BR112020025302A2 - Aumento de ações antibacterianas de um antibiótico depsipeptídico usando quantidades sinérgicas de ácido bórico - Google Patents

Abstract

"aumento de ações antibacterianas de um antibiótico depsipeptídico usando quantidades sinérgicas de ácido bórico". a presente invenção refere-se a uma formulação externa ou tópica para tratamento ou prevenção de infecções envolvendo superfícies corporais usando um antibiótico depsipeptídico, como lotilibcina, com eficácia e segurança melhoradas. o efeito antibacteriano da lotilibcina testado em modelos infecciosos é substancialmente aumentado pela adição de ácido bórico em baixa concentração, com nível de aditivo que não produz qualquer atividade farmacológica por si só, oferecendo assim uma formulação para preparações externas com segurança melhorada devido a uma redução na dose, período de dosagem e frequência de dosagem.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AU- MENTO DE AÇÕES ANTIBACTERIANAS DE UM ANTIBIÓTICO DE-

PSIPEPTÍDICO USANDO QUANTIDADES SINÉRGICAS DE ÁCIDO BÓRICO".

[0001] CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a formulações externas con- tendo fármaco antibiótico depsipeptídico (de preferência lotilibcina ou um sal ou estereoisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo) para uso na prevenção ou tratamento de infecções bacterianas. Méto- dos de uso dessas formulações no tratamento de infecções externas em um paciente ou indivíduo representam aspectos adicionais da pre- sente invenção

[0003] APLICAÇÕES RELACIONADAS

[0004] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório dos Estados Unidos número 62/684 316, de título idêntico, depositado em 13 de junho de 2018, cujo conteúdo é incorporado, por referência, em sua totalidade, neste documento.

[0005] ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[0006] A história de fármacos antibacterianos eficazes no trata- mento das infecções bacterianas abrange quase 80 anos, a partir de 1941, quando a penicilina apresentou sua eficácia clínica pela primeira vez. De 1940 a 1960, pelo menos 15 tipos de fármacos antibacterianos (fármacos antibióticos) foram encontrados em fontes naturais. Após o início dos anos 60, o desenvolvimento de novos fármacos passou a ser realizado predominantemente por métodos sintéticos a partir de um composto preexistente, resultando em uma diminuição extrema do número de novos antibióticos desenvolvidos a partir de fontes naturais. Assim, durante as épocas de 1980 a 2000, apenas dois exemplos desses fármacos foram desenvolvidos com sucesso.

[0007] Por outro lado, do ponto de vista clínico, com a proliferação da frequência e do número de antibióticos, surgiram e se espalharam por todo o mundo bactérias resistentes às quais os antibióticos são tolerantes. Isso é particularmente verdadeiro em países desenvolvidos, onde a antibioticoterapia e a tecnologia médica são avançadas, e o resultado é que a proporção de bactérias resistentes a medicamentos aumentou dramaticamente desde a década de 1980.

[0008] Além disso, como resultado do desenvolvimento biológico, bactérias resistentes a medicamentos evoluíram para adquirir resis- tência a múltiplos medicamentos em muitos países, um problema clíni- co significativo por si só que complicou o desenvolvimento de novos fármacos antibacterianos.

[0009] As infecções bacterianas que foram consideradas proble- máticas no passado foram quase sempre infecções adquiridas em hospitais de pacientes, mas depois de 2000, um número de casos ini- ciais devido a infecções adquiridas da comunidade em hospitais e uni- dades de saúde foram relatados, produzindo uma nova ameaça. Uma das principais causas do aumento da incidência dessas infecções é a natureza das bactérias e o fato de que elas podem ser facilmente transferidas por seus hospedeiros para pacientes não infectados pelo contato com a pele de um novo hospedeiro (que nunca foi contamina- do (naive)). Portanto, como uma das soluções eficazes para eliminar ou pelo menos reduzir este problema, é útil fornecer uma preparação antibacteriana para uso externo / tópico que exiba excelente eficácia contra infecções bacterianas externas / tópicas, que atualmente têm um número extremamente limitado de escolhas devido à dependência de fármacos bacterianos de linha antiga e de preparações orais e pre- parações injetáveis que foram frequentemente usadas para tratamen- tos antibacterianos no passado.

[0010] A lotilibcina, que é um antibiótico depsipeptídico com 12 resíduos de aminoácidos, foi descoberta como um fármaco antibacte-

riano eficaz contra infecções por cocos Gram-positivos, particularmen- te por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (methicillin- resistant Staphylococcus aureus - MRSA). A lotilibcina foi isolada de uma série de ingredientes antibacterianamente ativos produzidos por Lysobacter sp., cepa WAP-8294 como divulgado na patente US núme- ro 5 648 455, bem como Harad, et al., J Chromatogr. A, 2001, vol. 932, No. 1-2, pp. 75-81.

[0011] Ao contrário da maioria dos antibióticos convencionais que foram descobertos e/ou preparados a partir de uma fonte natural, a lotilibcina tem um perfil biológico de natureza única que exibe uma for- te atividade antibacteriana apenas em um número muito limitado de espécies de bactérias e geralmente tem ação apenas contra bactérias Gram-positivas. Em particular, a lotilibcina revela uma atividade anti- bacteriana bactericida em estafilococos resistentes a fármacos, como MRSA e MRSE (methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis - Staphylococcus epidermidis resistente à meticilina) em duas horas. Assim, a lotilibcina é um antibiótico anti-MRSA com um espectro anti- bacteriano de curto alcance e uma potente propriedade antibiótica.

[0012] Para uso prático de lotilibcina em preparações de fármacos, a patente US número 5 648 455 revela no Exemplo 13 formulações típicas para injeções, preparações orais (comprimidos) e preparações externas (unguentos e colírios) usando técnicas convencionais.

[0013] Para uso de lotilibcina por injeção ou infusão gota a gota, a patente dos EUA número 7 968 588 mostra uma fórmula contendo hi- droxipropil-P-ciclodextrina que pode fornecer uma melhoria dramática na segurança e que é eficaz no tratamento de infecções sistêmicas com uma bactéria resistente a fármacos, particularmente MRSA. No entanto, não há nenhuma divulgação com respeito a um método de aplicação a infecções bacterianas tópicas ou formulações tópicas que exibem atividade aumentada e inesperada.

[0014] Os presentes inventores investigaram a possibilidade de usar lotilibcina como um fármaco terapêutico para infecções bacteria- nas tópicas. Como uma questão prática, foi difícil colocar lotilibcina em uma preparação tópica para tratamento de infecções bacterianas tópi- cas usando os ensinamentos da patente US número 5 648 455, cuja patente apenas divulga fórmulas gerais, ou patente US número 7 968 588, cujos ensinamentos se referem a formulações parenterais para infusão em gotas ou injeção, ou outra técnica anterior pelas seguintes razões.

[0015] Conforme declarado na patente US número 5 648 455 co- mo uma característica, a lotilibcina é conhecida por ter uma atividade antibacteriana significativamente aumentada em um ambiente fisioló- gico no qual existe um componente de soro. Isso é novo e inesperado. Quase todos os antibióticos são menos ativos contra bactérias quando a interação ocorre na presença de albumina sérica. Portanto, a lotilib- cina exibe uma eficácia que ultrapassa os fármacos antibacterianos da técnica anterior em um modelo de infecção animal. No entanto, quan- do a lotilibcina foi administrada em uma dose que é a mesma que para os fármacos antibacterianos existentes ou mais usando uma fórmula conhecida na técnica anterior, conforme divulgado na patente US nú- mero 5 648 455, verificou-se que, embora uma eficácia farmacológica para a lotilibcina equivalente àquela dos fármacos antibacterianas da técnica anterior pudesse ser esperada, a manutenção da concentração de fármaco requerida resulta no aparecimento de toxicidade, particu- larmente na forma de reações de irritação ou reações tóxicas acompa- nhadas por alterações histológicas, resultando na conclusão de que ambas, segurança e eficácia não podem ser asseguradas simultane- amente.

[0016] Além disso, um número incrivelmente grande de fármacos antibacterianas foi usado/usado excessivamente em todo o mundo por longos períodos em uma ampla faixa de campos, incluindo cuidados médicos, pecuária, agricultura, silvicultura e pesca; evolução microbio- lógica de bactérias que foram expostas a esses fármacos aceleraram nos últimos anos, levando à mutação de bactérias em bactérias resis- tentes a fármacos, que adquiriram alto grau de resistência a múltiplos fármacos. Assim, no que diz respeito à lotilibcina, que é um composto descoberto há mais de vinte anos, foi inesperado demonstrar cientifi- camente sua eficácia como um agente terapêutico para infecções bac- terianas tópicas destinadas a uso externo em um grau que ultrapassa significativamente a eficácia de fármacos antibacterianos existentes contra bactérias altamente resistentes aos fármacos atuais.

[0017] Assim, o presente inventor continuou a investigar o uso de lotilibcina para encontrar uma nova formulação médica com o propósi- to de aplicar lotilibcina externamente para uso tópico de uma maneira eficaz e segura.

[0018] SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0019] Problemas a serem resolvidos pela presente invenção

[0020] O problema a ser resolvido pela presente invenção é forne- cer uma formulação para uso tópico ou composição externa que tenha perfil de alta eficácia e segurança que inclua um antibiótico depsipep- tídico de ocorrência natural (de preferência lotilibcina) com uma faixa de espectro antibacteriano alvo e atividade antibiótica potente. A refe- rida formulação contém aditivos que aumentam sinergicamente a ação antibacteriana da lotilibcina.

[0021] Meios para resolver o problema

[0022] Após sérias investigações para resolver o problema acima mencionado, os presentes inventores descobriram que a adição de ácido bórico em concentração baixa que corresponde a um nível de aditivo sem efeito antisséptico ou antibiótico por si só torna-se possível preparar uma formulação contendo um fármaco antibiótico depsipeptí-

dico para uso externo com alto grau de eficácia e segurança, e com- pletou a presente invenção.

[0023] Sumário dos efeitos da invenção

[0024] De acordo com a presente invenção, ao incorporar uma baixa concentração de ácido bórico com antibióticos depsipeptídicos e, em particular, lotilibcina em várias formações tópicas para uso externo para tratar pacientes e indivíduos, é possível atingir uma sinergia na atividade antibacteriana que é superior a fármacos antibacterianas existentes em infecções bacterianas tópicas. As referidas novas com- posições apresentam uma concentração eficaz significativamente di- minuída de um fármaco antibiótico depsipeptídico, particularmente loti- libcina, proporcionando assim uma preparação externa com alto grau de eficácia e segurança.

[0025] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026] Figura 1

[0027] Um gráfico que mostra o resultado de um teste de avalia- ção de eficácia (um teste preliminar) por aplicação de dose única usando modelos murinos experimentais infectados com Staphylococ- cus aureus resistente à meticilina (MRSA) na pele. A ordenada mostra o resultado da eficácia obtida pela aplicação de uma dose única de uma substância de teste na pele que foi inoculada por 1 x 106 CFU (colony forming units - unidades formadoras de colônia) de células bacterianas, excisando o tecido infectado da pele após 24 horas, con- tando o número de CFUs no tecido da pele e avaliando a eficácia por uma redução ou aumento no número de CFUs. A abcissa mostra as substâncias de teste individuais.

