BR112020026299A2

BR112020026299A2 - Composição de resina, célula de fluxo e método para fazer uma célula de fluxo

Info

Publication number: BR112020026299A2
Application number: BR112020026299-4A
Authority: BR
Inventors: Timothy J. Merkel; Wayne N. George; Andrew A. Brown; Audrey Zak; Gianluca Andrea Artioli; Julia Morrison; Nikolai Romanov; Lorenzo Berti; Graham Boud
Original assignee: Illumina, Inc.; Illumina Cambridge Limited
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2021-03-30
Also published as: US20200024661A1; SG11202012638TA; KR20210034551A; JP7408587B2; CN112673029A; MX2020014067A; CA3103448A1; BR112020026299B1; EP3823997A4; US11884976B2; AU2019305036A1; EP3823997A1; IL279472A; WO2020018798A1; TWI822818B; TW202012506A; JP2021530575A

Abstract

um exemplo de uma composição de resina inclui uma matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano, e um fotoiniciador de radical livre. quando curada, a composição de resina tem baixa ou nenhuma autofluorescência quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul variando de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm ou comprimentos de onda de excitação verde variando de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm.

Description

COMPOSIÇÃO DE RESINA E CÉLULAS DE FLUXO QUE INCORPORAM A MESMA REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA Serial Número 62/701,228, depositado em 20 de julho de 2018, o conteúdo do qual é incorporado a título de referência aqui em sua totalidade.

FUNDAMENTOS

[002] Arranjos biológicos estão entre uma ampla faixa de ferramentas usadas para detectar e analisar moléculas, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Nestas aplicações, os arranjos são modificados para incluir sondas para sequências de nucleotídeo presentes em genes em seres humanos e outros organismos. Em certas aplicações, por exemplo, sondas de DNA e RNA individuais podem ser ligadas em pequenos locais em uma grade geométrica (ou aleatoriamente) em um suporte de arranjo. Uma amostra de teste, por exemplo, de uma pessoa ou organismo conhecidos, pode ser exposta à grade, tal que fragmentos complementares hibridizam às sondas nos sítios individuais no arranjo. O arranjo pode ser depois examinado varrendo-se frequências específicas de luz sobre os sítios para identificar quais fragmentos estão presentes na amostra, por fluorescência dos sítios nos quais os fragmentos hibridizaram.

[003] Arranjos biológicos podem ser usados para sequenciamento genético. Em geral, o sequenciamento genético envolve determinar a ordem de nucleotídeos ou ácidos nucleicos em um comprimento de material genético, tal como um fragmento de DNA ou RNA. Sequências crescentemente mais longas de pares de base estão sendo analisadas e a informação de sequência resultante pode ser usada em vários métodos de bioinformática para encaixar logicamente os fragmentos de modo a determinar, com segurança, a sequência de comprimentos extensos de material genético dos quais os fragmentos foram derivados. O exame automatizado, com base em computador de fragmentos característicos foi desenvolvido e foi usado em mapeamento de genoma, identificação de genes e sua função, avaliação de riscos de certas condições e estados de doença e assim por diante. Além destas aplicações, arranjos biológicos podem ser usados para a detecção e a avaliação de uma ampla faixa de moléculas, famílias de moléculas, níveis de expressão genética, polimorfismos de nucleotídeo único e genotipagem.

INTRODUÇÃO

[004] Em um aspecto, uma composição de resina compreende uma matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano; e um fotoiniciador de radical livre; em que, quando curada, a composição de resina tem baixa ou nenhuma autofluorescência quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul variando de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm ou comprimentos de onda de excitação verde variando de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm.

[005] Em um exemplo, a composição de resina curada tem baixa autofluorescência, em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 25.000 quando a composição de resina curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação azul.

[006] Em um outro exemplo, a composição de resina curada tem baixa autofluorescência, em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 5.000 quando a composição de resina curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação azul.

[007] Ainda em um outro exemplo, a composição de resina curada tem baixa autofluorescência, em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 10.000 quando a composição de resina curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação verde.

[008] Ainda em um outro exemplo, a composição de resina curada tem baixa autofluorescência, em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 2.500 quando a composição de resina curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação verde.

[009] Em um exemplo, a matriz de resina curável por radical livre compreende um acrilato selecionado a partir do grupo que consiste em 1,3- bis(3-metacriloxipropil) tetrametildissiloxano, polidimetilsiloxano terminado em metacriloxipropil, tetrametil tetracis[3-acriloxipropil]ciclotetrassiloxano, metacril silsesquioxano poliédrico oligomérico, acrilo silsesquioxano poliédrico oligomérico, homopolímero de acriloxipropil metilsiloxano e combinações dos mesmos.

[010] Em um exemplo, o fotoiniciador de radical livre é 2-etil-9,10- dimetoxiantraceno.

[011] Em um outro exemplo, o fotoiniciador de radical livre é selecionado a partir do grupo que consiste em 2,2-dimetóxi-2-fenilacetofenona e 2-etóxi-2- fenilacetofenona.

[012] Ainda em um outro exemplo, o fotoiniciador de radical livre é um óxido de fosfina, em que o óxido de fosfina é selecionado a partir do grupo que consiste em óxido de difenil(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfina, uma mistura de óxido de difenil(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfina e 2-hidróxi-2-metilpropiofenona, óxido de fenilbis(2,4,6-,trimetilbenzoil)fosfina, etil(2,4,6-trimetilbenzoil)fenilfosfinato e combinações dos mesmos.

[013] Em um exemplo, a composição de resina compreende ainda um supressor escuro ou um aceptor de elétron.

[014] Em um exemplo, uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina curável por radical livre para o fotoiniciador de radical livre varia de cerca de 99,8:0,2 a cerca de 90:10.

[015] Em um exemplo, a composição de resina compreende ainda uma matriz de resina epóxi; e um gerador de fotoácido.

[016] Deve ser entendido que quaisquer características deste aspecto da composição de resina podem ser combinadas entre si em qualquer maneira e/ou configuração desejáveis para obter os benefícios como descrito nesta invenção, incluindo, por exemplo, a autofluorescência relativamente baixa.

[017] Em um outro aspecto, uma célula de fluxo compreende um substrato; e uma resina padronizada curada no substrato, a resina padronizada curada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais e a resina padronizada curada tendo sido formada a partir de uma composição de resina incluindo: uma matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano; e um fotoiniciador de radical livre; em que a resina padronizada curada tem baixa ou nenhuma autofluorescência quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul variando de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm ou comprimentos de onda de excitação verde variando de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm.

[018] Em um exemplo, a célula de fluxo compreende ainda um revestimento polimérico nas depressões; e um iniciador enxertado ao revestimento polimérico.

[019] Em um exemplo, a resina padronizada curada tem baixa autofluorescência, em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 25,000 quando a resina padronizada curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação azul.

[020] Em um outro exemplo, a resina padronizada curada tem baixa autofluorescência, em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 10.000 quando a resina padronizada curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação verde.

[021] Ainda em um outro exemplo, a composição de resina inclui ainda uma matriz de resina epóxi; e um gerador de fotoácido.

[022] Em um exemplo, a matriz de resina curável por radical livre compreende um acrilato selecionado a partir do grupo que consiste em 1,3- bis(3-metacriloxipropil) tetrametildissiloxano, polidimetilsiloxano terminado em metacriloxipropil, tetrametil tetracis[3-acriloxipropil]ciclotetrassiloxano, metacril silsesquioxano poliédrico oligomérico, acrilo silsesquioxano poliédrico oligomérico, homopolímero de acriloxipropil metilsiloxano e combinações dos mesmos.

[023] Em um exemplo, o fotoiniciador de radical livre é selecionado a partir do grupo que consiste em 2-etil-9,10-dimetoxiantraceno, 2,2-dimetóxi-2- fenilacetofenona e 2-etóxi-2-fenilacetofenona.

[024] Em um outro exemplo, o fotoiniciador de radical livre é um óxido de fosfina selecionado a partir do grupo que consiste em óxido de difenil(2,4,6- trimetilbenzoil)fosfina, uma mistura de óxido de difenil(2,4,6- trimetilbenzoil)fosfina e 2-hidróxi-2-metilpropiofenona, óxido de fenilbis(2,4,6- ,trimetilbenzoil)fosfina, etil(2,4,6-trimetilbenzoil)fenilfosfinato e combinações dos mesmos.

[025] Em um exemplo, a composição de resina compreende ainda um supressor escuro ou um aceptor de elétron.

[026] Em um exemplo, uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina curável por radical livre para o fotoiniciador de radical livre na composição de resina varia de cerca de 99,8:0,2 a cerca de 90:10.

[027] Deve ser entendido que quaisquer características deste aspecto da célula de fluxo podem ser combinadas entre si em qualquer maneira desejável para obter os benefícios como descrito nesta invenção, incluindo, por exemplo, a autofluorescência relativamente baixa. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características deste aspecto da célula de fluxo e/ou da composição de resina pode ser usada junto e/ou que quaisquer características de qualquer um ou ambos estes aspectos podem ser combinadas com qualquer um dos exemplos revelados aqui para obter os benefícios como descrito nesta invenção, incluindo, por exemplo, a autofluorescência relativamente baixa.

[028] Ainda em um outro aspecto, um método compreende depositar uma composição de resina sobre um substrato, a composição de resina incluindo: uma matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano; e um fotoiniciador de radical livre; nanoimprimir a composição de resina depositada usando um carimbo de trabalho; e curar a composição de resina depositada para formar uma resina padronizada curada; em que a resina padronizada curada tem baixa ou nenhuma autofluorescência quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul variando de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm ou comprimentos de onda de excitação verde variando de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm.

[029] Deve ser entendido que quaisquer características deste aspecto do método podem ser combinadas entre si em qualquer maneira desejável para obter os benefícios como descrito nesta invenção, incluindo, por exemplo, a autofluorescência relativamente baixa. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do método e/ou da célula de fluxo e/ou da composição de resina pode ser usada junto e/ou que quaisquer características de qualquer um ou todos estes aspectos podem ser combinadas com qualquer uma das características dos exemplos revelados aqui para obter os benefícios como descrito nesta invenção, incluindo, por exemplo, a autofluorescência relativamente baixa.

[030] Ainda mais, deve ser entendido que quaisquer características de qualquer um do método e/ou da célula de fluxo e/ou da composição de resina podem ser combinadas entre si em qualquer maneira desejável e/ou podem ser combinadas com qualquer um dos exemplos revelados aqui para obter os benefícios como descrito nesta invenção, incluindo, por exemplo, a autofluorescência relativamente baixa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[031] Características dos exemplos da presente invenção tornar-se-ão evidentes a título de referência à descrição detalhada e desenhos seguintes, em que numerais de referência semelhantes correspondem a componentes similares, ainda que talvez não idênticos. Por uma questão de brevidade, numerais de referência ou características tendo uma função previamente descrita podem ser descritos ou não em relação a outros desenhos nos quais eles aparecem.

[032] A Fig. 1 é um fluxograma que ilustra um exemplo de um método revelado aqui; As Figs. 2A a 2E são vistas em perspectiva esquemáticas que juntas descrevem um exemplo do método revelado aqui; A Fig. 2F é uma vista esquemática e em seção transversal tomada ao longo da linha 2F-2F da Fig. 2E; As Figs. 3A a 3F são imagens de micrografia eletrônica de varredura de poços de exemplo formados usando diferentes exemplos das composições de resina reveladas aqui; A Fig. 4 é um gráfico que ilustra a intensidade de fluorescência (em unidades arbitrárias) versus comprimento de onda (em nanômetros (nm)) para uma resina de exemplo comparativo, uma resina de exemplo e um substrato de vidro branco; e As Figs. 5A e 5B são gráficos que ilustram os resultados da autofluorescência proposta para uma composição de resina de exemplo profético e uma composição de resina de exemplo comparativo de profético.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[033] É desejável que células de fluxo padronizadas usadas em aplicações de sequenciamento tenham níveis basais de autofluorescência que permitem razões de sinal para ruído (SNRs) que são altas o bastante de modo que sinais de agrupamentos individuais possam ser resolvidos durante o sequenciamento. As composições de resina usadas em células de fluxo padronizadas frequentemente incluem fotoiniciadores (por exemplo, geradores de radical livre e/ou catiônicos) para iniciar a cura durante a padronização da composição. Em teoria, quando os fotoiniciadores usados não têm nenhuma absorção na região visível, nenhuma fluorescência deveria ocorrer quando excitados pelas fontes de luz azul, verde e/ou vermelha usadas durante o sequenciamento. Entretanto, com base em medições de solução de algumas combinações de fotoiniciador de radical livre e catiônico, foi descoberto que a autofluorescência indesejável pode ocorrer em comprimentos de onda de excitação de interesse, mesmo quando pouca ou nenhuma absorbância é prevista ocorrer com base nas propriedades espectrais dos componentes de resina na região visível.

[034] A matriz de resina da composição de resina revelada aqui é baseada em acrilato (por exemplo, a resina inclui um acrilato e/ou um metacrilato) e exibe níveis relativamente baixos de fluorescência depois da cura. Além disso, a resina baseada em acrilato cura somente através de um mecanismo de radical livre. Com este mecanismo de cura, um fotoiniciador de radical livre pode ser usado sem outros tipos de fotoiniciadores, tais como fotoiniciadores catiônicos. Isto, por sua vez, pode minimizar e em alguns exemplos ainda eliminar, interações intramoleculares que, de outro modo, possam ocorrer entre os diferentes tipos de fotoiniciadores (por exemplo, entre algumas combinações de fotoiniciador de radical livre e catiônico). Acredita-se que estas interações intramoleculares possam ocorrer antes ou durante a exposição à luz ultravioleta (UV), indicando que a troca de energia entre a combinação de fotoiniciadores e a formação subsequente de complexos de estado excitado (exciplexos) e adutos pode estar contribuindo para a autofluorescência indesejável. Acredita-se ainda que porque a composição de resina revelada aqui não experiencia as interações intramoleculares anteriormente mencionadas, a composição de resina curada revelada aqui pode exibir autofluorescência (quando exposta a comprimentos de onda de excitação de interesse (por exemplo, comprimentos de onda de excitação azul e/ou verde)) que é cerca de uma ordem de magnitude mais baixa do que resinas que incluem uma combinação de um fotoiniciador de radical livre e um fotoiniciador catiônico.

[035] A composição de resina revelada aqui também pode ser mais facilmente fotobranqueada, o que tornaria a composição de resina curada permanentemente incapaz de produzir autofluorescência (isto é, qualquer autofluorescência que ocorra está abaixo de um valor-limite de detecção ou não interfere com processos de detecção de sequenciamento).

