTICORPO N3 E O ANTICORPO N3-1 3-1. EFEITO INIBIDOR DA MIGRAÇÃO CELULAR PELO ANTICORPO
[212] Entre os anticorpos mutantes N3 do Exemplo 2, o anticorpo N3-1 foi convertido em um anticorpo IgG usando um método convencional. O seguinte experimento foi realizado usando o anticorpo IgG convertido.
[213] A migração celular foi medida usando uma câmara transwell de 24 poços com uma membrana de policarbonato comumente usada (tamanho de poro de 8,0 μm, Costar). O poço inferior foi revestido com 10 μg de laminina na câmara transwell. Em seguida, as células A549 foram suspensas em meio RPMI sem soro e colocadas na câmara superior a uma concentração de 1 x 105 células por poço. N3, N3-1 IgG e IgG humano simulado (mock)(controle) foram tratados na câmara a 10 nM ou 100 nM, respectivamente, e incubados por 24 horas. As células não migrantes presentes acima da membrana foram removidas com uma haste flexível com algodões nas pontas (swab). Em seguida, a membrana foi lavada duas vezes com PBS e tratada com MeOH a 70% (em PBS) por 30 minutos. Após a lavagem por duas vezes com PBS, a solução de hematoxilina foi tratada por 30 minutos. Em seguida, após a lavagem da câmara por três vezes com DW, a membrana da câmara foi cortada e montada em uma lâmina de vidro para observação.
[214] Como resultado, como mostrado na Fig. 4, foi confirmado que o anticorpo N3-1 inibiu significativamente a migração de células A549 em comparação com o anticorpo N3.
3-2. EFEITO DE AFINIDADE KRS DO ANTICORPO
[215] Usando a proteína purificada do fragmento KRS (1-207 aa) como um antígeno, a capacidade de ligação aos anticorpos N3 e N3-1 foi analisada por meio de ressonância plasmônica de superfície (SPR).
[216] O experimento SPR foi realizado usando um Biacore T200 (GE Healthcare) equipado com um chip sensor Série S CM5 (GE Healthcare) a 25ºC. Depois que o anticorpo foi imobilizado no chip usando um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare), o antígeno foi diluído 4 vezes em solução de PBS na faixa de 4,8 nM-1250 nM e fluído por 60 segundos. Depois disso, o PBS fluiu por 300 segundos. Os dados obtidos foram analisados com o software Biacore T200 Evaluation v2.0 (GE Healthcare).
[217] Como resultado, como mostrado na Fig. 5, o valor K D do anticorpo N3-1 foi medido como sendo 31 nM, indicando que a capacidade de ligação à proteína KRS aumentou em comparação com o anticorpo N3.
EXEMPLO 4
CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA DE EXPRESSÃO DE SUPERFÍCIE CELULAR DE LEVEDURA PARA AUMENTO DE AFINIDADE (ANTICORPO N 3-1)
[218] Os anticorpos N3-1, N3-3, N3-4 e N3-5 direcionados ao N- terminal de KRS derivados no Exemplo 2 têm afinidade semelhante para a KRS e, como mostrado no resultado do anticorpo N3-1, foi determinado ter uma afinidade de cerca de 31 nM. Isso ainda é baixo em comparação com a afinidade dos vários anticorpos na forma IgG completa. Para aumentar a afinidade e obter um anticorpo mais eficaz, tentou-se melhorar intensivamente a região variável de cadeia pesada do anticorpo.
[219] A sequência da região variável de cadeia leve foi fixada em N3-3, e a estrutura de modelagem aproximada de N3-3 foi prevista usando modelagem de homologia. Com isso, uma mutação aleatória foi introduzida na CDR prevista para desempenhar um importante papel na ligação ao antígeno.
[220] Especificamente, os resíduos de CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada usaram NNK, um códon degenerado que pode conter todas as 20 sequências de aminoácidos, e uma biblioteca foi construída da mesma maneira que no Exemplo 1.
EXEMPLO 5 SELEÇÃO DA REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE (VL) E REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA (VH) COM AFINIDADE MELHORADA PARA O PEPTÍDEO KRS (1-72)
CONJUGADO COM GST
[221] Usando o peptídeo KRS conjugado com GST (resíduos 1- 72) como um antígeno, foram selecionados dois tipos de bibliotecas de melhoramento de afinidade baseadas nas construções N3-3 no Exemplo 4.
Uma vez que se esperava que a afinidade de N3-3 e N3-1 fosse quase a mesma e as sequências fossem quase semelhantes, o experimento comparativo foi realizado com N3-1.
[222] Especificamente, as leveduras expressando a biblioteca ligada com o peptídeo KRS (1-72) conjugado GTP reagiram com Estreptavidina Microbead® (Miltenyi Biotec) a 4ºC durante 20 minutos, e leveduras expressando a região variável de cadeia pesada com alta afinidade para peptídeos KRS (1-72 aa) foram suspensos utilizando separação celular por ativação magnética (MACS). As leveduras expressando a biblioteca selecionada por MACS foram cultivadas em meio SG-CEA (20 g/L de galactose, 6,7 g/L de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 5,4 g/L de Na2HPO4, 8,6 g/L de NaH2PO4, 5 g/L de casaminoácidos) para induzir a expressão da biblioteca. Subsequentemente, da mesma maneira que no
Exemplo 2, a triagem sequencial foi realizada usando FACS.
[223] A triagem primária FACS foi realizada com 10 nM de peptídeo KRS (1-72) conjugado com GST, a triagem secundária FACS com 1 nM de peptídeo KRS (1-72) conjugado com GST, a triagem FACS foi realizada com 0,5 nM de peptídeo KRS (1-72) conjugado com GST, e a quarta triagem FACS foi realizada com 0,1 nM de peptídeo KRS (1-72) conjugado com GST.
[224] Como resultado, como mostrado na Fig. 6, através do processo de seleção usando MACS e FACS (separação de células ativadas por fluorescência), foi confirmado que os clones com alta afinidade dependendo da região variável de cadeia pesada (VH) para o peptídeo KRS (1-72) conjugado com GST foram selecionados em comparação com o anticorpo N3-1, e quatro clones únicos (N3-6, N3-7, N3-8, N3-9) com alta afinidade e especificidade para o peptídeo KRS (1-72) conjugado com GST foram selecionados pela análise da capacidade de ligação de clone individual.
[225] As sequências de CDR da região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada de quatro clones individuais, que apresentam uma alta capacidade de ligação para o peptídeo KRS (1-72 aa), estão apresentadas na Tabela 3, e a Tabela 4 mostra sequências da região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve.
TABELA 3 Pesada Leve CDR H1 CDR H2 CDR H3 CDR L1 CDR L2 CDR L3
AISPQM MALDFD TGSSSNI DNSNRP SSFSDEL
SYDMS GRVYYA N3- Y GSNYVT S GAYV (SEQ ID DSVKG 6 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5) NO: 7) NO: 9) NO: 15) NO: 17)
Pesada Leve CDR H1 CDR H2 CDR H3 CDR L1 CDR L2 CDR L3
AIDPLGG MALDFD TGSSSNI DNSNRP SSFSDEL
SYDMS NIYYADS N3- Y GSNYVT S GAYV (SEQ ID VKG 7 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5) NO: 7) NO: 9) NO: 15) NO: 19)
AISPYSG MALDFD TGSSSNI DNSNRP SSFSDEL
SYDMS RIYYADS N3- Y GSNYVT S GAYV (SEQ ID VKG 8 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5) NO: 7) NO: 9) NO: 15) NO: 21)
AIGADG MALDFD TGSSSNI DNSNRP SSFSDEL
SYDMS GPSYYA N3- Y GSNYVT S GAYV (SEQ ID DSVKG 9 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5) NO: 7) NO: 9) NO: 15) NO: 23) TABELA 4 SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAISP SEQ ID NO: 37 N3-6 VH QMGRVYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 2)
LQMNSLRAEDTAVYYSCARMALDFDY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 51
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 2) EDEADYYCSSFSDELgAYVFGGGTKLT
VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAIDP SEQ ID NO: 39
VH LGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL (N3 VH mutante 3)
QMNSLRAEDTAVYYSCARMALDFDYW
GQGTLVTVSS N3-7
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 51
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 2) EDEADYYCSSFSDELgAYVFGGGTKLT
VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAISP SEQ ID NO: 45 N3-8 VH YSGRIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL (N3 VH mutante 6)
QMNSLRAEDTAVYYCARMALDFDYWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 51
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 2) EDEADYYCSSFSDELgAYVFGGGTKLT
VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF
TFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAIGA SEQ ID NO: 43
VH DGGPSYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 5)
LQMNSLRAEDTAVYYSCARMALDFDY
WGQGTLVTVSS N3-9
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 51
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 2) EDEADYYCSSFSDELgAYVFGGGTKLT
VL
[226] Além disso, foi realizado um ensaio ELISA, da mesma maneira que no Exemplo 2, para medir a afinidade ao N-terminal de KRS e confirmar se a afinidade ao N-terminal de KRS aumentou.