[0028] Figura 2

[0029] Um gráfico que mostra o resultado de um teste de avalia- ção de eficácia (teste principal) por administração de dose única usan- do modelos murinos experimentais infectados com Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) na pele. Como descrito para a Figura 1, a ordenada mostra o resultado da eficácia obtida pela aplica- ção de uma dose única de uma substância de teste na pele que foi inoculada por 1 x 106 CFU (colony forming units - unidades formadoras de colônia) de células bacterianas, excisando o tecido infectado da pe- le após 24 horas, contando o número de CFUs no tecido da pele e avaliando a eficácia por uma redução ou aumento no número de CFUs. A abcissa mostra as substâncias de teste individuais.

[0030] Figura 3

[0031] Um gráfico que mostra o resultado de um teste de avalia- ção de eficácia (teste preliminar) por administração de dose única usando modelos murinos experimentais infectados com Staphylococ- cus aureus resistente à meticilina (MRSA) na pele. Como descrito para a Figura 1, a ordenada mostra o resultado da eficácia obtida pela apli- cação de uma dose única de uma substância de teste na pele que foi inoculada por 1 x 106 CFU (colony forming units - unidades formadoras de colônia) de células bacterianas, excisando o tecido infectado da pe- le após 24 horas, contando o número de CFUs no tecido da pele e avaliando a eficácia por uma redução ou aumento no número de CFUs. A abcissa mostra as substâncias de teste individuais.

[0032] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0033] Definição e uso de termos

[0034] A presente invenção será explicada abaixo em detalhes. Na seguinte descrição, porcentagem (%) é porcentagem em peso, a me- nos que indicado de outra forma no contexto de seu uso. Concentra- ções (por exemplo, mg/ml ou mM/ml etc.) também são usadas para descrever a presente invenção.

[0035] Os seguintes termos devem ser usados em todo o pedido para descrever a presente invenção. Quando um termo não é definido especificamente neste documento, esse termo deve ser entendido como sendo usado de maneira consistente com o seu uso por aqueles versados na técnica.

[0036] Quando uma faixa de valores é fornecida, a menos que o contexto dite claramente o contrário, entende-se que cada valor inter- mediário, até o décimo da unidade do limite inferior, entre o limite su- perior e inferior dessa faixa, e qualquer outro valor declarado ou inter- mediário nesse intervalo declarado está abrangido pela invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores que podem ser inde- pendentemente incluídos nas faixas menores também estão engloba- dos na invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído da faixa declarada. Quando o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, os intervalos que excluem qualquer um, ou ambos, os limites incluídos, também estão incluídos na invenção.

[0037] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta in- venção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento também possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e ma- teriais preferidos são agora descritos.

[0038] Deve-se notar que, conforme usadas aqui e nas reivindica- ções anexas, as formas singulares "um/uma" e "o/a" incluem referên- cias no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0039] Além disso, os termos a seguir devem ter as definições es- tabelecidas abaixo.

[0040] O termo "paciente" ou "sujeito" é usado ao longo do pedido dentro do contexto para descrever um animal, geralmente um mamífe- ro, incluindo especialmente um animal domesticado e, de preferência, um humano, a quem o tratamento, incluindo tratamento profilático (pro- filaxia), com as composições de acordo à presente invenção é forneci-

do. Para tratamento dessas infecções, condições ou estados de doen- ça que são específicos para um animal específico, como um paciente humano, o termo paciente refere-se a esse animal específico. Na mai- oria dos casos, o paciente ou sujeito da presente invenção é um paci- ente humano de um ou de ambos os sexos.

[0041] O termo "eficaz" é usado neste documento, a menos que indicado de outra forma, para descrever uma quantidade de um com- posto ou componente que, quando usado dentro do contexto de seu uso, produz ou efetua um resultado pretendido, seja esse resultado se referindo à profilaxia e/ou terapia de uma infecção e/ou estado de do- ença, especialmente uma infecção bacteriana incluindo MRSA, ou ou- tra infecção descrita aqui dentro do contexto de seu uso ou descrita aqui de outra forma, incluindo seu uso para produzir um resultado ou efeito sinérgico em certos casos. Em condições de uso comum no tra- tamento de doenças infecciosas, um antibiótico é considerado eficaz se o organismo bacteriano tratado com o referido antibiótico for morto ou eliminado do local da infecção. Um antibiótico eficaz usado por tempo suficiente também resulta na melhoria da saúde dos tecidos ou de todo o corpo. O termo eficaz inclui todos os outros termos de quan- tidade eficaz ou concentração eficaz (incluindo o termo "terapeutica- mente eficaz") que são de outra forma descritos ou usados no presen- te pedido. O termo "concentração terapeuticamente eficaz" é definido como a concentração ou quantidade do agente antibiótico suficiente para resultar ou produzir efeito preventivo, curativo, estabilizador, me- lhorador no tratamento do local ou condição em tratamento e pode in- cluir redução ou eliminação de MRSA.

[0042] Assim, são fornecidos aqui métodos de matar uma bactéria por contato da referida bactéria com a composição antimicrobiana aqui fornecida. Em um exemplo, a bactéria morta é o Staphylococcus. Em alguns exemplos, a bactéria é morta em 10 minutos, em 15 minutos,

em 20 minutos ou em 30 minutos (tal como em 10-30 minutos, 10-20 minutos ou 10-15 minutos) de contato com a composição antimicrobi- ana. Em alguns exemplos, nem todas as bactérias em contato com a composição são mortas, mas a composição ainda é uma composição antimicrobiana. Por exemplo, em alguns exemplos, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, pelo menos 99,9%, pelo menos 99,99% ou pelo menos 99,999% dos microrganismos (como pelo me- nos 10 vezes, em pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes de redução) são mortos em 10 minutos, em 20 minutos ou em 30 minutos (como em 10 -30 minutos, 10-20 minutos ou 10-15 minutos) de contato com a composição antimicrobiana.

[0043] O termo "composto" é usado neste documento para des- crever qualquer composto ou agente bioativo específico divulgado nes- te documento, incluindo todos e quaisquer estereoisômeros (incluindo diastereômeros, isômeros/enantiômeros ópticos individuais ou mistu- ras racêmicas e isômeros geométricos), sais farmaceuticamente acei- táveis e formas de pró-fármacos. O termo composto aqui se refere a compostos estáveis. Dentro da sua utilização no contexto, o termo composto pode se referir a um único composto ou uma mistura de compostos conforme descrito de outra forma aqui.

[0044] O termo "farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utili- zado, significa que o composto ou composição é adequado para admi- nistração a um sujeito para atingir os tratamentos descritos neste do- cumento, sem efeitos colaterais indevidamente deletérios, consideran- do a gravidade da doença e a necessidade do tratamento. O termo "independentemente" é usado neste documento para indicar que a va- riável, que é aplicada independentemente, varia independentemente de aplicação para aplicação.

[0045] Os termos “cerca de” e “aproximadamente” são usados como equivalentes. Quaisquer números usados neste pedido com ou sem cerca de/ aproximadamente destinam-se a cobrir quaisquer flutu- ações normais apreciadas por um versado na técnica relevante. Por exemplo, conforme usado neste documento, o termo "aproximadamen- te" ou "cerca de", conforme aplicado a um ou mais valores de interes- se, refere-se a um valor que é semelhante a um valor de referência declarado. Em certas modalidades, dependendo do contexto, o termo "aproximadamente" ou "cerca de" se refere a uma faixa de valores que cai dentro de 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em qualquer direção (maior ou menor que), mais frequentemente 5% ou menos do valor de referência indi- cado, a menos que indicado de outra forma ou de outra forma evidente a partir do contexto (exceto quando tal número ultrapassar 100% de um valor possível).

[0046] Formulação Tópica, Aplicação Tópica

[0047] O termo "formulação tópica" é usado para descrever com- posições de acordo com a presente invenção que são administradas externamente a um paciente ou indivíduo em forma de dosagem tópi- ca. Formulações gerais para transferência tópica são descritas em Pharmaceutical Sciences (Ciências Farmacêuticas) de Remington, l8a Edição, Mack Publishing, p. 1288-1300 [1990]. Assim, em algumas modalidades, os extratos são formulados como um gel ou pasta à ba- se de água, pomada, creme (anidro ou hidratado), loção (anidra ou hidratada), emulsão, spray, solução, aerossol, bastão (creme sólido), band-aid líquido, pó, spray para inalação, spray nasal, gotas basais (basal drops), gotas na bochecha, gotas sublinguais, colírios ou sprays para os olhos, gotas ou sprays para o ouvido e adesivos transdérmi- cos.

[0048] O termo "aplicação tópica" é usado para descrever a admi- nistração das composições a uma superfície externa de um paciente ou indivíduo no tratamento de um estado de doença e/ou condição aqui descrita. É contemplado que as composições para aplicação tópi- ca descritas acima sejam utilizadas tanto para fins cosméticos como terapêuticos. Usos terapêuticos são para o tratamento de infecções, frequentemente infecções bacterianas e, em particular, infecções bac- terianas resistentes a fármacos. Em algumas modalidades, é contem- plado que as composições descritas acima são aplicadas diretamente na pele ou outras superfícies epiteliais ou epidérmicas do corpo. As composições podem ser aplicadas uma, duas, três ou mais vezes ao dia conforme apropriado para a indicação. A quantidade aplicada não é geralmente importante, mas muitas vezes uma composição compre- endendo de cerca de 0,001 mg a 5,0 gramas ou mais (muitas vezes de pelo menos cerca de 1 mg a cerca de 2 gramas) pode ser aplicada a uma determinada superfície do corpo por dia em doses divididas. Con- forme descrito acima, a composição para uso tópico pode compreen- der outros componentes, tais como antissépticos, agentes tensoativos, adjuvantes, veículos, outros ingredientes ativos etc. e estar na forma de um gel, creme, loção, pomada ou líquido, entre outros.

[0049] O termo "antibacteriano" é aqui utilizado para definir um composto que destrói bactérias ou inibe o crescimento de bactérias e pode ser referido como um antibiótico ou bacteriostático.

[0050] O termo "antisséptico" é definido como uma substância an- timicrobiana que pode ser aplicada topicamente na superfície do paci- ente. Na presente modalidade, o ácido bórico é mais comumente clas- sificado como uma substância antisséptica. De acordo com os ensi- namentos da presente invenção, o uso do ácido bórico antisséptico em combinação com antibióticos, como depsipeptídeos, especialmente lotilibcina pode fornecer melhorias sinérgicas na atividade e mais efi- cácia contra certas bactérias, como estafilococos.