[036] Como mencionado aqui, os exemplos da composição de resina curada revelada aqui têm emissões mínimas de azul e verde e também exibem autofluorescência muito baixa ou nenhuma autofluorescência quando expostos a comprimentos de onda de excitação azul e verde. Como usado aqui, comprimentos de onda de emissão azul incluem de cerca de 463 nm a cerca de 514 e comprimentos de onda de emissão verde incluem de cerca de 583 nm a cerca de 660 nm. Também como usados aqui, comprimentos de onda de excitação azul incluem de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm e comprimentos de onda de excitação verde incluem de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm. Em um outro exemplo, os comprimentos de onda de excitação azul variam de cerca de 440 nm a cerca de 457 nm ou os comprimentos de onda de excitação verde variam de cerca de 519 nm a cerca de 535 nm. Ainda em um outro exemplo, os comprimentos de onda de excitação azul variam de cerca de 400 nm a cerca de 480 nm.

[037] Em alguns exemplos, a composição de resina curada é descrita como não tendo nenhuma fluorescência (emissão de luz) quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul e/ou comprimentos de onda de excitação verde. Nenhuma fluorescência ou nenhuma autofluorescência significa que o nível de fluorescência está abaixo de um valor-limite de detecção. Nenhuma fluorescência ou nenhuma autofluorescência, como os termos são definidos aqui, pode ocorrer quando a composição de resina curada foi fotobranqueada. Em outros exemplos, a composição de resina curada produz fluorescência (emite luz) quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul e/ou comprimentos de onda de excitação verde. Nestes exemplos, o termo “baixa autofluorescência” pode significar que o nível de emissão (da resina curada quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul e/ou comprimentos de onda de excitação verde) está acima do valor-limite de detecção, mas é baixo o bastante para ser considerado ruído e o ruído não interfere com os sinais de identificação de agrupamento durante o sequenciamento (por exemplo, os níveis de autofluorescência permitem razões de sinal para ruído (SNRs) que são altas o bastante de modo que sinais de agrupamentos individuais possam ser resolvidos durante o sequenciamento).

[038] Deve ser entendido que a definição de “baixo” ou “nível baixo”, em termos de quantificar a autofluorescência, pode variar dependendo da ferramenta usada para medir a autofluorescência e/ou lâmpadas usadas para fornecer a radiação da excitação. Por exemplo, quando um Amersham TYPHOON™ (anteriormente TYPHOON™ FLA 7000) (disponível da GE Healthcare Life Sciences) é usado para medir a autofluorescência da composição de resina curada após a exposição a comprimentos de onda de excitação azul, a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 25.000. Para um outro exemplo, quando o Amersham TYPHOON™ é usado para medir a autofluorescência da composição de resina curada após a exposição a comprimentos de onda de excitação azul, a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 5.000. Para ainda um outro exemplo, quando Amersham TYPHOON™ é usado para medir a autofluorescência da composição de resina curada após a exposição a comprimentos de onda de excitação verde, a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 10.000. Para ainda um outro exemplo, quando Amersham TYPHOON™ é usado para medir a autofluorescência da composição de resina curada após a exposição a comprimentos de onda de excitação verde, a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 2,500.

[039] A autofluorescência também pode ser medida usando uma ferramenta baseada em espectrômetro. O debate de um exemplo de uma ferramenta baseada em espectrômetro é encontrado no exemplo 2 abaixo. Em um exemplo, quando uma ferramenta baseada em espectrômetro é usada para medir a autofluorescência da composição de resina curada após a exposição a comprimentos de onda de excitação azul, a baixa autofluorescência corresponde com uma intensidade de fluorescência (em unidades arbitrárias (AU)) de menos do que cerca de 400 AU. Em um outro exemplo, quando uma ferramenta baseada em espectrômetro é usada para medir a autofluorescência da composição de resina curada após a exposição a comprimentos de onda de excitação verde, a baixa autofluorescência corresponde com uma intensidade de fluorescência (em unidades arbitrárias (AU)) de menos do que cerca de 500 AU.

[040] Deve ser entendido que termos usados aqui assumirão seu significado habitual na técnica relevante a menos que especificado de outro modo. Vários termos usados aqui e seus significados são apresentados abaixo.

[041] As formas no singular “um”, “uma” e “o”, “a” incluem referentes no plural a menos que o contexto claramente dite de outro modo.

[042] Os termos compreendendo, incluindo, contendo e várias formas destes termos são sinônimos entre si e são significados como sendo igualmente amplos.

[043] Os termos topo, fundo, inferior, superior, sobre, etc. são usados aqui para descrever a célula de fluxo e/ou os vários componentes da célula de fluxo. Deve ser entendido que estes termos direcionais não pretendem implicar uma orientação específica, mas são usados para designar a orientação relativa entre os componentes. O uso de termos direcionais não deve ser interpretado para limitar os exemplos revelados aqui a quaisquer orientações específicas.

[044] Uma “acrilamida” é um grupo funcional com a estrutura ou um monômero incluindo um grupo acrilamida com esta estrutura. Uma acrilamida pode ser o composto químico acilamida com um substituinte no lugar de um ou mais átomos de hidrogênio (por exemplo, metacrilamida). Exemplos do monômero incluindo um grupo acrilamida incluem azido acetamido pentil acrilamida: e N-isopropilacrilamida:

. Outros monômeros de acrilamida podem ser usados.

[045] Um “aldeído”, como usado aqui, é um composto orgânico contendo um grupo funcional com a estrutura -CHO, que inclui um centro carbonila (isto é, um carbono duplamente ligado a oxigênio) com o átomo de carbono também ligado a hidrogênio e um grupo R, tal como um alquila ou outra cadeia lateral. A estrutura geral de um aldeído é: .

[046] Como usado aqui, “alquila” se refere a uma cadeia hidrocarboneto reta ou ramificada que é completamente saturada (isto é, não contém nenhuma ligação dupla ou tripla). O grupo alquila pode ter 1 a 20 átomos de carbono. Grupos alquila de exemplo incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, butila terciário, pentila, hexila e semelhantes. Como um exemplo, a designação “C1-4 alquila” indica que existem um a quatro átomos de carbono na cadeia alquila, isto é, a cadeia alquila é selecionada a partir do grupo que consiste em metila, etila, propila, iso-propila, n-butila, isobutila, sec-butila e t-butila.

[047] Como usado aqui, “alquenila” se refere a uma cadeia hidrocarboneto reta ou ramificada contendo uma ou mais ligações duplas. O grupo alquenila pode ter 2 a 20 átomos de carbono. Grupos alquenila de exemplo incluem etenila, propenila, butenila, pentenila, hexenila e semelhantes.

[048] Como usado aqui, “alcino” ou “alquinila” se refere a uma cadeia hidrocarboneto reta ou ramificada contendo uma ou mais ligações triplas. O grupo alquinila pode ter 2 a 20 átomos de carbono.

[049] Como usado aqui, “arila” se refere a um anel aromático ou sistema de anel (isto é, dois ou mais anéis fundidos que compartilham dois átomos de carbono adjacentes) contendo apenas carbono na cadeia principal do anel. Quando o arila é um sistema de anel, cada anel no sistema é aromático. O grupo arila pode ter 6 a 18 átomos de carbono. Exemplos de grupos arila incluem fenila, naftila, azulenila e antracenila.

[050] Um grupo funcional “amino” se refere a um grupo -NRaRb, onde Ra e Rb são todos independentemente selecionados a partir de hidrogênio (por exemplo, ), C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila de 5 a 10 membros e heterociclila de 5 a 10 membros, como definido aqui.

[051] Como usado aqui, o termo “ligado” se refere ao estado de duas coisas sendo unidas, fixadas, aderidas, conectadas ou ligadas uma à outra, direta ou indiretamente. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser ligado a um revestimento polimérico por uma ligação covalente ou não covalente. Uma ligação covalente é caracterizada pelo compartilhamento de pares de elétrons entre os átomos. Uma ligação não covalente é uma ligação física que não envolve o compartilhamento de pares de elétrons e pode incluir, por exemplo, ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de van der Waals, interações hidrofílicas e interações hidrofóbicas.

[052] Um grupo funcional “azida” ou “azido” se refere a -N3.

[053] Como usado aqui, uma “região de ligação” se refere a uma área sobre um substrato que deve ser ligado a um outro material, que pode ser, como exemplos, uma camada espaçadora, uma tampa, um outro substrato, etc. ou combinações dos mesmos (por exemplo, uma camada espaçadora e uma tampa). A ligação que é formada na região de ligação pode ser uma ligação química (como descrito acima) ou uma ligação mecânica (por exemplo, usando um fixador, etc.).

[054] Como usado aqui, “carbociclila” significa um anel cíclico não aromático ou sistema de anel contendo apenas átomos de carbono no sistema de cadeia principal do anel. Quando o carbociclila é um sistema de anel, dois ou mais anéis podem ser reunidos em uma forma fundida, ligada em ponte ou espiro-conectada. Carbociclilas podem ter qualquer grau de saturação, contanto que pelo menos um anel em um sistema de anel não seja aromático. Assim, carbociclilas incluem cicloalquilas, cicloalquenilas e cicloalquinilas. O grupo carbociclila pode ter 3 a 20 átomos de carbono. Exemplos de anéis de carbociclila incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila, cicloexenila, 2,3-diidro- indeno, biciclo[2.2.2]octanila, adamantila e espiro[4.4]nonanila.

[055] Como usado aqui, “cicloalquenila” ou “cicloalceno” significa um anel de carbociclila ou sistema de anel tendo pelo menos uma ligação dupla, em que nenhum anel no sistema de anel é aromático. Exemplos incluem cicloexenila ou cicloexeno e norbornenila ou norborneno. Também como usado aqui, “heterocicloalquenila” ou “heterocicloalceno” significa um anel de carbociclila ou sistema de anel com pelo menos um heteroátomo na cadeia principal do anel, tendo pelo menos uma ligação dupla, em que nenhum anel no sistema de anel é aromático.

[056] Como usado aqui, “cicloalquila” significa quaisquer grupos univalentes derivados de cicloalcanos por remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono do anel (por exemplo, de um cicloalcano). Um exemplo inclui 2-metilciclopropila.

[057] Como usado aqui, “cicloalquinila” ou “cicloalcino” significa um anel de carbociclila ou sistema de anel tendo pelo menos uma ligação tripla, em que nenhum anel no sistema de anel é aromático. Um exemplo é ciclo-octino. Um outro exemplo é biciclononino. Também como usado aqui, “heterocicloalquinila” ou “heterocicloalcino” significa um anel de carbociclila ou sistema de anel com pelo menos um heteroátomo na cadeia principal do anel,

tendo pelo menos uma ligação tripla, em que nenhum anel no sistema de anel é aromático.

[058] Como usado aqui, o termo “depressão” se refere a uma característica côncava distinta em uma resina padronizada tendo uma abertura de superfície que é pelo menos parcialmente circundada por região(ões) intersticial(is) da resina padronizada. Depressões podem ter qualquer uma de uma variedade de formas em sua abertura em uma superfície incluindo, como exemplos, redonda, elíptica, quadrada, poligonal, em forma de estrela (com qualquer número de vértices), etc. A seção transversal de uma depressão tomada ortogonalmente com a superfície pode ser curva, quadrada, poligonal, hiperbólica, cônica, angular, etc. Como exemplos, a depressão pode ser um poço ou uma vala/linha/calha. A depressão também pode ter arquiteturas mais complexas, tais como cristas, degraus, etc.

[059] Como usado aqui, o termo “célula de fluxo” é intencionado a significar um vaso tendo uma câmara (isto é, canal de fluxo) onde uma reação pode ser realizada, uma entrada para liberar reagente(s) à câmara e uma saída para remover o(s) reagente(s) da câmara. Em alguns exemplos, a câmara permite a detecção da reação que ocorre na câmara. Por exemplo, a câmara/canal de fluxo pode incluir uma ou mais superfícies transparentes considerando a detecção óptica dos arranjos, moléculas opticamente rotuladas ou semelhantes, na depressão.

[060] Como usado aqui, um “canal de fluxo” pode ser uma área definida entre dois componentes ligados, que pode seletivamente receber uma amostra líquida. Em alguns exemplos, o canal de fluxo pode ser definido entre uma resina padronizada e uma tampa e assim pode estar em comunicação fluida com uma ou mais depressões definidas na resina padronizada.

[061] Como usado aqui, “heteroarila” se refere a um anel aromático ou sistema de anel (isto é, dois ou mais anéis fundidos que compartilham dois átomos adjacentes) que contém um ou mais heteroátomos, isto é, um elemento exceto carbono, incluindo, mas não limitado a, nitrogênio, oxigênio e enxofre, na cadeia principal do anel. Quando o heteroarila é um sistema de anel, cada anel no sistema é aromático. O grupo heteroarila pode ter 5 a 18 membros no anel.

[062] Como usado aqui, “heterociclila” significa um anel cíclico não aromático ou sistema de anel contendo pelo menos um heteroátomo na cadeia principal do anel. Heterociclilas podem ser reunidos em uma forma fundida, ligada em ponte ou espiro-conectada. Heterociclilas podem ter qualquer grau de saturação contanto que pelo menos um anel no sistema de anel não seja aromático. No sistema de anel, o(s) heteroátomo(s) podem estar presentes em um anel não aromático ou aromático. O grupo heterociclila pode ter 3 a 20 membros no anel (isto é, o número de átomos que compõem a cadeia principal do anel, incluindo átomos de carbono e heteroátomos). Em alguns exemplos, o(s) heteroátomo(s) são O, N ou S.

[063] O termo “hidrazina” ou “hidrazinila” como usado aqui se refere a um grupo -NHNH2.

[064] Como usado aqui, o termo “hidrazona” ou “hidrazonila” se refere a um grupo em que Ra e Rb são todos independentemente selecionados a partir de hidrogênio (por exemplo, ), C1-C6 alquila, C2- C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila de 5 a 10 membros e heterociclila de 5 a 10 membros, como definido aqui.

[065] Como usado aqui, “hidróxi” ou “hidroxila” se refere a um grupo -OH.

