BR112021002435A2

BR112021002435A2 - tratamento de câncer com um anticorpo

Info

Publication number: BR112021002435A2
Application number: BR112021002435-2A
Authority: BR
Inventors: Christopher Barry Wood; Tina C. FLATAU; Fiona DEMPSEY; Scott CRICHTON
Original assignee: Medannex Ltd.
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-05-04
Also published as: WO2020030827A1; IL280421B1; IL280421A; CA3107674A1; US20210238269A1; JP2021534121A; IL280421B2; JP2024041851A; KR20210088523A; CN112770786A; TW202014437A; MX2021001604A; AU2019319092A1; US11858982B2; EP3833404A1; JP7428696B2; GB201813137D0; CN112770786B

Abstract

TRATAMENTO DE CÂNCER COM UM ANTICORPO. A presente invenção se refere a anticorpos que se ligam à Anx A1 humana para uso no tratamento de câncer, incluindo câncer resistente a fármacos. Kits e produtos para esse uso também são fornecidos.

Description

“TRATAMENTO DE CÂNCER COM UM ANTICORPO”

[0001] A presente invenção refere-se a uma molécula de ligação específica para uso no tratamento de câncer em um sujeito. A molécula de ligação específica se liga à anexina-A1 humana (Anx-A1) e, em modalidades particulares, é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[0002] O câncer é um grupo de doenças caracterizadas pelo crescimento celular anormal. Caracteristicamente, o crescimento celular anormal associado ao câncer resulta na formação de um tumor (uma massa sólida de células formada devido ao crescimento celular anormal), embora nem sempre seja o caso (particularmente em cânceres do sangue). Em 2010 (o ano mais recente para o qual estatísticas detalhadas estão disponíveis), em todo o mundo mais pessoas (cerca de 8 milhões) morreram de câncer do que qualquer outra causa única (Lozano et al., Lancet 380: 2.095 a

2.128, 2012). Além disso, na medida em que as populações do mundo todo envelhecem, espera-se que as taxas de câncer aumentem. Há, portanto, uma necessidade urgente de terapias novas e melhoradas para o câncer.

[0003] Além disso, muitas mortes por câncer são o resultado de um câncer se tornar resistente aos fármacos quimioterápicos. Métodos pelos quais os cânceres se tornam resistentes a fármacos são revisados em Housman et al. (Cancers 6: 1.769 a 1.792, 2014). Conforme detalhado neste documento, os cânceres podem se tornar resistentes a fármacos por uma variedade de mecanismos diferentes, incluindo inativação ou metabolismo de fármacos (ou a prevenção de sua ativação metabólica), mutação ou alteração de alvo de fármaco e efluxo de fármaco por meio de transportadores ABC. Esses mecanismos podem resultar em cânceres se tornando multirresistente a fármacos (MDR). Conforme discutido abaixo, a resistência a fármaco é um problema particular para terapia com agentes quimioterápicos à base de platina.

[0004] Os agentes quimioterápicos à base de platina são uma opção de tratamento de primeira linha comum em vários tipos de câncer, incluindo câncer testicular, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer cervical, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer esofágico, câncer de pulmão, mesotelioma, linfoma, tumores cerebrais e neuroblastoma. Os agentes quimioterápicos à base de platina incluem cisplatina, oxaliplatina e carboplatina. Todos os agentes quimioterápicos à base de platina funcionam essencialmente da mesma maneira, reagindo com a posição N-7 em resíduos de guanina para formar ligações cruzadas de DNA inter e intrafilamentos e ligações cruzadas de proteína de DNA. As ligações cruzadas inibem a síntese e/ou a reparação de DNA e causam o início de apoptose (Shen et al., Pharmacol. Rev. 64: 706 a 721, 2012). No entanto, embora os pacientes geralmente respondam bem inicialmente à quimioterapia à base de platina, a grande maioria tem recidiva devido ao desenvolvimento de resistência ao tratamento (particularmente no caso de cisplatina), resultando em falha do tratamento (Shen et al., supra). Desse modo, atualmente o desenvolvimento de resistência às terapias à base de platina é um desafio significativo na oncologia. Os cânceres desenvolvem resistência às terapias à base de platina por meio de uma série de mecanismos, incluindo redução do acúmulo de agentes quimioterápicos à base de platina em células-alvo (devido ao influxo reduzido e/ou aumento de efluxo) e (re)ativação de vias de reparo de DNA.

[0005] Desse modo, atualmente o desenvolvimento de resistência às terapias à base de platina é um desafio significativo na oncologia. Novas opções de tratamento para cânceres que são ou se tornaram resistentes aos produtos quimioterapêuticos tradicionais (particularmente, produtos quimioterapêuticos à base de platina) são urgentemente necessárias.

[0006] Os presentes inventores constataram que determinadas moléculas de ligação específica (por exemplo, anticorpos) contra Anx-A1 são eficazes em tratamento de câncer. Constatou-se que as moléculas são particularmente eficazes no tratamento de câncer resistente a fármacos, incluindo o câncer que é resistente à quimioterapia à base de platina. A presente invenção fornece assim uma nova opção de tratamento para pacientes com câncer, particularmente, para pacientes com câncer que é resistente a agentes quimioterápicos. Essa opção de tratamento atende a uma necessidade urgente de novas terapias para indivíduos cuja doença não responde à quimioterapia tradicional.

[0007] Constatou-se que as moléculas de ligação específica da invenção são eficazes no tratamento de uma ampla variedade de cânceres, incluindo câncer de mama, câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de pulmão e câncer de pâncreas.

[0008] O câncer de mama é o câncer mais comum entre as mulheres e causa mais mortes em mulheres em todo o mundo do que qualquer outro câncer (Becker, Int J Gynaecol Obstet 131 (2015), S36 a S39). Mais de 55.000 casos de câncer de mama são diagnosticados a cada ano no Reino Unido (e mais de 300 casos em homens). Embora a taxa de mortalidade por câncer de mama seja menor do que a de muitos outros tipos de câncer, no Reino Unido mais de 11.000 mortes anuais são causadas por câncer de mama. O câncer de mama sem expressão do receptor de estrogênio, receptor de progesterona e receptor do fator de crescimento epidérmico do hormônio HER2 (conhecido como câncer de mama triplo negativo) é particularmente difícil de tratar, uma vez que muitos fármacos modernos contra o câncer de mama têm como alvo esses receptores. Constatou-se que as moléculas de ligação específica da invenção são eficazes no tratamento de câncer de mama, incluindo câncer de mama triplo negativo, fornecendo uma nova opção de tratamento importante para esta doença.

[0009] O câncer de ovário é outro tipo de câncer comum em mulheres e difícil de tratar. Só no Reino Unido, há mais de 7.500 incidências de câncer de ovário a cada ano, resultando em mais de 4.000 mortes (o câncer de ovário é frequentemente diagnosticado em um estágio tardio, resultando em uma taxa de sobrevivência relativamente baixa). O câncer de pâncreas é relativamente comum, com mais de 9.000 casos por ano apenas no Reino Unido, mas é conhecido por ser um dos cânceres mais não tratáveis, com uma taxa de sobrevivência de menos de 1% (novamente, isso é principalmente devido à doença ser diagnosticada em um estágio tardio). Constatou-se que as moléculas de ligação específica da invenção são eficazes em tratamento de ambos os cânceres, fornecendo uma nova terapia muito necessária para cânceres difíceis de tratar. O câncer colorretal (ou de intestino) também é um câncer comum, com 42.000 casos diagnosticados no Reino Unido a cada ano. Apesar de ser apenas o quarto tipo de câncer mais comum no Reino Unido, é o segundo câncer mais comum resultando em morte. De modo similar, o câncer de pulmão é diagnosticado em mais de 47.000 indivíduos a cada ano no Reino Unido, em que apenas 5% sobrevivem por dez anos ou mais após o diagnóstico. As moléculas de ligação específica da invenção oferecem novas terapias úteis para esses cânceres.

[0010] A Anx-A1 humana de comprimento total tem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 17. A Anx-A1 é um membro da família de proteínas de anexina. A maioria das proteínas desta família, incluindo Anx-A1, é caracterizada pela presença de uma região de “núcleo” que compreende quatro domínios de repetição homólogos, cada um dos quais compreende pelo menos um sítio de ligação de Ca2+. Cada membro da família é diferenciado por uma região N-terminal exclusiva. Anx-A1 é uma proteína anfipática monomérica, predominantemente localizada no citoplasma de células nas quais é expressa. No entanto, Anx-A1 também pode ser exportada, resultando na localização de superfície celular (D’Acquisto et al., Br. J. Pharmacol. 155: 152 a 169, 2008).

[0011] A Anx-A1 é conhecida por desempenhar um papel na regulação do sistema imunológico, estando envolvida na homeostase de vários tipos de células tanto do sistema imunológico inato quanto do sistema imunológico adaptativo. Por exemplo, a Anx-A1 demonstrou exercer controle homeostático sobre as células do sistema imunológico inato, tais como neutrófilos e macrófagos, e também desempenhar um papel em células T, modulando a força de sinalização de receptor de células T (TCR) (D’Acquisto et al., Blood 109: 1.095 a 1.102, 2007). O uso de um anticorpo neutralizante contra Anx-A1 para inibir suas funções no sistema imunológico adaptativo demonstrou ser eficaz no tratamento de várias doenças mediadas por células T, incluindo doenças autoimunes, tais como artrite reumatoide e esclerose múltipla (documentos WO 2010/064012; WO 2011/154705).

[0012] Os anticorpos contra Anx-A1 também mostraram ser úteis no tratamento de determinadas condições psiquiátricas, em particular, ansiedade, transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) e doenças relacionadas (documento WO 2013/088111), embora o mecanismo pelo qual isso ocorre seja desconhecido.

[0013] O documento WO 2005/027965 demonstra que Anx-A1 está localizada na superfície de células apoptóticas e que os anticorpos anti-Anx-A1 podem ser usados para monitorar a apoptose. O documento ensina que, com base nisso, tais anticorpos podem ser usados para monitorar e diagnosticar o câncer. O documento também ensina que a expressão de Anx-A1 na superfície de células apoptóticas inibe uma resposta imunológica contra as células. Com base nisso, o documento especula que um anticorpo que se liga à Anx-A1 pode ser usado para tratar câncer, bloqueando o efeito imunossupressor de Anx-A1 sobre células que iniciaram a apoptose e, assim, estimulando uma resposta imunológica contra o câncer.

[0014] Oh et al. (Nature 429: 629 a 635, 2004) ensina que Anx-A1 é expressa em alguns tumores sólidos e pode ser usada como um alvo para direcionar a radioimunoterapia a esses cânceres e demonstra que tal terapia aumenta a sobrevivência em um modelo animal de doença. O documento US 2015/0086553 sugere que os anticorpos anti-Anx-A1 podem ser usados no tratamento e diagnóstico de câncer, mas não ensina como esse tratamento pode ser executado. A ligação de um scFv anti-Anx-A1 à linhagem celular de câncer gástrico SNU-1 é demonstrada. Wang et al. (Biochem. BioPhys. Res. Commun. 314: 565 a 570, 2004) demonstra uma correlação entre a expressão de Anx-A1 e a resistência a múltiplos fármacos em câncer. Assim, várias doenças mostraram exibir uma associação com a expressão de Anx-A1, incluindo câncer. No entanto, antes da presente invenção, não havia sido demonstrado que um anticorpo anti-Anx-A1, particularmente quando usado sem qualquer cotratamento, poderia ser usado para tratar o câncer.

[0015] De fato, a presente invenção demonstra que a eficácia no tratamento de câncer não se estende a todas as moléculas de ligação específica que se ligam à Anx-A1 humana. A presente invenção fornece moléculas de ligação específica particulares que se ligam à Anx-A1 humana e podem ser vantajosamente usadas para tratar câncer, particularmente câncer que é resistente a fármacos de quimioterapia e/ou câncer de mama, câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de pulmão e câncer de pâncreas. Não se sabe por que as moléculas de ligação específica da invenção são eficazes no tratamento de câncer, enquanto outras moléculas de ligação específica que também se ligam à Anx-A1 humana não são. Sem estar limitado à teoria, especula-se que a atividade de moléculas de ligação específica que se ligam à Anx-A1 humana pode ser dependente do epítopo reconhecido.

[0016] Uma série de anticorpos monoclonais que reconhecem Anx-A1 humana é divulgada no documento WO 2018/146230.Os anticorpos divulgados no documento WO 2018/146230 têm propriedades particularmente vantajosas, pois são capazes de se ligar à Anx-A1 humana com afinidade muito alta. Os inventores constataram agora que os anticorpos divulgados no documento WO 2018/146230 são úteis no tratamento de câncer, conforme descrito mais adiante.

[0017] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1 humana para uso no tratamento de câncer em um sujeito, em que: (i) a dita molécula de ligação específica compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 e VHCDR3, em que cada uma das ditas CDRs tem uma sequência de aminoácidos como segue:

VLCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8; VLCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; VLCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3; VHCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4; VHCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e VHCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6; ou, para cada sequência, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência; e/ou (ii) a dita molécula de ligação específica se liga à Anx-A1 em um epítopo descontínuo que consiste nos aminoácidos 197 a 206, 220 a 224 e 227 a 237 de SEQ ID NO: 17.

[0018] De modo similar, a invenção fornece um método para tratar câncer em um sujeito, que compreende administrar ao dito sujeito uma molécula de ligação específica, conforme definido acima. Também é fornecido o uso de uma molécula de ligação específica, conforme definido acima, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em um sujeito.

[0019] Em um segundo aspecto, a invenção fornece um kit que compreende uma molécula de ligação específica, conforme definido acima, e um agente quimioterapêutico.

[0020] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece um produto que compreende uma molécula de ligação específica, conforme definido acima, e um segundo agente terapêutico para uso separado, simultâneo ou sequencial no tratamento de câncer em um sujeito.

[0021] Conforme mencionado acima, a invenção fornece uma molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1 humana para uso no tratamento de câncer em um sujeito. Uma “molécula de ligação específica”, conforme definido no presente documento, é uma molécula que se liga especificamente a um parceiro molecular particular, neste caso Anx-A1 humana. Uma molécula que se liga especificamente à Anx-A1 humana é uma molécula que se liga à Anx-A1 humana com uma afinidade maior do que aquela com a qual se liga a outras moléculas, ou pelo menos à maioria das outras moléculas. Assim, por exemplo, se uma molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1 humana fosse colocada em contato com um lisado de células humanas, a molécula de ligação específica se ligaria principalmente à Anx-A1. Em particular, a molécula de ligação específica se liga a uma sequência ou configuração presente na dita Anx-A1 humana. Quando a molécula de ligação específica é um anticorpo, a sequência ou configuração é o epítopo ao qual a molécula de ligação específica se liga. O epítopo de Anx-A1 ligado pelas moléculas de ligação específica para uso de acordo com a invenção é descrito abaixo.

[0022] A molécula de ligação específica para uso no presente documento não se liga necessariamente apenas à Anx-A1 humana: a molécula de ligação específica pode reagir de forma cruzada com determinadas outras moléculas-alvo indefinidas ou pode exibir um nível de ligação não específica durante o contato com uma mistura de um grande número de moléculas (tal como um lisado celular ou similares). Por exemplo, a molécula de ligação específica pode exibir um nível de reatividade cruzada com outros membros da família de anexina humana e/ou com proteínas Anx-A1 de outros animais. Independentemente disso, uma molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção mostra especificidade para Anx-A1. A pessoa versada será facilmente capaz de identificar se uma molécula de ligação específica mostra especificidade para Anx-A1 com o uso de procedimentos- padrão na técnica, por exemplo, ELISA, Western-blot, ressonância plasmônica de superfície (SPR), etc. Em modalidades particulares, a molécula de ligação específica para uso no presente documento se liga à Anx-A1 humana a uma KD (constante de dissociação) inferior a 20 nM, 15 nM ou 10 nM. Em uma modalidade, a molécula de ligação específica para uso no presente documento se liga à Anx-A1 humana a uma KD inferior a 5 nM.