[0051] Definição de Acne

[0052] Conforme usado neste documento, o termo "acne" se refere a uma condição selecionada do grupo que consiste em acne vulgaris, acne venenata, acne cística, acne fulminans, acne papulosa, acne pustulosa, acne causada por MRSA e acne nodulocística. A formula- ção tópica de acordo com a reivindicação 1, utilizada no tratamento da acne, pode envolver componentes de formulação adicionais que já são usados como tratamentos antiacne. Quando usados nesta composi- ção, agentes antiacne úteis combinados são selecionados no grupo que consiste em peróxido de benzoíla, ácido salicílico e um retinoide em combinação com o referido antibiótico depsipeptídico e o referido ácido bórico antisséptico.

[0053] Definição de ferida e infecção de ferida

[0054] Conforme usado neste documento, o termo "ferida" é defi- nido como uma lesão em qualquer tecido, e o termo "ferida infectada" ou "infecção da ferida" é definida como infecção que geralmente ocor- re como consequência de lesão do tecido, onde a referida lesão inclui queimaduras, lacerações, abrasões, mordidas, feridas cirúrgicas, feri- das de punção, úlceras, incluindo, mas não se limitando a feridas agu- das e crônicas de infecção complicada de pele e tecido mole e infec- ção de tecidos moles (complicated skin and soft tissue infection - cSS- TI), feridas agudas e crônicas de pele e infecção da estrutura da pele (skin and skin structure infection - SSSI) úlceras de estase venosa , úlceras diabéticas, úlceras de pressão, úlceras pós-cirúrgicas, úlceras pós-traumáticas e úlceras espontâneas.

[0055] Definição de sinergia e benefícios consequentes da mesma

[0056] Conforme usado neste documento, os termos "sinergia" e "atividade sinérgica" referem-se à interação de duas substâncias quando são combinadas ou usadas em conjunto para um propósito específico na medicina. Quando substâncias são combinadas, a ação de uma substância na presença da outra pode ser a mesma que se uma fosse duplicada e, portanto, a ação é dupla, que é definida como aditiva. Em interações aditivas, não há nenhum benefício para a se- gunda substância além de reproduzir o que o dobro da outra produ- ziria. Sinergia ocorre quando a ação resultante da combinação de du- as substâncias é maior do que a duplicação acima mencionada. Defi- nições comuns de sinergia abrangem mais de duas vezes a ação de combinação e, no uso prático, geralmente significam mais de quatro a mais de dez vezes de aumento dos componentes quando combinados.

[0057] Além de ações benéficas, como matar bactérias no local da infecção, ações benéficas de sinergia entre antibióticos e antissépticos e moléculas endógenas em uma infecção de ferida incluem estimular a migração de fibroblastos, estimular a produção de elastina, reduzir a expressão de fatores inflamatórios e aumentar a regulação de genes específicos, reduzindo linhas finas na pele, normalizando a cor da pe- le, equilibrando a pigmentação da pele, reduzindo a vermelhidão da pele, aumentando o brilho da pele, aumentando o teor de água e hi- dratação da pele, diminuindo ou normalizando a quantidade de sebo na pele, reduzindo a produção de melanina, aumentando a produção de proteína colágeno, aumentando a expressão do gene de colágeno, aumentando a proliferação de células-tronco adultas, aumentando o metabolismo celular de carboidratos, aumentando o metabolismo celu- lar de lipídios, prevenindo a apoptose, aumentando a angiogênese, suprarregulando o ciclo celular das células, aumentando a angiogêne- se, aumentando o desenvolvimento folicular.

[0058] Combinação sinérgica de depsipeptídeo lotilibcina e ácido bórico para uso externo

[0059] A presente invenção refere-se a uma formulação contendo antibiótico depsipeptídico para uso por aplicação tópica na prevenção ou tratamento de infecções bacterianas, mais frequentemente infec- ções bacterianas de feridas, que contém adicionalmente pelo menos

0,01% em peso de ácido bórico. Em modalidades particularmente pre- feridas, a concentração de ácido bórico varia de pelo menos cerca de 5,0 mM/ml (cerca de 313 µg / ml) a não mais do que cerca de 40 mM/ml (cerca de 2500 µg/ml) e a concentração de depsipeptídeo varia de pelo menos cerca de 18 nM/ml (0,03 µg/ml) ou pelo menos cerca de 152 nM/ml (0,25 µg/ml) a cerca de 4881 nM/ml (cerca de 8,0 µg/ml).

[0060] O fármaco antibiótico depsipeptídico que é do interesse da presente invenção é um composto com uma estrutura peptídica geral- mente formada pela combinação de resíduos de aminoácidos através de uma ligação amida (-CONHR-, R é a cadeia lateral de um aminoá- cido) em que pelo menos uma ligação amida é substituída por uma ligação éster (-COOR-). De preferência, o fármaco antibiótico depsi- peptídico que é usado na presente invenção tem uma estrutura mole- cular constituída por 12 resíduos de aminoácidos e, mais preferivel- mente, é lotilibcina com a seguinte fórmula estrutural (1) ou um sal ou estereoisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0061] O fármaco antibiótico depsipeptídico incluindo lotilibcina pode ser utilizado na forma do seu sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos desse sal farmaceuticamente aceitável são sais de ácidos inorgânicos, como um cloridrato, bromidrato, iodidrato e similares, bem como sais de ácidos orgânicos, tais como tartarato, citrato, toluenos-

sulfonato e similares. Um sal de lotilibcina particularmente preferido é o seu dicloreto.

[0062] A quantidade do fármaco antibiótico depsipeptídico na for- mulação externa de acordo com a presente invenção é definida como aquela que possa exercer sua atividade antibacteriana significativa- mente quando combinada com ácido bórico, embora a quantidade par- ticular possa ser selecionada dependendo de vários fatores, incluindo o tipo de bactéria alvo em questão, o tipo ou gravidade da doença in- fecciosa a ser tratada, o local afetado no corpo, a intenção da formula- ção que é usada para prevenção ou tratamento, a forma de dosagem da formulação. A quantidade mínima do fármaco antibiótico depsipep- tídico na formulação é de preferência de pelo menos 0,01%, mais pre- ferivelmente de 0,05% e no máximo da preferência 0,1% em peso, en- quanto a quantidade máxima do mesmo é preferivelmente de cerca de 5,0%, mais preferivelmente de 2,5%, ainda mais preferivelmente de 2,0% e no máximo da preferência de 1,0% em peso. Mais especifica- mente, a quantidade de lotilibcina ou outro antibiótico depsipeptídico na formulação final é, de preferência, de 0,01% a 5,0% em peso, mais preferivelmente de 0,05% a 2,5%, ainda mais preferivelmente de 0,05% a 2,0%, e no máximo da preferência de 0,1% a 1,0% em peso da formulação final. Em uma formulação tópica preferida, a composi- ção é apresentada em tubos de 50 ou 100 gramas e a composição é administrada a uma área afetada de um paciente ou indivíduo esfre- gando uma quantidade eficaz (frequentemente cerca de 1-2 gramas) da composição quatro ou cinco vezes por dia na área. Tipicamente, essa composição irá administrar cerca de 100-500 mg ou mais de áci- do bórico, de preferência até cerca de 250 mg de ácido bórico e cerca de 2,5 a 15 mg, de preferência até cerca de 10 mg de depsipeptídeo (de preferência lotilibicina) por dia à área afetada do paciente ou indi- víduo.

[0063] Ácido bórico que é adicionado com a finalidade de aumen- tar a atividade antibacteriana de uma droga antibiótica depsipeptídica, como a lotilibcina, de acordo com a presente invenção, pode ser usado na forma de seu sal, como borato de sódio (bórax) e borato de amônio ou seu éster, que é aceitável como um aditivo em uma preparação farmacêutica. Nesse caso, a quantidade (peso) de borato de sódio, borato de amônio ou seu éster correspondente ("agente químico de ácido bórico") na formulação final é ajustada para se conformar à quantidade de ácido bórico tipicamente usada na presente invenção. Assim, o peso do agente químico de ácido bórico é incluído nas formu- lações finais em uma quantidade igual ao equivalente molar do ácido bórico usado (como descrito acima). A título de exemplo, a quantidade de ácido bórico usada nas presentes formulações é convertida em um equivalente molar do agente químico de ácido bórico usado a fim de determinar a quantidade (peso) do agente químico de ácido bórico a ser incluído nas presentes formulações. A quantidade de agente quí- mico de ácido bórico que é convertida a partir da quantidade de ácido bórico cai dentro da faixa mencionada acima.

[0064] A quantidade de ácido bórico que é adicionada é de pelo menos 0,01% em peso da formulação final uma vez que foi verificado que a atividade antibacteriana da lotilibcina pode ser aumentada na presença dessa quantidade de ácido bórico. A quantidade mínima de ácido bórico é, de preferência. de 0,05% e mais preferivelmente de 0,1%, enquanto a quantidade máxima dele é, de preferência de 5,0%, mais preferivelmente de 2,5%, ainda mais preferivelmente de 2,0% e no máximo da preferência de 1,0% em peso. Mais especificamente, a quantidade de ácido bórico é, de preferência de 0,01% a 5,0%, mais preferivelmente de 0,05% a 2,5%, ainda mais preferivelmente de 0,05% a 2,0%, e no máximo da preferência de 0,1% a 1,0% em peso. A quantidade de agente químico de ácido bórico usado é geralmente maior do que a faixa acima para ácido bórico, dado que os agentes químicos de ácido bórico que podem ser substituídos por ácido bórico geralmente têm pesos molares que são maiores do que os do ácido bórico.

[0065] O ácido bórico (também chamado de ácido borácico) tem uma longa história como um composto usado na área médica. Em 1702, Wilhelm Homberg, um químico holandês, o produziu como um composto cristalino por destilação de uma mistura de sulfato de ferro e bórax. Mais tarde, em 1876, Joseph Lister, um cirurgião britânico, pro- pôs o uso de gaze borácica (feita a partir de gaze cirúrgica embebida em solução fervida de ácido bórico e depois seca) para fins de desin- fecção.

[0066] No Japão, o ácido bórico foi listado no passado na Farma- copeia do Japão como um fármaco na forma de pomada de ácido bó- rico e pomada de ácido bórico e de óxido de zinco, ambas contendo uma grande quantidade de ácido bórico da ordem de 10% (p/v). No entanto, em vista de casos de envenenamento por ácido bórico ocorri- dos no Japão e no exterior e preocupações de segurança por absor- ção percutânea, pomada de ácido bórico a 10% e pomada de ácido bórico a 10% e óxido de zinco foram consideradas "não úteis" e "não significativas como um aditivo ", respectivamente, no Drug Efficacy Reevaluation - Drugs for Medical Use (Reavaliação da Eficácia de Fármacos – Fármacos para uso medicinal), Parte 24, 1985 (publicado em 30 de julho de 1985 em Yakuhatsu No. 755 pelo Ministério de Sa- úde e Bem estar do Japão). Como resultado, pomada de ácido bórico, pomada de ácido bórico e óxido de zinco, e até mesmo bórax de glice- rina foram excluídos da Farmacopeia e dos preços padrão de medi- camentos no Japão.

