JP2021529789A - 免疫応答を強化するための複合物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年06月29日に中国特許庁に提出された、出願番号が201810700708.6、名称が「免疫応答を強化するための複合物」である中国特許出願、及び2018年06月29日に中国特許庁に提出された、出願番号が201810698033.6、名称が「免疫応答を強化するための複合物の調製方法」である中国特許出願の優先権を主張しており、その全内容が援用により本出願に組み込まれている。
本開示の詳細な内容を記述する前に、本明細書に使用されている複数の用語を理解すべきである。
本開示の一局面は、免疫応答を強化するための組み合わせ製品に関し、それは、ポリイノシン、少なくとも1種のカチオン安定剤及び可溶性カルシウム塩を含み、
前記カチオン安定剤は、分子量≦5kDaの水溶性非抗生物質アミノ化合物、又は前記水溶性非抗生物質アミノ化合物とポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、葉酸、及びガラクトースのうちの1種又は複数種とで形成されるグラフト物である。
いくつかの実施形態では、前記組み合わせ製品中の少なくとも2種の成分は混合して一体に包装し、たとえば陽イオンと水及び/又は緩衝塩は一体に包装し、
いくつかの実施形態では、ポリイノシンは、その原料の形式、たとえばイノシン酸(PI)及びシチジル酸(PC)で包装する。
ポリイノシンの濃度はグラフトの方式により溶解度を高めることができ、理論的には、より高濃度になることが可能であり、
いくつかの実施形態では、前記調製は溶液系にて行われ、且つ前記試薬中、前記ポリイノシンの濃度が0.5〜5mg/mlであり、また1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、6.4mg/ml、7mg/ml、8mg/ml又は9mg/mlを選択してもよい。
いくつかの実施形態では、前記カチオン安定剤の濃度が0.8〜25.6mg/mlであり、また1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml又は20mg/mlを選択してもよい。
前記溶液は、好ましくは緩衝溶液である。
いくつかの実施形態では、前記抗原が腫瘍抗原である場合、前記薬物の1ドースあたりの薬物含有量が1〜10mgである。
ここで前記その他の薬物は、L−アスパラギナーゼ、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン類薬物、又は上記薬物の誘導体から選ばれる。
いくつかの実施形態では、前記抗代謝薬は、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、シタラビン、アンシタビン、ヒドロキシ尿素、及び上記薬物の誘導体から選ばれ、
いくつかの実施形態では、前記抗腫瘍抗生物質は、アクチノマイシン、マイトマイシン、ビリルビン、アドリアマイシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、及び上記薬物の誘導体から選ばれ、
いくつかの実施形態では、前記ホルモン薬は、性ホルモン、グルココルチコイド、及び上記薬物の誘導体から選ばれる。
ポリイノシン、少なくとも1種のカチオン安定剤及び可溶性カルシウム塩を液体反応系中に接触させることを含み、
前記カチオン安定剤は、分子量≦5kDaの水溶性非抗生物質アミノ化合物、又は前記水溶性非抗生物質アミノ化合物とポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、葉酸、及びガラクトースのうちの1種又は複数種とで形成されるグラフト物である。
いくつかの実施形態では、温度は、また82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、92℃、94℃、96℃又は98℃を選択してもよく、
いくつかの実施形態では、加熱時間は、また、80min、90min、100min又は110minを選択してもよい。
まず、カルボニルジイミダゾールを用いてポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、葉酸、及びガラクトースのうちの1種又は複数種を活性化させ、次に、活性化済みの産物を用いて、イオン液体[bmim]Cl中に前記水溶性非抗生物質アミノ化合物とグラフト反応を行うことを含む。
架橋剤溶液を撹拌条件下で1滴ずつ、製造して得た複合物に加えて、反応系中にチンダル現象が現れることを観察すると、滴下を停止し、撹拌してナノ粒子を得ることをさらに含み、
前記架橋剤は、トリポリリン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、フェニルボロン酸、及びカテコールのうちから選ばれる少なくとも1種である。
前記抗原が腫瘍抗原である場合、前記薬物は、1回あたり1〜10mg/kg投与され、好ましくは、投与周期は、少なくとも360日、又は少なくとも180日、又は少なくとも60日、又は少なくとも30日である。
一、パミカ複合物の調製
1、PBS溶液(pH7.2)の調製
1.1 塩化ナトリウム溶液(0.85%、1500ml)の調製:塩化ナトリウム12.75gを秤量し、2000mlメスシリンダーに入れて、水を注入することにより1500mlに定容した。
1.2 リン酸水素二ナトリウム溶液(0.006mol/L、500ml)の調製:リン酸水素二ナトリウム0.006×0.5×141.96=0.4259gを秤量し、500mlメスフラスコに入れて、0.85%生理食塩水を用いて500mlに定容した。
1.3 リン酸二水素ナトリウム溶液(0.006mol/L、500ml)の調製:リン酸二水素ナトリウム0.006×0.5×137.99=0.4140gを秤量し、500mlメスフラスコに入れて、0.85%生理食塩水を用いて500mlに定容した。
1.4 pH値が7.2のPBS溶液の調製:「1.2液」273.6ml+「1.3液」126.4mlを取った。
2、PIC液(2.0mg/ml、100ml)の調製
2.1 PI 2.0mg/ml*100ml*[1.04/(1.04+1)]/91.5%/(1−2.7%)=114.5mgを秤取して、250ml三角フラスコに入れ、50mlのPBS溶液を加えて溶解し、且つ40−60℃水浴を用いて平衡化した。
2.2 PC 2.0mg/ml*100ml*[1/(1.04+1)]/90.4%/(1−4.2%)=113.2mgを秤取して、250ml三角フラスコに入れ、50mlのPBS溶液を加えて溶解し、且つ40−60℃水浴を用いて平衡化した。
2.3 PIC液の調製:50mlのPI溶液を50mlのPC溶液に注入して、且つ45℃水浴で30分間反応させた。
2.4 80−99℃でPIC液について分子量加熱を15〜300分間行った。
3、塩化カルシウム溶液(0.16mol/L、25ml)の調製
CaCl2.2H2O(MW:147.02)0.5881gを秤取して、100ml三角フラスコに入れ、約25mlの注射用水を加えて溶解し、且つ定容した。
4、COS−g−MPEGの調製
ここでCOS−g−MPEGグラフト物の調製方法は以下のとおりである。キトサンオリゴ糖グラフトポリエチレングリコールモノメチルエーテル(COS−g−MPEG)グラフトコポリマーを調製し、これを補助材料として抗癌薬を調製した。
原理:カルボニルジイミダゾール(CDI)カップリング法を用いてCOS−g−MPEGを調製した。まず、カルボニルジイミダゾールを用いてポリエチレングリコールモノメチルエーテル(MPEG)を活性化させ、活性化MPEGを調製し、次に、活性化MPEGとキトサンオリゴ糖(COS)を用いてイオン液体中に反応させ、COS−g−MPEGコポリマーを合成し、具体的な反応ステップは、以下の3つのステップを含む。
4.1 イオン液体1−ブチル−3−メチルイミダゾールクロリド塩([BMIM]Cl)の調製
1−メチルイミダゾールとクロロブタンとを反応させて、イオン液体[BMIM]Clを調製し、合成反応の方程式は以下のとおりである。
CDIを用いてMPEGを活性化させ、合成反応の方程式は以下のとおりである。
活性化MPEGとCOSをイオン液体中にグラフト重合し、合成反応の方程式は以下のとおりである。