[0023] A KD da ligação da molécula de ligação específica à Anx-A1 é, de preferência, medida sob condições de ligação em que íons de Ca2+ estão presentes em uma concentração de pelo menos 1 mM, e opcionalmente HEPES está presente em uma concentração de 10 a 20 mM, e o pH está entre 7 e 8, de preferência, em um nível fisiológico entre 7,2 e 7,5 inclusive. NaCl pode estar presente, por exemplo, em uma concentração de 100 a 250 mM, e uma baixa concentração de um detergente, por exemplo, polissorbato 20, também pode estar presente. Essa baixa concentração pode ser, por exemplo, de 0,01 a 0,5% v/v. Diversos métodos pelos quais a KD de uma interação entre uma molécula de ligação específica e o seu ligante pode ser calculada são bem-conhecidos na técnica. Os procedimentos conhecidos incluem SPR (por exemplo, Biacore) e diferença de refletividade de incidência oblíqua modulada por polarização (OI-RD).

[0024] Conforme descrito acima, uma molécula que “se liga à Anx-A1 humana” mostra especificidade para uma molécula de Anx-A1 humana. Há três isoformas humanas de Anx-A1 humana, obtidas a partir da tradução de quatro mRNAs de Anx-A1 com splicing alternativo. A proteína Anx- A1 humana de comprimento total é obtida a partir da tradução da transcrição de ANXA1-002 ou ANXA1-003 e, conforme observado acima, tem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 17. As transcrições de ANXA1-004 e ANXA1-006 codificam fragmentos da proteína Anx-A1 humana de comprimento total, que têm respectivamente as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 18 e 19.

[0025] A molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção se liga à Anx-A1 humana de comprimento total (isto é, Anx-A1 de SEQ ID NO: 17, codificada pela transcrição de ANXA1-002 ou ANXA1-003, que é uma proteína de 346 aminoácidos). A molécula de ligação específica também pode se ligar a fragmentos, partes ou variantes particulares de Anx-A1 de comprimento total, tais como os fragmentos codificados pelas transcrições de ANXA1-004 e ANXA1-006.

[0026] Conforme discutido a seguir, os anticorpos (e moléculas que contêm CDRs) formam moléculas de ligação específica preferenciais para uso de acordo com a invenção.

[0027] Conforme mencionado acima, uma série de anticorpos monoclonais que reconhecem a Anx-A1 humana é divulgada no documento WO 2018/146230. Como é do conhecimento da pessoa versada, os anticorpos são proteínas que compreendem quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Normalmente, as cadeias pesadas são idênticas umas às outras e as cadeias leves são idênticas umas às outras. As cadeias leves são mais curtas (e, portanto, mais leves) do que as cadeias pesadas. As cadeias pesadas compreendem quatro ou cinco domínios: no terminal N, um domínio variável (VH) está localizado, seguido por três ou quatro domínios constantes (do N-terminal ao C-terminal CH1, CH2, CH3 e, onde presente, CH4, respectivamente). As cadeias leves compreendem dois domínios: no N-terminal, um domínio variável (VL) está localizado, e no C-terminal, um domínio constante (CL) está localizado. Na cadeia pesada, uma região de dobradiça não estruturada está localizada entre os domínios CH1 e CH2. As duas cadeias pesadas de um anticorpo são unidas por ligações de dissulfeto formadas entre os resíduos de cisteína presentes na região de dobradiça e cada cadeia pesada é unida a uma cadeia leve por uma ligação de dissulfeto entre os resíduos de cisteína presentes nos domínios CH1 e CL, respectivamente.

[0028] Em mamíferos, são produzidos dois tipos de cadeia leve, conhecidos como lambda (λ) e kappa (κ). Para cadeias leves kappa, os domínios variável e constante podem ser referidos como domínios VK e CK, respectivamente. O fato de uma cadeia leve ser uma cadeia leve λ ou κ é determinado por sua região constante: as regiões constantes de cadeias leves λ e κ diferem, mas são as mesmas em todas as cadeias leves do mesmo tipo em qualquer espécie.

[0029] As regiões constantes das cadeias pesadas são as mesmas em todos os anticorpos de qualquer isotipo dado em uma espécie, mas diferem entre os isotipos (exemplos de isotipos de anticorpos são classes IgG, IgE, IgM, IgA e IgD; há também uma série de subtipos, por exemplo, há quatro subtipos de anticorpos IgG: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). A especificidade de um anticorpo é determinada pela sequência de sua região variável. A sequência de regiões variáveis varia entre anticorpos do mesmo tipo em qualquer indivíduo. Em particular, tanto as cadeias leves quanto pesadas de um anticorpo compreendem três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) hipervariáveis. Em um par de uma cadeia leve e uma cadeia pesada, as CDRs das duas cadeias formam o sítio de ligação a antígeno. As sequências de CDR determinam a especificidade de um anticorpo.

[0030] As três CDRs de uma cadeia pesada são conhecidas como VHCDR1, VHCDR2 e VHCDR3, do N-terminal ao C-terminal, e as três CDRs de uma cadeia leve são conhecidas como VLCDR1, VLCDR2 e VLCDR3, do N-terminal ao C-terminal.

[0031] Um anticorpo divulgado no documento WO 2018/146230 tem as seguintes sequências de CDR: VLCDR1: RSSQSLENSNAKTYLN (SEQ ID NO: 1); VLCDR2: GVSNRFS (SEQ ID NO: 2); VLCDR3: LQVTHVPYT (SEQ ID NO: 3); VHCDR1: GYTFTNYWIG (SEQ ID NO: 4); VHCDR2: DIYPGGDYTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 5); e VHCDR3: ARWGLGYYFDY (SEQ ID NO: 6).

[0032] Outro anticorpo divulgado no documento WO 2018/146230 tem as seguintes sequências de CDR: VLCDR1: RSSQSLENSNGKTYLN (SEQ ID NO: 7); VLCDR2: GVSNRFS (SEQ ID NO: 2); VLCDR3: LQVTHVPYT (SEQ ID NO: 3); VHCDR1: GYTFTNYWIG (SEQ ID NO: 4);

VHCDR2: DIYPGGDYTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 5); e VHCDR3: ARWGLGYYFDY (SEQ ID NO: 6).

[0033] Outro anticorpo divulgado no documento WO 2018/146230 tem as seguintes sequências de CDR: VLCDR1: RSSQSLENTNGKTYLN (SEQ ID NO: 8); VLCDR2: GVSNRFS (SEQ ID NO: 2); VLCDR3: LQVTHVPYT (SEQ ID NO: 3); VHCDR1: GYTFTNYWIG (SEQ ID NO: 4); VHCDR2: DIYPGGDYTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 5); e VHCDR3: ARWGLGYYFDY (SEQ ID NO: 6).

[0034] Assim, os anticorpos divulgados no documento WO 2018/146230 têm sequências de CDR idênticas, exceto pelas sequências de VLCDR1. A sequência de VLCDR1 de SEQ ID NO: 7 é uma sequência de VLCDR1 do tipo selvagem, encontrada no anticorpo murino Mdx001 que foi constituída a partir de uma sequência de mRNA menor obtida a partir do hibridoma depositado com o ECACC com número de acesso 10060301. Versões humanizadas de Mdx001 foram geradas e, de modo surpreendente, constatou-se que a modificação da sequência de VLCDR1 nesses anticorpos humanizados produz anticorpos aumentados. A substituição do resíduo de glicina na posição 11 da SEQ ID NO: 7 aumenta a estabilidade e a função de anticorpo. Sem estar limitado à teoria, acredita-se que isso é obtido removendo- se um sítio para modificação pós-tradução da CDR. Especificamente, acredita- se que a substituição deste resíduo de glicina remove um sítio de desamidação da proteína. A sequência de VLCDR1 estabelecida na SEQ ID NO: 7 compreende o motivo de sequência Ser-Asn-Gly. Esse motivo de sequência está associado à desamidação do resíduo Asn, o que leva à conversão do resíduo de asparagina em ácido aspártico ou ácido isoaspártico, que pode afetar a estabilidade do anticorpo e a ligação ao alvo. Acredita-se que a substituição de qualquer um dos resíduos dentro do motivo Ser-Asn-Gly remove o sítio de desamidação.

[0035] Os inventores identificaram anticorpos nos quais o resíduo de glicina na posição 11 da SEQ ID NO: 7 (que é o resíduo de glicina localizado no sítio de desamidação acima descrito) é substituído por alanina e que exibem ligação aumentada ao seu alvo (Anx-A1) em relação ao anticorpo nativo Mdx001. A VLCDR1 que compreende a substituição de glicina na posição 11 por alanina tem a sequência de aminoácidos RSSQSLENSNAKTYLN (o resíduo em negrito é a alanina introduzida pela substituição acima mencionada), que é estabelecida na SEQ ID NO: 1. Além disso, os anticorpos humanizados que compreendem uma VLCDR1 modificada na posição 9, por substituição de serina por treonina, também demonstraram exibir ligação aumentada de Anx-A1 em relação a Mdx001. A VLCDR1 que compreende a substituição de serina na posição 9 por treonina tem a sequência de aminoácidos RSSQSLENTNGKTYLN (o resíduo em negrito é a treonina introduzida pela substituição acima mencionada), que é estabelecida na SEQ ID NO: 8. Conforme mencionado acima, os inventores constataram que os anticorpos divulgados no documento WO 2018/146230 são adequados para uso em terapia para câncer.

[0036] Os anticorpos divulgados no documento WO 2018/146230 foram gerados por imunização genética de um camundongo com Anx-A1 humana, o que significa que o sistema imunológico do camundongo foi exposto à Anx-A1 humana inteira e intacta em sua conformação nativa. Conforme detalhado nos exemplos, a análise dos anticorpos do documento WO 2018/146230 por troca de hidrogênio-deutério (HDX) demonstrou que os mesmos se ligam à Anx-A1 humana em um epítopo descontínuo que consiste nos aminoácidos 197 a 206, 220 a 224 e 227 a 237 de Anx-A1 humana (isto é, os aminoácidos 197 a 206, 220 a 224 e 227 a 237 da SEQ ID NO: 17).

[0037] De forma notável, os anticorpos do documento WO 2018/146230 se ligam a Anx-A1 apenas na presença de concentrações fisiológicas de Ca2+. Sem estar limitado à teoria, acredita-se que isso seja resultado da localização de seu epítopo na molécula de Anx-A1. Na ausência de Ca2+, seu N-terminal fica em uma “bolsa” localizada adjacente a este epítopo descontínuo. A ligação de Ca2+ à Anx-A1 (que ocorre sob concentrações fisiológicas de Ca2+) resulta em uma alteração da conformação de Anx-A1 levando à expulsão do N-terminal de sua bolsa no domínio central, que acredita- se expor o epítopo, permitindo que o anticorpo se ligue. Qualquer anticorpo (ou molécula de ligação específica similar) que se liga a este epítopo de Anx-A1 pode ser usado em métodos e usos descritos no presente documento.

[0038] A molécula de ligação específica para uso de acordo com a presente invenção pode compreender as sequências de CDR de qualquer um dos três anticorpos divulgados no documento WO 2018/146230, ou variantes dos mesmos. Alternativamente ou adicionalmente, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção pode se ligar à Anx-A1 no mesmo epítopo que os anticorpos do documento WO 2018/146230. Consequentemente, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a presente invenção: (i) compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 e VHCDR3, em que cada uma das ditas CDRs tem uma sequência de aminoácidos como segue: VLCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8; VLCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; VLCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3; VHCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4; VHCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e VHCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6; ou, para cada sequência, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma; e/ou

(ii) se liga à Anx-A1 humana em um epítopo descontínuo que consiste nos aminoácidos 197 a 206, 220 a 224 e 227 a 237 de SEQ ID NO:

17.

[0039] Em um aspecto preferencial, as moléculas de ligação específica de (i) se ligam ao epítopo, conforme descrito em (ii).

[0040] A frase “ou, para cada sequência, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma” significa que cada uma das ditas CDRs pode ter a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO relevante, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma. Assim, a VLCDR1 tem a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 1, 7 ou 8, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 7 ou 8; a VLCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; a VLCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; a VHCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4; a VHCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5; e a VHCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6. Uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência (mas menos de 100% de identidade de sequência) com uma SEQ ID NO particular é aqui conhecida como uma variante dessa SEQ ID NO, por exemplo, uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, mas menos de 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, é uma variante de SEQ ID NO: 1.

[0041] Em uma modalidade particular, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção compreende CDRs com as seguintes sequências de aminoácidos: VLCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1; VLCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; VLCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3; VHCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4; VHCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e VHCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6.

[0042] Conforme indicado, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção pode compreender 6 CDRs que consistem em sequências de polipeptídeos. Conforme usado no presente documento, “proteína” e “polipeptídeo” são intercambiáveis e cada um se refere a uma sequência de 2 ou mais aminoácidos unidos por uma ou mais ligações peptídicas. Assim, a molécula de ligação específica pode ser um polipeptídeo. Alternativamente, a molécula de ligação específica pode compreender um ou mais polipeptídeos que compreendem as sequências de CDR. De preferência, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.

[0043] A molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção pode ser sintetizada por qualquer método conhecido na técnica. Em particular, a molécula de ligação específica pode ser sintetizada com o uso de um sistema de expressão de proteína, tal como um sistema de expressão celular utilizando células procarióticas (por exemplo, bacterianas) ou células eucarióticas (por exemplo, leveduras, fungos, insetos ou mamíferos). Um sistema de expressão de proteína alternativo é um sistema de expressão in vitro e livre de células, no qual uma sequência de nucleotídeos que codifica a molécula de ligação específica é transcrita em mRNA, e o mRNA é traduzido em uma proteína, in vitro. Os kits do sistema de expressão livre de células estão amplamente disponíveis e podem ser adquiridos, por exemplo, junto à Thermo Fisher Scientific (EUA). Alternativamente, as moléculas de ligação específica podem ser sintetizadas quimicamente em um sistema não biológico. A síntese em fase líquida ou a síntese em fase sólida podem ser usadas para gerar polipeptídeos que podem formar a molécula de ligação específica ou estar compreendidos na mesma para uso de acordo com a invenção. A pessoa versada pode facilmente produzir moléculas de ligação específica com o uso de metodologia apropriada comum na técnica. Em particular, a molécula de ligação específica pode ser expressa de forma recombinante em células de mamíferos, tais como células CHO.