[066] Como usado aqui, o termo “região intersticial” se refere a uma área em uma superfície (por exemplo, de uma resina padronizada) que separa as depressões. Por exemplo, uma região intersticial pode separar uma característica de um arranjo de uma outra característica do arranjo. As duas características que são separadas uma da outra podem ser distintas, isto é, carecendo de contato físico entre si. Em um outro exemplo, uma região intersticial pode separar uma primeira porção de uma característica de uma segunda porção de uma característica. Em muitos exemplos, a região intersticial é contínua ao passo que as características são distintas, por exemplo, como é o caso para uma pluralidade de poços definidos em uma superfície de outro modo contínua. Em outros exemplos, as regiões intersticiais e as características são distintas, por exemplo, como é o caso para uma pluralidade de valas separadas pelas respectivas regiões intersticiais. A separação fornecida por uma região intersticial pode ser separação parcial ou total. Regiões intersticiais podem ter um material de superfície que difere do material de superfície das características definidas na superfície. Por exemplo, as características de um arranjo podem ter uma quantidade ou concentração de um revestimento polimérico e iniciador(es) que excede a quantidade ou concentração presente nas regiões intersticiais. Em alguns exemplos, o revestimento polimérico e iniciador(es) podem não estar presentes nas regiões intersticiais.

[067] “Óxido de nitrila”, como usado aqui, significa um grupo “RaC≡N+O-” em que Ra é definido aqui. Exemplos da preparação de óxido de nitrila incluem geração in situ de aldoximas por tratamento com cloramida-T ou através da ação da base sobre cloretos de imidoíla [RC(Cl)=NOH] ou da reação entre hidroxilamina e um aldeído.

[068] “Nitrona”, como usado aqui, significa um grupo em que R1, R2 e R3 podem ser qualquer um dos grupos Ra e Rb definidos aqui.

[069] Como usado aqui, um “nucleotídeo” inclui uma base heterocíclica contendo nitrogênio, um açúcar e um ou mais grupos fosfato. Nucleotídeos são unidades monoméricas de uma sequência de ácido nucleico. Em RNA, o açúcar é uma ribose e em DNA, o açúcar é uma desoxirribose, isto é, um açúcar que carece de um grupo hidroxila que está presente na posição 2’ em ribose. A base heterocíclica contendo nitrogênio (isto é, nucleobase) pode ser uma base de purina ou uma base de pirimidina. Bases de purina incluem adenina (A) e guanina (G) e derivados modificados ou análogos das mesmas. Bases de pirimidina incluem citosina (C), timina (T) e uracila (U) e derivados modificados ou análogos das mesmas. O átomo C-1 da desoxirribose é ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina. Um análogo de ácido nucleico pode ter qualquer um da cadeia principal de fosfato, do açúcar ou da nucleobase alterado. Exemplos de análogos de ácido nucleico incluem, por exemplo, bases universais ou análogos da cadeia principal de fosfato de açúcar, tal como ácido peptidonucleico (PNA).

[070] Como usado aqui, um “gerador de fotoácido” (PAG) é uma molécula que libera prótons após a exposição à radiação. PAGs geralmente passam por fotodissociação de prótons irreversivelmente.

[071] Como usado aqui, um “fotoiniciador” (PI) é uma molécula que passa por uma fotorreação após a absorção da radiação, produzindo desse modo espécies reativas. Fotoiniciadores são capazes de iniciar ou catalisar reações químicas que resultam em mudanças na solubilidade e/ou propriedades físicas de formulações.

[072] Como usado aqui, o “iniciador” é definido como uma sequência de ácido nucleico de filamento único (por exemplo, DNA de filamento único ou RNA de filamento único). Alguns iniciadores, que podem ser referidos como iniciadores de amplificação, servem como um ponto de partida para a amplificação padrão e geração de agrupamento. Outros iniciadores, que podem ser referidos como iniciadores de sequenciamento, servem como um ponto de partida para a síntese de DNA ou RNA. O término 5’ do iniciador pode ser modificado para permitir uma reação de acoplamento com um grupo funcional de um revestimento polimérico. O comprimento do iniciador pode ser qualquer número de bases em comprimento e pode incluir uma variedade de nucleotídeos não naturais. Em um exemplo, o iniciador de sequenciamento é um filamento curto, variando de 10 a 60 bases ou de 20 a 40 bases.

[073] Uma “camada espaçadora”, como usada aqui, se refere a um material que liga dois componentes juntos. Em alguns exemplos, a camada espaçadora pode ser um material absorvente de radiação que auxilia na ligação ou pode ser colocado em contato com um material absorvente de radiação que auxilia na ligação.

[074] Um grupo funcional “tiol” se refere a -SH.

[075] Como usados aqui, os termos “tetrazina” e “tetrazinila” se referem a grupo heteroarila de seis membros compreendendo quatro átomos de nitrogênio. Tetrazina pode ser opcionalmente substituída.

[076] “Tetrazol”, como usado aqui, se refere a grupo heterocíclico de cinco membros incluindo quatro átomos de nitrogênio. Tetrazol pode ser opcionalmente substituído.

[077] Nos exemplos revelados aqui, o complexo de resina inclui uma matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano e um fotoiniciador de radical livre em que, quando curada, a composição de resina tem baixa ou nenhuma autofluorescência quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul variando de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm ou comprimentos de onda de excitação verde variando de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm.

[078] A matriz de resina curável por radical livre inclui um grupo acrilato e um grupo siloxano. Como usado aqui, o termo “acrilato” se refere a um grupo funcional “CH₂=CHCOO-” (isto é, ) ou um grupo funcional “CH₂=C(CH3)COO-” (isto é, metacrilato). Acrilatos incluem variações substituídas do mesmo (por exemplo, metacrilato é um exemplo de um acrilato). Um grupo siloxano é um grupo funcional que inclui uma ligação Si-O-Si. O peso molecular e a densidade de reticulação do(s) monômero(s) da matriz de resina curável por radical livre podem variar, contanto que a composição de resina seja imprimível por intermédio dos métodos revelados aqui. Em um exemplo, o peso molecular do(s) monômero(s) da matriz de resina curável por radical livre pode variar de cerca de 0,5 kDa a cerca de 5 kDa ou de cerca de 1 kDa a cerca de 4,5 kDa. A funcionalidade da reticulação e por sua vez, a densidade de reticulação, dependem do número de braços (por exemplo, di, tri, tetra) do monômero.

[079] Exemplos da matriz de resina curável por radical livre são matrizes compreendendo um acrilato selecionado a partir do grupo que consiste em: i) 1,3-bis(3-metacriloxipropil) tetrametildissiloxano: ,

ii) polidimetilsiloxano terminado em metacriloxipropil:

(em que n varia de 1 a 1000 ou qualquer faixa entre, por exemplo, de 1 a 500 ou 1 a 100 ou 2 a 50, 1 a 10, 1 a 2, etc.), iii) tetrametil tetracis[3-acriloxipropil]ciclotetrassiloxano:

, iv) metacril silsesquioxano poliédrico oligomérico (POSS):

,

v) acrilo silsesquioxano poliédrico oligomérico: , vi) homopolímero de acriloxipropil metilsiloxano: (em que m varia de 1 a 1000 ou qualquer faixa entre, por exemplo, 1 a 500, 30 a 200, 30 a 100, etc.), e vii) combinações dos mesmos. Quando combinações são usadas, deve ser entendido que quaisquer duas ou mais das matrizes de resina curável por radical livre listadas podem ser usadas juntas na composição de resina contanto que elas sejam ambas solúveis no solvente usado na composição.

[080] O fotoiniciador nas composições de resina de exemplo reveladas aqui pode ser qualquer fotoiniciador gerador de radical livre que exibe baixa autofluorescência na resina curada.

[081] Em alguns exemplos, o fotoiniciador de radical livre é 2-etil-9,10- dimetoxiantraceno: .

[082] Em outros exemplos, o fotoiniciador de radical livre é 2,2-dimetóxi- 2-fenilacetofenona: .

[083] Ainda em outros exemplos, o fotoiniciador de radical livre é 2-etóxi- 2-fenilacetofenona (a.k.a., éter etílico de benzoína): .

[084] Ainda em outros exemplos, o fotoiniciador de radical livre é um óxido de fosfina. Quando o óxido de fosfina é usado, ele pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: i) óxido de difenil(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfina:

, ii) uma mistura de óxido de difenil(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfina e 2-hidróxi- 2-metilpropiofenona:

, iii) óxido de fenilbis(2,4,6-,trimetilbenzoil)fosfina:

iv) etil(2,4,6-trimetilbenzoil)fenilfosfinato:

;e v) combinações dos mesmos.

Quando combinações são usadas, deve ser entendido que quaisquer dois ou mais dos fotoiniciadores de radical livre listados podem ser usados juntos na composição de resina contanto que eles sejam ambos solúveis no solvente usado na composição.

[085] A composição de resina pode ser fabricada misturando-se a matriz de resina curável por radical livre com o fotoiniciador. Em um exemplo, uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina curável por radical livre para o fotoiniciador varia de cerca de 99,8:0,2 a 90:10. Em um outro exemplo, uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina curável por radical livre para o fotoiniciador varia de cerca de 98:2 a 95:5. Ainda em um outro exemplo, uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina curável por radical livre para o fotoiniciador varia de cerca de 96:4 a 99:1. Quando quantidades mais baixas do fotoiniciador são incluídas, o tempo de cura UV pode ser aumentado para levar em consideração a reação completa.

[086] Deve ser entendido que a razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina curável por radical livre para o fotoiniciador pode ser mais alta ou mais baixa dependendo, pelo menos em parte, do(s) componente(s) da matriz de resina curável por radical livre que são usados.

[087] De modo a depositar a composição de resina, estes componentes (a matriz de resina curável por radical livre e o fotoiniciador) podem ser diluídos em um solvente adequado (para obter uma viscosidade desejada para a técnica de deposição usada), tal como acetato de éter monometílico de propileno glicol (PGMEA), tolueno, dimetil sulfóxido (DMSO), tetraidrofurano (THF), etc. Em um exemplo, a concentração da matriz de resina curável por radical livre no solvente varia de cerca de 15 % em peso (em porcentagem de peso) a cerca de 56 % em peso e a concentração do fotoiniciador no solvente varia de cerca de 1 % em peso a cerca de 10 % em peso, embora acredite-se que os limites superiores possam ser mais altos dependendo da respectiva solubilidade da matriz de resina curável por radical livre e fotoiniciador no solvente que é selecionado. Em um exemplo, o solvente é PGMEA. A concentração total (incluindo a matriz de resina curável por radical livre e o fotoiniciador (e um poliacrilato ou surfactante, se usado)) da composição de resina final pode variar de cerca de 16 % em peso a cerca de 66 % em peso. A quantidade de solvente pode variar de cerca de 34 % em peso a cerca de 84 % em peso.

[088] Em alguns exemplos, a composição de resina pode incluir ainda um supressor escuro ou um aceptor de elétron. Um supressor escuro é uma substância que absorve a energia da luz de um fluoróforo e dissipa a energia como calor. Isto fornece uma via não radiativa para atenuação das espécies de estado excitado. Nos exemplos revelados aqui, o supressor escuro selecionado deve ser capaz de absorver autofluorescência azul e/ou verde da composição de resina curada. Um aceptor de elétron também pode induzir a supressão da fluorescência.

[089] Em um exemplo, o supressor escuro pode compreender corantes azo. Em um outro exemplo, o supressor escuro compreende um derivado de azobenzeno substituído selecionado a partir do grupo que consiste em: ácido 4- dimetilaminoazobenzeno-4’-carboxílico: , dabcil azida: , dabsil-azida: , vermelho 19 disperso: , aditivos de pigmento de negro de carbono (CBP), um supressor à base de corante preto (tal como, por exemplo, supressor de autofluorescência de lipofuscina TRUEBLACK®, 20X em DMF) e combinações dos mesmos. Exemplos de aceptores de elétron adequados podem incluir [5.6]-fulereno-C70: ou fulereno-C60: .

[090] Em um exemplo, o supressor escuro ou o aceptor de elétron pode estar presente em uma quantidade variando de cerca de 0,1 % em peso a cerca de 10 % em peso, com base em um peso total da composição de resina.

[091] Alguns outros exemplos da composição de resina podem incluir ainda um poliacrilato ou um surfactante. Um exemplo de um poliacrilato comercialmente disponível é BYK®-350 (disponível da BYK Additives & Instruments). Qualquer surfactante biocompatível pode ser usado, tal como surfactantes TWEEN® (por exemplo, ésteres de polietileno sorbitol (TWEEN® 80) e ésteres de polioxietileno sorbitol (TWEEN® 20) da Uniqema Americas LLC); TRITON™ X-100 (Etoxilato de Octilfenol da The Dow Chemical Co.) e surfactantes poliméricos disponíveis da BYK Additives and Instruments. Em um exemplo, o poliacrilato ou surfactante pode estar presente na composição de resina em uma quantidade variando de cerca de 0,4 % em peso total de sólidos a cerca de 1,6 % em peso total de sólidos.

[092] Em alguns exemplos, a composição de resina pode incluir ainda uma matriz de resina epóxi em combinação com a matriz de resina curável por radical livre. Diferente da matriz de resina curável por radical livre revelada aqui, matrizes de resina epóxi envolvem um sistema de cura de duas partes, onde os radicais livres gerados pelo fotoiniciador revelado aqui reagem com um gerador de fotoácido, que decompõe para gerar um superácido, que, por sua vez, inicia a polimerização e/ou a reticulação do(s) componente(s) da matriz de resina epóxi. Como tal, nos exemplos que incluem um epóxi além da matriz de resina curável por radical livre, deve ser entendido que a composição de resina também inclui um gerador de fotoácido. Nestes exemplos, acredita-se que o Fotoiniciador derivado de antraceno Tipo II de Norrish e os fotoiniciadores de acetofenona Tipo I de Norrish ou óxido de fosfina revelados aqui podem gerar radicais com exposição UVA, que podem contribuir para o sistema de cura de duas partes com o gerador de fotoácido, sem passar por interações intramoleculares que levam à autofluorescência indesejável em comprimentos de onda de excitação azul e/ou verde de interesse. Exemplos de matrizes de resina epóxi e geradores de fotoácido adequados que podem ser adicionados à composição de resina revelada aqui serão agora descritos.

[093] Qualquer monômero de epóxi que pode reticular com a resina curável por radical livre revelada aqui pode ser usado. Exemplos de matrizes de resina epóxi adequadas incluem: i) um silsesquioxano poliédrico oligomérico (POSS) funcionalizado em epóxi (descrito ainda aqui abaixo); ii) éter triglicidílico de trimetilolpropano: ;

iii) tetracis(epoxicicloexil etil)tetrametil ciclotetrassiloxano:

; iv) um copolímero de (epoxicicloexiletil)metilsiloxano e dimetilsiloxano:

(em que uma razão de m:n varia de 8:92 a 10:90); v) 1,3-bis[2-(3,4-epoxicicloexil)etil] tetrametil dissiloxano:

; vi) 1,3-bis(glicidoxipropil)tetrametil dissiloxano:

;e vii) combinações dos mesmos. Quando combinações são usadas, deve ser entendido que quaisquer duas ou mais das matrizes de resina epóxi listadas podem ser usadas juntas na composição de resina revelada aqui.

