BR112020026976A2 - produto combinado e complexo para potencializarem uma resposta imune, uso do complexo, composição de vacina e composição farmacêutica, método que promove resposta imune in vivo a um antígeno em um hospedeiro - Google Patents

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Abstract

“produto combinado e complexo para potencializarem uma resposta imune, uso do complexo, composição de vacina e composição farmacêutica, método que promove resposta imune in vivo a um antígeno em um hospedeiro”. a presente invenção se refere a um complexo inédito. a pesquisa sobre a preparação e o uso, etc., do complexo foi realizada. o complexo é preparado pelo menos a partir dos seguintes ingredientes nas condições adequadas: poli i:c, estabilizadores catiônicos e sais de cálcio solúveis. os estabilizadores catiônicos são compostos amino não antibióticos com um peso molecular < 5 kda, ou enxertos formados pelos compostos amino não antibióticos em um ou mais de um polietileno glicol monometil éter, polietileno glicol, polietilenoimina, ácido fólico e galactose. o complexo apresenta as vantagens de viscosidade peso molecular moderados, preparação farmacêutica conveniente, propriedades químicas estáveis, não degradar facilmente durante armazenamento a longo prazo e uso seguro. o complexo, quando usado sozinho, pode melhorar significativamente a resposta imune não específica do corpo, atingir o propósito de prevenção de doença e tratamento, e quando usado em combinação com outros fármacos, o complexo apresenta melhor eficiência antitumor, antiviral e anti-(super)bacteriana, e pode ser facilmente absorvido pelos pacientes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PRODUTO COMBINADO E COMPLEXO PARA POTENCIALIZAREM UMA RESPOSTA IMUNE, USO DO COMPLEXO, COMPOSIÇÃO DE VACINA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,
MÉTODO QUE PROMOVE RESPOSTA IMUNE IN VIVO A UM ANTÍGENO EM UM HOSPEDEIRO” REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente Chinesa
201810700708.6, depositada em 29 de junho de 2018 no Departamento Chinês de Patentes e intitulado “COMPLEXES FOR POTENTIATING AN IMMUNE RESPONSE”, e do pedido de patente Chinesa 201810698033.6, depositado em 29 de junho de 2018 no Departamento Chinês de Patentes e intitulado “METHOD FOR PREPARING COMPLEXES FOR POTENTIATING AN IMMUNE RESPONSE”, cujos conteúdos inteiros são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.
CAMPO DA TÉCNICA
[002] A presente descrição se refere ao campo da biomedicina, e em particular a um complexo para potencializar uma resposta imune.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[003] Adjuvantes de RNA de dupla fita (RNAds), que são atualmente e geralmente considerados para incluir PIC (ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico), PICLC (PIC com poli-L-lisina e carboximetil celulose), PIC12U (PIC com ácido uridílico em intervalos específicos, nome comercial de Ampligen), e PICKCa (PIC-canamicina- CaCl2), são ligantes para uma variedade de receptores de reconhecimento padrão (PRRs), e são possíveis, de um lado, potencializando a resposta imune e, por outro lado, alterando os tipos de imunidade, para preparar vacinas profiláticas para serem vacinas terapêuticas.
[004] PIC (ácido poli-inosínico-policitidílico) foi desenvolvido por Merck (U.S.) nos anos de 1960. Em camundongos, PIC é um indutor de IFN-α com atividade antiviral. PIC pode proteger camundongos de infecções letais na cavidade nasal e pulmões. Entretanto, em virtude da degradação de PIC por nucleases séricas de primatas e humano, PIC apresenta uma estabilidade de estrutura reduzida, com pouco IFN-α produzido e sem atividade antitumoral.
[005] PICLC (ácido poli-inosínico-policitidílico com poli-L-lisina e carboximetil celulose), um conjugado de PIC, polilisina (Poli L-lisina, peso molecular relativo de
27.000) e carboximetil celulose (CMC, peso molecular relativo de 700.000), que foi desenvolvido por Levy HB nos anos de 1970, apresenta um peso molecular relativo maior e uma resistência à hidrólise pelas nucleases, que é 5-10 vezes maior que PIC, e produz interferon significativo (15) em macacos. Estudos clínicos preliminares em PICLC mostraram que uma resposta moderada-a-grave, tal como febre (100 %), mialgia (50 %), hipotensão (50 %), declínio significativo de glóbulo branco e similares, pode ser causada apenas em uma dose terapêutica. Isto leva a um equívoco de que um peso molecular maior leva a uma maior toxicidade.
[006] PIC12U, no qual nucleotídeos uracila são inseridos em uma posição na fita de PIC, foi desenvolvido por Johns Hopkins University em meados da década de 1970, e apresenta eficácia similar àquela de PIC, mas menos toxicidade. Em agosto de 2012, Hemispherx Biopharmaceutical Company submeteu dados adicionais de pesquisa clínica original; entretanto, PIC12U não foi aprovado pelo U.S. Food and Drug Administration (FDA), em virtude de dados insuficientes de segurança e eficiência.
[007] PICKCa contém um antibiótico, isto é, canamicina. Canamicina apresenta ototoxicidade moderada, e apresenta uma quantidade presente na vacina que excede o conjunto padrão pela farmacopeia nacional.
[008] Pode ser observado que PIC não pode ser usado sozinho em primatas e animais mais avançados que primatas, incluindo humanos, PIC 12U foi rejeitado pelo U.S. FDA em virtude de seu pouco efeito, e PICLC não realidade apresenta fortes efeitos colaterais.
[009] Em vista disso, a presente descrição é aqui apresentada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[010] A presente descrição se refere a um complexo inédito, e a preparação, uso e similares do complexo foram estudados.
[011] No trabalho prévio dos inventores, PIC, canamicina e cloreto de cálcio foram usados para preparar adjuvantes de vacina (nome comercial: adjuvante PIKA). Canamicina é usado em virtude do fato de que contém 4 grupos amino que se ligarão a um grupo fosfato no PIC para estabilizar a estrutura deste. Entretanto, a aplicação do produto em vacinas é limitada, em virtude da inclusão do antibiótico.
[012] Além disso, os inventores observaram que substituir canamicina por quitosana (cloridrato) também pode atuar como um estabilizador catiônico; entretanto, quitosana (cloridrato) apresenta um peso molecular elevado e não é facilmente absorvido pelo humano, sendo assim difícil de obter uma eficácia desejada.
[013] Portanto, a presente descrição provê um complexo para potencializar uma resposta imune. O complexo é preparado pelo menos pelos componentes a seguir, em uma condição adequada: um ácido poli-inosínico-policitidílico, pelo menos um estabilizador catiônico e um sal de cálcio solúvel.
[014] O complexo é preparado pelo menos pelos seguintes componentes, em uma condição adequada: um ácido poli-inosínico-policitidílico, pelo menos um estabilizador catiônico, um sal de cálcio solúvel ou/e um sal de manganês.
[015] Em que, o estabilizador catiônico é um composto amino não antibiótico solúvel em água, com um peso molecular menor que ou igual a 5 kDa, ou um enxerto formado pelo composto amino não antibiótico solúvel em água, e um ou mais de metoxipolietileno glicol, polietileno glicol, polietilenimina, ácido fólico e galactose.
[016] Comparado com a técnica prévia, o complexo apresenta uma viscosidade e um peso molecular moderados, preparado facilmente em um fármaco, e apresenta propriedades químicas estáveis, sendo difícil de ser degradado em armazenamento a longo prazo e seguro para uso. O complexo pode potencializar significativamente a resposta imune não específica no corpo, e atingir o propósito de prevenir e tratar uma doença quando é usado sozinho, e pode atingir melhor eficácia antitumor, antiviral e anti-(super) bactérias, e é facilmente absorvido por um paciente quando é usado em combinação com outros fármacos
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[017] Para ilustrar as soluções técnicas de acordo com as modalidades da presente invenção ou a técnica prévia mais evidentemente, os desenhos em anexo para descrever as modalidades ou a técnica prévia são introduzidos resumidamente a seguir. Aparentemente, os desenhos em anexo na descrição a seguir são apenas algumas modalidades da presente invenção, e os versados na técnica podem direcionar outros desenhos a partir dos desenhos em anexo, sem esforços criativos.
[018] A figura 1 é um diagrama esquemático da estrutura do complexo Pamica; A: um diagrama esquemático da estrutura de um complexo Poli I: C-COS-Ca2+; B: um diagrama esquemático da estrutura de um antígeno (Ag) + partícula do complexo; C: um diagrama esquemático da estrutura de um complexo Poli I: C-COS-Ca2+ + Ag.
[019] A figura 2 é um eletroforetograma de peso molecular de PIC após ser aquecido por diferentes períodos de tempo.
[020] A figura 3 é uma curva de degradação enzimática de um complexo Pamica, de acordo com uma modalidade da descrição.
[021] A figura 4 é uma curva de dissociação de um complexo Pamica, de acordo com uma modalidade da presente descrição.
[022] A figura 5 é um espectro de absorção de varredura das respectivas substâncias em 240 nm-260 nm, de acordo com uma modalidade da descrição.
[023] A figura 6 é uma imagem de microscópio eletrônico de transmissão de um complexo PIC-COS-CaCl2, de acordo com uma modalidade da descrição; barra de escala = 500 nm.
[024] A figura 7 é uma imagem de microscópio eletrônico de transmissão de um complexo PIC-COS-CaCl2, de acordo com uma modalidade da descrição; barra de escala = 200 nm.
[025] A figura 8 é uma imagem de microscópio eletrônico de transmissão de um complexo PIC-COS-g-MPEG-CaCl2, de acordo com uma modalidade da descrição; barra de escala = 200 nm.
[026] A figura 9 é uma imagem de microscópio eletrônico de transmissão de um complexo PIC-COS-g-MPEG-CaCl2, de acordo com uma modalidade da descrição;
barra de escala = 100 nm.
[027] A figura 10 é uma imagem de microscópio eletrônico de transmissão das nanopartículas formadas a partir do complexo PIC-COS-CaCl2 e TPP, de acordo com uma modalidade da descrição; barra de escala = 1000 nm.
[028] A figura 11 é uma imagem de microscópio eletrônico de transmissão das nanopartículas formadas a partir do complexo PIC-COS-CaCl2 e TPP, de acordo com uma modalidade da descrição; barra de escala = 200 nm.
[029] A figura 12 é um gráfico de detecção de anticorpos IgG, detectados pelo método de Elisa, no soro de camundongos no 21º dia após imunização com um adjuvante de alumínio/rHBsAg (CHO), ADV20/rHBsAg (CHO) e Pamica/rHBsAg (CHO) respectivamente, de acordo com uma modalidade da descrição.
[030] A figura 13 é a imunidade humoral de camundongos no 21º dia após imunização com um adjuvante de alumínio/rHBsAg (CHO), ADV20/rHBsAg (CHO) e Pamica /rHBsAg (CHO) respectivamente, de acordo com uma modalidade da descrição; o eixo vertical mostra inchaço na planta do pé: aumento em mm.
[031] A figura 14 é a comparação dos efeitos de complexo Pamica e adjuvante Freund completo na preparação de um anticorpo contra o antígeno MYO, de acordo com uma modalidade da presente descrição.
[032] A figura 15 é comparação dos efeitos de complexo Pamica e adjuvante Freund completo na preparação de um anticorpo contra o antígeno MYO, de acordo com uma modalidade da presente descrição.
[033] A figura 16 é uma foto exemplar de um experimento no qual o grupo Pamica estimula a função fagocítica de macrófago, de acordo com uma modalidade da presente descrição.
[034] A figura 17 é uma foto exemplar de um experimento no qual o grupo controle de PBS não estimula a função fagocítica de macrófago, de acordo com uma modalidade da descrição.
[035] As figuras 18~ 21 são resultados experimentais dos efeitos anticâncer da formulação imune de mucosa com Pamica, no modelo de câncer de pulmão LL2 em camundongo que carrega o tumor, de acordo com uma modalidade da presente descrição.
[036] A figura 18: As curvas de alterações do volume de tumor nos tratamentos com diferentes fármacos.
[037] A figura 19: Peso do tumor nos tratamentos com diferentes fármacos (o grupo controle de veículo apresenta um volume de tumor de 2201,09 ± 68,01mm 3 no 14º dia após administração, e o experimento finalizou no 14º dia após administração).
[038] A figura 20: A: controle de veículo, por gotejamento nasal, uma vez a cada dois dias; B: cisplatina (5 mg/kg), por injeção na veia caudal, uma vez por semana; C: Pamica-1 (isto é, Pamica), 200 µg/camundongo, por gotejamento nasal, uma vez a cada dois dias; D: Pamica-1, 200 µg/camundongo, por gotejamento nasal (administrado imediatamente após inoculação), uma vez a cada dois dias; E: Pamica- 1, 150 µg/camundongo, por gotejamento nasal, uma vez a cada dois dias; F: Pamica- 1, 200 µg/camundongo, por injeção intramuscular, uma vez a cada dois dias; G: Pamica-1 + cisplatina, 200 µg/camundongo + 5 mg/kg, por gotejamento nasal + por injeção na veia caudal, uma vez a cada dois dias + uma vez por semana; barra de escala = 1 cm.
[039] A figura 21: A taxa de inibição de tumor de anticorpo PD-1 de murino.
[040] As figuras 22~ 35 mostram efeitos antitumor in vivo de Pamica no modelo de câncer de mama 4T1-luc de camundongo in situ, de acordo com uma modalidade da presente descrição.
[041] A figura 22: As curvas de alterações de volume do tumor.
[042] A figura 23: As curvas das alterações do peso corporal de camundongos.
[043] A figura 24: Os efeitos dos tratamentos com diferentes fármacos no peso do tumor.
[044] A figura 25: Uma foto de tumores na influência de diferentes fármacos.
[045] A figura 26: Os efeitos de tratamentos com diferentes fármacos no peso do baço.
[046] A figura 27: Uma foto frontal dos pulmões na influência de diferentes fármacos.
[047] A figura 28: Uma foto do dorso dos pulmões na influência de diferentes fármacos.
[048] As figuras 29~ 35: As fotos do sítio de um tumor e intensidade de bioluminescência de metástase exibida pelo formador de imagem de animal pequeno.
[049] A figura 29: As bioluminescências de camundongos no grupo avançado no dia 7 com Pamica.
[050] A figura 30: As bioluminescências de camundongos no grupo do dia 0 com Pamica.
[051] A figura 31: As bioluminescências de camundongos no grupo de veículo.
[052] A figura 32: As bioluminescências de camundongos no grupo de gotejamento nasal com 200 μg/camundongo de Pamica.
[053] A figura 33: As bioluminescências de camundongos no grupo de gotejamento nasal com 300 μg/camundongo de Pamica.
[054] A figura 34: As bioluminescências de camundongos no grupo de injeção intramuscular com 200 μg/camundongo de Pamica.
[055] A figura 35: As bioluminescências de camundongos no grupo de injeção intramuscular com 300 μg/camundongo de Pamica
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES
[056] A presente descrição pode ser tornar mais evidente através da descrição a seguir de algumas modalidades desta, e dos conteúdos detalhados dos exemplos aqui incluídos.
[057] Antes de descrever adicionalmente a presente descrição, deve ser entendido que a presente descrição não é limitada às modalidades específicas, em decorrência destas modalidades serem necessariamente diversas. Deve ser entendido também que os termos usados nesta especificação são apenas para ilustrar modalidades específicas, em vez de prover como limitação, em decorrência do escopo da presente descrição ser definido apenas nas reivindicações em anexo
DEFINIÇÃO DE TERMO
[058] Antes de informar os detalhes da presente descrição, vários termos usados na presente especificação devem ser entendidos.
[059] O termo “Pamica” se refere em geral a um complexo preparado a partir de um ácido poli-inosínico-policitidílico, um estabilizador catiônico e um sal de cálcio solúvel (íons cálcio), independente da propriedade física e imunogenicidade específica do complexo.
[060] “Ácido poli-inosínico-policitidílico” também é conhecido como poli inosina- citidina, ácido poli-inosínico ácido policitidílico, nucleotídeo citosina do ácido poli- inosínico, ácido poli-inosínico-ácido policitidílico, PIC ou Poli I:C.
[061] Da maneira usada na presente especificação, o termo “potencializar uma imunorreação” se refere a induzir ou potencializar uma resposta imune a uma substância antigênica em um hospedeiro, ou potencializar a função de células imunes, ou promover a liberação de fatores inflamatórios ou citocinas das células imunes, ou melhorar a resistência a uma substância patogênica em um hospedeiro.
[062] O termo “induzir uma resposta imune” se refere a estimular, iniciar ou desenvolver uma resposta imune.
[063] “Potencializar uma resposta imune” se refere à melhoria, desenvolvimento, suplemento, expansão, aumento e extensão de uma resposta imune existente.
[064] A expressão “potencializar uma resposta imune” ou expressões similares significam que, comparada com o estado da resposta imune prévia, a resposta imune é intensificada, melhorada ou aumentada, o que é benéfico para o hospedeiro. O estado da resposta imune prévia, por exemplo, é o estado da resposta imune prévia antes da composição imunogênica da presente descrição ser administrada.
[065] O termo “indivíduo” é aqui usado indiferentemente como “hospedeiro”, “sujeito” e “animal”, e inclui humanos e todos as criações (tais como animais domésticos e animais de estimação) e animais selvagens e pássaros incluindo, sem limitação, gado, cavalo, vaca leiteira, porco, ovelha, cabra, rato, camundongo, cachorro, gato, coelho, camelo, burro, veado, vison, galinha, pato, ganso, peru, galo de rinha, etc.
[066] O termo “anticorpo” inclui anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais, bem como os fragmentos de ligação ao composto de antígeno destes anticorpos, incluindo Fab, F(ab’)2, Fd, Fv, scFv, anticorpos biespecíficos e a unidade de reconhecimento mínima de anticorpos, bem como derivados de cadeia única destes anticorpos e fragmentos. O tipo de anticorpo pode ser selecionado a partir de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, e IgD. Além disso, o termo “anticorpo” inclui anticorpos de ocorrência natural e anticorpos de ocorrência não natural incluindo, por exemplo, anticorpos quiméricos, bifuncional e humanizados, e isoformas sintéticas relacionadas. O termo “anticorpo” pode ser usado indiferentemente com “imunoglobulina”.
[067] Da maneira usada na presente especificação, o termo “composto de antígeno” se refere a quaisquer substâncias que podem ser reconhecidas pelo sistema imune (por exemplo, ligadas a um anticorpo ou processadas para induzir uma resposta imune celular) em circunstâncias apropriadas.
[068] Da maneira usada na presente especificação, “antígeno” inclui, mas sem limitação, células, extratos celulares, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, nucleoproteínas, polipeptídeos, peptídeos, polissacarídeos, conjugados de polissacarídeo, mímico de peptídeo polissacarídeos, gorduras, glicolipídeos, sacarídeos, vírus, extratos virais, bactéria, extratos bacterianos, fungos, extratos fúngicos, organismos multicelulares tais como parasitas, e alergênicos. Antígenos podem ser exógenos (por exemplo, de uma outra fonte, exceto o indivíduo para o qual o antígeno é administrado, por exemplo, de uma espécie diferente) ou endógeno (por exemplo, do corpo hospedeiro, tais como fatores de doença, antígenos de câncer, antígenos produzidos por células que são infectadas com vírus no corpo, etc.). Antígenos podem ser naturais (por exemplo, de ocorrência natural), sintéticos ou recombinantes. Antígenos incluem extratos celulares, células intactas e antígenos purificados, em que, o termo “purificado” significa que o antígeno é apresentado em uma forma mais enriquecida, comparado àquele no ambiente no qual o antígeno em geral existe, e/ou comparado àquele em uma forma de extrato bruto (tal como a forma de cultura de antígeno).
[069] O termo “composição de vacina” da maneira usada na presente especificação se refere a uma combinação de duas ou mais substâncias (tais como antígenos e adjuvantes), que estimularão em conjunto uma resposta imune, quando administradas a um hospedeiro.
[070] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo”, “oligopeptídeo” e “proteína” e similares, são usados indiferentemente na presente especificação e significam a forma de polímero de aminoácidos com qualquer tamanho. A forma de polímero pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, quimicamente ou bioquimicamente modificados, ou aminoácidos e polipeptídeos derivados com uma parte principal de peptídeo modificada.
[071] O termo “resposta imune” se refere a quaisquer respostas do sistema imune de um indivíduo vertebrado a um composto antigênico ou imunogênico. Resposta imunes típicas incluem, mas sem limitação, respostas imunes humorais e celulares locais e sistêmicas, tais como respostas de linfócito T citotóxico (CTL), incluindo indução antígeno específica de respostas de CD8+CTLs, célula T auxiliar, incluindo respostas à proliferação de célula T e liberação de citocinas, e respostas imunes de célula B, incluindo respostas de anticorpo.
[072] O termo “adjuvante”, da maneira aqui usada, se refere a qualquer substância ou mistura de substâncias que aumenta ou altera a resposta imune a um composto de antígeno em um hospedeiro.
[073] O termo “tratamento”, usado na presente especificação, se refere em geral ao alcance da eficácia farmacológica e/ou fisiológica desejada. A eficácia pode ser de uma natureza preventiva a partir da perspectiva de prevenir completamente e/ou parcialmente doenças ou os sintomas destas, e/ou os efeitos podem ser de uma natureza médica a partir da perspectiva de estabilizar ou curar completamente e/ou parcialmente doenças e/ou os efeitos negativos causados pelas doenças. O termo “tratamento” usado na presente especificação inclui quaisquer dos tratamentos de doenças em um indivíduo (especialmente um indivíduo mamífero, e mais particularmente humano), e incluem: (a) prevenir o indivíduo que pode ser predisposto a uma doença, mas ainda não foram diagnosticados a partir do desenvolvimento da doença ou um sintoma desta; (b) inibir o sintoma da doença, por exemplo, prevenindo o desenvolvimento do sintoma da doença; ou aliviando o sintoma da doença, tal como fazendo com que a doença ou sintomas diminuam; (c) reduzir o nível dos produtos produzidos pelas substâncias infecciosas da doença (tais como toxinas, antígenos, etc.); (d) reduzir reações fisiológicas adversas (tais como febre, edema tecidual, etc.) por substâncias infecciosas da doença.
[074] A substância química do “sal farmaceuticamente aceitável” significa que o sal é farmaceuticamente aceitável e possui a atividade farmacológica do composto parental. Estes sais incluem: (1) sais formados junto dos ácidos inorgânicos que sintetizam sais, tais como ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, etc.; ou sais formados junto com ácidos orgânicos e similares, tais como ácido acético, ácido propiônico, ácido capróico, ácido ciclopentapropiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido lático, ácido malônico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 1,2-etanodissulfônico, ácido 2- hidroxietanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido 4-clorobenzenossulfônico, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido 4-toluenossulfônico, ácido canforsulfônico, ácido glicoheptônico, ácido 4, 4’-metilenobis (3-hidroxi-2-eno-1-carboxílico), ácido 3- fenilpropiônico, ácido trimetilacético, ácido butil lático terciário, ácido lauril sulfúrico, ácido glicônico, ácido glutâmico, ácido hidroxinaftóico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucônico, etc.; ou (2) sais formados, quando os prótons acídicos presentes no composto parental são substituídos por íons metálicos tais como íons metálicos do grupo álcali, íons metálicos do grupo alcalino terroso ou íons alumínio, ou coordenados com compostos orgânicos tais como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina, e similares.