[227] Especificamente, a porção N-terminal (1-72) de KRS foi revestida em uma placa EIA/RIA de 96 poços (COSTAR Corning) a 25ºC por 1 hora e, em seguida, a placa foi lavada três vezes com PBS por 10 minutos. Em seguida, a placa foi incubada com 4% BSA PBS durante 1 hora e, em seguida,
lavada 3 vezes com PBS durante 10 minutos. Em seguida, os anticorpos alvo N3-1, N3-6, N3-7, N3-8 e N3-9 que visam a porção N-terminal de KRS do tipo IgG foram tratados e incubados e a placa foi lavada três vezes durante 10 minutos com PBST a 0,1%. Foi utilizado um anticorpo anti-humano conjugado com HRP, o qual reagiu com TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina) e a leitura da absorbância foi feita a 450 nm e a ligação foi quantificada.
[228] Como resultado, como mostrado na Fig. 7, foi confirmado que a afinidade dos anticorpos mutantes N3-6, N3-7, N3-8 e N3-9 foi aumentada em comparação com o anticorpo N3-1. Todos os anticorpos não interagiram com NRP1-b1b2, que foi usado como controle negativo.
EXEMPLO 6 COMPARAÇÃO DE AFINIDADE ENTRE O ANTICORPO N3-1 E OS ANTICORPOS N3-6, N3-7, N3-8, N3-9 6-1. COMPARAÇÃO DA LIGAÇÃO DO ANTICORPO À KRS
[229] Utilizando o epítopo peptídico F4 da KRS (EPKLSKNELKRRLKAEKKVAEKEAKQKE: SEQ ID NO: 117) como um epítopo de antígeno, a capacidade de ligação do anticorpo N3, anticorpo N3-6, anticorpo N3-7, anticorpo N3-8 e anticorpo N3-9 foi analisada por ressonância plasmônica de superfície (SPR). O experimento de SPR foi realizado da mesma maneira que no Exemplo 3-2. O epítopo foi diluído em solução de PBS e diluído 2 vezes no intervalo de 15,7 nM-4000 nM, e deixado fluir por 90 segundos. Depois disso, o PBS fluiu por 2400 segundos. Os dados obtidos foram analisados com o software Biacore T200 Evaluation v2.0 (GE Healthcare).
[230] Como resultado, como mostrado na Fig. 8, o valor K D do anticorpo N3-8 foi considerado como excelente, o valor KD dos anticorpos N3-9 e N3-6 foram semelhantes e o valor KD do anticorpo N3-7 foi o maior. O tempo de dissociação do anticorpo N3-6 foi maior do que o do N3-7 e N3-9 e mostrou um sensorgrama com ligação mais longa.
[231] Além disso, o ensaio ELISA foi realizado para identificar resíduos que são importantes para a ligação anticorpo-epítopo, usando peptídeos nos quais aminoácidos únicos do peptídeo F4 do epítopo KRS (SEQ ID NO: 117) foram substituídos por alanina (A), respectivamente. Como resultado, os resíduos no epítopo peptídeo F4 de KRS que são importantes na ligação a cada anticorpo puderam ser identificados.
6-2. EFEITO INIBIDOR DA MIGRAÇÃO CELULAR PELO ANTICORPO
[232] Os experimentos foram realizados da mesma maneira que no Exemplo 3-1. Os anticorpos N3-6, N3-7, N3-8, N3-9 preparados no Exemplo acima foram convertidos em IgG por um método convencional. O experimento a seguir foi realizado usando o anticorpo IgG convertido.
[233] As células foram colocadas na câmara superior a uma concentração de 1 x 105 e, em seguida, a IgG N3 foi tratada a 100 nM, e as IgGs N3-1, N3-6, N3-7, N3-8 e N3-9 e a IgG de controle humano simulado (mock) foram tratadas cada uma a 10 nM e cultivadas por 24 horas. As células não migrantes presentes acima da membrana foram removidas com uma haste flexível com algodões nas pontas (swab).
[234] Em seguida, a membrana foi lavada duas vezes com PBS e tratada com MeOH a 70% (em PBS) por 30 minutos. Após a lavagem por duas vezes com PBS, a solução de hematoxilina foi tratada por 30 minutos. Em seguida, após a lavagem da câmara por três vezes com água destilada (DW), a membrana da câmara montada em uma lâmina de vidro e observada.
[235] Como resultado, como mostrado na Fig. 9, foi confirmado que os anticorpos N3-6, N3-7, N3-8, e N3-9 inibem significativamente a migração celular comparando com o anticorpo N3-1. Além disso, não houve nenhuma diferença significativa no efeito de inibir a migração celular entre os anticorpos N3-6, N3-7, N3-8, e N3-9.
EXEMPLO 7 REFINAMENTO DE SEQUÊNCIA DE ANTICORPO N3-8 7-1. PRODUÇÃO DE MUTAÇÃO NA SEQUÊNCIA DO ANTICORPO N3-8
[236] No exemplo acima, foi confirmado que o anticorpo N3-8 tem a melhor afinidade. Assim, foram conduzidos os seguintes experimentos para confirmar as propriedades físicas, como produtividade e estabilidade do anticorpo N3-8.
[237] Foi induzida uma mutação na sequência esperada para afetar a estabilidade na sequência do anticorpo N3-8. Como resultado, foram obtidas duas sequências de cadeia pesada adicionais nas quais as mutações foram introduzidas na sequência de cadeia pesada (HC) do anticorpo N3-8.
Além disso, foi possível obter três sequências de cadeia leve adicionais nas quais a mutação foi introduzida. Consequentemente, 7 tipos de sequências de anticorpos (derivados do N3-8) nas quais a sequência do anticorpo N3-8 foi alterada são mostrados nas Tabelas 5 e 6 abaixo.