メチルイミダゾール、クロロブタン、トルエン、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、カルボニルジイミダゾール、無水エーテル、4A分子篩(2−3mm)、ジメチルスルホキシド、1,4−ジオキサン、キトサンオリゴ糖、集熱式恒温磁気加熱撹拌器(DF−101S型)、電子天びん、電気加熱送風乾燥箱、循環水式真空ポンプ、自動三重効用純水蒸留器、真空乾燥箱、凍結乾燥機、ガラス器具用エアフロードライヤー、単相コンデンサスターターモーター、ロータリーベーン真空ポンプ、6連式マグネチックスターラー、セルロース透析バッグ、すぐに使える透析バッグ45−2000RC膜、三口フラスコ(500mL、1000mL)、ガラス栓、磁気ビーズ、使い捨て紙コップ、500mLビーカー、2Lビーカー、使い捨てスポイト、薬匙、試薬瓶、乾燥器等。
4.5 準備
4.5.1蒸留水の調製
SZ−97A自動三重効用純水蒸留器を用いて三回蒸留水を調製した。
4.5.2 ガラス器皿の洗浄
三口フラスコ、ガラス栓、培養皿、磁気ビーズなどをまず水道水で洗い、次に、三回蒸留水でリンスし、最後に、ガラス器具用エアフロードライヤーに入れてベークした。
4.5.3 溶媒の乾燥:適量の分子篩を取って使い捨てビーカー中に入れ、適量のジメチルスルホキシド、1,4−ジオキサン、無水エーテルを取ってビーカーに入れ、水を除去した。
4.5.4 無水エーテルを冷凍しておく。
4.6. 操作(各ステップの注意事項):
4.6.1 イオン液体の調製
(1)1−メチルイミダゾール100g、クロロブタン148.5mLをそれぞれ取り、500mLの三口フラスコに順次加え、凝縮管を取り付けて、アルゴンガスを30min投入し、磁気撹拌して、油浴で80℃に加熱し、24h反応させた。
(2)反応終了後、取り出して、室温に冷却し、−18℃の冷蔵庫に入れて2h冷凍し、溶液の層状化が見られると、上層の液体(主にクロロブタンを除去する)を捨てた。
(3)80℃の送風乾燥箱に入れて、固体が完全に融解すると、熱いうちに適量のトルエンを加えて、振るってトルエンと溶液を十分に混合し、室温に冷却し、冷蔵庫に入れて冷凍し、取り出して、上層の液体(1−メチルイミダゾール、クロロブタンをトルエンに溶解して、トルエン、1−メチルイミダゾール、クロロブタンを除去する)を捨てた。
(4)さらにステップ(3)を2回繰り返して、未反応のクロロブタンを完全に除去した。
(5)サンプルを真空乾燥箱に入れ、90℃に加熱し、完全に融解した後、90℃で8h真空乾燥させ(トルエン除去)、取り出して室温まで放冷し、次に乾燥器に入れて使用に備えた。
4.6.2 MPEGの活性化
(1)ジメチルスルホキシド10mL、1,4−ジオキサン20mLを取って500mL三口フラスコに入れ、磁気撹拌し、MPEG 20gを加えて、MPEGが完全に融解すると、CDI 3.24gを加え、水浴で37℃に加熱して18h反応させた。
(2)反応完了後、氷水浴、磁気撹拌の条件下で、サンプルを予冷された無水エーテルに加えて、ラップフィルムでビーカー口を覆い、サンプルを冷蔵庫に30min放置した。
(3)30min後取り出して、上層の溶液を捨てて、沈殿物に予冷された無水エーテルを加え、30min磁気撹拌して、冷蔵庫に30min放置した。
(4)さらにステップ(3)を2回繰り返して、未反応のCDIを洗浄により十分に除去した。
(5)上層の溶液を捨てて、40℃の送風乾燥箱に6h放置し、エチルエーテルを予備除去した。
(6)40℃の真空乾燥箱に入れて2.5h真空乾燥し、エチルエーテルを十分に除去し、取り出して室温まで放冷した後、さらに乾燥器に入れて使用に備えた。
4.6.3 COS−g−MPEGの調製
(1)イオン液体を80℃の送風乾燥箱で融解した。
(2)イオン液体105gを秤取して三口フラスコに入れ、油浴で70℃に加熱し、アルゴンガスを導入して、COS 9gを緩やかに加え、COSが完全に溶解すると、活性化MPEG 6gを加え、磁気撹拌して、すべての原料の添加が完了した後、アルゴンガス保護下で6h反応させ、反応完了後、反応瓶を室温に冷却した。
(3)まず、クリップを用いて透析バッグの一方側を挟み、適量の蒸留水を加えて3回洗浄し、且つ透析バッグが水を漏らすか否かを検査し、その後、反応瓶中のサンプルを透析バッグ(分画分子量は2000である)に入れて72時間透析し、蒸留水の使用量について透析バッグを超えるのが好ましい。一日目に2〜3hおきに水を1回交換し、それ以降、12hおきに水を1回交換した。
(4)透析完了後、溶液を1000mL三口フラスコに加え、且つ水浴鍋に置き、減圧蒸留装置を取り付けて、蒸留温度を室温から25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃に勾配昇温し、50mL程度が残されるまで蒸留すると、蒸留装置を取り外し、熱いうちに、サンプルを使い捨てビーカーに注入して、使い捨て手袋を用いてカップ開口部をカバーし、−18℃の冷蔵庫に入れて8時間以上冷凍した。
(5)凍結乾燥機で30min予冷し、冷凍温度は−52℃に達する。サンプルを粉砕して、培養皿に敷き、予冷された凍結乾燥機に入れて、−52℃で30h凍結乾燥させた。冷凍完了後、装置を停止して、サンプルを取り出し、重量を量り、試薬袋に入れて、乾燥器に入れて保存した。
(6) 赤外線分析:適量のサンプルを取り、臭化カリウムを用いて打錠し、走査範囲を400〜4000cm−1として、サンプルの赤外線スペクトルを測定した。
5、COS−g−MPEGのPBS液の調製
5.1 5.12%:0.128gのCOS−g−MPEGを秤取して5ml遠心分離管に入れ、PBS液を加えて溶解し、且つ2.5mlに定容した。
5.2 2.56%:5.12%液1.2ml+PBS液1.2ml;
5.3 1.28%:2.56%液1.2ml+PBS液1.2ml;
5.4 0.64%:1.28%液1.2ml+PBS液1.2ml;
5.5 0.32%:0.64%液1.2ml+PBS液1.2ml;
5.6 0.16%:0.32%液1.2ml+PBS液1.2ml;
6、PIC、COS−g−MPEG及び塩化カルシウム溶液のパミカ溶液の調製
6.1 PIC液1.0mlを取って45℃の水浴鍋に入れ、5.1 1.0mlを滴下し、次に塩化カルシウム溶液0.005mlを滴下してその最終濃度を0.0004mol/Lとした。
6.2 PIC液1.0mlを取って45℃水浴鍋に入れ、5.2 1.0mlを滴下し、次に塩化カルシウム溶液0.005mlを滴下してその最終濃度を0.0004mol/Lとした。
6.3 PIC液1.0mlを取って45℃水浴鍋に入れ、5.3 1.0mlを滴下し、次に塩化カルシウム溶液0.005mlを滴下してその最終濃度を0.0004mol/Lとした。
6.4 PIC液1.0mlを取って45℃水浴鍋に入れ、5.4 1.0mlを滴下し、次に塩化カルシウム溶液0.005mlを滴下してその最終濃度を0.0004mol/Lとした。
6.5 PIC液1.0mlを取って45℃水浴鍋に入れ、5.5 1.0mlを滴下し、次に塩化カルシウム溶液0.005mlを滴下してその最終濃度を0.0004mol/Lとした。
6.6 PIC液1.0mlを取って45℃水浴鍋に入れ、5.6 1.0mlを滴下し、次に塩化カルシウム溶液0.005mlを滴下してその最終濃度を0.0004mol/Lとした。
7、結果
MPEG、PEG、PEIなどはすべて良好な水溶性を有し、且つ多くの有機物成分と良好な相溶性を有する。本実施例では、MPEGを例に、MPEGとカチオン安定剤(たとえばキトサンオリゴ糖)のグラフト物及びPICを用いて調製し、相容性が顕著に向上し、理論的には、PEGなどのグラフトキトサンなどのカチオン安定剤及びPICを用いて調製しても、相容性が向上し、カチオン安定剤上にPEGがグラフトされると、グラフト物自体にもPEGの特性を備える。
二、パミカナノ粒子の調製
薬用基準を満たすトリポリリン酸ナトリウム(TPP)を購入し、適切な割合でPIC−COS−g−MPEG−CaCl2複合物を恒温磁気撹拌器にて一定の回転数で等速撹拌し、異なる濃度のTPP水溶液を1滴ずつ滴下し、顕著な乳光が観察されると、すぐに停止し、反応を30分間維持し、イオン架橋自己組織化によりナノ粒子を形成し、高速遠心分離を経て、粒径が1000nm未満のものを取得した。且つ各種の検定をしたところ、合格する。
三、ポリペプチド又はタンパク質抗原ナノ粒子
態様1:ポリペプチド又はタンパク質抗原を上記ナノ粒子の形成過程に加えた。各成分がPEG−COSグラフト物又はCOS基質中に入り、ポリペプチド又はタンパク質抗原がTPP含有水相に入って結合される。ここで各成分を必ず適切な割合にし、且つ一定のpH環境下で、磁気ボールで撹拌して結合し、複合物及びナノ粒子を形成する。
態様2:ポリペプチド又はタンパク質抗原を上記予め形成された複合物及びナノ粒子とインキュベートし、ポリペプチド又はタンパク質抗原を複合物及びナノ粒子の表面に結合させ、ポリペプチド又はポリペプチド又はタンパク質抗原を上記複合物及びナノ粒子と一定の割合で混合し、5分間磁気撹拌し、室温で1時間放置し、グリセリン基質下、20000rcf、4℃で2時間超速遠心分離して取得した。