MODALIDADES EXEMPLARES DA PRESENTE DESCRIÇÃO
[075] Um aspecto da presente descrição se refere a um produto combinado para potencializar uma resposta imune, compreendendo um ácido poli-inosínico- policitidílico, pelo menos um estabilizador catiônico, e um sal de cálcio solúvel.
[076] O estabilizador catiônico é um composto amino não antibiótico solúvel em água com um peso molecular menor que ou igual a 5 kDa, ou um enxerto formado pelo composto amino não antibiótico solúvel em água, e um ou mais de metoxipolietileno glicol, polietileno glicol, polietilenimina, ácido fólico e galactose.
[077] Uma vantagem importante consiste no fato de que Pamica usado sozinho pode potencializar significativamente a resposta imune não específica em um corpo, e pode iniciar de maneira mais eficiente uma resposta imune humoral e resposta imune celular específicas, intensificando a imunidade protetora; melhores efeitos podem ser atingidos quando usados em combinação com uma substância antigênica.
[078] Uma vantagem importante consiste no fato de que Pamica pode passar no “Teste de toxicidade anormal 1141”, PHARMACOPOEIA OF THE PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA, o 4o vol., 2015, e pode ser aplicado de maneira segura no corpo humano. Complexos (tal como vacina com adjuvante PIC-composto amino- CaCl2 ou adjuvante PIC-composto amino-CaCl2) preparados com PIC que apresenta um peso molecular que não foi tratado por aquecimento não podem passar no teste de toxicidade anormal.
[079] Uma vantagem importante consiste no fato de que Pamica apresenta melhor estabilidade química e/ou física, tornando-se assim mais fácil de armazenar.
[080] Uma vantagem importante consiste no fato de que Pamica pode promover apoptose de célula tumoral por meio de uma via de sinalização, e também pode estimular células imunes para expressar uma variedade de citocinas e alterar um microambiente no qual as células tumorais estão presentes, permitindo que células imunes ataquem substâncias patogênicas, tais como células tumorais, vírus, bactéria e similares.
[081] Uma vantagem importante consiste no fato de que Pamica é mais facilmente absorvido por um hospedeiro ou digerido por uma célula hospedeira, que por sua vez, pode levar adicionalmente mais antígenos para as células, potencializando assim as respostas imunes causadas por proteínas e peptídeos.
[082] Uma vantagem importante consiste no fato de que Pamica apresenta efeito analgésico óbvio para um paciente com dor de câncer.
[083] Uma vantagem importante consiste no fato de que Pamica pode tornar a titulação viral de pessoa infectada com HPV de forte positivo para negativo.
[084] Uma vantagem importante consiste no fato de que o Pamica e a vacina inativada de Bacterium burgeri apresentam um bom efeito protetor.
[085] Deve-se observar que Pamica, da maneira descrita na presente descrição, é um complexo com uma estrutura completamente nova, ao invés de uma composição simples.
[086] Em algumas modalidades, o estabilizador catiônico apresenta um peso molecular que pode ser selecionado adicionalmente a partir de 4 kDa, 4,5 kDa, 3 kDa, 3,5 kDa, 2,5 kDa, 2 kDa, 1,5 kDa, 1 kDa, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da e 100 Da.
[087] Em algumas modalidades, o composto amino não antibiótico solúvel em água é um ou mais selecionado do grupo que consiste em oligossacarídeos de quitosana, quito-oligossacarídeos, glicosaminas, lipossomas catiônicos, DEAE- dextrano, poliacrilamida, poliaminas, tetra-aminofulveno e polietilenoimina.
[088] Em algumas modalidades, o estabilizador catiônico é selecionado do grupo que consiste em um enxerto (COS-g-MPEG) de oligossacarídeo de quitosana e metoxipolietileno glicol, um enxerto (PEG-g-CS) de cloridrato de quitosana e polietileno glicol, um enxerto (FA-g-CS) de ácido fólico e cloridrato de quitosana, um enxerto (GAL-g-PEG -g-PEI) de galactose, polietileno glicol e polietilenoimina, um enxerto (COS-g-MPEG-g-PEI) de quitosana e metoxipolietileno glicol e polietilenoimina, um enxerto (CS-g-PEG-g-PEI) de quitosana, metoxipolietileno glicol e polietilenoimina, um enxerto (PEI-g-PEG) de polietileno glicol e polietilenoimina, um enxerto (PEI-g-COS) de oligossacarídeo de quitosana e polietilenoimina, um enxerto (PEI-g-CS) de cloridrato de quitosana e polietilenoimina, um enxerto (COS-g-PEG) de oligossacarídeo de quitosana e polietileno glicol, e um enxerto (COS-g-PEG-g-PEI) de oligossacarídeo de quitosana, polietileno glicol e polietilenoimina.
[089] Em algumas modalidades, o estabilizador catiônico é selecionado do grupo que consiste em um oligossacarídeo de quitosana (COS), um enxerto (COS-g-MPEG) de oligossacarídeo de quitosana e metoxipolietileno glicol, um enxerto (COS-g-MPEG- g-PEI) de oligossacarídeo de quitosana, metoxipolietileno glicol e polietilenoimina.
[090] Em algumas modalidades, o enxerto apresenta peso molecular menor que ou igual a 50 kDa.
[091] Em algumas modalidades, o peso molecular do estabilizador catiônico pode ser selecionado adicionalmente a partir de 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 5 kDa, 4 kDa, 3 kDa, 2 kDa, 1 kDa, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da e 100 Da.
[092] Em algumas modalidades, o oligossacarídeo de quitosana que apresenta um grau de desacetilação maior que ou igual a 70 %; 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % também pode ser selecionado, preferivelmente 90 %~100 %.
[093] Em algumas modalidades, o monômero de oligossacarídeo de quitosana apresenta um peso molecular de 161, um grau de polimerização de 2-20, e um peso molecular selecionado em uma faixa de 322-3220.
[094] Em algumas modalidades, o peso molecular de oligossacarídeo de quitosana, quito-oligossacarídeo, e glicosamina é menor que ou igual a 3200.
[095] Em algumas modalidades, metoxipolietileno glicol, polietileno glicol e polietilenoimina que apresenta um peso molecular menor que ou igual a 40.000, e
30.000, 20.000, 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.500, 1.000 ou 500 podem ser selecionados adicionalmente.
[096] Em algumas modalidades, o sal de cálcio solúvel é selecionado de CaCl 2 e/ou CaNO3.
[097] Em algumas modalidades, o ácido poli-inosínico-policitidílico apresenta um peso molecular de 100 bp-3.000 bp.
[098] Em algumas modalidades, o ácido poli-inosínico-policitidílico apresenta um peso molecular de 100 bp-1.500 bp.
[099] Em algumas modalidades, o produto combinado compreende adicionalmente um ou mais de ajustador de pH, tripolifosfato de sódio, alginato de sódio, ácido fenilborônico, catecol, um sal/reagente tampão e água.
[0100] Em algumas modalidades, componentes respectivos no produto combinado são embalados separadamente.
[0101] Em algumas modalidades, pelo menos dois componentes no produto combinado são misturados e embalados juntos, por exemplo, íons positivos e água, e/ou um sal tampão são embalados juntos.
[0102] Em algumas modalidades, ácido poli-inosínico-policitidílico é embalado na forma de suas matérias-primas, por exemplo, ácido poli-inosínico (PI) e ácido policitidílico (PC).
[0103] De acordo com um aspecto da presente descrição, a presente descrição também se refere a um complexo para potencializar uma resposta imune, que é preparada a partir dos reagentes no produto combinado, da maneira descrita anteriormente.
[0104] Em algumas modalidades, a preparação é realizada em um sistema de solução, e no reagente, o ácido poli-inosínico-policitidílico apresenta uma concentração de 0,1 mg/mL~10 mg/mL.
[0105] A concentração de ácido poli-inosínico-policitidílico pode atingir uma concentração maior, teoricamente por enxerto, para aumentar a solubilidade.
[0106] Em algumas modalidades, a preparação é realizada em um sistema de solução, e no reagente, a concentração de poli-inosina que é 0,5 mg/mL~5 mg/mL, e 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 6,4 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL ou 9 mg/mL pode ser selecionada adicionalmente.
[0107] Em algumas modalidades, a preparação é realizada em um sistema de solução, e no reagente, a concentração de estabilizador catiônico é 0,5 mg/mL~51,2 mg/mL.
[0108] Em algumas modalidades, o estabilizador catiônico apresenta uma concentração de 0,8 mg/mL~25,6 mg/mL, e 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL ou 20mg/mL pode ser adicionalmente selecionada.
[0109] Em algumas modalidades, a preparação é realizada em um sistema de solução, e no reagente, a razão de massa do ácido poli-inosínico-policitidílico para o estabilizador catiônico é 1:0,8~25,6; 1:6,4 ou 1: 12,8 também pode ser selecionada.
[0110] Em algumas modalidades, a preparação é realizada em um sistema de solução, e no reagente, a concentração de íons cálcio no sal de cálcio solúvel é 0,1 mM~1 mM, e 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM ou 0,9 mM pode ser selecionada adicionalmente.
[0111] Em algumas modalidades, o complexo é armazenado em uma solução.
[0112] A solução é preferivelmente uma solução tampão.
[0113] Em algumas modalidades, a solução apresenta um pH em uma faixa de 5,0 a 7,2.
[0114] Em algumas modalidades, o pH da solução é igual a 5,9~6,9, e 6,0, 6,2, 6,4, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6 ou 7,8 também pode ser selecionado.
[0115] De acordo com um aspecto da presente descrição, a presente descrição também se refere ao uso não terapêutico do complexo da maneira descrita anteriormente como um adjuvante imune.
[0116] De acordo com um aspecto da presente descrição, a presente descrição também se refere ao uso do complexo da maneira descrita anteriormente para preparar um anticorpo, uma formulação de vacina ou uma composição de vacina, ou ao uso para preparar um excipiente de vacina ou um adjuvante de vacina.
[0117] De acordo com um aspecto da presente descrição, a presente descrição também se refere a uma composição de vacina compreendendo o complexo da maneira descrita anteriormente, e pelo menos um antígeno.
[0118] Em algumas modalidades, o antígeno é um vírus, uma bactéria, uma proteína, um polipeptídeo, um polissacarídeo, um ácido nucleico, ou um conjugado proteína-molécula pequena.
[0119] Em algumas modalidades, a composição de vacina é, por exemplo, uma vacina atenuada (por exemplo, uma vacina atenuada de vírus ou bactérias), uma vacina inativada (por exemplo, uma vacina inativada de vírus ou bactérias), uma vacina de proteína, uma vacina de polissacarídeo, uma vacina de subunidade proteica, uma vacina de vetor quimérico, uma vacina de DNA, uma vacina de RNA, uma vacina de polipeptídeo ou uma vacina conjugada de proteína-molécula pequena.
[0120] De acordo com um aspecto da presente descrição, a presente descrição também se refere ao uso do complexo da maneira descrita anteriormente na atividade de regulação de célula imune, que é aplicado in vivo ou in vitro.
[0121] Em algumas modalidades, a atividade de regulação de célula imune é especificamente potencializar a atividade de célula imune.
[0122] Em algumas modalidades, a célula imune é selecionada de macrófagos, linfócitos, e células dendríticas.
[0123] Em algumas modalidades, a atividade de regulação ou potencialização de célula imune é promover a célula imune que libera um fator inflamatório.
[0124] Em algumas modalidades, o fator inflamatório inclui IL-2, IL-6, IL-12p40, IL- 18, IL-22, IFN-α, IFN-γ, e TNF-α.
[0125] Em algumas modalidades, o fator inflamatório inclui IFN-γ e TNF-α.
[0126] De acordo com um aspecto da presente descrição, a presente descrição também se refere ao uso dos complexos, da maneira descrita anteriormente, na preparação de fármacos para tratar e/prevenir tumores, antivírus, antibacterianos, antifúngicos, antiparasitários, reduzir efeitos colaterais de quimioterapia, resistir à fadiga ou melhorar a imunidade, aliviar a dor do hospedeiro, e promover uma resposta imune a um antígeno em um hospedeiro.
[0127] Em algumas modalidades, o fármaco é uma forma de dosagem de administração por injeção, uma forma de dosagem de administração respiratória, gotas nasais, uma forma de dosagem de administração na pele, uma forma de dosagem de administração em mucosa, ou uma forma de dosagem de administração cavitária.
[0128] Em algumas modalidades, a forma de dosagem de administração por injeção é selecionada de, por exemplo, injeções (incluindo uma variedade de vias de injeção, tal como injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção subcutânea e injeção intradérmica).
[0129] Em algumas modalidades, a forma de dosagem de administração respiratória é selecionada de: por exemplo, pulverizações, aerossóis, aerossóis em pó e similares.
[0130] Em algumas modalidades, a forma de dosagem de administração na pele é selecionada do grupo que consiste em: por exemplo, soluções, loções, linimentos, pomadas, emplastros, pastas e adesivos, etc., que em geral é usada externamente e atua localmente, ou exerce efeito sistêmico por absorção percutânea após administração.
[0131] Em algumas modalidades, a forma de dosagem de administração em mucosa é selecionada do grupo que consiste em: por exemplo, colírios, gotas para o nariz, pomadas oftálmicas, gargarejos e comprimidos sublinguais, etc., a administração na mucosa pode atuar localmente ou por absorção da mucosa para exercer o efeito sistêmico. A forma de dosagem de administração cavitária compreende, como tal, supositórios, aerossóis, etc., usados para um reto, uma vagina, uma uretra, uma cavidade nasal, um canal auditivo e similares. A administração cavitária pode atuar localmente ou exercer efeito sistêmico após absorção.
[0132] Em algumas modalidades, o antígeno inclui um tumor, um antígeno de vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita.
[0133] Em algumas modalidades, o hospedeiro é um mamífero.
[0134] Em algumas modalidades, o hospedeiro é um primata.
[0135] Em algumas modalidades, o hospedeiro é um humano.
[0136] Em algumas modalidades, quando o antígeno é antígeno de um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita, o fármaco apresenta uma quantidade de 1 mg ~8 mg por dose.
[0137] Em algumas modalidades, quando o antígeno é um antígeno de tumor, o fármaco apresenta uma quantidade de 1 mg~10 mg por dose.
[0138] De acordo com um aspecto da presente descrição, a presente descrição também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo os complexos da maneira descrita anteriormente. A composição farmacêutica compreende adicionalmente um ou mais de um fármaco de terapia de célula imune, um fármaco de terapia de anticorpo, um fármaco químico, uma substância que promove absorção imune de mucosa ou adesão de mucosa, um imunomodulador, um antígeno patogênico, um ligante do receptor de reconhecimento padrão, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0139] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o complexo da maneira descrita anteriormente, e a composição farmacêutica compreende adicionalmente um ou mais de um fármaco de terapia de célula imune, um fármaco de terapia de anticorpo, um fármaco químico, uma substância que promove absorção imune de mucosa ou adesão de mucosa, um imunomodulador, um antígeno de patógeno, um ligante do receptor de reconhecimento padrão, e um sal ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0140] Em algumas modalidades, a fármaco de terapia de célula imune é um ou mais selecionado do grupo que consiste em linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), células dendríticas (DCs), células exterminadoras induzidas por citocinas (CIKs), células dendríticas-células exterminadoras induzidas por citocinas (DCs-CIKs), células exterminadoras naturais (NKs), células γδT, CD3AK, CAR-T e TCR-T.
[0141] Em algumas modalidades, o fármaco terapêutico de anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti- PDL1, um anticorpo anti-CTLA4 e um anticorpo de antígeno anti-CD.
[0142] Em algumas modalidades, o fármaco químico é um ou mais selecionado do grupo que consiste em um agente de alquilação, um antimetabólito, um antibiótico antitumor, um fármaco antitumor de planta, um fármaco hormonal e um fármaco variado.
[0143] O fármaco variado é selecionado do grupo que consiste em L- asparaginase, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, dacarbazina, fármacos de hexametilmelamina, e derivados dos fármacos anteriormente mencionados.
[0144] Em algumas modalidades, o agente de alquilação é selecionado do grupo que consiste em ciclofosfamida, bussulfano, dacarbazina, cisplatina, mecloretamina, mostarda fenilalanina, nitrosoureias e derivados dos fármacos precedentes.
[0145] Em algumas modalidades, o antimetabólito é selecionado do grupo que consiste em 5-fluorouracila, metotrexato, citarabina, ciclocitidina, hidroxiureia, e derivados dos fármacos precedentes.
[0146] Em algumas modalidades, o antibiótico antitumor é selecionado do grupo que consiste em actinomicina, mitomicina, jaundice, doxorubicina, daunomicina, dactinomicina, bleomicina e derivados dos fármacos supracitados.
[0147] Em algumas modalidades, o fármaco hormonal é selecionado do grupo que consiste em um hormônio sexual, um hormônio corticosteroide e derivados dos fármacos supracitados.
[0148] Em algumas modalidades, a substância que promove absorção imune de mucosa ou adesão de mucosa é uma ou mais selecionada do grupo que consiste em agentes tensoativos aniônicos (tais como carboxilatos, sulfonatos, sulfatos, fosfatos, etc.), agentes tensoativos catiônicos (tais como sais de amina, sais de amônio quaternário, heterociclos, sais de ônio, etc.), agentes tensoativos zwitteriônicos (tal como tipo carboxilato, tipo sulfonato, tipo fosfato, tipo betaína, tipo imidazolina, tipo aminoácido, etc.), agentes tensoativos não iônicos (tal como tipo alquil poliglicosídeo, tipo polioxietileno, tipo poliol, tipo alcanolamida, tipo poliéter bloco), agentes tensoativos especiais (tal como tipo contendo flúor, tipo contendo silício, tipo contendo boro, tipo polímero, etc.), agentes quelantes (tal como polifosfato, ácido aminocarboxílico, 1,3-dicetona, ácido hidroxicarboxílico, poliamina, etc.), adesivos [adesivos solúveis em água (tal como amido, dextrina, polivinil álcool, carboximetil celulose, etc.), adesivos de colagem a quente (tal como poliuretano, poliestireno, poliacrilato, copolímero de etileno-vinil acetato, etc.), adesivos de solvente (tais como goma-laca, borracha butílica, etc.), adesivos de emulsão (tal como resina de vinil acetato, resina acrílica, borracha clorada, etc.), adesivos líquidos sem solvente (tal como resina epóxi, etc.)], copolímero de ácido polilático-hidroxiacético, dextrano e polissacarídeo.
[0149] Em algumas modalidades, o imunomodulador é um ou mais selecionado do grupo que consiste em citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento de células- tronco, linfotoxinas, fatores hematopoiéticos, fatores estimuladores de colônia (CSFs), interferons, eritropoietinas, trombopoietinas, fatores de necrose tumoral (TNFs), interleucinas (ILs), fatores estimuladores de colônia de granulócito (G-CSFs), fatores estimuladores de colônia de granulócito e macrófago (GM-CSFs) e fatores de crescimento de células-tronco.
[0150] Em algumas modalidades, o antígeno patogênico é selecionado do grupo que consiste em antígenos de tumores, vírus, bactéria, fungos ou parasita.
[0151] Em algumas modalidades, os tumores incluem: tumores que se originam a partir de quaisquer lesões no osso, conexão óssea, músculo, pulmão, traqueia, faringe, nariz, coração, baço, artéria, veia, sangue, capilar, linfonodo, vaso linfático, fluido linfático, cavidade oral, faringe, esôfago, estômago, duodeno, intestino delgado, cólon, reto, ânus, apêndice, fígado, vesícula biliar, pâncreas, glândula parótida, glândula sublingual, rim urinário, ureter, bexiga, uretra, ovário, trompa de falópio, útero, vagina, vulva, escroto, testículos, canal deferente, pênis, olhos, orelhas, nariz, língua, pele, cérebro, tronco cerebral, bulbo raquidiano, medula espinhal, fluido cérebro-espinhal, nervos, tireoide, glândula paratireoide, glândula pituitária, glândula pineal, ilhota pancreática, timo, gônada, glândula sublingual e glândula parótida.
[0152] Em algumas modalidades, a bactéria inclui uma ou mais de Staphylococcus, Streptococcus, Listeria, Erysipelothrix,Renibacterium, Bacillus, Clostridium, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Corynebacterium, Rhodococcus, Bacillus anthracis, erysipelas bacillus, Bacillus tetani, listeria monocytogenes, Bacillus perfringens, Bacillus gangraenae emphysematosae, tuberculosis, Escherichia coli, Bactéria proteus, Shigella dysenteriae, Pneumobacillus, Bacterium burgeri, Clostridium perfringens, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Moraxella catarrhalis, Acinetobacter, Yersinia, Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Shigella, Pasteurella,
Vibrio cholerae, e Vibrio Parahemolyticus.
[0153] Em algumas modalidades, o parasita inclui um ou mais dos parasitas no trato digestivo (tais como lombrigas, ancilóstomos, tênias, Endoamoeba histolytica e flagelo de Yal, etc.), parasitas intraluminais (tal como Trichomonas vaginalis), parasitas intra-hepáticos (tal como fasciolose hepática, equinococos), parasitas intrapulmonares (tal como Paragonimus westermani), parasitas do tecido cerebral (tal como Cysticercus cellulosae, Toxoplasma gondii), parasitas intravasculares (tal como esquistossomose), parasitas intralinfáticos (tal como filária), parasitas do tecido muscular (tais como larvas de Trichinella), parasitas intracelulares (tal como plasmódio, Leishmania), parasitas do tecido ósseo (tal como hidátide; parasitas da pele, tais como sarcoptideo, ácaro do folículo) e parasitas intraoculares (tais como Thelazia callipaeda, Cysticerecus cellulosae).
[0154] Em algumas modalidades, os vírus incluem um ou mais de Adeniviridae, Arenaviridae, Astroviridae, Bunyaviridae, Cliciviridae, Flaviviridae, vírus da hepatite delta, Hepeviridae, Mononegavirales, Nidovirales, Piconaviridae, Orthomyxoviridae, Papillomaviridae, Parvoviridae, Poliomaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae ou Togaviridae.
[0155] Em algumas modalidades, o vírus é papilomavírus humano.
[0156] Em algumas modalidades, os fungos incluem um ou mais de Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Histoplasma capsulatum, Histoplasma duboisii, Blastomyces lobo, Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomyces dermatitis, Sporothrix schenckii, Penicillium marneffei, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Pneumocystis carinii, Aspergillus, Exophiala jeanselmei, Fonsecaea Pedrosoi, Fonsecaea compacta, Chromomyces verruciformis, Pigmentation dermatitis, Geotrichum candidum, Pseudallescheria boydii, Cryptococcus neoformans, Trichosporon Cutaneum, Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Absidia corymbifera, Syncephalastrum racemosum, Basidiobolus ranarum, Conidiobolus coronatus, Conidiobolus incongruus, Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Rhinosporidium seeberi, hyalohyphomycet e phaeohyphomycete.
