CN102058879B - 一种口服肿瘤纳米疫苗及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种口服肿瘤纳米疫苗及其构建方法，该疫苗由油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，和通过交联剂磷脂酰乙醇胺修饰于油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗表面的西红柿凝集素组成。其构建方法包括：1.油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备：2.西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成；3.纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰。本发明的口服肿瘤纳米疫苗以西红柿凝集素特异性靶向结合于肠道M细胞，有效提高疫苗吸收率，激活黏膜和全身双重免疫；以纳米乳剂为疫苗载体，保证疫苗有效通过酶障和膜障，提高口服疫苗的生物利用度；在肿瘤抗原中加入超抗原SEA成分，激活CD8+T细胞同时有效活化CD4+T细胞，二者协同起效，加强肿瘤抗原的免疫效果。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种口服肿瘤纳米疫苗及其构建方法。
背景技术
肿瘤疫苗的研制已有100多年的历史，多种疫苗进行了临床试验，取得了令人鼓舞的效果。但是，我们也应该注意到，一些在动物实验中很有效的疫苗在人体试验的结果却令人失望，一个重要的原因是运用常规途径(肌肉注射、皮内接种)接种后，淋巴组织摄取的抗原量有限，使得疫苗的免疫效能未能充分发挥。相比之下，2倍于体表面积的肠粘膜下含有极其丰富的淋巴组织，且疫苗经口服后可同时激活黏膜和全身免疫，具有效率高、维持时间长、使用方便、用药量小等特点，能更有效激发特异性CTL反应，堪称理想的免疫途径。
然而，肿瘤疫苗的有效成分多为抗原蛋白分子或编码抗原的基因，这些生物大分子口服后极易被体液稀释及酶系降解破坏、难于通过生物屏障(免疫系统，组织，细胞膜等)，或由于半衰期短、清除率高，降低了肿瘤疫苗的生物利用度，大大限制了蛋白/肽疫苗的口服应用。
虽然有实验证实了口服纳米药物后可被胃肠道吸收，然而，从黏膜途径投入的微粒抗原物质的吸收率仍很低，使得疫苗经口服后很难到达M细胞，通常并不会诱导出所期待的黏膜免疫反应，这种缺陷严重制约了黏膜疫苗的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种使用安全、方便，主动靶向于肠道M细胞的高效广谱口服肿瘤纳米疫苗。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种口服肿瘤纳米疫苗，其特征在于，该疫苗由油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，和通过交联剂磷脂酰乙醇胺修饰于油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗表面的西红柿凝集素组成。
本发明还提供了一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备；
(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成；
(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰。
上述步骤(1)中所述的油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备方法为：将0.5mg～1.5mg复合抗原与Span-20、Pluronic188和0.6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为1mL～4mL，混合均匀得到油相；然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入3mL～12mL双蒸水水相中，再移至真空高速剪切乳化机上，在0.5KPa～1KPa真空下，20000转/分钟～25000转/分钟条件下高速剪切30min～50min，温度控制在80℃以下；接着移至冰浴下30KHz～50KHz超声3min～8min，反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用0.22μm的滤膜过滤除菌后，得到油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗；所述复合抗原为MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白与SEA超抗原按50～150∶1的摩尔比混合而成；所述油相中Span-20的质量百分比浓度为5％～10％，Pluronic188的质量百分比浓度为15％～20％。
上述步骤(3)中所述的油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰方法为：将油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗加入西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中，在温度为0℃～4℃的条件下反应1h～3h，然后将反应物透析去除游离的西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到西红柿凝集素修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳米疫苗。
上述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，所述油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗与西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液的质量比为5～10∶1。