[0044] Uma molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1 humana em um epítopo conforme definido acima (isto é, que consiste nos aminoácidos 197 a 206, 220 a 224 e 227 a 237 de SEQ ID NO: 17) pode ser gerada por métodos padrão na técnica (por exemplo, imunização genética para anticorpos) e um anticorpo com o epítopo necessário identificado por métodos padrão de mapeamento de epítopos conhecidos na técnica. Exemplos de tais métodos incluem HDX, excisão de epítopo, seleção de peptídeo, cocristalografia de raios-X, RMN, etc. (Clementi et al., Methods Mol. Biol. 1131: 427 a 446, 2014; Abbott et al., Immunology 142(4): 526 a 535, 2014). As moléculas de ligação específica também podem ser geradas por modificação de moléculas de ligação específica existentes conhecidas por se ligarem ao epítopo relevante (por exemplo, por expressão de sequências modificadas) e moléculas que se ligam ao epítopo relevante identificadas por métodos descritos no presente documento. As moléculas de ligação específica que se ligam ao epítopo relevante também podem ser identificadas por competição com anticorpos conhecidos por se ligarem ao epítopo (por exemplo, conforme descrito no presente documento) ou por comparação da sua ligação ao epítopo, conforme divulgado neste documento, e suas variantes de epítopo (em que a falha de ligação a uma variante de epítopo é indicativa de ligação específica ao epítopo de interesse).

[0045] A molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção pode, se necessário, ser isolada (isto é, purificada). “Isolada”, conforme usado no presente documento, significa que a molécula de ligação específica é o componente primário (isto é, componente majoritário) de qualquer solução ou semelhante em que é fornecida. Em particular, se a molécula de ligação específica for inicialmente produzida em uma mistura ou solução mista, o isolamento da molécula de ligação específica significará que a mesma foi separada ou purificada a partir dela. Assim, por exemplo, se a molécula de ligação específica for um polipeptídeo e o dito polipeptídeo for produzido com o uso de um sistema de expressão de proteína, conforme discutido acima, a molécula de ligação específica será isolada de modo que seja o polipeptídeo mais abundante na solução ou composição em que está presente, de preferência, constituindo a maioria dos polipeptídeos na solução ou composição, e será enriquecida em relação a outros polipeptídeos e biomoléculas presentes no meio de produção nativo. Em particular, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção é isolada de modo que a mesma seja a molécula de ligação específica predominante (maioria) na solução ou composição. Em um recurso preferencial, a molécula de ligação específica está presente na solução ou na composição com uma pureza de pelo menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99% p/p quando avaliada em relação à presença de outros componentes, particularmente outros componentes de polipeptídeo, na solução ou na composição.

[0046] Se a molécula de ligação específica for uma proteína, por exemplo, produzida em um sistema de expressão de proteína, uma solução da molécula de ligação específica pode ser analisada por proteômica quantitativa para identificar se a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção é predominante e, portanto, isolada. Por exemplo, eletroforese em gel 2D e/ou espectrometria de massa podem ser usadas. Essas moléculas isoladas podem estar presentes em preparações ou composições, conforme descrito a seguir.

[0047] A molécula de ligação específica da presente invenção pode ser isolada com o uso de qualquer procedimento conhecido na técnica. Por exemplo, a molécula de ligação específica pode ser produzida com uma etiqueta de afinidade, tal como uma etiqueta de poli-histidina, uma etiqueta de strep, uma etiqueta de FLAG, uma etiqueta de HA ou similares, para permitir o isolamento da molécula por cromatografia de afinidade com o uso de um parceiro de ligação apropriado, por exemplo, em que uma molécula que contém uma etiqueta de poli-histidina pode ser purificada com o uso de íons de Ni2+. Em modalidades em que a molécula de ligação específica é um anticorpo, a molécula de ligação específica pode ser isolada com o uso de cromatografia de afinidade com o uso de uma ou mais proteínas de ligação a anticorpos, tais como Proteína G, Proteína A, Proteína A/G ou Proteína L. Alternativamente, a molécula de ligação específica pode ser isolada, por exemplo, por cromatografia de exclusão por tamanho ou cromatografia de troca iônica. Uma molécula de ligação específica produzida por síntese química (isto é, por um método não biológico), por outro lado, é provavelmente produzida em uma forma isolada. Assim, nenhuma etapa de isolamento ou purificação específica é necessária para que uma molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção seja considerada isolada, se a mesma for sintetizada de forma a produzir uma molécula isolada.

[0048] Em modalidades da invenção em que a molécula de ligação específica compreende uma sequência de CDR que é uma variante de SEQ ID NO: 1 (ou 7 ou 8) ou 2 a 6, essa variante pode ser alterada em relação à sua sequência de CDR de referência (isto é, a sequência de CDR com a qual tem pelo menos 85%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência) por substituição, adição e/ou deleção de resíduos de aminoácidos.

[0049] Quando uma sequência de CDR é modificada por substituição de um resíduo de aminoácido particular, a substituição pode ser uma substituição de aminoácido conservativa. A “substituição de aminoácido conservativa”, conforme usado no presente documento, é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. Os aminoácidos com cadeias laterais similares tendem a ter propriedades similares e, portanto, uma substituição conservativa de um aminoácido importante para a estrutura ou função de um polipeptídeo pode afetar a estrutura/função de polipeptídeo menos do que uma substituição de aminoácido não conservativa na mesma posição. Famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, cisteína, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, uma substituição conservativa de aminoácido pode ser considerada uma substituição em que um resíduo de aminoácido particular é substituído por um aminoácido diferente na mesma família. No entanto, uma substituição de um resíduo de CDR pode ser igualmente uma substituição não conservativa, em que um aminoácido é substituído por outro com uma cadeia lateral que pertence a uma família diferente.

[0050] As substituições ou adições de aminoácidos no escopo da invenção podem ser feitas com o uso de um aminoácido proteinogênico codificado pelo código genético, um aminoácido proteinogênico não codificado pelo código genético ou um aminoácido não proteinogênico. De preferência, qualquer substituição ou adição de aminoácido é feita com o uso de um aminoácido proteinogênico. Os aminoácidos que constituem a sequência das CDRs podem incluir aminoácidos de ocorrência não natural, mas que são modificações de aminoácidos de ocorrência natural. Contanto que esses aminoácidos de ocorrência não natural não alterem a sequência e não afetem a especificidade, os mesmos podem ser usados para gerar CDRs descritas no presente documento sem reduzir a identidade de sequência, isto é, considera- se que os mesmos fornecem um aminoácido da CDR. Por exemplo, derivados de aminoácidos, tais como aminoácidos metilados, podem ser usados. Em uma modalidade, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção não é uma molécula natural, isto é, não é uma molécula encontrada na natureza.

[0051] Modificações nas sequências de aminoácidos das CDRs estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 a 8 podem ser feitas utilizando qualquer procedimento adequado, tal como mutagênese sítio-dirigida da sequência de DNA codificadora ou síntese de estado sólido.

[0052] Moléculas de ligação específica para uso de acordo com a invenção podem compreender as CDRs acima descritas. Além disso, tais moléculas podem conter porções químicas de ligante ou sequências estruturais para permitir a apresentação apropriada das CDRs. Sequências adicionais que podem convenientemente conferir propriedades adicionais também podem estar presentes, por exemplo, sequências de peptídeos que permitem o isolamento ou a identificação das moléculas que contêm as CDRs, tais como as descritas anteriormente no presente documento. Em tais casos, uma proteína de fusão pode ser gerada.

[0053] Conforme afirmado acima, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção pode compreender CDRs com pelo menos 85% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 1 (ou 7 ou 8) e 2 a 6, conforme estabelecido acima. Em outra modalidade da invenção, cada uma das sequências de CDR pode ser modificada pela substituição, adição ou deleção de até 2 aminoácidos em relação às SEQ ID NOs: 1 (ou 7 ou 8) e 2 a 6, com a condição de que as sequências de CDR resultantes tenham pelo menos 85% ou 90% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 1 (ou 7 ou 8) e 2 a 6, conforme estabelecido acima. Por “substituição, adição ou exclusão” estão incluídas combinações de substituições, adições e deleções.

Assim, em particular, a VLCDR1 pode ter a sequência de SEQ ID NO: 1 (ou 7 ou 8) com 1 ou 2 substituições, adições ou deleções de aminoácidos; a VLCDR2 pode ter a sequência de SEQ ID NO: 2 com 1 substituição, adição ou deleção de aminoácido; a VLCDR3 pode ter a sequência de SEQ ID NO: 3 com 1 substituição, adição ou deleção de aminoácido; a VHCDR1 pode ter a sequência de SEQ ID NO: 4 com 1 substituição, adição ou deleção de aminoácido; a VHCDR2 pode ter a sequência de SEQ ID NO: 5 com 1 ou 2 substituições, adições ou deleções de aminoácidos; e a VHCDR3 pode ter a sequência de SEQ ID NO: 6 com 1 substituição, adição ou deleção de aminoácido. De preferência, a dita 1 ou 2 substituições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 7 ou 8 está/estão na posição 9 e/ou 11 nessa sequência.

[0054] A identidade de sequência pode ser avaliada por qualquer método conveniente. No entanto, para determinar o grau de identidade de sequência entre sequências, programas de computador que fazem alinhamentos em pares ou múltiplos alinhamentos de sequências são úteis, por exemplo, EMBOSS Needle ou EMBOSS stretcher (ambos de Rice, P. et al., Trends Genet. 16, (6) páginas 276 a 277, 2000) pode ser usado para alinhamentos de sequência em pares enquanto Clustal Omega (Sievers F et al., Mol. Syst. Biol. 7: 539, 2011) ou MUSCLE (Edgar, R.C., Nucleic Acids Res. 32(5):1.792 a 1.797, 2004) pode ser usado para múltiplos alinhamentos de sequência, embora qualquer outro programa apropriado possa ser usado. Quer o alinhamento seja em pares ou múltiplo, o mesmo deve ser executado globalmente (isto é, em toda a sequência de referência) em vez de localmente.

[0055] Os alinhamentos de sequência e cálculos de % de identidade podem ser determinados utilizando, por exemplo, parâmetros padrão de Clustal Omega: matriz Gonnet, penalidade de abertura de lacuna 6, penalidade de extensão de lacuna 1. Alternativamente, os parâmetros padrão de EMBOSS Needle podem ser usados: matriz BLOSUM62, penalidade de abertura de lacuna 10, penalidade de extensão de lacuna 0,5. Alternativamente, quaisquer outros parâmetros adequados podem ser usados.

[0056] Para os propósitos deste pedido, onde houver disputa entre valores de identidade de sequência obtidos por diferentes métodos, o valor obtido pelo alinhamento global pareado com o uso de EMBOSS Needle com parâmetros padrão deve ser considerado válido.

[0057] Conforme declarado acima, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção é, de preferência, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Um “anticorpo” é uma imunoglobulina com as características descritas anteriormente. Variantes de anticorpos de ocorrência natural que retêm as CDRs, mas são apresentadas em uma estrutura diferente, conforme discutido a seguir e que funcionam da mesma maneira, isto é, retêm a especificidade para o antígeno, também são contempladas. Assim, os anticorpos incluem equivalentes funcionais ou homólogos nos quais os domínios de ocorrência natural foram substituídos em parte ou totalmente por equivalentes ou homólogos de ocorrência natural ou não natural que funcionam da mesma maneira.

[0058] Quando a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção é um anticorpo, a mesma é, de preferência, um anticorpo monoclonal. Por “anticorpo monoclonal” entende-se uma preparação de anticorpo que consiste em uma única espécie de anticorpo, isto é, todos os anticorpos na preparação têm as mesmas sequências de aminoácidos, incluindo as mesmas CDRs e, assim, se ligam ao mesmo epítopo em seu antígeno-alvo (por “antígeno-alvo” entende-se o antígeno que contém o epítopo ao qual um anticorpo específico se liga, isto é, o antígeno-alvo de um anticorpo anti-Anx-A1 é Anx-A1) com o mesmo efeito. Em outras palavras, o anticorpo para uso de acordo com a invenção não é, de preferência, parte de uma mistura policlonal de anticorpos.

[0059] Em um anticorpo, conforme descrito acima, as sequências de CDR estão localizadas nos domínios variáveis das cadeias leves e pesadas. As sequências de CDR ficam dentro de uma estrutura polipeptídica, que posiciona as CDRs de forma apropriada para a ligação ao antígeno. Assim, o restante dos domínios variáveis (isto é, as partes das sequências de domínio variável que não fazem parte de qualquer uma das CDRs) constituem regiões de estrutura. O N-terminal de um domínio variável maduro forma a região de estrutura 1 (FR1); a sequência de polipeptídeos entre CDR1 e CDR2 forma FR2; a sequência de polipeptídeos entre CDR2 e CDR3 forma FR3; e a sequência de polipeptídeos que liga CDR3 ao domínio constante forma FR4. Em um anticorpo para uso de acordo com a invenção, as regiões estruturais de região variável podem ter qualquer sequência de aminoácidos apropriada de modo que o anticorpo se ligue à Anx-A1 humana através de suas CDRs. As regiões constantes podem ser as regiões constantes de qualquer isotipo de anticorpo de mamífero (de preferência, ser humano).

[0060] Em determinadas modalidades da invenção, a molécula de ligação específica pode ser multiespecífica, por exemplo, um anticorpo monoclonal biespecífico. Uma molécula de ligação multiespecífica contém regiões ou domínios (regiões de ligação a antígeno) que se ligam a pelo menos dois parceiros de ligação molecular diferentes, por exemplo, se ligam a dois ou mais antígenos ou epítopos diferentes. No caso de um anticorpo biespecífico, o anticorpo compreende duas cadeias pesadas e leves, na formação, conforme descrito acima, com exceção de que os domínios variáveis das duas cadeias pesadas e das duas cadeias leves, respectivamente, são diferentes e, portanto, formam duas regiões de ligação a antígeno diferentes. Em uma molécula de ligação multiespecífica (por exemplo, biespecífica), por exemplo, anticorpo monoclonal, para uso, de acordo com a invenção, uma das regiões de ligação a antígeno tem as sequências de CDR de uma molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção, conforme definido no presente documento e, portanto, se liga à Anx-A1. A outra região (ou regiões) de ligação a antígeno da molécula de ligação multiespecífica para uso de acordo com a invenção são diferentes das regiões de ligação a antígeno formadas por CDRs para uso de acordo com a invenção, por exemplo, têm CDRs com sequências diferentes daquelas aqui definidas para a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção. A região (ou regiões) de ligação a antígeno adicional (por exemplo, segunda) da molécula de ligação específica, por exemplo, no anticorpo biespecífico, também pode se ligar a Anx-A1, mas em um epítopo diferente à primeira região de ligação a antígeno que se liga à Anx- A1 (que tem as CDRs da molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção). Alternativamente, a região (ou regiões) de ligação a antígeno adicional (por exemplo, segunda) pode se ligar a antígeno (ou antígenos) diferente (por exemplo, um segundo) que não é Anx-A1. Em uma modalidade alternativa, as duas ou mais regiões de ligação a antígeno na molécula de ligação específica, por exemplo, em um anticorpo, podem se ligar cada uma ao mesmo antígeno, isto é, fornecer uma molécula multivalente (por exemplo, bivalente).

[0061] A molécula de ligação específica pode ser um fragmento de anticorpo ou construto sintético com capacidade de se ligar à Anx- A1 humana. Assim, um fragmento de anticorpo para uso de acordo com a invenção compreende um domínio de ligação a antígeno (isto é, o domínio de ligação a antígeno do anticorpo do qual é derivado). Os fragmentos de anticorpos são discutidos em Rodrigo et al., Antibodies, Vol. 4(3), p. 259 a 277, 2015. Os fragmentos de anticorpos para uso de acordo com a invenção são, de preferência, monoclonais (isto é, não fazem parte de uma mistura policlonal de fragmentos de anticorpos). Os fragmentos de anticorpos incluem, por exemplo, fragmentos Fab, F(ab’)2, Fab’ e Fv. Fragmentos Fab são discutidos em Roitt et al, Immunology segunda edição (1989), Churchill Livingstone, Londres. Um fragmento Fab consiste no domínio de ligação a antígeno de um anticorpo, isto é, um anticorpo individual pode ser visto como contendo dois fragmentos Fab, em que cada um consiste em uma cadeia leve e sua seção N-terminal conjunta da cadeia pesada. Assim, um fragmento Fab contém uma cadeia leve inteira e os domínios VH e CH1 da cadeia pesada à qual está ligado. Os fragmentos Fab podem ser obtidos por digestão de um anticorpo com papaína.