[0157] Em algumas modalidades, o ligante do receptor de reconhecimento padrão é selecionado do grupo que consiste em um ligante do receptor de TLR, um ligante do receptor de RLR, um ligante do receptor de CLR, e um ligante do receptor de NLR.
[0158] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um TLR receptor inclui: por exemplo, peptideoglicano, dissacarídeo, manana, lipopeptídeo, glicolipídeo, lipopolissacarídeo atípico, proteína amiloide sérica, CPG DNA, RNAds, RNAss, LPS, PGN, ácidos graxos saturados, ácido lipoteicóico, resistina, lactoferrina, proteína tensoativa, flagelina, ácido hialurônico, antígeno relacionado ao RNA, moléculas do tipo profilina, etc.
[0159] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um receptor RLR inclui: por exemplo, RNA, PIC, PICLC, PIC12u, etc.
[0160] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um receptor CLR receptor inclui: por exemplo, manose e β-glicano na superfície de paredes celulares fúngicas, etc.
[0161] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um receptor NLR incluem: por exemplo, MDP, Mesϴ DAP, etc.
[0162] De acordo com um aspecto da presente descrição, a presente descrição também se refere a um método para preparar um complexo para potencializar uma resposta imune, compreendendo: colocar um ácido poli-inosínico-policitidílico, pelo menos um estabilizador catiônico, e um sal de cálcio solúvel em contato com um sistema de reação líquido; o estabilizador catiônico é um composto amino não antibiótico solúvel em água com um peso molecular menor que ou igual a 5 kDa, ou um enxerto formado pelo composto amino não antibiótico solúvel em água e um ou mais de metoxipolietileno glicol, polietileno glicol, polietilenimina, ácido fólico e galactose.
[0163] Em algumas modalidades, o ácido poli-inosínico-policitidílico é preparado a partir de um ácido policitidílico e um ácido poli-inosínico por meio de uma reação de pareamento de base.
[0164] Em algumas modalidades, os pesos moleculares do ácido policitidílico e o ácido poli-inosínico são maiores que 23.000 Daltons.
[0165] Em algumas modalidades, o peso molecular do ácido policitidílico está em uma faixa de 66.000 Daltons a 660.000 Daltons.
[0166] Em algumas modalidades, o peso molecular do ácido poli-inosínico está em uma faixa de 66.000 Daltons a 660.000 Daltons.
[0167] Em algumas modalidades, a reação de pareamento de base é realizada em uma temperatura de 40 °C~50 °C, 41 °C, 42 °C, 43 °C, 44 °C, 45 °C, 46 °C, 47 °C, 48 °C ou 49 °C pode ser selecionada adicionalmente.
[0168] Em algumas modalidades, a reação de pareamento de base é realizada em pH de 6,8 a 7,6, 7,0, 7,2, 7,4 pode ser selecionado adicionalmente.
[0169] Em algumas modalidades, antes de colocar em contato, o ácido poli- inosínico-policitidílico é aquecido a 88 °C~92 °C por 70 min~120 min.
[0170] Em algumas modalidades, a temperatura pode ser selecionada adicionalmente de 82 °C, 84 °C, 86 °C, 88 °C, 90 °C, 92 °C, 94 °C, 96 °C ou 98 °C.
[0171] Em algumas modalidades, o tempo de aquecimento pode ser selecionado adicionalmente de 80 min, 90 min, 100 min ou 110 min.
[0172] Em algumas modalidades, o sistema de reação líquido está em uma temperatura de 40 °C~50 °C, e 41 °C, 42 °C, 43 °C, 44 °C, 45 °C, 46 °C, 47 °C, 48 °C ou 49 °C pode ser selecionada adicionalmente.
[0173] Em algumas modalidades, um método para preparar o enxerto inclui: primeiramente ativar um ou mais de metoxipolietileno glicol, polietileno glicol, polietilenimina, ácido fólico e galactose usando carbonil diimidazol, e a seguir enxertando o produto ativado com o composto amino não antibiótico solúvel em água em [bmim]Cl líquido iônico.
[0174] Em algumas modalidades, o enxerto é um enxerto de oligossacarídeo de quitosana e metoxipolietileno glicol, primeiramente ativando metoxipolietileno glicol (MPEG) que usa carbonil diimidazol (CDI), e a seguir enxertando um MPEG ativado com o oligossacarídeo de quitosana (COS) em [bmim]Cl líquido iônico.
[0175] Em algumas modalidades, o enxerto é reagido a 60 °C~80 °C em uma atmosfera não oxidante.
[0176] Em algumas modalidades, o método inclui adicionalmente:
[0177] adicionar uma solução de agente de reticulação, em gotas, a um complexo obtido, agitando ao mesmo tempo, até o efeito Tyndall aparecer no sistema de reação, e a seguir agitar para obter nanopartículas; o agente de reticulação sendo pelo menos um selecionado do grupo que consiste em tripolifosfato de sódio, alginato de sódio, ácido fenilborônico e catecol.
[0178] Em algumas modalidades, o agente de reticulação contém um antígeno (patógeno).
[0179] Em algumas modalidades, o método inclui adicionalmente: co-incubar o complexo ou as nanopartículas com um antígeno.
[0180] Em algumas modalidades, o antígeno é uma proteína ou um antígeno peptídico.
[0181] De acordo com um aspecto da presente descrição, a presente descrição também se refere a um método para promover uma resposta imune in vivo em um hospedeiro a um antígeno, regular e potencializar atividade de célula imune em um hospedeiro, auxiliar um hospedeiro a reduzir a fadiga, ou aliviar dores em um hospedeiro, o método compreende: administrar o complexo para o hospedeiro da maneira descrita anteriormente, ou o composição de vacina da maneira descrita anteriormente, ou a composição farmacêutica da maneira descrita anteriormente.
[0182] Em algumas modalidades, o hospedeiro sofre de uma doença infecciosa, e é administrado o composto de antígeno para estimular uma resposta imune contra o patógeno que causa a doença infecciosa.
[0183] Em algumas modalidades, a administração é realizada por injeção parenteral, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intravenosa, injeção subcutânea, administração local, administração transdérmica ou administração intradérmica.
[0184] Em algumas modalidades, o hospedeiro é um paciente com tumor, um paciente infectado por vírus, um paciente infectado por bactéria, um paciente infectado por parasita, ou um paciente com rinite que apresenta cirurgia falha, quimioterapia, radioterapia ou imunoterapia, ou foi abandonado para tratar em instituições médicas.
[0185] Em algumas modalidades, o método pode ser usado em combinação com cirurgia, radioterapia, quimioterapia e várias imunoterapias, ou também pode ser usado em combinação com terapias tradicionais para o paciente infectado por vírus, o paciente infectado por bactéria ou o paciente infectado por parasita.
[0186] Em algumas modalidades, a dor é aquela causada por infecção microbiana ou parasítica, aquela causada por um câncer, ou uma dor neuropática.
[0187] Em algumas modalidades, quando o antígeno é antígeno de um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita, o fármaco é administrado em 1 mg/kg~8 mg/kg toda vez e, alternativamente, é administrado preferivelmente uma vez ao dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias ou a cada 4 dias.
[0188] Quando o antígeno é um antígeno de tumor, o fármaco é administrado em 1 mg/kg~10 mg/kg toda vez e, preferivelmente, é administrado por um período de pelo menos 360 dias, pelo menos 180 dias, pelo menos 60 dias ou pelo menos 30 dias.
[0189] As modalidades da presente descrição serão descritas em detalhes a seguir, em combinação com exemplos, mas os versados na técnica entenderão que os exemplos a seguir são pretendidos apenas para ilustrar a presente descrição, e não devem ser considerados como limitantes do escopo da presente descrição. Os exemplos que são indicados na condição específica são realizados de acordo com condições convencionais, ou condições recomendadas pelo fabricante. Os reagentes ou instrumentos usados sem a indicação do fabricante são todos produtos convencionais, os quais são disponíveis comercialmente. EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE PAMICA I. PREPARAÇÃO DE COMPLEXO PAMICA
1. PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO DE PBS (PH 7,2):
[0190] 1.1 Preparação de solução de cloreto de sódio (0,85 %, 1.500 mL): 12,75g de cloreto de sódio foram pesados, adicionados em uma proveta graduada de 2.000 mL, e fixos em 1.500 mL por injeção de água;
1.2 Preparação de solução de fosfato de hidrogênio dissódico (0,006 mol/L, 500 mL): 0,4259 g (0,006×0,5×141,96) de fosfato de hidrogênio dissódico foram pesados, adicionados em um balão volumétrico de 500 mL, e diluídos em 500 mL com salina 0,85 %;
1.3 Preparação de solução de fosfato de di-hidrogênio sódio solução (0,006 mol/L, 500 mL): 0,4140 g (0,006×0,5×137,99) de fosfato de di-hidrogênio sódio foram pesados, adicionados em um balão volumétrico de 500 mL, e diluídos em 500 mL com salina 0,85 %;
1.4 Preparação de solução de PBS com um pH de 7,2: 273,6 mL de “a solução em 1.2” são misturados com 126,4 mL de “a solução em 1.3”.
2. PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO DE PIC (2,0 MG/ML, 100 ML):
[0191] 2.1 114,5 mg (2,0 mg/mL*100 mL*【1,04/(1,04+1)】/91,5 %/(1-2,7 %)) de PI foram pesados, adicionados em um frasco triangular de 250 mL, dissolvidos adicionando 50 mL de solução de PBS, e equilibrados em um banho-maria a 40 °C - 60 °C;
2.2 113,2 mg (2,0 mg/mL*100 mL*【1/(1,04+1) 】/90,4 %/(1-4,2 %)) de PC foram pesados, adicionados em um frasco triangular de 250 mL, dissolvidos adicionando 50 mL de solução de PBS, e equilibrados em um banho-maria a 40 °C - 60 °C;
2.3 Preparação de solução de PIC: 50 mL de solução de PI foram vertidos em 50 mL de solução de PC, e a mistura foi reagida em um banho-maria a 45 °C por 30 minutos;
2.4 A solução de PIC foi aquecida a 80 °C -99 °C por 15 minutos～300 minutos.
3. PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO DE CLORETO DE CÁLCIO (0,16 MOL/L, 25 ML):
[0192] 0,5881 g de CaCl2.2H2O (MW: 147,02) foram pesados, adicionados em um frasco triangular de 100 mL, dissolvidos adicionando cerca de 25 mL de água para injeção, e diluídos em 100 mL.
4. PREPARAÇÃO DE COS-G-MPEG:
[0193] O método para preparar enxerto de COS-g-MPEG é da maneira a seguir: copolímero de enxerto de metoxipolietileno glicol enxertado com oligossacarídeo de quitosana (COS-g-MPEG) foi preparado e usado como um excipiente para a preparação de um fármaco anticâncer.
[0194] Princípio: acoplamento de carbonil diimidazol (CDI) é usado para a preparação de COS-g-MPEG. Primeiramente, metoxipolietileno glicol (MPEG) é ativado com carbonil diimidazol para preparar um MPEG ativado, e a seguir o MPEG ativado é reagido com oligossacarídeo de quitosana (COS) em um líquido iônico para sintetizar copolímero de COS-g-MPEG. A reação específica inclui as três etapas a seguir:
4.1 PREPARAÇÃO DE LÍQUIDO IÔNICO DE SAL DE CLORETO DE 1- BUTIL-3-METILIMIDAZOL ([BMIM]CL)
[0195] 1-metil imidazol é reagido com clorobutano para preparar líquido iônico [BMIM]Cl, e a equação da reação sintética é da maneira a seguir: + N N N N Cl Cl .
4.2 ATIVAÇÃO DE METOXIPOLIETILENO GLICOL (MPEG, PESO MOLECULAR DE 1000)
[0196] MPEG é ativado com CDI, e a equação da reação sintética é da maneira a seguir:
O O
N N CH3 OCH2CH2 OH + N N C N CH3 OCH2CH2 O C N n n
4.3 SÍNTESE DE COPOLÍMERO DE COS-G-MPEG
[0197] O MPEG ativado é enxertado e polimerizado com COS em um líquido iônico, e a equação da reação sintética é da maneira a seguir:
O CH3 OCH2CH2 O C H NH2 n
H H HN OH H O
H N H + CH3 OCH2CH2 O C N OH H H O O n n H CH2OH H O O n CH2OH
4.4 EQUIPAMENTOS E REAGENTES:
[0198] Metil imidazol, clorobutano, tolueno, metoxipolietileno glicol, carbonil diimidazol, éter anidro, peneira molecular 4A (2 mm-3 mm), dimetil sulfóxido, 1,4- dioxano, oligossacarídeo de quitosana, agitador de aquecimento magnético termostático com coleta calor (tipo DF-101S), balança eletrônica, forno de secagem rápida eletrotérmico, bomba a vácuo de circulação de água, destilador de água pura triplo automático, forno de secagem a vácuo, liofilizador, secador de fluxo de ar para instrumentos de vidro, motor de partida com capacitor monofásico, bomba de vácuo de palheta rotativa, agitador magnético aquecido sêxtuplo, bolsa de diálise de celulose, membrana 45-2000RC para bolsa de diálise pronta para usar, frasco de três gargalos (500 mL, 1000 mL), rolha de vidro, barra de agitação magnética, copo de papel descartável, béquer de 500 mL, béquer de 2 L, conta-gotas descartável, colher de remédio, garrafa de reagente, dessecador, etc.
4.5 PREPARAÇÕES:
4.5.1 PREPARAÇÃO DE ÁGUA DESTILADA
[0199] A água destilada foi preparada usando Z-97A destilador de água pura triplo automático por três vezes.
4.5.2 LIMPEZA DOS ARTIGOS DE VIDRO
[0200] O frasco de três gargalos, a rolha de vidro, a placa de Petri, e a barra de agitação magnética, etc. foram primeiramente lavados com água corrente, a seguir enxaguados com água destilada três vezes, e finalmente secos em um secador de fluxo de ar para instrumentos de vidro.
[0201] 4.5.3 Secagem do solvente: a um béquer descartável foi adicionada uma quantidade apropriada de peneira molecular, seguido pela quantidade apropriada de dimetil sulfóxido, 1,4-dioxano e éter anidro, e a água foi removida.
[0202] 4.5.4 Congelar éter anidro com antecedência.
4.6. OPERAÇÕES (PONTOS PARA ATENÇÃO EM CADA ETAPA):
4.6.1 PREPARAÇÃO DE LÍQUIDO IÔNICO
[0203] (1) A um frasco de três gargalos de 500 mL foram adicionados 100 g de 1- metilimidazol e 148,5 mL de clorobutano em sequência. Um condensador foi instalado no frasco, e argônio foi introduzido por30 min. A solução foi agitada magneticamente, a seguir aquecida a 80 °C em um banho de óleo, e reagida por 24 horas; (2) Após finalização da reação, o frasco foi retirado, e a solução foi resfriada em temperatura ambiente, e congelada em um refrigerador a -18 °C por 2 horas. A estratificação da solução pode ser observada, e a seguir o líquido sobrenadante foi descartado (principalmente para remoção de clorobutano); (3) O restante foi colocado em um forno de secagem rápida a 80 °C, e após o sólido estar completamente fundido, uma quantidade apropriada de tolueno foi adicionada, enquanto estava quente e agitado para misturar completamente o tolueno com a solução. A mistura foi a seguir resfriada em temperatura ambiente, congelada no refrigerador, e a seguir retirada, e o líquido sobrenadante foi descartado (1- metilimidazol e clorobutano foram dissolvidos em tolueno, e tolueno, 1-metilimidazol e clorobutano foram removidos); (4) A etapa (3) foi repetida duas vezes para a remoção completa de clorobutano não reagido; (5) A amostra foi colocada em um forno de secagem a vácuo e aquecida a 90 °C. Após ser completamente fundida, a amostra foi seca no vácuo a 90 °C por 8 horas (para remoção de tolueno), a seguir foi retirada, permaneceu para resfriar em temperatura ambiente, e a seguir foi colocada em um dessecador para uso.
4.6.2 ATIVAÇÃO DE MPEG
[0204] (1) 10 mL de dimetil sulfóxido e 20 mL de 1,4-dioxano foram adicionados em um frasco de três gargalos de 500 mL e agitados magneticamente. 20 g de MPEG foram adicionados, e após MPEG ser completamente fundido, 3,24g de CDI foram adicionados. A mistura foi aquecida a 37 °C em um banho-maria e reagida por 18 horas; (2) Após finalização da reação, a amostra foi adicionada ao éter anidro pré- resfriado no banho-maria gelado, agitando magneticamente ao mesmo tempo, e a abertura do béquer foi coberta com filme conservante, e a seguir a amostra foi colocada no refrigerador por 30 minutos; (3) A amostra foi retirada após 30 min, e a solução sobrenadante foi descartada. Éter anidro pré-resfriado foi adicionado ao precipitado e agitado magneticamente por 30 minutos, e a seguir a mistura foi colocada no refrigerador por 30 minutos; (4) A etapa (3) foi repetida duas vezes para lavar completamente o CDI não reagido; (5) A solução sobrenadante foi descartada e o restante foi colocado em um forno de secagem rápida a 40 °C por 6 horas para remover principalmente éter; (6) O resíduo foi colocado em um forno de secagem a vácuo a 40 °C, seco no vácuo por 2,5 horas para remover completamente éter, a seguir foi retirado, permaneceu para resfriar em temperatura ambiente, e a seguir foi colocado em um dessecador para uso.
4.6.3 PREPARAÇÃO DE COS-G-MPEG:
[0205] (1) O líquido iônico foi fundido em um forno de secagem rápida a 80 °C; (2) 105 g de líquido iônico foram pesados, adicionados em um frasco de três gargalos, e aquecidos a 70 °C em um banho de óleo. Argônio foi introduzido, e 9 g de COS foi adicionado lentamente. Após COS ser completamente dissolvido, 6 g de MPEG ativado foram adicionados e a mistura foi agitada magneticamente. Após todas as matérias-primas serem adicionadas, a mistura foi reagida por 6 horas na proteção de argônio. Após finalização da reação, o frasco da reação foi resfriado em temperatura ambiente; (3) Primeiramente, uma bolsa de diálise foi presa de um lado com um grampo, e uma quantidade apropriada de água destilada foi adicionada para lavar a bolsa de diálise por três vezes e verificar se água vaza da bolsa de diálise. A seguir,
a amostra no frasco da reação foi colocada na bolsa de diálise (corte de peso molecular de 2.000) e dialisada por 72 horas, a água destilada está em uma quantidade que é adequada para submergir a bolsa de diálise. Água foi renovada a cada 2 horas~3 horas no primeiro dia, a seguir a cada 12 horas; (4) Após conclusão da diálise, a solução foi adicionada em um frasco de três gargalos de 1000 mL e colocada em um banho-maria. Um aparelho de destilação a vácuo foi instalado adequadamente, e a temperatura da destilação foi aumentada gradualmente a partir da temperatura ambiente para 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C. A destilação continuou até cerca de 50 mL da solução permanecer, a seguir o aparelho de destilação foi removido. A amostra foi vertida em um béquer descartável enquanto ainda estava quente. A abertura do béquer foi coberta com uma luva descartável, e a amostra foi congelada no refrigerador por não menos que 8 horas; (5) O liofilizador foi pré-aquecido por 30 minutos, de maneira tal que a temperatura de congelamento atinja -52 °C. A amostra foi triturada, espalhada e achatada em uma placa de Petri. A placa de Petri foi colocada no liofilizador pré- aquecido, e liofilizada a -52 °C por 30 horas. Após conclusão do congelamento, o liofilizador foi desligado, e a amostra foi retirada, pesada, colocada em uma bolsa de reagente, e a seguir armazenada em um dessecador; (6) Análise infravermelha: uma quantidade apropriada de amostra foi obtida, e comprimida com brometo de potássio. O espectro infravermelho da amostra foi medido com a área de varredura de 400 cm-1~4.000 cm-1.
5. PREPARAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE COS-G-MPEG EM PBS:
[0206] 5.1 5,12 %: 0,128 g de COS-g-MPEG foram pesados, adicionados em um tubo de centrífuga de 5 mL, dissolvidos adicionando solução de PBS, e diluídos em 2,5 mL;
5.2 2,56 %: 1,2 mL de solução 5,12 % + 1,2 mL de solução de PBS;
5.3 1,28 %: 1,2 mL de solução 2,56 % + 1,2 mL de solução de PBS;
5.4 0,64 %: 1,2 mL de solução 1,28 % + 1,2 mL de solução de PBS;
5.5 0,32 %: 1,2 mL de solução 0,64 % + 1,2 mL de solução de PBS;
5.6 0,16 %: 1,2 mL de solução 0,32 % + 1,2 mL de solução de PBS;
6. PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO PAMICA DE PIC, COS-G-MPEG E SOLUÇÃO DE CLORETO DE CÁLCIO:
[0207] 6.1 1,0 mL de solução de PIC foi colocado em um banho-maria a 45 °C, 1,0 mL de 5.1 foi adicionado em gotas, e a seguir 0,005 mL de solução de cloreto de cálcio foi adicionado para atingir sua concentração final de 0,0004 mol/L.
[0208] 6.2 1,0 mL de solução de PIC foi colocado em um banho-maria a 45 °C, 1,0 mL de 5.2 foi adicionado em gotas, e a seguir 0,005 mL de solução de cloreto de cálcio foi adicionado para atingir sua concentração final de 0,0004 mol/L.
[0209] 6.3 1,0 mL de solução de PIC foi colocado em um banho-maria a 45 °C, 1,0 mL de 5.3 foi adicionado em gotas, e a seguir 0,005 mL de solução de cloreto de cálcio foi adicionado para atingir sua concentração final de 0,0004 mol/L.
[0210] 6.4 1,0 mL de solução de PIC foi colocado em um banho-maria a 45 °C, 1,0 mL de 5.4 foi adicionado em gotas, e a seguir 0,005 mL de solução de cloreto de cálcio foi adicionado para atingir sua concentração final de 0,0004 mol/L.
[0211] 6.5 1,0 mL de solução de PIC foi colocado em um banho-maria a 45 °C, 1,0 mL de 5.5 foi adicionado em gotas, e a seguir 0,005 mL de solução de cloreto de cálcio foi adicionado para atingir sua concentração final de 0,0004 mol/L.
[0212] 6.6 1,0 mL de solução de PIC foi colocado em um banho-maria a 45 °C, 1,0 mL de 5.6 foi adicionado em gotas, e a seguir 0,005 mL de solução de cloreto de cálcio foi adicionado para atingir sua concentração final de 0,0004 mol/L.