[0067] Consequentemente, hoje em dia apenas uma baixa con- centração de ácido bórico (uma solução aquosa contendo 2% ou me-

nos de ácido bórico) é permitida em oftalmologia com o propósito de "lavagem e desinfecção contra sacos conjuntivais". Além disso, essa concentração baixa (no máximo 2%) de ácido bórico na qual nenhuma eficácia terapêutica positiva é exercida pode ser usada como um aditi- vo farmacêutico para uso como estabilizador, agente tampão, agente de tonicidade, agente de ajuste de pH, antisséptico, conservante, agente solubilizante ou similar. Para este propósito, ácido bórico pode ser usado em uma concentração de até 18 mg/g (1,8% (p/p)) para aplicação externa (percutânea), até 20 mg/ml (2,0% (p/v)) para uso oftálmico e até 20 mg/ml (2,0% (p/v)) para uso otorrinolaringológico no Japão.

[0068] Assim, apesar do histórico de que o ácido bórico tenha sido considerado útil até certo grau para aplicação médica quando usado em uma concentração elevada da ordem de 10%, depois que se sou- be que tal concentração elevada de ácido bórico causa problemas de segurança superando sua eficácia, a utilidade do ácido bórico no cam- po médico foi negada por uma autoridade médica e este tornou-se um composto que não pode ser colocado em uso prático como único in- grediente ativo. Por outro lado, em uma concentração baixa de 2% ou menos, o ácido bórico não exibe nenhuma eficácia qualificada como ingrediente ativo de fármaco, sendo apenas utilizado em oftalmologia para fins de lavagem ou em aplicações externas de fármacos como aditivo para fins de estabilização de fármacos, tamponamento, ajuste de tonicidade, solubilização, ajuste de pH e esterilização/preservação, para os quais existem opções alternativas.

[0069] Definições de bactérias

[0070] A formulação externa de acordo com a presente invenção se destina a tratar a infecção por bactérias Gram-positivas, tais como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Propionibacte- rium, Bacillus, que incluem bactérias resistentes a fármacos (por exemplo, Staphylococcus aureus resistente à meticilina, também co- nhecido como MRSA) e nas quais um fármaco antibiótico depsipeptí- dico exemplificado pela lotilibcina exibe uma atividade antibacteriana.

[0071] Staphylococcus aureus é uma espécie de bactéria normal- mente existente na pele, narina ou outro local de um ser humano ou mamífero e causa infecções tópicas decorrentes de um corte, facada ou outro ferimento na pele e várias infecções nos olhos, ouvido ou na- riz. Com a progressão dos sintomas causados pela infecção por essas bactérias, elas podem resultar em doenças infecciosas graves com risco de vida, como pneumonia, peritonite, sepse e meningite. Este tipo de bactéria, particularmente aquelas que têm resistência a um fármaco como resistência à meticilina, dão origem a problemas de in- fecções adquiridas na comunidade que agora estão se expandindo, além de infecções hospitalares. Portanto, a formulação externa de acordo com a presente invenção é útil na prevenção ou tratamento de infecções tópicas ou infecções de feridas pós-operatórias na pele ou outro local e, adicionalmente, na prevenção da propagação de infec- ções bacterianas em instalações médicas ou semelhantes, que é con- siderada importante de um aspecto da saúde pública.

[0072] Propionibacterium acnes, que pertence ao gênero Propioni- bacterium, está envolvido na ocorrência de espinhas (acne vulgaris e outras condições de acne). A formulação externa de acordo com a presente invenção também é eficaz contra esta bactéria. Assim, as presentes formulações podem ser usadas para tratar a acne, em que a acne é uma condição selecionada a partir do grupo que consiste em acne vulgaris, acne venenata, acne cística, acne fulminans, acne pa- pulosa, acne pustulosa, acne causada por MRSA e acne nodulocística e em que a formulação inclui ainda, além de uma quantidade eficaz de ácido bórico ou um agente químico de ácido bórico e lotilibcina, uma quantidade eficaz de peróxido de benzoíla, ácido salicílico e/ou um re-

tinoide.

[0073] Entre o gênero Bacillus, particularmente Bacillus anthracis é importante como uma bactéria causadora de infecções zoonóticas. Esse tipo de bactéria pode se espalhar não apenas por uma via de contágio comum, mas também por infecção por gotículas. A aplicação da formulação tópica/externa de acordo com a presente invenção tam- bém é útil para fins de evitar infecção não prevista por esta bactéria.

[0074] As infecções bacterianas que podem ser prevenidas ou tra- tadas pela formulação tópica / externa de acordo com a presente in- venção incluem não apenas infecções em seres humanos, mas tam- bém em animais como cães, gatos e gado.

[0075] Formulações e componentes da presente invenção

[0076] A formulação tópica/externa de acordo com a presente in- venção pode ser efetivamente usada por administração tópica à pele, olho, ouvido ou nariz (por exemplo, na forma de uma preparação de embrocação para a pele, colírio, gotas para ouvido e gotas nasais), administração na boca na forma de gargarejo e administração nos ór- gãos respiratórios na forma de um inalante. As formulações tópicas podem ser preparadas em formas de dosagem a serem administradas ao ânus/reto ou vagina de um indivíduo ou paciente.

[0077] Várias formas de dosagem podem ser utilizadas, como lí- quido (solução, suspensão, emulsão ou dispersão), pomada, gel, ae- rossol, sólido e creme.

[0078] Quando necessário para a preparação farmacêutica, vários aditivos auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como um tensoativo, excipiente, agente oleoso, espessante, conservante, agente vitamíni- co, agente de ajuste de pH, antioxidante, corante e aroma, podem ser apropriadamente incorporados na formulação. Esses aditivos incluem tensoativos aniônicos, tensoativos não iônicos, tensoativos anfotéricos, hidrocarbonetos, óleos e gorduras naturais, ácidos graxos, álcoois su-

periores, alquil gliceril éteres, ésteres, óleos de silicone, álcoois polií- dricos, álcoois inferiores, sacarídeos, compostos de alto peso molecu- lar, pó, sais, ácidos orgânicos, água e similares.

[0079] O tensoativo inclui tensoativos não iônicos, como polioxieti- leno éteres de ácidos graxos superiores, ésteres de ácidos graxos de sorbitano, mono-oleato de polioxietileno glicol e polioxietileno óleo de rícino hidrogenado, tensoativos aniônicos, como ácidos graxos mono- carboxílicos, polioxietileno alquil éter acetatos e polioxietileno sulfatos de alquila, e tensoativos anfotéricos como alquilamidobetaínas, aque- las do tipo imidazolina e aquelas do tipo glicina.

[0080] O excipiente inclui água, álcool, glicerina, propilenoglicol, polietilenoglicol, hidroxietilcelulose, sorbitol, carboximetilcelulose, celu- lose microcristalina, amido, dextrina, α-ciclodextrina, sílica precipitada e similares. O agente oleoso inclui óleo de coco, óleo de palma, óleo de oliva, petrolato líquido, esqualano, petrolato, ácido oleico, álcool cetílico, álcool estearílico, álcool isoestearílico, dimetilpolissiloxano, polioxietileno estearil éter e similares. O espessante inclui polímeros de carboxivinila, carboximetilcelulose, carragena, alginato de sódio e similares. O conservante inclui ácido benzoico, ácido desidroacético, ácido sórbico, cloreto de benzalcônio, ésteres alquílicos de ácido hi- droxibenzoico e similares. O agente vitamínico inclui vitamina A, vita- mina B, vitamina C, vitamina E e similares.

[0081] A formulação tópica/externa de acordo com a presente in- venção pode ser preparada por um método geral para preparações farmacêuticas conhecidas na técnica. A frequência ou intervalo de do- sagem não são críticos, mas frequentemente esta é administra- da/aplicada uma, duas, três ou mais vezes por dia, conforme apropria- do para a indicação ou condição a ser tratada. A quantidade da com- posição aplicada não é geralmente crítica para efetuar um resultado terapêutico pretendido, desde que uma quantidade eficaz seja usada.

Frequentemente, uma composição contendo de 0,001 mg a 1,0 grama pode ser aplicada a uma determinada superfície do corpo para efetuar um resultado pretendido no tratamento de um estado de doença e/ou condição descritos, de outra forma, neste documento. Conforme des- crito acima, a composição pode compreender outros componentes, como antissépticos, agentes tensoativos, adjuvantes, veículos, outros ingredientes ativos etc. A formulação pode ser administrada diariamen- te em dose única ou várias doses, e um intervalo de dosagem mais longo é possível.

[0082] Os seguintes exemplos de teste são dados para demons- trar o efeito do aumento de atividade antibacteriana de um fármaco antibiótico depsipeptídico na presença de ácido bórico. O antibiótico depsipeptídico usado nestes exemplos é a lotilibcina, uma vez que é representativa desse fármaco. O composto realmente usado nos exemplos foi o dicloridrato de lotilibcina.

[0083] EXEMPLO 1

[0084] Avaliação do Efeito de Ácido Bórico na atividade antibacte- riana de Lotilibcina

[0085] O efeito do ácido bórico na atividade antibacteriana da loti- libcina foi avaliado usando modelos murinos infectados por MRSA na pele, aos quais foi aplicada a administração de dose única para avaliar um efeito benéfico. Nesse teste, mupirocina, um agente antibacteriano externo frequentemente utilizado em clínicas, foi usada como controle comparativo (controle positivo).

[0086] (1-1) teste in vitro

[0087] Antes das investigações em camundongos, a atividade an- tibacteriana de cada composto foi determinada usando a mesma bac- téria utilizada neste teste de avaliação de eficácia. A medição foi reali- zada de acordo com o método padrão (método de microdiluição em caldo) especificado pela Sociedade Japonesa de Quimioterapia. O meio usado para a cultura foi caldo Mueller-Hinton ajustado para cá- tions (cation-adjusted Mueller-Hinton broth - CAMHB) ao qual 5% de FBS (fetal bovine serum - soro fetal bovino) foi adicionado ou não co- mo um componente do soro.

[0088] Os resultados são mostrados na Tabela 1. Como mostrado aqui, verificou-se que a lotilibcina tinha uma atividade antibacteriana inferior à da mupirocina na ausência de um componente sérico (FBS), mas exerceu sua atividade antibacteriana quase comparável à da mu- pirocina na presença de um componente sérico. Ácido bórico, quando utilizado isoladamente, exibiu atividade antibacteriana em concentra- ção equivalente a 0,25% (2500 µg/ml) e sua atividade não foi influen- ciada pela presença ou ausência de componente sérico.

[0089] Tabela 1 Substância em teste Presença de Concentração mínima de inibição contra FBS 5% MRSA usado em modelo animal (MIC µg/ml) Lotilibcina (sozinha) Não 1 Sim 0,25 Ácido bórico (sozinho) Não 2500 Sim 2500 Mupirocina Não 0,125 (Controle positivo) Sim 0,5 (1-2) Teste de avaliação de eficácia em camundongos

[0090] Com base nos resultados acima de medição in vitro para atividade antibacteriana, um teste de avaliação de eficácia foi realizado por um método de dose única usando modelo de infecção de pele de murino com MRSA.

[0091] Neste teste, uma formulação pouco irritativa foi preparada para uso no teste através da mistura de uma substância de teste com uma base de pomada solúvel em água bem conhecida (glicerina) para dissolvê-la na base, seguido pela adição de um agente de ajuste de pH suficiente para dar um valor de pH em torno de 5.

