JP2021534121A - 抗体による癌治療 - Google Patents

Abstract

本発明は、薬剤に耐性のある癌など、癌の治療に使用するための、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する抗体を提供し、また、この使用のためのキットおよび製品をも提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、対象（subject）における癌の治療に使用するための特異的結合分子を提供する。前記特異的結合分子は、ヒトアネキシンＡ１（Ａｎｘ−Ａ１）に結合し、特定の実施形態においては、前記特異的結合分子は抗体または抗体断片である。

癌とは、異常な細胞増殖を特徴とする疾患の一群である。癌に関連する異常な細胞増殖の結果、腫瘍（異常な細胞増殖のために形成された細胞の固形の塊）が形成されるのが特徴であるが、必ずしもそうとは限らない（特に血液の癌の場合）。２０１０年（詳細な統計がある直近の年）、全世界で死亡者数の多い単独の原因としては、癌が死亡者数最多となった（約８００万人が死亡）（Lozano et al., Lancet 380: 2095-2128, 2012）。さらに、全世界の人口の老化に伴い、癌の率が増加すると見込まれている。したがって、新たな、改良された癌治療が緊急の課題となっている。
そのうえ、癌による死亡の多くは、化学療法薬に耐性のできた癌によるものである。癌が薬剤耐性を獲得するしくみについては、ハウスマン（Housman）ら（Cancers 6: 1769-1792, 2014）において考察されている。そこに詳細に記載されているように、癌は、薬剤の不活性化や代謝（または代謝活性化の防止）、薬剤の標的の変異や改変、ＡＢＣトランスポータを介した薬剤排出など、様々なメカニズムにより薬剤耐性を獲得しうる。かかるメカニズムによって、癌は多剤耐性（ＭＤＲ）となりうる。下記に論じられているように、薬剤耐性は、白金系化学療法剤による治療にとって特に問題である。

白金系化学療法剤は、精巣癌、卵巣癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌、中皮腫、リンパ腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫など、様々な癌において一般的な第一選択治療の選択肢である。白金系化学療法剤には、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどがある。白金系化学療法剤はどれも、本質的には同じように働き、グアニン残基のＮ−７位と反応してＤＮＡ鎖間クロスリンクやＤＮＡ鎖内クロスリンク、ＤＮＡタンパク質クロスリンクを形成する。クロスリンクはＤＮＡの合成および／または修復を阻害し、アポトーシスを開始させる（シェン（Shen）ら, Pharmacol. Rev. 64: 706-721, 2012）。しかしながら、患者は、一般的に白金系化学療法に対して初期の反応はよいが、治療への耐性が発達するために大半は病気をぶり返し（特にシスプラチンの場合）、その結果治療は失敗する（シェン（Shen）ら、上記参照）。このように、白金系療法への耐性の発達は、今日の腫瘍学において重大な課題である。癌は、標的細胞における白金系化学療法剤の蓄積の減少（取り込みの削減および／または排出の増加により）、ＤＮＡ修復経路の（再）活性化など、数々のメカニズムを介して白金系療法への耐性を発達させる。

このように、白金系療法への耐性の発達は、今日の腫瘍学において重大な課題である。従来の化学療法（特に白金系化学療法）に対してもともと耐性がある、または耐性を獲得した癌に対する新たな治療の選択肢が、至急必要である。

本発明者らは、Ａｎｘ−Ａ１に対する特定の特異的結合分子（例えば抗体）が、癌治療に効果的であることを見出した。前記分子は、白金系化学療法に耐性のある癌など、薬剤に耐性のある癌の治療に特に効果があるとわかった。本発明は、したがって、癌患者、特に化学療法剤に耐性のある癌の患者に新たな治療の選択肢を提供する。従来の化学療法が効かない病を患う個人のために新たな治療が至急求められているが、かかる治療の選択肢は、この要求に応えるものである。

本発明の特異的結合分子は、乳癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌など、多種多様な癌の治療に効果的であることがわかった。

乳癌は、女性に最も多い癌であり、どの癌よりも、世界中で女性に死をもたらす癌である（ベッカー（Becker）, Int J Gynaecol Obstet 131 (2015), S36-S39）。イギリスでは、毎年５万５千人が乳癌と診断されている（男性における乳癌は３００を超える）。乳癌の死亡率は他の多くの癌の死亡率よりも低いが、イギリスでは毎年１万１千人以上の死亡が乳癌に起因するものである。エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびホルモン上皮成長因子受容体ＨＥＲ２の発現の無い乳癌（トリプルネガティブ乳癌として知られている）は、とりわけ治療が困難である。現代の乳癌治療薬の多くはこれらの受容体を標的にしているからである。本発明の特異的結合分子は、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌の治療に効果的であることがわかり、この疾患に対する重要かつ新たな治療の選択肢を提供する。

卵巣癌は、女性に多いもう一つの癌であり、治療が困難である。イギリス一国だけでも、毎年７千５百を超える卵巣癌の罹患があり、４千人以上が亡くなっている（卵巣癌は末期になって診断されることが多く、その結果このような比較的低い生存率になる）。膵臓癌は比較的一般的であり、イギリス一国だけで毎年９千人が罹患するが、最も治療不能の癌の一つであるとして知られており、生存率は１％未満である（これも、末期に診断される疾患であることが主な理由である）。本発明の特異的結合分子は、これらの癌の双方の治療に効果的であることがわかり、治療の困難な癌にとって非常に必要である新たな治療法を提供する。大腸癌（または腸癌）もまた、イギリスで毎年４万２千人が罹患を診断される一般的な癌である。イギリスでは４番目に多い癌であるにもかかわらず、死に至ることが２番目に多い癌である。同様に、肺癌はイギリスで毎年４万７千人に診断されているが、診断後１０年以上生存するのはわずか５％である。本発明の特異的結合分子は、これら癌に対する有用かつ新たな治療法を提供する。

全長ヒトＡｎｘ−Ａ１のアミノ酸配列は、配列番号１７に示すものである。Ａｎｘ−Ａ１は、アネキシンタンパク質ファミリーのメンバーである。Ａｎｘ−Ａ１を含むこのファミリーのタンパク質のほとんどは、４つの相同の繰り返しドメインを含む「コア」領域の存在に特徴づけられる。各繰り返しドメインは、少なくとも１つのＣａ^２＋結合部位を含む。前記ファミリーの各メンバーは、特有のＮ末端領域によって見分けられる。Ａｎｘ−Ａ１は、単量体両親媒性タンパク質であり、主に細胞の細胞質に存在し、そこで発現する。ただし、Ａｎｘ−Ａ１は、排出されて細胞表面に局在化することもありうる（ダキスト（D'Acquisto）ら, Br. J. Pharmacol. 155: 152-169, 2008）。

Ａｎｘ−Ａ１は、免疫系の調節の一端を担うことが知られている。自然免疫系および適応免疫系のいずれにおいても、様々な細胞種の恒常性の維持に関与している。例えば、Ａｎｘ−Ａ１は、好中球およびマクロファージなどの自然免疫系の細胞に対して恒常性を維持するための調節を行い、また、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナリングの強度を調節することで、Ｔ細胞においても役割を果たすということが示されてきている（ダキスト（D'Acquisto）ら，ブラッド（Blood）109:1095〜1102,2007）。Ａｎｘ−Ａ１に対する中和抗体を使用することにより、適応免疫系におけるＡｎｘ−Ａ１の役割を阻害することが、慢性関節リュウマチや多発性硬化症などの自己免疫疾患を含む様々なＴ細胞媒介疾患の治療に効果的であることが示されている（ＷＯ２０１０／０６４０１２、ＷＯ２０１１／１５４７０５）。
Ａｎｘ−Ａ１に対する抗体が、ある精神状態、特に不安、強迫性障害（ＯＣＤ）や関連する疾患の治療に有用であることも示されている（ＷＯ２０１３／０８８１１１）が、そうなるメカニズムはわかっていない。
ＷＯ２００５／０２７９６５は、Ａｎｘ−Ａ１がアポトーシス細胞の表面に局在し、抗Ａｎｘ−Ａ１抗体がアポトーシスを監視するために使用できることを示している。前記文献は、これに基づき、癌の監視および診断にかかる抗体が使用できることを教示している。前記文献はまた、アポトーシス細胞表面におけるＡｎｘ−Ａ１の発現が、当該細胞に対する免疫応答を阻害することも教示している。これに基づき、前記文献はまた、アポトーシスが始まった細胞へのＡｎｘ−Ａ１の免疫抑制効果をブロックして癌に対する免疫応答を刺激することにより、Ａｎｘ−Ａ１に結合する抗体が癌治療に使用できると推測している。

オー（Ｏｈ）ら（Nature 429: 629-635, 2004）は、Ａｎｘ−Ａ１がある固形腫瘍に発現し、放射免疫療法をその癌に向けて行う際に標的として使用できることを教示し、また、かかる療法が疾患の動物モデルの生存を向上することを示している。ＵＳ２０１５／００８６５５３は、抗Ａｎｘ−Ａ１抗体が癌治療や診断に使用されうることを示唆しているが、かかる治療がどのようになされるのかは教示していない。胃癌細胞株ＳＮＵ−１へ抗Ａｎｘ−Ａ１ ｓｃＦｖを結合させることが示されている。ワング（Wang）ら（Biochem. BioPhys. Res. Commun.314: 565-570, 2004）は、癌におけるＡｎｘ−Ａ１の発現と多剤耐性との相関を示している。このように、癌を含むいくつかの疾患がＡｎｘ−Ａ１の発現との関連を呈することが示されている。しかし、抗Ａｎｘ−Ａ１抗体が、併用治療せずに使用される場合特に、癌治療のために使用できることは、本発明以前に実証されていなかった。

確かに、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子すべてから、癌治療における効果が得られるとはかぎらないことを、本発明は実証している。本発明は、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合し、癌治療のために、特に、化学療法薬に耐性のある癌、および／または乳癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌、および膵臓癌の治療のために有利に使用されうる、特定の特異的結合分子を提供する。なぜ本発明の特異的結合分子が癌治療に効果があって、同様にヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する他の特異的結合分子がそうでないのかは、不明である。論理的な裏付けはないが、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子の活性は、認識されたエピトープに依存するのかもしれないと推測される。

ヒトＡｎｘ−Ａ１を認識する多数のモノクローナル抗体が、ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている。ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている抗体は、ヒトＡｎｘ−Ａ１に非常に高い親和性で結合するという点で、特に有利な特性を有する。ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示された抗体が以下に記載されるように癌治療に有用であることは、本発明者らによって今回見出されていた。

したがって本発明は、第一の態様において、対象における癌の治療に使用するための、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子を提供し、
（ｉ）前記特異的結合分子は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲそれぞれは以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、
ＶＬＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示す配列を有し、
ＶＬＣＤＲ２は、配列番号２に示す配列を有し、
ＶＬＣＤＲ３は、配列番号３に示す配列を有し、
ＶＨＣＤＲ１は、配列番号４に示す配列を有し、
ＶＨＣＤＲ２は、配列番号５に示す配列を有し、
ＶＨＣＤＲ３は、配列番号６に示す配列を有するか、あるいは各配列において、その配列に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列であり、および／または
（ｉｉ）前記特異的結合分子は、配列番号１７の１９７〜２０６位、２２０〜２２４位、および２２７〜２３７位のアミノ酸からなる不連続エピトープでＡｎｘ−Ａ１に結合する。

同様に、本発明は、対象における癌を治療する方法を提供し、前記方法は、上記で定義されるような特異的結合分子を前記対象に投与することを含む。また、本発明は、対象における癌の治療用の薬品の製造での、上記で定義されるような特異的結合分子の使用を提供する。

本発明は第二の態様において、上記で定義されるような特異的結合分子と化学療法剤とを含むキットを提供する。

本発明は第三の態様において、上記で定義されるような特異的結合分子と、対象における癌の治療に別々に、同時にもしくは逐次的に使用するための第２の治療薬とを含む製品を提供する。

上記のように、本発明は、対象における癌の治療に使用するための、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子を提供する。本明細書で定義されるような「特異的結合分子」とは、特定の分子パートナー（この場合は、ヒトＡｎｘ−Ａ１）に特異的に結合する分子である。ヒトＡｎｘ−Ａ１に特異的に結合する分子とは、他の分子に対する結合親和性、すなわち、少なくとも他のほとんどの分子に対する結合親和性よりも高い親和性で、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する分子である。したがって、例えば、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子がヒト細胞の溶解産物と接触した場合には、特異的結合分子は、主にＡｎｘ−Ａ１に結合する。特に、特異的結合分子は、ヒトＡｎｘ−Ａ１に存在する配列または立体配置（configuration）に結合する。特異的結合分子が抗体である場合、前記配列または立体配置は、特異的結合分子が結合するエピトープである。本発明に係る使用のための特異的結合分子が結合するＡｎｘ−Ａ１エピトープは、以下に記載される。

本明細書に記載の使用のための特異的結合分子は、必ずしも、ヒトＡｎｘ−Ａ１にのみ結合するものでなくてもよく、特異的結合分子は、ある不明確な他の標的分子と交差反応してもよいし、多数の分子の混合物（例えば、細胞溶解産物など）と接触した場合に、ある程度の非特異的な結合を呈してもよい。例えば、特異的結合分子は、ヒトアネキシンファミリーの他のメンバーと、および／または他の動物からのＡｎｘ−Ａ１たんぱく質と、ある程度の交差反応性を呈してもよい。いずれにせよ、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、Ａｎｘ−Ａ１に対して特異性を示す。当業者であれば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの当該技術分野における標準的な方法を用いて、特異的結合分子がＡｎｘ−Ａ１に対して特異性を示すかどうかを容易に特定することができるであろう。特定の実施形態において、本明細書に記載の使用のための特異的結合分子は、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＫ_Ｄ（解離定数）で、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する。好適な実施形態において、本明細書に記載の使用のための特異的結合分子は、５ｎＭ未満のＫ_Ｄで、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する。

特異的結合分子のＡｎｘ−Ａ１へのＫ_Ｄは、好適には、Ｃａ^２＋イオンが少なくとも１ｍＭの濃度で存在し、場合によってはＨＥＰＥＳが１０〜２０ｍＭの濃度で存在し、ｐＨが７〜８、好適には生理学的レベルである７．２以上７．５以下である条件下で測定される。ＮａＣｌは、例えば１００〜２５０ｍＭの濃度で存在していてもよく、低濃度の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）が存在していてもよい。かかる低濃度は、例えば、０．０１〜０．５％ｖ／ｖであればよい。特異的結合分子とそのリガンドとの間の相互作用のＫ_Ｄを算出し得る方法として、多くの方法が当該技術分野において周知されている。公知の技術としては、ＳＰＲ（例えば、ビアコア）や、分極変調斜め入射反射率差（ＯＩ−ＲＤ）などが挙げられる。