7. RESULTADOS
[0213] MPEG, PEG, PEI, e similares apresentam todos boa solubilidade em água, e apresentam boas compatibilidades com muitos componentes orgânicos. Neste exemplo, tirando MPEG, por exemplo, a compatibilidade aumentou significativamente quando o enxerto de MPEG com um estabilizador catiônico (tal como oligossacarídeo de quitosana) foi preparado com PIC. Em teoria, a compatibilidade também aumentará se um estabilizador catiônico enxertado com PEG (e similares), tal como quitosana,
for preparado com PIC; após o estabilizador catiônico ser enxertado com PEG, o próprio enxerto também apresentará as características de PEG. Solução de PBS de COS-g-MPEG Resultados Efeito hipercrômi 1,28 2,56 5,12 CaCl 0,16 0,32 0,64 co PIC % % % 2 N % % % (padrão (2 (12, (25, (51, (0,16 Solubilida o, (1,6 (3,2 (6,4 para ácido mg/mL) 8 6 2 mol/ de mg/ mg/ mg/ poli- mg/ mg/ mg/ L) mL) mL) mL) inosínico- mL) mL) mL) policitidílic o ≥ 55 %) 6, 1,0 0,00 solução 1,0 mL 65,3 % 1 mL 5 mL clara 6, 1,0 0,00 solução 1,0 mL 70,6 % 2 mL 5 mL clara 6, 1,0 0,00 solução 1,0 mL 62,7 % 3 mL 5 mL clara 6, 1,0 0,00 solução 1,0 mL 64,7 % 4 mL 5 mL clara 6, 1,0 0,00 solução 1,0 mL 44,1 % 5 mL 5 mL clara 6, 1,0 0,00 solução 1,0 mL 15,6 % 6 mL 5 mL clara
[0214] Foi demonstrado a partir dos resultados do teste que a solução ainda estava clara em 1: 25,6 mg de PIC: COS-g-MPEG, mas resultados para o efeito hipercrômico mostraram que mais enxertos não significam melhores. Além disso, as amostras em 6.1, 6, 6.3, 6.4, 6.5 e 6.6 foram deixadas em temperatura ambiente após serem preparadas em 7 de maio de 2018 e, em 14 de maio de 2018, observou-se que precipitado em flocos apareceu na amostra em 6.6 e não pode ser dissolvido novamente. Com base em uma consideração abrangente, a razão de PIC para COS- g-MPEG na formulação de Pamica é limitada em uma faixa de 1 mg : 6,4 mg. II. Preparação de nanopartículas de Pamica
[0215] Tripolifosfato de sódio (TPP) com padrões médicos foi comprado. O complexo PIC-COS-g-MPEG-CaCl2, em uma razão apropriada, foi agitado com um agitador magnético com temperatura constante em uma velocidade, e soluções aquosas de TPP em diferentes concentrações foram adicionadas em gotas. A adição em gotas parou imediatamente quando uma opalescência óbvia foi observada, e a reação foi mantida por 30 minutos. As nanopartículas com um tamanho de partícula menor que 1000 nm foram formadas por automontagem, por meio da reticulação de íons, e obtidas por centrifugação em alta velocidade. As nanopartículas foram verificadas em vários testes a serem qualificados. III. Nanopartículas de antígeno de polipeptídeo ou proteína
[0216] Esquema 1: um antígeno de polipeptídeo ou proteína foi adicionado durante a formação de nanopartículas anteriormente mencionadas: os respectivos componentes foram incorporados no enxerto de PEG-COS ou matriz de COS, e o antígeno de polipeptídeo ou proteína entrou na fase aquosa contendo TPP e ligado. Os respectivos componentes tiveram que ser ligados em uma razão e em um pH adequado, agitando ao mesmo tempo com esferas magnéticas para formar complexo e nanopartículas.
[0217] Esquema 2: o antígeno de polipeptídeo ou proteína foi incubado com o complexo pré-formado anteriormente mencionado e nanopartículas, de maneira tal que o antígeno de polipeptídeo ou proteína estivesse ligado em uma superfície do complexo e das nanopartículas, ou o antígeno de polipeptídeo ou proteína estivesse misturado com o complexo anteriormente mencionado e nanopartículas em uma razão. A mistura foi agitada magneticamente por 5 minutos, permaneceu em temperatura ambiente por 1 hora, e foi ultracentrifugada em matriz de glicerol em
20.000 rcf a 4 °C por 2 horas, e a seguir as nanopartículas de antígeno de polipeptídeo ou proteína foram obtidas.
[0218] Os complexos e nanopartículas do Esquema 1 / Esquema 2 precisam ser verificados em vários testes para serem qualificados. IV. A formulação de Pamica
[0219] O complexo anteriormente mencionado /complexo compreendendo o enxerto/ nanopartículas do complexo /nanopartículas de antígeno de polipeptídeo ou proteína foram embalados assepticamente em material de embalagem adequado/qualificado para preparar várias formas de dosagem, tal como uma injeção, uma pulverização ou um aerossol, e transformados em vários produtos após serem verificados em vários testes de produto para serem qualificados.
[0220] O complexo anteriormente mencionado /complexo compreendendo enxerto /nanopartículas de complexo/ nanopartículas de antígeno de polipeptídeo ou proteína foram embalados assepticamente em material de embalagem adequado/qualificado, e preparados em pomada.
[0221] Um exemplo de preparar uma pulverização: Pamica foi preparado de acordo com o método anterior, e solução de Pamica foi colocada em garrafas de pulverização. Uma detecção de padrão de pulverização de solução médica e uma detecção de dados de distribuição de gotas foram realizadas para 20 garrafas de solução de Pamica, respectivamente.
[0222] Os padrões de pulverização são mostrados na tabela a seguir: Solução D1 D2 Distância Ovalid Ovalid Ângulo Média do médica do (cm) (cm) da ade ade de ângulo cliente Valor Valor pulveriza (D1/D2 média pulveriza de máxi míni ção (cm) ) ção pulveriza mo mo completa ção completa APF 100 1# 4,4 4,1 5 1,07 1,20 43 posicion 2# 4,2 3,0 5 1,40 ado em 3# 4,5 3,5 5 1,29
NTS 4# 4,5 3,6 5 1,25 5# 4,2 3,7 5 1,14 6# 4,0 3,0 5 1,33 7# 4,7 4,1 5 1,15 8# 4,5 4,0 5 1,13 9# 4,0 3,7 5 1,08 10 4,0 3,5 5 1,14 # Nota: As formas de pulverização foram avaliadas pela razão do diâmetro mais longo para o diâmetro mais curto (quanto mais próximo de 1,0, melhores são as formas de pulverização).
[0223] As distribuições de gotas são mostradas na tabela a seguir: Solução médica do ˂10 µm D10 D50 D90 SPAN Média cliente (%) (µm) (µm) (µm) APF 100 1# 1,2 55,32 115,28 187,52 1,15 1,1 posicionado 2# 1,1 48,37 98,36 166,84 1,20 em NTS 3# 1,0 54,13 115,22 192,30 1,20 4# 1,3 42,18 89,78 132,54 1,01 5# 1,0 60,77 123,53 190,03 1,05 6# 1,3 51,81 111,83 173,90 1,09 7# 1,3 56,99 120,23 183,28 1,05 8# 1,4 43,88 87,50 126,41 0,94 9# 1,2 53,66 115,04 195,98 1,24 10# 1,2 53,28 125,02 197,17 1,15 EXEMPLO 2 O TESTE DE PAMICA COMBINADO COM PEI PARA
AUMENTAR SOLUBILIDADE
[0224] A preparação foi realizada com relação ao método de preparação de “Pamica combinado com PEG” (isto é, Exemplo 1). Após aumentar a quantidade de
COS em Pamica, a precipitação apareceu, o que afetou a uniformidade da administração deste. A precipitação pode ser evitada após adicionar PEI, e a dosagem de COS foi aumentada para intensificar adicionalmente o efeito imune deste. O teor de cada componente por 1 mL de amostra Resultado Nome COS CaCl2 PIC (mg/mL) PEI (mg/mL) s (mg/mL) (mol/L) solução 1 0,4 0 0,0004 clara solução Grupo 1 1 0,8 0 0,0004 clara precipitaç 1 1,6 0 0,0004 ão solução 1 0,8 32 0,0004 clara solução 1 1,6 32 0,0004 clara Grupo 2 solução 1 3,2 32 0,0004 clara solução 1 6,4 32 0,0004 clara
[0225] O experimento mostra claramente que após Pamica combinado com PEI, a solubilidade de COS em PIC aumentou de 1,6 mg/mL para 6,4 mg/mL, aumentando em pelo menos 4 vezes.
[0226] A publicação de patente CN105396130A descreve um “PIC- composto amino-adjuvante de CaCl2 e vacina compreendendo o PIC- composto amino- adjuvante de CaCl2”, e descreve que o composto amino não antibiótico pode ser opcionalmente quitosana.
[0227] Neste exemplo comparativo, quitosana solúvel em água (cloridrato de quitosana, CS para abreviar) foi usada para substituir o oligossacarídeo de quitosana no exemplo 1, para comparar os efeitos de quitosana solúvel em água e oligossacarídeo de quitosana na uniformidade da administração. Os resultados são mostrados na tabela a seguir. Nome PIC CS (mg/mL) COS CaCl2 Resultados (mg/mL) (mg/mL) (mol/L) Grupo 1 0,4 0 0,0004 precipitaçã 1 o 1 0,8 0 0,0004 precipitaçã o Grupo 1 0 0,4 0,0004 solução 2 clara 1 0 0,8 0,0004 solução clara
[0228] Estudos descobriram que a adição de quitosana solúvel em água leva à precipitação que não pode ser dispersada por agitação durante a preparação, o que afeta a uniformidade da administração desta, embora oligossacarídeo de quitosana possa ser usado para solucionar o problema anterior. Além disso, tanto PEG enxertado com quitosana quanto quitosana solúvel em água precisam ser degradados em oligossacarídeo de quitosana com peso molecular pequeno, de maneira a ser facilmente absorvido pelo corpo humano, mas oligossacarídeo de quitosana pode ser absorvido diretamente. EXEMPLO 3 AQUECIMENTO DE PIC E DETECÇÃO DE PESO
MOLECULAR
[0229] A solução de PIC foi preparada de acordo com o método de preparação do exemplo 1, 260 mL de solução de PIC foram divididos em 13 tubos, no total com 20 mL/tubo. 12 tubos de amostras foram colocados em um banho-maria de temperatura constante, quando a temperatura deste subiu para 80 °C -99 °C (preferivelmente 90 °C). Após os tubos serem colocados em banho-maria, a cronometragem iniciou, e um tubo foi retirado em 10 minutos (banda 3), 20 minutos (banda 4), 30 minutos (banda 5), 40 minutos (banda 6), 50 minutos (banda 7), 60 minutos (banda 9), 70 minutos (banda 10), 80 minutos (banda 11), 90 minutos (banda 12), 100 minutos (banda 13), 110 minutos (banda 14) e 120 minutos (banda 15), respectivamente. A amostra na banda 2 é não aquecida.
[0230] O complexo preparado por PIC (Pamica) e vacina deste, aquecido por 70- 120 minutos (preferivelmente aquecido por 120 minutos), pode passar pela detecção de toxicidade anormal em camundongos e porquinhos da índia, de acordo com “teste de toxicidade anormal 1141”, PHARMACOPOEIA OF PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA, o 4º vol., 2015. O PIC usado para preparar Pamica deve ser aquecido a 90 °C por pelo menos 70 minutos, preferivelmente a 90 °C por 120 minutos, antes de ser usado para preparação do produto. Os complexos selecionados, preparados por PIC não aquecido (banda 2) e preparados aquecendo por 60 minutos (banda 9), e vacinas destes não podem passar pela detecção de toxicidade anormal em porquinhos da índia. Os resultados são mostrados em a figura 2. A banda comparativa 1 do fundo para o topo: 100 bp, 300 bp, 500 bp, 750 bp, 1000 bp, 1.500 bp, 2.000 bp, 3.000 bp,
5.000 bp. Banda comparativa 8 do fundo para o topo: 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1.000 bp. EXEMPLO 4 TESTE DE DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE COMPLEXO
PAMICA
[0231] Método: o complexo Pamica foi preparado de acordo com o método de preparação do exemplo 1 da presente descrição. Após conclusão da preparação, as respectivas amostras do complexo Pamica e a injeção de ácido poli-inosínico- policitidílico (ácido poli-inosínico-policitidílico-canamicina-cloreto de cálcio) foram diluídas em 0,04 mg/mL, respectivamente. Amostra de 5 mL de diluente foi adicionada em cada um dos 13 tubos (10 mL cada), a seguir 25 μg de RNase (Cat. No. R4642) da Sigma foram adicionados em cada tubo. Os tubos foram colocados em um banho- maria a 37 °C. 1 tubo foi retirado a cada 5 minutos para avaliar o valor de OD em 248 nm, e uma curva foi desenhada.
[0232] O resultado é mostrado em a figura 3. EXEMPLO 5 O COMPLEXO PAMICA DA PRESENTE DESCRIÇÃO É UM
COMPLEXO COM UMA ESTRUTURA NOVA (1) DETERMINAÇÃO DE PICO DA CURVA DE DISSOCIAÇÃO
[0233] Método: as respectivas amostras do complexo Pamica e injeção de ácido poli-inosínico-policitidílico da presente descrição foram diluídas em 0,04 mg/mL, a seguir transferidas para garrafas de reagente de 250 mL. As garrafas de reagente foram colocadas em um banho-maria, e o banho-maria foi aquecido continuamente. 3 mL das respectivas amostras foram retirados a cada 5 °C e colocados em uma cubeta de quartzo. O valor de OD em 248 nm foi medido, e uma curva foi desenhada.
[0234] O resultado é mostrado em a figura 4.
[0235] O resultado do teste mostrou que o complexo Pamica (PIC-estabilizador catiônico-cloreto de cálcio) da presente descrição apresenta um pico de curva de dissociação a 85 °C, e a injeção de ácido poli-inosínico-policitidílico (PIC-canamicina- cloreto de cálcio) apresenta um pico de curva de dissociação a 80 °C, o que indica que o complexo Pamica da presente descrição é um complexo novo. (2) VARREDURA DE PICO DE ABSORÇÃO
[0236] Solução de PI, solução de PC, solução de PIC, solução de PIC-COS, soluções de PIC-COS-CaCl2 foram preparadas de acordo com o método de preparação do exemplo 1, respectivamente. As amostras anteriores foram diluídas em 0,04 mg/mL com tampão de PBS, e o espectro de absorção de varredura foi medido separadamente por ultravioleta. a figura 5 mostra que os picos que aparecem em 240 nm-260 nm do alto para baixo são aqueles de PI, PC, PIC, PIC-COS, PIC-COS-CaCl2, destes picos, os picos de PIC-COS e PIC-COS-CaCl2 foram sobrepostos, o que mostra que o complexo Pamica (PIC-COS-CaCl2) da presente descrição é um complexo com uma estrutura nova. EXEMPLO 6 NANOPARTÍCULAS PARCIAIS FORMADAS POR PIC,
COS E CLORETO DE CÁLCIO
[0237] Pamica foi preparada de acordo com o método do exemplo 1, em que COS foi selecionado como o estabilizador catiônico, e cloreto de cálcio foi selecionado como o cátion metálico. Pode ser observado a partir das micrografias eletrônicas de transmissão (a figura 6 e a figura 7) que nanopartículas foram formadas na solução de Pamica. A maioria das nanopartículas são esféricas e relativamente uniformes, com um tamanho de partícula de cerca de 50 nm, e algumas das nanopartículas são quadradas com tamanhos laterais que excedem 100 nm. EXEMPLO 7 NANOPARTÍCULAS PARCIAIS FORMADAS POR PIC, COS-G-MPEG E CLORETO DE CÁLCIO
[0238] Pamica foi preparado de acordo com o método do exemplo 1, em que COS- g-MPEG foi selecionado como o estabilizador catiônico, e cloreto de cálcio foi selecionado como o cátion metálico. Pode ser observado a partir das micrografias eletrônicas de transmissão (a figura 8 e a figura 9) que nanopartículas, a maioria das quais são quadradas com tamanhos laterais que excedem 100 nm, e algumas são esféricas, foram formadas na solução de Pamica. EXEMPLO 8 NANOPARTÍCULAS PARCIAIS FORMADAS POR PIC, COS, TPP E CLORETO DE CÁLCIO
[0239] COS foi dissolvido em uma solução de tampão fosfato, e uma solução de PIC em TPP foi preparada de acordo com o método do exemplo 1. A solução de PIC em TPP foi adicionada lentamente na solução de COS em agitação, e a seguir a solução de cloreto de cálcio foi adicionada em gotas. Pode-se observar a partir das micrografias eletrônicas de transmissão (a figura 10, a figura 11) que as nanopartículas formadas são fusiformes.
[0240] Pode-se observar através dos exemplos 5-8 que, surpreendentemente, a solução do complexo Pamica contém dois estágios de substâncias ao mesmo tempo, em que um é solução de nanopartículas (os resultados da microscopia eletrônica) e o outro não é nanopartícula (resultado de eletroforese do exemplo 3).
[0241] A vantagem das nanopartículas é que estas podem penetrar diretamente na membrana celular sem endocitose, e entrar na célula, e funcionam rapidamente; a solução sem nanopartícula pode entrar na célula apenas por meio de endocitose, e funciona mais lentamente do que as nanopartículas. Pamica pode exercer seu efeito de dois modos: endocitose e entrar diretamente nas células. Além disso, de maneira mais importante, as nanopartículas apresentam uma estrutura que pode proteger Pamica da degradação de PIC por ribonuclease no soro de primatas e animais mais avançados que primatas, incluindo humano, a fim de atingir uma inovação antiviral e antitumor e apresentar melhores efeitos. Estes efeitos permitem Pamica apresentar efeitos notáveis no anticâncer em humanos e camundongos.
EXEMPLO EXPERIMENTAL AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNE DO COMPLEXO PAMICA
[0242] Nos exemplos experimentais a seguir, o Pamica se refere à solução de Pamica de PIC, COS e solução de cloreto de cálcio preparada de acordo com o exemplo 1, a menos que de outra forma mencionada. EXEMPLO EXPERIMENTAL 1 AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNE DE COMPLEXO PAMICA EM VACINA DE HEPATITE B RECOMBINANTE [RHBSAG (CHO)]
[0243] Materiais: rHBsAg (CHO): 20 ug/mL; adjuvante de Pamica: 1 mg/mL; adjuvante de ADV20: 400 ug/mL; adjuvante de hidróxido de alumínio: 10 mg/mL; salina.
[0244] Adjuvante de alumínio/rHBsAg (CHO): adjuvante de alumínio 0,07 mL + rHBsAg (CHO) 0,5 mL + salina 0,43 mL.
[0245] ADV20 (citocina adjuvante)/rHBsAg (CHO): ADV20 0,25 mL + rHBsAg (CHO) 0,5 mL + salina 0,25 mL.
[0246] Adjuvante de Pamica/rHBsAg (CHO): adjuvante de Pamica 0,5 mL + rHBsAg (CHO) 0,5 mL.
[0247] Método: camundongos foram imunizados intramuscularmente com 0,1 mL de adjuvante de alumínio/rHBsAg (CHO), ADV20 (citocina adjuvante)/rHBsAg (CHO), Pamica/rHBsAg (CHO) no dia 0 e no 14º dia, respectivamente, e foram detectados em relação à sua imunidade celular e imunidade humoral no dia 21º.
[0248] Resultados: o complexo Pamica da presente descrição apresenta efeito imune excepcional; especialmente o anticorpo de ELISA e imunidade celular são melhorados consideravelmente, o que é significativamente melhor que aqueles de adjuvante de alumínio e ADV20 (adjuvante de citocina). Pamica é um adjuvante imune promissor, vide a figura 12 e a figura 13 para detalhes. EXEMPLO EXPERIMENTAL 2 AVALIAÇÃO DOS EFEITOS IMUNES DE
COMPLEXO PAMICA E ANTÍGENO INATIVADO DE BACTERIUM BURGERI
[0249] Método: camundongos foram imunizados com PBS, injeção de ácido poli- inosínico-policitidílico + antígeno inativado de Bacterium burgeri, complexo Pamica da presente descrição + antígeno inativado de Bacterium burgeri, respectivamente, imunizados uma vez no dia 0, e os camundongos foram atacados usando cepa virulenta de Brucella após imunização por 45 dias. Após desafio por 15 dias, os camundongos foram mortos para isolar os baços dos camundongos, e o Bacterium burgeri no baço foi cultivado por 3 dias, contado, e a seguir a eficiência protetora do complexo Pamica da presente descrição + antígeno inativado de Bacterium burgeri foi avaliada.
Valor Grupos 1 2 3 4 5 6 7 8 médi Número de o camundongo Grupo controle branco 5,9 6,17 6,08 6,04 6,16 6,08 6,10 6,12 6,08 (valor de log) injeção de ácido poli- inosínico-policitidílico + antígeno inativado 5,16 5,18 3,97 3,54 4,37 4,2 - - 4,4 de Bacterium burgeri (valor de log) o complexo Pamica 2,59 2,78 3,32 3,11 2,88 2,9 3,81 3,02 3,05 da presente descrição
+ antígeno inativado de Bacterium burgeri (valor de log)
[0250] Resultados: o complexo Pamica da presente descrição apresenta efeitos imunes excepcionais e apresenta perspectiva no desenvolvimento de antígeno inativado de Bacterium burgeris. O número de bactérias isoladas usando o complexo Pamica da presente descrição + antígeno inativado de Bacterium burgeri difere em 3,03 logs daquele que usa o grupo controle branco, e difere em 1,35 daquele que usa a injeção de ácido poli-inosínico-policitidílico + antígeno inativado de Bacterium burgeri. O complexo Pamica e Bacterium burgeri inativado apresentam um efeito protetor excelente. EXEMPLO EXPERIMENTAL 3 USO DO COMPLEXO PAMICA E ANTÍGENO MYO (MIOGLOBINA DE HUMANO) NA PREPARAÇÃO DE
ANTICORPOS
[0251] Materiais: antígeno MYO (mioglobina de humano), com uma concentração de 1 mg/mL
[0252] O complexo Pamica da presente descrição, com uma concentração de 1 mg/mL.
[0253] Adjuvante completo de Freund (CFA, Sigma).
