KR20210088523A - 항체를 사용한 암 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약물-내성 암을 비롯한 암의 치료에 사용하기 위한 인간 Anx-A1에 결합하는 항체를 제공한다. 이러한 용도를 위한 키트 및 제품이 또한 제공된다.

Description

항체를 사용한 암 치료
본 발명은 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 특이적 결합 분자를 제공한다. 특이적 결합 분자는 인간 아넥신-A1(Anx-A1)에 결합하고, 특정 실시형태에서 항체 또는 항체 단편이다.
암은 비정상적인 세포 성장을 특징으로 하는 질환 군이다. 특징적으로, 암과 연관된 비정상적인 세포 성장은 종양(비정상적인 세포 성장으로 인해서 형성되는 세포의 고체 덩어리)의 형성을 초래하지만, 항성 그러한 것은 아니다(특히 혈액 암에서). 2010년(가장 상세한 통계가 입수 가능한 가장 최근 연도)에 전 세계적으로 더 많은 사람들(약 8백만명)이 다른 단일 원인보다 암으로 사망하였다(Lozano et al., Lancet 380: 2095-2128, 2012). 추가로, 전 세계의 인구가 노화됨에 따라, 암 발병률이 증가할 것으로 예상된다. 따라서, 암에 대한 새롭고 개선된 치료법이 시급히 필요하다.
더욱이, 다수의 암 사망은 암이 화학요법 약물에 내성을 갖게 된 결과이다. 암이 약물 내성이 되는 방법은 Housman 등의 문헌(문헌[Cancers 6: 1769-1792, 2014])에 검토되어 있다. 상기 문헌에 상세히 설명된 바와 같이, 암은 약물의 불활성화 또는 대사(또는 대사 활성화의 예방), 약물 표적의 돌연변이 또는 변경, ABC 수송체를 통한 약물 유출 등 다양한 기전에 의해 약물 내성이 될 수 있다. 이러한 기전은 암이 다제 내성(multidrug resistant: MDR)이 되는 결과를 초래할 수 있다. 하기에 논의되는 바와 같이, 약물 내성은 백금-기반 화학치료제를 사용한 요법의 특별한 문제이다.
백금-기반 화학치료제는 고환암, 난소암, 결장직장암, 자궁경부암, 유방암, 방광암, 두경부암, 식도암, 폐암, 중피종, 림프종, 뇌종양 및 신경 모세포종을 포함한 몇몇 상이한 암에서 일반적인 1차 치료 선택이다. 백금-기반 화학치료제는 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴을 포함한다. 모든 백금-기반 화학치료제는 구아닌 잔기에서 N-7 위치와 반응하여 가닥 간 및 가닥 내 DNA 가교 및 DNA 단백질 가교를 형성함으로써 본질적으로 동일한 방식으로 작동한다. 가교는 DNA 합성 및/또는 수선을 저해하고, 아폽토시스의 개시를 야기한다(문헌[Shen et al., Pharmacol. Rev. 64: 706-721, 2012]). 그러나 환자는 일반적으로 처음에는 백금-기반 화학요법에 잘 반응하지만, 그 다음에는 대부분은 치료에 대한 내성 발달(특히, 시스플라틴의 경우)로 인해 재발하여 치료 실패를 초래한다(상기 Shen 등의 문헌). 따라서 백금-기반 요법에 대한 내성의 발달은 현재 종양학에서 중요한 과제이다. 암은 표적 세포에서 (유입 감소 및/또는 유출 증가로 인한) 백금-기반 화학치료제의 축적 감소 및 DNA 수선 경로의 (재)활성화를 포함한 다수의 기전을 통해 백금-기반 요법에 대한 내성이 발달한다.
따라서, 백금-기반 요법에 대한 내성의 발달은 현재 종양학에서 중요한 과제이다. 기존 화학요법(특히 백금-기반 화학요법)에 내성이 있거나 내성이 되는 암에 대한 새로운 치료 선택이 시급히 필요하다.
본 발명자들은 Anx-A1에 대한 특정 특이적 결합 분자(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 효과적이라는 것을 발견하였다. 이 분자는 백금-기반 화학요법에 내성이 있는 암을 포함하여 약물-내성 암을 치료하는 데 특히 효과적인 것으로 밝혀져 있다. 따라서 본 발명은 암 환자, 특히 화학치료제에 내성이 있는 암 환자를 위한 새로운 치료 선택을 제공한다. 이러한 치료 선택은 질환이 전통적인 화학요법에 반응하지 않는 개체를 위한 새로운 요법에 대한 긴급한 요구에 응답한다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 유방암, 결장직장암, 난소암, 폐암 및 췌장암을 비롯한 광범위한 암의 치료에 효과적인 것을 발견하였다.
유방암은 여성에게 가장 흔한 암이며, 임의의 다른 암보다 전 세계 여성에서 더 많은 사망을 유발한다(Becker, Int J Gynaecol Obstet 131 (2015), S36-S39). 영국에서는 매년 55,000건을 초과하는 유방암 사례가 진단된다(남성의 경우 300건 초과). 유방암 사망률은 다른 많은 암보다 낮지만 영국에서는 매년 11,000명이 넘는 사망자가 유방암으로 인해 발생한다. 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 호르몬 표피 성장 인자 수용체 HER2(삼중 음성 유방암으로 알려짐)의 발현이 없는 유방암은 많은 현대 유방암 약물이 이러한 수용체를 표적으로 하기 때문에 특히 치료가 어렵다. 본 발명의 특이적 결합 분자가 삼중 음성 유방암을 비롯한 유방암 치료에 효과적이어서, 이러한 질환에 대한 중요한 새로운 치료 선택을 제공한다는 겅슬 발견하였다.
난소암은 여성에게 흔한 또 다른 암이며, 치료가 어렵다. 영국에서만 매년 7,500건을 초과하는 난소암 발생이 발생하여, 4,000명이 넘는 사망자를 초래한다(난소암은 빈번하게는 후기 병기에서 진단되어, 상대적으로 낮은 생존율을 초래함). 췌장암은 상대적으로 흔하며, 영국에서만 매년 9,000건을 초과하는 사례가 발생하지만, 생존율이 1% 미만인 가장 치료가 어려운 암 중 하나로 알려져 있다(다시 말하면, 이것은 질환이 주로 후기 병기에 진단되기 때문임). 본 발명의 특이적 결합 분자는 이들 암 모두를 치료하는데 효과적이어서, 치료하기 어려운 암에 대해 절실히 필요한 새로운 요법을 제공하는 것을 발견하였다. 결장직장(또는 장)암이 또한 매년 영국에서 42,000건이 진단되는 흔한 암이다. 영국에서 네 번째로 흔한 암임에도 불구하고, 이것은 사망으로 이어지는 두 번째로 흔한 암이다. 유사하게, 영국에서는 매년 47,000명을 초과하는 사람들이 폐암으로 진단되며, 5% 만이 진단 후 10년 이상 생존한다. 본 발명의 특이적 결합 분자는 이들 암에 대한 유용한 새로운 요법을 제공한다.
전장 인간 Anx-A1은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. Anx-A1은 아넥신 단백질 패밀리의 구성원이다. Anx-A1을 포함하여 이러한 패밀리의 대부분의 단백질은 4개의 상동성 반복 도메인을 포함하는 "코어"영역의 존재를 특징으로 하는데, 이들 각각은 적어도 하나의 Ca2+ 결합 부위를 포함한다. 패밀리의 각각의 구성원은 고유한 N-말단 영역에 의해서 구별된다. Anx-A1은 단량체 양친매성 단백질로, 주로 그것이 발현되는 세포의 세포질에 위치한다. 그러나, Anx-A1은 또한 외수송되어, 세포 표면 국지화를 초래할 수 있다(문헌[D'Acquisto et al., Br. J. Pharmacol. 155: 152-169, 2008]).
Anx-A1은 선천성 면역계 및 적응성 면역계 둘 다의 다양한 세포 유형의 항상성에 관여하는 면역계의 조절에 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, Anx-A1은 호중구 및 대식세포와 같은 선천성 면역계의 세포에 대한 항상성 제어를 발휘하고, T-세포 수용체(TCR) 신호전달의 강도를 조절함으로써 T-세포에서 역할을 하는 것으로 나타났다(문헌[D'Acquisto et al., Blood 109: 1095-1102, 2007]). 적응성 면역계에서 그 역할을 저해하기 위해 Anx-A1에 대한 중화 항체를 사용하는 것은, 류마티스 관절염 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환을 포함한 다양한 T-세포-매개 질환의 치료에 효과적인 것으로 나타났다(WO 2010/064012; WO 2011/154705).
Anx-A1에 대한 항체는 특정 정신 질환, 특히 불안, 강박 장애(OCD) 및 관련 질환의 치료에 유용한 것으로 밝혀져 있지만(WO 2013/088111), 이것이 발생하는 기전은 공지되어 있지 않다.
WO 2005/027965는 Anx-A1이 아폽토시스 세포의 표면에 국지화되고, 항-Anx-A1 항체를 사용하여 아폽토시스를 모니터링할 수 있다는 것을 입증한다. 상기 문헌은, 이에 기초하여, 이러한 항체를 사용하여 암을 모니터링하고, 진단할 수 있다는 것을 교시한다. 상기 문헌은 또한 아폽토시스 세포의 표면 상의 Anx-A1 발현이 세포에 대한 면역 반응을 저해한다고 교시한다. 이에 기초하여, 상기 문헌은 Anx-A1에 결합하는 항체가 아폽토시스를 시작한 세포에 대한 Anx-A1의 면역억제 효과를 차단하여 암에 대한 면역 반응을 자극함으로써 암 치료에 사용될 수 있다고 추측한다.
Oh 등(문헌[Nature 429: 629-635, 2004])은 Anx-A1이 일부 고형 종양에서 발현되고, 이러한 암에 대한 방사선면역요법에 지향되는 표적으로 사용될 수 있다고 교시하며, 그러한 요법이 질환의 동물 모델에서 생존을 향상시킨다는 것을 입증한다. US 2015/0086553은 항-Anx-A1 항체가 암 치료 및 진단에 사용될 수 있음을 시사하지만, 그러한 치료가 어떻게 수행될 수 있는지는 교시하지 않는다. 위암 세포주 SNU-1에 대한 항-Anx-A1 scFv의 결합이 입증되었다. Wang 등(문헌[Biochem. BioPhys. Res. Commun. 314: 565-570, 2004])은 암에서 Anx-A1 발현 및 다제 내성 간의 상관 관계를 입증한다. 따라서 암을 포함한 여러 질환이 Anx-A1 발현과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 본 발명 이전에는, 항-Anx-A1 항체, 특히 임의의 공동-치료 없이 사용되는 경우 암 치료에 사용될 수 있다는 것은 입증되지 않았다.
사실, 본 발명은 암 치료에서의 효능이 인간 Anx-A1에 결합하는 모든 특이적 결합 분자로 확장되지 않음을 입증한다. 본 발명은 인간 Anx-A1에 결합하고 암, 특히 화학요법 약물 및/또는 유방암, 결장직장암, 난소암, 폐암 및 췌장암에 내성이 있는 암을 치료하는데 유리하게 사용될 수 있는 특정 특이적 결합 분자를 제공한다. 본 발명의 특이적 결합 분자가 암 치료에 효과적인 반면, 인간 Anx-A1에 또한 결합하는 다른 특이적 결합 분자는 효과적이지 않은 이유는 공지되어 있지 않다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자의 활성은 인식되는 에피토프에 의존할 수 있다고 추측된다.
인간 Anx-A1을 인식하는 다수의 단클론성 항체가 WO 2018/146230에 개시되어 있다. WO 2018/146230에 개시된 항체는 매우 높은 친화도로 인간 Anx-A1에 결합할 수 있다는 점에서, 특히 유리한 특성을 갖는다. 본 발명에 이르러서, 본 발명자들은 WO 2018/146230에 개시된 항체가 하기에 추가로 설명되는 바와 같이 암 치료에 유용하다는 것을 발견하였다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자를 제공하며, 여기서
(i) 상기 특이적 결합 분자는 상보성 결정 영역(CDR) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하며, 상기 CDR은 각각 하기와 같은 아미노산 서열을 갖고:
VLCDR1은 서열번호 1, 7 또는 8에 제시된 서열을 가짐;
VLCDR2는 서열번호 2에 제시된 서열을 가짐;
VLCDR3은 서열번호 3에 제시된 서열을 가짐;
VHCDR1은 서열번호 4에 제시된 서열을 가짐;
VHCDR2는 서열번호 5에 제시된 서열을 가짐; 및
VHCDR3은 서열번호 6에 제시된 서열을 가짐; 또는 각각의 서열의 경우, 아미노산 서열은 이와 적어도 85%의 서열 동일성을 가짐; 및/또는
(ii) 상기 특이적 결합 분자는 서열번호 17의 아미노산 197-206, 220-224 및 227-237로 이루어진 비연속적인 에피토프에서 Anx-A1에 결합한다.
유사하게, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 상기에 정의된 바와 같은 특이적 결합 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 또한 대상체에서 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 상기에 정의된 바와 같은 특이적 결합 분자의 용도를 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 특이적 결합 분자 및 화학치료제를 포함하는 키트를 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 특이적 결합 분자 및 대상체에서 암의 치료에서 별도로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 제2 치료제를 포함하는 제품을 제공한다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자를 제공한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 "특이적 결합 분자"는 특정 분자 파트너, 이 경우에 인간 Anx-A1에 특이적으로 결합하는 분자이다. 인간 Anx-A1에 특이적으로 결합하는 분자는 이것이 다른 분자, 또는 적어도 대 부분의 다른 분자에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 인간 Anx-A1에 결합하는 분자이다. 따라서, 예를 들어, 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자가 인간 세포의 용해물과 접촉되는 경우, 특이적 결합 분자는 Anx-A1에 주로 결합할 것이다. 특히, 특이적 결합 분자는 상기 인간 Anx-A1 상에 존재하는 서열 또는 구성(configuration)에 결합한다. 특이적 결합 분자가 항체인 경우 서열 또는 구성은 특이적 결합 분자가 결합하는 에피토프이다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자에 의해서 결합되는 Anx-A1 에피토프를 하기에 설명한다.
본 명세서에서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 반드시 인간 Anx-A1에만 결합하는 것은 아니다: 특이적 결합 분자는 특정 다른 비정의된 표적 분자와 교차-반응할 수 있거나, 또는 다수의 분자의 혼합물(예컨대, 세포 용해물 또는 그와 같은 것)과 접촉될 때 비-특이적 결합의 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합 분자는 인간 아넥신 패밀리의 다른 구성원 및/또는 다른 동물로부터의 Anx-A1 단백질과의 교차-반응성 수준을 나타낼 수 있다. 무관하게, 본 발명의 특이적 결합 분자는 Anx-A1에 대해 특이성을 나타낸다. 당업자는 당업계에서의 표준기술, 예를 들어, ELISA, 웨스턴-블롯, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 등을 사용하여 특이적 결합 분자가 Anx-A1에 대해 특이성을 나타내는지의 여부를 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 20 nM, 15 nM 또는 10 nM 미만의 KD(해리 상수)로 인간 Anx-A1에 결합한다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 5 nM의 KD로 인간 Anx-A1에 결합한다.