TABELA 5 Pesada Leve CDR H1 CDR H2 CDR H3 CDR L1 CDR L2 CDR L3
AISPYSG MALDFD TGSSSNI DNSNRP SSFSDE
SYDMS RIYYADS N3-8- Y GSNYVT S LGAYV (SEQ ID VKG 1 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5) NO: 7) NO: 9) NO: 15) NO: 21)
AISPYSG MALDFD TGSSSNI SNNQRP SSFSDE
SYDMS N3-8- RIYYADS Y GSNYVT S LGAYV (SEQ ID 2 VKG (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5) NO: 7) NO: 27) NO: 15)
Pesada Leve CDR H1 CDR H2 CDR H3 CDR L1 CDR L2 CDR L3 NO: 21)
AISPYSG MALDFD TGSSSNI RNNQRP SSFSDE
SYDMS RIYYADS N3-8- Y GSNYVT S LGAYV (SEQ ID VKG 3 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5) NO: 7) NO: 29) NO: 15) NO: 21)
AISPYSG LALDFD TGSSSNI DNSNRP SSFSDE
SYDMS RIYYADS N3-8- Y GSNYVT S LGAYV (SEQ ID VKG 4 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 25) NO: 7) NO: 9) NO: 15) NO: 21)
AISPYSG LALDFD TGSSSNI SNNQRP SSFSDE
SYDMS RIYYADS N3-8- Y GSNYVT S LGAYV (SEQ ID VKG 5 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 25) NO: 7) NO: 27) NO: 15) NO: 21)
AISPYSG LALDFD TGSSSNI RNNQRP SSFSDE
SYDMS RIYYADS N3-8- Y GSNYVT S LGAYV (SEQ ID VKG 6 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 25) NO: 7) NO: 29) NO: 15) NO: 21)
AISPYSG MALDFD TGSSSNI DNSNRP SSFSDE
SYDMS N3-8- RIYYADS Y GSNYVT S LGAYV (SEQ ID 7 VKG (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5) NO: 7) NO: 9) NO: 15)
Pesada Leve CDR H1 CDR H2 CDR H3 CDR L1 CDR L2 CDR L3 NO: 21) TABELA 6 SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAIS SEQ ID NO: 45
VH PYSGRIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 6)
LQMNSLRAEDTAVYYCARMALDFDYW N3-8- GQGTLVTVSS 1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 51
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 2)
EDEADYYCSSFSDELGAYVFGGGTKLT VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAIS SEQ ID NO: 45
VH PYSGRIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 6)
LQMNSLRAEDTAVYYCARMALDFDYW N3-8- GQGTLVTVSS 2 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYSNNQ SEQ ID NO: 53
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 3)
EDEADYYCSSFSDELGAYVFGGGTKLT VL
SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAIS SEQ ID NO: 45
VH PYSGRIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 6)
LQMNSLRAEDTAVYYCARMALDFDYW
GQGTLVTVSS N3-8- 3 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYRNNQ SEQ ID NO: 55
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 4)
EDEADYYCSSFSDELGAYVFGGGTKLT VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAIS SEQ ID NO: 47
VH PYSGRIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 7)
LQMNSLRAEDTAVYYCARLALDFDYW N3-8- GQGTLVTVSS 4
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 51
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 2)
EDEADYYCSSFSDELGAYVFGGGTKLT VL
SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAIS SEQ ID NO: 47
VH PYSGRIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 7)
LQMNSLRAEDTAVYYCARLALDFDYW
GQGTLVTVSS N3-8- 5
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYSNNQ SEQ ID NO: 53
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 3)
EDEADYYCSSFSDELGAYVFGGGTKLT VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAIS SEQ ID NO: 47
VH PYSGRIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 7)
LQMNSLRAEDTAVYYCARLALDFDYW N3-8- GQGTLVTVSS 6
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYRNNQ SEQ ID NO: 55
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 4)
EDEADYYCSSFSDELGAYVFGGGTKLT VL
SEQ ID NO: Sequência (nome da sequência)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
FTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAIS SEQ ID NO: 41
VH PYSGRIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY (N3 VH mutante 4)
LQMNSLRAEDTAVYYSARMALDFDYW N3-8- GQGTLVTVSS 7 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSS
NIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYDNSN SEQ ID NO: 51
VL RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQS (N3 VL mutante 2)
EDEADYYCSSFSDELGAYVFGGGTKLT
VL 7-2. MEDIÇÃO DE PRODUTIVIDADE E ESTABILIDADE DE DERIVADOS DO ANTICORPO N3- 8 E MEDIÇÃO DE TM
[238] O vetor que expressa o derivado do anticorpo N3-8 obtido no Exemplo 7-1 foi expresso e purificado usando transfecção transitória.
[239] As células HEK293-F (Invitrogen) suspensas em meio de expressão FreeStyle 293 sem soro (Invitrogen) em um balão de agitação, o plasmídeo e a polietilenimina (Polyethylenimine, Polyscience) foram transfectados. Durante a transfecção em um balão de agitação de 200 mL, as células HEK293-F foram semeadas em 100 mL de meio a uma densidade de 2 x 106 células/mL e cultivadas a 150 rpm e 37ºC com 8% de CO2.
[240] Para produzir cada anticorpo monoclonal, plasmídeos de cadeia pesada e leve adequados foram transfectados em 10 mL de meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen) a uma razão de 1:1 ou 1:2 de DNA de cadeia pesada:cadeia leve. Quando o DNA de cadeia pesada:cadeia leve é usado em uma proporção de 1:1, 125 μg de cadeia pesada e 125 μg de cadeia leve, um total de 250 μg (2,5 μg/mL) de DNA é misturado com 10 mL de meio contendo PEI a 750 μg (7,5 μg/mL) à temperatura ambiente. A reação foi realizada durante 10 minutos. No caso da proporção 1:2, a concentração de DNA de cadeia leve foi duplicada. Posteriormente, o meio misturado foi tratado com células previamente aliquotadas com 100 mL e incubado a 150 rpm e 37ºC, com 8% de CO2 por 4 horas e, em seguida, 100 mL adicionais de meio de expressão FreeStyle 293 foram adicionados e cultivados por 6 dias.
[241] Em seguida, a solução de cultura de células foi transferida para tubos de 50 mL e centrifugada por 5 minutos a 3000 rpm. A proteína foi então purificada a partir do sobrenadante da cultura de células coletado. O anticorpo foi aplicado a uma coluna de Proteína A Sepharose e depois lavado com PBS (pH 7,4). Após a eluição do anticorpo em pH 3,0 com tampão glicina 0,1 M, a amostra foi imediatamente neutralizada com tampão Tris 1M. A fração de anticorpo eluída foi concentrada por troca de tampão com PBS (pH 7,4) através de um método de diálise. A proteína purificada foi quantificada com base na medição de absorbância e coeficiente de absorção em um comprimento de onda de 280 nm.
[242] Além disso, a estabilidade térmica do anticorpo foi medida usando 100 μL dos anticorpos purificados a uma concentração de 1 mg/mL.
Termoestabilidade foi investigada 4 vezes utilizando o kit Protein Thermal Shift Dye (Thermofisher) e um equipamento de PCR em tempo real Quant Studio 3 Real-time PCR (Thermofisher).
[243] Como resultado, como mostrado na Tabela 7 abaixo, o rendimento de todos os derivados do anticorpo N3-8 testados foi melhorado ou mostrou um alto rendimento em um nível semelhante ao do anticorpo N3-8. Além disso, como mostrado na Tabela 7, um valor de Tm foi obtido. A transição térmica foi observada como 1-2 dependendo do anticorpo, mas o valor de Tm aumentou em todos os derivados de anticorpo N3-8.
[244] Através destes experimentos, confirmou-se que os derivados do anticorpo N3-8 tiveram um rendimento mais elevado e a estabilidade térmica deles foi melhorada em comparação com a estabilidade do anticorpo N3-8.
TABELA 7 Rend. (mg/L) Estabilidade térmica Anticorpo (1:1) (1:2) Tm1 Tm2 N3-8 69,9 104,61 67,37 - N3-8-1 87,13 109,9 69,94 - N3-8-2 96,76 109,68 72,41 - N3-8-3 93,44 93,53 71,02 76,31 N3-8-4 86,14 89,23 70,31 - N3-8-5 84,31 107,37 72,9 - N3-8-6 105,95 92,9 71,0 76,97
[245] A Tabela 8 mostra as sequências da cadeia pesada (HC) e de cadeia leve (LC) de todos os anticorpos IgG usados nos exemplos descritos acima.