[0254] Método: o sangue negativo de coelhos de 2,3 kg-2,5 kg foi coletado e soro foi separado como controle antes da imunização. Após amostras diferentes serem injetadas subcutaneamente no abdômen e costas e, vários sítios, o soro foi separado para detecção de anticorpo. O antígeno + adjuvante foi preparado em 0,5 mL + 0,5 mL, e a dosagem em cada imunização foi 1 mL. RESULTADOS:
[0255] (1) Coelhos foram imunizados com o complexo Pamica da presente descrição + antígeno MYO, adjuvante completo de Freund + antígeno MYO uma vez a cada 7 dias. Adjuvante completo de Freund foi adicionado para imunização por 2 vezes (10 dias), com uma titulação de anticorpo de ELISA de 13.000; adjuvante completo de Freund foi adicionado para imunização por 3 vezes (18 dias), com uma titulação de anticorpo de ELISA de 39.000; adjuvante completo de Freund foi adicionado para imunização por 6 vezes (3 meses), com uma titulação de anticorpo de ELISA de 25.000; o complexo Pamica da presente descrição foi adicionado para imunização por 2 vezes (10 dias), com uma titulação de anticorpo de ELISA de 45.000, para imunização por 3 vezes (18 dias), com uma titulação de anticorpo de ELISA de
51.000, e para imunização por 3 vezes (3 meses), com uma titulação de anticorpo de ELISA de 36.000. Adjuvante de Pamica apresenta uma titulação de anticorpo relativamente alta no estágio inicial em antígeno MYO, e uma melhor duração da imunização, indicando que o complexo Pamica da presente descrição é significativamente melhor que adjuvante completo de Freund como o padrão ouro de adjuvante imune em antígeno MYO, vide a figura 14 para detalhes.
[0256] (2) Coelhos foram imunizados para o antígeno MYO com o complexo Pamica da presente descrição, combinado com adjuvante completo de Freund duas vezes (uma vez imunizado no dia 0, uma vez imunizado no 14º dia), a titulação do anticorpo de ELISA (35 dias após imunização) é 10.000, usando adjuvante completo de Freund, 60.000 usando complexo Pamica da presente descrição, e 160.000 usando complexo Pamica da presente descrição + adjuvante completo de Freund (a figura 15).
[0257] Kits foram preparados com anticorpos produzidos imunizando coelhos com adjuvante completo de Freund + antígeno, adjuvante de Pamica + adjuvante completo de Freund + antígeno, e adjuvante de Pamica + antígeno, respectivamente. Após verificação clínica, os anticorpos produzidos pelo grupo de adjuvante completo de Freund ou grupo de antígeno de adjuvante completo de Freund + adjuvante de Pamica não combinam com amostras clínicas, e não passam no exemplo clínico. Apenas anticorpos produzidos por adjuvante de Pamica + antígeno podem passar pelo exame clínico, o que romperá completamente o monopólio da companhia Dutch Dako no fornecimento de matérias-primas de anticorpo usadas no kit de turbidez de látex de mioglobina de humano, e solucionar a situação grave de titulações imunes baixas comuns, diversidade de epítopo insuficiente, e detecção de amostra clínica ineficiente durante o uso de adjuvante completo de Freund para produtos domésticos.
[0258] Os kits preparados com anticorpos produzidos usando grupo de adjuvante de Pamica + antígeno, e os kits clinicamente usados, preparados com anticorpos providos pela companhia Dutch Dako, são comparados na tabela a seguir. Kit de quimiluminescê Kit de látex do Soro ncia (preparado Kit de látex Kit de látex de Kit de látex de grupo de de com um CHUAN ZHI Homa JIEMEN antígeno de huma anticorpo de Chuanzhi Biological Biotechnology Pamica no monoclonal Biotechnology importado, alta sensibilidade) 1 35 25,44 12,48 17,09 55,54 2 24 35,59 17,66 9,12 37,48 3 186 130,11 88,6 71,33 79,17 4 1200 353,25 248,66 OVER 523,29 5 47 51,65 32,91 25,35 44,2 6 74 85,55 63,5 73,74 46,54 7 18 14,89 8,91 1,32 39,13 8 37 46,42 30,05 27,58 37,21 9 54 50,46 31,37 30,51 58,14 10 56 63,63 32,12 21,78 106,3 EXEMPLO EXPERIMENTAL 4 AVALIAÇÃO DE EFICIÊNCIA NIH DE
COMPLEXO PAMICA EM ANTÍGENO DE VACINA ANTIRRÁBICA
[0259] Nome: Avaliação de eficiência de NIH do complexo Pamica da presente descrição em antígeno de vacina antirrábica.
[0260] Método: camundongos foram imunizados com o complexo Pamica da presente descrição (1 mg/mL) + antígeno, injeção de ácido poli-inosínico-policitidílico (1 mg/mL) + antígeno, PBS + antígeno e antígeno no dia 0, desafiados no 14º dia, e a eficácia foi determinada após 28 dias.
[0261] Resultados: vide tabela a seguir. Preparação Injeção de Resul o complexo ácido poli- tados Grupos Pamica da PBS antígeno inosínico- (IU/m presente (mL) (mL) policitidílico L) descrição (mL) (mL) 1 0 0 0 1,0 3,5 2 0 0 0,8 0,2 1,0 3 0 0,8 0 0,2 2,0 4 0,8 0 0 0,2 3,6
[0262] Os resultados mostram que: a. o efeito protetor do complexo Pamica da presente descrição + antígeno de vacina antirrábica da cepa CTN é 3,6 vezes aquela do antígeno de vacina antirrábica da cepa CTN sozinha, e antígeno é polpado em 1/5; b. o efeito protetor do complexo Pamica da presente descrição + antígeno de vacina antirrábica da cepa CTN é 1,8 vezes aquele da injeção de ácido poli- inosínico-policitidílico + antígeno de vacina antirrábica da cepa CTN, e é excelente. EXEMPLO EXPERIMENTAL 5 COMPLEXO PAMICA INDUZ A
PRODUÇÃO DE CITOCINAS MÚLTIPLAS EM CAMUNDONGOS
[0263] Método: camundongos foram imunizados com o complexo Pamica da presente descrição e injeção de ácido poli-inosínico-policitidílico. Os globos oculares dos camundongos foram removidos em 1 hora, 2 horas e 5 horas após imunização, e o sangue foi coletado em um tubo de centrífuga de 2 mL esterilizado. O tubo de centrífuga permaneceu em temperatura ambiente por 30 minutos, centrifugado em
3.500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi sugado para um novo tubo de centrífuga,
e o soro foi congelado a -20 °C.
[0264] Resultados: os rendimentos de citocina TNF-α e IFN-γ induzidos pelo complexo Pamica da presente descrição são obviamente superiores àqueles de injeção de ácido poli-inosínico-policitidílico. Os dados obtidos são todos valores médios geométricos, e os resultados específicos são mostrados na tabela a seguir. Fator de necrose Induz a produção de Interferon (IFN-γ) Grupos tumoral (TNF-α) citocinas pg/mL pg/mL Controle branco 0h 2 3 Injeção de ácido 1 h 12 4 poli-inosínico- 2h 5 38 policitidílico 5h 13 258 1h 863 32 Pamica 2h 331 71 5h 143 285
[0265] Sumário: TNF-α pode matar e inibir células tumorais, promover fagocitose de neutrófilo e resistir à infecção, e é um tipo de citocina que pode causar diretamente a morte de células tumorais; IFN-γ pode induzir resistência celular à infecção viral, e interferindo com a transcrição de genes virais ou a tradução de componentes de proteína viral, IFN-γ pode prevenir ou limitar infecções virais, e é atualmente a infecção antiviral e citocina antitumor mais importante.
[0266] Os níveis de citocinas TNF-α e IFN- γ produzidas, induzidos por Pamica em camundongos, são maiores que aqueles induzidos por injeção de ácido poli-inosínico- policitidílico, indicando que o TNF-α e IFN-γ produzidos induzidos pelo complexo Pamica da presente descrição apresentam capacidade mais acentuada de matar células tumorais e anti-infecção sinergisticamente. EXEMPLO EXPERIMENTAL 6 EXAME DE TOXICIDADE ANORMAL
1. O TESTE DO COMPLEXO PAMICA DA PRESENTE DESCRIÇÃO EM CAMUNDONGOS:
1.1 TESTE:
[0267] Injeção da amostra: camundongos SPF saudáveis de 18 g～22 g de Kunming foram injetados intraperitonealmente em 0,5 mL/camundongo e 5 camundongos/amostra, e 5 camundongos saudáveis como controles brancos foram pesados em 18 g～22 g ao mesmo tempo.
1.2 CRITÉRIOS:
[0268] Cada camundongo é injetado intraperitonealmente com 0,5 mL da substância teste e observados por 7 dias. Durante a observação, todos os camundongos devem sobreviver sem reações anormais. Quando o tempo expira, cada camundongo deve ganhar peso, e a seguir a substância teste é considerada qualificada. Se as exigências anteriores não forem atendidas, 10 camundongos podem ser usados para um novo teste, e os critérios são os mesmos da maneira anterior (ip. é para abreviação para injeção intraperitoneal).
1.3. RESULTADOS Peso Injeção Dias de observação, reações anormais e mortes Peso corp corpo Númer oral ral Result os de ante Dosage Via 1 2 3 4 5 6 7 após ados série s da m injeçã injeç o ão
Amostr a paralel a 1 de Pamic a 0,5 (prepar sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 20,2 mL/cam 33,7 qualifi ada ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados com ram ram ram ram ram ram ram o
PIC aqueci do por 120 minuto s)
Amostr a paralel a 2 de Pamic a 0,5 (prepar sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 20,3 mL/cam 32,6 qualifi ada ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados com ram ram ram ram ram ram ram o
PIC aqueci do por 120 minuto s)
Amostr a paralel a 3 de Pamic a 0,5 (prepar sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 21,4 mL/cam 33,4 qualifi ada ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados com ram ram ram ram ram ram ram o
PIC aqueci do por 120 minuto s)
Amostr a paralel a 4 de Pamic a 0,5 (prepar sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 19,3 mL/cam 27,3 qualifi ada ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados com ram ram ram ram ram ram ram o
PIC aqueci do por 120 minuto s)
Amostr a paralel a 5 de Pamic a 0,5 (prepar sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 21,2 mL/cam 31,3 qualifi ado ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados com ram ram ram ram ram ram ram o
PIC aqueci do por 120 minuto s) Amostr a paralel a 1 de Pamic 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 20,9 mL/cam 32,1 qualifi (prepar ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados ado ram ram ram ram ram ram ram o com
PIC não aqueci do)
Amostr a paralel a 2 de Pamic 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 20,4 mL/cam 32,2 qualifi (prepar ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados ado ram ram ram ram ram ram ram o com
PIC não aqueci do) Amostr a paralel a 3 de Pamic 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 19,9 mL/cam 29,8 qualifi (prepar ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados ado ram ram ram ram ram ram ram o com
PIC não aqueci do)
Amostr a paralel a 4 de Pamic 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 20,1 mL/cam 30,7 qualifi (prepar ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados ado ram ram ram ram ram ram ram o com
PIC não aqueci do) Amostr a paralel a 5 de Pamic 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 19,7 mL/cam 30,6 qualifi (prepar ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados ado ram ram ram ram ram ram ram o com
PIC não aqueci do)
Amostr 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 20,6 mL/cam 33,7 qualifi paralel ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados a 1 de ram ram ram ram ram ram ram o
PBS Amostr 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 19,8 mL/cam 31,9 qualifi paralel ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados a 2 de ram ram ram ram ram ram ram o
PBS Amostr 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 19,2 mL/cam 30,2 qualifi paralel ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados a 3 de ram ram ram ram ram ram ram o
PBS Amostr 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 21,3 mL/cam 31,5 qualifi paralel ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados a 4 de ram ram ram ram ram ram ram o
PBS Amostr 0,5 a sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 19,2 mL/cam 27,8 qualifi paralel ip. evive evive evive evive evive evive evive g undong g cados a 5 de ram ram ram ram ram ram ram o
PBS 2 O TESTE DE COMPLEXO PAMICA DA PRESENTE DESCRIÇÃO EM PORQUINHOS DA ÍNDIA:
2.1 TESTE:
[0269] Injeção da amostra: porquinhos da índia Hartley grau SPF saudáveis de
250 g～350 g foram injetados intraperitonealmente em 5 mL/porquinho da índia e 2 porquinhos da índia/amostra e 2 porquinhos da índia saudáveis como controles brancos foram pesados em 250 g～350 g ao mesmo tempo.
2.2 CRITÉRIOS:
[0270] Cada porquinho da índia é injetado intraperitonealmente com 5 mL da substância teste e observados por 7 dias. Durante a observação, todos os porquinhos da índia devem sobreviver sem reações anormais. Quando o tempo expira, cada porquinho da índia deve ganhar peso, e a seguir a substância teste é considerada qualificada. Se as exigências anteriores não forem atendidas, 4 porquinhos da índia podem ser usados para um novo teste, e os critérios são os mesmos da maneira anterior.
2.3. RESULTADOS DO TESTE: Peso Injeção Dias de observação, reações anormais e mortes Peso corp Núm corp oral eros oral Result ante Dosage de Via 1 2 3 4 5 6 7 após ados s da m série injeç injeç ão ão
Amo stra paral ela 1 de Pami ca (prep 5 sobr sobr sobr sobr sobr sobr arad 271 mL/porq sobrev eviv 295 qualific ip. evive evive evive evive evive o g uinho iveram era g ados ram ram ram ram ram com da índia m
PIC aque cido por 120 minu tos)
Amo stra paral ela 2 de Pami ca (prep 5 sobr sobr sobr sobr sobr sobr arad 263 mL/porq sobrev eviv 301 qualific ip. evive evive evive evive evive a g uinho iveram era g ados ram ram ram ram ram com da índia m
PIC aque cido por 120 minu tos)
Amo stra paral ela 1 de Pami ca (prep 5 sobr sobr sobr sobr sobr sobr arad 276 mL/porq sobrev eviv 298 qualific ip. evive evive evive evive evive o g uinho iveram era g ados ram ram ram ram ram com da índia m
PIC aque cido por 90 minu tos)
Amo stra paral ela 2 de Pami ca (prep 5 sobr sobr sobr sobr sobr sobr arad 296 mL/porq sobrev eviv 326 qualific ip. evive evive evive evive evive a g uinho iveram era g ados ram ram ram ram ram com da índia m
PIC aque cido por 90 minu tos)
Amo stra paral ela 1 de Pami ca (prep 5 sobr sobr sobr sobr sobr sobr arad 266 mL/porq sobrev eviv 297 qualific ip. evive evive evive evive evive a g uinho iveram era g ados ram ram ram ram ram com da índia m
PIC aque cido por 70 minu tos)
Amo stra paral ela 2 de Pami ca (prep 5 sobr sobr sobr sobr sobr sobr arad 273 mL/porq sobrev eviv 302 qualific ip. evive evive evive evive evive a g uinho iveram era g ados ram ram ram ram ram com da índia m
PIC aque cido por 70 minu tos)
Amo stra paral ela 1 do com morr plexo eram (prep 5 , não arad 263 mL/porq ip. pelo solto, perda de apetite, apatia peso qualific o g uinho de ados com da índia 230
PIC g aque cido por 60 minu tos)
Amo stra paral ela 2 do com morr plexo eram (prep 5 , não arad 277 mL/porq pelo solto, perda de apetite, apatia ip. peso qualific o g uinho morreram de ados com da índia 246
PIC g aque cido por 60 minu tos)
Amo stra paral ela 1 do com morr plexo eram (prep 5 , não arad 287 mL/porq pelo solto, perda de apetite, apatia ip. peso qualific o g uinho morreram de ados com da índia 234
PIC g aque cido por 50 minu tos)
Amo stra paral ela 2 do com morr plexo eram (prep 5 , não arad 293 mL/porq pelo solto, perda de apetite, apatia ip. peso qualific o g uinho morreram de ados com da índia 268
PIC g aque cido por 50 minu tos)
Amo stra paral ela 1 do morr com eram 5 plexo , não 280 mL/porq (prep ip. pelo solto, perda de apetite, apatia peso qualific g uinho arad de ados da índia o 258 com g
PIC não aque cido)
Amo stra paral ela 2 do morr com eram 5 plexo , não 290 mL/porq (prep ip. pelo solto, perda de apetite, apatia peso qualific g uinho arad de ados da índia o 265 com g
PIC não aque cido) Amo stra 5 sobr sobr sobr sobr sobr sobr paral 288 mL/porq sobrev eviv 308 qualific ip. evive evive evive evive evive ela 1 g uinho iveram era g ados ram ram ram ram ram de da índia m
PBS Amo stra 5 sobr sobr sobr sobr sobr sobr paral 301 mL/porq sobrev eviv 334 qualific ip. evive evive evive evive evive ela 2 g uinho iveram era g ados ram ram ram ram ram de da índia m
PBS Nota: o novo teste ainda não estava qualificado. 3 O TESTE DE COMPLEXO PAMICA DA PRESENTE DESCRIÇÃO +
ANTÍGENO PURIFICADO DE VACINA ANTIRRÁBICA EM PORQUINHOS DA ÍNDIA:
3.1 TESTE:
[0271] Injeção da amostra: porquinhos da índia Hartley grau SPF saudáveis, com 250 g～350 g, foram injetados intraperitonealmente em 5 mL/porquinho da índia e 2 porquinhos da índia/amostra, e 2 porquinhos da índia saudáveis como controles brancos foram pesados em 250 g～350 g ao mesmo tempo.
3.2 CRITÉRIOS:
[0272] Cada porquinho da índia é injetado intraperitonealmente com 5 mL da substância teste e observados por 7 dias. Durante a observação, todos os porquinhos da índia devem sobreviver sem reações anormais. Quando o tempo expira, cada porquinho da índia deve ganhar peso, e a seguir a substância teste é considerada qualificada. Se as exigências anteriores não forem atendidas, 4 porquinhos da índia podem ser usados para um novo teste, e os critérios são os mesmos da maneira anterior.
3.3. RESULTADOS DO TESTE: Peso Injeção Dias de observação, reações anormais e mortes Peso corp corpor Núme oral Resu al ros de ante Dosag ltado Via 1 2 3 4 5 6 7 após série s da em s injeçã injeç o ão
Pamic a (prepa rado com
PIC aqueci do por 5 120 mL/po sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobre qualif 281 minut rquinh ip. evive evive evive evive evive evive vivera 303 g icado g os) + o da ram ram ram ram ram ram m s antíge índia no purific ado de vacina antirrá bica 1
Pamic a (prepa rado com
PIC aqueci do por 5 120 mL/po sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobre qualif 273 minut rquinh ip. evive evive evive evive evive evive vivera 316 g icado g os) + o da ram ram ram ram ram ram m s antíge índia no purific ado de vacina antirrá bica 2
Compl exo (prepa rado com
PIC aqueci do por 5 60 não mL/po minut 275 qualif rquinh ip. pelo solto, perda de apetite, apatia 238 g os) + g icado o da antíge s índia no purific ado de vacina antirrá bica 1
Compl exo (prepa rado com
PIC aqueci morrer do por 5 am, não 60 mL/po 302 morr peso qualif minut rquinh ip. pelo solto, perda de apetite, apatia g eram corpor icado os) + o da al de s antíge índia 266 g no purific ado de vacina antirrá bica 2 Amost 5 ra mL/po sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobre qualif 293 paralel rquinh ip. evive evive evive evive evive evive vivera 328 g icado g a 1 de o da ram ram ram ram ram ram m s PBS índia Amost 5 ra mL/po sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobre qualif 314 paralel rquinh ip. evive evive evive evive evive evive vivera 340 g icado g a 2 de o da ram ram ram ram ram ram m s PBS índia
Nota: 1) o novo teste ainda não estava qualificado; 2) antígeno purificado de vacina antirrábica: célula: célula Vero; cepa do vírus: cepa de CTN (não pretende-se que este seja limitado apenas à célula Vero, e cepa de CTN e cepa do vírus). 4 O TESTE DE COMPLEXO PAMICA DA PRESENTE DESCRIÇÃO + ANTÍGENO DA VACINA CONTRA HEPATITE B EM PORQUINHOS DA ÍNDIA:
4.1 TESTE:
[0273] Injeção da amostra: porquinhos da índia Hartley grau SPF saudáveis, com 250 g～350 g, foram injetados intraperitonealmente em 5 mL/porquinho da índia e 2 porquinhos da índia/amostra, e 2 porquinhos da índia saudáveis como controles brancos foram pesados em 250 g～350 g ao mesmo tempo.
4.2 CRITÉRIOS:
[0274] Cada porquinho da índia é injetado intraperitonealmente com 5 mL da substância teste e observados por 7 dias. Durante a observação, todos os porquinhos da índia devem sobreviver sem reações anormais. Quando o tempo expira, cada porquinho da índia deve ganhar peso, e a seguir a substância teste é considerada qualificada. Se as exigências anteriores não forem atendidas, 4 porquinhos da índia podem ser usados para um novo teste, e os critérios são os mesmos da maneira anterior.
4.3. RESULTADOS DO TESTE: Peso Injeção Dias de observação, reações anormais e mortes Peso corp corpor Númer oral al Result os de ante Dosag Via 1 2 3 4 5 6 7 após ados série s da em injeçã injeç o ão
Pamic a (prepar ado com
PIC aqueci 5 do por mL/po sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 263 qualific 120 rquinh ip. evive evive evive evive evive evive evive 299 g g ados minuto o da ram ram ram ram ram ram ram s) + índia antíge no da vacina contra hepatit eB1
Pamic a (prepar ado com
PIC aqueci 5 do por mL/po sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 259 qualific 120 rquinh ip. evive evive evive evive evive evive evive 294 g g ados minuto o da ram ram ram ram ram ram ram s) + índia antíge no da vacina contra hepatit eB2
Compl exo (prepar ado com
PIC aqueci 5 do por mL/po não 265 60 rquinh ip. pelo solto, perda de apetite, apatia 229 g qualific g minuto o da ados s) + índia antíge no da vacina contra hepatit eB1
Compl exo (prepar ado com morr PIC eram aqueci 5 , do por mL/po peso não 272 60 rquinh ip. pelo solto, perda de apetite, apatia corp qualific g minuto o da oral ados s) + índia de antíge 246 no da g vacina contra hepatit eB2 Amostr 5 a mL/po sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 288 qualific paralel rquinh ip. evive evive evive evive evive evive evive 318 g g ados a 1 de o da ram ram ram ram ram ram ram PBS índia Amostr 5 a mL/po sobr sobr sobr sobr sobr sobr sobr 294 qualific paralel rquinh ip. evive evive evive evive evive evive evive 326 g g ados a 2 de o da ram ram ram ram ram ram ram PBS índia Nota: 1) o novo teste ainda não estava qualificado; 2) antígeno da vacina contra hepatite B: expresso em levedura (não pretende-se que seja limitado apenas à expressão em levedura, e células CHO geneticamente modificadas recombinantes também podem ser usadas para expressar antígeno de hepatite B). SUMÁRIO E ANÁLISE:
[0275] PIC (ácido nucleico de fita dupla) desenrola após ser aquecido em uma certa temperatura, e as duas fitas simples são pareadas por meio de ligações de hidrogênio, com a temperatura diminuindo lentamente para restabelecer a fita dupla. O aquecimento pode reduzir o peso molecular de PIC e reduzir sua toxicidade. Se PIC for não aquecido ou preparado sem ser aquecido por tempo suficiente, o complexo preparado por este método é muito tóxico por si só, e a vacina preparada por este complexo também é muito tóxica, a qual é difícil de ser submetida para uso. EXEMPLO EXPERIMENTAL 7 O USO DE COMPLEXO PAMICA EM
ALGUNS PACIENTES COM CÂNCER AVANÇADO E PARA TRATAMENTO DE
INFECÇÃO Antes da Tempo de No Gêne Idad Doença administra Após administração administraçã me ro e ção o
2016.5. Acamada, Desde outubro de 2016 o Junho de metástase náusea, apetite aumentou 2016 ocorreu em vômito, gradualmente, com 3 -Julho de múltiplos apenas refeições ao dia, ganho de 2017, a órgãos uma peso, e bom estado paciente 80 XX Mulh após 2 refeição mental. O período de morreu por ano Lin er operações por dia, sobrevivência é maior que reincidência s de apatia. o médico calculou e em julho de carcinoma suporte estendeu para 14 meses 2017, 2 de vital por (Julho de 2016～ meses após glândula transfusão Setembro de 2017). Após parar com o submandib de sangue injeção intramuscular, a fármaco ular.