Anx-A1에 대한 특이적 결합 분자의 결합의 KD는 바람직하게는, Ca2+ 이온이 적어도 1 mM의 농도로 존재하고, 선택적으로 HEPES가 10 내지 20 mM의 농도로 존재하고, 그리고 pH가 7 내지 8, 바람직하게는 7.2 내지 7.5(이들 수치 포함)인 생리적 수준인 결합 조건 하에서 측정된다. NaCl은, 예를 들어 100 내지 250 mM의 농도로 존재할 수 있고, 그리고 저농도의 세제, 예를 들어, 폴리소르베이트 20이 또한 존재할 수 있다. 이러한 저농도는 예를 들어, 0.01 내지 0.5% v/v일 수 있다. 특이적 결합 분자와 이의 리간드 사이의 상호작용의 KD가 계산될 수 있는 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있다. 공지된 기술은 SPR(예를 들어, Biacore) 및 분극화-조절된 경사-입사 반사율 차이(olarization-modulated oblique-incidence reflectivity difference)(OI-RD)를 포함한다.
상기에 기재된 바와 같이, "인간 Anx-A1에 결합하는" 분자는 인간 Anx-A1 분자에 대해 특이성을 나타낸다. 4개의 교대로-스플라이싱된 Anx-A1 mRNA의 번역으로부터 얻은, 인간 Anx-A1의 3개의 인간 아이소폼이 존재한다. 전장 인간 Anx-A1 단백질은 ANX-A1-002 또는 ANX-A1-003 전사체로부터 얻고, 상기에 주목된 바와 같이 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. ANX-A1-004 및 ANX-A1-006 전사체는 전장 인간 Anx-A1 단백질의 단편을 암호화하고, 서열번호 18 및 19에 제시된 아미노산 서열을 각각 갖는다.
본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 전장 인간 Anx-A1(즉, 346 아미노산 단백질인 ANX-A1-002 또는 ANX-A1-003 전사체에 의해서 암호화된, 서열번호 17의 Anx-A1)에 결합한다. 특이적 결합 분자는 또한 ANX-A1-004 및 ANX-A1-006 전사체에 의해 암호화된 단편과 같은 전장 Anx-A1의 특정 단편, 부분 또는 변이체에 결합할 수 있다.
하기에 논의되는 바와 같이, 항체 (및 CDR을 함유하는 분자)는 본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 특이적 결합 분자를 형성한다.
상기에서 언급한 바와 같이, 인간 Anx-A1을 인식하는 다수의 단클론성 항체가 WO 2018/146230에 개시되어 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 항체는 2개 중쇄 및 2개 경쇄인 4개 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 단백질이다. 전형적으로, 중쇄는 서로에 대해서 동일하고, 경쇄는 서로에 대해서 동일하다. 경쇄는 중쇄보다 더 짧다 (그리고 따라서 더 가볍다). 중쇄는 N-말단에서 가변(VH)도메인이 위치되고, 이어서 3개 또는 4개 불변 도메인(각각, N-말단에서부터 C-말단으로 CH1, CH2, CH3 및 존재하는 경우, CH4)이 이어지는 4개 또는 5개 도메인을 포함한다. 경쇄는 2개 도메인을 포함하는데, N-말단에서 가변(VL) 도메인이 위치되고 C-말단에서 불변(CL) 도메인이 위치된다. 중쇄에서 비구조적인 힌지 영역은 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치된다. 항체의 2개의 중쇄는 힌지 영역에 존재하는 시스테인 잔기 사이에 형성된 디설파이드 결합에 의해 연결되고, 각각의 중쇄는 각각 CH1 및 CL 도메인에 존재하는 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 하나의 경쇄에 연결된다.
포유동물에서 람다(λ) 및 카파(κ)로 공지된 경쇄의 2개 유형이 생산된다. 카파 경쇄의 경우, 가변 도메인 및 불변 도메인은 각각 VK 도메인 및 CK 도메인으로 지칭될 수 있다. 경쇄가 λ 경쇄인지 κ 경쇄인지의 여부는 그것의 불변 영역에 의해 결정된다: λ 및 κ 경쇄의 불변 영역은 상이하지만, 임의의 주어진 종에서 동일한 유형의 모든 경쇄에서 동일하다.
중쇄의 불변 영역은 종에서 임의의 주어진 아이소타입의 모든 항체에서 동일하지만, 아이소타입 간에 상이하다(항체 아이소타입의 예는 클래스 IgG, IgE, IgM, IgA 및 IgD이고; 또한 다수의 항체 하위유형이 존재하며, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4인 4가지 하위유형의 IgG 항체가 존재한다). 항체의 특이성은 그것의 가변 영역의 서열에 의해 결정된다. 가변 영역의 서열은 임의의 개체에서 동일한 유형의 항체 간에 다양하다. 특히, 항체의 경쇄 및 중쇄 둘 다는 3개의 초가변성 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 한 쌍의 경쇄 및 중쇄에서, 2개 쇄의 CDR이 항원-결합 부위를 형성한다. CDR 서열은 항체의 특이성을 결정한다.
중쇄의 3개의 CDR은 N-말단에서부터 C-말단으로 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3으로 공지되어 있고, 경쇄의 3개의 CDR은 N-말단에서부터 C-말단으로 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3으로 공지되어 있다.
WO 2018/146230에 개시된 하나의 항체는 하기 CDR 서열을 갖는다:
VLCDR1: RSSQSLENSNAKTYLN (서열번호 1);
VLCDR2: GVSNRFS (서열번호 2);
VLCDR3: LQVTHVPYT (서열번호 3);
VHCDR1: GYTFTNYWIG (서열번호 4);
VHCDR2: DIYPGGDYTNYNEKFKG (서열번호 5); 및
VHCDR3: ARWGLGYYFDY (서열번호 6).
WO 2018/146230에 개시된 또 다른 항체는 하기 CDR 서열을 갖는다:
VLCDR1: RSSQSLENSNGKTYLN (서열번호 7);
VLCDR2: GVSNRFS (서열번호 2);
VLCDR3: LQVTHVPYT (서열번호 3);
VHCDR1: GYTFTNYWIG (서열번호 4);
VHCDR2: DIYPGGDYTNYNEKFKG (서열번호 5); 및
VHCDR3: ARWGLGYYFDY (서열번호 6).
WO 2018/146230에 개시된 또 다른 항체는 하기 CDR 서열을 갖는다:
VLCDR1: RSSQSLENTNGKTYLN (서열번호 8);
VLCDR2: GVSNRFS (서열번호 2);
VLCDR3: LQVTHVPYT (서열번호 3);
VHCDR1: GYTFTNYWIG (서열번호 4);
VHCDR2: DIYPGGDYTNYNEKFKG (서열번호 5); 및
VHCDR3: ARWGLGYYFDY (서열번호 6).
따라서 WO 2018/146230에 개시된 항체는 VLCDR1 서열을 제외하고는 동일한 CDR 서열을 갖는다. 서열번호 7의 VLCDR1 서열은 수탁 번호 10060301을 갖는 ECACC로 기탁된 하이브리도마로부터 얻은 마이너 mRNA 서열로부터 작제된 뮤린 항체 Mdx001에서 발견되는 야생형 VLCDR1 서열이다. Mdx001의 인간화 버전을 생성시켰고, 놀랍게도, 이들 인간화된 항체에서 VLCDR1 서열의 변형은 강화된 항체를 산출하는 것을 발견하였다. 서열번호 7의 위치 11에서 글리신 잔기의 치환은 항체 안정성 및 기능을 향상시킨다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 이것은 CDR의 번역 후 변형을 위한 부위를 제거함으로써 달성되는 것으로 여겨진다. 특히, 이러한 글리신 잔기의 치환은 단백질에서 탈아미드화 부위를 제거하는 것으로 여겨진다. 서열번호 7에 제시된 VLCDR1 서열은 서열 모티프 Ser-Asn-Gly를 포함한다. 이 서열 모티프는 Asn 잔기의 탈아미드화와 연관되어 아스파라긴 잔기가 아스파라긴산 또는 아이소아스파르트산으로 전환되어 항체 안정성 및 표적 결합에 영향을 미칠 수 있다. Ser-Asn-Gly 모티프 내의 잔기 중 어느 하나의 치환은 탈아미드화 부위를 제거하는 것으로 여겨진다.
본 발명자들은 서열번호 7의 위치 11에서의 글리신 잔기(상기에 기재된 탈아미드화 부위 내에 위치한 글리신 잔기)가 알라닌으로 치환되고, 네이티브 Mdx001 항체에 비해서 이들의 표적(Anx-A1)에 대한 결합이 강화된 항체를 식별하였다. 위치 11에서 글리신이 알라닌으로 치환된 VLCDR1은 아미노산 서열 RSSQSLENSNAKTYLN(볼드체로 표시된 잔기는 전술한 치환에 의해 도입된 알라닌임)을 가지며, 이는 서열번호 1에 제시되어있다. 또한, 세린이 트레오닌으로 치환됨으로써 위치 9에서 변형된 VLCDR1을 포함하는 항체는 Mdx001에 비해 Anx-A1의 강화된 결합을 나타내는 것을 발견하였다. 위치 9에서 세린이 트레오닌으로 치환된 VLCDR1은 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열 RSSQSLENTNGKTYLN(볼드체의 잔기는 전술한 치환에 의해 도입된 트레오닌임)을 갖는다. 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 WO 2018/146230에 개시된 항체가 암을 위한 요법에 사용하기에 적합하다는 것을 발견하였다.
WO 2018/146230에 개시된 항체는, 인간 Anx-A1를 갖는 마우스의 유전자 면역화에 의해 생성되었으며, 이는 마우스의 면역계가 이의 네이티브 입체배좌로 온전한 전체 인간 Anx-A1에 노출되었음을 의미한다. 실시예에서 상세히 설명된 바와 같이, 수소-중수소 교환(HDX)에 의한 WO 2018/146230의 항체 분석은 이들이 인간 Anx-A1의 아미노산 197-206, 220-224 및 227-237(즉, 서열번호17의 아미노산 197-206, 220-224 및 227-237)로 이루어진 불연속 에피토프에서 인간 Anx-A1에 결합한다는 것을 입증하였다.
특히, WO 2018/146230의 항체는 생리학적 농도의 Ca2+가 존재하는 경우에만 Anx-A1에 결합한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 이것은 Anx-A1 분자 상의 에피토프의 위치의 결과라고 여겨진다. Ca2+의 부재 하에서, N-말단은 이러한 불연속 에피토프에 인접한 "포켓"에 위치한다. Ca2+가 Anx-A1에 결합하면(생리학적 Ca2+ 농도 하에서 발생) Anx-A1의 입체배좌가 변화되어, 코어 도메인의 포켓에서 N-말단이 배출되는데, 이것은 에피토프가 노출되어 항체가 결합하게 한다고 여겨진다. Anx-A1의이 에피토프에 결합하는 임의의 항체(또는 유사한 특이적 결합 분자)는 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 WO 2018/146230에 개시된 3개의 항체 또는 이의 변이체 중 어느 하나의 CDR 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 WO 2018/146230의 항체와 동일한 에피토프에서 Anx-A1에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 특이적 결합 분자는,
(i) 상보성 결정 영역(CDR) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하며, 상기 CDR은 각각 하기와 같은 아미노산 서열을 갖고:
VLCDR1은 서열번호 1, 7 또는 8에 제시된 서열을 가짐;
VLCDR2는 서열번호 2에 제시된 서열을 가짐;
VLCDR3은 서열번호 3에 제시된 서열을 가짐;
VHCDR1은 서열번호 4에 제시된 서열을 가짐;
VHCDR2는 서열번호 5에 제시된 서열을 가짐; 및
VHCDR3은 서열번호 6에 제시된 서열을 가짐; 또는 각각의 서열의 경우, 아미노산 서열은 이와 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 가짐; 및/또는
(ii) 서열번호 17의 아미노산 197-206, 220-224 및 227-237로 이루어진 비연속적인 에피토프에서 인간 Anx-A1에 결합한다.
바람직한 양태에서, (i)의 특이적 결합 분자는 (ii)에 기재된 바와 같은 에피토프에 결합한다.
"또는 각각의 서열의 경우, 아미노산 서열은 이와 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 가짐"은, 상기 CDR 각각이 관련 서열번호에 명시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, VLCDR1은 서열번호 1, 7 또는 8에 제시된 서열 또는 서열번호 1, 7 또는 8과 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; VLCDR2은 서열번호 2에 제시된 서열 또는 서열번호 2와 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; VLCDR3은 서열번호 3에 제시된 서열 또는 서열번호 3과 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; VHCDR1은 서열번호 4에 제시된 서열 또는 서열번호 4와 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; VHCDR2는 서열번호 5에 제시된 서열 또는 서열번호 5와 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; VHCDR3은 서열번호 6에 제시된 서열 또는 서열번호 6과 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 서열번호와 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성(하지만 100% 미만의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열은 본 명세서에서 그 서열번호의 변이체로 공지되며, 예를 들어, 서열번호 1과 적어도 85%의 서열 동일성 내지 서열번호 1과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 서열번호 1의 변이체이다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 하기 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다:
VLCDR1은 서열번호 1에 제시된 서열을 가짐;
VLCDR2는 서열번호 2에 제시된 서열을 가짐;
VLCDR3은 서열번호 3에 제시된 서열을 가짐;
VHCDR1은 서열번호 4에 제시된 서열을 가짐;
VHCDR2는 서열번호 5에 제시된 서열을 가짐; 및
VHCDR3은 서열번호 6에 제시된 서열을 가짐.
지시된 바와 같이, 본 발명에 따라 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 폴리펩타이드 서열로 구성된 6개 CDR을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 상호 교환 가능하고, 그리고 각각은 하나 이상의 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산의 서열을 지칭한다. 따라서, 특이적 결합 분자는 폴리펩타이드일 수 있다. 대안적으로, 특이적 결합 분자는 CDR 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 특이적 결합 분자는 항체 또는 항체 단편이다.
본 특이적 결합 분자는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다. 특히, 이러한 특이적 결합 분자는 단백질 발현 시스템, 예컨대 원핵(예를 들어 박테리아) 세포 또는 진핵(예를 들어 효모, 진균, 곤충 또는 포 유동물) 세포를 사용한 세포 발현 시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 대안적인 단백질 발현 시스템은 특이적 결합 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 내에서 전사되고, mRNA가 시험관내에서 단백질로 번역되는 무세포, 시험관내 발현 시스템이다. 무세포 발현 시스템 키트가 널리 입수 가능하고, 예를 들어 ThermoFisher Scientific(USA)으로부터 구매될 수 있다. 대안적으로, 특이적 결합 분자는 비-생물학적 시스템에서 화학적으로 합성될 수 있다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자를 형성할 수 있거나 그에 포함될 수 있는 폴리펩타이드를 생성하기 위해 액체상 합성 또는 고체상 합성이 사용될 수 있다. 당업자는 당업계에서 일반적인 적절한 방법을 사용하여 특이적 결합 분자를 쉽게 생산할 수 있다. 특히, 이러한 특이적 결합 분자는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포에서 재조합으로 발현될 수 있다.