態様1/態様2の複合物及びナノ粒子については、各検定に合格する必要がある。
四、パミカの製剤形式
上記複合物/グラフト物含有複合物/複合物ナノ粒子/ポリペプチド又はタンパク質抗原ナノ粒子を無菌で適切な/合格する包材に包装し、注射、噴霧剤又はエアロゾル剤などの各種の剤型を調製し、各種の製品検定をしたところ合格すると、製品を調製した。
上記複合物/グラフト物含有複合物/複合物ナノ粒子/ポリペプチド又はタンパク質抗原ナノ粒子を無菌で適切な/合格する包材に包装し、膏剤を調製した。
噴霧剤に調製した実施例:上記方法によりパミカを調製し、その溶液を噴霧剤瓶に包装し、20瓶を取り、それぞれ薬液の噴霧モード検出及び霧滴分布のデータ検出を行った。
噴霧モードを下記表に示す。
「パミカとPEGとの組み合わせ」の調製方法(即ち実施例1)を参照して調製し、パミカ中のCOS使用量を増加すると沈殿が現れ、その投与の均一性に影響するが、PEIを添加すると、沈殿の出現を回避でき、且つCOSの使用量を増加すると、その免疫効果をさらに強化させる。
CN105396130A特許公開文献には、「ポリイノシン−アミノ化合物−塩化カルシウムアジュバント及びポリイノシン−アミノ化合物−塩化カルシウムアジュバントを含有するワクチン」が開示されており、且つ非抗生物質アミノ化合物は選択的にキトサンであることが開示されている。
本比較例では、実施例1におけるキトサンオリゴ糖を水溶性キトサン(キトサン塩酸塩、略語CS)に代え、それにより、投与均一性の点についての両方の影響を比較し、結果を下記表に示す。
実施例1の調製方法により、PIC液を調製し、PIC液260mlを取って20ml/本、合計13本個包装し、恒温水浴鍋の温度が80−99℃に上昇すると(好ましくは90℃)、サンプル12本を入れ、入れた後、計時し始めてそれぞれ10分間(バンド3)、20分間(バンド4)、30分間(バンド5)、40分間(バンド6)、50分間(バンド7)、60分間(バンド9)、70分間(バンド10)、80分間(バンド11)、90分間(バンド12)、100分間(バンド13)、110分間(バンド14)、及び120分間(バンド15)持続し、1回あたり1本取り出した。未加熱のサンプルはバンド2であった。
70−120分間(好ましくは加熱時間120分間)加熱したPICで調製された複合物(パミカ)及びそのワクチンを取り、『中国薬局方』2015版四部「1141異常毒性検査法」によれば、これらは、すべてマウス及びモルモット異常毒性検出に合格し、パミカを調製するために使用されるPICは、90℃で少なくとも70分間加熱して初めて製品の調製に用いるべきであり、好ましくは90℃で、加熱時間は120分間である。未加熱PIC(バンド2)及び60分間(バンド9)加熱したものを選択して調製された複合物及びそのワクチンは、モルモット異常毒性検出に合格できなかった。結果を図2に示し、対照バンド1:下から上へそれぞれ100bp、300bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp、3000bp、5000bpであった。対照バンド8:下から上へそれぞれ100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bpであった。
方法:本開示の実施例1の調製方法によりパミカ複合物を調製し、調製完了後、パミカ複合物及びポリイノシン注射液(ポリイノシン−カナマイシン−塩化カルシウム)のそれぞれのサンプルをそれぞれ0.04mg/mlに希釈し、13個の10ml管を取り、管ごとに5mlのサンプル希釈液を加え、さらに管ごとにsigmaのRNA酵素(商品番号R4642)25μgをそれぞれ加えて、37℃水浴鍋に放置し、5minおきに1本取り出して、248nmでのOD値を測定し、曲線を描画した。
結果を図3に示す。
(一)融解曲線のピーク値の測定
方法:本開示のパミカ複合物及びポリイノシン注射液のそれぞれのサンプルを0.04mg/mlに希釈し、250ml試薬瓶に移し、水浴鍋に置き、水浴鍋を持続的に昇温した。5℃おきに、3mlを取って石英キュベットに入れて、248nmでのOD値を測定し、曲線を描画した。
結果を図4に示す。
試験の測定結果から明らかなように、本開示のパミカ複合物(PIC−カチオン安定剤−塩化カルシウム)の融解曲線のピーク値は85℃であり、ポリイノシン注射液(PIC−カナマイシン−塩化カルシウム)の融解曲線のピーク値は80℃であり、これは、本開示のパミカ複合物が新規複合物であることを示した。
(二)吸収ピーク走査
実施例1の調製方法により、PI溶液、PC溶液、PIC溶液、PIC−COS溶液、PIC−COS−CaCl2溶液をそれぞれ調製し、PBS緩衝液を用いて上記サンプルをそれぞれ0.04mg/mlに希釈し、紫外線を用いてそれらの走査吸収スペクトルをそれぞれ測定し、図5の結果から、240−260nmで現れるピークが降順で順次PI、PC、PIC、PIC−COS、PIC−COS−CaCl2であり、ここでPIC−COSとPIC−COS−CaCl2ピークが重なることを示し、これは、本開示のパミカ複合物(PIC−COS−CaCl2)が新規構造の複合物であることを示した。
実施例1の方法によりパミカを調製し、ここでカチオン安定剤はCOSを用い、金属カチオンは塩化カルシウムを用いた。透過型電子顕微鏡写真(図6、図7)から分かるように、パミカ溶液中にナノ粒子が形成されており、そのほとんどは球状であり、粒径が50nm程度であり、比較的均一であり、少数は角形であり、辺長が100nmを超える。
実施例1の方法によりパミカを調製し、ここでカチオン安定剤はCOS−g−MPEGを用い、金属カチオンは塩化カルシウムを用いた。透過型電子顕微鏡写真(図8、図9)から分かるように、パミカ溶液中にナノ粒子が形成されており、そのほとんどは角形であり、辺長が100nmを超え、少数は球状である。
COSをリン酸塩緩衝溶液に溶解し、実施例1の方法によりPICのTPP溶液を調製し、PICのTPP溶液を撹拌下でCOS溶液に緩やかに滴下し、次に、塩化カルシウム溶液を滴下した。透過型電子顕微鏡写真(図10、図11)からわかるように、形成されたナノ粒子は紡錘状である。
実施例5〜8から、驚くべきことに、パミカ複合物溶液中に2種の状態の物質を同時に含有しており、1種はナノ粒子(電子顕微鏡結果)であり、もう1種は非ナノ粒子(実施例3の電気泳動結果)溶液であることを見出すことができた。
ナノ粒子の利点は、エンドサイトーシス作用を介さずに細胞膜を直接透過して、細胞内に入り、効き目が早いことであり、非ナノ粒子溶液は、エンドサイトーシスを介してしか細胞内に入られず、ナノ粒子よりも効き目が遅い。パミカは、エンドサイトーシスを介するモード、細胞に直接入るモードという2種のモードで効果を発揮できる。さらに、より重要なことは、ナノ粒子の構造では、パミカを保護し、それをヒトを含める霊長類以上の体内の血清中の核糖ヌクレアーゼによるPICの分解から守ることで、抗ウイルス・抗腫瘍の突破を達成させて、より大きな効果を取得することを期待することである。これらの効果により、パミカは、ヒトやマウスの抗癌効果のいずれに関しても、目立った効果を取得した。
下記実験例では、特に言及がない場合、パミカはすべて実施例1により調製されたPIC、COS及び塩化カルシウム溶液のパミカ溶液を指す。
材料:rHBsAg(CHO):20μg/ml、パミカアジュバント:1mg/ml、ADV20アジュバント400μg/ml、水酸化アルミニウムアジュバント:10mg/ml、生理食塩水
アルミニウムアジュバント/rHBsAg(CHO):アルミニウムアジュバント0.07ml+rHBsAg(CHO)0.5ml+生理食塩水0.43ml
ADV20(サイトカインアジュバント)/rHBsAg(CHO):ADV20 0.25ml+rHBsAg(CHO)0.5ml+生理食塩水0.25mlパミカアジュバント/rHBsAg(CHO):パミカアジュバント0.5ml+rHBsAg(CHO)0.5ml
方法:アルミニウムアジュバント/rHBsAg(CHO)、ADV20(サイトカインアジュバント)/rHBsAg(CHO)、パミカ/rHBsAg(CHO)をそれぞれ用いて、0、14日目に筋肉を介してハツカネズミを0.1mlで免疫し、21日目に、細胞免疫及び体液免疫の状況を検出した。
結果:本開示のパミカ複合物は、免疫効果が目立ち、特にELISA抗体及び細胞免疫のいずれも大幅に向上し、アルミニウムアジュバント及びADV20(サイトカインアジュバント)よりも明らかに優れており、パミカは、将来性が期待できる免疫アジュバントであり、詳細については図12及び図13を参照する。