Um e proteína. paciente foi administrada período de com 4 mg de toda vez. sobrevivên Uma vez que o sítio de cia de 1-2 injeção era doloroso e meses foi endurecido, a seguir esperado administração por por um administração por médico. pulverização nasal foi aplicada em 4 mg-6 mg de toda vez.
Adenocarci O paciente foi noma administrado com pulmonar, pulverização nasal com 6 diagnostic mg de toda vez, uma vez Março de ado como por dia sem efeitos 2017 câncer colaterais.
A formulação -Junho de pulmonar imune de mucosa, 2017, a em Peking apatia, combinada com um família do XX 67 Union recebeu fármaco de quimioterapia home paciente We ano Medical quimiotera (cisplatina), apresentou m tomou o n s College pia sem efeitos colaterais fármaco Hospital e cirurgia. reduzidos, com apenas proativamen Tianjin alguma náusea e vômito, te em Quanjian e os glóbulos brancos outubro de Hospital aumentaram a partir de 2017 (vivo). em 1.000 /mm3 - 2.000 /mm3 fevereiro não tomando nenhum de 2017 e fármaco com mais de março de 3.000/mm3.
2017, respectiva mente.
Havia um tumor do tamanho de um ovo de pata no mediastino . A paciente A paciente foi Maio de foi administrada uma vez em 2017-Agosto diagnostic Efeitos dias alternados a partir de de 2017, XX ada com colaterais 4 de maio de 2017, com Zhu relatou câncer na graves primeira administração por uma mama após duas pulverização nasal em 4 melhoria direita, quimiotera mg toda vez, e a seguir significativa com pias, perda injeção intramuscular em na qualidade 62 carcinoma de peso, 2 mg toda vez.
Após mais de vida.
Ela XX Mulh ano metastátic náusea e de 10 tais ciclos de morreu logo Zhu er s o múltiplo vômito, administração, a paciente de no fígado, cresciment não relatou nenhum efeito insuficiência e ninhos o do tumor colateral.
Combinação hepática, em de células e com fármacos de virtude de de câncer transamina quimioterapia reduziu tabagismo no tecido se significativamente os após fibroso elevada. efeitos colaterais de retornar para observado quimioterapia com dieta sua cidade na aumentada, maior força natal no glândula física, e massas mamárias nordeste da linfática, mais macias. a China. diagnóstic transaminase glutâmica- a por Jilin pirúvica diminuiu de 130,5 Provincial U/L para 38,4 U/L. O halo Tumor hipoecóico máximo do Hospital fígado reduziu de 7,6 em 8 de cm×5,1 cm em 9 de abril maio de de 2017 para 5,9 cm×3,0
2017. cm em 2 de junho de 2017. Submetida Sem A paciente foi à cirurgia apetite, administrada em dias de câncer sem alternados a partir de 27 de cólon paladar, de maio de 2017, com em 2002, sono leve, administração por cirurgia de fadiga e pulverização nasal em 4 câncer de fraqueza, mg toda vez. Após 6 mama em perda de administrações, o Maio de XX 73 2008, cabelo paciente e sua família não Mulh 2017-até o Wa ano cirurgia de leve, relataram nenhum efeito er momento ng s câncer de pouca colateral, aumentou a (viva) pulmão em motilidade dieta, reduziu tumores, e 2015, e gástrica, aliviou de maneira óbvia a radioterapi tosse e tosse, e parou de usar o a e usando fármaco para tosse. quimiotera fármaco Os resultados de pia para para tosse, laboratório em 29 de câncer de sem março de 2018: 1) o nível pulmão em tratamento de antígeno abril de . carcinoembrionário é 1,93,
2017. o valor de referência é 0 ng/mL-5 ng/mL; 2) o nível de antígeno de carboidrato CA153 é 9,2, o valor de referência é 0 IU/mL-25 IU/mL; 3) o nível de antígeno de carboidrato CA-125 é 1,2 U/mL, valor de referência é 0 U/mL-35 U/mL; 4) o nível de antígeno de carboidrato CA19-9 é 6,24, valor de referência <39 U/mL; 5) o nível de antígeno de carboidrato CA-724 é 0,72, valor de referência é 0 U/ mL-6,9 U/ mL; 6) o nível de enolase específica de neurônio é 12,36, valor de referência é 0 ng/mL-16,3 ng/mL; 7) o nível de sangue fecal oculto é 0, valor de referência <100 ng/mL. 72 Câncer de Perda de A paciente foi Abril de XX Mulh ano laringe; força física administrada com 2 mg de 2016- Gao er s sem (atividade dois em dois dias por Janeiro de nenhuma em uma injeção intramuscular. 2017 medicação faixa Após 15 dias, o sintoma (Morreu) após a limitada), de fadiga aliviou, a cirurgia em cansaço, paciente pode ir ao 2014, e perda de mercado, com maior recaída no apetite, apetite, dispneia foi início de dispneia, aliviada, e bom sono. A
2016. facilidade paciente se sentiu para significativamente melhor acordar e bem tolerada, nenhuma engasgado reação adversa óbvia, e durante o desistiu de tomar sono. analgésicos. A paciente foi então administrada intratumoralmente a cada dois dias com injeção de 2 mg toda vez no tumor, na superfície da pele. Após 7 injeções, o tumor na superfície da pele desapareceu após supuração. Câncer de Sudorese, O paciente foi injetado Agosto de esôfago; fadiga, intramuscularmente uma 2016- 59 câncer foi perda de vez com 2 mg em dias Fevereiro de XX home ano observado apetite alternados, 15 dias após a 2017, Bai m s na prisão (consumo primeira administração, morreu 2 por volta de apenas apetite muito aumentado meses após de junho 1 creme de (o paciente pode comer 7 parar de de 2016, e ovo), ou 8 cremes de ovo, e tomar o o paciente dispneia, e pode beber álcool), e fármaco. foi trazido desconfort ganhou peso.
O paciente de volta o se sentiu para a vila sistêmico. significativamente melhor, pelo com perspectiva espiritual comitê da melhorada, sem febre, Vila Su da sem diarreia, sem reações prisão.
O adversas óbvias, sem paciente febre nas mãos e pós, não temperatura corporal recebeu normal, sem sudorese, e nenhum sem dor no sítio de tratamento injeção. e foi prescrito que o câncer era tumor benigno.
Câncer Perda de O paciente foi injetado hepático; força física intramuscularmente uma um terço (atividade vez com 2 mg em dias Setembro de XX 48 de seu em uma alternados. 4 dias após a 2016- home Zhe ano fígado foi faixa primeira administração, o Janeiro de m ng s retirado, a limitada), paciente teve alívio no 2017 bile foi cansaço, sintoma de fadiga, força (vivo) removida, perda de física aumentada, e parou e o apetite. de tomar medicamentos.
paciente Poucos dias depois, o tomava paciente continuou a analgésico tomar medicamento, com s. sintoma de dor aliviado.
O paciente então desistiu de tomar analgésicos, e o apetite aumentou.
Acamado, perda da força física O paciente foi injetado Câncer de (o paciente intramuscularmente uma pulmão poderia vez com 2 mg em dias descoberto caminhar alternados. 15 dias após a em 2016, com uma primeira administração, o nenhum muleta e paciente teve alívio do tratamento suporte), Augusto de sintoma de fadiga, poderia 50 , tomou magro (50 2016- XX home caminhar para fora do ano apenas Catty), Outubro de Qi m pátio sem a muleta, com s fármacos fadiga, 2016 apetite aumentado, mas anti- perda de (morreu) não aliviou inflamatóri apetite, significativamente o fluido o e dispneia, pleural.
Febre (sem analgésico cerca de medição de temperatura) . metade de e diarreia ocorreram após um Catty administração. de fluido pleural por dia.
XX Mulh 63 Câncer de Metástase Pamica foi administrado Maio de
Zha er ano mama; s múltiplas uma vez em dias 2017-até o o s duas para alternados desde o início momento quimiotera pulmão, de maio de 2017, com (viva) pias após fígado, e administração por cirurgia. ossos, pulverização nasal em 3,6 náusea, mg toda vez.
A paciente anorexia não apresentou efeitos colaterais, dieta normal, e boa força física.
A paciente apresentou transaminase extremamente elevada antes de tomar Pamica e poderia não ser submetida à quimioterapia, mas apresentou transaminase normal após a administração, e recebeu a terceira quimioterapia.
Um mês depois, o hospital relatou que o câncer metastático do fígado reduziu de 7,5 cm×5,3 cm para 5,9 cm×3,5 cm.
Em 18 de julho, o hospital informou por telefone que o tumor do fígado reduziu para cerca de 5 cm, e a paciente se sentia como uma pessoa normal
(relatório de teste hospitalar). Metástase Pulverização nasal de óssea Pamica foi administrada múltipla por pulverização nasal sistêmica, uma vez em 3,6 mg em pneumonia dias alternados, desde 14 , embolia de novembro de 2017 (o pulmonar, peso do paciente é 90 kg). O paciente etc., Gefitinib foi tomado foi citoquerati oralmente em 1 diagnostic na 19, (isto comprimido/dia, ao ado com é, mesmo tempo.
Após 10 um câncer CYFRA21- dias, a dor desapareceu de pulmão Novembro 64 1) em 3,04 dia a dia.
Dolantina foi XX home avançado de 2017-até ano ng/mL, reduzida em 1 agulha/dia, Ji m em 13 de o momento s antígeno até a dolantina não ser novembro (vivo) carcinoem mais administrada, e a dor de 2017 briogênico desapareceu por Peking em 298,50 completamente.
O nível University ng/mL, e de antígeno Third linfadenect carcinoembrionário Hospital asia.
O (2017.12.1) foi 174,50 paciente ng/mL (298,50ng/mL sofria de antes da administração). dor nas Folha de relato de imagem costas, CT em 7 de dezembro de região das 2017: sombras de nódulos nádegas e múltiplos menores que 5 do mm em ambos os sacrococcí pulmões, lamelar geo.
Após aumentou a densidade da hospitaliza sombra no lobo inferior do ção, pulmão esquerdo, com dolantina delimitação clara, foi aberturas desobstruídas aumentand da traqueia e brônquios, e o dia após nenhuma linfadenectasia dia até 5 mediastinal.
Diagnóstico agulhas/di por imagem: sombras de a para nódulo pequeno em alívio da ambos os pulmões, dor, mas observação de não acompanhamento foi funcionou. recomendada, inflamação crônica no pulmão inferior esquerdo.
Faringalgia A faringe foi pulverizada , com Pamica, a faringalgia acompanh e tosse melhoraram 20 de ada de significativamente após novembro 73 tosse, algumas vezes, e XX Hom de 2017-22 ano Faringite expectoraç recuperou em cerca de 3 Lin em de s ão dias.
O paciente foi novembro amarela, liberado dos antibióticos de 2017 secreção que eram tomados no nasal passado e não apresentou purulenta nenhum efeito colateral.
[0276] A partir de muitos casos com câncer avançado, pode-se observar que o presente produto pode ser administrado através da pulverização nasal, além da via de administração injetada, e apresenta um efeito significativo em câncer metastático.
[0277] (1) Boa segurança, nenhum efeito colateral óbvio; formulação imune Pamica é um fármaco não citotóxico; (2) Efeitos colaterais reduzidos de radioterapia e quimioterapia: o número de glóbulos brancos e teor de proteína sérica aumentam; (3) Efeitos clínicos significativos: alívio da dor, apetite aumentado, força física aumentada, espírito alterando de pessimismo para otimismo, confidência, sobrevida global estendida por vários meses e por 13 meses para alguns cases; (4) Tamanho reduzido significativamente de câncer metastático, para 1/3- 1/2 para alguns casos. EXEMPLO TESTE 8: TESTES DE ESTABILIDADE
[0278] Após a produção dos complexos de Pamica da presente descrição ser concluída, estes foram armazenados em ambientes fechados no escuro, e as amostras foram testadas a cada 6 meses Injeção de ácido Item de poli-inosínico- Lote de Pamica P- Lote de Pamica P- teste policitidílica 20170801 20170801 injeção armazenar armazenar armazenar armazenar Condições armazenar em em em em em de um local frio e temperatura temperatura temperatura temperatura armazena escuro (não ambiente ambiente ambiente ambiente mento excedeu 20 °C) por 0 mês por 6 meses por 0 mês por 6 meses Caracterís solução solução solução solução solução clara tica clara clara clara clara Reação de fluorescência fluorescênci fluorescênci fluorescênci fluorescênci fluorescên crescente a crescente a crescente a crescente a crescente cia pH 6,8 6,66 6,51 6,85 6,48 Efeito hipercrômi 58,1 % 70,5 % 65,7 % 71,0 % 67,7 % co Peso 100 bp- 100 bp- 100 bp- 100 bp- 25 kD～500 kD molecular 1.500 bp 1.500 bp 1.500 bp 1.500 bp Teor 94,2 % 95,8 % 102,3 % 91,3 % 95,3 % Teste de esterilidad Qualificado Qualificado Qualificado Qualificado Qualificado e Endotoxin a ＞100 EU/mL ＜10 EU/mL ＜10 EU/mL ＜10 EU/mL ＜10 EU/mL bacteriana
[0279] Resultados: as amostras foram armazenadas em temperatura ambiente (a temperatura ambiente estava acima de 30 graus de agosto a setembro em Beijing) por 6 meses, e os índices de teste dos produtos não alteraram significativamente, indicando que os produtos foram relativamente estáveis; Pamica preparado em 1 mg/mL pode estabilizar por pelo menos 12 meses; Pamica preparado em 3mg/mL pode estabilizar por pelo menos 9 meses. O pH dos produtos é relativamente estável, e não altera significativamente por 3 anos. A endotoxina bacteriana de Pamica da presente descrição é menor que 10 EU/mL, enquanto a endotoxina bacteriana de injeção de ácido poli-inosínico-policitidílico é maior que 100 EU/mL. Como é de conhecimento de todos na técnica que a endotoxina bacteriana é o componente da parede celular de bactérias gram-negativas, uma bactéria liberará endotoxinas após sua morte ou autólise. Portanto, endotoxina bacteriana é amplamente encontrada na natureza. Por exemplo, a endotoxina contida em água corrente apresenta uma quantidade de 1 EU/mL a 100 EU/mL. Quando endotoxina bacteriana é introduzida no corpo humano através do trato digestivo, esta é inócua, mas quando a endotoxina entra no sangue através da injeção ou outras maneiras, pode causar diferentes doenças. Após uma pequena quantidade de endotoxina entrar no sangue, esta é inativada pelas células Kupffer do fígado e fica inócua para o corpo humano. Uma grande quantidade de endotoxina entrando no sangue causará uma reação febril, isto é, “reação pirogênica”. Portanto, a formulação tal como produtos biológicos, medicamentos de injeção, produtos químicos, produtos radiofarmacêuticos, antibióticos, vacinas, dialisados e similares, bem como equipamentos médicos (tais como seringas descartáveis, materiais biológicos implantáveis) devem ser verificados por meio de teste de endotoxina bacteriana para serem qualificados antes do uso. EXEMPLO EXPERIMENTAL 9 A DETERMINAÇÃO DE PAMICA QUE
PROMOVE A FUNÇÃO FAGOCÍTICA DE MACRÓFAGO
[0280] Local: Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences.
[0281] Método: coleção de macrófagos: 6 camundongos Kunming grau SPF de 20 g-25 g foram divididos aleatoriamente em 2 grupos, com 3 camundongos de cada grupo. Os camundongos foram imunizados com Pamica e PBS no dia 0, cada camundongo passou por gotejamento nasal em 200 μL. 2 horas depois, cada camundongo foi injetado com 5,0 % de células vermelhas do sangue de galinha em suspensão de salina 0,85 %. 4 horas depois, 3 camundongos em cada grupo de camundongos foram sacrificados por desarticulação. Após desinfecção, a pele foi cortada e tampão de Hanks foi injetado peritonealmente em 2,5 mL/camundongo, e o abdômen do camundongo foi esfregado suavemente para fazer com que o tampão de Hanks lave completamente os macrófagos na cavidade abdominal. A seguir, um pequeno orifício foi cortado no meio do peritônio, e cerca de 2 mL de líquido na cavidade abdominal foram sugados usando uma pipeta de 5 mL e colocados em um tubo de teste.
[0282] Gotejamento em lâmina: a loção peritoneal foi sugada assepticamente para fora do tubo de teste, e descartada em uma lâmina de vidro. A lâmina gotejada foi colocada horizontalmente em uma gaze úmida. A lâmina foi incubada em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C, por meia hora, e neste período; um grande número de macrófagos ficou aderido na lâmina de vidro. As células vermelhas do sangue de galinha, e outras células teciduais na lâmina de vidro, que não foram fagocitadas, foram lavadas com salina 0,85 %, a seguir a lâmina de vidro foi seca em ar frio.
[0283] Fixação e coloração de espécimes: os espécimes foram fixos com metanol por 5 minutos e corados com solução de coloração Giemsa-Wright. A coloração foi realizada de acordo com o método de coloração de Giemsa, e o tampão PBS usado foi ajustado em pH de 6,5. Os espécimes foram observados e calculados com uma lente de óleo de imersão após secar em ar frio.
[0284] Percentual de fagocitose: o total número de macrófagos que fagocita células vermelhas do sangue ÷ o total número de macrófagos × 100 %.
[0285] Índice de fagocitose: o número total de células vermelhas do sangue fagocitadas por macrófagos ÷ o número total de macrófagos que fagocita células vermelhas do sangue × 100 % (100 macrófagos foram observados em uma lente de óleo de imersão, e o valor, que é obtido contando os números de células vermelhas do sangue fagocitadas por cada macrófago, somando os números e dividindo a soma obtida por 100, é o índice fagocítico).
[0286] Resultados: no grupo controle de PBS, o percentual de fagocitose é 12 % e o índice de fagocitose foi 0,11; e no grupo Pamica, o percentual de fagocitose é 66 % e o índice de fagocitose é 1,2, indicando que Pamica apresenta um efeito de estímulo forte na função fagocítica do macrófago. a figura 16 mostra que células vermelhas do sangue são fagocitadas por macrófagos, e a figura 17 mostra que células vermelhas do sangue não são fagocitadas por macrófagos azuis (por setas). EXEMPLO EXPERIMENTAL 10 O TESTE DE PROTEÇÃO DE FORMULAÇÃO IMUNE DE MUCOSA EM GOTA NASAL DE PAMICA SOZINHO, CONTRA INFLUENZA, EM CAMUNDONGOS
[0287] Influenza vírus: influenza vírus subtipo A cepa FM1 adaptativa ao pulmão de camundongos, obtida do Institute of Viral Disease Prevention and Control, Chinese Academy of Preventive Medicine.
[0288] Ribavirina: fármaco controle positivo, obtido de Shenyang Yanfeng Pharmaceutical Factory.
[0289] Camundongos: espécie Kunming, os camundongos de 8 g～10 g foram usados para passagem de vírus FM1, e os camundongos de 14 g～20 g foram usados para os experimentos formais a seguir.
[0290] A pneumonia fatal pode ser causada por gotejamento nasal com uma suspensão de influenza vírus, cepa FM1 adaptativa ao pulmão de camundongo, em 5 LD50/camundongo. No teste, os camundongos foram infectados primeiro e a seguir administrados. O teste foi realizado em grupos de acordo com a tabela a seguir. % de Grupos Dosagem Taxa de X2 Valor de p morte influenza vírus cepa FM1 adaptativa ao pulmão de salina 89 camundongos Controle positivo de 0,07 g/kg/d 63 1,64 > 0,05 Ribavirina 0,1 Apenas gotas nasais da mL/camundong 43 3,88 < 0,05 presente descrição o
[0291] Os resultados experimentais mostraram que no teste de proteção em camundongos, as gotas nasais da presente descrição, através da via imune da mucosa, apresentam um melhor efeito anti-influenza não específico do que ribavirina, que é um fármaco antiviral reconhecido, e um efeito anti-influenza significativo mostrado por análise estatística. EXEMPLO EXPERIMENTAL 11 OS EFEITOS DE FORMULAÇÃO IMUNE DE MUCOSA PAMICA (GOTAS NASAIS) COMBINADA COM VACINA CONTRA INFLUENZA, ATRAVÉS DE IMUNIZAÇÃO POR MUCOSA NASAL E IMUNIZAÇÃO
POR INJEÇÃO SUBCUTÂNEA NO ANTICORPO HUMORAL IGA E NA TITULAÇÃO DE REPRODUÇÃO DO VÍRUS INFLUENZA, COMPARADO AO ADJUVANTE COMPLETO DE FREUND
[0292] O esquema experimental é da maneira a seguir: Influenza vírus: cepa de influenza vírus adaptativa ao pulmão de camundongos FM1 obtida do Institute of Viral Disease Prevention and Control, Chinese Academy of Preventive Medicine; Vacina contra influenza: vacina de influenza vírus fragmentado obtida de Hualan Biological Products Co., Ltd. Adjuvante completo de Freund: Shanghai Via-geneprobio Technologies Co. Ltd. Adjuvante imune de mucosa da presente descrição: de Xinfu (Beijing) Medical Technology Co., Ltd. Camundongo: espécie Kunming, os camundongos de 8 g～10 g foram usados para a passagem do vírus FM1, e os camundongos de 14 g～20 g foram usados para os experimentos formais a seguir.
[0293] Vacina com adjuvante completo de Freund contra influenza: em um tubo de centrífuga, vacina e adjuvante completo de Freund no mesmo volume foram adicionados de maneira homogênea e misturados em um vórtex para formar uma emulsão água-em-óleo.
[0294] Gotas nasais combinadas com vacina contra influenza da presente descrição: a vacina contra influenza e o adjuvante imune de mucosa da presente descrição foram misturados em quantidades iguais para formar um solvente aquoso.
[0295] Vacina contra influenza: A vacina contra influenza foi misturada com PBS em quantidades iguais para formar um solvente aquoso. MÉTODO DE IMUNIZAÇÃO:
[0296] Imunização por injeção subcutânea: camundongos foram injetados subcutaneamente no dia 0 e no 28º dia com 0,1 mL/camundongo no 42º dia, foi retirado sangue de alguns camundongos e o soro foi separado, para teste de titulação de anticorpo. Outros camundongos foram infectados pela suspensão de cepa de influenza vírus adaptativa ao pulmão de camundongos FM1 em 5 LD 50/gotejamento nasal. No 5º dia após infecção, a titulação do vírus do tecido pulmonar foi detectada.