[0062] Os fragmentos F(ab’)2 consistem nos dois fragmentos Fab de um anticorpo, mais as regiões de dobradiça dos domínios pesados, incluindo as ligações de dissulfeto que ligam as duas cadeias pesadas. Em outras palavras, um fragmento F(ab’)2 pode ser visto como dois fragmentos Fab unidos de modo covalente. Os fragmentos F (ab)’2 podem ser obtidos por digestão de um anticorpo com pepsina. A redução de fragmentos F(ab’)2 produz dois fragmentos Fab’, que podem ser vistos como fragmentos Fab que contêm um grupo sulfidrila adicional que pode ser útil para a conjugação do fragmento a outras moléculas.

[0063] Os fragmentos Fv consistem apenas nos domínios variáveis das cadeias leve e pesada. Os mesmos não estão covalentemente ligados e são mantidos juntos apenas fracamente por interações não covalentes. Os fragmentos Fv podem ser modificados para produzir um construto sintético conhecido como uma molécula Fv de cadeia única (scFv). Tal modificação é tipicamente executada de forma recombinante, através da modificação genética do gene de anticorpo para produzir uma proteína de fusão na qual um único polipeptídeo compreende os domínios de VH e VL. Os fragmentos scFv geralmente incluem um ligante peptídico que une covalentemente as regiões de VH e VL, o que contribui para a estabilidade da molécula. O ligante pode compreender de 1 a 20 aminoácidos, tal como, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos, 5, 10 ou 15 aminoácidos, ou outros números intermediários na faixa de 1 a 20, conforme conveniente. O ligante peptídico pode ser formado a partir de quaisquer resíduos de aminoácidos geralmente convenientes, tais como glicina e/ou serina. Um exemplo de um ligante adequado é Gly4Ser. Multímeros de tais ligantes podem ser usados, tal como, por exemplo, um dímero, um trímero, um tetrâmero ou um pentâmero, por exemplo, (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)4 ou (Gly4Ser)5. No entanto, não é essencial que um ligante esteja presente, e o domínio VL pode ser ligado ao domínio VH por uma ligação peptídica. Um scFv é aqui definido como um fragmento de anticorpo.

[0064] A molécula de ligação específica pode ser um análogo de um scFv. Por exemplo, o scFv pode ser ligado a outras moléculas de ligação específica (por exemplo, outros scFvs, fragmentos de anticorpos Fab e anticorpos IgG quiméricos (por exemplo, com estruturas humanas)). O scFv pode ser ligado a outros scFvs de modo a formar um multímero que é uma proteína de ligação multiespecífica, por exemplo, um dímero, um trímero ou um tetrâmero. Os scFvs biespecíficos são às vezes referidos como diacorpos, os scFvs triespecíficos como triacorpos e os scFvs tetraespecíficos como tetracorpos. Em outras modalidades, o scFv para uso de acordo com a invenção pode ser ligado a outras moléculas de scFv idênticas, assim, formando um multímero que é monoespecífico, mas multivalente, por exemplo, um dímero bivalente ou um trímero trivalente pode ser formado.

[0065] Os construtos sintéticos que podem ser usados incluem peptídeos de CDR. Esses são peptídeos sintéticos que compreendem determinantes de ligação a antígeno. Os miméticos de peptídeos também podem ser usados. Essas moléculas são geralmente anéis orgânicos conformacionalmente restritos que imitam a estrutura de uma alça de CDR e que incluem cadeias laterais interativas com antígeno.

[0066] Conforme observado acima, em modalidades particulares, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a presente invenção compreende CDRs que possuem as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 1, 7 ou 8 e 2 a 6. Conforme detalhado, esses são derivados ou modificados do anticorpo murino Mdx001. No entanto, um anticorpo ou fragmento do mesmo para uso de acordo com a presente invenção é, de preferência, humano ou humanizado.

[0067] O anticorpo ou fragmento de anticorpo para uso de acordo com a invenção pode ser um anticorpo quimérico humano/de camundongo ou, de preferência, pode ser humanizado. Este é particularmente o caso de anticorpos e fragmentos de anticorpos monoclonais. Anticorpos ou fragmentos de anticorpos humanizados ou quiméricos são desejáveis quando a molécula é para ser usada como um agente terapêutico humano. O tratamento terapêutico de seres humanos com anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) pode ser ineficaz por uma série de razões, por exemplo, uma meia-vida curta in vivo do anticorpo; funções efetoras fracas mediadas pela região constante de cadeia pesada estranha, devido ao baixo reconhecimento de regiões constantes de cadeia pesada não humana por receptores Fc em células efetoras imunes humanas; sensibilização do paciente ao anticorpo e (no contexto de anticorpos murinos) geração de uma resposta de anticorpo humano anticamundongo (HAMA); e neutralização do anticorpo de camundongo por HAMA levando à perda de eficácia terapêutica.

[0068] Um anticorpo quimérico é um anticorpo com regiões variáveis derivadas de uma espécie e regiões constantes derivadas de outra. Assim, um anticorpo ou fragmento de anticorpo para uso de acordo com a invenção pode ser um anticorpo quimérico ou fragmento de anticorpo quimérico, que compreende domínios variáveis murinos e domínios constantes humanos.

[0069] Conforme detalhado acima, o isotipo de um anticorpo é definido pela sequência de suas regiões constantes de cadeia pesada. O anticorpo quimérico para uso de acordo com a invenção pode ter as regiões constantes de qualquer isotipo de anticorpo humano e qualquer subclasse dentro de cada isotipo. Por exemplo, o anticorpo quimérico pode ter as regiões Fc de um anticorpo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM (isto é, o anticorpo quimérico pode compreender os domínios constantes de cadeias pesadas α, δ, ε, γ ou μ, respectivamente), embora, de preferência, o anticorpo para uso de acordo com a invenção seja do isotipo IgG. Assim, o anticorpo quimérico pode ser de qualquer isotipo. A cadeia leve do anticorpo quimérico pode ser uma cadeia leve κ ou λ, isto é, pode compreender a região constante de uma cadeia leve λ humana ou uma cadeia leve κ humana. Um fragmento de anticorpo quimérico é, correspondentemente, um fragmento de anticorpo que compreende domínios constantes (por exemplo, um fragmento Fab, Fab’ ou F(ab’)2). Os domínios constantes de um fragmento de anticorpo quimérico para uso de acordo com a invenção podem ser, conforme descrito acima, para um anticorpo monoclonal quimérico.

[0070] Os anticorpos quiméricos podem ser gerados com o uso de qualquer procedimento adequado, por exemplo, tecnologia de DNA recombinante, em que a sequência de DNA do domínio variável murino é fundida com a sequência de DNA do domínio (ou domínios) constante humano de modo a codificar um anticorpo quimérico. Um fragmento de anticorpo quimérico pode ser obtido com o uso de tecnologia de DNA recombinante para produzir uma sequência de DNA que codifica tal polipeptídeo, ou processando um anticorpo quimérico para uso de acordo com a invenção para produzir os fragmentos desejados, conforme descrito acima. Pode-se esperar que os anticorpos quiméricos superem os problemas de uma meia-vida curta in vivo e funções efetoras fracas associadas ao uso de um anticorpo estranho, por exemplo, murino, em terapia humana, e podem reduzir a probabilidade de sensibilização do paciente e de ocorrência de HAMA. No entanto, a sensibilização do paciente e HAMA ainda podem ocorrer quando um anticorpo quimérico for administrado a um paciente humano, devido à presença de sequências murinas nos domínios variáveis.

[0071] De preferência, o anticorpo ou fragmento de anticorpo para uso de acordo com a invenção é, portanto, totalmente humanizado. Um anticorpo humanizado é um anticorpo derivado de outra espécie, por exemplo, um camundongo, em que os domínios constantes das cadeias de anticorpos são substituídos por domínios constantes humanos, e as sequências de aminoácidos das regiões variáveis são modificadas para substituir as sequências estruturais estranhas (por exemplo, murinas) por sequências estruturais humanas, de modo que, de preferência, as únicas sequências não humanas no anticorpo sejam as sequências de CDR. Um anticorpo humanizado pode superar todos os problemas associados ao uso terapêutico de um anticorpo não humano em um ser humano, incluindo evitar ou minimizar a probabilidade de ocorrência de sensibilização do paciente e HAMA.

[0072] A humanização do anticorpo é geralmente executada por um processo conhecido como enxerto de CDR, embora qualquer outro procedimento da técnica possa ser usado. O enxerto de anticorpo é bem- descrito em Williams, D.G. et al., Antibody Engineering Vol. 1, editado por R. Kontermann and S. Dübel, Capítulo 21, páginas 319 a 339. Neste processo, um anticorpo quimérico, conforme descrito acima, é gerado primeiro. Assim, no contexto de humanização de um anticorpo, o domínio constante não humano é primeiramente substituído por um domínio constante humano, produzindo um anticorpo quimérico que compreende um domínio constante humano e um domínio variável não humano.

[0073] A humanização subsequente dos domínios variáveis estranhos, por exemplo, murinos, envolve a intercalação das CDRs murinas de cada cadeia de imunoglobulina nas FRs da região variável humana mais apropriada. Isso é feito alinhando-se os domínios variáveis murinos com bancos de dados de domínios variáveis humanos conhecidos (por exemplo, IMGT ou Kabat). As regiões de estrutura humana adequadas são identificadas a partir dos domínios variáveis mais bem alinhados, por exemplo, domínios com alta identidade de sequência entre as regiões de estrutura humana e murina, domínios que contêm CDRs do mesmo comprimento, domínios com as estruturas mais semelhantes (com base na modelagem de homologia), etc. As sequências de CDR murinas são, então, enxertadas nas principais sequências estruturais humanas nos locais apropriados com o uso de tecnologia de DNA recombinante e os anticorpos humanizados são, então, produzidos e testados quanto à ligação ao antígeno-alvo. O processo de humanização de anticorpo é conhecido e compreendido pelo indivíduo versado, que pode executar o procedimento sem instruções adicionais. Os serviços de humanização de anticorpos também são oferecidos por várias empresas comerciais, por exemplo, GenScript (EUA/China) ou MRC Technology (Reino Unido). Os fragmentos de anticorpos humanizados podem ser facilmente obtidos a partir de anticorpos humanizados, conforme descrito acima.

[0074] Alternativamente, anticorpos monoclonais totalmente humanos podem ser obtidos in vitro e sem imunização com o uso da tecnologia de exibição de fago, conforme descrito em Frenzel et al. (Transfus. Med. Hemother. 44(5): 312 a 318, 2017).

[0075] Assim, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo para uso de acordo com a invenção pode ser derivado de qualquer espécie, por exemplo, pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo murino. É preferível, no entanto, que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo seja um anticorpo ou fragmento de anticorpo quimérico, isto é, que apenas os domínios variáveis do anticorpo ou fragmento de anticorpo sejam não humanos e os domínios constantes sejam todos humanos. De forma ideal, o anticorpo ou fragmento de anticorpo para uso de acordo com a invenção é um anticorpo ou fragmento de anticorpo humano ou humanizado.

[0076] Versões humanizadas de Mdx001 foram desenvolvidas pelos inventores, conforme detalhado no documento WO 2018/146230. Os domínios variáveis de cadeia leve humanizados foram desenvolvidos com as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO: 9 (conhecida como a região variável L1M2) e SEQ ID NO: 10 (conhecida como a região variável L2M2), que contêm as CDRs, conforme descrito anteriormente. Em uma modalidade específica, o anticorpo ou fragmento do mesmo para uso de acordo com a invenção compreende uma região variável de cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% (de preferência, pelo menos 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com a mesma, e em que as sequências de CDR VLCDR1 a VLCDR3 têm pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 1, 7 ou 8 e 2 a 3, respectivamente.

[0077] Os domínios variáveis de cadeia pesada humanizados foram desenvolvidos com as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO: 11 (conhecida como a região variável de H4) e SEQ ID NO: 12 (conhecida como a região variável de H2). Em uma modalidade particular, o anticorpo ou fragmento do mesmo para uso de acordo com a invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% (de preferência, pelo menos 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com a mesma, e em que as sequências de CDR VHCDR1 a VHCDR3 têm pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 4 a 6, respectivamente.

[0078] Em uma modalidade particular, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção é um anticorpo monoclonal do isotipo IgG1 e compreende cadeias leves do subtipo κ. A cadeia leve L1M2 é do subtipo κ e tem a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 13. A cadeia pesada H4 tem a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14. Em uma modalidade específica, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção é o anticorpo L1M2H4 que compreende a cadeia leve L1M2 e a cadeia pesada H4. Assim, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção pode ser um anticorpo monoclonal que compreende ou consiste em: i) uma cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% (de preferência, pelo menos 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com a mesma, e em que as sequências de CDR VLCDR1 a VLCDR3 têm pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 1, 7 ou 8 e 2 a 3 respectivamente; e ii) uma cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 14, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% (de preferência, pelo menos 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com a mesma, e em que as sequências de CDR VHCDR1 a VHCDR3 têm pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 4 a 6, respectivamente.

[0079] De modo similar, a cadeia leve L2M2 é do subtipo κ e tem a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 15. A cadeia pesada de H2 tem a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade particular, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção é o anticorpo L2M2H2 que compreende a cadeia leve L2M2 e a cadeia pesada H2. Assim, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção pode ser um anticorpo monoclonal que compreende: i) uma cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% (de preferência, pelo menos 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com a mesma, e em que as sequências de CDR VLCDR1 a VLCDR3 têm pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 1, 7 ou 8 e 2 a 3, respectivamente; e ii) uma cadeia pesada que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 16, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% (de preferência, pelo menos 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com a mesma, e em que as sequências de CDR VHCDR1 a VHCDR3 têm pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 4 a 6, respectivamente.

[0080] Em uma modalidade alternativa, a cadeia leve L1M2 pode ser pareada com a cadeia pesada H2 e a cadeia leve L2M2 pode ser pareada com a cadeia pesada H4.

[0081] Como é do conhecimento da pessoa versada, as cadeias de anticorpos são produzidas na natureza com sequências-sinal. As sequências-sinal de anticorpos são sequências de aminoácidos localizadas nos

N-terminais das cadeias leve e pesada, N-terminal para as regiões variáveis. As sequências-sinal direcionam as cadeias de anticorpos para exportação a partir da célula em que são produzidas. Se produzidas em um sistema de expressão celular, as cadeias leve e pesada com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 13 a 16 podem ser codificadas com uma sequência-sinal. A sequência- sinal das cadeias leves L1M2 e L2M2 é estabelecida na SEQ ID NO: 20; a sequência-sinal das cadeias pesadas H2 e H4 é estabelecida na SEQ ID NO:

21. Se sintetizada com uma sequência-sinal, a cadeia de L1M2 pode, portanto, ser sintetizada com a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22; a cadeia de H4 pode ser sintetizada com a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 23; a cadeia de L2M2 pode ser sintetizada com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 24 e a cadeia de H2 pode ser sintetizada com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 25. As sequências de nucleotídeos que codificam tais sequências podem ser facilmente derivadas pela pessoa versada, mas exemplos de sequências de nucleotídeos adequadas que codificam as cadeias de anticorpos de SEQ ID NOs: 22 a 25, e podem ser usadas para a sua síntese, são estabelecidos em SEQ ID NOs: 26 a 29, respectivamente.