方法:PBS、ポリイノシン注射液+不活性化ブルセラ抗原、本開示のパミカ複合物+不活性化ブルセラ抗原をそれぞれ用いてマウスを免疫し、0日目に1回免疫し、免疫してから45日後、ブルセラ強毒株を用いてハツカネズミを攻撃し、毒株攻撃15日後、ネズミを殺してマウス脾臓を摘出し、且つ脾臓のブルセラを3日間培養して計数し、本開示のパミカ複合物+不活性化ブルセラ抗原の保護効力を評価した。
材料:MYO抗原(ヒトミオグロビン)、濃度1mg/ml
本開示のパミカ複合物、濃度1mg/ml
完全フロイントアジュバント(CFA、Sigma)
方法:2.3−2.5kgのウサギを準備し、免疫前に陰性血を採取して血清を分離し対照とし、腹背部の皮下の複数の部位にそれぞれ異なるサンプルを注射した後、血清を分離して抗体検出を行った。ここで抗原+アジュバントは0.5ml+0.5mlで調製し、1回あたりの免疫用量は1mlであった。
結果
(1)本開示のパミカ複合物+MYO抗原、完全フロイントアジュバント+MYO抗原をそれぞれ用いてカイウサギを免疫し、7日おきに1回免疫注射した。完全フロイントアジュバントによる免疫を2回(10日)追加すると、ELTSAによる抗体力価は13000であり、完全フロイントアジュバントによる免疫を3回(18日)追加すると、ELTSAによる抗体力価は39000であり、完全フロイントアジュバントによる免疫を6回(3ヵ月)追加すると、ELTSAによる抗体力価は25000であり、本開示のパミカ複合物による免疫を2回(10日)追加すると、ELTSAによる抗体力価は45000であり、3回(18日)免疫すると、ELTSAによる抗体力価は51000であり、6回(3ヵ月)免疫すると、ELTSAによる抗体力価は36000であり、パミカアジュバントは、MYO抗原の初期では、抗体力価が高く、持続性が良好であり、これは、本開示のパミカ複合物が、MYO抗原に対しては、免疫アジュバントゴールドスタンダードを有する完全フロイントアジュバントよりも顕著に優れ、詳細については図14を参照する。
(2)本開示のパミカ複合物と完全フロイントアジュバントを組み合わせてMYO抗原に関してカイウサギを2回免疫する場合(0日目に1回免疫、14日目に1回免疫)、ELISAによる抗体力価(免疫後35日)は、完全フロイントアジュバントでは10000、本開示のパミカ複合物では60000、本開示のパミカ複合物+完全フロイントアジュバントでは160000(図15)であった。
完全フロイントアジュバント+抗原、パミカアジュバント+完全フロイントアジュバント+抗原、パミカアジュバント+抗原でカイウサギを免疫して産生した抗体をそれぞれ用いてキットを調製した。臨床検証を経たところ、完全フロイントアジュバント又は完全フロイントアジュバント+パミカアジュバント抗原群を用いて産生した抗体は臨床サンプルとマッチングしておらず、臨床検査に合格できず、パミカアジュバント抗原を用いて産生した抗体だけは臨床検査に合格でき、これは、中国国内のヒトミオグロビンラテックス比濁キットに使用される抗体原料の供給に対するオランダDako社の独占を完全に破り、中国国内の製品が完全フロイントアジュバントを使用することにより一般的に存在する、免疫力効が低く、エピトープ多様性が不足し、臨床サンプルを効果的に検出できないという深刻な状況を解決する。
下表は、パミカアジュバント+抗原群で産生した抗体を用いて調製したキットと、オランダDako社により提供される抗体で調製した、臨床に使用されているキットとの比較である。
名称:狂犬病ワクチン抗原における本開示のパミカ複合物のNIH効力の評価
方法:本開示のパミカ複合物(1mg/ml)+抗原、ポリイノシン注射液(1mg/ml)+抗原、PBS+抗原、及び抗原をそれぞれ用いて、0日目にマウスを免疫し、14日目に毒株で攻撃し、28日後、効力を測定した。
結果:下記表に示す。
a 本開示のパミカ複合物+CTN株狂犬病ワクチン抗原は、保護効果が単純なCTN株狂犬病ワクチン抗原の3.6倍であり、且つ抗原を1/5節約した。
b 本開示のパミカ複合物+CTN株狂犬病ワクチン抗原は、保護効果がポリイノシン注射液+CTN株狂犬病ワクチン抗原の1.8倍であり、効果が目立った。
方法:本開示のパミカ複合物、ポリイノシン注射液をそれぞれ用いてマウスを免疫し、免疫後1時間、2時間、5時間にそれぞれマウスの眼球を摘出して血を滅菌2ml遠心分離管に採取し、室温で30分間放置し、3500回転で5分間遠心分離し、上清を1つの新しい遠心分離管に吸い取り、血清を−20℃で冷凍保存した。
結果:本開示のパミカ複合物により誘導されたTNF−α、IFN−γサイトカインは、産量がポリイノシン注射液よりも顕著に優れ、得られたデータはすべて幾何平均値であり、具体的な結果を下記表に示す。
マウスがパミカの誘導により産生したTNF−α、およびIFN−γサイトカインのレベルはいずれポリイノシン注射液よりも高く、これは、本開示のパミカ複合物の誘導により産生したTNF−α及びIFN−γが、腫瘍細胞の共同殺滅及び抗感染の能力がより高いことを示す。
1、本開示のパミカ複合物のマウス試験法
1.1 試験方法
サンプル注射:18〜22gの健全SPF昆明マウスを、5匹/サンプルとし、0.5ml/匹で腹腔注射しながら、18〜22gの健全マウス5匹を秤取して空白対照とした。
1.2 判定基準
各匹のマウスに試験品0.5mlを腹腔注射して、7日間観察した。観察期間の間に、マウスがすべて健全に生存し、且つ異常反応がなく、期間が切れると、各匹のマウスの体重が増加すると、試験品を合格と判定した。上記要件に合致しないと、10匹のマウスを用いて再度試験することができ、判定基準は前記と同じであった。
1.3 結果
2.1 試験方法
サンプル注射:250〜350gの健全SPFグレードHartelyモルモットを、2匹/サンプルとし、5ml/匹で腹腔注射しながら、250〜350gの健全モルモットを2匹秤取して空白対照とした。
2.2. 判定基準
各匹のモルモットに試験品5mlを腹腔注射して、7日間観察した。観察期間の間に、モルモットがすべて健全に生存し、且つ異常反応がなく、期間が切れると、各匹のモルモットの体重が増加すると、試験品を合格と判定した。上記要件に合致しないと、4匹のモルモットを用いて再度試験することができ、判定基準は前記と同じであった。
2.3. 試験結果
3 本開示のパミカ複合物+狂犬病ワクチン精製抗原のモルモット試験法
3.1 試験方法
サンプル注射:250〜350gの健全SPFグレードHartelyモルモットを、2匹/サンプルとし、5ml/匹で腹腔注射しながら、250〜350gの健全モルモットを2匹秤取して空白対照とした。
3.2. 判定基準
各匹のモルモットに試験品5mlを腹腔注射して、7日間観察した。観察期間の間に、モルモットがすべて健全に生存し、且つ異常反応がなく、期間が切れると、各匹のモルモットの体重が増加すると、試験品を合格と判定した。上記要件に合致しないと、4匹のモルモットを用いて再度試験することができ、判定基準は前記と同じであった。
3.3. 試験結果
4.1 試験方法
サンプル注射:250〜350gの健全SPFグレードHartelyモルモットを、2匹/サンプルとし、5ml/匹で腹腔注射しながら、250〜350gの健全モルモットを2匹秤取して空白対照とした。
4.2. 判定基準
各匹のモルモットに試験品5mlを腹腔注射して、7日間観察した。観察期間の間に、モルモットがすべて健全に生存し、且つ異常反応がなく、期間が切れると、各匹のモルモットの体重が増加すると、試験品を合格と判定した。上記要件に合致しないと、4匹のモルモットを用いて再度試験することができ、判定基準は前記と同じであった。
4.3. 試験結果
PIC(二本鎖核酸)は、一定の温度に加熱されるとねじれを解き、温度が徐々に下がるにつれて、2本の一本鎖がさらに水素結合をもってペアリングして、二本鎖に回復し、加熱は、PICの分子量を低下させて、その毒性を低下させることができ、PICは加熱せず又は加熱時間が不十分である場合に調製すると、このような方法で調製された複合物自体は毒性が極めて高く、このような複合物で調製されたワクチンも毒性が極めて高く、このため、使用が極めて困難である。
(1)安全性が良好であり、顕著な副作用が見られておらず、パミカ免疫製剤は非細胞毒性薬物である。
(2)放射線・化学療法の副作用を低減させ、白細胞数及び血清タンパク質の含有量を向上させることができる。
(3)臨床的効果が明らかである:疼痛が低減し、摂食量を増加し、体力を増加し、精神的に悲観的な状態から楽観的になり、全生存期間がすでに数月延長しており、13ヵ月延長する病例がある。
(4)転移性癌の体積縮小が顕著であり、1/3−1/2の腫瘍縮小を示す病例がある。
本開示のパミカ複合物は、生産完了後、遮光下、室内に保管し、6ヵ月おきにサンプルを1回検出した。
場所:中国医学科学院薬物研究所