上述したように、「ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する」分子は、ヒトＡｎｘ−Ａ１分子に対する特異性を示す。４つの選択的にスプライスされたＡｎｘ−Ａ１ ｍＲＮＡｓを翻訳して得られたヒトＡｎｘ−Ａ１のアイソフォームは３つある。全長ヒトＡｎｘ−Ａ１タンパク質は、ＡＮＸＡ１−００２転写産物またはＡＮＸＡ１−００３転写産物の翻訳から得られ、上記のように、そのアミノ酸配列は配列番号１７に示すものである。ＡＮＸＡ１−００４転写産物およびＡＮＸＡ１−００６転写産物は全長ヒトＡｎｘ−Ａ１タンパク質の断片をコードし、そのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８、１９に示すものである。
本発明に係る使用のための特異的結合分子は、全長ヒトＡｎｘ−Ａ１（すなわち、ＡＮＸＡ１−００２転写産物またはＡＮＸＡ１−００３転写産物がコードする、３４６個のアミノ酸のタンパク質である、配列番号１７のＡｎｘ−Ａ１）に結合する。特異的結合分子は、ＡＮＸＡ１−００４転写産物またはＡＮＸＡ１−００６転写産物がコードする断片のような、全長Ａｎｘ−Ａ１の特定の断片、部分、または変異体（variant）に結合してもよい。

後述するように、抗体（およびＣＤＲを含む分子）は、本発明に係る使用のための好適な特異的結合分子を形成する。

上述のように、ヒトＡｎｘ−Ａ１を認識する多数のモノクローナル抗体が、ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている。当業者には公知であるように、抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖という４本のポリペプチド鎖を含むタンパク質である。典型的には、重鎖は互いに同一であり、軽鎖は互いに同一である。軽鎖は、重鎖よりも短い（したがって、軽量である）。重鎖は、４つまたは５つのドメインを含む。すなわち、可変（Ｖ_Ｈ）ドメインがＮ末端に位置し、それに３つまたは４つの定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれ、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、および、存在する場合には、Ｃ_Ｈ４）が続く。軽鎖は、２つのドメインを含む。すなわち、可変（Ｖ_Ｌ）ドメインがＮ末端に位置し、定常（Ｃ_Ｌ）ドメインがＣ末端に位置する。重鎖においては、不定形のヒンジ領域が、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間に位置している。抗体の２本の重鎖は、ヒンジ領域に存在するシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合によって結合されており、各重鎖は、それぞれＣ_Ｈ１ドメインおよびＣ_Ｌドメインに存在するシステイン残基間のジスルフィド結合によって、一本の軽鎖と結合されている。

哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）として知られる、２種類の軽鎖が産生される。カッパ軽鎖においては、可変ドメインおよび定常ドメインは、それぞれＶ_ＫドメインおよびＣ_Ｋドメインと称することができる。軽鎖がλ軽鎖とκ軽鎖のどちらであるかということは、その定常領域によって決定される。すなわち、λ軽鎖の定常領域とκ軽鎖の定常領域とは異なるものであるが、既定の種においては、同種の軽鎖の定常領域はすべて同じである。

ある種における既定のアイソタイプの抗体では、重鎖の定常領域はすべて同じであるが、アイソタイプ間では異なっている（抗体のアイソタイプの例は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤといったクラスである；また、多くの抗体サブタイプが存在し、例えば、ＩｇＧ抗体では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４という４つのサブタイプが存在する）。抗体の特異性は、その可変領域の配列によって決定される。可変領域の配列は、どの個体においても、同種の抗体間で異なっている。特に、抗体の軽鎖および重鎖のいずれも、超可変性の相補性決定領域（ＣＤＲ）を３つ有している。軽鎖および重鎖の対において、この２本の鎖のＣＤＲは、抗原結合部位を形成する。ＣＤＲ配列が、抗体の特異性を決定する。

重鎖の３つのＣＤＲは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３として知られており、軽鎖の３つのＣＤＲは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３として知られている。
ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている１つの抗体は、下記のＣＤＲ配列を有する。
ＶＬＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＡＫＴＹＬＮ （配列番号１）、
ＶＬＣＤＲ２：ＧＶＳＮＲＦＳ （配列番号２）、
ＶＬＣＤＲ３：ＬＱＶＴＨＶＰＹＴ （配列番号３）、
ＶＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧ （配列番号４）、
ＶＨＣＤＲ２：ＤＩＹＰＧＧＤＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧ （配列番号５）、および
ＶＨＣＤＲ３：ＡＲＷＧＬＧＹＹＦＤＹ （配列番号６）。
ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている別の抗体は、下記のＣＤＲ配列を有する。
ＶＬＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＡＫＴＹＬＮ （配列番号７）、
ＶＬＣＤＲ２：ＧＶＳＮＲＦＳ （配列番号２）、
ＶＬＣＤＲ３：ＬＱＶＴＨＶＰＹＴ （配列番号３）、
ＶＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧ （配列番号４）、
ＶＨＣＤＲ２：ＤＩＹＰＧＧＤＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧ （配列番号５）、および
ＶＨＣＤＲ３：ＡＲＷＧＬＧＹＹＦＤＹ （配列番号６）。
ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている別の抗体は、下記のＣＤＲ配列を有する。
ＶＬＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＡＫＴＹＬＮ （配列番号８）、
ＶＬＣＤＲ２：ＧＶＳＮＲＦＳ （配列番号２）、
ＶＬＣＤＲ３：ＬＱＶＴＨＶＰＹＴ （配列番号３）、
ＶＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧ （配列番号４）、
ＶＨＣＤＲ２：ＤＩＹＰＧＧＤＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧ （配列番号５）、および
ＶＨＣＤＲ３：ＡＲＷＧＬＧＹＹＦＤＹ （配列番号６）。

このように、ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている抗体のＣＤＲ配列は、ＶＬＣＤＲ１配列以外は、同じである。配列番号７のＶＬＣＤＲ１配列は、野生型ＶＬＣＤＲ１配列であり、寄託番号１００６０３０１として欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマから得られたマイナーなｍＲＮＡ配列から構築されたマウス抗体Ｍｄｘ００１の中に見出だされた。Ｍｄｘ００１抗体をヒト化したものを作製したが、驚くべきことに、これらヒト化された抗体中のＶＬＣＤＲ１配列を改変することによって、強化された抗体が得られることが見出された。配列番号７の１１位のグリシン残基を置換すると、抗体の安定性および機能が向上する。論理的な裏付けはないが、ＣＤＲの翻訳後修飾の部位を除去することにより、このことが得られたと考えられる。具体的には、このグリシン残基を置換することによって、タンパク質から脱アミド化部位が除去されると考えられる。配列番号７に示すＶＨＣＤＲ１配列は、配列モチーフＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙを含む。この配列は、Ａｓｎ残基の脱アミド化に関連し、アスパラギン残基をアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸に変換するものであり、これは抗体の安定性と標的への結合に影響を与えうる。Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙモチーフ内の残基のいずれかを置換することにより、脱アミド化部位が除去されると考えられる。

本発明者らは、配列番号７の１１位のグリシン残基（上述した脱アミド化部位内に位置するグリシン残基である）がアラニンに置換され、標的（Ａｎｘ−Ａ１）への結合が、その天然型のＭｄｘ００１抗体と比較して向上している抗体を同定した。１１位のグリシンがアラニンに置換されたＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＡＫＴＹＬＮであり（太字で示す残基は、上記の置換によって導入されたアラニンである）、これは配列番号１に示された配列である。さらに、セリンのスレオニンへの置換によって９位が改変されたＶＬＣＤＲ１を含むヒト化抗体もまた、Ｍｄｘ００１と比較して、Ａｎｘ−Ａ１への結合が向上していることが見出された。９位のセリンがスレオニンに置換されたＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＲＳＳＱＳＬＥＮＴＮＧＫＴＹＬＮであり（太字で示す残基は、上記の置換によって導入されたスレオニンである）、これは配列番号８に示された配列である。上記のように、ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている抗体が癌治療での使用に適していることを、本発明者らは見出した。

ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている抗体は、ヒトＡｎｘ−Ａ１でマウスを遺伝子免疫することにより作られ、これはマウスの免疫系が、本来の構造をとっている、全長の改変の無いヒトＡｎｘ−Ａ１に曝露されたことを意味する。実施例に詳述されているように、水素重水素交換（ＨＤＸ）によってＷＯ２０１８／１４６２３０の抗体を分析すると、抗体は、ヒトＡｎｘ−Ａ１の１９７〜２０６位、２２０〜２２４位、および２２７〜２３７位のアミノ酸（すなわち、配列番号１７の１９７〜２０６位、２２０〜２２４位、および２２７〜２３７位のアミノ酸）からなる不連続エピトープで、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合することが示された。

とりわけ、ＷＯ２０１８／１４６２３０の抗体は、生理的濃度のＣａ^２＋の存在下でのみＡｎｘ−Ａ１に結合する。論理的な裏付けはないが、これはＡｎｘ−Ａ１分子上のエピトープの位置の結果であると考えられる。Ｃａ^２＋非存在下であれば、そのＮ末端は、この不連続エピトープに隣接して存在する「ポケット」内に入る。Ｃａ^２＋をＡｎｘ−Ａ１に結合すると（これは生理的濃度のＣａ^２＋の存在下で起こる）、Ａｎｘ−Ａ１の構造を変化させ、コアドメインのそのポケットからＮ末端を露出させ、これによってエピトープを露出させて抗体を結合させると考えられる。Ａｎｘ−Ａ１のこのエピトープに結合する抗体（または、同様の特異的結合分子）はいずれも、本明細書に記載の方法および使用に用いてもよい。

本発明に係る使用のための特異的結合分子は、ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示されている前記３つの抗体のいずれかのＣＤＲ配列、またはその変異体を含んでいてもよい。または／さらに、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、ＷＯ２０１８／１４６２３０の抗体と同じエピトープでＡｎｘ−Ａ１に結合してもよい。したがって、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、
（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲそれぞれは以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、
ＶＬＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示す配列を有し、
ＶＬＣＤＲ２は、配列番号２に示す配列を有し、
ＶＬＣＤＲ３は、配列番号３に示す配列を有し、
ＶＨＣＤＲ１は、配列番号４に示す配列を有し、
ＶＨＣＤＲ２は、配列番号５に示す配列を有し、
ＶＨＣＤＲ３は、配列番号６に示す配列を有するか、または、各配列において、その配列に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である、アミノ酸配列であるか、および／または
（ｉｉ）配列番号１７の１９７〜２０６位、２２０〜２２４位、および２２７〜２３７位のアミノ酸からなる不連続エピトープでヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する。

好適な態様において、前記（ｉ）の特異的結合分子は、（ｉｉ）に記載されたようなエピトープに結合する。

「または、各配列において、配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である、アミノ酸配列」とは、ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列が、当該配列番号で規定されるものであるか、またはそれに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である、アミノ酸配列であるということを意味する。したがって、ＶＬＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号７、または配列番号８に示す配列を有するか、あるいは配列番号１、配列番号７、または配列番号８に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるアミノ酸配列であり、ＶＬＣＤＲ２は、配列番号２に示す配列を有するか、あるいは配列番号２に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるアミノ酸配列であり、ＶＬＣＤＲ３は、配列番号３に示す配列を有するか、あるいは配列番号３に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるアミノ酸配列であり、ＶＨＣＤＲ１は、配列番号４に示す配列を有するか、あるいは配列番号４に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるアミノ酸配列であり、ＶＨＣＤＲ２は、配列番号５に示す配列を有するか、あるいは配列番号５に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるアミノ酸配列であり、ＶＨＣＤＲ３は、配列番号６に示す配列を有するか、あるいは配列番号６に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるアミノ酸配列である。特定の配列番号に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％（ただし配列同一性が１００％未満）であるアミノ酸配列は、本明細書では当該配列番号の変異体として記載される。例えば、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも８５％であるが、配列番号１に対する配列同一性が１００％未満であるアミノ酸配列は、配列番号１の変異体である。

特定の実施形態において、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、下記のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。すなわち、
ＶＬＣＤＲ１は、配列番号１に示す配列を有し、
ＶＬＣＤＲ２は、配列番号２に示す配列を有し、
ＶＬＣＤＲ３は、配列番号３に示す配列を有し、
ＶＨＣＤＲ１は、配列番号４に示す配列を有し、
ＶＨＣＤＲ２は、配列番号５に示す配列を有し、
ＶＨＣＤＲ３は、配列番号６に示す配列を有する。

上記のように、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、ポリペプチド配列からなる６つのＣＤＲを含んでもよい。本明細書において、「タンパク質」および「ポリペプチド」は交換可能であり、どちらも、１つ以上のペプチド結合で結合された２つ以上のアミノ酸からなる配列のことをいう。したがって、特異的結合分子は、ポリペプチドであってもよい。あるいは、特異的結合分子は、ＣＤＲ配列を含むポリペプチドを、１つ以上含んでいてもよい。好ましくは、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、抗体または抗体断片である。

本発明に係る使用のための特異的結合分子は、当該技術分野で公知のいずれの方法によって合成されてもよい。特に、特異的結合分子は、原核細胞（例えば、細菌細胞）または真核細胞（例えば、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞）を用いる細胞発現系などのタンパク質発現系を用いて合成されてもよい。別のタンパク質発現系としては、インビトロにおける無細胞発現系が挙げられ、この系では、インビトロにおいて、特異的結合分子をコードする塩基配列がｍＲＮＡに転写され、このｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される。無細胞発現系のキットは、広く入手可能であり、例えばサーモフィッシャー・サイエンティフィック社（ThermoFisher Scientific）（米国）から購入することができる。あるいは、特異的結合分子は、非生物系において化学合成されてもよい。本発明に係る使用のための特異的結合分子を形成し得る、またはそれに含有され得るポリペプチドを作製するために、液相合成を用いてもよいし、固相合成を用いてもよい。当業者であれば、当該技術分野において一般的な手法のうち適切なものを用いて、特異的結合分子を容易に産生することができる。特に、特異的結合分子は、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞において、組み換え技術によって発現されてもよい。

上記で定義されるようなエピトープでヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する（すなわち、配列番号１７の１９７〜２０６位、２２０〜２２４位、および２２７〜２３７位のアミノ酸からなる）特異的結合分子は、当該技術分野における標準的な手法（例えば、抗体の遺伝子免疫など）で作られてもよく、必要なエピトープを有する抗体は、当該技術分野で公知のエピトープマッピングの標準的な手法により同定されてもよい。かかる手法の例としては、ＨＤＸ、エピトープ切除、ペプチドパニング、Ｘ線共結晶解析、ＮＭＲなどがある（Clementi et al., Methods Mol. Biol. 1131: 427-446, 2014; Abbott et al., Immunology 142(4): 526-535, 2014）。特異的結合分子はまた、当該エピトープに結合することがわかっている既存の特異的結合分子を改変して（例えば、改変配列の発現により改変して）作製してもよく、当該エピトープに結合する分子を本明細書に記載の方法で同定してもよい。当該エピトープに結合する特異的結合分子はまた、当該エピトープ（例えば、本明細書に記載するもの）に結合することがわかっている抗体との競合により、または、本明細書に開示されているエピトープとそのエピトープ変異体との結合を比較することにより、同定してもよい（あるエピトープの変異体へ結合しなければ、それは当該エピトープへの特異的な結合を示唆する）。