상기에 정의된 바와 같은 에피토프에서 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자(즉, 서열번호 17의 아미노산 197-206, 220-224 및 227-237로 이루어짐)는 당업계의 표준 방법(예를 들어, 항체의 유전적 면역화)에 의해서 생성될 수 있고, 필요한 에피토프를 갖는 항체는 당업계에 공지된 에피토프 매핑의 표준 방법에 의해서 식별된다. 이러한 방법의 예는 HDX, 에피토프 절단, 펩타이드 패닝, X선 공-결정학, NMR 등을 포함한다(문헌[Clementi et al., Methods Mol. Biol. 1131: 427-446, 2014]; 문헌[Abbott et al., Immunology 142(4): 526-535, 2014]). 특이적 결합 분자는(예를 들어, 변형된 서열의 발현에 의해서) 관련 에피토프에 결합한다고 공지된 기존의 특이적 결합 분자를 변형시킴으로써 그리고 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 식별된 관련 에피토프에 결합하는 분자에 의해서 생성될 수 있다. 관련 에피토프에 결합하는 특이적 결합 분자는 또한(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은) 에피토프에 결합한다고 공지된 항체와의 경쟁에 의해서 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 에피토프 및 이의 에피토프 변이체에 대한 결합을 비교함으로써 식별될 수 있다(여기서 에피토프 변이체에 대한 결합 실패는 관심대상 에피토프에 대해 특이적 결합을 나타냄).
본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 필요한 경우 단리(정제)된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "단리된"은 특이적 결합 분자가 이것이 제공된 임의의 용액 또는 유사한 것의 일차 성분(즉, 다수 성분)이라는 것을 의미한다. 특히, 특이적 결합 분자가 혼합물 또는 혼합된 용액에 초기에 생산되는 경우, 특이적 결합 분자의 단리는 이것이 이들로부터 분리 또는 정제되었다는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 특이적 결합 분자가 폴리펩타이드이고, 상기 폴리펩타이드가 상기에 논의된 바와 같은 단백질 발현 시스템을 사용하여 생산된 경우, 이러한 특이적 결합 분자는 이것이 존재하는 용액 또는 조성물에서, 바람직하게는 용액 또는 조성물에서 다수의 폴리펩타이드를 구성하는, 대부분의 풍부한 폴리펩타이드가 되도록 그리고 네이티브 생산 배지에 존재하는 다른 폴리펩타이드 및 생체 분자에 비하여 풍부하게 되도록 단리된다. 특히, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 이것이 용액 또는 조성물에서 우세한(다수) 특이적 결합 분자가 되도록 단리된다. 바람직한 특징부에서, 특이적 결합 분자는 용액 또는 조성물에서 다른 성분, 특히 다른 폴리펩타이드 성분의 존재에 비교하여 평가될 때 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% w/w의 순도로 용액 또는 조성물에 존재한다.
특이적 결합 분자가, 예를 들어 단백질 발현 시스템에서 생산된 단백질인 경우, 특이적 결합 분자의 용액은 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자가 우세하고 따라서 단리되는지의 여부를 확인하기 위해 정량적 프로테오믹스에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 2D 겔 전기영동 및/또는 질량 분광분석법이 사용될 수 있다. 이러한 단리된 분자는 본 명세서에서 하기에 기재된 바와 같은 제제 또는 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 당업계에서 공지된 임의의 기술을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합 분자는 적절한 결합 파트너를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 분자의 단리가 가능하도록 친화성 태그, 예컨대, 폴리히스티딘 태그, 스트렙 태그, FLAG 태그 및 HA 태그 등과 함께 생산될 수 있고, 예를 들어 폴리히스티딘 태그를 보유하는 분자는 Ni2+ 이온을 사용하여 정제될 수 있다. 특이적 결합 분자가 항체인 실시형태에서, 특이적 결합 분자는 하나 이상의 항체-결합 단백질, 예컨대 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 또는 단백질 L을 사용한 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단리될 수 있다. 대안적으로, 특이적 결합 분자는 예를 들어 크기-배제 크로마토그래피 또는 이온교환 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 반대로, 화학적 합성에 의해(즉 비-생물학적 방법에 의해) 생산된 특이적 결합 분자는 단리된 형태로 생산될 가능성이 있다. 따라서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자가 단리된 분자를 생산하는 방식으로 합성되는 경우, 단리되는 것으로 간주되는 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자에 대해서는 특이적 정제 또는 단리 단계는 필요하지 않다.
특이적 결합 분자가 서열번호 1(또는 7 또는 8) 또는 2 내지 6의 변이체인 CDR 서열을 포함하는 본 발명의 실시형태에서, 변이체는 아미노산 잔기의 치환, 부가 및/또는 결실에 의해서 이의 참조 CDR 서열(즉, 적어도 85% 내지 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열)에 비해서 변형될 수 있다.
CDR 서열이 특정 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형되는 경우, 이러한 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 아미노산 치환을 지칭한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산은 유사한 특성을 갖는 경향이 있고, 따라서 폴리펩타이드의 구조 또는 기능에 대해 중요한 아미노산의 보존적 치환은 동일한 위치에서 비- 보존적 아미노산 치환보다 덜 폴리펩타이드 구조/기능에 영향을 준다고 예측될 수 있다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄(예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신), 무극성 측쇄(예를 들어 글리신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 당업계에서 정의되어 있다. 따라서 보존적 아미노산 치환은 특정 아미노산 잔기가 동일한 패밀리에서 상이한 아미노산에 대해 치환된 치환인 것으로 간주될 수 있다. 그러나, CDR 잔기의 치환은, 하나의 아미노산이 상이한 패밀리에 속하는 측쇄를 갖는 또 다른 것에 대해 치환된, 동등하게 비-보존적 치환일 수 있다.
본 발명의 범위에서 아미노산 치환 또는 첨가는 유전자 암호에 의해 암호화된 단백질을 구성하는 아미노산, 유전자 암호에 의해 암호화되지 않은 단백질을 구성하는 아미노산, 또는 비-단백질을 구성하는 아미노산을 사용하여 행해질 수 있다. 바람직하게는 임의의 아미노산 치환 또는 첨가는 단백질을 구성하는 아미노산을 사용하여 행해진다. CDR의 서열을 구성하는 아미노산은 자연적으로 발생하지 않지만, 자연적으로 발생하는 아미노산의 변형인 아미노산을 포함할 수 있다. 이들 비-자연 발생 아미노산의 제공이 서열을 변형하지 않고 특이성에 영향을 주지 않으면, 이들은 서열 동일성이 감소하지 않고 본 명세서에서 기재된 CDR을 생성하기 위해 사용될 수 있고, 즉, 본 CDR의 아미노산을 제공하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 아미노산의 유도체, 예컨대, 메틸화된 아미노산이 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 특이적 결합 분자는 자연 분자가 아니고, 즉 자연에서 발견된 분자가 아니다.
서열번호 1-8에 제시된 CDR의 아미노산 서열에 대한 변형은 임의의 적합한 기술, 예컨대, 암호화 DNA 서열의 부위 지향적 돌연변이유발 또는 고체 상태 합성을 사용하여 행해질 수 있다.
본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 상기에 기재된 CDR을 포함한다. 추가로, 이러한 분자는 CDR의 적절한 제시를 허용하는 링커 모이어티 또는 프레임워크 서열을 함유할 수 있다. 추가 특성, 예를 들어 상기에 기재된 것과 같은 CDR을 함유하는 분자의 단리 또는 식별을 허용하는 펩타이드 서열을 편리하게 부여할 수 있는 추가 서열이 또한 존재할 수 있다. 이러한 경우, 융합 단백질이 생성될 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 특이적 결합 분자의 CDR은 상기에 제시된 바와 같은 서열번호 1 (또는 7 또는 8) 및 2 내지 6과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 각각의 CDR 서열은 서열번호 1(또는 7 또는 8) 및 2 내지 6에 비해서 최대 2개 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실에 의해 변형될 수 있되, 단 생성된 CDR 서열은 상기에서 제시된 바와 같이 서열번호 1(또는 7 또는 8) 및 2 내지 6과 적어도 85% 또는 90%의 서열 동일성을 가진다. "치환, 첨가 또는 결실"에는 치환, 첨가 및 결실의 조합이 포함된다. 따라서, 특히, VLCDR1은 1 또는 2개 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는 서열번호 1(또는 7 또는 8)의 서열을 가질 수 있고; VLCDR2는 1개 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는 서열번호 2의 서열을 가질 수 있고; VLCDR3은 1개 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는 서열번호 3의 서열을 가질 수 있고; VHCDR1은 1개 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는 서열번호 4의 서열을 가질 수 있고; VHCDR2는 1 또는 2개 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는 서열번호 5의 서열을 가질 수 있고; 그리고 VHCDR3은 1개 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는 서열번호 6의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1, 7 또는 8의 상기 1 또는 2개 아미노산 치환은 그 서열에서 위치 9 및/또는 11에 존재한다.
서열 동일성은 임의의 편리한 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 서열 간에 서열 동일성의 정도를 결정하기 위해, 서열의 쌍별 또는 다중 정렬을 만드는 컴퓨터 프로그램이 유용하고, 임의의 다른 적절한 프로그램이 사용될 수 있지만, 예를 들어 EMBOSS 니들 또는 EMBOSS 스트레처(둘 다 문헌[Rice, P. et al., Trends Genet. 16, (6) pp. 276-277, 2000])가 쌍별 서열 정렬에 대해 사용될 수 있는 반면 Clustal Omega(문헌[Sievers F et al., Mol. Syst. Biol. 7:539, 2011]) 또는 MUSCLE(문헌[Edgar, R.C., Nucleic Acids Res. 32(5):1792-1797, 2004])이 다중 서열 정렬에 대해 사용될 수 있지만, 임의의 다른 적절한 프로그램이 사용될 수 있다. 정렬이 쌍별이든 또는 다중이든 간에, 이것은 국소적으로 보다는 전반적으로(즉 참조 서열의 전체에 걸쳐) 수행되어야 한다.
서열 정렬 및 동일성% 계산은 예를 들어 표준 Clustal Omega 파라미터: 매트릭스 Gonnet, 갭 개구 페널티 6, 갭 연장 패널티 1을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 표준 EMBOSS 니들 파라미터, 매트릭스 BLOSUM62, 갭 개구 페널티 10, 갭 연장 패널티 0.5가 사용될 수 있다. 임의의 다른 적합한 파라미터가 대안적으로 사용될 수 있다.
상이한 방법에 의해 수득된 서열 동일성 값 사이에 분쟁이 있는 본 출원의 목적의 경우, 디폴트 파라미터를 갖는 EMBOSS 니들을 사용하여 전반적인 쌍별 정렬에 의해 수득된 값이 유효한 것으로 간주되어야 한다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 바람직하게는 항체 또는 항체 단편이다. "항체"는 상기에 기재된 특징을 갖는 면역글로불린이다. CDR을 보유하지만, 이후에서 논의된 바와 같은 상이한 프레임워크로 제시되고, 동일한 방식으로 기능하는, 즉 항원에 대한 특이성을 보유하는 자연 발생 항체의 변이체가 또한 본 발명에 의해 고려된다. 따라서 항체는 자연 발생 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로, 동일한 방식으로 기능하는 자연 또는 비-자연 등가물 또는 동족체로 대체된, 기능적 등가물 또는 동족체를 포함한다.
본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자가 항체인 경우, 이것은 바람직하게는 단클론성 항체이다. "단클론성 항체"는 단일 항체 종으로 구성되는 항체 제제를 의미하고, 즉 제제 내의 모든 항체는 동일한 CDR을 포함하여 동일한 아미노산 서열을 갖고, 따라서 동일한 효과로 그것의 표적 항원("표적 항원"은 특정 항체에 의해 결합된 에피토프를 함유하는 항원을 의미하고, 즉 항-Anx-A1 항체의 표적 항원은 Anx-A1임) 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 즉, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체는 바람직하게는 항체의 다클론성 혼합물의 일부가 아니다.
상기에 기재된 바와 같이, 항체에 있어서, CDR 서열은 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인에 위치된다. CDR 서열은 폴리펩타이드 프레임워크 내에 자리하며, 이는 CDR을 항원 결합을 위해 적절하게 위치시킨다. 따라서 가변 도메인의 나머지(즉, CDR 중 임의의 하나의 일부를 형성하지 않는 가변 도메인 서열의 일부)는 프레임워크 영역을 구성한다. 성숙한 가변 도메인의 N-말단은 프레임워크 영역 1(FR1)을 형성하고; CDR1과 CDR2 사이의 폴리펩타이드 서열은 FR2를 형성하고; CDR2와 CDR3 사이의 폴리펩타이드 서열은 FR3을 형성하고; 그리고 불변 도메인에 CDR3을 연결하는 폴리펩타이드 서열은 FR4를 형성한다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체에서, 가변 영역 프레임워크 영역은 항체가 그것의 CDR을 통해 인간 Anx-A1에 결합하도록 임의의 적절한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 불변 영역은 임의의 포유동물(바람직하게는 인간) 항체 아이소타입의 불변 영역일 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 특이적 결합 분자는 다중-특이적, 예를 들어 이중 특이적 단클론성 항체일 수 있다. 다중-특이적 결합 분자는 적어도 2개의 상이한 분자 결합 파트너에 결합하는, 예를 들어 2개 이상의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는 영역 또는 도메인(항원-결합 영역)을 함유한다. 이중 특이적 항체의 경에서, 항체는 상기에 기재된 바와 같은 형성에서 2개의 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 단, 2개 중쇄 및 2개 경쇄의 가변 도메인 각각은 상이하고, 따라서 2개의 상이한 항원-결합 영역을 형성한다. 다중-특이적(예를 들어, 이중 특이적) 결합 분자, 예를 들어 단클론성 항체에 있어서, 항원-결합 영역 중 하나는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자의 CDR 서열을 갖고, 따라서 Anx-A1를 결합한다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 다중-특이적 결합 분자의 다른 항원-결합 영역(들)은 본 발명에 따라서 사용하기 위한 CDR에 의해 형성된 항원-결합 영역에 상이하고, 예를 들어 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자에 대해 본 명세서에서 정의된 것과 상이한 서열을 갖는 CDR을 갖는다. 예를 들어, 이중 특이적 항체에서, 특이적 결합 분자의 추가의(예를 들어 제2) 항원-결합 영역(들)은 또한, 그러나 (본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자의 CDR을 갖는) Anx-A1에 결합하는 제1 항원-결합 영역에 대한 상이한 에피토프에서 Anx-A1을 결합할 수 있다. 대안적으로, 추가의(예를 들어, 제2) 항원-결합 영역(들)은 Anx- A1이 아닌 추가의(예를 들어 제2), 상이한 항원(들)을 결합할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 예를 들어, 항체에서 특이적 결합 분자에서의 2개 이상의 항원-결합 영역 각각은 동일한 항원에 결합할 수 있고, 즉 다가(예를 들어 2가) 분자를 제공할 수 있다.