方法:マクロファージの収集:20〜25gのSPFグレード昆明ハツカネズミを6匹準備して、2群にランダムに分け、1群あたり3匹とした。0日目にパミカ及びPBSで免疫し、各匹のマウスに200μL点鼻し、2時間後、各匹のマウスに5.0%鶏赤血球の0.85%生理食塩水懸濁液をさらに腹腔注射し、4時間後、各群のマウスごとにそれぞれハツカネズミ3匹を頸椎脱臼により死亡させた。消毒後、皮膚を切り開き、且つHanks緩衝液を腹膜注射し、各匹に2.5mLを注射し、マウスの腹部を軽く揉んで、Hanks緩衝液で十分に腹腔内のマクロファージを濯いだ。その後、腹膜の中央部位で1つの小孔を開き、5mLピペットを用いて腹腔内の液体を約2mL吸い取り、試験管中に投入した。
滴下済みスライドガラス:試験管から腹腔洗液を無菌で吸いだし、スライドガラス上に滴下し、滴下済みスライドガラスを水平にしてウェットガーゼ上に置き、37℃恒温インキュベータに入れて半時間インキュベーションし、このとき、大量のマクロファージがスライドガラス上に粘着しており、0.85%生理食塩水を用いてスライドガラス上の貪食されていない鶏赤血球及び他の組織細胞をリンスして除去し、冷たい空気で風乾した。
標本の固定化及び染色:標本をメタノールで5分間固定化し、ライトギムザ染色液で染色した。ギムザ染色法により行い、使用されるPBS緩衝液のpHを6.5に調整し、冷たい空気で風乾した後、油浸レンズで観察して且つ計算した。
貪食百分率:赤血球を貪食するマクロファージ総数÷マクロファージ総数×100%。
貪食指数:マクロファージにより貪食される赤血球総数÷赤血球を貪食するマクロファージ総数×100%(油浸レンズ下で100個のマクロファージを観察し、各マクロファージにより貪食される赤血球数を記録し、これらの和を求めて100で割って、得た数値は貪食指数となる)。
結果:PBS対照群では、貪食百分率は12%であり、貪食指数は0.11であり、パミカ群では、貪食百分率は66%であり、貪食指数は1.2であり、これは、パミカが高いマクロファージ貪食機能刺激の作用を有することを示し、以下の図16には、マクロファージは赤血球を貪食し、図17には、青色マクロファージ(矢印に示される)は赤血球を貪食していない。
インフルエンザウイルス:アジアA型ネズミ肺適応株FM1、中国予防医学科学院ウイルス病予防・治療研究所から購入。
リバビリン:陽性対照薬、瀋陽延風薬廠から購入。
ハツカネズミ:昆明種、8〜10gのものは、FM1ウイルス継代に用い、14〜20gのものは下記本実験に用いた。
インフルエンザウイルスFM1株ウイルスネズミ肺懸濁液を、5LD50/匹でハツカネズミに点鼻することにより致死性肺炎を引き起こす可能性があり、試験時にまず感染させて、次に投与し、下記表に従って群分けして試験した。
実験態様は以下のとおりである。
インフルエンザウイルス:アジアA型ネズミ肺適応株FM1、中国予防医学科学院ウイルス病予防・治療研究所から購入。
インフルエンザワクチン:インフルエンザウイルススプリットワクチン 華蘭生物製品有限公司
完全フロイントアジュバント:上海偉進生物科技有限公司
本開示の粘膜免疫アジュバント:信福(北京)医薬科技有限公司
ハツカネズミ:昆明種、8〜10gのものはFM1ウイルス継代に用い、14〜20gのものは下記本実験に用いた。
完全フロイントアジュバントインフルエンザワクチン:遠心分離管内に、均一にボルテックス混合しながらワクチンと完全フロイントアジュバントとを等体積で加えて、油中水型エマルジョンとした。
本開示とインフルエンザワクチンとを組み合わせた点鼻剤:インフルエンザワクチンと本開示の粘膜免疫アジュバントとを等量で混合して水溶媒とした。
インフルエンザワクチン:インフルエンザワクチンとPBSとを等量で混合して水溶媒とした。
免疫方法
皮下注射免疫:0日目、28日目に0.1ml/匹の皮下注射によりハツカネズミを免疫し、42日目に、一部のハツカネズミから採血して血清を分離し、抗体力価を検出し、別の一部のハツカネズミを、インフルエンザウイルスFM1株ウイルスネズミ肺懸濁液5LD50/点鼻により感染させ、感染後5日目に、肺組織のウイルス力価を検出した。
鼻腔免疫:点鼻法により0日目、28日目にハツカネズミを0.1ml/匹で免疫し、42日目に、一部のハツカネズミを採血して血清を分離し、抗体力価を検出し、別の一部のハツカネズミを、インフルエンザウイルスFM1株ウイルスネズミ肺懸濁液5LD50/点鼻により感染させ、感染後5日目に、肺組織のウイルス力価を検出した。
各群の実験結果を下記表に示す。
粘膜免疫製剤とインフルエンザワクチンとの組み合わせの点鼻法による抗インフルエンザ試験
北京京蒙高科乾細胞技術有限公司により検出したところ、本開示は、CIK細胞エフェクターターゲット実験に対して明確な効果を有する。
試料番号:JSCIK2016042614;検出日付:2016.04.26;報告日付:2016.04.28。
操作手順:一般的なCIK細胞エフェクターターゲット実験に従って培養及び分析を行い、実験方法は、たとえば(荘捷ら、樹枝状細胞とCIK細胞を共培養して誘発したDCCIK細胞群の、腫瘍に対する死滅作用、細胞生物学雑誌、2007,29;237−240)に示される。
ターゲット細胞:A549 エフェクター細胞:培養JSCIK2016042614
結論:蛍光顕微鏡とマイクロプレートリーダーによる検出方法及び実験自体の誤差を考慮して、JSCIK2016042614細胞死滅能力を総合的に分析したところ、1:10の死滅効果は中であった(ターゲットエフェクター比が1:10である場合、ターゲット細胞A549に対する死滅率は51.4%であった)。
LL2ハツカネズミ腫瘍移植モデルを用いて、鼻腔噴霧によりパミカの抗腫瘍効果を検出したところ、該モデルでは、腫瘍細胞が迅速に成長し、接種後14日目に腫瘍体積がすでに2201.9±68.01mm3に達し、ここまで実験を終了し、ここで、陽性対照シスプラチンは、腫瘍縮小が最も好ましく、パミカ筋肉内注射群がそれに次いで、ただし、パミカ鼻腔噴霧は、0.1mg/匹のハツカネズミを除く。残りの0.2mg/匹の各鼻腔噴霧群は、溶媒陰性対照群よりもP<0.0001であり、有意差を有した。特に、従来の資料では、同じハツカネズミモデルにおいて、ネズミモデルPD1はほぼ効果がなかった。解釈すべきのは、シスプラチン群では、細胞分裂が非常に迅速である該モデルにおいてその効力をより発揮しやすく、総合的に考慮すると、新しい抗癌メカニズムに基づくこのような担癌ハツカネズミモデルへのパミカ効果が注目されることである。また、該モデルでは、ハツカネズミに対する副作用が発現されなかった。
実験の群分けを下記表に示す。
本回の実験では、細胞の腫瘍形成率が高く、溶媒対照群の腫瘍が迅速に成長し、実験終了時に、腫瘍体積が2201.09±68.01mm3に達し、陽性対照群のシスプラチンは顕著な腫瘍抑制効果を示し、これは、本回の実験が成功し、結果が確実であることを示した。
試験結果から示すように、マウス肺癌LL2細胞C57BL/6マウス腫瘍移植モデルに対する本回の研究では、パミカ、150μg/匹の群を除き、残りの群は、点鼻でも筋肉内投与でも、顕著な腫瘍成長抑制作用を示し、統計学的測定から、極めて有意的な差を有し、P<0.0001であり、また、担癌マウスに対して顕著な毒性や副作用がないことが示される。
輝源生物社の以前のデータから示されるように、マウス由来のPD−1抗体は、LL2モデルにおいて薬効が低く(腫瘍抑制率は10%未満であった)、同様に免疫系に作用するパミカとしては、示す効果がPD−1抗体よりも優れた。通常、PD−1抗体の抗腫瘍薬効が、腫瘍細胞PD−L1の発現レベルにより決まるか、もしくはmutation load、マイクロサテライト不安定性(MSI−H)もしくはミスマッチ修復欠陥(dMMR)に関連し、さらにその薬物の効果に影響すると考えられている。免疫アジュバント類のパミカとして示す腫瘍抑制効果は、免疫検査点の範囲よりも広く、極めて巨大な開発将来性を示した。
本回の薬力学的実験には、溶媒群、PD1群、6つのパミカ治療群、パミカ−PD1同時投与群の合計9群が設置されている。ここで、溶媒群は、接種16日後、点鼻によりPBS溶液を66.7μL/匹、2日ごとに1回投与するものであり、PD1群は、接種16日後、PD1溶液を100μg/匹、1週間に1回腹腔注射投与するものであり、6つのパミカ治療群は、それぞれ、接種7日前、点鼻によりパミカを200μg/匹、2日に1回投与するもの、接種当日に、点鼻によりパミカを200μg/匹、2日に1回投与するもの、接種16日後、点鼻によりパミカを200μg/匹、2日に1回投与するもの、接種16日後、点鼻によりパミカを300μg/匹、2日に1回投与するもの、接種16日後、筋肉内注射によりパミカを200μg/匹、2日に1回投与するもの、接種16日後、筋肉内注射によりパミカを300μg/匹、2日に1回投与するものであり、パミカ−PD1同時投与群は、接種16日後、点鼻によりパミカを200μg/匹、2日に1回投与し、且つ接種16日後、PD1溶液を100μg/匹、1週間に1回腹腔注射投与するものである。実験には、雌Balb/cマウスを使用し、3日ごとに腫瘍体積を1回測定し、2日ごとに体重を1回量る。溶媒対照群の平均腫瘍体積が2000mm3を超えるときに実験を終了し、小動物ライブイメージャーで腫瘍生物発光の状況を測定し、最後に、各群のマウスの臓器を取ってHE染色を行った。