本発明に係る使用のための特異的結合分子は、必要に応じて単離（すなわち、精製）されてもよい。本明細書における「単離された」とは、特異的結合分子が、これを含む溶液などの主成分（すなわち、成分の大部分）であるということを意味する。特に、特異的結合分子が、最初は混合物または混合溶液において産生される場合には、特異的結合分子の単離とは、特異的結合分子が分離または精製されていることを意味する。したがって、例えば、特異的結合分子がポリペプチドであり、該ポリペプチドが上述したようなタンパク質発現系を用いて産生される場合には、特異的結合分子は、それが存在する溶液または組成物においてもっとも量の多いポリペプチドとなるように、好ましくは溶液または組成物中のポリペプチドの大部分を占めるように、単離され、元の産生培地に存在する他のポリペプチドおよび生体分子よりも濃縮される。特に、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、溶液または組成物において主要な（大部分の）特異的結合分子となるように、単離される。好ましい特徴においては、特異的結合分子は、溶液または組成物中の他の成分、特に他のポリペプチド成分の存在量と比較して評価した場合に、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の純度で、溶液または組成物中に存在する。

特異的結合分子が、例えばタンパク質発現系で産生されたタンパク質である場合には、定量的プロテオミクスによって特異的結合分子の溶液を解析して、本発明に係る使用のための特異的結合分子が最も主要であり、かつ単離されているかどうかを確認してもよい。例えば、２Ｄゲル電気泳動および／または質量分析が用いられてもよい。このような単離された分子は、以下で述べるような製剤または組成物中に存在し得る。

本発明の特異的結合分子は、当該技術分野において公知のいずれの方法を用いて単離されてもよい。例えば、特異的結合分子は、適切な結合パートナーを用いるアフィニティクロマトグラフィによって分子を単離することができるように、ポリヒスチジンタグ、ストレップタグ（strep-tag）、ＦＬＡＧタグ、およびＨＡタグなどのアフィニティタグを有して産生されてもよい。例えば、ポリヒスチジンタグがついた分子を、Ｎｉ^２＋イオンを用いて精製してもよい。特異的結合分子が抗体である実施形態においては、特異的結合分子は、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの抗体結合タンパク質を１つ以上用いるアフィニティクロマトグラフィによって単離されてもよい。あるいは、特異的結合分子は、例えばサイズ排除クロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィなどによって単離されてもよい。対照的に、化学合成（すなわち、非生物系の方法）によって産生された特異的結合分子は、単離された形態で産生され得る。したがって、単離されると考えられる本発明に係る使用のための特異的結合分子が、単離された分子を産生する様式で合成された場合には、特定の精製ステップまたは単離ステップは必要ではない。

特異的結合分子が配列番号１（または配列番号７もしくは配列番号８）または配列番号２〜６の変異体であるＣＤＲ配列を含む、本発明の実施形態においては、その変異体が、基準ＣＤＲ配列（すなわち、特異的結合分子の配列同一性が少なくとも８５％であるが、１００％未満であるＣＤＲ配列）と比較して、アミノ酸残基の置換、付加および／または欠失により改変されてもよい。

ＣＤＲ配列が、ある特定のアミノ酸残基を置換することによって改変される場合は、その置換は保存的アミノ酸置換であってもよい。本明細書における「保存的アミノ酸置換」なる語は、あるアミノ酸残基を、類似の側鎖を有する他のアミノ酸残基に置き換えるアミノ酸置換のことをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸は、類似の性質を有する傾向があるので、ポリペプチドの構造または機能において重要なアミノ酸の保存的置換は、同じ位置における非保存的アミノ酸置換よりも、ポリペプチドの構造／機能に及ぼす影響が小さいことが期待され得る。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸など）、無電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンなど）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなど）、および芳香性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）が挙げられる。したがって、保存的アミノ酸置換は、特定のアミノ酸残基を同じファミリーの別のアミノ酸と置換する置換とみなされてもよい。しかしながら、ＣＤＲ残基の置換は、同様に、あるアミノ酸を、異なるファミリーに属する側鎖を有する他のアミノ酸と置換する、非保存的置換であってもよい。

本発明の範囲におけるアミノ酸の置換または付加は、遺伝暗号がコードするタンパク質原性のアミノ酸を用いて行われてもよいし、遺伝暗号がコードしないタンパク質原性のアミノ酸を用いて行われてもよいし、非タンパク質原性のアミノ酸を用いて行われてもよい。好ましくは、アミノ酸の置換または付加は、タンパク質原性のアミノ酸を用いて行われる。ＣＤＲの配列を構成するアミノ酸は、天然由来のアミノ酸ではないが天然由来のアミノ酸の改変体であるアミノ酸を含んでいてもよい。これらの天然由来ではないアミノ酸が、配列を変化させず、特異性に影響を及ぼさないのであれば、配列同一性を低下させることなく、本明細書に記載のＣＤＲを作製するのに用いられてもよい。すなわち、ＣＤＲのアミノ酸を与えるものとみなされる。例えば、メチル化アミノ酸などのアミノ酸誘導体が用いられてもよい。一実施形態では、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、天然分子でない、すなわち、天然に見出される分子ではない。

配列番号１〜８に示すＣＤＲのアミノ酸配列に対する改変は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発または固相合成などの適切ないずれの技術を用いて行われてもよい。

本発明に係る使用のための特異的結合分子は、上記のＣＤＲを含んでいてもよい。さらに、このような分子は、ＣＤＲの適切な提示を可能にするリンカー部分またはフレームワーク配列を含んでいてもよい。都合の良いように、さらなる性質を付与し得るさらなる配列が存在していてもよい。それは、例えば、これまでに述べてきたようなＣＤＲを含む分子の単離または同定を可能にするペプチド配列である。このような場合、融合タンパク質が作製されてもよい。

上述したように、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、配列番号１（または配列番号７、もしくは配列番号８）および配列番号２〜６に対する配列同一性が少なくとも８５％であるＣＤＲを含んでいてもよい。本発明の他の実施形態においては、ＣＤＲ配列はそれぞれ、結果として得られるＣＤＲ配列の、配列番号１（または配列番号７もしくは配列番号８）および配列番号２〜６に対する配列同一性が、上述したように、少なくとも８５％または少なくとも９０％であるという条件において、配列番号１（または配列番号７もしくは配列番号８）および配列番号２〜６と比較して、２つ以下のアミノ酸の置換、付加、または欠失によって、改変されていてもよい。「置換、付加、または欠失」とは、置換、付加、および欠失を組み合わせたものも含む。したがって、特に、ＶＬＣＤＲ１の配列は、配列番号１（または配列番号７もしくは配列番号８）の配列において１つまたは２つのアミノ酸が置換、付加、または欠失した配列であってもよく、ＶＬＣＤＲ２の配列は、配列番号２の配列において１つのアミノ酸が置換、付加、または欠失した配列であってもよく、ＶＬＣＤＲ３の配列は、配列番号３の配列において１つのアミノ酸が置換、付加、または欠失した配列であってもよく、ＶＨＣＤＲ１の配列は、配列番号４の配列において１つのアミノ酸が置換、付加、または欠失した配列であってもよく、ＶＨＣＤＲ２の配列は、配列番号５の配列において１つまたは２つのアミノ酸が置換、付加、または欠失した配列であってもよく、ＶＨＣＤＲ３の配列は、配列番号６の配列において１つのアミノ酸が置換、付加、または欠失した配列であってもよく、好ましくは、配列番号１、配列番号７、または配列番号８における１つまたは２つのアミノ酸の置換は、その配列内の９位および／または１１位において行われる。

配列同一性は好都合ないずれの方法によって評価されてもよい。しかしながら、配列間の配列同一性の程度を求めるためには、配列を２つ１組でまたは複数で、アラインメントするコンピュータプログラムが有用であり、例えば、ＥＭＢＯＳＳニードル（Needle）またはＥＭＢＯＳＳストレッチャー（stretcher）（いずれも、ライス、Ｐ（Rice, P.）ら、Trends Genet. 16, (6) pp. 276-277, 2000）が、２つ１組の配列アラインメントに用いられてもよく、また、クラスタル・オメガ（Clustal Omega）（シーバース Ｆ（Sievers F）ら，Mol. Syst. Biol. 7:539, 2011）またはＭＵＳＣＬＥ（エドガー Ｒ．Ｃ．（Edgar, R.C.）， Nucleic Acids Res. 32(5):1792-1797, 2004）が、複数配列のアラインメントに用いられてもよいが、適切な他のプログラムが用いられてもよい。アラインメントは、２つ１組または複数のいずれで行われたとしても、局所的ではなく全体的に（すなわち、参照配列の全体にわたって）行われなければならない。

配列のアラインメントおよび同一性のパーセント値の算出結果は、例えば、クラスタル・オメガの標準的なパラメータを用いて求められてもよい。すなわち、マトリックスはゴネット（Gonnet）であり、ギャップオープニングペナルティは６であり、ギャップエクステンションペナルティは１である。あるいは、ＥＭＢＯＳＳニードルの標準的なパラメータが用いられてもよい。すなわち、マトリックスはブロサム６２（BLOSUM62）であり、ギャップオープニングペナルティは１０であり、ギャップエクステンションペナルティは０．５である。適切な他のパラメータが代わりに用いられてもよい。

このような用途に用いる目的では、異なる方法で得られた配列同一性の値に相違がある場合、デフォルトのパラメータでＥＭＢＯＳＳニードルを用いて２つ１組のアラインメントを全体的に行って得た値が、有効であるとみなされることになっている。

上述したように、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、好ましくは抗体または抗体断片である。「抗体」とは、これまでに述べた特徴を有する免疫グロブリンである。本発明は、後述するように、ＣＤＲを保持するが異なるフレームワークで提示され、同様に機能する、すなわち、抗原に対する特異性を保持している、天然由来の抗体の変異体をも意図するものである。したがって、抗体は、天然由来のドメインが、部分的または全体的に、同様に機能する天然または非天然の等価物または相同体と置き換わった、機能的等価物または機能的相同体を含む。

本発明に係る使用のための特異的結合分子が抗体である場合、好ましくはモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体種からなる抗体製剤を意味する。すなわち、製剤中の抗体はすべて、アミノ酸配列が同一で、同じＣＤＲを含んでおり、そのため、標的抗原（「標的抗原」とは、特定の抗体が結合するエピトープを含む抗原を意味し、すなわち、抗Ａｎｘ−Ａ１抗体の標的抗原は、Ａｎｘ−Ａ１である）上の同じエピトープに結合して同じ効果を発揮する。換言すると、本発明に係る使用のための抗体は、好ましくはポリクローナル抗体混合物の一部ではない。

上述したように、抗体においては、ＣＤＲ配列が、重鎖および軽鎖の可変ドメインに位置している。ＣＤＲ配列はポリペプチドのフレームワーク内に存在し、それによって抗原結合のために適切にＣＤＲが位置決めされる。したがって、可変ドメインの残部（すなわち、どのＣＤＲの一部も形成しない可変ドメイン配列の部分）は、フレームワーク領域を構成する。成熟可変ドメインＮ末端はフレームワーク領域１（ＦＲ１）を形成し、ＣＤＲ１とＣＤＲ２との間のポリペプチド配列はＦＲ２を形成し、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間のポリペプチド配列はＦＲ３を形成し、ＣＤＲ３を定常ドメインに連結するポリペプチド配列はＦＲ４を形成する。本発明に係る使用のための抗体においては、可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、抗体がそのＣＤＲを介してヒトＡｎｘ−Ａ１に結合するような、適切なアミノ酸配列のいずれかであればよい。定常領域は、いずれの哺乳類（好ましくはヒト）の抗体アイソタイプの定常領域であってもよい。

本発明のある実施形態においては、特異的結合分子は、例えば二重特異性モノクローナル抗体などの多特異性モノクローナル抗体であってもよい。多特異性結合分子は、少なくとも２つの異なる分子結合パートナーに結合する、例えば、２つ以上の異なる抗原またはエピトープに結合する、領域またはドメイン（抗原結合領域）を含む。二重特異性抗体の場合、抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖の可変ドメインのそれぞれが異なっており、したがって２つの異なる抗原結合領域を形成していること以外は、上述したような構成において、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。多特異性モノクローナル抗体などの本発明に係る使用のための多特異性（例えば、二重特異性）結合分子においては、抗原結合領域のうちの１つは、本明細書で定義される本発明に係る使用のための特異的結合分子のＣＤＲ配列を有しており、したがって、Ａｎｘ−Ａ１に結合する。本発明に係る使用のための多特異性結合分子の他の抗原結合領域は、本発明に係る使用のためのＣＤＲによって形成される抗原結合領域とは異なっており、例えば、本発明に係る使用のための特異的結合分子について本明細書において定義されたものとは異なる配列のＣＤＲを有している。例えば、二重特異性抗体における、特異的結合分子のさらなる（例えば、第２の）抗原結合領域は、Ａｎｘ−Ａ１に結合してもよいが、Ａｎｘ−Ａ１に結合する（本発明に係る使用のための特異的結合分子のＣＤＲを有する）第１の抗原結合領域とは異なるエピトープで結合する。あるいは、さらなる（例えば、第２の）抗原結合領域は、Ａｎｘ−Ａ１ではない、さらなる（例えば、第２の）異なる抗原に結合してもよい。別の実施形態においては、例えば抗体などの特異的結合分子における２つ以上の抗原結合領域は、それぞれ同じ抗原に結合してもよく、すなわち、多価（例えば、二価）分子を提供するものであってもよい。

特異的結合分子は、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合可能な、抗体断片であってもよいし、合成コンストラクトであってもよい。このように、本発明に係る使用のための抗体断片は、抗原結合ドメイン（すなわち、抗体断片の元である抗体の抗原結合ドメイン）を含む。抗体断片については、ロドリゴ（Rodrigo）ら，Antibodies, Vol. 4(3), p. 259-277, 2015に記載されている。本発明に係る使用のための抗体断片は、好ましくはモノクローナルである（すなわち、ポリクローナル抗体混合物の一部ではない）。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、およびＦｖ断片を含む。Ｆａｂ断片については、ロイット（Roitt）ら，Immunology second edition (1989), Churchill Livingstone, Londonに記載されている。Ｆａｂ断片は、抗体の抗原結合ドメインからなる。すなわち、個々の抗体は、それぞれが軽鎖およびそれに結合した重鎖のＮ末端部からなる２つのＦａｂ断片を含むものとみなされてもよい。したがって、Ｆａｂ断片は、軽鎖全体と、これが結合する重鎖のＶ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインとを含む。抗体をパパインで消化することによって、Ｆａｂ断片が得られてもよい。

Ｆ（ａｂ’）_２断片は、抗体のＦａｂ断片２つと重ドメインのヒンジ領域とからなり、２本の重鎖を連結するジスルフィド結合を含む。換言すると、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、２つのＦａｂ断片が共有結合したものとみなすことができる。抗体をペプシンで消化することによって、Ｆ（ａｂ’）_２断片が得られてもよい。Ｆ（ａｂ’）_２断片を還元すると、２つのＦａｂ’断片が得られる。これらは、断片を他の分子に結合させるのに有用であり得るさらなるスルフヒドリル基を含むＦａｂ断片とみなすことができる。