[094] O silsesquioxano poliédrico oligomérico funcionalizado em epóxi inclui um núcleo de silsesquioxano poliédrico oligomérico (POSS) que é funcionalizado com grupos epóxi. Como usado aqui, o termo “silsesquioxano poliédrico oligomérico” (POSS) se refere a uma composição química que é um intermediário híbrido (RSiO1,5) entre aquela de sílica (SiO2) e silicona (R2SiO). Um exemplo de POSS pode ser aquele descrito em Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), páginas 776 - 778, que é incorporado a título de referência em sua totalidade. A composição é um composto de organossilício com a fórmula química [RSiO3/2]n, onde os grupos R podem ser os mesmos ou diferentes. A composição de resina revelada aqui pode compreender uma ou mais estruturas de gaiola ou núcleo diferentes como unidades monoméricas. Em alguns exemplos, a estrutura inclui uma estrutura polioctaédrica de gaiola ou núcleo. Por exemplo, a estrutura poliédrica pode ser uma estrutura T8, tal como:

e representada por: . Esta unidade monomérica tipicamente tem oito braços de grupos funcionais R1 a R8.

[095] A unidade monomérica pode ter uma estrutura de gaiola com 10 átomos de silício e 10 grupos R, referida como T10, tal como: ou pode ter uma estrutura de gaiola com 12 átomos de silício e 12 grupos R, referida como T12, tal como: . O material com base em POSS pode incluir alternativamente estruturas de gaiola T6, T14 ou T16. O conteúdo da gaiola média pode ser ajustado durante a síntese e/ou controlado por métodos de purificação e uma distribuição de tamanhos de gaiola da(s) unidade(s) monomérica(s) pode ser usada nos exemplos revelados aqui. Como exemplos, qualquer uma das estruturas de gaiola pode estar presente em uma quantidade variando de cerca de 30 % a cerca de 100 % das unidades monoméricas de POSS totais usadas. O material com base em POSS pode ser uma mistura de estruturas de gaiola junto com estruturas de gaiola aberta e parcialmente aberta. Assim, um precursor de resina ou resina com base em POSS pode incluir materiais de POSS epóxi, que podem ser uma mistura de configurações de silsesquioxano. Por exemplo, qualquer material de POSS descrito aqui pode ser uma mistura de gaiolas de POSS distintas e estruturas de silsesquioxano não distintas e/ou estruturas distintas, incompletamente condensadas, tais como polímeros, escadas e semelhantes. Os materiais parcialmente condensados, portanto, incluiriam grupos R epóxi como descrito aqui em alguns vértices de silício, mas alguns átomos de silício não seriam substituídos com os grupos R e podem ser substituídos em vez de grupos OH. Em alguns exemplos, os materiais de POSS compreendem uma mistura de várias formas, tal como:

[096] Nos exemplos revelados aqui, pelo menos um de R1 a R8 ou R10 ou R12 compreende um epóxi e assim o POSS é referido como um POSS epóxi. Em alguns exemplos, a maioria dos braços, tal como os oito, dez ou doze braços ou grupos R, compreendem grupos epóxi. Em outros exemplos, R1 a R8 ou R10 ou R12 são os mesmos e assim cada um de R1 a R8 ou R10 ou R12 compreende um grupo epóxi. Ainda em outros exemplos, R1 a R8 ou R10 ou R12 não são os mesmos e assim pelo menos um de R1 a R8 ou R10 ou R12 compreende epóxi e pelo menos um outro de R1 a R8 ou R10 ou R12 é um grupo epóxi não funcional, que em alguns casos é selecionado a partir do grupo que consiste em um azida/azido, um tiol, um poli(etileno glicol), um norborneno, uma tetrazina, acrilatos e metacrilatos ou ainda, por exemplo, grupos alquila, arila, alcóxi e haloalquila. Em alguns aspectos, o grupo epóxi não funcional é selecionado para aumentar a energia de superfície da resina. Nestes outros exemplos, a razão de grupos epóxi para grupos não epóxi varia de 7:1 a 1:7 ou 9:1 a 1:9 ou 11:1 a 1:11. Em qualquer um dos exemplos, grupo(s) epóxi dissubstituído(s) ou monossubstituído(s) (terminal(is)) permitem que a unidade monomérica polimerize em uma matriz reticulada após a iniciação usando luz ultravioleta (UV) e um ácido. Em alguns aspectos, o POSS epóxi compreende grupos epóxi terminais. Um exemplo deste tipo de POSS é glicidil POSS tendo a estrutura: .

[097] Um outro exemplo deste tipo de POSS é POSS funcionalizado em epoxicicloexil etila tendo a estrutura:

.

[098] Um exemplo da matriz de resina epóxi revelada aqui inclui uma combinação de dois compostos de POSS epóxi, onde a combinação inclui glicidil POSS e POSS funcionalizado em epoxicicloexil etila.

[099] Nos exemplos revelados aqui, o POSS epóxi também pode ser um POSS epóxi modificado, que inclui um agente de polimerização via radical controlada (CRP) e/ou um outro grupo funcional de interesse incorporado na resina ou núcleo ou estrutura de gaiola como um ou mais dos grupos funcionais R1 a R8 ou R10 ou R12.

[0100] Como mencionado acima, quando uma matriz de resina epóxi é usada em combinação com a matriz de resina curável por radical livre, a composição de resina também inclui um gerador de fotoácido. Acredita-se que qualquer gerador de fotoácido adequado que não passará por interações intramoleculares indesejáveis com o fotoiniciador de radical livre revelado aqui pode ser usado. Exemplos de geradores de fotoácido adequados podem incluir benzila, imino éster, imino éster conjugado, espiropirano, com base em teraileno, dois fótons e sistemas de PAG organometálicos. Alguns exemplos específicos de geradores de fotoácido adequados são selecionados a partir do grupo que consiste em: i) triflato de N-hidroxinaftalimida:

; ii) sais de hexafluorofosfato de triarilsulfônio, mistos:

; iii) sais de hexafluoroantimonato de triarilsulfônio, mistos:

; iv) triflato de 1-naftil difenilsulfônio (NDS-TF):

; v) triflato de (4-feniltiofenil)difenilsulfônio:

; vi) hexafluorofosfato de bis-(4-metilfenil)iodônio:

; vii) hexafluorofosfato de bis(4-terc-butilfenil)iodônio:

; viii) triflato de (2-metilfenil)(2,4,6-trimetilfenil)iodônio:

; xi) triflato de bis(2,4,6-trimetilfenil)iodônio:

; x) sal de hexafluoroantimonato de bis-(4-dedecilfenil)iodônio:

;e xi) combinações dos mesmos. Combinações dos geradores de fotoácido podem ser usadas contanto que elas sejam solúveis no solvente selecionado.

[0101] Em um exemplo da composição de resina incluindo a matriz de resina epóxi e o gerador de fotoácido, uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina epóxi para o gerador de fotoácido varia de cerca de 99,8:0,2 a 90:10. Em um outro exemplo, uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina epóxi para o gerador de fotoácido varia de cerca de 98:2 a 95:5. Ainda em um outro exemplo, uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina epóxi para o gerador de fotoácido varia de cerca de 96:4 a 99:1. Quando quantidades mais baixas do gerador de fotoácido são incluídas, o tempo de cura UV pode ser aumentado para levar em consideração a reação completa.

[0102] Deve ser entendido que a razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina epóxi para o gerador de fotoácido pode ser mais alta ou mais baixa dependendo, pelo menos em parte, do(s) componente(s) da matriz de resina epóxi que são usados.

[0103] Qualquer exemplo da composição de resina revelada aqui pode ser usado na formação da célula de fluxo. Um exemplo de um método 100 para fabricar um exemplo de uma célula de fluxo é mostrado na Fig. 1. Como mostrado na Fig. 1, o método 100 inclui depositar uma composição de resina sobre um substrato, a composição de resina incluindo uma matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano e um fotoiniciador de radical livre (numeral de referência 102); nanoimprimir a composição de resina depositada usando um carimbo de trabalho (numeral de referência 104); e curar a composição de resina depositada para formar uma resina padronizada curada, em que a resina padronizada curada tem baixa ou nenhuma autofluorescência quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul variando de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm ou comprimentos de onda de excitação verde variando de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm (numeral de referência 106). A célula de fluxo resultante inclui um substrato e uma resina padronizada curada no substrato, a resina padronizada curada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais e a resina padronizada curada tendo sido formada a partir de um exemplo da composição de resina revelada aqui.

[0104] Embora não mostrado na Fig. 1, exemplos do método 100 podem incluir ainda aplicar um revestimento polimérico nas depressões e enxertar um iniciador ao revestimento polimérico. O método 100, incluindo estes processos adicionais, será agora descrito ainda em referência às Figs. 2A a 2E.

[0105] A Fig. 2A descreve um substrato 12 e a Fig. 2B descreve uma composição de resina 14 depositada no substrato 12.

[0106] Exemplos de substrato 12 adequado incluem epóxi siloxano, vidro e vidro modificado ou funcionalizado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (tal como TEFLON® da Chemours), olefinas cíclicas/polímeros de ciclo-olefina (COP) (tal como ZEONOR® da Zeon), poliimidas, etc.), náilon, cerâmicas/óxidos cerâmicos, sílica, sílica fundida ou materiais à base de sílica, silicato de alumínio, silício e silício modificado (por exemplo, silício tipo p+ dopado com boro), nitreto de silício (Si3N4), óxido de silício (SiO2), pentóxido de tântalo (TaO5) ou outro(s) óxido(s) de tântalo (TaOx), óxido de háfnio (HaO2), carbono, metais, vidros inorgânicos ou semelhantes. O substrato 12 também pode ser vidro ou silício, com uma camada de revestimento de óxido de tântalo ou um outro óxido cerâmico na superfície.

[0107] Em um exemplo, o substrato 12 pode ter um diâmetro variando de cerca de 2 mm a cerca de 300 mm ou uma folha ou painel retangulares tendo sua maior dimensão até cerca de 10 pés (~ 3 metros). Em um exemplo, o substrato 12 é uma pastilha tendo um diâmetro variando de cerca de 200 mm a cerca de 300 mm. Em um outro exemplo, o substrato 12 é um molde tendo uma largura variando de cerca de 0,1 mm a cerca de 10 mm. Embora dimensões de exemplo tenham sido fornecidas, deve ser entendido que um substrato 12 com quaisquer dimensões adequadas pode ser usado. Para um outro exemplo, um painel pode ser usado que é um substrato retangular 12, que tem uma maior área de superfície do que uma pastilha redonda de 300 mm.

[0108] A composição de resina 14 pode ser quaisquer exemplos da composição de resina descrita aqui, que inclui a matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano e o iniciador de radical livre (ou uma matriz de resina epóxi em combinação com a matriz de resina curável por radical livre). A composição de resina 14 pode ser depositada no substrato 12 usando qualquer técnica de aplicação adequada, que pode ser manual ou automatizada. Como exemplos, a deposição da composição de resina 14 pode ser realizada usando técnicas de deposição de vapor, técnicas de revestimento, técnicas de enxerto ou semelhantes. Alguns exemplos específicos incluem deposição de vapor químico (CVD), revestimento por pulverização (por exemplo, revestimento por pulverização ultrassônica), revestimento por rotação, revestimento por submersão ou imersão, revestimento por lâmina de raspador, distribuição de poças, impressão por aerossol, serigrafia, impressão por microcontato, impressão a jato de tinta ou semelhantes. Em um exemplo,

revestimento por rotação é usado para depositar a composição de resina 14.

[0109] Depois que a composição de resina 14 é depositada, ela pode ser cozida suavemente para remover o solvente em excesso. A composição de resina depositada 14 é depois padronizada, usando qualquer uma das técnicas de padronização mencionadas aqui. No exemplo mostrado na Fig. 2B, litografia por nanoimpressão é usada para padronizar a composição de resina 14. Um molde ou carimbo de trabalho 20 de litografia por nanoimpressão é comprimido contra a camada da composição de resina 14 para criar uma impressão sobre a composição de resina 14. Em outras palavras, a composição de resina 14 é recortada ou perfurada pelas saliências do carimbo de trabalho 20. Em um exemplo, a composição de resina 14 pode ser curada com o carimbo de trabalho 20 no lugar.

[0110] Para as composições de resina 14 reveladas aqui, a cura pode ser realizada por exposição à radiação actínica, tal como radiação ultravioleta (UV) (por exemplo, fontes de luz de haleto metálico, fontes de luz de vapor de mercúrio, fontes de luz LED de emissão UV, etc.). A cura promove a formação de radical devido à presença do fotoiniciador e estes radicais são usados para curar a porção acrilato da composição de resina. Como tal, a cura promove a polimerização e/ou a reticulação da composição de resina 14. Como um exemplo, a cura pode incluir um único estágio de exposição UV ou pode incluir estágios múltiplos, incluindo um cozimento suave (por exemplo, para expelir solvente(s)) e depois exposição UV. Quando incluído, o cozimento suave pode ocorrer em uma temperatura mais baixa, variando de cerca de 50 °C a cerca de 150 °C por mais do que 0 segundos a cerca de 3 minutos e pode ocorrer antes que o carimbo de trabalho 20 seja colocado na composição de resina 14. Em um exemplo, o tempo de cozimento suave varia de cerca de 30 segundos a cerca de 2,5 minutos. Durante o cozimento suave, um ou mais processos químicos podem estar ocorrendo que contribuem ainda para uma redução na autofluorescência. Processos químicos de exemplo podem incluir a evaporação de alguns dos materiais de composição de resina, sublimação de alguns dos materiais de composição de resina, polimerização de alguns dos materiais de composição de resina e/ou combinações dos mesmos. Alguns exemplos também podem incluir um cozimento forte. Entretanto, o mecanismo de cura da composição de resina 14 revelado aqui é tão rápido, que a composição de resina 14 pode ser completamente curada sem um cozimento forte. Se realizado, o carimbo de trabalho 20 é liberado/separado antes do cozimento forte, por exemplo, de modo que o carimbo de trabalho 20 não se ligue à composição de resina curada

14. Se realizado, a duração do cozimento forte pode durar de cerca de 5 segundos a cerca de 10 minutos em uma temperatura variando de cerca de 100 °C a cerca de 300 °C. O cozimento forte pode ser realizado, por exemplo, para remover o(s) solvente(s) residual(is) da composição de resina 14, para a polimerização adicional de alguns dos materiais de composição de resina (e assim realçar a extensão da cura) e/ou para reduzir ainda mais a autofluorescência. Exemplos de dispositivos que podem ser usados para cozimento suave e/ou cozimento forte incluem uma placa com aquecimento, forno, etc.