TABELA 8 Sequência de aminoácidos Sequência de DNA HC SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90 N3 LC SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 92 HC SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90 N3-1 LC SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 108 HC SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90 N3-3 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 HC SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 94 N3-4 LC SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 108 HC SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 94 N3-5 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 HC SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 96 N3-6 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 HC SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 98 N3-7 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110
Sequência de aminoácidos Sequência de DNA HC SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 N3-8 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 HC SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 102 N3-9 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 HC SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 N3-8-1 LC SEQ ID NO: 111 SEQ ID NO: 112 HC SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 N3-8-2 LC SEQ ID NO: 113 SEQ ID NO: 114 HC SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 N3-8-3 LC SEQ ID NO: 115 SEQ ID NO: 116 HC SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 106 N3-8-4 LC SEQ ID NO: 111 SEQ ID NO: 112 HC SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 106 N3-8-5 LC SEQ ID NO: 113 SEQ ID NO: 114 HC SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 106 N3-8-6 LC SEQ ID NO: 115 SEQ ID NO: 116 HC SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 100 N3-8-7 LC SEQ ID NO: 111 SEQ ID NO: 112 7-3. COMPARAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPOS N3-8-1 E N3-8-4
[246] Conforme descrito no Exemplo 6, o peptídeo de epítopo F4 da KRS (EPKLSKNELKRRLKAEKKVAEKEAKQKE: SEQ ID NO: 117) foi usado como um epítopo de antígeno, e a força de ligação aos anticorpos N3-8-1 e N3- 8-4 foi analisada por ressonância plasmônica de superfície (SPR).
[247] O experimento de SPR foi realizado da mesma maneira que no Exemplo 3-2, e o epítopo foi diluído em solução de PBS, diluído duas vezes em um intervalo de 15,7 nM-4000 nM e fluído por 90 segundos. Depois disso, o PBS fluiu por 2400 segundos. Os dados obtidos foram analisados com o software Biacore T200 Evaluation v2.0 (GE Healthcare).
[248] Como resultado, como mostrado na Tabela 9 abaixo, verificou-se que o valor KD do anticorpo N3-8-1 foi o mais excelente.
TABELA 9 Peptídeo Ab Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM) N3-8-1 267900 0,000215 0,8025 F4 N3-8-4 89480 0,00090 10,06
EXEMPLO 8
CONFIRMAÇÃO DO MECANISMO DO ANTICORPO
[249] Após a conjugação de uma sonda fluorescente com anticorpo (Ab) e tratamento de células de câncer de mama 4T1, confirmou-se que os anticorpos anti-KRS (N3, N3-8) foram endocitados.
[250] Os anticorpos anti-KRS (N3, N3-8) marcados com a sonda fluorescente Alexa Fluor 488 (Thermofisher) e 1 μM de IgG simulado (Mock)(Thermofisher) como controle foram usados para tratar as células, e a localização dos anticorpos foi monitorada após 4 horas. Neste momento, Lysotracker (Thermofisher) foi usado como um marcador de lisossoma e DAPI foi usado para a coloração do núcleo. Ao contrário da IgG Mock, os anticorpos N3 e N3-8 estavam presentes nas células em 4 horas.
[251] Como resultado, como mostrado na Fig. 10, foi confirmado que o anticorpo anti-KRS reconhece as KRS da membrana celular e é rapidamente endocitada, diminuindo assim o nível de KRS na membrana celular.
EXEMPLO 9
SEQUÊNCIA E PURIFICAÇÃO DO ANTICORPO A PARTIR DO QUAL A FUNÇÃO ADCC/CDC FOI REMOVIDA 9-1. INTRODUÇÃO DE MUTAÇÃO NA SEQUÊNCIA DE ANTICORPOS PARA REMOVER A FUNÇÃO ADCC/CDC
[252] A fim de remover a função ADCC/CDC do anticorpo, foi realizado o seguinte experimento. Em cada uma das sequências de anticorpo acima, foram introduzidas mutações na porção esperada para desempenhar a função de ADCC/CDC de uma região constante de cadeia pesada de IgG 1.
Foram obtidas cinco sequências de cadeia pesada adicionais onde as mutações foram introduzidas. Além disso, a sequência da cadeia pesada de IgG4 e uma sequência adicional na qual uma mutação foi introduzida foram geradas. Consequentemente, as sequências de anticorpos mutantes nos quais a função ADCC/CDC foi removida de cada anticorpo são mostradas na Tabela 10, respectivamente.
TABELA 10 Sequência de aminoácidos Sequência de DNA IgG1 SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 141 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 142 SEQ ID NO: 143 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO: 145
HC N3 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 146 SEQ ID NO: 147 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 149 IgG4 SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 151 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 153 LC SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 92 IgG1 SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 141 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 142 SEQ ID NO: 143 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO: 145 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 146 SEQ ID NO: 147 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 149
HC N3-1 IgG4 SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 151 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 153 LC SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 108 IgG1 SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 141 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 142 SEQ ID NO: 143 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO: 145 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 146 SEQ ID NO: 147 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 149
HC N3-3 IgG4 SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 151 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 153 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110
Sequência de aminoácidos Sequência de DNA IgG1 SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 94 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 154 SEQ ID NO: 155 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO: 157 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 158 SEQ ID NO: 159 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO: 161 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 163
HC N3-4 IgG4 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 165 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 166 SEQ ID NO: 167 LC SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 108 IgG1 SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 94 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 154 SEQ ID NO: 155 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO: 157 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 158 SEQ ID NO: 159 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO: 161 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 163
HC N3-5 IgG4 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 165 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 166 SEQ ID NO: 167 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 IgG1 SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 96 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 168 SEQ ID NO: 169 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 170 SEQ ID NO: 171 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 173 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 174 SEQ ID NO: 175 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO: 177
HC N3-6 IgG4 SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 179 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO: 181 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 IgG1 SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 98 N3-7 HC IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 182 SEQ ID NO: 183
Sequência de aminoácidos Sequência de DNA IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 184 SEQ ID NO: 185 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 186 SEQ ID NO: 187 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO: 189 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 190 SEQ ID NO: 191 IgG4 SEQ ID NO: 192 SEQ ID NO: 193 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 194 SEQ ID NO: 195 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 IgG1 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 225 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 227 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 229 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO: 231 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 233
HC N3-8 IgG4 SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 235 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 237 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 IgG1 SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 102 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 210 SEQ ID NO: 211 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 213 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 214 SEQ ID NO: 215 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 216 SEQ ID NO: 217 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 218 SEQ ID NO: 219
HC N3-9 IgG4 SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 221 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 222 SEQ ID NO: 223 LC SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 110 IgG1 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 225 N3-8-1 HC IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 227 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 229
Sequência de aminoácidos Sequência de DNA IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO: 231 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 233 IgG4 SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 235 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 237 LC SEQ ID NO: 111 SEQ ID NO: 112 IgG1 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 225 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 227 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 229 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO: 231 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 233
HC N3-8-2 IgG4 SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 235 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 237 LC SEQ ID NO: 113 SEQ ID NO: 114 IgG1 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 225 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 227 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 229 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO: 231 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 233
HC N3-8-3 IgG4 SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 235 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 237 LC SEQ ID NO: 115 SEQ ID NO: 116 IgG1 SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 106 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 239 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO: 241 N3-8-4 HC IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 243 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 245 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 246 SEQ ID NO: 247
Sequência de aminoácidos Sequência de DNA IgG4 SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 249 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 251 LC SEQ ID NO: 111 SEQ ID NO: 112 IgG1 SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 106 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 239 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO: 241 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 243 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 245 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 246 SEQ ID NO: 247
HC N3-8-5 IgG4 SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 249 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 251 LC SEQ ID NO: 113 SEQ ID NO: 114 IgG1 SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 106 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 239 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO: 241 IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 243 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 245 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 246 SEQ ID NO: 247 HC IgG4 SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 249 N3-8-6 IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 251 LC SEQ ID NO: 115 SEQ ID NO: 116 IgG1 SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 100 IgG1 mutante TA SEQ ID NO: 196 SEQ ID NO: 197 IgG1 mutante LALA SEQ ID NO: 198 SEQ ID NO: 199 N3-8-7 HC IgG1 mutante LALATA SEQ ID NO: 200 SEQ ID NO: 201 IgG1 mutante LALAPG SEQ ID NO: 202 SEQ ID NO: 203 IgG1 mutante LALAPGTA SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO: 205 IgG4 SEQ ID NO: 206 SEQ ID NO: 207
Sequência de aminoácidos Sequência de DNA IgG4 mutante TA SEQ ID NO: 208 SEQ ID NO: 209 LC SEQ ID NO: 111 SEQ ID NO: 112 9-2. PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS MUTANTES COM FUNÇÃO ADCC/CDC
REMOVIDA
[253] O vetor que expressa o anticorpo N3-8-1 mutante entre os anticorpos a partir do qual as funções ADCC/CDC foram removidas conforme descrito no Exemplo 9-1 foi transitoriamente transfectado em células para expressar e purificar a proteína.