Ｆｖ断片は、軽鎖および重鎖の可変ドメインのみからなる。これらは共有結合で連結されておらず、非共有結合的な相互作用によって、弱く維持されているだけである。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子として知られる合成コンストラクトを産生するために、Ｆｖ断片を改変することができる。典型的には、このような改変は、抗体遺伝子を操作し、ひとつのポリペプチドがＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインの両方を含む融合タンパク質を産生することによって、組み換えで行うことができる。ｓｃＦｖ断片は、一般的に、Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域を共有結合させるペプチドリンカーを含み、ペプチドリンカーは分子の安定性に寄与する。このリンカーは、１〜２０個のアミノ酸からなるものであってもよく、例えば、１個、２個、３個、または４個のアミノ酸、あるいは、５個、１０個、または１５個のアミノ酸、あるいは、好都合には、１〜２０の範囲にある他の数であってもよい。ペプチドリンカーは、グリシンおよび／またはセリンなどの一般的に好都合なアミノ酸残基から形成されてもよい。適したリンカーの一例は、Ｇｌｙ_４Ｓｅｒである。このようなリンカーの多量体、例えば、二量体、三量体、四量体、または五量体（（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４、または（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５など）などが用いられてもよい。しかしながら、リンカーの存在は必須ではなく、Ｖ_Ｌドメインは、ペプチド結合によってＶ_Ｈドメインに連結されていてもよい。本明細書において、ｓｃＦＶは、抗体断片として定義される。

特異的結合分子は、ｓｃＦｖの類似体であってもよい。例えば、ｓｃＦｖは他の特異的結合分子（例えば、他のｓｃＦｖ、Ｆａｂ抗体断片、およびキメラＩｇＧ抗体（例えば、ヒトのフレームワークを有する））に連結されてもよい。ｓｃＦｖは、他のｓｃＦｖに連結されて、例えば二量体、三量体、または四量体などの、多特異性結合タンパク質である多量体を形成してもよい。二重特異性ｓｃＦｖは、二重特異性抗体と称されることがあり、三重特異性ｓｃＦｖは、三重特異性抗体と称されることがあり、また、四重特異性ｓｃＦｖは、四重特異性抗体と称されることがある。他の実施形態においては、本発明に係る使用のためのｓｃＦｖは、他の同一ｓｃＦｖ分子に結合され、これによって、単一特異性であるが多価である多量体が形成されてもよく、例えば、二価二量体または三価三量体が形成されてもよい。

使用可能な合成コンストラクトは、ＣＤＲペプチドを含む。これらは、抗体結合決定基を含む合成ペプチドである。ペプチド模倣物（mimetic）を使用することもできる。これらの分子は、通常、ＣＤＲループ構造を模倣し、抗原と相互作用する側鎖を有する、立体配置が制限された有機環である。

上記のように、特定の実施形態において、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、配列番号１、配列番号７、または配列番号８、および配列番号２〜６に示すアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。詳述されるように、これらは、マウス抗体Ｍｄｘ００１から誘導または変性されたものである。ただし、本発明に係る使用のための抗体、またはその断片は、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。

本発明に係る使用のための抗体または抗体断片は、ヒト／マウスキメラ抗体であってもよいし、好ましくは、ヒト化されていてもよい。これは特に、モノクローナル抗体およびその抗体断片の場合である。分子をヒトの治療法に用いる場合には、ヒト化抗体またはキメラ抗体あるいはそれらの断片が望ましい。非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）を使用したヒトに対する治療的処置は、下記のような多くの理由から効果が無い。たとえば、抗体のインビボにおける半減期が短いこと、ヒトの免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体による非ヒト重鎖定常領域の認識率が低いために、異種の重鎖定常領域が媒介するエフェクター機能が弱いこと、抗体に対する患者の感作や、（マウス抗体では）ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が発生すること、ＨＡＭＡによるマウス抗体の中和によって治療効果が失われること、などがその理由に挙げられる。

キメラ抗体とは、ある種に由来する可変領域と、他の種に由来する定常領域とを有する抗体である。したがって、本発明に係る使用のための抗体または抗体断片は、マウス可変ドメインとヒト定常ドメインとを含む、キメラ抗体またはキメラ抗体断片であってもよい。

上記に詳述したように、抗体のアイソタイプは、その重鎖定常領域の配列によって定義される。本発明に係る使用のためのキメラ抗体の定常領域は、いずれのヒト抗体アイソタイプのものであってもよく、また各アイソタイプ内のいずれのサブクラスのものであってもよい。例えば、キメラ抗体は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、またはＩｇＭ抗体のＦｃ領域を有していてもよい（すなわち、キメラ抗体は、重鎖α、δ、ε、γ、またはμの各定常ドメインを含んでいてもよい）が、好ましくは、本発明に係る使用のための抗体は、アイソタイプがＩｇＧである。したがって、本発明のキメラ抗体は、どのアイソタイプであってもよい。キメラ抗体の軽鎖は、κ軽鎖であってもよいしλ軽鎖であってもよい。すなわち、ヒトλ軽鎖の定常領域を含んでいてもよいし、ヒトκ軽鎖の定常領域を含んでいてもよい。同様に、キメラ抗体断片は、定常ドメインを含む抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）_２断片）である。本発明に係る使用のためのキメラ抗体断片の定常ドメインは、キメラモノクローナル抗体について上述したような定常ドメインであってもよい。

キメラ抗体は適切ないずれの方法を用いて作製されてもよく、例えば、マウス可変ドメインのＤＮＡ配列をヒト定常ドメインのＤＮＡ配列に融合させてキメラ抗体をコードするようにした、組み換えＤＮＡ技術などを用いてもよい。キメラ抗体断片は、組み換えＤＮＡ技術を用いて、このようなポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を産生することで得られてもよいし、本発明に係る使用のためのキメラ抗体を処理して、上述したような所望の断片を産生することで得られてもよい。キメラ抗体は、ヒトの治療法に異種の抗体、例えば、マウス抗体を用いることに伴う、インビボにおける半減期が短いことやエフェクター機能が弱いという問題を克服することが期待でき、患者の感作やＨＡＭＡが生じる可能性が低減できる。しかしながら、可変ドメインにマウス配列が存在しているために、キメラ抗体をヒトの患者に投与した際に、患者の感作やＨＡＭＡは依然として生じ得る。

したがって、本発明に係る使用のための抗体または抗体断片は、好適には完全にヒト化されている。ヒト化抗体とは、マウスなどの他の種に由来する抗体であって、抗体鎖の定常ドメインがヒト定常ドメインと置き換わっており、抗体内の非ヒト配列が好ましくはＣＤＲ配列のみとなるように、可変領域のアミノ酸配列を改変して異種（例えば、マウス）フレームワーク配列をヒトフレームワーク配列と置き換えることも行われている、抗体である。ヒト化抗体によって、ヒトに対して非ヒト抗体を治療用途で用いることに伴う問題をすべて克服することができ、その例として、患者の感作やＨＡＭＡが生じる可能性を回避または最小化することが挙げられる。

通常、抗体のヒト化は、ＣＤＲ移植として知られるプロセスによって行われるが、当該技術分野における他の方法が用いられてもよい。抗体移植については、ウィリアムズ，Ｄ．Ｇ．（Williams, D.G.）ら，Antibody Engineering第１巻，編集：Ｒ．コンターマン（R. Kontermann）およびＳ．デュベル（S. Dubel），２１章，ｐｐ．３１９〜３３９にてよく説明されている。このプロセスにおいて、上述したようなキメラ抗体が最初に作製される。したがって、抗体のヒト化においては、非ヒト定常ドメインは最初にヒト定常ドメインと置き換えられ、これによってヒト定常ドメインと非ヒト可変ドメインとを含むキメラ抗体が得られる。

続く異種（例えば、マウス）可変ドメインのヒト化は、各免疫グロブリン鎖からのマウスＣＤＲを、最も適切なヒト可変領域のＦＲ内に挿入することを含む。これは、マウス可変ドメインを、公知のヒト可変ドメインのデータベース（例えば、ＩＭＧＴまたはＫａｂａｔ）とアライメントすることによって行われる。例えば、ヒトフレームワーク領域とマウスフレームワーク領域との間で高い配列同一性を有するドメインや、同じ長さのＣＤＲを含むドメイン、（相同性モデリングに基づき）最も似通った構造を有するドメインなど、最もよくアライメントされた可変ドメインから、適切なヒトフレームワーク領域が識別される。次に、マウスＣＤＲ配列が、組み換えＤＮＡ技術を用いて、先頭のヒトフレームワーク配列の適切な位置に移植され、その後、ヒト化抗体が産生されて、標的抗原に対する結合について調べられる。当業者であれば、抗体のヒト化プロセスについて知り、かつ理解しており、さらなる指示がなくても本方法を行うことができる。抗体をヒト化するサービスも、ジェンスクリプト社（GenScript）（米国／中国）やＭＲＣテクノロジー社（MRC Technology）（英国）など、多くの営利企業によって提供されている。ヒト化抗体断片は、上述したように、ヒト化抗体から容易に得ることができる。

または、全長ヒトモノクローナル抗体を、インビトロで、ファージディスプレイ技術を用いた免疫化をすることなく得ることができ、これはフレンゼル（Frenzel）ら（Transfus. Med. Hemother.44(5): 312-318, 2017）が記載している通りである。

したがって、本発明に係る使用のための抗体または抗体断片は、いずれの種に由来するものであってもよく、例えば、マウスの抗体または抗体断片であってもよい。しかしながら、抗体または抗体断片は、キメラ抗体またはその抗体断片であることが好ましい。すなわち、抗体または抗体断片の可変ドメインのみが非ヒト由来であり、定常ドメインはすべてヒト由来であることが好ましい。最適には、本発明に係る使用のための抗体または抗体断片は、ヒト化抗体またはその抗体断片である。

ＷＯ２０１８／１４６２３０に詳述されているように、Ｍｄｘ００１をヒト化したものが本発明者らによって開発されている。配列番号９に示すアミノ酸配列（Ｌ１Ｍ２可変領域として知られる）と配列番号１０（Ｌ２Ｍ２可変領域として知られる）で、上述されたＣＤＲを含む、ヒト化軽鎖可変ドメインが開発されている。特定の実施形態において、本発明に係る使用のための抗体またはその断片は、配列番号９または配列番号１０に示すアミノ酸配列、あるいは、これらのアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）であり、かつＣＤＲ配列ＶＬＣＤＲ１〜３それぞれの配列番号１、配列番号７または配列番号８、および配列番号２〜３に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなる、軽鎖可変領域を含む。

配列番号１１に示すアミノ酸配列（Ｈ４可変領域として知られる）と配列番号１２（Ｈ２可変領域として知られる）で、ヒト化重鎖可変ドメインが開発されている。特定の実施形態において、本発明に係る使用のための抗体またはその断片は、配列番号１１または配列番号１２に示すアミノ酸配列、あるいは、これらアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）であり、かつＣＤＲ配列ＶＨＣＤＲ１〜３それぞれの配列番号４〜６に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなる、重鎖可変領域を含む。

特定の実施形態において、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、ＩｇＧ１アイソタイプのモノクローナル抗体であり、κサブタイプの軽鎖を含む。Ｌ１Ｍ２軽鎖はκサブタイプであり、そのアミノ酸配列は、配列番号１３に示すものである。Ｈ４重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４に示すものである。特定の実施形態において、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、Ｌ１Ｍ２軽鎖とＨ４重鎖を含むＬ１Ｍ２Ｈ４抗体である。したがって、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、以下のものを含む、または以下のものからなる、モノクローナル抗体であってもよい。すなわち、
（ｉ）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または、このアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）であり、かつＣＤＲ配列ＶＬＣＤＲ１〜３それぞれの配列番号１、配列番号７または配列番号８、および配列番号２〜３に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなる、軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１４に示すアミノ酸配列、あるいは、このアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）であり、かつＣＤＲ配列ＶＨＣＤＲ１〜３それぞれの配列番号４〜６に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなる、重鎖と、を含む。

同様に、Ｌ２Ｍ２軽鎖はκサブタイプであり、そのアミノ酸配列は、配列番号１５に示すものである。Ｈ２重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６に示すものである。特定の実施形態において、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、Ｌ２Ｍ２軽鎖とＨ２重鎖を含むＬ２Ｍ２Ｈ２抗体である。したがって、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、以下のものを含む、または以下のものからなる、モノクローナル抗体であってもよい。すなわち、
（ｉ）配列番号１５に示すアミノ酸配列、または、このアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）であり、かつＣＤＲ配列ＶＬＣＤＲ１〜３それぞれの配列番号１、配列番号７または配列番号８、および配列番号２〜３に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなる、軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１６に示すアミノ酸配列、あるいは、このアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）であり、かつＣＤＲ配列ＶＨＣＤＲ１〜３それぞれの配列番号４〜６に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなる、重鎖と、を含む。

別の実施形態においては、Ｌ１Ｍ２軽鎖はＨ２重鎖と対になり、Ｌ２Ｍ２軽鎖はＨ４重鎖と対になりうる。

当業者にとっては公知であるが、抗体鎖は、天然ではシグナル配列とともに産生される。抗体のシグナル配列は、軽鎖および重鎖のＮ末端、すなわち、可変領域のＮ末端に位置するアミノ酸配列である。シグナル配列によって、抗体鎖は、産生された細胞から輸送される。細胞発現系で産生される場合、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列を有する軽鎖および重鎖が、シグナル配列でコードされてもよい。Ｌ１Ｍ２軽鎖およびＬ２Ｍ２軽鎖のシグナル配列は、配列番号２０に示すものであり、Ｈ２重鎖およびＨ４重鎖のシグナル配列は、配列番号２１に示すものである。したがって、シグナル配列と合成される場合、Ｌ１Ｍ２鎖は、配列番号２２に示すアミノ酸配列と合成されてもよく、Ｈ４鎖は、配列番号２３に示すアミノ酸配列と合成されてもよく、Ｌ２Ｍ２鎖は、配列番号２４に示すアミノ酸配列と合成されてもよく、Ｈ２鎖は、配列番号２５に示すアミノ酸配列と合成されてもよい。かかる配列をコードする塩基配列は、当業者であれば容易に誘導できるが、配列番号２２〜２５の抗体鎖をコードし、その合成に使用するのに適した配列の例としては、それぞれ、配列番号２６〜２９に示す塩基配列がある。

上記に詳述したように、本発明は、対象における癌の治療に使用するための特異的結合分子（上記のような）を提供する。精巣癌、卵巣癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、胆管癌、胃癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌、膵臓癌、中皮腫、リンパ腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫などの、癌の治療における使用も、範囲内である。好ましい態様においては、卵巣癌が治療される。別の好ましい態様においては、乳癌が治療される。好ましい実施の形態において、乳癌が、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびヒト上皮増殖因子受容体ＨＥＲ２のうちの１つ以上を発現する。別の実施の形態において、乳癌はトリプルネガティブ（すなわち、ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−）である。別の好ましい態様においては、大腸癌が治療される。別の好ましい態様においては、膵臓癌が治療される。別の好ましい態様においては、肺癌が治療される。癌種（腺癌、扁平上皮癌、 基底細胞癌、移行上皮癌など）、肉腫、白血病、リンパ腫など、あらゆるタイプの癌を、本発明に従って治療してもよい。