[0092] Este teste foi realizado em duas etapas, um teste preliminar e um teste principal.

[0093] Teste Preliminar

[0094] No teste preliminar, uma dose única de várias concentra- ções de lotilibcina ou apenas de ácido bórico, ou de mupirocina2% (controle positivo) foi administrada para determinar a resposta à dose de cada substância teste com relação à eficácia antibacteriana.

[0095] O teste preliminar foi realizado da seguinte maneira. Após um local experimental de ferida por queimadura ter sido feito nas cos- tas de cada camundongo, 1 x106 CFU por animal de células MRSA foram inoculadas por via subcutânea no local afetado para causar in- fecção de pele. No dia seguinte, cada substância em teste foi adminis- trada percutaneamente em uma dose única a três animais por grupo. Após mais um dial, um tecido de pele foi coletado do local afetado e um aumento ou redução no número de células (CFU) foi determinado por uma técnica bacteriológica para avaliar a eficácia da substância em teste.

[0096] Tabela 2 Grupo No Substância em teste Rota de administração Dose (única) 1 Pomada base sozinha (controle Aplicação tópica externa 100µl/animal negativo) 2 Mupirocina 2% (controle positivo) idem 100µl/animal 3 Ácido bórico 1% sozinho idem 100µl/animal 4 Ácido bórico 0,1% sozinho idem 100µl/animal 5 Lotilibcina 0,5 % sozinha idem 100µl/animal 6 Lotilibcina 0,2 % sozinha idem 100µl/animal 7 Lotilibcina 0,02 % sozinha idem 100µl/animal

[0097] Neste teste, concentrações de 0,1% e 1,0% de ácido bórico foram testadas para avaliação. Essas concentrações foram seleciona- das tendo em vista os antecedentes históricos do ácido bórico, con- forme discutido anteriormente em detalhes. Ou seja, foi revelado que o ácido bórico apresenta um risco de segurança sobre sua eficácia em uma concentração elevada de 10% ou mais. Por outro lado, em baixa concentração de 2% ou menos, o ácido bórico não apresenta nenhu- ma eficácia qualificada como ingrediente ativo do fármaco, sendo ape- nas utilizado na oftalmologia para fins de lavagem ou em aplicações externas como aditivo para fins de estabilização de fármacos, tampo- namento, ajuste de tonicidade, solubilização, ajuste de pH e esteriliza- ção / preservação, para os quais existem opções alternativas.

[0098] Os resultados do teste preliminar são mostrados na Figura

1. Como pode ser visto a partir da mesma, a eficácia dependente da dose foi observada pela administração única de lotilibcina em concen- trações de 0,02%, 0,2% e 0,5%. A eficácia observada em uma concen- tração de 0,5% foi comparável à de 2% de mupirocina como controle positivo para comparação.

[0099] Em relação ao ácido bórico, por outro lado, embora tivesse uma concentração inibitória mínima equivalente a 0,25% (2500 µg/ml) contra os microrganismos em teste no teste in vitro citado, a alteração no número de células observada na avaliação de eficácia usando mo- delos de infecção animal foi no mesmo nível ou pior do que o resultado do controle negativo, mesmo quando administrado em uma concentra- ção de 1% (10 000 µg/ml), que é 4 vezes maior que seu valor de MIC in vitro. Nomeadamente, verificou-se que ácido bórico, sozinho, não tinha eficácia antibacteriana em concentrações que variam de 0,1% a 1% quando testado com modelos de infecção animal.

[00100] Teste Principal

[00101] No teste principal, que geralmente foi realizado da mesma maneira que a descrita no teste preliminar, foi preparada uma formula- ção contendo 0,5% de lotilibcina e contendo adicionalmente 1% de ácido bórico, que por si só não mostrou eficácia antibacteriana no teste preliminar. Uma dose única da formulação foi aplicada a modelos mu- rinos com infecção de pele por MRSA e avaliada quanto à eficácia em comparação com mupirocina a 2% como controle positivo.

[00102] Tabela 3 Grupo No Substância em teste Rota de administração Dose (única) 1 Pomada base sozinha (controle Aplicação tópica externa 100µl/animal negativo) 2 Mupirocina 2% (controle positivo) idem 100µl/animal 3 0,5%lotilibcina + 1% ácido bórico idem 100µl/animal

[00103] Os resultados são mostrados na Figura 2. Surpreendente- mente, foi determinado que o grupo no qual uma formulação contendo 0,5% de lotilibcina junto com 1% de ácido bórico que é uma baixa con- centração sem atividade antibacteriana foi administrada por via percu- tânea com dose única resultou na redução do número de CFUs em comparação com 2% de mupirocina por um fator de 100, indicando uma eficácia muito alta da formulação.

[00104] Teste Adicional

[00105] Com base na nova descoberta obtida no teste principal, o presente inventor realizou um teste adicional. Neste teste, foi prepara- da uma formulação com concentrações de lotilibcina e ácido bórico reduzidas pela metade, a saber 0,25% e 0,5%, respectivamente, e comparada com 2% de mupirocina no que diz respeito à eficácia anti- bacteriana.

[00106] Tabela 4 Grupo No Substância em teste Rota de administração Dose (única) 1 Pomada base sozinha (controle Aplicação tópica externa 100 µl/animal negativo) 2 Mupirocina 2% (controle positivo) idem 100 µl/animal 3 0,25%lotilibcina + 0,5% ácido bó- idem 100 µl/animal rico

[00107] Como pode ser visto na Figura 3 que mostra os resultados, a formulação contendo 0,25% de lotilibcina e 0,5% de ácido bórico também exibiu uma atividade antibacteriana com uma redução signifi- cativa no número de CFUs em comparação com 2% de mupirocina.

[00108] Como evidenciado a partir da série de investigações sobre a avaliação da eficácia descrita acima, o presente inventor teve suces-

so em aumentar drasticamente o perfil de eficácia da lotilibcina como um composto antibiótico depsipeptídico, adicionando uma baixa con- centração de ácido bórico.

[00109] O uso de uma formulação de acordo com a presente inven- ção torna possível melhorar dramaticamente a eficácia terapêutica ou a eficácia protetora na prevenção de infecções quando um antibiótico, lotilibcina, é aplicado como um agente antibacteriano externo com a finalidade de tratamento de várias infecções bacterianas em seres humanos s e animais. Por este efeito, é possível encurtar muito todo o período necessário para o tratamento. Como resultado, um agente an- tibacteriano para uso externo com alta segurança com uma dose ou frequência de dosagem diminuída é fornecido no campo médico. Tam- bém contribui para a supressão do aparecimento de bactérias resisten- tes a fármacos devido a uma redução significativa na exposição a fár- macos antibacterianos.

[00110] EXEMPLO 2

[00111] Relação entre atividades antibacterianas em um teste in vitro e avaliação de eficácia em um teste animal

[00112] Como resultado da avaliação da eficácia no teste com ani- mais mostrado no Exemplo de Teste 1 acima, o presente inventor teve a nova descoberta de que a adição de ácido bórico teve uma influência surpreendentemente benéfica na utilidade da lotilibcina como um anti- biótico depsipeptídico para uso externo. Este resultado, no entanto, apresentou um novo problema subsidiário que o presente inventor teve de enfrentar. O problema é que os dados de eficácia obtidos nos tes- tes de avaliação em animais devem ser reproduzidos em um teste in vitro para medição da atividade antibacteriana, como um teste de sen- sibilidade antibacteriana in vitro que é mais conveniente do que testes em animais.

[00113] Em um departamento de exame clínico de uma instalação médica, como um hospital, um agente antibacteriano para uso médico geralmente recebe um teste in vitro simples. A partir do resultado des- te teste, a eficácia do fármaco quando administrado a um ser humano é prevista antes que a administração real de uma formulação prescrita seja realmente iniciada para terapia antibacteriana.

[00114] Em uma série de investigações in vitro sem animais que o presente inventor realizou com antecedência, um aumento significativo na atividade antibacteriana não foi observado pela adição de ácido bó- rico à lotilibcina.

[00115] (2-1) Teste MIC in vitro

[00116] Para resolver o problema acima mencionado, investigações adicionais foram feitas para conhecer a resposta à dose do efeito de ácido bórico usado para aumentar a atividade antibacteriana da lotilib- cina em condições in vitro. A saber, foi medida a atividade antibacteri- ana da lotilibcina contra uma cepa de MRSA clinicamente isolada na presença de diferentes concentrações de ácido bórico. A medição foi realizada de acordo com o método padrão (método de microdiluição em caldo) especificado pela Sociedade Japonesa de Quimioterapia. O meio que foi usado foi caldo Mueller-Hinton ajustado para cátions (CAMHB). A concentração de lotilibcina foi fixada em 1 µg/ml corres- pondente ao MIC da lotilibcina sozinha.

[00117] Neste teste, um componente do soro, FBS, foi usado como controle positivo, pois já era conhecido por aumentar a atividade anti- bacteriana da lotilibcina. A atividade antibacteriana do ácido bórico so- zinho contra a bactéria usada neste teste foi avaliada previamente, e sua atividade anti-MRSA (MIC) foi de 2500 µg/ml (equivalente a 0,25%).

[00118] Os resultados deste teste são mostrados na Tabela 5. Co- mo pode ser visto a partir desses resultados, na presença de ácido bórico, uma aparente diminuição no valor de MIC devido à atividade antibacteriana do próprio ácido bórico foi observada quando a concen- tração de ácido bórico foi de 0,25% ou superior em que o ácido bórico teve uma atividade inibidora sobre o crescimento das bactérias. No entanto, no teste de eficácia de fármaco murino mencionado anterior- mente, o ácido bórico quando usado sozinho não exibiu atividade (efi- cácia) antibacteriana. Portanto, tornou-se claro que os resultados obti- dos neste teste in vitro não puderam ser diretamente correlacionados com a eficácia observada no teste em animais (os testes em animais mostraram aumento sinérgico da atividade antibacteriana da lotilibcina por adição de ácido bórico).

[00119] Neste teste in vitro, uma concentração de ácido bórico de 0,1% ou menos não exibiu qualquer aumento da atividade antibacteri- ana da lotilibcina. Na presença de ácido bórico a 0,2%, foi observado um fraco aumento da atividade antibacteriana (uma pequena diminui- ção no valor de MIC), mas é claro que isso não pode explicar os resul- tados observados no teste animal na presença de uma baixa concen- tração de ácido bórico ácido.