[0082] Conforme detalhado acima, a invenção fornece uma molécula de ligação específica (conforme descrito acima) para uso no tratamento de câncer em um sujeito. O uso no tratamento de qualquer câncer é coberto, incluindo o tratamento de câncer testicular, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer cervical, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de duto biliar, câncer de estômago, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer de pulmão, câncer de pâncreas, mesotelioma, linfoma, tumores cerebrais e neuroblastoma. Em um aspecto preferencial, o câncer de ovário é tratado. Em outro aspecto preferencial, o câncer de mama é tratado. Em uma modalidade preferencial, o câncer de mama expressa um ou mais dentre um receptor de estrogênio (ER), um receptor de progesterona (PR) e o receptor do fator de crescimento epidérmico humano HER2. Em outra modalidade, o câncer de mama é triplo negativo (isto é, ER-/PR-/HER2-). Em outro aspecto preferencial, o câncer colorretal é tratado. Em outro aspecto preferencial, o câncer de pâncreas é tratado. Em outro aspecto preferencial, o câncer de pulmão é tratado. Qualquer tipo de câncer pode ser tratado de acordo com a presente invenção, incluindo carcinoma (incluindo adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, carcinoma de células transicionais, etc.), sarcoma, leucemia e linfoma.

[0083] De acordo com a invenção, o câncer de qualquer estágio (ou grau) pode ser tratado, incluindo câncer de estágio I, estágio II, estágio III e estágio IV. Tanto o câncer metastático quanto o localizado (isto é, não metastático) podem ser tratados.

[0084] Em uma modalidade particular da invenção, o câncer expressa Anx-A1 (o que significa que as células no câncer expressam Anx-A1, por exemplo, na superfície das células). É simples para a pessoa versada determinar se um câncer expressa Anx-A1. A expressão de Anx-A1 pode ser analisada em uma amostra de biópsia de um câncer, por exemplo, no nível de proteína por análise imuno-histoquímica de uma amostra. Uma amostra pode ser imunocorada com o uso de um anticorpo anti-Anx-A1 (como os anticorpos descritos acima que podem ser usados de acordo com a invenção) para detectar a expressão de Anx-A1, seguindo os procedimentos padrão na técnica. Ao permeabilizar uma amostra (por exemplo, com o uso de um detergente, como é padrão na técnica), tanto Anx-A1 intracelular quanto extracelular podem ser detectados.

[0085] Alternativamente, a expressão de Anx-A1 pode ser analisada no nível de ácido nucleico, por exemplo, por PCR quantitativa (qPCR). O mRNA pode ser extraído a partir de uma amostra de tecido e transcrito reversamente em DNA com o uso de procedimentos padrão na técnica. Os níveis de expressão de Anx-A1 podem, então, ser determinados por amplificação quantitativa de uma sequência-alvo de Anx-A1. Procedimentos de qPCR adequados, por exemplo, TaqMan, são bem-conhecidos na técnica.

[0086] Em uma modalidade particular, o câncer superexpressa Anx-A1. Por “superexpressa Anx-A1” significa que o câncer expressa Anx-A1 em um nível mais alto do que o tecido saudável da mesma origem. Ou seja, as células cancerosas expressam Anx-A1 em um nível mais alto do que as células saudáveis (isto é, não cancerosas) da mesma origem. Por mesma origem entende-se o mesmo tecido. Por exemplo, um carcinoma de células epiteliais de ovário poderá ser considerado uma superexpressão de Anx- A1 se expressar Anx-A1 em um nível mais alto do que o tecido epitelial ovariano saudável. Se um tecido canceroso superexpressa Anx-A1, portanto, requer uma comparação quantitativa de expressão de Anx-A1 em pelo menos dois tecidos diferentes (o tecido canceroso e um tecido de controle saudável). Qualquer procedimento apropriado pode ser utilizado para executar esta comparação, embora qPCR possa ser o mais adequado. Seria simples para a pessoa versada determinar se um câncer superexpressa Anx-A1. Em uma modalidade particular, a diferença entre o nível de expressão de Anx-A1 no câncer que o superexpressa e no tecido saudável é estatisticamente significativa. Em outras modalidades, a expressão de Anx-A1 é aumentada em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% ou mais no tecido canceroso em relação ao tecido saudável correspondente.

[0087] Em outra modalidade da invenção, o câncer expressa Anx-A1 em sua superfície (isto é, Anx-A1 é expressa na superfície das células do câncer). Por expressão de Anx-A1 na superfície de células cancerosas, entende-se que as células expressam Anx-A1 e a Anx-A1 expressa é exportada e localizada na superfície celular. A expressão de superfície celular de Anx-A1 pode ser identificada por imuno-histoquímica, conforme descrito acima. Em particular, para analisar a expressão de superfície celular de Anx-A1, a análise imuno-histoquímica é executada sem permeabilização celular. Isso significa que o anticorpo usado para detectar a Anx-A1 no tecido é incapaz de entrar no interior das células e apenas a proteína extracelular (por exemplo, localizada na superfície) pode ser detectada. A Anx-A1 exportada geralmente se liga às superfícies celulares (em vez de ser liberada no plasma ou em qualquer outro espaço extracelular) e, portanto, qualquer Anx-A1 detectada por imuno- histoquímica de células não permeabilizadas pode ser considerada Anx-A1 localizada na superfície. No entanto, seguindo os protocolos padrão, o tecido pode ser lavado antes da coloração para remover o material extracelular solto, incluindo proteínas.

[0088] O câncer tratado pela presente invenção pode ser um câncer resistente a fármacos. Ou seja, o câncer pode ser resistente a um ou mais agentes quimioterapêuticos (fármacos quimioterápicos). A resistência a fármacos em câncer é revisada em Housman et al. (supra). Um câncer pode ser considerado resistente a um fármaco de quimioterapia se for capaz de tolerá-lo, isto é, se o fármaco for (ou se tornar) ineficaz contra o câncer. Conforme detalhado em Housman et al. (supra), os cânceres podem se tornar resistentes a fármacos por uma variedade de mecanismos diferentes, incluindo inativação ou metabolismo de fármacos (ou a prevenção de sua ativação metabólica), mutação ou alteração do alvo de fármaco e efluxo de fármaco por meio de transportadores ABC. Métodos para identificar se um câncer é resistente a fármacos são conhecidos na técnica, consultar, por exemplo, os ensinamentos de Wang et al. (Genes & Diseases 2: 219 a 221, 2015) e Volm & Efferth (Front. Oncol. 5: 282, 2015), ambos incorporados ao presente documento a título de referência. Tais métodos incluem o teste do efeito de um fármaco em uma população de células ex vivo e a triagem genética de células cancerosas para marcadores de suscetibilidade/resistência.

[0089] Em uma modalidade particular, o câncer tratado pela presente invenção é multirresistente (MDR). Por câncer MDR entende-se um câncer que é resistente a mais de um fármaco quimioterápico, em particular, a mais de uma família de fármaco quimioterápico. O câncer MDR pode ser resistente a 2, 3, 4 ou 5 ou mais fármacos quimioterápicos diferentes ou famílias (ou classes) de fármacos quimioterápicos. O termo “câncer MDR” é bem-conhecido na técnica e é usado no presente contexto de acordo com seu significado na técnica. O câncer MDR pode ser resistente a todos os fármacos quimioterápicos conhecidos. A resistência a múltiplos fármacos pode ser mediada pela expressão de uma ou mais dentre proteína 1 de resistência a múltiplos fármacos (MDR1), proteína 1 associada à resistência a múltiplos fármacos (MRP1) e proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP) de transportadores ABC. Todas as três têm ampla especificidade de substrato e são capazes de expelir agentes quimioterápicos de múltiplas classes diferentes das células que os expressam.

[0090] As moléculas de ligação específica para uso de acordo com a presente invenção são mostradas nos Exemplos como sendo particularmente eficazes na inibição da proliferação de células cancerosas que são resistentes à quimioterapia à base de platina. Em uma modalidade particular, o câncer tratado de acordo com a presente invenção é resistente a agentes quimioterapêuticos à base de platina. (De preferência, o câncer, neste caso, é um câncer de mama, câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de pulmão ou câncer de pâncreas). Os agentes quimioterápicos à base de platina incluem cisplatina, oxaliplatina, carboplatina e nedaplatina, todas as quais foram aprovadas para uso em seres humanos. Outros agentes quimioterapêuticos à base de platina conhecidos incluem satraplatina, picoplatina, fenantriplatina e tetranitrato de triplatina. O câncer tratado de acordo com a presente invenção pode ser resistente a qualquer um ou todos esses agentes. Em uma modalidade particular, o câncer é resistente à cisplatina.

[0091] As células cancerosas podem adicionalmente ou alternativamente ser resistentes a outros agentes alquilantes bifuncionais, incluindo mostardas nitrogenadas (por exemplo, bendamustina, clorambucila, ciclofosfamida, ifosfamida, mecloretamina e melfalano).

[0092] Em uma modalidade alternativa ou adicional, o câncer tratado de acordo com a presente invenção pode ser resistente a agentes quimioterapêuticos, tais como taxanos (tais como paclitaxel e docetaxel), inibidores de topoisomerase (tal como topotecano), antraciclinas (tais como doxorrubicina e epirrubicina) e análogos de nucleosídeo (tal como a gencitabina). De preferência, o agente quimioterapêutico nesta modalidade é uma antraciclina, por exemplo, doxorrubicina (também conhecida como adriamicina). Em outra modalidade, o câncer tratado de acordo com a presente invenção é resistente a produtos terapêuticos hormonais (por exemplo, produtos terapêuticos hormonais antiestrogênio, tal como tamoxifeno). O câncer de mama pode, em particular, ser resistente a produtos terapêuticos hormonais, tal como tamoxifeno. O câncer tratado de acordo com a presente invenção pode ser resistente a qualquer um ou todos esses agentes. (De preferência, o câncer, neste caso, é um câncer de mama, câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de pulmão ou câncer de pâncreas). Em uma modalidade particular, o câncer é resistente à doxorrubicina (opcionalmente, em adição à resistência a um agente quimioterapêutico à base de platina).

[0093] As células cancerosas podem adquirir resistência ao agente quimioterápico à base de platina por uma série de mecanismos, conforme discutido acima. Por exemplo, a produção de metalotioneínas e/ou glutationa pelo câncer pode levar à inativação de agentes à base de platina, enquanto o dano ao DNA induzido por tais agentes pode ser reparado por vias ativas de reparo por excisão de nucleotídeo e recombinação homóloga, revertendo assim a ação do agente à base de platina. Outros mecanismos também podem desempenhar um papel, e vários mecanismos não redundantes podem ser necessários para tornar uma célula resistente à terapia à base de platina. Os pacientes identificados como resistentes à platina apresentam progressão do tumor dentro de 6 meses de seu último tratamento de quimioterapia à base de platina. As células podem ser identificadas como resistentes à platina pelo uso do ensaio clonogênico para testar a sobrevivência celular reprodutiva após a exposição ao fármaco. Isso identifica se as células cancerosas são capazes de formar tumores ou colônias após a exposição ao fármaco.

[0094] A molécula de ligação específica pode ser administrada ao sujeito a ser tratado na forma de uma composição farmacêutica. Tal composição pode conter um ou mais diluentes, carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. “Farmaceuticamente aceitável”, conforme usado no presente documento, se refere a ingredientes que são compatíveis com outros ingredientes das composições, bem como fisiologicamente aceitáveis para o destinatário. A natureza da composição e carreadores ou materiais excipientes, dosagens etc. podem ser selecionados de maneira rotineira de acordo com a escolha da via de administração desejada, etc. As dosagens também podem ser determinadas de maneira rotineira e podem depender da natureza da molécula, idade do paciente, modo de administração, etc.

[0095] A composição farmacêutica pode ser preparada para administração a um sujeito por qualquer meio adequado. Tal administração pode ser, por exemplo, oral, retal, nasal, tópica, vaginal ou parenteral. Administração oral, conforme usado no presente documento, inclui a administração bucal e sublingual. A administração tópica, conforme usado no presente documento, inclui a administração transdérmica. A administração parenteral, conforme definido no presente documento, inclui a administração subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal e intradérmica.

[0096] As composições farmacêuticas, conforme divulgado no presente documento, incluem soluções líquidas ou xaropes, composições sólidas, tais como pós, grânulos, comprimidos ou cápsulas, cremes, pomadas e qualquer outro estilo de composição comumente usado na técnica. Diluentes, carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados para uso em tais composições são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, excipientes adequados incluem lactose, amido de milho ou derivados do mesmo, ácido esteárico ou sais do mesmo, óleos vegetais, ceras, gorduras e polióis. Os carreadores ou diluentes adequados incluem carboximetilcelulose (CMC), metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), dextrose, trealose, lipossomas, álcool polivinílico, amido de grau farmacêutico,

manitol, lactose, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, magnésio, sacarose (e outros açúcares de carbono), gelatina, óleo, álcool, detergentes e emulsificantes, tais como os polissorbatos. Também podem ser usados agentes estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, edulcorantes, etc.

[0097] As composições farmacêuticas líquidas, sejam soluções, suspensões ou outra forma semelhante, podem incluir um ou mais dos seguintes: diluentes estéreis, tal como água para injeção, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, tais como mono- ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tal como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes, tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tal como EDTA; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajuste de tonicidade, tal como dextrose. Uma preparação parenteral pode ser acondicionada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses produzidos a partir de vidro ou plástico. Uma composição farmacêutica injetável é, de preferência, estéril.

[0098] As composições farmacêuticas para uso de acordo com a presente invenção podem ser administradas de qualquer maneira apropriada. A quantidade e a frequência de administração serão determinadas por fatores, tais como a condição do paciente e o tipo e gravidade da doença do paciente, embora as dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos. Convenientemente, uma molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção pode ser fornecida a um sujeito em uma dose diária, semanal ou mensal, ou uma dose em uma frequência intermediária, por exemplo, uma dose pode ser fornecida a cada 2, 3, 4, 5 ou 6 dias, a cada 2, 3, 4, 5 ou 6 semanas, a cada 2, 3, 4, 5 ou 6 meses, anualmente ou semestralmente. A dose pode ser fornecida na quantidade de 10 ng/kg a 100 mg/kg, por exemplo, 1 μg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo, de 10 μg/kg a 1 mg/kg. O clínico versado será capaz de calcular uma dose apropriada para um paciente com base em todos os fatores relevantes, por exemplo, idade, altura, peso e condição a ser tratada.

[0099] De preferência, a molécula de ligação específica ou composição farmacêutica para uso de acordo com a invenção é administrada ao sujeito em necessidade da mesma em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Por “quantidade terapeuticamente eficaz” entende-se uma quantidade suficiente para mostrar benefício para a condição do sujeito. A possibilidade de uma quantidade ser suficiente para mostrar benefício para a condição do sujeito poderá ser determinada pelo médico/veterinário.