이러한 특이적 결합 분자는 인간 Anx-A1를 결합할 수 있는 항체 단편 또는 합성 작제물일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체 단편은 항원-결합 도메인(즉, 그것이 유래된 항체의 항원-결합 도메인)을 포함한다. 항체 단편은 문헌[Rodrigo et al., Antibodies, Vol. 4(3), p. 259-277, 2015]에 논의되어 있다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체 단편은 바람직하게는 단클론성이다(즉, 이들은 항체 단편의 다클론성 혼합물의 일부가 아니다). 항체 단편은, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 단편을 포함한다. Fab 단편은 문헌[Roitt et al, Immunology second edition (1989), Churchill Livingstone, London]에 논의되어 있다. Fab 단편은 항체의 항원-결합 도메인을 구성하고, 즉, 개별 항체는, 그 각각이 경쇄와 중쇄의 그것의 연합된 N-말단 부문을 구성하는, 2개의 Fab 단편을 함유하는 것으로 인지될 수 있다. 따라서 Fab 단편은 전체 경쇄와 이것이 결합되는 중쇄의 VH 및 CH1 도메인을 함유한다. Fab 단편은 항체를 파파인으로 항체를 소화시킴으로써 수득될 수 있다.
F(ab')2 단편은 항체의 2개의 Fab 단편과 2개의 중쇄를 함께 연결하는 디설파이드 결합을 포함한 중쇄 도메인의 힌지 영역으로 구성된다. 즉, F(ab')2 단편은 2개의 공유적으로 연결된 Fab 단편으로 인지될 수 있다. F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 소화시킴으로써 수득될 수 있다. F(ab')2 단편의 환원은 다른 분자에 대한 단편의 컨주게이션에 유용할 수 있는 추가의 설프하이드릴기를 함유하는 Fab 단편으로 관찰될 수 있는 2개의 Fab' 단편을 생성한다.
Fv 단편은 경쇄 및 중쇄의 단지 가변 도메인으로 구성된다. 이들은 공유결합되지 않고, 비-공유 상호작용에 의해 단지 약하게 함께 유지된다. Fv 단편은 단일 쇄 Fv(scFv) 분자로 공지된 합성 작제물을 생산하도록 변형될 수 있다. 이러한 변형은 단일 폴리펩타이드가 VH 도메인 및 VL 도메인 둘 다를 포함하는 융합 단백질을 생산하도록 항체 유전자를 조작함으로써 전형적으로 재조합으로 수행된다. scFv 단편은 일반적으로, 분자의 안정성에 기여하는, VH 영역 및 VL 영역을 공유적으로 연결하는 펩타이드 링커를 포함한다. 링커는 1 내지 20개의 아미노산, 예컨대, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산, 5, 10 또는 15개의 아미노산, 또는 편리하기로는 1 내지 20개 범위의 다른 중간 수의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 링커는 임의의 일반적으로 편리한 아미노산 잔기, 예컨대 글리신 및/또는 세린으로부터 형성될 수 있다. 적합한 링커의 일 예는 Gly4Ser이다. 이러한 링커의 다량체, 예컨대, 예를 들어 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체, 예를 들어, (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)5가 사용될 수 있다. 그러나, 링커가 존재하는 것이 필수적인 것은 아니고, VL 도메인은 펩타이드 결합에 의해 VH 도메인에 연결될 수 있다. scFv는 본 명세서에서 항체 단편으로 정의된다.
이러한 특이적 결합 분자는 scFv의 유사체일 수 있다. 예를 들어, scFv는 다른 특이적 결합 분자((예를 들어, 인간 프레임워크를 갖는) 예를 들어, 다른 scFv, Fab 항체 단편 및 키메라 IgG 항체)에 연결될 수 있다. scFv는 다중-특이적 결합 단백질, 예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체인 다량체를 형성하기 위해 다른 scFv에 연결될 수 있다. 이중 특이적 scFv는 때때로 디아바디, 트리아바디와 같은 삼중-특이적 scFv 및 테트라바디와 같은 테트라-특이적 scFv로 지칭된다. 다른 실시형태에서 본 발명의 scFv는 다른, 동일한 scFv 분자에 결합될 수 있고, 따라서 단일-특이적 다량체를 형성하지만 다가, 예를 들어 2가 이량체 또는 3가 삼량체가 형성될 수 있다.
사용될 수 있는 합성 작제물은 CDR 펩타이드를 포함한다. 이들은 항원-결합 결정인자를 포함하는 합성 펩타이드이다. 펩타이드 모방체가 또한 사용될 수 있다. 이들 분자는 일반적으로 CDR 루프의 구조를 모방하고 항원-상호작용 측쇄를 포함하는 입체배좌-구속된 유기 고리이다.
상기에 언급된 바와 같이, 특정 실시형태에서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 서열번호 1, 7 또는 8 및 2 내지 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 상술한 바와 같이, 이것은 뮤린 항체 Mdx001로부터 유래되거나 변형된다. 그러나, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체 또는 이의 단편은 바람직하게는 인간이거나 또는 인간화된다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 인간/마우스 키메라 항체일 수 있거나 또는 바람직하게는 인간화될 수 있다. 이것은 특히 단클론성 항체 및 항체 단편에 대한 경우이다. 분자가 인간 치료제로 사용되려는 경우, 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편이 바람직하다. 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체로 인간을 치료적으로 치료하는 것은 다수의 이유, 예를 들어, 항체의 짧은 생체내 반감기; 인간 면역 효과기 세포 상의 Fc 수용체에 의한 비인간 중쇄 불변 영역의 낮은 인식에 기인한, 외래 중쇄 불변 영역에 의해 매개된 약한 효과기 기능; 항체에 대한 환자 감작 및 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응의 생성(뮤린 항체의 맥락에서); 및 치료적 효능의 손실을 초래하는 HAMA에 의한 마우스 항체의 중성화 때문에 비효과적일 수 있다.
키메라 항체는 하나의 종으로부터 유래된 가변 영역 및 또 다른 것으로부터 유래된 불변 영역을 갖는 항체이다. 따라서 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체 또는 항체 단편은 뮤린 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 포함하는 키메라 항체 또는 키메라 항체 단편일 수 있다.
상기에 상술된 바와 같이, 항체의 아이소타입은 그것의 중쇄 불변 영역의 서열에 의해 정의된다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 키메라 항체는 임의의 인간 항체 아이소타입, 및 각각의 아이소타입 내의 임의의 하위-부류의 불변 영역을 가질 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 항체의 Fc 영역을 가질 수 있지만(즉 키메라 항체는 각각 중쇄 α, δ, ε, γ 또는 μ의 불변 도메인을 포함할 수 있음), 바람직하게는 본 발명의 항체는 IgG 아이소타입의 것이다. 따라서 본 발명의 키메라 항체는 임의의 아이소타입의 것일 수 있다. 키메라 항체의 경쇄는 κ 또는 λ 경쇄 중 어느 하나일 수 있고, 즉 이것은 인간 λ 경쇄 또는 인간 κ 경쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 상응하게, 키메라 항체 단편은 불변 도메인을 포함하는 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편)이다. 본 발명의 키메라 항체 단편의 불변 도메인은 상기에 기재된 바와 같이 키메라 단클론성 항체에 대한 것일 수 있다.
키메라 항체는 임의의 적합한 기술, 예를 들어, 뮤린 가변 도메인의 DNA 서열이 키메라 항체를 암호화하도록 인간 불변 도메인(들)의 DNA 서열에 융합되는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 키메라 항체 단편은 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 생산하도록 재조합 DNA 기술을 사용하거나, 또는 상기에 기재된 바와 같은 원하는 단편을 생성하도록 본 발명의 키메라 항체를 가공함으로써 수득될 수 있다. 키메라 항체는 인간 요법에 외래, 예를 들어, 뮤린 항체를 사용하는 것과 연관된 짧은 생체내 반감기 및 약한 효과기 기능의 문제를 극복한다고 예측될 수 있고, 그리고 환자 감작 및 HAMA가 발생하는 확률을 감소시킬 수 있다. 그러나, 환자 감작 및 HAMA는 가변 도메인 내의 뮤린 서열의 존재로 인해서, 키메라 항체가 인간 환자에게 투여될 때 여전히 발생할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체 또는 항체 단편은 따라서 완전하게 인간화된다. 인간화된 항체는, 인간 불변 도메인으로 대체된 항체 쇄의 불변 도메인이 있을 뿐만 아니라, 가변 영역의 아미노산 서열이, 바람직하게는, 항 체에 비-인간 서열만 CDR 서열이 되도록, 특히 외래(예를 들어, 뮤린) 프레임워크 서열을 인간 프레임워크 서열로 대체하도록 변형된, 또 다른 종, 예를 들어, 마우스로부터 유래된 항체이다. 인간화된 항체는 환자 감작 및 HAMA가 발생할 확률을 회피하거나 최소화하는 것을 포함하여, 인간에서 비-인간 항체의 치료적 용도와 연관된 모든 문제를 극복할 수 있다.
항체 인간화는 CDR 이식으로 공지된 방법에 의해 일반적으로 수행되지만, 당업계에서의 임의의 다른 기술이 사용될 수 있다. 항체 이식은 문헌[Williams, D.G. et al., Antibody Engineering Vol. 1, edited by R. Kontermann and S. Dubel, Chapter 21, pp. 319-339]에 널리 기재되어 있다. 이 방법에서, 상기에 기재된 바와 같이 키메라 항체가 먼저 생성된다. 따라서, 항체의 인간화의 맥락에서, 비-인간 불변 도메인이 인간 불변 도메인으로 대체되어, 인간 불변 도메인 및 비-인간 가변 도메인을 포함하는 키메라 항체를 산출한다.
외래, 예를 들어 뮤린 가변 도메인의 후속 인간화는 가장 적절한 인간 가변 영역의 FR 내에 각각의 면역글로불린 사슬로부터의 뮤린 CDR을 삽입하는 것을 포함한다. 이것은 공지된 인간 가변 도메인의 데이터베이스(예를 들어 IMGT 또는 Kabat)로 뮤린 가변 도메인을 정렬함으로써 수행된다. 적절한 인간 프레임워크 영역은 최상의 정렬된 가변 도메인, 예를 들어 인간과 뮤린 프레임워크 영역 사이의 높은 서열 동일성을 갖는 도메인, 동일한 길이의 CDR을 함유하는 도메인, (상동성 모델링에 기반하여) 가장 유사한 구조를 갖는 도메인, 등으로부터 식별된다. 이어서, 뮤린 CDR 서열은 재조합 DNA 기술을 사용하여 적절한 위치에서 리드 인간 프레임워크 서열 내에 이식되고, 이어서 인간화된 항체가 생산되고, 표적 항원에 대한 결합에 대해 시험되었다. 항체 인간화의 과정은 추가의 지시 없이 본 기술을 수행할 수 있는 숙련된 개인에게 공지되어 있고 이해된다. 항체 인간화 서비스는 또한 수많은 상업적 회사, 예를 들어 GenScript(미국/ 중국) 또는 MRC Technology(영국)에 의해 제공된다. 인간화된 항체 단편은 상기에 기재된 바와 같은 인간화된 항체로부터 쉽게 수득될 수 있다.
대안적으로, 완전 인간 단클론성 항체는 문헌[Frenzel et al. (Transfus. Med. Hemother. 44(5): 312-318, 2017)]에 기재된 바오 같은, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 면역화 없이 그리고 시험관내에서 얻어질 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체 또는 항체 단편은 임의의 종으로부터 유래될 수 있고, 그것은 뮤린 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 그러나, 항체 또는 항체 단편이 키메라 항체 또는 항체 단편인 것이 바람직하며, 즉, 항체 또는 항체 단편의 가변 도메인만 비인간이고, 불변 도메인이 모두 인간 인 것이 바람직하다. 최적으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 항체 또는 항체 단편은 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편이다.
WO 2018/146230에 상세히 설명된 바와 같이, Mdx001의 인간화 버전이 본 발명자들에 의해 개발되었다. 인간화 경쇄 가변 도메인은 서열번호 9(L1M2 가변 영역으로 알려짐) 및 서열번호 10(L2M2 가변 영역으로 알려짐)에 제시된 아미노산 서열로 개발되었으며, 상기에 설명한 CDR을 함유한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체 또는 이의 단편은 서열번호 9 또는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%(바람직하게는 적어도 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 CDR 서열 VLCDR1 내지 3은 각각 서열번호 1, 7 또는 8 및 2 내지 3과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
인간화 중쇄 가변 도메인은 서열번호 11(H4 가변 영역으로 알려짐) 및 서열번호 12(H2 가변 영역으로 알려짐)에 제시된 아미노산 서열로 개발되었다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 항체 또는 이의 단편은 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%(바람직하게는 적어도 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 CDR 서열 VHCDR1 내지 3은 각각 서열번호 4 내지 6과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 IgG1 아이소타입의 단클론성 항체이고, κ 하위유형의 경쇄를 포함한다. L1M2 경쇄는 κ 하위유형을 갖고, 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. H4 중쇄는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 L1M2 경쇄 및 H4 중쇄를 포함하는 L1M2H4 항체이다. 따라서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 하기를 포함하거나 하기로 이루어진 단클론성 항체일 수 있다:
i) 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%(바람직하게는 적어도 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(여기서 CDR 서열 VLCDR1 내지 3은 각각 서열번호 1, 7 또는 8 및 2 내지 3과 적어도 85%의 서열 동일성을 가짐); 및
ii) 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%(바람직하게는 적어도 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(여기서 CDR 서열 VHCDR1 내지 3은 각각 서열번호 4 내지 6과 적어도 85%의 서열 동일성을 가짐).
유사하게, L2M2 경쇄는 κ 하위유형을 갖고, 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. H2 중쇄는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 L2M2 경쇄 및 H2 중쇄를 포함하는 L2M2H2 항체이다. 따라서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 하기를 포함하는 단클론성 항체일 수 있다:
i) 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%(바람직하게는 적어도 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(여기서 CDR 서열 VLCDR1 내지 3은 각각 서열번호 1, 7 또는 8 및 2 내지 3과 적어도 85%의 서열 동일성을 가짐); 및
ii) 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%(바람직하게는 적어도 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(여기서 CDR 서열 VHCDR1 내지 3은 각각 서열번호 4 내지 6과 적어도 85%의 서열 동일성을 가짐).
대안적인 실시형태에서, L1M2 경쇄는 H2 중쇄와 짝을 이룰 수 있고, L2M2 경쇄는 H4 중쇄와 짝을 이룰 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 항체 쇄는 신호 서열과 함께 자연적으로 생성된다. 항체 신호 서열은 경쇄 및 중쇄의 N-말단, 가변 영역의 N-말단에 위치한 아미노산 서열이다. 신호 서열은 항체 쇄가 생산되는 세포에서 외수송되도록 지시한다. 세포 발현 시스템에서 생산되는 경우, 서열번호 13 내지 16의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 중쇄는 신호 서열과 함께 암호화될 수 있다. L1M2 및 L2M2 경쇄의 신호 서열은 서열번호 20에 제시되어 있으며; H2 및 H4 중쇄의 신호 서열은 서열번호 21에 제시되어있다. 신호 서열과 함께 합성되는 경우, 따라서 L1M2 쇄는 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열로 합성될 수 있고; H4 쇄는 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열로 합성될 수 있고; L2M2 쇄는 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열로 합성될 수 있고, H2 쇄는 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열로 합성될 수 있다. 이러한 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 당업자에 의해 쉽게 유래될 수지만, 서열번호 22 내지 25의 항체 쇄를 암호화하고 이들의 합성에 사용될 수 있는 적합한 뉴클레오타이드 서열의 예는 각각 서열번호 26 내지 29에 제시되어있다.