本発明によると、ステージＩの癌、ステージＩＩの癌、ステージＩＩＩの癌、およびステージＩＶの癌など、あらゆるステージ（すなわち悪性度）の癌を治療してもよい。転移性の癌も限局性（すなわち、非転移性）の癌も、治療してもよい。

本発明の特定の実施形態において、癌は、Ａｎｘ−Ａ１を発現する（これは、癌の中の細胞がＡｎｘ−Ａ１を、例えば細胞の表面に、発現することを意味する）。癌がＡｎｘ−Ａ１を発現しているかどうか判断することは、当業者にとって簡単なことである。Ａｎｘ−Ａ１の発現は、癌の生検サンプル内で、例えばサンプルの免疫組織化学分析によるタンパク質レベルで、解析してもよい。サンプルは、抗Ａｎｘ−Ａ１抗体（本発明にしたがって使用できる、上記の抗体など）を用いて免疫染色され、当該技術分野における標準的な手順に従い、Ａｎｘ−Ａ１の発現を検出する。サンプルを透過処理する（例えば、当該技術分野で標準的に行われているように、洗浄剤を用いて）ことにより、細胞内および細胞外のＡｎｘ−Ａ１を検出してもよい。

または、Ａｎｘ−Ａ１発現は、核酸レベルで解析してもよく、例えば定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で解析してもよい。ｍＲＮＡは、当該技術分野において標準的な手順を用いて、組織サンプルから抽出されＤＮＡに反転転写される。その後、標的Ａｎｘ−Ａ１配列の定量的な増幅よりＡｎｘ−Ａ１発現レベルを判定してもよい。例えばＴａｑＭａｎなどの適切なｑＰＣＲ技術が、当該技術分野においてよく知られている。

特定の実施形態において、癌はＡｎｘ−Ａ１を過剰発現する。「Ａｎｘ−Ａ１を過剰発現する」とは、同じ由来元からの健康な組織と比べて高いレベルで、癌がＡｎｘ−Ａ１を発現する、ということを意味する。すなわち、同じ由来元（source）からの健康な（つまり、非癌の）細胞と比べて高いレベルで、癌細胞がＡｎｘ−Ａ１を発現する、ということである。「同じ由来元」とは、同じ組織ということを意味する。例えば、卵巣上皮細胞癌が健康な卵巣上皮組織と比べて高いレベルでＡｎｘ−Ａ１を発現するなら、それはＡｎｘ−Ａ１を過剰発現していると考えられるだろう。癌組織がＡｎｘ−Ａ１を過剰に発現するかどうかについては、少なくとも２つの異なる組織（癌組織と健康な対照の組織）でＡｎｘ−Ａ１で発現させて定量的な比較をする必要がある。この比較を行うために適切な技術であればどれを利用してもよいが、ｑＰＣＲが最も適しているだろう。癌がＡｎｘ−Ａ１を過剰発現しているかどうか判断することは、当業者にとって簡単なことであろう。特定の実施形態において、Ａｎｘ−Ａ１を過剰発現している癌と、健康な組織とで、Ａｎｘ−Ａ１の発現レベルの差異が統計学的に有意である。他の実施形態において、癌組織におけるＡｎｘ−Ａ１の発現は、対応する健康な組織と比較して、少なくとも１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または１００％以上増加している。

本発明の別の実施形態において、癌は、その表面にＡｎｘ−Ａ１を発現する（すなわち、癌の細胞の表面にＡｎｘ−Ａ１が発現する）。癌細胞表面でＡｎｘ−Ａ１が発現することは、その細胞がＡｎｘ−Ａ１を発現し、発現したＡｎｘ−Ａ１が輸送されて細胞表面に局在化することを意味する。Ａｎｘ−Ａ１の細胞表面での発現は、上述したように、免疫組織化学に同定されてもよい。特に、細胞表面におけるＡｎｘ−Ａ１の発現を分析するために、透過処理を行うことなく、免疫組織化学的な分析が行われる。このことは、Ａｎｘ−Ａ１の検出に使用される抗体が細胞の内部に進入することができず、細胞外の（例えば、表面に局在する）タンパク質のみが検出されるということである。輸送されたＡｎｘ−Ａ１は、通常、（血漿中や他の細胞外スペースに放出されるよりはむしろ）細胞表面に付着し、したがって免疫組織化学で検出される非透過処理の細胞のＡｎｘ−Ａ１が表面に局在するＡｎｘ−Ａ１であると考えてよい。しかしながら、標準的なプロトコルに従い、着色の前に組織を洗浄して、タンパク質など、遊離している細胞外物質を除去してもよい。

本発明によって治療される癌は、薬剤に耐性のある癌であってもよい。すなわち、癌は１つ以上の化学療法剤（化学療法薬）に耐性があってもよい。癌における薬剤耐性は、ハウスマン（Housman）ら（上記参照）において考察されている。癌が化学療法薬を許容できれば、つまり薬が癌に対して効果が無い（無くなる）場合、その癌は化学療法薬に対して耐性があると考えてよい。ハウスマン（Housman）ら（上記参照）に詳細に記載されているように、癌は、薬剤の不活性化や代謝（または代謝活性化の防止）、薬剤の標的の変異や改変、ＡＢＣトランスポータを介した薬剤排出など、様々なメカニズムにより薬剤耐性を獲得しうる。癌が薬剤に耐性があるかどうかを識別する方法は当該技術分野において知られている。例えば、ワング（Wang）ら（Genes & Diseases 2: 219-221, 2015）およびヴォルム＆エファース（Volm & Efferth）（Front. Oncol. 5: 282, 2015）の教示を参照。いずれもここに参照することにより本明細書に援用する。かかる方法は、エクスビボ（生体外）で細胞集団に与える薬剤の効果を試験し、感受性マーカー／耐性マーカーについて癌細胞を遺伝子スクリーニングすることを含む。

特定の実施形態において、本発明によって治療される癌は、多剤耐性（ＭＤＲ）である。ＭＤＲ癌とは、１つ以上の化学療法薬に対して、特に化学療法薬の１つ以上のファミリーに対して、耐性がある癌を意味する。ＭＤＲ癌は、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、または５つ以上の異なる化学療法薬、または化学療法薬ファミリー（クラス）に対して耐性があってもよい。「ＭＤＲ癌」という用語は、当該技術分野において周知されており、この文脈では当該技術分野での意味に従って使用されている。ＭＤＲ癌は、周知の化学療法薬のすべてに対して耐性があってもよい。多剤耐性は、１つ以上のＡＢＣトランスポータ多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ１）、多剤耐性関連タンパク質１（ＭＲＰ１）、および乳癌耐性たんぱく質（ＢＣＲＰ）の発現によって媒介されてもよい。３つはすべて幅広い基質特異性を有し、それらを発現させる細胞から、多数の異なるクラスの化学療法剤を排出することができる。

本発明に係る使用のための特異的結合分子は、白金系化学療法に対する耐性のある癌細胞の増殖を阻害することに特に効果があると、実施例に示されている。特定の実施形態において、本発明に従って治療される癌は、白金系化学療法剤に耐性がある。（好ましくは、この場合の癌は、乳癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌または膵臓癌である。）。白金系化学療法剤には、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンがあり、どれもヒトに使用することが認められている。他の公知の白金系化学療法剤としては、サトラプラチン、ピコプラチン、フェナンスリプラチン、四硝酸トリプラチンがある。本発明に従って治療される癌は、これら薬剤のいずれに耐性があってもよく、または、これら薬剤すべてに耐性があってもよい。特定の実施形態において、癌はシスプラチンに耐性がある。

癌細胞は、上記に加え、または上記に代わり、ナイトロジェンマスタード（例えば、ベンダムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、およびメルファラン）などの他の二機能性のアルキル化薬剤に対して耐性があってもよい。

代替の、または追加の実施形態において、本発明に従って治療される癌は、タキサン（パクリタキセルやドセタキセルなど）、トポイソメラーゼ阻害剤（トポテカンなど）、アントラサイクリン（ドキソルビシンやエピルビシンなど）、ヌクレオシド類似体（ゲムシタビンなど）などの化学療法剤に対して耐性があってもよい。好ましくは、本実施形態における化学療法剤は、例えばドキソルビシン（アドリアマイシンとしても知られている）などのアントラサイクリンである。他の実施形態において、本発明に従って治療される癌は、ホルモン療法（例えば、タモキシフェンなどの、抗エストロゲンホルモン療法）に耐性がある。乳癌は特に、タモキシフェンなどのホルモン療法に耐性があってもよい。本発明に従って治療される癌は、これら薬剤のいずれに耐性があってもよく、または、これら薬剤すべてに耐性があってもよい。（好ましくは、この場合の癌は、乳癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌または膵臓癌である。）。特定の実施形態において、癌は、（場合によっては、白金系化学療法剤に対する耐性に加えて）ドキソルビシンに耐性がある。

癌細胞が白金系化学療法剤に対する耐性を獲得するメカニズムは、上記のように、多数ある。例えば、癌がメタロチオネインおよび／またはグルタチオンを産生すると、白金系薬剤が不活性化され、かかる薬剤によって誘発されるＤＮＡの損傷がヌクレオチド切除修復と相同組み換えの活性経路によって修復されて、白金系薬剤の働きを覆す。他のメカニズムもまた働いており、白金系療法に対する耐性のある細胞を作るためには、多数の重複しないメカニズムが必要とされうる。白金耐性であると認められる患者には、直近の白金系化学療法の６か月の間に腫瘍の進行が見られる。薬物暴露の後に生殖細胞の生存を調べる増殖性細胞アッセイを使用して、細胞に白金耐性があると識別してもよい。癌細胞が薬物暴露の後に腫瘍や塊を形成することができるかどうかで、これを識別する。

特異的結合分子は、医薬組成物の形態で、治療を受ける対象に投与されてもよい。かかる組成物は、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含有してもよい。本明細書における「薬学的に許容される」とは、組成物の他の成分と親和性があり、かつ受容者が生理学的に許容できる成分のことをいう。組成物および担体または賦形物質の種類や投与量などは、好みや、望ましい投与経路などに応じて、所定の様式で選択されてもよい。また、投与量も、所定の様式で決定されてもよく、分子の種類、患者の年齢、投与形態などによって決まってもよい。

医薬組成物は、対象に投与するために、適切ないずれかの手段によって調製されてもよい。このような投与は、例えば、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、経膣投与、または非経口投与であってもよい。本明細書における経口投与は、頬側投与および舌下投与を含む。本明細書における局所投与は、経皮投与を含む。本明細書で定義される非経口投与は、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、および皮内投与を含む。

本明細書に開示する医薬組成物としては、溶液またはシロップや、粉末、細粒、錠剤、またはカプセルなどの固形組成物、クリーム、軟膏、および当該技術分野において一般的に用いられるその他の組成物の形式が挙げられる。このような組成物に用いられる薬学的に許容される適切な希釈剤、担体、および賦形剤は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、適切な賦形剤としては、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリン酸またはその塩、植物油、蝋、脂肪、およびポリオールが挙げられる。適切な担体または希釈剤としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デキストロース、トレハロース、リポソーム、ポリビニルアルコール、医薬品グレードのデンプン、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース（および他の糖）、炭酸マグネシウム、ゼラチン、油脂、アルコール、界面活性剤、およびポリソルベートなどの乳化剤が挙げられる。安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料などが用いられてもよい。安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料なども、使用されてもよい。

液体医薬組成物は、溶液か、懸濁液か、その他類似のいずれの形態であろうと、以下に挙げるもののうちの１つ以上を含んでいてもよい：すなわち、注射用水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒として働き得る合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリド等の不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、あるいは他の溶媒などの滅菌済希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤である。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入することができる。注射可能な医薬組成物は、好ましくは滅菌済である。

したがって、本発明に係る使用のための医薬組成物は、適切な様式で投与されればよい。投与量および投与回数は、患者の状態ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は、臨床試験によって決定されてもよい。本発明に係る使用のための特異的結合分子は、都合の良いように、１日に１回、週に１回、または月に１回の投与で対象に提供されてもよいし、中間的な頻度で提供されてもよい。例えば、投与は、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、もしくは６日毎に、または２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、もしくは６週間毎に、または２ヶ月毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎、５ヶ月毎、もしくは６ヶ月毎に、または年に１回もしくは年に２回、行われてもよい。投与は、１０ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇの量で、例えば、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇの量、または１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／体重ｋｇの量で、行われてもよい。熟練の臨床医であれば、年齢、身長、体重、治療する病状などのすべての関連要因に基づいて、患者への適切な投与量を算出することができるであろう。

好ましくは、本発明に係る使用のための特異的結合分子、製剤、または医薬組成物は、それを必要とする対象に、治療上有効な量で投与される。「治療上有効な量」とは、対象の病気に対して効果を示すのに十分な量を意味する。対象の病状に対して効果を示すのに十分な量であるかどうかは、医師／獣医によって決定されてもよい。

治療はさらに、対象に対して第２の治療薬を投与することを含む。しかしながら、本発明に係る使用において、特異的結合分子は治療に用いられる唯一の治療用分子であるのが都合よく、例えば、他の細胞障害性薬物や免疫療法薬を併用して治療が行われることはない。細胞障害性薬剤については以下で述べる。免疫療法薬は、免疫応答を誘発する、向上する、または抑制するように働く、投与剤である。

特定の実施形態において、本発明に係る使用のための特異的結合分子は、第２の治療用分子を標的の癌に運ぶために使用されることはない。例えば、特定の実施の形態において、特異的結合分子は細胞障害性分子や放射性核種などの第２の治療用分子に接合することはない（また、第２の治療用分子に結合パートナーを提供することもない）。

第２の治療薬が使用される際には、Ａｎｘ−Ａ１と結合する特異的結合分子と同じ医薬組成物に入れて投与されてもよいし、別の医薬組成物に入れて投与されてもよく、別の医薬組成物は上述されているようなものであってもよい。（したがって、薬品を作る使用においては、前記薬品は特異的結合分子（または第２の治療薬）を含んでいてもよく、前記治療は、前記薬品と共に、第２の治療薬（または特異的結合分子）を、別々に、同時にもしくは逐次的に投与することを含んでいてもよい。）。Ａｎｘ−Ａ１と結合する特異的結合分子と第２の治療薬とは、対象に対して別々に、同時にもしくは逐次的に投与されてもよい。本明細書における「別々」の投与とは、特異的結合分子と第２の治療薬とが同時に、または少なくとも実質的に同じ時に逐次的に、しかし異なる投与ルートで、対象に対して投与されることを意味する。本明細書における「同時」の投与とは、特異的結合分子と第２の治療薬とが同時に、または少なくとも実質的に同時に、同じ投与ルートで、対象に対して投与されることを意味する。本明細書における「逐次」の投与とは、特異的結合分子と第２の治療薬とが異なる時間に対象に対して投与されることを意味する。特に、第１の治療薬の投与は、第２の治療薬の投与が始まる前に完了される。逐次的投与は、第１の治療薬の投与と、第２の治療薬の投与とが、１０分から３０日の間隔をあけて、例えば１時間から９６時間（または２週間）間隔をあけて、行われればよい。対象に逐次的に投与されるとき、第１の治療薬と第２の治療薬とは、同じ投与ルートで投与されても、異なる投与ルートで投与されてもよい。