薬力学的試験の結果から示すように、7日前群及び0日目群は、腫瘍成長及び転移の抑制能力が比較的低く、2つのパミカ筋肉内注射群は、腫瘍成長及び転移に対する抑制作用が、2つのパミカ点鼻群よりも高く、200μg/匹パミカ点鼻群を除き、300μg/匹パミカ点鼻群、200μg/匹パミカ筋肉内注射群、及び300μg/匹パミカ筋肉内注射群は、すべて腫瘍成長及び転移を明らかに抑制できた。実験終了時、200μg/匹パミカ点鼻群及び300μg/匹パミカ点鼻群の腫瘍抑制率はそれぞれ25%、及び35%であった。200μg/匹パミカ筋肉内注射群及び300μg/匹パミカ筋肉内注射群の腫瘍抑制率は、それぞれ56%、及び61%であった。
以上の結果から、パミカは、4T1乳癌に対して良好な腫瘍成長及び転移抑制作用を有することを示した。
以下、実験手順及び実験結果を具体的に検討する。
1.実験方法
1.1 4T1−lucマウス乳腺上皮内癌腫瘍モデルの構築
雌Balb/cマウスを取り、対数増殖期にある4T1−luc乳癌細胞を選択して、1×105個/0.2mL/匹の数量でBalb/cマウスの第4乳腺パッド下に接種し、同所性担癌マウスモデルを構築した。ノギスを用いて腫瘍塊の体積を動的に計測した。腫瘍体積の計算式:V=0.5×L×D2(ここで、Vは腫瘍体積、Lは腫瘍長径、Dは腫瘍短径である)。
1.2 投与時間の設定
接種7日前にパミカを点鼻投与する群(略語7日前群):腫瘍接種7日前に、10匹のマウスをランダムに選択し、表1に従って投与し始めた。
接種0日目にパミカを点鼻投与する群(略語0日目群):腫瘍接種当日に、10匹のマウスをランダムに選択し、表1に従って投与し始めた。
溶媒群:腫瘍体積が80mm3程度成長し、即ち、腫瘍接種後16日目に、表1に従って投与し始めた。
PD1群:腫瘍体積が80mm3程度成長し、即ち、腫瘍接種後16日目に、表1に従って投与し始めた。
200μg/匹パミカ点鼻群:腫瘍体積が80mm3程度成長し、即ち、腫瘍接種後16日目に、表1に従って投与し始めた。
300μg/匹パミカ点鼻群:腫瘍体積が80mm3程度成長し、即ち、腫瘍接種後16日目に、表1に従って投与し始めた。
200μg/匹パミカ筋肉内注射群:腫瘍体積が80mm3程度成長し、即ち、腫瘍接種後16日目に、表1に従って投与し始めた。
300μg/匹パミカ筋肉内注射群:腫瘍体積が80mm3程度成長し、即ち、腫瘍接種後16日目に、表1に従って投与し始めた。
投与後30日目に、腫瘍体積が2000mm3を超えるため、実験全体を終了した。
1.4観察指標
3日ごとに腫瘍体積を1回計測し、2日ごとに体重を1回秤量した。実験終点時に心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍を剥離し、ここで、心臓、肝臓、脾臓、腎臓を4%中性ホルムアルデヒドで固定化した後、パラフィン切片にして、且つHE染色分析を行い、腫瘍について写真を取って且つ重量を量り、肺を、Bouin’s固定液で16h固定化し、その後、50%アルコールで2h浸漬した後、写真を取り、4%中性ホルムアルデヒドで固定化した後、パラフィン切片にして、且つHE染色分析を行った。
1.5 小動物ライブイメージャー
投与終点時に、腹腔注射により濃度100μLの30mg/mLのフルオレセイン基質Luciferinを与えて、イソフルランを用いてマウスを麻酔し、17min後、マウスを小動物ライブイメージャーに固定して生物発光の状況を観察した。画像収集パラメータは以下のとおりである。収集時間 0.2秒;Bin値 4;F値 2。画像処理ソフトウェア:Living Image software(version 4.3.1;Caliper Life Sciences Inc.)。
2. 統計学的分析
実験データはすべて「平均値±標準偏差」で表され、データ分析には、SPSS Statistics 19(version 4.0.100.1124;SPSS Inc.,IBM Company,USA)ソフトウェアが採用された。データ比較には、一元配置分散分析ANOVAが採用され、群間有意差にはt検定が採用された:*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
3. 実験結果及び検討
3.1 腫瘍体積
腫瘍体積の変化曲線を図22に示す。
パミカ7日前群及び0日目群は、後期では、一定の腫瘍抑制作用を有し、前期では、ほぼ腫瘍抑制効果がなく、これは、早めて投与する、もしくはすぐに投与する場合、顕著な腫瘍死滅効果がないことを示し、別の角度からパミカは腫瘍治療ワクチンであり、予防ワクチンではないことを示す。実験終了時、7日前群及び0日目群の腫瘍抑制率は、それぞれ36%及び26%であった。
PD1群は、12日目の腫瘍体積に関して、溶媒群に比べて、すべて有意差(**p<0.01)を有し、これは、PD1が4T1マウス乳癌に対して一定の抑制作用を有することを示す。
PD1−パミカ同時投与群の各治療群は、投与後20日に、ほとんどのマウスがすでに死亡しており、したがって、後期の測定には、2群ともにデータなしであった。ここで、同時投与群は、6、12、18日目の腫瘍体積が、溶媒群に比べて、すべて有意差を有した(それぞれ*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。
200μg/匹パミカ点鼻群は、投与前期では、抑制効果が比較的顕著であり、投与後期では、腫瘍抑制効果が徐々に弱まり、6日目及び12日目の腫瘍体積が、溶媒群に比べて、すべて有意差(**p<0.01)を有し、300μg/匹パミカ点鼻群は、18日目を除き、残りの時間での腫瘍体積が、溶媒群に比べて、すべて有意差を有した。これは、点鼻投与が有効であり、且つ腫瘍抑制作用が用量依存性を呈することを示す。実験終了時、200μg/匹パミカ点鼻群及び300μg/匹パミカ点鼻群の腫瘍抑制率は、それぞれ25%及び35%であった。
パミカの2つの筋肉内注射用量群は、投与過程にわたって腫瘍抑制効果が類似しており、且つ溶媒群に比べて、すべて有意差を有し、且つ、2つの筋肉内注射群は、腫瘍抑制効果が2つの点鼻群よりも良好であった。実験終了時、200μg/匹パミカ筋肉内注射群及び300μg/匹パミカ筋肉内注射群の腫瘍抑制率は、それぞれ56%及び61%であった。
3.2 体重
マウス体重の変化曲線を図23に示す。
以上の結果から、筋肉内注射投与は、マウスの体重に対する影響が比較的小さく、副作用が比較的小さく、点鼻投与は、マウスに対して一定の副作用を有することを示す。
3.3 腫瘍重量、脾臓重量及び腫瘍写真
図24及び図25から見られるように、7日前群、及び0日目群の腫瘍重量は、対照群に比べて、有意差がなく、2つのパミカ筋肉内注射群は、腫瘍成長に対する抑制作用が2つのパミカ点鼻群よりも高く、200μg/匹パミカ点鼻群を除き、300μg/匹パミカ点鼻群、200μg/匹パミカ筋肉内注射群、及び300μg/匹パミカ筋肉内注射群は、すべて、腫瘍成長を明らかに抑制することができ、溶媒群に比べて、統計学的有意差を有した(それぞれ*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。
脾臓は、生体の最大の免疫器官であり、全身のリンパ組織の全量の25%を占め、大量のリンパ球及びマクロファージを含有し、生体細胞免疫及び体液免疫のセンターである。図26から見られるように、200μg/匹パミカ筋肉内注射群、及び300μg/匹パミカ筋肉内注射群の脾臓重量はすべて溶媒群よりも明らかに高く、統計学的有意差を有し(それぞれ**p<0.01、*p<0.05)、これは、筋肉内注射群の免疫反応が比較的強い可能性があることを示す。
3.4 肺写真
図27及び図28から見られるように、溶媒群、7日前群、0日目群のいずれも、肺組織の表面に比較的多くの白色腫瘍結節があり、これは、7日前群及び0日目群には、4T1肺転移抑制作用がほぼないことを示す。200μg/匹パミカ点鼻群及び300μg/匹パミカ点鼻群は、肺組織の表面における結節が比較的少なく、200μg/匹パミカ筋肉内注射群及び300μg/匹パミカ筋肉内注射群は、肺組織の表面における結節が最も少なく、これは、この2つの点鼻群及び2つの筋肉内注射群がすべて4T1肺転移を効果的に抑制でき、且つ筋肉内注射群の4T1肺転移抑制能力が点鼻群よりも強いことを示す。