[254] As células HEK293-F (Invitrogen) foram transfectadas em um balão de agitação de acordo com o método descrito no Exemplo 7-2 acima.
Em seguida, as células HEK293-F foram semeadas em um meio a uma densidade de 2 × 106 células/mL e cultivadas a 150 rpm, 8% de CO2 e 37ºC.
[255] A fim de produzir cada anticorpo monoclonal, plasmídeos de cadeia pesada e leve adequados foram transfectados em 10 mL de meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen) a uma razão de 1:1 ou 1:2 de DNA de cadeia pesada:cadeia leve. No caso da proporção 1:1, 125 μg de cadeia pesada e 125 μg de cadeia leve, um total de 250 μg (2,5 μg/mL), foram misturados com 10 mL de meio contendo 750 μg de PEI (7,5 μg/mL) e a mistura reagiu à temperatura ambiente durante 10 minutos. No caso de 1:2, a concentração de DNA de cadeia leve foi duplicada. Depois disso, o meio misturado que reagiu foi colocado em 100 mL de células e incubado por 4 horas a 150 rpm, 8% de CO2 e 37ºC, e mais 100 mL de meio de expressão FreeStyle 293 foram adicionados e a cultura foi cultivada por 6 dias.
[256] Em seguida, a solução de cultura de células foi transferida para tubos de 50 mL e centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos. Em seguida, a proteína foi purificada a partir do sobrenadante da cultura de células coletado.
O anticorpo foi aplicado a uma coluna de Proteína A Sepharose e lavado com PBS (pH 7,4). Após a eluição do anticorpo em pH 3,0 com tampão glicina 0,1 M, a amostra foi imediatamente neutralizada utilizando tampão Tris 1M. A fração de anticorpo eluída foi concentrada por troca de tampão com PBS (pH 7,4) através de um método de diálise. A proteína purificada foi quantificada com base na medição de absorbância e coeficiente de extinção em um comprimento de onda de 280 nm.
[257] A pureza do anticorpo purificado foi medida, e a termoestabilidade foi investigada 4 vezes utilizando um equipamento Quant Studio 3 Real-time PCR (Thermofisher) e um kit protein thermal shift dye (Thermofisher).
[258] Como um resultado, como mostrado na Tabela 11 abaixo, o rendimento de todos os anticorpos mutantes N3-8-1 testados foi semelhante ou mais elevado do que o dos anticorpos tipo selvagem, dos quais mutações LALAPGTA foram encontradas como responsáveis para o rendimento mais elevado. Além disso, todos os mutantes do anticorpo N3-8-1 exibiram pureza elevada em um nível semelhante ao do anticorpo tipo selvagem.
[259] Assim, foi confirmado que os anticorpos dos quais a função ADCC/CDC de N3-8-1 foi removida têm rendimentos semelhantes ou superiores e têm pureza semelhante em comparação com o anticorpo N3-8-1.
TABELA 11 Anticorpo Rendimento (mg/mL) Pureza (%) tipo selvagem 78,72 99,47 mutante LALA 70,7 99,87 N3-8-1 mutante LALAPG 73,78 99,86 mutante LALATA 77,7 99,91 mutante LALAPGTA 146,37 99,9
EXEMPLO 10 VERIFICAÇÃO DA EFICÁCIA DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA A PORÇÃO N-
TERMINAL DE KRS EM MODELOS DE DOENÇA IN VIVO RELACIONADOS À MIGRAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES – MODELOS DE HIPERTENSÃO ARTERIAL PULMONAR IN VIVO
[260] Quando tratado com um anticorpo que se liga especificamente à extremidade N-terminal de KRS, a migração/invasão de células imunes é inibida devido à internalização de KRS no local da membrana celular (por meio de endocitose, etc.) e, como resultado, pode-se observar em efeito de redução no nível de KRS na membrana celular. Portanto, acredita-se que o anticorpo específico para a porção N-terminal de KRS da presente invenção (tipicamente anticorpo N3) terá um efeito terapêutico contra doenças relacionadas à migração de células imunes, que é adicionalmente demonstrado pelos exemplos descritos abaixo.
MÉTODOS EXPERIMENTAIS 1) CONSTRUÇÃO DE MODELOS DE HIPERTENSÃO ARTERIAL PULMONAR (HAP) E
ADMINISTRAÇÃO DE UMA SUBSTÂNCIA TESTE
[261] Para induzir a HAP em ratos SD de 7 semanas de idade (Oriental Bio), 60 mpk de MCT (monocrotalina) foram injetados por via subcutânea. Em seguida, os ratos foram divididos em quatro grupos (testados com cinco animais em cada grupo), e foram administrados com 1mpk de IgG humana Mock (simulada) (Thermo Fisher Scientific, controle negativo), 1mpk de anticorpo IgG N3, 10mpk de anticorpo IgG N3 e 25 mpk de sildenafil (controle positivo) por 3 semanas. Todos os anticorpos foram injetados por via i.v. duas vezes por semana e o sildenafil foi administrado por via oral todos os dias.
2) FLUXO SANGUÍNEO E MEDIÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL
[262] Após três semanas, os ratos foram anestesiados com isoflurano e o fluxo sanguíneo e a pressão foram medidos usando um sistema de pressão e volume cardiovascular MPVS (nome do modelo: MPVS Ultra, fabricante: Millar Instruments). A pressão sistólica final do ventrículo direito (RVESP), pressão diastólica final do ventrículo direito, pressão sistólica final do ventrículo esquerdo, pressão diastólica final do ventrículo esquerdo foram medidas usando um cateter exclusivo (cateter de pressão para ratos Mikro-Tip, fabricante: Millar Instruments). O débito cardíaco foi medido usando uma sonda de fluxo sanguíneo perivascular (sondas Transonic Flow, fabricante: Millar Instruments), e o método experimental foi realizado pelo mesmo método divulgado na seguinte literatura: Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Kass DA. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008;3(9):1422-
34.
3) IMUNO-HISTOQUÍMICA (IHQ)
[263] Os pulmões coletados foram fixados em PFA (paraformaldeído) de acordo com o procedimento convencional e, a seguir, incluídos em parafina por lavagem, desidratação e clarificação. Os blocos de parafina de tecido pulmonar de rato foram cortados em cortes histológicos de 3 μm de espessura e uma lâmina foi confeccionada. A amostra foi primeiramente tratada com xilol durante 5 min por três vezes, tratada com etanol 100%, etanol 95%, etanol 90% e etanol 70%, e DW nessa ordem por 2 min, e lavada com PBS por 5 min. Após um tratamento com H2O2 a 0,3%, a amostra foi lavada com PBS durante 5 min por duas vezes. Após imersão em tampão citrato 0,01 M e aquecimento, a amostra foi lavada com PBS-T (0,03% de Tween 20) e, em seguida, foi realizado o bloqueio à temperatura ambiente por 30 minutos (BSA a 2% e soro de cabra 2% em PBS). As lâminas foram coradas durante a noite a 4ºC com anticorpo anti-CD68 (1:200, clone ED1, Abcam). Após três lavagens com PBS-T durante 5 minutos, a amostra foi tratada com um kit de visualização de polímero-HRP anti-camundongo (DAKO) durante 1 hora a 4ºC. Após três lavagens com PBS-T, a amostra foi desenvolvida por tratamento com tampão de substrato DAB e DAB cromógeno 20. O tecido corado foi tratado com hematoxilina de Mayer (Sigma) durante 1 minuto, e depois tratado duas vezes durante 2 minutos na seguinte ordem; etanol 70%, etanol 90%, etanol 95% e etanol 100%. Por fim, o tecido foi tratado com xilol durante 5 min por três vezes, sendo então observado ao microscópio óptico.