上述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，所述西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中西红柿凝集素的浓度为2mg/mL～6mg/mL。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明以黏膜免疫系统为切入点，选择口服免疫途径，发挥黏膜免疫系统数量和功能上的优势，提高疫苗导入效率，放大肿瘤疫苗抗肿瘤免疫效应。并具有使用安全、方便、用药剂量少，效率高的特点。
2、本发明采用纳米乳剂作为口服疫苗的载体，在保护抗原成分不被破坏的同时，保证疫苗有效通过膜障、酶障，提高口服肿瘤疫苗的生物利用度；并使疫苗被动靶向于APCs、促进抗原成分提呈；利用其缓释所载抗原特性，持续、有效激活机体免疫。
3、本发明以西红柿凝集素修饰于纳米乳剂疫苗NE(MHMS)表面，利用凝集素能特异性靶向结合于肠道M细胞的特性，有效提高纳米疫苗吸收率，激活黏膜和全身双重免疫的同时，能进一步保护微粒抗原免于酶解，具有创新性。
4、本发明联合使用MAGE-1和MAGE-3，发挥两种肿瘤特异性抗原优势互补作用，进一步增强疫苗的广谱性；并以一定比例混合入SEA超抗原，在激活CD8+T细胞同时有效活化CD4+T细胞，二者协同起效，高效杀伤癌细胞。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明口服肿瘤纳米疫苗的模式图。
图2为本发明口服肿瘤纳米疫苗的电镜图。
图3为各组肿瘤疫苗免疫后小鼠脾淋巴细胞对B16-MAGE1-MAGE3细胞的杀伤率。
图4为各组肿瘤疫苗免疫后小鼠脾淋巴细胞对B16细胞的杀伤率。
图5为经各组肿瘤疫苗治疗后荷瘤小鼠的肿瘤体积变化。
图6为各组肿瘤疫苗对肿瘤切除后复发的预防作用。
具体实施方式
如图1所示的一种口服肿瘤纳米疫苗，该疫苗由油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，和通过交联剂磷脂酰乙醇胺修饰于油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗表面的西红柿凝集素组成；所述油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗由纳米乳剂NE，和包裹在纳米乳剂NE内的复合抗原(MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白与SEA超抗原按100∶1的摩尔比混合而成)组成。
一、口服肿瘤纳米疫苗的构建
该口服肿瘤纳米疫苗的构建方法包括：油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备；西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成；纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰。
实施例1
(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备
将1.0mg复合抗原(MAGE1/HSP70/MAGE3与SEA按100∶1的摩尔比混合)、Span-20、Pluronic188和0.6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为2.5mL，混合均匀得到油相；然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入7.5mL双蒸水水相中，再移至真空高速剪切乳化机上，在0.7KPa真空下，23000转/分钟条件下高速剪切40min，温度控制在80℃以下；接着移至冰浴下40KHz超声5min，反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用0.22μm的滤膜过滤除菌后，于4℃保存备用，得到油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗；所述油相中Span-20的质量百分比浓度为8％，Pluronic188的质量百分比浓度为18％；
(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成
将60mg的磷脂酰乙醇胺(PE)溶于60mL氯仿中，加入过量戊二酸酐室温反应5h，反应液过硅胶柱，氯仿-甲醇(体积比为9∶1)洗脱，收集戊二酰磷脂酰乙醇胺(N-glut-PE)，称取10mg的戊二酰磷脂酰乙醇胺(N-glut-PE)，并向其中加入250μL DMSO和1mL浓度为0.15mol·L-1的氯化钠，超声15s，调节pH值至3.5，然后加入15mg EDC，1mL含80mg·mL-1西红柿凝集素(TL)的Tris-HCl溶液，冰浴搅拌反应24h，薄层色谱监测反应进程，薄层色谱的展开剂为丁醇-乙酸-水(体积比为4∶1∶1)，碘蒸气显色，反应液过硅胶柱，丁醇-乙酸-水(体积比为4∶1∶1)洗脱，收集产物，用流动的去离子水透析过夜，然后用PBS缓冲液透析48h，收集透析内液，冻干即得纯化的西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺(TL-PE)；
(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰
将油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗按8∶1的质量比加入西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺(TL-PE)的PBS溶液中，在温度为2℃的条件下反应2h，然后将反应物透析去除游离西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到西红柿凝集素修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳米疫苗TL-NE(MHMS)；所述西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中西红柿凝集素的浓度为4mg/mL。
实施例2
(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备