[0111] Depois da liberação do carimbo de trabalho 20, características topográficas, por exemplo, as depressões 16, estão na composição de resina 14. Como mostrado na Fig. 2C, a composição de resina 14 tendo as depressões 16 definidas nesta é referida como a resina padronizada curada 14’. Em alguns exemplos, a resina padronizada curada 14’ pode estar sujeita a outro cozimento forte, por exemplo, para auxiliar no bloqueio na topografia impressa e/ou para reduzir ainda mais a fluorescência. Em alguns exemplos, o cozimento forte adicional pode ser realizado em uma temperatura variando de cerca de 60 °C a cerca de 300 °C.

[0112] A composição química da resina padronizada curada 14’ depende da matriz ou matrizes de resina curável por radical livre e do(s) fotoiniciador(es) de radical livre usados na composição de resina 14.

[0113] Como mostrado na Fig. 2C, a resina padronizada curada 14’ inclui as depressões 16 definidas nesta e regiões intersticiais 22 que separam as depressões adjacentes 16. Nos exemplos revelados aqui, as depressões 16 se tornam funcionalizadas com um revestimento polimérico 18 (Figs. 2C a 2D) e iniciadores 24 (Figs. 2E a 2F), enquanto as porções das regiões intersticiais 22 podem ser usadas para ligação mas não terão o revestimento polimérico 18 ou o(s) iniciador(es) 24 sobre o mesmo.

[0114] Muitos layouts diferentes das depressões 16 podem ser considerados, incluindo padrões regulares, de repetição e não regulares. Em um exemplo, as depressões 16 são dispostas em uma grade hexagonal para compactação e densidade melhorada. Outros layouts podem incluir, por exemplo, layouts retilíneos (isto é, retangulares) (por exemplo, linhas ou valas), layouts triangulares e assim por diante. Em alguns exemplos, o layout ou padrão pode ser um formato x-y de depressões 16 que estão em fileiras e colunas. Em alguns outros exemplos, o layout ou padrão pode ser um arranjo de repetição de depressões 16 e/ou regiões intersticiais 22. Ainda em outros exemplos, o layout ou padrão pode ser um arranjo aleatório de depressões 16 e/ou regiões intersticiais 22. O padrão pode incluir pontos, almofadas, poços, postes, tiras, redemoinhos, linhas, triângulos, retângulos, círculos, arcos, xadrezes, padrões escoceses, diagonais, setas, quadrados e/ou linhas cruzadas. Em um exemplo, as depressões 16 são poços, como mostrado na Fig. 2C.

[0115] O layout ou padrão pode ser caracterizado com respeito à densidade das depressões 16 (isto é, número de depressões 16) em uma área definida. Por exemplo, as depressões 16 podem estar presentes em uma densidade de aproximadamente 2 milhões por mm2. A densidade pode ser sintonizada a diferentes densidades incluindo, por exemplo, uma densidade de pelo menos cerca de 100 por mm2, cerca de 1.000 por mm2, cerca de 0,1 milhões por mm2, cerca de 1 milhões por mm2, cerca de 2 milhões por mm2, cerca de 5 milhões por mm2, cerca de 10 milhões por mm2, cerca de 50 milhões por mm2 ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, a densidade pode ser sintonizada para ser não mais do que cerca de 50 milhões por mm2, cerca de 10 milhões por mm2, cerca de 5 milhões por mm2, cerca de 2 milhões por mm2, cerca de 1 milhões por mm2, cerca de 0,1 milhões por mm2, cerca de 1.000 por mm2, cerca de 100 por mm2 ou menos. Deve ser entendido ainda que a densidade de depressões 16 na resina padronizada curada’ 14 pode estar entre um dos valores inferiores e um dos valores superiores selecionados a partir das faixas acima. Como exemplos, um arranjo de alta densidade pode ser caracterizado como tendo depressões 16 separadas por menos do que cerca de 100 nm, um arranjo de densidade média pode ser caracterizado como tendo depressões 16 separadas por cerca de 400 nm a cerca de 1 µm e um arranjo de densidade baixa pode ser caracterizado como tendo depressões 16 separadas por mais do que cerca de 1 µm. Embora densidades de exemplo tenham sido fornecidas, deve ser entendido que substratos com quaisquer densidades adequadas podem ser usados.

[0116] O layout ou padrão das depressões 16 também pode ou alternativamente ser caracterizado em termos do passo médio, isto é, o espaçamento do centro da depressão 16 ao centro de uma depressão adjacente 16 (espaçamento de centro a centro) ou da margem de uma depressão 16 à margem de uma depressão adjacente 16 (espaçamento de margem a margem). O padrão pode ser regular, tal que o coeficiente de variação em torno do passo médio é pequeno ou o padrão pode ser não regular caso este em que o coeficiente de variação pode ser relativamente grande. Em cada caso, o passo médio pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 10 nm, cerca de 0,1 μm, cerca de 0,5 μm, cerca de 1 μm, cerca de 5 μm, cerca de 10 μm, cerca de 100 μm ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o passo médio pode ser, por exemplo, no máximo cerca de 100 μm, cerca de 10 μm, cerca de 5 μm, cerca de 1 μm, cerca de 0,5 μm, cerca de 0,1 μm ou menos. O passo médio para um padrão particular de depressões 16 pode estar entre um dos valores inferiores e um dos valores superiores selecionados a partir das faixas acima. Em um exemplo, as depressões 16 têm um passo (espaçamento de centro a centro) de cerca de 1,5 μm. Embora valores de passo médio de exemplo tenham sido fornecidos, deve ser entendido que outros valores de passo médio podem ser usados.

[0117] No exemplo mostrado nas Figs. 2A a 2E, as depressões 16 são poços e assim a resina padronizada curada 14’ inclui um arranjo de poços em uma superfície da mesma. Os poços podem ser micropoços ou nanopoços. O tamanho de cada poço pode ser caracterizado por seu volume, área de abertura de poço, profundidade e/ou diâmetro.

[0118] Cada poço pode ter qualquer volume que seja capaz de confinar um líquido. O volume mínimo ou máximo pode ser selecionado, por exemplo, para acomodar o rendimento (por exemplo, multiplexidade), resolução, composição do analito ou reatividade do analito esperados para usos a jusante da célula de fluxo. Por exemplo, o volume pode ser pelo menos cerca de 1×10−3 μm3, cerca de 1×10−2 μm3, cerca de 0,1 μm3, cerca de 1 μm3, cerca de 10 μm3, cerca de 100 μm3 ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o volume pode ser no máximo cerca de 1×104 μm3, cerca de 1×103 μm3, cerca de 100 μm3, cerca de 10 μm3, cerca de 1 μm3, cerca de 0,1 μm3 ou menos. Deve ser entendido que o revestimento polimérico 18 pode preencher todo ou parte do volume de um poço.

[0119] A área ocupada por cada abertura de poço em uma superfície pode ser selecionada com base em critérios similares como aqueles apresentados acima para volume de poço. Por exemplo, a área para cada abertura de poço em uma superfície pode ser pelo menos cerca de 1×10−3 μm2, cerca de 1×10−2 μm2, cerca de 0,1 μm2, cerca de 1 μm2, cerca de 10 μm2, cerca de 100 μm2 ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, a área pode ser no máximo cerca de 1×103 μm2, cerca de 100 μm2, cerca de 10 μm2, cerca de 1 μm2, cerca de 0,1 μm2, cerca de 1×10−2 μm2 ou menos. A área ocupada por cada abertura de poço pode ser maior do que, menor do que ou entre os valores especificados acima.

[0120] A profundidade de cada poço pode ser pelo menos cerca de 0,1 μm, cerca de 1 μm, cerca de 10 μm, cerca de 100 μm ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, a profundidade pode ser no máximo cerca de 1×103 μm, cerca de 100 μm, cerca de 10 μm, cerca de 1 μm, cerca de 0,1 μm ou menos. A profundidade de cada poço pode ser maior do que, menor do que ou entre os valores especificados acima.

[0121] Em alguns exemplos, o diâmetro de cada poço pode ser pelo menos cerca de 50 nm, cerca de 0,1 μm, cerca de 0,5 μm, cerca de 1 μm, cerca de 10 μm, cerca de 100 μm ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o diâmetro pode ser no máximo cerca de 1×103 μm, cerca de 100 μm, cerca de 10 μm, cerca de 1 μm, cerca de 0,5 μm, cerca de 0,1 μm ou menos (por exemplo, cerca de 50 nm). O diâmetro de cada poço pode ser maior do que, menor do que ou entre os valores especificados acima.

[0122] Como mostrado entre as Figs. 2C e 2D, depois que a composição de resina 14 é padronizada e curada, a resina padronizada curada 14’ pode ser tratada para preparar a superfície para a aplicação de um revestimento polimérico 18.

[0123] Em um exemplo, a resina padronizada curada 14’ pode ser exposta à silanização, que liga um silano ou o derivado de silano à resina padronizada curada 14’. A silanização introduz o silano ou o derivado de silano através da superfície, incluindo nas depressões 16 (por exemplo, na superfície de fundo e ao longo das paredes laterais) e nas regiões intersticiais 22.

[0124] A silanização pode ser realizada usando qualquer silano ou derivado de silano. A seleção do silano ou derivado de silano pode depender, em parte, da molécula funcionalizada que deve ser usada para formar o revestimento polimérico 18 (mostrado na Fig. 2D), visto que pode ser desejável formar uma ligação covalente entre o silano ou derivado de silano e o revestimento polimérico 18. O método usado para ligar o silano ou derivado de silano à resina padronizada curada 14’ pode variar dependendo do silano ou derivado de silano que está sendo usado. Vários exemplos são apresentados aqui.

[0125] Em um exemplo, o silano ou derivado de silano é (3- aminopropil)trietoxissilano (APTES) ou 3-aminopropil)trimetoxissilano (APTMS) (isto é, X-RB-Si(ORC)3, em que X é amino, RB é -(CH2)3- e RC é etila ou metila). Neste exemplo, a superfície do substrato 12 pode ser pré-tratada com o (3- aminopropil)trietoxissilano (APTES) ou 3-aminopropil)trimetoxissilano (APTMS) para ligar covalentemente o silício a um ou mais átomos de oxigênio sobre a superfície (sem intencionar ser mantido por mecanismo, cada silício pode se ligar a um, dois ou três átomos de oxigênio). Esta superfície quimicamente tratada é cozida para formar uma monocamada de grupo amina. Os grupos amina são depois reagidos com Sulfo-HSAB para formar um derivado de azido. A ativação UV a 21 °C com 1 J/cm2 a 30 J/cm2 de energia gera uma espécie de nitreno ativa, que pode passar facilmente por uma variedade de reações de inserção com PAZAM (por exemplo, um exemplo da molécula funcionalizada usada para formar o revestimento polimérico 18).

[0126] Outros métodos de silanização também podem ser usados. Exemplos de métodos de silanização adequados incluem deposição de vapor (por exemplo, um método YES), revestimento por rotação ou outros métodos de deposição. Alguns exemplos de métodos e materiais que podem ser usados para silanizar a resina padronizada curada 14’ são descritos aqui, embora deva ser entendido que outros métodos e materiais podem ser usados.

[0127] Em um exemplo utilizando o forno de CVD YES, a resina padronizada curada 14’ no substrato 12 é colocada no forno de CVD. A câmara pode ser ventilada e depois o ciclo de silanização iniciado. Durante a ciclização, o vaso com silano ou derivado de silano pode ser mantido em uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de 120 °C por norborneno silano), as linhas de vapor de silano ou derivado de silano podem ser mantidas em uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de 125 °C por norborneno silano) e as linhas de vácuo podem ser mantidas em uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de 145 °C).

[0128] Em um outro exemplo, o silano ou derivado de silano (por exemplo, norborneno silano líquido) pode ser depositado dentro de um frasco de vidro e colocado dentro de um dessecador a vácuo de vidro com um substrato padronizado 12. O dessecador pode ser depois evacuado a uma pressão variando de cerca de 15 mTorr (2,00 Pa) a cerca de 30 mTorr (4,00 Pa) e colocado dentro de um forno em uma temperatura variando de cerca de 60 °C a cerca de 125 °C. A silanização é deixada proceder e depois que o dessecador é removido do forno, resfriado e ventilado em ar.

[0129] A deposição de vapor, o método YES e/ou o dessecador a vácuo podem ser usados com uma variedade de silanos ou derivados de silano, tais como aqueles silanos ou derivados de silano incluindo uma porção cicloalceno insaturada, tal como norborneno, um derivado de norborneno (por exemplo, um (hetero)norborneno incluindo um oxigênio ou nitrogênio no lugar de um dos átomos de carbono), transciclo-octeno, derivados de transciclo-octeno, transciclopenteno, transcicloepteno, trans-ciclononeno, biciclo[3.3.1]non-1- eno, biciclo[4.3.1]dec-1 (9)-eno, biciclo [4.2.1]non-1(8)-eno e biciclo[4.2.1]non- 1-eno. Qualquer um destes cicloalcenos podem ser substituídos, por exemplo, com um grupo R, tal como hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila, arila, heteroarila, heteroaliciclila, aralquila ou (heteroaliciclil)alquila. Um exemplo do derivado de norborneno inclui [(5- biciclo[2.2.1]hept-2-enil)etil]trimetoxissilano. Como outros exemplos, estes métodos podem ser usados quando o silano ou derivado de silano inclui uma porção cicloalcino insaturada, tal como ciclo-octino, um derivado de ciclo-octino ou biciclononinos (por exemplo, biciclo[6.1.0]non-4-ino ou derivados do mesmo, biciclo[6.1.0]non-2-ino ou biciclo[6.1.0]non-3-ino). Estes cicloalcinos podem ser substituídos com qualquer um dos grupos R descritos aqui.

[0130] A ligação do silano ou derivado de silano forma uma resina padronizada curada 14’ pré-tratada (por exemplo, silanizada), que inclui depressões silanizadas e regiões silanizadas intersticiais.