[0100] O tratamento pode compreender ainda a administração de um segundo agente terapêutico ao sujeito. No entanto, convenientemente, nos usos de acordo com a invenção, a molécula de ligação específica é a única molécula terapêutica usada no tratamento, por exemplo, o tratamento não é realizado em conjunto com outros agentes citotóxicos ou imunoterapêuticos. Os agentes citotóxicos são conforme descrito a seguir. Os agentes imunoterapêuticos são agentes administrados que atuam para induzir, aumentar ou suprimir uma resposta imunológica.

[0101] Em uma modalidade particular, a molécula de ligação específica para uso de acordo com a presente invenção não é usada para entregar uma segunda molécula terapêutica a um câncer-alvo. Por exemplo, em uma modalidade particular, a molécula de ligação específica não está conjugada a (e não fornece um parceiro de ligação para) uma segunda molécula terapêutica, tal como uma molécula citotóxica ou um radionuclídeo.

[0102] Quando usado, o segundo agente terapêutico pode ser administrado dentro da mesma composição farmacêutica que a molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1, ou dentro de uma composição farmacêutica separada, que pode ser conforme descrito acima. (Assim, em usos em que um medicamento é produzido, o medicamento pode conter a molécula de ligação específica (ou um segundo agente terapêutico) e o dito tratamento pode compreender a administração separada, sequencial ou simultânea do segundo agente terapêutico (ou molécula de ligação específica) com o medicamento). A molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1 e o segundo agente terapêutico podem ser administrados ao sujeito separadamente, simultaneamente ou sequencialmente. A administração “separada”, conforme usado no presente documento, significa que a molécula de ligação específica e o segundo agente terapêutico são administrados ao sujeito ao mesmo tempo, ou pelo menos substancialmente ao mesmo tempo, mas por diferentes vias de administração. A administração “simultânea”, conforme usado no presente documento, significa que a molécula de ligação específica e o segundo agente terapêutico são administrados ao sujeito ao mesmo tempo, ou pelo menos substancialmente ao mesmo tempo, pela mesma via de administração. Por administração “sequencial”, conforme usado no presente documento, entende- se que a molécula de ligação específica e o segundo agente terapêutico são administrados ao sujeito em momentos diferentes. Em particular, a administração do primeiro agente terapêutico é completada antes do início da administração do segundo agente terapêutico. A administração sequencial pode ser executada em que o primeiro e o segundo agentes terapêuticos são administrados com 10 minutos a 30 dias de intervalo, por exemplo, de 1 hora a 96 horas (ou 2 semanas). Quando administrados a um sujeito sequencialmente, o primeiro e o segundo agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via de administração ou por vias de administração diferentes.

[0103] O segundo agente terapêutico pode ser um segundo agente anticâncer, embora em outras modalidades possa ter uma atividade diferente, por exemplo, pode ser um agente antibacteriano ou antifúngico, ou qualquer outro agente útil no tratamento do paciente. Em uma modalidade particular, o segundo agente terapêutico é um agente quimioterapêutico, em particular, um agente citotóxico. Conforme referido no presente documento, um agente quimioterapêutico é um fármaco administrado que é destrutivo para as células e tecidos malignos. Um agente citotóxico é uma substância que destrói células ou impede sua multiplicação. Qualquer agente de quimioterapia de qualquer classe pode ser usado, por exemplo, taxanos (tais como paclitaxel e docetaxel), inibidores de topoisomerase (tal como topotecano), antraciclinas (tais como doxorrubicina e epirrubicina), análogos de nucleosídeos (tal como gemcitabina), agentes à base de platina (tais como cisplatina e carboplatina), agentes alquilantes (tal como ciclofosfamida) e inibidores de quinase (tal como imatinibe) ou outros fármacos ou agentes quimioterapêuticos, conforme descrito no presente documento anteriormente.

[0104] Esses agentes podem ser usados em combinação com a molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção. Em um aspecto, o agente quimioterapêutico pode ser um agente ao qual o câncer é resistente (quando tratado sem a molécula de ligação específica para uso na invenção). Em alternativa, o agente quimioterapêutico não é um agente ao qual o câncer é resistente (quando tratado sem a molécula de ligação específica para uso na invenção).

[0105] A molécula de ligação específica para uso de acordo com a invenção também pode ser administrada ao sujeito em combinação com radioterapia e/ou cirurgia.

[0106] Conforme detalhado acima, a presente invenção se refere ao tratamento de câncer em um sujeito. O tratamento pode ser (ou pode ter a intenção de ser) curativo, mas pode ser alternativamente paliativo (isto é, projetado apenas para limitar, aliviar ou melhorar os sintomas do câncer, ou para estender a sobrevida). De preferência, o tamanho do tumor é reduzido pelo tratamento ou a sua taxa de crescimento é estabilizada ou diminuída. Uma redução de pelo menos 10%, de preferência, pelo menos 20, 30 ou 50% (por exemplo, até 30, 50, 75 ou 100%) no tamanho do tumor é preferencial e os mesmos níveis de diminuição de crescimento são preferenciais.

[0107] O sujeito tratado pela invenção pode ser qualquer mamífero, por exemplo, um animal de fazenda, tal como uma vaca, cavalo, ovelha, porco ou cabra, um animal de estimação, tal como um coelho,

gato ou cachorro, ou um primata, tal como um macaco, chimpanzé, gorila ou ser humano. Com a máxima preferência, o sujeito é um ser humano. O sujeito pode ser qualquer animal (de preferência, ser humano) que sofre de câncer ou está com suspeita de sofrer de câncer. Assim, o sujeito é um indivíduo que necessita de tratamento para o câncer.

[0108] A presente invenção pode, portanto, ser considerada fornecer um método de tratamento de câncer em um sujeito, que compreende administrar ao dito sujeito uma molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1 humana. O tratamento, câncer, sujeito e/ou molécula de ligação específica podem ser conforme definido acima.

[0109] De modo similar, a presente invenção pode ser considerada fornecer o uso de uma molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1 humana na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em um sujeito. O tratamento, câncer, sujeito e/ou molécula de ligação específica podem ser conforme definido acima.

[0110] Em outro aspecto, a invenção fornece um kit que compreende uma molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1 humana, conforme definido acima, e um agente quimioterapêutico. Os agentes quimioterapêuticos adequados são descritos acima. A molécula de ligação específica e o agente quimioterapêutico podem ser fornecidos em recipientes separados, isto é, em composições separadas, ou em uma única composição em um único recipiente. Cada agente terapêutico pode ser fornecido em qualquer forma apropriada, por exemplo, em uma solução aquosa ou como um liofilizado.

[0111] Em outro aspecto, a invenção fornece um produto que compreende uma molécula de ligação específica que se liga à Anx- A1 humana, conforme definido acima, e um segundo agente terapêutico para uso separado, simultâneo ou sequencial no tratamento de câncer em um sujeito. O segundo agente terapêutico, câncer e/ou sujeito podem ser conforme definido acima. Em uma modalidade particular, o segundo agente terapêutico é um agente quimioterapêutico. A molécula de ligação específica e o segundo agente terapêutico podem ser fornecidos em recipientes separados, isto é, em composições separadas, ou em uma única composição em um único recipiente. Cada agente terapêutico pode ser fornecido em qualquer forma apropriada, por exemplo, em uma solução aquosa ou como um liofilizado.

[0112] Todos os documentos citados no presente pedido são totalmente incorporados ao presente documento a título de referência.

[0113] A invenção pode ser mais bem entendida com referência às figuras e exemplos não limitantes abaixo.

[0114] A Figura 1 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 L1M2H4 e L2M2H2 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de mama MCF7. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0115] A Figura 2 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 L1M2H4 e L2M2H2 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de mama HCC1806. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0116] A Figura 3 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 L1M2H4 e L2M2H2 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de ovário A2780. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0117] A Figura 4 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 L1M2H4 e L2M2H2 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de ovário A2780cis. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0118] A Figura 5 mostra o efeito do anticorpo L2M2H2 anti-Anx-A1 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de ovário A2780ADR. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0119] A Figura 6 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 L1M2H4 e L2M2H2 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de pâncreas MIA PaCa-2. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0120] A Figura 7 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 L1M2H4 e L2M2H2 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de pâncreas BxPC-3. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0121] A Figura 8 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 MDX-124 e ab65844 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de mama HCC1806. O impacto de um IgG de controle não específico também é mostrado. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0122] A Figura 9 mostra o efeito do anticorpo anti- Anx-A1 MDX-124 e um IgG de controle não específico sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de mama MCF7. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0123] A Figura 10 mostra o efeito do anticorpo anti- Anx-A1 MDX-124 e um IgG de controle não específico sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de mama resistente a tamoxifeno MCF-7/TAMR7. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0124] A Figura 11 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 MDX-124 e ab65844 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de ovário A2780. O impacto de um IgG de controle não específico também é mostrado. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0125] A Figura 12 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 MDX-124 e ab65844 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer colorretal HCT116. O impacto de um IgG de controle não específico também é mostrado. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0126] A Figura 13 mostra o efeito do anticorpo anti- Anx-A1 MDX-124 e um IgG de controle não específico sobre a proliferação da linhagem celular de câncer colorretal Caco-2. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0127] A Figura 14 mostra o efeito do anticorpo anti- Anx-A1 MDX-124 e um IgG de controle não específico sobre a proliferação da linhagem celular de câncer colorretal SW480. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0128] A Figura 15 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 MDX-124 e ab65844 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de pâncreas BxPC-3. O impacto de um IgG de controle não específico também é mostrado. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0129] A Figura 16 mostra o efeito do anticorpo anti- Anx-A1 MDX-124 e um IgG de controle não específico sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de pâncreas MIA PaCa-2. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0130] A Figura 17 mostra o efeito do anticorpo anti- Anx-A1 MDX-124 e um IgG de controle não específico sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de pâncreas PANC-1. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0131] A Figura 18 mostra o efeito dos anticorpos anti-Anx-A1 MDX-124 e ab65844 sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de pulmão COR-L23. O impacto de um IgG de controle não específico também é mostrado. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0132] A Figura 19 mostra o efeito do anticorpo anti- Anx-A1 MDX-124 e um IgG de controle não específico sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de pulmão resistente à adriamicina COR-L23.5010. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0133] A Figura 20 mostra os resultados do tratamento com MDX-124 em um modelo de camundongo de câncer de mama. A figura mostra os volumes médios do tumor para os quatro grupos de tratamento. O Grupo 1 é o grupo de controle, administrado com doses apenas de veículo (PBS). O Grupo 2 recebeu doses de 1 mg/kg de MDX-124, o Grupo 3 foi administrado com doses de 10 mg/kg de MDX-124 e o Grupo 4 foi administrado com doses de 25 mg/kg de MDX-124. As barras de erro indicam o erro padrão da média.

[0134] A Figura 21 mostra os resultados do tratamento com MDX-124 em um modelo de camundongo de câncer de mama. A figura mostra os volumes médios relativos de tumor para os quatro grupos de tratamento. O Grupo 1 é o grupo de controle, administrado com doses apenas de veículo (PBS). O Grupo 2 foi administrado com doses de 1 mg/kg de MDX-124, o Grupo 3 foi administrado com doses de 10 mg/kg de MDX-124 e o Grupo 4 foi administrado com doses de 25 mg/kg de MDX-124. O volume de tumor no dia 12, o dia da primeira dose de tratamento, é definido como o volume de tumor de linha de base, isto é, um volume de tumor relativo de 100%. Os volumes de tumor relativos apresentados, portanto, correspondem ao volume de cada tumor como uma porcentagem de seu volume no dia 12.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 - EFEITO DE ANTICORPOS SOBRE A

PROLIFERAÇÃO CELULAR MATERIAIS

[0135] As linhagens celulares MCF7, MCF- 7/TAMR7, A2780, A2780cis, A2780ADR, HCT116, Caco-2, SW480, COR-L23, COR-L23.5010, MIA-PaCa-2, PANC-1 e BxPC-3 foram obtidas a partir das Coleções de Cultura de Saúde Pública da Inglaterra. A linhagem celular HCC1806 foi obtida junto à ATCC. MCF7 é uma linhagem celular de adenocarcinoma de mama humano positiva para o receptor de estrogênio e receptor de progesterona; MCF-7/TAMR7 é um derivado de MCF7 resistente a tamoxifeno; HCC1806 é uma linhagem celular de câncer de mama humano triplo-negativo; A2780 é uma linhagem celular de carcinoma de ovário humano; A2780cis é uma linhagem celular de carcinoma de ovário humano resistente à cisplatina (derivada de A2780); A2780ADR é uma linhagem celular de carcinoma de ovário humano resistente à adriamicina (derivada de A2780); MIA PaCa-2 é uma linhagem celular de carcinoma pancreático humano; BxPC-3 é uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano; PANC-1 é uma linhagem celular de carcinoma epitelioide de pâncreas humano; Caco-2 é uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano; HCT116 é uma linhagem celular de carcinoma colorretal humano; SW480 é uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano; COR-L23 é uma linhagem celular de carcinoma de células grandes de pulmão humano; COR-L23.5010 é um derivado resistente à adriamicina de COR-L23.

[0136] Os anticorpos anti-Anx-A1 L1M2H4 e L2M2H2 são divulgados no documento WO 2018/146230 com as sequências descritas no presente documento. O anticorpo L1M2H4 tem uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 13 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 14; o anticorpo L2M2H2 tem uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 15 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 16.

[0137] O anticorpo anti-Anx-A1 ab65844 foi obtido junto à Abcam (Reino Unido). O anticorpo é um anticorpo policlonal de coelho que se liga aos aminoácidos 3 a 24 de Anx-A1 humana (SEQ ID NO: 30). Esta sequência de epítopo faz parte da região de N-terminal de Anx-A1 que, na ausência de Ca2+, se liga a uma bolsa no núcleo de Anx-A1, discutido acima.

MÉTODOS CULTURA DE CÉLULAS

[0138] Nos ensaios de proliferação iniciais, as células foram cultivadas nos seguintes meios: DMEM + Glutamax, 10% de FBS + pen/strep (MCF7, MIA PaCa-2, HCC1806), RPMI 1640 + 2mM de L-glu, 10% de FBS + pen/strep (BxPc-3, A2780). A2780cis e A2780ADR foram cultivados no mesmo meio de crescimento que A2780, mas incluíram o respectivo fármaco em vários estágios de cultura para manter a resistência ao fármaco (isto é, cisplatina para A2780cis e adriamicina para A2780ADR).

[0139] Nos ensaios de proliferação adicionais, as células foram cultivadas nos seguintes meios sob as seguintes condições:

[0140] MCF7, HCC1806, MIA PaCa-2 e PANC-1 em DMEM contendo 10% de FBS, 1% de pen/strep e 1% de L-glutamina;

[0141] MCF7/TAMR7 em DMEM/F12 livre de vermelho de fenol contendo 1% de FBS, 1% de pen/strep, 1% de L-glutamina e 1% de insulina;

[0142] A2780, COR-L23, COR-L23.5010 e BxPC-3 em RPMI contendo 10% de FBS, 1% de pen/strep e 1% de L-glutamina;

[0143] HCT116 em McCoy's 5A contendo 10% de FBS, 1% de pen/strep e 1% de L-glutamina;

[0144] SW480 em L-15 contendo 10% de FBS, 1% de pen/strep e 1% de L-glutamina;

[0145] Caco-2 em MEM contendo 10% de FBS, 1% de pen/strep, 1% de L-glutamina e 1% de solução de aminoácidos não essenciais.

[0146] Além disso, COR-L23.5010 foi cultivado na presença de adriamicina, para manter a resistência ao fármaco. Todas as linhagens celulares foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera que contém 5% de CO2.

ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR

[0147] A proliferação celular foi medida com o uso do ensaio colorimétrico MTT para medir a atividade metabólica celular. No ensaio, as enzimas oxidorredutase celular dependentes de NADPH reduzem o corante de tetrazólio amarelo, MTT, a um produto de formazan roxo insolúvel, quantificado pela medição de absorbância em 500 a 600 nm com o uso de um espectrofotômetro. A quantidade de formazan é proporcional ao nível de proliferação celular com células em divisão rápida, reduzindo um nível mais alto de MTT. Os ensaios foram executados em triplicado. As células foram semeadas em um volume final de 100 µL.

[0148] Nos ensaios de proliferação iniciais, as células foram semeadas nas seguintes densidades: 1 x 105/ml (MCF7, MIA PaCa-2 e n = 2 de A2780cis), 2 x 105/ml (A2780, A2780ADR e n = 1 de A2780cis), 5 x 104/ml (HCC1806) e 2,5 x 104/ml (BxPC-3).

[0149] Nos ensaios de proliferação adicionais, as células foram semeadas nas seguintes densidades:

[0150] MCF7, HCC1806, A2780, A2780ADR, A2780cis, CR-L23 e HCT116 a 5 x 103 células por poço;

[0151] MCF7/TAMR7, COR-L23.5010, SW480, Caco-2, MIA PaCa-2, BxPC-3 e PANC-1 a 1 x 104 por poço.

[0152] As células foram, então, cultivadas por 24 horas antes do ensaio, então, a proliferação celular foi medida. A proliferação celular foi medida seguindo um dos seguintes protocolos: (a) cultura de 48 horas na ausência de anticorpo (como controle), com 1 μM de anticorpo (L1M2H4 ou L2M2H2) ou 10 μM de anticorpo (L1M2H4 ou L2M2H2). Os ensaios de MTT foram executados nas várias linhagens de células cancerosas em até três ocasiões separadas (ensaios de proliferação iniciais); ou (b) cultura de 72 horas na ausência de anticorpo ou na presença de anticorpo a uma concentração de 2,5, 5, 7,5 ou 10 μM. Os anticorpos usados neste protocolo foram L1M2H4 (também referido aqui como MDX-124), o anticorpo anti-Anx-A1 comercialmente disponível ab65844, e um IgG não específico para Anx-A1 como controle de isotipo (Thermo Fisher Scientific, EUA, número de catálogo 31154) (ensaios de proliferação adicionais).

[0153] O número de células da cultura de controle foi definido como a contagem de linha de base para o ensaio de proliferação. As contagens de células para culturas nas quais um anticorpo estava presente foram normalizadas para a linha de base e apresentadas como uma porcentagem do valor da linha de base (referido como “viabilidade”). A análise estatística de resultados de ensaio de proliferação celular foi realizada com o uso do teste U de Mann-Whitney.

ELISA

[0154] O ELISA foi realizado pela The Antibody Company (Reino Unido) com o uso de procedimentos padrão de ELISA. As placas de ELISA foram revestidas com 25 μg/ml de peptídeo de N-terminal de Anx-A1 ou Anx-A1 de comprimento total (correspondendo aos aminoácidos 2 a 26 de Anx-A1, SEQ ID NO: 31) e tampão de revestimento (45 mM de Na2CO3, pH 9,6 suplementado com 1 mM de CaCl2) por 17 horas a 4 °C. As placas foram, então, bloqueadas durante 1,5 hora à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (1 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES, 2% de p/v de BSA).

[0155] Anticorpo primário (ab65844) foi, então, aplicado às placas. O anticorpo foi aplicado em duplicado em diluições de quatro vezes feitas através da placa, começando em uma concentração de 1 μg/ml e terminando em uma concentração de 2,38 x 10-7 μg/ml. O anticorpo foi diluído em tampão de lavagem (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,05% (v/v) de TWEEN-20 e 1 mM de CaCl2) suplementado com BSA a 0,1. O anticorpo primário foi aplicado à placa durante 1 hora à temperatura ambiente e a placa foi, então, lavada com tampão de lavagem.

[0156] O anticorpo de detecção foi, então, aplicado. Para a detecção, foi usado um anticorpo anticoelho de cabra conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (Merck KGaA, Alemanha; número de catálogo AP156P) a uma diluição de 1:3.000. Isto foi aplicado à placa de ELISA durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa de ELISA foi, então, lavada novamente com tampão de lavagem.

[0157] O substrato colorimétrico OPD (dicloridrato de o-fenilenodiamina, Sigma-Aldrich P4664) foi, em seguida, aplicado à placa. A solução de OPD foi preparada de acordo com as instruções do fabricante para gerar uma solução de OPD de 0,4 mg/ml em tampão fosfato-citrato, pH 5. 40 μl de 30% de H2O2 foram adicionados por 100 ml de solução de OPD imediatamente antes do uso. 100 μl da solução de OPD resultante foram, então, adicionados a cada poço da placa.

[0158] A placa foi incubada por 20 minutos no escuro à temperatura ambiente, após o que 50 μl de H2SO4 a 3 M foram adicionados para interromper a reação. Imediatamente após a adição de H2SO4 as absorbâncias da placa foram lidas a 492 nm.

RESULTADOS

[0159] O anticorpo anti-Anx-A1 adquirido comercialmente ab65844 foi testado por ELISA para confirmar a ligação ao seu epítopo relatado. O ensaio demonstrou que o anticorpo ab65844 se liga à Anx-A1 de comprimento total e a um peptídeo de Anx-A1 de N-terminal (dados não mostrados), indicando que o epítopo relatado dos aminoácidos 3 a 24 de Anx-A1 humana (SEQ ID NO: 30) está correto.

ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO INICIAL

[0160] Os primeiros ensaios de proliferação realizados mediram a proliferação ao longo de 48 horas e compararam o efeito dos dois anticorpos L1M2H4 e L2M2H2 sobre as linhagens celulares de interesse, em relação à incubação sem qualquer anticorpo (isto é, com o uso do protocolo (a) conforme descrito acima).

[0161] Os resultados desses ensaios de proliferação com as linhagens celulares de câncer de mama são mostrados nas Figuras 1 e

2. Conforme mostrado, o anticorpo L1M2H4 teve um efeito estatisticamente significativo (p < 0,001) a 10 μM, reduzindo a proliferação das células MCF7, embora isso tenha sido apenas n = 1. Na linhagem celular HCC1806, o anticorpo L2M2H2 também mostrou uma diminuição estatisticamente significativa na proliferação (p < 0,05) a 10 μM (n = 2).

[0162] Os resultados do ensaio de proliferação com a linhagem celular de câncer de ovário, A2780, são mostrados na Figura 3. Conforme mostrado, uma redução estatisticamente significativa na proliferação foi observada após a incubação com o anticorpo L1M2H4 a 10 μM, p < 0,01) (n

= 2). Na linhagem celular de câncer de ovário resistente à cisplatina, A2780cis (Figura 4), uma redução estatisticamente significativa na proliferação foi observada após a incubação com o anticorpo L1M2H4 a 1 μM (p < 0,001) e 10 μM (p < 0,01) (n = 2) com uma diminuição estatisticamente significativa na proliferação observada com o anticorpo L2M2H2 a 10 μM (p < 0,05) (n = 3). Os resultados dos ensaios de proliferação com a linhagem celular de câncer de ovário resistente à adriamicina, A2780ADR, são mostrados na Figura 5. O anticorpo L2M2H2 teve um efeito significativo sobre a proliferação dessas células.

[0163] Os resultados dos ensaios de proliferação com as linhagens celulares de câncer de pâncreas são mostrados nas Figuras 6 e 7.

ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO ADICIONAIS

[0164] Os ensaios de proliferação foram repetidos, medindo a proliferação ao longo de 72 horas. Esses ensaios compararam o efeito de um anticorpo da invenção (L1M2H4, também conhecido como MDX- 124) com o efeito sobre a proliferação de um IgG de controle não específico e, quando indicado, o anticorpo anti-Anx-A1 comercialmente disponível ab65844. A comparação com a proliferação na ausência de qualquer anticorpo também foi executada e usada como linha de base. Todos os experimentos foram executados em triplicado (para MDX-124 e o controle de IgG, e em que ab65844 também foi testado, os experimentos com esse anticorpo foram realizados em duplicado).

[0165] Constatou-se que o MDX-124 tem um efeito significativo sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de mama HCC1806, causando uma redução de quase dois terços (63%) na viabilidade em relação à linha de base (Figura 8). O controle de IgG não específico não teve efeito sobre a viabilidade. Em relação ao controle de IgG não específico, MDX- 124 causou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células HCC1806 em todas as concentrações testadas, com um valor de P < 0,001 (em uma concentração de anticorpo de 2,5 μM) ou < 0,0001 (em todas as outras concentrações de anticorpos). Notavelmente, o anticorpo policlonal anti-Anx-A1 ab65844 na verdade causou um aumento na viabilidade celular (e, portanto, proliferação). De fato, em todas as concentrações de anticorpos, constatou-se que MDX-124 causa uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células HCC1806 em relação a ab65844, com um valor de P < 0,01 (em uma concentração de anticorpo de 2,5 μM) ou < 0,001 (em todas as outras concentrações de anticorpos). Este resultado demonstra que MDX-124 inibe a proliferação de células HCC1806 (causando uma redução significativa em viabilidade). Este efeito, entretanto, não é observado para todos os anticorpos anti-Anx-A1, em que ab65844 tem o efeito oposto sobre a viabilidade celular.

[0166] O MDX-124 também apresentou efeitos significativos sobre a proliferação da linhagem celular de câncer de mama MCF7 e seu derivado resistente a tamoxifeno (Figuras 9 e 10, respectivamente). Em ambos os casos, o controle de IgG não específico reduz a proliferação em até 26%. Na sua concentração máxima, o MDX-124 causa uma redução significativa de 76% na viabilidade de células MCF7 e também uma redução significativa (embora inferior) de 47% na viabilidade de células MCF7 resistentes a tamoxifeno. Em relação ao IgG de controle não específico, MDX-124 causou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células MCF7 em todas as concentrações testadas com um valor de P < 0,0001. MDX-124 também causou reduções estatisticamente significativas na viabilidade de células MCD7/TAMR7, em relação ao IgG de controle não específico, em concentrações de 5 e 7,5 μM (P < 0,01) e 10 μM (P < 0,05). Esses resultados mostram que o MDX-124 é altamente eficaz na inibição da proliferação de células de câncer de mama, tanto de linhagens de células triplo-negativas quanto positivas para receptores hormonais. O anticorpo também é eficaz contra o câncer de mama resistente a fármacos. Este efeito é específico para MDX-124 e não é observado em todos os anticorpos anti-Anx-A1.

[0167] De modo similar, constatou-se que MDX-124 tem um efeito significativo sobre a proliferação da linha celular de câncer de ovário A2780 (Figura 11). Enquanto o IgG não específico reduz a proliferação em até 30% (na concentração máxima), o MDX-124 tem mais do que o dobro do efeito na proliferação (causando uma redução de 61% na proliferação na concentração máxima). Em relação ao IgG de controle não específico, constatou-se que o MDX-124 causa uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células A2780 em concentrações de 5 e 7,5 μM (P < 0,05) e 10 μM (P < 0,01). Novamente, isso não é visto para o anticorpo policlonal anti-Anx- A1 ab65844, que não causou impacto significativo sobre a proliferação. Para esse anticorpo, a proliferação ligeiramente aumentada foi observada em baixas concentrações deste anticorpo (até 5 μM), enquanto na concentração máxima uma pequena redução na proliferação de 5% foi observada. De fato, em concentrações de anticorpos de 5, 7,5 e 10 μM, o MDX-124 causou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células A2780 em relação a ab65844, com um valor de P < 0,001.

[0168] O MDX-124 também demonstrou ter um impacto substancial sobre a proliferação de células de câncer colorretal (Figuras 12 a 14). Os resultados sobre a proliferação da linhagem celular de HCT116 são mostrados na Figura 12. O MDX-124 diminui para menos que a metade a proliferação dessas células (reduzindo a proliferação em até 54% na concentração máxima). O IgG de controle não específico não tem impacto real sobre a proliferação e o anticorpo policlonal anti-Anx-A1 ab65844 teve impactos variáveis nas diferentes concentrações. Em relação ao IgG de controle não específico, MDX-124 causou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células HCT116 em todas as concentrações testadas com um valor de P < 0,001 (em concentrações de anticorpos de 2,5 e 7,5 μM) ou < 0,0001 (em concentrações de anticorpos de 5 e 10 μM). Embora os dados para ab65844 sejam ligeiramente inconsistentes, há uma tendência geral clara do anticorpo conduzindo novamente o aumento da proliferação das células cancerosas e, em relação a ab65844, MDX-124 causou reduções estatisticamente significativas na viabilidade de células HCT116 em concentrações de anticorpos de 2,5 μM (P < 0,01) e 5 e 10 μM (em ambas P < 0,001). Nenhum dado sugere que ab65844 causa uma redução na proliferação.

[0169] Os resultados utilizando as linhagens celulares Caco-2 (Figura 13) e SW480 (Figura 14) contam uma história similar, em que o MDX-124 causa uma redução significativa na proliferação, enquanto o IgG de controle não específico tem no máximo um impacto mínimo. Em relação ao IgG de controle não específico, MDX-124 causou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células Caco-2 em todas as concentrações testadas, com um valor de P < 0,05 (em concentrações de anticorpos de 2,5 e 5 μM) ou < 0,001 (em concentrações de anticorpos de 7,5 e 10 μM). Em relação ao IgG de controle não específico, MDX-124 causou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células SW480 em todas as concentrações testadas, com um valor de P < 0,01 (em uma concentração de anticorpo de 2,5 μM) ou < 0,0001 (em todas as outras concentrações de anticorpos testadas). Esses resultados demonstram que o MDX-124 é altamente eficaz na inibição da proliferação de células cancerosas colorretais. Novamente, esse efeito é específico para MDX-124, não sendo observado em todos os anticorpos anti-Anx-A1.

[0170] O impacto de MDX-124 em linhagens celulares de câncer de pâncreas é mostrado nas Figuras 15 a 17. O impacto de MDX-124 na linhagem celular BxPC-3 é mostrado na Figura 15. Mais uma vez, o MDX-124 tem um impacto significativo na proliferação celular, reduzindo a proliferação pela metade na concentração máxima. O IgG de controle não específico teve impacto mínimo na proliferação, enquanto novamente o anticorpo policlonal anti-Anx-A1 ab65844 levou a um aumento significativo em proliferação. Em relação ao IgG de controle não específico, MDX-124 causou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células BxPC-3 em todas as concentrações testadas, com um valor de P < 0,001 (em uma concentração de anticorpo de 2,5 μM) ou < 0,0001 (em todas as outras concentrações de anticorpos testadas). Em relação a ab65844, constatou-se que MDX-124 causa uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células BxPC-3 com um valor de P < 0,001 em todas as concentrações de anticorpos testadas.

[0171] O impacto de MDX-124 nas linhagens celulares MIA PaCa-2 e PANC-1 é mostrado nas Figuras 16 e 17, respectivamente. Em ambos os casos, o MDX-124 causa uma redução significativa na proliferação de quase metade, enquanto o IgG não específico causa reduções muito menores na viabilidade. Em relação ao IgG de controle não específico, MDX-124 causou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células MIA PaCa-2 em concentrações de anticorpos de 5 e 10 μM, com um valor de P < 0,05. Em relação ao IgG de controle não específico, MDX-124 causou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade de células PANC-1 em todas as concentrações de anticorpos, com um valor de P < 0,05 (em uma concentração de anticorpos de 2,5 μM) ou < 0,001 (em todas as outras concentrações de anticorpos testadas).