상기에 상술된 바와 같이, 본 발명은 대상체에서 암 치료에 사용하기 위한 특이적 결합 분자(상기에 기재된 바와 같음)를 제공한다. 고환암, 난소암, 결장직장암, 자궁경부암, 유방암, 방광암, 담관암, 위함, 두경부암, 식도암, 폐암, 췌장암, 중피종, 림프종, 뇌종양 및 신경 모세포종의 치료를 포함한, 임의의 암의 치료에서의 용도가 포괄된다. 바람직한 양태에서 난소암이 치료된다. 또 다른 양태에서, 유방암이 치료된다. 바람직한 실시형태에서, 유방암은 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR) 및 인간 표피 성장 인자 수용체 HER2 중 하나 이상을 발현한다. 다른 실시형태에서, 유방암은 삼중 음성이다(즉, ER-/PR-/HER2-). 또 다른 양태에서, 결정직장암이 치료된다. 또 다른 양태에서, 췌장암이 치료된다. 또 다른 양태에서, 폐암이 치료된다. 암종(선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 전이 세포 암종 등 포함), 육종, 백혈병 및 림프종을 포함하는 모든 유형의 암이 본 발명에 따라 치료될 수 있다.
본 발명에 따르면, I기, II기, III기 및 IV기 암을 포함하는 임의의 병기(또는 등급)의 암이 치료될 수 있다. 전이성 및 국소(즉, 비전이성) 암 모두 치료될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서 암은 Anx-A1을 발현한다(즉, 암 내의 세포가 예를 들어, 세포 표면에서 Anx-A1을 발현한다는 것을 의미함). 당업자가 암이 Anx-A1을 발현하는지의 여부를 결정하는 것은 간단하다. Anx-A1 발현은 암의 생검 샘플에서, 예를 들어, 샘플의 면역조직화학 분석에 의해 단백질 수준에서 분석될 수 있다. 샘플은 당업계의 표준 절차에 따라 Anx-A1 발현을 검출하기 위해 항-Anx-A1 항체(예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 상기 기재된 항체)를 사용하여 면역염색될 수 있다. (예를 들어, 당업계에서 표준인 세제를 사용하여) 샘플을 투과시킴으로써 세포내 및 세포외 Anx-A1 둘 다를 검출할 수 있다.
대안적으로, Anx-A1 발현은 예를 들어, 정량적 PCR(qPCR)에 의해 핵산 수준에서 분석될 수 있다. mRNA는 조직 샘플로부터 추출되고, 당업계 표준 절차를 사용하여 DNA로 역전사될 수 있다. Anx-A1 발현 수준은 표적 Anx-A1 서열의 정량적 증폭에 의해 결정될 수 있다. 적합한 qPCR 기술, 예를 들어, TaqMan은 당업계에 널리 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, 암은 Anx-A1을 과발현한다. "Anx-A1을 과발현한다"는 것은 암이 동일한 공급원의 건강한 조직보다 더 높은 수준으로 Anx-A1을 발현함을 의미한다. 즉, 암성 세포는 동일한 공급원의 건강한(즉, 비암성) 세포보다 더 높은 수준으로 Anx-A1을 발현한다. 동일한 공급원은 동일한 조직을 의미한다. 예를 들어, 난소 상피 세포 암종은 건강한 난소 상피 조직보다 더 높은 수준으로 Anx-A1을 발현하는 경우 Anx-A1을 과발현하는 것으로 간주될 수 있다. 따라서 암 조직이 Anx-A1을 과발현하는지의 여부는 적어도 2개의 다른 조직(암 조직 및 건강한 대조군 조직)에서 Anx-A1 발현을 정량적으로 비교하는 것이 필요하다. qPCR이 가장 적합 할 수 있지만 이 비교를 수행하기 위해 적절한 기술을 사용할 수 있다. 당업자가 암이 Anx-A1을 과발현하는지의 여부를 결정하는 것은 간단할 것이다. 특정 실시형태에서, 이를 과발현하는 암에서 Anx-A1 발현 수준과 건강한 조직 사이의 차이는 통계학적으로 유의하다. 다른 실시형태에서, Anx-A1 발현은 상응하는 건강한 조직에 비해 암성 조직에서 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 이상 증가된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 암은 그 표면에서 Anx-A1을 발현한다(즉, Anx-A1은 암 세포의 표면에서 발현된다). 암세포의 표면 상에서 Anx-A1의 발현은 세포가 Anx-A1을 발현하고, 발현된 Anx-A1이 세포 표면에 외수송되어, 국지화된다는 것을 의미한다. Anx-A1의 세포 표면 발현은 상기에 설명한 바와 같이 면역조직화학에 의해 식별될 수 있다. 특히 Anx-A1의 세포 표면 발현을 분석하기 위해 세포 투과 없이 면역조직화학 분석을 수행한다. 이는 조직에서 Anx-A1을 검출하는 데 사용되는 항체가 세포 내부로 들어갈 수 없고, 세포외(예를 들어, 표면에 위치한) 단백질만 검출될 수 있음을 의미한다. 외수송된 Anx-A1은 일반적으로 (혈장 또는 다른 세포외 공간으로 방출되지 않고) 세포 표면에 부착되며, 따라서 비-투과성 세포의 면역조직화학에 의해 검출된 모든 Anx-A1은 표면에 위치한 Anx-A1이라고 간주될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 표준 프로토콜에 따라, 단백질을 포함한 느슨한 세포외 물질을 제거하기 위해 염색 전에 조직을 세척할 수 있다.
본 발명에 의해 치료되는 암은 약물 내성암일 수 있다. 즉, 암은 하나 이상의 화학치료제(화학요법 약물)에 내성이 있을 수 있다. 암에 대한 약물 내성은 상기 Housman 등의 문헌에 검토되어 있다. 암이 약물에 내약성인 경우, 즉 약물이 암에 대해 효과가 없는 경우(또는 효과가 없게 되는 경우) 암은 화학요법 약물에 내성이 있는 것으로 간주될 수 있다. 상기 Housman 등의 문헌에 상세히 설명된 바와 같이, 암은 약물의 불활성화 또는 대사(또는 대사 활성화의 예방), 약물 표적의 돌연변이 또는 변경, ABC 수송체를 통한 약물 유출 등 다양한 기전에 의해 약물 내성이 될 수 있다. 암이 약물 내성인지를 식별하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 둘 다 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Wang et al. (Genes & Diseases 2: 219-221, 2015)] 및 문헌[Volm & Efferth (Front. Oncol. 5: 282, 2015)]을 참고하기 바란다. 이러한 방법은 생체외 세포 집단에 대한 약물의 효과 시험 및 감수성/ 저항성 마커에 대한 암세포의 유전적 스크리닝을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 의해 치료되는 암은 다제 내성(MDR)이다. MDR 암이란 하나 이상의 화학요법 약물, 특히 하나 이상의 화학요법 약물 패밀리에 내성이 있는 암을 의미한다. MDR 암은 2, 3, 4 또는 5종 이상의 다른 화학요법 약물 또는 화학요법 약물 패밀리(또는 클래스)에 내성이 있을 수 있다. 용어 "MDR 암"은 당업계에 널리 공지되어 있고, 당업계에서의 의미에 따라 본 맥락에서 사용된다. MDR 암은 공지된 모든 화학요법 약물에 내성이 있을 수 있다. 다제 내성은 ABC 수송체 다제 내성 단백질 1(MDR1), 다제 내성 관련 단백질 1(MRP1) 및 유방암 내성 단백질(BCRP) 중 하나 이상의 발현에 의해 매개될 수 있다. 세 가지 모두 광범위한 기질 특이성을 가지고 있고, 이를 발현하는 세포로부터 여러 다른 부류의 화학치료제를 배출할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 실시예에서 백금-기반 화학요법에 내성이 있는 암세포의 증식을 저해하는데 특히 효과적인 것으로 나타났다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료되는 암은 백금-기반 화학치료제에 내성이 있다. (바람직하게는 이 경우에 암은 유방암, 결장직장암, 난소암, 폐암 또는 췌장암임.) 백금-기반 화학치료제는 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴 및 네다플라틴을 포함하며, 이들 모두는 인간에서 사용하도록 승인되었다. 다른 공지된 백금-기반 화학치료제는 사트라플라틴, 피코플라틴, 페난트리플라틴 및 트리플라틴 테트라니트레이트를 포함한다. 본 발명에 따라 치료되는 암은 이들 작용제 중 어느 하나 또는 모두에 대해 내성을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 암은 시스플라틴에 내성이다.
암세포는 또한 또는 대안적으로 질소 머스타드(예를 들어, 벤다무스틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 메클로레타민 및 멜팔란)를 포함하는 다른 이작용성 알킬화제에 내성일 수 있다.
대안적 또는 추가적 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료되는 암은 탁산(예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 토포아이소머라제 저해제(예를 들어, 토포테칸), 안트라사이클린(예를 들어, 독소루비신 및 에피루비신) 및 뉴클레오사이드 유사체(예를 들어, 젬시타빈)와 같은 화학치료제에 내성일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 실시형태에서 화학치료제는 안트라사이클린, 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신이라고도 함)이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료되는 암은 호르몬 치료제(예를 들어, 항-에스트로겐 호르몬 치료제, 예컨대, 타목시펜)에 내성이다. 유방암은 특히 호르몬 치료제, 예컨대, 타목시펜에 내성이 있을 수 있다. 본 발명에 따라 치료되는 암은 이들 작용제 중 어느 하나 또는 모두에 대해 내성을 가질 수 있다. (바람직하게는 이 경우에 암은 유방암, 결장직장암, 난소암, 폐암 또는 췌장암임.) 특정 실시형태에서, 암은 (선택적으로 백금-기반 화학치료제에 대한 내성에 추가로) 독소루비신에 대해 내성이 있다.
암세포는 상기에 논의한 바와 같이 다수의 기전에 의해 백금-기반 화학치료제에 대한 내성을 획득할 수 있다. 예를 들어, 암에 의한 메탈로티오네인 및/또는 글루타티온의 생산은 백금-기반 작용제의 불활성화로 이어질 수 있는 반면, 이러한 작용제에 의해 유도된 DNA 손상은 뉴클레오타이드 절제 수선 및 상동성 재조합의 활성 경로에 의해 수선될 수 있기 때문에, 백금-기반 작용제의 작용을 역전시킬 수 있다. 다른 기전이 또한 역할을 할 수 있으며, 세포가 백금-기반 요법에 내성을 갖도록 하기 위해 여러 개의 비-중복 기전이 필요할 수 있다. 백금-내성으로 식별된 환자는 마지막 백금-기반 화학요법 치료 후 6개월 이내에 종양 진행을 나타낸다. 약물 노출 후 생식 세포 생존을 시험하기 위해 클론생성 검정을 사용함으로써 세포가 백금 내성인 것으로 식별될 수 있다. 이것은 암 세포가 약물 노출 후 종양이나 집락을 형성할 수 있는지를 식별한다.
특이적 결합 분자는 약제학적 조성물의 형태로 치료될 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용 가능한"은 조성물의 다른 성분과 양립 가능할 뿐만 아니라 수여자에게 생리학적으로 허용 가능한 성분을 지칭한다. 조성물의 특성 및 담체 또는 부형제 물질, 투여량 등은, 선택사항, 투여의 원하는 경로 등에 따라 통상의 방식으로 선택될 수 있다. 마찬가지로, 투여량은 통상의 방식으로 결정될 수 있고, 분자의 특성, 환자의 연령, 투여의 모드 등에 따라 달라질 수 있다.
약제학적 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해 대상체에게 투여하기 위해 제조될 수 있다. 이러한 투여는 예를 들어, 구강, 직장, 비강, 국소, 질 또는 비경구일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 경구 투여는 협측 및 설하 투여를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 국소 투여는 경피 투여를 포함한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 비경구 투여는 피하, 근육내, 정맥내, 복강내 및 피내 투여를 포함한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물은 액체 용액 또는 시럽, 고체 조성물, 예컨대, 분말, 과립, 정제 또는 캡슐, 크림, 연고 및 당업계에서 일반적으로 사용되는 임의의 다른 스타일의 조성물을 포함한다. 이러한 조성물에 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 및 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 부형제는 락토스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 스테아르산 또는 이의 염, 식물성 오일, 왁스, 지방 및 폴리올을 포함한다. 적합한 담체 또는 희석제는 카복시메틸셀룰로스(CMC), 메틸셀룰로스, 하이드록시 프로필메틸셀룰로스(HPMC), 덱스트로스, 트레할로스, 리포좀, 폴리비닐 알코올, 제약 등급 전분, 만니톨, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 포도당, 수크로스(및 다른 당), 탄산마그네슘, 젤라틴, 오일, 알코올, 세제 및 유화제, 예컨대, 폴리소르베이트를 포함한다. 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미료 등이 또한 사용될 수 있다.
액체 약제학적 조성물은 용액, 현탁액 또는 기타 유사 형태이든, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 링거 용액, 등장성 염화나트륨, 고정 오일, 예컨대, 용매 또는 현탁 매질로 작용할 수 있는 합성 모노-또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매; 항박테리아제, 예컨대, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 완충제, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조절제, 예컨대, 덱스트로스. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다회 용량 바이알에 동봉될 수 있다. 주사용 약제학적 조성물은 바람직하게는 무균이다.
본 발명에 따라서 사용하기 위한 약제학적 조성물은 임의의 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자의 병태, 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 따라 결정되지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다. 편리하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 일 단위, 주 단위 또는 월 단위 용량 또는 중간 빈도의 용량으로 대상체에게 제공될 수 있거나, 예를 들어, 용량은 2, 3, 4, 5 또는 6일마다, 2, 3, 4, 5 또는 6주마다, 2, 3, 4, 5 또는 6개월마다, 매년 또는 2년마다 제공될 수 있다. 용량은 10 ng/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어, 1 μg/kg 내지 10 mg/kg 체중, 예를 들어, 10 μg/kg 내지 1 mg/kg의 양이 제공될 수 있다. 숙련된 임상의는 모든 관련 요소, 예를 들어, 연령, 신장 체중 및 치료하고자 하는 병태에 기초하여 환자에 대한 적절한 용량을 계산할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 특이적 결합 분자 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량으로 투여된다. "치료적 유효량"은 대상체의 상태에 이익을 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 양이 대상체의 병태에 유익하기에 충분한지의 여부는 의사/수의사가 결정할 수 있다.
치료는 대상체에게 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 그러나, 편리하게는, 본 발명에 따른 사용에서, 특이적 결합 분자는 치료에 사용되는 유일한 치료 분자이며, 예를 들어 치료는 다른 세포 독성제 또는 면역치료제와 함께 수행되지 않는다. 세포 독성제는 하기에 기재된 바와 같다. 면역치료제는 면역 반응을 유도, 강화 또는 억제하는 작용을 하는 투여되는 작용제이다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 표적 암에 제2 치료 분자를 전달하기 위해 사용되지 않는다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 특이적 결합 분자는 세포 독성 분자 또는 방사성 핵종과 같은 제2 치료 분자에 접합되지 않는다(그리고 이에 대한 결합 파트너를 제공하지 않는다).