第２の治療薬は、第２の抗癌剤であってもよいが、他の実施形態においては異なる働きをするものであってもよい。例えば、第２の治療薬は抗菌薬や抗真菌薬であってもよく、または、患者を治療するために有用な別の薬剤であってもよい。特定の実施形態において、第２の治療薬は化学療法剤、特に細胞障害性薬剤である。本明細書で言及するように、化学療法剤は、悪性細胞や悪性組織を破壊する投与薬である。細胞障害性の薬剤は、細胞を破壊するか、または、細胞の繁殖を防止する物質である。いずれのクラスのいずれの化学療法剤も使用してもよい。例えば、タキサン（パクリタキセルやドセタキセルなど）、トポイソメラーゼ阻害剤（トポテカンなど）、アントラサイクリン（ドキソルビシンやエピルビシンなど）、ヌクレオシド類似体（ゲムシタビンなど）、白金系薬剤（シスプラチンや、カルボプラチンなど)、アルキル化薬剤（シクロホスファミドなど）、キナーゼ阻害剤（イマチニブなど）、または他の化学療法剤やこれまでに述べた薬剤などを使用してもよい。

かかる薬剤は、本発明に係る使用のための特異的結合分子と組み合わせて使用してもよい。一態様において、化学療法剤は、癌が（本発明で使用するための特異的結合分子を使用せずに治療するときに）耐性を有する薬剤であってもよい。別の態様において、化学療法剤は、癌が（本発明で使用するための特異的結合分子を使用せずに治療するときに）耐性を有する薬剤ではない。

本発明に係る使用のための特異的結合分子もまた、放射線治療および／または手術と組み合わせて、対象に投与してもよい。

上記に詳述したように、本発明は、対象における癌の治療に使用するためのものである。治療は、治癒的なものであってもよい（または、治癒を意図するものであってもよい）が、もしくは苦痛緩和のもの（すなわち、単に、癌の症状を制限する、和らげる、または改善する、もしくは延命するためのもの）であってもよい。好ましくは、治療によって腫瘍が小さくなるか、または、その増殖の速度が落ち着く、または減少する。腫瘍のサイズの減少が、少なくとも１０%、好ましくは少なくとも２０％、３０％、または５０％（例えば、３０％まで、５０％まで、７５％まで、または１００％まで）であることが好ましい。増殖低下のレベルについても同様であることが好ましい。

本発明で治療される対象は、哺乳類のことをいい、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、またはヤギなどの家畜や、ウサギ、ネコ、またはイヌなどのペット動物、サル、チンパンジー、ゴリラ、またはヒトなどの霊長類である。最も好ましくは、対象はヒトである。対象は、癌を患っているか、または、癌を患っている疑いのある、いずれの動物（好ましくはヒト）であってもよい。したがって、対象は、癌治療の必要のある個体である。

本発明は、したがって、対象における癌を治療する方法を提供し、前記方法は、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子を前記対象に投与することを含む、とみなされてよい。前記治療、癌、対象、および／または特異的結合分子は、上記に定義された通りであればよい。

同様に、本発明は、対象における癌の治療用の薬品の製造での、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子の使用を提供する、とみなされてよい。前記治療、癌、対象、および／または特異的結合分子は、上記に定義された通りであればよい。

他の態様において、本発明は、上記に定義されたようなヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子と、化学療法剤とを含むキットを提供する。適切な化学療法剤は、上述されている。特異的結合分子と化学療法剤とは、別々の容器に提供されてもよく、すなわち、別々の組成物で提供されてもよく、もしくは、単一の組成物で単一の容器に提供されてもよい。各治療薬は、適切な形態で提供されればよく、例えば、水溶液として、または、凍結乾燥物として提供されてもよい。

他の態様において、本発明は、対象における癌の治療に別々に、同時にもしくは逐次的に使用するための、上記で定義されたような、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子と、第２の治療薬とを含む製品を提供する。第２の治療薬、癌および／または対象は、上記に定義された通りであればよい。特定の実施形態において、第２の治療薬は化学療法剤である。特異的結合分子と第２の治療薬とは、別々の容器に提供されてもよく、すなわち、別々の組成物で提供されてもよく、もしくは、単一の組成物で単一の容器に提供されてもよい。各治療薬は、適切な形態で提供されればよく、例えば、水溶液として、または、凍結乾燥物として提供されてもよい。

本願において引用される文献は、すべて、参照によりその全体が本明細書に援用される。

本発明は、以下の限定しない実施例を参照することによって、さらに理解されるであろう。

図１は、乳癌細胞株ＭＣＦ７の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ１Ｍ２Ｈ４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ２Ｍ２Ｈ２の効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図２は、乳癌細胞株ＨＣＣ１８０６の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ１Ｍ２Ｈ４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ２Ｍ２Ｈ２の効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図３は、卵巣癌細胞株Ａ２７８０の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ１Ｍ２Ｈ４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ２Ｍ２Ｈ２の効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図４は、卵巣癌細胞株Ａ２７８０ｃｉｓの増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ１Ｍ２Ｈ４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ２Ｍ２Ｈ２の効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図５は、卵巣癌細胞株Ａ２７８０ＡＤＲの増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ２Ｍ２Ｈ２の効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図６は、膵臓癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ−２の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ１Ｍ２Ｈ４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ２Ｍ２Ｈ２の効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図７は、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ１Ｍ２Ｈ４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体Ｌ２Ｍ２Ｈ２の効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図８は、乳癌細胞株ＨＣＣ１８０６の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４の効果を示す。非特異的なコントロールＩｇＧの影響も示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図９は、乳癌細胞株ＭＣＦ７の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および非特異的なコントロールＩｇＧの効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１０は、タモキシフェン耐性乳癌細胞株ＭＣＦ−７／ＴＡＭＲ７の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および非特異的なコントロールＩｇＧの効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１１は、卵巣癌細胞株Ａ２７８０の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４の効果を示す。非特異的なコントロールＩｇＧの影響も示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１２は、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４の効果を示す。非特異的なコントロールＩｇＧの影響も示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１３は、大腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および非特異的なコントロールＩｇＧの効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１４は、大腸癌細胞株ＳＷ４８０の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および非特異的なコントロールＩｇＧの効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１５は、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４の効果を示す。非特異的なコントロールＩｇＧの影響も示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１６は、膵臓癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ−２の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および非特異的なコントロールＩｇＧの効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１７は、膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および非特異的なコントロールＩｇＧの効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１８は、肺癌細胞株ＣＯＲ−Ｌ２３の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４の効果を示す。非特異的なコントロールＩｇＧの影響も示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図１９は、アドリアマイシン耐性肺癌細胞株ＣＯＲ−Ｌ２３．５０１０の増殖に対する抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ＭＤＸ−１２４および非特異的なコントロールＩｇＧの効果を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図２０は、乳癌のマウスモデルにおけるＭＤＸ−１２４による治療の結果を示す。当図は４つの治療群について平均腫瘍体積を示す。第１群は、コントロール群であり、投与量分の媒質（ＰＢＳ）のみを投与した。第２群には、投与量１ｍｇ／ｋｇのＭＤＸ−１２４を投与し、第３群には、投与量１０ｍｇ／ｋｇのＭＤＸ−１２４を投与し、第４群には、投与量２５ｍｇ／ｋｇのＭＤＸ−１２４を投与した。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 図２１は、乳癌のマウスモデルにおけるＭＤＸ−１２４による治療の結果を示す。当図は４つの治療群について平均相対腫瘍体積を示す。第１群は、コントロール群であり、投与量分の媒質（ＰＢＳ）のみを投与した。第２群には、投与量１ｍｇ／ｋｇのＭＤＸ−１２４を投与し、第３群には、投与量１０ｍｇ／ｋｇのＭＤＸ−１２４を投与し、第４群には、投与量２５ｍｇ／ｋｇのＭＤＸ−１２４を投与した。最初の治療投与の日である１２日目の腫瘍体積を、ベースラインの腫瘍体積、つまり、相対腫瘍体積１００％と定義する。提示された相対腫瘍体積は、したがって、１２日目の体積に基づくパーセンテージとしての各腫瘍の体積に対応する。

実施例
実施例１―細胞の増殖に対する抗体の効果
材料
細胞株ＭＣＦ７、細胞株ＭＣＦ―７／ＴＡＭＲ７、細胞株Ａ２７８０、細胞株Ａ２７８０ｃｉｓ、細胞株Ａ２７８０ＡＤＲ、細胞株ＨＣＴ１１６、細胞株Ｃａｃｏ−２、細胞株ＳＷ４８０、細胞株ＣＯＲ−Ｌ２３、細胞株ＣＯＲ−Ｌ２３．５０１０、細胞株ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、細胞株ＰＡＮＣ−１、および細胞株ＢｘＰＣ−３は、Public Health England Culture Collectionsから入手した。細胞株ＨＣＣ１８０６は、ＡＴＣＣから入手した。ＭＣＦ７は、エストロゲン受容体とプロゲステロン受容体とに陽性であるヒト乳腺癌細胞株である。ＭＣＦ−７／ＴＡＭＲ７は、ＭＣＦ７のタモキシフェン耐性誘導体である。ＨＣＣ１８０６は、トリプルネガティブヒト乳癌細胞株である。Ａ２７８０は、ヒト卵巣癌細胞株であり、Ａ２７８０ｃｉｓは、シスプラチン耐性ヒト卵巣癌細胞株（Ａ２７８０由来）である。Ａ２７８０ＡＤＲは、アドリアマイシン耐性ヒト卵巣癌細胞株（Ａ２７８０由来）である。ＭＩＡ ＰａＣａ−２は、ヒト膵癌細胞株である。ＢｘＰＣ−３は、ヒト膵臓腺癌細胞株である。ＰＡＮＣ−１は、ヒト膵臓類上皮癌細胞株である。Ｃａｃｏ−２は、ヒト結腸直腸腺癌（colorectal carcinoma）細胞株である。ＨＣＴ１１６は、ヒト結腸直腸癌細胞株である。ＳＷ４８０は、ヒト結腸直腸腺癌（colorectal adenocarcinoma）細胞株である。ＣＯＲ−Ｌ２３は、ヒト肺大細胞癌細胞株である。ＣＯＲ−Ｌ２３．５０１０は、ＣＯＲ−Ｌ２３のアドリアマイシン耐性誘導体である。
Ｌ１Ｍ２Ｈ４抗Ａｎｘ−Ａ１抗体およびＬ２Ｍ２Ｈ２抗Ａｎｘ−Ａ１抗体は、ＷＯ２０１８／１４６２３０に開示され、配列は本明細書に記載されている。Ｌ１Ｍ２Ｈ４抗体は、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する重鎖とを有する。Ｌ２Ｍ２Ｈ２抗体は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する重鎖とを有する。
抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４は、アブカム（Ａｂｃａｍ）社（英国）から入手した。前記抗体は、ヒトＡｎｘ−Ａ１アミノ酸３−２４（配列番号３０）に結合するポリクローナルウサギ抗体である。このエピトープ配列は、Ｃａ^２＋非存在下でＡｎｘ−Ａ１のコアのポケット内で結合する、Ａｎｘ−Ａ１のＮ末端領域の一部を形成する。これは上述した通りである。

方法
細胞培養
初期増殖アッセイにおいて、細胞を下記培地で培養した。ＤＭＥＭ＋グルタマックス、１０％のＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン（ＭＣＦ７、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＨＣＣ１８０６）、ＰＲＭＩ１６４０＋２ｍＭのＬ−ｇｌｕ，１０％のＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン（ＢｘＰｃ−３、Ａ２７８０）。Ａ２７８０ｃｉｓおよびＡ２７８０ＡＤＲは、Ａ２７８０と同一の増殖培地で培養されたが、様々な培養の段階で、薬剤耐性を維持するためにそれぞれの薬剤を含有した（すなわち、Ａ２７８０ｃｉｓはシスプラチンを、Ａ２７８０ＡＤＲはアドリアマイシンを含有した）。
さらなる増殖アッセイにおいて、細胞を下記培地、下記条件下で培養した。
ＭＣＦ７、ＨＣＣ１８０６、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１を、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ中で培養。
ＭＣＦ７/ＴＡＭＲ７を、１％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のＬ−グルタミン、および１％のインスリンを含有するフェノールレッド不含のＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養。
Ａ２７８０、ＣＯＲ−Ｌ２３，ＣＯＲ−Ｌ２３．５０１０、およびＢｘＰＣ−３を、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ中で培養。
ＨＣＴ１１６を、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンを含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ中で培養。
ＳＷ４８０を、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンを含有するＬ−１５中で培養。
Ｃａｃｏ−２を、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のＬ−グルタミン、および１％の非必須アミノ酸溶液を含有するＭＥＭ中で培養。
さらに、ＣＯＲ−Ｌ２３．５０１０を、アドリアマイシンの存在下で培養し、薬剤耐性を維持させた。細胞株はすべて、３７℃で、５％のＣＯ_２を含む雰囲気中で培養した。

細胞増殖アッセイ
細胞の増殖は、細胞代謝活性を測定するためにＭＴＴ比色アッセイを用いて測定した。このアッセイでは、ＮＡＤＰＨ依存性細胞酸化還元酵素が、黄色テトラゾリウム色素、つまりＭＴＴを、還元して不溶性紫色ホルマザン生成物とし、分光光度計を用いて５００〜６００ｎｍでの吸光度を測定することによって、これを定量する。ホルマザンの量は、細胞増殖のレベルに比例し、急速に分裂する細胞は、より高いレベルのＭＴＴを還元する。アッセイは３回行った。細胞は、１００μＬの最終体積で播種した。
初期増殖アッセイにおいて、細胞は下記の密度で播種した。１×１０^５／ｍＬ（ＭＣＦ７、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、およびｎ＝２のＡ２７８０ｃｉｓ）、２×１０^５／ｍＬ（Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、およびｎ＝１のＡ２７８０ｃｉｓ）、５×１０^４／ｍＬ（ＨＣＣ１８０６）および２．５×１０^４／ｍＬ（ＢｘＰＣ−３）。
さらなる増殖アッセイにおいて、細胞は下記の密度で播種した。
ＭＣＦ７、ＨＣＣ１８０６、Ａ２７８０、Ａ２７８０、Ａ２７８０ｃｉｓ、ＣＯＲ−Ｌ２３、およびＨＣＴ１１６の細胞を、５×１０^３／ウェルずつ播種し、
ＭＣＦ７／ＴＡＭＲ７、ＣＯＲ−Ｌ２３．５０１０、ＳＷ４８０、Ｃａｃｏ−２、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＢｘＰＣ−３、およびＰＡＮＣ−１の細胞を、１×１０^４／ウェルずつ播種した。
そして細胞をアッセイ前に２４時間培養し、その後細胞増殖を測定した。細胞増殖は、下記プロトコルのうちの一つにしたがって測定した。
（ａ）抗体非存在下（コントロールとして）、抗体（Ｌ１Ｍ２Ｈ４またはＬ２Ｍ２Ｈ２）を１μＭ加えて、または抗体（Ｌ１Ｍ２Ｈ４またはＬ２Ｍ２Ｈ２）を１０μＭ加えて、４８時間培養した。ＭＴＴアッセイは、最大３回別々に、様々な癌細胞株で行われた（初期増殖アッセイ）。または、
（ｂ）抗体非存在下、または２．５μＭ、５μＭ、７．５μＭ、または１０μＭの濃度の抗体存在下で７２時間培養した。このプロトコルで用いられた抗体は、Ｌ１Ｍ２Ｈ４（本明細書においてはＭＤＸ−１２４とも称される），市販の抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４、およびアイソタイプコントロールとしての非Ａｎｘ−Ａ１特異的ＩｇＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国、カタログ番号３１１５４）であった（さらなる増殖アッセイ）。
コントロール培養の細胞数は、増殖アッセイ用のベースラインカウントと定められた。抗体がある培養の細胞のカウントは、ベースラインを基準に標準化し、ベースライン値のパーセンテージとして提示した（“生存率”と称する）。細胞増殖アッセイ結果の統計的な分析は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いて行われた。

ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、標準的なＥＬＩＳＡ技術を用いてThe Antibody Company社（英国）によって行われた。２５μｇ／ｍｌの全長Ａｎｘ−Ａ１またはＡｎｘ−Ａ１ Ｎ末端ペプチド（Ａｎｘ−Ａ１アミノ酸２−２６、配列番号３１に対応）、およびコーティング緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ_２を添加した４５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、ｐＨ９．６）を用いて、４℃で１７時間、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。その後、ブロッキング緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２％ｗ／ｖ ＢＳＡ）を用いて、室温で１．５時間、プレートのブロッキングを行った。
次いで、一次抗体（ａｂ６５８４４）をプレートに加えた。抗体は、プレートの全体に４倍希釈で２回塗布した。すなわち、１μｇ／ｍｌの濃度から始まって、最後は２．３８×１０^−７μｇ／ｍｌの濃度とした。０．１ ＢＳＡを添加した洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０、および１ｍＭ ＣａＣｌ_２）で抗体を希釈した。一次抗体を、プレートに室温で１時間添加した後、洗浄緩衝液を用いてプレートを洗浄した。
次いで、検出抗体を加えた。検出には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギ抗体（メルク社、ドイツ、カタログ番号ＡＰ１５６Ｐ）を、１：３０００に希釈して用いた。これを、室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。その後、再度、洗浄緩衝液を用いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄した。
次に、比色用基質であるＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、シグマ・アルドリッチ社、Ｐ４６６４）をプレートに加えた。ＯＰＤ溶液を製造者の説明書にしたがって作製し、リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５）を用いた０．４ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ溶液を得た。使用直前に、ＯＰＤ溶液１００ｍｌあたり４０μｌの３０％ Ｈ_２Ｏ_２を加えた。その後、得られたＯＰＤ溶液１００μｌを、プレートの各ウェルに加えた。
室温、暗所で２０分間、プレートをインキュベートし、その後、５０μｌの３Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。Ｈ_２ＳＯ_４の添加直後に、プレートの４９２ｎｍにおける吸光度を読み取った。

結果
市販の抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４をＥＬＩＳＡによって調べ、その報告されたエピトープの結合を確認した。このアッセイは、抗体ａｂ６５８４４は全長Ａｎｘ−Ａ１にも、Ｎ末端Ａｎｘ−Ａ１ペプチドにも結合することを示し（データは示していない）、ヒトＡｎｘ−Ａ１（配列番号３０）のアミノ酸３−２４の報告されたエピトープが正しいことを示している。

初期増殖アッセイ
初めの増殖アッセイは、４８時間にわたって増殖を測定し、２つの抗体、すなわち抗体Ｌ１Ｍ２Ｈ４と抗体Ｌ２Ｍ２Ｈ２の、当該細胞株への効果を、抗体が無い状態での（すなわち、上記のプロトコル（ａ）を用いた）インキュベーションと比較した。
乳癌細胞株についてのこれら増殖アッセイの結果を図１および図２に示す。図示されたように、Ｌ１Ｍ２Ｈ４抗体は、１０μＭで統計的に有意な効果（ｐ＜０．００１）を有し、ＭＣＦ７細胞の増殖を低減した。ただしこれはｎ＝１である。ＨＣＣ１８０６細胞株において、Ｌ２Ｍ２Ｈ２抗体もまた、１０μＭで、十分に有意に増殖を減少させた（ｐ＜０．０５）（ｎ＝２）。
卵巣癌細胞株Ａ２７８０の増殖アッセイの結果を、図３に示す。図示されたように、Ｌ１Ｍ２Ｈ４抗体とともにインキュベーションすると、１０μＭで、十分に有意な増殖の減少が見られた（ｐ＜０．０１）（ｎ＝２）。シスプラチン耐性卵巣癌細胞株、Ａ２７８０ｃｉｓ（図４）では、Ｌ１Ｍ２Ｈ４抗体とともにインキュベーションすると、１μＭ（ｐ＜０．００１）および１０μＭ（ｐ＜０．０１）で、統計的に有意な増殖の減少が見られ（ｎ＝２）、Ｌ２Ｍ２Ｈ２抗体を使用すると１０μＭで、十分に有意な増殖の減少が見られた（ｐ＜０．０５）（ｎ＝３）。アドリアマイシン耐性の卵巣癌細胞株Ａ２７８０ＡＤＲの増殖アッセイの結果を、図５に示す。Ｌ２Ｍ２Ｈ２抗体は、これら細胞の増殖に対して有意な効果を有していた。
膵臓癌細胞株の増殖アッセイの結果を、図６および図７に示す。

さらなる増殖アッセイ
前記増殖アッセイを繰り返し、７２時間かけて増殖を測定した。これらアッセイは、本発明のある抗体（Ｌ１Ｍ２Ｈ４，ＭＤＸ−１２４としても知られる）の効果を、非特異的ＩｇＧコントロールの増殖に対する効果と比較し、記載のある場合は市販の抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４の増殖に対する効果と比較した。抗体非存在下での増殖に対する比較も行い、ベースラインとして使用した。実験はすべて３回行った（ＭＤＸ−１２４とＩｇＧコントロールについて３回行い、ａｂ６５８４４も調べられた場合については、この抗体を用いた実験は２回行った。）

ＭＤＸ−１２４がＨＣＣ１８０６乳癌細胞株の増殖に有意な効果をもち、ベースラインと比較して生存率をほぼ三分の二（６３％）減少させることがわかった（図８）。非特異的ＩｇＧコントロールは、生存率に影響をもたなかった。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４は、調べられた濃度のすべてにおいて、ＨＣＣ１８０６の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．００１（抗体濃度が２．５μＭの時）、または＜０．０００１（すべての抗体濃度で）であった。特に、ポリクローナル抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４は、実際には細胞の生存率を（ひいては増殖を）増大させた。確かに、抗体の濃度のすべてにおいて、ＭＤＸ−１２４はａｂ６５８４４と比較して、ＨＣＣ１８０６の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．０１（抗体濃度が２．５μＭの時）、または＜０．００１（すべての抗体濃度で）であった。この結果は、ＭＤＸ−１２４がＨＣＣ１８０６細胞の（生存率に有意の減少を引き起こして）増殖を阻害することを表している。しかしながら、すべての抗Ａｎｘ−Ａ１抗体について、この効果が見られるわけではない。ａｂ６５８４４は細胞の生存率について反対の効果を有するからである。

ＭＤＸ−１２４はまた、乳癌細胞株ＭＣＦ７と、そのタモキシフェン耐性誘導体の増殖にも有意の効果があることがわかった（それぞれ図９および図１０）。どちらの例でも、非特異的ＩｇＧコントロールによる増殖の減少はせいぜい２６％であった。ＭＤＸ−１２４は最大濃度では、ＭＣＦ７細胞の生存率に有意の７６％の減少を引き起こし、また、タモキシフェン耐性誘導体ＭＣＦ７細胞の生存率に有意の（より低くはあるが）４７％の減少を引き起こした。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４は、調べられた濃度のすべてにおいて、ＭＣＦ７細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．０００１であった。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４はまた、５μＭおよび７．５μＭの濃度、ならびに１０μＭの濃度で、ＭＣＤ７／ＴＡＭＲ７の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかった。Ｐ値はそれぞれ、５μＭおよび７．５μＭの濃度でＰ＜０．０１、１０μＭの濃度でＰ＜０．０５であった。これらの結果はＭＤＸ−１２４が、トリプルネガティブ細胞株と、ホルモン受容体陽性細胞株との両方で、乳癌細胞の増殖を阻害する効果が高いことを示している。この抗体はまた、薬剤耐性乳癌に対しても効果がある。この効果は、ＭＤＸ−１２４に対して特異的であり、抗Ａｎｘ−Ａ１抗体すべてに見られるわけではない。

同様に、ＭＤＸ−１２４が卵巣癌細胞株Ａ２７８０の増殖に有意な効果をもつことがわかった（図１１）。非特異的ＩｇＧが増殖を減少させるのはせいぜい３０％（最大濃度で）である一方で、ＭＤＸ−１２４は増殖に対して二倍以上の効果を有した（最大濃度で増殖に６１％の減少を引き起こした）。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４はまた、５μＭおよび７．５μＭの濃度、ならびに１０μＭの濃度で、Ａ２７８０の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかった。Ｐ値はそれぞれ、５μＭおよび７．５μＭの濃度でＰ＜０．０５、１０μＭの濃度でＰ＜０．０１であった。また、ポリクローナル抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４についてもこの効果は見られず、増殖に対して有意な影響を与えなかった。この抗体については、低濃度（５μＭ以下）でわずかに増殖が増大するが、最大濃度では５％という控えめな増殖の減少が見られる。確かに、５μＭ、７．５μＭ、および１０μＭという抗体の濃度で、ＭＤＸ−１２４はａｂ６５８４４と比較して、Ａ２７８０の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．００１であった。

ＭＤＸ−１２４はまた、大腸癌細胞の増殖にかなりの影響を有することが分かった（図１２〜１４）。ＨＣＴ１１６細胞株の増殖の結果を、図１２に示す。ＭＤＸ−１２４は、これらの細胞の増殖を半分強に減少させる（最大濃度で増殖を最大５４％減少させる）。非特異的ＩｇＧコントロールは、増殖に対して実際の影響が無く、ポリクローナル抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４は、異なる濃度では異なる影響を及ぼしていた。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４は、調べられた濃度のすべてにおいて、ＨＣＴ１１６の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．００１（抗体濃度が２．５μＭおよび７．５μＭの時）、または＜０．０００１（抗体濃度が５μＭおよび１０μＭの時）であった。ａｂ６５８４４についてのデータはわずかに矛盾しているが、この抗体が癌細胞の増殖をさらに促進させるという一般的傾向がある。その一方で、ａｂ６５８４４と比較して、ＭＤＸ−１２４は、ＨＣＴ１１６の細胞の生存率に、抗体濃度２．５μＭで、また抗体濃度５μＭおよび１０μＭで、統計的に有意な減少を引き起こすことがわかった。濃度２．５μＭではＰ＜０．０１、抗体濃度５μＭおよび１０μＭでは、どちらもＰ＜０．００１であった。どのデータポイントでも、ａｂ６５８４４が増殖の減少を引き起こすことは示唆されない。

細胞株Ｃａｃｏ−２を用いた場合の結果（図１３）と、ＳＷ４８０を用いた場合の結果（図１４）とからは同様のことがわかった。すなわち、ＭＤＸ−１２４は有意に増殖の減少を引き起こし、一方で、非特異的ＩｇＧコントロールはせいぜい最小限の影響を有するだけである。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４は、調べられた濃度のすべてにおいて、Ｃａｃｏ−２の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．０５（抗体濃度が２．５μＭおよび５μＭの時）、または＜０．００１（抗体濃度が７．５μＭおよび１０μＭの時）であった。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４は、調べられた濃度のすべてにおいて、ＳＷ４８０の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．０１（抗体濃度が２．５μＭの時）、または＜０．０００１（調べられた抗体濃度すべてで）であった。ＭＤＸ−１２４は大腸癌細胞の増殖の阻害に非常に効果的があることを、これらの結果が示している。この効果もまた、ＭＤＸ−１２４に対して特異的であり、抗Ａｎｘ−Ａ１抗体すべてに見られるわけではない。

膵臓癌細胞株へのＭＤＸ−１２４の影響を、図１５〜１７に示す。細胞株ＢｘＰＣ−３へのＭＤＸ−１２４の影響を、図１５に示す。ＭＤＸ−１２４はまた、細胞増殖に有意の影響を有し、最大濃度では増殖を半減させる。非特異的ＩｇＧコントロールは増殖に対して最小限の影響を有するのみであったが、ポリクローナル抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４はここでもまた増殖を有意に増大させた。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４は、調べられた濃度のすべてにおいて、ＢｘＰＣ−３の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．００１（抗体濃度が２．５μＭの時）、または＜０．０００１（調べられた抗体濃度すべてで）であった。ａｂ６５８４４と比較して、ＭＤＸ−１２４は、ＢｘＰＣ−３の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は調べられた抗体濃度すべてで＜０．００１であった。

細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ−２およびＰＡＮＣ−１へのＭＤＸ−１２４の影響を、それぞれ図１６および図１７示す。どちらの例でも、ＭＤＸ−１２４は増殖にほぼ半分という有意の減少を引き起こし、一方で非特異的ＩｇＧが生存率に引き起こす減少は大幅に小さい。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４は、抗体濃度が５μＭおよび１０μＭの時ＭＩＡ ＰａＣａ−２の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．０５であった。非特異的ＩｇＧコントロールと比較して、ＭＤＸ−１２４は、調べられた濃度のすべてにおいて、ＰＡＮＣ−１の細胞の生存率に統計的に有意な減少を引き起こすことがわかり、Ｐ値は＜０．０５（抗体濃度が２．５μＭの時）、または＜０．００１（調べられた抗体濃度すべてで）であった。

肺癌細胞株ＣＯＲ−Ｌ２３およびＣＯＲ−Ｌ２３．５０１０へのＭＤＸ−１２４の影響を、それぞれ図１８および図１９に示す。ＭＤＸ−１２４抗体が、増殖に対して控えめではあるが負の効果を有するが、非特異的ＩｇＧコントロールとポリクローナル抗Ａｎｘ−Ａ１抗体ａｂ６５８４４とは増殖に対して非常に小さい効果を示したことを、これらの結果は示している。他の肺癌細胞株でも同様の結果が得られた（データは示していない）。

結論
ＭＤＸ−１２４に暴露することにより、乳癌（トリプルネガティブ細胞株、ホルモン受容体陽性細胞株、および薬剤耐性細胞株を含む）、大腸癌、卵巣癌、肺癌、および膵臓癌からの細胞株の増殖が有意に減少した。
ＭＤＸ−１２４の癌細胞増殖への影響は、抗体特異的であり、つまり同じ標的（Ａｎｘ−Ａ１）に対してすべての抗体が同じ影響を有するとは限らない。これは、ａｂ６５８４４が調べられた細胞株のいずれの増殖も有意に減少させることが無く、むしろ多くの場合、増殖を増大させたという事実によって示されている。ＭＤＸ−１２４を使用した場合に見られた増殖の有意な減少を、非特異的ＩｇＧコントロールが起こすことも無かった。

実施例２―エピトープ判定
ＨＤＸ解析は、Ｌ１Ｍ２Ｈ４抗体を用いて、ドイツ、チュービンゲン大学の自然科学医学研究所（Natural and Medical Sciences Institute）（ＮＭＩ）にて行った。