[0172] O impacto de MDX-124 nas linhagens celulares de câncer de pulmão COR-L23 e COR-L23.5010 é mostrado nas Figuras 18 e 19, respectivamente. Esses resultados mostram que o anticorpo de MDX-124 tem um efeito pequeno, mas negativo na proliferação, enquanto o IgG de controle não específico e o anticorpo policlonal anti-Anx-A1 ab65844 mostraram muito pouco efeito sobre a proliferação. Resultados similares foram obtidos com outras linhagens celulares de câncer de pulmão (dados não mostrados).

CONCLUSÕES

[0173] A exposição ao MDX-124 causa uma redução significativa na proliferação de linhagens celulares de câncer de mama (incluindo triplo negativo, receptor de hormônio positivo e linhagens celulares resistentes a fármacos), câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de pulmão e câncer de pâncreas.

[0174] O impacto de MDX-124 na proliferação de células cancerosas é específico para anticorpos, isto é, nem todos os anticorpos contra o mesmo alvo (Anx-A1) têm o mesmo impacto. Isso é demonstrado pelo fato de que o ab65844 falhou em reduzir significativamente a proliferação de qualquer uma das linhagens celulares contra as quais foi testado e, de fato, aumentou a proliferação na maioria dos casos. O IgG de controle não específico também não causou a redução significativa em proliferação observada com o uso de MDX-124. EXEMPLO 2 - DETERMINAÇÃO DE EPÍTOPO

[0175] A análise de HDX foi realizada no Natural and Medical Sciences Institute (NMI), University of Tübingen, Alemanha, com o uso do anticorpo L1M2H4.

PREPARAÇÃO E ANÁLISE DE AMOSTRAS FORMAÇÃO DE COMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO E TROCA DE HIDROGÊNIO-DEUTÉRIO

[0176] Cinco alíquotas de amostras de anticorpo- antígeno e cinco alíquotas de antígeno sem anticorpo foram preparadas da seguinte forma: 0,8 µl de Anx-A1 (41 µM), 1,8 µl de anticorpo (38,7 µM) ou tampão HEPES (10 mM de HEPES, 1 mM de CaCl2, 150 mM de NaCl, pH 7,4), respectivamente, 1 ml de tampão HEPES e 0,5 ml de CaCl2 (a 8 mM) foram misturados e incubados durante 10 minutos a 20 °C. Adicionou-se 8,5 µl de tampão HEPES para ajustar o teor de sal. O complexo anticorpo-antígeno foi liofilizado durante a noite a 0 °C e subsequentemente a 15 °C por 2 h para remover o máximo de água possível. As dez alíquotas liofilizadas foram congeladas a -20 °C até a troca de HDX e análise de LC-MS. Uma alíquota de cada um dentre complexo anticorpo-antígeno e antígeno sem anticorpo foi solubilizada em 12,5 µl de H2O, as outras em 12,5 µl de D2O. As alíquotas foram incubadas pelos seguintes tempos, em que cada alíquota foi preparada separadamente logo antes da análise:

[0177] 0 minuto (amostras de referência de H2O);

[0178] 5, 70, 360 minutos e 24 horas (amostras cinéticas de troca de deutério D2O).

[0179] A troca foi resfriada bruscamente pela adição de 12,5 µl de solução de resfriamento brusco preparada de modo fresco (cloridrato de guanidina a 0,8 M com TCEP a 0,4 M em 100 mM de tampão de formato de amônio, pH 2,5).

DIGESTÃO PEPTÍDICA

[0180] Imediatamente após a adição da solução de resfriamento brusco, 0,35 µl de pepsina (100 µM) foi adicionado e a digestão executada durante 2 minutos a 20 °C. As alíquotas foram colocadas imediatamente em frascos autoamostradores pré-resfriados a -20 °C e injetadas por meio de uma seringa de injeção pré-resfriada na LC-MS. LC-MS

[0181] A mistura de peptídeos obtida foi injetada e separada sem pré-tratamento com o uso de HPLC de fase reversa (RSLC3000 LC, Thermo Scientific Dionex, Idstein, Alemanha). Uma coluna de LC (ACQUITY UPLC BEH300 C18 1,7 μm 1 x 50 mm Thermo Scientific Dionex, Idstein, Alemanha) foi usada para a separação da amostra. Execuções sem carga e execuções de lavagem de coluna foram executadas em execuções de amostra consecutivas.

[0182] A separação cromatográfica foi obtida utilizando-se um gradiente quase isocrático por 31 minutos. O eluente A foi água com 0,1% de ácido fórmico e o eluente B foi acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico. Um gradiente linear otimizado de 20 minutos com declives variáveis foi aplicado a aproximadamente 0 °C da seguinte forma (minuto/% de B): 0/8, 3/8, 11,9/20, 31,9/20, 33/99, 34/99, 35/8. A injeção manual foi executada. A quantidade de injeção foi de 25,35 µl com o uso de um circuito de amostra de 20 µl de volume. A taxa de fluxo foi de 40 µl/min. O eluato de HPLC foi infundido diretamente em um espectrômetro de massa do tipo QTOF (MaXis HD, Bruker). O espectrômetro de massa operou em modo de íon positivo, a tensão de pulverização foi de 1,9 kV, a temperatura capilar foi de 275 °C e a tensão de RF de lente S foi de 55 V.

ANÁLISE DE DADOS

[0183] Os dados foram analisados por meio do software HDExaminer 2.40 beta 1 64 bit (Sierra Analytics, Modest, CA, EUA). Em suma, um conjunto de dados bruto que contém diferentes pontos de tempo de troca e para cada ponto de tempo a análise de Anx-A1 com e sem anticorpo foi examinada. Usando as informações da sequência de Anx-A1 e uma lista de sequência de peptídeos pépticos com tempos de retenção e carga correspondentes, o software identifica os peptídeos com e sem troca de deutério e calcula a captação de deutério por peptídeo como sendo a diferença entre a massa centroide do deuterado versus o peptídeo não deuterado. Ao usar as informações de peptídeo sobreposto (mudança de massa de peptídeos sobrepostos individuais), a região de epítopo foi ainda mais limitada manualmente.

RESULTADOS

[0184] Após a avaliação inicial dos dados com o uso do HDExaminer, os peptídeos pépticos individuais foram verificados manualmente quanto a uma absorção estatisticamente relevante de deutério. No caso de vários peptídeos sobrepostos, a região de epítopo foi ainda limitada com o uso de dados HDX sem captação de deutério cobrindo as partes de N-terminal e C-terminal do peptídeo com captação de deutério. Todo o experimento foi repetido duas vezes. No primeiro experimento identificado, uma região de epítopo potencial foi identificada, mas uma captação de deutério estatisticamente relevante também foi observada em um peptídeo muito longo que contém o N-terminal, que do ponto de vista estrutural é bastante flexível. No segundo experimento foi possível confirmar a região de epítopo, enquanto o N- terminal não apresentou captação de deutério.

[0185] As regiões sublinhadas na sequência indicam o epítopo ligado pelo anticorpo:

[0186] MAMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVKSSK

GGPGSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAA YLQETGKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDT LIEILASRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSED FGVNEDLADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYS KHDMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIR IMVSRSEIDMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN

[0187] As regiões de epítopo identificadas não estão na região de autointeração de Anx-A1, mas os peptídeos da região de autointeração mostram uma ligeira tendência a mais captação de deutério nas amostras do complexo anticorpo-antígeno, o que pode ser devido a ligeiras diferenças na concentração de Anx-A1 local quando duas moléculas de Anx-A1 estão ligadas aos dois braços do anticorpo. EXEMPLO 3 - ATIVIDADE ANTICÂNCER IN VIVO DE MDX-124

MÉTODOS ESTUDO DE TOLERABILIDADE

[0188] O estudo de tolerabilidade foi realizado pela Crown Bioscience (EUA). Os camundongos foram tratados uma vez por semana durante 2 semanas com MDX-124 a 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 29 mg/kg. O peso corporal de cada camundongo foi medido diariamente durante o estudo. Uma redução no peso corporal é considerada uma indicação de toxicidade do anticorpo para os camundongos.

MODELO DE CÂNCER DE MAMA MURINO

[0189] O trabalho do camundongo foi executado pela Crown Bioscience. Os camundongos usados foram camundongos BALB/c fêmeas com 8 a 9 semanas de idade. O modelo de câncer de mama usado utilizou a linhagem celular de câncer de mama murino que expressa luciferase 4T1-Luc. A linhagem celular foi obtida junto à ATCC e cultivada em meio RPMI que contém 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina e 2 μg/ml de puromicina.

[0190] Os camundongos foram raspados e, 72 horas depois, um chip transponder implantado para fins de identificação individual de camundongo. O creme de Bepanthen foi aplicado imediatamente após a raspagem e depois diariamente até a inoculação do tumor.

[0191] Cada camundongo foi inicialmente inoculado com 5 x 104 células 4T1-Luc, suspensas em 100 μl de PBS. A inoculação foi executada no dia 0 em uma almofada de gordura mamária (inferior do lado esquerdo, 2ª almofada a partir de baixo), enquanto os camundongos estavam sob anestesia gasosa. A pele no local da inoculação foi limpa com etanol a 70% antes da inoculação.

[0192] O tamanho do tumor foi medido três vezes por semana a partir do dia 5, usando um IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer, EUA). Imaginologia bioluminescente foi usada para medir cada tumor em 2 dimensões, com o uso de pinças eletrônicas. Os volumes de tumor foram estimados com o uso da fórmula 0,5 (LxW2), em que L = comprimento de tumor e W = largura de tumor. O tratamento começou quando o volume médio de tumor atingiu 50 a 60 mm3. Após a primeira medição do tumor, o creme de bepanthen foi novamente aplicado na área ao redor do tumor. O creme de bepanthen foi posteriormente aplicado diariamente.

[0193] Os camundongos foram divididos em 4 grupos de 12 camundongos cada, com volume tumoral médio uniforme entre os grupos. O tratamento foi administrado semanalmente. Dos quatro grupos de camundongos, um grupo de controle foi doseado apenas com veículo (PBS). Os três grupos experimentais receberam doses de 1, 10 ou 25 mg/kg de MDX-124, em PBS. Cada dose foi administrada por via intravenosa em um volume de 10 ml/kg. O tratamento se destinava a ser continuado por até 3 semanas. A medição de tumor três vezes por semana continuou após o início do tratamento. Os camundongos foram pesados três vezes por semana antes do início do tratamento e diariamente a partir de então.

RESULTADOS

[0194] Para verificar se o MDX-124 não era inerentemente tóxico para os camundongos, foi executado um estudo de tolerabilidade. Os camundongos foram administrados com o anticorpo e seus pesos corporais monitorados. Nenhuma perda de peso corporal foi evidente nos camundongos (dados não mostrados), indicando que o anticorpo não era tóxico para os mesmos em nenhuma das doses testadas.

[0195] O efeito anticâncer de MDX-124 foi, então, testado em um modelo murino de câncer de mama. Os volumes de tumor médios para cada grupo de camundongos testados são mostrados na Figura 20. Após a inoculação das células tumorais no dia 0, a primeira dose de tratamento foi administrada a todos os grupos no dia 12. Conforme mostrado, no dia 17 do estudo, os camundongos tratados com MDX-124 tiveram volumes de tumor significativamente mais baixos do que os camundongos de controle tratados com um veículo. O padrão de aumento do crescimento de tumor no grupo de controle continuou até o dia 19. Os menores volumes de tumor observados nos grupos tratados com MDX-124 também corresponderam a menores volumes de tumor relativos nesses grupos (consultar Figura 21).

[0196] O volume de tumor no dia 12 foi definido como o volume de tumor de linha de base (isto é, 100% do volume de tumor). No dia 19, os tumores dos camundongos tratados com MDX-124 aumentaram de tamanho em aproximadamente 2,5 vezes. Os tumores dos camundongos de controle aumentaram de tamanho aproximadamente 3,3 vezes. Isso significa que o tratamento com MDX-124 resultou em uma redução de aproximadamente um terço no crescimento do tumor em relação ao controle no dia 19, demonstrando o efeito anticâncer do anticorpo. Embora o anticorpo tenha sido administrado aos camundongos em três concentrações diferentes (1 mg/kg, 10 mg/kg e 25 mg/kg), cada um desses regimes de tratamento teve um efeito similar sobre o crescimento tumoral (isto é, o aumento da quantidade de anticorpo administrada não parece aumentar o efeito do tratamento).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação específica que se liga à Anx-A1 humana para uso no tratamento de câncer em um sujeito caracterizada pelo fato de que: (i) a dita molécula de ligação específica compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 e VHCDR3, em que cada uma das ditas CDRs tem uma sequência de aminoácidos como segue: VLCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8; VLCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; VLCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3; VHCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4; VHCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e VHCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6; ou, para cada sequência, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência; e/ou (ii) a dita molécula de ligação específica se liga à Anx-A1 em um epítopo descontínuo que consiste nos aminoácidos 197 a 206, 220 a 224 e 227 a 237 de SEQ ID NO: 17.

2. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: VLCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1; VLCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; VLCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3; VHCDR1 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4; VHCDR2 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e VHCDR3 tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6.

3. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a dita molécula de ligação específica é caracterizada pelo fato de que é um anticorpo ou fragmento do mesmo.

4. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo é humanizado.

5. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal, ou o dito fragmento de anticorpo é um fragmento de anticorpo Fab, Fab’ ou F(ab’)2 ou uma molécula de scFv.

6. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: i) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 9 ou 10, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma; e ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 11 ou 12, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma.

7. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 6, em que a dita molécula de ligação específica é caracterizada pelo fato de que é um anticorpo monoclonal que compreende: i) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma; e ii) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 14, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma.

8. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 6, em que a dita molécula de ligação específica é caracterizada pelo fato de que é um anticorpo monoclonal que compreende: i) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma; e ii) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 16, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma.

9. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o dito câncer expressa Anx-A1.

10. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que Anx-A1 é expressa na superfície das células do dito câncer.

11. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é resistente a um ou mais agentes quimioterapêuticos.

12. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é multirresistente a fármacos.

13. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é resistente a agentes quimioterapêuticos à base de platina.

14. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é resistente à cisplatina; adriamicina e/ou tamoxifeno.

15. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que o dito tratamento compreende ainda a administração de um segundo agente terapêutico ao dito sujeito.

16. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o dito segundo agente terapêutico é um agente quimioterapêutico.

17. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o dito agente quimioterapêutico é um agente citotóxico.

18. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o dito sujeito é um ser humano.

19. Molécula de ligação específica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é selecionado a partir de câncer de mama, câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de pulmão e câncer de pâncreas.

20. Método de tratamento de câncer em um sujeito caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito sujeito uma molécula de ligação específica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito câncer, tratamento e/ou sujeito é conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 19.

22. Uso de uma molécula de ligação específica na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em um sujeito caracterizado pelo fato de que a dita molécula de ligação específica é conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito câncer, tratamento e/ou sujeito é conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 19.

24. Kit caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ligação específica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um agente quimioterapêutico.

25. Produto caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ligação específica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um segundo agente terapêutico para uso separado, simultâneo ou sequencial no tratamento de câncer em um sujeito.

26. Produto para uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o dito câncer, segundo agente terapêutico e/ou sujeito é conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 14 ou 16 a

19.