[0131] Em outros exemplos, a resina padronizada curada 14’ pode não ser exposta à silanização. De preferência, a resina padronizada curada 14’ pode ser exposta à calcinação por plasma e depois o revestimento polimérico 18 pode ser diretamente revestido por rotação (ou de outro modo depositado) na resina padronizada curada 14’ calcinada por plasma. Neste exemplo, a calcinação por plasma pode gerar agente(s) ativador(es) de superfície (por exemplo, grupos hidroxila (C-OH ou Si-OH) e/ou carboxila) que podem aderir o revestimento polimérico 18 à resina padronizada curada 14’. Nestes exemplos, o revestimento polimérico 18 é selecionado de modo que ele reaja com os grupos de superfície gerados por calcinação por plasma.

[0132] Ainda em outros exemplos, a resina padronizada curada 14’ pode incluir grupos epóxi não reagidos (por exemplo, quando a matriz de resina epóxi é usada com a matriz de resina curável por radical livre); e assim pode não ser exposta à silanização porque os grupos epóxi não reagidos podem reagir diretamente com grupos funcionais em amino do revestimento polimérico 18. Neste exemplo, a calcinação por plasma pode ser realizada, por exemplo, se for desejável limpar a superfície de contaminantes potenciais.

[0133] O revestimento polimérico 18 depois pode ser aplicado à resina padronizada curada 14’ pré-tratada (como mostrado entre as Figs. 2C e 2C). O revestimento polimérico 18 pode ser um material polimérico semirrígido que é permeável a líquidos e gases e que é preso à resina padronizada curada 14’.

[0134] Um exemplo do revestimento polimérico 18 inclui um copolímero de acrilamida, tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co- acrilamida, PAZAM. PAZAM e algumas outras formas do copolímero de acrilamida são representados pela estrutura (I) seguinte:

em que: R1 é H ou alquila opcionalmente substituído; RA é selecionado a partir do grupo que consiste em azido, amino opcionalmente substituído, alquenila opcionalmente substituído, hidrazona opcionalmente substituída, hidrazina opcionalmente substituída, carboxila, hidróxi, tetrazol opcionalmente substituído, tetrazina opcionalmente substituída, óxido de nitrila, nitrona e tiol; R5, R6 e R8 são todos independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H e alquila opcionalmente substituído; cada um do -(CH2)p- pode ser opcionalmente substituído; p é um número inteiro na faixa de 1 a 50; n é um número inteiro na faixa de 1 a 50.000; e m é um número inteiro na faixa de 1 a 100.000.

[0135] Um técnico no assunto reconhecerá que o arranjo das características “n” e “m” recorrentes na estrutura (I) é representativo e as subunidades monoméricas podem estar presentes em qualquer ordem na estrutura polimérica (por exemplo, aleatória, em bloco, padronizada ou uma combinação da mesma).

[0136] O peso molecular do PAZAM pode variar de cerca de 10 kDa a cerca de 1500 kDa ou pode ser, em um exemplo específico, cerca de 312 kDa.

[0137] Em alguns exemplos, PAZAM é um polímero linear. Em alguns outros exemplos, PAZAM é um polímero levemente reticulado.

[0138] Em outros exemplos, o revestimento polimérico 18 pode ser uma variação da estrutura (I). Em um exemplo, a unidade de acrilamida pode ser substituída com N,N-dimetilacrilamida ( ). Neste exemplo, a unidade de acrilamida na estrutura (I) pode ser substituída com , onde R6, R7 e R8 são todos H e R9 e R10 são todos um grupo metila (ao invés de H como é o caso com a acrilamida). Neste exemplo, q pode ser um número inteiro na faixa de 1 a 100.000. Em um outro exemplo, a N,N-dimetilacrilamida pode ser usada além da unidade de acrilamida. Neste exemplo, a estrutura (I) pode incluir além das características “n” e “m” recorrentes, onde R6, R7 e R8 são todos H e R9 e R10 são todos um grupo metila. Neste exemplo, q pode ser um número inteiro na faixa de 1 a 100.000.

[0139] Como um outro exemplo polímero, a característica “n” recorrente na estrutura (I) pode ser substituída com um monômero incluindo um grupo azido heterocíclico tendo a estrutura (II): em que R1 é H ou C1-C4 alquila; R2 é H ou C1-C4 alquila; L é um ligante incluindo uma cadeia linear com 2 a 20 átomos selecionados a partir do grupo que consiste em carbono, oxigênio e nitrogênio e 10 substituintes opcionais no carbono e quaisquer átomos de nitrogênio na cadeia; E é uma cadeia linear incluindo 1 a 4 átomos selecionados a partir do grupo que consiste em carbono, oxigênio e nitrogênio e substituintes opcionais no carbono e quaisquer átomos de nitrogênio na cadeia; A é uma amida substituída por N com um H ou C1-C4 alquila ligado ao N; e Z é um nitrogênio contendo heterociclo. Exemplos de Z incluem 5 a 10 membros no anel presentes como uma única estrutura cíclica ou uma estrutura fundida.

[0140] Como ainda um outro exemplo, o polímero pode incluir uma unidade recorrente de cada uma das estruturas (III) e (IV): e em que cada um de R1a, R2a, R1b e R2b é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, alquila opcionalmente substituído ou fenila opcionalmente substituído; cada R3a e R3b é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, alquila opcionalmente substituído, fenila opcionalmente substituído ou C7-C14 aralquila opcionalmente substituído; e cada L1 e L2 é independentemente selecionado a partir de um ligante de alquileno opcionalmente substituído ou um ligante de heteroalquileno opcionalmente substituído.

[0141] Deve ser entendido que outras moléculas funcionalizadas podem ser usadas para formar o revestimento polimérico 18, contanto que elas sejam funcionalizadas para interagir com a resina padronizada curada 14’ pré-tratada e o(s) iniciador(es) subsequentemente aplicado(s) 24. Outros exemplos de moléculas adequadas para formar o revestimento polimérico 18 incluem aquelas tendo uma estrutura coloidal, tal como agarose; ou uma estrutura de malha polimérica, tal como gelatina; ou uma estrutura polimérica reticulada, tais como polímeros e copolímeros de poliacrilamida, acrilamida isenta de silano (SFA) ou uma versão azidolizada de SFA. Exemplos de polímeros de poliacrilamida adequados podem ser sintetizados a partir de acrilamida e um ácido acrílico ou um ácido acrílico contendo um grupo vinila ou a partir de monômeros que formam reações de fotocicloadição [2+2]. Ainda outros exemplos de moléculas adequadas para formar o revestimento polimérico 18 incluem copolímeros mistos de acrilamidas e acrilatos. Polímeros ramificados, tais como polímeros estrelas, polímeros em forma de estrela ou estrelas-em bloco, dendrímeros e semelhantes também podem ser usados.

[0142] A molécula funcionalizada (por exemplo, PAZAM) pode ser depositada sobre a superfície da resina padronizada curada 14’ pré-tratada usando revestimento por rotação ou imersão ou revestimento por imersão ou fluxo da molécula funcionalizada sob pressão positiva ou negativa ou uma outra técnica adequada. A molécula funcionalizada pode estar presente em uma mistura. Em um exemplo, a mistura inclui PAZAM em água ou em uma mistura de etanol e água.

[0143] Depois de ser revestida, a molécula funcionalizada também pode ser exposta a um processo de cura para formar o revestimento polimérico 18 através do substrato padronizado inteiro (isto é, na(s) depressão(ões) 16 e na(s) região(ões) intersticial(is) 22). Em um exemplo, a cura da molécula funcionalizada pode ocorrer em uma temperatura variando da temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 25 °C) a cerca de 95 °C por um tempo variando de cerca de 1 milissegundo a cerca de vários dias. Em um outro exemplo, o tempo pode variar de 10 segundos a pelo menos 24 horas. Ainda em um outro exemplo, o tempo pode variar de cerca de 5 minutos a cerca de 2 horas.

[0144] A ligação do revestimento polimérico 18 às depressões e regiões intersticiais pré-tratadas pode ser através de ligação covalente. A ligação covalente do revestimento polimérico 18 às depressões silanizadas ou calcinadas por plasma é útil para manter o revestimento polimérico 18 nas depressões 16 por toda a vida da célula de fluxo finalmente formada durante uma variedade de usos. Os seguintes são alguns exemplos de reações que podem ocorrer entre o silano ou derivado de silano e o revestimento polimérico 18.

[0145] Quando o silano ou derivado de silano inclui norborneno ou um derivado de norborneno como a porção insaturada, o norborneno ou um derivado de norborneno pode: i) passar por uma reação de cicloadição 1,3- dipolar com um grupo azida/azido de PAZAM; ii) passar por uma reação de acoplamento com um grupo tetrazina ligado a PAZAM; passar por uma reação de cicloadição com um grupo hidrazona ligado a PAZAM; passar por uma reação de fotoclique com um grupo tetrazol ligado a PAZAM; ou passar por um cicloadição com um grupo óxido de nitrila ligado a PAZAM.

[0146] Quando o silano ou derivado de silano inclui ciclo-octino ou um derivado de ciclo-octino como a porção insaturada, o ciclo-octino ou derivado de ciclo-octino pode: i) passar por uma reação de 1,3-cicloadição (SPAAC) de azida-alcino promovida por tensão com um azida/azido de PAZAM ou ii) passar por uma reação de cicloadição de alcino-óxido de nitrila promovida por tensão com um grupo óxido de nitrila ligado a PAZAM.

[0147] Quando o silano ou derivado de silano inclui um biciclononino como a porção insaturada, o biciclononino pode passar por cicloadição de alcino SPAAC similar com azidas ou óxidos de nitrila ligados a PAZAM devido à tensão no sistema de anel bicíclico.

[0148] Para formar o revestimento polimérico 18 na(s) depressão(ões) 16 e não na(s) região(ões) intersticial(is) 22 da resina padronizada curada 14’, o revestimento polimérico 18 pode ser polido das regiões intersticiais 22. O processo de polimento pode ser realizado com uma pasta fluida química suave (incluindo, por exemplo, um abrasivo, um tampão, um agente quelante, um surfactante e/ou um dispersante) que pode remover o revestimento polimérico 18 das regiões intersticiais 22 sem afetar deleteriamente a resina padronizada curada 14’ subjacente e/ou o substrato 12 nestas regiões. Alternativamente, o polimento pode ser realizado com uma solução que não inclui as partículas abrasivas. A pasta fluida química pode ser usada em um sistema químico de polimento mecânico. Neste exemplo, cabeça(s)/almofada(s) de polimento ou outra(s) ferramenta(s) de polimento é/são capazes de polir o revestimento polimérico 18 das regiões intersticiais 22 enquanto deixando o revestimento polimérico 18 nas depressões 16 e deixando a resina padronizada curada 14’ subjacente pelo menos substancialmente intacta. Como um exemplo, a cabeça de polimento pode ser uma cabeça de polimento Strasbaugh ViPRR II. Em um outro exemplo, o polimento pode ser realizado com uma almofada de polimento e uma solução sem qualquer abrasivo. Por exemplo, a almofada de polimento pode ser utilizada com uma solução livre da partícula abrasiva (por exemplo, uma solução que não inclui partículas abrasivas).

[0149] A Fig. 2D descreve o precursor de célula de fluxo 10 depois que a camada polimérica 18 foi aplicada às depressões 16. O precursor de célula de fluxo 10 pode ser exposto a um processo de limpeza. Este processo pode utilizar um banho de água e sonicação. O banho de água pode ser mantido em uma temperatura relativamente baixa variando de cerca de 22 °C a cerca de 30 °C. o substrato padronizado silanizado, revestido e polido também pode ser seco por rotação ou seco por intermédio de uma outra técnica adequada.

[0150] Como mostrado entre as Figs. 2D e 2E, um processo de enxerto é realizado de modo a enxertar um iniciador 24 ao revestimento polimérico 18 na(s) depressão(ões) 16. O iniciador 24 pode ser qualquer iniciador de amplificação dianteiro ou iniciador de amplificação reverso que inclui um grupo funcional alcino ou um outro iniciador terminado. Outros exemplos de iniciadores terminados que podem ser usados incluem um iniciador terminado em tetrazina, um iniciador terminado em azido, um iniciador terminado em amino, um iniciador terminado em epóxi ou glicidila, um iniciador terminado em tiofosfato, um iniciador terminado em tiol, um iniciador terminado em aldeído, um iniciador terminado em hidrazina, um iniciador terminado em fosforamidita e um iniciador terminado em triazolinodiona. Uma mistura de iniciadores também pode ser usada. Exemplos específicos de iniciadores adequados incluem iniciadores P5 e/ou P7, que são usados sobre a superfície de células de fluxo comerciais vendidas por Illumina Inc. para sequenciamento em HiSeq™, HiSeqX™, MiSeq™, MiSeqDX™, MiNISeq™, NextSeq™, NextSeqDX™, NovaSeq™, iSeq™, Genome Analyzer™ e outras plataformas de instrumentos.

[0151] Em um exemplo, o enxerto pode ser realizado por deposição de fluxo contínuo (por exemplo, usando uma tampa temporariamente ligada), revestimento por submersão, revestimento por pulverização, distribuição de poças ou por um outro método adequado que ligará o(s) iniciador(es) 24 ao revestimento polimérico 18. Cada uma destas técnicas de exemplo pode utilizar uma solução ou mistura de iniciador, que pode incluir o(s) iniciador(es), água, um tampão e um catalisador.

[0152] O revestimento por submersão pode envolver submergir o precursor de célula de fluxo 10 (mostrado na Fig. 2D) em uma série de banhos com temperatura controlada. Os banhos também podem ser controlados por fluxo e/ou cobertos com uma manta de nitrogênio. Os banhos podem incluir a solução ou mistura de iniciador. Por todos os vários banhos, o(s) iniciador(es) 24 se ligarão ao(s) grupo(s) funcional(is) de iniciador-enxerto do revestimento polimérico 18 em pelo menos alguma da(s) depressão(ões) 16. Em um exemplo, o precursor de célula de fluxo 10 será introduzido em um primeiro banho incluindo a solução ou mistura de iniciador onde uma reação ocorre para ligar o(s) iniciador(es) 24 e depois movido para banhos adicionais para lavagem. O movimento de banho a banho pode envolver um braço robótico ou pode ser realizado manualmente. Um sistema de secagem também pode ser usado no revestimento por submersão.

[0153] O revestimento por pulverização pode ser realizado pulverizando- se a solução ou mistura de iniciador diretamente sobre o precursor de célula de fluxo 10. A pastilha revestida por pulverização pode ser incubada por um tempo variando de cerca de 4 minutos a cerca de 60 minutos em uma temperatura variando de cerca de 0 °C a cerca de 70 °C. Depois da incubação, a solução ou mistura de iniciador pode ser diluída e removida usando, por exemplo, um revestidor por rotação.