RESULTADOS 10-1. VERIFICAÇÃO DAS ALTERAÇÕES DA PRESSÃO ARTERIAL E DO DÉBITO CARDÍACO
[264] Os animais com HAP, que é uma doença com estreita relação entre a invasão de células imunes e fenômenos patológicos, foram tratados com anticorpo IgG N3 (1 mpk ou 10 mpk) por 3 semanas (iv, duas vezes por semana), e então a pressão sistólica final ventricular direita (RVESP), pressão diastólica final ventricular direita (RVEDP), pressão sistólica final ventricular (LVESP), pressão diastólica final ventricular esquerda (LVEDP) e débito cardíaco (CO) foram mesurados. Os resultados são mostrados na Tabela 12.
TABELA 12
MCT MCT MCT + IgG Mock (n MCT + Sildenafil + N3 Ab 1mpk + N3 Ab 10mpk = 4) (n = 5) (n = 5) (n = 5) RVESP (mmHg) 62,5 ± 5,7 45,0 ± 8,1 41,2 ± 7,7 48,4 ± 9,6 RVEDP (mmHg) 2,8 ± 1,5 1,4 ± 2,2 3,8 ± 1,3 2,6 ± 1,3 LVESP (mmHg) 81,5 ± 11,4 95,8 ± 4,8 93,4 ± 11,3 83,2 ± 4,7 LVEDP (mmHg) 1,0 ± 0,8 2,6 ± 1,9 4,6 ± 3,9 3,6 ± 2,3 58 ± 4,7 74,0 ± 10,9 59,8 ± 12,9 49,6 ± 17,7 CO (mL/min) (n = 4) (n = 5) (n = 5) (n = 4)
(CO não foi medido em um animal do grupo MCT + IgG mock e um animal do grupo de tratamento com sildenafil, uma vez que morreram pela anestesia e durante a cirurgia, respectivamente).
[265] A hipertensão arterial pulmonar faz com que a pressão do ventrículo direito aumente devido ao estreitamento da artéria pulmonar, resultando em insuficiência ventricular direita. Além disso, se o mecanismo de recompensa é destruído pela hipertensão persistente, o aumento do ventrículo direito é seguido por hipertrofia do ventrículo direito. Isso causa a compressão do ventrículo esquerdo devido ao movimento do septo interventricular e uma diminuição do volume diastólico final do ventrículo esquerdo e do débito cardíaco (Lee Woo Seok et al., Clinical characteristics and prognostic factors of patients with severe pulmonary hypertension, Korean Circulation J. 2007; 37: 265-270). Como resultado, a hipertensão pulmonar está principalmente associada ao ventrículo direito, mas também à função do ventrículo esquerdo.
[266] Os pacientes com HAP apresentam aumento de RVESP, o que também foi confirmado nos modelos animais com HAP do presente experimento. Em contraste, como mostrado na Fig. 11, o anticorpo N3 (um anticorpo que se liga especificamente ao domínio N-terminal de KRS) reduziu significativamente a RVESP em ambas as concentrações e, especialmente, diminuiu a RVESP de forma melhor em comparação com o Sildenafil, um fármaco de controle positivo.
[267] Além disso, não houve diminuição na pressão sistólica final do ventrículo esquerdo (LVESP) após a administração do anticorpo N3 (um anticorpo que se liga especificamente ao N-terminal de KRS). Em vez disso, a LVESP foi significativamente aumentada no grupo administrado com o anticorpo da presente invenção, conforme mostrado na Fig. 13. Isso contrasta com o risco de redução da pressão arterial sistêmica por causar a expansão da artéria pulmonar, bem como a expansão da artéria sistêmica no caso do Sildenafil, que é usado como tratamento convencional para hipertensão pulmonar. Ou seja, foi confirmado que o anticorpo da presente invenção mostrou uma tendência de ter um efeito baixo sobre a pressão arterial sistêmica em comparação com o sildenafil, e este efeito é considerado uma característica favorável de um agente terapêutico, considerando que há um risco de desenvolver hipotensão pela administração de sildenafil em locais clínicos. Além disso, a hipertensão arterial pulmonar grave causa insuficiência sistólica do VD, que pode ser acompanhada por baixo débito cardíaco e hipotensão sistêmica. Ao passo que se espera que um tratamento para aliviar a hipertensão arterial pulmonar com o anticorpo N3 da presente invenção aumente o débito cardíaco e a pressão sanguínea sistêmica, normalizando assim a pressão sanguínea.
[268] Em resumo, foi confirmado que a administração do anticorpo de ligação ao N-terminal de KRS (particularmente, anticorpo N3) da presente invenção reduziu o risco de efeitos colaterais de medicamentos terapêuticos existentes e mostrou alívio dos sintomas de HAP e efeitos do tratamento.
10-2. ECOCARDIOGRAFIA
[269] O ventrículo esquerdo em forma de D indicando sobrecarga de pressão no ventrículo direito foi observado em três animais no grupo de administração de MCT sozinho (ou seja, animais sem tratamento com anticorpos) e três animais no grupo de administração de MCT + sildenafil, mas não foi observado nos grupos de administração terapêutica de anticorpos.
[270] Além disso, conforme mostrado na Tabela 13 abaixo, o peso de cada grupo foi aumentado em um grau semelhante, sem diferença significativa. Ou seja, nenhum sinal anormal, incluindo redução de peso anormal foi observado nos animais tratados com o anticorpo terapêutico.
TABELA 13 MCT + IgG Mock MCT + Ab 1 mpk MCT + Ab 10 mpk MCT + Sildenafil (n = 4) (n = 5) (n = 5) (n = 5) Mudança absoluta 101,4 ± 14,2 113,5 ± 14,6 104,1 ± 12,3 104,1 ± 26,4 (g) Mudança relativa 48,8 ± 7,8 43,6 ± 5,2 40,7 ± 5,0 49,8 ± 10,5 (%) 10-3. VERIFICAÇÃO DA MIGRAÇÃO E INFILTRAÇÃO DE MONÓCITOS/MACRÓFAGOS
[271] A coloração por IHQ foi realizada com os tecidos pulmonares de cada grupo experimental para detectar CD68, que é um marcador de monócito/macrófago. Conforme mostrado na Fig. 12, foi confirmado que o grupo de tratamento com anticorpo N3 (anticorpo de ligação ao N-terminal KRS) da presente invenção reduziu explicitamente a infiltração de monócitos/macrófagos nos tecidos pulmonares e tal efeito foi significativamente melhor do que o tratamento com sildenafil.
EXEMPLO 11 VERIFICAÇÃO DA EFICÁCIA DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA A PORÇÃO N-
TERMINAL DE KRS EM MODELOS DE DOENÇA IN VIVO RELACIONADOS À MIGRAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES – MODELOS DE LESÃO PULMONAR AGUDA
MÉTODOS 1) CONSTRUÇÃO DE MODELOS DE LESÃO PULMONAR AGUDA INDUZIDA POR LPS E
ADMINISTRAÇÃO DA SUBSTÂNCIA TESTE
[272] Uma lesão pulmonar aguda foi introduzida em camundongos por injeção intratraqueal de 2,5 mg/kg de LPS (Sigma) em camundongos C57BL/6 machos de 7 semanas de idade (duothermal bio). Para investigar os efeitos dos inibidores KRS na lesão pulmonar aguda, primeiro, a injeção intravenosa de anticorpo IgG N3 em camundongos C57BL/6 foi realizada a 1 mg/kg ou 10 mg/kg, respectivamente, seguida por injeção endotraqueal de 2,5 mg/kg de LPS após 24 horas. Vinte e quatro horas após a injeção de LPS, cada camundongo foi sacrificado para coletar e analisar o tecido pulmonar e BALF (fluido de lavagem broncoalveolar).