3.5 小動物イメージャー
図29−図35から見られるように、溶媒群、7日前群、0日目群は、腫瘍部位及び転移性病巣の生物発光強度が比較的高く、200μg/匹パミカ点鼻群、及び300μg/匹パミカ点鼻群は、腫瘍部位及び転移性病巣の生物発光強度が弱まり、200μg/匹パミカ筋肉内注射群、及び300μg/匹パミカ筋肉内注射群は、腫瘍部位及び転移性病巣の生物発光強度が最も弱く、これは、筋肉内注射群の4T1乳癌成長及び転移の抑制能力が点鼻群よりも高いことを示し、上記結果と一致した。
4. 結論
本回の実験では、我々は、4T1−lucマウス乳腺上皮内癌モデルの作成に成功し、腫瘍成長が迅速であり、実験終了時、腫瘍体積が2000mm3を超える。
試験結果から示すように、マウス乳癌4T1−luc細胞Balb/cマウス同所性腫瘍モデルに対する本回の研究では、PD1及び同時投与群マウスは、PD1の原因のため、大量のマウスが死亡して、一部の実験データだけを取得することを引き起こす以外、残りの各群は、すべて一定の時間で、一定の腫瘍抑制作用を有した。7日前群、0日目群、及び200μg/匹パミカ点鼻群は、腫瘍抑制作用が顕著ではなく、200μg/匹パミカ点鼻群、200μg/匹パミカ筋肉内注射群、及び300μg/匹パミカ筋肉内注射群は、すべて顕著な腫瘍抑制作用を示した。
1、陽性対照薬
PD1、パクリタキセル注射液
4T1マウス乳腺上皮内癌担持動物モデルの構築
雌BALB/cマウスを取り、対数増殖期にある4T1−luc乳癌細胞を選択し、1×105cells/0.2mL/匹の数量でBALB/cマウスの第4乳腺パッド下に接種し、同所性担癌マウスモデルを構築した。ノギスを用いて腫瘍塊の体積を動的に計測した。腫瘍体積の計算式:V=0.5×L×D2(ここで、Vは腫瘍体積、Lは腫瘍長径、Dは腫瘍短径である)
3、4T1乳腺上皮内癌の成長及び自発転移に対する影響
3.1 群設置及び投与態様
1)PBS群:腫瘍接種数日後、PBSを、100μL/匹で点鼻投与し、1日おきに1回投与した。
2)PD1群:腫瘍接種数日後、PD1を、100μg/匹で腹腔投与し、1週間に1回投与した。
3)パクリタキセル群:腫瘍接種数日後、パクリタキセルを10mg/kg、1週間に1回尾静脈注射投与した。
4)パミカ点鼻群:腫瘍接種数日後、パミカを、100μL(0.3mg)/匹で点鼻投与し、1日おきに1回投与し、投与当日の午前に50μL点鼻し、午後に50μL点鼻した。
5)パミカ筋肉内注射群:腫瘍接種数日後、パミカを100μL(0.3mg)/匹で筋肉内注射投与し、1日おきに1回投与した。
6)同時投与群:腫瘍接種数日後、PD1を(100μg/匹、1週間に1回)腹腔投与し、且つ、パミカを(100μL/匹、1日おきに1回投与)点鼻した。
7)同時投与群:腫瘍接種数日後、パクリタキセルを(10mg/kg、1週間に1回投与)尾静脈注射し、且つパミカを(100μL/匹、1日おきに1回投与)点鼻した。
3.2 各群の動物数:15匹/群(各群に5匹多い)。
3.3 終了実験時点:実際の状況(マウスが死亡する、もしくは投与群と対照群との差が有意である)に応じて、実験を早めて終了する可能性がある。
3.4 実験態様
同所性4T1−luc乳癌モデルを作成し、小動物ライブイメージャーを用いて早期検出を行って群分けし、6.1項における群設置及び投与態様に従って投与した。腫瘍体積(3日に1回測定)、体重変化(3日に1回測定)、腫瘍重量(終点検出)、脾臓重量(終点検出)、TUNEL染色(終点検出)を検出し、肺をBouin’s固定液で固定化した後、写真を取り、各組織器官を中性ホルムアルデヒドで固定化した後、H&E染色(終点検出)を行い、且つ小動物ライブイメージャーを用いて、異なる時点及び最終時点での同所性腫瘍及び転移部位の生物発光強度を観察した。各群間の同所性腫瘍の成長及び転移の抑制作用の強さを総合的に比較した。
実験から、パミカは、乳癌腫瘍体積縮小、腫瘍重量、脾臓重量制御、腫瘍細胞アポトーシス促進などの点のいずれに関しても、顕著な効果を有することが証明されている。
最後に、なお、以上の各実施例は、本開示の技術案を説明するだけに使用され、それを制限するものではなく、前述各実施例を参照して本開示を詳細に説明したが、当業者が理解すべきことは、それは、依然として前述各実施例に記載の技術案を修正したり、ここの一部もしくは全部の技術的特徴に対して等同置換を行ったりすることができ、一方、これらの修正もしくは置換は、対応する技術案の趣旨が本開示の各実施例の技術案の範囲を逸脱するようにすることがない。
Claims (19)
- 免疫応答を強化するための組み合わせ製品であって、ポリイノシン(PIC)、少なくとも1種のカチオン安定剤及び可溶性カルシウム塩を含み、
前記カチオン安定剤は、分子量≦5kDaの水溶性非抗生物質アミノ化合物であり、又は前記水溶性非抗生物質アミノ化合物と、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、葉酸、及びガラクトースのうちの1種又は複数種とが形成されるグラフト物であり、
選択的に、前記水溶性非抗生物質アミノ化合物は、キトサンオリゴ糖、キトオリゴ糖、グルコサミン、カチオン性リポソーム、DEAE−グルカン、ポリアクリルアミド、ポリアミン、テトラアミノフルベン、及びポリエチレンイミンのうちから選ばれる1種又は複数種であり、
選択的に、前記カチオン安定剤は、キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖とポリエチレングリコールモノメチルエーテルのグラフト物、及びキトサンオリゴ糖とポリエチレングリコールモノメチルエーテルとポリエチレンイミンのグラフト物から選ばれ、
選択的に、前記グラフト物の分子量が≦50kDaであり、
選択的に、前記キトサンオリゴ糖の脱アセチル化度が70%以上であり、
選択的に、前記可溶性カルシウム塩は、CaCl2及び/又はCaNO3から選ばれ、
選択的に、前記ポリイノシンの分子量が100bp〜3000bpであり、
選択的に、前記ポリイノシンの分子量が100bp〜1500bpであり、
選択的に、それは、pH調整剤、トリポリリン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、フェニルボロン酸、カテコール、緩衝塩/試薬及び水のうちの1種又は複数種をさらに含む、免疫応答を強化するための組み合わせ製品。 - 請求項1に記載の組み合わせ製品中の試薬で調製して得る、免疫応答を強化するための複合物。
- 前記調製は溶液系にて行われ、且つ前記試薬中、前記ポリイノシンの濃度が0.1〜10mg/mlであり、
選択的に、前記ポリイノシンの濃度が0.5〜5mg/mlであり、
選択的に、前記調製は溶液系にて行われ、且つ前記試薬中、前記カチオン安定剤の濃度が0.5〜51.2mg/mlであり、
選択的に、前記カチオン安定剤の濃度が0.8〜25.6mg/mlであり、
選択的に、前記調製は溶液系にて行われ、且つ前記試薬中、前記可溶性カルシウム塩中のカルシウムイオンの濃度が0.1〜1mMである、請求項2に記載の複合物。 - 前記複合物は溶液中に保存しており、選択的に、前記溶液は緩衝溶液であり、選択的に、前記溶液はpH=5.0〜7.2であり、選択的に、前記溶液はpH=5.9〜6.9である、請求項2又は3に記載の複合物。
- 請求項2〜4のいずれか1項に記載の複合物の、免疫アジュバントとしての非治療的使用。
- 請求項2〜5のいずれか1項に記載の複合物の、抗体、ワクチン製剤又はワクチン組成物の調製における使用、又はワクチン補助材料又はワクチンアジュバントの調製における使用。
- ワクチン組成物であって、請求項2〜6のいずれか1項に記載の複合物及び少なくとも1種の抗原を含有し、選択的に、前記抗原は、ウイルス、細菌、タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸又は小分子−タンパク質結合物である、ワクチン組成物。
- 請求項2〜6のいずれか1項に記載の複合物の、免疫細胞活性調整における使用であって、前記使用は生体内又は生体外で行われ、選択的に、前記免疫細胞活性調整は、具体的には免疫細胞活性強化であり、選択的に、前記免疫細胞はマクロファージ、リンパ球及び樹枝状細胞から選ばれ、選択的に、前記免疫細胞活性強化は、前記免疫細胞による炎症性因子の放出を促進することであり、選択的に、前記炎症性因子は、IL−2、IL−6、IL−12p40、IL−18、IL−22、IFN−α、IFN−γ及びTNF−αを含む、使用。