[00120] Tabela 5 Atividade antibacteriana de lotilibcina contra cepa de MRSA clinicamente isolada Aditivo Atividade antibacteriana Observações (MIC, µg/ml) FBS 5% ≤0,06 Controle positivo Ácido bórico 1% ≤0,06 Aparente valor de MIC 0,5% ≤0,06 reduzido devido à ativi- 0,25% ≤0,06 dade antibacteriana do ácido bórico em si 0,2% 0,25 Fraco aumento de ativi- dade antibacteriana 0,1% 1 Nenhum efeito de au- mento de atividade antibacteriana de lotilib- cina (1µg/ml)

[00121] (2-2) Teste de MIC cruzado

[00122] Uma vez que a investigação in vitro acima não trouxe um resultado que pudesse explicar com sucesso o aumento significativo da atividade antibacteriana de lotilibcina na presença de ácido bórico observado no teste animal, o presente inventor fez uma investigação adicional para avaliação mais completa do efeito de ácido bórico quando adicionado à lotilibcina. A saber, a atividade antibacteriana contra MRSA foi determinada com concentrações variáveis das duas substâncias em teste (lotilibcina e ácido bórico) de uma forma cruzada (teste MIC cruzado). A medição foi realizada de acordo com o método padrão (método de microdiluição em caldo) especificado pela Socie- dade Japonesa de Quimioterapia. O meio utilizado para a cultura foi o caldo Mueller-Hinton ajustado para cátions (CAMHB). O meio foi ino- culado com 2x105 CFU/poço de MRSA e incubado durante 20 horas a 37°C. A presença ou ausência de crescimento bacteriano foi determi- nada nas condições com concentrações variáveis das duas substân- cias em teste. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 6.

[00123] Tabela 6 Incubado em caldo de Mueller-Hinton ajustado para cátions por 20 horas a 37C Ácido bórico µg/ml 0 313 625 1250 2500 5000 Lotilibcina 8,0 - - - - - - (µg/ml) 4,0 - - - - - - 2,0 - - - - - - 1,0 - - - - - - 0,5 + + + - - - 0,25 + + + + - - 0,125 + + + + - - 0 + + + + - - (+): presença de crescimento; (-) ausência de crescimento

[00124] Cálculo do índice FIC como indicador de Sinergia

[00125] A partir desses resultados, o valor de MIC cruzado de cada substância em teste (a concentração inibitória mínima na presença do outro componente) foi lido, e a contra-ação entre essas substâncias foi avaliada pelo índice FIC (Fractional Inhibitory Concentration (concen- tração inibitória fracionária)) calculado pela seguinte equação:

[00126] Índice FIC* = [(Valor MIC da substância A quando combi- nada com a substância B)/valor da substância MIC da substância A quando usada sozinha] + [(valor MIC da substância B quando combi- nada com a substância A)/valor MIC da substância B quando usada sozinha)] *<0,5: efeito sinérgico,>0,5 e<1,0: efeito aditivo; >1,0 e <2,0: sem efeito,> 2,0: efeito contrário

[00127] Em relação ao efeito do uso combinado de lotilibcina e áci- do bórico, o índice FIC dessas duas substâncias calculado pela equa- ção acima é 1,0, indicando que nenhum ou apenas um efeito muito fraco foi obtido pelo uso combinado.

[00128] (2-3) Teste de MIC cruzado adicional usando 5% de FBS

[00129] Para elucidar a causa pela qual a atividade antibacteriana in vitro da lotilibcina avaliada na presença de ácido bórico não se cor- relacionou com os dados discutidos acima obtidos no teste de avalia- ção da eficácia animal, o efeito do ácido bórico na atividade antibacte- riana da lotilibcina foi novamente testado em condições que foram tor- nadas mais próximas de um corpo vivo pela adição de FBS como um componente de soro a um meio basal. Mais especificamente, 5% de FBS foi adicionado ao caldo Mueller-Hinton ajustado para cátions (CAMHB) antes que este meio de teste fosse usado e o teste de MIC cruzado foi realizado da mesma maneira como mencionado em (2-2) acima.

[00130] Como resultado, surpreendentemente, o índice FIC para avaliar o efeito do uso combinado de lotilibcina e ácido bórico diminuiu para 0,25, um valor que indica interação sinérgica. Assim, o presente inventor conseguiu determinar o efeito sinérgico muito elevado do áci- do bórico sobre a atividade antibacteriana da lotilibcina em um teste in vitro. Estes resultados também se correlacionaram com a descoberta obtida no teste para avaliação da eficácia em animal discutido acima. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 7. Na tabela 7, o pon- to de sinergia do ácido bórico é 313 µg/ml ou 5,0 mM/ml para ácido bórico e para lotilibcina, 0,03 µg/ml ou 18 nM/ml.

[00131] Tabela 7 Incubado em caldo de Mueller-Hinton ajustado para cátions com adição de 5%FBS por 20 horas a 37C Ácido bórico µg/ml 0 313 625 1250 2500 5000 Lotilibcina 1,0 - - - - - - (µg/ml) 0,5 - - - - - - 0,25 - - - - - - 0,125 + - - - - - 0,06 + - - - - - 0,03 + - - - - - 0,015 + + - - - - 0 + + + + - - (+): presença de crescimento; (-) ausência de crescimento

[00132] O estudo in vitro discutido acima pode revelar que um teste in vitro para avaliar a atividade antibacteriana de lotilibcina na presen- ça de ácido bórico usando um meio basal ao qual foi adicionada uma certa quantidade (por exemplo, uma solução a 5% ou 0,05 g/ml) de um componente do soro, como FBS, pode prever reflexivamente a eficácia em animais e, assim, demonstrar uma diminuição sinérgica na MIC da lotilibcina de maneira dependente da concentração.

[00133] EXEMPLO 3

[00134] Neste exemplo, o efeito de ácido bórico na atividade anti- bacteriana da lotilibcina na presença de um componente de soro foi avaliado mais quantitativamente. A saber, as bactérias de teste (MRSA) e concentrações variadas de uma ou ambas as substâncias em teste (lotilibcina e ácido bórico) foram adicionadas ao meio de teste com adição de FBS a 5% (CAMHB) e incubadas durante 24 horas a 37°C. O número de células no meio de teste foi contado após 24 horas de incubação, e a intensidade da atividade antibacteriana da lotilibcina na presença de ácido bórico foi avaliada. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 8.

[00135] Tabela 8 Lotilibcina (µg/ml) Ácido bórico (µg/ml) Número de células (CFU/ml) Inicial (T=0) Após 24 horas 0,25 - 2,3 x 105 2,5 - 7,6 x 102 - 1250 1,5 x 107 - 2500 6,1 x 105 1,9 x 106 0,25 1250 2,0 x 102 2,5 2500 0

[00136] Na avaliação, pela mudança (diminuição) no número de cé- lulas após 24 horas de incubação como um indicador, verificou-se que a atividade antibacteriana de lotilibcina testada em um meio suplemen- tado com 5% de FBS foi aumentada em um fator de 1 000 pela pre- sença de ácido bórico, em comparação com a obtida com lotilibcina sozinha, mesmo a concentração de ácido bórico sendo tão baixa quanto 1250 µg/ml, que é inferior à MIC e, portanto, não inibe ineren- temente o crescimento das bactérias de teste.

[00137] Por outro lado, quando ácido bórico foi usado sozinho para avaliação, o número de células não diminuiu após 24 horas de incuba- ção, mesmo quando a concentração de ácido bórico foi de 2500 µg/ml correspondendo ao valor de MIC. Este resultado indica que o ácido bórico em si não possui uma alta atividade antibacteriana.

[00138] EXEMPLO 4

[00139] Um teste adicional in vitro foi realizado com o objetivo de elucidar a quantidade (concentração) mínima de ácido bórico que po- deria aumentar significativamente a atividade antibacteriana da lotilib- cina. A um meio de teste que foi caldo Mueller-Hinton ajustado para cátions (CAMHB) suplementado com 5% de FBS, uma diluição em sé- rie de lotilibcina na faixa de 0,015 – 8 µg/ml e uma baixa concentração de ácido bórico que era 10 µg/ml (0,001 %), 100 µg/ml (0,01%) ou 300 µg/ml (0,03%) foram adicionados e usados como amostra para avalia- ção. A atividade antibacteriana de cada amostra contra MRSA foi me- dida. A medição foi realizada de acordo com o método padrão (método de microdiluição em caldo) especificado pela Sociedade Japonesa de Quimioterapia.

[00140] Como resultado, verificou-se que a concentração mínima de ácido bórico necessária para aumentar a atividade anti-MRSA da lotilibcina foi de 100 µg/ml (0,01%), que era tão pequena quanto um vigésimo quinto da concentração de 2500 µg/ml que corresponde ao MIC quando o ácido bórico foi testado sozinho. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 9.

[00141] Tabela 9 Atividade antibacteriana de lotilibcina na presença de diferentes concentrações de ácido bórico Ácido bórico (µg/ml) Atividade antibacteriana de lotilibcina (MIC µg/ml) 300 0,03 100 0,125 10 0,25 0 0,25

[00142] EXEMPLO 5

[00143] Como uma abordagem para avaliar a utilidade de uma for- mulação contendo lotilibcina e ácido bórico, a influência da formulação no aparecimento de resistência foi estudada com base nos resultados do teste in vitro nos Exemplos de Teste 2 - 4 avaliando a aquisição de resistência a MRSA por um método de subcultura incremental da se- guinte maneira. Inicialmente, o valor MIC de uma substância em teste em um meio de teste que era caldo Mueller-Hinton ajustado para cá- tions (CAMHB) suplementado com 5% de FBS contra o crescimento de bactérias de teste (bactérias de primeira geração) foi determinado da maneira convencional. Em seguida, um caldo testado tendo uma concentração da substância em teste que correspondia a 1/4 do valor de MIC foi amostrado e cultivado em um meio de cultura adequado, como ágar. As bactérias cultivadas no meio de cultura foram isoladas como bactérias de segunda geração e usadas para inocular um caldo de teste que foi submetido à medição de MIC. O crescimento bacteria- no e processo de isolamento e a medição de MIC foram repetidos da mesma forma até que o valor de MIC das bactérias de terceira gera- ção fosse determinado. A medição da atividade antibacteriana (valor de MIC) foi realizada de acordo com o método padrão (método de mi- crodiluição em caldo) especificado pela Sociedade Japonesa de Qui- mioterapia. Os resultados foram avaliados comparando o valor de MIC obtido com as bactérias de primeira geração com o das bactérias de terceira geração. No caso em que foi encontrado um aumento no valor de MIC, concluiu-se que havia ocorrido aquisição de resistência, e o resultado foi avaliado pelo grau de aumento (comparação numérica). Neste caso, uma pequena quantidade de um caldo testado da terceira geração com uma concentração que correspondeu a 1/4 do valor de MIC foi amostrada e cultivada em ágar para observar as característi- cas morfológicas das colônias.

[00144] Como resultado, com as bactérias de terceira geração, o valor de MIC da lotilibcina quando testada sozinha aumentou para 32 µg/ml, enquanto o aumento permaneceu em 8 µg/ml quando testada na presença de ácido bórico. Assim, elucidou-se que a administração de lotilibcina junto com ácido bórico teve o efeito de retardar a indução de bactérias resistentes a fármacos. No que diz respeito à morfologia da colônia das bactérias de terceira geração, quer a lotilibcina tenha sido usada sozinha ou em combinação com ácido bórico, o crescimen- to das colônias foi mais lento em comparação com as bactérias da primeira geração e resultou em colônias com um diâmetro menor. Veri- ficou-se que eram colônias pequenas variantes (small colony variants

– SCV’s). Os resultados do teste são mostrados na Tabela 10.