2) CONTAGEM DE CÉLULAS IMUNES NO LÍQUIDO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (BALF)
[273] O BALF obtido por lavagem dos pulmões com PBS foi coletado e os sedimentos celulares foram recolhidos por centrifugação a 800 x g durante 10 minutos a 4ºC. Após a suspensão das células, os glóbulos vermelhos foram removidos usando tampão de lise de hemácias (eBioscience nº de cat.: 00-4333-57). Após a reação ser interrompida com PBS, as células foram lavadas duas vezes e suspensas em 400 µL de PBS para medir o número de células por hemocitômetro e o número de neutrófilos por coloração Hema3.
3) FACS PARA ANALISAR CÉLULAS IMUNES NO TECIDO PULMONAR
[274] Os tecidos pulmonares foram coletados e rodados durante 45 min a 37ºC utilizando o dissociador MACS Octo suave (MACS Miltenyi Biotec, Pedido n.º 130-095-937) para esmagar o tecido. Após filtrar com um filtro de células (40 μm), as células foram centrifugadas em temperatura ambiente por 5 minutos a 1.500 rpm. O sedimento foi coletado e os glóbulos vermelhos foram removidos usando tampão de lise de hemácias (eBioscience, nº de cat.: 00-4333-57). As células foram coletadas e suspensas em tampão FACS (PBS contendo 1% de NaN 3 e 3% de SBF). As células (50 μL) foram colocadas em um tubo, bem misturadas com a mesma quantidade de mistura de anticorpo e coradas em câmara escura a 4ºC por 1 hora. Os anticorpos FITC rato Anti-CD11b (BD Pharmingen) e PE rato Anti-F4/80 de camundongo (BD Pharmingen) foram usados para a análise de macrófagos intersticiais (IM) infiltrados nos pulmões. Após lavagem duas vezes a 400 x g por 5 minutos usando tampão FACS, as células foram analisadas em um citômetro Navios
Flow Cytometer (Beckman).
4) COLORAÇÃO COM TRICRÔMIO DE MASSON PARA TECIDO PULMONAR
[275] O tecido pulmonar foi emblocado em parafina da maneira usual e depois cortado. Em seguida, a lâmina de tecido foi desparafinada usando xilol e foi lavada com DW e, em seguida, tratada com líquido de Bouin a 56-60ºC durante 1 hora. Depois de corada com solução de hematoxilina de ferro de Weigert por 10 minutos, a lâmina de tecido foi lavada. Depois de corado novamente com solução de fucsina ácida - escarlate de Biebrich por 10- 15 minutos, a lâmina foi lavada. A lâmina foi tratada com solução de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico por 10-15 minutos e, em seguida, a lâmina foi transferida para uma solução de azul de anilina e corada por 5-10 minutos.
Após a lavagem, a lâmina foi tratada com solução de ácido acético a 1% por 2 a 5 minutos. Após a lavagem e desidratação, a lâmina foi tratada com xilol e montada.
RESULTADOS 11-1. VERIFICAÇÃO DO EFEITO INIBITÓRIO SOBRE A MIGRAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES NO FLUIDO DE LAVAGEM BRONCOALVEOLAR (BALF)
[276] Conforme mostrado na Fig. 13, foi confirmado que o número total de células imunes no BALF aumentou nos camundongos onde a lesão pulmonar aguda foi induzida pelo tratamento com LPS. O número de células imunes infiltradas foi reduzido pelo tratamento com anticorpo N3 (anticorpo de ligação ao N-terminal de KRS) de um modo dependente da concentração.
[277] Em particular, como mostrado na Fig. 14, foi confirmado que houve um aumento de neutrófilos nos camundongos com lesão pulmonar aguda pelo tratamento com LPS, e o tratamento com anticorpo N3 (anticorpo de ligação ao N-terminal de KRS) reduziu esses níveis de neutrófilos. Como resultado, foi confirmado que a infiltração de células imunes, particularmente neutrófilos, no BALF foi significativamente inibida pelo tratamento com anticorpo que se liga especificamente ao N-terminal de KRS.
11-2. VERIFICAÇÃO DO EFEITO INIBITÓRIO DO ANTICORPO SOBRE A MIGRAÇÃO DE
CÉLULAS IMUNES NO TECIDO PULMONAR
[278] As Fig. 15 e 16 mostram os resultados da análise FACS de macrófagos migrados para o tecido pulmonar devido à lesão pulmonar aguda.
Os macrófagos intersticiais (IM) são células CD11b+/F4/80+, que são macrófagos migrantes que não residem no pulmão, mas migram para o pulmão em certas situações. O tratamento com LPS aumentou a infiltração de IM no pulmão, mas o tratamento com anticorpo N3 reduziu a migração dos IMs para o pulmão de uma maneira dependente da concentração. Assim, confirmou-se que a migração e a invasão de células do sistema imunológico, tais como os macrófagos/monócitos em tecidos pulmonares, foram inibidas pelo tratamento de anticorpos (tipicamente, anticorpo N3) que se ligam especificamente ao N- terminal de KRS.
[279] A migração excessiva e invasão de células do sistema imunológico, tais como os macrófagos/monócitos, são fenômenos patológicos importantes nos tecidos de doença fibróticas. Como resultado da observação do tecido pulmonar com a coloração de tricrômio de Masson em relação ao modelo de lesão pulmonar aguda (Fig. 17) confirmou que a fibrose no tecido pulmonar progrediu consideravelmente. Em contrapartida, foi confirmado que o tratamento do anticorpo N3 (um anticorpo que se liga especificamente ao N- terminal de KRS) inibiu essa fibrose.
EXEMPLO 12
ANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES COM ANTICORPOS MUTANTES COM FUNÇÃO ADCC/CDC REMOVIDA
[280] A fim de confirmar o efeito sobre a migração de células imunes utilizando o anticorpo mutante a partir do qual a função ADCC/CDC foi removida, foi realizado um ensaio de migração de células de acordo com o método descrito na literatura prévia (Park, S. G. et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad.
Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005)).
[281] As medições foram feitas em uma câmara transwell com uma membrana de policarbonato (tamanho de poro de 5,0 μm, Costar). LN421 foi colocado na câmara inferior a uma concentração de 2,5 µg/mL na câmara transwell. Em seguida, as células RAW264.7 foram colocadas na parte superior da câmara a uma concentração de 5 x 104 células por poço. Em seguida, cada anticorpo foi colocado na câmara em uma concentração de 10 nM e, em seguida, incubado por 24 horas. Em seguida, as câmaras foram lavadas duas vezes com PBS e tratadas com MeOH a 70% (em PBS). Após duas lavagens com PBS novamente, as células transferidas foram coradas com cristal violeta (Sigma) e secas. Em seguida, a câmara superior foi colocada em ácido acético a 33% (Merck) e agitada por 10 minutos. A solução de ácido acético dissolvido em violeta de cristal foi transferida para uma placa de 96 poços e a absorbância foi medida a 590 nm em um leitor de microplacas (Tecan).
[282] Como resultado, como mostrado na Fig. 18, verificou-se que todos os anticorpos N3-8, N3-8-1, N3-8-1 mutante LALA, N3-8-1 mutante LALATA, N3-8-1 mutante LALAPG, N3-8-1 mutante LALAPGTA inibiram a migração celular dependente de LN421 em um nível semelhante ao do grupo de controle (controle, C) que não foi tratado.
EXEMPLO 13 ANÁLISE DO EFEITO DE ANTICORPOS MUTANTES COM FUNÇÃO ADCC/CDC
REMOVIDA SOBRE A MIGRAÇÃO DE CÉLULAS CANCEROSAS
[283] A fim de confirmar o efeito do anticorpo mutante a partir do qual a função ADCC/CDC foi removida sobre a migração de células imunes, foi realizado um ensaio de migração de células de acordo com o método descrito no Exemplo 12.