[0297] Nasal imunização: camundongos foram imunizados em 0,1 mL/camundongo por gotejamento nasal no dia 0 e no 28º dia. No 42º dia, foi retirado sangue de alguns camundongos e o soro foi separado para teste de titulação de anticorpo. Outros camundongos foram infectados pela suspensão de cepa de influenza vírus adaptativa ao pulmão de camundongos FM1 em 5 LD 50/gotejamento nasal. No 5º dia após infecção, a titulação do vírus do tecido pulmonar foi detectada.
[0298] Os resultados experimentais de cada grupo são mostrados na tabela a seguir: Teste anti-influenza de formulação imune de mucosa combinada com vacina contra influenza por gotejamento nasal Índice de Titulação de Influenza Grupos anticorpo vírus após tratamento Imunização por injeção subcutânea: Vacina contra influenza 103,1 104 Vacina contra influenza com 105,5 103,5 adjuvante completo de Freund Gotas nasais da presente descrição combinadas com 104,5 102,0 vacina contra influenza Imunização por mucosa nasal: Vacina contra influenza 102,5 104,5 Gotas nasais da presente descrição combinadas com 104 <10 vacina contra influenza Controle do vírus FM1 105,0
[0299] O adjuvante completo de Freund é o padrão ouro para testar a promoção da imunidade celular do corpo. Os resultados do teste mostram que a imunização subcutânea da formulação imune de mucosa da presente descrição, combinada com vacina contra influenza, produz 10 vezes menos anticorpos que a vacina contra influenza com adjuvante completo de Freund produz, mas reduz a titulação de influenza vírus em 31,6 vezes em relação à vacina contra influenza com adjuvante completo de Freund; em particular, a imunização por mucosa nasal em camundongo mostra que a gota nasal da formulação imune de mucosa da presente descrição, combinada com o antígeno, produz 31,6 vezes mais anticorpos que a vacina simples contra influenza, e reduz a titulação de influenza vírus em mais de 3.100 vezes, o que apresenta efeitos extremamente significativos. EXEMPLO EXPERIMENTAL 12 PAMICA APRESENTA UM EFEITO EVIDENTE NO TESTE PRELIMINAR DO EXPERIMENTO EFEITO-ALVO DE
CÉLULA CIK
[0300] No teste realizado por Beijing Jingmeng Hi-Tech Stem Cell Technology Co., Ltd., a presente descrição apresenta um efeito evidente no teste preliminar do experimento efeito-alvo de célula CIK.
[0301] Número da amostra: JSCIK2016042614; data do teste: 26 de abril de 2016; data do relato: 28 de abril de 2016.
[0302] Processo de operação: cultivo e análise foram realizados de acordo com o experimento efeito-alvo de célula CIK convencional, o método experimental é da maneira mostrada em, por exemplo, (The Immunotherapeutic Antitumor Effect of Dendritic Cells Co-cultured with Cytokine Induced Killer Cells, Jie Zhuang et al., Chinese Journal of Cell Biology, 2007, 29; 237-240).
[0303] Célula alvo: Célula efetora A549: JSCIK2016042614 cultivada.
[0304] Conclusão: a capacidade de extermínio de células JSCIK2016042614 foi analisada de maneira compreensiva, em combinação com microscópio de fluorescência e detecção por leitor de microplacas, bem como o erro do próprio experimento e é média em 1:10 (quando a razão alvo-efeito foi 1:10, a taxa de extermínio na célula alvo A549 foi 51,4 %).
EXEMPLO EXPERIMENTAL 13 O EFEITO ANTICÂNCER DE
PREPARAÇÃO IMUNE DE MUCOSA PAMICA NO MODELO DE CÂNCER PULMONAR LL2 DE UM CAMUNDONGO QUE CARREGA TUMOR
[0305] O efeito antitumor de Pamica foi testado por pulverização nasal no modelo de tumor transplantado em camundongo LL2. As células tumorais neste modelo crescem rapidamente, com volume do tumor de 2.201,9 mm 3± 68,01 mm3 no 14º dia após a inoculação, e o experimento finalizou. Cisplatina como o controle positivo apresentou o melhor efeito na redução do tumor, seguido pelo grupo de injeção intramuscular de Pamica. Entretanto, em relação à pulverização nasal de Pamica, exceto para o grupo administrado em 0,1 mg/camundongo, cada grupo de pulverização nasal administrado em 0,2 mg/camundongo apresenta P<0,0001, comparado com o grupo veículo-controle negativo, mostrando uma diferença significativa. Especialmente, no mesmo modelo de camundongo registrado nos dados passados, camundongo tipo PD1 se mostra quase inválido. Como explicação, o grupo cisplatina é mais provável de mostrar eficiência neste modelo com divisão celular muito rápida. Em geral, Pamica apresenta um efeito notável em modelo de camundongo que carrega tumor como este, no novo mecanismo anticâncer. Além disso, nenhum efeito colateral foi observado neste modelo de camundongo.
[0306] Os grupos do experimento são mostrados na tabela a seguir: TV T/Cb Tratamento valor de p no dia 14 (%) Veículo 2201,09 ± 68,01 -- -- cisplatina (5 mg/kg) 637,79 ± 62,87 28,9 <0,0001 Pamica-1 (200 µg, administrado 1331,51 ± 60,4 <0,0001 imediatamente, gotejamento nasal) 139,21 Pamica-1 (200 µg, gotejamento nasal) 1163,83 ± 52,88 52,8 <0,0001 Pamica-1 (150 µg, gotejamento nasal) 1839,36 ± 83,57 83,5 0,0667 Pamica-1 (200 µg, injetado por via 929,69 ± 109,95 41,7 <0,0001 intramuscular)
Pamica-1 + cisplatina(200 µg+5 mg/kg, 799,63 ± 82,86 36,3 <0,0001 gotejamento nasal + I,V)
[0307] Os resultados experimentais específicos são mostrados nas figuras18~21.
[0308] Neste experimento, as células apresentaram uma taxa de formação de tumor elevada, e o tumor no grupo de veículo controle cresceu rapidamente, com um volume de tumor de 2.201,09 mm3 ± 68,01 mm3 no final do experimento. No grupo controle positivo, cisplatina mostrou efeito de inibição de tumor óbvio, indicando que este experimento é satisfatório e os resultados são confiáveis.
[0309] Os resultados do teste mostram que neste estudo para o modelo de tumor transplantado em camundongo, de camundongo C57BL/6 com célula LL2 de câncer de tumor, com exceção para o grupo administrado com Pamica em 150 μg/camundongo, os grupos mostram efeito significativo da inibição de crescimento de tumor, independentemente de gotejamento nasal ou administração intramuscular, e a determinação estatística mostra que existem diferenças extremamente significativas com P<0,0001; ao mesmo tempo, nenhum efeito tóxico e colateral óbvio é exibido em camundongos que carregam tumor.
[0310] Dados prévios de Huiyuan Biotech mostraram que o anticorpo PD-1 de murino é relativamente menos eficiente no modelo LL2 (taxa de inibição do tumor é menor que 10 %). Pamica, que também atua no sistema imune, apresenta melhor efeito do que aquele do anticorpo PD-1. Em geral, acredita-se que a eficácia antitumor de anticorpo PD-1 depende do nível de expressão de PD-L1 em células tumorais, ou está relacionada à carga de mutação, alta instabilidade de microssatélite (MSI-H) ou defeitos no reparo de incompatibilidade (dMMR), que por sua vez afeta o efeito de fármaco deste. Como um adjuvante imune, Pamica apresenta efeito de inibição de tumor em uma faixa mais ampla do que aquela de pontos de controle imunológico, mostrando grande perspectiva de desenvolvimento. EXEMPLO EXPERIMENTAL 14 ESTUDO DE EFEITO ANTITUMOR IN VIVO DE PAMICA NO MODELO DE CAMUNDONGO 4T1-LUC DE CÂNCER DE
MAMA IN SITU
[0311] Este experimento farmacodinâmico foi realizado para 9 grupos: grupo veículo, grupo PD1, 6 grupos de tratamento com Pamica, e grupo de administração de Pamica combinada com PD1. O grupo veículo foi administrado por gotejamento nasal com solução de PBS em 66,7 μL/camundongo no 16º dia após inoculação, uma vez a cada dois dias; grupo PD1 foi injetado intraperitonealmente com solução de PD1 em 100 μg/camundongo no 16º dia após inoculação, uma vez por semana; 6 grupos de tratamento com Pamica foram administrados respectivamente da maneira a seguir: um grupo foi administrado por gotejamento nasal com Pamica em 200 μg/camundongo, 7 dias antes da inoculação, uma vez a cada dois dias; um grupo foi administrado por gotejamento nasal com Pamica em 200 μg/camundongo no dia da inoculação, uma vez a cada dois dias; um grupo foi administrado por gotejamento nasal com Pamica em 200 μg/camundongo no 16º dia após inoculação, uma vez a cada dois dias; um grupo foi administrado por gotejamento nasal com Pamica em 300 μg/camundongo no 16º dia após inoculação, uma vez a cada dois dias; um grupo foi administrado intramuscularmente com Pamica em 200 μg/camundongo no 16º dia após inoculação, uma vez a cada dois dias; e um grupo foi administrado intramuscularmente com Pamica em 300 μg/camundongo no 16º dia após inoculação, uma vez a cada dois dias; o grupo de administração de Pamica combinada com PD1 foi administrado por gotejamento nasal com Pamica em 200 μg/camundongo no 16º dia após inoculação, uma vez a cada dois dias + injetado intraperitonealmente com Pamica em 100 μg/camundongo no 16º dia após inoculação, uma vez por semana. Camundongos Balb/c fêmeas foram usados no experimento, avaliados em relação ao volume do tumor a cada três dias, e pesados em relação ao peso corporal a cada dois dias. O experimento foi finalizado quando o volume médio do tumor do grupo veículo controle excedeu 2.000 mm3, e a bioluminescência do tumor foi medida pelo formador de imagem in vivo de animal pequeno. Finalmente, os órgãos de camundongos em cada grupo foram retirados para coloração com HE.
[0312] Os resultados do teste farmacodinâmico mostraram que o grupo avançado no dia 7 e o grupo no dia 0 apresentaram capacidades relativamente fracas de inibir o crescimento e metástase de tumor, e o dois grupos de injeção intramuscular de Pamica apresentaram um efeito de inibição mais forte no crescimento e metástase de tumor do que aquele dos dois grupos de gotejamento nasal de Pamica. Exceto para o grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo, o grupo de gotejamento nasal de Pamica com 300 μg/camundongo, o grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo e o grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo, todos podem inibir significativamente o crescimento e metástase de tumor. No final do experimento, as taxas de inibição do tumor do grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo e do grupo de gotejamento nasal de Pamica com 300 μg/camundongo foram 25 % e 35 %, respectivamente. As taxas de inibição do tumor do grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo e do grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo foram 56 % e 61 %, respectivamente.
[0313] Os resultados anteriores indicam que Pamica apresenta um bom efeito em inibir o crescimento e metástase de tumor em câncer de mama 4T1.
[0314] O processo experimental e resultados experimentais são descritos em detalhe a seguir.
1. MÉTODO EXPERIMENTAL
1.1 CONSTRUÇÃO DE MODELO DE CAMUNDONGO 4T1-LUC DE
CÂNCER DE MAMA IN SITU
[0315] Os camundongos Balb/c fêmeas foram obtidos, células de câncer de mama 4T1-luc na fase de crescimento logarítmica foram selecionadas e inoculadas na quarta glândula mamária de camundongos Balb/c em uma quantidade de 1×10 5 células/0,2 mL/camundongo para construir o modelo de camundongo que carrega tumor in situ. O volume da massa do tumor foi medido dinamicamente com calibrador de vernier. O volume do tumor é calculado de acordo com a seguinte fórmula: V=0,5×L×D2 (em que V é o volume do tumor, L é o diâmetro longo do tumor, e D é o diâmetro curto do tumor).
1.2 AJUSTE DE TEMPO DE ADMINISTRAÇÃO
[0316] Para o grupo de gotejamento nasal de Pamica administrado 7 dias antes da inoculação (referido como o grupo avançado no dia 7), 10 camundongos foram selecionados aleatoriamente 7 dias antes da inoculação do tumor, e foram administrados de acordo com a tabela 1; Para o grupo de gotejamento nasal de Pamica administrado no dia 0 de inoculação (referido como o grupo no dia 0), 10 camundongos foram selecionados aleatoriamente no dia da inoculação do tumor, e foram administrados de acordo com a tabela 1; Para o grupo veículo, quando o volume do tumor cresceu em cerca de 80 mm3, isto é, no 16º dia após a inoculação do tumor, a administração começou de acordo com a tabela 1.
[0317] Para o grupo PD1, quando o volume do tumor cresceu em cerca de 80 mm3, isto é, no 16º dia após a inoculação do tumor, a administração começou de acordo com a tabela 1.
[0318] Para o grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo, quando o volume do tumor cresceu em cerca de 80 mm 3, isto é, no 16º dia após a inoculação do tumor, a administração começou de acordo com a tabela 1.
[0319] Para o grupo de gotejamento nasal de Pamica com 300 μg/camundongo, quando o volume do tumor cresceu em cerca de 80 mm 3, isto é, no 16º dia após a inoculação do tumor, a administração começou de acordo com a tabela 1.
[0320] Para o grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo, quando o volume do tumor cresceu em cerca de 80 mm 3, isto é, no 16º dia após a inoculação do tumor, a administração começou de acordo com a tabela 1.
[0321] Para o grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo, quando o volume do tumor cresceu em cerca de 80 mm 3, isto é, no 16º dia após a inoculação do tumor, a administração começou de acordo com a tabela 1.
[0322] Tabela 1 Dosagem experimental e grupos Amostra de Anima Via de administração Dosagem Intervalo de teste l administraçã o uma vez a 1 veículo 16 gotejamento nasal 66,7 μL cada dois dias
100 uma vez por 2 PD1 16 intraperitoneal μg/camund semana ongo gotejamento nasal 200 uma vez a 3 Pamica 16 (administrado no 16º dia μg/camund cada dois após inoculação) ongo dias gotejamento nasal 300 uma vez a 4 Pamica 16 (administrado no 16º dia μg/camund cada dois após inoculação) ongo dias injeção intramuscular 200 uma vez a 5 Pamica 16 (administrado no 16º dia μg/camund cada dois após inoculação) ongo dias injeção intramuscular 300 uma vez a 6 Pamica 16 (administrado no 16º dia μg/camund cada dois após inoculação) ongo dias gotejamento nasal 200 uma vez a 7 Pamica 10 (administrado 7 dias μg/camund cada dois antes da inoculação) ongo dias gotejamento nasal 200 uma vez a 8 Pamica 10 (administrado 0 dia após μg/camund cada dois inoculação) ongo dias
200 uma vez a μg/camund cada dois Pamica + gotejamento nasal + 9 10 ongo + 100 dias + uma PD1 intraperitoneal μg/camund vez por ongo semana
1.3 FINALIZAÇÃO EXPERIMENTAL
[0323] O experimento na íntegra foi finalizado no 30º dia após a administração, em decorrência do volume do tumor ter excedido 2.000 mm 3.
1.4 OBSERVAÇÃO DE ÍNDICE
[0324] O volume do tumor foi avaliado em relação ao volume a cada três dias, e os camundongos foram pesados a cada dois dias. No final do experimento, o coração, fígado, baço, pulmão, rim e tumor foram separados. O coração, fígado, baço e rim foram fixos com 4 % de formaldeído neutro, a seguir seccionados em parafina e analisados por coloração com HE; o tumor foi fotografado e pesado; o pulmão foi fixo com fixador Bouin por 16 horas, imerso em álcool 50 % por 2 horas, fotografado, fixo com formaldeído neutro 4 %, seccionado com parafina e analisado por coloração com HE.
1.5 FORMADOR DE IMAGEM DE ANIMAL PEQUENO IN VIVO
[0325] No final da administração, os camundongos foram administrados intraperitonealmente com 100 μL de Luciferina, em uma concentração de 30 mg/mL como o substrato fluoresceína, e anestesiados com isoflurano. Após 17 minutos, os camundongos foram fixos em um formador de imagem de animal pequeno in vivo para observar a bioluminescência. Os parâmetros de aquisição de imagem são da maneira a seguir: tempo de aquisição: 0,2 segundos; valor Bin: 4; e valor F: 2. Software de processamento de imagem: software Living Image® (versão 4.3.1; Caliper Life Sciences Inc.).
2. ANÁLISE ESTATÍSTICA
[0326] Os dados experimentais são todos expressos como “média ± desvio padrão”, e o software SPSS Statistics 19 (versão 4.0,100,1124; SPSS Inc., IBM Company, Estados Unidos) foi usado para análise de dados. Análise de variância ANOVA de um fator foi usada para comparação de dados, e o teste t foi usado para diferenças significativas entre os grupos: * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001.
3. RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
3.1 VOLUME DO TUMOR
[0327] As curvas de alterações de volume do tumor são mostradas na a figura 22. Tabela 2 Resultados do teste t de volume do tumor 6 dias 12 dias 18 dias 24 dias 30 dias Grupo avançado ** no dia 7 Grupo no dia 0 ** * PD1 ** —— —— gotejamento nasal ** ** * de Pamica com 200 μg/camundongo gotejamento nasal ** * ** * de Pamica com 300 μg/camundongo injeção ** *** * *** *** intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo injeção *** *** *** *** *** intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo gotejamento nasal * ** *** —— —— de Pamica com 200 μg/camundongo + PD1 Nota: Barra de erro indica SD; —— indica sem dados *: indica p<0,05 comparado com o grupo veículo; **: indica p<0,01 comparado com o grupo veículo; ***: indica p<0,001 comparado com o grupo veículo.
[0328] Pode ser observado a partir de a figura 22 e tabela 2 que os efeitos que inibem o tumor do grupo avançado no dia 7 e do grupo no dia 0 são relativamente fracos, e os dois grupos de injeção intramuscular apresentam melhores efeitos de inibição do tumor do que os dois grupos de gotejamento nasal. Os resultados específicos são da maneira a seguir.
[0329] O grupo avançado no dia 7 com Pamica e grupo no dia 0 apresentam certos efeitos de inibição de tumor no estágio posterior, e basicamente nenhum efeito na inibição do tumor no estágio inicial, indicando que a administração avançada ou administração imediata não apresenta nenhum efeito de extermínio do tumor, e provando lateralmente que Pamica é uma vacina para tratamento de tumor, não uma vacina preventiva. No final do experimento, a taxa de inibição dos tumores do grupo avançado no dia 7 e grupo no dia 0 foram 36 % e 26 %, respectivamente.
[0330] Os volumes de tumor do grupo PD1 no 12º dia foram significativamente diferentes daqueles do grupo veículo (**p<0,01), indicando que PD1 apresenta um certo efeito de inibição em câncer de mama 4T1 camundongo.
[0331] Em cada grupo de tratamento do PD1 combinado com grupos de administração de Pamica, a maioria dos camundongos morreu no 20º dia após a administração, assim não houve nenhum dado a partir da última avaliação para os dois grupos. Entre estes, os volumes do tumor dos grupos de administração combinada no 6º, 12º e 18º dia foram significativamente diferentes daqueles do grupo veículo (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, respectivamente).
[0332] O grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo apresentou um efeito de inibição significativo no estágio inicial de administração, e um efeito de inibição do tumor gradualmente enfraquecido no estágio posterior de administração. Os volumes do tumor no 6º e 12º dia foram significativamente diferentes daqueles do grupo veículo (**p<0,01). Exceto para o 18º dia, os volumes do tumor do grupo de gotejamento nasal de Pamica com 300 μg/camundongo foram significativamente diferentes daqueles de grupo veículo em outros momentos. Mostra que a administração por gotejamento nasal é eficiente e o efeito de inibição do tumor é dependente da dosagem. No final do experimento, as taxas de inibição do tumor do grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo e do grupo de gotejamento nasal de Pamica com 300 μg/camundongo foram 25 % e 35 %, respectivamente.
[0333] Os efeitos de inibição do tumor dos dois grupos de dosagem de injeção intramuscular de Pamica foram similares durante o processo completo de administração, e foram significativamente diferentes daqueles do grupo veículo, e o efeito de inibição do tumor dos dois grupos de injeção intramuscular foram melhores que aqueles dos dois grupos de gotejamento nasal. No final do experimento, as taxas de inibição do tumor do grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo e do grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo foram 56 % e 61 %, respectivamente.
3.2 PESO CORPORAL
[0334] As curvas do alterações de peso corporal de camundongos são mostradas em a figura 23. Tabela 3 Resultados estatísticos do teste t de peso corporal de camundongos em cada grupo e grupo veículo 0 dia 2 dias 4 dias 6 dias 8 dias 10 12 14 dias dias dias grupo avançado no ** ** ** ** *** ** ** *** dia 7 grupo no dia 0 *** *** ** ** ** ** ** *** PD1 gotejamento nasal * * ** ** *** *** *** de Pamica com 200 μg/camundongo gotejamento nasal ** *** *** ** *** *** *** de Pamica com 300 μg/camundongo injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo injeção ** * intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo gotejamento nasal * ** ** ** *** de Pamica com 200 μg/camundongo + PD1
16 18 20 22 24 26 28 30 dias dias dias dias dias dias dias dias grupo avançado no *** *** * * * * dia 7 grupo no dia 0 *** ** ** ** * PD1 —— —— —— —— —— gotejamento nasal *** *** *** ** * *
de Pamica com 200 μg/camundongo gotejamento nasal *** ** ** ** ** ** * de Pamica com 300 μg/camundongo injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo injeção intramuscular * * * de Pamica com 300 μg/camundongo gotejamento nasal —— —— —— —— —— de Pamica com 200 μg/camundongo + PD1 Nota: Barra de erro indica SD; —— indica sem dados *: indica p<0,05 comparado com o grupo veículo; **: indica p<0,01 comparado com o grupo veículo; ***: indica p<0,001 comparado com o grupo veículo.
[0335] Pode ser observado a partir de a figura 23 e Tabela 3 que os pesos corporais dos camundongos no PD1 e grupos de administração combinada não foram significativamente diferentes daqueles do grupo veículo durante o tempo de avaliação eficiente, indicando que os efeitos colaterais destes são menores. Exceto no estágio posterior de administração, os pesos corporais do grupo avançado no dia 7, grupo no dia 0, grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo, e grupo de gotejamento nasal de Pamica com 300 μg/camundongo, foram significativamente menores que aqueles do grupo veículo em outros momentos. Não houve nenhuma diferença significativa entre o grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo e o grupo veículo durante todo o período de administração. O peso corporal do grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo foi menor que aquele do grupo veículo no estágio médio de administração, e não foi significativamente diferente do grupo veículo no estágio inicial e estágio posterior de administração.