- 請求項2〜6のいずれか1項に記載の複合物の、腫瘍の治療及び/又は予防、抗ウイルス、抗細菌、抗真菌、抗寄生虫、化学療法の副作用軽減、抗疲労又は免疫力向上、宿主疼痛緩和、抗原に対する宿主の免疫反応の促進のための薬物の調製における使用であって、
選択的に、前記薬物は、注射投与剤型、呼吸器投与剤型、点鼻剤、皮膚投与剤型、粘膜投与剤型又は腔道投与剤型であり、
選択的に、前記抗原は、腫瘍、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫抗原を含み、
選択的に、前記宿主は哺乳動物であり、
選択的に、前記宿主は霊長類動物であり、
選択的に、前記宿主はヒトであり、
選択的に、前記抗原がウイルス、細菌、真菌又は寄生虫抗原である場合、前記薬物の1ドースあたりの薬物含有量が1〜8mgであり、前記抗原が腫瘍抗原である場合、前記薬物の1ドースあたりの薬物含有量が1〜10mgである、使用。 - 薬物組成物であって、
前記薬物組成物は、請求項2〜6のいずれか1項に記載の複合物を含み、前記薬物組成物は、免疫細胞治療薬、抗体治療薬、化学薬物、粘膜免疫吸収又は粘膜粘着を促進する物質、免疫調整剤、病原体抗原、パターン認識受容体のリガンド、薬学的に許容可能な塩又は賦形剤のうちの1種又は複数種をさらに含む、薬物組成物。 - 前記免疫細胞治療薬は、腫瘍浸潤リンパ球、樹枝状細胞、サイトカイン誘導キラー細胞、樹枝状細胞−サイトカイン誘導キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、γδT細胞、CD3AK、CAR−T、及びTCR−Tのうちから選ばれる1種又は複数種である、請求項10に記載の薬物組成物。
- 前記抗体治療薬は、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、及び抗CD抗原抗体から選ばれる、請求項10又は11に記載の薬物組成物。
- 前記化学薬物は、アルキル化剤、抗代謝薬、抗腫瘍抗生物質、植物類抗腫瘍薬、ホルモン薬及びその他の薬物のうちから選ばれる1種又は複数種であり、前記その他の薬物は、L−アスパラギナーゼ、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン類薬物、又は上記薬物の誘導体から選ばれる、請求項10〜12のいずれか1項に記載の薬物組成物。
- 前記粘膜免疫吸収又は粘膜粘着を促進する物質は、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、特殊界面活性剤、キレート化剤、粘着剤、ポリ乳酸−グリコール酸コポリマー、デキストラン、及び多糖類のうちから選ばれる1種又は複数種である、請求項10〜13のいずれか1項に記載の薬物組成物。
- 前記免疫調整剤は、サイトカイン、ケモカイン、幹細胞成長因子、リンパ性毒素、造血因子、コロニー刺激因子(CSF)、インターフェロン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子(TNF)、インターロイキン(IL)、顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)、及び幹細胞成長因子のうちから選ばれる1種又は複数種である、請求項10〜14のいずれか1項に記載の薬物組成物。
- 前記病原体抗原は、腫瘍、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫抗原から選ばれ、
選択的に、前記腫瘍は、骨、骨接合部、筋肉、肺、気管、咽頭、鼻、心臓、脾臓、動脈、静脈、血液、毛細血管、リンパ節、リンパ管、リンパ液、口腔、咽頭、食道、胃、十二指腸、小腸、結腸、直腸、肛門、虫垂、肝臓、胆、膵臓、耳下腺、舌下腺、泌尿腎臓、尿管、膀胱、尿道、卵巣、卵管、子宮、膣、外陰部、陰嚢、精巣、輸精管、陰茎、眼、耳、鼻、舌、皮膚、脳、脳幹、延髄、脊髄、脳瘠液、神経、甲状腺、副甲状腺、副腎、下垂体、松果腺、膵島、胸腺、生殖腺、舌下腺、及び耳下腺のうちのいずれかが病変して生成した腫瘍を含み、
選択的に、前記細菌は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、リステリア菌属、エリジペロトリックス属、レニバクテリウム属、バシラス属、フソバクテリウム属、マイコバクテリア属、放線菌属、ノカルディア属、コリネバクテリウム属、ロドコッカス属、炭疽菌、エリシペラス、破傷風菌、リステリア菌、ウェルシュ菌、気腫疽菌、結核菌、大腸菌、プロテウス、赤痢菌、肺炎桿菌、ブルセラ、ウェルシュ菌、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、モラクセラ・カタラーリス、アシネトバクター属、エルシニア属、レジオネラ・ニューモフィラ、百日咳菌、パラ百日咳菌、志賀赤痢菌属、パスツレラ属、コレラ菌、及びビブリオ・パラヘモリティカスのうちの1種又は複数種を含み、
選択的に、前記寄生虫は、消化管内寄生虫、腔内寄生虫、肝内寄生虫、肺寄生虫、脳組織寄生虫、血管内寄生虫、リンパ管内寄生虫、筋肉組織寄生虫、細細胞内寄生虫、骨組織寄生虫、及び眼内寄生虫のうちの1種又は複数種を含み、
選択的に、前記ウイルスは、アデノウイルス(adeniviridae)、アレナウイルス(arenaviridae)、アストロウイルス(astroviridae)、ブニヤウイルス(bunyaviridae)、カリシウイルス(cliciviridae)、フラビウイルス(flaviviridae)、D型肝炎ウイルス(hepatitis delta virus)、肝炎ウイルス(hepeviridae)、モノネガウイルス(mononegavirales)、ニドウイルス(nidovirales)、小RNAウイルス(piconaviridae)、オルトミクソウイルス(orthomyxoviridae)、パピローマウイルス(papillomaviridae)、パルボウイルス(parvoviridae)、ポリオーマウイルス(polyomaviridae)、ポックスウイルス(poxviridae)、レオウイルス(reoviridae)、レトロウイルス (retroviridae)又はトガウイルス(togaviridae)のうちの1種又は複数種を含み、
選択的に、前記真菌は、コクシジオイデス・イミチス、コクシジオイデス・ポサダシ、アジェロミセス・カプスラーツス、ヒストプラズマ・ズボアジ、ロボ真菌、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、ブラストマイセス・デルマチチジス、スポロトリックス・シェンキィ、ペニシリウム・マルネッフェイ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ ルシタニアエ、ニューモシスチス・カリニ、アスペルギルス、エクソフィアラ・ジャンセルメイ、フォンセカエア・ペドロソイ、フォンセカ・コンパクタ、フィアロフォラ・ベルコーサ、エクソフィアラ・デルマチチヂス、ジェオトリクム・カンディデュム、シュードアレシェリア・ボイジイ、クリプトコックス・ネオフォルマンス、トリコスポロン、リゾプス・オリーゼ、ムコール・インディカス、アブシディア・コリムビフェラ、ハリサシカビモドキ、藻菌類、コニディオボルス・コロナトゥス、コニディオボルス・インコングルス、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ、脳炎性胞子虫、リノスポリジウム・セーベリ、無色菌糸、及び黒色菌糸のうちの1種又は複数種を含む、請求項10〜15のいずれか1項に記載の薬物組成物。 - 前記パターン認識受容体のリガンドは、TLR受容体のリガンド、RLR受容体のリガンド、CLR受容体のリガンド、及びNLR受容体のリガンドから選ばれる、請求項10〜16のいずれか1項に記載の薬物組成物。
- 抗原に対する宿主体内の免疫反応促進、又は宿主の免疫細胞活性の調整強化、又は宿主の疲労軽減補助、又は宿主疼痛軽減のための方法であって、
該方法は、請求項2〜6のいずれか1項に記載の複合物、又は請求項7に記載のワクチン組成物、又は請求項10〜17のいずれか1項に記載の薬物組成物を該宿主に与えることを含む方法。 - 前記抗原がウイルス、細菌、真菌又は寄生虫抗原である場合、前記薬物は1回あたり1〜8mg/kg投与し、好ましくは、毎日又は1日又は2日又は3日おきに1回投与し、前記抗原が腫瘍抗原である場合、前記薬物は、1回あたり1〜10mg/kg投与し、好ましくは、投与周期は、少なくとも360日、又は少なくとも180日、又は少なくとも60日、又は少なくとも30日である、請求項18に記載の方法。
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