将0.5mg复合抗原(MAGE1/HSP70/MAGE3与SEA按50∶1的摩尔比混合)、Span-20、Pluronic188和0.6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为1mL，混合均匀得到油相；然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入3mL双蒸水水相中，再移至真空高速剪切乳化机上，在1KPa真空下，20000转/分钟条件下高速剪切50min，温度控制在80℃以下；接着移至冰浴下30KHz超声8min，反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用0.22μm的滤膜过滤除菌后，于4℃保存备用，得到油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗；所述油相中Span-20的质量百分比浓度为5％，Pluronic188的质量百分比浓度为20％；
(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成(同实施例1)。
(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰
将油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗按5∶1的质量比加入西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺(TL-PE)的PBS溶液中，在温度为0℃的条件下反应3h，然后将反应物透析去除游离西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到西红柿凝集素修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳米疫苗TL-NE(MHMS)；所述西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中西红柿凝集素的浓度为2mg/mL。
实施例3
(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备
将1.5mg复合抗原(MAGE1/HSP70/MAGE3与SEA按150∶1的摩尔比混合)、Span-20、Pluronic188和0.6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为4mL，混合均匀得到油相；然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入12mL双蒸水水相中，再移至真空高速剪切乳化机上，在0.5KPa真空下，25000转/分钟条件下高速剪切30min，温度控制在80℃以下；接着移至冰浴下50KHz超声3min，反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用0.22μm的滤膜过滤除菌后，于4℃保存备用，得到油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗；所述油相中Span-20的质量百分比浓度为10％，Pluronic188的质量百分比浓度为15％；
(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成(同实施例1)。
(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰
将油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗按10∶1的质量比加入西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺(TL-PE)的PBS溶液中，在温度为4℃的条件下反应1h，然后将反应物透析去除游离西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到西红柿凝集素修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳米疫苗TL-NE(MHMS)；所述西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中西红柿凝集素的浓度为6mg/mL。
二、口服肿瘤纳米疫苗的鉴定
1、口服肿瘤纳米疫苗的电镜结果
经表面修饰后的纳米乳剂肿瘤疫苗(口服肿瘤纳米疫苗)为乳白色的均质胶体混悬液，如图2所示，在透射电子显微镜下观察发现纳米乳剂呈球形，大小较均匀，平均粒径、包裹率与未经修饰前变化不大，将采集的图象经计算机图象分析得出纳米乳剂平均粒径为(20±5)nm，经计算得出，包裹率为87％，于4℃放置6个月或3000转/分钟离心10min后，外观依然为均质胶体混悬液，无分层和沉淀现象。
2、口服肿瘤纳米疫苗TL-NE(MHMS)的靶向性检测
以胶体金标记的MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白(MHM)与SEA混合后经纳米乳剂包裹制备油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，进一步以TL修饰于其表面构建口服肿瘤纳米疫苗，对构建的口服肿瘤纳米疫苗进行体外、体内靶向性检测，与未经修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗比较，结果显示经修饰后的纳米乳剂肿瘤疫苗(口服肿瘤纳米疫苗)在体内、外实验中表现出了明确的PP结和肠系膜淋巴结靶向性和趋向迁移特性。
3、分泌IFN-γ的MAGE-1和MAGE-3特异性T细胞的检测(ELISPOT)