[0336] Os resultados anteriores indicam que a injeção intramuscular apresentou pouco efeito no peso corporal de camundongos, e apresentou menos efeito colateral, e a administração intranasal apresenta certo efeito colateral em camundongos.
3.3 PESO DO TUMOR, PESO DO BAÇO E FOTOS DO TUMOR
[0337] Pode ser observado a partir de a figura 24 e a figura 25 que não houve nenhuma diferença significativa no peso do tumor entre o grupo avançado no dia 7 ou o grupo no dia 0 comparado com o grupo controle, e os dois grupos de injeção intramuscular de Pamica apresentaram um efeito de inibição mais forte no crescimento de tumor que os dois grupos de gotejamento nasal de Pamica. Exceto para o grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo, o grupo de gotejamento nasal de Pamica com 300 μg/camundongo, o grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo e o grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo podem todos inibir significativamente o crescimento de tumor, com diferença estatística comparada com o grupo veículo (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, respectivamente).
[0338] O baço é o maior órgão imune do corpo, representando 25 % do tecido linfático total do corpo, contém um grande número de linfócitos e macrófagos, e é o centro da imunidade celular e imunidade humoral de corpo. Pode ser observado a partir de a figura 26 que os pesos do baço do grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo e do grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo foram significativamente maiores que do grupo veículo, com diferenças estatísticas (**p<0,01, *p<0,05, respectivamente), indicando que a resposta imune do grupo de injeção intramuscular pode ser mais forte.
3.4 FOTOS DO PULMÃO
[0339] Pode ser observado a partir de a figura 27 e a figura 28 que existem muitos nódulos de tumor branco na superfície do tecido pulmonar no grupo veículo, no grupo avançado no dia 7, e no grupo no dia 0, indicando que o grupo avançado no dia 7 e o grupo no dia 0 basicamente não apresentam nenhum efeito na inibição da metástase pulmonar de 4T1. Existem nódulos menores na superfície do tecido pulmonar do grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo e grupo de gotejamento nasal de Pamica com 300 μg/camundongo, o grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo e grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo apresentam menos nódulos na superfície do tecido pulmonar, indicando que os dois grupos de gotejamento nasal e os dois grupos de injeção intramuscular podem inibir eficientemente a metástase pulmonar de 4T1, e o grupo de injeção intramuscular apresenta uma capacidade mais forte de inibir a metástase pulmonar de 4T1 do que aquela do grupo de gotejamento nasal.
3.5 FORMADOR DE IMAGEM DE ANIMAL PEQUENO
[0340] Pode ser observado a partir de a figura 29-a figura que as intensidades de bioluminescência dos sítios de tumor e metástases do grupo veículo, grupo avançado no dia 7, e grupo no dia 0 são mais fortes. As intensidades de bioluminescência do sítio do tumor e metástase no grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo e o de Pamica com 300 μg/camundongo foram enfraquecidas, e as intensidades de bioluminescência dos sítios de tumor e metástase no grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo e grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo foram as mais fracas, indicando que o grupo de injeção intramuscular apresenta uma capacidade mais forte de inibir o crescimento e metástase de câncer de mama 4T1 doque aquela do grupo de gotejamento nasal, o que é consistente com os resultados anteriores.
4. CONCLUSÃO
[0341] Neste experimento, foi estabelecido satisfatoriamente um modelo de camundongo 4T1-luc de câncer de mama in situ. O tumor cresceu rapidamente, e o volume do tumor excedeu 2.000 mm3 no final do experimento.
[0342] Os resultados do teste mostram que neste estudo do modelo de tumor ortotópico de camundongo Balb/c com célula 4T1-luc de câncer de mama de camundongo, exceto para aquele no PD1 e do grupo de administração combinada, um grande número de camundongos morreu em virtude de PD1, assim apenas parte dos dados experimentais foram obtidos, os outros de cada grupo apresentaram todos um certo efeito de inibição do tumor em um certo período de time.
O grupo avançado no dia 7, grupo no dia 0 e grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo não apresentaram nenhum efeito de inibição de tumor óbvio, grupo de gotejamento nasal de Pamica com 200 μg/camundongo, grupo de injeção intramuscular de Pamica com 200 μg/camundongo e grupo de injeção intramuscular de Pamica com 300 μg/camundongo apresentaram todos os efeitos de inibição de tumor óbvios.
EXEMPLO EXPERIMENTAL 15 O USO DE PAMICA NO TRATAMENTO DE PACIENTES INFECTADOS COM PAPILOMA VÍRUS HUMANO (HPV) Após Tempo de Nome (gênero, Antes da Método de administraçã administraç idade) administração administração o ão Zhang X (mulher, Alto risco de pulverização Alto risco de 2017-08-09 28 anos) infecção por administrada papiloma a 2018-01- papiloma vírus uma vez em vírus humano 05 humano (positivo- dias HPV16 se infecção por alternados, 2,4 torna HPV16) mg de toda vez negativo XX Zhang Alto risco de pulverização Alto risco de 2017-11-04 (mulher, 30 anos) infecção por administrada papiloma a 2018-01- papiloma vírus uma vez em vírus humano 25 humano (positivo- dias HPV18 se HPV18 infecção) alternados, 2,4 torna mg de toda vez negativo XX Qu (mulher, Alto risco de pulverização Alto risco de 2017-10-23 34 anos) infecção por administrada papiloma a 2018-01-
papiloma vírus uma vez em vírus humano 13 humano (positivo- dias HPV18 se HPV18 infecção) alternados, 2,4 torna mg de toda vez negativo EXEMPLO EXPERIMENTAL 16 O USO DE PAMICA NO TRATAMENTO
DE CÂNCER DE MAMA
1. FÁRMACOS DE CONTROLE POSITIVO:
[0343] PD1, injeção de paclitaxel
2. CONSTRUÇÃO DE UM MODELO ANIMAL DE CÂNCER DE MAMA ORTOTÓPICO DE CAMUNDONGO QUE CARREGA 4T1
[0344] Os camundongos Balb/c fêmeas foram obtidos; células de câncer de mama 4T1-luc na fase de crescimento logarítmica foram selecionadas e inoculadas em uma quantidade de 1×105 células/0,2 mL/camundongo na quarta glândula mamária de camundongos BALB/c para construir um modelo de camundongo que carrega tumor ortotópico. O volume da massa do tumor foi medido dinamicamente com calibrador de vernier. O volume do tumor é calculado de acordo com a seguinte fórmula: V=0,5×L×D2 (onde V é o volume do tumor, L é o diâmetro longo do tumor, e D é o diâmetro curto do tumor).
3. INFLUÊNCIA NO CRESCIMENTO E METÁSTASE ESPONTÂNEA DE CÂNCER DE MAMA 4T1 IN SITU
3.1 CONFIGURAÇÃO DE GRUPO E REGIME DE DOSAGEM ① para o grupo PBS, poucos dias após a inoculação do tumor, PBS foi administrado por gotejamento nasal, 100 μL/camundongo, uma vez em dias alternados; ② para o grupo PD1, poucos dias após a inoculação do tumor, PD1 foi administrado intraperitonealmente, 100 μg/camundongo, uma vez por semana; ③ para o grupo paclitaxel, poucos dias após a inoculação do tumor, paclitaxel foi administrado por injeção na veia caudal, 10 mg/kg, uma vez por semana; ④ para o grupo de gotejamento nasal de Pamica, poucos dias após a inoculação do tumor, Pamica foi administrado por gotejamento nasal, 100 μL (0,3 mg)/camundongo, uma vez em dias alternados, com 50 μL de gotejamento nasal na manhã no dia de administração, e 50 μL de gotejamento nasal no período da tarde; ⑤ para o grupo de injeção intramuscular de Pamica, poucos dias após a inoculação do tumor, Pamica foi injetado intramuscularmente, 100 μL (0,3 mg)/camundongo, administrado uma vez em dias alternados; ⑥ para o grupo de administração combinada, poucos dias após a inoculação do tumor, PD1 intraperitoneal (100 μg/camundongo, administrado uma vez por semana) + gotejamento nasal de Pamica (100 μL/camundongo, administrado uma vez em dias alternados); ⑦ para o grupo de administração combinada, poucos dias após a inoculação do tumor, injeção na veia caudal de paclitaxel (10 mg/kg, administrado uma vez por semana) + gotejamento nasal de Pamica (100 μL/camundongo, administrado uma vez em dias alternados).
[0345] 3.2 Número de animais em cada grupo: 15 animais em cada grupo (existem 5 animais redundantes em cada grupo).
[0346] 3.3 Tempo para finalizar o experimento: de acordo com a situação atual (o camundongo morreu, ou a diferença entre o grupo de administração e o grupo controle é óbvia), o experimento pode finalizar precocemente.
3.4 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
[0347] O modelo de câncer de mama 4T1-luc in situ foi estabelecido, e o formador de imagem de animal pequeno in vivo foi usado para detecção precoce e agrupamento. A administração foi realizada de acordo com o conjunto de grupo e regime de dosagem no item 6.1. O volume do tumor (medido uma vez a cada 3 dias), alteração de peso (medido uma vez a cada 3 dias), peso do tumor (detectado no final), peso do baço (detectado no final), coloração de TUNEL (detectada no final) foram medidos. O pulmão foi fixo com fixador de Bouin, e a seguir foi fotografado. Cada tecido e órgão foi fixo com formaldeído neutro, a seguir corado com H&E (detectado no final), e a intensidade de bioluminescência de tumor in situ e metástase em diferentes pontos de tempo, e pontos de tempo final, foi observada por um formador de imagem de animal pequeno in vivo. Os efeitos de inibir o crescimento e metástase de tumor in situ entre cada grupo foram comparados de maneira compreensiva.
[0348] Os experimentos provaram que Pamica apresenta efeitos óbvios na redução do volume do tumor de câncer de mama, controlando peso do tumor e peso do baço, e promovendo apoptose de célula tumoral e outros aspectos.
[0349] Finalmente, deve-se observar que as modalidades anteriores são pretendidas apenas para ilustração, mas não se limitam às soluções técnicas da presente descrição; embora a presente descrição tenha sido descrita em detalhes com referência aos exemplos supracitados, os versados na técnica devem entender que ainda é possível realizar modificações nas soluções técnicas citadas nos exemplos supracitados, ou realizar substituições equivalentes a algumas ou todas as características técnicas; e estas modificações ou substituições não fazem a essência das soluções técnicas correspondentes desviar do escopo das soluções técnicas dos exemplos da presente descrição.
UTILIDADE INDUSTRIAL
[0350] A presente descrição descreve um complexo para potencializar uma resposta imune. Comparado à técnica prévia, o complexo apresenta viscosidade moderada e peso molecular, e é conveniente usar em aplicação farmacêutica; apresenta propriedades químicas estáveis, e é dificilmente degradado no armazenamento a longo prazo e seguro para uso. O complexo, se usado sozinho, pode potencializar significativamente a resposta imune não específica do corpo, e atingir o propósito de prevenir e tratar doenças, e se usado em combinação com outros fármacos, apresenta melhor eficácia antitumor, antiviral e anti(super) bactérias, e é facilmente absorvido por pacientes.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES
1. Produto combinado para potencializar uma resposta imune, caracterizado por compreender um ácido poli-inosínico-policitidílico, pelo menos um estabilizador catiônico, e um sal de cálcio solúvel em um sistema de reação líquido; o estabilizador catiônico ser um composto amino não antibiótico solúvel em água com um peso molecular menor que ou igual a 5 kDa, ou um enxerto formado pelo composto amino não antibiótico solúvel em água e um ou mais de metoxipolietileno glicol, polietileno glicol, polietilenimina, ácido fólico e galactose; opcionalmente, o composto amino não antibiótico solúvel em água ser um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em oligossacarídeos de quitosana, quito-oligossacarídeos, glicosaminas, lipossomas catiônicos, DEAE- dextrano, poliacrilamida, poliaminas, tetra-aminofulveno e polietilenoimina; opcionalmente, o estabilizador catiônico ser selecionado a partir do grupo que consiste em um oligossacarídeo de quitosana, um enxerto de oligossacarídeo de quitosana e metoxipolietileno glicol, e um enxerto de oligossacarídeo de quitosana, metoxipolietileno glicol e polietilenoimina; opcionalmente, o enxerto apresentar um peso molecular menor que ou igual a 50 kDa; opcionalmente, o oligossacarídeo de quitosana apresentar um grau de desacetilação que é maior que ou igual a 70 %; opcionalmente, o sal de cálcio solúvel ser CaCl2 e/ou CaNO3; opcionalmente, o ácido poli-inosínico-policitidílico apresentar um peso molecular de 100 bp-3000 bp; opcionalmente, o ácido poli-inosínico-policitidílico apresentar um peso molecular de 100 bp-1500 bp; opcionalmente, o produto combinado compreender adicionalmente um ou mais de um ajustador de pH, tripolifosfato de sódio, alginato de sódio, ácido fenilborônico, catecol, sal/reagente tampão e água.
2. Complexo para potencializar uma resposta imune, caracterizado por ser preparado a partir de reagentes no produto combinado de acordo com a reivindicação 1.
3. Complexo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a preparação ser realizada em um sistema de solução, e nos reagentes, o ácido poli- inosínico-policitidílico apresentar uma concentração de 0,1 mg/mL ~ 10 mg/mL; opcionalmente, a concentração do ácido poli-inosínico-policitidílico ser 0,5 mg/mL ~ 5 mg/mL; opcionalmente, preparação ser realizada em um sistema de solução, e nos reagentes, o estabilizador catiônico apresentar uma concentração de 0,5 mg/mL ~ 51,2 mg/mL; opcionalmente, a concentração do estabilizador catiônico ser 0,8 mg/mL ~ 25,6 mg/mL; opcionalmente, preparação ser realizada em um sistema de solução, e nos reagentes, a concentração de íons cálcio no sal de cálcio solúvel ser 0,1 mM ~ 1 mM.
4. Complexo, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por o complexo ser armazenado em uma solução; opcionalmente, a solução ser uma solução tampão; opcionalmente, a solução apresentar um pH em uma faixa de 5,0 ~ 7,2; opcionalmente, a solução apresentar um pH em uma faixa de 5,9 ~ 6,9.
5. Uso não terapêutico do complexo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado por ser como um adjuvante imune.
6. Uso do complexo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado por ser para preparar um anticorpo, uma formulação de vacina ou uma composição de vacina, ou para preparar um excipiente de vacina ou um adjuvante de vacina.
7. Composição de vacina, caracterizada por compreender o complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, e pelo menos um antígeno; opcionalmente, o antígeno ser um vírus, uma bactéria, uma proteína, um polipeptídeo, um polissacarídeo, um ácido nucleico, ou um conjugado proteína-
molécula pequeno.
8. Uso do complexo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado por ser na regulação da atividade de célula imune, em que o uso é aplicado in vivo ou in vitro; opcionalmente, a atividade de regulação de célula imune ser especificamente potencializar a atividade de célula imune; opcionalmente, a célula imune ser selecionada de macrófagos, linfócitos, e células dendríticas; opcionalmente, regular e potencializar atividade de célula imune ser promover célula imune que libera fatores inflamatórios; opcionalmente, os fatores inflamatórios incluírem IL-2, IL-6, IL-12p40, IL- 18, IL-22, IFN-α, IFN-γ, e TNF-α.
9. Uso do complexo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado por ser na preparação de fármacos para tratar e/prevenir tumores, antivírus, antibacterianos, antifungos, antiparasitários, reduzir efeitos colaterais de quimioterapia, resistir à fadiga ou melhorar a imunidade, aliviar dor nos hospedeiros, e promover uma resposta imune a um antígeno em um hospedeiro; opcionalmente, o fármaco ser uma forma de dosagem de administração de injeção, uma forma de dosagem de administração respiratória, gotas nasais, uma forma de dosagem de administração na pele, uma forma de dosagem de administração em mucosa, ou uma forma de dosagem de administração cavitária; opcionalmente, o antígeno incluir o antígeno de um tumor, um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita; opcionalmente, o hospedeiro ser um mamífero; opcionalmente, o hospedeiro ser um primata; opcionalmente, o hospedeiro ser humano; opcionalmente, quando o antígeno for o antígeno de um vírus, uma bactéria, um fungo, ou um parasita, o fármaco apresentar uma quantidade em uma faixa de 1 mg ~ 8 mg por dose;
quando o antígeno for um antígeno de tumor, o fármaco apresentar uma quantidade em uma faixa de 1 mg ~ 10 mg por dose.
10. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, em que a composição farmacêutica compreende o complexo da maneira descrita anteriormente, e a composição farmacêutica compreende adicionalmente um ou mais de um fármaco de terapia de célula imune, um fármaco de terapia de anticorpo, um fármaco químico, uma substância que promove a absorção imune de mucosa ou a adesão de mucosa, um imunomodulador, um antígeno de patógeno, um ligante do receptor de reconhecimento padrão, e um sal ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o fármaco de terapia de célula imune ser um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), células dendríticas (DCs), células exterminadoras induzidas por citocinas (CIKs), células dendríticas-células exterminadoras induzidas por citocinas (DCs-CIKs), células exterminadoras naturais (NKs), células γδT, CD3AK, CAR-T e TCR-T.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada por o fármaco terapêutico de anticorpo ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PDL1, um anticorpo anti-CTLA4 e um anticorpo de antígeno anti-CD.
13. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada por o fármaco químico ser um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em um agente de alquilação, um antimetabólito, um antibiótico antitumor, um fármaco antitumor de planta, um fármaco hormonal e um fármaco variado; em que o fármaco variado é selecionado a partir do grupo que consiste em L-asparaginase, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, dacarbazina, fármacos de hexametilmelamina, e derivados dos fármacos anteriormente mencionados.
14. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada por a substância que promove a absorção imune de mucosa ou a adesão de mucosa ser uma ou mais selecionadas a partir do grupo que consiste em agentes tensoativos aniônicos, agentes tensoativos catiônicos, agentes tensoativos zwitteriônicos, agentes tensoativos não iônicos, agentes tensoativos especiais, agentes quelantes, adesivos, copolímeros de ácido polilático- ácido glicólico, dextranos e polissacarídeos.
15. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizada por o imunomodulador ser um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento de células-tronco, linfotoxinas, fatores hematopoiéticos, fatores estimuladores de colônia (CSFs), interferons, eritropoietinas, trombopoietinas, fatores de necrose tumoral (TNFs), interleucinas (ILs), fatores estimuladores de colônia de granulócito (G-CSFs), fatores estimuladores de colônia de granulócito e macrófago (GM-CSFs) e fatores de crescimento de células-tronco.
16. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizada por o antígeno de patógeno ser selecionado a partir do grupo que consiste em antígeno de um tumor, um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita; opcionalmente, o tumor incluir aqueles que se originam de quaisquer lesões no osso, conexão óssea, músculo, pulmão, traqueia, faringe, nariz, coração, baço, artéria, veia, sangue, capilar, linfonodo, vaso linfático, fluido linfático, cavidade oral, faringe, esôfago, estômago, duodeno, intestino delgado, cólon, reto, ânus, apêndice, fígado, vesícula biliar, pâncreas, glândula parótida, glândula sublingual, rim urinário, ureter, bexiga, uretra, ovário, trompa de falópio, útero, vagina, vulva, escroto, testículos, canal deferente, pênis, olhos, orelhas, nariz, língua, pele, cérebro, tronco cerebral, bulbo raquidiano, medula espinhal, fluido cérebro-espinhal, nervos, tireoide, glândula paratireoide, glândula pituitária, glândula pineal, ilhota pancreática, timo, gônada, glândula sublingual e glândula parótida;
opcionalmente, a bactéria incluir uma ou mais de Staphylococcus, Streptococcus, Listeria, Erysipelothrix, Renibacterium, Bacillus, Clostridium, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Corynebacterium, Rhodococcus, Bacillus anthracis, Erysipelas bacillus, Bacillus tetani, Listeria monocytogenes, Bacillus perfringens, Bacillus gangraenae emphysematosae, tuberculose, Escherichia coli, Bacterium proteus, Shigella dysenteriae, Pneumobacillus, Bacterium burgeri, Clostridium perfringens, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Moraxella catarrhalis, Acinetobacter, Yersinia, Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Shigella, Pasteurella, Vibrio cholerae e Vibrio Parahemolyticus; opcionalmente, o parasita incluir um ou mais dos parasitas no trato digestivo, parasitas intraluminais, parasitas intra-hepáticos, parasitas intrapulmonares, parasitas do tecido cerebral, parasitas intravasculares, parasitas intralinfáticos, parasitas do tecido muscular, parasitas intracelulares, parasitas do tecido ósseo e parasitas intraoculares; opcionalmente, os vírus incluírem um ou mais de adeniviridae, arenaviridae, astroviridae, bunyaviridae, cliciviridae, flaviviridae, hepatitis delta vírus, hepeviridae, mononegavirales, nidovirales, piconaviridae, orthomyxoviridae, papillomaviridae, parvoviridae, poliomaviridae, poxviridae, reoviridae, retroviridae ou togaviridae; opcionalmente, os fungos incluírem um ou mais de Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Histoplasma capsulatum, Histoplasma duboisii, Blastomyces lobo, Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomyces dermatitis, Sporothrix schenckii, Penicillium marneffei, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Pneumocystis carinii, Aspergillus, Exophiala jeanselmei, Fonsecaea Pedrosoi, Fonsecaea compacta, Chromomyces verruciformis, Pigmentation dermatitis, Geotrichum candidum, Pseudallescheria boydii, Cryptococcus neoformans, Trichosporon Cutaneum, Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Absidia corymbifera, Syncephalastrum racemosum, Basidiobolus ranarum,
Conidiobolus coronatus, Conidiobolus incongruus, Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Rhinosporidium seeberi, hyalohyphomycet, e phaeohyphomycete.
17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizada por o ligante do receptor de reconhecimento padrão ser selecionado a partir do grupo que consiste em um ligante do receptor de TLR, um ligante do receptor de RLR, um ligante do receptor de CLR, e um ligante do receptor de NLR.
18. Método, caracterizado por promover resposta imune in vivo a um antígeno em um hospedeiro, regular e potencializar a atividade de célula imune em um hospedeiro, auxiliar um hospedeiro a reduzir a fadiga, ou aliviar a dor em um hospedeiro, compreendendo: administrar ao hospedeiro com o complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, ou a composição de vacina de acordo com a reivindicação 7, ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por quando o antígeno for um vírus, uma bactéria, um fungo, ou um parasita antígeno, o fármaco ser administrado em 1 mg/kg ~ 8 mg/kg cada vez; alternativamente e preferivelmente, administrado uma vez a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, ou a cada 4 dias; quando o antígeno for um antígeno de tumor, o fármaco ser administrado em 1 mg/kg ~ 10 mg/kg cada vez, e preferivelmente administrado por pelo menos 360 dias, pelo menos 180 dias, pelo menos 60 dias ou pelo menos 30 dias.
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