사용되는 경우, 제2 치료제는 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자와 동일한 약제학적 조성물 내에서 또는 상기 기재된 바와 같을 수 있는 별도의 약제학적 조성물 내에서 투여될 수 있다. (따라서, 의약이 제조되는 용도에서, 의약은 특이적 결합 분자(또는 제2 치료제)를 함유할 수 있고, 상기 치료는 제2 치료제(또는 특이적 결합 분자)를 의약과 별도로, 순차적으로 또는 동시에 투여하는 것을 포함할 수 있다.) Anx-A1 및 제2 치료제에 결합하는 특이적 결합 분자는 별도로, 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "별도" 투여는 특이적 결합 분자 및 제2 치료제가 동시에 또는 적어도 실질적으로 동시에 그러나 상이한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여된다는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "동시" 투여는 특이적 결합 분자 및 제2 치료제가 동시에 또는 적어도 실질적으로 동시에 동일한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여된다는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "순차적" 투여는 특이적 결합 분자 및 제2 치료제가 상이한 시간에 대상체에게 투여된다는 것을 의미한다. 특히, 제1 치료제의 투여는 제2 치료제의 투여가 시작되기 전에 완료된다. 제1 치료제 및 제2 치료제가 10분 내지 30일 간격으로, 예를 들어, 1시간 내지 96시간(또는 2주) 간격으로 투여되는 순차적 투여가 수행될 수 있다. 대상체에게 순차적으로 투여될 때, 제1 치료제 및 제2 치료제는 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
제2 치료제는 제2 항암제일 수 있지만, 다른 실시형태에서는 상이한 활성, 예를 들어, 항박테리아제 또는 항진균제, 또는 환자 치료에 유용한 다른 작용제일 수 있다. 특정 실시형태에서, 제2 치료제는 화학치료제, 특히 세포독성제이다. 본 명세서에서 언급되는 바와 같이, 화학치료제는 악성 세포 및 조직에 파괴적인 투여되는 약물이다. 세포 독성제는 세포를 파괴하거나 증식을 방지하는 물질이다. 임의의 부류의 화학치료제가 사용될 수 있으며, 예는 탁산(예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 토포아이소머라제 저해제(예를 들어, 토포테칸), 안트라사이클린(예를 들어, 독소루비신 및 에피루비신), 뉴클레오사이드 유사체(예를 들어, 젬시타빈), 백금-기반 작용제(예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴), 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드) 및 키나제 저해제제(예를 들어, 이마티닙) 또는 전술한 바와 같은 다른 화학치료제 또는 약물이다.
이러한 작용제는 본 발명에 따라 사용하기 위해 특이적 결합 분자와 조합하여 사용될 수 있다. 일 양태에서, 화학치료제는 암이 내성인 작용제일 수 있다(본 발명에서 사용하기 위해 특이적 결합 분자 없이 치료되는 경우). 대안에서, 화학치료제는 암이 내성인 작용제가 아니다(본 발명에서 사용하기 위해 특이적 결합 분자 없이 치료되는 경우).
본 발명에 따라 사용하기 위한 특이적 결합 분자는 또한 방사선 요법 및/또는 수술과 함께 대상체에게 투여될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 대상체의 암 치료에 관한 것이다. 치료는 치유적일 수 있지만(또는 치유적이도록 의도될 수 있지만), 대안적으로 완화적일 수 있다(즉, 단순히 암의 증상을 제한, 완화 또는 개선하거나, 생존을 연장하도록 설계됨). 바람직하게는 종양의 크기는 치료에 의해 감소되거나 성장 속도가 안정화되거나 감소된다. 종양 크기를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20, 30 또는 50%(예를 들어, 최대 30, 50, 75 또는 100%) 감소시키는 것이 바람직하고, 동일한 수준의 성장 감소가 바람직하다.
본 발명에 의해 치료되는 대상체는 임의의 포유 동물, 예를 들어, 농장 동물, 예컨대, 소, 말, 양, 돼지 또는 염소, 애완 동물, 예컨대, 토끼, 고양이 또는 개 또는 영장류, 예컨대, 원숭이, 침팬지, 고릴라 또는 인간일 수 있다. 가장 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 대상체는 암을 앓고 있거나 암을 앓고 있는 것으로 의심되는 동물(바람직하게는 인간)일 수 있다. 따라서 대상은 암 치료를 필요로 하는 개체이다.
따라서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하는 것으로 인지될 수 있고, 이 방법은 상기 대상체에게 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 치료, 암, 대상체 및/또는 특이적 결합 분자는 상기에 정의된 바와 같을 수 있다.
유사하게, 본 발명은 대상체에서 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자의 용도를 제공하는 것으로 인지될 수 있다. 치료, 암, 대상체 및/또는 특이적 결합 분자는 상기에 정의된 바와 같을 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자 및 화학치료제를 포함하는 키트를 제공한다. 적합한 화학치료제는 위에 설명되어 있다. 특이적 결합 분자 및 화학치료제는 별도의 용기, 즉, 별도의 조성물로 또는 단일 용기의 단일 조성물로 제공될 수 있다. 각각의 치료제는 임의의 적절한 형태, 예를 들어, 수용액 또는 동결 건조물로 제공될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은, 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자 및 대상체에서 암의 치료에서 별도로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 제2 치료제를 포함하는 제품을 제공한다. 제2 치료제, 암 및/또는 대상체는 상기에 정의된 바와 같을 수 있다. 특정 실시형태에서, 제2 치료제는 화학치료제이다. 특이적 결합 분자 및 제2 치료제는 별도의 용기, 즉, 별도의 조성물로 또는 단일 용기의 단일 조성물로 제공될 수 있다. 각각의 치료제는 임의의 적절한 형태, 예를 들어, 수용액 또는 동결 건조물로 제공될 수 있다.
본 출원에 인용된 모든 문헌은 본 명세서에 전체적으로 참조에 의해 포함된다.
본 발명은 하기 도면 및 비제한적인 실시예를 참조하여 추가로 이해될 수 있다.
도 1은 유방암 세포주 MCF7의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 L1M2H4 및 L2M2H2의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 2는 유방암 세포주 HCC1806의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 L1M2H4 및 L2M2H2의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 3은 난소암 세포주 A2780의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 L1M2H4 및 L2M2H2의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 4는 난소암 세포주 A2780cis의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 L1M2H4 및 L2M2H2의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 5는 난소암 세포주 A2780ADR의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 L2M2H2의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 6은 췌장암 세포주 MIA PaCa-2의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 L1M2H4 및 L2M2H2의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 7은 췌장암 세포주 BxPC-3의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 L1M2H4 및 L2M2H2의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 8은 유방암 세포주 HCC1806의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 ab65844의 효과를 도시한다. 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 또한 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 9는 유방암 세포주 MCF7의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 10은 타목시펜-내성 유방암 세포주 MCF-7/TAMR7의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 11은 난소암 세포주 A2780의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 ab65844의 효과를 도시한다. 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 또한 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 12는 결장직장암 세포주 HCT116의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 ab65844의 효과를 도시한다. 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 또한 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 13은 결장직장암 세포주 Caco-2의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 14는 결장직장암 세포주 SW480의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 15는 췌장암 세포주 BxPC-3의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 ab65844의 효과를 도시한다. 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 또한 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 16은 췌장암 세포주 MIA PaCa-2의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 17은 췌장암 세포주 PANC-1의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 18은 폐암 세포주 COR-L23의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 ab65844의 효과를 도시한다. 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 또한 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 19는 아드리아마이신-내성 폐암 세포주COR-L23.5010의 증식에 대한 항-Anx-A1 항체 MDX-124 및 비-특이적 대조군 IgG의 효과를 도시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 20은 유방암의 마우스 모델에서 MDX-124 치료 결과를 도시한다. 이 도면은 4개의 치료군에 대한 평균 종양 부피를 나타낸다. 군 1은 비히클(PBS) 단독의 용량이 투여된 대조군이다. 군 2는 1 mg/kg의 MDX-124의 용량이 투여되었고, 군 3은 10 mg/kg의 MDX-124의 용량이 투여되었으며, 군 4는 25 mg/kg의 MDX-124의 용량이 투여되었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 21은 유방암의 마우스 모델에서 MDX-124 치료 결과를 도시한다. 이 도면은 4개의 치료군에 대한 평균 상대 종양 부피를 나타낸다. 군 1은 비히클(PBS) 단독의 용량이 투여된 대조군이다. 군 2는 1 mg/kg의 MDX-124의 용량이 투여되었고, 군 3은 10 mg/kg의 MDX-124의 용량이 투여되었으며, 군 4는 25 mg/kg의 MDX-124의 용량이 투여되었다. 첫 번째 치료 투여일인, 제12일에 종양 부피는 기준선 종양 부피라고 정의되며, 즉, 100%의 상대 종양 부피이다. 따라서 제시된 상대 종양 부피는 제12일에 부피의 백분율로서 각각의 종양의 부피에 해당한다.
실시예
실시예 1 ― 세포 증식에 대한 항체의 효과
물질
세포주 MCF7, MCF-7/TAMR7, A2780, A2780cis, A2780ADR, HCT116, Caco-2, SW480, COR-L23, COR-L23.5010, MIA-PaCa-2, PANC-1 및 BxPC-3을 Public Health England Culture Collections로부터 입수하였다. HCC1806 세포주를 ATCC로부터 입수하였다. MCF7은 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체에 양성인 인간 유방 선암종 세포주이고; MCF-7/TAMR7은 MCF7의 타목시펜-내성 유도체이고; HCC1806은 삼중-음성 인간 유방암 세포주이고; A2780은 인간 난소 암종 세포주이고; A2780cis는 시스플라틴-내성 인간 난소 암종 세포주(A2780으로부터 유래됨)이고; A2780ADR은 아드리아마이신-내성 인간 난소 암종 세포주(A2780으로부터 유래됨)이고; MIA PaCa-2는 인간 췌장 암종 세포주이고; BxPC-3은 인간 췌장 선암종 세포주이고; PANC-1은 인간 췌장 상피모양 암종 세포주이고; Caco-2는 인간 결장직장 선암종 세포주이고; HCT116은 인간 결장직장 암종 세포주이고; SW480은 인간 결장직장 선암종 세포주이고; COR-L23은 인간 폐 거대 세포 암종 세포주이고; COR-L23.5010은 COR-L23의 아드리아마이신-내성 유도체이다.
L1M2H4 및 L2M2H2 항-Anx-A1 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 서열과 함께 WO 2018/146230에 개시되어 있다. L1M2H4 항체는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖고; L2M2H2 항체는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는다.
항-Anx-A1 항체 ab65844는 Abcam(영국)으로부터 입수하였다. 항체는 인간 Anx-A1 아미노산 3-24(서열번호 30)에 결합하는 다클론성 토끼 항체이다. 이 에피토프 서열은 Ca2+의 부재 하에서, 상기에 논의된 Anx-A1 코어 내의 포켓 내에 결합하는 Anx-A1의 N-말단 영역의 부분을 형성한다.
방법
세포 배양
초기 증식 검정에서, 세포를 하기 배지에서 배양하였다: DMEM + 글루타맥스, 10% FBS + pen/strep(MCF7, MIA PaCa-2, HCC1806), RPMI 1640 + 2 mM L-glu, 10% FBS + pen/strep(BxPc-3, A2780). A2780cis 및 A2780ADR을, 약물 내성을 유지하기 위해서 다양한 단계의 배양물에서 각각의 약물(즉, A2780cis의 경우 시스플라틴 및 A2780ADR의 경우 아드리아마이신)을 포함하는 것만 상이하고 A2780과 동일한 성장 배지에서 배양하였다.
추가 증식 검정에서, 세포를 하기 조건 하에서 하기 배지에서 배양하였다:
10% FBS, 1% pen/strep 및 1% L-글루타민을 함유하는 DMEM 중의 MCF7, HCC1806, MIA PaCa-2 및 PANC-1;
1% FBS, 1% pen/strep, 1% L-글루타민 및 1% 인슐린을 함유하는 페놀 레드 무함유 DMEM/F12 중의 MCF7/TAMR7;
10% FBS, 1% pen/strep 및 1% L-글루타민을 함유하는 RPMI 중의 A2780, COR-L23, COR-L23.5010 및 BxPC-3;
10% FBS, 1% pen/strep 및 1% L-글루타민을 함유하는 McCoy's 5A 중의 HCT116;
10% FBS, 1% pen/strep 및 1% L-글루타민을 함유하는 L-15 중의 SW480;
10% FBS, 1% pen/strep, 1% L-글루타민 및 1% 비-필수 아미노산 용액을 함유하는 MEM 중의 Caco-2.
추가로, 약물 내성을 유지하기 위해서, COR-L23.5010을 아드리아마이신의 존재 하에서 배양하였다. 모든 세포주를 5% CO2를 함유하는 분위기에서 37oC에서 배양하였다.
세포 증식 검정
세포 대사 활성을 측정하기 위해서 MTT 비색 분석을 사용하여 세포 증식을 측정하였다. 검정에서, NADPH-의존 세포 옥시도리덕타제 효소는 황색 테트라졸륨 염료인 MTT를 불용성인 자색 포르마잔 생성물로 환원시키고, 분광 광도계를 사용하여 500 내지 600 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화한다. 포르마잔의 양은 세포 증식 수준에 비례하며, 빠르게 분열하는 세포는 더 높은 수준의 MTT를 감소시킨다. 분석을 삼중으로 수행하였다. 세포를 최종 부피 100 μL로 시딩하였다.
초기 증식 검정에서, 세포를 하기 밀도로 시딩하였다: 1 x105/mL(MCF7, MIA PaCa-2 및 A2780cis의 경우 n=2), 2 x105/mL(A2780, A2780ADR 및 A2780cis의 경우 n=1), 5 x104/mL(HCC1806) 및 2.5 x104/mL(BxPC-3).
추가 증식 검정에서, 세포를 하기 밀도로 시딩하였다:
웰당 5 x 103개 세포의 MCF7, HCC1806, A2780, A2780ADR, A2780cis, COR-L23 및 HCT116;
웰당 1 x 104개의 MCF7/TAMR7, COR-L23.5010, SW480, Caco-2, MIA PaCa-2, BxPC-3 및 PANC-1.
이어서 세포를 검정 전에 24시간 동안 배양하고, 이어서 세포 증식을 측정하였다. 하기 프로토콜 중 하나에 따라서 세포 증식을 측정하였다:
(a) 항체의 부재 하에서(대조군으로서), 1 μM 항체(L1M2H4 또는 L2M2H2) 또는 10 μM 항체(L1M2H4 또는 L2M2H2)와 함께 48시간 배양. MTT 검정은 최대 3회의 개별 경우(초기 증식 검정)에 대해서 다양한 암 세포주에서 수행하였음; 또는
(b) 항체의 부재 하에서 또는 2.5, 5, 7.5 또는 10 μM의 항체의 존재 하에서 72시간 배양. 이러한 프로토콜에 사용된 항체는 L1M2H4(본 명세서에서 MDX-124라고 지칭), the 상업적으로 입수 가능한 항-Anx-A1 항체 ab65844 및 아이소타입 대조군(Thermo Fisher Scientific, 미국, 카탈로그 번호 31154)로서의 비-Anx-A1-특이적 IgG였다(추가 증식 검정).