[00145] Tabela 10 Substância em teste MIC na presença de 5%FBS (µg/ml) Atividade anti-MRSA Lotilibcina sozinha 0,25 de primeira geração Ácido bórico sozinho 2500 Atividade anti-MRSA Lotilibcina sozinha 32 de terceira geração Ácido bórico sozinho 5000 Lotilibcina + ácido bórico 8 (625µg/ml)

[00146] EXEMPLO 6

[00147] Tendo em vista a utilidade do ácido bórico no aumento da atividade anti-MRSA de lotilibcina demonstrada nos exemplos anterio- res, foi realizado um teste de triagem in vitro para verificar se a mesma utilidade é exibida com bactérias diferentes de MRSA. Vários tipos de cocos Gram-positivos foram testados em um meio de teste apropria- damente selecionado na ausência ou presença de 5% de FBS para determinar a atividade antibacteriana da lotilibcina, pesquisando assim as espécies bacterianas contra as quais a lotilibcina tinha sua ativida- de antibacteriana, que foi aumentada pela adição de soro. Neste teste de triagem, ácido bórico não foi usado. A medição foi realizada de acordo com o método padrão (método de microdiluição em caldo) es- pecificado pela Sociedade Japonesa de Quimioterapia.

[00148] Como resultado, verificou-se que a atividade antibacteriana da lotilibcina foi aumentada pela adição de 5% de FBS a um meio de cultura quando testado com Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, ambos pertencentes ao gênero Bacillus, um tipo de bacilo Gram-positivo, e bactérias Propionibacterium incluindo Propionibacterium acnes que causa acne vulgaris. Assim, estas espécies bacterianas satisfazem as condições em que a atividade antibacteriana da lotilibcina pode ainda ser aumentada pelo uso de ácido bórico em combinação com a lotilib- cina. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 11.

[00149] Tabela 11 Bactéria em teste (gram Atividade antibacteriana de lotilibcina na ausência ou pre- positiva) sença de soro (5%FBS) (MIC, µg/ml) Sem soro Com soro Bacillus subtilis 2,0 0,25 Bacillus anthracis 1,0 0,1 Propionibacterium acnes 1,0 <0,125

[00150] EXEMPLO 7

[00151] Uma vez que as três espécies bacterianas mostradas na Tabela 11 atendem às condições que lotilibcina tem uma atividade an- tibacteriana e sua atividade é aumentada por adição de um componen- te do soro, esperava-se que a atividade antibacteriana da lotilibcina pudesse ser ainda mais aumentada pelo uso de ácido bórico em com- binação com lotilibcina.

[00152] Para validar esse pensamento, Propionibacterium acnes, que causa acne vulgaris e pioderma e que é clinicamente importante como bactéria resistente a fármacos, foi testada quanto a avaliação quantitativa do efeito de ácido bórico na atividade antibacteriana da lotilibcina na presença de um componente sérico da mesma forma que já realizada com MRSA. A saber, Propionibacterium acnes como bac- térias de teste e diferentes concentrações de substâncias em teste fo- ram adicionadas a um meio de teste suplementado com 5% de FBS, e após incubação a 37°C por um determinado período de tempo, o nú- mero de células no meio foi contado para avaliar a atividade antibacte- riana da lotilibcina na presença de ácido bórico. Uma vez que Propio- nibacterium acnes é anaeróbica, ao contrário de MRSA, um ágar GAM (Gifu anaerobic medium - meio Gifu anaeróbico) foi usado como meio de teste e incubação foi realizada anaerobicamente (usando um elimi- nador de oxigênio e um agente gerador de gás dióxido de carbono) por 48 horas. A concentração de ácido bórico usado junto com a lotilibcina foi de 625 µg/ml (equivalente a 0,0625%), uma vez que a atividade an- tibacteriana (MIC) de ácido bórico sozinho contra a bactéria de teste foi determinada como sendo 1250 µg/ml (equivalente a 0,125%) em um teste conduzido anteriormente.

[00153] Como resultado, quando a mudança (diminuição) no núme- ro de células após 48 horas de incubação foi usada como um indicador para avaliação, verificou-se que a atividade antibacteriana da lotilibcina testada em um meio suplementado com 5% de FBS foi aumentada por um fator de 10 000 pela presença de ácido bórico em comparação com a obtida com lotilibcina sozinha, mesmo a concentração de ácido bórico sendo tão baixa quanto 625 µg/ml, que é inferior ao MIC e, por- tanto, não inibe inerentemente o crescimento das bactérias de teste. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 12.

[00154] Tabela 12 Substância em teste Número de células Inicial (T=0) Após 48 horas Lotilibcina (0,1 µg/ml) sozinha 2,8 x106 1,3 x106 Lotilibcina (0,1 µg/ml) + ácido bórico (625 µg/ml) 5,3 x 102

[00155] Conforme discutido acima, o presente inventor teve suces- so em aumentar drasticamente o perfil de eficácia da lotilibcina, um fármaco antibiótico depsipeptídico, para uso externo por adição de uma baixa concentração de ácido bórico que não proporciona ativida- de farmacológica (antibacteriana) por si só.

[00156] Além disso, as condições de teste para um teste in vitro pa- ra avaliar a atividade antibacteriana da lotilibcina de maneira que se correlacione com os dados de eficácia obtidos com modelos de infec- ção animal puderam ser reveladas. Essas condições de teste são im- portantes quando um fármaco é colocado em uso prático em seres humanos.

[00157] A lotilibcina exerce sua atividade antibacteriana contra MRSA em uma concentração de 1,0 µg/ml ou superior quando testada por um teste de avaliação antibacteriana in vitro convencional. Em contraste, quando testada pelo método de teste mencionado acima em que um meio de teste suplementado com FBS é usado e ácido bórico é adicionado, é possível demonstrar a atividade antibacteriana da loti- libcina em uma concentração na faixa de 0,015-0 1,0 µg/ml ou inferior. Os resultados obtidos neste teste in vitro podem ser aplicados na pre- visão de eficácia em animais ou seres humanos.

[00158] A dose de ácido bórico que é adicionada é desejavelmente no máximo metade da concentração inibitória mínima de ácido bórico quando testado sozinho contra a bactéria de interesse. Assim, uma dose desejável de ácido bórico fica na faixa de 100 - 1250 µg/ml (0,01% - 0,125%) e de preferência na faixa de 100 - 625 µg/ml (0,01% - 0,0625%). Como mencionado anteriormente, ácido bórico pode ser substituído por um composto borato, como o borato de sódio, com uma dose equivalente molar.

[00159] (Nota: Esses intervalos de concentração de ácido bórico não estão refletidos nas reivindicações)

[00160] FORMULAÇÕES

[00161] A presente invenção será ilustrada pelos seguintes exem- plos sem intenção de limitar a presente invenção aos mesmos.

[00162] Formulação Externa 1

[00163] As formulações de pomada em gel 1A e 1B tendo as com- posições mostradas na Tabela 13 abaixo foram preparadas misturan- do os ingredientes individuais por agitação de modo a formar uma so- lução homogênea. A solução de ajuste de pH que foi usada foi um tampão de fosfato preparado pela mistura de 39 volumes de hidroge- nofosfato dissódico 100 mM e 61 volumes de di-hidrogenofosfato de sódio100 mM seguido pela adição de uma solução de hidróxido de só- dio 0,1 N em uma quantidade suficiente para ser diluída para 0,02 N.

[00164] Tabela 13 Ingrediente Quantidade (% em peso) Formulação 1A Formulação 1B 1 Lotilibcina 0,5 0,25

2 Ácido bórico 1,0 0,5 3 Propileno glicol 15,0 15,0 4 p-hidroxibenzoato de metila 0,2 0,2 5 p-hidroxibenzoato de propila 0,03 0,03 6 Hidroxietil celulose 1,5 1,5 7 Sorbitol 5,0 5,0 8 Ácido etileno diamino tetracético 0,17 0,17 9 Solução de ajuste de pH 20,0 20,0 10 Água purificada 56,6 57,35 Total 100 100 pH 5,0 5,2 Aparência Gel translúcido Gel translúcido

[00165] Quando estas formulações 1 A e 1B foram deixadas duran- te um mês a 25°C para avaliar a estabilidade da aparência, nenhuma alteração na cor e outras propriedades físicas que são problemáticas nas preparações farmacêuticas foi observada em qualquer das formu- lações. Quando submetidas a um teste de irritação da pele em uma cobaia, mostraram uma irritação suficientemente baixa.

[00166] Formulação Externa 2

[00167] Formulações de creme 2A e 2B tendo as composições mostradas na Tabela 14 abaixo foram preparadas misturando os in- gredientes individuais com agitação de modo a formar uma solução homogênea.

[00168] Tabela 14 Ingrediente Quantidade (% em peso) Formulação 2A Formulação 2B 1 Lotilibcina 0,5 0,25 2 Ácido bórico 0,5 0,5 3 Propileno glicol 15,0 15,0 4 p-hidroxibenzoato de metila 0,2 0,2 5 p-hidroxibenzoato de propila 0,03 0,03 6 Petrolato branco 5,0 5,0 7 Álcool cetílico 3,0 3,0 8 Álcool estearílico 2,0 2,0 9 Hidroxietil celulose 0,3 0,3

10 Polioxietileno estearil éter 5,0 5,0 11 Solução de ajuste de pH* 20,0 20,0 12 Água purificada 48,47 48,72 Total 100 100 pH 4,7 4,9 Aparência Creme ligeiramente amarelado com baixa viscosidade

[00169] * A mesma solução de ajuste de pH usada na Formulação 1.

[00170] Quando essas formulações 2A e 2B foram deixadas por um mês a 25°C, para avaliar a estabilidade da aparência, nenhuma mu- dança na cor e outras propriedades físicas que são problemáticas em preparações farmacêuticas foi observada em qualquer formulação. Quando submetidas a um teste de irritação da pele em uma cobaia, mostraram uma irritação suficientemente baixa.

[00171] Formulação Externa 3

[00172] As formulações de colírio 3 A e 3B que também podem ser aplicadas ao ouvido e ao nariz e que tinham as composições mostra- das na Tabela 15 abaixo foram preparadas misturando os ingredientes individuais com agitação de modo a formar uma solução homogênea.

[00173] Tabela 15 Ingrediente Quantidade (% em peso) Formulação 3A Formulação 3B 1 Lotilibcina 0,25 0,1 2 Ácido bórico 0,5 0,5 3 α-ciclodextrina 2,5 1,0 4 Glicerol 2,5 2,5 5 Álcool benzílico 0,1 0,1 6 Solução de ajuste de pH* 20,0 20,0 7 Água purificada 74,15 75,8 Total 100 100 pH 6,7 7,1 Aparência Fluido transparente incolor

[00174] * A mesma solução de ajuste de pH usada na Formulação

1.

[00175] Quando estas formulações 3A e 3B foram deixadas durante um mês a 25°C para avaliar a estabilidade de aparência, nenhuma al- teração na cor e outras propriedades físicas que são problemáticas nas preparações farmacêuticas foi observada em qualquer das formu- lações. Quando submetidas a um teste de irritação oftálmica da mem- brana mucosa em coelho, mostraram boa tolerabilidade sem anormali- dades.