[284] As medições foram feitas em placas de 24 poços transwell com uma membrana de policarbonato (tamanho de poro de 8,0 μm, Costar). A laminina foi adicionada à câmara inferior a uma concentração de 1 mg/mL, e um ensaio de migração foi realizado usando células MDA-MB-231 estáveis com superexpressão de KRS T52D, que mimetiza uma KRS fosforilada. Para induzir a expressão de T52D KRS, células estáveis T52D KRS-MDA-MB-231 foram tratadas com doxiciclina (0,1 µg/mL) por um dia e, em seguida, semeadas na câmara superior a uma concentração de 4 x 10 4 células e, em seguida, foram suspensas em meio RPMI sem soro. Em seguida, 10 nM de anticorpo N3-8, N3-8-1, N3-8-1 mutante LALA, N3-8-1 mutante LALATA, N3-8- 1 mutante LALAPG, N3-8-1 mutante LALAPGTA foram adicionados na câmara e as câmaras foram incubadas por 7 horas. As células não migrantes presentes acima da membrana foram removidas com uma haste flexível com algodões nas pontas (swab). A membrana foi lavada duas vezes com PBS e tratada com MeOH a 70% (em PBS) por 30 minutos. As membranas foram novamente lavada por duas vezes com PBS, coradas com violeta cristal (Sigma) e secas.
Em seguida, as câmaras superiores foram colocadas em ácido acético a 33% (Merck) e agitadas por 10 minutos. A solução de ácido acético dissolvido em violeta de cristal foi transferida para uma placa de 96 poços e a absorbância foi medida a 590 nm em um leitor de microplacas (Tecan).
[285] Conforme mostrado na Fig. 19, todos os anticorpos N3-8, N3-8-1, N3-8-1 mutante LALA, N3-8-1 mutante LALATA, N3-8-1 mutante LALAPG, N3-8-1 mutante LALAPGTA inibiram a migração células cancerosas de maneira dependente de laminina.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[286] Como descrito acima, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos da presente invenção têm uma sequência específica da CDR (região determinante de complementaridade) aqui descrita e têm excelente capacidade de ligação específica e afinidade para a região N-terminal de KRS exposta à membrana extracelular.
Portanto, eles podem ser utilizados para o diagnóstico de doenças associadas a um comportamento específico de KRS, como o câncer ou doenças relacionadas à migração de células imunes.
E eles têm uma excelente produtividade e estabilidade, e excelente efeito inibidor de metástases do câncer.
Portanto, eles podem ser utilmente utilizados como terapêuticos para o câncer, bem como podem ser utilizados como preventivos ou inibidores da metástase do câncer, e podem ser uteis na prevenção,
melhora e tratamento de doenças relacionadas à migração de células imunes.

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES
1. ANTICORPO ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma região N-terminal da lisil-tRNA sintetase (KRS) extracelularmente exposta, caracterizado por compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo; (i) a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos SYDMS; (ii) a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos X1IX2X3X4X5GX6X7YYADSVKG, em que X1 é A ou V, X2 é S, D ou G, X3 é Y, P, S ou A, X4 é D, Q, L ou Y, X5 é N, M, S, ou G, X6 é N, R ou P, X7 é T, V, I ou S; e (iii) a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos X 8ALDFDY, em que X8 é M ou L, e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende; (i) a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo uma sequência de aminoácidos TGSSSNIGSNYVT; (ii) a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo uma sequência de aminoácidos X 9NX10X11RPS, em que X9 é D, S ou R, X10 é S ou N, e X11 é N ou Q; e (iii) a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo uma sequência de aminoácidos X12SFSDELGAYV, em que X12 é A ou S.
2. ANTICORPO ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela (a) região variável da cadeia pesada (VH) compreender uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1; uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 118; e uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 25.
3. ANTICORPO ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela (b) região variável da cadeia leve (VL) compreender uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo uma sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7; uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29; uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15.
4. ANTICORPO ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento do mesmo compreender: i) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 3, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 13;
ii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 3, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
iii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 118, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 13;
iv) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 118, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
v) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 17, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
vi) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 19, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
vii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
viii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 23, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
ix) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 27, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
x) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve
(VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 29, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
xi) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 25, e uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 9, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15;
xii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 25, e uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 27, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15; ou xiii) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 21, região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 25, e uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 7, a região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 29, e a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 15.
5. ANTICORPO ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma cadeia pesada (HC) compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 105; e uma cadeia leve (LC) compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:
107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 115.
6. ANTICORPO ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento do mesmo compreender: uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 89, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 107; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 89, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 93, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 107; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 93, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 95, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 97, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 99, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 101, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109;
uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 103, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 111; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 103, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 113; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 103, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 115; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 105, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 111; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 105, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 113; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 105, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 115; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 99, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 111; e uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 103, e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 109.
7. ANTICORPO ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ser selecionado a partir do grupo que consiste em IgG, IgA, IgM, IgE e IgD, e pelo fragmento ser selecionado a partir do grupo que consiste em diacorpo (diabody), Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab')2,
Fv e scFv.
8. ANTICORPO ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fragmento conter uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 87.
9. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por codificar o anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. VETOR DE EXPRESSÃO recombinante, caracterizado por compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 9.
11. CÉLULA TRANSFORMADA, caracterizada por ser transformada com o vetor recombinante conforme definido na reivindicação 10.
12. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma região N-terminal da lisil-tRNA sintetase (KRS) extracelularmente exposta, caracterizado por compreender: (a) a transformação de células hospedeiras com o vetor de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 11; (b) a incubação das células hospedeiras transformadas para produzir um anticorpo ou fragmento do mesmo; e (c) a coleta do anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras.
13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para prevenir ou inibir o câncer e metástase do câncer, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.
14. COMPOSIÇÃO PARA DIAGNÓSTICO de câncer ou metástase do câncer, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, como ingrediente ativo.
15. ANTICORPO ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um polipeptídeo contendo uma Fc variante de uma região Fc de IgG humana tipo selvagem, e em que a Fc variante compreende L117A, L118A, T182A, P212G de uma região Fc de IgG 1 humana tipo selvagem definida pela SEQ ID NO: 126 ou pelo menos uma substituição de aminoácido adicional T179A da região Fc da IgG 4 humana definida pela SEQ ID NO: 138, e em que o polipeptídeo tem uma função ADCC / CDC reduzida em comparação com um polipeptídeo compreendendo a região Fc de IgG tipo selvagem.
16. COMPOSIÇÃO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE UMA DOENÇA relacionada à migração de células imunes, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.
17. COMPOSIÇÃO PARA DIAGNÓSTICO de uma doença relacionada à migração de células imunes, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.
18. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pela doença relacionada à migração de células imunes ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma doença cardiovascular, uma doença fibrótica, uma doença inflamatória e síndrome de Alport.
19. USO DO ANTICORPO ou fragmento funcional do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparar um agente para prevenir ou inibir o câncer e metástase do câncer.
20. MÉTODO PARA PREVENIR OU INIBIR O CÂNCER E METÁSTASE DO CÂNCER, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, a um sujeito com tal necessidade.
21. USO DO ANTICORPO ou fragmento funcional do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparar um agente para diagnosticar o câncer ou metástases do câncer.
22. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR CÂNCER OU METÁSTASE DO CÂNCER, caracterizado por compreender: a) a obtenção de uma amostra biológica de um indivíduo (sujeito) com suspeita de metástase de câncer; b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando que o câncer e a metástase de câncer ocorreram quando o nível de expressão de KRS está aumentado.
23. USO do anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparar um agente para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.
24. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA relacionada à migração de células imunes, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, a um sujeito com tal necessidade.
25. USO do anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparar um agente para o diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes.
26. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA relacionada à migração de células imunes, caracterizado por compreender: a) a obtenção de uma amostra biológica a partir de um sujeito com suspeita de ter uma doença relacionada à migração de células imunes; b) a administração de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, à amostra ou sujeito; c) a detecção do nível de expressão da proteína KRS na amostra ou no sujeito da etapa (b); e d) a comparação do nível de expressão da proteína KRS com o nível de um grupo controle normal, e diagnosticando como uma doença relacionada à migração de células imunes quando o nível de expressão de KRS está aumentado.
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