대조군 배양물의 세포 수는 세포 증식에 대한 기준선 수치로서 정의되었다. 항체가 존재하는 배양물에 대한 세포 수를 기준선에 대해 정규화하였고, 기준선 값의 백분율로 나타내었다("생존율"이라고 지칭). 세포 증식 검정 결과의 통계학적 분석을 만-위트니 유 검정(Mann-Whitney U test)을 사용하여 수행하였다.
ELISA
ELISA는 표준 ELISA 기술을 사용하여 The Antibody Company(영국)에서 수행하였다. ELISA 플레이트를 25 μg/ml 전장 Anx-A1 또는 Anx-A1 N-말단 펩타이드(Anx-A1 아미노산 2-26, 서열번호 31에 상응함) 및 코팅 완충액(45 mM Na2CO3, pH 9.6, 1 mM CaCl2가 보충됨)으로 4℃에서 17시간 동안 코팅하였다. 이어서 플레이트를 차단 완충액(1 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 2% w/v BSA)으로 실온에서 1.5시간 동안 차단하였다.
이어서, 1차 항체(ab65844)를 플레이트에 적용하였다. 항체를 1 μg/ml의 농도에서 시작하여 2.38 x 10-7 μg/ml의 농도에서 끝나는 플레이트에 걸쳐서 4배 희석으로 이중으로 적용하였다. 항체를 0.1 BSA가 보충된 세척 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) TWEEN-20 및 1 mM CaCl2)에 희석하였다. 1차 항체를 실온에서 1시간 동안 플레이트에 적용한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하였다.
이어서 검출 항체를 적용하였다. 검출을 위해서, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합 염소 항-토끼 항체를 1:3000 희석으로 사용하였다(Merck KGaA, 독일; 카탈로그 번호 AP156P). 이를 ELISA 플레이트에 실온에서 1시간 동안 적용하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충액으로 다시 세척하였다.
비색 기질 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로 클로라이드, Sigma-Aldrich P4664)를 플레이트에 적용하였다. OPD 용액은 제조사의 지침에 따라 포스페이트-시트레이트 완충액(pH 5)에서 0.4 mg/ml OPD 용액을 생성하도록 만들었다. 사용 직전에 100 ml OPD 용액 당 40 μl의 30% H2O2를 첨가하였다. 100 μl의 생성된 OPD 용액을 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다.
플레이트를 암실에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션시키고, 그 후 50 μl의 3 M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시켰다. H2SO4를 첨가한 직 후 플레이트의 흡광도를 492 nm에서 판독하였다.
결과
보고된 에피토프에 대한 결합을 확인하기 위해서 상업적으로 얻은 항-Anx A1 항체_ab65844를 ELISA에 의해 시험하였다. 검정은 항체 ab65844가 전장 Anx-A1 및 N-말단 Anx-A1 펩타이드 둘 다에 결합한다는 것을 입증하였는데(데이터 나타내지 않음), 이는 인간 Anx-A1(서열번호 30)의 아미노산 3-24의 보고된 에피토프가 올바르다는 것을 나타낸다.
초기 증식 검정
첫 번째 증식 분석은 48시간에 걸쳐 증식을 측정하고, 항체가 없는 배양과 비교하여 관심대상 세포주에 대한 두 항체 L1M2H4 및 L2M2H2의 효과를 비교하였다(즉, 상기에 기재된 바와 같은 프로토콜 (a) 사용).
유방암 세포주를 사용한 이러한 증식 검정의 결과를 도 1 및 도 2에 도시한다. 도시된 바와 같이, L1M2H4 항체는 10 μM에서 통계학적으로 유의한 효과(p <0.001)를 가져서, 단지 n=1이긴 하지만, MCF7 세포의 증식을 감소시켰다. HCC1806 세포주에서, L2M2H2 항체는 또한 10 μM(n=2)에서 증식에서 통계학적으로 유의한 감소(p <0.05)를 나타냈다.
난소암 세포주 A2780을 사용한 증식 검정의 결과를 도 3에 도시한다. 도시된 바와 같이, 10 μM에서 L1M2H4 항체와 함께 인큐베이션시킨 후 통계학적으로 유의한 증식 감소가 인지되었다(p<0.01)(n=2). 시스플라틴 내성 난소암 세포주 A2780cis(도 4)에서, 1 μM(p<0.001) 및 10 μM(p<0.01)(n=2)에서 L1M2H4 항체와 함께 인큐베이션시킨 후 통계학적으로 유의한 증식 감소가 인지되었고, 10 μM에서 L2M2H2 항체에서 증식의 통계학적으로 유의한 감소(p<0.05)(n=3)가 관찰되었다. 아드리아마이신 내성 난소암 세포주 A2780ADR을 사용한 증식 검정의 결과를 도 5에 도시한다. L2M2H2 항체는 이들 세포의 증식에 상당한 영향을 미쳤다.
췌장암 세포주를 사용한 이러한 증식 검정의 결과를 도 6 및 도 7에 도시한다.
추가 증식 검정
72시간에 걸친 증식을 측정하면서 증식 검정을 반복하였다. 이들 검정은 본 발명의 하나의 항체(MDX-124라고도 공지된 L1M2H4)의 효과를 비-특이적 IgG 대조군 및 제시된 경우 상업적으로 입수 가능한 항-Anx-A1 항체 ab65844의 증식에 대한 효과와 비교하였다. 임의의 항체의 부재 하의 증식과의 비교를 또한 수행하였고, 기준선으로 사용하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행하였다(MDX-124 및 IgG 대조군의 경우, ab65844이 또한 시험된 경우, 본 항체를 사용한 실험을 이중으로 수행함).
MDX-124는 HCC1806 유방암 세포주의 증식에 상당한 영향을 미쳐서, 기준선에 비해 생존율이 거의 3분의 2(63%) 감소한 것을 발견하였다(도 8). 비-특이적 IgG 대조군은 생존율에 영향을 미치지 않았다. 비-특이적 IgG 대조군과 비교하여, MDX-124는 모든 시험 농도에서 HCC1806 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.001 미만(항체 농도 2.5 μM에서) 또는 0.0001 미만(모든 다른 항체 농도에서)이었다. 특히, 다클론성 항-Anx A1 항체 ab65844는 실제로 세포 생존율의 증가(따라서 증식)를 유발하였다. 사실, 모든 항체 농도에서 MDX-124는 ab65844에 비해 HCC1806 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.01 미만(항체 농도 2.5 μM에서) 또는 0.001 미만(모든 다른 항체 농도에서)이었다. 이 결과는, MDX-124가 HCC1806 세포의 증식을 저해한다는 것을 입증한다(생존율의 상당한 감소를 유발함). 그러나, 이러한 효과는 ab65844가 세포 생존율에 반대 효과가 있다는 점에서 모든 항-Anx A1 항체에 대해 인지되지는 않는다.
MDX-124는 또한 유방암 세포주 MCF7 및 타목시펜-내성 유도체의 증식에 상당한 영향을 미치는 것을 발견하였다(각각 도 9 및 도 10). 두 경우 모두, 비-특이적 IgG 대조군은 증식을 최대 26%까지 감소시킨다. 최대 농도에서, MDX-124는 MCF7 세포의 생존율을 76% 크게 감소시키고, 타목시펜-내성 MCF7 세포의 생존율을 47% 감소시킨다. 비-특이적 IgG 대조군과 비교하여, MDX-124는 모든 시험 농도에서 MCF7 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.0001 미만이었다. MDX-124는 또한 5 및 7.5 μM(P<0.01) 및 10 μM(P<0.05)의 농도에서 비-특이적 IgG 대조군에 비해 MCD7/TAMR7 세포 생존율에서 통계학적으로 유의한 감소를 유발하는 것을 발견하였다. 이러한 결과는, MDX-124가 삼중-음성 및 호르몬 수용체 양성 세포주의 유방암 세포의 증식을 저해하는데 매우 효과적임을 나타낸다. 항체는 약물 내성 유방암에도 효과적이다. 이러한 효과는 MDX-124에 특이적이며, 모든 항-Anx A1 항체에서 인지되는 것은 아니다.
유사하게, MDX-124는 난소암 세포주 A2780의 증식에 중요한 효과를 갖는 것을 발견하였다(도 11). 비-특이적 IgG는 최대 30%까지(최대 농도에서) 증식을 감소시키는 반면, MDX-124는 증식에 대한 효과를 2배를 초과하게 증가시킨다(최대 농도에서 증식이 61% 감소). 비-특이적 IgG 대조군에 비해서, MDX-124는 5 및 7.5 μM(P<0.05) 및 10 μM(P<0.01) 농도에서 A2780 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였다. 다시, 이것은 증식에 큰 영향을 주지 않는 다클론성 항-Anx-A1 항체 ab65844에서는 나타나지 않았다. 이 항체의 경우, 이 항체의 저농도(최대 5 μM)에서 약간 증가된 증식이 인지된 반면, 최대 농도에서는 5%의 약간의 증식 감소가 인지되었다. 사실, 5, 7.5 및 10 μM의 항체 농도에서 MDX-124는 ab65844에 비해 A2780 세포 생존율에서 통계학적으로 유의한 감소를 유발하는 것으로 발견하였고, P 값은 0.001 미만이다.
MDX-124는 또한 결장직장암 세포의 증식에 상당한 영향을 미치는 것을 발견하였다(도 12 내지 도 14). HCT116 세포주의 증식에 대한 결과를 도 12에 도시한다. MDX-124는 이들 세포의 증식을 절반을 초과하게 감소시킨다(최대 농도에서 최대 54% 증식 감소). 비-특이적 IgG 대조군은 증식에 실질적인 영향을 미치지 않으며, 다클론성 항-Anx A1 항체 ab65844는 다양한 농도에서 다양한 영향을 갖는다. 비-특이적 IgG 대조군과 비교하여, MDX-124는 모든 시험 농도에서 HCT116 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.001 미만(항체 농도 2.5 및 7.5 μM에서) 또는 0.0001 미만(5 및 10 μM의 항체 농도에서)이었다. ab65844에 대한 데이터는 약간 일관성이 없지만, 암세포의 증식을 다시 지시하는 항체의 일반적인 경향이 분명하며, ab65844에 비해 MDX-124는 2.5 μM(P<0.01) 및 5 및 10 μM(둘 다 P<0.001)의 항체 농도에서 HCT116 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였다. 데이터 지점은, ab65844가 증식 감소를 유발한다는 것을 시사하지 않는다.
세포주 Caco-2(도 13) 및 SW480(도 14)을 사용한 결과는 MDX-124가 증식을 크게 감소시키는 반면, 비-특이적 IgG 대조군이 최소한의 영향을 미친다는 점에서, 유사한 스토리를 시사한다. 비-특이적 IgG 대조군과 비교하여, MDX-124는 모든 시험 농도에서 Caco-2 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.05 미만(항체 농도 2.5 및 5 μM에서) 또는 0.001 미만(7.5 및 10 μM의 항체 농도에서)이었다. 비특이적 IgG 대조군과 비교하여, MDX-124는 모든 시험 농도에서 SW480 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.01 미만(항체 농도 2.5 μM에서) 또는 0.0001 미만(모든 시험된 항체 농도에서)이었다. 이러한 결과는 MDX-124가 결장직장암 세포의 증식을 저해하는데 매우 효과적이라는 것을 입증한다. 다시, 이러한 효과는 MDX-124에 특이적이며, 모든 항-Anx A1 항체에서 인지되는 것은 아니다.
췌장암 세포주에 대한 MDX-124의 영향을 도 15 내지 도 17에 도시한다. 세포주 BxPC-3에 대한 MDX-124의 영향을 도 15에 도시한다. 다시, MDX-124는 세포 증식에 상당한 영향을 미쳐, 최대 농도에서 증식을 절반으로 감소시킨다. 비-특이적 IgG 대조군은 증식에 최소한의 영향을 미치는 반면, 다클론성 항-Anx A1 항체 ab65844는 증식을 상당히 증가시켰다. 비특이적 IgG 대조군과 비교하여, MDX-124는 모든 시험 농도에서 BxPC-3 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.001 미만(항체 농도 2.5 μM에서) 또는 0.0001 미만(모든 시험된 항체 농도에서)이었다. ab65844와 비교하여, MDX-124는 모든 시험 항체 농도에서 BxPC-3 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.001 미만이었다.
세포주 MIA PaCa-2 및 PANC-1에 대한 MDX-124의 영향을 각각 도 16 및 도 17에 도시한다. 두 경우 모두, MDX-124는 증식을 거의 절반으로 상당히 감소시키는 반면, 비-특이적 IgG는 생존율을 훨씬 덜 감소시킨다. 비-특이적 IgG 대조군과 비교하여, MDX-124는 5 및 10 μM의 항체 농도에서 MIA PaCa-2 세포 생존율을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.05 미만이었다. 비특이적 IgG 대조군과 비교하여, MDX-124는 모든 항체 농도에서 PANC-1 세포 생존률을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, P 값은 0.05 미만(항체 농도 2.5 μM에서) 또는 0.001 미만(모든 시험된 항체 농도에서)이었다.
폐암 세포주 COR-L23 및 COR-L23.5010에 대한 MDX-124의 영향을 각각 도 18 및 도 19에 도시한다. 이러한 결과는, MDX-124 항체가 증식에 약간 내지 부정적인 효과를 갖는 반면, 비-특이적 IgG 대조군 및 다클론성 항-Anx A1 항체 ab65844는 증식에 거의 효과를 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 다른 폐암 세포주에서도 유사한 결과가 얻어졌다(데이터 나타내지 않음).
결론
MDX-124에 대한 노출은 유방암(삼중 음성, 호르몬 수용체 양성 및 약물-내성 세포주 포함), 결장직장암, 난소암, 폐암 및 췌장암으로부터의 세포주의 증식을 상당히 감소시킨다.
암세포 증식에 대한 MDX-124의 영향은 항체-특이적이고, 즉, 동일한 표적(Anx-A1)에 대해서 모든 항체가 동일한 영향을 갖는 것은 아니다. 이는, ab65844가 시험된 세포주 중 임의의 것의 증식을 상당히 감소시키지 못했고, 실제로 대부분의 경우 증식을 증가시켰다는 사실에 의해 입증된다. 비-특이적 IgG 대조군은 또한 MDX-124를 인지되는 증식의 상당한 감소를 유발하지 않았다.
실시예 2 ― 에피토프 결정
HDX 분석은 L1M2H4 항체를 사용하여, 독일 튀빙겐 대학의 자연 및 의학 연구소(Natural and Medical Sciences Institute: NMI)에서 수행하였다.
샘플 준비 및 분석
항체-항원 복합체 형성 및 수소-중수소 교환
항체-항원 샘플의 5개 분취물 및 항체가 없는 항원의 5개 분취물을 하기와 같이 준비하였다: 0.8 μL Anx-A1(41 μM), 1.8 μL 항체(38.7 μM) 또는 HEPES 완충액(10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 150 mM NaCl pH 7.4) 각각, 1 μL HEPES 완충액 및 0.5 μL CaCl2(8 mM)를 혼합하고, 10분 동안 20℃에서 인큐베이션시켰다. 8.5 μL의 HEPES 완충액을 첨가하여 염 함량을 조정하였다. 항체-항원 복합체를 밤새 0℃에서 동결건조하고, 이어서 15℃에서 2시간 동안 동결건조하여 가능한 한 많은 물을 제거하였다. 10개의 동결건조된 분취물을 HDX-교환 및 LC-MS 분석까지 -20℃에서 동결시켰다. 항체-항원 복합체 및 항체가 없는 항원 각각의 하나의 분취물을 12.5 μl의 H2O에 용해시켰고, 나머지는 12.5 μL의 D2O에 용해시켰다. 분취물을 하기 시간 동안 인큐베이션시키고, 분석 직전에 각각의 분취물을 별도로 준비하였다.