サンプル調製および分析
抗体―抗原複合体形成および水素―重水素交換
抗体−抗原サンプルの５つのアリコート、および抗体を伴わない抗原の５つのアリコートを、下記のように調製した：０．８μＬのＡｎｘ−Ａ１（４１μＭ）と、１．８μＬの抗体（３８．７μＭ）またはＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ ＣａＣｌ_２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）をそれぞれと、１μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液と、０．５μＬのＣａＣｌ_２（８ｍＭ）とを混合し、１０分間２０℃でインキュベートした。８．５μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加して、塩含有量を調整した。この抗体−抗原複合体を０℃で一晩、その後１５℃で２時間、凍結乾燥させて、水分をできるだけ取り除いた。１０個の凍結乾燥アリコートを、ＨＤＸ交換とＬＣ−ＭＳ分析まで−２０℃で凍結した。各抗体−抗原複合体と、抗体を伴わない抗原とは、アリコート一つずつを１２．５μｌのＨ_２Ｏ中で可溶化し、その他を１２．５μＬのＤ_２Ｏで可溶化した。各アリコートを分析直前に別々に調製し、アリコートを下記時間インキュベートした。
０分間（Ｈ_２Ｏ標準サンプル）；
５分間、７０分間、３６０分間、および２４時間（Ｄ_２Ｏ重水素交換動的サンプル）。
用意したて（freshly prepared）のクエンチング溶液１２．５μＬを加えて、前記交換をクエンチした（塩酸グアニジンを０．８Ｍ、ＴＣＥＰを０．４Ｍ、１００ｍＭの蟻酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ２．５）。

ペプシン消化
クエンチング溶液添加直後、０．３５μＬのペプシン（１００μＭ）を加え、２０℃で２分間消化を行った。アリコートをすぐに−２０℃に予め冷却されたオートサンプラーバイアルに入れ、予め冷却された注射器を介して液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）に注入した。

ＬＣ−ＭＳ
得られたペプチド混合物を、逆相高速液体クロマトグラフィ（HPLC、RSLC3000 LC, Thermo Scientific Dionex, Idstein, Germany）を使用して前処理せずに注入して分離した。サンプルの分離には、ＬＣカラム（ACQUITY UPLC BEH300 C18 1.7 μm 1x50mm Thermo Scientific Dionex, Idstein, Germany）を使用した。空試験運転と、カラム洗浄運転とを、連続したサンプル運転中に行った。
クロマトグラフィによる分離は、ほぼ均一濃度の勾配を３１分間使用して行った。溶離液Ａは、０．１％蟻酸を含む水であり、溶離液Ｂは、０．１％蟻酸を含むアセトニトリルであった。最適化した２０分の直線勾配を、傾斜を変えて、０℃までの温度で次のように適用した（分／％Ｂ）：０／８、３／８、１１．９／２０、３１．９／２０、３３／９９、３４／９９、３５／８。手動注入を行った。注入量は、体積２０μＬのサンプルループを使用して、２５．３５μＬであった。流速は４０μＬ／ｍｉｎであった。ＨＰＬＣの溶離液は、ＱＴＯＦ型の質量分析計（ＭａＸｉｓ ＨＤ、ブルカー（Bruker）社）に直接注入した。質量分析計は陽イオンモードで動作し、スプレー電圧は１．９ｋＶ、キャピラリ温度は２７５℃、ＳレンズＲＦ電圧は５５Ｖであった。

データ分析
データは、ソフトウェアＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ２．４０ ｂｅｔａ１、６４ビット（SierraAnalytics、米国カリフォルニア州モデスト市）を使用して解析した。簡単に言うと、異なる交換時点（exchange time points）を含む未処理データセットと、各時点について抗体を伴うＡｎｘ−Ａ１の分析と抗体を伴わないＡｎｘ−Ａ１の分析とを検討した。Ａｎｘ−Ａ１配列情報と、対応する保持時間と荷電を併記した消化性ペプチド（peptic peptides）の配列リストとを使用して、前記ソフトウェアにより、重水素交換されたペプチドと、重水素交換されていないペプチドとを識別し、重水素化ペプチドと非重水素化ペプチドとの重心質量の違いとしてペプチドごとの重水素取り込みを算出する。重複するペプチド情報（重複するペプチドの個々の質量シフト）を使用して、エピトープ領域を手動でさらに限定した。

結果
ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒを使用した初期データ評価の後、統計的に妥当な重水素取り込みについて個々の消化性ペプチド（peptic peptides）を手動で検証した。いくつかの重複するペプチドの場合、エピトープ領域は、重水素取り込みのあるペプチドのＮ末端部分およびＣ末端部分をカバーする、重水素取り込み無しのＨＤＸデータを用いて、さらに限定した。全実験は、２回繰り返した。１回目の実験では、潜在的なエピトープ領域が識別されたが、統計的に妥当な重水素取り込みもまた、Ｎ末端を含む非常に長いペプチド中に観察された。構造的な観点からは、これはややフレキシブルである。２回目の実験では、エピトープ領域を確定可能であったが、Ｎ末端は重水素取り込みを示さなかった。
配列中の下線の領域は、抗体が結合するエピトープを指す。
MAMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVKSSKGGPGSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQETGKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNEDLADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIMVSRSEIDMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN（配列番号１７）

識別されたエピトープ領域は、Ａｎｘ−Ａ１の自己相互作用領域には無く、自己相互作用領域からのペプチドが、抗体−抗原複合体サンプル中により多くの重水素を取り込む傾向をわずかに示す。これは、２つのＡｎｘ−Ａ１分子が抗体の２つのアームに結合する場合に、局所的にＡｎｘ−Ａ１濃度がわずかに異なるためであろう。

実施例３-ＭＤＸ−１２４のインビボ抗癌活性
方法
忍容性試験
クラウン・バイオサイエンス社（米国）により、忍容性試験がなされた。マウスに２週間のあいだ、週１回、ＭＤＸ−１２４を１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または２９ｍｇ／ｋｇ、投与した。各マウスの体重を、実験期間中毎日測定した。体重の減少は、抗体のマウスに対する毒性を示すものと考えられよう。

マウス乳癌モデル
クラウン・バイオサイエンス社（米国）により、マウスを使用した実験がなされた。使用されるマウスは、８〜９週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスであった。使用された乳癌モデルには、ルシフェラーゼ発現マウス乳癌細胞株４Ｔ１−Ｌｕｃが使用された。細胞株は、ＡＴＣＣから入手し、１０％のＦＢＳと、２ｍＭのＬ−グルタミンと、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＲＰＭＩ培地で培養した。
マウスは毛をそり、７２時間後に個々のマウスの識別のためのトランスポンダ・チップを埋め込んだ。毛をそった後すぐにと、その後は腫瘍を接種するまで毎日、ベパンテンクリームを塗った。
各マウスには、まず、１００μｌのＰＢＳに懸濁された４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を５×１０^４個接種した。接種は、０日目に、マウスにガス麻酔をしながら、乳腺皮下脂肪（左下側、下から２番目の乳腺皮下脂肪）内に行った。接種部位の皮膚は、接種前に７０％エタノールで消毒した。

腫瘍のサイズの測定は、ＩＶＩＳスペクトルｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（パーキンエルマー（PerkinElmer）社、米国）を使用し、５日目から開始して、週３回行った。電子ノギスを使用して、各腫瘍を二次元で測定するために、生物発光イメージングが用いられた。腫瘍体積は、式０．５（Ｌ×Ｗ^２）を用いて推定した。式中、Ｌは腫瘍長さ、Ｗは腫瘍幅である。平均値腫瘍体積が５０〜６０ｍｍ^３に達した時に、治療を開始した。最初の腫瘍の測定の後、ベパンテンクリームを再度腫瘍のまわりの領域に塗った。ベパンテンクリームは、その後毎日塗った。
マウスは、グループ間で平均腫瘍体積が一定になるように、１グループに１２体ずつ４グループに分けた。治療は、毎週投与することで行った。４つのマウスのグループうち、コントロールのグループには、媒質のみ（ＰＢＳ）を投与した。３つ実験グループは、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または２５ｍｇ／ｋｇのＭＤＸ−１２４の投与量を摂取した。各投与は、１０ｍｌ／ｋｇの体積で静脈内に投与した。治療は、最長３週間継続した。週３回の腫瘍の測定は、治療開始後も継続した。マウスの体重測定は、治療前は週３回、治療開始後は毎日行った。

結果
ＭＤＸ−１２４がマウスにとってもともと毒性があるかどうかを調べるために、忍容性試験を行った。マウスに抗体を投与し、その体重を監視した。明らかな体重減少はどのマウスにも見られず（データ示していない）、これは調査したどの投与量でも、抗体はマウスに対して毒性が無かったことを示している。
ＭＤＸ−１２４の抗癌効果を、乳癌のマウスモデルで調べた。調べたマウスの各グループの平均腫瘍体積を、図２０に示す。０日目の腫瘍細胞の接種の後、最初の投与量（treatment dose）を、１２日目にすべてのグループに投与した。図示されたように、調査１７日目までに、ＭＤＸ−１２４で治療されたマウスには、媒質で治療されたコントロールのマウスと比べて、腫瘍体積に有意の減少が見られた。コントロールグループにおいて益々腫瘍が成長する傾向は、１９日目まで継続した。ＭＤＸ−１２４で治療したグループでは腫瘍体積の減少がみられたが、これはまた、これらのグループの相対腫瘍体積の減少と対応していた（図２１参照）。
１２日目の腫瘍体積を、ベースラインの腫瘍体積（つまり、相対腫瘍体積１００％）と定義する。１９日目までに、ＭＤＸ−１２４で治療されたマウスの腫瘍は、約２．５倍のサイズに増大していた。コントロールのマウスの腫瘍は、約３．３倍のサイズに増大していた。これは、ＭＤＸ−１２４での治療の結果、１９日目までに、コントロールと比較して腫瘍の成長を約３分の１減少させたことを意味し、この抗体の抗癌効果を示している。異なる３つの濃度（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ）で抗体をマウスに投与したが、これらの治療投薬法のどれも、腫瘍の成長には同じような効果を有した（すなわち、投与された抗体の量を増やしても、治療の効果が上りはしなかったように見える）。

Claims (26)

1. 対象における癌の治療に使用するための、ヒトＡｎｘ−Ａ１に結合する特異的結合分子であって、
   （ｉ）前記特異的結合分子は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含み、
   ＶＬＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示す配列を有し、
   ＶＬＣＤＲ２は、配列番号２に示す配列を有し、
   ＶＬＣＤＲ３は、配列番号３に示す配列を有し、
   ＶＨＣＤＲ１は、配列番号４に示す配列を有し、
   ＶＨＣＤＲ２は、配列番号５に示す配列を有し、
   ＶＨＣＤＲ３は、配列番号６に示す配列を有するか、または、各配列において、その配列に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列であり、および／または
   （ｉｉ）前記特異的結合分子は、配列番号１７の１９７〜２０６位、２２０〜２２４位、および２２７〜２３７位のアミノ酸からなる不連続エピトープでＡｎｘ−Ａ１に結合する、特異的結合分子。
2. ＶＬＣＤＲ１は、配列番号１に示す配列を有し、
   ＶＬＣＤＲ２は、配列番号２に示す配列を有し、
   ＶＬＣＤＲ３は、配列番号３に示す配列を有し、
   ＶＨＣＤＲ１は、配列番号４に示す配列を有し、
   ＶＨＣＤＲ２は、配列番号５に示す配列を有し、
   ＶＨＣＤＲ３は、配列番号６に示す配列を有する、請求項１に記載の使用のための特異的結合分子。
3. 前記特異的結合分子は抗体またはその断片である、請求項１または２に記載の使用のための特異的結合分子。
4. 前記抗体またはその断片は、ヒト化されている、請求項３に記載の使用のための特異的結合分子。
5. 前記抗体がモノクローナル抗体であるか、あるいは前記抗体断片が、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、もしくはＦ（ａｂ’）_２抗体断片、またはｓｃＦｖ分子である、請求項３または４に記載の使用のための特異的結合分子。
6. 前記抗体またはその断片は、
   （ｉ）配列番号９または配列番号１０に示すアミノ酸配列、あるいは、これらのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域と、
   （ｉｉ）配列番号１１または配列番号１２に示すアミノ酸配列、あるいは、これらのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域と、を含む、請求項５に記載の使用のための特異的結合分子。
   
7. 前記特異的結合分子はモノクローナル抗体であり、前記モノクローナル抗体は、
   （ｉ）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または、このアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、
   （ｉｉ）配列番号１４に示すアミノ酸配列、または、このアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、請求項６に記載の使用のための特異的結合分子。
8. 前記特異的結合分子はモノクローナル抗体であり、前記モノクローナル抗体は、
   （ｉ）配列番号１５に示すアミノ酸配列、または、このアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、
   （ｉｉ）配列番号１６に示すアミノ酸配列、または、このアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、請求項６に記載の使用のための特異的結合分子。
9. 前記癌はＡｎｘ−Ａ１を発現する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための特異的結合分子。
10. Ａｎｘ−Ａ１は、前記癌の細胞の表面に発現する、請求項９に記載の使用のための特異的結合分子。
11. 前記癌は１つ以上の化学療法剤に対して耐性がある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための特異的結合分子。
12. 前記癌は、多剤耐性である、請求項１１に記載の使用のための特異的結合分子。
13. 前記癌は、白金系化学療法剤に対して耐性がある、請求項１１または１２に記載の使用のための特異的結合分子。
14. 前記癌は、シスプラチン、アドリアマイシン、および／または、タモキシフェンに対して耐性がある、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための特異的結合分子。
15. 前記治療はさらに、前記対象に対して第２の治療薬を投与することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための特異的結合分子。
16. 前記第２の治療薬は化学療法剤である、請求項１５に記載の使用のための特異的結合分子。
17. 前記化学療法剤は、細胞障害性薬剤である、請求項１６に記載の使用のための特異的結合分子。
18. 前記対象はヒトである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用のための特異的結合分子。
19. 前記癌は、乳癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌、および膵臓癌から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用のための特異的結合分子。
20. 請求項１〜８のいずれか一項で定義された特異的結合分子を前記対象に投与することを含む、対象における癌を治療する方法。
21. 前記癌、前記治療、および／または前記対象は、請求項９〜１９のいずれか一項で定義されるものである、請求項２０に記載の方法。
22. 対象における癌の治療のための薬剤の製造における特異的結合分子の使用であって、前記特異的結合分子は、請求項１〜８のいずれか一項で定義されるものである、使用。
23. 前記癌、前記治療、および／または前記対象は、請求項９〜１９のいずれか一項で定義されるものである、請求項２２に記載の方法。
24. 請求項１〜８のいずれか一項で定義される特異的結合分子と、化学療法剤とを含むキット。
25. 請求項１〜８のいずれか一項で定義される特異的結合分子と、対象における癌の治療において、別々に、同時にもしくは逐次的に使用するための、第２の治療薬とを含む製品。
26. 前記癌、前記第２の治療薬、および／または前記対象は、請求項９〜１４、または１６〜１９のいずれか一項で定義されるものである、請求項２５に記載の使用のための製品。

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