C57BL/6小鼠以每组10例随机分组为：PBS阴性对照口服组PBS-po、空白乳剂口服组NE(-)-po、MHM口服组MHM-po、MHMS口服组MHMS-po、油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗口服组NE(MHMS)-po、口服肿瘤纳米疫苗口服组TL-NE(MHMS)-po、油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗皮下组NE(MHMS)-sc和口服肿瘤纳米疫苗皮下组TL-NE(MHMS)-sc。由于活化的T细胞能够分泌IFN-γ，因此采用ELISPOT检测小鼠脾脏淋巴细胞与B16-MAGE1-MAGE3混合培养后，以分泌IFN-γ的T淋巴细胞频数反映活化的T细胞(包括CD8+和CD4+T细胞)数量。结果显示，以B16-MAGE1-MAGE3为靶细胞时，NE(MHMS)-po组、TL-NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc组均有特异性T淋巴细胞，与PBS-po组、NE(-)-po组、MHM-po组和MHMS-po组相比，IFN-γ释放细胞频数有统计学差异，而后4组无组间差异；前4组中以TL-NE(MHMS)-po组免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对MAGE1和MAGE3的特异性T细胞的数量最高，与NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc组相比有统计学差异(p＜0.05)；NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)组3组相比，未见统计学差异。以B16为靶细胞时，各组均可见少量非特异分泌IFN-γ的细胞。
4、细胞毒性实验(LDH)
C57BL/6小鼠以每组10例随机分组为：PBS-po、NE(-)-po、MHM-po、MHMS-po、NE(MHMS)-po、TL-NE(MHMS)-po、NE(MHMS)-sc和TL-NE(MHMS)-sc，分别进行LDH释放实验，结果如图3所示，NE(MHMS)-po组、TL-NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc组免疫小鼠，其脾淋巴细胞能杀伤B16-MAGE1-MAGE3，而且其效果明显强于PBS-po组、NE(-)-po组、MHM-po组和MHMS-po组小鼠(P＜0.01)；TL-NE(MHMS)-po组杀伤效果明显强于NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc组(P＜0.01)；NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc组杀伤效果无明显差别(P＞0.05)；如图4所示，各组对B16的杀伤能力均较低。
5、抗MAGE-1抗体和抗MAGE-3抗体的检测
采用间接ELISA法检测各组小鼠(每组6例)血清中抗MAGE-1的抗体和抗MAGE-3抗体水平，结果如下表：
表1各组疫苗免疫小鼠血清的MAGE-1、MAGE-3抗体滴度(OD450nm)
注：#p＜0.01；ns与NE(-)-po组相比无显著性差异；*与TL-NE(MHMS)-po组相比p＜0.05。
NE(-)-po组和MHMS-po组小鼠血清抗体滴度(Anti-MAGE-1、Anti-MAGE-1)均明显低于其余4个治疗组，其余4个治疗组中，以TL-NE(MHMS)-po组为最高，经组间比较有统计学差异(P＜0.05)；NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc组组间的小鼠血清抗体水平无显著性差异。
6、肿瘤攻击实验
C57BL/6小鼠分组后皮下接种B16-MAGE1-MAGE3，1周后100％成瘤，可以看见并可触及瘤结节，分别经口服或皮下注射免疫3次，观察疫苗对荷瘤小鼠的治疗作用。结果如图5所示，NE(-)-po组和MHMS-po组肿瘤生长迅速；相对于NE(MHMS)-po组，NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc组组间两两比较，肿瘤生长速度相近，无统计学差异；相对以上3组，TL-NE(MHMS)-po组的肿瘤生长速度明显小于其它组，能够明显抑制肿瘤生长。同时，如表2所示，NE(MHMS)-po组，TL-NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc组小鼠的生存期较NE(-)-po组和MHMS-po组明显延长，且TL-NE(MHMS)-po组平均生存时间和生命延长率分别为43.10天和62.6％，明显高于其它组，经组间比较均显示有显著性统计学差异。
表2 各组疫苗对荷瘤小鼠生命延长率的影响
注：#p＜0.01；ns与NE(-)-po组相比无显著性差异；*与TL-NE(MHMS)
-po组相比p＜0.05。
7、纳米疫苗对肿瘤攻击鼠的保护效果
C57BL/6小鼠接种B16-MAGE1-MAGE3前的第21天、14天和7天，分别给予小鼠不同免疫1次。接种肿瘤细胞当日计为第0天，其后每周观察两次，通过成瘤率反映疫苗对肿瘤攻击鼠的保护效果。其中MHMS-po组和NE(-)-po组的小鼠均在10天内成瘤；24天时，NE(MHMS)-po组、TL-NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc组成瘤小鼠分别为5只、2只、4只、4只；42天时，NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-sc均成瘤，而TL-NE(MHMS)-po组有2只未成瘤；TL-NE(MHMS)-po组最后1只小鼠的成瘤时间为56天。
8、纳米疫苗预防肿瘤转移的效果
经过3次免疫治疗的小鼠，7天后经静脉注射B16-MAGE1-MAGE3细胞，20天后剖检动物观察肺转移情况。结果如表3所示，NE(MHMS)-po组、TL-NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组、TL-NE(MHMS)-sc组小鼠肺转移瘤结节数明显少于NE(-)-po组及MHMS-po组(P＜0.05)；而TL-NE(MHMS)-po组又较NE(MHMS)-po组、NE(MHMS)-sc组、TL-NE(MHMS)-sc组少(P＜0.05)。
表3 各组疫苗对小鼠B16-MAGE1-MAGE3瘤肺内转移的影响
注：#与NE(-)-po组和MHMS-po组相比，p＜0.01；*与TL-NE(MHMS)-po组相比，p＜0.05。
9、纳米疫苗对肿瘤切除后复发的预防作用