0분(H2O 기준 샘플);
5, 70, 360분 및 24시간(D2O 중수소 교환 동태 샘플).
새로 준비된 12.5 μL의 급냉 용액(100 mM 포름산 암모늄 완충액 pH 2.5 중의 TCEP 0.4 M을 함유한 구아니딘 염산염 0.8 M)을 첨가함으로써 교환을 급냉시켰다.
소화성 소화
급냉 용액을 첨가한 직 후, 0.35 μL의 펩신(100 μM)을 첨가하고, 20℃에서 2분 동안 소화를 수행하였다. 분취물을 20℃의 사전냉각된 오토샘플러 바이알에 즉시 넣고, 사전 냉각된 주입 주사기를 통해 LC-MS에 주입하였다.
LC-MS
수득된 펩타이드 혼합물을 역상 HPLC(RSLC3000 LC, Thermo Scientific Dionex, 독일 이드스타인 소재)를 사용하여 전처리없이 주입 및 분리하였다. LC 컬럼(ACQUITY UPLC BEH300 C18 1.7 μm 1x50 mm Thermo Scientific Dionex, 독일 이드스타인 소재)을 샘플 분리에 사용하였다. 연속 샘플 전개로 블랭크 전개 및 컬럼 세척 전개를 수행하였다.
31분 동안 거의 등용매 구배를 사용하여 크로마토그래피 분리를 달성하였다. 용리액 A는 0.1% 포름산이 함유된 물이고, 용리액 B는 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴이었다. 다양한 기울기로 최적화된 20분 선형 구배를 약 0℃에서 다음과 같이 적용하였다(분/B%): 0/8, 3/8, 11.9/20, 31.9/20, 33/99, 34/99, 35/8. 수동 주입을 수행하였다. 주입량은 20 μL 부피의 샘플 루프를 사용하여 25.35 μL였다. 유량은 40 μL/분이었다. HPLC 용리물을 QTOF-타입 질량 분석기(MaXis HD, Bruker)에 직접 주입하였다. 질량 분석기는 양이온 모드로 작동하였고, 스프레이 전압은 1.9 kV였고, 모세관 온도는 275℃였고, S-렌즈 RF 전압은 55 V였다.
데이터 분석
데이터를 소프트웨어 HDExaminer 2.40 베타 1 64 비트(Sierra Analytics, 미국 캘리포니아주 모디스트 소재)를 사용하여 분석하였다. 약술하자면, 상이한 교환 시점을 포함하는 원시 데이터 세트 및 각각의 시점에 대해 항체 유무에 관계없이 Anx-A1 분석을 조사하였다. Anx-A1 서열 정보 및 상응하는 체류 시간 및 전하를 갖는 소화성 펩타이드의 서열 목록을 사용하여, 소프트웨어는 중수소 교환이 있거나 없는 펩타이드를 식별하고, 중수소화된 펩타이드와 중수소화되지 않은 펩타이드의 중심 질량 간의 차이로서 펩타이드당 중수소 흡수를 계산한다. 중첩 펩타이드 정보(개별적인 중첩 펩타이드의 질량 이동)를 사용하여, 에피토프 영역을 수동으로 추가로 제한하였다.
결과
HDExaminer를 사용한 초기 데이터 평가 후, 개별 소화성 펩타이드를 통계학적으로 관련된 중수소 흡수에 대해 수동으로 확인하였다. 몇몇 중첩 펩타이드의 경우, 에피토프 영역은 중수소 흡수로 펩타이드의 N- 및 C-말단 부분을 덮는 중수소의 흡수 없이 HDX-데이터를 사용하여 추가로 제한되었다. 전체 실험을 2회 반복하였다. 식별된 제1 실험에서, 잠재적인 에피토프 영역이 식별되었지만, N-말단을 포함하는 매우 긴 펩타이드에서도 통계학적으로 관련성이 있는 중수소 흡수가 관찰되었으며, 이는 구조적 관점에서 보면 다소 유연하다. 두 번째 실험에서는, 에피토프 영역을 확인할 수 있었지만, N-말단은 중수소 흡수를 나타내지 않았다.
서열에서 밑줄 친 영역은 항체에 의해 결합된 에피토프를 나타낸다:
MAMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVKSSKGGPGSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQETGKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNEDLADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIMVSRSEIDMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN
식별된 에피토프 영역은 Anx-A1 자가-상호작용 영역에 존재하지 않지만, 자가-상호작용 영역으로부터의 펩타이드는 항체-항원 복합체 샘플에서 중수소 흡수가 약간 증가하는 경향을 나타내는데, 이는 2개의 Anx-A1 분자가 항체의 2개의 아암(arm)에 결합되는 경우 국지적인 Anx-A1 농도의 약간의 차이로 인한 것일 수 있다.
실시예 3 ― MDX-124의 시험관내 항암 활성
방법
내약성 연구
내약성 연구는 Crown Bioscience(미국)에서 수행하였다. 1 mg/kg, 10 mg/kg 또는 29 mg/kg의 MDX-124를 2주 동안 주 1회 마우스에게 투여하였다. 연구 기간 동안 각각의 마우스의 체중을 매일 측정하였다. 체중 감소를 마우스에 대한 항체 독성의 표시로 간주할 것이다.
뮤린 유방암 모델
마우스 작업은 Crown Bioscience에서 수행하였다. 사용된 마우스는 8 내지 9주령의 암컷 BALB/c 마우스였다. 사용된 유방암 모델은 뮤린 유방암 세포주 4T1-Luc를 발현하는 루시퍼라제를 사용하였다. ATCC로부터 세포주를 입수하고, 10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 2 μg/ml 퓨로마이신을 함유하는 RPMI 배지에서 배양하였다.
마우스를 면도하고, 이어서 72시간 후 개별 마우스 식별을 위해 트랜스폰더 칩을 이식하였다. 비판텐 크림을 면도 직후에 도포하고, 이어서 종양 접종 시까지 매일 도포하였다.
각각의 마우스에게 먼저 100 μl PBS에 현탁된 5 x 104개의 4T1-Luc 세포를 접종하였다. 마우스가 가스 마취되었을 때 제0일에 유선 지방 패드(좌측 아래, 하단에서 두 번째 패드)에 접종을 수행하였다. 접종 부위의 피부를 접종 전에 70% 에탄올로 세정하였다.
종양 크기를 IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(PerkinElmer, 미국)을 사용하여 5일부터 시작하여 주 3회 측정하였다. 생체발광 영상화를 사용하여 전자 캘리퍼스를 사용하여 각각의 종양을 2차원으로 측정하였다. 종양 부피를 수학식 0.5(LxW2)를 사용하여 추정하였고, 여기서 L=종양 길이이고, W=종양 폭이다. 평균 종양 부피가 50 내지 60 mm3에 도달했을 때 치료를 시작하였다. 첫 번째 종양 측정 후, 비판텐 크림을 종양 주변 부위에 다시 도포하였다. 비판텐 크림을 이후 매일 도포하였다.
군 간에 평균 종양 부피가 균일하게 마우스를 각각 12마리씩 4개의 군으로 나누었다. 치료제를 주 단위로 투여하였다. 4개의 마우스 군 중, 대조군에 비히클 단독(PBS)을 투여하였다. 3개의 실험군 PBS 중의 1, 10 또는 25 mg/kg의 MDX-124의 용량을 제공받았다. 각각의 용량을 10 ml/kg의 부피로 정맥 내로 투여하였다. 치료를 최대 3주 동안 계속하였다. 치료 시작 후 매주 3회 종양 측정을 계속하였다. 마우스를 치료를 시작하기 전에 주 3회, 그 후에는 매일 체중을 쟀다.
결과
MDX-124가 마우스에게 본질적으로 독성이 없는지 확인하기 위해서, 내약성 연구를 수행하였다. 마우스에게 항체를 투여하고 체중을 모니터링하였다. 마우스에서 체중 감소는 분명하지 않았는데(데이터 나타내지 않음), 이는 항체가 시험된 용량에서 마우스에게 독성이 없음을 나타낸다.
이어서 MDX-124의 항암 효과를 유방암의 모델 모델에서 시험하였다. 시험된 마우스의 군 각각에 대한 평균 종양 부피를 도 20에 도시한다. 제0일에 종양 세포 접종 후, 제12일에 모든 군에 첫 번째 치료 용량을 투여하였다. 도시된 바와 같이, 연구 제17일에 MDX-124로 치료된 마우스는 비히클로 처리한 대조군 마우스보다 종양 부피가 상당히 더 낮았다. 대조군에서 증가된 종양 성장의 패턴은 19일까지 계속되었다. MDX-124로 치료된 군에서 인지된 더 낮은 종양 부피가 또한 이들 군에서 더 낮은 상대 종양 부피에 상응하였다(도 21 참조).
제12일에 종양 부피를 기준 종양 부피(즉, 100% 종양 부피)로 정의하였다. 제19일에 MDX-124로 치료된 마우스의 종양은 크기가 대략 2.5배 증가하였다. 대조군 마우스의 종양은 크기가 대략 3.3배 증가하였다. 이것은 MDX-124로의 치료가 제19일까지 대조군에 비해 종양 성장을 대략 1/3 감소시켰다는 것을 의미하는데, 이는 항체의 항암 효과를 입증한다. 항체를 3개의 상이한 농도(1 mg/kg, 10 mg/kg 및 25 mg/kg)로 마우스에게 투여하는 동안, 이들 각각의 치료 요법은 종양 성장에 유사한 효과를 가졌다(즉, 투여되는 항체의 양을 증가시키는 것이 치료 효과를 증가시키지 않는 것 같다).
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Val 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2M2 light chain variable region <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser 20 25 30 Asn Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Val 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4 heavy chain variable region <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Leu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2 heavy chain variable region <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Leu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu 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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly 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agcctgtcct ccgtcgtgac tgtgcctagc tcctccctgg gaacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtcgacaaga aggtcgaacc gaagtcgtgc 720 gacaagactc atacgtgccc tccttgcccg gccccggaac tgctgggagg cccatccgtg 780 ttcctgttcc cacccaagcc taaggatacc ctgatgatca gcagaacacc ggaagtgacc 840 tgtgtggtgg tggacgtcag ccacgaagat cccgaggtca agttcaattg gtacgtggac 900 ggggtggagg tgcacaacgc aaagaccaag ccccgggagg aacagtacaa ctccacctat 960 cgcgtggtgt cggtgctgac ggtgctgcac caggactggt tgaacggaaa ggagtataag 1020 tgcaaagtgt cgaacaaggc cctgcccgct cctatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1080 ggccagccgc gggaacccca ggtctacact ctcccaccga gccgcgacga actgactaag 1140 aatcaagtgt cgctgacttg cctcgtcaag ggcttctacc cgtccgacat cgccgtggaa 1200 tgggagagca acggccagcc ggaaaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggattcc 1260 gacgggtcct tcttcctgta ctcaaaactg accgtggata agtccagatg gcagcagggc 1320 aatgtctttt catgctccgt gatgcacgag gctctgcata accactacac ccagaagtcg 1380 ctgtccctgt ccccggggaa gtga 1404 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn Glu Glu 1 5 10 15 Gln Glu Tyr Val Gln Thr 20 <210> 31 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn Glu 1 5 10 15 Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys 20 25

Claims (26)

  1. 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 인간 Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자로서,
    (i) 상기 특이적 결합 분자는 상보성 결정 영역(complementarity-determining region: CDR) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하며, 상기 CDR은 각각 하기와 같은 아미노산 서열을 갖고:
    VLCDR1은 서열번호 1, 7 또는 8에 제시된 서열을 가짐;
    VLCDR2는 서열번호 2에 제시된 서열을 가짐;
    VLCDR3은 서열번호 3에 제시된 서열을 가짐;
    VHCDR1은 서열번호 4에 제시된 서열을 가짐;
    VHCDR2는 서열번호 5에 제시된 서열을 가짐; 및
    VHCDR3은 서열번호 6에 제시된 서열을 가짐; 또는 각각의 서열의 경우, 아미노산 서열은 이와 적어도 85%의 서열 동일성을 가짐; 및/또는
    (ii) 상기 특이적 결합 분자는 서열번호 17의 아미노산 197-206, 220-224 및 227-237로 이루어진 비연속적인 에피토프에서 Anx-A1에 결합하는, 특이적 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    VLCDR1은 서열번호 1에 제시된 서열을 갖고;
    VLCDR2는 서열번호 2에 제시된 서열을 갖고;
    VLCDR3은 서열번호 3에 제시된 서열을 갖고;
    VHCDR1은 서열번호 4에 제시된 서열을 갖고;
    VHCDR2는 서열번호 5에 제시된 서열을 갖고;
    VHCDR3은 서열번호 6에 제시된 서열을 갖는, 특이적 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 특이적 결합 분자는 항체 또는 이의 단편인, 특이적 결합 분자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간화된, 특이적 결합 분자.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체이거나, 상기 항체 단편은 Fab, Fab' 또는 F(ab')2 항체 단편 또는 scFv 분자인, 특이적 결합 분자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함하는, 특이적 결합 분자:
    i) 서열번호 9 또는 10에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    ⅱ) 서열번호 11 또는 12에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역.
  7. 제6항에 있어서, 상기 특이적 결합 분자는 하기를 포함하는 단클론성 항체인, 특이적 결합 분자:
    i) 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
    ⅱ) 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  8. 제6항에 있어서, 상기 특이적 결합 분자는 하기를 포함하는 단클론성 항체인, 특이적 결합 분자:
    i) 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
    ii) 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 Anx-A1을 발현하는, 특이적 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서, Anx-A1은 상기 암의 세포의 표면 상에서 발현되는, 특이적 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 1종 이상의 화학치료제에 내성인, 특이적 결합 분자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 다제 내성(multi-drug resistant)인, 특이적 결합 분자.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 암은 백금-기반 화학치료제에 내성인, 특이적 결합 분자.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 시스플라틴; 아드리아마이신 및/또는 타목시펜에 내성인, 특이적 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 상기 대상체에게 제2 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 특이적 결합 분자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제2 치료제는 화학치료제인, 특이적 결합 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 화학치료제는 세포독성제인, 특이적 결합 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 특이적 결합 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 결장직장암, 난소암, 폐암 및 췌장암으로부터 선택되는, 특이적 결합 분자.
  20. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 특이적 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 암, 치료 및/또는 대상체는 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 방법.
  22. 대상체에서 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 특이적 결합 분자의 용도로서, 상기 특이적 결합 분자는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 용도.
  23. 제22항에 있어서, 상기 암, 치료 및/또는 대상체는 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 용도.
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 특이적 결합 분자 및 화학치료제를 포함하는, 키트.
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 특이적 결합 분자 및 대상체에서 암의 치료에서 별도로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 제2 치료제를 포함하는, 제품.
  26. 제25항에 있어서, 상기 암, 제2 치료제 및/또는 대상체는 제9항 내지 제14항 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 제품.
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