[00176] Formulação Externa 4

[00177] As formulações aquosas inalantes 4A e 4B que têm as composições mostradas na Tabela 16 abaixo foram preparadas mistu- rando os ingredientes individuais com agitação de modo a formar uma solução homogênea.

[00178] Tabela 16 Ingrediente Quantidade (% em peso) Formulação 4A Formulação 4B 1 Lotilibcina 0,5 0,1 2 Ácido bórico 0,05 0,05 3 α-ciclodextrina 2,5 1,0 4 Carboximetil celulose sódica 0,2 0,2 5 Glicerol 2,0 2,0 6 Solução de ajuste de pH* 20,0 20,0 7 Água purificada 74,75 76,65 Total 100 100 pH 6,9 7,2 Aparência Fluido transparente incolor

[00179] * A mesma solução de ajuste de pH usada na Formulação

1.

[00180] Quando estas formulações 4A e 4B foram deixadas durante um mês a 25°C para avaliar a estabilidade de aparência, nenhuma al- teração na cor e outras propriedades físicas que são problemáticas em preparações farmacêuticas foi observada em qualquer das formula- ções. Quando submetidas a um teste de irritação da mucosa oral em cobaia, mostraram boa tolerabilidade sem anormalidades.

[00181] Formulação Externa 5

[00182] As formulações de loção 5 A e 5B com as composições mostradas na Tabela 17 abaixo foram preparadas misturando os in- gredientes individuais com agitação de modo a formar uma solução homogênea.

[00183] Tabela17 Ingrediente Quantidade (% em peso) Formulação 5A Formulação 5B 1 Lotilibcina 0,5 0,25 2 Ácido bórico 1,0 0,5 3 Sorbitol 2,5 2,5 4 Glicerol 1,0 1,0 5 Carboximetilcelulose sódica 2,0 3,0 6 Celulose microcristalina 2,0 3,0 7 Solução de ajuste de pH* 20,0 20,0 8 Água purificada 71,0 69,75 Total 100 100 pH 5,0 5,3 Aparência Fluido similar à loção com ligeira cor branca acinzentada

[00184] * A mesma solução de ajuste de pH usada na Formulação

1.

[00185] Quando estas formulações 5A e 5B foram deixadas durante um mês a 25°C para avaliar a estabilidade de aparência, nenhuma al- teração na cor e outras propriedades físicas que são problemáticas em preparações farmacêuticas foi observada em qualquer das formula- ções. Quando submetidas a um teste de irritação da pele em cobaia, mostraram uma irritação suficientemente baixa.

[00186] Formulação Externa 5

[00187] As formulações tópicas 6A e 6B com as composições são mostradas na Tabela 18 abaixo. Estas são preparadas misturando os componentes e formando uma composição homogênea. 100 gramas da formulação tópica podem ser prontamente feitos usando os seguin-

tes componentes.

[00188] Tabela 18 Ingrediente Quantidade (% em peso) Formulação 6A Formulação 6B 1 Lotilibcina 0,5 – 3,0 g 2,0 g 2 Ácido bórico 1,0 – 7,5 5,0 g 3 Sorbitol 1,5 – 4,0 2,5 4 Glicerol 0,5 – 1,5 1,0 5 Carboximetilcelulose sódica 2,0 – 4,0 3,0 6 Celulose microcristalina 1,5 – 4,0 3,0 7 Solução de ajuste de pH* 20,0 20,0 8 Água purificada Adicionar para completar 100g no 63,5 total Total 100 100 pH 4,5 – 6,5 4,94 Aparência Fluido similar à loção com cor esbranquiçada

[00189] * A mesma solução de ajuste de pH usada na Formulação

1.

[00190] Esta formulação pode ser aplicada a uma infecção na su- perfície ou ferida de um paciente ou indivíduo. Na prática, aproxima- damente 0,5-1,5 gramas da loção são administrados 2-4 vezes ao dia na área infectada. As formulações proporcionam atividade antibacteri- ana sinérgica contra infecções bacterianas, incluindo MRSA.

[00191] Aplicabilidade Industrial

[00192] A presente invenção fornece uma nova formulação externa de um antibiótico depsipeptídico com uma elevada eficácia terapêutica ou profilática para infecções tópicas causadas pela bactéria alvo e ca- paz de suprimir o desenvolvimento de bactérias resistentes a fármaco quando um antibiótico depsipeptídico, particularmente lotilibcina, é administrado topicamente como um fármaco antibacteriano externo para o tratamento de várias infecções bacterianas em seres humanos e animais.

[00193] O efeito mencionado acima também torna possível reduzir significativamente o período total necessário para o tratamento, resul- tando no fornecimento de um fármaco antibacteriano externo de alta segurança, capaz de reduzir uma dose ou frequência de dosagem ou suprimir o desenvolvimento de bactérias resistentes a fármaco por uma exposição significativamente reduzida a fármacos antibacteria- nos. Assim, a presente invenção pode oferecer uma solução eficaz para o problema mundial de bactérias resistentes a fármacos.

[00194] REFERÊNCIAS

[00195] Documentos de Patentes

[00196] Patente dos Estados Unidos no. 5 648 455 ou patente US número 7 968 588

[00197] Patente dos Estados Unidos no. 7 968 588

[00198] Documentos que não são de Patente

[00199] J. Am. Chem. Soc., Vol. H9: No. 28, 6680-6681 (1997)

[00200] J. Antibiotics, Vol. 51: No. 10, 929-935 (1998)

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição antimicrobiana externa formulada para uso na prevenção ou tratamento de infecção bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende um antibiótico depsipeptídico em uma con- centração de pelo menos 0,03 µg/ml e ácido bórico em uma quantida- de de pelo menos 0,01% em massa, em que a referida combinação exibe sinergia antimicrobiana e assim resulta na erradicação das refe- ridas bactérias e melhoria ou resolução da referida infecção causada pelas referidas bactérias.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato que a referida bactéria tratada pela referida composição é um Staphylococcus aureus, incluindo Staphylococcus aureus resis- tente à meticilina, ou Propionibacterium acne

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato que a referida infecção bacteriana tratada inclui infec- ções após lesão de tecido por queimaduras, lacerações, abrasões, mordidas, feridas cirúrgicas, feridas de punção, úlceras, incluindo, mas não se limitando a, feridas agudas e crônicas de infecção complicada de pele e tecidos moles ( cSSTI), feridas agudas e crônicas de infec- ção da pele e da estrutura da pele (SSSI), úlceras de estase venosa, úlceras diabéticas, úlceras de pressão, úlceras pós-cirúrgicas, úlceras pós-traumáticas e úlceras espontâneas.

4. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 3, ca- racterizada pelo fato que o antibiótico depsipeptídico é aquele que possui uma estrutura molecular constituída de 12 resíduos de aminoá- cidos.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zada pelo fato que o antibiótico depsipeptídico é lotilibcina com a se- guinte fórmula estrutural (1):

ou um sal ou estereoisômero farmaceuticamente aceitável da mesma.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 5, caracterizada pelo fato que o referido antibiótico depsi- peptídico está presente em uma quantidade de 0,01% a 5,0% em massa.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zada pelo fato que o antibiótico depsipeptídico está presente em uma quantidade de 0,05% a 2,5% em massa.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zada pelo fato que o antibiótico depsipeptídico está presente em uma quantidade de 0,05% a 2,0% em massa.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zada pelo fato que o antibiótico depsipeptídico está presente em uma quantidade de 0,1% a 1,0% em massa.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 6 a 9, caracterizada pelo fato que o ácido bórico está presente em uma quantidade de 0,01% a 5,0% em massa.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, carac- terizada pelo fato que o ácido bórico está presente em uma quantidade de 0,05% a 2,5% em massa.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 10, carac- terizada pelo fato que o ácido bórico está presente em uma quantidade de 0,05% a 2,0% em massa.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 10, carac- terizada pelo fato que o ácido bórico está presente em uma quantidade de 0,1% a 1,0% em massa.

14. Composição bactericida formulada para uso externo na inibição do crescimento microbiano em uma ferida ou infecção da su- perfície corporal, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um antibiótico depsipeptídico que exibe potência prolongada em combinação com uma quantidade eficaz de ácido bóri- co, em que a referida combinação do referido antibiótico depsipeptídi- co e do referido ácido bórico apresenta atividade antibacteriana sinér- gica.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, carac- terizada pelo fato que é utilizada para tratamento de feridas ou infec- ções da superfície corporal que são causadas por uma bactéria resis- tente a fármacos ou resistente a múltiplos fármacos.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, carac- terizada pelo fato que a referida bactéria resistente a fármacos é Sta- phylococcus aureus resistente à meticilina.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato que o referido depsipeptídeo consiste essenci- almente em 12 resíduos de aminoácidos.

18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 14 a 17, caracterizada pelo fato que o depsipeptídeo é lotilibci- na com a estrutura química:

ou um sal ou estereoisômero farmaceuticamente aceitável da mesma.

19. Composição, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato que a referida composição consiste essencialmente em ácido bórico em uma composição final que varia de pelo menos 5,0 mM/ml (313 µg/ml) a não mais que 40 mM/ml (2500 µg/ml ) e a concentração de depsipeptídeo varia de pelo menos 18 nM/ml (0,03 µg/ml) ou pelo menos 152 nM/ml (0,25 µg/ml) a 4881 nM/ml (cerca de 8,0 µg/ml).

20. Composição, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de ser formulada como uma composição em pomada, creme, loção, unguento ou líquida.

21. Composição, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato que a referida mistura de antibiótico depsipeptídico e ácido bórico (X) também compreende HP- beta ciclodextrina (Y) em uma razão em peso X:Y de 1:16.

22. Composição, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de incluir adicionalmente albumina de soro bovino (bovine serum albumin - BSA) em uma quan- tidade eficaz.

23. Composição, como definida em qualquer uma das rei-

vindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de ser na forma de dosa- gem tópica.

24. Composição, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de ser na forma de dosa- gem para inalação.

25. Composição, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de ser na forma de dosa- gem ocular.

26. Método para o tratamento de uma infecção bacteriana na superfície ou em uma ferida de um paciente ou indivíduo com ne- cessidade do mesmo, caracterizado pelo fato que compreende a ad- ministração ao referido paciente de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato que a referida infecção bacteriana é uma infecção causa- da por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (Methicillin- resistant Staphylococcus aureus - MRSA).

28. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, carac- terizado pelo fato que a referida ferida é uma ferida aguda.

29. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, carac- terizado pelo fato que a referida ferida é uma ferida crônica.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 29, caracterizado pelo fato que a referida ferida é clinica- mente definida como uma infecção complicada da pele e dos tecidos moles (complicated skin and soft tissue infection - cSSTI) ou uma in- fecção complicada da pele e da estrutura da pele (complicated skin and skin structure infection cSSSI).

31. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, carac- terizado pelo fato que a infecção é acne, incluindo acne causada por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)