[0154] A distribuição de poças pode ser realizada de acordo com um método de agrupar e desmembrar e assim pode ser realizada com um revestidor por rotação. A solução ou mistura de iniciador pode ser aplicada (manualmente ou por intermédio de um processo automatizado) ao precursor de célula de fluxo

10. A solução ou mistura de iniciador aplicada pode ser aplicada a ou difundida através da superfície inteira do precursor de célula de fluxo 10. O precursor de célula de fluxo 10 revestido com iniciador pode ser incubado por um tempo variando de cerca de 2 minutos a cerca de 60 minutos em uma temperatura variando de cerca de 0 °C a cerca de 80 °C. Depois da incubação, a solução ou mistura de iniciador pode ser diluída e removida usando, por exemplo, o revestidor por rotação.

[0155] A Fig. 2F ilustra um exemplo da célula de fluxo 10’ depois do enxerto de iniciador. Embora um único tipo de iniciador 24 seja mostrado, deve ser entendido que dois ou mais iniciadores diferentes 24 podem ser anexados.

[0156] Os exemplos mostrados nas Figs. 2E e 2F são exemplos da célula de fluxo 10’ sem uma tampa ligada a esta. Embora não mostrado, as células de fluxo 10’ podem ter a tampa ligada a pelo menos uma porção da região intersticial 22. A tampa pode ser ligada antes ou depois do enxerto de iniciador 24. Quando a tampa é realizada antes do enxerto de iniciador 24, deve ser entendido que um processo de fluxo contínuo pode ser usado para o enxerto. No processo de fluxo contínuo, a solução ou mistura de iniciador pode ser introduzida em um canal de fluxo (definido entre a tampa e a região intersticial 22) através da(s) respectiva(s) porta(s) de entrada (não mostrado), pode ser mantida no(s) canal(is) de fluxo por um tempo suficiente (isto é, um período de incubação) para que o(s) iniciador(es) 24 se liguem ao revestimento polimérico 18 em uma ou mais das depressões 16 e depois possam ser removidos da(s) respectiva(s) porta(s) de saída (não mostrado). Depois da ligação do iniciador 24, o(s) fluido(s) adicional(is) podem ser dirigidos através do(s) canal(is) de fluxo para lavar as depressões agora funcionalizadas e os(s) canal(is) de fluxo.

[0157] A tampa pode ser posicionada na região intersticial 22 de modo que ela defina um canal de fluxo único ou múltiplo, canais de fluxo fluidicamente separados.

[0158] A tampa pode ser qualquer material que seja transparente a uma luz de excitação que é dirigida para a(s) depressão(ões) 16. Como exemplos, a tampa pode ser vidro (por exemplo, Corning Eagle XG (CEXG), borossilicato, sílica fundida, etc.), plástico ou semelhantes. Um exemplo comercialmente disponível de um vidro de borossilicato adequado é D 263®, disponível da Schott North

America, Inc. Exemplos comercialmente disponíveis de materiais plásticos adequados, isto é, polímeros de ciclo-olefina, são os produtos ZEONOR® disponíveis da Zeon Chemicals L.P.

[0159] Em alguns exemplos, a tampa pode ser integralmente formada com parede(s) lateral(is) que correspondem com a forma da porção da região intersticial 22 à qual ela será ligada. Por exemplo, um recesso pode ser gravado em um bloco transparente para formar uma porção substancialmente planar (por exemplo, topo) e parede(s) lateral(is) estendendo da porção substancialmente planar. Quando o bloco gravado é montado à região intersticial 22, o recesso pode se tornar o canal de fluxo.

[0160] Em outros exemplos, a(s) parede(s) lateral(is) e a tampa podem ser componentes separados que são acoplados um ao outro. Por exemplo, a tampa pode ser um bloco substancialmente retangular tendo uma superfície exterior pelo menos substancialmente planar e uma superfície interior pelo menos substancialmente planar que definem uma porção (por exemplo, uma porção de topo) do canal de fluxo (uma vez ligado à porção da região intersticial 22). O bloco pode ser montado sobre (por exemplo, ligado a) a(s) parede(s) lateral(is), que são ligadas à porção da região intersticial 22 e formam parede(s) lateral(is) do canal de fluxo. Neste exemplo, a(s) parede(s) lateral(is) podem incluir qualquer um dos materiais apresentados aqui para a camada espaçadora (descrita abaixo).

[0161] A tampa pode ser ligada usando qualquer técnica adequada, tal como ligação a laser, ligação por difusão, ligação anódica, ligação eutética, ligação por ativação de plasma, ligação por frita de vidro ou outros métodos conhecidos na técnica. Em um exemplo, uma camada espaçadora pode ser usada para ligar a tampa à porção da região intersticial 22. A camada espaçadora pode ser qualquer material que vedará pelo menos algumas das regiões intersticiais

22 e a tampa juntas.

[0162] Em um exemplo, a camada espaçadora pode ser um material absorvente de radiação que absorve a radiação em um comprimento de onda que é transmitido pela tampa e/ou pela resina padronizada curada 14’. A energia absorvida, por sua vez, forma a ligação entre a camada espaçadora e a tampa e entre a camada espaçadora e a resina padronizada curada 14’. Um exemplo deste material absorvente de radiação é KAPTON® preto (poliimida contendo negro de carbono) da DuPont (USA), que absorve em torno de 1064 nm. Deve ser entendido que poliimida pode ser usada sem a adição de negro de carbono, exceto que o comprimento de onda teria que ser alterado para um que é significativamente absorvido pelo material de poliimida natural (por exemplo, 480 nm). Como um outro exemplo, poliimida CEN JP pode ser ligada quando irradiada com luz em 532 nm. Quando a camada espaçadora é o material absorvente de radiação, a camada espaçadora pode ser posicionada em uma interface entre a tampa e a porção da região intersticial 22 de modo que a camada espaçadora contate a região de ligação desejada. Compressão pode ser aplicada (por exemplo, aproximadamente 100 PSI de pressão) enquanto energia laser em um comprimento de onda adequado é aplicada à interface (isto é, o material absorvente de radiação é irradiado). A energia laser pode ser aplicada à interface tanto a partir do topo quanto a partir do fundo de modo a obter ligação adequada.

[0163] Em um outro exemplo, a camada espaçadora pode incluir um material absorvente de radiação em contato com a mesma. O material absorvente de radiação pode ser aplicado na interface entre a camada espaçadora e a tampa bem como na interface entre a camada espaçadora e a porção da região intersticial 22. Como um exemplo, a camada espaçadora pode ser poliimida e o material absorvente de radiação separado pode ser negro de carbono. Neste exemplo, o material absorvente de radiação separado absorve a energia laser que forma as ligações entre a camada espaçadora e a tampa e entre a camada espaçadora e a porção da região intersticial 22. Neste exemplo, compressão pode ser aplicada nas respectivas interfaces enquanto energia laser em um comprimento de onda adequado é aplicada às interfaces (isto é, o material absorvente de radiação é irradiado).

[0164] As células de fluxo 10’ reveladas aqui podem ser usadas em uma variedade de abordagens ou tecnologias de sequenciamento, incluindo técnicas frequentemente referidas como sequenciamento por síntese (SBS), sequenciamento de arranjo cíclico, sequenciamento por ligação, pirossequenciamento e assim por diante. Com qualquer uma destas técnicas, visto que o revestimento polimérico 18 e iniciador(es) ligado(s) 24 estão presentes nas depressões 16 e não nas regiões intersticiais 22, a amplificação será limitada às depressões.

[0165] Como um exemplo, uma reação de sequenciamento por síntese (SBS) pode ser conduzida em um sistema tal como os sistemas sequenciadores HiSeq™, HiSeqX™, MiSeq™, MiSeqDX™, MiNISeq™, iSeq™, NovaSeq™, NextSeqDX™ ou NextSeq™ da Illumina (San Diego, CA). Em SBS, a extensão de um iniciador de ácido nucleico (por exemplo, um iniciador de sequenciamento) ao longo de um padrão de ácido nucleico (isto é, o padrão de sequenciamento) é monitorada para determinar a sequência de nucleotídeos no padrão. O processo químico subjacente pode ser polimerização (por exemplo, catalisada por uma enzima polimerase) ou ligação (por exemplo, catalisada por uma enzima ligase). Em um processo de SBS com base em polimerase particular, nucleotídeos fluorescentemente rotulados são adicionados ao iniciador de sequenciamento (desse modo estendendo o iniciador de sequenciamento) em uma forma dependente de padrão tal que a detecção da ordem e do tipo de nucleotídeos adicionados ao iniciador de sequenciamento pode ser usada para determinar a sequência do padrão.

[0166] Antes do sequenciamento, iniciadores de amplificação 24 podem ser expostos a uma biblioteca de sequenciamento, que é amplificada usando qualquer método adequado, tal como geração de agrupamento.

[0167] Em um exemplo de geração de agrupamento, os fragmentos da biblioteca são copiados dos iniciadores hibridizados 24 por extensão 3’ usando uma DNA polimerase de alta fidelidade. Os fragmentos da biblioteca originais são desnaturados, deixando as cópias imobilizadas. A amplificação da ponte isotérmica pode ser usada para amplificar as cópias imobilizadas. Por exemplo, os padrões copiados iteram para hibridizar a um iniciador complementar adjacente 24 e uma polimerase copia os padrões copiados para formar pontes de filamento duplo, que são desnaturadas para formar dois filamentos únicos. Estes dois filamentos iteram e hibridizam aos iniciadores complementares adjacentes 24 e são estendidos novamente para formar duas novas alças de filamento duplo. O processo é repetido em cada cópia de padrão por ciclos de desnaturação e amplificação isotérmicas para criar agrupamentos clonais densos. Cada agrupamento de pontes de filamento duplo é desnaturado. Em um exemplo, o filamento reverso é removido por clivagem de base específica, deixando filamentos de polinucleotídeo de padrão dianteiros. Deve ser entendido que o agrupamento resulta na formação de vários filamentos de padrão.

[0168] Para iniciar um primeiro ciclo de SBS, um ou mais nucleotídeos rotulados, DNA polimerase, etc., podem ser liberados dentro/através do canal de fluxo, etc., onde a extensão do iniciador de sequenciamento faz com que um nucleotídeo rotulado seja incorporado aos filamentos de padrão. Esta incorporação pode ser detectada através de um evento de imagiologia. Durante um evento de imagiologia, um sistema de iluminação (não mostrado) pode fornecer uma luz de excitação às depressões funcionalizadas. Durante o evento de imagiologia, quaisquer emissões (se alguma) da resina padronizada curada 14’ resultante da exposição a comprimentos de onda de excitação azul e/ou verde podem ser i) não detectadas porque elas estão abaixo de um valor-limite de detecção ou ii) distinguidas como ruído devido à baixa autofluorescência da resina padronizada curada 14’. Como tal, a resina padronizada curada 14’ revelada aqui é essencialmente invisível ao detector.

[0169] Em alguns exemplos, os nucleotídeos podem incluir ainda uma propriedade de terminação reversível que termina ainda a extensão do iniciador uma vez que um nucleotídeo foi adicionado ao iniciador de sequenciamento. Por exemplo, um análogo de nucleotídeo tendo uma porção terminadora reversível pode ser adicionado ao iniciador de sequenciamento tal que a extensão subsequente pode não ocorrer até que um agente de desbloqueio seja liberado para remover a porção. Assim, para exemplos que usam terminação reversível, um reagente de desbloqueio pode ser liberado ao canal de fluxo, etc. (antes ou depois que a detecção ocorra).

[0170] Lavagem(es) podem ocorrer entre as várias etapas de liberação de fluido. O ciclo de SBS pode ser depois repetido n vezes para estender o iniciador de sequenciamento em n nucleotídeos, detectando, desse modo, uma sequência de comprimento n.

[0171] Embora SBS tenha sido descrito em detalhe, deve ser entendido que as células de fluxo descritas aqui podem ser utilizadas com outro protocolo de sequenciamento, para genotipagem ou em outras aplicações químicas e/ou biológicas. O sequenciamento de extremidade pareada facilita a detecção de rearranjos genômicos e elementos de sequência repetitivos, bem como fusões de genes e novos transcritos. Em um outro exemplo, as células de fluxo reveladas aqui podem ser usadas para a geração de biblioteca sobre célula.

[0172] Embora o exemplo descrito nas Figs. 1 e 2A a 2F ilustre o uso da composição de resina na formação de uma célula de fluxo, deve ser entendido que a composição de resina pode ser usada em outras aplicações onde baixa autofluorescência é desejada. Como um exemplo, a composição de resina 14, 14’ pode ser usada em qualquer técnica SBS opticamente baseada. Como outros exemplos, a composição de resina 14, 14’ pode ser usada em guias de ondas planares, em semicondutores de óxido metálico complementares (CMOS), etc.

[0173] Para ilustrar ainda mais a presente invenção, dois exemplos e um exemplo profético são fornecidos aqui. Deve ser entendido que estes exemplos e exemplo profético são fornecidos para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo da presente invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1

[0174] Seis exemplos da composição de resina foram preparados. Cada exemplo incluiu uma matriz de resina curável por radical livre diferente, que incluiu 1,3-bis(3-metacriloxipropil) tetrametildissiloxano, polidimetilsiloxano terminado em metacriloxipropil, tetrametil tetracis[3- acriloxipropil]ciclotetrassiloxano, metacril silsesquioxano poliédrico oligomérico, acrilo silsesquioxano poliédrico oligomérico e homopolímero de acriloxipropil metilsiloxano. Cada uma destas matrizes de resina curável por radical livre foi misturada com um fotoiniciador, isto é, bis(2,4,6-trimetilbenzoil)- fenilfosfinoóxido (comercialmente disponível como OMNIRAD™ 2022, da IGM Resins).

[0175] As matrizes de resina curável por radical livre e o fotoiniciador foram misturados com solvente de PGMEA, com a concentração dos monômeros variando de cerca de 15 % em peso a cerca de 66 % em peso e a concentração do fotoiniciador sendo cerca de 1 % em peso.

[0176] Cada uma destas composições de resina foi depositada por revestimento por rotação em 2200 (revoluções por minuto) rpm por cerca de 1 minuto em um substrato de vidro. Depois da deposição, as composições de resina foram expostas a um cozimento suave por cerca de 2 minutos em torno de 130 °C para expelir PGMEA. A composição de resina depositada depois foi impressa usando litografia por nanoimpressão. Um carimbo de trabalho foi comprimido na composição depositada e a resina foi exposta à cura UV com uma lâmpada LED UV por cerca de 20 segundos.