C57BL/6小鼠接种B16-MAGE1-MAGE3后，待肿瘤达5mm～7mm时手术切除肿瘤，同时免疫小鼠，每隔7天免疫1次，共免疫3次。手术当日计为第0天，其后每周观察两次，通过瘤复发率反映纳米疫苗预防肿瘤切除后复发作用，结果如图5所示，其中NE(-)-po组和MHMS-po组的小鼠均在术后7～21天内全部肿瘤复发；TL-NE(MHMS)-po组小鼠术后24天发现首例肿瘤复发；手术后42天时，TL-NE(MHMS)-po组瘤复发小鼠为5只时，其他组10只小鼠均成瘤；TL-NE(MHMS)-po组有1只小鼠肿瘤复发时间长至56天。
目前国内外尚缺乏有效防治肿瘤复发转移的疫苗，我国没有具有自主知识产权的肿瘤疫苗上市进入临床应用，国外也只有为数不多的肿瘤疫苗获批上市。如果单纯依赖进口肿瘤疫苗，价格昂贵，且其专利权都集中在国外医药公司，所以，迫切需要发现和创制具有我国自主知识产权的新型抗肿瘤疫苗。
本发明以西红柿凝集素修饰于油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗表面构建的口服肿瘤纳米疫苗-TL-NE(MHMS)疫苗，该疫苗主动靶向于PP结和肠系膜淋巴结，经口服后TL-NE(MHMS)在体内能够引起较TL-NE(MHMS)-sc组、油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗NE(MHMS)-sc组更强的针对MAGE1-MAGE3的细胞免疫反应，对表达MAGE-1和MAGE-3的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用，延迟了B16-MAGE1-MAGE3肿瘤细胞攻击后肿瘤的生长，延长了小鼠生存时间，有效预防了肿瘤转移和切除后复发。本发明构建的口服肿瘤纳米疫苗，具有设计巧妙、靶点明确、药效确切、给药途径新颖的鲜明特色，兼具高效、低毒、广谱，使用安全、方便等特点，口服肿瘤纳米乳剂拥有广阔的市场前景，不仅可应用于国内庞大的肿瘤人群，而且由于其在多方面设计明显优于目前国外临床应用的其他肿瘤疫苗，定会具有相当的国际竞争力。
Claims (5)
1.一种口服肿瘤纳米疫苗，其特征在于，该疫苗由油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，和通过交联剂磷脂酰乙醇胺修饰于油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗表面的西红柿凝集素组成；
所述口服肿瘤纳米疫苗的构建方法包括以下步骤：
(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备：将0.5mg～1.5mg复合抗原与Span-20、Pluronic188和0.6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为1mL～4mL，混合均匀得到油相；然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入3mL～12mL双蒸水水相中，再移至真空高速剪切乳化机上，在0.5KPa～1KPa真空下，20000转/分钟～25000转/分钟条件下高速剪切30min～50min，温度控制在80℃以下；接着移至冰浴下30KHz～50KHz超声3min～8min，反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用0.22μm的滤膜过滤除菌后，得到油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗；所述复合抗原为MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白与SEA超抗原按100∶1的摩尔比混合而成；所述油相中Span-20的质量百分比浓度为5％～10％，Pluronic188的质量百分比浓度为15％～20％；
(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成；
(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰。
2.一种构建如权利要求1所述口服肿瘤纳米疫苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备；
(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成；
(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰。
3.根据权利要求2所述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰方法为：将油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗加入西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中，在温度为0℃～4℃的条件下反应1h～3h，然后将反应物透析去除游离的西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到西红柿凝集素修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳米疫苗。
4.根据权利要求3所述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，其特征在于，所述油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗与西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液的质量比为5～10∶1。
5.根据权利要求3或4所述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，其特征在于，所述西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中西红柿凝集素的浓度为2mg/mL～6mg/mL。
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Granted publication date: 20120523 |
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