[0177] Imagens SEM de cada uma das resinas padronizadas, curadas foram tomadas. As imagens são mostradas nas Figs. 3A a 3F, respectivamente, para as resinas padronizadas, curadas formadas com 1,3-bis(3-metacriloxipropil) tetrametildissiloxano, polidimetilsiloxano terminado em metacriloxipropil, tetrametil tetracis[3-acriloxipropil]ciclotetrassiloxano, metacril silsesquioxano poliédrico oligomérico, acrilo silsesquioxano poliédrico oligomérico e homopolímero de acriloxipropil metilsiloxano. Estas imagens demonstram que as composições de resina reveladas aqui podem ser nanoimpressas para formar depressões adequadas para células de fluxo ou outras aplicações adequadas. Exemplo 2

[0178] Uma composição de resina de exemplo foi preparada incluindo cerca de 17 % em peso de acrilo silsesquioxano poliédrico oligomérico (acrilo- POSS - como a matriz de resina curável por radical livre), cerca de 1 % em peso de bis(2,4,6-trimetilbenzoil)-fenilfosfinoóxido (como o fotoiniciador de radical livre) e acetato de éter monometílico de propileno glicol (PGMEA - um solvente). O solvente compôs o equilíbrio (cerca de 82 % em peso) da composição.

[0179] Uma composição de resina comparativa foi preparada incluindo cerca de 4 % em peso de POSS funcionalizado em glicidila e cerca de 13 % em peso de POSS funcionalizado em epoxicicloexil etila (como uma matriz de resina epóxi), cerca de 1,2 % em peso total de um combinação de fotoiniciador/gerador de fotoácido de tioxant-9-ona (ITX) (presente em torno de 0,34 % em peso)/TEGO® PC 1467 (Evonik Industries) (presente em torno de 0,85 % em peso), cerca de 1,4 % em peso de poliacrilato (BYK®-350) e um solvente (PGMEA). O solvente compôs o equilíbrio (cerca de 80 % em peso) da composição.

[0180] Cada uma da composição de resina de exemplo comparativo e composição de resina de exemplo foi depositada em um substrato de vidro por revestimento por rotação em 2200 (revoluções por minuto) rpm por cerca de 1 minuto.

[0181] Depois da deposição das composições de resina de exemplo e exemplo comparativo, as composições de resina de exemplo e exemplo comparativo foram expostas a um cozimento suave por cerca de 2 minutos em torno de 120 °C para expelir PGMEA. Depois, as resinas foram curadas UV com uma lâmpada LED UV por cerca de 20 segundos. A resina de exemplo comparativo foi cozida fortemente a 250 °C por cerca de 10 minutos depois da cura UV. A resina de exemplo não foi cozida fortemente.

[0182] Depois, o exemplo curado e o exemplo comparativo curado foram expostos a comprimentos de onda de excitação usando uma ferramenta baseada em espectrômetro. A fonte de excitação da ferramenta foi um laser a 445 nm (azul). O tamanho do ponto de laser é cerca de 200 µm. O feixe de laser passou através de um filtro para filtrar algumas linhas de comprimento de onda mais alto e depois passou através das amostras. Amostras transparentes (do exemplo curado e do exemplo comparativo curado) foram usadas para a medição. Em linha com o feixe de laser no outro lado da amostra estava um espectrômetro Ocean Optics que foi acoplado opticamente por fibra. A potência do laser incidente pode ser sintonizada ajustando-se a corrente de acionamento ou adicionando-se filtros atenuadores na frente do feixe de laser. Para as medições mostradas no gráfico da Fig. 4, uma potência de laser de 3 mW foi usada.

[0183] Como pode ser observado a partir do gráfico da Fig. 4, a intensidade de fluorescência (em unidades arbitrárias (AU)) do exemplo comparativo nos comprimentos de onda de excitação azul é tão alta quanto 2.500 AU e nos comprimentos de onda de excitação verde varia de cerca de 2.000 AU a cerca de

2.400 AU. Ao contrário, a intensidade de fluorescência do exemplo nos comprimentos de onda de excitação azul e verde está geralmente abaixo de cerca de 500 AU e não parece ser significativamente mais alta do que a intensidade de fluorescência do substrato de vidro branco.

EXEMPLO PROFÉTICO

[0184] A intenção deste exemplo profético é comparar duas formulações em um exemplo hipotético.

[0185] Uma composição de resina de exemplo inclui 1,3-bis(3- metacriloxipropil) tetrametildissiloxano (como a matriz de resina curável por radical livre) e bis(2,4,6-trimetilbenzoil)-fenilfosfinoóxido (como o fotoiniciador de radical livre) em PGMEA.

[0186] Uma composição de resina comparativa inclui POSS funcionalizado em glicidila e POSS funcionalizado em epoxicicloexil etila (como uma matriz de resina epóxi), uma combinação de fotoiniciador/gerador de fotoácido de tioxant-9-ona (ITX) e TEGO® PC 1467 (Evonik Industries) em PGMEA.

[0187] A composição de exemplo comparativo é depositada nas duas primeiras raias (1 e 2) de uma célula de fluxo de vidro ou silício e a composição de exemplo é depositada nas últimas duas raias (4 e 5) da célula de fluxo de vidro ou silício.

[0188] Depois da deposição das composições de resina de exemplo e exemplo comparativo, as resinas são curadas.

[0189] Cada um do exemplo curado e do exemplo comparativo curado é respectivamente exposto a comprimentos de onda de excitação azul e comprimentos de onda de excitação verde usando uma ferramenta de autofluorescência Amersham TYPHOON™. Acredita-se que os resultados da autofluorescência para o exemplo comparativo serão muito mais altos do que para o exemplo. As Figs. 5A e 5B são gráficos que ilustram os resultados propostos para a autofluorescência do exemplo curado e do exemplo comparativo curado quando expostos, respectivamente, a comprimentos de onda de excitação azul (Fig. 5A) e comprimentos de onda de excitação verde (Fig. 5B). Nestas figuras, os valores cinzas representam a autofluorescência e a distância em cm na qual as raias estão localizadas na célula de fluxo.

[0190] Este exemplo profético compara uma formulação hipotética com base em acrilato com uma formulação hipotética com base em resina epóxi e apresenta os resultados da autofluorescência proposta para cada uma das formulações hipotéticas para ilustrar que a combinação da matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano e do fotoiniciador de radical livre pode levar à autofluorescência mais baixa. Notas adicionais

[0191] Deve ser avaliado que todas as combinações dos conceitos precedentes e conceitos adicionais debatidos em mais detalhe abaixo (contanto que tais conceitos não sejam mutuamente inconsistentes) são consideradas como sendo parte do assunto inventivo revelado aqui. Em particular, todas as combinações do assunto reivindicado que aparecem no final desta invenção são consideradas como sendo parte do assunto inventivo revelado aqui. Também deve ser avaliado que a terminologia explicitamente utilizada aqui que também pode aparecer em qualquer invenção incorporada a título de referência deve estar de acordo com um significado mais compatível com os conceitos particulares revelados aqui.

[0192] Referência por todo o relatório descritivo a “um exemplo”, “um outro exemplo”, “um exemplo” e assim por diante, significa que um elemento particular (por exemplo, aspecto, estrutura e/ou característica) descrito em relação ao exemplo é incluído em pelo menos um exemplo descrito aqui e pode estar presente ou não em outros exemplos. Além disso, deve ser entendido que os elementos descritos para qualquer exemplo podem ser combinados em qualquer maneira adequada nos vários exemplos a menos que o contexto claramente dite de outro modo.

[0193] Deve ser entendido que as faixas fornecidas aqui incluem a faixa estabelecida e qualquer valor ou subfaixa dentro da faixa estabelecida, como se tais valores ou subfaixas fossem explicitamente relatados. Por exemplo, uma faixa de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm, deve ser interpretada para incluir não apenas os limites explicitamente relatados de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm, mas também para incluir valores individuais, tal como cerca de 408 nm, cerca de 445,5 nm, etc e subfaixas, tal como de cerca de 425 nm a cerca de 475 nm, etc. Além disso, quando “cerca de” e/ou “substancialmente” são/é utilizados para descrever um valor, eles são significados abranger variações menores (até +/- 10 %) do valor estabelecido.

[0194] Embora vários exemplos tenham sido descritos em detalhe, deve ser entendido que os exemplos revelados podem ser modificados. Portanto, a descrição precedente deve ser considerada não limitante.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uma composição de resina, compreendendo: uma matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano; e um fotoiniciador de radical livre; em que, quando curada, a composição de resina tem baixa ou nenhuma autofluorescência quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul variando de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm ou comprimentos de onda de excitação verde variando de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm.

2. A composição de resina como definida na reivindicação 1, em que a composição de resina curada tem baixa autofluorescência, e em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 25,000 quando a composição de resina curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação azul.

3. A composição de resina como definida na reivindicação 1, em que a composição de resina curada tem baixa autofluorescência, e em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 5,000 quando a composição de resina curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação azul.

4. A composição de resina como definida na reivindicação 1, em que a composição de resina curada tem baixa autofluorescência, e em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 10,000 quando a composição de resina curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação verde.

5. A composição de resina como definida na reivindicação 1, em que a composição de resina curada tem baixa autofluorescência, e em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 2,500 quando a composição de resina curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação verde.

6. A composição de resina como definida na reivindicação 1, em que a matriz de resina curável por radical livre compreende um acrilato selecionado a partir do grupo que consiste em 1,3-bis(3-metacriloxipropil) tetrametildissiloxano, polidimetilsiloxano terminado em metacriloxipropil, tetrametil tetracis[3-acriloxipropil]ciclotetrassiloxano, metacril silsesquioxano poliédrico oligomérico, acrilo silsesquioxano poliédrico oligomérico, homopolímero de acriloxipropil metilsiloxano, e combinações dos mesmos.

7. A composição de resina como definida na reivindicação 1, em que o fotoiniciador de radical livre é 2-etil-9,10-dimetoxiantraceno.

8. A composição de resina como definida na reivindicação 1, em que o fotoiniciador de radical livre é selecionado a partir do grupo que consiste em 2,2- dimetóxi-2-fenilacetofenona e 2-etóxi-2-fenilacetofenona.

9. A composição de resina como definida na reivindicação 1, em que o fotoiniciador de radical livre é um óxido de fosfina e em que o óxido de fosfina é selecionado a partir do grupo que consiste em óxido de difenil(2,4,6- trimetilbenzoil)fosfina, uma mistura de óxido de difenil(2,4,6- trimetilbenzoil)fosfina e 2-hidróxi-2-metilpropiofenona, óxido de fenilbis(2,4,6- ,trimetilbenzoil)fosfina, etil(2,4,6-trimetilbenzoil)fenilfosfinato, e combinações dos mesmos.

10. A composição de resina como definida na reivindicação 1, compreendendo ainda um supressor escuro ou um aceptor de elétron.

11. A composição de resina como definida na reivindicação 1 em que uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina curável por radical livre para o fotoiniciador de radical livre varia de cerca de 99,8:0,2 a cerca de 90:10.

12. A composição de resina como definida na reivindicação 1,

compreendendo ainda: uma matriz de resina epóxi; e um gerador de fotoácido.

13. Uma célula de fluxo, compreendendo: um substrato; e uma resina padronizada, curada no substrato, a resina padronizada, curada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais, e a resina padronizada, curada tendo sido formada a partir de uma composição de resina incluindo: uma matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano; e um fotoiniciador de radical livre; em que a resina padronizada, curada tem baixa ou nenhuma autofluorescência quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul variando de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm ou comprimentos de onda de excitação verde variando de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm.

14. A célula de fluxo como definida na reivindicação 13, compreendendo ainda: um revestimento polimérico nas depressões; e um iniciador enxertado ao revestimento polimérico.

15. A célula de fluxo como definida na reivindicação 13, em que a resina padronizada, curada tem baixa autofluorescência, e em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 25,000 quando a resina padronizada, curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação azul.

16. A célula de fluxo como definida na reivindicação 13, em que a resina padronizada, curada tem baixa autofluorescência, e em que a baixa autofluorescência corresponde com um valor cinza de menos do que 10,000 quando a resina padronizada curada é exposta aos comprimentos de onda de excitação verde.

17. A célula de fluxo como definida na reivindicação 14, em que a composição de resina inclui ainda: uma matriz de resina epóxi; e um gerador de fotoácido.

18. A célula de fluxo como definida na reivindicação 13, em que a matriz de resina curável por radical livre compreende um acrilato selecionado a partir do grupo que consiste em 1,3-bis(3-metacriloxipropil) tetrametildissiloxano, polidimetilsiloxano terminado em metacriloxipropila, tetrametil tetracis[3- acriloxipropil]ciclotetrassiloxano, metacril silsesquioxano poliédrico oligomérico, acrilo silsesquioxano poliédrico oligomérico, homopolímero de acriloxipropil metilsiloxano, e combinações dos mesmos.

19. A célula de fluxo como definida na reivindicação 13, em que o fotoiniciador de radical livre é selecionado a partir do grupo que consiste em 2- etil-9,10-dimetoxiantraceno, 2,2-dimetóxi-2-fenilacetofenona, e 2-etóxi-2- fenilacetofenona.

20. A célula de fluxo como definida na reivindicação 13, em que o fotoiniciador de radical livre é um óxido de fosfina selecionado a partir do grupo que consiste em óxido de difenil(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfina, uma mistura de óxido de difenil(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfina e 2-hidróxi-2-metilpropiofenona, óxido de fenilbis(2,4,6-,trimetilbenzoil)fosfina, etil(2,4,6- trimetilbenzoil)fenilfosfinato, e combinações dos mesmos.

21. A célula de fluxo como definida na reivindicação 13, em que a composição de resina compreende ainda um supressor escuro ou um aceptor de elétron.

22. A célula de fluxo como definida na reivindicação 13, em que uma razão em porcentagem (%) de peso da matriz de resina curável por radical livre para o fotoiniciador de radical livre na composição de resina varia de cerca de 99,8:0,2 a cerca de 90:10.

23. Um método para fazer uma célula de fluxo, compreendendo: depositar uma composição de resina sobre um substrato, a composição de resina incluindo: uma matriz de resina curável por radical livre incluindo um acrilato e um siloxano; e um fotoiniciador de radical livre; nanoimprimir a composição de resina depositada usando um carimbo de trabalho; e curar a composição de resina depositada para formar uma resina padronizada, curada; em que a resina padronizada curada tem baixa ou nenhuma autofluorescência quando exposta a comprimentos de onda de excitação azul variando de cerca de 380 nm a cerca de 480 nm ou comprimentos de onda de excitação verde variando de cerca de 510 nm a cerca de 560 nm.